FI91975B - Method and reagent for the determination of luteinising hormone and monoclonal antibodies suitable for that purpose - Google Patents

Abstract

The immunological method for determining luteinising hormone (LH) entails using at least one monoclonal antibody which is directed against LH and cross-reacts only slightly, if at all, with other glycoprotein hormones. Processes for obtaining such antibodies, and hybridoma cell lines which produce such antibodies are described.

Description

9197591975

Menetelmä ja reagenssi luteinisoivan hormonin määrittämiseksi sekä tähän tarkoitukseen sopivat monoklonaaliset vasta-aineetMethod and reagent for the determination of luteinising hormone and monoclonal antibodies suitable for that purpose

Luteinisoivan hormonin (LH) määrittämistä ruumiin nesteistä, esimerkiksi virtsasta, seerumista ja plasmasta, käytetään pääasiallisesti alanäkökukkulan (hypothalamus), aivolisäkkeen (hypophyse) ja sukupuolirauhasten (gonadi) endokrinologisen tilan arviointiin. Näitä tutkimuksia käytetään ennen kaikkea sukupuolirauhasten vajaatoiminnan, hedelmättömyyden ja muiden vastaavien tilojen erotusdiagnoosissa. Tämän lisäksi LH-mää-ritystä käytetään ovulaation ajankohdan selvittämiseksi raskauden indusoinnin yhteydessä.Luteinizing hormone (LH), determined from body fluids such as urine, serum, and plasma, is used primarily to assess the endocrinological status of the hypothalamus, pituitary gonad, and gonads. These studies are used primarily in the differential diagnosis of gonadal insufficiency, infertility, and other similar conditions. In addition, the LH assay is used to determine the timing of ovulation upon induction of pregnancy.

Kaikissa näissä tapauksissa seerumiarvot ovat fysiologisella alueella. Tämän lisäksi LH-pitoisuus seerumissa mitataan myös pelkästään siitä syystä, että tämän hormonin biologisesta vaikutuksesta saataisiin jonkinlainen käsitys. Diagnostisesti merkityksellistä on näin ollen olennaisesti se, että luonnollisen hormonin taso seerumissa tunnetaan.In all these cases, the serum values are in the physiological range. In addition, serum LH levels are also measured for the sole purpose of gaining some understanding of the biological effect of this hormone. Thus, it is essentially diagnostically relevant that the level of natural hormone in the serum is known.

Ihmisissä luteinisoivan hormonin fysiologinen pitoisuus seerumissa on seuraavilla alueilla: miehet 4-24 mIU/ml • naiset ennen vaihdevuosia, sykliä 10-20 mIU/ml naiset, ovulaation huippu 80-100 mIU/ml naiset vaihdevuosien jälkeen 80-150 mIU/ml.In humans, the physiological serum concentration of luteinizing hormone is in the following ranges: men 4-24 mIU / ml • women before menopause, cycle 10-20 mIU / ml women, ovulation peak 80-100 mIU / ml women after menopause 80-150 mIU / ml.

Liiteinisoivan hormonin määrittämiseksi soveltuvat ennen kaikkea immunologiset koemenetelmät, joissa antigeeninä toimiva hormoni määritetään yhdellä tai useammalla sitä vastaan vaikuttavalla vasta-aineella. Näiden polypeptidisten hormonien avulla toteutettavaan vasta-aineiden tuottamiseen liittyy vaikeuksia, sillä kaikki oolypeptidiset hormonit ovat huonosti immunogeenisiä.In particular, immunological test methods in which the hormone acting as an antigen is determined by one or more antibodies against it are suitable for the determination of attachment hormone. There are difficulties in producing antibodies with these polypeptide hormones, as all oligopeptide hormones are poorly immunogenic.

LH on homologinen muiden glykoproteiinihormonien, esimerkiksi follikkelia stimuloivan hormonin (FSH) tyreotropiinia stimuloivan hormonin (TSH), ja ihmisen koriongonadotropiinin (hCG) 2 91 975 kanssa, joten jotakin tällaista hormonia vastaan vaikuttavien, spesifisten vasta-aineiden muodostaminen on erittäin vaikeata. Jotakin tällaista glykoproteiinihormonia vastaan vaikuttavalla vasta-aineella on tavallisesti heikompaa tai voimakkaampaa ristireaktiivisuutta myös muiden glykoproteiinihormonien kanssa.LH is homologous to other glycoprotein hormones, such as follicle stimulating hormone (FSH), thyrotropin stimulating hormone (TSH), and human chorionic gonadotropin (hCG) 2 91 975, so it is very difficult to generate specific antibodies against any such hormone. An antibody against one such glycoprotein hormone usually has a weaker or stronger cross-reactivity with other glycoprotein hormones as well.

Julkaisussa Clinica Chemica Acta 133 (1983), sivut 263-274 kuvataan luteinisoivaa hormonia vastaan vaikuttava vasta-aine, jonka ristireaktiivisims hormonien TSH ja hCG kanssa on 10%, ja FSH kanssa on 3%. Patenttijulkaisun GB-A 2 111 201 perusteella tunnetaan samoin luteinisoivaa hormonia vastaan vaikuttava mono-klonaalinen vasta-aine. Tämä reagoi kuitenkin myös yhtä hyvin hCG-hormonin kanssa. Monoklonaalinen vasta-aine, jonka vaikutus kohdistuu spesifisesti luteinisoivaan hormoniin, ja jolla ei ole ristireaktiivisuutta muiden glykoproteiinien kanssa, on toistaiseksi tuntematon. Näin ollen tällä hetkellä ei ole mahdollista määrittää luteinisoivaa hormonia immunologisesti siten, etteivät muut glykoproteiinihormonit vaikuttaisi enemmän tai vähemmän saatuihin tuloksiin.Clinica Chemica Acta 133 (1983), pages 263-274, describes an antibody against luteinizing hormone with 10% cross-reactivity with the hormones TSH and hCG and 3% with FSH. A monoclonal antibody against luteinizing hormone is also known from GB-A 2 111 201. However, this also reacts just as well with the hormone hCG. A monoclonal antibody that specifically targets luteinizing hormone and has no cross-reactivity with other glycoproteins is still unknown. Thus, at present, it is not possible to determine luteinizing hormone immunologically without other glycoprotein hormones affecting the results obtained more or less.

Tämän keksinnön tehtävänä oli saada aikaan uusi immunologinen menetelmä ja reagenssi, joiden avulla luteinisoiva hormoni voidaan määrittää spesifisesti myös muiden glykooroteiinihormonien läsnäollessa. Tämä tehtävä ratkaistiin keksinnön mukaisella immunologisella menetelmällä ja reagenssilla.The object of the present invention was to provide a new immunological method and reagent by means of which luteinizing hormone can be determined specifically also in the presence of other glycorotein hormones. This object was solved by the immunological method and reagent according to the invention.

Näin ollen tämä keksintö kohdistuu immunologiseen menetelmään luteinisoivan hormonin määrittämiseksi, jossa menetelmässä käytetään vähintään yhtä sellaista monoklonaalista vasta-ainetta, jonka vaikutus kohdistuu spesifisesti luteinisoivaa hormonia vastaan, ja josta korkeintaan 3% ristireagoi muiden glykoproteiinihormonien kanssa, sekä tähän menetelmään soveltuvaan rea-genssiin.Accordingly, the present invention relates to an immunological method for the determination of luteinizing hormone using at least one monoclonal antibody which specifically acts against luteinizing hormone, of which up to 3% cross-reacts with other glycoprotein hormones, and to a reagent suitable for this method.

Immunologisena määritysmenetelmänä voidaan periaatteessa käyttää kaikkia tavanomaisia immunokokeita, kuten radioimmunokoetta, entsymaattista immunokoetta, fluresenssiin perustuvaa immuno-koetta, jne. Käyttökelpoisia ovat edelleen näiden menetelmienIn principle, all conventional immunoassays, such as radioimmunoassay, enzymatic immunoassay, fluorescence-based immunoassay, etc., can be used as the immunological assay method.

