FI92326B - LHRH:n nonapeptidi- ja dekapeptidianalogeja, jotka ovat käyttökelpoisia LHRH:n antagonisteina - Google Patents

Description

9 >; 326 LHRH:n nonapeptidi- ja dekapeptidianalogeja, jotka ovat käyttökelpoisia LHRH:n antagonisteina

Luteinisoivaa hormonia (LH) ja follikkelia stimu-5 loivaa hormonia (FSH) vapautuu aivolisäkkeen etulohkosta hypothalamuksen alueella tuotettavan luteinisoivaa hormonia vapauttavan hormonin (LHRH, LH/FSH-RH, GnRH) säätelyn alaisena. LH ja FSH vaikuttavat gonadeihin kiihdyttäen steroidihormonien synteesiä ja gameettien kypsymis-10 tä. LHRH:n sykäyksittäinen vapautuminen ja siten LH:n ja FSH:n vapautuminen säätelevät lisääntymissykliä kotieläimillä ja ihmisillä.

LHRH vaikuttaa myös istukkaan ja sitä kautta epäsuorasti gonadeihin aikaansaamalla koriogonadotropiinin 15 (OG) synteesin ja vapautumisen.

LHRH:n antagonistit ovat käyttökelpoisia hedelmällisyyden säätelyssä. Sellaiset antagonistit estävät ovulaatiota naarailla ja spermatogeneesiä uroksilla. Näihin vaikutuksiin liittyy läheisesti gonadiperäisten steroi-• 20 disten sukupuolihormonien tason aleneminen verenkierrossa esiintyvästä normaalitasosta, mikä aiheuttaa aksesso-risten elinten massan pienentymistä uroksilla ja naarailla. Kotieläimillä tämä vaikutus ehkäisee sukupuolista kiertoa ja käyttäytymistä (edistäen painon lisääntymistä ..25 laiduntamisvaiheessa), aiheuttaa keskenmenoja tiineillä I « eläimillä ja saa yleensä aikaan kemiallisen sterilisaation.

Luonnollinen vapauttava hormoni LHRH on dekapep-tidi, joka koostuu luonnossa esiintyvistä aminohapoista 30 (joilla glysiiniä, joka on asymmetriakeskukseton amino-·;· happo, lukuunottamatta on L-konfiguraatio). Sen aminohap- pojärjestys on seuraava: (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH^ 35 123456789 10 2 ?V7'-6 Tämän luonnollisen aineen kanssa analogiset yhdisteet esitetään usein lyhennetyssä muodossa osoittamalla jonkin tietyn aminohapon, jonka asema osoitetaan yläindek-sillä, korvaajan luonne, mitä seuraa "LHRH". Monia LHRH:n 5 analogeja on tutkittu, ja hyvin suurella enemmistöllä niistä on riittämätön biologinen aktiivisuus, jotta ne olisivat kliinisesti käyttökelpoisia. Eräillä tietyillä muunnoksilla on kuitenkin agonistista biologista aktiivisuutta tehostava vaikutus. Huomattava agonistisen ak-10 tiivisuuden lisääntyminen saavutetaan vaihtamalla Gly:n tilalle 6-asemassa sijaitsevaksi happotähteeksi D-ami-nohappotähde.

Agonistien lisäksi on valmistettu analogeja, jotka ovat LHRH:n kompetitiivisia antagonisteja ja jotka 15 kaikki edellyttävät 2-asemassa sijaitsevan histidyyli-ryhmän poistamista tai korvaamista Zw· Vale et ai., Science 176 (1972) 933/. Yleisesti ottaen vaikuttaa siltä, että D-aminohappotähde tuottaa kyseiseen asemaan ketjussa sijoitettuna tulokseksi parhaan aktiivisuuden 20 ZR.W.A. Rees et ai., J.Med.Chem. 17 (1974) 10167-

Sen lisäksi lisämuunnos 6-asemassa (joka ilman 2-aseman muuntamista johtaa edellä mainittuun agonisti-seen aktiivisuuteen) lisää 2-muunnettujen analogien antagonistista aktiivisuutta iC. W. Beattie et ai., J. Med.

·, 25 Chem. 18 (1975) 1247; J. Rivier et ai., Peptides 1976, Editions de 1'Universite de Bruxeller, Belgia, 1976, s 4277.

Näiden kahden päämuunnoksen, jotka johtavat tehokkaampiin LHRH:n antagonisteihin, pohjalta antagonis-30 tista aktiivisuutta on voitu lisätä edelleen muuntamalla jo 2,6-muunnetun peptidin 1-, 3-, 5- ja/tai 10-asemaa 7¾. H. Coy et ai., Peptides 1976, Editions de 1'Univer-site de Bruxelles, Belgia, 1976, s 462; J. E. Rivier et ai., Life Sei. 23 (1978) 869; A. S. Dutta et ai., 35 Biochem. Biophys. Res. Commun. 85 (1979) 7097· 0n myös 1

II

· 3 9 2526 osoitettu, että 1-asemassa sijaitsevan aminohappotähteen N-asyloinnista on etua /K. Channabasavaia et ai., Bio-chem. Biophys. Res. Commun. 81 (1978) 382; D. H. Coy et ai., Peptides - Structure and Biological Function, Pier-5 ce Chemical Co., 1979, s 775/. Lisäksi on julkaistu artikkeli /5.H. Coy, Endocrinology 110 (1982) 1445/1 joka käsittelee erittäin tehokasta antagonistia, joka sisäl-tää D-Arg -substituution, (N-Ac-D-pCl-Phe , D-pCl-Phe , D-Trp3, D-Arg6, D-Ala10)LHRH.

β 10 Ikävä kyllä, vaikka D-Arg -substituution sisältävä ryhmä LHRH:n analogeja on havaittu tehokkaiksi ovulaatiota estäviksi aineiksi, ne olivat myös voimakkaita syöttösoluja degranuloivia aineita /Schmidt et ai.,

Contraception 29 (1984) 283/ ja aiheuttivat ödeemaa in 1 2 15 vivo. Niinpä esimerkiksi (N-Ac-D-Nal(2) , D-pCl-Phe , -¾ β D-Trp , D-Arg )LHRH:n ED,-g on 0,2 yug/ml, mitä tulee histamiinin vapauttamiseen rotan syöttösoluista in vitro.

Tämä sivureaktio on kliinisesti tärkeä seuraavan anafy-laktistyyppisen reaktion mahdollisen hengenvaarallisen 20 luonteen vuoksi.

On alalla tunnettua, että positiivisen varauksen/-positiivisia varauksia, erityisesti useita positiivisia varauksia, joihin yhdistyy hydrofobisuus, sisältävät molekyylit ovat voimakkaita syöttösolujen degranuloijia '1 25 /Foreman ja Jordan, Agents and Action 13 (1983) 1057· Ensimmäinen yritys kiertää tämä ongelma kaksi Arg-täh-dettä (asemissa 6 ja 8) sisältävien analogien yhteydessä oli lisätä tähteiden etäisyyttä (esim. (N-Ac-D-Nal(2)1, D-pCl-Phe2, D-Trp3, Arg5, D-Tyr6, D-Ala10)LHRH; ED^Q = 30 2,ug/ml histamiinin vapautuksessa; R.W. Roeske et ai., • 5 5 "Substitution of Arg for Tyr in GNRH antagonists".

Peptides - Structure and Function, toim. C.M. Deber, V. J. Hruby ja K. D. Kopple, Pierce Chemical Co.,

Rockford, Illinois, 1985, s 561). Vaikka tämä heikensi 35 analogin kykyä degranuloida syöttösoluja ja vapauttaa * 4 9/326 histamiinia, analogilla oli yhä monta kertaa suurempi kyky aiheuttaa anafylaktistyyppinen reaktio kuin LHRH:11a, jonka EDgg on 328 pg/ml, mitä tulee histamiinin vapauttamiseen.

5 Myös Lys(iPr) on sisällytetty eri asemiin LHRH:n antagonisteihin. Sijoitettaessa se 6- ja 8-asemaan, kun 2-asemassa on samanaikaisesti D-pCl-Phe-tähde, suuri ovulaation vastainen teho ja heikentynyt histamiinin vapautuminen säilyvät (esim. (N-Ac-D-Nal(2)\ pCl-Phe2,

Q Q

10 D-Trp , D-Lys(iPr) , D-Ala )LHRH; EDj-q = 6,6 pg/ml histamiinin vapautuksessa). Erääseen analogiin sijoitettiin 8-asemaan hArg(Et-), jolloin analogin kyky vapauttaa his- z 1 tamiinia oli samaa tasoa (so. (N-Ac-D-Nal(2) , D-oMe-pCl-Phe2, D-Pal(3)3, D-Arg6, hArg(Et^)8, 10 z 15 D-Ala )LHRH; ED^q =4,9 pg/ml histamiinin vapautuksessa). Voidaan kuitenkin havaita, että nämä analogit ovat silti hyvin tehokkaita histamiinia vapauttavia aineita LHRH:hon verrattuna. (R.W. Roeske et ai., "LHRH Antagonists with Low Histamine Releasing Activity". LHRH and 20 its Analogs: Contraceptive and Therapeutic Applications, Part 2, toim. B. H. Vickery ja J. J. Nestor Jr., MTP Press, Boston, 1987, s 17-24).

8- ja 9-asema on myös tunnistettu tärkeimmiksi substituoitaviksi kohdiksi, jotta estetään histamiinin - 25 vapautus, koska Arg-Pro-jakso on neuropeptideissä, jotka aiheuttavat syöttösolujen degranuloitumista, usein havaittu ominaispiirre. Vaikka siis 8-asema on tieteellisin perustein ratkaiseva asema substituoitavaksi, nykyisin tunnetulla joukolla analogeja on huomattava mahdolli-30 suus myrkyllisyyteen ja muihin sivuvaikutuksiin.

Tämä keksintö koskee uusia, hyvin tehokkaita LHRH:n nonapeptidi- ja dekapeptidianalogeja, joiden kyky vapauttaa histamiinia on hyvin pieni ja joiden ratkaisevan tärkeä ominaispiirre on steerisesti estetty guanidi-35 nosubstituoitu arginyyliryhmä 8-asemassa, välttäen argi-nyyliryhmää 6-asemassa. Keksintö koskee myös koostumuk-. siä, jotka sisältävät näitä yhdisteitä.

5 9'/ 3 2 6

Keksinnön kohteena on yhdiste, jolla on kaava (I), A-B-C-Ser-D-E-F-G-Pro-J (I) 123 4 5678 9 10 5 tai sen fysiologisesti hyväksyttävä suola.

LHRH:n 2-asemassa sijaitsevan L-histidyyliryhmän korvaaminen muuttaa peptidin LHRH:n antagonistiksi. LHRH:ssa 6-asemassa sijaitsevan glysyyliryhmän korvaami-10 nen jollakin E:nä mainituista ryhmistä lisää antagonistista vaikutusta voimakkaasti. Tässä esitetyt 1-, 2-, 3-, 5-, 7- ja 10-asemassa tehtävät korvaukset auttavat edelleen parantamaan antagonistista aktiivisuutta. Substituutio G 8-asemassa alentaa voimakkaasti analogien te-15 hoa histamiinin vapautuksessa, kun 6-aseman Arg on korvattu jollakin muulla ryhmällä, ja on ratkaisevan tärkeä ajatellen analogien turvallisuutta.

Kuten edellä on esitetty, erilaisista yleisistä aminohapoista käytetään tämän keksinnön kuvauksen helpot-20 tamiseksi tavanomaisia lyhenteitä peptidialalla yleisesti hyväksytyllä tavalla, jota on suositellut IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (Biochemistry 11 (1972) 1726). Kaikki tässä mainitut peptidijaksot on kirjoitettu noudattaen yleisesti hyväksyttyä tapaa, jossa N-. 25 terminaalinen aminohappo on vasemmalla ja C-terminaalinen aminohappo oikealla.

Esitetyt lyhenteen tarkoittavat L-aminohappoja, poikkeuksena asymmetriakeskukseton (akiraalinen) amino-happoglysiini ja lisäpoikkeuksina ne luonnossa esiinty-30 mättömät tai esiintyvät aminohapot, jotka ovat akiraali-sia tai joita muussa tapauksessa on merkitty D:llä tai DL:llä.

Tulisi huomata, että J:n ollessa -NH-C(0)-NH2 C-terminaalinen ryhmä on atsaglysinamidiryhmä.

35 Lyhenne D-Glu(AA) tarkoittaa anisolin ja D-Glu- tähteen välistä additiotuotetta, jolloin muodostuu p-met- 6 92326 oksifenyyliketöni (glutamiinihapposivuketjun C-terminaa-liseen päähän), so Glu(pMeO-Ph).

Eräät muutkin lyhenteet ovat käyttökelpoisia keksinnön kuvauksessa. Tässä keksinnössä luonnollisen LHRH-5 peptidin aminohappoja korvataan aminohapoilla, joita ei esiinny luonnossa. Erityisen yleisesti käytettyjä niistä ovat seuraavat:

Aminohappotähde Lyhenne 3-(2-naftyyli)alanyyli Nal(2) 10 3-(p-fluorifenyyli)alanyyli pF-Phe 3-(p-kloorifenyyli)alanyyli pCl-Phe 3-(3-pyridyyli)alanyyli Pal(3) N,N'-guanidino(dimetyyli)- homoarginyyli Dmh tai hArg(Me)2 15 N,N'-guanidino(dietyyli)- homoarginyyli Deh tai hArg(Et)2 N,N'-guanidino(diprop- yyli)homoarginyyli Dph tai hArg(Pr>2 N,N'-guanidino(di-iso- 20 propyyli)homoarginyyli Dih tai hArgiiPr^ N,N'-guanidino(diheksyy- li)homoarginyyli Dhh tai hArg(heksyy- 11 >2 N,N'-guanidino(etano)- . . 25 homoarginyyli Eha tai hArgfCI^^ N,N'-guanidino(propeno)- homoarginyyli Pha tai hArgiCl·^)^ N,N'-guanidinobis(2,2,2-tri- fluorietyyli)homoarginyyli Bth tai hArg(CI^CF^)^ 30 NG-etyyli-NG'-(trifluorietyyli )homoarginyyli hArgiCH^CFg, Et) NG,NG,-2-trifluorimetyyli- 2,2-difluorietyylihomoargi- nyyli hArg(CH2CF2CF3) 35 n-guanidino(etyyli)homo- arginyyli Meh tai hArg(Et) N-guanidino(propyyli)- homoarginyyli Prh tai hArg(Pr) 92326 7

Aminohappotähde Lyhenne N-guanidino(isopropyyli)- homoarginyyli Tph tai hArg(iPr) N-guanidino(butyyli)homo- 5 arginyyli Mbh tai hArg(Bu) N,N'-guanidino(disyklo- heksyyli)homoarginyyli Dch tai hArg(syklo- heksyyli >2 N-guanidino(heptyyli)homo- 10 arginyyli Hha tai hArg(heptyy li ) N-guanidino(etyyli)arginyyli Mea tai Arg(Et) N,N'-guanidino(di-iso- propyyli)arginyyli Dia tai Arg(iPr)2 15 N,N'-guanidino(disyklo- heksyyli)arginyyli Dca tai Arg(syklohek- syyii)2 3-(3-piperidyyli)alanyyli 3-Pia 3- (4-piperidyyli)alanyyli 4-Pia 20 3-[ (NE-metyyli)piperid- 4- yyli]-alanyyli Mpa 3- [(Ne-pentyyli)piperid- 4- yyli]alanyyli Ppa 3-[(Ne-bentsyyli)piperid- — 25 4-yyli]alanyyli Bpa

Ne-nikotinyyli-D-lysyyli Lys(Nic) Νε-(3-pyridyyli)asetyyli- D-lysyyli Lys(pyridyyliasetyy- li) 30 3-(2,4,6-trimetyylifenyy- li)alanyyli Tmp 2,2-difenyyliglysyyli Dpg Tässä käytettynä ilmaisu fysiologisesti hyväksyt-35 tävät suolat" tarkoittaa suoloja, joilla säilyy kantayh- disteen toivottu biologinen aktiivisuus ja joilla ei ole . mitään ei-toivottuja toksikologisia vaikutuksia. Esimerk kejä sellaisista suoloista ovat δ 9 2326 (a) epäorgaanisten happojen, esimerkiksi suolahapon, bro-mivetyhapon, rikkihapon, fosforihapon, typpihapon ja vastaavien, kanssa muodostetut happoadditiosuolat sekä orgaanisten happojen, kuten esimerkiksi etikkahapon, oksaa- 5 lihapon, viinihapon, meripihkahapon, maleiinihapon, fu- maarihapon, glukonihapon, sitruunahapon, omenahapon, as-korbiinihapon, bentsoehapon, parkkihapon, pamonihapon, algiinihapon, polyglutamiinihapon, naftaleenisulfonihap-pojen, naftaleenidisulfonihappojen ja polygalakturoniha-10 pon, kanssa muodostetut suolat; (b) moniarvoisten metallikationien, kuten sinkin, kalsiumin, vismutin, bariumin, magnesiumin, alumiinin, kuparin, koboltin, nikkelin, kadmiumin ja vastaavien, sekä N, N' -dibentsyylietyleenidiamiinista tai etyleenidiamiinista 15 muodostuneen orgaanisen kationin kanssa muodostetut emäs-additiosuolat; ja (c) yhdistelmät, jotka koostuvat (a):sta ja (b):stä, esimerkiksi sinkkitannaattisuola ja vastaavat.

