FI87795B - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara polypeptider - Google Patents

Description

1 87795

Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten polypep-tidien valmistamiseksi.

Keksintö koskee menetelmää uusien, terapeuttisesti 5 käyttökelpoisten polypeptidien valmistamiseksi, joilla on kaava (IA):

Cys-Asn-A3-Leu-Ser-Thr-Cys-A8-Leu-Gly- AU~A12-A13-Gln*A15-A16_A17_LyS-A19-A20- ( IA ) 10 Thr-A22-Pro-A24-Thr-A26-A27-Gly-A29-Gly-A31-

Pro-NH2 jossa A3 = Ser, Gly tai Ala A8 = Vai tai Leu 15 An = Lys tai Thr A12 = Leu tai Tyr A13 = Ser tai Thr A15 = Glu tai Asp A16 = Leu tai Phe 20 A17 = His tai Asn A19 = Leu tai Phe . A20 = Gin tai His , A22 = Tyr tai Phe A24 = Arg tai Gin -’25 A26 = Asp, Asn tai Ala A27 = Vai, Thr tai Ile A29 = Ala, Ser tai Vai A31 = Thr, Vai tai Ala 30 tai kaava (lB): • -(CH2)5 -, CO-Asn-A'2-Leu-Ser-Thr-NHCHCO-A'7-Leu-Gly-A'io-A,u-A,i2-Gln-A'14-A'15-A'16-Lys-A'18- (IB) 35 A'19-Thr-A'21-Pro-A'23-Thr-A'25-A'26-Gly-A'28- .··. Gly-A130-Pro-NH2 2 87795 t r ,.r> i jossa A'2 = Ser, Gly tai Ala A'7 = Vai tai Leu A' 10 = Lys tai Thr A'n = Leu tai Tyr 5 A112 = Ser tai Thr A' 14 = Glu tai Asp A' 15 = Leu tai Phe A'i6 = His tai Asn A' 18 = Leu tai Phe 10 A' 19 = Gin tai His A' 21 = Tyr tai Phe A' 23 = Arg tai Gin A'25 = Asp, Asn tai Ala A'26 = Vai, Thr tai Ile 15 A' 2g = Ala, Ser tai Vai A'30 = Thr, Vai tai Ala jolloin kaavan (IB) mukaiset yhdisteet sisältävät α-amino-korkkihappoa (Asu), jossa ω -karboksyyli on liittynyt 20 Asn:n aminoryhmään.

Kaavan (IB) mukaiset tuotteet ovat rakenteellisia analogeja · luonnon peptideille, joita K. Jost ja J. Rudinger esitti- I vät aivolisäkkeen hermolohkon tapauksessa (Collect. Czech.

; Chem. Comm., 1967, 32, 1229).

‘ 25 Kaavojen (IA) ja (IB) mukaiset tuotteet voidaan ryhmitellä uudelleen seuraavaksi kaavaksi: D-A’7-Leu-Gly-A' 10-A'n-A' 12-Gln-A ' 14-A ' 15-A ' 16-Lys-A'18-A' 19-Thr-A' 21-Pro-A' 23-Thr-A ’ 25-A' 26-GLY-A ’ 28-Gly-A' 30-Pro NH2 30 jossa symboleilla A'7, A'10, A'u< A'12, A'14, A'15, A'16 ^ 18, A 19' A 21/ A 23' ^ 25' ^ 26' ^28' 3a ^ ' 30 on edellä annettu merkitys ja D esittää: - joko radikaalia Cys-Asn-A3-Leu-Ser-Thr-Cys-, jossa symbolilla A3 on edellä annettu merkitys, ;-·f 35 - tai radikaalia: 3 87795 I-(CH2)5-1 CO-Asn-A' 2-Leu-Ser-Thr-NHCHCO- jossa symbolilla A'2 on edellä annettu merkitys.

5 Keksinnön kohteena ovat erityisesti yhdisteet, jotka vastaavat yleisiä kaavoja (IA) ja (IB), kuten edellä määriteltiin, joissa A8 ja A'7 esittävät valii-nia.

Keksinnön kohteena ovat tarkemmin yhdisteet, jot-10 ka vastaavat seuraavia yleisiä kaavoja (IA) ja (IB): - Cys - Asn - Ser - Leu - Ser5 - Thr - Cys - Vai - Leu -Gly10 - Lys - Leu - Ser - Gin - Glu15 - Leu - His -

Lys - Leu - Gln20 - Thr - Tyr - Pro - Arg - Thr2b -1 15 Asp - Vai - Gly - Ala - Gly30 - Thr - proamidi |- (CH2 ) 5-1 - CO-Asn-Ser-Leu-Ser-Thr5-NH-CH-CO-Val-Leu-Gly-Lys10-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu15-His-Lys-Leu-Gln-Thr20-Tyr-Pro-Arg- 20 Thr-Asp25-Val -Gly-Ala-Gly-Thr30-proamidi . - Keksinnön mukaiset polypeptidit alentavat kalsemiaa h ja fosfatemiaa; ne hidastavat luiden haurastumista, kiih- ; dyttävät uusien luiden muodostumista, lisäävät kalsiumin 25 absorboitumista suolessa ja alentavat kalkkivirtsaisuutta.

: · Ne sitovat kalsiumia solujen sisällä. Niillä on tärkeä tu- : ·· lehduksenvastainen ja kipua lievittävä vaikutus.

Nämä ominaisuudet puolustavat aikaisemmin määriteltyjen kaavojen (ΙΛ) ja (IB) mukaisten polypeptidien käyt-: -.:30 töä lääkkeinä.

•Lääkkeiden pääindikaatioita ovat Pagetin sairaus, eri syistä johtuvat osteoporoosit (tavallinen, huokosten -·_ pehmentymisestä johtuva, kortisoniperäinen, loukkaantumi sen jälkeinen, liikkumattomuudesta johtuva ja idiopaatti-·-··* 35 nen), renaalinen luun kasvuhäiriö, murtumat, hyperkalse- 4 37795 miat, luu-nivelkivut, erityisesti ne, jotka johtuvat luun metastaaseista, spasmofilia ja kalkkiaineenvaihdunnan aiheuttama häiriö normaalikalsemiassa.

Lääkekäyttöä varten muodostetaan farmaseuttisia 5 koostumuksia, jotka sisältävät vaikuttavana perusaineena ainakin yhtä aikaisemmin määriteltyä tuotetta.

Nämä farmaseuttiset koostumukset voivat olla esimerkiksi kiinteitä tai nestemäisiä ja ne ovat farmaseuttisissa muodoissa, joita nykyään käytetään ihmisten lää-10 kintään, kuten esimerkiksi yksinkertaiset tai sokeripääl-lysteiset tabletit, kapselit, rakeet, liposomit, aerosolit, peräpuikot, injektoitavat valmisteet; ne valmistetaan tavallisten menetelmien mukaan. Vaikuttava aine tai aineet voidaan liittää täyteaineisiin, joita tavallisesti käyte-15 tään näissä farmaseuttisissa koostumuksissa, kuten talkki, arabikumi, laktoosi, tärkkelys, magnesiumstearaatti, kaakaovoi, vesipitoiset tai vedettömät apuaineet, eläin- tai kasvialkuperää olevat rasva-aineet, parafiinijohdannaiset, glykolit, erilaiset kostuttavat, dispergoivat tai emulgoi-20 vat aineet, ja säilöntäaineet.

