FI92222C - Onkofetaalisia spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita, menetelmä niiden valmistamiseksi ja niiden käyttö. - Google Patents

Description

92222

Onkofetaalisia spesifisia monoklonaalisia vasta-aineita, menetelma niiden valmistamiseksi ja niiden kayttb

Tama keksintb tehtiin osittain Yhdysvaltojen halli-5 tukselta saatua rahoitusta kayttaen. Hallituksella on tietty ja oikeuksia tahan keksintbbn.

Tekninen ala

Tama keksintO koskee onkofetaaliantigeeneja, monoklonaalisia vasta-aineita, jotka reagoivat immunologisesti 10 niiden kanssa, naiden vasta-aineiden valmistusmenetelmia seka kåyttOsovellutuksia, kuten esimerkiksi sybvån diag-nostisoinnissa ja kasvaintyypityksessa.

Tausta

SyOpa on yksi ihmiskunnan pelottavimpia ja turhaut-15 tavimpia tauteja. On selvåa, etta sivistyneen ihmisen elinian piteneminen on suuresti lisannyt sita mahdolli-suutta, etta yksilO tulee sairastumaan syOpaan. SyOpabio-logit ovat enenevassa maarin turhautuneita, silia sybvan kontrollointiin kaytettavissa olevat hoidot silloin, kun 20 se on kliinisesti ilmennyt, parhaimmillaan lievittavat sen tarkeimpia tappavia muotoja. Eloonjaamisindeksit eivåt yleensa ole parantuneet tårkeimpien ihmista kiusaavien sydpalajien kohdalla huolimatta miljardeista tutkimukseen kaytetyista dollareista ja miljooneista ihmistybtunneista, : 25 jotka on kaytetty uusien syOvånkontrollointimenetelmien kehittamiseen. Siten on luonnollista, etta onkologit ja kasvainbiologit epatoivoisesti ovat etsineet parempia va-lineita syOvan toteamiseksi ja sybvan biologian parempaan ymmartamiseen perustuvaan hoidon parantamiseksi.

30 Pieni mutta merkittava maarå spontaaneja remissioi- ta, joita tapahtuu muuten ei-hoidettavissa olevissa kas-vaimissa, on rohkaissut biologeja toivomaan, etta ruumiin luonnollisia puolustusmekanismeja voitaisiin kayttaa ole-massa olevien kasvainten vastustamiseksi paremmin. Tama 35 optimismi on laajentunut pitkan tåhtaimen suunnitelmaksi, 2 92222 jonka mukaan jonakin pSivånå saattaa jopa olla mahdollis-ta, ainakin teoriassa, immunisoida ihmiset niin, ettei sydpia koskaan esiinny.

Viimeisten 20 vuoden aikana sydpabiologit ovat tul-5 leet tietoisiksi siita, etta monissa ihmisen kasvaimissa ja eiainten kokeellisissa kasvaimissa sydvan isannan im-muunisysteemi nayttaa muistavan antigeeniset determinan-tit, joita esiintyy laajassa joukossa luonnollisia ja kei-notekoisesti aiheutettuja kasvaimia. Vaihtoehtoisesti ha-10 vaitaan sekaantumista immuunivasteisiin (esimerkiksi sup-pressiota). Tasmailinen kuvaus keirioista, joilla tamå im-munologinen muisti tulee mukaan kuvaan isdntien alttiudes-sa antigeenisen kasvaimen kasvulle, on kuitenkin vasta askettåin alkanut selventya.

15 Monien vuosien ajan syopabiologit ovat keskittyneet toteamaan ja karakterisoimaan uusia antigeeneja, joita esiintyy kasvainsoluissa tai niiden pinnalla. Monet nåistå determinanteista esiintyvat virusten avulla ja kemialli-sesti aiheutetuissa eiainten kasvaimissa. Antigeenityyppe-20 ja, joita esiintyy transformoiduissa soluissa tai niiden pinnalla onkogeenisilia, DNA:ta sisaltavilia viruksilla, kuten SV40 -viruksella, aiheutetun abortoivan infektion tai RNA:ta sisaltavilia retroviruksilla aiheutetun infektion seurauksena, voidaan yleensa osoittaa esiintyvan eri 25 solulajeissa, jotka on transformoitu kullakin naista vi-ruksista; kukin viruslaji indusoi kuitenkin ainoalaatuisia antigeeneja verrattuna eri kasvainvirusten indusoimiin antigeeneihin. Kemiallisesti aiheutetut kasvaimet ovat usein antigeenisia isånnassaan, mutta niilta saattaa puut-30 tua virukseen liittyvat kudossiirtoantigeenit.

. Parhaiten tunnettuja kasvaimeen liittyvia antigee neja, joita esiintyy virusten aiheuttaman solujen trans-formaation aikana tai sen jaikeen joko in vitro tai in vivo, ovat (1) kasvaimeen liittyvat solun pinta-antigee-35 nit; (2) kalvoon liittyvat kasvainspesifiset tai kasvai- • · 3 92222 meen liittyvåt kudossiirtoantigeenit; (3) solunsisåiset, ensisijaisesti tumassa olevat antigeenit, jotka on nimetty kasvain- tai T-antigeeneiksi ja jotka voivat toimia immu-nogeeneina vain silloin, kun kasvaimet kasvavat suuriksi 5 ja kuoliota esiintyy; (4) virukseen liittyvåt antigeenit, joita esiintyy viruspartikkeleiden pinnalla tai solukal-voissa olevien kypsyvien virusten pinnalla in situ; ja (5) alkio- tai sikiGantigeenit, joita esiintyy uudelleen solun pinnalla ja myGs solun ulkopuolisessa nesteesså, kun SV40-10 transformoituja soluja viljellåan in vitro. Alkio- tai sikiGantigeenit voidaan todeta vasta-aineen avulla sekå myGs kudossiirtohylkåyskokeilla. (Tåmå johdanto on oleel-lisesti otettu julkaisusta Coggin, Jr. ja Ambrose, Methods in Cancer Research, volyymi 18, luku 10, sivut 371 - 389.) 15 Lukuisia kertoja on yritetty kehittåå sekå poly- klonaalisia ettå monoklonaalisia vasta-aineita kasvainan-tigeeneja vastaan siinå toivossa, ettå valmistetaan diag-nostisia ja terapeuttisia reagensseja. Kahdentyyppisiå immunisointeja on suoritettu alalla aikaisemmin tåmå toive 20 mielesså, nimittåin ksenogeenisiå ja allogeenisiå immunisointeja. Ksenogeeninen immunisointi tarkoittaa immuni-sointia, jossa elåin, kuten hiiri tai rotta, immunisoidaan eri lajista (esimerkiksi ihmisestå) peråisin olevalla elåinkudoksella (esimerkiksi kasvainkudoksella). Allogee-25 ninen immunisointi saadaan immunisoimalla tiettyå lajia oleva elåin kudoksella, joka on peråisin samaa lajia mutta eri kantaa olevasta elåimestå. Hiirien ksenogeeniset immu-nisoinnit, joilla saadaan aikaan monoklonaalisia vasta-aineita esimerkiksi ihmisen neuroblastoomia vastaan, kuva-30 taan julkaisussa Kennett, R. H., Monoclonal Antibodies.

Hybridomas: A New Dimension In Biological Analysis, luku 10, ss. 155 - 168. Ihmisen leukemiasoluja vastaan kseno-geenisesti tuotetut monoklonaaliset vasta-aineet, jotka ovat peråisin hiiren haimasoluista, kuvataan esimerkiksi 35 julkaisussa Sato et al., Development, Growth and Differentiation 25 (1983) 333 - 344.

4 92222

Ksenogeenisilia immunisoinneilla valmistettuihin vasta-aineisiin (olivatpa ne polyklonaalisia tai monoklo-naalisia) liittyy useita ongelmia. Ehkapa tarkein ongelma on selva vaikeus koskaan aikaansaada nSiden vasta-aineiden 5 absoluuttinen kasvainspesifisyys. Harvat monoklonaaliset vasta-aineet, jotka on saatu immunisoimalla ksenogeenises-ti hiiria tai rottia tietylia ihmisen kasvainkudoksella, ovat osoittaneet absoluuttista spesifisyytta kyseiselle kasvainluokalle ja monet reagoivat jonkin normaalin aikui-10 sen ihmisen kudoksen kanssa (katso esimerkiksi Rosenberg, S. A., kirjassa Rosenberg, toim., Serological Analysis of Human Cancer Antigens, New York, Academic Press, 1980). NSmS ongelmat johtuvat siitå tosiasiasta, etteivat ihmisen kasvainsolut sisalla vain kasvainspesifisiå antigeeneja 15 vaan sisåltåvåt myds suuren joukon muita, kasvaimeen liit-tymSttOmia antigeeneja, kun niita injektoidaan kudossopi-mattomiin isantiin. Siten eri lajin tai kannan kasvainso-luja vastaan tuotettu polyklonaalinen seerumi pakostakin reagoi immunologisesti seka kasvainspesifisten etta kas-20 vaimelle epaspesifisten antigeenien kanssa. Mahdollisuus saada monoklonaalisia (Mc) vasta-aineita spesifisia epi-tooppeja vastaan on heråttånyt toiveen, etta jotkut hybri-doomasupernatanteista satunnaisesti valitut monoklonaaliset vasta-aineet olisivat todella kasvainspesifisiå. Tåma ' 25 on kuitenkin vaivalloinen ja tyOias menetelmå ja antaa huonon vakuuden tulosten toistettavuudesta. Tulokset ovat umpimahkaisia ja perustuvat klassisiin immunologisiin la-hestymistapoihin vasta-aineiden "nostattamisessa”.

Viimeisten 10-15 vuoden kuluessa syovantutkimuk-30 sen toisenlaisen suunnan mukana on kehittynyt mahdollisuus, etta ihmisten ja jyrsijbiden pahalaatuisten kasvain-ten pååosa sisaitaa yhteisia, alkioperaisia determinantte-ja (EA), jotka saattavat olla immunogeenisia syngeenises-sa isannassa ja jotka liittyvat solun plasmamembraaneihin 35 [katso esimerkiksi Coggin, Jr., Fetal Antigens and Cancer, • ' 5 92222 ss. 28 - 54, Pittman, Lontoo (Ciba Foundation Symposium 96), 1983]. TSssS kaytetyn mSåritelmSn mukaan oikeat EA:t esiintyvåt ainoalaatuisesti sukusolu-, alkio- ja joillakin sikiGasteella olevien solukalvojen pinnalla eika niita 5 esiinny (immunogeenisesti) normaaleissa aikuisen kudoksis-sa eika uudistuvissa kudoksissa. Alkioantigeenien immuno-loginen rooli sikiGnkehityksessa kohdussa on yha epåselva. Tiedetaan, etta aidissa kehittyy vasta-aineita kohdussa esiintyvia EA:ita vastaan. EA:n uudelleenesiintymiseen 10 esiintulevassa pahanlaatuisessa solukloonissa johtavan onkogeenisen prosessin biologinen tuote nayttaa liittyvan laheisesti kasvaimelta suojelevan immuunivasteen nousuun isannåssa. Nama vasteet matkivat raskaudenaikaisia immuu-nivasteita, joiden tehtavana saattaa olla suojella EA-po-15 sitiivista sikiGta åidin immuunisysteemin hyokkaykselta.

Alkioantigeeneja esiintyy todellakin jyrsijGiden ja ihmisen kaikissa kasvainluokissa. Jotkut vastaavat sikiG-antigeenit, onkofetaaliantigeenit tai 0FA:t, joita esiintyy ihmisen kasvaimissa (esimerkiksi ihosyGpåkasvaimissa), 20 nayttavåt ryhmittyneen erillisiin histologisiin luokkiin, vaikkakin yhteisia EA:ita on myGs raportoitu. On osoitet-tu [Ambrose, K. R. et al., Nature 233 (1971) 194; Coggin, J. et al., Advances in Cancer Research 19 (1974) 105 ja Coggin, CIBA Symposium, yllå], etta jyrsijain ja ihmisen 25 alkioantigeenit, jotka ovat yhteisiå immunogeenisiå determinantte ja ja jotka sailyvat lajikehityksessa, esiintyvat uudelleen 0FA:ina ihmisen samoin kuin jyrsijain kasvaimissa. Tama ajatus syntyi alunperin havainnosta, etta satei-lytetyt ihmisen sikiGperaiset munuaissolut samoin kuin 30 syngeeniset, sateilytetyt hamsterin sikiGperaiset solut saattoivat keskeyttaa SV40-onkogeneesin hamstereissa. Aikuisen ihmisen kudokset eivat suojanneet samalla tavalla. Tama viittaa siihen, etta jyrsijain alkioantigeenit liit-tyvat laheisesti jyrsijain onkofetaaliantigeeneihin ja 35 etta jyrsijain alkioantigeenit ovat identtisia joidenkin 6 92222 ihmisen alkioantigeenien kanssa. Koska alkioantigeenit, joita on 13sn& ihmisen sikidper&isissd munuaissoluissa, suojasivat SV40-aktivoiduilta alkioantigeeneilta, ainakin jotkut ihmisen alkioantigeenit ovat yhtålåisia jyrsijain 5 onkofetaaliantigeenien kanssa.

Viimeaikoihin asti EA:iden luonne oli epSselvå, koska saatavissa ex ollut reagensseja niiden immunokemial-liseen karakterisointiin. Useat tydryhmSt ovat kuitenkin raportoineet osoittaneensa joukon våitettyja sikiOperåisiå 10 antigeeneja, vaikkakaan yhtåån niistå ei ole puhdistettu monoklonaalisia vasta-aineita kSyttSen. Price, M., Soc. Trans. 2 (1974) 650, osoitti rotan maksasydpakasvaimesta suuren, karakterisoimattoman siki06n liittyvan antigeenin, jonka arvioitu molekyylipaino oli 100 kD. Evans et al., 15 Can. Res. 39 (1979) 2006, havaitsivat, ettå rottien sar-koomissa esiintyi kaksi onkofetaalista antigeenia, joiden arvioitiin olevan kooltaan alueella 3,5 - 10 kD. Dickinson et al., Br. J. Cancer 29 (1974) 425, raportoivat, ettå rinnasta, kohdunkaulasta, emSttimestå ja vastapaidasta 20 peråisin olevat ihmisen kasvainuutteet sisSlsivåt useita pieniå, yhteisiå proteiineja, jotka nåyttivSt olevan si-ki66n liittyviS ja joiden koko oli 16 - 18 kD. Jornvall et al., P.N.A.S. USA 79 (1982) 287, raportoivat osoittaneensa 53 kD:n onkofetaaliproteiinin, joka on sekventoitu ja jol-25 la havaittiin olevan yhteisiå DNArta sitovia ominaisuuksia polyooma-keski-T-antigeenin (polyoma middle T antigen) (55 kD) kanssa. TSma transformaatioon liittyvS proteiini esiintyi raskausajan keskivaiheen sikiOperåisissa soluissa monissa lajeissa samoin kuin useissa mååritetyissa ihmisen 30 ja tfiysikasvuisissa kasvaintyypeissS.

:· Tutkiessaan jyrsijåin ja/tai ihmisen alkioantigee nien esiintymista ihmisen kasvainsolujen pinnalla jotkut tutkijat ovat tehneet syngeenisia immunisointeja. Syngee-ninen immunisointi on sellainen immunisointi, joka saa-35 daan elåinsysteemistå, josta puuttuu immunologisin mene- 7 92222 telmin maaritettyna havaittavissa olevat kudossopimatto-muusdeterminantit. Toisin sanoen syngeeniset immunisoinnit ovat sellaisia, jotka saadaan immunisoimalla tietty elåin geneettisesti identtisesta eiaimesta (tama tarkoittaa, 5 sama laji, sama kanta) saadulla kudoksella.

Coggin, Jr. et al., The Journal of Immunology 105 (1970) 524, ja Coggin et al., Adv. Can. Res. 19 (1974) 105 - 165, osoittivat, etta hamsterin ja hiiren sikiOsolut sisaisivat antigeeneja, jotka ristireagoivat SV40:lia ai-10 heutetun sarkooman kanssa ja joita esiintyy muissa virusten avulla tai kemiallisesti aiheutetuissa sarkoomissa, siten, etta ne stimuloivat vasta-aineen muodostumisen. Vasta-ainetta syntetisoitui, kun 10 paivaa vanhoja mutta ei 14 paivaa vanhoja, sateilytettyjå hamsterin sikiGsoluja 15 injektoitiin taysikasvuisiin syngeenisiin hamstereihin ja naiden eiainten havaittiin sen jaikeen olevan immuuneja SV40-kasvainsolualtistukselle. SåteilyttamattGmat sikiG-solut eivat saaneet aikaan kudossiirtoimmuniteettia.

Hanna, Jr., Coggin et al., Proceedings of the Na-20 tional Academy of Sciences, USA 68 (1971) 1748, tutkivat immunisoinnin estavia vaikutuksia hiiren sikiGantigeenilla RLV-viruksella infektoitujen solujen kasvuun seka plasma-solukasvaimiin. Nuoret BALB/c-uroshiiret kasiteltiin kolmen viikon valein rGntgensateilytetyilia syngeenisilia 25 alkiosoluilla. Kasvainten kehittyminen estyi hiirissa. Samanlaista estymista ei havaittu hiirisså, jotka oli kå-sitelty vastasyntyneesta peraisin olevilla tai normaaleil-la ksenogeenisilia soluilla.

Ting, In Vitro 14 (1978) 207, seuraten Coggin, Jr. 30 et al'n, ylia, kuvaamaa tyOta, jossa kaytetaan syngeeni- • sille sikiGille herkistamista hamstereissa ja Balb/c-hii-rissa, tutki hiiren sikiGsoluista peraisin olevien sikiG-antigeenien esiintymista. Antiseerumi tuotettiin syngee-niselia immunisoinnilla 5000 R:lia (1290 mC:lia) rGntgen- 35 sateilytettyjen, yhdesta kahteen viikon raskausaikaisista 1 é 8 92222 hiiren sikioistå peråisin olevilla kudoksilla. Sikioanti-geeneja havaittiin olevan jåljellå vielå viiden vuoden kuluttua varsinaisista hiiren sikiokudoksista peråisin olevissa in vitro -transformoiduissa solulinjoissa.