Ilmaisu "alempi alkyyli" tarkoittaa suoraketjuista 20 tai haaroittunutta, tyydytettyä hiilivetyryhmää, joka sisältää 1-4 hiiliatomia, kuten esimerkiksi metyyliä, etyyliä, n-propyyliä, isopropyyliä, n-butyyliä, isobutyyliä, s-butyyliä ja t-butyyliä. "1-6 hiiliatomia sisältävä al-kyyli" sulkee sisäänsä samat substituentit kuin alempi 25 alkyyli mutta lisäksi myös 5 tai 6 hiiliatomia sisältävät ryhmät, kuten esimerkiksi n-pentyylin, n-heksyylin ja 5 tai 6 hiiliatomia sisältävät haaroittuneet ryhmät. "1-12 hiiliatomia sisältävä alkyyli" sulkee sisäänsä hiilivety-ryhmät, joissa on 1-12 hiiliatomia, mm. edellä mainitut 30 ryhmät sillä erotuksella, että ryhmät voivat sisältää jopa 12 hiiliatomia.

"Fluorialkyyli" tarkoittaa 1-5 fluoriatomilla substituoitua alempaa alkyyliä, esimerkiksi ryhmiä CF3CH2-, CFg-, CF3CF2CH2- ja vastaavia.

35 "Halogeeni" tarkoittaa fluoria, klooria tai bro mia.

Lyhenne "N-Ac" tarkoittaa N-asetyyli-suojaryhmää, so. terminaalisen aminohappotähteen amiinityppeen sitou- 92326 9 tunutta asetyyliryhmää, yleisesti hyväksytyn nimeämistavan mukaisesti.

Edullisia tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä ovat yhdisteet, joissa 5 A on N-Ac-D-Nal(2); B on D-pF-Phe tai D-pCl-Phe; C on D-Trp tai D-Pal(3); D on Pal(2), Tyr, Arg, Deh, Mbh, Bth tai Pha; E on D-Trp, D-Tyr, D-Pal(3), D-Deh, D-Mbh, D-Bth tai 10 D-Pha; F on Leu tai Phe; G on Deh, Bth, Mbh tai Bha; ja J on D-AlaNl·^ tai GlyNl^.

Vielä edullisempia substituutiomalleja ovat sel-15 laiset, joissa A on N-Ac-D-Nal(2); B on D-pCl-Phe; C on D-Trp tai D-Pal(3); D on Tyr, Arg, Deh, Mbh, Bth tai Pha; 20 E on D-Trp, D-Pal(3), D-Tyr, D-Deh, D-Mbh, D-Bth tai D-Pha; F on Leu; G on Deh, Mbh, Bth tai Pha; ja J on D-AlaNH2.

- - 25 Tähän edullisempaan ryhmään kuuluu kolme edullista • · alaryhmää: 1. Kun D on Tyr, E voi olla joko (a) jokin hydrofobisista ryhmistä D-Trp, D-Pal(3), ja D-Tyr, mutta edullisimmin D-Trp tai D-Pal(3); tai (b) jokin ryhmistä D-Deh, D-Mbh, 30 D-Bth ja D-Pha.

2. Kun D on Arg, E on jokin kohdassa 1(a) luetelluista hydrofobisista ryhmistä, edullisesti D-Tyr.

3. Kun D on Deh, Mbh, Bth tai Pha, E on edullisimmin D-Tyr tai D-Pal(3), mutta myös D-Trp on edullinen.

35 Kussakin edullisista alaryhmistä G on Deh, Mbh,

Bth tai Pha. Erityisen edullisia ovat Bth ja Deh ja edul- . lisin Deh.

> · 10 9, 326

Esimerkkejä edullisemmista substituutiomalleista ovat siis N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-C-Ser-Tyr-C-Leu-G-Pro-D-AlaNI^, jossa C on D-Trp tai D-Pal(3) ja G on Deh, Mbh, Bth tai Pha; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-C-Ser-Tyr-E-Leu-G-5 Pro-D-AlaNH2, jossa C on D-Trp tai D-Pal(3), E on D-Deh, D-Bth, D-Mbh tai D-Pha ja G on tässä kappaleessa esitetyn määritelmän mukaisen E:n L-muoto; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-C-Ser-Arg-E-Leu-G-Pro-D-AlaNH2, jossa C on D-Trp tai D-Pal(3), E on D-Trp, D-Pal(3) tai D-Tyr ja G on Deh, 10 Mbh, Bth tai Pha; ja N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-C-Ser-D-E-

Leu-G-Pro-D-AlaNH2, jossa C on D-Trp tai D-Pal(3), D ja G ovat kumpikin itsenäisesti Deh, Bth, Mbn tai Pha ja E on D-Tyr, D-Trp tai D-Pal(3).

Muita edullisia toteutusmuotoja ovat 15 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-E-Leu-G-Pro-D-Ala- ΝΗ2, jossa E on D-Trp tai D-Tyr ja G on Deh, Bth, Mbh tai Pha; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-C-Ser-D-E-Leu-G-Pro-D-AlaNH2, jossa D ja G ovat kumpikin itsenäisesti Deh, Bth, Mbh tai 20 Pha ja C ja E ovat kumpikin itsenäisesti D-Trp tai D-Pal(3); ja N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-G-Pro-D-AlaNH2, jossa G on Deh, Bth, Mbh tai Pha.

Esimerkkejä edullisista toteutusmuodoista ovat -25 seuraavat: • · N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; 30 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-

Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-35 Deh-Pro-D-AlaNI^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-

Bth-Pro-D-AlaNH0; • z n $2326 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phs-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; U_Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-

Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-

Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Mbh-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-3th-10 Leu-3th-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Pna-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; ^ N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Mbn-

Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-3th-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pha-20 Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-T rp-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pa1(3)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-

Leu-Deh-Pro-D-AlaNH^; 35 92326 12 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-

Lsu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N_Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Tyr-Leu-Den-Pro-D-AlaNH2; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-T rp-Ser-Arg-D-Tyr-

Leu-öth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Tyr-Leu-MDh-Pro-D-AlaNH2; r>4_Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Ty ΓΙΟ Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Tyr-

Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Tyr-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; 15 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Tyr-

Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal (3 )-Ser-Arg-D-Tyr-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Deh-D-Tyr-Leu-20 Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Mbh-D-Tyr-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Bth-D-Tyr-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; 25 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Pha-D-Tyr-Leu-

Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Deh-D-T rp-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Mbh-D-Trp-Leu-30 Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Bth-D-Trp-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Pha-D-Trp-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; 35 13 92326 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phs-D-Pal(3)-Ser-Deh-D-Pal(3)-Le'J-Deh-Pro-D-AlaNh2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Pne-D-Pal(3)-Ser-Mbn-D-Pal(3)-Leu-MDh-Pro-U-AlaNH2; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-3th-D-Pal(3)-

Leu-3th-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pha-D-Pal(3)-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; M-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Deh-D-Nal(2)-10 Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Mbh-D-Nal(2)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-T rp-Ser-3th-D-Nal(2)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; 15 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-T rp-Ser-Pha-D-Nal(2)-

Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)-D-Pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; .

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)-20 D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)- D-Pal(3)-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)- D-Pal(3)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; 25 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Mbh-Leu- 3tn-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Mbh-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-30 Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Pl^e-D-Trp-SeΓ-Tyr-D-TΓp-

Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; -35 92326 14 N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-

Leu-3th-Pro-D-rtlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Den-

Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-T rp-Ser-Tyr-D-Bth-

Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Den-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-3th-10 Leu-3th-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal (2)-D-pF-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-T rp-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-Leu-3th-Pro-D-AlaNH2; 15 N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Pal(3 )-Ser-Arg-D-Pal(3)-

Leu-3th-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-

Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-T rp-Ser-Deh-D-Tyr-Leu-20 Deh-Pro-D-AlaNH2; and N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Trp-Ser-Bth-D-Tyr-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2.

Tämän keksinnön piiriin kuuluu myös peptidejä,jotka eivät välttämättä kuulu edellä mainittuihin edullisiin rytmiin, kuten 25 esimerkiksi seuraavat: N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-T rp-Ser-Tyr-D-Tyr-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Tyr-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; 30 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Tyr-

Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Tyr-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-35 D-Nal(2)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; « · > • » 92326 15 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Nal(2)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNI^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Nal(2)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNI^; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Na-(2)-

Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-aMe,pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-Leu-Btn-Pro-D-AlaNi^; N-Ac-D-Nal(2)-D-aMe,pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-10 Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-aMe,pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Glu(AA)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; 15 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-

Glu(AA)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Glu(AA) -Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2 ? N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-20 Pal(3)-Leu-HArg(CH2CF2CF3)-Pro-D-AlaNH2; ja N-Ac-D-Nal(2)-Dpg-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Nal(2)-Bth-Pro-D-AlaNH2.

On yleensä edullista, että A-, B-, C-, E- ja J-amlnohappotähde ovat D-isomeerin muodossa ja että D-, F-.25 ja G-aminohappotähde ovat L-isomeerin muodossa. Stereoke- • m mla tulee käsittää tällaiseksi, ellei sitä ole toisenlaiseksi erikseen mainittu.

Kaikissa edellä mainituissa toteutusmuodoissa yhdiste voidaan valmistaa myös vastaavan farmaseuttisesti 30 hyväksyttävän suolan muodossa.

Tämän keksinnön mukaisilla yhdisteillä ja erityisesti niiden suoloilla on yllättävän voimakas ja pitkään kestävä LHRH-antagonistinen aktiivisuus.

9 L o 16 LHRH-antagonismin voimakkuuden ensisijainen mitta on kyky estää ovulaatiota rotilla, mikä määritetään A. Corbinin ja C.W. Beattien menetelmällä (Endocrine Res. Commun. 2 (1975) 1).

5 Kyky saada aikaan histamiinin vapautuminen rotan peritoneaalisista syöttösoluista in vitro voidaan määrittää tavalla, jonka ovat esittäneet Sydbom ja Terenius (Agents and Action 16 (1985) 269) tai Siraganian et ai. (Manual of Clinical Immunology, 2. painos, toim. N.E.

10 Rose ja M. Friedman, Amer. Soc. Microbiol., Washington, D.C., 1980, s. 808).

Muita biologisia testejä, joita voidaan käyttää LHRH:n antagonistien ja tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden tutkimiseen, ovat 15 (a) LHRH:n aiheuttaman FSH:n ja LH:n vapautumisen inhi- bitio rotalla in vivo (J.A. Vilchez-Martinez et ai., Endocrinology 96 (1975) 1130); (b) aivolisäkkeen etulohkon solujen dispersioviljelmän aikaansaama LH:n ja FSH:n vapautumisen inhibitio radio- 20 immunologisesti mitattuna (W. Vale et ai., Endocrinology 91 (1972) 562); ja (c) gonadotropiinitasojen alentaminen kastroidulla rotalla ja koiralla (Petrie et ai., Male Contraception, Harper and Row, Philadelphia, 1985, s. 361).

25 Antagonistiset vaikutukset ja käyttömahdollisuudet Tässä kuvattujen yhdisteiden antagonistisesta vaikutuksesta johtuvat seuraavat käyttömahdollisuudet: - hedelmöityksen ehkäisy naarailla, - ovulaation esto tai viivytys, 30 - hedelmöityksen ehkäisy uroksilla, - diagnostiset käyttömahdollisuudet, kuten osteoporoosin diagnosointi, - muut käyttömahdollisuudet, joita on esitetty artikkelissa B. H. Vickery, Endocrine Reviews 7 (1986) 115.

Il 17 92326

Sovellettaessa tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä esim. ovulaation estoon halutulle kohteelle annetaan vaikuttava määrä tämän keksinnön mukaista yhdistettä tai sitä sisältävää koostumusta. Nämä yhdisteet tai koostumuk-5 set voidaan antaa eri tavoilla sen mukaan, mikä on tarkka käyttötarkoitus, mm. suun kautta, parenteraalisesti (mikä käsittää ihonalaisen, lihaksensisäisen ja laskimonsisäi-sen annon), emättimen kautta (erityisesti hedelmöityksen ehkäisyn tapauksessa), peräsuolen kautta, bukkaalisesti 10 (kuten esimerkiksi kielen alle), ihon läpi tai nenän kautta. Sopivin tie kussakin eri tapauksessa riippuu käyttötarkoituksesta, kulloisestakin vaikuttavasta aineosasta ja kohteesta. Yhdiste tai koostumus voidaan antaa myös säännöstellysti käyttäen vaikuttavaa aineosaa va-15 pauttavia depotistute- tai ruiskeformuloita, joita kuvataan tarkemmin jäljempänä.

Mitä edellä esitettyihin käyttötarkoituksiin tulee, vaikuttavaa aineosaa on yleensä tarkoituksenmukaista antaa noin 0,001 - 5 mg/ruumiinpaino-kg. Ihmisille ainet-20 ta annetaan edullisesti noin 0,01-1 mg/kg/vuorokausi ja eläimille noin 0,1-1 mg/kg/vuorokausi. Tämä antaminen voi tapahtua yhdellä kertaa, jakamalla annos useaan antoerään tai vaikuttavaa aineosaa hitaasti vapauttavassa muodossa tehokkaimpien tulosten saavuttamiseksi. Kun kysymyksessä 25 on kiiman tai tiineyden ehkäisy eläimillä, annos on edul- • · lisimmin noin 1-10 mg/kg ja se annetaan yhtenä annoksena.

Parenteraalinen anto edellyttää yleensä pienempää annostusta kuin muut antomenetelmät, jotka ovat enemmän imeytymisestä riippuvaisia.

30 Keksintö koskee myös koostumuksia, jotka sisältä vät vaikuttavana aineosana tämän keksinnön mukaista yh- ♦ distettä, joka on sekoitettu johonkin fysiologisesti hyväksyttävään myrkyttömään kantajaan. Kuten edellä on mainittu, sellaiset koostumukset voidaan valmistaa käytettä- I · 18 92326 viksi parenteraaliseen (ihonalaiseen, lihaksensisäiseen tai laskimonsisäiseen) antamiseen erityisesti nestemäisten liuosten ja suspensioiden muodossa; käytettäviksi emättimen tai peräsuolen kautta antamiseen erityisesti 5 puolikiinteissä muodoissa, kuten esimerkiksi voiteina ja peräpuikkoina; käytettäviksi suun kautta tai bukkaalises-ti antamiseen erityisesti tablettien tai kapselien muodossa; tai käytettäviksi nenän kautta erityisesti pulve-reiden, nenätippojen tai aerosolien muodossa.

10 Koostumukset voidaan antaa kätevästi yksikköannos- muodossa ja voidaan valmistaa millä tahansa niistä menetelmistä, jotka ovat farmasian alalla tunnettuja ja joita esimerkiksi kuvataan teoksessa Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsyl-15 vania, 1970. Parenteraalisesti annettaviksi tarkoitetut formulat voivat sisältää tavanomaisia täyteaineita, esimerkiksi steriiliä vettä tai fysiologista suolaliuosta, alkyleeniglykoleja, kuten propyleeniglykolia, polyalky-leeniglykoleja, kuten polyetyleeniglykolia, kasviperäisiä 20 öljyjä, hydrattuja naftaleeneja sekä vastaavia. Emättimen tai peräsuolen kautta annettaviksi tarkoitetut formulat, esimerkiksi peräpuikot, voivat sisältää täyteaineina esimerkiksi polyalkyleeniglykoleja, vaseliinia, kaakaovoita ja vastaavia. Nenän kautta annettaviksi tarkoitetut for-25 mulat voivat olla kiinteitä ja sisältää täyteaineina esi- · merkiksi laktoosia ja dekstraania tai olla vesi- tai öl-jyliuoksia, jotka on tarkoitettu annettaviksi nenätippojen tai annostellun suihkeen muodossa. Bukkaalisissa an-tomuodoissa tyypillisiä täyteaineita ovat sokerit, kal-30 siumstearaatti, magnesiumstearaatti, esigelatinoitu tärkkelys ja vastaavat.

Tämän keksinnön mukaisten nona- ja dekapeptidien antaminen nenän kautta on erityisen edullista. Imeytymistä nenän limakalvon läpi parantavat pinta-aktiiviset ha- 19

O o 7 O L

y l o^o pot, kuten esimerkiksi glykokoolihappo, koolihappo, tau-rokoolihappo, kolaanihappo, etokoolihappo, deoksikooli-happo, kenodeoksikoolihappo, dehydrokoolihappo ja glyko-deoksikoolihappo.