Erityisesti voidaan muodostaa farmaseuttisia koos-• tumuksia, kuten edellä on määritelty, jotka on tarkoitettu ... parenteraalisesti annettavaksi, oraalisesti annettavaksi liposomien muodossa, tai nenän kautta annettavaksi jauhe-'*·· 25 tussa muodossa.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle uusien polypepti-dien valmistamiseksi on tunnusomaista, että tarvittavat Y.: aminohapot, peptidit tai niiden yhdistelmät kondensoidaan kaavojen (IA) ja (IB) mukaisten aminohapposekvenssien jär- - -.:30 jestyksessä, ja valmistettaessa kaavan (IB) mukaisia tuot- -'· teitä, yhdistetään kiinteäfaasimenetelmä sekvenssin 10 - 31 saamiseksi ja klassinen nestefaasimenetelmä sekvenssin 1-9 saamiseksi.

Kuten aikaisemmin esitettiin, kaavan (IA) mukaisten — '35 peptidien ja kaavan (IB) mukaisten tuotteiden sekvenssin 10 5 87795 - 31 synteesit suoritetaan käyttäen kiinteätaasimenetel-mää. Tämä tuo käytettäväksi bentsyylihydryyliaminohartsin käytön (P.G. Piettä ja G.R. Marshall,, Chem. Commun., 1970, 650), jonka valmistus ja käyttö on kuvattu (P. Ri-5 vaille, A. Robinson, M. Kamen ja G. Milhaud, Helv., 1971, 54, 2772).

Kaavan (IÄ) mukaisten tuotteiden edullisessa valmistusmenetelmässä ryhmä Ν-α-butyylioksikarbonyyli (t-Boc) suojaa aminohappojen α-aminoryhmää. Aminohappojen la-10 teraaliset ryhmät suojataan muodossa: 1) bentsyyliesterinä asparagiinihapon ja glutamiinihapon karboksyyliketjuun, 2) bentsyylieetterinä seriinin ja treoniinin hydroksyyliin ja 2,4-diklooribentsyylieetterinä tyrosiiniin, 15 3) metoksibentsyylieetterinä kysteiinin sulfhydryyliryh- mään, 4) dinitro-2,4-fenyylinä histidiinin imidatsoliin, 5) bentsoksikarbonyyliryhmänä lysiinin ?-aminoryhmään.

Eri aminohapot liitetään peptidiketjuun disyklo-20 heksyylikarbodi-imidillä (DCCI) ja hydroksibentsotriatso- lilla (HOBT) antamalla proliinin suhteen ylimäärän suojat- . tuja aminohappoja ensin reagoida peräkkäin hartsiin kiin- .1 / nitettynä. Reaktion annetaan jatkua kaksi tuntia. t-Boc- ryhmät poistetaan trifluorietikkahapolla metyleenikloridi-25 liuoksessa; metyleenikloridilla pesemisen jälkeen neutra- - lointi suoritetaan trietyyliamiinilla tai di-isopropyyli- : ·· etyyliamiinilla (DIEA) samassa liuottimessa.

Asparagiini ja glutamiini liitetään paranitrofenyy-liestereidensä muodossa liuoksessa dimetyyliformamidissa *·_: 30 (DMF). Jos kontrollikoe ninhydriinin kytkemiseksi Kaise- rin ja Colescottin menetelmän mukaan on positiivinen, seos käsitellään pivaliinihapolla (1 %); jos tässä kokeessa si-·· ninen väri vielä pysyy, DMF/1 % AcOH-seos kyllästetään urealla. Kuitenkin, vaikka tämä koe olisi negatiivinenkin -- ‘35 (ei siniseksi värjäytymistä), kukin kytkentä voidaan tois- 6 87795 taa kaksi kertaa systemaattisesti. Jos kytkentä ei ole totaalinen 48 tunnin reaktion jälkeen, kuten on asianlaita asemassa 20 olevan glutamiinin suhteen, reagoimaton treo-niini asetyloidaan asetyyli-imidatsolilla metyleeniklori-5 dissa tai etikkahapolla ja DCCIrllä.

Lopuksi histidiinin imidatsolia suojaava ryhmä poistetaan, kun peptidi on edelleen hartsiin kiinnittyneenä, pHrssa 8, merkaptoetanolilla DMF-liuoksessa. Peptidi erotetaan hartsista käsittelemällä nestemäisellä vetyfluo-10 ridihapolla anisolin ja metioniinin läsnäollessa. Kaikki suojaryhmät poistetaan tämän tapahtuman aikana.

Peptidit puhdistetaan geelisuodatuksella. Pääpiik-kejä vastaavat fraktiot kootaan, lyofilisoidaan, siirretään jälleen puskuriin pH:ssa 8 ja hapetetaan 24 tuntia 15 ilmavirralla tarkoituksena muodostaa disulfidisilta kahden kysteiinijäännöksen väliin.

Fraktio, joka vastaa piikkiä, jolla on haettu biologinen aktiivisuus, puhdistetaan jälleen ioninvaihtohart-silla CMC 32 happoeluointigradientilla. Saatu peptidi on 20 homogeeninen paperielektroforeesissa ja selluloosakromato- grafiässä.

. - Kaavan (IB) mukaisten tuotteiden sekvenssi 10 - 31 saadaan samoissa olosuhteissa, jotka aikaisemmin esitettiin kaavan (IA) mukaisten tuotteiden valmistukselle. Se 25 mitä esitettiin glutamiinille asemassa 20 kaavan (IA) mukaisissa tuotteissa, pätee tietenkin asemaan 19 kaavan . *** (IB) mukaisissa tuotteissa.

Kaavan (IB) mukaisten tuotteiden edullisessa valmistusmenetelmässä sekvenssin 1-9 synteesi suoritetaan 30 nestemäisessä väliaineessa. Fragmentti:

(CH^L.COOR

H-Asn-Λ ’ ,-Leu-Ser-Thr -NH-CH-OO

7 S77S5 jossa symbolilla A'2 on edellä annettu merkitys ja R = esteri, kondensoidaan syklisoinnin jälkeen tripeptidin A'7-Leu-Gly kanssa. Käytetään peptidien synteeseissä yleensä käytettäviä suojaryhmiä.