IIII

3 91975 kaikki muunnokset, kuten kilpaileva immunokoe, kerrostamismene-telmä ("sandwich"), jne. Merkitsemiseen voidaan käyttää kullekin määritysmenetelmälle tavallisia aineita. Täten esimerkiksi radioimmunokokeessa merkitsemiseen käytetään radioiso- 125 tooppeja, esimerkiksi isotooppia I. Entsymaattiseen lmmuno-kokeeseen soveltuvat kaikki tässä menetelmässä tavallisesti käytetyt entsyymit, kuten peroksidaasi tai β-galaktosidaasi. Fluoresenssiin perustuvassa immunokokeessa merkkiaineena voidaan käyttää tavallisia fluresoivia ryhmiä. Näiden eri koemenetelmien ja menetelmänmuunnosten yksityiskohdat ovat tuttuja alan asiantuntijalle. Edullisia ovat näiden menetelmien ne muunnok-kset, joissa käytetään vähintään kahta monoklonaalista vasta-ainetta, joiden vaikutus kohdistuu antigeenisyyden eri determinantteihin luteinisoivassa hormonissa, ja joista vähintään yksi ristireagoi korkeintaan 3-prosenttisesti muiden glykoproteiini-hormonien kanssa.3,91975 all variants, such as competitive immunoassay, sandwich method, etc. Materials common to each assay method can be used for labeling. Thus, for example, radioisotopes, for example isotope I, are used for labeling in a radioimmunoassay. All enzymes commonly used in this method, such as peroxidase or β-galactosidase, are suitable for the enzymatic immunoassay. In a fluorescence-based immunoassay, common fluorescent groups can be used as a marker. The details of these various test methods and method modifications are familiar to one skilled in the art. Preferred variants of these methods are those that use at least two monoclonal antibodies that act on different determinants of antigenicity in the luteinizing hormone, and at least one of which cross-reacts up to 3% with other glycoprotein hormones.

Luteinisoivaa hormonia määritettäessä tarkoituksenmukaiseksi menetelmäksi on osoittautunut kerrostamismenetelmä ("sandwich") jossa määritettävä antigeeni saatetaan kosketuksiin kantajaan sidotun, merkkiaineella merkityn vasta-aineen kanssa. Tällaista määritysmenetelmää varten kiinteään faasiin voidaan sitoa esimerkiksi tämän keksinnön mukainen, spesifinen monoklonaalinen vasta-aine. Tätä inkuboidaan ensimmäisessä inkubointivaihtees-sa näytteen kanssa, joka näyte sisältää määritettävän luteini-' soivan hormonin, sekä yleisesti ottaen muut glykoproteiinihor- monit. Tällöin tämä spesifinen vasta-aine sitoo luteinisoivan hormonin selektiivisesti. Tavanomaisen pesuvaiheen jälkeen seuraa inkubointi merkityn vasta-aineen kanssa. Tämän merkityn vasta-aineen vaikutuksen ei välttämättä täydy kohdistua spesifisesti luteinisoivaan hormoniin, vaan se voi ristireagoida myös muiden glykoproteiinihormonien kanssa.In the determination of luteinizing hormone, a sandwich method in which the antigen to be determined is contacted with a labeled antibody bound to a carrier has proven to be a suitable method. For such an assay method, for example, a specific monoclonal antibody of the present invention can be bound to the solid phase. This is incubated in the first incubation step with a sample containing the luteinizing hormone to be determined, as well as other glycoprotein hormones in general. In this case, this specific antibody selectively binds luteinizing hormone. After the usual washing step, incubation with the labeled antibody follows. The effect of this labeled antibody may not be specific for the luteinizing hormone, but may cross-react with other glycoprotein hormones.

Tämä menetelmä voidaan toteuttaa myös epäspesifisellä, kantajaan sidotulla vasta-aineella. Tällöin on kuitenkin välttämätöntä, että merkkiaineella merkittynä vasta-aineena käytetään tämän keksinnön mukaista vasta-ainetta, jonka vaikutus kohdistuu spesifisesti luteinisoivaan hormoniin.This method can also be performed with a nonspecific, carrier-bound antibody. In this case, however, it is necessary to use as the labeled antibody an antibody of the present invention which acts specifically on a luteinizing hormone.

4 919754,91975

Kerrostamismenetelmän muunnokset soveltuvat samoin luteinisoi-van hormonin määrittämiseen. Täten, esimerkiksi ensin voidaan muodostaa liukoinen kerrostettu kompleksi ("sandwich”) merkkiaineella merkitsemättömästä, liukoisesta vasta-aineesta ja merkitystä vasta-aineesta. Tämä kompleksi tehdään tämän jälkeen liukenemattomaksi sellaisella kantajaan sidotulla vasta-aineella, jonka vaikutus kohdistuu Fcy-osaan merkitsemättömässä, liukoisessa vasta-aineessa. Tässä menetelmän muunnoksessa vähintään merkitsemättömän, liukoisen vasta-aineen on oltava tämän keksinnön mukainen vasta-aine. Tässä muunnoksessa merkittyä vasta-ainetta käytetään mieluiten ylimäärin.Variations in the deposition method are also suitable for the determination of luteinizing hormone. Thus, for example, a soluble layered complex ("sandwich") of unlabeled, soluble antibody and labeled antibody may first be formed, which complex is then rendered insoluble by a carrier-bound antibody that acts on the Fcγ moiety in an unlabeled, soluble antibody. In this variant of the method, at least the unlabeled, soluble antibody must be an antibody of the present invention, and the labeled antibody in this variant is preferably used in excess.

Olennaisena tässä keksinnössä on pidettävä sitä, että yllättävästi oli mahdollista saada aikaan näihin immunologisiin menetelmiin soveltuvia monoklonaalisia vasta-aineita, joiden vaikutus kohdistuu spesifisesti luteinisoivaan hormoniin, ja jotka täten tekevät luteinisoivan hormonin spesifisen määrittämisen mahdolliseksi.It is to be considered essential in the present invention that it was surprisingly possible to obtain monoclonal antibodies suitable for these immunological methods which act specifically on luteinizing hormone and thus make it possible to determine luteinizing hormone specifically.

Näin ollen tämä keksintö kohdistuu edelleen luteinisoivaa hormonia vastaan vaikuttaviin monoklonaalisiin vasta-aineisiin, joiden ristireaktiivisuus muiden glykoproteiinihormonien kanssa on alle 3%.Accordingly, the present invention is further directed to monoclonal antibodies against luteinizing hormone having less than 3% cross-reactivity with other glycoprotein hormones.

Tämän keksinnön mukaisten monoklonaaliSten vasta-aineiden tuotta-: miseksi koe-eläimiä, esimerkiksi hiiriä, immunoidaan luteinisoi- valla hormonilla. Eläinten immunoimiseksi tätä immunogeenia annetaan tavalliseen tapaan, esimerkiksi yhdessä jonkin apuaineen kanssa. Apuaineina käytetään mieluiten alumiinihydroksidia yhdessä Bordatella pertussis-toksiinin tai Freund'in apuaineen kanssa. Immunointi toteutetaan mieluiten usean kuukauden aikana vähintään neljällä immunoinnilla 4-6 viikon välein (vatsaontelon sisäinen injektointi).To produce the monoclonal antibodies of this invention, experimental animals, e.g., mice, are immunized with luteinizing hormone. To immunize animals, this immunogen is administered in the usual manner, for example in combination with an excipient. Aluminum hydroxide is preferably used as excipients in combination with Bordatella pertussis toxin or Freund's excipient. Immunization is preferably performed over several months with at least four immunizations every 4-6 weeks (intraperitoneal injection).

