FI86558C - Dna- sekvenser, rekombinant-dna- molekyler och foerfaranden foer framstaellning av humant interferon av -typ och val av dna-sekvensen. - Google Patents

Description

1 86558 DNA-sekvenssejä, yhdistelmä-DNA-molekyylejä ja menetelmiä ihmisen et-tyyppiä olevan interferonin valmistamiseksi ja DNA-sekvenssien valitsemiseksi 5 Tämä keksintö kohdistuu DNA-sekvensseihin, yhdistel- mä-DNA-molekyyleihin ja menetelmiin interferonin ja interferonin kaltaisten polypeptidien valmistamiseksi. Tarkemmin määriteltynä keksintö kohdistuu DNA-sekvensseihin, jotka ekspressoituvat sopivissa isäntäorganismeissa. Keksinnön 10 suojapiiriin kuuluville yhdistelmä-DNA-molekyyleille on ominaista, että ne sisältävät DNA-sekvenssejä, jotka koo-daavat polypeptidejä, joilla on ihmisen leukosyytti-interferonin immunologinen tai biologinen aktiivisuus. Seu-raavasta keksinnön kuvauksesta ilmenee, että keksinnön rau-15 kaisia DNA-sekvenssejä, yhdistelmä-DNA-molekyylejä ja menetelmiä voidaan käyttää sellaisten polypeptidien valmistukseen, jotka ovat käyttökelpoisia virustautien, kasvainten ja syövän hoidossa.

Tässä hakemuksessa käytetään julkaisussa Nature 286 20 (July 10, 1980) 2421 esitettyä interferonien nimistöä. Tämä nimistö korvaa hakijan aikaisemmissa hakemuksissa käytetyn nimistön (joista hakemuksista prioriteettia haetaan esillä olevalle hakemukselle). Esimerkiksi IF merkitään nyt IFNillä, ja leukosyytti-interferonia merkitään IFN-0(:lla.

25 Interferoneista ("IFN") tunnetaan kaksi luokkaa.

Luokkaan I kuuluvat interferonit ovat pieniä, hapoille stabiileja (glyko)-proteiineja, joiden ansiosta solut tulevat vastustuskykyisiksi virusinfektiolle /A. Isaacs & J. Lindemann, Virus Interference I. The Interferon, Proc.

30 Royal Soc. Ser. B 1947 (1957) 258-267 ja W.E. Stewart, II, The Interferon System, Springer-Verlag (1979) (käytetään tästä lähtien viittausta "The Interferon System")J. IFN-interferonit ovat jossakin määrin soluspesifisiä, mutta eivät virusspesifisiä. Sitä vastoin IFN-interferonit suojaa-: 35 vat soluja hyvin erilaisia viruksia vastaan.

Ihmisen interferonit ("HuIFN") on luokiteltu kolmeen ryhmään. HuIFN-Ofcaa eli leukosyytti-interferonia syntyy 2 86558 ihmisen valkosoluissa ja pienen HuIFN-/J-määrän (fibroblasti-interferoni) ohella lymfoblastoidisoluissa. HuIFN-Ot on puhdistettu homogeeniseksi yhdisteeksi ja karakterisoitu /esim. M. Rubenstein et ai., Human Leycosyte Interferon: Production, 5 Purification To Homogeinity And Initial Characterization, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76 (1979) 640-6447. Sen koko on heterogeeninen oletettavasti hiilihydraattiosan ansiosta. Kaksi komponenttia on kuvattu, toisen molekyylipaino on 21 000 - 22 000 ja toisen 15 000 - 18 000. Komponentin, 10 jolla on pienempi molekyylipaino, on havaittu esiintyvän ei-glykosyloidussa muodossa. Saman HuIFN-Ot-komponentin on myös havaittu säilyttävän suurimman osan tai kaiken HuIFN-Ä-aktiivisuudestaan /w.E. Stewart, II et ai., Effect of Glykosylation Inhibitors On The Production And Properties 15 of Human Leucocyte Interferon, Virology 97 (1979) 473-4767. Osa lymfoblastoidisoluista eristetyn HuIFN-Ofcn aminohappo-sekvenssistä ja sen aminohappokoostumus on selvitetty /k.C. Zoon et ai., Amino Terminal Sequence Of The Major Component Of Human Lymphoblastoid Interferon, Science 207 (1980) 20 527-528, ja M. Hunkapiller & L. Hood, henkilökohtainen tie donanto (1980).7.

