FI91542C - Hybridoomia ihmisen monitehoisia granulosyyttipesäkkeitä stimuloivia tekijöitä vastaan - Google Patents

Description

91542

Hybridoomia ihmisen monitehoisia granulosyyttipesakkeitå stimuloivia tekijdita vastaan

Keksinndn tausta 5 Tama keksinto koskee yleisesti materiaaleja ja me- netelmia kåytettåvåksi immunologisissa menetelmissa hematopoieettisten kasvutekijdiden eristSmiseksi ja kvantita-tiiviseksi toteamiseksi biologisista nesteista. Erityises-ti keksintd koskee uusien hybridoomasolulinjojen solulin-10 jojen A.T.C.C. HB-8957, A.T.C.C. HB-8958, A.T.C.C. HB-8959, A.T.C.C. HB-8960, A.T.C.C. HB-8961 ja A.T.C.C. HB-8962 tuottamia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka rea-goivat spesifisesti hematopoieettisten kasvutekijdiden kanssa, seka naiden vasta-aineiden kayttdå hematopoieet-15 tisten kasvutekijdiden eriståmisesså affiniteettipuhdis-tusmenetelmilia, maaritysmenetelmissa hematopoieettisten kasvutekijoiden toteamiseksi ja nåitå kasvutekijdita tut-kittaessa kéytettavissa immunologisissa menetelmissa. Vielå tarkemmin sanottuna keksintd koskee monoklonaalisia 20 vasta-aineita, jotka reagoivat spesifisesti luonnollisista lahteistå olevan ja yhdistelma-DNA-menetelmilia valmiste-tun ihmisen monitehoisen granulosyyttipesakkeita stimuloi-van tekijan (hpG-CSF) kanssa.

Ihmisen verta muodostava (hematopoieettinen) sys-. 25 teemi muodostaa uusia erityyppisiå valkoisia verisoluja (mukaan lukien neutrofiilit, makrofagit ja basofiilit/ syOttOsolut), punaisia verisoluja (erytrosyytteja) seka hyytymån muodostavia soluja (megakaryosyytteja/verihiuta-leita). On arvioitu, etta keskiarvomiehen hematopoieetti-30 nen systeemi tuottaa granulosyyttejå ja erytrosyyttejå vuosittain luokkaa 4,5 x 1011 olevan maårån, joka on yhta suuri kuin kokonaisruumiinpainon vuotuinen korvautuminen (Dexter et al., BioEssays 2 (1985) 154 - 158).

Uskotaan, ettå pienet måarat tiettyja hematopoieet-35 sisia kasvutekijoita vastaa pienen maaran esikantasoluja • · 2 91 542 (progenitor "stem cells") erilaistumisesta moniksi eri verisolulinjoiksi, naiden solulinjojen valtavasta lisaan-tymisesta seka naista solulinjoista peraisin olevien kyp-sien verisolujen lopullisesta erilaistumisesta. Koska he-5 matopoieettisia kasvutekijOita esiintyy erittain pienia maaria, naiden tekijdiden toteaminen ja identifiointi on perustunut suureen joukkoon maaritysmenetelmia, jotka toistaiseksi kuitenkin erottavat eri tekijat viljeltyihin soluihin kohdistuvien stimuloivien vaikutusten perusteella 10 keinotekoisissa olosuhteissa. Tdsta seurauksena on muodos-tettu suuri maara nimia nimeamaan paljon pienempaa maaraa tekijdita. Esimerkkina syntyneesta sekaannuksesta termit IL-3, BPA, multi-CSF, HCGF, MCGF ja PSF ovat kaikki lyhen-teita, joiden taiia hetkelia uskotaan kuvaavan yhta ainoaa 15 hiiren hematopoieettista kasvutekijaa (Metcalf, Science 229 (1985) 16 - 22).

Yhdistelma-DNA-menetelmien soveltaminen on tuonut tahan kaaokseen jonkin verran jarjestysta. Esimerkiksi erytrosyyttien tuotantoa stimuloivan ihmisen erytropoie-20 tiinin aminohappo- ja DNA-sekvenssit on selvitetty (katso Lin, PCT-hakemusjulkaisu nro 85/02610, joka on julkaistu kesakuun 20. paivana, 1985). Yhdistelma-DNA-menetelmia on sovellettu myOs ihmisen granulosyytti-makrofagipesakkeita stimuloivan tekijan (GM-CSF) ja ihmisen makrofagispesifi-25 sia pesakkeita stimuloivan tekijan (CSF-1) cDNA:n erista-misessa [katso Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82 (1985) 4360 - 4364; Wong et al., Science 228 (1985) 810 -814 ja Kowasaki et al., Science 230 (1985) 291 - 296].

Ihmisen hematopoieettisen kasvutekijan, jota kutsu-30 taan ihmisen monitehoiseksi pesakkeita stimuloivaksi teki-.: jaksi (hpCSF) tai pluripoietiiniksi, on osoitettu esiinty- 1 · k van ihmisen rakkosydpasolulinjan, joka on nimetty 5637:ksi ja joka on talletettu rajoittavien olosuhteiden alaisena American Type Culture Collection -talletuslaitokseen, 35 Rockville, Maryland, A.T.C.C. -talletusnumerolla HTB-9, 1

II

· 3 91542 viljelyvaiiaineessa. Tasta solulinjasta puhdistetun hpCSFrn on raportoitu stimuloivan monitehoisten kantasolu-jen lisaantymista ja erilaistumista, jolloin tuotetaan kaikkia verisolujen paatyyppeja, ihmisen luuytimen kanta-5 soluja kayttavissa maaritysmenetelmissa [Welte et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82 (1985) 1526 - 1530].

Alustavat tutkimukset osoittavat, etta hpCSF:ksi identifioidulla tekijaiia on ensisijaisesti granulosyytti-pesakkeita stimuloiva vaikutus ensimmaisten seitseman pai-10 van aikana ihmisen CFU-GM-maaritysmenetelmassa.

MyOs toinen tekija, joka on nimetty ihmisen CSF-β-.ksi, on eristetty ihmisen rakkosyOpasolulinjasta 5637, ja sen on kuvattu kilpailevan hiiren lz5I-leimatun granulo-syyttipesakkeita stimuloivan tekijan (G-CSF) kanssa sitou-15 tumisesta WEHI-3B D1 -soluihin annos-vaste -suhteessa, joka on identtinen leimaamattoman hiiren G-CSF:n annos-vaste -suhteen kanssa [Nicola et al., Nature 314 (1985) 625-628]. Aikaisemmin oli raportoitu, etta tama annos-vaste -suhde on ainutlaatuinen leimaamattomalle hiiren G-CSF:Ile ja 20 ettei sellaisilla tekijdilia kuin M-CSF, GM-CSF tai 11-3 ollut tata aktiivisuutta [Nicola et al., Proc. Natl. Acad.