Täten immunoiduista eläimistä otetaan talteen B-lymfosyytit, jotka sulautetaan yhteen myeloomasolujen pysyvän sukupolven kanssa. Tämä yhteensulauttaminen toteutetaan tutkijoiden Kähler ja Milstein esittämällä tunnetulla menetelmällä (Nature 256, 1975, s. 495-497). Täten muodostettujen hybridisolujenThus, B lymphocytes are recovered from immunized animals and fused to a permanent generation of myeloma cells. This fusion is accomplished by a known method proposed by researchers Kähler and Milstein (Nature 256, 1975, pp. 495-497). The hybrid cells thus formed

IIII

5 91 975 primääriviljelmät kloonataan tavalliseen tapaan, esimerkiksi käyttämällä jotakin tavanomaista kaupallista solulajittelijaa tai rajoittavaa laimentamista ("limiting dilution"). Jatkokäsittelyyn valittiin kulloinkin ne viljelmät, jotka reagoivat positiivisesti luteinisoivaa hormonia vastaan, ja negatiivisesti, tai ainoastaan vähäisessä määrin, muita glykoproteiinihor-moneja vastaan jossakin sopivassa koemenetelmässä, esimerkiksi entsymaattisessa immunokokeessa (ELISA-menetelmä). Näin saadaan useita hybridomisolujen sukupolvia, jotka tuottavat tämän keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta. Näitä solusuku-polvia voidaan viljellä, ja niiden tuttama monoklonaalinen vasta-aine voidaan eristää tunnettuja menetelmiä käyttäen.5,991,975 primary cultures are cloned in the usual manner, for example using a conventional commercial cell sorter or limiting dilution. Cultures that reacted positively against luteinizing hormone and negatively, or only slightly, against other glycoprotein hormones in a suitable test method, for example an enzymatic immunoassay (ELISA), were selected for further treatment. Thus, several generations of hybridoma cells are obtained that produce the monoclonal antibody of this invention. These genera of cells can be cultured, and the monoclonal antibody they are familiar with can be isolated using known methods.

Esimerkkeinä täten valmistetuista solusukupolvista mainittakoon: klooni 369 (NCACC 84122001) ja klooni 799 (NCACC 84122005).Examples of cell generations thus prepared include: clone 369 (NCACC 84122001) and clone 799 (NCACC 84122005).

Nämä solusukupolvet on tallennettu kokoelmaan NCACC (National Collection of Animal Cell Cultures), ja niille on annettu edellä esitetyt tunnusnumerot.These cell generations are stored in the National Collection of Animal Cell Cultures (NCACC) and have been given the identification numbers shown above.

Täten saatujen monoklonaalisten vasta-aineiden tunnusomaisena piirteenä on se, että niiden affiniteetti luteinisoivaa hormonia vastaan on hyvin korkea (affiniteettivakio suuruusluok-kaa 10 - 10 1/mol), ja että niiden ristireaktiivisuus muiden glykoproteiinihormonien kanssa on alle 3%. Erityisen edullisten monoklonaalisten vasta-aineiden ristireaktiivisuus, joka kohdistuu muihin glykoproteiinihormoneihin, kuten hormoneihin hCG, FSH ja TSH, on alle 1%, erityisen mielellään alle 0,1%. Affiniteetin ja muihin hormoneihin kohdistuvan ristireaktiivi-suuden määrittämiseksi voidaan käyttää tavanomaisia, alan asiantuntijalle tunnettuja menetelmiä.The monoclonal antibodies thus obtained are characterized by a very high affinity for luteinizing hormone (affinity constant of the order of 10 to 10 1 / mol) and a cross-reactivity with other glycoprotein hormones of less than 3%. Particularly preferred monoclonal antibodies have less than 1% cross-reactivity with other glycoprotein hormones, such as hCG, FSH and TSH, particularly preferably less than 0.1%. Conventional methods known to those skilled in the art can be used to determine affinity and cross-reactivity with other hormones.

Tämän keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää erinomaisesti luteinisoivan hormonin spesifiseksi määrittämiseksi näytteestä, esimerkiksi seerumista tai plasmasta, muiden glykoproteiinihormonien läsnäollessa. Näissä määritysmenetelmissä näitä monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää 6 91975 sellaisenaan tai niistä voidaan käyttää kappaleita, joilla on vastaavat immunologiset ominaisuudet, esimerkiksi Fab-kappalei-ta. Näin ollen käsitteellä "monoklonaalinen vasta-aine" tarkoitetaan sekä täydellistä vasta-ainetta että sen kappaleita.The monoclonal antibodies of this invention are excellent for the specific determination of luteinizing hormone in a sample, for example serum or plasma, in the presence of other glycoprotein hormones. In these assays, these monoclonal antibodies can be used as 6,91975 as such, or fragments having similar immunological properties can be used, for example, Fab fragments. Thus, the term "monoclonal antibody" refers to both a complete antibody and fragments thereof.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.The essential features of the invention are set out in the appended claims.

Tätä keksintöä havainnollistetaan edelleen seuraavilla esimerkeillä:The present invention is further illustrated by the following examples:

Esimerkki 1Example 1

Luteinisoivaa hormonia vastaan vaikuttavien monoklonaalisten vasta-aineiden tuottaminen_ 8-12 viikon ikäiset Balb/c-hiiret immunoidaan antamalla niille vatsaontelon sisäisesti 100 μg ihmisen luteinisoivaa hormonia (hLH, yhtiö Immunex), joka on adsorboitu alumiinihydroksidiin ja Bordatella pertussis -toksiiniin. 6 viikon kuluttua eläimet immunoidaan edelleen kolmasti, kulloinkin 4 viikon välein. Tällöin niille annetaan vatsaontelon sisäisesti kulloinkin 50 μg luteinisoivaa hormonia, joka on adsorboitu alumiinihydroksidiin ja Bordatella pertussis -toksiiniin.Production of monoclonal antibodies against luteinizing hormone_ Balb / c mice aged 8-12 weeks are immunized by intraperitoneal administration of 100 μg of human luteinizing hormone (hLH, Immunex) adsorbed on aluminum hydroxide and Bordatella pertussis. After 6 weeks, the animals are further immunized three times, every 4 weeks. In this case, they are given 50 μg of luteinising hormone adsorbed on aluminum hydroxide and Bordatella pertussis toxin intraperitoneally.

Yhteensulauttaminen toteutetaan suurin piirtein neljän kuukauden kuluttua viimeisestä immunoinnista. Eläimet immunoidaan vielä kerran antamalla niille vatsaontelon sisäisesti tai suonen sisäisesti neljä vuorokautta ja kolme vuorokautta ennen .· yhteensulauttamista kulloinkin 100 μg luteinisoivaa hormonia PBS-liuoksessa (fosfaatilla puskuroitu suolaliuos).Fusion is performed approximately four months after the last immunization. Animals are immunized once more by intraperitoneal or intravenous administration four days and three days before fusion: 100 μg of luteinizing hormone in PBS (phosphate buffered saline) each time.

Yhteensulauttaminen toteutetaan menetelmällä, joka on esitetty julkaisussa Galfre, Methods in Enzymology, 73 (1981), sivu 3,The fusion is performed by the method described in Galfre, Methods in Enzymology, 73 (1981), page 3,

QQ

ja tässä menetelmässä 10° immunoidusta hiirestä saatua perna-,v solua sekoitetaasn 2 x 107 myeloomasoluun (P3x63Ag8-653, ATCC-CRL 8375), minkä jälkeen tätä seosta sentrifugoidaan 10 min (300 g, 4°C). Nämä solut pestään vielä kertaalleen BSS-liuok-sella (tasapainotettu suolaliuos), ja sentrifugoidaan nopeudella 400 g. Erottunut neste poistetaan. Saatuun solukasaumaan lisätään 1 ml 50-prosenttista PEG-liuosta (MG 4000, Merck).and in this method, a spleen cell from a 10 ° immunized mouse is mixed with 2 x 10 7 myeloma cells (P3x63Ag8-653, ATCC-CRL 8375), after which this mixture is centrifuged for 10 min (300 g, 4 ° C). These cells are washed once more with BSS (equilibrated saline) and centrifuged at 400 g. The separated liquid is removed. To the resulting cell pellet is added 1 ml of 50% PEG solution (MG 4000, Merck).

·. Tämän jälkeen tähän seokseen lisätään hitaasti, pisaroit- tain, huoneenlämpötilassa 5 ml RPMI 1640 -väliainetta (RPMI = il 7 91975·. 5 ml of RPMI 1640 medium (RPMI = il 7 91975) are then slowly added dropwise to this mixture at room temperature.