Interferonin HuIFN-Ot on myös havaittu esiintyvän - - useissa eri muodoissa (esim. GB-patenttijulkaisu nro 2 037 296 A). Nämä muodot näyttävät eroavan toisistaan ra-25 kenteellisesti ja fysiologisesti. Näille HuIFN-Ot:n muodoil-le ei ole mitään vakiintunutta nimistöä. Sen tähden tässä hakemuksessa kutakin muotoa merkitään numerolla yleisen HuIFN-0(-merkinnän jälkeen, esim. HuIFN-Äl tai HuIFN-0t3.

HuIFN-Ot voi monien ihmisproteiinien tapaan olla 30 myös polymorfinen. Sen vuoksi eri yksilöiden solut voivat tuottaa yleisempään HuIFN-Ot-ryhmään tai sen eri muotoihin kuuluvia lajeja, jotka ovat fysiologisesti samanlaisia, mutta rakenteellisesti hieman erilaisia kuin ryhmä tai muoto, johon laki kuuluu. Tästä johtuu, että vaikkakin 35 HuIFN-C(:n proteiinirakenne saattaa olla yleisesti ottaen tarkoin määritetty, tietyt yksilöt voivat tuottaa HuIFN-0fc-interferonia, jonka rakenne hieman poikkeaa määritetystä, 3 8 6 5 E 8 eron ollessa kuitenkin vähemmän jyrkkä kuin eri HuIFN-OC-muotojen välillä.

HuIFN ei ole tavallisesti todettavissa normaaleista tai terveistä soluista (The Interferon System, 55-57). Sitä 5 vastoin proteiinia muodostuu sen seurauksena, että solu joutuu kosketukseen IFN-indusoijän kanssa. IFN-indusoijät ovat tavallisesti viruksia, mutta ne voivat olla myös luonteeltaan ei-viruksia, kuten luonnollista tai synteettistä kaksijuosteista RNArta, solunsisäisiä mikrobeja, mikrobi-10 tuotteita tai erilaisia kemiallisia aineita. Lukuisia yrityksiä on tehty, jotta pystyttäisiin hyödyntämään näitä ei-virusperäisiä indusoijia siten, että saataisiin ne tekemään ihmissolut vastustuskykyisiksi virusinfektiolle /S. Baron ja F. Dianzani (toim.), Texas Reports On Biology And 15 Medicine, 35 (1977) ("Texas Reports") 528-5407. Nämä yritykset eivät ole olleet erityisen menestyksellisiä. Nyt pidetään sen sijaan parempana ulkoisen HuIFN-interferonin käyttöä.

Virussairauksien, kasvainten ja syövän hoidossa in-20 terferoniterapiaa on toteutettu käyttäen eri suuruisia annoksia ja useita eri annostelumuotoja (The Interferon System, 305-321). Interferonia on menestyksellisesti annettu poti-laille esimerkiksi suun kautta, rokottomalla (suoneen, li-hakseen, nenään, ihonsisäisesti ja ihonalaisesti) sekä sil- 25 mätippoina, voiteina ja suihkeina. Sitä on tavallisesti an- : 4 7 nettu 1-3 kertaa päivässä annosten ollessa 10 - 10 yk sikköä. Terapian määrä riippuu potilaasta ja tautitilasta. Esimerkiksi virusinfektioita hoidetaan tavallisesti antamalla interferoniannoksia kerran tai kaksi kertaa vuorokau-20 dessa hoitojakson vaihdellessa muutamasta päivästä kahteen viikkoon, ja kasvaimia tai syöpää hoidetaan tavallisesti antamalla interferoniannoksia kerran tai monta kertaa vuorokaudessa useiden kuukausien tai vuosien ajan. Tietylle potilaalle annettavan tehokkaimman hoitotavan määrää luon-35 nollisesti häntä hoitava lääkäri, joka tällöin ottaa huomioon sellaiset hyvin tunnetut seikat, kuten tautitilan, aikaisemman hoidon ja potilaan reaktion interferonille.

