FI89075B - Foerfarande foer soenderdelning av akrylamid med hjaelp av acylamidamidohydrolasenzym - Google Patents

Description

, 89075

Menetelmä akryyliamidin hajottamiseksi asyyliamidiamido-hydrolaaslentsyymin avulla Tämä keksintö koskee menetelmää akryyliamidin ha-5 jottamiseksi, menetelmää akryyliamidin hajottamisessa käytettävän amidaasientsyymin (akryyliamidiamidohydrolaasi EC numero 3-5-1-4) tuottamiseksi ja menetelmää akryylihapon tai sen suolan tai esterin tuottamiseksi akryyliamidin hajottamisella.

10 Polyakryyliamidipolymeerejä, nimittäin akryyliami din homo- ja heteropolymeerejä, käytetään laajalti flokku-lantteina juomavesiteollisuudessa, viemäriveden käsittelyssä, paperin valmistuksessa ja kaivosteollisuudessa. Niiden käyttömahdollisuus on kuitenkin rajoitettu ja niitä 15 ei voi esimerkiksi käyttää elintarvikkeiden yhteydessä, koska ne ovat yleensä kontaminoituneet reagoimattomalla akryyliamidimonomeerillä, joka on kumulatiivinen neurotok-siini ja karsinogeeni. Tällä hetkellä polyakryyliamidien sallitaan USA:ssa tavallisesti sisältävän reagoimatonta 20 akryyliamidia 500 ppm:ään saakka ja tämä raja luultavasti tulee voimaan muuallakin. Tämä reagoimattoman monomeerin määrä voidaan saavuttaa käyttämällä pitempiä polymeraa-tioaikoja ja lämpökäsittelymenetelmällä. Sellaiset käsittelyt lisäävät tuotantokustannuksia ja alentavat tuotettu-25 jen polymeerien tehokkuutta aiheuttamalla näissä polymeereissä haaroittumista. Lineaarisilla polymeereillä on korkeampi flokkulaatiotehokkuus ja niitä pidetään parempina. On olemassa tarve luotettavasta menetelmästä, joka alentaa reagoimattoman monomeerin määrän polyakryyliamideissa 500 30 ppm:n tasolle ja mieluummin jopa alemmille tasoille (5 -10 ppm tai alemmaksi) ilman polymeerin vahingoittumista. Jos läsnäolevan reagoimattoman monomeerin määrä voitaisiin luotettavasti alentaa hyvin alhaisille tasoille (1-5 ppm tai vähemmän), polyakryyliamideja voitaisiin harkita käyt-35 tötarkoituksiin, joista ne nykyään on suljettu pois, esi- 2 P90?5 merkiksi valmistettaessa elintarvikkeiden kanssa kosketuksissa olevia materiaaleja tai ollessaan suorassa kosketuksessa elintarvikkeisiin.

JP-patenttijulkaisussa nro 79 Oli 389 (vastaa Ja-5 panese kokai nro 53 860 078) kuvataan menetelmä esimerkiksi jätevedessä tai polyakryyliamideissa olevan akryyliami-dimonomeerin hajottamiseksi saattamalla ne kosketuksiin Brevibacterium ammoniogenes -bakteerin, edullisesti kantojen ATCC 1641, ATCC 6871 ja ATCC 6872 intrasellulaarisen 10 entsyymin kanssa. Kuitenkin huolimatta siitä, että tämä menetelmä on ollut tunnettu lukuisia vuosia, sitä ei ole tunnuttu käytetyn kaupallisesti missään merkittävässä määrin. Lisäksi Brevibacterium ammoniogenes -entsyymi toimii huonosti polyakryyliamidilateksisysteemeissä.