Sci (USA) 81 (1984) 3765 - 3769; katso rnyds Metcalf et al., Leukemia Research (1985) Vol 9, nro 5, s. 521 - 527]. CSF-8 ja G-CSF ovat ainutlaatuisia CSF:ia myds siina, etta 25 ne mo lemmat pystyvat suuressa maar in indusoimaan WEHI-3B D1 •« -solujen erilaistumista [Nicola et al., Immunology Today 5 (1984) 76 - 80]. Korkeina pitoisuuksina G-CSF stimuloi granulosyytti-makrofagi-sekapesakkeita muodostavia soluja (mixed granulocyte-macrophage colonyforming cells) [Nico-30 la et al., (1984), ylia], mika on yhtapitavaa alustavien tulosten kanssa, jotka osoittavat, etta granulosyyttisia pesakkeita, monosyyttisia pesakkeita, granulosyyttis-mo-nosyyttisia sekapesakkeita seka eosinofiilisia pesakkeita (CFU-GEMM) ilmestyy, kun ihmisen luuydinviljelmia on inku-35 boitu 14 paivaa hpCSF:n kanssa. CSF-B:n on myds kuvattu . · · 4 91542 stimuloivan neutrofiilisten granulosyyttipesakkeiden muo-dostumista hiiren luuydinsoluja kayttavissa maaritysmene-telmissa, mika on ominaisuus, jota on pidetty kriteeriona tekijan identifioimiseksi G-CSF:ksi. Naiden saman kaltai-5 suuksien perusteella ihmisen CSF-β on identifioitu G-CSF:n (granulosyyttipesakkeita stimuloiva tekija) kanssa [katso Nicola et al., Nature 314 (1985) 625 - 628].

Yhteisten ominaisuuksiensa perusteella vaikuttaa silta, etta Nicola et al.'n, ylia, ihmisen CSF-8 ja Welte 10 et al.'n, ylia, hpCSF ovat sama tekija, johon voitaisiin asianmukaisesti viitata ihmisen monitehoisena granulosyyttipesakkeita stimuloivana tekijana (hpG-CSF).

Yhdessa omistetussa ja samanaikaisesti kasittelyn alaisena olevassa US-patenttihakemusjulkaisussa sarjanume-15 ro 768 959: "Production of Pluripotent Granylocyte Colony--Stimulating Factor", joka on jatetty elokuun 23. paivana, 1985, ja joka on liitetty tahan viitteeksi, julkaistaan uudet, yhdistelma-DNA-menetelmilia tuotetut polypeptidit, jotka sisaitavat osan ihmisen monitehoisen granulosyytti-20 pesakkeita stimuloivan tekijan primaarirakenteen konfor-maatiosta tai sen kokonaan ja joilla on yksi tai useampia ihmisen monitehoisen granulosyyttipesakkeita stimuloivan tekijan biologisia ominaisuuksia. Hakemusjulkaisussa julkaistaan myOs naita polypeptideja koodaavat DNA-sekvens-25 sit, naita polypeptideja koodaavat transformoidut isanta- • » solut seka menetelmat naiden tekijdiden syntetisoimiseksi yhdistelma-DNA-menetelmia kayttaen.

KeksinnOn taustan kannalta mielenkiintoista on ta-manhetkinen tutkimus, joka kohdistuu hybridoomamenetelmiin 30 valittua antigeenista ainetta vastaan muodostettuja, erit-tain spesifisia monoklonaalisia vasta-aineita tuottavien •« kasvainsolulinjojen tuottamiseksi. Menetelmat monoklonaa-listen vasta-aineiden tuottamiseksi ovat yleisesti hyvin tunnettuja alalla. Tyypillisia kuvauksia naista menetel-35 mista voidaan lOytaa julkaisuista Wands, J.R. ja Zurawski, ♦ · i

II

5 91542 V.R., Gastroenterology 80 (1981) 225; Marshak-Rothstein et al., J. Immunol. 122 (1979) 2491 seka Oi, V.T. ja Herzen-berg, L.A., "Immunoglobulin Producing Hybrid", Mishell, B.B. ja Shiigi, S.M. (toim.): Selected Methods in Cellular 5 Immunology, San Francisco, W.H. Freeman Publishing, 1979, ja Goding, "Antibody Production by Hybridomas", J. of Immunol. Meth. 39 (1980) 285 - 308. Lyhyesti kuvattuna lym-fosyytit, jotka on otettu mielenkiinnon kohteena olevalla antigeenilla aikaisemmin injektoidun el&imen pernasta, 10 indusoidaan fuusioitumaan myeloomasolujen kanssa polyety-leeniglykolin lasna ollessa. Fuusiosta syntyy tuhansia "hybrid!" -myeloomasoluja. Jokaisen "hybridooma"-soluvil-jelman supernatantti testataan halutun vasta-aineaktiivi-suuden suhteen. Kun tailainen aktiivisuus lbytyy yhden 15 soluviljelmSn supernatantista, se kloonataan rajoittavia laimennuksia kSyttMen, ja kloonit maaritetaan yksittain supernatantin aktiivisuuden suhteen.

Hybridoomamenetelmilia kehitettyjen monoklonaalis-ten vasta-aineiden immunologisten ominaisuuksien erittain 20 spesifisesta luonteesta johtuen niita on ehdotettu kaytet-tavaksi diagnostisina reagensseina, terapeuttisina aineina ja reagensseina puhdistamattomista raaka-aineiahteista peraisin olevien, spesifisesti ristiin reagoivien anti-geenisten proteiinien affiniteettipuhdistuksessa [katso 25 esim. Trends in Biotechnology, Vol 3, nro 7 (heinakuu 1985) ja US-patenttijulkaisut nro:t 4 465 624, 4 514 505 ja 4 514 507] .

Vaikka onkin olemassa huomattava tarve spesifisista monoklonaalisista vasta-aineista kaytettavaksi hematopoi-30 eettisten kasvutekijOiden, kuten ihmisen monitehoisen gra-nulosyyttipesakkeita stimuloivan tekijan, toteamiseksi, eristamiseksi, puhdistamiseksi ja tutkimiseksi, raportteja hybridoomamenetelmien onnistuneesta kaytOsta hpG-CSF:aa vastaan muodostettujen monoklonaalisten vasta-aineiden 35 valmistamiseksi ei ole ollut.

6 91542

Lyhyt yhteenveto

Tama keksintb antaa kayttddn ensimmaista kertaa hybridoomasolulinjat, jotka tuottavat monoklonaalisia vas-ta-aineita, jotka ovat spesifisesti immunoreaktiivisia ih-5 misen monitehoisen granulosyyttipesakkeita stimuloivan tekijan kanssa antigeeni/vasta-aine-reaktiossa. Niinpa tama keksintb koskee uusia hiiriperaisia hybridoomasolu-linjoja A.T.C.C. HB-8957, A.T.C.C. HB-8958, A.T.C.C. HB-8959, A.T.C.C. HB-8960, A.T.C.C. HB-8961 ja A.T.C.C. HB-10 8962, joista kukin tuottaa viljelmansa supernatantin kom- ponenttina monoklonaalista vasta-ainetta, joka spesifisesti reagoi hpG-CSF:n kanssa. Hybridoomasolulinjat A.T.C.C. HB-8957, A.T.C.C. HB-8958, A.T.C.C. HB-8959, A.T.C.C. HB-8960, A.T.C.C. HB-8961 ja A.T.C.C. HB-8962 on 15 talletettu American Type Culture Collection -talletuslai-tokseen, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md 20852.