Rosewell Parker Memory Institute), joka ei sisällä sikiöasteisen vasikan seerumia (FKS), tämän jälkeen vielä kerran 5 ml RPMI 1640-väliainetta, jossa on 10 % FKS-seerumia, täytetään väliaineella 50 millilitraksi, ja sentrifugoidaan 10 minuuttia nopeudella 400 g. Solukasauma siirretään 10 % FKS-seerumia sisältävään RPMI 1640-väliaineeseen. 24 koloa käsittäville solu- viljelylevyille (yhtiö Nunc) siirretään kulloinkin 2 x 10 perna-solua. Kuhunkin viljelmään lisätään ravinnesoluiksi 1 x 10 4 pernasolua tai 5 x 10 vatsakalvon läpi tihkunutta eksudaatti-solua. Seuraavana päivänä näihin viljelmiin lisätään hypoksantiinista ja atsaseriinistä muodostuvaa valikoinnin väliainetta (lOO mM hypoksantiinia, 1 ^.ug/ml atsaseriiniä) .Rosewell Parker Memory Institute), which does not contain fetal calf serum (FKS), then once again 5 ml of RPMI 1640 medium with 10% FKS serum is made up to 50 ml with medium and centrifuged at 400 g for 10 minutes. The cell pellet is transferred to RPMI 1640 medium containing 10% FKS serum. 2 x 10 spleen cells are transferred to 24-well cell culture plates (Nunc). 1 x 10 4 spleen cells or 5 x 10 exudate cells oozing through the peritoneum are added to each culture as nutrient cells. The next day, a selection medium consisting of hypoxanthine and azacerin (100 mM hypoxanthine, 1 μg / ml azacerin) is added to these cultures.

Noin 7-10 vuorokauden kuluttua nähdään jo useita klooneja. Primääriviljelmien supernatantti testataan esimerkissä 2 kuvatulla ELISA-menetelmällä. Antigeenille spesifisiä vasta-aineita sisältävät primääriviljelmät kloonataan edelleen 96 koloa käsittäville soluviljelylevyille (yhtiö Nunc) fluoresenssiaktivoi- 4 van solulajittelijän avulla. Ravinnesoluina käytetään 1 x 10 4 vatsakalvon läpi tihkunutta eksudaattisolua tai 2 x 10 perna-solua viljelmän 96 koloa kohden.After about 7-10 days, several clones are already seen. The supernatant of the primary cultures is tested by the ELISA method described in Example 2. Primary cultures containing antibodies specific for the antigen are further cloned into 96-well cell culture plates (Nunc) using a fluorescence-activating cell sorter. 1 x 10 4 exudate cells oozing through the peritoneum or 2 x 10 spleen cells per 96 wells of culture are used as nutrient cells.

Tällä tavalla voitiin eristää hybridomisolujen sukupolvien molemmat kloonit, klooni 369 ja klooni 799, jotka on tallennettu kokoelmaan NCACC (National Collection of Animal Cell Cultures), ja niillä on seuraavat tunnusnumerot: NCACC 84122001 (= klooni 369) ja NCACC 84122005 (= klooni 799).In this way, both clones of the hybridoma cell generations, clone 369 and clone 799, stored in the National Collection of Animal Cell Cultures (NCACC) with the following identification numbers could be isolated: NCACC 84122001 (= clone 369) and NCACC 84122005 (= clone 799) .

Vesivatsan (ascites) aikaansaamiseksi hiiriin injektoidaan vatsa-• £ * ontelon sisäisesti 5 x 10 hybridisolua sen jälkeen, kun ne on ensin käsitelty 1-2 kertaa 0,5 millilitralla pristan-liuosta. Tästä injektoinnista yhden - kolmen viikon kuluttua hiirten vesivatsan nestettä, voidaan ottaa talteen. Vasta-aineet voidaan eristää tästä nesteestä tavalliseen tapaan. Näiden monoklonaalisten vasta-aineiden vaikutus kohdistuu soesifisesti luteinisoivaan hormoniin, ja niillä on ainoastaan vähäistä, 8 91975 mikäli lainkaan, ristireaktiivisuutta muiden glykoproteiini-hormonien kanssa. Niistä käytetään seuraavassa tunnuksia MAK 369 (kloonista 369) sekä MAK 799 (kloonista 799).To induce ascites, mice are injected intraperitoneally with 5 x 10 6 hybrid cells after first treatment 1-2 times with 0.5 ml of Pristan solution. One to three weeks after this injection, the peritoneal fluid of the mice can be recovered. Antibodies can be isolated from this fluid in the usual manner. These monoclonal antibodies specifically target luteinizing hormone and have little, if any, cross-reactivity with other glycoprotein hormones. In the following, the symbols MAK 369 (from clone 369) and MAK 799 (from clone 799) are used.

Nämä molemmat monoklonaaliset vasta-aineet kuuluvat alaluokkaan IgGl/K. Niiden affiniteetit ovat seuraavat: MAK 369 = 7,9 x 1010 1/mol MAK 799 = 9,5 x 1011 1/mol.Both of these monoclonal antibodies belong to the IgG1 / K subclass. Their affinities are as follows: MAK 369 = 7.9 x 1010 1 / mol MAK 799 = 9.5 x 1011 1 / mol.

Affiniteetin määrittämiseksi niiden kilpailukäyrät muodostetaan homologisen antigeenin kanssa Scatchard'in menetelmällä (Ann. N.Y. Acad. Sei. 51_ (1949) sivu 660), ja nämä käyrät analysoidaan. Tätä varten tarvittavat mittaukset toteutetaan analogisesti esimerkissä 2 esitetyllä tavalla.To determine affinity, their competition curves are generated with the homologous antigen by the method of Scatchard (Ann. N.Y. Acad. Sci. 51_ (1949) page 660), and these curves are analyzed. The measurements required for this are carried out analogously to Example 2.

Esimerkki 2Example 2

Luteinisoivaa hormonia vastaan vaikuttavan vasta-aineen seulon- takoe___________Luteinizing hormone antibody screening test___________

Jotta luteinisoivaa hormonia vastaan vaikuttavien vasta-aineiden spesifisyys ja läsnäolo immunoitujen hiirien seerumissa, tai hybridisoluviljelmän supernatantissa tai vesivatsan nesteessä saataisiin todetuksi, niin ELISA-menetelmää käytetään tes-tausperiaatteena: mikrotiitterilevyt päällystetään 37°C:n lämpötilassa yön yli liuoksella, joka sisältää 1 ^ug luteinisoivaa hormonia 1 millilitrassa päällystämispuskuria (0,2 M natrium-• karbonaatti/-bikarbonaatti, pH 9,3-9,5). Tämän jälkeen niitä käsitellään 10 minuutin ajan O,9-prosenttisella natriumkloridi-liuoksella ja 1-prosenttisella albumiiniliuoksella. Sitten ne pestään O,9-prosenttisella natriumkloridiliuoksella. Tämän jälkeen niitä inkuboidaan 37°C:n lämpötilassa tunnin ajan lOO ^,ul suuruisen näytteen kanssa, ja pestään sitten uudestaan 0,9-prosenttisella natriumkloridiliuoksella. Tämän jälkeen niitä inkuboidaan (tunnin ajan 37°C:n lämpötilassa) lammas-antihiiri-IgG-peroksidaasikonjugaatin kanssa, jota käytetään pitoisuutena 100-150 mU/ml. Levyt pestään jälleen O,9-prosenttisella natrium-kloridilla, ja peroksidaasin aktiivisuus määritetään tavanomaiseen tapaan (esimerkiksi ABTS-menetelmällä, 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, ekstinktioero AmE määritetään aallonpituudella 405 nm).In order to determine the specificity and presence of antibodies against luteinizing hormone in the serum of immunized mice, or in the hybrid cell culture supernatant or aqueous humor, the ELISA method is used as a test principle: microtiter plates are coated at 1 ° C overnight at 37 ° C. luteinizing hormone in 1 ml of coating buffer (0.2 M sodium carbonate / bicarbonate, pH 9.3-9.5). They are then treated for 10 minutes with 0.9% sodium chloride solution and 1% albumin solution. They are then washed with 0.9% sodium chloride solution. They are then incubated at 37 ° C for one hour with a 100 μl sample, and then washed again with 0.9% sodium chloride solution. They are then incubated (for one hour at 37 ° C) with a sheep anti-mouse IgG peroxidase conjugate used at a concentration of 100-150 mU / ml. The plates are washed again with 0.9% sodium chloride, and the peroxidase activity is determined in the usual manner (for example, by the ABTS method, for 30 minutes at room temperature, the extinction difference AmE is determined at 405 nm).