5 Kaikkien nåiden syngeenistå immunisointia kåyttå- vien tutkimusten suorittamisen tarkoituksena oli analy-soida alkioantigeenin låsnåoloa solujen pinnalla sekå nii-den isånnåsså aiheuttarnaa immuniteettia kasvaimia vastaan. Hybridoomien ja syngeenisestå isånnåstå peråisin olevien 10 sikiOkudosten sikiospesifisiå determinantteja vastaan muo-dostettujen monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamista ei ole kuvattu. Mitå tahansa tunnetun raskausajan ikåisten hamsterin tai hiiren sikidsolujen pinnalla olevaa alkioan-tigeenideterminanttia vastaan reagoivien monoklonaalisten 15 vasta-aineiden synnyn on odotettu olevan parhaimmillaankin ongelmallista, sillå tållaiset pyrkimykset koskisivat immunisointia syngeenisten systeemien sisållå. Asiaa moni-mutkaistaisi edelleen se, ettå tavanomaisen, monoklonaali-sia vasta-aineita koskevassa kirjallisuudessa usein kuva-20 tun, useita immunisointeja kåyttåvån menettelytavan liu-koisia, alkioantigeenia sisåltåviå valmisteita kåyttåen on jo osoitettu aktivoivan T-eståjålymfosyyttejå ja håiritse-vån kasvainkudossiirtoimmuniteettiå annoksesta riippuvalla tavalla [Weppner, W. A., et al., Cancer Research 40 (1980) 25 1380]. Syngeenisellå sikiollå tehdyn hyperimmunisoinnin « vaikutuksia B-lymfosyyttiaktivaatioon ei mybskåån tunnettu ennen tåtå keksintdå. On havaittu, ettå naarasjyrsijåt kehittåvåt sytostaattista IgG:tå SV40-sarkoomasolujen kanssa ristireagoivia alkioantigeeneja vastaan, kun ne 30 immunisoitiin suoraan såteilytetyillå, syngeenisiå sikid-soluja sisåltåvillå valmisteilla, jotka sisåltåvåt monia hajoitettuja sikidsoluja, mutta eivåt kehittåneet kasvain-resistenssiå eivåtkå oletettavasti solulle myrkyllisiå efektori-T-soluja nåisså olosuhteissa [Ambrose, K. R., 35 yllå; Coggin, J. H., Cancer Research 39 (1979) 2952].

« > li 9 92222

Shevinsky et al., Cell 30 (1982) 697 - 705, todel-lakin raportoivat suuria vaikeuksia saada hybridoomia al-kiolla herkistettyjen hiiren tai rotan pernoilla. Vain yksi alkiospesifinen monoklonaalinen vasta-aine (2000 5 kloonista 14 fuusiossa) voitiin saada ja raportoida. Lisaksi tama oli saatu ksenogeenista immunisointia kayttaen.

Siten ennen tata keksintca alalla oli useita syita odottaa, etta syngeeninen immunisointi ei ehka toimisi tai jopa osoittautuisi immunogeeniseksi tuotettaessa lymfo-10 syytteja, jotka olisivat kayttbkelpoisia muodostettaessa hybridoomia ja monoklonaalisia vasta-aineita, joita voi-taisiin soveltaa diagnostiikassa ja/tai hoidossa.

Koska tarvitaan suuresti sellaisia immunologisia reagensseja, jotka ovat hyvin spesifisia ihmisen kasvai-15 mien sailyneiden EAriden ja OFA:iden osoittamisen suhteen, alalla aikaisemmin vallinneet ennakkoluulot jatettiin kui-tenkin ottamatta huomioon, kun tahan keksintiJCn johtaneet alkututkimukset suoritettiin.

Keksinnon sisaitb 20 Tama keksintb syntyi siitå odottamattomasta keksin- nOsta, etta on mahdollista immunisoida syngeenisesti elain nopeasti lisaantymattbmilia (esimerkiksi kuolettavasti sa-teilytetyilia ), raskauden keskivaiheesta olevilla, syngee-nisilia sikiGsoluilla, jolloin saadaan lymfosyytteja ja 25 lopulta monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat erittain spesifisia jyrsijbiden ja ihmisen alkioantigeeneille. Tål-ia tavoin herkistettyjen hiirien pernasolut voidaan fuusi-oida sopivien immortaliteettisolujen kanssa tunnetuissa olosuhteissa, jolloin saadaan hybridimyeloomia (hybridoo-30 mia), joiden valinnan, seulomisen ja kloonauksen jaikeen havaitaan tuottavan monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat erittain spesifisia alkioantigeeneille. Naiden mono-klonaalisten vasta-aineiden erityisominaisuus on se, etta ne tunnistavat ristiin ihmisen onkofetaaliantigeenit, jot-35 ka nayttavat olevan identtisia tai lahes identtisiå jyrsi- 10 92222 jåin ja ihmisen EAiiden kanssa. Tållå menetelmållå saadut monoklonaaliset vasta-aineet pystyvåt spesifisesti tunnis-tamaan tåhån mennesså julkaistussa kirjallisuudessa kuvaa-mattoman, ainoalaatuisen onkofetaalipolypeptidin determi-5 nantit.

Siten keksinto sisåltåå menetelmån hybridoomien ja monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi seuraavien vaiheiden avulla: a) immunisoidaan sopiva elåin sopivilla måårillå 10 syngeenista, nopeasti lisååntymåtOntå raskausajan keski- vaiheesta peraisin olevaa sikiosoluvalmistetta; b) eriste-taån herkistetyt lymfosyytit mainitusta elåimesta; c) fuusioidaan mainitut lymfosyytit sopivissa fuu-sio-olosuhteissa immortalisoivan solulinjan kanssa, jol- 15 loin saadaan hybridooma; ja d) otetaan talteen monoklonaaliset vasta-aineet mainitusta hybridoomasta.

Yksi menetelman ratkaisevista puolista on elainten syngeeninen immunisointi nopeasti leviåmåttOmillå sikib-20 soluilla. Kyky saada keksinnbn mukaisia tuloksia on vas-toin alalla aikaisemmin vallinnutta uskoa ja ennakkoluu-loa, ettS alkioantigeeneja olisi vaikea kåyttSS immunogee-neina, koska niiden yleisesti uskottiin olevan ei-immuno-geenisiå tai heikosti immunogeenisiå in vivo Balb/c-hii- • 25 risså ja hamstereissa ja olevan immunosuppressiivisia, kun niitå annetaan pidennettyjen immunisointiaikataulujen ku-luessa soluttomia antigeenin raakavalmisteita kåyttåen, ja ettå ne olivat ehdottomasti faasispesifisiå eståen niiden viljelyn in vitro. Menetelmå vahvistaa edelleen, ettå on 30 mahdollista kehittåå monoklonaalisia immunoglubuliineja • evoluutiossa såilyneitå alkioantigeeneja vastaan, joita antigeenejå esiintyy laajasti jyrsijbiden ja ihmisten kas-vaimissa.

Tåmå keksinto koskee my6s menetelmåsså saatujen 35 monoklonaalisten vasta-aineiden tyyppiå, tarkemmin sanot-

II

11 92222 tuna monoklonaalisia vasta-aineita, joilla on seuraavat spesifisyysominaisuudet: a) immunoreaktiivisuus jyrsijåin ja ihmisen ras-kauden kesklvalheen aikaisia alkio-sikiOantigeeneja vas- 5 taan; b) immunoreaktiivisuus ihmisen onkofetaalisia kas-vainantigeeneja vastaan; c) oleellisesti ei-havaittava immunoreaktiivisuus jyrsijåin raskauden myohåisvaiheen sikibkudosta tai hii- 10 ren, hamsterin tai ihmisen tåysikasvuisia kudoksia vastaan; ja d) oleellisesti ei-havaittava immunoreaktiivisuus ihmisen normaalia kudosta vastaan.

Vasta-aineita voidaan kåyttåå eristettåesså affini-15 teettikromatografisesti kasvaimeen liittyvia antigeeneja; identifioitaessa kasvaimia, joissa diagnoosin mukaan esiintyy 0FA:ita, primaarikasvainten samoin kuin metas-taasien toteamisessa tai kasvaimen tyypityksesså.

KeksintO koskee myos tiettyjå uusia onkofetaalian-20 tigeeneja, joita voidaan kåyttåå kasvainten diagnostisina ja/tai tyypittåvinå merkkiaineina ja joista yksi on poly-peptidi, jonka molekyylipaino on noin 44 000 - 48000 ja toinen on polypeptidi (joka saattaa olla ensimmåisen kova-lenttisesti sitoutunut multimeeri), jonka molekyylipaino 25 on noin 200 000.

Tåmå keksintO avaa tien todella onkofetaalispesi-fisten reagenssien luokalle.

Piirrosten kuvaus

Kuvio 1 esittåå hybridoomien 10 - 12 påivån vilje-30 lyn supernatanteissa olevien useiden monoklonaalisten vas- ta-aineiden titrausta muovisiin, pienoiskaivoihin ELISA-måårityksesså kiinteåfaasi (SP) kiinnitettyjå 12 dmfc -soluja (day gestation mouse fetal cell, påivån raskausai-kaisen hiiren sikibperåinen solu) kohteina kåyttåen. Kaik-35 ki esitetyt anti-EA-monokloonit olivat IgM-isotyyppiå 12 92222 poikkeuksena monoklooni 58, joka on IgG2a~isotyyppia.

MPC 11 on kontrollina kaytetty IgG-luokan monoklonaalinen vasta-aine, joka valittiin vertailun vuoksi, sillå se koh-distuu tuntematonta determinanttia vastaan, joka determi-5 nantti ei ole sikiOOn liittyvå determinantti (IE-måårityk-sen perusteella). MPC-ll:ta kåytettiin negatiivisena kontrollina kaikissa kokeissa kunkin kokeen ELISA:n taustata-sojen måårittåmiseksi.

Kuvio 2 osoittaa toisen anti-EA-monokloonin, IgM 10 69,l:n sikiOspesifisyyden. Monoklonaalista immunoglobu- liinia (650 absorbanssiyksikkoå) kåsiteltiin alkuabsorp-tiossa kasvavilla pitoisuuksilla tåysikasvuisen hiiren perna-, maksa-, lihas-, keuhko- ja ihosoluilla ( ) tax 12 - 13 påivån raskausaikaisen, kerran synnyttåneen hiiren 15 sikiGsoluilla (o) tai 24 påivåå vanhoilla hiiren lihas- ja pernasoluilla ( ) 12 tunnin ajan 4 °C:ssa, sentrifugoitiin solunapin poistamiseksi ja titrattiin uudelleen kiinteå-faasi-ELISA-måårityksellå.

Kuvio 3 esittåa immunosuodatus-ELISA:n tulokset, 20 joissa verrataan satunnaisesti valittujen hybridoomasuper-natanttien sitoutumisaffiniteetin (maksimaaliseen reaktii-visuuteen kulunut aika) muutosta kåyttåen kohteena hiiren 12 - 13-påivåisiå sikiosoluja, jotka oli vasta keratty talteen tai joita oli kasvatettu in vitro 4 tax 24 tunnin 25 ajan ennen kokeen suorittamista. Solut vakioitiin samaan lukumååråån kaikissa tapauksissa ja niiden elåvien solujen lukumåårå oli sama (10 %).

Kuvio 4 esittåa kuvion 3 yllå olevien supernatant-tien vertailun tuloksia niiden kapasiteetin suhteen rea-30 goida 13 dmfc-solujen kanssa, jotka oli joko vasta keratty talteen ja kaytetty vålittomasti tai jåådytetty nestemai-sessa typesså yhden viikon ajan ja sulatettu ja kåytetty inununosuodatus-ELISA-måårityksesså. Molemmat mååritykset tehtiin samana påivånå samassa kokeessa. ELISA-reaktiot 35 mååritellåån kromogeenin lisåystå seuranneen vårinkehitty- 13 92222 misen mukaan (++++ taysi vflri 5 minuutissa; +++ = tåysi våri 10 minuutissa; ++ = v&ri 15 minuutissa; + = jonkin verran varia 20 minuutissa; o = ei varia.)

Kuvio 5 esittaa fetaalispesifisten 44 - 48 kD:n ja 5 200 kD:n polypeptidien osoittamista 12 dmfc -solujen tai taysikasvuisen hiiren kudosten NP40-uutteista (4 pg), jot-ka oli laitettu Sepharose 4B -pylvåaseen, johon luetellut monoklonaaliset vasta-aineet oli kiinnitetty. Geelikomp-leksi pestiin perusteellisesti, eluoitiin ja eluaatti val-10 mistettiin SDS-PAGE-elektroforeesia vårten ja varjattiin Coomassie-siniselia. Hiiren monoklonaalista IgM-vasta-ai-netta Moloney-sarkoomaviruksen vaippaglykoproteiinideter-minanttia (MSV) vastaan kaytettiin monoklonaalinen vasta-aine -kontrollina sikiOsolu-uutteiden kanssa. f = sikiO-15 uute; a = taysi-ikainen kudosuute. Oikeanpuolimmainen rivi esittaa vakiona kaytetyt molekyylipainomerkkiaineet. 19 -20 paivan ikaiset hiiren sikiOsolut antoivat identtiset tulokset ylia esitettyjen, taysi-ikaisilia soluilla saatu-jen tulosten kanssa.

20 Kuvio 6 esittaa Mel15 shIII:n kapasiteettia poistaa kasvavat maarat sikiospesifisia 46 ja 200 kD:n polypepti-deja 12 paivan ikåisten hiiren sikiosolujen NP40-uutteis-ta. Rivi 1 = molekyylipainovakiot; Rivi 2 = Mc 115 shIII + 10 μΐ sikiouutetta; Rivi 3 = Mc 115 shIII + 20 μΐ uutetta; 25 Rivi 4 = Mc 115 shIII + 30 μΐ uutetta; Rivi 5 = Mc 115 shIII + 10 μΐ kymmenkertaista taysi-ikåistå uutetta; Rivi 6 = 20 μΐ uutetta; Rivi 7 = 30 μΐ uutetta.

Paras tapa keksinnOn suorittamiseksi Menetelmat 30 KeksintO perustuu eiainten syngeenisen immunisoin- nin suorittamiseen nopeasti leviamattOmaiia, raskauden keskivaiheen sikiOsoluvalmisteella. Mitå tahansa sopivaa eiainta, esimerkiksi jyrsijdita, kuten hiiriå, rottia tai hamstereita, vuohia, hevosia, kananpoikia ja vastaavia 35 voidaan kayttaa. Edullisimpia ovat hiiret. Laajojen kokei- 14 92222 den jaikeen keksittiin todellakin, etta hyvin karakteri-soitu, sisSsiittoinen hiirikanta, jonka alan asiantuntijat hyvin tuntevat ja joka on kaupallisesti saatavissa, C57BL/6n, oli kaikkein paras lopullisten hybridoomien saa-5 miseksi. Toista sisSsiittoista Balb/c-hiiri-kantaa ei voi-tu helposti kayttaa alkukokeissa.

On ratkaisevaa, etta syngeeniset sikiOsolut ovat valitun lajin raskausajan raskauden keskivaiheilta ja saa-tu kerran synnyttaneista naaraista. Siten esimerkiksi hii-10 ren raskauden keskivaihe on vålilia 12 - 14 paivaa, kun taas hamsterilla se on 9 - 10 paivåa. Syy tåhan vaatimuk-seen on se, etta alkioantigeenit ovat faasispesifisiå. Raskausajan varhaiset vaiheet ovat todennåkoisesti anti-geenipositiivisia, mutta sikiokudoksen maara on hyvin pie-15 ni, eivatka nama varhaisen ajan kudokset ole kayttdkelpoi-sia. Jos kaytetaan normaaleja taysi-ikaisia soluja, raskauden loppuajan sikiOsoluja (19 - 21 paivaa hiirelia tai 15 paivaa hamsterilla) tai vastasyntyneen soluja tai tay-si-ikaisen hiiren tai hamsterin kudoksia, ei voida saada 20 onnistuneita tuloksia.

Toinen ehto menestykselliselle immunisoinnille on tarve estaa nopeasti lisaantyminen syngeenisessa, immuni-soivassa sikiosoluvalmisteessa. Nopeasti lisåantymisen estaminen voidaan suorittaa milla tahansa lukuisista, hy-25 vin tunnetuista menetelmista pysayttåa DNA:n replikaatio, kuten esimerkiksi sateilyttamaiia rontgensateillå, ultra-violetti- tai cesiumsateilytykselia tai jodideoksiuridii-ni-kasittelyllå. Edullista on såteilyttaa rbntgensateilia annoksella noin 4000 - 6000 R (1032 - 1548 mC) kokonaisia 30 soluja ennen immunisointia. Jos jatkuva solureplikoitumi- · nen sallitaan immunisoinnin aikana, alkioantigeenit katoa- vat solujen pinnalta nopeasti ( immunogeeneina), eika ha-luttujen hybridoomien saannissa onnistuta.

SikiOsolujen talteenotto ja dispergointi (ennen 35 immunisointia) on kuvattu artikkelissa Coggin, J. H. et • 4 15 92222 al., Advances in Cancer Research 19 (1974) 105. Entsyymi-dispergoimista ei edullisesti kåytetS.

Kannattaa mainita, etta monet alussa tehdyt immuni- sointiyritykset kayttaen raskaana olevia luovuttajia, 5 Balb/c-luovuttajia, jotka injektoitiin sikiOsoluilla, ja suurella annoksella tehtya pitkåaikaista herkiståmista, jota perinnSisesti kaytetaan hybridoomien tuottamiseksi, eivat onnistuneet. Paras immunisointi saadaan soluilla, jotka ihannetapauksessa annetaan joko lyhytaikaisena, 10 kaikkiaan kolmen injektion sarjana mukaan lukien viimeinen tehosteannos. Solut voidaan injektoida yksinaån tai Freun- din adjuvantissa joko Mycobacterium smegmatitis - tai M. tuberculosis -bakteerien kanssa, jonka jålkeen seuraa tehosteinjektio sikiOsoluilla ja epåtåydelliselia Freun- 15 din adjuvantilla ja lopullinen tehosteannos vain sikid- soluilla. Injektiot voidaan antaa vatsaonteloon tai suo- neen edellisen ollessa edullisin. Herkistetyt pernasolut voidaan saada noin kolmen paivan kuluttua lopullisesta tehosteannoksesta, joka yleensa annetaan noin 2-3 vii- 20 kon kuluttua viimeisesta immunogeeni-injektiosta. Immuni- soivat maåråt sikiOsoluja ovat tavallisesti mita tahansa 6 8 10 - 10 solun vaiilia injektiota kohti. Kokonaisia solu- ja tai huolellisesti valmistettuja solukalvoja tai muita EA:ta sisaitavia solu-uutevalmisteita voidaan kayttaa, 25 mutta tassa tapauksessa immunisointijarjestelman tulee olla ankarasti kontrolloitu, jotta rajoitetaan estajasolu-jen kehittyminen [Weppner & Coggin, Cell Imm. 54 (1980) 193] .

Kun herkistetyt pernasolut on saatu, ne fuusioidaan 30 sopivissa fuusio-olosuhteissa minka tahansa halutun immor- • taliteettisolulinjan kanssa, jolloin saadaan hybridoomia.