4 86558

Viruksia tuhoavana aineena HuIFN-interferonia on käytetty seuraavien tautien hoitoon: hengitysteiden infektiot (Texas Reports, 486-496), herpes simplex keratitis (Texas Reports, 497-500), akuutti hemorrhagic conjunctivitis 5 (Texas Reports, 501-510), varicella zoster (Texas Reports, 511-515), sytomegalovirusinfektio (Texas Reports, 523-527) ja hepatitis B (Texas Reports, 516-522). Katso myös The Interferon System, 307-319. IFN-interferonin käyttö viruksia tuhoavan aineena laajassa mittakaavassa edellyttää kui-10 tenkin suurempia määriä IFNrää kuin tähän asti on ollut saatavissa. HuIFN vaikuttaa myös muilla tavoilla kuin viruksia tuhoavasti. Se esimerkiksi vastustaa pesäkkeitä stimuloivien tekijöiden vaikutusta, estää hemopoieettisten pesäkkeitä muodostavien solujen kasvua ja häiritsee granulo-15 syyttien ja makrofagien esiasteiden normaalia erilaistumista (Texas Reports 343-349). Se estää myös orytroidien erilaistumista DMSOrlla käsitellyissä Friend-leukemiasoluissa (Texas Reports, 420-428). HuIFN voi mahdollisesti vaikuttaa myös immunivastineen säätelyyn. Riippuen annoksen suuruu-20 desta ja annosteluajasta antigeenin suhteen HuIFN-OC voi olla sekä immunivastinetta vahvistava että sitä heikentävä in vitro ja in vivo (Texas Reports, 357-369). Lisäksi tietyllä tavalla herkistettyjen lymfosyyttien on havaittu tuottavan HuIFN-o(-interferonia joutuessaan kosketukseen antigee-25 nin kanssa. Tällainen antigeenin indusoima HuIFN- voisi siten olla immunivastineen säätelijä vaikuttaen sekä kiertävien antigeenien pitoisuuteen että soluimmuniteetin ilmentymiseen (Texas Reports, 370-374). HuIFN:n tiedetään myös lisäävän tappajalymfosyyttien aktiivisuutta ja vasta-30 aineista riippuvaa soluvälitteistä sytotoksisuutta /R.R. Herberman et ai., Augmentation By Interferon Of Human Natural And Antibody Dependant Cell-Mediated Cytotoxicity, Nature 277 (1979) 221-223, P. Beverley & D. Knight, Killing Comes Naturally, Nature 278 (1979) 119-120, Texas Reports, 35 375-38Q7· Molemmat lajit osallistuvat luultavasti immuno logiseen hyökkäykseen kasvainsoluissa.

5 86558 Täten sen lisäksi, että HuIFN-interferonia voidaan käyttää viruksia tuhoavana aineena, sitä voidaan myös tehokkaasti soveltaa kasvainten ja syövän hoitoon (The Interferon System, 319-321). Nykyään tiedetään, että IFN-inter-5 feronit vaikuttavat monenlaatuisten kasvainten kasvuun monilla eläimillä (The Interferon System, 292-304). Ne näyttävät vaikuttavan tehokkaimmin monien muiden kasvaimia tuhoavien aineiden tavoin pieniin kasvaimiin. Eläinten IFN-interferonin kasvaimia tuhoava vaikutus riippuu annoksesta, 10 mutta sillä on saatu tuloksia käytettäessä annoksia, jotka alittavat myrkyllisyysrajat. Täten IFN:n kasvaimia ja syöpää tuhoavia ominaisuuksia on tutkittu laajalti, lukuisia kliinisiä kokeita on tehty, ja tutkimuksia tullaan jatkamaan tulevaisuudessakin. Tällaisiin kliinisiin kokeisiin 15 kuuluvat useiden pahanlaatuisten tautien hoito, kuten osteo-sarkooman, akuutin myeloidileukemian, multippelimyelooman ja Hodgkinsin taudin hoito (Texas Reports, 429-435). Lisäksi HuIFN-interferonin on äskettäin havaittu aiheuttavan paikallisesti annettuna kasvainkudoksen muuttumista normaa-20 likudokseksi injektoitaessa sitä ihonalaisiin kasvainkyh-myihin melanooma- ja rintasyöpäpotilailla /Ϊ. Nemoto et ai., Human Interferons And Intralesional Therapy Of Melanoma And Breast Caecinoma, Amer. Assoc. For Cancer Research, Abs. nro 994 (1979) 2467· Vaikka näistä kliinisistä kokeista 25 saadut tulokset ovat rohkaisevia, IFN:n käyttöä kasvainten ja syövän hoitoon on suuresti rajoittanut se, että puhdistettua IFN-interferonia ei ole riittävästi saatavissa.