Il 91975 9 ELISA-koe voidaan toteuttaa myös seuraavasti:Il 91975 9 The ELISA test may also be carried out as follows:

Mikrotiitterilevyt päällystetään ensin lammas-antihiiri-IgG-kompleksilla (20-30 ^ug/ml päällystämispuskuria, yksi tunti -yön yli, 37°C:n lämpötilassa). Tämän jälkeen levyjä jatkokäsi-tellään edellä kuvatulla tavalla, näyteliuos lisätään ja levyt pestään uudestaan. Lopuksi levyjä inkuboidaan 250 mU/ml suuruisen määrän kanssa LH-peroksidaasikonjugaattia (1 tunti, 37°C). Levyt pestään ja peroksidaasin aktiivisuus määritetään esimerkiksi ABTS-menetelmällä.Microtiter plates are first coated with sheep anti-mouse IgG complex (20-30 ug / ml coating buffer, overnight, at 37 ° C). The plates are then further processed as described above, the sample solution is added and the plates are washed again. Finally, the plates are incubated with 250 mU / ml LH-peroxidase conjugate (1 hour, 37 ° C). The plates are washed and the peroxidase activity is determined, for example, by the ABTS method.

Esimerkki 3Example 3

Muihin glykoproteiinihormoneihin kohdistuvan ristireaktiivisuu- den määrittäminen___ • Tässä määrityksessä menetellään esimerkissä 2 kuvatulla tavalla. Ensin määritetään luteinisoivan hormonin reaktiivisuus. Tämän jälkeen kyseiseen monoklonaaliseen vasta-aineeseen lisätään ristireaktiivisuuden suhteen tarkasteltavaa antigeeniä (hCG, TSH, FSH) kasvavina pitoisuuksina.Determination of cross-reactivity to other glycoprotein hormones ___ • This assay is performed as described in Example 2. First, the reactivity of the luteinizing hormone is determined. The antigen of interest (hCG, TSH, FSH) is then added to the monoclonal antibody in increasing concentrations.

Tämän jälkeen ristireaktiivisuudet lasketaan seuraavalla kaavalla : C ( LH ) - x 100 = ristireaktiivisuus prosentteina C(ristireagoiva antigeeni) • · « missä C tarkoittaa antigeenin sitä pitoisuutta, joka tarvitaan suurimman mahdollisen signaalin 50-prosenttisesti saavuttamiseksi .The cross-reactivities are then calculated by the following formula: C (LH) - x 100 = cross-reactivity as a percentage C (cross-reactive antigen) • · «where C is the concentration of antigen required to reach 50% of the maximum possible signal.

Seuraavassa taulukossa esitetään vasta-aineiden MAK 369 ja • MAK 799 tapauksissa mitatut arvot.The following table shows the values measured for the antibodies MAK 369 and • MAK 799.

10 9197510 91975

Taulukko 1table 1

Luteinisoivaa hormonia vastaan vaikuttavien monoklonaalisten vasta-aineiden MAK 369 ja MAK 799 ristireaktiivisuus hormonien hCG, FSH ja TSH kanssa_Cross-reactivity of monoclonal antibodies against luteinizing hormone MAK 369 and MAK 799 with hormones hCG, FSH and TSH_

Glyko- Alkuperä suurin pi- pitoisuusalue prosenttinen ristireak-hormoni (yhtiö) toisuus ristireaktii- MAK 369 ^MÄff^"7QQSGlyko- Origin maximum pi- concentration range percent cross-reactive hormone (company) second cross-reac- MAK 369 ^ MÄff ^ "7QQS

_ _ seerumissa visuuskokeessa__MAK_ _ in the serum visibility test__MAK

hCG UCB, 200 IU/ml 0-250 IU/ml <0,1 <0,1hCG UCB, 200 IU / ml 0-250 IU / ml <0.1 <0.1

Belgia FSH UCB, 400 mIU/ml 0-9 IU/ml <0,1 <0,1Belgium FSH UCB, 400 mIU / ml 0-9 IU / ml <0.1 <0.1

Belgia a-TSH Boehringer 1000 .uIU/ml 0-9000 ,uIU/ml <0,1 <0,1Belgium α-TSH Boehringer 1000 .uIU / ml 0-9000, uIU / ml <0.1 <0.1

Mannheim ' ' β-TSH Boehringer lOOO.uIU/ml 0-9000 ,uIU/ml <0,1 <0,1Mannheim '' β-TSH Boehringer 100.uIU / ml 0-9000, uIU / ml <0.1 <0.1

Mannheim ' 'Mannheim ''

Esimerkki 4Example 4

Epitooppispesifisyyden määrittäminenDetermination of epitope specificity

Mikrotiitterilevyä päällystetään 2 tuntia 37°C:n lämpötilassa, tai yön yli 4°C:n lämpötilassa, liuoksella, joka käsittää pitoisuutena 10^.ug/ml lampaan vasta-ainetta, jonka vaikutus kohdistuu erään hiiri-vasta-aineen Fcy-alueeseen, 0,2 M karbonaatti-puskurissa, pH 9,6. Levy pestään tämän jälkeen PBS/Tween 20 (0,1%)-seoksella, pH 7,35. Tämän jälkeen levylle lisätään in-kubointipuskurissa (PBS, 0,1% naudan seerumin albumiini (BSA), 0,1% Tween 20) 100 ui monoklonaalista vasta-ainetta (MAK 1, . pitoisuus 10/Ug/ml), ja levyä inkuboidaan 2 tuntia 37 C:n lämpötilassa.The microtiter plate is coated for 2 hours at 37 ° C, or overnight at 4 ° C, with a solution comprising 10 μg / ml of sheep antibody acting on the Fcγ region of a mouse antibody, In 0.2 M carbonate buffer, pH 9.6. The plate is then washed with PBS / Tween 20 (0.1%), pH 7.35. Then, 100 monoclonal antibody (MAK 1, 10 .mu.g / ml) is added to the plate in incubation buffer (PBS, 0.1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween 20), and the plate is incubated. 2 hours at 37 ° C.

LH-peroksidaasi-konjugaattia (100 mU/ml inkuboidaan edeltä käsin yön yli 4°C:n lämpötilassa liuoksessa erään toisen monoklonaa-lisen vasta-aineen (MAK2) kanssa, pitoisuus lO^ug/ml.LH-peroxidase conjugate (100 mU / ml is pre-incubated overnight at 4 ° C in solution with another monoclonal antibody (MAK2) at a concentration of 10 ug / ml.

Sen jälkeen, kun levyä on inkuboitu vasta-aineen MAK 1 kanssa, ylimääräinen MAK 1 poistetaan pesemällä levy PBS-Tween 20-seoksella. Tämän jälkeen levy päällystetään 1-prosenttisella hiiren normaaliseerumilla PBS-RSA-liuoksessa 30 minuutin ajan, huoneen lämpötilassa. Levylle lisätään lOO^ul edeltä käsin inkuboitua MAK 2/LH-peroksidaasikompleksia, ja levyä inkuboi-After incubating the plate with antibody MAK 1, excess MAK 1 is removed by washing the plate with PBS-Tween 20. The plate is then coated with 1% normal mouse serum in PBS-RSA for 30 minutes at room temperature. 100 μl of pre-incubated MAK 2 / LH peroxidase complex is added to the plate, and the plate is incubated

IIII

n 91975 daan 2 tuntia 37°C:n lämpötilassa. Sitoutunut peroksidaasi-aktiivisuus tehdään näkyväksi käyttämällä substraattina ABTS-liuosta. Värin mitattu intensiteetti on suoraan verrannollinen vasta-aineeseen MAK 1 sitoutuneeseen MAK 2/LH-peroksi-daasi-konjugaattiin. Siinä tapauksessa, että MAK 799 on MAK 1 ja MAK 369 on MAK 2, niin sitoutunut aktiivisuus on 34¾ kilpailemattomasta LH-POD-aktiivisuudesta.n 91975 for 2 hours at 37 ° C. Bound peroxidase activity is visualized using ABTS solution as a substrate. The measured intensity of the color is directly proportional to the MAK 2 / LH-peroxidase conjugate bound to the MAK 1 antibody. In the case that MAK 799 is MAK 1 and MAK 369 is MAK 2, then the bound activity is 34¾ of the uncompetitive LH-POD activity.