Hybridoomien valmistusmenetelmat seka niiden valitseminen ovat hyvin kuvatut kirjassa Monoclonal Antibodies. Hybri-domas: a New Dimension in Biological Analysis, Kennett, 35 McKearn ja Bechtol, toim., Plenum Press, New York ja Lon- 16 92222 too (1982), erityisesti liite, joka on nimeltSSn "Methods of Reproduction and Characterization of Monoclonal Antibodies" sivuilla 363 - 417 ja joka on liitetty tahån viit-teeksi kokonaisuudessaan. Yksi edullisista immortaliteet-5 tisolulinjoista on P3X63Ag8.653. Fuusio voidaan suorittaa solusuhteessa 1:10 hiiren myeloomasolujen suhde pernaso-luihin polyetyleeniglykolin låsnåollessa. Valinta suorite-taan tavallisesti valikoivassa vSliaineessa, kuten esimer-kiksi HAT-vSliaineessa. Hybridisolut pidetåån ylla HT-vå-10 liaineessa, jota on tåydennetty makrofaagisolulinjan RAW264.7 supernatanteilla. Tåmå valiaine on oleellinen voimakkaasti kasvavien, IgM-vasta-ainetta tuottavien hyb-ridoomien saamiseksi. Tamå makrofaagilinja on talletettu ennen tSmSn hakemuksen jåttOpåivåmåårSå American Type Cul-15 ture Collection -talletuslaitokseen ja sille on annettu numero CRL 8668.

Massahybridoomapesåkkeiden kloonaus voidaan suorittaa mills tahansa lukuisista menetelmista, kuten esimer-kiksi terminaalisella laimennuksella tai pesåkkeen muodos-20 tuksella metyyliselluloosassa. Immunoglobuliiniluokka voi daan måårittåå esimerkiksi immunodiffuusiomåSrityksilia ja tyypittåviå vasta-aineita (anti-hiiri-immunoglobuliineja) kSyttaen. On havaittu, etta kaikissa tatå keksintoa koske-vissa tapauksissa monoklonaaliset vasta-aineet ovat IgM-• 25 luokkaa, kun ne on aiheutettu kokonaisilla sikiOsoluilla, ja IgG-isotyyppisiS, kun ne on aiheutettu liukoisilla sikiOsoluilla. Taman ei kuitenkaan tulisi olla rajoittavaa ja muita luokkia voidaan saada ja niitS voidaan kåyttaa

Ratkaiseva koe monoklonaalisten vasta-aineiden spe-30 sifisyydestå alkioantigeenien suhteen suoritetaan pesåke- '· supernatanttien absorptioseulonnalla vastasyntyneen tai tSysikasvuisen hiiren kudoksista (C57BL/6n tai kokonaisel-la kudoksella, joka on vasta otettu talteen) valmistetuil-la asetonipulvereilla. Pakattu tilavuus asetonipulveria 35 sekoitetaan yhtå suuren tilavuuden hybridoomasupernatant- 17 92222 tia kanssa ja seosta inkuboidaan. Seos sentrifugoidaan, ennen kuin sitå kåytetåån ELISA (enzyme linked immuno absorption assay) -måårityksesså. Jos absorboitu hybridoo-masupernatantti antaa positiivisen reaktion, sen katsotaan 5 silloin olevan oikeaa determinanttia vastaan ja prosessoi-daan kloonausta vårten.

Tuotteet

Monoklonaaliset vasta-aineet, jotka voidaan saada yllå mainitulla menetelmållå, oleellisesti reagoivat immu-10 nologisesti alkuperåisen elåimen raskauden keskivaiheen alkio-sikiOantigeenien kanssa; oleellisesti reagoivat immunologisesti ihmisen ja jyrsijåin onkofetaalikasvainanti-geenien kanssa; oleellisesti eivåt havaittavasti reagoi immunologisesti alkuperåisestå elåimestå peraisin olevan 15 myOhåisraskaudenaikaisen sikiOkudoksen kanssa; eivåtkå ne oleellisesti havaittavasti reagoi immunologisesti ihmisen normaalin kudoksen kanssa.

Kun immunisoitava elfiin on hiiri, keksinnOn mukaiset monoklonaaliset vasta-aineet reagoivat immunologisesti 20 jyrsijåin raskauden keskivaiheen antigeenien kanssa, mutta eivåt reagoi immunologisesti jyrsijåin myOhåisraskaudenai-kaisen kudoksen kanssa.

Koska raskauden keskivaiheen alkioantigeenit ilmes-tyvåt uudelleen ihmisen syOpåsoluihin, mutta eivåt esiin-* 25 ny havaittavissa olevissa pitoisuuksissa ihmisen normaa-leissa tåysi-ikåisisså tai vastasyntyneen tai raskauden loppuvaiheen sikidn soluissa, saadut monoklonaaliset vasta-aineet ovat korkeasti sikiO- ja kasvainspesifisiå. To-dellakin, koskapa raskauden keskivaiheen syngeenisisså so-30 luissa ei ole mitåån antigeeneja (muita kuin alkioantigee-l neja), jotka eroavat immunisoitavan isånnån antigeeneista, niistå peråisin olevat monoklonaaliset vasta-aineet ovat todella EA- ja OFA-spesifisiå.

Mielenkiintoista tåmån keksinnOn mukaisten monoklo-35 naalisten vasta-aineiden spesifisyyttå koskien on keksi- l · 18 92222 jGiden havainto, ettS 10 påivån raskausaikaisia hamsterin sikiGsoluja vastaan saatu polyklonaalinen, in vivo -absor-boitu ksenogeeninen antiseerumi saostaa immunologisesti selvat sikiGspesifiset polypeptidit 12 - 13 paivaisten 5 hiiren tai 10-paivaisten hamsterin sikiGsolujen 3 mol/1 KC1 - tai NP-40-uutteista. TMllaiset tutkimukset osoitta-vat myGs, etta jotkut 10 - 12-polypeptidit ovat lasna ras-kauden tana ajankohtana, mutta eivat ole lasna vastasynty- · neesta tai taysikasvuisesta peraisin olevissa kudoksissa; 10 jotkut naista saattavat olla pienempien polypeptidien po-lymeerisia muotoja. Useimmat havaitut alkioantigeenit ovat yhteisia molemmille jyrsijaiajeille (hiirelle ja hamste-rille). Polyklonaalinen antiseerumi tappaa myGs joukon kasvainlinjoja, joilla tiedetaån olevan yhteisia alkioan-15 tigeeneja 10-paivåisten hamsterin sikiGsolujen kanssa. Toisaalta tiettyja kasvainlinjoja, joilla ei ole yhteisia, havaittavia onkofetaaliantigeeneja hamsterin sikiosolujen kanssa, ei tapeta, eikå myGskåan aikuisen ihmisen normaa-leja fibroblasteja. Polyklonaalisessa seerumissa olevat 20 anti-EA-IgG:t spesifisesti saostavat immunologisesti usei-ta alkioantigeenideterminantteja, mikå osoittaa, etta on olemassa useita, mutta vain rajoitettu lukumaara låsnåole-vien IgG:iden tunnistamia EA-polypeptideja.

Nama polyklonaalisella seerumilla saadut tulokset 25 ovat yhdenmukaisia keksinnon mukaisten monoklonaalisten vasta-aineiden spesifisyyden kanssa. KeksinnGn mukaisilla monoklonaalisilla vasta-aineilla on kapea spesifisyysalue.

Kaikissa tapauksissa ne tunnistavat yhden ainoalaa-tuisen polypeptidin, jonka molekyylipaino on noin 44 000 -30 48 000 Daltonia (tassa nimetty myos "46 kD:n polypeptidik- si"). Ne tunnistavat samoista sikiGsoluista myOs polypeptidin, jonka molekyylipaino on noin 200 000 Daltonia. jalkimmainen saattaa olla 46 kD:n polypeptidin multimeeri tai se saattaa olla toinen polypeptidi, joka sisåltåå sa-35 man EA-epitoopin, joka on 46 kD:n proteiinissa. 46 kD:n 19 92222 polypeptidi on alkioasteen, raskauden keskivaiheelle aino-alaatuinen antigeeni ja se nåyttas olevan oikea alkiope-rainen antigeeni ja siten onkofetaaliantigeeni.

KavttOmenetelmat 5 KeksinnOn mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita voidaan kayttaa suuressa joukossa eri sovellutuksia. NMita sovellutuksia ovat diagnostiset sovellutukset seka ana-lyyttiset kuvantamis- ja tutkimussovellutukset.

Kåytettavissa olevien diagnostisten menetelmien 10 joukosta yksi keksinnOn puoli kohdistuu menetelmaån, jossa osoitetaan ihmisen kasvaimeen liittyva onkofetaaliantigeeni ja jossa: a) inkuboidaan ihmisen naytetta, jonka epSillSSn sisaltavan mainittua onkofetaaliantigeenia, keksinnOn mu- 15 kaisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa; ja b) maaritetaan, tapahtuuko mitaan oleellista sitou-tumista mainitun antigeenin ja mainitun vasta-aineen va- liiia.

Onkofetaaliantigeenin osoittaminen voidaan tehda 20 kayttåen menetelmiå, jotka immunologisten mååritysmenetel-mien tekniikan asiantuntijat hyvin tuntevat. Voidaan kayt-taa esimerkiksi kompetetiivisia maaritysmenetelmia tai immunometrisia maaritysmenetelmia. Kompetetiivisessa maa-ritysmenetelmassa monoklonaalista vasta-ainetta inkuboi-25 daan havaittavaksi leimatun maaran kanssa onkofetaaliantigeenia ja naytteiden kanssa, joiden epåiliaan sisaitavan tuntematon maarå onkofetaaliantigeenia. Syntyy kilpailu havaittavaksi leimatun antigeenin ja nåytteessa olevan antigeenin vSlille, mika johtaa suhteellisen suoraviivai-30 sella tavalla naytteessa olevan antigeenimåarfin kvantitoi-miseen.

Immunometrisisså maåritysmenetelmissS keksinnOn mukainen monoklonaalinen vasta-aine kiinnitetSSn (etukfi-teen tai myOhemmSssa vaiheessa) sopivaan kiinteaan faasiin 35 ja sita inkuboidaan naytteen kanssa, jonka epailiaan si- 20 92222 såltåvån ihmisen kasvaimeen liittyvåå onkofetaaliantigee-nia. Sitten nåytteen kanssa inkuboidaan samaa tai eri rao-noklonaalista vasta-ainetta, joka on liukoisessa, havait-tavaksi leimatussa muodossa, ja sopivien pesuvaiheiden 5 jålkeen muodostuu kompleksi, joka samanaikaisesti sitoo leiman kiinteåån faasiin. Voidaan saada suoraviivainen suhteellinen riippuvuus leiman ja nåytteesså olevan onko-fetaaliantigeenimåårån vålille. Immunometriset mååritys-menetelmåt voidaan suorittaa suorilla, kåånteisillå tai 10 samanaikaisilla tavoilla. Alan asiantuntijat tuntevat namå kaikki hyvin. Katso esimerkiksi David et al.'Ile mydnnet-tyå US-patenttijulkaisua 4 376 110 nimeltåån "Immunometric Assays Using Monoclonal Antibodies" ("Immunometriset måå-ritysmenetelmåt monoklonaalisia vasta-aineita kåyttåen"). 15 Koskien immunometrisiå mååritysmenetelmia, joissa spesifi-sesti kåytetåån IgM-luokan monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on multivalentteja antigeeneja vastaan, katso myds esimerkiksi Wands et al., PCT/US 81/01270.

Mita tahansa havaittavaa leimaa voidaan kayttaa 20 joko leimatussa antigeenissa tai leimatussa vasta-ainees- sa. Naita leimoja ovat radioisotooppileimat (esimerkiksi 125 2 25 14 P, 3I, h, S, C ja vastaavat). Niita ovat ELISA-tekniikoissa kaytettavat entsyymit (esimerkiksi alkalinen fosfataasi, piparjuuriperoksidaasi, penisillinaasi ja vas-25 taavat), fluorogeeniset yhdisteet (kuten fluoreseiini), bakteriofaagit, NMR-kuvantamistekniikoissa kåyttdkelpoiset metallit, muut radiokuvantamistekniikoissa kåyttdkelpoi-set radioisotooppileimat ja vastaavat. Radioisotooppileimat tai entsyymit ovat edullisia mååritysmenetelmissa kåy-30 tettaviksi.

v Mita tahansa sopivaa ja hyvin tunnettua, immunolo- gisissa mååritysmenetelmissa kåyttokelpoista kiinteåå faa-sia voidaan kåyttåå. Nåitå ovat lateksipartikkelit, poly-styreenihelmet, koeputket, kuidut, kaivot, muut luonnolli-35 set ja/tai synteettiset polymeeriset aineet ja vastaavat.

II

21 92222

Monoklonaalisen immunoglobuliinin avulla puhdistet-tuja antigeeneja voidaan kayttaa tavanomaisissa ihokokeis-sa OFA:Ile herkistymisen testaamiseksi seka antigeeneina lymfosyyttitransformaatiomaarityksissa. Antigeenit voivat 5 my6s olla kayttdkelpoisia herkistettaessa isannån immuuni-systeemi kasvalmen kehittymista tai uudelleenesiintymistå vastaan.

Keksinndn mukaisia alkioantigeeneja voidaan my6s kayttaa merkkiaineina kasvainten toteamisessa ja/tai diag-10 nostisoinnissa aikaisemmin kuvattuja, normaaleja immunolo-gisia måaritysmenetelmia kåyttaen. Naissa maåritysmenetel-missa voidaan kayttåå keksinndn mukaisella menetelmaiia valmistettuja vasta-aineita tai muita niiden kanssa ekvi-valentteja analogisia vasta-aineita, jotka on valmistettu 15 milia muulla menetelmaiia tahansa. Maaritysmenetelmå voi kayttaa mainittuja polypeptideja havaittavaksi leimatussa muodossa (esimerkiksi kompetetiivisella tavalla) tai liu-kenemattomaksi saatetussa muodossa (vasta-aineiden agglu-tinaatiomaaritys tai vasta-aineen sitoutumismaaritys). 20 Siten esimerkiksi havaittavaksi leimatut tai kiinnitetyt polypeptidit, joiden molekyylipaino on 44 000 - 48 000 ja joilla on tassa kuvattuja alkioantigeeni-OFA-erityisomi-naisuuksia, ovat myds osa keksintda.

Polypeptideista muodostuvien antigeenien monoklo-25 naalisten vasta-aineiden kanssa muodostamat kompleksit ovat my5s osa keksintda. Naita komplekseja syntyy esimerkiksi silloin, kun monoklonaalinen vasta-aine sitoutuu polypeptidiin diagnostisessa maaritysmenetelmassa in vitro tai diagnostisessa menetelmåssa tai kuvantamismenetelmas-30 sa. Siten radiokuvantamismenetelmissa (esimerkiksi radio-* aktiivisissa tai ydinmagneettista resonanssia kayttavissa menetelmisså), joissa monoklonaalinen vasta-aine sitoutuu radioisotooppiin tai metalliatomiin tai -atomeihin, kayt-t6kelpoiset kompleksit ovat my6s osa keksintbå.

22 92222

Muita antigeenien ja/tai vasta-aineiden kåyttoso-vellutuksia alkioantigeenin toteaminen ihmisen sikidssS raskauden normaalisuuden varmistamiseksi, erilaistumis-rnerkkiaineiden analyysi sikibbiologiassa, alkioantigeenien 5 ja onkofetaaliantigeenien puhdistus, ihraisten ja eiainten kasvainten tyypitys, kiertSvien onkofetaaliantigeenien seulonta kasvainpotilaissa ja kasvaimen erilaistumismerk-kiaineiden analyysi.

Kasvaintyypitys on erityisen mielenkiinnon kohtee-10 na. On olemassa neljå perustyyppia kasvainluokkia: karsi-noomat, lymfoomat, leukemiat ja sarkoomat. Jokaisessa on useita alaluokkia. Onkofetaaliantigeeneja voi esiintyS eri kudoksissa. Esimerkiksi tietyt onkofetaaliantigeenit saat-tavat esiintyå paksusuolisyovSsså j’a eri onkofetaalianti-15 geenit rintasydvåssa. Siten voidaan valmistaa taman kek-sinnOn mukaisten monoklonaalisten vasta-aineiden panee-leja, joiden avulla voidaan nopeasti suorittaa seulonta ei vain tietyn onkofetaaliantigeenin lasnaolon varmistamiseksi vaan myos sen luokittelu karsinoomaksi, lymfoomaksi, 20 leukemiaksi tai sarkoomaksi sekå edelleen låhdekudos (pak-susuoli, rinta jne. )

Siten tata keksintoå voidaan kayttaa testipakkaus-ten valmistamiseen mainittujen sovellutusten suorittami-seksi. Nama testipakkaukset saattavat sisaitaa pakkauksen, , 25 joka on jaettu lokeroihin, joihin lahekkain mahtuu yksi tai useampia astioita, ja joissa ensimmåinen astia saattaa sisaitaa (esimerkiksi) taman keksinndn mukaisen monoklo-naalisen vasta-aineen liukenemattomassa muodossa ja toinen astia saattaa sisaitaa saman tai eri monoklonaalisen vas-30 ta-aineen liukoisessa, havaittavaksi leimatussa muodossa. Sitten kayttaja voisi suorittaa tietyn onkofetaaliantigeenin immunometrisen maarityksen. Joukko astioita, jotka sisaitavat vaihtelevia pitoisuuksia onkofetaaliantigeenia, saattaisi olla mukana testipakkauksessa, jolloin kayttaja 35 voisi valmistaa vakiokalibraatiokayrån.

Ii 23 92222

LisSksi kasvaintyypityksen mahdollistamiseksi tes-tipakkaus saattaa sisaitaa sarjan astioita, jotka sisaita-vat ennalta maaritettyja, erilaisia monoklonaalisia vasta-aineita havaittavaksi leimatussa muodossa tai liukenemat-5 tomassa muodossa tai molemmissa muodoissa niin, etta nopea seulonta ja erilaistumismaaritys voidaan suorittaa tie-tylle ihmisen kasvainnaytteelle (kuten koepalalle jne).

Nyt kun tama keksintd on yleisesti kuvattu, se voidaan paremmin ymmartaa tiettyjen spesifisten esimerkkien 10 perusteella, jotka on otettu tahån mukaan tarkoituksena vain valaista keksintdå, eika niiden tarkoiteta rajoitta-van keksintdå, jollei toisin ole mainittu.