Nykyään HuIFN-OC-interferonia valmistetaan joko ihmis-solujen kudosviljelmistä tai verenluovuttajien verestä eris-30 tetyistä ihmisen leukosyyteistä. 2,6 x 10 IU raakaa HuIFN-Ä-interferonia on saatu 800 litrasta viljeltyjä Namalva-solu-ja (P.J. Bridgen et ai., edellä). Hyvin suurissa veripalve-lukeskuksissa, esim. Suomen Punaisen Ristin veripalvelu-keskuksessa Helsingissä mainitun interferonin tuottokapasi-35 teetti on noin 1011 IU vuosittain. Koska tyypillinen annos on 3 x 106 IU potilasta kohti päivässä, näistä lähteistä ei saada riittäviä kaupallisia määriä HuIFN-ofc-interferonia.

6 8 6 5 R

v V/ u/ U

Täten HuIFN-Ct:n valmistus muilla menetelmillä olisi toivottavaa. Koska IFN-QC:n ominaisaktiivisuus on korkea, suuruus- 8 9 luokkaa 4,0 x 10 - 10 IU/mg, kaupalliseen käyttöön tar vittava HuIFN-oc-interferonin määrä on pieni. Esimerkiksi 5 100 g:sta puhdasta HuIFN-ot-interferonia saataisiin 3-30 miljoonaa annosta.

Viimeaikaiset edistysaskeleet molekyylibiologian alalla ovat tehneet mahdolliseksi liittää tiettyjä ei-baktee-rien eukaryoottiproteiineja koodaava DNA-sekvenssi baktee-10 risoluihin. Yleispiirteittäin sellaisen DNA:n ollessa kyseessä, joka on valmistettu muulla tavalla kuin kemiallisella synteesillä, tällaisen yhdistelmä-DNA:n valmistus koostuu seuraavista vaiheista: valmistetaan yksijuosteinen DNA-kopio (cDNA) puhdistetusta halutun proteiinin lähetti-15 RNA-muotista (mRNA-muotista), muutetaan cDNA kaksijuostei-seksi DNA:ksi, liitetään DNA sopivan kloonausvektorin sopivaan kohtaan yhdistelmä-DNA-molekyylin muodostamiseksi ja transformoidaan sopiva isäntäorganismi tällä yhdistelmä-DNA-molekyy1 il1ä. Tällaisen transformaation ansiosta isän-20 tä mahdollisesti pystyy tuottamaan haluttua proteiinia.

Useita ei-bakteeriproteiineja ja geenejä on tuotettu E. colissa yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttämällä. Näitä ovat proteiini, josta on löydetty rotan proinsuliinin anti-geenideterminantit /L. Villa-Komaroff et ai., A Bacterial 25 Clone Synthesizing Proinsulin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978) 3727-37217, rotan kasvuhormoni /R.H. Seeburg et al., Synthesis Of Growth Hormone By Bacteria, Nature 276 (1978) 795-7987, hiiren dihydrofolaattireduktaasi fA.C.Y. Chang et al., Phenotypic Expression In E. coli Of A 30 DNA Sequence Coding For Mouse Dihydrofolate Reductase,

Nature 275 (1978) 617-6247, ihmisen somatostätiini /k.

Itakura et al., Expression In Escherichia coli Of A Chemically Synthesized Gene For The Hormone Somatostatin, Science 198 (1977) 1056-1063, eurooppalaiset patenttiha-35 kemukset nro 0 001 929, 0 001 930 ja 0 001 931 ja vastaavat hakemukset muissa maissa/, ihmisen insuliinin A- ja B-polypeptidiketjut /D.V. Goeddel et al., Expression In 7 86558