Saadut tulokset osoittavat, että ^näiden molempien monoklonaa-listen vasta-aineiden vaikutus kohdistuu LH-antigeenin eri eDi-tooppeihin .The results obtained show that the effect of both of these monoclonal antibodies is directed at different eDi tops of the LH antigen.

Esimerkki 5Example 5

Luteinisoivan hormonin määrittäminen A) Reagenssiliuosten valmistaminen 1) Substraattipuskuri:Determination of luteinizing hormone A) Preparation of reagent solutions 1) Substrate buffer:

15 mM natriumfosfaattipuskuri, pH 7,4 15 mM natriumkloridi 5 mM EDTA15 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4 15 mM sodium chloride 5 mM EDTA

0,2% naudan seerumin albumiini, pH 7,4 5 mM o-nitrofenyyligalaktosidi.0.2% bovine serum albumin, pH 7.4 5 mM o-nitrophenylgalactoside.

2) Reseptori-l-liuos2) Receptor-1 solution

Reseptorina 1 käytetään tämän keksinnön mukaista monoklonaalista hiiren anti-hLH-vasta-ainetta. Tätä vasta-ainetta sisältävän vesivatsan neste tehdään ammoniumsulfaatin suhteen korkeintaan ·· 1,8 molaariseksi. Sakka sekoitetaan puskuriin, joka käsittää 15 mM natriumfosfaattia, pH 7,0, sekä 50 mM natriumkloridia.As the receptor 1, a murine anti-hLH monoclonal antibody of the present invention is used. The aqueous humor containing this antibody is made to a maximum of 1.8 molar relative to ammonium sulfate. The precipitate is mixed with a buffer comprising 15 mM sodium phosphate, pH 7.0, and 50 mM sodium chloride.

Näin saatu liuos johdetaan kertaalleen DEAE-selluloosan läpi.The solution thus obtained is passed once through DEAE cellulose.

3) Reseptori-3-liuos3) Receptor-3 solution

Reseptorina 3 käytetään samoin tämän keksinnön mukaista mono-• klonaalista hiiren anti-hLH-vasta-ainetta, joka kuitenkin tun nistaa toisen antigeenisyyden determinantin kuin reseptori 1.As the receptor 3, the mouse anti-hLH monoclonal antibody of the present invention is also used, which, however, recognizes a different antigenic determinant than the receptor 1.

Tätä vasta-ainetta sisältävä vesivatsan neste puhdistetaan kohdassa 2 esitetyllä tavalla. Täydellinen vasta-aine pilkotaan tunnetulla tavalla Fab-kappaleeksi. Saadut Fab-kappaleet kytketään β-galaktosidaasiin menetelmällä, joka kuvataan julkaisussa R.R. Porter, Biochem. J. 73_, (1959) s. 119.The aqueous humor containing this antibody is purified as described in section 2. The complete antibody is cleaved into a Fab fragment in a known manner. The resulting Fab fragments are coupled to β-galactosidase by the method described in R.R. Porter, Biochem. J. 73_, (1959) p. 119.

12 91975 4) Aktivoitu reseptori-2-1iuos12 91975 4) Activated receptor-2-1 solution

Lampaan antihiiri-Fcy-antiseerumiin lisätään ammoniumsulfaattia korkeintaan pitoisuudeksi 1,8 M. Sakka sekoitetaan puskuriin, joka käsittää 15 mM natriumfosfaattia, pH 7,0, ja 50 mM natriumkloridia. Näin saatu liuos johdetaan kertaalleen DEAE-selluloosan läpi.Ammonium sulfate is added to the sheep anti-mouse Fcγ antiserum to a maximum concentration of 1.8 M. The precipitate is mixed with a buffer comprising 15 mM sodium phosphate, pH 7.0, and 50 mM sodium chloride. The solution thus obtained is passed once through DEAE cellulose.

B) Reagenssikantajien valmistaminen 1) Reagenssikantaja 1 40^,ul liuosta, joka käsittää yhtä millilitraa kohden 100 ^umol natriumfosfaattia, pH 7,3 (37°C) 2^umol magnesiumkloridia 0,9% natriumkloridia 0,5% naudan seerumin albumiinia 5yug monoklonaalista anti-hLH-vasta-ainetta hiirestä (reseptori-1-1iuos) 100 mU anti-hLH-vasta-aine-(hiiri)-Fab-kappale-g-galaktosidaasi-konjugaattia (reseptori-3-liuos) siirretään oisaroittain kuitumatolle, joka on valmistettu kaupallisesta polyesteripaperista. Tämän jälkeen se kuivataan huoneen lämpötilassa. Näitä kuitumattoja säilytetään käyttöhetkeen saakka 4°C:n lämpötilassa olosuhteissa, joissa ilman kosteus on 20%.B) Preparation of reagent carriers 1) Reagent carrier 1 40 [mu] l of a solution comprising 100 [mu] l of sodium phosphate per milliliter, pH 7.3 (37 [deg.] C.) 2 [mu] mol of magnesium chloride 0.9% sodium chloride 0.5% bovine serum albumin 5yug anti-hLH monoclonal antibody from mouse (receptor-1-1 solution) 100 mU of anti-hLH antibody (mouse) -Fab fragment-g-galactosidase conjugate (receptor-3 solution) is transferred in stems to the nonwoven, made of commercial polyester paper. It is then dried at room temperature. These non-woven mats are stored at 4 ° C until use at a temperature of 20%.

2) Reagenssikantaja 2 ' Selluloosasta valmistetulle kuitumatolle kiinnitetään tunnetulla, bromisyaanilla toteutettavalla aktivointimenetelmällä (DE-OS 1 768 512) lampaan vasta-ainetta, jonka vaikutus kohdistuu hiiristä saadun vasta-aineen Fcy-osaan (aktivoitu reseptori-2-liuos) siten, että kuitumateriaalin yhtä grammaa kohden pyritään kiinnittämään 10yug vasta-ainetta. Kytkeytymättä, jäänyt vasta-aine poistetaan Desemällä, ja kuitumatto kuivataan varovaisesti huoneen lämpötilassa. Näin saadut kuitumatot säilytetään reagens-sikantajan 1 kohdalla esitetysti.2) Reagent carrier 2 'A sheep antibody is applied to a cellulose non-woven mat by a known method of bromocyanin activation (DE-OS 1 768 512) which acts on the Fcγ portion of the mouse antibody (activated receptor-2 solution) so that the fibrous material an attempt is made to attach 10yug of antibody per gram. Uncoupled, the remaining antibody is removed with Desema, and the nonwoven mat is carefully dried at room temperature. The fibrous mats thus obtained are stored as described for reagent carrier 1.

Näiden kahden reagenssikantajän 1 ja 2 avulla tapahtuva määrittäminen toteutetaan DE-patenttihakumuksessa 3 425 008.5 kuvatulla laitteella analyyttisten määritysten suorittamiseksi.The determination by means of these two reagent carriers 1 and 2 is carried out with the apparatus described in DE patent application 3,425,008.5 for performing analytical determinations.