Taman keksinnOn kaytanniin mukaisesti hybridikas-vainsolulinja tuotetaan kayttamaiia normaalia immunologis-ta menetelmaa, kuten julkaisuissa Oi ja Herzenberg, "Immu-20 noglobulin Producing Hybrid", ylia, ja Goding, "Antibody Production by Hybridomas", J. of Immunol. Meth. 39 (1980) 285 - 308, on kuvattu. Luonnollisella hpG-CSF:lia hyperim-munisoitujen hiirien pernasolut fuusioidaan hiiren myeloo-masolulinjan kanssa polyetyleeniglykolin lasnaollessa. Jo-25 kaisen "hybridooma" -soluviljelman supernatantti testataan halutun vasta-aineaktiivisuuden suhteen. Valikoitu hybri-doomasolu kloonataan sellaisen solulinjan kasvattamiseksi, joka tuottaa kasvatussupernatanttiinsa vasta-ainetta, jol-la on erittain spesifinen anti-hpG-CSF-aktiivisuus.

30 Tama keksintO koskee myOs monoklonaalisia vasta- aineita, joille on tunnusomaista, etta ne pystyvat spesifisesti sitoutumaan ihmisen monitehoisen granulosyyttipesakkeita stimuloivan tekijan (hpG-CSF) kanssa antigeeni/-vasta-aine-reaktiossa ja etta niita voidaan tuottaa vilje-35 lemana solulinjaa A.T.C.C. HB-8957, A.T.C.C. HB-8958, »

II

7 91542 A.T.C.C. HB-8959, A.T.C.C. HB-8960, A.T.C.C. HB-8961 tai A.T.C.C. HB-8962.

KeksinnOn mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita voidaan kayttaa inununologisissa menetelmissa hpG-CSF:n 5 (samoin kuin muiden hematopoieettisten kasvutekijOiden, joissa saattaa esiintyå samanlaisia tai samantyyppisia epitooppeja) affiniteettipuhdistamiseksi ja eristamiseksi luonnollisista tai yhdistelma-DNA-menetelmilia valmiste-tuista lahdemateriaaleista. Tailaisessa menetelmassa va-10 littu vasta-aine kiinnitettaisiin paikoilleen (esim. pyl-vaaseen) ja lahdemateriaali saatettaisiin kosketukseen paikoilleen kiinnitetyn vasta-aineen kanssa. hpG-CSF tai antigeenisesti sita laheisesti muistuttava materiaali si-toutuisi vasta-aineeseen, minka jaikeen se voitaisiin elu-15 oida paikoilleen kiinnitetysta vasta-aineesta erittain puhtaassa muodossa. KeksinnOn mukaisia vasta-aineita voidaan myOs kayttaa yksin tai yhdessa toistensa tai poly-klonaalisten vasta-aineiden kanssa inununologisissa mene-telmissa (RIA:t, ELISA:t ja vastaavat) hpG-CSF:n toteami-20 seksi kvantitatiivisesti. Muut taman keksinnOn piirteet kayvat ilmi tarkasteltaessa seuraavaa yksityiskohtaista kuvausta.

Yksityiskohtainen kuvaus

Seuraavat esimerkit valaisevat keksinnOn kaytannOn 25 suoritusta tuotettaessa lukuisia hybridoomasolulinjoja mu-kaan lukien A.T.C.C. HB-8957, A.T.C.C. HB-8958, A.T.C.C. HB-8959, A.T.C.C. HB-8960, A.T.C.C. HB-8961 ja A.T.C.C. HB-8962 hpG-CSF:aa vastaan muodostettuja vasta-aineita eristettaessa ja monoklonaalisten vasta-aineiden monista-30 misessa ja karakterisoinnissa.

Tarkemmin sanottuna, esimerkki 1 koskee hiiri-isan-nan stimulointia tuottamaan polyklonaalisia seerumin vasta-aineita hpG-CSF:aa vastaan, pernasolujen fuusiota mye-loomasolujen kanssa seka hybridoomasolujen seulontaa, 35 kloonausta ja kasvatusta seka monoklonaalisen vasta-aineen 8 91542 eristamista. Esimerkki 2 koskee nåin tuotettujen monoklo-naalisten vasta-aineiden karakterisointia ELISA- ja RIA-maaritysmenetelmilia seka kompetetiivinen inhibitio- ja neutralointimaaritysmenetelmilia samoin kuin monoklonaali-5 sen vasta-aineen saantojen monistamista askites-menetel-maiia. Esimerkki 3 kuvaa menetelmia hpG-CSF:n eristamisek-si ja puhdistamiseksi kayttamaiia keksinndn mukaisia mono-klonaalisia vasta-aineita. Esimerkki 4 kuvaa menetelmia hpG-CSF:n toteamiseksi kvantitatiivisesti kayttamaiia kek-10 sinnOn mukaisia vasta-aineita kayttavia maaritysmenetel-mia.

Esimerkki 1 A. Polyklonaalisen seerumin tuottaminen

Kukin BALB/C-hiiri injektoitiin ihmisen rakkosydpa-15 solulinjasta nro 5637 (alaklooni 1A6) HPLC:lia puhdiste-tulla hpG-CSF:lia US-patenttihakemusjulkaisun sarjanumero 768 959 esimerkin 1(b) menetelmien mukaisesti. Materiaali puhdistettiin C4-HPLC-pylvaaiia yli 85-%:iseen puhtauteen ja sen pitoisuus oli noin 60 pg/ml liuoksessa, joka sisai-20 si 50 % propanolia ja 100 mmpl/l ammoniumasetaattia (pH

7). Kullekin 10 hiirelle annettiin aluksi useita ihonalai-sia injektioita, jotka yhteensa sisaisivat noin 0,1 ml rokotettavaa ainetta (7,2 pg hpG-CSF:aa hiirta kohti) ja jotka muodostuivat 1,2 mlrsta hpG-CSF-liuosta, joka oli 25 konsentroitu 0,6 ml:ksi nopealla vakuumikonsentroinnilla ja sekoitettu sitten sonikoimalla 0,6 mlraan BACTO-Freund-'s Complete Adjuvant H37 Ra -adjuvanttia (DIFCO 3113-60).

18 paivan kuluttua jokaiselle hiirelle annettiin useita ihonalaisia tehosteinjektioita, jotka yhteensa sisaisivat 30 noin 0,15 ml rokotettavaa ainetta (7,2 pg hpG-CSF:aa hiirta kohti) ja jotka muodostuivat 1,2 ml:sta hpG-CSF-liuos-ta, joka oli konsentroitu 0,75 ml:ksi ja sekoitettu 0,75 ml:aan Freund's Incomplete Adjuvant -adjuvanttia (BACTO 0639-60-6, DIFCO).