5 LHRH:n antagonistia sisältävään liuos- tai jauhe- formulaan voidaan lisätä yhtä tai useampaa pinta-aktiivista happoa tai suolaa mutta edullisesti yhtä fysiologisesti hyväksyttävää happosuolaa. Sopivia fysiologisesti hyväksyttäviä pinta-aktiivisia suoloja ovat suolat, joita 10 käytettäessä peptidin parantunut imeytyminen samoin kuin yhdisteen pinta-aktiiviset ominaisuudet säilyvät ja jotka eivät ole kohteelle vahingollisia tai muista syistä soveltumattomia. Sellaisia suoloja ovat esimerkiksi epäorgaanisista emäksistä saatavat suolat, mm. natrium-, ka-15 lium-, litium-, ammonium-, kalsium-, magnesium-, alumiini-, rauta(III)- ja magnaani(III)suolat sekä vastaavat. Erityisen edullisia ovat ammonium-, kalium-, natrium-, kalsium- ja magnesiumsuolat. Fysiologisesti hyväksyttävistä myrkyttömistä orgaanisista emäksistä saatavia suo-20 loja ovat primaaristen, sekundaaristen ja tertiaaristen amiinien, substituoitujen amiinien (luonnossa esiintyvät substituoidut amiinit mukaan luettuina), syklisten amiinien ja emäksisten ioninvaihtohartsien, kuten esimerkiksi isopropyyliamiinin, trimetyyliamiinin, dietyyliamiinin, 25 trietyyliamiinin, tripropyyliamiinin, etanolamiinin, 2- I · dimetyyliaminoetanolin, 2-dietyyliaminoetanolin, tromet-amiinin, disykloheksyyliamiinin, lysiinin, arginiinin, histidiinin, kofeiinin, prokaiinin, hydrabamiinin, kolii-nin, betaiinin, etyleenidiamiinin, glykosamiinin, metyy-30 liglukamiinin, teobromiinin, puriinien, piperatsiinin, piperidiinin, N-etyylipiperidiinin, polyamiinihartsien sekä muiden vastaavien, suolat. Erityisen edullisia myrkyttömiä orgaanisia emäksiä ovat isopropyyliamiini, di-etyyliamiini, etanolamiini, trometamiini, disykloheksyy-35 liamiini, koliini ja kofeiini. 1 · 20 9'/ ό i 6

Vielä edullisemmin tämän keksinnön käytännön sovellutuksissa käytettävä pinta-aktiivinen aine on glyko-koolihapon alkalimetallisuola, edullisimmin natriumglyko-kolaatti.

5 Pinta-aktiivista ainetta käytetään tämän keksin nön käytännön sovellutuksissa sellaisena määränä, että se parantaa LHRH-peptidien imeytymistä enemmän kuin muut pinta-aktiiviset aineet, jotka saattavat parantaa peptidien imeytymistä jossakin määrin. On havaittu, että usein 10 sellainen määrä on 0,2-15 % (massa/tilavuus), vielä useammin 0,2-5 % (massa/tilavuus) liuoksesta. Pinta-aktiivista ainetta on edullista olla mukana noin 0,5-4 % (massa/tilavuus), mielellään noin 1 % (massa/tilavuus) ja edullisesti noin 2 % (massa/tilavuus).

15 Näihin formuloihin voidaan lisätä muitakin ainei ta, kuten esimerkiksi säilymistä parantavia aineita, suoloja kudosta vastaavan elektrolyyttipitoisuuden saavuttamiseksi sekä muita lisäaineita, jotka ovat nenän kautta annettaviksi tarkoitettujen formuloiden kemiassa tunnet-20 tuja. Erityisen edullisia sellaisia muita aineita ovat pinta-aktiiviset aineet, edullisesti ionittomat pinta-aktiiviset aineet, kuten polysorbaatit, 0,1-5 %:n (massa/tilavuus), vielä edullisemmin 0,25-2 %:n (massa/tilavuus ), pitoisuuksina.

25 On havaittu, että paremman liukenevuuden ja sta- • 1 biilisuuden saavuttamiseksi sappihapon ja peptidin mooli-suhteen on tarkoituksenmukaista olla vähintään 20:1, esimerkiksi ainakin 25:1.

Tämän keksinnön mukaiset yhdisteet on erityisen 30 toivottavaa vapauttaa kohteeseen pitkän ajanjakson aikana, esimerkiksi viikosta vuoteen vaihtelevan ajanjakson aikana yhdestä ainoasta antamisesta. Voidaan käyttää hyväksi erilaisia hitaasti vaikuttavaa ainetta vapauttavia depotistutteita tai ruiskeina annosteltavia muotoja. An-35 nostusmuoto voi esimerkiksi sisältää yhdisteen fysiologi- 2

II

2 * · 21 c\ Γ . · Λ S’

S L·^ lQ

sestl hyväksyttävää myrkytöntä suolaa, jonka liukoisuus ruumiin nesteisiin on pieni, esimerkiksi (a) moniemäksi-sen hapon, kuten fosforihapon, rikkihapon, sitruunahapon, viinihapon, parkkihapon, pamonihapon, algiinihapon, poly-5 glutamiinihapon, naftaleenimono- tai -disulfonihappojen, polygalakturonihapon tai vastaavan, muodostamaa happoad-ditiosuolaa; (b) moniarvoisten metallikationin, kuten sinkin, kalsiumin, vismutin, bariumin, magnesiumin, alumiinin, kuparin, 10 koboltin, nikkelin, kadmiumin tai vastaavan, tai esimer kiksi N,N'-dibentsyylietyleenidiamiinista tai etyleeni-diamiinista muodostuneen orgaanisen kationin muodostamaa suolaa; tai (c) yhdistelmää, joka koostuu (a):sta ja (b):stä, esimer- 15 kiksi sinkkitannaattisuolaa.

Lisäksi tämän keksinnön mukaiset yhdisteet tai edullisesti, niiden suhteellisen liukenemattomat suolat, kuten esimerkiksi juuri edellä esitetyt suolat, voidaan formuloida ruiskeina annettavaksi soveltuvaksi geeliksi, 20 esimerkiksi alumiinimonostearaattigeeliksi seesamiöljyä käyttäen. Erityisen edullisia suoloja ovat sinkkisuolat, sinkkitannaattisuolat, pamoaattisuolat ja vastaavat.

Erästä toista tyyppiä oleva hitaasti vaikuttavaa ainetta vapauttava depotformula, joka soveltuu annettavaksi ruis-... 25 keina tai istutettavaksi kudokseen, voisi sisältää yhdistettä tai sen suolaa dispergoituna tai kapseloituna hitaasti hajoavaan, myrkyttömään, ei-antigeeniseen polymeeriin, kuten esimerkiksi polymaitohappo-polyglykolihappo-polymeeriin. Yhdisteet tai, edullisesti, niiden suhteel-30 lisen liukenemattomat suolat, kuten esimerkiksi edellä esitetyt suolat, voidaan myös formuloida kolesterolimat-riksipelleteiksi tai silastomeerimatriksi-istutteiksi tai hydrogeeli- tai huokoskapseleiksi, erityisesti silloin, kun niitä on tarkoitus käyttää eläimillä. Muut hitaasti 35 vaikuttavaa ainetta vapauttavat depotistute- ja ruiske- • · « 92326 22 formulat, esimerkiksi liposomit, ovat alan kirjallisuudessa hyvin tunnettuja. Viitataan esimerkiksi teokseen Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, toim. J.R. Robinson, Marcel Dekker, Inc., New York, 5 1978. Erityisesti LHRH-tyyppisten yhdisteiden lähteeksi voidaan todeta esimerkiksi US-patenttijulkaisu 4 010 125. Tutustukaa myös C.C. Pittin artikkeliin "The controlled delivery of polypeptides including LHRH analogs" teoksessa LHRH and its Analogs: Contraceptive and Therapeutic 10 Applications, Part 2, toim. B.H. Vickery ja J.J. Nestor, Jr., MTP Press, Boston, 1987, s. 557.

Peptidien syntetisointi Tämän keksinnön mukaisia polypeptidejä voidaan syntetisoida peptidi-alaan perehtyneille tutuin menette-15 lytavoin. Erinomainen yhteenveto monista sellaisista käyttökelpoisista menettelytavoista on löydettävissä teoksista J.M. Stewart ja J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969 ja J. Meienhofer, Hormonal Prosteins and Peptides, osa 2, Aca-20 demic Press, New York, 1973, s. 46, kun kysymyksessä on peptidien kiinteä-faasisynteesi, ja teoksesta E. Schroder ja K. Lubke, The Peptides, osa 1, Academic Press, New York, 1865, kun kysymyksessä on klassinen liuossynteesi.

Yleensä nämä menetelmät käsittävät yhden tai .. 25 useamman aminohapon tai sopivalla tavalla substituoidun aminohapon liittämisen peräkkäin kasvavaan peptidiket-juun. Normaalisti joko ensimmäisen aminohapon aminoryhmä tai karboksyyliryhmä suojataan sopivalla suojausryhmällä. Suojattu tai johdannaisekseen muunnettu aminohappo voi-30 daan sitten joko kiinnittää inerttiin kiinteään kantajaan tai käyttää hyväksi liuoksena liittämällä järjestyksessä seuraava aminohappo, jossa vapaa ryhmä (amino- tai karboksyyliryhmä) on sopivalla tavalla suojattu, amidisidok-sen muodostamiseen soveltuvissa olosuhteissa. Sen jälkeen 35 tästä vastaliitetystä aminohappotähteestä poistetaan suo- 92326 23 jausryhmä, ja sitten liitetään seuraava (sopivalla tavalla suojattu) aminohappo jne. Sen jälkeen kun kaikki aminohapot on liitetty oikeassa järjestyksessä, kaikki jäljellä olevat suojausryhmät (ja mahdollinen kiinteä kan-5 taja) poistetaan peräkkäin tai samanaikaisesti, jolloin saadaan lopullinen polypeptidi. Muuntamalla tätä yleistä menettelyä yksinkertaisella tavalla on mahdollista lisätä kasvavaan ketjuun enemmän kuin yksi aminohappo kerrallaan, esimerkiksi liittämällä toisiinsa suojattu tripep-10 tidi ja sopivalla tavalla suojattu dipeptidi (sellaisissa olosuhteissa, että asymmetriakeskukset eivät rasemisoi-du), jolloin muodostuu suojausten poiston jälkeen penta-peptidi.

Synteesin edullisia toteutustapoja 15 Eräs erityisen edullinen menetelmä tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi sisältää kiinteä-faasipeptidisynteesin.

Tässä erityisen edullisessa menetelmässä aminohappojen funktionaalinen α-aminoryhmä suojataan happo- tai 20 emäsherkällä ryhmällä. Sellaisten suojausryhmien tulisi olla ominaisuuksiltaan stabiileja peptidisidosten muodos-tusolosuhteissa ja samalla helposti poistettavissa hajottamatta kasvavaa peptidiketjua tai rasemisoimatta mitään sen sisältämistä asymmetriakeskuksista. Sopivia suojaus-.. 25 ryhmiä ovat t-butyloksikarbonyyli (Boc), bentsyloksikar-bonyyli (Cbz), bifenyyli-isopropyloksikarbonyyli, t-amy-loksikarbonyyli, isobornyloksikarbonyyli, a,a-dimetyyli- 3,5-dimetoksibentsyloksikarbonyyli, o-nitrofenyylisulfe-nyyli, 2-syaani-t-butyloksikarbonyyli, 9-fluorenyylimety-30 loksikarbonyyli ja vastaavat, erityisesti t-butyloksikar- .: bonyyli.

Erityisen edullisia ryhmiä sivuketjujen suojaukseen ovat arginiinin tapauksessa nitro, p-tolueenisulfo-nyyli, 4-metoksibentseenisulfonyyli, Cbz, Boc ja adaman- 35 tyloksikarbonyyli; tyrosiinin tapauksessa bentsyyli, o- bromibentsyloksikarbonyyli, 2,6-diklooribentsyyli, iso- 24 propyyli, sykloheksyyli, syklopentyyli ja asetyyli; seriinin tapauksessa bentsyyli ja tetrahydropyranyyli; sekä histidiinin tapauksessa bentsyyli, p-tolueenisulfo-nyyli ja 2,4-dinitrofenyyli.

5 C-terminaalinen aminohappo kiinnitetään sopivaan kiinteään kantajaan. Sopivia kiinteitä kantajia, joita voidaan käyttää edellä esitetyssä synteesissä, ovat sellaiset aineet, jotka ovat inerttejä vaiheittaisten kon-densaatiosuojauksenpoistoreaktioiden reagensseille ja 10 olosuhteille ja jotka eivät liukene käytettäviin väliaineisiin. Sopivia kiinteitä kantajia ovat kloorimetyyli-polystyreeni-divinyylibentseenipolymeeri, hydroksimetyy-lipolystyreeni-divinyylibentseenipolymeeri ja vastaavat, erityisesti kloorimetyylipolystyreenistä ja 1 %:ista divi-15 nyylibentseeniä koostuva polymeeri. Siinä erikoistapauksessa, että yhdisteen C-terminaalinen tähde on glysiin-amidi, yksi erityisen käyttökelpoinen kantaja on bents-hydryyliaminopolystyreeni-divinyylibentseenipolymeeri, jota kuvaavat P. Rivaille et ai., Helv. Chim. Acta 54 20 (1971) 2772. Kiinnitys kloorimetyylipolystyreeni-divi- nyylibentseenityyppiseen hartsiin toteutetaan antamalla —suojatun amihohapon, erityisesti Boc-aminohapon reagoida cesium-, trimetyyliammonium-, trietyyliammonium-tai 1,5-diatsabisyklo,^4.4.07undek-5-eenisuolanaan tai 25 muuna samankaltaisena suolana etanolissa, asetonitriilis-sä, Ν,Ν-dimetyyliformamidissa (DMF) tai vastaavassa, erityisesti cesiumsuolana DMF:ssä, kloorimetyylihartsin kanssa korotetussa lämpötilassa, esimerkiksi noin 40-60°C: ssa, edullisesti noin 50°C:ssa, noin 12-48 tuntia, edul-30 lisesti noin 24 tuntia. N°^-Boc-aminohappo kiinnitetään ·· bentshydryyliamiinihartsiin N,N'-di-isopropyylikarbodi- imidin (DIC)/1-hydroksibentsotriatsolin (HBT) välittämän, noin 2-24 tuntia, edullisesti noin 12 tuntia, kestävän kytkentäreaktion avulla jossakin liuottimessa, kuten di-35 kloorimetaanissa tai DMF:ssä, edullisesti dikloorimetaa- 25 92326 nissa, noin 10-50°C:n, edullisesti 25°C:n, lämpötilassa. Peräkkäisten suojattujen aminohappojen liittäminen voidaan toteuttaa automaattisessa polypeptidien synte-tisointilaitteessa, joka on alalla tunnettu. N^-suojaus-5 ryhmien poisto voidaan toteuttaa esimerkiksi trifluori-etikkahapon metyleenikloridiliuoksella, vetykloridin di-oksaaniliuoksella, vetykloridin etikkahappoliuoksella tai jollakin muulla vahvan hapon liuoksella, edullisesti 50 %:isella trifluorietikkahapon dikloorimetaaniliuok-10 sella, suunnilleen ympäristön lämpötilassa. Kutakin suojattua aminohappoa lisätään edullisesti suunnilleen 2,5-kertaisesti ylimäärin ja liittäminen voidaan toteuttaa dikloorimetaanissa, dikloorimetaani-DMF-seoksessa tai vastaavassa,erityisesti dikloorimetaanissa, suunnilleen 15 ympäristön lämpötilassa. Kytkentäaine on normaalisti DCC dikloorimetaanissa mutta voi olla myös N, N*-di-isopropyy-likarbodi-imidi (DIC) tai muu karbodi-imidi joko yksinään tai yhdessä HBT:n, N-hydroksisukkinimidin, muun N-hydroksi-imidin tai oksiimin kanssa. Vaihtoehtoisesti 20 voidaan käyttää suojattuja aminohappojen aktiivisia es-tereitä (esim. nitrofenyyli- ja pentafluorifenyylieste-riä ja vastaavia) tai symmetrisiä anhydridejä.