Escherichia coli Of Chemically Synthesized Genes For Human Insulin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 106-110 ja eurooppalaiset ja vastaavat patenttijulkaisut, yllä/, ihmisen hepatitis-B-viruksen antigeenit /t.J. Burrell et al.f 5 Expression In Escherichia coli: Of Hepatitis B Virus DNA Sequences Cloned In Plasmid pBR322, Nature 279 (1979) 43-47 ja M. Pasek et al., Hepatitis B Virus Genes And Their Expression In E. Coli, Nature (1979) 575-579/, ihmisen kasvuhormon i /ϊ> .V. Gooddel et a)., Direct Expression In 10 Escherichia coli Of Λ DNA Sequence Coding For Human Growth Hormone, Nature 281 (1979) 544-551/, antigeeni SV40 t /T.M. Roberts et al., Synthesis Of Simian Virus 40 t Antigen In Escherichia coli, Proc. Natl. Acad. Sci USA 76 (1979) 5596-5600/ ja ihmisen fibroblasti-interferoni 15 (HuIFN-/3) /T. Taniguchi et al. , Construction And Identification Of A Bacterial Plasmid Containing The Human Fibroblast Interferon Gene Sequence, Proc. Japan Acad., 55 (1979) Ser. B 464-469 sekä henkilökohtainen tiedonanto 1980/.

20 Mikään näistä yhdistelmä-DNA-menetelmistä ei ole kuitenkaan esillä olevan hakemuksen tavoin kohdistunut IluIFN-OC-interfcronin synteesiin. Esillä oleva hakemus kohdistuu nimenomaan tämän ongelman ratkaisuun. Siihen verrattuna edellä luetellut yhdistelmä-DNA-tuotteet ovat helpom-25 pia valmistaa, koska näissä tapauksissa synteettisen geenin valmistamiseen tarvittava sekvenssi-informaatio on käytettävissä (esim. somatostatiini) tai on käytettävissä solu-tyyppi tai virus, joka sisältää runsaasti tiettyä DNA-sek-venssiä (esim. hepatitis-virusantigeeni) tai tiettyä mRNA-30 lajia (esim. rotan insuliini), jonka avulla on mahdollista valmistaa ja identifioida haluttua hybridi-DNA:ta sisältäviä bakteeriklooneja, tai menetelmä, jonka avulla pystytään erottamaan E. coli-isäntäorganismit, jotka ekspressoivat halutun proteiinin (esim. hiiren dihydrofolaattireduktaasi). 35 Ongelman ratkaisua ei myöskään helpota tieto, että on olemassa plasmidi, jonka sanotaan sisältävän DNA-sekvenssin, joka hybridisoituu poly(A)RNA-seoksessa olevan mRNA:n kanssa, 8 86558 jolloin mainittu mRNA tuottaa HuIFN-/3-aktiivisuutta varhais-munasoluissa (esim. fibrobasti-interferoni). Ongelman ratkaisua ei myöskään auta tieto menetelmästä, jolla voidaan mahdollisesti valmistaa puhdasta tai käytännöllisesti kat-5 soen puhdasta HuIFN-OLmRNA: ta ennen HuIFN-of-geenin kloonausta /Research Disclosure nro 18309 (1979) 361-3627·

Lopuksi on tunnustettava, että DNA-sekvenssin valinta tai sellaisen yhdistelmä-DNA-molekyylin valmistaminen, joka hybridisoituu poly(A)RNA-seoksessa olevan mRNA:n kansio sa ja joka mRNA tuottaa HuIFN-aktiivisuutta varhaismuna- soluissa, ei riitä osoittamaan, että kyseinen DNA-sekvenssi tai yhdistelmä-DNA-molekyylin hybridisekvenssi koodaa HuIFN-interferonia. Vasta silloin, kun on pystytty tuottamaan polypeptidi, jolla on HuIFNrn immunologinen tai biologinen 15 aktiivisuus, voidaan olla varmoja siitä, että valittu DNA-sekvenssi tai valmistettu yhdistelmä-DNA-molekyyli koodaa HuIFN-interferonia. Vielä tärkeämpää on, että vasta sitten, kun HuIFN-aktiivisuus on osoitettu, kyseistä DNA-sekvenssiä, yhdistelmä-DNA-molekyyliä tai niitä vastaavia sekvenssejä 20 voidaan käyttää muiden HuIFN-interferonia vastaavien sekvenssien toteamiseen esillä olevan keksinnön mukaisesti.

Edellä esitetyn perusteella on selvää, että HuIFN-06-interferonin valmistus yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttämällä eroaa huomattavasti edellä mainituista menetelmistä.