II

9 91542

Neljfin paivén kuluttua hiirista otettiin verta ja seerumit seulottiin RIA:11a anti-hpG-CSF-vasta-aineiden tuottamisen suhteen. Seerumin maarltysmenetelmassa kaytet-ty hpG-CSF sisalsi noin 0,5 ml 80-%:isesti puhdasta hpG-5 CSFzaa, joka oli konsentroitu nelja kertaa, pitoisuutena noin 100 pg/ml liuoksessa, joka sisalsi 100 mmol/1 ammo-niumsulfaattia ja 50 % propanolia. 250 μΐ ylia olevaa liuosta konsentroitiin 150 pliksi ja sekoitettiin 5 mltaan 50 mmol/1 C03-2/HC03'-puskuria (pH 9,2). Sitten 50 μΐ tata 10 ainetta pipetoitiin 96-kuoppaisen kuoppalevyn jokaiseen kuoppaan ja levya inkuboitiin 2 tuntia huoneen lamptttilas-sa ja yli yOn 4 eC:ssa. Lisareaktiot estavaa yhdistetta ("blokkausyhdiste"), joka sisalsi 5 % naudan seerumin al-bumiinia (BSA), inkuboitiin kuopissa 30 minuuttia. Testi-15 seerumi laimennettuna suhteissa 1:5, 1:25, 1:625 ja 1:3125 ja kontrolliseerumi (rokottamaton) laimennettuna suhteissa 1:5 ja 1:125 pipetoitiin kuoppiin, 50 μΐ/kuoppa, ja inkuboitiin kaksi tuntia huoneen lampOtilassa. Sitten kuopat pestiin kolme kertaa kayttaen Wash Solution -pesuliuosta 20 [Kirkequard Perry Laboratories (KPL), Gaithersburg, Maryland]. Taman jaikeen 125i:lia leimattua kanin anti-hii-ren IgG-vasta-ainetta lisattiin siten, etta saatiin noin 199 000 pulssia/min/50 μΐ/kuoppa, ja inkuboitiin 1,5 tuntia huoneen lampdtilassa. Sitten kuopat pestiin viisi ker-25 taa Wash Solution -pesuliuoksella ja niiden radioaktiivi-suus maaritettiin gammalaskijalla.

21 paivaa tehosteinjektion jaikeen viidelle hii-relle, joiden RIAzlla todettiin tuottavan anti-hpG-CSF-vasta-aineita, annettiin kolmas injektio. Hiiret immuni-30 soitiin samalla materiaalilla kuin tehosteinjektiossakin, mutta ne saivat noin 10 pg hpG-CSF:aa hiirta kohti.

B. Solufuusio

Hybridooman tuottamismenetelmassa rokotettujen hiirten pernat hajotetaan anti-hpG-CSF-vasta-ainetta tuot-35 tavien lymfosyyttien suspendoimiseksi. Nama pernasolut • 10 91542 fuusioidaan SP2/0-myeloomasolulinjan solujen kanssa hybri-disolujen muodostamiseksi. Perna- ja myeloomasolujen solu-kalvot fuusioituvat ja aluksi ympSrdivSt yhteistS syto-plasmaa, jossa on kaksi tai useampia tumia. Useiden pSi-5 vien kuluttua solukalvojen fuusiosta tumat fuusioituvat ja pystyvSt samanaikaiseen mitoosiin. Kun nSmS fuusioituneet solut jakautuvat, vaihteleva mSSrS molempien fuusioitunei-den osapuolien kromosomeja menetetSSn, kunnes hybridisolu-linjat stabiloituvat. Hypoksantiini-aminopteriini-tymidii-10 ni (HAT) -vSliaine estSS hybridisaation aikana muodostu-neiden SP2/0:SP2/0-hybridien tai fuusioitumattomien SP2/0-solujen kasvun, kun taas perna:perna-soluhybridit yleensS kuolevat viljelmSssS kahden viikon kuluttua. Siten vain SP2/0:perna-hybridisolut pysyvSt elossa viljelmissS.

15 Kolmen pSivSn kuluttua toisesta tehosterokotukses- ta hiiret tapettiin katkaisemalla selkSranka ja valeltiin 70-%risella etanolilla. Hiirten pernat poistettiin asep-tisesti ja laitettiin jSiden pSSHS olevalle steriilille petrimaljaile, joka sisSlsi DMEM-vSliainetta (Dulbecco's 20 Modified Eagle's Medium, luettelonumero 320-1885, erS 18K3252, GIBCO) tSydennettynS penisilliini G-strepto-mysiiniliuoksella ("lX-liuos"), jota tåstå IShtien nimite-tåån "lXPS"-liuokseksi (luettelonumero 9366, Irvine Scientfic) ja joka sisSlsi 100 yksikkdS penisilliini G:tS 25 ja 100 pg streptomysiiniS millilitrassa. Pernojen rasvaku-dos poistettiin, ja pernat pestiin kahdesti DMEM-vSliai-neella, joka sisSlsi 2XPS:SS (200 yksikkOS penisilliini G:tS ja 20 pg streptomysiiniS millilitrassa), ja laitettiin jSiden pSSHS olevaan steriiliin stomacher-pussiin.

30 Pussiin lisSttiin DMEM-2XPS-liuosta. Pernat hajoitettiin stomacher-laitteessa, jonka jSlkeen ne suodatettiin neli-kerroksisen steriilin harsokankaan lSpi 50 ml:n sentrifu-giputkiin. Pussi ja suodattimet pestiin enintSSn 40 ml:11a DMEM-2XPS-liuosta. Sitten soluja sentrifugoitiin kymmenen 35 minuuttia kierrosnopeudella 1 000 rpm IEC NH-SII -sentri- •

II

11 91542 fugissa (Damon/IEC Division), ja supernatantti imettiin pois varovasti. Sitten solut pestiin kahdesti DMEM-2XPS-liuoksella ja kerran DMEM-vaiiaineella, jossa ei ollut lisSaineita. Sitten solut suspendoitiin DMEM-vaiiainee-5 seen.

Myeloomasolut (SP2/0) kasvatettiin HBlOl-vaiiai-neessa, joka sisSlsi lCPS:aa ja 1 % naudan sikiOn seerumia (FBS, Irvine Scientific, luettelonumero 3000, erånumero 209608, lampOinaktivoitu), ja niiden annettiin lisaantya 10 logaritmisen kasvun vaiheessa kolmen påivSn ajan. SP2/0-solut otettiin talteen sentrifugoimalla IEC NH-SII -sent-rifugissa kierrosnopeudella 1 000 rpm kymmenen minuuttia. Solut pestiin DMEM-liuoksella, minka jaikeen ne suspendoitiin DMEM-liuokseen.