Kiinteätaasisynteesin lopussa täydellisesti suojattu polypeptidi irrotetaan hartsista. Polypeptidin ja • · • 25 hartsikantajän välisen sidoksen ollessa bentsyyliesteri- tyyppiä lohkaisu toteutetaan aminolyysillä, joka suoritetaan peptidien, jotka sisältävät C-terminaalisena aminohappona proliinin, tapauksessa alkyyliamiinilla tai fluorialkyyliamiinilla, tai aminolyysillä, joka suori-30 tetaan peptidien, jotka sisältävät C-terminaalisena ami- * nohappona glysiinin, tapauksessa esimerkiksi ammoniakki-metanoli- tai ammoniakki-etanoliyhdistelmällä, noin 10-50°C:n, edullisesti noin 25°C:n, lämpötilassa reaktio-ajan ollessa noin 12-24 tuntia, edullisesti noin 18 tun- 35 tia. Vaihtoehtoisesti peptidi voidaan irrottaa hartsista ' · 92326 26 transesteröinnin avulla, jota suoritetaan esimerkiksi metanolilla ja jota seuraa aminolyysi. Suojattu peptidi voidaan tässä vaiheessa puhdistaa silikageelikromatogra-fian avulla. Sivuketjuja suojaavien ryhmien poisto poly-5 peptidistä toteutetaan käsittelemällä aminolyysituote esimerkiksi vedettömällä nestemäisellä vetyfluoridilla anisolin tai jonkin muun karboniumakseptorin ollessa mukana, vetyfluoridipyridiinikompleksilla tai tris(trifluo-riasetyyli)boorilla ja trifluorietikkahapolla, pelkistäkö mällä se vedyllä palladium-hiili- tai palladium-polyvi-nyylipyrrolidonikatalysaattorin ollessa mukana tai pelkistämällä se natriumilla nestemäisessä ammoniakissa, edullisesti nestemäisellä vetyfluoridilla ja anisolilla noin -10 - +10°C:n, edullisesti noin 0°C:n, lämpötilas-15 sa käsittelyäjän ollessa noin 15 minuutista 1 tuntiin, edullisesti noin 30 minuuttia. Kun kysymyksessä ovat glysiiniterminaaliset aminohapot bentshydryyliamiini-hartseilla, hartsin lohkaisu ja suojauksen poisto voidaan yhdistää yhdeksi ainoaksi vaiheeksi, jossa käyte-20 tään hyväksi nestemäistä vetyfluoridia ja anisolia kuten edellä on kuvattu. Polypeptidi, josta suojaukset on poistettu täydellisesti, puhdistetaan sitten kromatografisten vaiheiden sarjalla, jossa käytetään jotakin tai kaikkia seuraavista vaihetyypeistä: ioninvaihtokromato-\ 25 grafia-asetaattimuodossa olevalla heikosti emäksisellä hartsilla; hydrofobinen adsorptiokromatografia derivati-soimattomalla polystyreenidivinyylibentseenihartsilla (esimerkiksi Amberlite XAD:llä); silikageeliadsorptio-kromatografia; ioninvaihtokromatografia karboksimetyyli-30 selluloosalla; partitiokromatografia, esimerkiksi Sep-hadex G-25 vastavirtadistribuutio; ja suuren erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC), erityisesti käänteis-faasi-HPLC käyttäen kolonnin sidottu faasi - täytteenä oktyyli- tai oktadekyylisilyylisilikaa.

35 Käytettäessä 1-, 2-, 3- tai 6-asemassa raseemista aminohappoa diastereomeeriset nonapeptidi- tai dekapep- 27 qo 7 9 c y i. sj ί. d tidilopputuotteet erotetaan ja haluttu peptidi, joka sisältää asianmukaisessa asemassa D-aminohapon, eristetään ja puhdistetaan, edullisesti edellä mainitun kromatografisen prosessin aikana.

5 Peptideinä, jotka sisältävät C-terminaalisen atsa- glysiiniamidin, valmistus toteutetaan edullisesti klassista peptidien liuossyntetisointia ja tunnettuja pepti-divälituotteita käyttäen. Tätä kuvataan yksityiskohtaisemmin esimerkissä 3.

10 Kaavan (I) mukaisia yhdisteitä ja niiden fysiolo gisesti hyväksyttäviä suoloja valmistetaan yleisesti siten, että suojatusta polypeptidistä poistetaan suojaryh-mät ja mahdollisesti kovalenttisesti sitoutunut kiinteä kantaja, kaavan (I) mukaisen yhdisteen tai sen suolan ai- 15 kaansaamiseksi; tai kaksi halutun, kaavan (I) mukaisen yhdisteen fragmenttia liitetään yhteen vaadittavaan järjestykseen; tai (a) kaavan (I) mukainen yhdiste muunnetaan fysiologisesti hyväksyttäväksi suolakseen; 20 (b) kaavaa (I) mukaisen yhdisteen suola muunnetaan fysio logisesti hyväksyttäväksi suolaksi tai (c) kaavan (I) mukaisen yhdisteen suola muunnetaan vapaaksi polypeptidiksi, jolla on kaava (I).

Seuraavat esimerkit on esitetty, jotta alan ammat-. 25 ti-ihmiset kykenevät saamaan paremman käsityksen keksinnöstä ja soveltamaan sitä käytännössä. Niitä ei tulisi käsittää keksinnön piiriä rajoittaviksi, vaan pelkästään keksintöä valaiseviksi ja kuvaaviksi.

Valmistus A

30 3-(2-naftyyli)-DL-alaniini 3-(2-naftyyli)-DL-alaniini valmistetaan US-patent-tijulkaisussa nro 4 341 767 esitetyllä menettelytavalla.

N-asetyyli-3-(2-naftyyli)-DL-alaniinin valmistus ja muuntaminen metyyli-N-asetyyli-3-(2-naftyyli)-DL-ala- 35 ninaatiksi sekä D-isomeerin erottaminen toteutetaan US- 92326 28 patenttijulkaisussa nro 4 341 767 esitetyllä menettelytavalla.

Valmistus B

Bentsyyli-N^-bentsyloksikarbonyyli-NfN'-guanidinodi-5 isopropyyli-D-homoargininaattitolueenisulfonaatti

Seokseen, joka sisälsi 5,24 g bentsyyli-N°°-bentsyl-karbonyyli-D-lysinaattitolueenisulfonaattia (B. Bezus ja L. Zervas, J. Am. Soc . 83 (1961) 719) ja 1,72 ml di-iso-propyylietyyliamiinia 60 mlrssa dioksaania, lisättiin 10 1,89 g N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidiä. Reaktioseosta sekoitettiin 100°C:ssa 6 tuntia, ja se jäähdytettiin huoneen lämpötilaan ja haihdutettiin, jolloin saatiin kiinteä aine. Kiintoaine suspendoitiin 20 ml:aan lämmintä DMF:ä, suspensio suodatettiin N,N'-di-isopropyyliurean 15 poistamiseksi ja suodos haihdutettiin, jolloin saatiin kiinteä aine. Bentsyyli-Nc^'-bentsyloksikarbonyyli-N,N'-guanidinodi-isopropyyli-D-homoargininaattitolueenisulfo-naatti saatiin valkoisena kiinteänä aineena kiteyttämällä se metanoli-etyyliasetaattiseoksesta; 20 /o£7d = “7,26° (c = 0,3, MeOH).

Vastaavasti käyttämällä edellä kuvattua menettelytapaa mutta vaihtamalla N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidin tilalle N,N1-disykloheksyylikarbodi-imidi; N,N'-di-(n-heksyyli)-karbodi-imidi? *'25 N ,N' -dietyylikarbodi-imidi; N,N'-di-(n-propyyli)-karbodi-imidi? N-isopropyylikarbodi-imidi; N-propyylikarbodi-imidi; N-(n-butyyli)-karbodi-imidi? . 30 N,N'-di-(n-butyyli)-karbodi-imidi; : Ν,Ν'-di-isobutyylikarbodi-imidi? N,N'-di-(n-pentyyli)-karbodi-imidi; N,N1-di-isopentyylikarbodi-imidi; N,N1-difenyylikarbodi-imidi; 35 N,N'-ditolyylikarbodi-imidi tai 92326 29

1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidihydro-kloridi tai vastaava saadaan bentsyyli-N °^-bentsyloksi-karbonyyli-Ν,Ν'-guanidinodisykloheksyyli-D-homoargini-naattia, = 8,07° (c = 0,9, MeOH) , bentsyyli-N

5 bentsyloksikarbonyyli-N,N'-guanidinodietyyli-D-homoargi-ninaattia, bentsyyli-N -bentsyloksikarbonyyli-N-N'-gua-nidinodi-(n-propyyli)-D-homoargininaattia, ~ 8,07° (c = 0,9, MeOH), bentsyyli-N*·-bentsyloksikarbonyyli-N-guanidino-(n-propyyli)-D-homoargininaattia, 10 bentsyyli-N*-bentsyloksikarbonyyli-N-guanidino-(n-butyy- li)-D-homoargininaattia, bentsyyli-N * -bentsyloksikarbonyyli-N,N'-guanidinodi-(n-butyyli)-D-homoargininaattia, bentsyyli-N* -bentsyloksikarbonyyli-N,N-guanidinodi-iso-15 butyyli-D-homoargininaattia, bentsyyli-N*-bentsyloksikarbonyyli-N,N'-guanidinodi-(n-pentyyli)-D-homoargininaattia, bentsyyli-N* -bentsyloksikarbonyyli-N,N'-guanidinodifenyy-li-D-homoargininaattia, 20 bentsyyli-N *-bentsyloksikarbonyyli-N,N' -guanidinodimetyy- li-D-homoargininaattia, bentsyyli-N*-bentsyloksikarbonyyli-N,N'-guanidinodi-(n-heksyyli)-D-homoargininaattia ja bentsyyli-N* -bentsyloksikarbonyyli-N,N1-guanidinodi-iso-: 25 propyyli-D-argininaattia, /jpQ-q = -10,5° (c = 0,5, MeOH), bentseenisulfonaattisuoloinaan. Vastaavasti korvaamalla D-lysinaatti bentsyyli-N *-bentsyloksikarbonyyli-D-orni-tinaatilla voidaan saada aikaan vastaavia arginiinianalo-geja tolueenisulfonaattisuoloinaan.

30 Valmistus C

^^ Q|

Bentsyyli-N -bentsyloksikarbonyyli-N ,N -eteno-D-homoargininaatti

Seokseen, joka sisälsi 15 ml tolueenia ja 15 ml t-BuOH:ta, lisättiin 2,71 g bentsyyli-N*-bentsyloksikar-35 bonyylilysinaattia ja 1,46 g 2-metyylitio-imidatsoliini- 30 92326 hydrojodidia (saatavissa Aldrichilta). Seoksen pH säädettiin suunnilleen arvoon 8 di-isopropyylietyyliamiinia lisäämällä, ja liuosta refluksoitiin 24 tuntia.

Liuos väkevöitiin alipaineessa, ja jäännös pakat-5 tiin silikageelipylvääseen (250 mg). Pylväs eluoitiin käyttäen C^C^-MeOH-seosgradienttia suhteesta 19:1 suhteeseen 7:3. Tuotetta sisältävät jakeet tunnistettiin TLC:n avulla, yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 2,9 g valkoista vaahtoa.

10 2 gin erä edellä mainittua tuotetta liuotettiin 50 ml:aan EtOH:ta, joka sisälsi 0,8 g katalysaattoria, joka sisälsi 10 % Pd:a hiilikantoaineella. Liuosta sekoitettiin Η2,·η alla 8 tuntia. Seos suodatettiin seliitin (piimään) läpi ja suodos haihdutettiin kuiviin, jolloin G G1 15 saatiin 1,2 g N ,N -etanohomoarginiinia valkoisena vaah tona.

Samalla tavoin mutta käyttämällä guanylointiaineena S-metyyli-3,4,5,6-tetrahydro-2-pyrimidiinitiolia (Aldrich) G G1 saatiin N ,N -propanohomoarginiinia valkoisena vaahtona.

20 Vastaavasti mutta käyttämällä guanylointiaineena S-metyylibis-(2,2,2-trifluorietyyli)-tiouroniumjodidia G G1 saatiin N ,N -bis-(trifluorietyyli)-homoarginiinia (Bth) valkoisena vaahtona.

Valmistus D

25 Ν'** -t-butyloksikarbonyyli-N ,N ’ -guanidinodi-iso- propyyli-D-homoarginiinitolueenisulfonaatti Tämä valmistusesimerkki valaisee N,N'-guanidinodi-substituoitujen D-homoarginiinien valmistamista tolueeni-sulfonaattiesiasteistaan.

30 Seosta, joka sisälsi bentsyyli-N^-bentsyloksikar- : bonyyli-N,N'-guanidinodi-isopropyyli-D-homoargininaatti- tolueenisulfonaattia (3,25 g) ja 100 mg katalysaattoria, joka sisälsi 10 % Pd:a hiilikantoaineella, 50 ml:ssa jääetikkaa, käsiteltiin vetykaasulla ilmakehän paineessa 35 4 tuntia. Katalysaattori erotettiin suodattamalla seos

II

31 ο Λ o c )? <- o l 6 seliitin läpi, ja suodos haihdutettiin, jolloin saatiin kiinteätä N,N’-guanidinodi-isopropyyli-D-homoarginiinito-lueenisulfonaattia. Liuokseen, joka sisälsi tätä yhdistettä (2,13 g) 60 ml:ssa dioksaani-vesiseosta (1:1), lisät-5 tiin 10 ml IN natriumhydroksidia ja 0,4 g magnesiumoksidia. Sen jälkeen tähän seokseen lisättiin 1,1 g di-(t-butyv-li)-dikarbonaattia, ja sitä sekoitettiin huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Magnesiumsuola erotettiin suodattamalla ja suodos väkevöitiin alipaineessa. Emäksinen liuos pes-10 tiin etanolilla, ja sen jälkeen sen pH säädettiin arvoon 2,5 natriumsulfaatilla. Hapan vesiliuos uutettiin etyyliasetaatilla, ja etyyliasetaattiliuos kuivattiin magnesium-sulfaatilla. Kuivausaine poistettiin suodattamalla, ja suodos haihdutettiin. Kiteytys etyyliasetaatti-heksaani-15 seoksesta tuotti tulokseksi -t-butyloksikarbonyyli-N,N1 -guanidinodi-isopropyyli-D-homoarginiinitolueenisulfonaat-tia.

Menettelemällä samalla tavalla mutta käyttämällä asianmukaisia tolueenisulfonaattiesiasteita voidaan val-20 mistaa muita Ν°ί-t-butyloksikarbonyyli-N,N'-guanidinodi-substituoituja D-homoarginiini- tai D-arginiiniyhdistei-tä.

Valmistus E

N^-t-butyloksikarbonyyli-3-/4'-(1'-propyylipipe-• 25 ridyyli)y-D-alaniini 400 ml:aan absoluuttista etanolia lisättiin 4,6 g natriummetallia ja seosta kuumennettiin. Tulokseksi saatuun natriumetoksidiliuokseen lisättiin 21,.7 g dietyyli-(asetamidomalonaattia) ja 16,4 g 4-pikolyylikloridihydro-. 30 kloridia (Aldrich Chemical Co). Reaktioseosta kuumennettiin 100°C:ssa 4 tuntia, ja se jäähdytettiin, suodatettiin ja väkevöitiin alipaineessa. Seos siirrettiin sili-kageelipylvääseen metyleenikloridi-metanoliseoksessa (19:1) , ja eluointi suoritettiin samalla seoksella. Tuo-35 te paikallistettiin nopeasti liikkuvaksi UV-positiivisek- « 32 92326 si täpläksi silikageeliohutkerroskromatogrammissa (eluent-tina metyleenikloridi-metanoliseos suhteessa 19:1). Yhdistetyt jakeet väkevöitiin, jolloin saatiin tuote.

Edellisen kappaleen mukainen tuote liuotettiin 200 5 ml:aan etanolia, ja tätä liuosta käsiteltiin liuoksella, joka sisälsi 2,72 g natriumhydroksidia 40 ml:ssa vettä, 50°C:ssa 6 tuntia. Liuos tehtiin happamaksi 12 ml :11a 6 N HCl:ä, se haihdutettiin kuiviin, ja jäännös sekoitettiin 200 ml:aan dioksaania. Suspensio suodatettiin, ja 10 suodosta refluksoitiin 2 tuntia. Liuos jäähdytettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin etyyli-N^Casetyyli-3-(4-pyridyyli)-DL-alaniinia valkoisena kiinteänä aineena.

Osa tästä N-asetyyliesteristä liuotettiin uudelleen käsittelemällä sitä 200 ml :11a subtilisiini Carls-15 bergia (Sigma Chem. Co., Proteaasi VIII) seoksessa joka sisälsi 300 ml dimetyylisulfoksidia ja 400 ml 0,01 M KCl, (pH 7,2). 6 tunnin kuluttua uudelleen liukeneminen oli täydellistä. Liuos laimennettiin 400 ml:11a vettä ja uutettiin neljällä 750 ml:n erällä etyyliasetaat-20 tia. Orgaaniset kerrokset yhdistettiin ja kuivattiin mag nesiumsulfaatilla sekä väkevöitiin, jolloin saatiin etyyli -N ^ -asetyyli-3-(4-pyridyyli)-3-alaninaattia öljynä.

öljyn annettiin 1,22 g:n kanssa n-propyylibromi-dia 50 ml:ssa etanolia, minkä jälkeen liuos haihdutettiin 25 kuiviin, jolloin saatiin etyyli-N0^-asetyyli-3-(1-propyy- lipyridinium-4-yyli)-D-alaninaattibromidia valkoisena hygroskooppisena kiintoaineena.