5 Kaavan (IB) mukainen peptidi saadaan sitten seuraa vasti :

Edelläoleva suojattu nonapeptidi muutetaan N-hyd-roksisukkiini-imidiesteriksi, kytketään sitten fragmentin 10 - 31 kanssa hartsiin kiinnittyneenä DMF-väliaineessa 10 30 °C:ssa. Peptidi erotetaan hartsista käsittelemällä nes temäisellä vetyfluoridihapolla dimetyylisulfidin ja p-kre-solin läsnäollessa (J.P. Tam, W.H. Heathand ja R.B. Merri-field, J.A.C.S.,.1983, 105, 6442). Kaikki suojaryhmät poistetaan tämän tapahtuman aikana.

15 Peptidit puhdistetaan geelisuodatuksella

Tuotteiden biologinen aktiivisuus määritetään käyttäen urosrottia joiden paino on 100 - 120 g ja joita on pidetty ilman ruokaa 16 tuntia. Aktiivisuus on ilmaistu MRC-yksiköissä alkaen kalsemian vähenemisestä, mitattuna 20 tunti tutkittavan peptidin suoneen injektoinnin jälkeen sopivasti 0,1N natriumasetaattipuskuriin pHrssa 6 ja 0,1 % albumiiniin laimennettuna, verrattuna sopivasti laimennetun "Research Standard B":n aktiivisuuteen. Esimerkin 1 ; peptidin biologinen aktiivisuus on suurempi kuin 4000 MRC- - 25 yksikköä mg:aa kohti ja esimerkin 2 peptidin aktiivisuus on suurempi kuin 4500 MRC-yksikköä mg:aa kohti. Tämän aktiivisuuden huomioon ottaen tavanomainen annos voi olla : esim. 1 - 100 MAC-yksikköä päivää kohti lihaksensisäisesti tai ihonalaisesti annettuna, vaihdellen käytetyn tuotteen, 30 käsiteltävän potilaan jo kyseessä olevan taudin mukaan. ·“' Esimerkin 1 mukaisen yhdisteen aktiivisuus on ver- rattu lohen kalsitoniini-aktiivisuuteen in vitro-kokeella, ··· jossa luukudoskato-aktiivisuus määritetään kvantitatiivi sesti mittaamalla 1uunäytteiden kuoppien lukumäärää ja —'35 pinta-alaa. Mitä enemmän kalsitoniini kokeessa vähentää s 87795 näiden kuoppien lukumäärää ja pinta-alaa, sitä aktiivisempi se on. Kokeen suorittamiseksi vastasyntyneiden rottien pitkät luut poistettiin, raaputettiin skalpellilla ja näytteet kerättiin puskuroituun Hepes-liuokseen. Näin saa-5 tu luukudossuspensio saatetaan välittömästi kosketukseen muiden luunäytteiden kanssa. Inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa kukin luunäyte siirretään steriiliin astiaan ja inkuboi-daan 18 h kalsitoniinin tai liuottimen läsnäollessa. Kuoppien lukumäärä ja pinta-ala määritetään pyyhkäisyelektro-10 nimikroskoopilla. Tulokset on laskettu luukudoskato-aktii-visuutena prosenttina kontrollinäytteen arvosta. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa.

' Kuoppien lukumäärä Kuoppien pinta-ala 15 luunäytteessä luunäytteessä (% kontrollista) (% kontrollista)

Lohen kalsito-niini 20 (0,1 pg/ml) 35 % 40 %

Esimerkin 1 mukainen tuote (0,1 pg/ml) 26 % 21 % : 25 __,

Tuloksista ilmenee, että esimerkin 1 mukainen modifioitu kanan kalsitoniini on aktiivisempi kuin lohen kalsitonii-ni. Kuoppien lukumäärän väheneminen on suurempi uuden kal-30 sitoniinin ollessa kyseessä kuin tunnetun lohen kalsitoniinin ollessa kyseessä; 26 % kontrollin kuopista ja vastaavasti 35 %. Ero on siis 35-%:inen. Pinta-alan pienenemisen suhteen vastaavat luvut ovat 21 % ja 40 %, mikä vastaa 90-%:ista eroa.

35 Alan kirjallisuuden perusteella (Nieto, Moya and R- ··_ Candela, Biochim. Biophys. Acta, 322, 1973, 383 - 391) tiedetään, että kanan kalsitoniinilla ja lohen kalsitonii-··- nilla on hyvin samantyyppiset ominaisuudet. Tämän keksin- 9 37795 nön mukaisesti saatu yhdiste on siten aktiivisempi myös kanan kalsitoniiniin nähden.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

Esimerkki 1 5 Seuraavan kaavan (IA) mukaisen peptidin valmis taminen

Cys - Asn - Ser - Leu - Ser5 - Thr - Cys - Vai - Leu -Gly10 - Lys - Leu - Ser - Gin - Glu15 - Leu - His -10 Lys - Leu - Gln20 - Thr - Tyr - Pro - Arg - Thr25 - (IA) Asp - Vai - Gly - Ala - Gly30 - Thr -proamidi

Lateraalisia ryhmiä sisältävät t-Boc-aminohapot tulevat BACHEMilta (Dubendorf, Sveitsi) tai valmistetaan labora-15 toriossa Schnabelin menetelmällä (E. Schnabel, Liebigs Ann. Chem. 702, 188, 1967) autotitrauslaitteessa. Niiden puhtaus määritetään polarimetrialla, sulamispisteen avulla j a ohutkerrossilikageelikromatografiällä.

Puhdistetun peptidin hydrolyysi suoritetaan sulje-20 tussa putkessa vakuumissa 6N HC1-väliaineessa (110 °C, 24 tuntia).

I. Sekvenssin synteesi / a) Hartsin valmistus (P. Rivaille, A. Robinson, M. Kamen ja G. Milhaud, Helv., 1971, 54, 2772).

• 25 Bentsyyliketohartsi 2 litran kolmikaulapullossa, joka on varustettu sekoittajalla, annetaan 50 g:n polystyreeniä, jossa on 1 % divinyylibentseeniä Bio-rad SX2 (200 - 400) turvota 2 tuntia 350 ml:ssa nitrobentseeniä. Toisessa pullossa liuote-30 taan 66 g A1C13 300 mlraan nitrobentseeniä, johon on lisätty 80 ml bentsoyylikloridia. Seos kaadetaan ensimmäiseen pulloon hyvin sekoittaen ja pidetään 2 tuntia ympäristön lämpötilassa. Jos hartsi turpoaa liikaa, lisätään nitrobentseeniä (noin 100 ml). Seos suodatetaan, pestään diok-....:35 saanilla (3 x), etikkahapolla (3 x), metanolilla (3 x) ja • · · 10 37 795 lopuksi vuorotellen CH2Cl2:lla ja CH20H:lla tarkoituksena tehdä hartsi sellaiseksi, että se turpoaa ja supistuu kulloinkin jättäen riittävän kosketusajan. Seos kuivataan ek-sikaattorissa vakuumissa koko yön (saanto 75 g).