15 Taman jaikeen pernasolut yhdistettiin myeloomaso- luihin 50 ml:n sentrifugiputkessa suhteessa 4:1, ja seosta sentrifugoitiin kymmenen minuuttia kierrosnopeudella 1 000 rpm, ja supernatantti imettiin pois. Sitten solunappi lai-tettiin 37 eC:n vesihauteeseen kuvun alle. Polyetyleeni-20 glykoli (MP 1500, M.A. Bioproducts, luettelonumero 17-780Z, eranumero 4J030) sulatettiin ja sekoitettiin sitten tilavuussuhteessa 1:1 DMEM-liuokseen, jolloin saatiin 50-%:inen liuos. Sitten PEG-liuos lisattiin soluihin seuraa-valla menetelmaiia. Ensimmaisen minuutin aikana 1,0 ml 50-- 25 %:ista PEG-liuosta lisattiin. Seuraavan minuutin aikana liuosta sekoitettiin varovasti pipetilia, jolla sekoitettiin tasaisesti pyOrivaiia liikkeelia mutta vaittaen kos-kettamasta putkien seinia tai pohjaa. Kolmannen minuutin aikana lisattiin 1,0 ml liuosta, joka sisalsi DMEM:ta, 10 30 % FCS:aa ja lXPS:aa. Neljannen minuutin aikana lisattiin taas 1,0 ml samaa liuosta. Viidennen ja kuudennen minuutin aikana lisattiin taas 8,0 ml samaa liuosta. Sitten seos sentrifugoitiin kierrosnopeudella 1 000 rpm 10 minuuttia 35 IEC NH-SII -sentrifugissa. Supernatantti imettiin pois 12 91542 sentrifuglputkesta ja solut suspendoitiin varovasti 100 -150 ml:aan vaiiaineita, jotka sisaisivat DMEM:S, 10 % FCS:aa ja lXPSiaa. Sitten solususpensiota levitettiin 0,1 ml suspenslota kuoppaa kohtl noln 800 kuoppaan kahdeksalla 5 ja puolelle 96-kuoppaisella levylia, jotka oli etukateen tasapalnotettu C02-inkubaattorissa. Sitten levyt laitettiin takaisin C02-inkubaattoriin, jonka C02-pitoisuus oli noin 7 % 37 °C:ssa.

Yhden paivan kuluttua 100 μΐ HAT-vaiiainetta 10 DMEM:ssa, joka sisaisi 10 % FCS:aa, lisattiin jokaiseen kuoppaan. Toisena paivana jokaisesta kuopasta imettiin 100 μΐ kaytettyå vaiiainetta ja korvattiin 120 pl:lla tuoretta HAT-vaiiainetta DMEM:ssa, joka sisaisi 10 % FCS:aa. Tama toimenpide toistettiin paivana 2, paivana 4, paivana 7 ja 15 paivana ll. paivana 14 jokaisesta kuopasta poistettiin 100 μΐ kaytettya vaiiainetta ja korvattiin 100 pl:lla HT-vaii-ainetta, joka sisaisi 1,36 mg/dl hypoksantiinia ja 0,76 mg/dl tymidiinia. Toimenpide toistettiin paivana 18, paivana 22 ja paivana 26. Paivana 28 viljelmiin vaihdettiin 20 lopullinen vaiiaine, joka sisaisi DMEM:a ja 10 % FCS:aa.

Taman jaikeen viljelmiin vaihdettiin tama lopullinen vaiiaine kahdesti viikossa. Paivana 17 kuopat seulottiin immu-noglobuliinin tuottamisen suhteen kayttaen anti-hiiren IgG -vasta-ainetta. RIA- ja ELISA-maaritykset osoittivat, etta 25 800 kuopasta noin 260 oli merkittavasti positiivisia hii- ren IgG:n suhteen.

Esimerkkl 2 A. Monoklonaalisten vasta-aineiden alkukarakteri- sointi 30 ELISA-maåritys suoritettiin anti-hpG-CSF-vasta-ai- neita tuottavien kloonien toteamiseksi. 96-kuoppaisten levyjen kuopat paailystettiin pipetoimalla niihin noin 50 μΐ liuosta, joka sisaisi 100 ng 90-%:isesti puhdasta hpG-CSF:aa, joka liuotettiin 50 mmol/1 C03'2/HC03—puskuri-35 liuokseen (pH 9,2) huoneen lampOtilassa kahden tunnin

II

13 91542 ajan, minka jSlkeen liuos lisSttiin levyjen jokaiseen kuoppaan ja inkuboitiin yli yOn 4 °C:ssa. Sitten kuoppia kasiteltiin 5 % BSA:ta sisålt3v3113, lisåreaktiot est&vål-ia liuoksella ("blokkausliuoksella"), jota inkuboitiin 30 5 min ajan.

Hybridoomaviljelmien supernatantti laimennettiin PBS-liuoksella (pH 7,0), joka sisalsi 1 % BSA:ta, ja inkuboitiin sitten paailystetyissa kuopissa kahden tunnin ajan huoneen låmpdtilassa. Taman jaikeen kuopat pestiin kolmes-10 ti Wash Solution -pesuliuoksella ja kasiteltiin piparjuu-riperoksidaasilla leimatulla anti-hiiren IgG-vasta-aineel-la .(BMB No 605-250), joka oli laimennettu 1:300, 1,5 tun-tia. Sitten kuopat pestiin viisi kertaa Wash Solution -pesuliuoksella ja peroksidaasin substraattia ABTS (KPL) 15 lisattiin 50 μΐ/kuoppa. Sitten kuopat luettiin absorbans- sin suhteen aallonpituudella 414 nm Titertek Multiscan -spektrofotometrilia (Flow Labs, McLean, VA). 23 kuopan (nro:t 3, 4, 5, 20, 21, 28, 35, 37, 39, 40, 58, 61, 63, 64, 66, 68, 72, 74, 75, 98, 151, 182 ja 231) havaittiin 20 merkittavasti reagoivan pelkistetyn hpG-CSF:n kanssa.

Positiivisista kuopista saatujen hybridoomasolujen varsinainen kloonaus suoritettiin laimentamalla solut uu-siin kuoppiin sellaisessa suhteessa, etta saatiin noin yksi solu kolmea kuoppaa kohti. Yleisesti aktiivisen kuo-25 pan varsinainen kloonaus tuotti varsinaisia klooneja, jot-ka nayttivat olevan saman hybridoomasolun alaklooneja mut-ta jotka useissa tapauksissa paljastuivat eri kloonipopu-laatioiksi, joilla oli eri vasta-ainealatyypit ja reaktio-ominaisuudet. Saman kuopan alakloonit merkittiin kirjai-30 mella (esim. kuopasta 4 saadut kloonit merkittiin 4A:ksi, 4B:ksi jne).

ELISA-maaritys suoritettiin monoklonaalisten vasta-aineiden reaktiivisuuden luonnollista hpG-CSF:aa samoin kuin pelkistettya luonnollista hpG-CSF:aa vastaan toteami-35 seksi. Supernatantti, joka oli saatu kuopista, joiden oli • 14 91542 havaittu tuottavan hpG-CSF:n kanssa reaktiivisia vasta-aineita, testattiin seka luonnollista hpG-CSF:aa etta SDS/ merkaptoetanolilla denaturoitua hpG-CSF:aa vastaan. Kloo-nien vasta-aineet reagoivat molempia materiaaleja vastaan 5 suunnilleen samansuuruisella spesifisyydelia, mika viittaa siihen, etta vasta-aineet voivat spesifisesti reagoida sellaisten antigeenisten epitooppien kanssa, joita ensi sijaisesti maarittavat proteiinin jatkuvat aminohapposek-venssit (primaarirakenne).