Esimerkki I

Tassa esimerkissa kuvataan menetelmat, joilla voi-15 daan menestyksellisesti kehittaa useita hiiren alkioanti-geeneja vastaan muodostettuja monoklonaalisia vasta-ainei-ta; nopean monoklonaalisten vasta-aineiden seulontasystee-min aikaansaaminen kokonaisia hiiren sikidsoluja kåyttåen; monoklonaalisten vasta-aineiden isotyyppien måårittaminen 20 ja niiden spesifisyyden EA:a sisSltåville kudoksille ja soluille selvittåminen; ja kiinteåfaasi-ELISA-menetelman kuvaus solun pintaan liittyvåå EA:a vastaan muodostetun monoklonaalisen vasta-aineen tiitterin kvantitatiiviseksi maarittåmiseksi. Epitoopin havaitaan esiintyvSn ihmisen ja 25 hamsterin samoin kuin hiiren sikidsså ja joukossa jyrsi-jdiden kasvaimia.

Materiaalit 1a menetelmat

Kemikaalit

Hanker/Yates, fenyylihydratsiini ja dimetyylisulf-30 oksidi (DMSO) hankittiin kaupallisesti.

Solut

Hiiren magrofaagisolulinja RAW 264.7 kasvatettiin Dulbeccon vaiiaineessa, joka sisalsi 10 % vasikan sikidn seerumia (CS), 2 mmol/1 L-glutamiinia ja 0,045 % natrium-35 bikarbonaattia. Suodatettua, naiden solujen yhdistetyista 24 92222 viljelmistå saatua viljelyvfiliainetta kåytettiin tåydentå-måån hybridoomakasvuvåliainetta. Hiiren L-solut kasvatet-tiin Eaglen vålivaiheessa, joka sisålsi minimimååråt tar-peellisia aineita, (Eagle's minimum essential medium) ja 5 joka sisalsi Eaglen suolat taydennettyna 5 %:lla naudan sikiOn seerumia (FBS), 2 mmol/1 L-glutamiinilla ja 0,045 % natriumbikarbonaatilla. WF5-1-SV40:lia indusoidut hams-terin (LVG) sarkoomasolut ja mKSA-solut, jotka ovat SV40:lia transformoidusta hiiren (Balb/c) sarkoomasta, 10 kasvatettiin 199-vaiiaineessa, jota oli tåydennetty 10 % FBS:lia, 2 mmol/1 glutamiinilla ja 0,045 % natriumbikarbonaatilla, GD-36-solut, SV40-transformoidut hamsterin (LVG) lymfoomasolut yliapidettiin RPMI 1640 -valiaineessa, joka sisålsi 10 % FBS:a, 2 mmol/1 L-glutamiinia ja 0,045 % 15 natriumbikarbonaattia.

Hvbridisoluien fuusioissa kavtettvien C57BL/6n-hii-rien immunisointiprotokollat

Yritykset selvittåå tuottoisinta immunisointiproto-kollaa stimuloida humoraalinen vaste sikioantigeeneilla 20 syngeenisisså urosvastaanottajissa tehtiin kåyttåen seit- semåå erillistå elåinryhmåå, jotka saivat pitoisuuksia kokonaisten, syngeenisten 12-påivåisen raskausajan sikid-solujen uutteita 3 mol/1 KClrssa, eri tavoilla annettuna ja/tai eri injektioiden aikatauluja kåyttåen. Immunisoin-25 tia vårten sikidsolut otettiin talteen ja dispergoitiin, kuten Coggin et al., Advanced Cancer Research 19 (1974) 105, ovat kuvanneet. Entsyymidispergointia ei kåytetty koskaan. Kuten taulukossa 1 on esitetty, hiiriryhmåt sai- 7 6 vat joko suuria (10; tai pieniå (10°) pitoisuuksiasyn-30 geenisiå, kuolettavasti såteilytettyjå (5000 R, 1290 mC) raskausajan keskivaiheen (10 - 12 påivåå) hiiren sikid-soluja.

25 92222

Taulukko 1 a

Immunisointiryhmat immuunipernasoluien (C57Bl/6n) stimuloimiseksi sikiddeterminanteille (EA:t) 1. (SH) = ryhma, joka sai lyhyen aikaa suuren an-5 noksen. Kaksi 10^ elåvåå, 13 påivån C57BL/6n-sikidsolua sisaitavaa annosta annettuna vatsaonteloon yhden viikon vaiein. Yksi samansuuruinen tehosteannos kolmen viikon kuluttua viimeisesta annoksesta ja kolme paivåå ennen per-nasolujen talteenottoa fuusiota vårten.

10 2. (SL) = ryhma, joka sai lyhyen aikaan pienen annoksen. Sama kuin nro 1 paitsi ettå kaytettiin 10° elå-våa, 13 paivan C57BL/6n-sikidsolua.

3. (CFA Ms) = ryhma, joka sai annoksensa Freundin taydellisessa adjuvantissa, joka sisålsi Mycobacterium 15 smegmatitis -bakteeria. Yksi annos Freundin tåydellista adjuvanttia ja pakattuja sikidsoluja sekoitettuna 1:1 (v/v) annettuna 0,03 ml kummankin takajalan anturaan ja 0,04 ml ihon alle keskiselkåån. Viikon kuluttua siirros-tukset toistettiin kayttåen Freundin epatåydellista adju- 20 vanttia. Vain soluja sisaitavå lopullinen tehosteannos annettiin kolmen viikon kuluttua.

4. (CFA Mt) = ryhma, joka sai annoksensa Freundin taydellisessa adjuvantissa, joka sisalsi M. tuberculosis -bakteeria. Sama kuin nro 3 paitsi etta kaytettiin eri My- 25 cobacterium-lajia.

5. (LH) = ryhma, joka sai pitkan aikaa suuren annoksen. Sama kuin SH-ryhma, mutta annettiin viisi viikot-taista annosta ennen lopullista tehosteannosta.

6. (LL) = ryhma, joka sai pitkån aikaa pienen an- 30 noksen. Sama kuin SR-ryhma, mutta annettiin viisi viikot- taista annosta ennen lopullista tehosteannosta.

a) Nelja (4) taysikasvuista (viisiviikkoista) C57BL/6n -uroshiirta ryhmaa kohti.

35 b) Immunisointiin kåytetyt sikidsolut olivat kaikki 13 pfiivan syngeenisia soluja, jotka oli valmistettu asket-tain ja jotka olivat saaneet 5000 R (1290 mC) rontgensa-teita ennen injektioita.

26 92222

Taulukko 1 (iatkuu) 7. (3M KC1) = ryhmS, joka sai 3 mol/1 KClilla liu- koiseen muotoon saatettuja sikibsoluja. Kaksi annosta 13 5 pSivSn C57BL/6n-siki6solujen 3 mol/1 KC1 -uutetta annet-tiin vatsaonteloon annoksina 700 μΐ proteiinia ja vastaa-vasti 450 μΐ proteiinia. Lopullinen, 100 μΐ proteiinia si-saitavS tehosteannos annettiin suoneen.

10 Solut annettiin joko kaikkiaan kolmen injektion, mukaan lukien lopullinen tehosteannos, lyhytaikaisena sar-jana tai kaikkiaan kuuden injektion pitkaaikaisena sarja-na. Kaksi muuta ryhmåa saivat sikiosolut Freundin adju-vantissa, joka sisalsi joko Mycobacterium smegmatitis tai 15 M. tuberculosis -bakteereja, jonka jålkeen seurasi tehos-teinjektio sikiOsoluilla ja Freundin epåtåydellisellå ad-juvantilla ja lopullinen, pelkSstSSn sikibsoluja sisåltSvS tehosteannos. Adjuvantit sekoitettiin yhtå suureen tila-vuuteen pakattuja soluja ja 0,03 ml antigeenivalmistetta 20 annettiin kummankin takajalan anturoihin ja 0,04 ml annettiin ihon alle jokaisen hiiren selkåån. Yksi hiiriryhmå immunisoitiin kahdella vatsaonteloon annetulla injektiol-la, jotka sisålsivåt 3 mol/1 KCl:lla liukoiseen muotoon saatettuja kalvoja pitoisuudessa 0,5 mg proteiinia hiirtå 25 kohti, jonka jaikeen seurasi lopullinen 0,1 mg:n tehosteannos suoneen annettuna. Kaikki lopulliset tehosteannok-set annettiin 2-3 viikon kuluttua viimeisesta immunogee-ni-injektiosta. Herkistetyt pernasolut otettiin talteen kolme påivåå lopullisesta tehosteannoksesta.

30 Hvdridoomavilielmat

Hydridoomasolut valmistettiin fuusioimalla hiiren myelooma, P3X63Ag8.653, ja pernasolut, jotka saatiin tSy-sikasvuisista C57BL/6n-uroshiiristå, jotka oli immunisoitu kuolettavasti såteilytetyillå, raskauden keskivaiheen syn-35 geenisillå vastaavilla sikiosoluilla. Fuusiot suoritet-tiin kåyttåen Kohierin ja Milsteinin menetelmån [Nature

II

27 92222 256 (1975) 495] muunnelmaa kåyttåen solusuhdetta 1:10 hii-ren myeloomasolujen suhde pernasoluihin 50 % (v/v) poly-etyleeniglykoli 4000:ssa. Hybridisolut valittiin kåyttåen RPMI 1640 -våliainetta, joka sisålsi hypoksantiinia, ami-5 nopteriinia, tymidiiniå, 15 % FBS:a, 2 mmol/1 L-glutamii-nia, 0,045 % natriumbikarbonaattia ja 50 pg/ml gentamy-siiniå (HAT-våliaine). Solut ympåttiin 96-kuoppaisille, 5 tasapohjaisille Linbro-levyille pitoisuudessa 3,5 x 10 solua kuoppaa kohti. Sen jålkeen kun hybridisolut oli 10 siirretty 24-kuoppaisille Linbro-levyille, niitå yllåpi-dettiin RPMI 1640 -våliaineessa, jota oli tåydennetty hy-poksantiinilla, tymidiinilla, 15 % FBS:11a, 2 mmol/1 L-glutamiinilla, 0,045 % natriumbikarbonaatilla ja genta-mysiinillå (HT-våliaine). Siirtovåliaine oli mybs tåyden-15 netty 10 %:n tilavuudella suodattamalla steriloituja mak-rofaagisolulinjan RAW 264.7 72 tunnin viljelyn superna-tantteja (HAT + RS-våliaine). Viljelysupernatanteissa ole-vat sikiOperåisiå determinantteja vastaan muodostuneet vasta-aineet mitattiin, kun hybridiviljelmåt olivat tåysin 20 sopeutuneet ja ne voitiin helposti siirtåå in vitro.

Massahvbridoomavilielmien kloonaus monoklonaalisia vasta-aineita tuottavien hvbridoomien tuottamista vårten

Massahybridoomapesåkkeiden kloonaus suoritettiin terminaalisella laimennuksella HT-våliaineessa, jota oli 25 tåydennetty 10 % RAW 264.7 viljelysupernatanteilla. Sata (100) ja kaksi sataa (200) hybridisolua massaviljelmåstå suspendoitiin 10 ml:aan yllå mainittua kloonausvåliainetta ja jaettiin 96-kuoppaiselle levylle, jossa oli 100 μΐ HAT + RS -våliainetta/kuoppa. Sitten kloonit siirrettiin 24-30 kuoppaisille levyille ja myOhemmin kypsåt pesåkkeet mååri-tettiin niiden anti-EA-aktiivisuuden suhteen. Uudelleen-kloonaus suoritettiin kerran tai useamman kerran kullekin hybridoomalle.

Monoklonaalisen vasta-aineen immunoqlobuliiniluokka 35 Kaksoisimmunodiffuusiomååritystå kåytettiin mono- * · · 28 92222 klonaalisen vasta-aineen immunoglobuliiniluokan selvittå-miseksi. Viisi millilitraa l,5-%:ista agaroosia, joka sisalsi 2,5 % polyetyleeniglykoli 4000:ta, sulatettiin kie-huvassa H20:ssa ja tasapainotettiin sen jålkeen 56 °C:seen 5 15 minuutin ajan. Sitten agaroosiliuos kaadettiin immuno- diffuusiolevylle (Miles Laboratory, Inc.) ja sen annettiin jahmettya 25 °C:ssa kolmen minuutin ajan. Agaroosiin lei-kattiin 5 mm:n kaivot siten, etta keskuskaivoa ymparbi symmetrisesti kuusi kaivoa. 10 μΐ 25-kertaisesti konsent-10 roitua monoklonaalisen hybridooman supernatanttia annos-teltiin keskuskaivoon ja 10 μΐ kuutta anti-hiiri-immunog-lobuliini-seerumia, nimittåin anti-IgG.^: ta, anti-IgG2:ta, anti-IgG2Q:ta, anti-IgG^:ta, anti-IgG^Ja ja anti-IgM:aa (Miles Laboratory, Inc.), annosteltiin ympårbiviin kaivoi-15 hin. Levyjé inkuboitiin 48 tuntia 25 °C:ssa ja niita tark-kailtiin paivittain presipitaativiivojen havaitsemiseksi. Normaalia hiiren seerumia ja P3X63 Ag8.653 -viljelysuper-natanttia kaytettiin positiivisena ja vastaavasti negatii-visena kontrollina.

20 Immunosuodatus-ELISA:n laitteisto

TM

Reusable Microfold -laitteistoa V and P Scientific, Inc. -yhtibstå, San Diego, Kalifornia, kåytettiin ELISA-menetelman suorittamiseksi. Lasikuitusuodatinpaperia V & P Scientific -yhtibsta kåytettiin kohdesolujen pyydys-25 tåmiseksi ja kiinnittåmiseksi paikoilleen. Suodatinpaperia esikasiteltiin 2-%:isella gelatiinilla, joka sulatettiin pois kuoppien alta kuumalla vedellå (90 °C) ennen solujen pipetointia.

Immunosuodatus-ELISA:n kohdesolut 30 ELISA-menetelmåsså kåytetyt kohdesolut olivat as- kettain talteenotettuja, kerran synnyttaneista ja samaan aikaan pariutetuista naaraista peraisin olevia 12 - 13 paivan raskausajan C57BL/6n-sikibsoluja. Kokonaiset, elå-vat sikibt poistettiin aseptisesti kohdusta ja pestiin 35 perin pohjin 5 kertaa Hankin tasapainotetulla suolaliuok- 29 92222 sella (HBSS), pH 7,0, ennen kuin ne puristettiin 20 gaugen neulan lapi tuoreeseen HBSS:3Sn 37 °C:ssa. Sen jålkeen kun soluja oli varovasti pipetoitu 2-3 kertaa, ne suodatet-tiin steriilin, 4x4 -suuruisen puuvillaisen harsokangas-5 tyynyn låpi jatteiden poistamiseksi. Solut pestiin HBSStsså sentrifugoimalla hitaalla nopeudella, minkå jai-keen ne laskettiin ja 5 x 10^ solua suspendoitiin uudel-leen 10 ml:aan 0,05-%:ista fenyylihydratsiinia fosfaatilla puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa (PBS), 10 10 mmol/1, pH 7,4, ja suspensiota inkuboitiin 30 minuuttia 25 °C:ssa endogeenisen peroksidaasiaktiivisuuden inhiboi-miseksi. Sitten kåsitellyt solut kaytettiin suoraan ELISA:ssa.

Suodatus-ELISA:ssa kåytetyt viljellyt kasvainsolu-15 linjat suspendoitiin raaputtamalla solut pulloista ja dis-pergoimalla ne pipetoimalla. Sitten solut pestiin kahdesti HBSSrllå, ennen kuin ne suspendoitiin uudelleen fenyyli-hydratsiiniliuokseen.

ELISA- (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay)

TM

20 -maaritvs Reusable Microfold -laitteistoa kåvttåen

Kaytetty immunosuodatus-ELISA-menetelma oli epa-suora immunoperoksidaasireaktio. Fenyylihydratsiinilla kasitellyt sikibsolut laitettiin 96-kuoppaiseen Reusable TM 4

Microfold -laitteistoon pitoisuudessa 5 x 10 solua 25 kuoppaa kohti. Solut kiinnitettiin vakuumin avulla lasi- kuitusuodattimen paaile laitteen keski- ja yiaosien vaiiin laitettuna. Suodatinpaperi esikasiteltiin gelatiinilla (3 %) kuoppien vaiisen reaktioiden ristikontaminaation estamiseksi. Gelatiini poistettiin yksittaisista suodatus- 30 kanavista antamalla kuuman veden kulkea gelatiinilla kasi- tellyn suodattimen lapi ennen kayttbå. Soluja inkuboitiin 50 μ1:η kanssa normaalia vuohen seerumia (NGS) 20 rainuutin

ajan 25 °C:ssa ja NGS poistettiin vakuumin avulla Reusable TM

Microfold -laitteistossa olevista soluista. Sitten jokai-35 seen kuoppaan lisattiin 100 μΐ hybridisolupesakesuperna- 92222 30 tanttia ja inkuboitiin 60 min:n ajan huoneenlåmpotilassa. Sitten solut kasiteltiin vakuumilla, pestiin palkolllaan laitteessa kuusl kertaa 250 pl:lla PBS:aa, joka sisalsi 5 % CS:aa, ennen kuln lisattlln 100 μΐ peroksidaasilla 5 konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG - ja -IgM-seerumia (af-finiteettipuhdistettu, absorboitu ihmlsen seerumllla, KPL, Incorporated, Gaithersburg, Maryland). Peroksidaasilla konjugoitua antiseerumia kaytettiin laimennoksena 1:300 PBS:ssa, joka sisalsi 5 % CS:aa. 30 minuutin inkuboinnin 10 jaikeen 25 °C:ssa solut pestiin kolmesti PBS + CS -seok-sella ja kolmesti Tris:lia puskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella, 10 mmol/1, pH 7,4, (TBS). Nåytteisiin li-sattiin 100 μΐ Hanker/Yates-reagenssia (8 mg/10 ml TBS) ja 0,03 % H2^*2:a ja reaktiota tarkkailtiin 30 minuutin ajan. 15 Positiiviset reaktiot kåsittivåt tumman, mustanruskean sakan muodostumisen. Reaktiot pysaytettiin 25 pl:lla 4 N HoS0.:a ja kuivattiin vakuumilla suodatuslaitteistossa. Vierekkain olevat negatiiviset ja positiiviset kuopat voi-tiin helposti erottaa toisistaan. Suodatinpaperi voitiin 20 mybs sailyttåå pysyvånå todisteena ja uusi gelatiinilla kasitelty suodatin laitettiin laitteistoon valitdnta uu-delleenkSyttOå vårten.