15 On toivottavaa, että parannetun aktiviteetin omaa vat amidaasientsyymit tulisivat kaupallisesti helposti saataviksi.

Tämän keksinnön kohteena on menetelmä kohotetun aktiviteetin omaavan asyyliamidiamidohydrolaasientsyymin 20 tuottamiseksi. Menetelmälle on tunnusomaista, että Methy-lophilus methylotrophus -mikrobisoluja, joissa tällainen entsyymi on indusoitu, tai mainittujen solujen entsyymiä sisältäviä ekstrakteja kuumennetaan 40 - 80 °C:n lämpötilaan pH:ssa 4-9 proteiinikonsentraatiossa 0,1 - 200 25 mg/ml ja aikavälillä 20 minuuttia - 10 tuntia, jolloin kohoaminen amidaasin aktiviteetissa akryyliamidin hajottamisen suhteen saadaan aikaan. Keksinnön mukaisella menetelmällä tuotetun paremman amidaasiaktiviteetin omaavat mik-robisolut ja ekstraktit kuuluvat myös keksinnön piiriin. 30 Lisäksi keksinnön kohteena on menetelmä akryyliami din hajottamiseksi sitä sisältävässä alustassa, jossa menetelmässä alusta saatetaan kosketuksiin akryyliamidia hajottamaan kykenevän entsyymin kanssa olosuhteissa, jotka ovat sopivia entsyymin aiheuttamalle akryyliamidin hajo-35 tukselle. Menetelmälle on tunnusomaista, että entsyymi on 3 89075 asyyliamidiamidohydrolaasientsyymi, joka on valmistettu edellä kuvatun menetelmän mukaisesti.

Lisäksi keksinnön kohteena on menetelmä akryyliha-pon tai sen suolan tai esterin tuottamiseksi, jossa mene-5 telmässä akryyliamidia sisältävä alusta saatetaan kosketuksiin entsyymin kanssa, joka kykenee hajottamaan akryy-liamidia akryylihapoksi olosuhteissa, jotka ovat sopivia entsyymin aiheuttamalle akryyliamidin hajotukselle akryylihapoksi tai sen suolaksi tai esteriksi, jolloin entsyymi 10 on asyyliamidiamidohydrolaasientsyymi, joka on valmistettu edellä kuvatun menetelmän mukaisesti.

Amidaasit ovat osa typen assimilaatiokoneistoa monissa soluissa, jotka on kasvatettu olosuhteissa, joissa ainoa typenlähde on alifaattinen amidi.

15 Näin ollen amidaasin metabolinen rooli on vapauttaa ammoniakkia kyseisestä amidista esimerkiksi seuraavalla reaktiolla: 0 0 il 1/ 20 CH3-C-NH2 + H20 -> CHj-C-OH + NH3

Vapautettu ammoniakki assimiloidaan proteiini-biosynteesiin. Tuotettu alifaattinen happo joko assimiloidaan tai ei, riippuen mikro-organismityypistä.

25 Amidaasit voivat myös katalysoida akryyliamidin muuttamista akryylihapoksi seuraavalla reaktiolla: CH,=CH-C-NH2 + H20 -> CH,“CH-C-0H + NH,

H H

O O

30

Sopivien suolojen tai alkoholien läsnäollessa tuotettu akryylihappo voidaan muuttaa sen suoloiksi tai estereiksi.

Keksinnön mukaista hajottamismenetelmää voidaan 35 käyttää hajottamaan akryyliamidia missä tahansa alustassa, 4 89075 jossa sitä esiintyy. Se on erityisen käyttökelpoinen poly-akryyliamidipolymeereissä läsnäolevan reagoimattoman ak-ryyliamidin ja jätevesissä, esimerkiksi polyakryyliamidien tuotantoprosessin jätevedessä läsnäolevan akryyliamidin 5 hajottamiseen. Polyakryyliamideja tuotetaan kolmentyyppi sinä polymeereinä, nimittäin liuos-, kuiva- ja suspensio-polymeereinä .

Polyakryyliamideja valmistetaan polymeereinä, joita on kolmea kemiallista tyyppiä. Nämä ovat kationiset, anio-10 niset ja ei-ioniset polymeerit, joissa akryyliamidit voivat olla kopolymeroituina muiden monomeerien, esimerkiksi akryylihapon kanssa. Näitä polymeerejä voidaan tuottaa jollakin seuraavista kolmesta perustekniikasta: liuospolymeraatio, jossa valmistetaan geelityyppi-15 nen tuote polymeroimalla monomeerit vesiliuoksessa; kuivat polymeerit, jotka ovat edellä mainitulla tavalla tuotettuja polymeerejä, mutta jotka tämän jälkeen lämpökuivataan ennen käyttöä; ja lateksi- tai suspensiopolymeraatio, jossa vedessä 20 oleva monomeeriliuos sekoitetaan detergenttien tai vedettömän lievästi tuoksuvan parafiinisen liuottimen kanssa muodostamaan vesipisaroista koostuva stabiili suspensio, jossa polymeeripisarat muodostetaan lisäämällä systeemiin vesiliukoista polymeraatio-initiaattoria.