Tämä valkoinen kiinteä aine liuotettiin 200 ml:aan etanolia ja pelkistettiin vetyatmosfäärissä käyttäen ka-30 talysaattorina 100 mg yhdistelmää, joka sisälsi 10 % Pd:a hiilikantoaineellaö 18 tunnin pelkistyksen jälkeen katalysaattori erotettiin suodattamalla ja liuos haihdutettiin, jolloin saatiin etyyli-N"^ -asetyyli-3-/4'-(1'-propyyli-piperidyyli^-D-alaninaattia kullanruskeana kiinteänä 35 aineena. Vapaa happo valmistettiin refluksoimalla etyyli-

II

33 92326 esteriä 100 ml:ssa 6 H HCl:ä 4 tuntia, jolloin saatiin 3- /4 1 - (1' -piperidyyli)_7-D-alaniinia valkoisena kiinteänä aineena.

Vapaa happo liuotettiin 100 ml:aan dioksaani-vesi-5 seosta (1:1), ja liuokseen lisättiin 2 g di-(t-butyyli)-dikarbonaattia. pH pidettiin 9:nä pH-staatilla 1 N NaOH: ta lisäämällä. Kahden tunnin kuluttua reaktioseos väke-vöitiin alipaineessa ja pestiin 100 ml :11a etyylieette-riä, ja vesikerros siirrettiin Amberlite XAD-2 hartsi-10 pylvääseen (hydrofobinen hartsi). Pylväs eluoitiin 250 ml :11a vettä ja sen jälkeen 250 ml:lla etanoli-vesiseosta (1:1). Etanolieluaatit yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin N -t-butyloksikarbonyyli-3-/41 -(1'-propyylipiperidyyli)7-D-alaniinia valkoisena kiinteä-15 nä aineena.

Menettelemällä samalla tavalla mutta korvaamalla 4- pikolyylikloridihydrokloridi 3-pikolyylikloridihydro-kloridilla saadaan valmistetuksi -t-butyloksikarbo-nyyli-3-^3' - (1' -propyylipiperididyyli)_7-D-alaniinia.

20 Valmistus F

Boc-Gly-O-hartsi 4,9 g Boc-glysiiniä liuotettiin seokseen, joka sisälsi 50 ml etanolia ja 50 ml tislattua vettä. Liuoksen pH säädettiin arvoon 7 cesiumvetykarbonaatin vesi-.·. 25 liuoksella. Liuotin haihdutettiin sitten alipaineessa.

Sen jälkeen kun jäännöstä oli kuivattu 18 tuntia suuressa alipaineessa, se liuotettiin 150 ml:aan kuivaa DMF:ä. Liuokseen lisättiin 25 g kloorimetyloitua poly-styreenihartsia, joka sisälsi 1 % divinyylibentseeniä 30 (Merrifield# 25 mmol:a kloridia vastaava). Seosta ravis-!: tettiin 50°C:ssa 24 tuntia, se suodatettiin, ja hartsi pestiin sen jälkeen peräkkäin DMFillä, vedellä ja etanolilla. Hartsia kuivattiin alipaineessa 3 vuorokautta, jolloin saatiin 28,34 g Boc-Gly-O-hartsia.

34 9 2 3 2 6

Valmistus G

A. S-metyyli-3,4,5,6-tetrahydro-2-pyrimidiini- tiolihydrojodidi

Liuokseen, joka sisälsi 23,24 g 3,4,5,6-tetrahydro-5 2-pyrimidiinitiolia 175 ml:ssa MeOH:ta, lisättiin 15,57 ml Mel:tä, ja seosta refluksoitiin 1,5 tuntia. Liuotin haihdutettiin alipaineessa ja jäännös suspendoitiin di-etyylieetteriin. Sakka erotettiin suodattamalla ja kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin 51,4 g S-metyyli-10 3,4,5,6-tetrahydro-2-pyrimidiinitiolia valkoisina kiteinä.

B. N^-t-butyloksikarbonyyli-N ,N -propeno-L-ho- moarginiini S-metyyli-3,4,5,6-tetrahydro-2-pyrimidiinitioli saatiin 51,4 g:sta HI-suolaansa suorittamalla partitio 15 CH2Cl2:n (300 ml) ja 4 N NaOH:n (50 ml) kesken. Tulokseksi saatu CH2Cl2-liuos väkevöitiin noin 100 ml:n tilavuuteen, ja siihen lisättiin noin 100 ml EtOHrta. S-me-tyyli-3,4,5,6-tetrahydro-2-pyrimidiinitioliliuos lisättiin pisaroittain 60°C:ssa liuokseen, joka sisälsi 24 g 20 lysiinihydrokloridia 66 ml:ssa 2 N NaOH:ta. Sekoittamista jatkettiin yön yli 60°C:ssa typen alla. 10,78 g lisää HI-suolaa hajotettiin 15 ml:11a 4 N NaOH:ta, uutettiin 90 %:sella CH2Cl2:lla ja lisättiin pisaroittain ja sekoittaen toiset 24 tuntia 60°C:ssa, jona aikana reaktio : 25 meni suurin piirtein loppuun.

Reaktioseos pestiin kahdella EtOAc-erällä, ja Pha:ta sisältävä vesikerros laimennettiin 200 ml:11a dioksaania ja 200 ml:11a vettä. Liuos jäähdytettiin 0°C: seen, ennen kuin siihen lisättiin 33 mg di(t-butyyli)-30 dikarbonaattia ja 6 g MgO:ta. 4 g:n lisäerä MgO:ta ja 22 g:n lisäerä di-(t-butyyli)-dikarbonaattia saivat reaktion menemään loppuun.

MgO erotettiin suodattamalla seliitin läpi, ja suodos väkevöitiin alipaineessa puoleen tilavuudestaan.

35 Jäännös pestiin kahdesti dietyylieetterillä ennen siir-

II

35 92326 tämistä silikageelipylvääseen (750 g silikageeliä, joka oli pakattu pylvääseen CH^CNissä). Pylväs pestiin 5 litralla CH^CN:. ja eluoitiin CH^CNrllä, joka sisälsi 10 % vettä (yht. 2 litraa), ja edelleen CH^CNtllä, joka sisäl-5 si 20 % vettä (yht. 5 litraa). Tuotejakeet paikallistettiin ohutkerroskromatografisesti silikageelilevyillä (CH^CN-HOAc-I^O-seos suhteessa 4:1:1). Tuotejakeet yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 5,0 g tuotetta O 2 5 valkoisena vaahtona, jonka sulamispiste oli 96°C ja 10 = 16,1° (c = 0,54, MeOH), ja lisäksi 15 g lievästi epä puhdasta öljyä.

Samalla tavalla mutta käyttämällä asianmukaisia S-metyyli-N,N1-dialkyylitiouroniumhydrojodideja saadaan vastaavia N4*-t-butyloksikarbonyyli-N ,N -dialkyylihomo-15 arginiineja.

Esimerkki 1 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-hArg(CH2CF3)2~ D-Tyr-Leu-hArg (CI^CF^) 2~Pro-D-Ala-NH2 Otsikon mukainen yhdiste on esitetty tässä seli-20 tyksessä myös N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Bth- D-Tyr-Leu-Bth-Pro-D-Ala-NH2:na.

Beckman 990 Peptide Synthesizer-laitteen reaktio-astiaan laitettiin 0,758 g (0,5 mmol) bentshydryyliamino-polystyreenihartsia (Peninsula Labs., 0,66 mmol/g).

25 Ensimmäinen aminohappo liitettiin lisäämällä 0,284 g

Boc-D-Ala-OH:ta, 0,202 g Hbt:t. ja 3 ml 0,5 M di-iso-propyylikarbodi-imidiä. 3 tunnin liitäntäjakson ja hartsin pesun jälkeen tähän hartsiin lisättiin peräkkäin muut aminohapot synteesiohjelman mukaisesti seuraavasti: 30 Vaihe 1 CH2CL2-pesu kerran 1,5 min 2 suojauksen poisto CF^C^H-CI^C^-seoksella (1:1) kerran 1,5 min 3 suojauksen poisto cf3co2h-ch2ci2- 35 seoksella (1,1) kerran 30 min 36 ^2326 4 C^C^-pesu kolmesti 1,5 min 5 trietyyliamiini-CJ^C^-seos (1:1) kahdesti 1,5 min 6 CH2Cl2-pesu kolmesti 1,5 min 7 N -Roc-aminohappo liuotettuna 5 C^C^-DMF-seokseen (1:1) kerran lisäys 8 N,N'-di-isopropyylikarbodi- imidiliuos (0,5 M) kerran lisäys 9 Cl^C^-huuhtelu ja -säilytys, liitäntä kerran liitäntä- 10 reaktio 2 tuntia 10 CH2Cl2-huuhtelu kerran 1,5 min 11 CH2Cl2-pesu kolmesti 1,5 min 12 etanolipesu kolmesti 1,5 min 15 13 CHjC^-pesu kolmesti 1,5 min

Vaiheet 1-13 päättävät yhden aminohapon liitäntä-syklin, ja reaktion loppuunmeno voidaan tarkistaa nin-hydriinimenetelmällä /E. Kaiser et ai., Anal. Biochem.

34 (1970) 595J.

20 Hartsiin liitettiin aminohappoja peräkkäin käyt täen 2,0-3,0 -kertaista moolista ylimäärää kutakin suojattua aminohappoa sekä DIC:tä. Hartsi käsiteltiin peräkkäisten liitäntäsyklien aikana 0,269 g:11a Boc-Pro-OH:ta, 25 0,610 g:11a Boc-Bth-OH:ta, 0,311 g:11a Boc-Leu-OH*H20:ta, 0,375 g:11a Boc-D-Tyr-OH:ta, 0,610 g:11a Boc-Bth-OH:ta, 0,380 g:11a Boc-Ser(bentsyyli)-OH:ta, ; 30 0,320 g:11a Boc-D-Pal(3)-OH:ta, 0,390 g:11a Boc-D-pCl-Phe-OH:ta, 0,400 g:11a Boc-D-Nal(2)-OH:ta ja 2,5 ml:11a etikkahappoanhydridiä.

Hartsi poistettiin reaktioastiasta, pestiin C^C^: 35 Ha ja kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin 1,43 g » ·

II

92326 37 suojattua polypeptidi-hartsiyhdistelmää. Peptidistä poistettiin suojaukset, ja se irrotettiin hartsista käsittelemällä yhdistelmää 25 ml :11a vedetöntä nestemäistä HF:. 2,5 ml:n anisolia (akseptori) läsnä ollessa Kel-5 F-reaktioastiassa 0°C:ssa 1 tunti, HF haihdutettiin ali paineessa, jäljelle jäänyt N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal (3)-Ser-hArg(CG2CF3)2-D-Tyr-Leu-hArg(CH2CF3)2~Pro-D-Ala-NH2 (HF-suolanaan) pestiin eetterillä. Jäännös uutettiin sitten jääetikalla (3 x 30 ml). Etikkahappouuttoliuos 10 haihdutettiin kuiviin. Puhdistamaton aine muunnettiin asetaattisuolaksi laskemalla se vedessä asetaattimuotoon muunnetun AG3-pylvään (heikosti emäksinen tertiaarinen amiinihartsi läpi. Eluaatin kylmäkuivaus tuotti tulokseksi 0,5 g puhdistamatonta peptidin asetaattisuolaa 15 valkoisena kiinteänä aineena.

Epäpuhdas peptidi puhdistettiin HPLC:n avulla Licroprep RP-18-pylväässä (25,40^um), jonka koko oli 2,5 x 100 cm ja joka oli saatettu tasapainoon 0,1 % CF3C02:ta CH2CN-H20-seoksessa (1:1) sisältävällä pusku-20 rilla (pH 2,5). UV-valoa absorboiva (280 nm) päähuippu, joka eluoitui siinä vaiheessa, kun pylväästä oli saatu noin 2 kertaa pylväin tilavuus eluaattia, kerättiin talteen ja haihdutettiin kuiviin sekä kylmäkuivattiin kolmesti tislatusta vedestä, jolloin saatiin 64 mg puh-25 dasta N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-hArg(CG2CF3)2- D-Tyr-Leu-hArg(CH2CF3)2-Pro-D-Ala-NH2:ta, foCj^5 = -17,96° (c = 0,4, HOAc).

B. Menettelemällä samalla tavalla mutta käyttämällä mainittujen aminohappojen tilalla asianmukaista .30 A-, B-, C-, D-, E-, F-, G- ja J-aminohappoa valmistet tiin vastaavat dekapeptidit, joista on annettu esimerkkejä alla: 38 9/326 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal (3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Mbh-D-Pal(3)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)- D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pa 1(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-Leu-Deb-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)- 10 Leu-3tb-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal (2)-D-pCl-Pbe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Mbb-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal (3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; 15 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-

Leu-3tb-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-Ls'J-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Pbe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-20 Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-T rp-Ser-Arg-D-Trp-Leu-Pna-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-Leu-Pba-Pro-D-AlaNH2; *25 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-T rp-Ser-Tyr-D-Btb-

Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Pna-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Deh-;.30 Leu-Den-Pro-D-AlaNH2; and : N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-3th-

Leu-Bth-Pro-D-AlaNH^.

C. Menettelemällä samalla tavalla mutta korvaamalla 35 mainitut aminohapot asianmukaisella A-, B-, C-, D-, E-, . F-, G- ja J-aminohapolla saadaan valmistetuksi vastaa vat dekapeptidit, joista on annettu esimerkkejä alla: li 92326 39 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-MPh-Pro-D-AlaNH^; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-

Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; W_Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phs-O-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Deh-Pro-D-AlaNh^; N-Ac-D-Nal (2)-D-pCl-Pne-D-Trp-Ser-Tyr-D-i*lbn-Leu-Moh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Mbh-Leu-Mbh-Prc-D-Ala NH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal (3)-Ser-Tyr-D-Pha-^ Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Pbe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-Leu-Nbh-Prc-D-Ala NH2; N-Ac-D-Nal(2) -D-pCl-Phe-D-Pal (3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-Leu-Bth-Prc-D-AlaNH2; 2o N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg- D-Pal (3)-Leu-Mbn-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Tyr-

Lsu-Den-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Tyr-25 Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; : N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Tyr-

Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Tyr-

Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; 30 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Tyr-

Leu-Bth-Prc-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Tyr-Leu-Mbh-Prc-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Tyr-35 Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; Q o 3 9 6

40 st-OLO

,M-Ac-D-NaK2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-TyΓιε u -Ph a- Pro -D- Ala ΝΗ 2 ; N-Ac-D-Nai (2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Deh-D-Tyr-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Mbh-D-Tyr-Leu-

Mbh-Pro-D-AlaNH9; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Stn-O-Tyr-Leu-3tn-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-ϋ-Na1(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-5er-Pna-D-Tyr-Leu- 10

Pha-Pro-D-AlaNH^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-T rp-Ser-Dsh-D-T rp-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Mbh-D-Trp-Leu-1 Mbn-Pro-D-AlaNH^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-3th-D-Trp-Leu-

Btn-Pro-D-AlaNH^; N-Ac-D-Nai(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Pha-D-Trp-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH^; 2Q N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Deh-D-Pal(3)-

Leu-Deh-Pro-D-AlaNH^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Mbh-D-Pal(3)-

Leu-Mbh-Pro-D-AlaNr^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-3th-D-Pal(3)-«25 Leu-Bth-Pro-D-AlaNh^; N-Ac-D-Nai(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pha-D-Pal(3)-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nai(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-3er-Deh-D-Nal(2)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2*j 2q N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Moh-D-Nal(2)- *: Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-3th-D-Nal(2)-Leu-3th-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Pha-D-Nal(2)-35 Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; li « 52326 N-Ac-D-Nai(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)-D-Pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N_Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Psl(3)-Ser-Pal(3)-D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)- D-Pal(3)-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N_Ac-D-Nal(2)-0-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)- 0-3al(3)-Leu-MDn-Pro-D-AlaNH2.

Esimerkki 2 10 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-hArg(CH2CF3)2~ D-Tyr-Leu-hArg(CH2CF2)2~Pro-NHet C-terminaalisen Pro-NHCH2CH2:n sisältävien analogien syntetisoinnissa käytettiin esimerkissä 1 kuvatun synteesiohjelman kanssa identtistä ohjelmaa. Beckman 990-15 syntetisointilaitteen reaktioastiaan laitettiin 0,71 g

Boc-Pro-O-hartsia, joka oli valmistettu antamalla 1,3 kertaisen moolisen ylimäärän kuivaa Boc-Pro-OH:n cesiumsuo-laa reagoida 1 % divinyylibentseeniä sisältävän kloori-metyylipolystyreenihartsin (Lab Systems, Inc.) kanssa.

20 Käytetty määrä Boc-Pro-O-hartsia sisälsi 0,5 mmol proliinia.

Hartsiin liitettiin aminohappoja peräkkäin käyttäen 2,0-3,0-kertaista moolista ylimäärää kutakin suojattua aminohappoa sekä DIC:tä. Hartsin annettiin siis reagoida peräkkäisten liitäntäsyklien aikana : '25 0,610 g:n kanssa Boc-Bth-OH:ta, 0,311 g:n kanssa Boc-Leu-0H*H20:ta, 0,375 g:n kanssa Boc-D-Tyr-OH:ta, 0,610 g:n kanssa Boc-Bth-OH:ta, 0,380 g:n kanssa Boc-Ser(bentsyyli)-OH:ta, .:30 0,320 g:n kanssa Boc-D-Pal (3)-OH:ta, 0,390 g:n kanssa Boc-D-pCl-Phe-OH:ta, 0,400 ml:n kanssa Boc-D-Nal(2)-OH:ta ja 2.5 ml:n kanssa etikkahappoanhydridiä.