Kiinteafaasi-ELISA ( Enzyme-Linked-Immunosorbent-

Assav) 25 Monoklonaalisen anti-EA-vasta-aineen titraus 5 ELISA:11a suoritettiin seuraavasti. 100 μΐ 5 x 10 asket-tain talteenotettuja kokonaisia, pestyja (viisi kertaa) C57Bl/6n-siki0soluja kiinnitettyna 0,2-%:iseen puskuroi-tuun glutaraldehydiin, joka sisalsi 1 % BSA:a, lisattiin 30 jokaiseen tasapohjaisen polyvinyylikloridi-mikrotiitteri-levyn kuoppaan ja inkuboitiin 2-3 tuntia 25 °C:ssa. So-lususpensiliuos sipaistiin pois ja 100 μΐ 50-%:ista NGS:a lisåttiin kuoppaa kohti ja levya sailytettiin 4 °C:ssa kayttOQn asti. ELISA-menetelma aloitettiin poistamalla 35 50-%:inen NGS-seos ja 100 μΐ monoklonaalista hybridoomasu- 31 92222 pernatanttia, joka oli laimennettu PBS - l-%:isella BSA-seoksella (2-kertainen sarjalaimennus) lisåttiin jokaiseen kuoppaan ja levyjå inkuboitiin huoneenlåmpåtilassa yli yOn. Menetelmå suoritettiin tåstå låhtien kuten normaali 5 epåsuora ELISA inkuboiden kahden tunnin ajan peroksidikon-jugaatin (laimennettu 1:500) kanssa. 30 minuutin kuluttua kromogeenin lisåyksestå ABTSråå ja H2O2:a lisåttiin perok-sidaasireaktion aktivoimiseksi, levyt luettiin Multiscan ELISA -spektrofotometrillS 414 nm:n valon aallonpituudel-10 la. Sikiåsolukalvoja, jotka oli valmistettu kuten Coggin, Cancer Research 39 (1979) 2752; tai Coggin, Methods in

Cancer Research XVIII (1979) 371 - 389, on kuvannut, voi-tiin myos kåyttåå.

Hybridipesåkkeiden seulonta vasta-aineiden EA-spe-15 sifiswden suhteen

Hybridipesåkesupernatantit, jotka olivat positiivi-sia kohdesikiOsoluille, seulottiin spesifisyyden suhteen absorboimalla hybridoomaviljelysupernatantit vastasynty-neen tai tåysikasvuisen hiiren (C57BL/6n)) kudosten so-20 lususpensioilla. Tåysikasvuisen hiiren aivot, lihas, sy- dSn, maksa ja munuaiset kerSttiin ja laitettiin HBSS:åan, pH 7,4. NSiden kudosten solut dispergoitiin puristamalla ne hienolankaisen 40 mesh:n seulan låpi ja pestiin kahdes-ti HBSS:llå. Kolmentoista påivån sikiOsoluja kerran syn-25 nyttåneistå luovuttajista kåytettiin EA-positiivisena kontrollina. Sikidsolujen vakioabsorptiokåyrå valmistet-tiin kåyttåen 1 x 10^ - 3 x 10® solua 200 μ1:η kanssa ti-ettyå monoklonaalista supernatanttia. Jokaisen absorptio-nåytteen absorbanssilukemaa verrattiin saman monoklonaali-30 sen supernatantin absorboimattomalta titrauskåyråltå saa- tuun vastaavaan absorbanssiin. Laimennosten lukumåarån ero laskettiin ja poistetun aktiivisuuden suhde måSritettiin 50-%:isella poistolla laimennosta kohti (tåmå tarkoittaa, yksi laimennos, 50 %; 2 laimennosta, 75 %; 3 laimennosta, 35 87,5 %, jne). Sitten vakioabsorbanssi esitettiin graafi- • 32 92222 sesti kåyttåen poistetun aktiivisuuden prosenttisuutta solujen lukumååråå kohti.

Myds monoklonaalisten vasta-aineiden spesifisyys sikidsolujen suhteen ja kasvaimien pinnalla olevien, ris-5 tireagoivien OFA:iden osoittamisen suhteen testattiin kiinteåfaasi (SP)-ELISA:a kåyttåen. Kohdesoluina kåytet-tiin jyrsijåin kasvainsolulinjoja, jotka oli dispergoitu ei-entsymaattisesti. Jokaiselle jyrsijåin kasvainsolulin-jalle mååritettiin sikidsoluekvivalentti-absorptioarvo 10 vertaamalla poistettujen aktiivisuuksien prosenttia vas-taavaan saman lukumåårån sikidsoluja avulla poistetun aktiivisuuden prosenttiin. Nåmå solutyypit sisålsivfit hiiren SV40-transformoidun mKSA-linjan samoin kuin hamsterin SV40-transformoidut WF5-l-ja GD-36-linjat.

15 Tulokset

Aikaisemmassa tyosså (Coggin, J. et al., Ciba Foundation Symposium (toim. ), Embryonic Antigens in Malignancy and Pregnancy: Common Denominators in Immune Regulation, Lontoo: Pitman Books, sivut 28 - 54, havaittiin, ettå 10 20 påivån raskausaikaisia hamsterin sikiosoluja vastaan saatu polyklonaalinen, in vivo absorboitu, ksenogeeninen anti-seerumi saosti immunologisesti sikidspesifiset polypepti-dit 12 - 13 påivån hiiren tai 10 påivån hamsterin sikidso-lujen 0,5-%:inen Nonidet-P-40- ja 3 mol/1 KC1 -uutteista. 25 Useita selviå sikidspesifisiå polypeptidiviivoja esiintyi SDS-PAGE-måårityksesså. Monoklonaalisen vasta-aineen saa-misen mitå tahansa nåitå EA-determinantteja vastaan odo-tettiin olevan vaikeaa, sillå herkiståmispyrkimykset kå-sittåisivåt immunisoinnin syngeenisillå sikidsoluilla. 30 Raskaana olevat, syngeenisesti pariutetut naarashiiret ja -hamsterit saattaisivat olla hyvå EA-herkistettyjen B-so-lusplenosyyttien låhde hybridoomafuusiota vårten, mutta aikaisemmissa tutkimuksissa nåisså pernakudoksissa oli havaittu eståjåaktiviteettia anti-EA-immuunivasteita vas-35 taan ja tåmå saattaisi rajoittaa hybridooman kehittymistå.

« 33 92222

Syngeenisesti pariutettuja, raskaana olevia Balb/c-hiiria kåytettiin toistuvasti EA-herkistettyjen haimasolu-jen låhteenå fuusioon ja hybridooman tuottamiseen, eika stabiileja hybridoomia saatu. Edelleen kokonaisten, såtei-5 lytettyjen, syngeenisten sikidsolujen tai naiden solujen liukoisten uutteiden injektoiminen LSH-hamstereihin pyr-kimyksena saada hamsteri: hiiren P3X63Ag8.653 -myeloomaso-luhybrideja syngeenisilia sikifisoluilla herkistettyjen hamsterin pernasolujen kanssa epåonnistuivat. LisSksi 10 Balb/c-hiiret osoittautuivat mytts varsin huonoiksi vastaa-jiksi syngeeniselle sikiolle, vaikka muutamia anti-EA+-reaktiivisia hybridoomia saatiinkin EI-maaritysta 12 dmfc -soluja kohdesoluina kåyttSen. Valitettavasti nåitå hybridoomia ei voitu siirtåå in vitro.

15 Pyrkimys onnistui kuitenkin C57Bl/6n-hiirelia.

sateilytetyilia 12 dmfc -soluilla immunisoidut C57Bl/6n-hiiret osoittautuivat erinomaisiksi pernasolujen lahteeksi haluttujen anti-EA-immunoglobuliinia tuottavien hybridoo-mien tuottamiseksi. Kuten taulukossa 2 on esitetty, huo-20 mattavia maåriå hybridipesåkkeitå, jotka tuottivat vasta-ainetta EA+-12 dmfc -soluja vastaan EI-maarityksessa, saa-tiin 12 dmfc -soluille herkistettyjen C57Bl/6n-hiirien pernasolujen fuusioista.

34 92222 i Ή \ I 1-1 q £> G I :(τ) id 0) id 0) 3 >

cn 0) 4/ 0) .¾ I

3 cn -3 id ,* 3 tn

. C r—I ιΗ Ή tC

+ id Æ '-ι =<d

<q x -3 -n q C

U fi 3 <U Id (d

C (Id 3 C -3 (d C

0) > Ο O > CM · 3 S -3 — -r"> *3 0) -3 -3 CN E-ι 3 Id 0) c 3 «0 iO 3 O «d \ \ >3

Cl) 3 (¾ -3 C4 O' 3 O Z ο cn ,c η o ,y 3 id =id mo

Cfl Cl) ‘ CN -3 O 0) (Id x χ <H i η η n ic g 2 o 4J id " 8 id -η CD 3 C >3 CD ¾ G I <U -H i—1 hO σι α) n i -3 3 0 r η οι id h > 3 cn

ir I C lid -H 3 lO

-3| >1 Id -η Ο 0-3 W < 3 rH O' (id 3 ω Crl C « 4 (N · ,-Ι -3-3 q >, -3 O 0) (id CN E-l 3 · ,Q 01 :id cn in οι -3 3 ud \ \ c id «d 3 id .* 3 8 cm z ι-i Q)+jq 3 3 3 o a q 3 cn ,-i a>cn :id (uetnOncu^ x > 3 O id 3 O 0) 3 3 id -3 -3 3 > x w x ,h :id -n (id 0) ·3 -1-1 Qi a) id i a/ o

E I I I 01 I C rH CN O

Id -3 3 3 3 0) 3 Ild lid ,—13 3 0) O «8 rH 0 3 -3 3 g 3

DU ·π O tr\ > :» 3 >1 Id X

O Id W id =3 0 (Id 0) > 3 -n 0) G I 0) 3 -X 8 3 0) O «d SH >, O 3 (Id 3 3 Ο) 3 -3 3 - rH 4-1 (Id Id ^ C-P»d id (id a) s id ε -n 3 ai <u (id

H J4 -nd ID 3 ri g ,-ι Id E

3 0) 3 0) .¾ C C|-| o 1-1 0) 3

·· CD -3 CN C 3 3 3 LD · -3 -3 3 X

C > H Id Η ·η (I IN E-l (-1 CO Id I 3 , W C Ο -X 3 -3 \ · r-1 3 -3 < 3 ™H<VXGGX£cv Z \ · 3 id M 01 iGC3a)G(D33CN 3 C 3 Οι H -3

Ow-Hidaiai-HidO 3 a) cn i3 <d ,* i 6 Ό .x -r-ι > 3 -r-> 3 o o w a X « Id 3 M 3 Ο 3 3 +j q) a m χ μ χ 3 jj +j ci—. > tu i x o *-< id -3 G 0J 3 c#> ai O' ω 3 Ό Ο 0) Ό 3 —- q CN -3

Id O CO -3 -3 «1 Id -r4 > c pj 3 0 > ni -H (id -3 c id -3 a) ^ 01 Η Λ! Id 4 —. . - 3 3 3-3 ¾ 0 C Ο Λ< C (Id CM O C0 Λ rH 01 4-1 -3 C a) O' (id ο «ΰ m in co 0 «d O -3 tu 3 G id ω λ; g — -- —,*>30).*

E -3 0) 0) O 3 CN LO Γ- 0) I 3 Ο -X

8 > (¾ & -X .X cn ^3· -3 H -3 Cn =3

-3-3 >, r% -3 CO

•3 4-1 ΓΠ cn m a>

Id 4-1 G G I -3 Ck

3-3 00)3 o) 3 :id G

5 » 3TIh .* Id cn (Id c 0 0 3-3 01U >, > 01 (id 0) rH Oi 3 0) -3 (id id -3 3 *i—» 3 3 .X id 3 3 > O' G 3 Φ — id c (id σι o cNddaic-3 3 οι ο 3 ad ο 'id 40 r3 cn 8 id ο ,c 3 3 3 0) cn Λί g 3 3 ,¾ Æ (Id -3 λ 8 ο) ai ο 3 o» >8 r-i Ό tr< Qt X X 3 id 3 -3 id —- ai λ: ud 3 ο ---- C3>ldQ( G C G G λ a> O -3 > \ aj 01 a) ω Λ s -<—> >ι -3 3 Ό -η -η Ό I m rH O 0) 3 3 3 -3 01 4| Id · -3 3 0) 0) rH 3 0) -3 (Id -1-1 3 ild c Λ! J<0 3 ^ Id (IJ CO CN Ί3· OJ 01 Id ^ ;· X M -3 C g cn cn 3 0) ud nd (O 8 ud 0 3 3 3 -3 x id nj ai W ‘i 'ri i?. -¾ -¾ 3 X X X 0) H) X O 0) O 3 id (id 3 3 C4 ft -3 O, Q| X 3 I (dcnoo· id 01 :0 -3 φ -n -r-ι ud 3 cn C.H n o, ω ω 01CI "Π Q)(d--0101 (da) -3 ftl-X i 3B3301-3 S3 3i C-h i id *3 3 idoa)ida>i(d>>, ld-3C(d -3 CO I -3 3Q| U 800)010)3-3 3 g-3-3 3 Id -3 id li 3 W d X » )< 3 H fl 0^30(3 fti^o 3<i3rH 0-3 340)20)30) O 0)0 H li 3 -3 id O 01 3 01 4 Id II Ili (J .IC o ¾ C -3 3^id idnj-3 idSoic 3 λ 01 C 01 >, (d 3 Ild q 0 (Id 3 v CH -3 (0 3-3 Id >1 01 -3 0) Ild 0) -3 3 > 3 3 § >17· åen >1 *- -3 01 o !>ia3cnidcnAi«w

Λ-3Β05 £« H 3 4dC^i-3S

.. >, (Id E 3 >, >1 O 0 3 >1 <D -3 o ^ S ft H cn 3 I» ID i3CU)3CO id Λ O ¾ 0)3 35 92222

Suuria eroja havaittiin eri immunisointiprotokol-lien tehokkuudessa saatujen hybridoomien lukumåårån perus-teella arvioituna. Immunisointi seka kokonaisilla sikidso-luilla suurta annosta ja lyhytaikaista immunisointimene-5 telmaa kayttaen etta 12 dmfc -solujen 3 mol/1 KCl-uutteel-la johti korkeimpiin antl-EA-hybrldoomalukumåariin, joilla saatiln positiiviset ELISA-reaktiot syngeenisia 12 dmfc -soluja vastaan EI-seulontamaarityksessa. Glassy et al.’n, J. Immuno. Methods 58 (1983) 119, ELISA-immunosuodatus 10 (El) -maaritykselia voitiin osoittaa ja nopeasti seuloa vasta-aine niitå EA-determinantteja vastaan, joita esiin-tyi 12 paivan raskausaikaisissa hiiren sikidsoluissa, sil-la edellytyksellå, etta endogeeninen, solussa oleva pe-roksldaasl estettiin riittavåsså måårin vuohen seerumilla 15 ennen testattavan hybridoomasupernatantin lisaystå (katso menetelmat-osa yksityiskohtia vårten). Taysikasvuisen hiiren kudokset 19 paivan, EA" [Weppner, W. A. ja Coggin, J.

H., Cancer Res. 40 (1980) 1380] raskausajan loppuvaiheen sikidperaiset hiiren solut eivat reagoineet minkaan hybri-20 doomasupernatantin kanssa. Varovaisuutta taytyi noudattaa valittaessa oikeat kromogeenipitoisuudet korkeiden tausta-tasojen vaittamiseksi. Eivat adjuvanttia kåyttavat immuni-sointiprotokollat sikidsoluilla eivatkå pitkaaikaiset, useita inokulaatioita sisaltaneet protokollat olleet me-25 nestyksellisia tuotettaessa sopivia anti-EA-hybridoomia.

Taulukossa 2 on esitetty myds anti-EA-vasta-ainetta sisaltavien alkuhybridoomapesakkeiden eloonjaåminen jatko-viljelyn jalkeen. Vaikka kaikkiaan 201 pesaketta (70 %) jai eloon jatkoviljeltyinå 24-kuoppaisilla muovilevyillå 30 ja kasvoi HT-vaiiaineessa, joka oli tåydennetty RAW 264.7-solusupernatanteilla, suuri joukko pesakkeita kuoli myd-hemmin, kun hybridisolut stabiloituivat. Seuranneet yri-tykset, jotka suoritettiin ilman 10 % RAW-supernatantti-taydennysta, osoittivat, ettå normaalit lymfosyytteja ra-35 vitsevat solut eivåt olleet kyenneet stabiloimaan hybri-doomia. Tulokset, jotka saatiin kudosviljelyn lapikaynei- 36 92222 den hybridoomapesåkkeiden alkuseulonnasta niiden spesifi-sen sitoutumisen suhteen kerran synnyttåneestå naaraasta perSisin oleviin syngeenisiin EA+ 12 - 13 pSivan hiiren sikiOn soluihin (12 dmfc -solut) EI-måårityksesså, on esi-5 tetty taulukossa 2. Kaikki taulukon 2 sarakkeen 4 positii-viset hybridoomapesSkkeet, jotka tuottivat anti-EA-vasta-ainetta, reagoivat EA+-sikiiSsolujen kanssa v&hintåån kol-messa erillisessS ELISA-kokeessa kolmella peråkkaiselia kloonaamattomalla hybridoomajatkoviljelmållå. Kun vasta- g 10 syntyneen tai tåysikasvuisen hiiren soluja (10 /ml) sus- pendoitiin vasta-aineeseen ja kåytettiin absorptiokohde- soluina ennen testausta EI-måårityksellå 12 dmf -kohdeso- luilla (sarakkeet 5 ja 6, taulukko 2), hybridoomat yhden- mukaisesti eivSt reagoineet nSiden ei-sikidperåisten ku- 15 dosten kanssa eivåtkå absorption jalkeiset vasta-ainetiit- terit muuttuneet. Tåydellinen vasta-aineiden absorptio El- 6 8 maaritykselia havaittuna saatiin kuitenkin 10 - 10 12 dmfc -soluilla.