25 Lateksi- tai suspensiopolymeerit muodostavat suu rimman polyakryyliamidiryhmän markkinaosuuksien perusteella.

Keksinnön mukaisissa hajottamis- ja akryylihapon tuottoprosesseissa käytetty amidaasientsyymi voi olla läs-30 nä missä tahansa sopivassa muodossa kokonaisissa mikro- organismisoluissa tai raakana tai puhdistettuna entsyymi-ekstraktina. Entsyymi voidaan tuoda prosesseihin kokonaisina viljelmässä olevina soluina, jotka on valmistettu alunperin keksinnön mukaisella menetelmällä, tai kasvu-35 alustana, joka on tuotettu erottamalla vain osittain vesi ja muut komponentit sellaisista viljelmistä. Yleisesti 5 Ρ9Π75 kuitenkin pidetään parempana, että solut erotettaisiin viljelmästä ennen käyttöä prosesseissa.

Kun amidaasia sisältävät, keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut solut tai soluvapaat ekstraktit 5 kuumennetaan 40 - 80 °C:n välillä oleviin lämpötiloihin, on havaittu, että erittäin epätavallisesti amidaasiaktivi-teetti nousee lirreversiibelisti 1,5 - 35-kertaisesti riippuen entsyymipreparaatista. Tämä vaikutus on suurin 55 - 65 °C:n välillä olevissa lämpötiloissa, erityisesti vä-10 Iillä 58 - 62 °C, pH:ssa 4-9, erityisesti pH:ssa 6-7, ja proteiinikonsentraation ollessa 0,1 - 200 mg/ml. Näissä olosuhteissa tapahtuu vain vähän merkittävää amidaasin de-naturaatiota.

Sopiva kuumennus tapahtuu aikavälillä 20 minuuttia 15 - 10 tuntia, erityisesti 30 minuuttia - 180 minuuttia joissakin tapauksissa. Nousseen aktiviteetin tuottamiseksi solut tai soluvapaa entsyymi voidaan kuumentaa välittömästi sen jälkeen, kun ne on tuotettu keksinnön mukaisella menetelmällä, tai jonakin muuna myöhempänä ajankohtana.

20 Keksinnön mukainen menetelmä voidaan käyttökelpoisesta suorittaa joko kuten on kuvattu edellä tai samanlaisella prosessilla, joka käsittää kolme vaihetta, nimittäin ensimmäisen fermentaatiovaiheen, jossa indusoitua amidaasia sisältäviä soluja kasvatetaan fermentorissa, 25 toisen lämpöshokkivaiheen, jossa solut kuumennetaan edellä mainittuihin lämpötilaväleihin, ja kolmannen erotteluvaiheen, jossa solujäänteet sisältävä presipitaatti erotetaan entsyymin sisältävästä superna-tanttinesteestä.

30 Keksinnön mukaisella menetelmällä kohotetun aktivi- teetiin omaava amidaasientsyymi voi sijaita kokonaisissa mikrobisoluissa tai niistä valmistetuissa raa'oissa tai puhdistetuissa ekstrakteissa. Entsyymi voi olla peräisin mistä tahansa sopivasta mikrobilähteestä. Sopivat baktee-35 rilähteet käsittävät kantoja suvuista Brevibacterium,

Pseudomonas, Alcaligenes, Arthobacter, Corynebacterium, 6 89075

Mycobacterium, Lactobacillus, Bacillus, Micrococcus, No-cardia ja Streptomyces. Sopivat hiivat ja homeet käsittävät Fusarium ja Aspergillus -kantoja.

Erittäin käyttökelpoisia lähteitä ovat lajin Methy-5 lophilus methylotrophus -kannat, joissa entsyymi on indusoitu, kuten on kuvattu GB-patenttihakemuksessa nro 8 639 029 (ICI hakemus B 34 138) viljelemällä niitä sopivia ravinteita ja amidia sisältävässä kasvualustassa sellaisissa olosuhteissa, että entsyymi indusoituu bakteeris-10 sa.