10 B. Monoklonaalisten vasta-aineiden reaktiivisuus imettavaisten ja yhdistelma-DNA-menetelmaiia valinistettua hpG-CSF:aa vastaan

Tassa esimerkissa suoritettiin kiintea faasi -RIA-ja ELISA-maaritykset aktiivisista kuopista saatujen hybri-15 doomasupernatanttien reaktiivisuuden mittaamiseksi kayt-taen seka imettavaisten hpG-CSF:aa etta yhdistelma-DNA-menetelmaiia E. colissa tuotettua hpG-CSF:aa. Yhta tapaus-ta lukuunottamatta imettavaisten tuottaman (luonnollisen) hpG-CSF:n kanssa reagoiva monoklonaalinen vasta-ainemate-20 riaali reagoi yhta hyvin yhdistelma-DNA-menetelmaiia val-mistetun hpG-CSF:n kanssa. Tuo tapaus kasitti alakloonit 35B, 35D ja 351, jotka tuottivat vasta-aineita, jotka reagoivat merkittavasti vahemman yhdistelma-DNA-menetelmilia valmistetun materiaalin kanssa kuin imettavaisperaisen 25 materiaalin kanssa molemmissa suorissa sitoutumismaaritys-menetelmissa.

C. Vasta-ainealatyyppien seulonta

Tassa esimerkissa alunperin aktiivisiksi havaituis-ta 23 kloonista saadut varsinaiset kloonit seulottiin 30 RIA:lla niiden vasta-ainealatyypin maarittamiseksi. 96-kuoppaisia levyja kasiteltiin kanin anti-hiiren immunoglo-buliini-vasta-aineilla, joilla oli erilaiset alatyyppispe-sifisyydet. Antihiiren immunoglobuliini-vasta-aineet oli-vat kanin anti-hiiren IgGx (MILES Laboratories, Naperville, 35 IL, 64-360-1), kanin anti-hiiren IgG2a (MILES 64-361-1), •

II

15 91542 kanin anti-hiiren IgG2b (MILES 64-362-1), kanin anti-hiiren IgG3 (MILES 64363-1), kanin anti-hiiren IgM (MILES 64-365-1) ja kanin anti-hiiren IgG (MILES 65-157-2). Jokainen kuoppa paailystettiin 50 yl:lla noin 0,5 yg vasta-ainetta 5 sisaitavaa anti-hiiren immunoglobuliini-liuosta C03"2/HC03' -puskuriliuoksessa ja inkuboitiin kahden tunnin ajan huo-neen lampOtilassa ja yli y5n 4 °C:ssa. Sitten lisareaktiot estettiin inkuboimalla kuoppia 5-%:isella BSA-liuoksella 30 minuutin ajan. Taman jalkeen jokaista kuoppaa inkuboi-10 tiin hybridoomakudosviljelysupernatantin kanssa kaksi tun- tia huoneen lampOtilassa ja pestiin kolmesti Wash Solution -pesuliuoksella. Sitten anti-IgG-vasta-aineella kasitelty-ja kuoppia inkuboitiin 1,5 tuntia 125I-kanin anti-hiiren IgG-vasta-aineen kanssa, 50 μΐ kuoppaa kohti, kun taas 15 anti-IgM:lia kasiteltyja kuoppia inkuboitiin 1,5 tuntia 125I-kanin anti-hiiren IgM-vasta-aineen kanssa, 50 μΐ kuoppaa kohti. Taman jalkeen kuopat pestiin viisi kertaa Wash Solution -pesuliuoksella ja laskettiin gammalaskijassa. Alkuperåisten 23 kloonin analyysin tulokset osoittavat, 20 etta kaksi kuoppaa (nro:t 37 ja 182) lakkasivat synteti-soimasta IgG:ta, yksi kuoppa osoittautui IgG-positiivisek-si, mutta ei osoittanut reaktiivisuutta aikaisemmassa seu-lonnassa hpG-CSF:lle (nro 58); 15 kuoppaa olivat positii-visia IgG1:lle (nro:t 4C, 5, 28, 39, 40, 61, 63, 64, 66, , 25 68, 72, 74, 75, 98 ja 231). Eraan naista alakloonin, nro 5d:n, havaittiin reagoivan seka anti-IgG3- etta anti-IgM-vasta-aineiden kanssa. Nelja kuoppaa oli positiivisia IgG2a:n tuotannon suhteen (nro:t 3, 4A, 21 ja 151) ja yksi kuoppa IgG2b:n tuotannon suhteen (nro 35).

30 D. hpG-CSF-aktiivisuuden neutraloituminen mitattu- na 3H-tymidiinin sisaanoton avulla

Tassa esimerkissa hpG-CSF:aa vastaan nostetut mono-klonaaliset vasta-aineet testattiin sen suhteen, pystyi-vatkO ne neutraloimaan hpG-CSF:n biologisen aktiivisuuden 35 stimuloida 3H-tymidiinin ottoa ihmisen luuydinsoluihin. 3H- 16 91542 tymidiinin sisaanoton neutraloinnin testaamiseksi yhdis-telma-DNA-menetelmaiia valmistettua tai luonnollista hpG-CSF:aa inkuboltiin keksinndn mukaisten vasta-ainelden eri pitoisuuksissa 4 °C:ssa 12 tunnin ajan. Sitten liuokset 5 lisattiin tiheydeltaan alhaisiin, non-adherervtteihin ihmi-sen luuydinsoluihin ja k&siteltiin samanaikaisesti kasit-telyn alaisena olevan US-patenttihakemusjulkaisun sarja-numero 768 959 esimerkissS 7 kuvattujen menetelmien mukai-sesti. Mm. kloonien nro:t 20A, 35B, 39B, 40A, 61D, 63D, 10 75A ja 151K vasta-aineet testattlin ja kloonin 75A vasta- aineet olivat tehokkaimpia neutraloimaan hpG-CSF:n vaiku-tusta 3H-tymidiinin sisaanottoon, ja kaikki ylia olevat vasta-aineet neutraloivat eriasteisesti 3H-tymidiinin si-saanottoa lukuun ottamatta kloonin 35B tuottamia vasta-15 aineita.

E. hpG-CSF-aktiivisuuden neutraloituminen mitattu-na solun erilaistumisen indusoitumisen avulla

Tassa esimerkissa hpG-CSF:aa vastaan nostetut vasta-aineet testattiin sen suhteen, pystyvatktt ne neutraloi-20 maan hpG-CSF:n kykya indusoida hiiren myelomonosyyttisen leukemiasolulinjan WEHI-3B D* erilaistumista. Eri pitoi-suuksia keksinnttn mukaisesti tuotettuja vasta-aineita (klooneista nro:t 20A, 39B, 40A, 61D, 63D ja 75A) inkuboi-tiin hpG-CSF:n kanssa 4 °C:ssa 12 tuntia. Sitten liuokset 25 lisattiin WEHI-3B D+ -soluihin agar-suspensiossa kayttaen

menetelmaa, joka on kuvattu esimerkisså 7 US-patenttihake-musjulkaisussa sarjanumero 768 959, joka samanaikaisesti on kSsittelyn alaisena. Kloonien nro:t 40A, 61D ja 75A

tuottamat vasta-aineet kykenivat estamaan erilaistumisen.