Hartsi poistettiin reaktioastiasta, pestiin 35 CH2Cl2:lla ja kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin 1.5 g suojattua polypeptidi-hartsiyhdistelmää.

92326 42 lyysillä, joka toteutettiin 25 ml :11a etyyliamiinia 2°C: ssa reaktioajan ollessa 18 tuntia. Etyyliamiinin annettiin haihtua, ja hartsi uutettiin metanolilla. Metanoli haihdutettiin, 2,5 ml:n kanssa anisolia ja 25 ml:n kans-5 sa uudelleen tislattua (CoF^JSta) vedetöntä nestemäistä HF:ä Kel-F-reaktioastiassa 0°C:ssa 1 tunti. HF haihdutettiin alipaineessa, ja jäännös pestiin eetterillä. Jäännös liuotettiin 2 M etikkahappoon ja muunnettiin asetaattisuo-laksi laskemalla se vedessä asetaattimuotoon muunnetun 10 AC3-pylvään läpi. Eluaatin kylmäkuivaus tuotti tulokseksi 0,5 g puhdistamatonta peptidin asetaattisuolaa valkoisena kiinteänä aineena. Lopullinen puhdistus toteutettiin HPLC-pylväässä, jonka koko oli 2,5 x 100 mm ja joka sisälsi 40-50^,um:n oktadekyylisilyloitua silikaa (Merck, Lichro-15 prep C-^g), käyttäen eluenttina 50-%:sta CHgCNrä (0,1 % CFgCC^Hita). Tuotteen kylmäkuivaus vedestä tuotti tulokseksi 70 mg N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-hArg-(CH2CF2-D-Tyr-Leu-hArg (Cf^CF^ 2-ProNHEt :tä valkoisena jauheena.

20 Menettelemällä samalla tavalla mutta käyttämällä vaadittavia suojattuja aminohappoja saadaan valmistetuksi seuraavat yhdisteet: N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-NHEt, *;25 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-

Mbh-Pro-NHEt, N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Pha-Pro-NHEt, N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-30 Deh-Pro-NHEt, • N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Nal(2)-Leu- 3th-Pro-NHEt.

Toistettaessa edellä esitetty lohkaisu ja korvat-^ taessa etyyliamiini stökiometrisella määrällä metyyli- _ ·« 43

Q07 o £ s /--J LO

tai propyyliamiinia saadaan vastaavia edellä mainittujen nonapeptidien metyyli- tai propyyliamideja.

Esimerkki 3

Yhdisteitä, jotka vastaavat kaavaa (I), voidaan 5 valmistaa myös klassisella liuossynteesillä.

Esimerkiksi kahden pentapeptidifragmentin yhteen liittämisessä voidaan käyttää seuraavaa menettelytapaa: N_Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe- 3oc-Den-Leu-Den-Pro-D-Ala-NH 2 10 D-?al(3)-Ser-Tyr-QMe (1) (2) — V — H-D-Deh-Leu-Deh-Pro-D-Ala-Ny 'f N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-15 D-PalC3)-5er-Tyr-N3

V

H-D-Deh-

Leu-Deh-Pro-AzaGlyNH2 (3) 'f N-Ac-D-Nai(2)-D-p-Cl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Oeh-Pro-D-Ala-NH? 20 *

Erillisten fragmenttien liittäminen yhteen voidaan toteuttaa asyyliatsidimenetelmällä (J. Honzel et ai.,

Coll. Czech. Chem. Commun. 26 (1971) 2333), DCC/HBT-lii-*.25 tännällä, difenyylifosforyyliatsidiliitännällä tai jolla kin muulla rasemisoimattomalla fragmenttien liitäntätek-niikalla. Yhdiste (2) voidaan valmistaa edellä esitetyllä tavalla, ja yhdiste (1) voidaan valmistaa esimerkissä 1 kuvatun kaltaisilla menetelmillä. Yhdiste (3) valmis-30 tetaan yhdisteestä (2) poistamalla Cbz hydraamalla, mitä.

« ί seuraa N-Boc-N,N*-guanidinodietyyli-D-homoarginiinin liit täminen DCC-HBT-yhdistelmää tai jotakin muuta, alalla tunnettua liitäntäainetta käyttäen.

Tällä tavalla yhteen liitettävät fragmentit ovat 35 usein peptidejä tai aminohappoja. Vaihtoehtoisesti N-ter- 92326 44 minaalinen nonapeptidi voidaan valmistaa kiinteäfaasi-tai liuosmenetelmällä ja liittää sen jälkeen alkyyliamii-niin tai semikarbatsidihydrokloridiin disykloheksyyli-karbodi-imidin ja hydroksibentsotriatsolin avulla tai 5 jollakin muulla liitäntämenetelmällä, jolloin saadaan vastaavan kaltaisia yhdisteitä.

Esimerkki 4

Suolojen valmistus A. Liuos, joka sisälsi 0,1 g (N-Ac-D-Nal(2)x, 10 D-pCl-Phe2, D-Pal(3)3,8, Btn8, D-Ala"^) LHRH :n vetyfluori-disuolaa (ts esimerkki 1) liuotettuna 50 ml:aan vettä, laskettiin pylvään läpi, joka sisälsi 50 g Dowex 3-anio-ninvaihtohartsia, joka oli saatettu tasapainoon aikaisemmin etikkahapolla ja pesty deionisoidulla vedellä.

15 Pylväs eluoitiin deionisoidulla vedellä ja eluaatti kylmä-kuivattiin, jolloin saatiin vastaavaa (N-Ac-D-Nal(2)^, 9 O C O T Λ D-pCl-Phe“, D-Pal(3) ' , Bth , D-Ala )LHRH:n etikkahappo- suolaa.

Toistettaessa edellä esitetty menettely mutta kor-20 vattaessa etikkahappo muilla hapoilla hartsin tasapainotuksessa voidaan valmistaa esimerkiksi vastaavia suolahapon, bromivetyhapon, rikkihapon, fosforihapon, typpihapon, bentsoehapon sekä muiden samankaltaisten happojen suoloja.

·* 25 Vastaavasti voidaan valmistaa muita LHRH:n kanssa analogisten peptidien, joita tässä selityksessä on esitetty, happoadditiosuoloja.

B. Suoloja, joiden vesiliukoisuus on heikko, voidaan valmistaa vedestä saostamalla haluttua happoa hyväk- , 30 si käyttäen. Esimerkiksi: » « ·· Sinkkitannaattisuola - Liuos, joka sisälsi 10 mg (N-Ac-D-

Nal (2)1, D-pCl-Phe2, D-Pal(3)3,6, Bth8, D-Ala10)LHRHrn etikkahapposuolaa 0,1 mlrssa vettä, käsiteltiin liuoksella, joka sisälsi 8 mg parkkihappoa 0,08 ml:ssa 0,25 M 35 NaOH:ta. LHRH-analogin liuokseen lisättiin välittömästi « _ · 92326 45 liuos, joka sisälsi 5 mg ZnSO^-7H20:ta 0,1 ml:ssa vettä.

Tulokseksi saatu suspensio laimennettiin 1 ml :11a vettä, ja sakka erotettiin sentrifugoimalla. Supernatant-ti poistettiin dekantoimalla, ja jäännös pestiin kahdesti 5 1 ml:n erillä vettä sentrifugoimalla sakka ja dekantoi malla supernatantti. Sakka kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin 15 mg edellä mainitun LHRH-analogin sinkki-tannaattisekasuolaa.

Pamoaattisuola — Liuokseen, joka sisälsi 50 mg 10 (N-Ac-D-Nal(2)1, D-pCl-Phe2, D-Pal(3)3'6, Bth8, D-Ala10)-LHRH:n etikkahapposuolaa seoksessa, joka sisälsi 1,6 ml etanolia ja 0,1 ml 0,25 M NaOH:ta, lisättiin liuos, joka sisälsi 11 mg pamonihappoa 0,3 ml:ssa 0,25 M NaOH:ta. Liuottimet poistettiin alennetussa paineessa, jäännös 15 suspendoitiin 2 ml:aan vettä, suspensio sentrifugoitiin, ja supernatantti dekantoitiin. Sakka pestiin 1,5 ml :11a vettä ja sentrifugoitiin, ja supernatantti dekantoitiin. Sakka kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin 54 mg edellä mainitun LHRH-analogin pamoaattisuolaa.

20 Samalla tavalla voidaan valmistaa muitakin suoloja, joiden vesiliukoisuus on heikko.

C. Happoadditiosuolan valmistus vapaasta peptidistä

Liuokseen joka sisälsi 50 mg (N-Ac-D-Nal(2)^, . 25 D-pCl-Phe2, D-Pal(3)3,6, Bth8, D-Ala10)LHRH:ta vapaana emäksenä, lisättiin 30 ml 1 N etikkahappoa. Tulokseksi saatu liuos kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 50 mg edellä mainitun LHRH-analogin etikkahapposuolaa.

Vastaavasti korvattaessa etikkahappo muilla hapoil-30 la (stökiometrisesti ekvivalenttisina määrinä suhteessa peptidiin) saadaan muita tässä selityksessä esitettyjen peptidien happoadditiosuoloja, esimerkiksi suolahapon, bromivetyhapon, rikkihapon, fosforihapon ja typpihapon suoloja.

35 D. Metallikationin muodostaman suolan, esimerkik si sinkkisuolan, valmistus : Liuokseen, joka sisälsi 50 mg (N-Ac-D-Nal(2) 46 9232 6 D-pCl-Phe2, D-Pal(3)3'6, Bth8, D-Ala10)LHRH:n etikkahap-posuolaa seoksessa, joka sisälsi 0,4 ml 0,25 M NaOH:ta, 0,3 ml vettä ja 1 ml etanolia, lisättiin liuos, joka si-5 sälsi 15 mg ZnSO^·71^0:ta 0,2 ml:ssa vettä. Sakka sentri-fugoitiin ja supernatantti erotettiin dekantoimalla. Sakka pestiin 1 ml:11a vettä sentrifugoimalla ja dekantoimalla supernatantti. Sakka kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin edellä mainitun LHRH-analogin sinkkisuolaa.

10 Samalla tavalla voidaan valmistaa suoloja muiden moniarvoisten kationien, esimerkiksi kalsiumin, vismutin, bariumin, magnesiumin, alumiinin, kuparin, koboltin, nikkelin, kadmiumin ja muiden samankaltaisten, kanssa.

Esimerkki 5 15 Suolojen muuntaminen vapaaksi emäkseksi

Liuos, joka sisälsi 50 mg (N-Ac-D-Nal(2)*, D-pCl-Phe2, D-Pal(3)3'6, Bth8, D-Ala10)LHRH:n etikkahap-posuolaa 25 ml:ssa vettä laskettiin pylvään läpi, joka sisälsi 50 g Dowex l:tä (voimakkaasti emäksinen ammonium- 20 anioninvaihtohartsi), joka oli tasapainotettu NaOH-liuok-sella hydroksidivastaionin aikaansaamiseksi. Pylväs elu-oitiin 150 ml:11a vettä, ja eluaatti kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 45 mg vastaavaa polypeptidiä vapaana emäksenä.

25 Muut tässä selityksessä esitettyjen peptidiyhdis- teiden happoadditiosuolat voidaan muuntaa vapaiksi emäksiksi vastaavalla tavalla.

Karakterisointitiedot

Edellä olevien esimerkkien mukaisesti valmistettu- 30 jen yhdisteiden karakterisointitiedot on esitetty taulu-koissa 1 ja 2: 92326 47 S D iZ<Z<<Z<< ~Ζ<<<Ζ*<Ζ<<<<ί<Ζ<<< ν' < c x if x Q . -

|0 _* — * — * * m — Φ x_ * -n* . o r- 7· r- ® mt (N o "M « cm <N O

u o ~ o ^ O* o O 6 o “ o o o' 6 O o o o o o o o o' o o O o ° ο°ο°ουθου °°οουυοοουοοοοοουου awCJ·*— Ow-W*-'^·'^-' β Ο O o 9 β 9 β β

Ow>ew09eeo —·» w ® <ρ ιΠ psj QvO“<rQn^«^^>''^ ϋ3 '«το νΟ ® Λ ν (Ν ^ J · · ^.S^iCSSSrNO^^rOCOO^^ ©CNjr^r^CNvor^infN - ο ο ο ^ ^ 1,,, , . .. . .

I (Ν®νΟΓ~Γ^<Νθι°*ί~ — — ίί — — ^

L — (VI — — _ _ ΓΜ ΓΜ — ΓΜ — — ΓμΓμ — ~ (N 'J· I I I I I I I I

0 I I I I I I I I I .......I I I I ......

Ε·Η 11 kssäsisks ssssssissssisssiss 11 gsssl^ii |iggigis|ssisi;isj * * * * * *

K X

x j£ X J x ¥ X

¥^ ϊο | | ¥=^¥x _l — x_l— XXX -J <=> -J g

o' — ¥ o' — — — ¥ X X o' OO _| X

X X— o _» — < © © —i er X Qi — — — — Q£ » KO- ~ « i--== X XX e < io o ^ x x x — < o — q«oo-)XX-j — i — — x -j _l X _J < I — < . —--— K _l — <Q<0 g — — X— io X <3 I® << OO X—O I « I — XO fs) o το ο .χχχχ— o n i ---_ _i o — o ® o < _j — — _J— *©0:ΧίΕα:<»'",*Ω©< % K> · I X © * X — O CD CM X _J X X I ® K> *“i I — ©e — __X®~®oK°^ ffj • Q£ © — * λ j — j I n λ ^03 ¢0 Q ^ ^ X X QJ ^ CM—*· % ^ < .

<1— < m KM — o — — . (NO . I C < I g g X —X (NOO _l e I -P

I _l O I INIlO - o o β M- ΓΜ ~ (NOO o — I O X X _J 3 O +- — — — O (fl O — — O — O — O— — ~ UJ X (N -t- (N . < 0_* J J - o ~ U (NO < * λ

, - o < . ιλΤι a - aa γμ w o x uj ~ ® i -® — — o — σ>_+-—_ >® U

i—i i— — i ffl u. x — < — — ·*-σ>— ο—ι^γμο® ("Ό o — σι I. σι uu aa— M

Φ O Ο ~ O o < I < < UJ L O) — Olli. —-___ ~—„ —_ 0i-< l. — — ' ,7 «

_ -C — · ΓΜ ΓΜ I Q I I — < U O) L U KTOO - NC«-<r<OI<®lll P

O Q_ < m -t-χ σιΟ »Oq oijc< i_<'Nu. κίγμΧ — — <£ «-c u ' ' Jk 1—1 _V »I · uj n [ «CO · « u. «2i^£XO — I »O » ^ O ιΛ K% r-( 75 O O IT> — ϋ < ® κβ®<ν0.2 .o(N(NO — ΙΙΟΟ KMiM 2 - — U. 2 Λ; ~ ·« oin|£/>^« n2«iO .O „ I f ~ en O O * Λ * ® rsi(j dj 3 CMJO — l_ C. » (M (M -Λ , ΓΊ — Ό —0)O0O>l. *_ «® — (Nyin — +-ΓΊ Jj

7 f K\3<<IT 4-13 K>0 4-— K^(N^wwl.<®® I03X< — (NUJX

72 uj— — ujömu. — uj οσι<£^· — ~®o ι_ υ,7"Χ.υ 3 wrM— « . — q <N*_cO uj 2 u i- j: «cn — rjww>. — iijpi-r Jj σι x our « wO>o>®TN-*-cnXXw .<< *«r( +-3Ϊ woQ.zri ® T.