Methylophilus methylotrophus -laji (aiemmin nimeltään Pseudomonas methylotropha), jonka kannat voidaan kuumentaa keksinnön mukaisella menetelmällä, on kuvattu GB-patenttijulkaisussa nro 1 370 892. Tämän lajin kannat, 15 jotka ovat sopivia käytettäviksi keksinnön mukaisessa menetelmässä, on tallennettu seuraaviin kolmeen viljelmäko-koelmaan, joista viljelmät ovat saatavissa: 1) The National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), Torrey Research Station, P.O. Box 31, 135 Abbey 20 Road, Aberdeen AB9 8DG, Scotland, Englanti; 2) The Acricultural Research Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA; ja 3 ) The Fermentation Research Institute (RFI), Agency of 25 Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3 Higashi 1-Chome, Yatabe-mac-hi, Tsukuba-kun, Ibaragi-ken, Japan.

Vastaavat tallennetuille kannoille annetut koodinumerot näissä viljelmäkokoelmissa ovat seuraavat: 30 NICB 10508 - 10515 ja 10592 - 10596, kaikki mukaan luettuina ; NRRL B 5352 - B 5364 mukaan luettuina; ja FRI 1215 - 1227 mukaan luettuina.

Edullinen kanta, jossa amidaasi voidaan indusoida, 35 on Methylophilus methylotrophus -kanta AS-1 (NCIB 10515), jota voidaan turvallisesti käyttää esimerkiksi elintarvik- 7 β 9075 keiden yhteydessä käytettäväksi tarkoitettujen polyakryy-liamidipolymeerien käsittelyssä. Methylophilus methylotro-phus -laji ja edellä mainitut kannat, varsinkin kanta AS-1, ovat tulleet laajalti tunnetuiksi ja ne on mainittu 5 lukuisissa julkaisuissa sekä hakijan että muiden taholta. Edellä mainittujen tallennuspaikkojen lisäksi niiden viljelmiä säilytetään monissa yliopistoissa ja laboratorioissa Englannissa ja muissa maissa. Myös erittäin sopiva keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettäväksi on NClB:sta 10 saatavissa oleva kanta NCIB 11585, jonka tuotanto kannan NCIB 10515 geneettisellä modifikaatiolla on kuvattu EP-patenttijulkaisussa 35 831 B ja lukuisissa muissa julkaisuissa.

Methylophilus methylotrophus -kannan amidaasin omi-15 naisuudet:

Fysiologinen status:Indusoituva Sijainti: Sytoplasminen

Proteiini: Liukoinen

Hapan Isoelektrinen piste 20 4,2

Tetrameerinen

Natiivi MW (Geelikromatografia 155000

Monomeerin MW (SDS page) 38000 25 Ominaisuudet: pH optimi: Asetamidi 5

Akryyliamidi 8 Lämpötila

optimi: 60 °C

Ka Asetamidi 0,2 mM

30 Akryyliamidi 10 mM

Aktiviteetit: Asyyliamidaasi

Asyylitransferääsi

Substraatti: C1 < C2 < C3 > C4 > C5

Asetamidi < Akryyli- 35 amidi > Propionamidi β 89075

Amidaasi voidaan indusoida Methylophilus methylo-trophus -kannassa, kun sitä kasvatetaan aerobisesti hiilen, typen, fosforin ja muiden tarkoituksenmukaisten ravinteiden lähteitä sisältävässä alustassa amidin läsnäol-5 lessa sellaisissa olosuhteissa, että amidaasi indusoituu bakteerisoluissa. Sopiva viljely tapahtuu lämpötilavälillä 20 - 40 °C, edullisesti 34 - 38 °C ja pH:ssa 5,0 - 8,0, edullisesti 5,8 - 7,6. Kasvatus voi tapahtua panosviljely-nä, yksivaiheisena jatkuvana viljelynä tai monivaiheisena 10 jatkuvana viljelynä. Sopiva jatkuvan viljelyn laimennusno-peus on välillä 0,05/tunti - 0,55/tunti. Metanoli on edullinen hiilenlähde. Mikä tahansa sopiva amidi voi olla läsnä kasvatusalustassa. Asetamidi tai formamidi ovat edullisia. Muita sopivia amideja ovat karboksyylihappojen ami-15 dit, joilla on kaava

R-C-OH

II

0 20 jossa R on lyhytketjuinen alifaattinen ryhmä sisältäen 1 -5 hiiliatomia, joka voi olla suora tai haarautunut ketjultaan. Amidi on edullisesti ainoa tai pääasiallinen typen-lähde ja kasvatus tapahtuu jatkuvana viljelynä typen rajoittaessa. Erittäin edullisella kasvatusalustalla on seu-25 raava koostumus:

Komponentti Määrä/litra

Fosforihappo 1,6 ml

MgS04 · 7H20 1,912 g 30 K2S04 0,952 g

CuS04 · 5H20 0,840 mg

ZnS04 · H20 2 , 568 mg

MnS04 · 4H20 4,04 mg

FeS04 · 7H20 37,20 mg 35 Kalsiumformiaatti 0,173 g 9 89075

Typpi hankitaan joko yksinään asetamidista tai asetamidista ja ammoniakista. Soluja kasvatetaan typen ylimäärässä tai typen rajoittaessa solukonsentraatioiden rajoissa.

5 Jatkuvalla, panos- tai syötetyllä panosfermentaa- tiolla tuotetut solut voidaan kerätä millä tahansa sopivilla keinoilla, edullisesti ultrasuodatuksella tai sent-rifugaatiolla liemen valmistamiseksi, jonka painosta 10 -25 % on kuiva-aineita. Tämä liemi hajotetaan esimerkiksi 10 useilla jäähdytys/sulatus-sykleillä tai mekaanisesti jauhamalla helmimyllyssä tai french-pressure -laitteella. Solujätteet voidaan sitten poistaa sentrifugaatiolla jättäen jäljelle raa'an soluvapaan, amldaasin sisältävän ekstraktin. Lämpökäsittely voi tapahtua ennen tätä sentri-15 fugaatiota tai sen jälkeen, mutta mieluummin ennen, koska sen avulla saadaan aikaan aktiviteettia stimuloivan vaikutuksen lisäksi tuotteen parempi sedimentaatio sentrifugaa-tion aikana. Tämä ekstrakti voidaan haluttaessa lisäpuh-distaa anioninvaihtokromatografiällä ja geelisuodatuksel-20 la. Soluvapaat amidaasipreparaatit on sopivaa säilyttää kylmässä 0-10 °C:ssa tai jäädytettyinä liuoksina tai kylmäkuivattuina preparaatteina ennen liuotusta ja käyttöä.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä amidaasia voidaan käyttää vähentämään kaikissa akryyliamidipolymeeri-25 tyypeissä, erityisesti kolmen kemiallisen perustyypin verkkorakenteissa esiintyvien vapaiden akryyliamidijäänteiden määrää. Lateksia käsiteltäessä amidaasiliuosta lisätään lateksiin ja dispergoidaan lateksin läpi ravistelemalla samanlaisilla sekoitustekniikoilla määränä 1 -.30 10 000 U/kg lateksia, edullisesti 100 - 2 000 U/kg latek sia. Amidaasin inkubaatio lateksin kanssa aiheuttaa vapaan akryyliamidin muuttumisen akryylihapoksi tai sen suolaksi. Inkubaatiolämpötilat 10 - 100 °C (erityisesti 30 - 80 °C) ovat suositeltavia. Verkkorakenteita on sopiva käsitellä 35 pH:ssa 3-10, edullisesti 5-7.

10 89075

Keksinnön mukaisella menetelmällä tuotettu parannetun aktiviteetin omaava amidaasi muuttaa akryyliamidin ak-ryylihapoksi. Tätä reaktiota voidaan näin ollen käyttää keinona tuottaa akryylihappoa tai kun reaktio suoritetaan 5 sopivan suolan tai alkoholin läsnäollessa, tuottaa akryy-lihapon suoloja tai estereitä.

Keksinnön mukaisella menetelmällä kuumennetulla amidaasilla on erittäin korkea aktiviteetti. Tämä laajentaa suuresti polyakryyliamidipolymeerien käyttöaluetta.

10 Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä.

Esimerkki 1

Methylophilus methylotrophus AS-1 -kannan soluva-paiden ekstraktien amidaasiaktiviteetin lämpöstimu-laatio 15 Sarja Methylophilus methylotrophus AS-1 -kannasta sitraattifosfaattipuskurisysteemiin (pH 6,0) ja proteiini-konsentraatioon 30 mg/ml valmistettuja soluvapaita eks-trakteja kuumennettiin vesihauteessa 1 ja 2 tunnin ajan lämpötilasarjoissa välillä 30 - 70 °C. Otettiin näytteitä 20 eri aikoina ja niistä määritettiin amidaasiaktiviteetti 30 °C:ssa. Kaikissa tapauksissa käytetty substraatti oli ak-ryyliamidi konsentraationa 100 mM. Määritykset tehtiin 30 °C:ssa 0,1 M sitraatti/O,2 M fosfaattipuskurisysteemissä (pH 6,0).