Naiden alkuperaisten hybridoomien kloonatuista hyb-20 ridoomista peraisin olevan monoklonaalisen vasta-aineen spesifisyyden osoittaminen kuvataan seuraavassa osassa. Vedettiin se johtopaatos, etta immunisointimenetelmat, joissa kåytettiin lyhytaikaista, suuriannoksista menetel-maa ja 3 mol/1 KCl-menetelmaa, olivat parempia kuin kaikki 25 muut testatut menetelmat. Kolmekymmentaviisi alkuperaista, kloonaamatonta hybridoomaviljelmaa, jotka siirtyivat ku-dosviljelyyn RAW:11a taydennetyssa vaiiaineessa ja joilla saatiin positiiviset tulokset EA+-kohdesikiosoluja kaytta-vassa EI-maarityksessa valittiin satunnaisesti lisatutki-30 mukseen. Nåma jatkoviljeltiin ja maaritettiin mydhemmin EA-spesifisyyden suhteen absorboimalla hybridoomasuper-natantit vastasyntyneen hiiren EA -kudoksen tai EA+ 12 dmfc -solujen asetonipulverin kanssa (taulukko 2). Positiiviset ELISA-reaktiot havaittiin EA+ 12 dmfc -kohde-35 soluilla viela sen jalkeen, kun supernatantteja oli toi-stuvasti absorboitu vastasyntyneen C57Bl/6n-hiiren kudok-sen kanssa, 32:ssa 35:stS supernatanttiviljelmånesteestM, 37 92222 mika osoittaa kloonaamattomissa viljelysupernatanteissa olevien anti-EA-vasta-aineiden suunnatonta spesifisyytta. Anti-EA-reaktiivinen immunoglobuliini(t) poistui, kun suo-ritettiin yksi ainoa laimentamattomien hybridoomasuperna-5 tanttien absorptio EA+ 12 dmfcs -soluilla, 32:ssa 32:sta in vitro siirretyista kloonaamattomista hybridoomista.

EA-determinanttia vastaan saatuien monoklonaalisten vasta-aineiden karakterisointi ia titraus

Alussa saatiin kolme monoklonaalista vasta-ainetta 10 tuottavaa hybridoomasolulinjaa kloonaamalla lyhytaikaises-ta, suuriannoksisesta immunisointimenetelmåsta 12 dmfcs -soluja kayttaen peraisin olevia massapesåkkeiden soluja RAW-supernatanttitaydennysta kaytettiin, kun saatiin nama kloonatut solut. Yksi kloonattu hybridooma saatiin 3 mol/1 15 KC1 -ryhmasta ja yksi saatiin lyhytaikaisesta, matala-an-noksisesta ryhmasta. Kummankin kloonaus saatiin aikaan pesakkeenmuodostuksella metyyliselluloosaan ja terminaali-sella laimennuksella nestemaisesså våliaineessa. Seuraava kloonaus viela yhta loppupistelaimennus- ja yksisolueris-20 tys -menetelmia kayttaen suoritettiin kautta koko tutki-muksen. Nelja monoklonaalista vasta-ainetta oli IgM-iso-tyyppia ja yksi oli IgG-isotyyppia. Kaikki viisi monoklo-naalisen vasta-aineen tuottajaa ovat yhdenmukaisesti tuot-taneet vasta-ainetta, joka reagoi spesifisesti 12 dmfc 25 -solujen kanssa mutta ei taysikasvuisten solujen kanssa SP-ELISA:ssa monissa perattaisissa kokeissa. Isotyypin muuttumista (IgM IgG) neljan IgM:aa tuottavan monokloonin joukossa ei havaittu edes kaanteisen viljelyshokin olosuh-teissa. Yksikaan vasta-aineista ei ristireagoinut vasikan 30 fetaaliseerumin tai tavallisen vasikan seerumin kanssa geelidiffuusio- tai SP-ELISA-menetelmassa edes 25-kertai-sesti konsentroituna.

Kvantitatiivista PVC-levyilia suoritettua SP-ELISA-menetelmåå kåyttaen viiden hybridooman supernatantin im-35 munoglobuliinit voitiin titrata tiitteriin >1024 neljan monokloonin kohdalla ja tiitteriin >2048 monoklonaalisen • vasta-aineen 155 (sh) kohdalla kayttåen kohdeantigeenina 38 92222 syngeenisiå 12 dmfc -soluja (kuvio 1). Hyvin samantapaisia tuloksia saatiln monilla monoklooneilla, jotka testattiin glutaraldehydillå kiinnitettyjå sikidsolukalvoja vastaan, jotka oli valmistettu aikaiseimnin kuvatulla tavalla [Lef-5 fell, M. S. ja Coggin, J. H., Cancer Res. 37 (1977) 4112 ja Sijens, R. J. et al., Hybridoma 2 (1983) 231 - 234] ja joita kåytettiin kohdeantigeenina SP-ELI-SA:ssa.

Anti-EA-monoklonaalisen vasta-aineen speslfisws Viiden yllå luetellun monokloonin tuottamien viiden 10 vasta-aineen spesifisyys testattiin joko 13 dmfs-solujen tai raskauden loppuvaiheen (19 pv) hiiren sikidsolujen tai tåysikasvuisen C57Bl/6n-hiiren solujen avulla tehdyn ab-sorboinnin jålkeen. Kuten kuviossa 4 on esitetty, mono-kloonille 69.1, joka tuottaa IgM:åå, yksi ainoa absorptio 7 15 10 13 dmfc-soluilla, mutta ei yhtå suurella måårållå tåy sikasvuisen hiiren soluja, poisti IgM:n taustan tasolle, kun absorboitu supernatantti mydhemmin testattiin EA+ 12 dmfc -soluja vastaan SP-ELISA-måårityksesså. Toisessa kokeessa kahdentoista påivån raskausaikaiset sikidsolut 20 poistivat kaiken monoklooni 69.1:n aktiivisuuden vain 10° g solulla, kun taas 10 tåysikasvuisen hiiren solua ei pois-tanut merkittåvåsti vasta-ainetta (tuloksia ei ole esitetty). Oleellisesti identtisiå tuloksia taulukossa 2 esitet-tyjen tulosten kanssa saatiin neljålle muulle monokloonil-25 le, kun kantasupernatantit (tiitterit yli 1024) laimennet-tiin siten, ettå saatiin 600 - 800 absorbanssiyksikkdå (SP-ELISA) IgM:åå tai IgG:tå, ja absorboitiin kerran 5 x 6 7 10 tai 10 sikidsolun tai tåysikasvuisen hiiren solulle.

Absorptiotulokset, jotka saatiin monoklonaalisille 30 immunoglobuliineille EA+-soluja tai -kudoksia kåyttåen korreloivat tåsmållisesti aikaisemmin havaittuun nåiden • i eri kudosten tai kasvainten potentiaaliin ristireagoida hiiren tai hamsterin sikidsolujen kanssa kudossiirtomååri-tyksisså (Coggin, J. H. ja Anderson, N. G., Adv. Cancer 35 Res. 19 (1974) 105, ja Coggin, J. H. ja Ambrose, K. R.,

Cancer Research Voluumi XVIII, ss. 371 - 389 (Academic • Press, New York, 1979) (taulukko 3).

I

39 92222

Taulukko 3

Monoklonaalisten vasta-alneiden spesifisyys siJciosoludeterminan-teillea absorptioanalyysm perusteella

Osoitetun kudoksen kapasiteetti poistaa 5 12 dmfc-solujen kanssa reaktiiviset monoklonaaliset vasta-aineet ELISA-maarityksessa

Absorptiokohdeso lut (EA-esiintyminen)b_ KC158 SL13.1 SH115 SH38,46 SH69.1 10 13 pv C57-hiiren sikiosolut (EA+) + + + + + 10 pv LVG-hamsterin sikio- + + + + solut (EA ) + + + + + + 10 vk ihnisen sikiosolut (EA ) + + + + + + 17 vk ihnisen sikiosolut (EA ) WF5-l-hamsterinsolut (EA+) + TC + + + ++ +

Ij mKSA-hiiren sarkocxnasolut (EA ) GD- 36-hamsterm lymfocmasolut + + + + + (EA ) _ L-solut (EA?) BHK-solut (EA-) 16 pv C57-hiiren sikiosolut (EA ) 14 pv LVG-hamsterin sikiosolut - - 20 (EA-)

Vastasyntyneen C57Bl/6n:n solut ~

Taysikasvuisen C57-hiiren - - - - - solut (EA )

Taysikasvuisen hamsterin solut (EA ) - ~

Aikuisen ihnisen fibroblastit (EA )

Aikuisen ihnisen esinahka (EA?) - _ _ _ _ 25 Aikuisen ihnisen perifeerinen veri - - - -

Lymfosyytit (EA?) - - - 40 92222 a) Spesifisyys mitattiin kiinteafaasi-ELISA:11a 12 dmfc -kohdesikiGsoluja kåyttåen senjålkeen, kun oli suo-ritettu yksi ainoa monoklonaalisten supernatanttien ab-sorptio mainituilla absorptiokohdesoluilla.

5 b) Absorptiokohdesolut valmistettiin suspendoimalla solut ei-entsymaattisia menetelmiå kåyttåen ja kasitellen niitå l-%:isella BSA:lla PBS:ssa. (EA+) = Solulinjat, joi-den tiedetåån aktivoivan T-lymfosyyttien vålittåmån kas-vainresistenssin. (EA ) = Solut, jotka eivåt osoittaneet 10 aktiivisia kasvainresistenssiå. Identtiset tulokset voi-tiin saada asetonilla uutetuista sikiGkudoksista tai tåy-sikasvuisten kudoksista.

c) Yhta suuret tilavuudet monoklonaalisia superna-tantteja ja pakattuja absorptiokohdesoluja sekoitettiin ja 15 inkuboitiin 1 tunti 37 °C:ssa ja 18 tuntia 4 °C:ssa ennen kåyttoa immunosuodatus-ELlSA:ssa EA+-dmfc-soluja kayttaen.

d) +, osoittaa yli 400 absorbanssiyksikon vasta-ainetta tåydellistå absorboitumista aallonpituudella 490 nm yhdesså ainoassa absorptiokokeessa; -, ELISA-reaktio ei 20 osoita 400 absorbanssiyksikon vasta-ainetta absorptiota yhdessa ainoassa absorptiokokeessa jåttaen yli 350 absorbanssiyksikon suuruisen vasta-ainereaktiivisuuden 12 dmfc -kohdesoluja kåytettåessa; NT tarkoittaa ei mååritettyS.

e) Ei mååritetty.

25 Monoklonaalista vasta-ainetta sisåltav&t superna- tantit reagoivat voimakkaasti ksenogeenisten LVG-hamsterin 10 pv:n EA+-siki0perSisten kohdesolujen kanssa, mutta eivåt nåiden jyrsijGiden tåysikasvuisten kudosten kanssa (taulukko 3). Useimpien kåytettyjen varhaisviljelmåsuper-30 natanttien monoklonaalisen vasta-aineen tiitterit olivat 1:512 tai suuremmat kvantitatiivisessa SP-ELISA-måårityk-sesså. Sekå tuoreet tåysikasvuisen jyrsijån kudokset ettå asetonilla uutetut tåysikasvuisen kudokset, mukaan lukien aivo-, keuhko-, sydån-, maksa-, perna- tai munuaissolut 35 testattiin, eivåtkå ne pysytyneet poistamaan vasta-aineita li 41 92222 eri monokloonien supernatanteista. Jokaisesta viidesta viljellysta linjasta saatu monoklonaalinen vasta-aine rea-goi myOs EA+:n SV40:lia indusoitujen tai transformoitujen WF5-l-solujen, GD-36- ja mKSA-solujen kanssa El-méSrityk-5 sen mukaan (taulukko 3), mutta eivåt reagoineet pitkSai-kaisten in vitro -viljeltyjen L-solujen (hiiri) tai kon-takti-inhiboitujen BHK (hamsteri) -solujen kanssa.

Erittåin mielenkiintoista oli, etta raskauden toisen kolmanneksen ihmisen sikiiJn tuoreet homogenaatit 10 (taulukko 3) absorboivat jokaisen vasta-aineen. Tuoreet tai tuoreiden, viljelemSttOmien esinahkasolujen asetoni-pulverit tai ihmisen perifeerisen veren lymfosyytit eivåt kyenneet absorboimaan monoklonaalisia vasta-aineita (taulukko 3).

15 EA:n såilvttåminen iaadyttårnålla

Kloonaamattomien hybridoomien supernatanttien, jot-ka oli saatu 12 dmfc -soluilla lyhytaikaista, korkea-an-noksista immunisointiprotokollaa kayttaen herkistetyistå hiirista, alkuseulonnoissa havaitsimme, etta voitiin ha-20 vaita huomattava siirtymå tietyn supernatantin reaktiivi-suusmalleissa (kuvio 3), kun askettain talteenotettuja sikidsoluja verrattiin kasvuvaliaineessa 24 tunnin ajan in vitro viljeltyihin kahteen sikiosoluun. Tarkemmin sa-nottuna, huomattava siirtymå ELISA-reaktiivisuuden astees-25 sa (2+, 3+-lukumaåråsta reaktiivisia pesåkkeita lukumaa-raan 0 tai 1+ reaktiivisia pesakkeita) havaittiin monissa reaktiivisissa supernatanteissa, jotka sisaisivat IgM:ia kloonaamattomista, 12 dmfc -soluja vastaan muodostetuista hybridoomista. Kuten kuviossa 4 on esitetty, 13 dmfc-solu-30 jen jaådytys kuukauden ajaksi -70 °C:ssa ja sen jålkeinen nopea sulatus sailyttivat saman kuvion ja kloonaamattomien

• V

supernatanttien ELISA-reaktiivisuuden asteen EI-ELISA-maa-rityksessa, joka havaittiin vasta talteenotetuilla ja pes-tyilia 13 dmfc-soluilla.

35 42 92222

Pohdinta

Monet syyt voivat vaikuttaa siihen, ettå on vaikeaa saada useammin kuin kolme kertaa syngeenisillå alkioso-luilla immunisoiduista hiiristå pysyviå hybridoomia. Liu-5 koiset sikiOsolu-uutteet, jotka sisåltåvåt EA:ta, indusoi-vat eståjå-aktiivisuutta hamstereissa ja hiirissa, jotka saavat useita injektioita tai suuria pitoisuuksia EA+-so-lujen raakauutetta [Coggin, J. H., Ciba Foundation Symposium, yllå; Weppner, W. A. et al., Cell. Immunol. 54 10 (1980) 445; Weppner, W. A. ja Coggin, J. A., Cancer Res.

40 (1980) 1380; ja Coggin, J. H. et al., J. Natl. Cancer Inst. 72 (1984) 853 - 862], Tamå eståjåaktiivisuus havait-tiin niitå lymfosyyttejå ja/tai makrofaageja vastaan, jotka liittyivåt sarkoomasolujen pinnalla olevia EA-determi-15 nantteja vastaan kohdistuvaan kasvainspesifiseen kudos-siirtoresistenssiin. Naarasjyrsijoiden havaittiin kehit-tåvån sytostaattista IgGrtå EArille, jotka ovat risti-reagoivia SV40-sarkoomasolujen kanssa, kun ne immunisoi-tiin suoraan såteilytetyillå syngeenisillå sikiOsoluilla, 20 mutta eivSt kehittåneet kasvainresistenssiå eivåtkå ole-tettavasti solulle myrkyllisiå efektori-T-soluja naissa olosuhteissa [Ambrose, K. R. et al., J. Immunol. 105 (1970) 524; Coggin, J. H., Cancer Res. 39 (1979) 2952; Irie, R. F. et al., J. Natl. Cancer Inst. 63 (1979) 367]. 25 Raskaana olevat Balb/c-hiiret eivSt tuottaneet an- ti-EA:ta tuottavia hybridoomia, kuten tuottivat Balb/c-uroshiiret, jotka oli immunisoitu sSteilytetyilia 12 dmfc -soluilla. MyOskaSn hamsterit eivåt tuottaneet hybridoomia, kun ne immunisoitiin såteilytetyillS sikidsoluilla. 30 Hamsterin ja hiiren sikiosolujen pinnalla olevia EA:ita on ollut yleisesti vaikea karakterisoida. Nåmå determinantit olivat faasispesifisiå tietyille alkion- tai sikidnkehi-tyksen vaiheille. Sikiosoluissa ei enåå esiintynyt anti-geeneja in vitro -viljelmåsså [Irie, R. F. et al., J.

35 Natl. Cancer Inst. 63 (1979) 367; Hellstrom, I. et al., ii 43 92222

Inter. J. Cancer 7 (1971) 1, 10; Leffell, M. S. ja Coggin, J. H. , Cancer Res. 37 (1977) 4112) vain harvaa poikkeusta lukuunottamatta (Ting, C. C. et al., In Vitro 14 (1978) 207]. Balb/c-hiiret osoittautuivat huonoiksi vastaajiksi 5 syngeeniselle sikiOperaiselle herkistamiselle, kuten Ting et al. ylia, ehdottivat, SV40-transformoituja kohdesoluja kåytettåesså.

Kuten tåssM raportoidaan, C57Bl/6n-uroshiiria kSy-tettiin menestyksellisesti EA:lle vasta-aineita tuottavi-10 en, pysyvien hybridoomien saamiseksi, kun ne immunisoitiin syngeenisilia 5000 R:n (1290 mC:n) rOntgensateilia inakti-voiduilla sikiOsoluilla. Tehokkain immunisointiprotokolla sisSlsi syngeenisen isånnSn herkiståmisen sikiosoluille lyhyen immunisointiaikataulun kuluessa.

15 Kloonaus tuotti viisi pysyvaa monokloonia ensimmåi- sestå seitsemåsta satunnaisesti valitusta hybridoomasta. Kaikki monoklonaaliset vasta-aineet, jotka saatiin koko-naisia sikiOsoluja vastaan, olivat IgM-tuottajia. Myohem-min havaittiin, ettå kaikki hybridoomat, jotka oli saatu 20 herkiståmållå uroshiiret kokonaisille, såteilytetyille sikiOsoluille seka lyhyita etta pidennettyja sarjoja kSyt-tSen, tuottivat vain IgM-tuottajia. lgG:tS tuottavia hyb-ridoomia saatiin vain hiiristå, jotka saivat liukoiseen muotoon saatettuja (3 mol/1 KC1) sikidsolu-uutteita pikera-25 minkin kuin kokonaisia EA+-sikiosoluja. Ei tiedetå, pysyy- ‘ kd tama ehdottomana havaintona jokaiselle kokonaisia si kiOsoluja vastaan tuotetulle hybridomalle, mutta tulokset, jotka on saatu tutkittaessa useita tusinoita eri hybridoo-maklooneja tåhan paivaan mennessS, tuottivat vain IgMråa 30 tuottaviin monoklooneihin.

Alkukokeissa menetettiin usein kokonaisia sikiOsoluja vastaan tehtyja hybridoomia aikaisissa jatkovilje-lyvaiheissa hiiren pernasolu-ravintokerroksiin. Oli mah-dollista saada erinomainen hybridooman jatkoviljelmien 35 eloonjaaminen ja suorittaa tehokas IgM:ia tuottavien hyb- 44 92222 ridoomien kloonaus tåydentåmållå siirtovåliaine makrofaa-gin kaltaisen solulinjan RAW 264.7 supernatanteilla. Ra-vitsijana kåytetyt hiiren pernasolut eivåt olleet kåyttd-kelpoisia, kuten ne ovat olleet muille antigeeneille tuo-5 tettujen hybridoomien saamisessa. RAW-viljelysupernatan- tilla taydentémistS ei ole raportoitu aikaisemmin ja sen kayttd oli helpompaa kuin ravintosolukerrosten. Nåyttaå silta, ettå RAW 264.7 -solut antavat kaytt65n kasvutekijån (-tekijdita), joita IgM-hybridoomaa tuottavat solut tar-10 vitsevat. Suodatetun RAW-solusupernatantin kaytto poisti myds mahdollisen kontaminoivien aineiden lahteen, joka esiintyy normaaleja hiiren pernasoluja hybridoomaviljel-miin lisattaessa.