•o l_Ol-0>u _ (.I.I.IIULOIO Oli' OllumOui- — W> p < <D

E-< <~<i>-e<<<Ow<uwL.oi««o»i*iXX < < λ n i f < ω £Οΐ£<ι.ιιΐΐ£ΪοΙ2<υι<ι.ιΐΜΛ ι_< οι οι σι £ j: >->~< i -c ~

I i- > -1« - - . OI L | 2 l.^< σισ>< - ι.ν.ι.ι i i i —i _ “ M

O < ® O o® I0®<o U<QI<I® tl- *O < < < O O » » * O

1 fO I Kl IO K| l<l JO Kl Kl 2 I IO . I ,ΙΛ - - - - «K1 K> · > » « IO I—I

—— — — λ Λ <—» KO -— — - (O K| io jo -- ·—< ΚΛ .IOJOjOKIIOKIIO· . ΙΛ- .-ΙΟ· *.τ'^* .* > IO n - - - - ^ 3

II; — K> wwwwwwwm»0 „ κι K\ |^ WK3 IO n - m « IO W w K> K3 OO (^1 w -P

JJ — a. — — — — — a. a. — _. a. ~ — 0.0.--0.0.0. - — — w ^ w — ^-1 »n QuaaQio*>aQuu<o — u — ct.^ - ouui-oo — — xx® rn

, 0-1— Q.CLxxCLQ-Xf-|_ ΧβΙ— ® Q_ t— 1-eQ.t-l— Η-χχΟΟββΟ. M

H I I I ((iTT t|||n_in.|l I Q_ I I I 'ιιαχΟ-ή-Ι. >1 ιτ-j OOOOooOOOqooioioQQ IOOOOoo I 1 · T o ζ\ zu ------------a *Q - * o'

44 «N NNNIMNNINNIVN .<N “(M ΓΜ ΓΜ -(N OI M M IM IM .»« -(N

Sh ΦΦΦΦφφβΦφφφφ(Μ φ (M φ φφΓΗ ΦΦΦΦΦΦΓΜΓΝ (N ΓΜ Φ --

ο.ο.ο.ο-ο.οΙο.ο.χχχχ^έ^έχα.ΛΟ.ο-ο-ο-χχ®®^^!!. C

j_2._i_2_t7_i__i__i_iiiS:^x^2__i_q-_i__i__i__i.' 2,0-0-^^- fO

oooöooööööööi!.ou-oööu-öcJoo3ou-uLo-u^o o p-p-p-f-p-p-p-p-p-f-p-p-p-p-p-p-p-p-p-p-f-p-f-p-p-p-p-p-p·?· a QOQQqqOQCI 3QCiQQQq0Q0QOQOqq0Ö^^^ — — ϋ — rx — — — — — — — — — — — — — — — — — — — e

OC<3CcO®OHJoeoeeec<0<jO«3C <3O<Jt0<0H)«3CC

UOUUgnUUOoguuUUOOOUUOoUouOÖ^U^

<<<<ii<<<iiMlii^<i<<<<<<i<i<<< O

n · I 1 I I < ' · I I I 1 1 1 I I II I '! · · 1 · · m

X zzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzz M

H “ “ “ “ — — — — “ — — — — — — _ — — — — — — — — — — — — JJ

C (tJ

I i

Xi Ocd — r- — σ^ίΟΡ-ο© — fN(NOCOCN(NOmm — comoQ^ rgp^r^vD— in,r'r/,'®p^^,t,n‘CN©fN— o— ^^OvOin^fnr-aoO·™’ Il - — ΐηιΛ-ι^ιΤ'ΟΟΟΝΟιΰιΟ-ίΟιΟ'ώ^Ο'β'β^^^ν^ν^ν^ Ό * u -i-^iOi^i«i=|x|x|r|-i|!£|x|s|2i|g|^|a|s:|s|K|s|?:|s|R|s|p;|«|^|^|Ä| 48

O O 7 9 A

W L. V

Taulukko 2 Aminohappoanalyysit 15 (RS-26334): Ser 0,96 (1); Pro 0,96 (1); Ala 0,98 (1); Leu 0,95 (1); Tyr 1,07 (1); Lys 5 0,09 (0); NH3 1,82 (1); Trp 2,12 (2); p-Cl-Phe 1.00 (1); hrtrg(CH2CF3 )2 0,89 (1); Nai(2 ) 1,09 (1).

21 (RS-26126): Ser 1,01 (1); Pro 0,99 (1); Ala 0,98 i n — (1); Leu 0,95 (1); Lys 0,20 (1); N H 3 1,27 (1); Arg 1,08 (1); Pal(3) 2,10 (2); p-Cl-Phe 1,11 (1); hArg(CH2CF3) 0,79 (1); Nai(2) 1,02 (1).

15 2_2 (RS-26906): Ser 1,03 (1); Pro 0,97 (1); Ala 0,98 (1); Leu 0,90 (1); NH3 2,25 (1); Trp 2.30 (2); Arg 1,12 (1); p-Cl-Phe 1,03 (1); hArg(CH2CF3)2 0,99 (1);

Nai(2) 1,12 (1).

20 r 31 (RS-64736): Ser 0,84 (1); Pro 0,89 (1); Ala 0,99 (1); Leu 1,01 (1); Lys 1,05 (1); ΝΗ? 0,91 (1); hArg(Et2) 1,04 (1); Pal(3) ; 25 2,42 (2); p-F-Phe 1,21 (1); Nal(2) 1,13 (1).

32 (RS-64802): Ser 0,92 (1); Pro 0,95 (1); Ala 1,01 (1); Leu 0,99 (1); Lys 1,01 (1); NH3 30 0,96 (1); hArg(Et2) 1,02 (1); Pal(3) 2.30 (2); p-F-Phe 1,15 (1); Nal(2) 0,96 (1).

39 (RS-12972): Ser 0,76 (1); Pro 1,06 (1); Ala 0,89 (1); Leu 1,04 (1) ; Tyr 1,07 (1); 35 p-Cl-Phe 1,17 (1); NH3 1,03 (1);

Pal(3 ) 2,10 (2); hArg(C2H5> . : CH2CF3) 1,66 (1); Nai(2) 1,14 (1).

Il

, .'· "7 S

49 yj/ο

Yhdisteiden biologinen aktiivisuus (a) Testosteronitasojen aleneminen Testosteronitasojen aleneminen mitattiin seuraavaa testausmenettelyä käyttäen: 5 Suoritettiin kaksi tutkimusta käyttäen toisessa 11 ja toisessa 13 täysikasvuista, urospuolista, intaktia be-aglekoiraa (iältään 1,5-6,5 vuotta, toimittaja Syntex, LRE, Ridglan tai White Eagle). Kullakin viikolla 6 viikon ajan eläimet jaettiin sattumanvaraisesti johonkin 11 tai 10 13 annosryhmästä (apuainetta tai erilaisia annoksia ku takin LHRH:n antagonistia) niin, että kuhunkin ryhmään tuli 6 koiraa. Ryhmään 1 kuuluneet saivat yhtenä ihonalaisena ruiskeena 0,1 ml apuainetta ruumiinpaino-kg:a kohden. Muihin ryhmiin kuuluneet eläimet saivat jäljem-15 pänä esitetyssä luettelossa 1 esitetyt annokset (^ug yh-distettä/0,1 ml:n ruisketilavuus/ruumiinpaino-kg). Apuaineena oli propyleeniglykolin ja fysiologisen suolaliuoksen seos suhteessa 1:1. Kultakin koiralta otettiin pään valtimon kautta juuri ennen ruiskeen antamista ja 30 mi-20 nuuttia sekä 1, 2, 4, 6, 8 ja 24 tuntia ruiskeen annon jäl keen noin 3 ml:n hepariinipitoinen verinäyte. Verinäytteen sijoitettiin välittömästi ottamisen jälkeen jäihin. Plasma erotettiin sentrifugoimalla ja imusuodattamalla 2 tun-. nin kuluessa ja säilytettiin -20°C:ssa ennen testoste- 25 ronitasojen RIA-määritystä.

Testosteronitasot mitattiin radioimmunologisella määrityksellä. Näiden kahden tukimuksen tulokset yhdistettiin, ja piirrettiin testosteronitasoja annostasojen funktiona kuvaava käyrä ID^-arvojen (annos, joka vaadi-‘30 taan testosteronitason alentamiseksi 50 %:iin maksimiar vostaan 8 tunnin aikana) saamiseksi. Nämä arvot on esitetty taulukossa 3, jossa on esitetty myös teho suhteessa LHRH:n standardiantagonistiin Detirelix (RS-68439).

50 'J'/ 3 /! ^

Luettelo 1 Annosryhmät

Tutkimus 1 (11 annosryhmää):

Ryhmä Yhdiste (RS-nro) Annos 1 Väliaine 2 RS-26306 0,06yg/0,Imi/kg 3 RS-26306 0,25yg/0,lml/kg 4 RS-26306 1,0yg/0,lml/kg 5 RS-26306 410yg/0,lnl/kg 6 RS-26306 16,0y3/0,lml/kg 7 RS-26723 0f06yg/0,Imi/kg 8 RS-26723 0,25yQ/0,lml/kg 9 RS-26723 1 fOyg/0,Imi/kg 10 RS-26723 4,Oyg/QfIml/kg 11 RS-26723 16;Oyg/ύ,lml/kg

Tutkimus 2 (13 annosryhmää)

Ryhmä Yhdiste (RS-nro) Annos 1 väliaine 2 RS-68439 (standardi) 0,25 yg/o, 1„,1/kg 3 RS-68439 (standardi) 1,0 Mg/0 lml/kg 4 RS-68439 (standardi) 4,0 yg/0 lml/kg : 5 RS-68439 (standardi) 16,0 yg/0'lml/kg 6 RS-15378 0,25 yg/g,lml/kg 7 RS-15378 1,0 yg/o,lml/kg 8 RS-15378 4,0 yg/o lml/kg 9 RS-15378 16,0 yg/0flml 10 RS'15678 °»2= yg/0,lml/kg 1' 11 RS-15678 1,0 yg/o,lml/kg 12 RS-15678 4,0 yg/oimi/kg 13 ftS-15678 »9/0,lml/kg 92326 51 c .3 α> ^ r* 00 5 ι ^ ^ ^ '2 Ο Ο <3* CNJ CO C0 Ε ·»· ·* ^ ·* ·% Ο) Ο <-Η Ο ,—I ΙΑ Γ- C -Η ·-— ν— -—^ ^ -— m -Ρ

Jl ·η σι ο1. οι σι CT e 5j -9 -*-*.*-* x. a c«| S s SS s * .^flc ^ m θ'-sr rs Ei UM-rH^ rsi (Λ _| O <—) -1-· W -H CO _ (öo P -S 05 -P * O M $ m

•h tn -p Pj ϋ 4J

C O m -K to

O U O) Q X S

l_i 3 M -U O tn Q) to lt» 5

P -P 3 Ä G -H

0) 0) O H H E

O to to m -P -* .* ^ ^ Λ i2 10 O 3 CO lA *”N '—- tl) E -P I tn ^ * · -h £ -P -H 3 -H I V w w ^ Λί M £ C\ _ 5 | .p -H S S 3 tn -C -d

_ <P ^ Έ: C> \ -° -C J= -C <r P

0E-li>Q24J^o CM H

> qSlOrH® Ό ® Λ Φ •h 3 to a) > -p -p ,* ro tn

to r-4 rH Q

S SvSuQ g iB^ua-s s tn Ό 'O Ό VO c 5 ^ Ή —< g to i I I I i Tl

•H iti I +J -P

> c tn tl) <a vo m ia vo -3 H $ S 3 JS ^ ° °1 “ 5 -Ρ ·5 ω ro 8 ° ° ° ° ° fj y «·ηεΞ^ m «5 δ I1 s C § 8 in 3 tn vo ** o“ x tn

5 SSSfl-'' "X X X 5 A

: 3 K T S C 3d" “> < e ^ i—i i—t e n P- ή K <T3 _ ro ro ro ro O p ro T CL X Q- O-^nro

Cn i— Q. _1 i rr I i d 2} ro -7 · t-—>qtq a i -h 4-* · t_) Ω ^-N «_!_·> ·* Q Tl rl ^ “ t· «O CM i—i CM CM ·> nj ro S N,. 5 N <1)0 Q)X QJ CO {§ <° $ (U X turo -Cn; n ^ >

_ 5J m?F, e H CL ro CL X x (M

3 3 V1 ^ =J Q- «i i^h i _ι I 4J ro ·· 3 1 q rC1 h i »—t « _r-> —i uj 12 § jg 3 ?Sro ^ ^ Γ *Q. "ct "ct .1 I 1 ϊ s d.* L" is

*1 (0 mT^a Jj Q Λ _J C

' “ s e»* ΰ s ΰ s ~«r- ϊ„· 1

2 -5 ® ? ’ro 2* ’ro *”cm ^ ^~cm II

O Li _ z 4J Zd zeZ-u z*j

Λί O 0) OvlbJrA I O CO | r O IU VO | sj O

3+)S t^QwCMQir^Qir^QCi oqw «η

h mi H <[ I CT Γ7 I _J VO 1 ^ ΓΑ 1 £T) ΓΑ 1 r-T) O

coopvou « m o IA o S vo Λ u «n Ό « « C^ «IA H 5iA -<«5« N «f e 3^1 ItJCIlCTliOi^lX I 1 r- Il ro x: tn cozi οηχ u tn z u <s> z: 1 vo χ 1

EhXOh CE^jQaC^eicCwjetOCi—>_j q;. ,q K

92326 52 (b) Histamiinin vapautusvaikutus ja ovulaation vastainen vaikutus

Seuraavia menettelytapoja käyttäen vertailtiin tyypillisten tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden histamii-5 ninvapautusvaikutusta ja ovulaation vastaista vaikutusta.

1. Histamiinin vapautustutkimus

Kolmesta tai neljästä urospuolisesta Sprague-Dawley-rotasta (350 g, Iffa-Credo, Ransa) eristettiin sekalaisia peritoneaalisia soluja antaen niille intraperitoneaalisena 10 ruiskeena 10 ml 0,9 %:sta NaCl:ä (joka sisälsi 50^ug hepa-riinia/ml). Sen jälkeen kun vatsaonteloa on hierottu kevyesti 1 minuutin ajan, peritoneaaliset solut eristettiin ja yhdistettiin, ja niitä sentrifugoitiin 5 minuuttia nopeudella 1500 min Kolmesti Ca++-vapaalla Krebs-Ringer-15 puskurilla (KRB), jonka koostumus oli seuraava: 141,9 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgS04, 2,5 mM Na2HP04, 0,6 raM KH2P04; huuhtelemisen jälkeen solut laskettiin mikroskoopin alla ja laimennettiin sopivalla tilavuusmäärällä Ca -vapa-ata KBR:tä niin, että saavutettiin solutiheydek-20 si noin 2 x 10® solua/ml. 0,3 ml:n eriä esilämmitettiin 0,3 ml:n kanssa Ca++-vapaata KRB:tä 5 minuuttia 35°C:ssa, ja lisättiin 0,1 ml asianmukaista testattavaa lääkeliuos-ta. 5 minuutin kuluttua käynnistettiin reaktio lisäämällä 0,1 ml Ca -pitoista KRB:tä halutun pitoisuuden saavuttami-. 25 seksi. 15 minuutin kuluttua reaktio pysäytettiin lisäämällä 2,5 ml jääkylmää Ca++-vapaata KRB:tä ja asettamalla suspensio jäihin. Solususpension sentrifugoinnin jälkeen määritettiin supernatantin histamiinipitoisuus fluori-metrisesti menetelmällä, jonka ovat esittäneet Shore et ai. 30 /Immunol. 127 (1959) 182-1867» jättäen pois uuttoprosessi (eksitaatio aallonpituudella 365 nm, emissio aallonpituudella 450 nm). Yksikään reagensseista ei fluoresoinut 0-ftaalidialdehydin kanssa kokeissa käytettyinä pitoisuuksina.

35 Solususpension kokonaishistamiinipitoisuus määri- 53 9 2 3 2 6 tettiin ultraäänikäsittelyn (2 min, pulssitaajuus 5/s) jälkeen.

Kaikista mitatuista arvoista vähennettiin spontaani histamiinin vapautuminen.

5 - Laskut

Prosentuaalinen histamiinin vapautuminen laskettiin seuraavan yhtälön avulla:

Histamiinia soluista vapaassa supernatantissa -spontaani vapautuminen 10 - x 100

Kokonaishistamiinimäärä solususpensiossa - Reagenssit ja laitteet: O-ftaalidialdehydi hankittiin Piukalta (nro 79760) . 15 Kaikki muut yhdisteet olivat analyysilaatua ja liuotettiin Ca++-vapaaseen KRB:hen. Käytetty fluorimetri oli Perkin Elmer 2000 -malli. Ultraäänikäsittely tehtiin VIBRA-CELL-laitteella (Sonics Materials) mikrokärkiä käyttäen.

20 2. Ovulaation vastaisuuden tutkiminen

Menettely: Naarasrottia sopeutetaan laboratorio-olosuhteisiin (valon ja pimeän suhde 14:10, valot päällä klor 5 aamulla) vähintään 7-10 vuorokautta. Kullekin rotalle tehdään päivittäinen emätinhuuhtelu klo 7,30 - 9,00 25 ainakin 12 vuorokauden ajan. Emätinhuuhtelunesteen sytologia tutkitaan mikroskooppisesti estrussyklin vaiheen määrittämiseksi. Rotat, joilla on ollut ainakin 2 normaalia nelipäiväistä sykliä ennen parhaillaan olevaa sykliä, valitaan. Odotetun estruspäivän aamuna rotat tapetaan, 30 munanjohtimet poistetaan, ja niistä tutkitaan vastairron-neiden munasolujen esiintyminen. Munasolut "houkutellaan" ulos munanjohtimesta ja lasketaan. Niiden naaraiden, joilla esiintyy ovulaatiota, prosentuaalinen määrä esitetään graafisesti annoksen logaritmin funktiona ED^-arvon 35 laskemiseksi ovulaation vastaiselle vaikutukselle.

Histamiinin vapautusvaikutus ja ovulaation vastainen vaikutus on esitetty seuraavassa taulukossa 4.