25 Tulokset esitetään taulukossa ja ne osoittavat ko honneen aktiviteetin useimmissa käytetyissä olosuhteissa, korkeimpien lisääntymisten ollessa 60 °C:ssa. Lisääntymiset olivat suurempia kahden tunnin kuin yhden tunnin kuumennuksella.

η 89075

Taulukko Käsittely Amidaasiaktiviteetti Stimulaatio (U/ml) (* 5 ei mitään 3,69 1 tunnin kuumennus 30 °C 3,69 1 x 50 °C 5,91 1,6 x 60 °C 24,65 6,7 x 10 70 °C 14,48 3,9 x 2 tunnin kuumennus 30 °C 3,76 1,02 x 50 °C 8,86 2,04 x 60 °C 40,06 10,8 x 15 70 °C 2,28 0,62 x *) 1 yksikkö vastaa määrää, joka vapauttaa 1 pmoolia NH3/- minuutti 20 Esimerkki 2

Esimerkissä 1 kuvattuja soluvapaita ekstrakteja in-kuboitiln 55 °C:ssa, 60 °C:ssa ja 65 °C:ssa kutakin erikseen. Otettiin näytteitä eri aikoina ja niistä määritettiin amidaasiaktiviteetti kuten on kuvattu esimerkissä 1. 25 Tulokset esitetään kuviossa 1, joka on piirros amidaasiak-tiviteetista (U/ml) aktivaatioajan (minuutteja) funktiona ja osoittaa amidaasiaktiviteetin optimaalista stimulaatiota 60 °C:ssa kahden tunnin ajanjakson aikana. Inkubaatio alemmissa lämpötiloissa saa aikaan matalamman aktivaation. 30 Inkubaatio korkeammissa lämpötiloissa, esimerkiksi 65 °C:ssa, osoittaa alussa 60 °C:seen verrattavissa olevaa ak-tivaationopeuden stimulaatiota, mutta alempaa lopullista amidaasiaktiviteettia.

Esimerkki 3 35 Akryyliamidin poistaminen anionisesta lateksista

Anionista lateksia Nalfloc tyyppi A 626 (valmistaja 12 89075

Nalfloc Co., Cheshire, Englanti), jonka pH on säädetty 5,9:ään 60 °C:ssa, käsiteltiin lisäämällä siihen keksinnön mukaisella menetelmällä tuotettua amidaasiliuosta, jonka aktiivisuus oli 300 U/ml ja lopputaso 1 000 U amidaasia/kg 5 lateksia. Otettiin näytteitä eri aikoina ja niistä määritettiin vapaa akryyliamidi korkeapainenestekromatografiällä (HPLC).

Tulokset esitetään kuviossa 2, joka on piirros vapaan akryyliamidin (mM) määrästä käsittelyajan (minuutte-10 ja) funktiona ja osoittaa vapaan akryyliamidin määrän vähentymisen 1,78 mM:sta (126 ppm) 0,2 mM:een (1,4 ppm) 30 minuutissa.

Esimerkki 4

Akryyliamidin poistaminen kationisesta lateksista 15 Kationista lateksia Nalfloc tyyppi 4625-SC, jonka pH oli säädetty 6,0:aan, käsiteltiin kuten on kuvattu esimerkissä 3, analysoiden näytteet HPLC:llä.

Tulokset esitetään kuviossa 3, joka on piirros vapaan akryyliamidin (mM) määrästä käsittelyajan (minuutte-20 ja) funktiona ja osoittaa vapaan akryyliamidin määrän vähentymisen 2,2 mMrsta (156 ppm) 0,02 mM:een (1,4 ppm) 45 minuutissa.

Esimerkki 5

Akryyliamidin poistaminen ei-ionisesta lateksista 25 Ei-ionista lateksia Nalfloc tyyppi 8861-SC, jonka pH oli säädetty 6,0:aan, käsiteltiin kuten on kuvattu esimerkissä 3, analysoiden näytteet HPLC:llä.