25 Tässä menetelmässä tietty DNA-sekvenssi, jolla on tuntematon rakenne (joka koodaa HuIFN-Οϋη ekspressoitumista sopivassa isäntäorganismissa), täytyy löytää hyvin suuren määrän erilaisia DNA-sekvenssejä sisältävästä joukosta ja erottaa siitä, jotta sitä voitaisiin käyttää HuIFN-Ofcn valmis-30 tukseen. Lisäksi tätä paikallistamis- ja erotusongelmaa vaikeuttaa se, että halutun DNA-sekvenssin pitoisuus monimutkaisessa seoksessa on todennäköisesti erittäin pieni sekä se, että ei ole olemassa tehokkaita keinoja seoksen lukuisien DNA-sekvenssien nopeaan analysoimiseen halutun 35 DNA-sekvenssin erottamiseksi.

Esillä olevan keksinnön mukaan DNA-sekvenssit, jotka koodaavat HuIFN-Ofcn ekspressoitumista sopivassa isäntä- 9 86558 organismissa, on paikallistettu ja erotettu, jolloin on saatu DNA-sekvenssejä, yhdistelmä-DNA-molekyylejä ja menetelmiä, joilla isäntäorganismi on transformoitu ja tämän avulla valmistettu sellainen polypeptidi, jolla on ihmisen leu-5 kosyytti-interferonin immunologinen tai biologinen aktiivisuus .

Esillä olevan keksinnön avulla on mahdollista valmistaa polypeptidi tai polypeptidejä, joilla on HuIFN-Q£:n immunologinen tai biologinen aktiivisuus ja joita täten 10 voidaan käyttää virussairauksien, kasvainten ja syövän hoitoaineisiin ja -menetelmiin. Esillä olevan keksinnön avulla näitä polypeptidejä voidaan valmistaa toistaiseksi tuntemattomilla menetelmillä huomattavasti suurempia määriä kuin aikaisemmin.

15 Kuten seuraavasta keksinnön kuvauksesta ilmenee, esillä olevan keksinnön mukaiset DNA-sekvenssit ja yhdistel-mä-DNA-molekyylit pystyvät ohjaamaan sopivassa isäntäorga-nismissa sellaisen polypeptidin tuotantoa, jolla on HuIFN-Ojn immunologinen tai biologinen aktiivisuus. Rep-20 likoimalla näitä DNA-sekvenssejä ja yhdistelmä-DNA-mole- kyylejä sopivassa isäntäorganismissa pystytään valmistamaan myös suuria määriä näitä polypeptidejä koodaavia geenejä. Näiden polypeptidien ja geenien molekyylirakenne ja ominaisuudet voidaan helposti määrittää. Polypeptidit ja geenit 25 ovat käyttökelpoisia joko sellaisenaan isäntäorganismissa muodostuneina tuotteina tai sopivina johdannaisina tai modifikaatioina koostumuksissa ja menetelmissä, joilla voidaan seurata ja parantaa näiden tuotteiden tuotantoa tai joita voidaan käyttää virustautien, kasvainten ja syövän hoito-30 aineissa ja -menetelmissä.

Tämä menetelmä eroaa siten aikaisemmin tunnetuista menetelmistä siinä, että tässä menetelmässä aikaisemmin tunnetuista menetelmistä poiketen valmistetaan ja erotetaan DNA-sekvenssejä ja yhdistelmä-DNA-molekyylejä, jotka sisäl-35 tävät sopivia DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat ainakin yhtä polypeptidiä, jolla on HuIFN-Cfcn immunologinen tai biologinen aktiivisuus. Keksinnön mukaisille DNA-sekvensseille ja menetelmille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa esitetään.