54 92326 C tn ^' O 3 Cn •H 3 d m «"> £ £ y 3 ίιΛ5-ίΟΝ1ΟΟιΛ o m rs φι C7) S3 V irt I1 ·1> ^ 1, 4' 1 ^ 1 ·.

fl (0 1. „ _ o — O o — o — — ©rsrs©OOoO

i—I -P O O O — — lii - p m m j S Ι5Θ to 3 ci

TI "d ^s rs m vO vOO

tn e tri o o - - ~ « « 3 «Γ o ° £ 8

Iti'' +l + l + l + l + l + l ΐΛΌ— tt m C 4Jmo od — m <e r» ° ο^ιη^β N_in ^ 5 w a tn "l’»» «"η o o ιλ m ® « O o o' nT- 5 o — •H -HfpQ o o es in ® (N — — 10 -P K > W — (0

rO

i—· X

5 ϊ £ > x I _/ x x 0 ¥ ¥o £ τ 5 =1 _ -1 p — τ £ j° JH, ό" o' — — ¥ X X o' e ° £"«> -» T2 d ¥ = ¥ -e <

<-. T — — O «JO P X X P — I

5 X P < <1 —tr ϊ pr < ° O e — I _ X I ® < Ο O X — O I.

m To αΧχχα rs i — — p o — o ®_^ **? ·0ίΧοί»1<-1ό^ζθ—— β «, k> <D _Χ--β®ΧιΤ® kn . i — o « — ® ~

I) ΧχΟ — O < “ — < X CN

a X — < m —o — <N o -s · I Q < I £ —X

CO X _j C I (NO — O +· <N fSjO O — I O X 3 0 r-t —I — — Q -v — β— UJ I f <N 1 < q » J CD w < — O <· K1\ «3 — <0 w O IU I «® — w O) •P O— I® — 0)ww ΙΛ NQ® KO o L.

r-j -·β0Λϋ<ι<ι®σιΐΐ(Λ ι<

x o — « o1 r1 I Q I < U U o »o® «-1 <N e < «C

(0 - <o f xo“. o2<< nil m mi - j; .

Q. < i 1 ui o 1®_“· •c2xo~xo< -o X4 I Q m w —- ® ΚΌ0 ® · m O (N fNo « 110 K\ (0 O - © en ~ ~ ~ ->« Ό — x x ~ en o — ~

S «»O — l. L. (M <M — <N — — 07) ö O 07) t. 1 — IN

^ \Cm3^<S-X3S- — rsu— — 1_<®=X

- 'τ~βι22ιυοΐΒω=·1-·<ρ>07)<^';ιηο ρ s- X atm Ό σι σ> o ej) — — »<< .in — © en m /s/ULOiLtLtL^1 or .e .e m ou l t , ®θ£<κ2ί££<<ί in m »_ < O) 2 .e m l-l_..|...|.c2<®>©<.l-|l

-p <<®®Q)0'0OQl|'0t-L.«'0<OO

eni ΐ £ 1 · · 1 1 · % O q · < ^ Ό » £ « » w iimmmmmmm . .m » . . m «m m (rt pj ο0«»«;ΛΛΛιηη «βιοιη Λ-, .1 r n 1 · KinnininKirtTTin . · — m . mm to mm — w — mm—mm m — m_ — tn -H o- o. — — — — — — — ~w — ao.w — ä. — — rrl Ρΐ,ΟΟβΟοβο — _«ji_l — 51-«J1> m iti ·7ν-ο.ο.α.<1-ο.ο.ο.<>«ιΰ-ΐ-)- cq-J-a_a.

-d X! •itijJiiiO.q.iiiq.Tiii S_i QOOOQOqqqI I O O Q | a o o a C n1 <n (s (s (s (n (s (s rs . «cn rs rs .es rs rs rs m ΦΦΦΦΦΦΦΦΦ rs rs φφφγμ ΦΦφΦ •h tt-o.o.Q.Q.Q-Q.a.a.^£a.q.n£cLo.o.a-

Cn i iiij.i'l't-iirii-lij.l.

* O C OoOOOPOOO li- il. oooiLoocjo ^ p Λ ? f P1 P- f P- P- p- f f f1 Λ f- P· P- ?

•o 'm O0OO0“0OOQqOOqq0OqO

CrO . . ......

(Ö -P Λ Λ — _ — „ I p rscsrsrsrsrspsnirsrsnirsrscsrsrsrsnirs ac o rrrrr-rrr-r--rr--r- J c ?ί?????ίί??????????

^ OugugUuguOoOUuuUUgU

•H.C <<<<<<<<<<<<<<·<<<<< P(U < « I ·'· < 'i'ii1 •‘.i'-i.

w +J ΖΖΖΖΖΖΪΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖ ’ 0 rr p c O I Oiv^OOOi®OOO®OO£rsrTmst — — k/ rn mm — r^rsfT— <Z>0®rsrsOoO(MrsO— ao TT Xi 5mr»\o — mmoomrsrs — <5 — inr^oom a Ps ® — noi"inioiBiO~)OOiOa))i)Osss

Z3 ®m — — ® — NsrsOismrssrsisioiO

1-1 I ^ «N|m|1|r>|oi| = |m|:|^|.|o|-|a|S|s|a|S|o;|o| H w 55 92326

Yhdisteiden akuutti myrkyllisyys

Keksinnön mukaisten yhdisteiden akuuttia myrkyllisyyttä arvioitiin antamalla niitä rotille laskimonsisäi-senä ruiskeena. 3 urosrotan ryhmät saivat yhden ruiskeen 5 väliainetta tai lääkettä (RS-15378 tai RS-26306) annoksen ollessa 1,0 mg/kg. Kaksi muuta rottaryhmää sai joko 0,3 mg tai 1,0 mg standardiyhdistettä (RS-68439)/kg.

(Kaikki yhdisteet on nimetty aikaisemmissa esimerkeissä).

Ruiskeet annettiin häntälaskimoon 15-20 sekunnin 10 välein. Eläimiä tarkkailtiin myrkyllisyyden kliinisten merkkien havaitsemiseksi välittömästi antamisen jälkeen ja 0,5, 1,0, 3,0 ja 6,0 tunnin kuluttua ruiskeen antamisesta .

Tulokset on esitetty taulukossa 5.

j 3 56 9/326

(1) :rO

Λ! -η •H t—( (O Q) > T3 C <1) - (1)

•H C S

01 Ή d) o ε -tj 0 0 3 3 3 J* (0 -n >i :rö 01 -p ti >1 d)

- C X

tn >, λ;

3 -P M

-PC d) O :3 ε > :r0 MO) rö

3 -H -H

-P <H > fö rO

tO -P -P

> ' M -P -P

C tn ro -H ω d)

•H >, > 01 -P -P

-p σ'-p a oi oi

•H M -H C rO tO rO

Λί 3 σ' -rl H t> >

M -P C > .H

0) d) d) >i O -H -H

S M) JO Βϋ W W

•H r—4 o

— M

σ' >i

M .-I

\ σ> σ' -h ε c —' m o o o <1) -· ^ ^ *. Φ 01 O i—I *—I i—| i—i o >1 3 a 5 0 a 3 ω c

ÖP

_ O

d) m in -P * a . 01 —t t-· _H . ·· : -h 'T; Hr ^ tn J Ό w O VO X <N -r- (N ·> 3 O * 2"« *f5 *<n“^ 5 - ~CV®“ 5 * 5 Ja u_- 9 - ^ί, z ωΓ^ ΰ - j * a; O 9 9 'oiS D E ^ a £ m w *-> o :3 3 Μ σι λ Λ S’ (0 00 1 I ^ y ^«3 «> I I ^ CT UJ <—t > 31 rr I a r « η « “ i 21¾ m «E o « <« cn ^ „ mtooo z T I · m 4 9 9¾ ιο 4 9 9 9 =r ^

EnDiiD ι-j O O Q rH SoaaQrN^QQQaQ * k · 57 9 v 3 2 6

Fysiologiset formulat

Seuraavat ovat tyypillisiä fysiologisia koostumuksia, jotka sisältävät vaikuttavana aineosana jotakin tämän keksinnön mukaista LHRH:n antagonistia, esimerkiksi 5 (N-Ac-D-Nal(2)1, D-pCl-Phe2, Pal(3)3'6, Bth8, D-Ala10)- LHRH:ta sellaisenaan tai fysiologisesti hyväksyttävänä suolanaan, esimerkiksi etikkahappoadditiosuolana, sinkki-suolana, sinkkitannaattisuola tms.

A. Tablettiformulat 10 1. LHRH:n antagonistia 10,0 mg

Puristettavissa olevaa sokeria, USP 86,0 mg

Kalsiumstearaattia 4,0 mg 2. LHRH:n antagonistia 10,0 mg

Puristettavissa olevaa sokeria, USP 88,5 mg 15 Magnesiumstearaattia 1,5 mg 3. LHRH:n antagonistia 5,0 mg

Mannitolia, USP 83,5 mg

Magnesiumstearaattia, USP 1,5 mg

Esigelatinoitua tärkkelystä, USP 10,0 mg 20 4. LHRH:n antagonistia 10,0 mg

Laktoosia, USP 74,5 mg

Esigelatinoitua tärkkelystä, USP 15,0 mg

Magnesiumstearaattia, USP 1,5 mg 25 Valmistusmenetelmä (a) LHRH:n antagonisti liuotetaan riittävään määrään vettä, jotta muodostuu märkä granulaatti, kun siihen sekoitetaan sokeriosuus täyteaineista. Täydellisen sekoittumisen jälkeen granulaatti kuivataan lautasella tai 30 leijukerroskuivurissa. Kuiva granulaatti seulotaan mahdollisten suurten aggregaattien hajottamiseksi, ja sen jälkeen siihen sekoitetaan jäljellä olevat aineosat. Granulaatti puristetaan sitten tavanomaisella tabletointiko-neella määrätyn massan omaaviksi tableteiksi.

35 (b) Tässä valmistusmenetelmässä kaikki formulat sisältävät 0,01 % sisältävät 0,01 % gelatiinia (USP). Ge- 58 923/6 latiini liuotetaan ensin granulointiliuottimena toimivaan veteen ja sen jälkeen liuotetaan LHRH-analogi. Loput vaiheet on samanlaisia kuin edellä kohdassa (a).

Formulaa 4 voitaisiin käyttää myös suun kautta an- 5 nettavana tablettina.

B. Pitkävaikutteinen lihaksensisäisesti injek toitava formula 1. Pitkävaikutteinen lihaksensisäinen ruiske-sesamöljygeeli 10 LHR:n antagonistia 10,0 mg

Alumiinimonostearaattia, USP 20,0 mg

Seesamiöljyä gs ad 1,0 ml:ksi

Alumiinimonostearaatti ja seesamiöljy yhdistetään ja yhdistelmää kuumennetaan 125°C:ssa samalla sekoittaen, 15 kunnes muodostuu kirkas keltainen liuos. Sen jälkeen tämä seos autoklavoidaan steriloinnin suorittamiseksi ja sen annetaan jäähtyä. Sitten lisätään LHRH-analogi aseptisesti samalla trituroiden. Erityisen edullisia LHRH-analoge-ja ovat heikosti liukenevat suolat, esimerkiksi sinkki-20 suolat, sinkkitannaattisuolat, pamoaattisuolat ja vastaavat. Niillä on poikkeuksellisen pitkä vaikutuksen kesto.

2. Pitkävaikutteinen lihaksensisäinen ruiske -biologisesti hajoavasta polymeeristä valmistetut mikrokapselit . 25 LHRH:n antagonistia 7 % 25/75 glykosidi/aktidikopolymeeriä 93 % (ominaisviskositeetti 0,5)

Edellä olevan formulan mukaiset mikrokapselit sus-pendoidaan seuraavaan liuokseen: 30 Dekstroosia 5,0 % ; Natrium-CMC:tä 0,5 %

Bentsyylialkoholia 0,9 %

Tween 80:ä 0,1 %

Puhdistettua vettä gs 100,0 %:ksi 35 25 mg mikrokapseleita suspendoitiin 1,0 ml:aan väliainet ta.

92326 59 C. Lihaksensisäisesti ruiskutettava vesiliuos LHRHrn antagonistia 0,5 %

Etikkahappoa 0,02 mol/1

Bentsyylialkanolia 0,9 % 5 Mannitolia 3,5 %

Propyleeniglykolia 20 %

NaOH:a pH:n säätämiseksi arvoon 5

Vettä gs 100 %:ksi

Etikkahappo, bentsyylialkoholi, mannitoli ja pro-10 pyleeniglykoli liuotettiin 90 %:iin vesimäärästä. Tähän liuokseen liuotettiin sitten LHRH:n antagonisti, ja pH säädettiin NaOHtlla. Lisättiin puuttuva vesimäärä. Liuos suodatettiin 1 pm:n suodattimen läpi, pakattiin pieniin lääkepulloihin ja steriloitiin autoklaavikäsittelyllä.

15 D. Nenään annettava vesiformula LHRH:n antagonistia 50 mg 0,02M asetaattipuskuria 5 ml

Natriumglykokolaattia 500 mg 0,02M asetaattipuskuria, pH 5,2 10 ml:ksi 20 E. Rektaalisesti annettava formula

Peräpuikko: LHRH:n antagonistia 5,0 mg

Witepsol H15:tä 20,0 g LHRH:n antagonisti yhdistettiin sulaan Witepsol .25 H15:een, ne sekoitettiin hyvin ja seos kaadettiin 2 g:n muotteihin.

·

Claims (10)

60 92326

1. LHRH:n nonapeptidi-tai dekapeptidianalogi, jolla on kaava (I), 5 A-B-C-Ser-D-E-F-G-Pro-J (I) 123 4 5678 9 10 tai sen fysiologisesti hyväksyttävä suola, tunnet-10 t u siitä, että A on jokin aminoasyyliryhmistä N-Ac-3- (1-naftyyli)-D,L-alanyyli ja N-Ac-3-(2-naftyyli)-D,L-ala-nyyli, niiden D- tai L-isomeeri; B on jokin aminoasyyliryhmistä D-fenyylialanyyli, D-p-kloorifenyylialanyyli, D-p-fluorifenyylialanyyli ja D-a-15 metyyli-p-kloorifenyylialanyyli; C on jokin aminoasyyliryhmistä D-tryptofanyyli ja 3-(3-pyridyyli)-D-alanyyli; D on jokin aminoasyyliryhmistä L-fenyylialanyyli, L-tyro-syyli, 3-(3-pyridyyli)-alanyyli ja arginyyli, tai amino-20 asyyliryhmä, jolla on rakennekaava -HN-CH-CO- "K>n UI) NH 1 1 2

25 R -HN-C=NR jossa n on 1 - 5; R1 on alkyyli, joka sisältää 1-6 hiiliatomia, tai fluorialkyyli; ja R2 on vety tai R1; E on 3-(3-pyridyyli)-D-alanyyli, D-tyrosyyli, D-tryptofa-30 nyyli tai aminoasyyliryhmä, jolla on rakennekaava -HN-CH-CO- «7K2>n (II) NH 1 1 2

35 R -HN-C=NR 61 C o 7 O ^ s ΔΌ jossa n on 1 - 5; R1 on alkyyli, joka sisältää 1-6 hiiliatomia, ja R2 on vety tai R1; tai R1-HN-C=NR2 on , /cv

2. A on N-Ac-D-Nal(2); B on D-pCl-Phe; C on D-Trp tai D-Pal(3); D on Tyr, Arg, Deh, Mbh tai Bth; F on Leu; ja 30 J on D-AlaNH2.

• 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdiste, tun nettu siitä, että se on N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Pro-D-AlaNH2 tai sen fysiologisesti hyväksyttävä suola.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste tai sen fysiologisesti hyväksyttävä suola, tunnettu siitä, että

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdiste, tun nettu siitä, että se on N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D- 62 9 9 3 6 Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2 tai sen fysiologisesti hyväksyttävä suola.

5 Pal(3)-Ser-Mbh-D-Pal(3)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2 tai sen fy siologisesti hyväksyttävä suola.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että se on N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-

5 HN N \ / H-f-<CH2>m H jossa m on 1 - 4; 10. on jokin aminoasyyliryhmistä L-leusyyli ja L-fenyyli-alanyyli; G on aminoasyyliryhmä, jolla on rakennekaava -HN-CH-CO- 15 <CH2)n (II) NH 1 * 2 R -HN-C=NR jossa n on 1 - 5; R1 on alkyyli, joka sisältää 1-6 hii-20 liatomia, tai fluorialkyyli; ja R2 on vety tai R1; ja J on D-alaninamidi tai glysinamidi.

6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että se on N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)-D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2 tai sen 10 fysiologisesti hyväksyttävä suola.

7. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että se on N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2 tai sen fysiologisesti hyväksyttävä suola.

8. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdiste, tun nettu siitä, että se on N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Bth-D-Tyr-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2 tai sen fysiologisesti hyväksyttävä suola.

9. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdiste, t u n - 20. e t t u siitä, että se on N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D- Pal(3)-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2 tai sen fysiologisesti hyväksyttävä suola.

10. Koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukaista yhdis- 25 tettä sekoitettuna ainakin yhteen fysiologisesti hyväksyttävään täyteaineeseen. 63 92326