Tulokset esitetään kuviossa 4, joka on piirros vapaan akryyliamidin (mM) määrästä käsittelyajan (minuutte-30 ja) funktiona ja osoittaa vapaan akryyliamidin määrän vähenemisen 3,1 mM:sta (220 ppm) 0,15 mM:een (10,7 ppm) 120 minuutissa.

Esimerkki 6

Sarja Methylophilus methylotrophus -kannasta val-35 mistettuja soluvapaita ekstrakteja, joiden pH oli säädetty puskurinvaihdolla Pharmacia RD10 -geelisuodatuspylväiden 13 89075 läpi 5:een, 6reen, 7:ään ja 8:aan, inkuboitiin näissä pH-arvoissa 0 °C:ssa. Otettiin eri aikoina näytteitä pH 6,0:ssa amidaasiaktiivisuuden analyysiä varten, kuten on kuvattu esimerkissä 1.

5 Tulokset esitetään kuviossa 5, joka on piirros ami- daasiaktiviteetista (yksikköä (U)/ml) kuumennusajan (minuutteja) funktiona ja osoittaa amidaasin maksimistimulaa-tion pH 7,0:ssa. Inkubaatio pHrssa 5, 6 ja 8 antaa tulokseksi merkittävästi pienemmän aktiivisuuden stimulaation. 10 Esimerkki 7

Keksinnön menetelmän mukaisesti valmistettu Methy-lophilus mehtylotrophus -kannan kokonaisia ja osittain hajotettuja soluja sisältävä "tahna", jonka kuiva-ainepitoisuus oli 10 %, kuumennettiin 60 °C:seen. Otettiin näytteitä 15 eri aikoina amidaasin aktiviteetin mittausta varten, kuten on kuvattu esimerkissä 1.

Tulokset esitetään kuviossa 6, joka on piirros ami-daasiaktiviteetista yksikköinä (U)/mg solun kuivapainoa (DCW) kohti kuumennusajan (tunteja) funktiona ja osoittaa 20 aktiviteetin maksimistimulaation 7 tunnin jälkeen, nousten arvosta 0,06 U/mg DCW arvoon 1,25 U/mg DCW.

Claims (6)

14 89075

1. Menetelmä kohotetun aktiviteetin omaavan asyyli-amidiamidohydrolaasientsyymin tuottamiseksi, tunnet- 5. u siitä, että Methylophilus methylotrophus -mikrobiso-luja, joissa tällainen entsyymi on indusoitu, tai mainittujen solujen entsyymiä sisältäviä ekstrakteja kuumennetaan 40 - 80 °C:n lämpötilaan pH:ssa 4-9 proteiinikon-sentraatiossa 0,1 - 200 mg/ml ja aikavälillä 20 minuuttia 10 - 10 tuntia, jolloin kohoaminen amidaasin aktiviteetissa akryyliamidin hajottamisen suhteen saadaan aikaan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymiä sisältäviä soluja tai ekstrakteja kuumennetaan 55 - 62 °C:n välillä olevaan 15 lämpötilaan.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymiä sisältäviä soluja tai ekstrakteja kuumennetaan 58 - 62 °C:n välillä olevaan lämpötilaan.

4. Menetelmä akryyliamidin hajottamiseksi sitä si sältävässä alustassa, jossa menetelmässä alusta saatetaan kosketuksiin akryyliamidia hajottamaan kykenevän entsyymin kanssa olosuhteissa, jotka ovat sopivia entsyymin aiheuttamalle akryyliamidin hajotukselle, tunnettu sii- 25 tä, että entsyymi on asyyliamidiamidohydrolaasientsyymi, joka on valmistettu patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän mukaisesti.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi on sellainen, joka 30 on kuumennettu 40 - 80 °C:n välillä olevaan lämpötilaan silloin, kun se sisältyy hajotettuihin soluihin ja/tai on assosioitunut solujätteisiin.

6. Menetelmä akryylihapon tai sen suolan tai esterin tuottamiseksi, jossa menetelmässä akryyliamidia sisäl- 35 tävä alusta saatetaan kosketuksiin entsyymin kanssa, joka is 89075 kykenee hajottamaan akryyliamidia akryylihapoksi olosuhteissa, jotka ovat sopivia entsyymin aiheuttamalle akryy-liamidin hajotukselle akryylihapoksi tai sen suolaksi tai esteriksi, tunnettu siitä, että entsyymi on asyy-5 liamidiamidohydrolaasientsyymi, joka on valmistettu patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän mukaisesti. 16 89075