Il n 91975 Tämä laite käsittää roottorin lisäelementin sentrifugaalivoi-maan perustuvia analyysiautomaatteja varten, tämän roottorin lisäelementin käsittäessä muotokappaleen, jossa on näytteen vas-taanottokammio, joka näytteen vastaanottokammio on yhteydessä usean reagenssikentän kanssa, ja kukin näistä reagenssikentistä sisältää imukykyistä, tietyllä reagenssilla kyllästettyä kanta jamateriaalia , ja jossa muotokappaleessa on lisäksi vähintään yksi sekoitusventtiilikammio sekä mittauskammio, jotka muodostavat yhdessä näytenesteen kuljetusreitin, joka kuljetusreitti kulkee säteittäisesti sisäänpäin ja edelleen säteittäisesti ulospäin, kun tämä lisäelementti on kiinnitetty roottoriin, tämän muotokappaleen käsittäessä edelleen vähintään yhden kammion nesteen vastaanottamiseksi, sekä yhden kuljetusreitin, joka kulkee tästä kammiosta mittauskammioon, ja joka on vähintään osittain identtinen näytenesteen kuljetusreitin kanssa. Tällöin näytenesteen kuljetusreitti kulkee näytteen vastaanottokammios-ta (P) imukykyisellä materiaalilla täytetyn, puskuria sisältävän kammion (a), kammion (c) ja kammioiden (a) ja (c) välissä sijaitsevan ensimmäisen venttiilikammion (VK1) kautta toiseen venttiilikammioon (VK2), ja tästä venttiilikammiosta kammion (d) kautta ja kokoomakammion (AK) kautta mittauskammioon (K). Laitteessa on muun nesteen vastaanottamista varten pumppauskam-miona esitetty substraattikammio (PK), joka on yhteydessä toisen venttiilikammion (VK2) kanssa annostelukammiosta (DK) ja kapillaarista (Kap) muodostuvan annostelulaitteen ja ylijuok-sukammion (UK) välityksellä. Kuvassa 1 esitetään kaavamaisesti « * käytetty roottorin lisäelementti. Reagenssikantajaa 1 laitetaan laitteen kenttään c, ja reagenssikantajaa 2 kenttään d.Il n 91975 This apparatus comprises an additional rotor element for centrifugal force-based analysis machines, said additional rotor element comprising a shaped body having a sample receiving chamber, the sample receiving chamber communicating with a plurality of reagent fields, and each of these reagent fields containing absorbent and wherein the molding further comprises at least one mixing valve chamber and a metering chamber which together form a sample fluid transport path which extends radially inwards and further radially outwards when this additional element is attached to the rotor, said molding further comprising at least one chamber for receiving fluid, and one transport path, from this chamber to the measuring chamber and which is at least partially identical to the transport route of the sample liquid. In this case, the sample liquid transport path passes from the sample receiving chamber (P) through a buffer-filled chamber (a), a chamber (c) and a first valve chamber (VK1) between the chambers (a) and (c) filled with absorbent material, and a second valve chamber (VK2), and from this valve chamber through the chamber (d) and through the collecting chamber (AK) to the measuring chamber (K). The device has a substrate chamber (PK) shown as a pumping chamber for receiving other liquid, which communicates with the second valve chamber (VK2) via a dosing device consisting of a dosing chamber (DK) and a capillary (Kap) and an overflow chamber (UK). Figure 1 shows schematically the additional rotor element used. Reagent carrier 1 is placed in field c of the device, and reagent carrier 2 in field d.

40^,ul näytettä pipetoidaan suoraan kenttään a yläreunassa sijaitsevan aukon kautta. Näyte on laimentamaton. 270yUl subs-traattiliuosta pipetoidaan kammioon PK. Tämän jälkeen näyte ja substraattiliuos saadaan liikkumaan erotusmatriisin ja kyvetin suuntaan sopivalla ohjelmalla, jossa esiintyy vuorotellen suuria pyörimisnopeuksia ja roottorin liikkumattomuutta. Ohjelman edetessä näyteneste eluoi reseptorit 1 ja 3 kentästä c, jonka jälkeen tämän homogeenisen seoksen annetaan reagoida. Muodostuneet kompleksit sidotaan reseptoriin 2 kentässä d. Näytteen siirtyminen kentästä c kenttään d tapahtuu erittäin lyhyessä ajassa.A 40 μl sample is pipetted directly into field a through an opening at the top. The sample is undiluted. 270 ul of substrate solution is pipetted into chamber PK. The sample and substrate solution are then moved in the direction of the separation matrix and cuvette by a suitable program with alternating high rotational speeds and rotor immobility. As the program progresses, the sample fluid elutes receptors 1 and 3 from field c, after which this homogeneous mixture is allowed to react. The complexes formed bind to receptor 2 in field d. The transition of the sample from field c to field d takes place in a very short time.

14 91 97514 91 975

Annostelukammio DK jakaa substraattiliuoksen osiin, joista ensimmäisiä käytetään ylimääräisen, komplekseja muodostamattoman konjugaatin uloshuuhtomiseen.The dosing chamber DK divides the substrate solution into portions, the former of which are used to flush out excess, uncomplexed conjugate.

Kentässä d komplekseja muodostamalla sitoutuneen β-galaktosidaa-sin aktiivisuus on verrannollinen näytteen sisältämän hLH-määrään. Tämä aktiivisuus määritetään uudella substraattiannok-sella, jolloin substraatti muutetaan 5 minuutin pituisella reaktiolla värillisiksi tuotteiksi. Muodostunut väri mitataan kyve-tissä aallonpituudella 410 nm.In field d, the activity of bound β-galactosidase by forming complexes is proportional to the amount of hLH in the sample. This activity is determined with a new dose of substrate, whereby the substrate is converted into colored products by a reaction for 5 minutes. The color formed is measured in a cuvette at 410 nm.

Kuvan 2 mukainen kalibrointikäyrä saadaan kalibrointiseerumeilla, joiden LH-pituus tunnetaan, ja tämä kalibrointikäyrä kattaa alueen 0-25 mU hLH/ml (standardisoitu hLH 68/40-hormonin ensimmäisen IRP-standardin mukaan), ja se mahdollistaa ihmisen luteinisoi-van hormonin (hLH) riittävän herkän mittaamisen seerumista tai plasmasta. Ihmisen luteinisoivan hormonin tuntematon pitoisuus ruumiin nesteissä, kuten seerumissa tai plasmassa, saadaan tämän kalibrointikäyrän avulla. Tämän menetelmän toistettavuus standardilla, jonka pitoisuus on 100 IU/ml hCG (1. IRP = Maailman Terveysjärjestön WHO 1. referenssipreparaatti), on 96-104¾.The calibration curve in Figure 2 is obtained with calibration sera of known LH length, and this calibration curve covers the range 0-25 mU hLH / ml (standardized according to the first IRP standard for hLH 68/40) and allows human luteinizing hormone (hLH ) for a sufficiently sensitive measurement of serum or plasma. The unknown concentration of human luteinizing hormone in body fluids such as serum or plasma is obtained from this calibration curve. The repeatability of this method with a standard with a concentration of 100 IU / ml hCG (1st IRP = WHO 1st reference preparation) is 96-104¾.

Esimerkki 6Example 6

Luteinisoivan hormonin määrittäminen kerrostamisperiaatteella ( "sandwich" )________ ; Mikrotiitterilevyn kuhunkin koloon laitetaan lOO^ul liuosta, joka sisältää luteinisoivaa hormonia vastaan vaikuttavaa, tämän keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta päällystämis-puskurissa (0,2 M natriumkarbonaatti/-bikarbonaatti, pH 9,4) pitoisuutena 50^.ug/ml, ja levyä inkuboidaan tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen levyn kolot päällystetään uudestaan inkubointipuskurilla (1% naudan seerumin albumiinia, 0,9¾Determination of luteinising hormone by the sandwich principle ________; Each well of a microtiter plate is charged with 100 μl of a solution containing a monoclonal antibody of the present invention against luteinizing hormone in coating buffer (0.2 M sodium carbonate / bicarbonate, pH 9.4) at a concentration of 50 μg / ml, and the plate is incubated for one hour at room temperature. The wells of the plate are then recoated with incubation buffer (1% bovine serum albumin, 0.9¾

NaCl), ja inkuboidaan 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Pesu-puskurilla (0,9¾ NaCl, 0,1¾ Tween 20) pesun jälkeen levyn jokaiseen koloon laitetaan lOO^ul näytettä, joka sisältää määritettävää luteinisoivaa hormonia, ja levyä inkuboidaan 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen, kun levy on pesty jälleen pesupuskurilla, koloihin lisätään 100yul konjugaattia, jokaNaCl), and incubated for 30 minutes at room temperature. After washing with wash buffer (0.9¾ NaCl, 0.1¾ Tween 20), 100 μl of a sample containing the luteinizing hormone to be determined is placed in each well of the plate and the plate is incubated for 30 minutes at room temperature. After washing the plate again with wash buffer, 100 ul of conjugate is added to the wells

IIII

is 91975 muodostuu peroksidaasista (aktiivisuus mU/ml) sekä toisesta tämän keksinnön mukaisesta monoklonaalisesta vasta-aineesta, jonka vaikutus kohdistuu kuitenkin luteinisoivan hormonin toiseen epitooppiin, ja levyä inkuboidaan tunnin ajan huoneen lämpötilassa.is 91975 consists of peroxidase (activity mU / ml) and another monoclonal antibody of this invention, which, however, acts on another epitope of luteinizing hormone, and the plate is incubated for one hour at room temperature.