Kyky kayttaa åskettain talteenotettuja, kokonaisia, 15 raskauden keskivaiheen sikidsoluja kerran synnyttaneista aideista seulottaessa hybridoomia, jotka tuottivat anti-fetaali monoklonaalisia vasta-aineita, jotka reagoivat solun pinnalla olevien luonnollisen EA:n kanssa, oli

TM

Reusable Microfold -laitteiston suuri etu; koesoluja ei 20 tarvinnut kiinnittaa glutaraldehydilia eika kiinnittaa sentrifugoimalla poly-L-lysiinilia esikasitellyille le- vyille. Tuoreista kudoksista peraisin olevat solut voitiin

TM

prosessoida ja pipetoida Reusable Microfold -suodatti-melle minuuteissa ja laaja hybridoomasupernatanttien seu-25 lonta oli suoritettu loppuun alle kolmessa tunnissa. Sa-manlaisen menetelman ihmisen muuntyyppisia solun pinta-aktigeeneja vastaan nostettuja IgGtita tuottavien ihmisen hybridoomien seulomiseksi ovat askettain raportoineet Glassy et al. [J. Immuno. Methods 58 (1983) 119].

30 Edelleen SP-ELISA:n kehittaminen (kuvio 1) joko kiinnitettyjen sikiosolujen tai sikidsolukalvojen måårit-tamiseksi teki mahdolliseksi suorittaa kvantitatiivisia EA:ta vastaan tuotettujen vasta-aineiden absorptiospesi-fisyysanalyyseja raakakudoksilla. On tarkeåa, etta kudok-35 set, jotka on maaritetty niiden EA- tai OFA-esiintymisen 45 92222 suhteen, voidaan analysoida tarvitsematta viljellå niita in vitro, mika on selva etu primaarikasvainten tai normaa-likudosten seulonnassa. SP-ELISA-menetelma oli seka herkka etta hyvin toistettava.

5 EA:ita vastaan syngeenisessa hiiren sikibssa tuo- tettujen hiiren monoklonaalisten vasta-aineiden avulla tehty raskauden keskivaiheen hamsterin samoin kuin ihmi-sen sikiOssa esiintyvien (taulukko 3) evoluutiossa såily-neiden epitooppien osoittaminen on samansuuntainen kuin 10 aikaisemmat naiden sikibsolutyyppien immunogeenisyytta koskevat havainnot kasvainresistenssin saamiseksi, ylia. Samanlaista ristireaktiivisuuspaneelia ei havaittu naista lajeista peraisin olevilla raskauden loppuaikaisilla si-kiOsoluilla eika taysikasvuisilla kudoksilla absorptio-15 analyysilia eikå immunopresipitaatiolla taysikasvuisista kudoksista (Muller, R. et al., Nature 299 (1982) 640), mika osoittaa monoklonaalisten vasta-aineiden spesifisyyt-ta oikeille EA:ille (alkio-sikiospesifinen antigeeni).

Se havainto, etta sitoutuminen tai absorptioreak-20 tiivisuus on erilainen jyrsijOiden SV40-indusoiduille sar-koomille tai lymfoomille, joiden tiedetaan olevan EA+, mutta ei hiiren L-soluille tai BHK-21-soluille, osoittaa tahan paivåån mennessS testatun viiden monoklonaalisen vasta-aineen avulla osoitettujen EAriden mahdollista ra-25 joittumista tai jakautumista.

Monien tutkimusten tulokset (Coggin, J. H. et al., J. Natl. Cancer Inst. 72:853-862; Rosenberg, S. A. kirjas-sa Serological Analysis of Human Cancer Antigens, Rosenberg, S. A. (toim.) (Academic Press, New York); ja 30 Brown, J. P. et al., J. Immunol. 127 (1981) 539) tukevat sita mahdollisuutta, etta tietyt EA:t (0FA:t) rajoittuvat maarattyihin kasvainten histologisiin luokkiin, vaikka Salinas et al. (Serological Analysis of Human Cancer Antigens, Rosenberg, S. A. (toim.) (Academic Press, New York), 35 ss. 539 - 564), Brown et. al. (J. Immunol 127, 539), 46 92222

Jornvall et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. (US) 79 (1981) 287 - 291 ja Granatek et al. (Science 224 (1984) 1198 - 1206] ovat raportoineet ihmisen kasvainten pinnalla olevista yhteisista EA:ista. Ihmisen sikid reagoi nåitå OFA:ita 5 vastaan tuotettujen ksenogeenisten, polyklonaalisten ja monoklonaalisten immunoglobuliinien kanssa useimmissa ra-porteissa ja keksinnOn monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa. Useat polypeptidin sisSltavSt, polyklonaalisten 12 pSivSn hiiren tai vastaavasti 10 påivån hamsterin sikifiso-10 luja vastaan tuotettujen antiseerumien, immunologisesti saostamat EA-lajit jakautuivat selektiivisesti SV40- ja Adv. 7-indusoitujen sarkoomien joukossa. Nåillå sarkoomil-la tiedetaan olevan yhteisia 0FA:ita, joita ei havaittu kemiallisesti indusoiduissa sarkoomissa, joilla ei ollut 15 ristiinsuojelevaa immuniteettia SV40-sarkoomille. Kolmen 160, 45 - 48 ja 23 dD:n polypeptidin sisaitavan lajin ha-vaittiin olevan yhteisia SV40- ja Adv 7 -sarkoomasoluille [Hellstrom, I. et al., Inter. J. Cancer 7:1:10, ja Wepp-ner, W. A. et al., Cell Immunol. 54 (1980) 445].

20 Immunogeenisen samoin kuin antigeenisen aktiivisuu- den menetys talteen otetussa sikidssa nayttåa olevan no-peaa ja tåydellista eraiden sikioepitooppien kohdalla. EA+-sikiosolujen on osoitettu menettavån kapasiteettinsa aktivoida soluvaiitteista immuniteettia EA+-kasvainsoluil-: 25 le vain muutamien tuntien in vitro -viljelyn jalkeen ja ne olivat tåysin ei-immunogeenisia, jos ne sateilytettiin kuolettavasti ennen viljelya [Coggin, J. H. ja Anderson, N. G., Cancer Res., 40 (1980) 1568, ja Coggin, J. H. ja Ambrose, K. R., Methods in Cancer Research, (Fishman, W. 30 H. ja Busch, H., toim.), Volyymi XVIII, ss. 371 - 389 (Academic Press, New York)]. Tåsså saadut tulokset (kuvio 3) hybridoomasupernatantteja ja EI-maåritysta kåyttaen sen jalkeen, kun kohteena olleita 12 paivån raskausaikaisia hiiren sikiosoluja oli viljelty lyhyita aikoja (24 tun-35 tia), olivat yhdenmukaisia tåmån aikaisemman havainnon kanssa.

II

47 92222

Pysyvån varaston tietyn raskausajan sikidsoluja saaminen rutiinimåårityksiin on tårkeåå vaikeaa, silia samanaikaisesti pariutettujen, sisåsiittoisten hiirien kasvattaminen ei ole tehokasta. Kun sikidsoluja oli kåy-5 tettSvisså mSSritykseen muutaraasta, samanaikaisesti pa- riutetusta raskaana olevasta luovuttajasta, niitå oli usein enemmån kuin tarvittiin tietyn påivån kokeeseen. Mahdollisuus jaadyttaa ylimaaråiset sikidsolut tulevaa kSyttdå vårten poistaa naiden vaikeasti saatavien ja kal-10 liiden solujen tuhlauksen. Havaittiin myos, etta glutaral-dehydilia kiinnitettyja sikidsoluja voitiin menestykselli-sesti sailyttaa 4 °C:ssa viikon ajan ilman herkkyyden las-kua kiinteafaasimaårityksessa.

Seuraavassa esimerkissa kuvatuissa tutkimuksissa on 15 karakterisoitu anti-EA monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa reagoivat sikiOsolujen polypeptidit. Huomautetaan, etta kaikki viisi taulukossa 3 lueteltua monoklonaalista vasta-ainetta reagoivat ilmeisesti saman polypeptidin kanssa, kuten SDS-akryyliamidigeelielektroforeesimåårityk-20 sella on osoitettu.

Esimerkki 2

Esimerkissa 1 valmistettuien monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa reaqoivien polypeptidien identifiointi

Materiaalit ja menetelmat 25 Kasvainsolut SV40:lia indusoidut hiiren sarkoomasolut (mKsa) tai hamsterin lymfoomasolut (GD-36) saatiin syngeenisten hiirien tai hamsterien pienista kasvainsiirrånnåisista seulo-malla ne lankaverkon lapi, kuten julkaisussa Payne, W. J. 30 ja Coggin, J. H., J. Natl. Cancer Inst. (1984).

Ihmisen kasvaimet saatiin vasta jaadytettyina pri-maarikasvaimina Kansallisen Syopainstituutin tukemasta Alabaman Yliopiston (Birmingham, Alabama) kasvainpankista. Kaikki kasvaimet luokiteltiin histologisesti patologista 35 paneelia kayttaen ja jaadytettiin suojaavassa våliainees-sa. jaådytetyt kudosfragment!t sulatettiin nopeasti ja 48 92222 dispergoitiin lankaverkon låpi ilman entsyymidissosiaa-tiota raakasolususpensioiden valmistamiseksi, pestiin kuten aikaisemmin on kuvattu, ja kåytettiin absorptiotutki-muksiin aikaisemmin kuvatulla tavalla (Payne, W. J. ja 5 Coggin, J. H., yllå). Kontrollina kåytetty normaali kudos saatiin monissa tapauksissa histologisesti normaalista kudoksesta kasvaimen vierestå tai muuten normaalista ter-veestå potilaskudoksesta, joka oli poistettu viereisen vaurioituneen kudoksen kanssa oleellisten kirurgisten syi-10 den takia.

Monoklonaaliset vasta-aineet

Monoklonaaliset immunoglobuliinit 69.1, 38,7, 8 ja 14 olivat peråisin, kuten aikaisemmin tåsså selityksesså on kuvattu, C57Bl/6n-hiiren sikiOta vastaan syngeenisistå 15 vastaanottajista. Monoklonaaliset vasta-aineet 69.1, 38,7 ja 8 olivat IgM-luokkaa ja ne oli stimuloitu kokonaisilla sikiOsoluilla, kun taas monoklonaalinen vasta-aine 14 oli saatu aikaan sikiosolujen KCl-uutteilla ja se oli IgG-iso-tyyppiå. Kaikkien tiitterit olivat yli 1024 testattaessa 20 12 dmfc -soluja vastaan kiinteåfaasi (SP)-ELISA-menetel- mållå yllå.

EA;n eristvs ia molekvvlipainoien mååritvs

Sikibperåinen antigeeni(t) eristettiin kåyttåen affiniteettipylvåstå, jonka muodosti Sepharose 4B:hen 25 kiinnitetty anti-hiiri-immunoglobuliini. Jokaisen raono- klonaalisen vasta-aineen kahden viikon vanhat, tiheydel-tåån suurten viljelmien supernatantit sekoitettiin pesty-jen, tasapainotettujen affiniteettigeelien kanssa ja niitå inkuboitiin 12 tunnin ajan 4 °C:ssa. Geeli pestiin 100-30 kertaisella tilavuudella Trisillå puskuroitua fysiologista suolaliuosta (TBS), 10 mmol/1, pH 7,4, ja 5 ml 12 dmfc -solujen tai tåysiaikaisten solujen vakio-NP40- (40 pg/0,1 ml) tai KCl-uutetta (10 μ/0,1 ml) sekoitettiin geelin kanssa.

35 Solu-uutteet valmistettiin kåsittelemållå koekudok- sen tai solujen pakattua solunappia 10-kertaisella tila- 49 92222 vuudella 0,5-%:ista NP 40:ta fosfaatilla puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa, joka sisalsi 1 mmol/1 PMSF:åå. Tunnin 25 °C:ssa inkuboinnin jaikeen solut sent-rifugoitiin napiksi 1500 rpm:n nopeudella, minka jålkeen 5 supernatantti kirkastettiin sentrifugoimalla 50 000 x g:n nopeudella 30 minuutin ajan. Uutteita ja affiniteettigee-leja inkuboitiin 12 - 15 tuntia 4 °C:ssa, minka jålkeen ne pestiin uuttopuskurilla, kunnes pesuliuoksessa ei voitu osoittaa proteiinia. KCl-uutteet valmistettiin kuten ylia 10 on kuvattu.

Sitten vasta-aine-antigeeni-Sepharose 4B -kompleks! eluoitiin 5 mol/1 MgC^Jlla kåyttaen tilavuutta, joka oli sama kuin pylvåån tilavuus, yhden tunnin ajan. Tamå vaihe toistettiin uudelleen. Eluaatit dialysoitiin 100-kertai-15 sella tilavuudella TBS:åå ja kåytettiin SDS-PAGE:en. Eluaatit kåsiteltiin liukoiseksi tekevailå puskurilla, joka sisalsi 2,5 % SDSråå, 1,25 mmol/1 ureaa ja 1 % B-merkapto-etanolia 12,5 mmol/1 Tris:ssa. Sitten nåytteistå ajettiin elektroforeesit 20 %:sta 7 %:iin (pohjasta ylåosaan) ole-20 valla akryyliamidigradienttigeelilevyllå Laemmlin epåjat-kuvaa puskurisysteemiå kåyttåen. Elektroforeesin jålkeen geelit vårjåttiin Commasie-sinisellå R-250 (BioRab Labs, Incorporated, Richmond, Virginia) etikkahappo: metanoli: vesi -seoksessa (7:40:53) ja vari poistettiin jålkimmåi- 25 sella liuoksella.

Blastooeenisen aktiivisuuden arviointi

Lymfosyyttitransformaatiomååritys (LTA) suoritet-tiin kåyttaen pernasoluja, jotka oli herkistetty sateily-tetyille mKsa-soluille, joiden tiedettiin olevan EA-posi-30 tiivisia ja stimuloituvan, kun ne altistetaan 12 dmfc -solujen KCl-uutteille. Tåysikasvuisen hiiren solujen KCl-uutteet eivåt olleet stimuloivia. LTA-måårityksen olosuh-teet olivat kuten Weppner, W. A. ja Coggin, J. H., Cell Immunol. 54 (1980) 193, ovat kuvanneet. Kåytettiin 0,01 -35 0,05 g uutetta maksimaalisen stimulaation aikaansaamisek- si ja stimuloitumisindeksi laskettiin kuvatulla tavalla.

50 92222

Tulokset

Monoklonaaliselle vasta-aineelle spesifisen polv-peptidin osoitus

Kolmen IgM-luokan monoklonaalisen inununoglobuliinin 5 (69.1, 38.7 ja 8) ja IgG-luokan monoklonaalisen immunoglo- buliinin havaittiin kaikkien sitovan selektiivisesti 44 -48 kD:n polypeptidin samoin kuin suuremman, 200 kD:n poly-peptidimultimeerin. 46 kD:n proteiini osoitettiin vain sikibsolu-uutteessa, eikå sitå esiintynyt tSysikasvuisen 10 hiiren kudoksista, mukaan lukien lihas, iho, maksa, perna, sydSn, suoli, aivo, valmistetuissa uutteissa eikå C57BL/6n-hiiren 19 - 21 påivån sikion kokonaisen elSimen homogenaateissa. Tåmå tulos saatiin silloinkin, kun tåysi-kasvuisen hiiren uutteita kaytettiin pitoisuuksina, jotka 15 olivat 25-kertaiset 12 - 13 dmfc -solujen sikibuutteisiin nShden.

Affiniteettigeelin eluaateissa olevat muut viivat olivat: lisStystå monoklonaalisesta vasta-aineesta peråi-sin oleva IgM:n kevyt ketju + J-ketju (20 - 23 kD); raskas 20 ketju, joka oli peråisin "sandwich"-affiniteettigeelin

IgGistå, jota kaytettiin sitomaan hiiren monoklonaalista IgM:3å (57 kD), seerumin albumiini (70 kD) ja IgM:n raskas ketju (75 kD) yhdesså sikibspesifisen 200 kD:n polypeptidin kanssa, joka saattaa olla 46 kD:n proteiinin multimee- • 25 ri. Affiniteettigeelista peråisin olevia vasta-ainefrag- mentteja esiintyi molemmissa riveisså, jotka kuvaavat tåy-sikasvuisia samoin kuin sikibperåisiå affiniteettigeelejS, kuten oli odotettukin. Tarkeåå on, ettå 46 ja 200 kD:n polypeptidin affiniteettigeelin sitoutumisen spesifisyys 30 lisSttyjen EA-spesifisten monoklonaalisten immunoglobulii- nien suhteen osoitettiin kåyttåmållå merkityksetontM hiiren monoklonaalista IgMråå, jonka tiedettiin olevan spesi-finen Moloney-sarkoomaviruksen vaipan glykoproteiinille (MSV). Tåmå asiaankuulumaton monoklonaalinen immunoglobu-35 liini ei sitoutunut kumpaakaan epitoopin sisåltavaå poly- 51 92222 peptidia, jonka ylia luetellut monoklonaaliset vasta-ai-neet tunnistivat.

Valmistettiin monoklonaalisen vasta-aineen 69.1 25-kertainen konsentraatti ja sita kaytettiin absorboimaan 12 5 dmfc -solujen KCl-uute (500 pg proteiinia) yllå kuvattua affiniteettigeelia kayttåen. Uute otettiin talteen geelis-ta monoklonaalisen IgM:n poistaessa siita sidotun EA:n ja konsentroitiin alkuperaiseen tilavuuteensa. Nayte analy-soitiin uudelleen SDS-PAGE-maårityksellå ja verrattiin 10 alkuperaiseen KCl-uutteeseen. Tulokset osoittivat, ettå kaikki havaittavat 46 ja 200 kD:n viivat olivat poissa.

Sitten affiniteettigeelillå absorboitu uute testat-tiin LTA:lla sen maårittåmiseksi, estiko 46 kD:n polypep-tidin (tai sen multimeerin poisto) Webbnerin W. A. ja Cog-15 ginin, J. H. Cell Immunol. 54 (1980) 193, kuvaamalla ta-valla valmistettujen, EA-herkistettyjen hiiren pernasolu-jen stimulaation. Taulukon 4 tulokset osoittivat, ettei IgM-absorboitu uute todellakaan stimuloinut EA-herkistet-tyjå lymfosyytteja, kun taas absorboimaton KCl-uute oli 20 stimuloiva.