5 Bentshydryyliamiinihartsi 1 litran pullossa, johon on kiinnitetty "Dean Stark" ja sekoittaja, kuumennetaan 500 g ammoniumformiaat-tia 120 - 130 °C:seen 1-2 tunniksi. Hartsi (50 g) lisätään kerralla ja lämpötilan annetaan nousta 160 - 165 °C:- 10 seen puolen tunnin kuluessa tehokkaasti sekoittaen, joka lämpötila sitten pidetään 6 tuntia. Seos pestään vedellä, käsitellään sitten kuten edellä bentsyyliketohartsin tapauksessa. Vakuumissa kuivattua hartsia kuumennetaan palautus jäähdyttäen ja sekoitetaan 8 tuntia 6N HCltssä. Sit-15 ten se suodatetaan ja pestään kuten edellä. Kiinnitys kapasiteetti vaihtelee, aminohapon luonteen mukaisesti, välillä 0,3 ja 0,5 mmol/g.

b) Peptidin valmistus Käytetty laite mahdollistaa 25 ml: n pyrexputken 20 mekaanisen sekoittamisen, jonka keskimmäinen osa sisältää hartsia (2 g). Putken päissä olevista huokoslasisuodatti- mista on tarkoitus lisätä ja poistaa reagensseja (noin 15 V ml).

Aminohappojen kytkentä käsittää seuraavat vaiheet: '25 Sykli 32

Kytkentä: 2 g hartsia (kiinnityskapasiteetti 0,5 mmol/g) sekoitetaan (10 min) CH2C12, (CH3)2NCH0 (DMF)-väliaineessa (1:1, v/v) Boc-L-proliinin läsnäollessa (2 mM, 0,43 g).

30 DCCI (4 mmol) ja 1-hydroksibentsotr iät solia (HOBT) (4 mmol) lisätään ja sekoittamista jatketaan 2 tuntia. Hartsi pestään peräkkäin CH2Cl2:lla (1 x,2 min), CH30H:lla, abs. (3 x,2 min), ja CH2Cl2:lla (3 x, 2 min). Ninhydriinireak-tio suoritetaan hartsinäytteelle: se on negatiivinen.

Μ 07795

Aininoryhmän vapautus:

Hartsi käsitellään seoksella CF3COOH-CH2Cl2 (1:1, v/v) 1 min; seos suodatetaan ja suoritus toistetaan antaen kosketuksen kestää 15 min. Hartsi pestään CH2Cl2:lla (3 x.

5 1 min). CF3COOH poistetaan käsittelemällä hartsi kahdesti

Et3N/CH2Cl2-seoksella (12,5:87,5 v/v) (kosketusaika 1 min, sitten 5 min). Se pestään CH2Cl2:lla (8 x, 1 min). L-pro-liinihartsi titrataan: se sisältää 0,5 mmol/g proliinia.

Sykli 31 10 Kytkentä: L-prolyylihartsia (1 mmol) sekoitetaan (10 min) 4 mmol:n kanssa Boc-O-bentsyyli-L-treoniinia (1,23 g) CH2-C12-DMF:ssä (1:1, v/v) (10 ml). DCCI (4 mmol) ja HOBT (4 mmol) lisätään ja sekoitusta jatketaan (2 h). Hartsi pes- 15 tään peräkkäin: CH2C12 (1 x, 2 min), CH30H abs. (3 x, 2 min), CH2C12 (3 x, 2 min). Ninhydriinireaktio on negatiivinen.

Aminoryhmän vapautus - katso sykli 32

Syklit 30 - 25 20 Käytetään edellä olevia kytkentä- ja vapautusmene- telmiä seuraaviin reaktioihin: ' . Sykli 30 4 mmol Boc-glysiiniä (0,71 g) . Sykli 29 4 mmol Boc-L-ala (0,76 g) . Sykli 28 4 mmol Boc-glysiiniä (0,71 g) ' :25 . Sykli 27 4 mmol Boc-L-valiinia (0,87 g) : .. . Sykli 26 4 mmol Boc-L-asparagiim hapon B-bentsyy- liesteriä (1,29 g)

Sykli 25 4 mmol Boc-O-bentsyyli-L-treoniinia : (1,24 g) .'./30 Sykli 24

Kytkentä:

Syklin 25 hartsipeptidiä, joka aikaisemmin pestiin —: DMFrllä (2 x), sekoitetaan (10 min) 4 mmol:n kanssa Boc- N- Y-tosyyli-L-arginiinia (1,41 g) DMF-liuoksessa ja sen ... 35 jälkeen prosessi on sama, joka kuvattiin syklille 31.

i2 3 7795

Sykli 23 Kytkentä:

Syklin 24 peptidihartsia sekoitetaan (10 min) 4 mmol:n kanssa Boc-L-proliinia (0,88 g CH2Cl2-väliaineessa) 5 (10 ml). DCCI/HOBT-seosta lisätään, kuten syklille 32 ku vattiin. Reaktio jakson lopussa ninhydriinireaktio on negatiivinen.

Vapautus - katso sykli 32 Syklit 22 - 21 10 Syklissä 23 käytettyjä kytkentä- ja vapautusproses- seja käytetään seuraaviin reaktioihin: . Sykli 22 4 mmol Boc-O-bentsyyli-L-tyrosiinia (1,49 g) . Sykli 21 4 mmol Boc-O-bentsyyli-L-reoniinia (1,24 g). Sykli 20 15 Kytkentä:

Syklin 21 hartsipeptidiä, joka aikaisemmin pestiin DMF:llä (2 x), sekoitetaan 4 mmol:n kanssa Boc-L-glutamii-ni-p-nitrofenyyliesteriä (1,5 g) ja 10 ml:n kanssa DMF, johon on lisätty 1 % etikkahappoa. DCCI (4 mmol) ja HOBT 20 (4 mmol) lisätään ja seosta sekoitetaan 48 tuntia. Hartsi pestään DMF:llä, CH2Cl2:lla, CH30H:lla, CH2Cl2:lla (2 x). Vapautus - katso sykli 32 Syklit 19 - 15 Käytetään prosessia syklille 31 seuraaviin reakti- : 25 oihin: "· . Sykli 19 4 mmol Boc-L-leusiini (1,0 g)

Sykli 18 4 mmol Boc- -karbobentsyylioksi-L-lysiini d,52g) . Sykli 17 4 mmol Boc-dinitro-2,4-fenyyli(im)L-histidiini .. 30 (1,23 g) . Sykli 16 4 mmol Boc-L-leusiini (1,0 g) . Sykli 15 4 mmol Boc-L-glutamiinihapon -bentsyyliesteri (1,3 g)

Sykli 14 35 Prosessi on sama kuin syklille 20 i3 87795

Sykli 13

Prosessi on kuin syklille 31, käyttäen 4 mmol Boc- O-bentsyyli-L-seriiniä (1,0 g).

Syklit 12-9 5 Prosessi on sama kuin syklille 31 seuraaviin reak tioihin: . Sykli 12: syklissä 19 käytetty johdannainen.

. Sykli 11: syklissä 18 käytetty johdannainen.

. Sykli 10: syklissä 30 käytetty johdannainen.

10 . Sykli 9: syklissä 19 käytetty johdannainen.