30 Koska nama monoklonaaliset vasta-aineet kykenevat saosta- maan hpG-CSF:aa eri lailla, sita tosiasiaa, etta jotkut estavat hpG-CSF:n kyvyn indusoida erilaistumista, vaikka toiset eivat siihen pysty, ei voida selittaa vain affini-teetin voimakkuuden perusteella. On merkittavaa, etta 35 kloonin 75A tuottama monoklonaalinen vasta-aine ei vain

II

17 91542 inhiboinut WEHI-3B D* -solujen erilaistumista, vaan my6s inhlbol solun kasvua, mika viittaa silhen, etta se saat-taa rlstlreagolda WEHI-3B D* -solujen erittaman hiiren kasvutekijSn kanssa ja silia saattaa olla lisaantymista 5 estavia valkutuksla riippumatta sen kapasiteetista sltoa hpG-CSF:aa.

F. Epitooppikarakterisointi

Tassa eslmerklssa suoritettiin kompetetiivisia si-toutumistutkimuksia kayttaen 125I:lia leimattua vasta-10 ainetta klooneista 75A ja 151K seka paikoilleen kiinnitet-tya, yhdistelma-DNA-menetelmaiia valmistettua hpG-CSF:aa. Naissa tutklmukslssa mulden kloonlen vasta-ainelden annet-tiin kilpailla radioaktiivisella isotoopilla leimattuja kloonlen 75A ja 151K tuottamla monoklonaalisla vasta-ai-15 nelta vastaan, jotka oli sidottu yhdistelma-DNA-menetel-maiia valmistettuun hpG-CSF:aan. Inkuboinnin ja pesun jaikeen, jotka suoritettiin alalla hyvin tunnettujen me-netelmien mukaisesti, sSteilypulssit mitattiin sen rnaårit-tamiseksi, kuinka paljon joko 75A:n tuottamaa vasta-ai-20 netta tal 15lK:n tuottamaa vasta-ainetta oli syrjaytetty hpG-CSF:sta.

Naiden maaritysten tulokset osoittavat, etta kloo-nien 63D, 75A ja 151K tuottamissa vasta-aineissa saattaa esiintya paailekkain menevia hpG-CSF-proteiinin yhteisen 25 antigeenisen epitoopin osia. Tulokset osoittavat myfJs, etta kloonlen 4C, 28A ja 35B tuottamat vasta-aineet nayt-tavat reagoivan sellaisen hpG-CSF-proteiinin epitoopin (tai epitooppien) kanssa, jonka kanssa 75A:n ja 151K:n tuottamat vasta-aineet eivat reagoi spesifisesti. Nåma 30 tulokset myds viittaavat silhen, etta kloonien 40A ja 61D tuottamien vasta-aineiden hpG-CSF:aa sitovat ominaisuudet saatetaan voida erottaa kloonien 4C, 28A, 35B, 75A ja 151K tuottamien vasta-aineiden vastaavista ominaisuuksista.

91 5^2 18 G. Talletettujen keksinnOn mukaisten solulinjojen tuottamien vasta-aineiden ominaisuudet

Uudet hybridoomasolulinj at, jotka pystyvSt tuotta-maan tamån keksinndn mukaisia monoklonaalisia vasta-ainei-5 ta, on talletettu American Type Culture Collection -talle-tuslaitokseen, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852. N&m& solulinjat vastaavat solulinjoja, jotka on kehitetty varsinaisen kloonausprosessin aikana seuraavasti: klooni 4C (A.T.C.C. HB-8962), klooni 28A (A.T.C.C. HB-8957),

10 klooni 35B (A.T.C.C. HB-8960), klooni 63D (A.T.C.C. HB-8958), klooni 75A (A.T.C.C. HB-8959) ja klooni 151A

(A.T.C.C. HB-8961). NSiden kloonien tuottamien vasta-aineiden ominaisuuksien yhteenveto on esitetty alla olevassa taulukossa 1.

15

Taulukko 1

Samanlaisuus epitooppi-

Sitoutuminen Neutraloituminen karakterisoin-20 3

Klooni Η-Thy (Ihmi- WEHI nissa

nro Tyyppi E. coli Natiivi sen luuydin) 38 D*3 75A 151K

4C IgG1 + + ND ND

28A IgG1 + + ND ND -

35B IgG2b - + ND

63D IgG1 + + ♦ + + 25 75A JgQ^ + + + + + + + + 151K I^G2a + + ++ ND + + ND (koetta ei suoritettu) 30 H. Vasta-ainesaantojen monistaminen askites-mene- telmån avulla

Jotta saataisiin konsentroidumpaa vasta-ainetta kuin kudosviljelmåsså tuotettu vasta-aine, tåmdn keksinnOn mukaiset vasta-aineet monistettiin kSyttSen askites-mene-35 telmaa, joka on yleisesti kuvattu kirjassa Monoclonal An-

II

19 91542 tibodies, Hybrldomas: A New Dimension in Biological Analysis, Kenneth et al., (toim. ), s. 403, New York, Plenum Press (1981). Taman menetelman mukaisesti hiiret esikasi-teliaan 0,5 ml:11a Pristanea (2,6,19,14-tetrametyylipenta-5 dekaani, Aldrich Chemical Co.), joka injektoidaan niiden vatsaonteloihin kayttaen 25 tai 27 gaugen neuloja. Prista-ne-k&sittely sallii kasvainsolujen kasvun askites-muodossa vatsaontelossa. Noin 1-2 viikon kuluttua noin 106 hybri-doomasolua injektoidaan hiirien vatsaonteloihin seerumit-10 tomassa Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) -vSliai-neessa (Irvine Scientific Co.) tai HBlOl-vSliaineessa (Hanna Biologicals, Berkeley, Kalifornia). Sarja injek-tioita suoritetaan hiiriin jokaista kloonia kayttaen.

Noin 1-3 viikon kuluttua hybridoomasolujen injektiosta, 15 askites-neste otettiin talteen hiirten vatsaonteloista tekemaiia pienet viillot ihoon ja pipetoimalla neste ulos. Askitesneste kirkastettiin sentrifugoimalla, minka jai-keen se pakastettiin. Askistesnesteen vasta-aineet voi-daan puhdistaa edelleen askitesnesteen albumiinista saos-20 tamalla 45-%:isella ammoniumsulfaatilla ja proteiini A-sepharose -kromatografialia.