Taulukko 4 12 dmfc -solujen KCl-uute, jota oli kåsitelty ennen Sepha-rose 4B-affiniteettigeelillå, johon oli kiinnitetty mono-25 klonaalinen lgM-vasta-aine 69.1, kasittelya ja sen jai-keen.

Uutteen kasittely Stimuloitumisindeksi lymfosyyt- titransformaatiomaarityksessa 30 Kasittelematbn 12 dmfc- 27 ± 5 eluaatti (46 kD:n ja 200 kD:n polypeptidit mukana) 69.1-kasitelty 12 dmfc- 6 ± 3 35 eluaatti (46 ja 200 kD:n polypeptidit eivåt mukana) 52 92222 46 kD:n proteiini ihmisen kasvaimissa Kuten taulukossa 5 on esitetty, joukon ihmisen kas-vaimia, mukaan lukien keuhkon, rinnan, paksusuolen ja pe-résuolen karsinoomat, havaittiin selektiivisesti absorboi-5 van useita yllS mainituista monoklonaalisista vasta-ai-neista analysoitaessa mydhemmin SP-ELISA-måårityksellå 12 dmfc -soluja kSyttSen. Aikuiset kontrollikudokset ja moni-en potilaiden, joiden kasvaimet olivat myos mukana, nor-maalit kudokset olivat negatiivisia samojen monoklonaalis-10 ten vasta-aineiden absorptiolle. Kahden keuhkon adenokar- sinooman KCl-uutteen affiniteettigeelianalyysi paljasti merkittåvån 46 kD:n viivan ja pienen jåljen 200 kD:n vii-vaa molemmissa kasvaimissa seka nåiden polypeptidien puut-tumisen yhtå suurissa proteiinipitoisuuksissa normaaleja 15 tåysikasvuisen kudoksia.

53 92222 i •Η

•P

- -μ ed g rH Q)

i—i i—I

•Η Cd <D > i—I Ή H £> O oo o oo cn cn m cd J_l d) CNJ (N CN Ν' I—I N ro I—I I o 11 i 1. 1. 1 ·. «- »«.O»·

c o O O CD O o O ι-H O I i—I

O n-ro

Ai B tn d ed cn 3 -Γ0 rH U3 cd

i—I i—I

Ή

S CN

H CD

Cd Ό > £ tn d itJ tn ^31 oo ro o r-' n oo oo m n ,»4 O n mm m m id cn n o m >r«| 1, k» ^ 2 1. ^ ·» ^ 1· s β 4_> O O O O o o oooo dl Dj CQiH S-l

•H :cd O

B G cn

5 >. XI

r-i -P -P O Q)

•H -P -P -H

a p g p :<d (1) 0 -'(d -ro , 01 £ d

LT) Xi rH

cd id o O ή oi a: c ή Μ 1) · g d Ό C dl

Hi H CO -rood 3 o h >i n c> r" r~ r-- oo r" cd co co id! C p p « o o o o o o oooo S-ι -H W -P :<d I—I Ή Ή i—I i—I i—I <—1'—I1—1'—1 cd i 01 g 1 -Η -P 3 X X X X X xxxx cd oi >1 a; +J(d:cddlO [~~ ID rH uo r- cn m cn (Il Cd XH - '

'(d OH N rH rH rH

.> :cd H(u cd cd <d <0 cd cdcd

p P B B B B B B B

d d OOOO O 00 d Ή 0 0 0 0 O O 0 _ _ _ p-Η C C C C G G C C CC G G d C :d :d :<d <D Λί dl H dl H CD H dl -H d) H 0) -H dl Η Oj Oj Ck p d rH οι Η οι H oi rH m H oi rH oi rH m :0 :0 :0

Icd H OP OP OP OP OP OP OP >1 >1 >1 -η,η rd d cd o d cd o 3 cd cn d ed o d cd d cd d cd cn ccirH 01 cd 01 P rH > cn Αί Γ—- 01 AJ CN 03 Αί Ή 03 Αί Γ~ 03 Αί 03 Αί 03 Al CD OC- om o d -h oi do do do do dom do do a; aj a: r~ ca cn cd oidi oidi oidi oidi oidcN oidcN oidi x: i xl i x: n « Λίΰΐ a; di m di Aid) Αία)2Αί<ι>ΡΑί<ι> d d di o cd d h cd Ό <N id d in ed ό -h ed ti cd dd H ed ό r~ aw aw d) cn G rd & id 10 ft id 01 λ ed 10 Dj <d cd ft id m Di ed S3 ft id m xjio X! 10 xi S! d) d

P Αί O

(Λ ij

* Cd G

P rH

CO rH -H CD ID CD

Φ .<-1 £ rH rH ^ ^ ι-H rH ιΗ «Η rH

C Q) O ^ 1> 1- 1 1- ·1 111· O ,—1 o ctn <y> 00 00 00 <r> er» <τ» er» —i rd 1—I ro ro CO <0 VD <0 \£) -¾ cd a; IB g 2 •s g i 4 54 92222 i •d -ρ - 4->

P C

id (1)

I-1 I—I

•d (0 0) > I—I -r-i 'ο δ rn oj rn in οί oooco Μ φ ομγμ^οίι m σ> cH p ^ 4J| *·«·*···νΟ ' V ^ ·. ^

β U INOOOOI CN CN Ο Ο O

0 «-ro λ; em

P

P CN P

n rH co

P

I—I

•H

ε cm

-d CD

(0 Ό > Λ m p P m

.x O

p .p tnoiHon^ id vo o m m (Ud, r-'minn'm.H ro d< c— vo cn

WrH a ' - - * * •d :p o oo o ooo o o o o o EC m 5 >i Λ •d -P <

-P

p O QJ

p -d 4-> ,Χ -P d 4J an p p a :P cd -η Ο :P τι me p m Λ d P P o Ο ή m „ ,χ cj h r~ oo oo oo MU·· β oooo oo Γ" r~~ oo oo r-~ P Ό < Q) idid id ή r~- o o o o o o id d C/3 -nip Old id id id id id P CD H >, d X X X "d

p p PI d :p Λ , X XXX X X

Eh| -d W -P :p inoO Π X

PI gig O'1 σν i—I co lo d1 vo lt> 1 -d -p P ·* ' 00 ^ v. * P cn 1—1 1-1 id CN d· CN mo

P (ί :P P

m p x: id P Id i> :p _ CD OOOiOCOOOid rd id CM CN d1

•d-p i—I <N <N CN CN OV Γ0 VO id ^ rH

^ C I I 1 I 1 I III I I

P-d n d* d1 Eh Eh O cn Ο o vo Ph ^•d K vo vo Μ K in vo m in in cn <u p c c P β β β p β p v p d P 3 P P P ad :P :P & I , I id p *X -X rX iX iX cp :p :p :p ρ ρ h > 3 3 c 2 c ο. a a di pppp

-rl 03 iO fo ru fd rd G G G G G ^ g G ^ S

£ cn (d r-j :rd «Η :nj H :rd H ad H :id G G t*Q G G ifd id O O fd Ο O

^ -x « 8 2 28* «a flftxaxa .x a. .x a. p p o p p o O ·£ '9 ·£ '9 ·£5 ·Ρ Χί ·0 XJ :θ M :0 Ih :0 Ih :0 Ih :θ C CD β β cu β 8 'O «2 >, P >, d>1 3>1 d Ό d -d 'O -d <dp SmSm Sm gmSmiXmlXm X!m cxm K P co cn P m P X 0 m jh dp p fd rd p id d

p d P x> VD VO

Cook'd ^ ^ fd id id id rd rH d· O id O ' - v ^ ^ ' - - ·. ^ id p rH CTi OO 00 <Τι ΟΊ ΟΊ CTi CTi CT\ 00 λ; P Λί 'X oo rocDipvo vo vo vo ro o e o C d p .: ooo s p s

II

55 92222 Λ

-P

*· jj Ό c

Ή (U

Ή i—I

rH (tf 0) > ·Η 'Η > rn σ> oo O Αί Γ~~ I O r—I VO *3· M <y ' * Ο · I I I Ο Ο Ο JJ ι Ο Ο I ο ο ο ο c υ ι ι ι ο ο ο Ο U-iro ·* ε ui 3 η IN 3 η rH (Λ ro rH »—I •Η ε γνι Ή Q) (0 Ό

> JZ

ro 3 π3 μ Λί Ο „ ^j^cnnoo *£ “1 ί_1 £ _ρ 00 ΓΟ Ο VO ο <-η »-* ω α ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο υ;·—i μ Η :d Ο ε C ro -Ξ >ι λ •Η 4J < -Ρ

- Ο CD

^ -ri 4-> 5 -U ·Η +3 CU U C 3 Ih :ru Q) ί~1 Ο :d ·γο w ε 3 η Λ Η rod ο Ο Ή (Λ ^ c ι—ι α: ο .. c P ο ’—1 Ή U2 -r-ι :ro ^ ^ rO Ρ ο ο Ρ Ρ J ·υ s ο ο ι—ι γ—ι co οο οο οο exp co Επ| -w W -Ρ :d rH rH ooc!S23

ΙΟΙΦΕ XX r-| rH rH rH rH rH

«Μ >,1 Χ ^ « * * * * * * -:->ro :ro 3 °ί ^ ‘"Ι η η η η ro ro

rodvin co oo rH rH

d ip ^ :!H ι i i t ι i •η ω ro ro ro ro <9 Ώ r-H +* . d d d C d *5 ^ 3 3 3 3 3 3 ^ Q SS &-H a-H &·Η £h 0) ·* C II I rH :d P :ro Sh :d Ih :d M :d P -d Ih

UH C Q) H i c H G rH 4JH HH 4JH 4JH -UH -UH

•.5 'd V, ro ω φ S <u j

• H1-1 <0 d H rH rH M

4J ^ £ c g J2 g 3 3 E ’roe roe roe roe 'roe roe g| s i § 18 la la ig i§ l| il il i§ £§ as ss si « ss ss ås åg a> ss -X o “ s 9 ro c S ή

ro 3 9 KO rH

9 ci> o 9. 9. ^ 9. J· 5 1—1 O σ» σι οο σι σ' σ σ <χ> co æ -idrH S S ro S ^ ^ Noron ro

3 <0 Λί ° E O g P C O O O SC S

56 92222 1. Kunkin tyyppiset luetellut, standardoidut mono-klonaaliset immunoglobuliinit absorboitiin 12 tunnin ajan osoitetulla mSSrålia kasvainsoluja tai normaalin kontrol-likudoksen seoksilla (perna, sydån, lihas, paksusuoli, 5 keuhko ja maksa) ja mååritettiin uudestaan kiinteåfaasi- ELISA:lla EA+ 12 påivån raskausaikaisella hiiren sikioso-luilla.

2. Apsorptio- = Absorboidun Iq:n abs (414 nm); suhde Absorboimattoman Ig:n abs (414 nm) 10 0 = ei absorptiota; 1,0 = tåydellinen absorptio.

3. Mååritetty vertaamalla koekasvaimen tai normaa-lien kohdesolujen absorptiosuhdetta (AR) samojen mono-klonaalisten immunoglobuliinien 12 dmfc -solujen AR:aan.

15 (esim.

4 1.8 x 10 kohdesolua = 1 abs. vksikko_ 4 3,3 x 10 12 dmfc = 1 abs. yksikko (vakioabsorptiokSyrål- ta) = 0,54)

Pohdinta 20 N3ma tulokset identifioivat hiiren sikidsoluista yhteiset 46 ja 200 kD:n polypeptidit, jotka reagoivat useiden anti-EA spesifisten monoklonaalisten immunoglobuliinien kanssa ja joita ei voitu osoittaa taysikasvuisen hiiren soluuutteissa eika hiirien tai ihmisten raskauden • 25 loppuvaiheen sikidsoluissa. Proteiinit osoitettiin myos joukossa ihmisen karsinoomia, mutta niita ei voitu osoittaa tutkituissa normaaleissa ihmisen kudoksissa, mukaan lukien paksusuoli, perna, aivot, iho ja lihas. 200 kD:n sikidspesifisen polypeptidin, jonka kaikki monoklonaaliset 30 immunoglobuliinit sitoivat Sepharose 4B -affiniteettigee-. liin, lasnaolo viittaa siihen, etta monoklonaalisten im munoglobuliinien tunnistamat epitoopit saattavat sijaita 46 kD:n proteiinin multimeerissa natiivissa muodossaan sikidsoluissa ja kasvainsoluissa.

35 57 92222

Havainto, etta hiiren ja ihmisen sikio- ja kasvain-soluissa on yhteisia, evoluutiossa sailyneita 46 ja 200 kD:n polypeptideja, on mita paljastavin. Se lisahavainto, etta polypeptidien valikoiva poisto monoklonaalista IgM:aa 5 kayttavan afiiniteettikromatografian avulla teki uutteen ei-stimuloivaksi EAzlle tai kasvain- ja sikiosoluille her-kistetyille lymfosyyteille, on myos mielenkiintoinen. Tama havainto viittaa selvasti siihen, etta nama polypeptidit saattavat sisaitaa ainakin yhden niista EA-determinanteis-10 ta, jotka ovat vastuussa sikiGsolujen tai niiden uutteiden syngeenisessa hiiressa tai hamsterissa aiheuttaman ris-tiinsuojelevan kasvaimen siirron resistenssin indusoinnis-ta.

Viisi hybridoomaa, jotka tassa keksinnOssa valit-15 tiin satunnaisiin, spesifisiin jatkotutkimuksiin, talle- tettiin 30 vuodeksi ATCCzhen, Rockville, Maryland, ennen hakemuksen jattGpaivamååraa. Talletusnumerot ovat:

Hybridooma 8 (nimetty my5s 8 KCL III:ksi): ATCC-nro HB-8663; 20 Hybridooma 69,1 (nimetty myGs 69,1 sh III:ksi): ATCC-nro HB-8664;

Hybridooma 38,46 (nimetty myos 38,46 sh Illrksi): ATCC-nro HB-8665;

Hybridooma 38,7 (nimetty myos 38,7 sh III:ksi): 25 ATCC-nro HB-8666; ja

Hybridooma 115 (nimetty myos 115 sh III:ksi): ATCC-nro HB-8667.

Claims (13)

92222

1. Menetelmå onkofetaalispesifisiå monoklonaalisia vasta-aineita erittåvan hybridooman valmistamiseksi, 5 tunnettu siitå, ettå a) immunisoidaan elåin immunisoivilla måårillå no-peasti lisååntymåtdntå, syngeenistå raskauden keskivaiheen sikiOsoluvalmistetta; b) eristetåån immunisoidut lymfosyytit mainitusta 10 elåimestå; ja c) fuusioidaan mainitut lymfosyytit sopivissa fuu- sio-olosuhteissa immortalisoivan solulinjan kanssa, jol-loin saadaan hybridoomat, joilla on ATCC-talletusten HB-8663, HB-8664, HB-8665, HB-8666 tai HB-8667 mukaiset 15 tunnistusominaisuudet.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå mainittua hybridoomaa viljellåfin hiiren makrofaagisolulinjan RAW 264.7, ATCC TIB 71, låsnå-ollessa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tun nettu siitå, ettå mainittujen solulinjojen erittåmåt monoklonaaliset vasta-aineet ovat spesifisiå jyrsijOiden ja ihmisen alkio- ja sikiosoluille ja jyrsijdiden ja ihmi-sen kasvainsoluille.

4. Menetelmå sellaisen monoklonaalisen vasta-ai- neen valmistamiseksi, joka on spesifinen tietylle elåin-kasvaimelle, tunnettu siitå, ettå viljellåån hybridoomaa, jolla on ATCC-talletusten HB-8663, HB-8664, HB-8665, HB-8666 tai HB-8667 mukaiset tunnistusominaisuu-30 det; ja otetaan talteen mainittu sen erittåmå monoklonaa-linen vasta-aine.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå seulotaan mainittu monoklonaalinen vasta-aine niiden vasta-aineiden joukosta, joilla vasta-35 aineilla ei oleellisesti ole affiniteettia normaalille tåysikasvuisen elåimen kudokselle. 92222

6. Monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitå, etta silia on seuraavat spesifisyysominaisuudet: a) immuunireaktiivisuus jyrsijbiden raskauden kes-kivaiheen antigeeneja kohtaan; 5 b) immuunireaktiivisuus ihmisenonkofetaalikasvain- antigeeneja kohtaan; c) oleellisesti ei immuunireaktiivisuutta jyrsijbi-den myOhaisraskaudenaikaista sikiokudosta kohtaan; ja d) olellisesti ei immuunireaktiivisuutta ihmisen 10 normaalia kudosta kohtaan; ja etta sitå tuotetaan hybri- dooman avulla, jolla on ATCC-talletusten HB-8663, HB-8664, HB-8665, HB-8666 tai HB-8667 mukaiset tunnistusominaisuu-det.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen monoklonaalinen 15 vasta-aine, tunnettu siita, etta se on immuuni- reaktiivinen molekyylipainoltaan noin 44 000 - 48 000 ole-vaa onkofetaalipolypeptidia kohtaan.

8. Menetelma ihmisen kasvaimeen liittyvan onkofe-taaliantigeenin osoittamiseksi, tunnettu siitå, 20 etta inkuboidaan ihmisen naytetta, jonka epåiliaån sisai-tavan mainitun onkofetaaliantigeenin, patenttivaatimuksen 6 mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa; ja maari-tetaan, tapahtuuko mitaan oleellista sitoutumista mainitun antigeenin ja mainitun vasta-aineen vålilia.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelma, tun nettu siita, etta se on immunometrinen maaritysmene-telma tai kompetetiivinen immunologinen maaritysmenetelma.

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta mainitun antigeenin ja mai- 30 nitun vasta-aineen vaiisen oleellisen sitoumisen maaritta-minen suoritetaan havaittavaksi leimatun onkofetaaliantigeenin lasnaollessa.

11. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta mainittu antigeeni on poly- 35 peptidi, jonka molekyylipaino on noin 44 000 - 48 000. • 92222

12. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmå, tunnettu siita, ettå mainittu antigeeni on poly-peptidi, jonka molekyylipaino on noin 200 000.

13. Molekyylikompleksi, joka sisåltåå antigeeniin 5 sitoutuneen monoklonaalisen vasta-aineen, tunnettu siitå, ettå mainittu antigeeni on polypeptidi, jonka molekyylipaino on 44 000 - 48 000, tai polypeptidi, jonka molekyylipaino on 200 000 ja ettå vasta-aine on patenttivaatimuksen 6 mukainen vasta-aine. 10 II 92222