. Sykli 8: syklissä 27 käytetty johdannainen.

Sykli 7 Käytetään syklin 31 menetelmää saattamaan 4 mmol Boc-L-kysteiinin S-p-metoksibentsyylieetteriä (1,13 g) 15 reagoimaan.

Syklit 6-3 . Sykli 6: identtinen syklin 31 kanssa.

. Sykli 5: identtinen syklin 13 kanssa.

. Sykli 4: identtinen syklin 19 kanssa.

20 . Sykli 3: identtinen syklin 13 kanssa.

Sykli 2 '· Kytkentä: : ." Peptidihartsia syklistä 3, joka aikaisemmin on pes- ty DMF:llä (2 x), sekoitetaan (48 h) 4 mmol:n kanssa Boc-: ' ·25 L-asparagiinin p-nitrofenyyliesteriä (1,45 g) DMF-väliai- neessa HOBT:n läsnäollessa (4 mmol). Hartsi pestään peräk-käin DMF:llä, CH2Cl2:llä, CH30H:lla, CH2Cl2:lla. Ninhydrii-nireaktio on negatiivinen.

; Vapautus 30 Prosessi on sama kuin kuvattiin syklille 32.

- Sykli 1 3 mmol Boc-L-kysteiinin S-p-metoksibentsyylieette-riä (1,13 g) saatetaan reagoimaan syklin 31 olosuhteissa.

: II - Histidiinin dinitrofenyyliryhmän eliminointi ... 35 2 ml merkaptoetanolia lisätään 15 ml: aan dimetyy- i4 37795 liformamidia (DMF), ja pH säädetään arvoon 8 trietyyli-amiinilla. Tämä reagenssi viedään laitteeseen ja seosta sekoitetaan 14 tuntia. Hartsi suodatetaan ja pestään vuorotellen metyleenikloridilla (3 x) ja metanolilla (3 x).

5 Vakuumissa kuivatuksen jälkeen hartsin paino on 2,85 g.

III. Peptidin irrotus hartsista ja suojaryhmien eliminointi 15 ml vetyfluoridihappoa tiputetaan seokseen, jossa on 1,5 g hartsipeptidiä ja 1,5 ml anisolia. Seosta sekoili) tetaan 1 h °C:ssa ja 30 min ympäristön lämpötilassa. Happo erotetaan vakuumissa ja jäännös siirretään jälleen 3 kertaa 5 ml:aan etikkahappoa ja seostetaan etyylieetterillä vapaaksi peroksidista. Sakka sentrifugoidaan kylmänä, pestään useita kertoja eetterillä, ja kuivataan vakuumissa. 15 Sakka siirretään jälleen vedellä ja liukenematon jäännös poistetaan sentrifugoimalla. Lyofilisoitu liuos antaa 800 mg tuotetta.

IV - Peptidin puhdistus 200 mg epäpuhdasta peptidiä pannaan Biogel P6-pyl-20 vään yläpäähän (halkaisija 2,5 cm, pituus 90 cm) (50 - 100 meshiä), ja eluoidaan 0,1 M etikkahapolla ja kerätään 12 ’· ml:n fraktioita seuraamalla eluointia 280 nm:n rekiste- röintilaitteella. Puhdistettu peptidi kerätään fraktioista 23 - 28.

• 25 V- Syklisointi

Puhdistettua peptidiä sisältävät fraktiot lyofili-soidaan ja jäännös siirretään jälleen 500 ml:aan IM ammo-niumvetykarbonaattipuskuria, pH 8, ja siihen kohdistetaan . : ilmaporeilu huokoisen levyn läpi 24 tunniksi. Liuos lyofi- : 30 lisoidaan ja jäännös puhdistetaan CMC 52 Whatman-pylväällä ammoniumasetaattigradientilla 0,6 mho-7 mho, pH 4, LKB Ultrograd 11300-laitteella. Happohydrolyysin jälkeen ami-nohappokoostumus on seuraava, viitaten proliiniin = 2 (teoreettiset numerot suluissa): 15 87795

Ala (1) 1,05; Arg (1) 0,83; Asp (2) 2,10; Cys (2) 1,80; Glu (3) 3,10; Gly (3) 3,30; His (1) 0,80; Leu (5) 5,2; Lys (2) 1,90; Pro (2) 2,0; Ser (3) 3,10; Thr (4) 4,15;

Tyr (1) 0,85; Vai (2) 2,1.

5

Esimerkki 2

Seuraavan kaavan (IB) mukaisen peptidin saaminen: (CH2)5 10 CO-Asn-Ser-Leu-Ser-Thr5-NH-CH-CO-Val-Leu-Gly-Lys10-Leu-

Ser-Gln-Glu-Leu15-His-Lys-Leu-Gln-Thr20-Tyr-Pro-Arg- (IB) Thr-Asp25-Val-Gly-Ala-Thr30-proamidi t-Boc-aminohapot, joissa on lateraalisia ryhmiä, 15 saadaan kuten esimerkissä 1 on esitetty.

Samalla tavalla suoritetaan puhdistetun peptidin hydrolyysi suljetussa putkessa vakuumissa 6N HCl-väliai-neessa (110 °C, 24 tuntia).

Peptidin sekvenssin 10 - 31 synteesi 20 la) Hartsin valmistus (P. Rivaille, A. Robinson, M. Kamen ja G. Milhaud, Helv., 1971, 54, 2772) .

Bentsyyliketohartsi 2 l:n kolmikaulapullossa, joka on varustettu sekoittajalla, annetaan 50 g:n polystyreeniä, jossa on mu-: 25 kana 1 % divinyylibentseeniä Bio-rad SXx (200 - 400 meshiä), turvota 350 ml:ssa nitrobentseeniä. Toisessa pullossa liuotetaan 66 g AlCl3;a 300 ml:aan nitrobentseeniä, johon on lisätty 80 ml bentsoyylikloridia. Seos kaadetaan ; ensimmäiseen pulloon hyvin sekoittaen ja pidetään kaksi I.. 30 tuntia ympäristön lämpötilassa. Jos hartsi turpoaa liikaa, lisätään nitrobentseeniä (noin 100 ml). Seos suodatetaan, pestään dioksaanilla (3 x), etikkahapolla (3 x), metano-*:*: lilla (3 x) ja lopuksi vuorotellen CH2Cl2:lla ja CH30H:lla tarkoituksena saada hartsi turpoamaan ja supistumaan kul-35 loinkin jättäen kosketusajan riittäväksi. Seos kuivataan oka i kaa l.tor I aua vakuuiuiaaa koko yön (saanto 75 g).

i6 87795

Bentshydryyliamiinihartsi 1 litran pullossa, joka on varustettu "Dean Star-killa" ja sekoittajalla, kuumennetaan 500 g ammoniumformi-aattia lämpötilaan 120 - 130 °C 1 - 2 tunniksi. Hartsi (50 5 g) lisätään kerrallaan ja lämpötilan annetaan nousta 160 -165 °C:seen puoleksi tunniksi tehokkaasti sekoittaen, ja annetaan olla 6 tuntia. Seos suodatetaan, pestään vedellä, sitten käsitellään kuin edellä bentsyyliketohartsin tapauksessa. Vakuumissa kuivattua hartsia kuumennetaan pa-10 lautusjäähdyttäen 8 tuntia 6N HCl:ssä. Sitten se suodatetaan ja pestään kuten aikaisemmin. Kiinnityskapasiteetti vaihtelee aminohapon luonteen mukaisesti välillä 0,3 ja 0,5 mmol/g.