Konjugaatin valmistamiseen käytetään piparjuuren peroksidaasia EC 1.11.1.7. Konjugaatti valmistetaan perjodaatilla hapettamalla ja tämän jälkeen boorihydridillä pelkistämällä, käyttäen Nakane'n menetelmää julkaisusta (M.B. Wilson ja P.K. Nakane, teoksessa W. Knapp toim. "Immunoflurescense and Related Staining Techniques", 1978, Elsevier/North Holland, Biomedical Press, sivut 215-224).Horseradish peroxidase EC 1.11.1.7 is used to prepare the conjugate. The conjugate is prepared by periodate oxidation followed by reduction with borohydride, using the method of Nakane from MB Wilson and PK Nakane, W. Knapp, "Immunoflurescense and Related Staining Techniques", 1978, Elsevier / North Holland, Biomedical Press, pages 215- 224).

Pesupuskurilla pesun jälkeen koloihin laitetaan lOO^ul ABTS-substraattiliuosta, ja tunnin pituisen värinmuodostusreaktion jälkeen ekstinktio mitataan aallonpituudella 405 nm ELISA-mit-talaitteella (Dynatec).After washing with wash buffer, 100 of ABTS substrate solution is added to the wells, and after one hour of color formation reaction, the extinction is measured at 405 nm with an ELISA meter (Dynatec).

Kalibrointikäyrän valmistamiseksi edellä kuvatussa menetelmässä käytetään näytteen sijasta liuoksia, jotka sisältävät luteini-soivaa hormonia erilaisina, tarkoin määrättyinä pitoisuuksina.To prepare the calibration curve, the method described above uses solutions containing lutein-ringing hormone at different, well-defined concentrations instead of the sample.

««

Claims (10)

1. Immunologiskt förfarande för bestämning av ett lutei-niserande hormon (LH), kännetecknat av att i förfarandet används minst en mot ett luteiniserande hormon LH riktad mo-noklonal antikropp, vars korsreaktivitet med andra glykopro-teinhormoner, FSH, TSH och h-CG, är under 3 %, och som är erhällbar frän en hybridomacellinje NCACC 84122001 och NCACC 84122005. „ SI 9751. Immunological method for the determination of a luteinizing hormone (LH), characterized in that the method uses at least one monoclonal antibody directed against a luteinizing hormone LH, whose cross-reactivity with other glycoprotein hormones, FSH, TSH and h-CG , is less than 3% and obtainable from a hybridoma cell line NCACC 84122001 and NCACC 84122005. „SI 975 2. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att i förfarandet används minst en mot ett luteiniserande hormon LH riktad monoklonal antikropp, och vars korsreaktivitet med andra glykoproteinhormoner, FSH, TSH och h-CG, är under 1 %.Method according to claim 1, characterized in that the method uses at least one monoclonal antibody directed against a luteinizing hormone LH, and whose cross-reactivity with other glycoprotein hormones, FSH, TSH and h-CG, is below 1%. 3. Förfarande enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknat av att i förfarandet används minst tvä monoklonala antikroppar riktade mot ett luteiniserande hormon LH, av vilka minst den enas korsreaktivitet med andra glykoproteinhormoner, FSH, TSH och h-CG, är under 3 %.Method according to claim 1 or 2, characterized in that at least two monoclonal antibodies directed against a luteinizing hormone LH, of which at least one of them cross-reactivity with other glycoprotein hormones, FSH, TSH and h-CG, are used, are less than 3%. 4. Reagens för bestämning av ett luteiniserande hormon, kännetecknad av att den innehäller minst en mot ett luteiniserande hormon LH riktad monoklonal antikropp, vars korsreaktivitet med andra glykoproteinhormoner, FSH, TSH och h-CG, är under 3 %, och som är erhällbar frän en hybridoma-cellinje NCACC 84122001 OCh NCACC 84122005.4. Reagent for the determination of a luteinizing hormone, characterized in that it contains at least one monoclonal antibody directed against a luteinizing hormone LH, whose cross-reactivity with other glycoprotein hormones, FSH, TSH and h-CG, is below 3% and is obtainable from and hybridoma cell line NCACC 84122001 and NCACC 84122005. 5. Reagens enligt patentkrav 4, kännetecknad av att den innehäller minst en mot ett luteiniserande hormon LH riktad monoklonal antikropp, vars korsreaktivitet med andra glykoproteinhormoner, FSH, TSH och h-CG, är under 1 %.5. Reagent according to claim 4, characterized in that it contains at least one monoclonal antibody directed against a luteinizing hormone LH, whose cross-reactivity with other glycoprotein hormones, FSH, TSH and h-CG, is below 1%. 6. Reagens enligt patentkrav 4 eller 5, kännetecknad av att den innehäller minst tvä monoklonala antikroppar riktade mot ett luteiniserande hormon LH, av vilka minst den enas korsreaktivitet med andra glykoproteinhormoner, FSH, TSH och h-CG, är under 3 %.Reagent according to claim 4 or 5, characterized in that it contains at least two monoclonal antibodies directed against a luteinizing hormone LH, of which at least one of them cross-reactivity with other glycoprotein hormones, FSH, TSH and h-CG, is less than 3%. 7. Monoklonal antikropp mot ett luteiniserande hormon, kännetecknad av att korsreaktivitet av denna antikropp med andra glykoproteinhormoner, FSH, TSH och h-CG, är under 3 %, och den är erhällbar frän en hybridomacellinje NCACC 84122001 OCh NCACC 84122005.7. Monoclonal antibody to a luteinizing hormone, characterized in that cross-reactivity of this antibody with other glycoprotein hormones, FSH, TSH and h-CG, is below 3% and is obtainable from a hybridoma cell line NCACC 84122001 and NCACC 84122005. 8. Monoklonal antikropp enligt patentkrav 7, kännetecknad av att dess korsreaktivitet med andra glykoproteinhormoner, ··' FSH, TSH och h-CG, är under l %. Il 91975Monoclonal antibody according to claim 7, characterized in that its cross-reactivity with other glycoprotein hormones, ··· FSH, TSH and h-CG, is below 1%. Il 91975 9. Förfarande för producering av en monoklonal antikropp enligt patentkrav 7 eller 8, kannetecknat av att lämpliga djur immuniseras med ett luteiniserande hormon LH, frän mjältar av dessa djur utvinns B-lymfocyter, som fusioneras med myelomaceller, de bildade hybridomacellerna, NCACC 84122001 eller NCACC 84122005, klonas, de kloner som produ-cerar specifikt mot det luteiniserande hormonet LH riktade antikroppar selekteras, och antikroppar producerade av dessa kloner utvinns.A method for producing a monoclonal antibody according to claim 7 or 8, characterized in that suitable animals are immunized with a luteinizing hormone LH, from the spleens of these animals, B lymphocytes fused with myeloma cells, the hybridoma cells formed, NCACC 84122001 are recovered. 84122005, the clones that produce specifically against the luteinizing hormone LH directed antibodies are selected, and antibodies produced by these clones are recovered. 10. Hybridomacellinje, kännetecknad av att den har de-ponerats med deponeringsnumret NCACC 84122001 eller NCACC 84122005. 410. Hybridoma cell line, characterized in that it has been deposited with the deposit number NCACC 84122001 or NCACC 84122005. 4