Esimerkki 3

Hematopoieettisten kasvutekijOiden eristys ja puh- distus ,: 25 Antaessaan kayttddn erittain spesifisia ja reaktii- visia anti-hpG-CSF-monoklonaalisia vasta-aineita tama kek-sintO mahdollistaa ensimmaisen kerran hpG-CSF:n ja hematopoieettisten kasvutekijdiden eristamisen fermentointivil-jelmista samoin kuin luonnollisista imettavaisiahteista 30 kayttaen alalia hyvin tunnettuja affiniteettipuhdistusme-netelmia. Lyhyesti sanottuna edulliset eristysmenetelmat kasittaisivat keksinndn mukaisen vasta-aineen kiinnittami-sen paikoilleen kiinteaan kantajaan (esim. kromatografi-seen pylvaaseen), hpG-CSF:aa tai hematopoieettista tekijaa 35 sisaitavan nesteen saattamisen kosketukseen paikoilleen • 20 91542 kiinnitetyn vasta-aineen kanssa ja taman jaikeen puhdiste-tun hpG-CSF:n tai hematopoieettisen kasvutekijan eluoimi-sen vasta-aineen kanssa muodostetusta immunokompleksista. Valitsemalla tietty kSytetty vasta-aine puhdistusmenetelma 5 saattaa sallia natiivin hpG-CSF:n eristyksen oikein ko-koonkiertyneessa konformaatiossaan vSårin kokoonkierty-neesta tai denaturoituneesta hpG-CSF:sta, hpG-CSF:n analoge ja samoin kuin hematopoieettisen kasvutekijSmolekyylien spesifisia epitooppeja voitaisiin eristaa ja niita voitai-10 siin tutkia.

Esimerkki 4

Hematopoieettisten kasvutekijOiden kvantitatiivinen toteaminen

Antaessaan kayttOOn erittain spesifisia anti-hpG-15 CSF -monoklonaalisia vasta-aineita tama keksintO mahdol- listaa mytts uudet kiinteat faasi- tai nestefaasimaaritys-menetelmat hpG-CSF:n ja hematopoieettisten kasvutekijOiden toteamiseksi nestenaytteesta, joissa menetelmissa kayte-taan useampia kuin yhta vasta-ainetta. Kiintea faasi -maa-20 ritysmenetelma kasittaisi tyypillisesti vaiheet: (1) saatetaan neste kosketukseen ensimmaisen, pai-koilleen kiinnitetyn vasta-aineen kanssa, joka vasta-aine reagoi nesteessa olevan hpG-CSF:n ensimmaisen antigeenisen determinantin kanssa, jolloin muodostuu hpG-CSF:n ja en- 25 simmaisen vasta-aineen immunokompleksi; (2) saatetaan vaiheessa (1) muodostettu kompleks! kosketukseen toisen vasta-aineen kanssa, joka vasta-aine reagoi toisen hpG-CSF:n antigeenisen determinantin kuin ensimmaisen antigeenisen determinantin kanssa, jolloin 30 muodostuu hpG-CSF:n ja toisen vasta-aineen immunokompleksi; ja « (3) kvantitoidaan vaiheessa (2) muodostettuun immu-nokompleksiin sitoutuneen toisen vasta-aineen maara.

Nestefaasi-kompetetiiviset maaritysmenetelmat ka-35 sittaisivat hpG-CSF:n leimaamisen ja sen saostamisen yh-

II

21 91542 dellS tai useammalla keksinniin mukaisella vasta-aineella. Leimaamattoman hpG-CSF:n tai sitS laheisesti muistuttavien tekijttiden mSSrittSminen voitaisiin sitten suorittaa kom-petetiivinen sitoutuminen -formaattia kayttaen. Tailaiset 5 maaritysmenetelmat edullisesti sisaitaisivat kaksi ylia kuvattua monoklonaalista vasta-ainetta, mutta ne voidaan myOs kehittaa sellaisiksi, etta kSytetaan yhta monoklonaalista vasta-ainetta ja polyklonaalisesta seerumista perSi-sin olevaa vasta-ainetta hpG-CSF:aa vastaan.

10 Lukuisten modifikaatioiden ja variaatioiden keksin- nttn kSytannOn suorituksessa otaksutaan olevan ilmeisia alan asiantuntijoille tarkasteltaessa sen edullisten suo-ritusmuotojen edelia olevaa kuvausta. Niinpa keksinnOlle tulisi asettaa vain sellaiset rajoitukset, jotka esiinty-15 vat seuraavissa patenttivaatimuksissa.

* *

Claims (10)

22 91542

1. Hiiresta per&isin oleva hybridoomasolulinja, tunnettu siita, etta se pystyy tuottamaan kasvu- 5 valiaineeseensa monoklonaalista vasta-ainetta, joka pystyy spesifisesti sitoutumaan ihmisen monitehoisen granulosyyt-tlpesakkeita stimuloivan tekijan (hpG-CSF) kanssa antigee-ni/vasta-aine-reaktiossa, ja etta se on jokin solulinjois-ta A.T.C.C. HB-8957, A.T.C.C. HB-8958, A.T.C.C. HB-8959,

10 A.T.C.C. HB-8960, A.T.C.C. HB-8961 ja A.T.C.C. HB-8962.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hybridoomasolu-linja,. tunnettu siita, etta se tuottaa monoklonaalista vasta-ainetta, jonka alatyyppi on IgGl, IgG2a tai IgG2b.

3. Monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siita, etta se pystyy spesifisesti sitoutumaan ihmisen monitehoisen granulosyyttipesakkeita stimuloivan tekijan (hpG-CSF) kanssa antigeeni/vasta-aine-reaktiossa ja etta sita voidaan tuottaa viljelemaiia solulinjaa A.T.C.C. HB-20 8957, A.T.C.C. HB-8958,-A.T.C.C. HB-8959, A.T.C.C. HB- 8960, A.T.C.C. HB-8961 tai A.T.C.C. HB-8962.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siita, etta sen alatyyppi on IgGl, IgG2a tai IgG2b.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siita, etta se pystyy neut-raloimaan hpG-CSF:n kykya indusoida WEHI-3B D+ -solujen erilaistumista viljelmassa.

6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen monoklonaalinen 30 vasta-aine, tunnettu siita, etta se pystyy neut- raloimaan hpG-CSF:n kykya stimuloida luuydinsolujen tymi-diinin sisaanottoa.

7. Immunologinen menetelma biologisesti aktiivisen ihmisen monitehoisen granulosyyttipesakkeita stimuloivan 35 tekijan (hpG-CSF) eristamiseksi biologisesta nesteesta II 91542 hpG-CSF:lle spesifisen vasta-aineen kanssa selektiivisen immunologisen reaktion perusteella, tunnettu siita, etta kaytetaan patenttivaatimuksen 3 mukaista monoklo-naalista vasta-ainetta.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen immunologinen menetelma, tunnettu siita, etta monoklonaalinen vasta-aine on alatyyppia IgGl, IgG2a tai IgG2b.

9. Immunologinen maaritysmenetelma ihmisen monite-hoisen granulosyyttipesakkeita stimuloivan tekijan (hpG-

10 CSF) kvantitiiviseksi toteamiseksi biologisessa nesteessd yhden tai useamman hpG-CSF:lle spesifisen vastaaineen kanssa selektiivisen immunologisen reaktion perusteella, tunnettu siita, etta kaytetaan yhta tai useampaa patenttivaatimuksen 3 mukaista monoklonaalista vasta-ai-15 netta.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen immunologinen menetelma, tunnettu siita, etta monoklonaaliset vasta-aineet ovat alatyyppia IgGl, IgG2a tai IgG2b. 91542