Ib) Peptidin sekvenssin 10 - 31 valmistus 15 Käytetyssä laitteessa on mahdollista sekoittaa mekaanisesti 25 ml:n pyrexputkea, jonka keskiosa sisältää hartsia (2 g). Putken päissä olevista 2 huokoslasisuodattimes-ta on tarkoitus lisätä ja sitten poistaa reagenssit (noin 15 ml).

20 Sykli 31

Kytkentä: 2 g:aa hartsia (kiinnityskapasiteetti 0,5 mmol/g) sekoitetaan (10 min) väliaineessa CH2C12' (CH3)2NCHO (DMF) (1:1, v/v) Boc-L-pro] iinin läsnäollessa ( ?. mmol, 0,43 g).

.25 DCCl (4 mmol) ja 1 hydroksiben t soti i a tso.L ia (HOBT) (4 ; ·.. mmol) lisätään ja sekoitusta jatketaan 2 tuntia. Hartsi pestään peräkkäin CH30H:lla (1 x, 2 min), CH30H:lla, abs. (3 x, 2 min), CH2Cl2:lla (3 x, 2 min). Ninhydriinireaktio .·. : suoritetaan hartsinäytteelle: se on negatiivinen.

-.30 Aminoryhmän vapautus:

Hartsi käsitellään seoksella CF3COOH-CH2Cl2 (1:1, ..." v/v) 1 min; seos suodatetaan ja tapahtuma toistetaan anta en kosketuksen kestää 15 min. Hartsi pestään CH2Cl2:lla (3 ...: x, 1 min). CF3C00H poistetaan käsittelemällä hartsia kah- ... 35 desti Et3N/CH2Cl2 seoksella (12,5:87,5 v/v) (kosketusaika i7 87795 1 min, sitten 5 min). Seos pestään CH2Cl2:lla (8 x, 1 min). Hartsi-L-proliini titrataan: se sisältää 0,5 mmol/g pro-liinia.

Sykli 30 5 Kytkentä:

Hartsi-L-prolyyliä (1 mmol) sekoitetaan 4 mmol:n kanssa Boc-O-bentsyyli-L-treoniinia (1,23 g) CH2C12-DMF: ssä (1:1 v/v) (10 ml). DCCI (4 mmol) ja HOBT (4 mmol) lisätään ja sekoittamista jatketaan (2 h). Hartsi pestään 10 peräkkäin: CH2C12 ( 1 x, 2 min), CU ,0H abs. (3 x, 2 min), CH2C12 (3 x, 2 min). Ninhydriinireaktio on negatiivinen.

Aminoryhmän vapautus - katso sykli 31

Syklit 29 - 24 Käytetään ylläolevia kytkentä- ja vapautusprosesse-15 ja seuraavien aineiden reagoimiseen: . Sykli 29 4 mmol Boc-glysiiniä (0,71 g) . Sykli 28 4 mmol Boc-L-ala (0,76 g) . Sykli 27 4 mmol Boc-glysiiniä (0,71 g) . Sykli 26 4 mmol Boc-L-valiinia (0,87 g) 20 . Sykli 25 4 mmol Boc-L-asparagiinihapon B-bentsyylieste- . . riä (1,29 g) • . Sykli 24 4 mmol Boc-O-bentsyyli-L-treoniinia (1,24 g).

Sykli 23

Kytkentä: ‘ : 25 Syklin 24 hartsipeptidiä, joka aikaisemmin on pesty DMFrllä (2 x), sekoitetaan (10 min) 4 mmol: n kanssa Boc-N- γ -tosyyli-L-arginiinia (1,41 g) DMF-liuoksessa ja seu-raava prosessi on sama kuin syklille 30 kuvattiin.

· Sykli 22 ... 30 Kytkentä:

Syklin 23 hartsipeptidiä sekoitetaan (10 min) 4 ..." mmolrn kanssa Boc-L-proliinia (0,88 g) väliaineessa CH2C12 (10 ml). DCCI/HOBT lisätään kuten syklille 31 kuvattiin. Reaktiojakson lopussa ninhydriinireaktio oli negatiivinen. ... 35 Vapautus - katso sykli 31 is f 37795 .: 4;' \ .. -

Syklit 21 - 20 Käytetään syklissä 22 käytettyjä kytkentä- ja va-pautusprosesseja seuraavien aineiden reagoimiseen: . Sykli 21 4 mmol Boc-O-bentsyyli-L-tyrosiinia (1,49 g) 5 . Sykli 20 4 mmol Boc-O-bentsyyli-L-treoniinia (1,24 g)

Sykli 19 Kytkentä:

Syklin 20 hartsipeptidiä, joka aikaisemmin on pesty DMF:llä (2 x), sekoitetaan (10 min) 4 mmol:n kanssa Boc-10 L-glutamiini-p-nitrofenyyliesteriä (1,5 g) ja 10 ml:n kanssa DMF; johon on lisätty 1 % etikkahappoa. DCCI (4-mmol) ja HOBT (4 mmol) lisätään ja seosta sekoitetaan 48 tuntia. Hartsi pestään DMF:llä, CH2Cl2:lla, CH30H:lla, CH2C12:11a (2 x).

15 Vapautus - katso sykli 31

Sykljt 18_-_14

Sykliin 30 käytettyä prosessia käytetään seuraavien aineiden reagoimiseen: . Sykli 18 4 mmol Boc-L-leusiinia (1,0 g) 20 . Sykli 17 4 mmol Boc- t--karbobentsyylioksi-L-lysiiniä (1,52 g) . Sykli 16 4 mmol Boc-dinitro-2,4-fenyyli(im)L-histidii-niä (1,23 g) . Sykli 15 4 mmol Boc-L-leusiinia (1,0 g) 25 . Sykli 14 4 mmol Boc-L-glutamiinihapon γ-bentsyylieste- riä (1,3 g)

Sykli 13

Prosessi on sama kuin syklille 19.

Sykli 12 30 Prosessi on sama kuin syklille 30 käyttäen 4 mmol

Boc-O-bentsyyli-L-seriiniä (1,0 g).

Syklit 11 ja 10

Prosessi on sama kuin syklille 30 seuraavien ai-. .· neiden reagoimiseksi: 35 . Sykli 11: syklissä 18 käytetty johdannainen.

. Sykli 10: syklissä 17 käytetty johdannainen.