ίο 8 6 5 b 8

Seuraavasta keksinnön kuvauksesta ilmenee, että keksinnössä olennaisinta on DNA-sekvenssi, jolle on tunnusomaista, että se koodaa polypeptidiä, jolla on HuIFN:n immunologinen tai biologinen aktiivisuus ja joka on erotettu 5 DNA-sekvenssiryhmästä, johon kuuluvat DNA-sekvenssit Z-pBR322 (Pst)/HcIF-4c, Z-pBR322(Pst)/HcIF-2h, Z-pBR322 (Pst)/HcIF-SN35, Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN42, Z-pKT287(Pst)/ HcIF-2h-AH6, DNA-sekvenssit, jotka hybridisoituvat joidenkin edellä mainittujen DNA-sekvenssien kanssa, mistä tahan-10 sa lähteestä peräisin olevat DNA-sekvenssit, kuten luonnon DNA-sekvenssit tai synteettiset tai puolisynteettiset DNA-sekvenssit, jotka ovat minkä tahansa edellä mainittujen DNA-sekvenssien tai inserttien mutaatioita (mutaatioiksi luetaan yksinkertaiset ja moninkertaiset mutaatiot, emässubsti-15 tuutiot, deleetiot, insertiot ja inversiot), ja DNA-sekvenssit, jotka koostuvat kodonisekvensseistä, jotka ekspressoitues-saan koodaavat polypeptidiä, jolla on samanlainen immunologinen tai biologinen aktiivisuus kuin polypeptidillä, jota minkä tahansa edellä mainitun DNA-sekvenssin kodonit 20 ekspressoituessaan koodaavat, keksinnön toisen olennaisen piirteen ollessa siinä, että näiden sekvenssien avulla pystytään valmistamaan interferonia ja interferonin kaltaisia polypeptidejä isäntäorganismeissa.

Kuvio 1 esittää erään tämän keksinnön mukaisen suo-25 ritusmuodon kaaviokuvaa, jonka avulla valmistetaan yhdistei-mä-DNA-molekyylien seos, jolloin joillekin näistä molekyyleistä on tunnusomaista, että niihin on liittynyt DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat esillä olevan keksinnön mukaisia polypeptidejä.

30 Kuviossa 2 on esitetty kaaviokuva esillä olevan kek sinnön mukaisesta alustavasta kloonien erotusmenetelmästä.

Kuviossa 3 on esitetty kaaviokuva eräästä kloonien erotusmenetelmän suoritusmuodosta, jossa käytetään esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettuja DNA-sekvenssejä.

35 Kuvio 4 esittää erään esillä olevan keksinnön mu kaisen kloonin restriktiokarttaa. Restriktiokohtien sijainnit perustuvat fragmenttien kokolajitteluun agaroosigeeli— elektrofoneesin avulla.

11 86558

Kuvioista 8-10 ilmenee näiden restriktiokohtien sijainti määritettynä nukleotidisekvenssitietojen avulla.

Kuvio 5 esittää kaaviokuvaa menetelmästä, jolla voidaan määrittää erääseen esillä olevan keksinnön mukaiseen 5 yhdistelmä-DNA-molekyyliin liitetyn DNA-sekvenssin orientaatio .

Kuviosta 6 ilmenee eräiden esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä käyttökelpoisten kloonausvektorei-den osittaiset nukleotidisekvenssit.

10 Kuvio 7 esittää tuloksia, jotka on saatu esillä ole van keksinnön mukaisesta bakteeriviljelmästä eristetyn pintanesteen fraktioinnista (Sephadex G-100).

Kuviot 8-10 esittävät esillä olevan keksinnön mukaiseen yhdistelmä-DNA-molekyyliin liitetyn DNA-sekvenssin 15 nukleotidisekvenssiä. Sekvenssi on numeroitu alkaen

PolyG-5'-päätä seuraavasta nukleotidista ja jatkuen polyA-ryhmiä ja polyC-3'-päitä edeltävään nukleotidiin. Nukleotidit 57-125 muodostavat signaalisekvenssin ja nukleotidit 126-626 "kypsää" interferonia koodaavan alueen ja pääte-20 kodonin. Signaalisekvenssin aminohapposekvenssi on merkitty sen nukleotidisekvenssin yläpuolelle (matalammat kirjaimet) "kypsän" interferonin aminohapposekvenssi sen nukleotidi-.!'! sekvenssin yläpuolelle (korkeammat kirjaimet) . Tämän geenin sisältämät eri endonukleaasien tunnistuskohdat on myös 25 merkitty kuvioihin 8-10, jolloin nämä kohdat on määritelty nukleotidisekvenssitietoja analysoimalla.

Kuviossa 11 on kaavionomaisesti vertailtu esillä olevan keksinnön mukaisten yhdistelmä-DNA-molekyylien kahden DNA-insertin restriktiokarttaa.