19 87795 2. Peptidin sekvenssin 1-9 synteesi 2a) Osittainen sekvenssi Boc-L-Thr (Bzl)-Asu OMe (A) Z-Asu OMe (11,2 g) viedään seokseen MeOH-H20 (2:1, v/v) ja seosta hydrataan palladiumhiilen läsnäollessa (14 h).

5 Katalyytin poistamisen jälkeen seos konsentroidaan vakuu-missa. Dioksaania (40 ml) lisätään, sitten lisätään tri-etyyliamiinia (4,2 ml), samalla jäähdyttäen, sitten lisätään Boc-L-Thr (Bzl) OSu (16 g). Sekoittamisen (72 h) jälkeen sekoitetaan joukkoon N,N-dimetyyliamino-1,3-propani-10 didiamiinia, ja seosta sekoitetaan (4 h) ja konsentroidaan sitten kolmasosaan tilavuudestaan. Se uutetaan etyyliasetaatilla (AcOEt), sitten AcOEt pestään HClrllä (IN), sitten H20:lla; sitten tislataan vakuumissa. Öljyinen jäännös siirretään.eetteriin, uutetaan NaHC03:lla (5 %), uutetaan 15 uudelleen AcOEtrllä ja pestään peräkkäin H20:lla, HClillä (IN),·, H20:lla. Uutteet kuivataan vedettömällä natriumsul-faatilla ja AcOEt erotetaan. A saadaan öljymäisen tuotteen muodossa (10 g).

2b) Osittainen sekvenssi Boc-L-Ser-(Bzl)-L-Thr-(Bzl) Asu όμθ.οηα (b).

Tuote A (5 g) liuotetaan jäähdyttäen TFA:han (15 ml). Ympäristön lämpötilassa TFA erotetaan vakuumissa ja jäännös kuivataan vakuumissa, liuotetaan sitten DMF:ään (10 ;.il) ja pH asetetaan arvoon 6 trietyyliamiinilla (4 ml) 25 äähdyttäen. Sitten lisätään HOBT (5 g) ja Boc-L-Ser (Bzl) OSu sekoittaen (3 päivää) ympäristön lämpötilassa ja pH:-Lsa 6. Lisätään N,N-dimetyyliamino-1,3-propaanidiamiinis sekoittaen (1 h), lisätään H20, ja uutetaan sen jälkeen.

: AcOEt:llä kuten edellä kuvattiin. Sykloheksyyliamiinia 30 (CHA) lisätään kuivaan AcOEt:hen ja tislataan alipaineessa. Saadaan öljymäinen tuote B (4 g).

2c) Osittainen sekvenssi Boc-L-Asn-Ser( Bzl) ‘-L-Leu-NH-Ni-'!2 (C).

... · 3 g Boc-L-Asn-L-Ser-(Bzl)-L-Leu OEt:tä liuotetaan 20 ial.: .· ·. 35 aan C-.20h, lisätään 10 ml 80 % NH2NH2H20, ja seos jätetään 20 37 79 5 14 tunniksi ympäristön lämpötilaan. Sitten se seostetaan etyylieetterillä, sakka pestään etyylieetterillä ja uudelleenko teytetään seoksesta CH3OH-AcOEt-etyylieetteri. Saadaan 2,5 g odotettua tuotetta (C).

5 2d) Osittainen sekvenssi Boc-L-Asn-L-Ser (Bzl)-L-Leu-L-

Ser (Bzl)-L-Thr (Bzl)-Asu OMe (D).

Tuote B (2 g) lisätään AcOEt:hen HCl:n (IN) läsnäollessa; seos kuivataan vedettömällä natriumsulfaatilla ja konsentroidaan vakuumissa. TFA (6 ml) lisätään kylmänä se-10 koittaen ympäristön lämpötilassa (0,5 h), sitten TFA poistetaan vakuumissa ja jäännös kuivataan vakuumissa. Jäännös liuotetaan DMFrään (2 ml) ja trietyyliamiinilla neutraloinnin jälkeen lisätään hitaasti -40 °C:ssa liuokseen, jossa on C:tä Boc-L-Asn-L-Ser(Bzl)-L-Leu-NH-NH2 (1,7 g) 15 DMF:ssä (6 ml), johon on aikaisemmin lisätty dioksaania-(2,8 ml), HCl:n (IN) ja isoamyylinitriitin (0,6 ml) läsnäollessa. pH säädetään arvoon 7 trietyyliamiinilla, ja reaktio tapahtuu 5 °C:ssa (72 h) .

Reaktioseos viedään hitaasti -5 °C:ssa 0,5N HClrään 20 (60 ml). Sakka pestään H20:lla. Uuttaminen suoritetaan . . CHCl3:lla (100 ml), ja uutteet pestään peräkkäin HCltn ve siliuoksella (IN), NaCl:llä. CHC13 poistetaan.

Tuote D seostetaan seoksella CHCl3-n-heksaani (2 g). (2e) -L-Asn-L-Ser (Bzl)-L-Leu-L-Ser (Bzl)-L-Thr (Bzl) Asu^-NH-’25 NH2: n (E) syklisointi

Tuote D (1,6 g) liuotetaan vedettömään pyridiiniin (15 ml). Lisätään TFA-ONP (2,5 g), sekoittaen 45 °C:ssa (3 h), konsentroidaan sen jälkeen vakuumissa, saostetaan etyyli-eetterillä, käsitellään TFA:11a kuten edellä, ja sitten ..'f. 30 syklisoidaan vedettömässä pyridiinissä 50 °C:ssa 5 tuntia.

Uuttaminen suoritetaan CHCl,:lla ja uutteet pestään kuten edellä, konsentroidaan vakuumissa, ja saostetaan n-heksaa-nilla.

Sakka (2 g) liuotetaan DMF:ään (5 ml) ja CH30H: ,*··. 35 hon (25 ml). 15 ml hydratsiinia (80 %) lisätään, seosta 21 87795 sekoitetaan ympäristön lämpötilassa (14 h) ja lisätään H20. Sakka suodatetaan ja pestään H20:lla. CH3OH (50 ml) lisätään ja seos kuumennetaan palautusjäähdyttäen; tuote E saostuu (0,8 g).

5 2f) Sekvenssin 1-9 valmistus: -L-Asn-L-Ser (Bzl)-L-Leu- L-Ser-(Bzl)-L-Thr (Bzl )-Asul,7-L-Val-L-Leu-Gly OH (F)

Tuote E (1 g) suspendoidaan DMF:ään (4 ml), lisätään dioksaania ja 4N HC1 (1,7 ml) -5 °C:ssa. Isoamyyli-nitriittiä (0,3 ml) lisätään -10 °C:ssa sekoittaen. L-H-10 Val-L-Leu-Gly (0,9 g) lisätään -5 eC:ssa pH:n ollessa säädetty arvoon 7 trietyyliamiinilla. Seosta sekoitetaan jäähauteessa (48 h, sitten tuote F (1 g) seostetaan 0,5N HClillä (150 ml).

3. Peptidin valmistus

15 3a) HOBT (111 mg) ja DCCL (150 mg) lisätään tuotteeseen F

(500 mg) liuotettuna DMFiään (2 ml). Sekoitetaan 72 tuntia peptidyylihartsin 10 - 31 (300 mg) läsnäollessa Lys10:n t-Boc:n poistamisen jälkeen.

3b) Peptidin lohkaisu Tam et ai.:n mukaan JACS (1983), 20 105, 6442.

Määrät viittaavat 1 g:aan peptidyylihartsia.

1) HF (2,5 ml) tiputetaan hartsipeptidin (1 g), dimetyy-lisulfidin (6,5 ml) ja p-kresolin (250 mg) seokseen, sekoittaen (1 h) 0 °C:ssa. Happo ja dimetyylisulfidi erote- .25 taan vakuumissa ja jäännös siirretään 3 kertaa 5 ml:11a ; AsOEt.

2) Kuivattu peptidyylihartsi suspendoituna dimetyylisulfi-diin (1 ml) käsitellään nestemäisellä HF:llä (10 ml) 0 °C- ;’· ssa (1 h). HF:n ja dimetyylisulfidin vakuumissa tapahtu- . 30 neen poistamisen jälkeen hartsi pestään eetterillä (3 ker taa 10 ml); peptidi siirretään etikkahappoon, saostetaan etyylieetterillä, sentrifugoidaan kylmänä, pestään useita - kertoja eetterillä, ja kuivataan vakuumissa. Sakka siir- —: retään jälleen veteen ja liukenematon jäännös poistetaan 35 sentrifugoimalla. Lyofilisoimalla liuoksesta saadaan 500 mg tuotetta.

22 87795 3c) Peptidin puhdistus 200 g epäpuhdasta peptidiä pannaan 50 - 100 meshin Biogel P6-pylvään (halkaisija 2,5 cm, pituus 90 cm) yläpäähän. Se eluoidaan 0,1M etikkahapolla ja kerätään 12 ml: n fraktioi-5 ta seuraten eluoitumista 280 nm:n rekisteröintilaitteella. Puhdistettu peptidi kerätään fraktioissa 23 - 28. Nämä fraktiot lyofilisoidaan ja jäännös puhdistetaan Whatman CMC 32 pylväällä ammoniumasetaattigradientilla 0,6 mho - 7 mho, pH 4, LKB Ultrograd 11300-laitteella.

10 Happohydrolyysin jälkeen aminohappokoostumus on seuraava, viitaten proliiniin = 2 (teoreettiset numerot suluissa):

Ala (1) 1,15; Arg (1) 0,85; Asp (2) 2,15; Glu (3) 3,10; Gly (3) 2,9; His (1) 0,83; Leu (5) 5,3; Lys (2) 1,95; 15 Pro (2) 2,0; Ser (3) 3,20; Thr (4) 4,10; Tyr (1) 0,80;

Vai (2) 2,1; Asu (1) 0,93.

Lyhenteet:

AcOEt = etyyliasetaatti

Asu = a-aminokorkkihappo 20 Bzl = bentsyyli CHA = sykloheksyyliamiini DCHA = disykloheksyyliamiini • ONP = p-nitrofenyyliesteri ·- OSu = N-hydroksisukkiini-imidiesteri '25 Z = bentsyylioksikarbonyyli

Claims (5)

23 87795

1. Menetelmä uusien, terapeuttisesti käyttökelpoisten polypeptidien valmistamiseksi, joilla on kaava (IA): 5 Cys-Asn-Aj-Leu-Ser-Thr-Cys-Ag-Leu-Gly-A11-Ai2-A13-Gln-A15-A16-A17-Lys-Aig-A2o- ( 1A) Thr-A22-Pro-A24-Thr-A26-A27-Gly-A29-Gl'y-A31-Pro-NH2 10 jossa A3 = Ser, Gly tai Ala Αθ = Vai tai Leu An = Lys tai Thr A12 = Leu tai Tyr

15 Aj= Ser tai Thr A15 = Glu tai Asp A16 = Leu tai Phe A17 = His tai Asn A19 = Leu tai Phe

20 A20 = Gin tai His . A22 = Tyr tai Phe A24 = Arg tai Gin • ; A26 = Asp, Asn tai Ala A27 = Vai, Thr tai Ile • .'25 A29 = Ala, Ser tai Vai i '· A31 = Thr, Vai tai Ala tai kaava (IB): .-:-.30 |-(CH2)5 -1 ,; CO-Asn-A ' 2-Leu-Ser-Thr-NHCHCO-A ' 7-Leu-Gly- A' 10-A ' n - A ' 12-Gln-A' 14 - A ' 15-A ' 16 - Lys-A ' 18- ( IB ) "" A' 19-Thr-A ' 21 -Pro-A ' 23-Thr-A ' /s-A ' X(i-Gly-A ' 28- *:·! Gly-A 130-Pro-NH2 35 87795 jossa A'2 = Ser, Gly tai Ala A'7 = Vai tai Leu A'10 = Lys tai Thr A'n = Leu tai Tyr

5 A'12 = Ser tai Thr A114 = Glu tai Asp A'15 = Leu tai Phe A' 16 = His tai Asn A' 18 = Leu tai Phe

10 A11? = Gin tai His A1= Tyr tai Phe A'23 = Arg tai Gin A',,, = Asp, Asn tai Ala A' 2l, = Vai, Thr tai Ile

15 A12β = Ala, Ser tai Vai A' 30 = Thr, Vai tai Ala jolloin kaavan (IB) mukaiset yhdisteet sisältävät a-amino-korkkihappoa (Asu), jossa ω-karboksyyli on liittynyt 20 Asn:n aminoryhmään, tunnettu siitä, että tarvit- . . tavat aminohapot, peptidit tai niiden yhdistelmät konden- soidaan kaavojen (IA) ja (IB) mukaisten aminohapposekvens-; sien järjestyksessä, ja valmistettaessa kaavan (IB) mukai sia tuotteita, yhdistetään kiinteäfaasimenetelmä sekvens-- 25 sin 10 - 31 saamiseksi ja klassinen nestefaasimenetelmä sekvenssin 1-9 saamiseksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan (IÄ) mu-"kainen polypeptidi, jossa symboli A8 on väliini.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan (IB) mukainen polypeptidi, jossa symboli A'7 on väliini.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan tuote, jolla on 35 kaava (IA): 25 87795 Cys-Asn-Ser-Leu-Ser5-Thr-Cys-Val-Leu-Gly10-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu15-Leu-His-Lys-Leu-Gln20- (IA) Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr2ii-Asp-Val-Gly-Ala-Gly30-5 Thr-proamidi

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan tuote, jolla on kaava (IB): 10 ,-(CH2)5--1 CO-Asn-Ser-Leu-Ser-Thr5-NH-CH-CO-Val-Leu-Gly-Lys10-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu15-His-Lys-Leu- (IB) Gln-Thr20-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp2,-Val - Gly-Ala-15 Gly-Thr30-proamidi 26 87795