30 Kuviot 12-16 esittävät esillä olevan keksinnön mu kaisten yhdistelmä-DNA-molekyylien kahden DNA-insertin nukleotidisekvenssejä. Sekvenssit on numeroitu polyG-5'-päätä seuraavasta nukleotidista alkaen ja jatkuen polyA-ryhmiä ja polyC-3'-päitä edeltävään nukleotidiin. Kunkin 35 DNA-insertin signaalisekvenssin aminohappojärjestys on merkitty vastaavan nukleotidisekvenssin yläpuolelle matalammilla kirjaimilla ja "kypsän" interferonin aminohapposek- i2 86558 venssi on merkitty nukleotidisekvenssin yläpuolelle korkeammilla kirjaimilla.

Kuvio 17 esittää Z-pBR322(Pst)/HcIF-II-206:n osittaista restriktiokarttaa ja kuvioissa 12-16 esitetyn Hif-5 II-206-fragmentin nukleotidisekvenssin määrityksessä käytettyä menetelmää.

Kuvio 18 esittää eräiden Hif-2h-fragmentin kanssa hybridisoituvien hybridifagien osittaisia restriktiokartto-ja.

10 Kuvio 19 esittää hybridi-DNA-insertin Z-pBR233Pst/

HchrIF-35HBotosittaista restriktiokarttaa ja sen nukleotidisekvenssin määrityksessä käytettyä menetelmää.

Kuviot 20-23 esittävät Heh rl F-3 5 HB oi-f ragmentin nuk-leotidisekvenssiä ja siitä johdettua aminohapposekvenssiä.

15 Kuvio 24 esittää HuIFN-0C:aa koodaavien geenien osit taisia liittymisalueita. Nuolet osoittavat alueita, jotka muodostavat R-silmukoita indusoidun leukosyytti-poly(A)-RNA:n kanssa. Ristiviivoitettu kohta (chr-16) osoittaa alueen, joka oli johdettu alustavista kokeista, mutta joka 20 ei tullut esille R-silmukkakartoituksella.

Kuvio 25 esittää kaaviokuvaa plasmidin C8-IFN-CC1 valmistuksesta.

Kuvio 26 esittää kaaviokuvaa plasmidin LAC-AUG (ot2) valmistuksesta.

25 Kuvio 27 esittää AUG-initiaatiokodonin ja CYS-alku- kodonin uudelleenkonstruointia LAC-AUG (OC2):n valmistuksessa.

Kuvio 28 esittää kaaviokuvaa plasmidin C8-IFN-OC2 ja hybridimolekyylien I, II, III ja IV valmistuksesta.

Kuviot 29-32 esittävät IFN-<X4b:tä vastaavaa nukleo-30 tidisekvenssiä ja aminohapposekvenssiä ja sen signaalisek-venssiä.

Keksinnön kuvauksessa käytetään seuraavia termejä:

Nukleotidi: Monomeerinen DNA- tai RNA-yksikkö, joka koostuu sokeriosasta (pentoosi), fosfaatista ja hetero-35 syklisestä typpiemäksestä. Emäs on liittynyt sokeriosaan glykosidisen hiilen välityksellä (pentoosin l'-hiili). Emäksen ja sokerin yhdistelmää nimitetään nukleosidiksi. Kukin 13 36558 nukleotidi krakterisoidaan sen sisältämän emäksen perusteella. Neljä DNA-emästä ovat adeniini ("A"), guaniini ("G"), sytosiini ("C") ja tyrniini ("T"). Neljä RNA-emästä ovat A, G, C ja urasiili ("U").

5 DNA-sekvenssi: Lineaarinen nukleotidiketju, jossa nukleotidit ovat liittyneet toisiinsa fosfodiesterisidok-silla vierekkäisten pentoosien 3'- ja 5'-hiilistä.

Kodoni: Kolmen nukleotidin muodostama DNA-sekvenssi (tripletti), joka koodaa mRNA:n välityksellä aminohappoa, 10 translaation aloitussignaalia tai translaation terminaatio-signaalia. Esimerkiksi nukleotiditripletit TTA, TTAG, CTT, CTC, CTA ja CTG koodaavat leusiini-aminohappoa, TAG, TAA ja TGA ovat translaation päätesignaaleja ja ATG on translaation aloitussignaali.

15 Lukukehys; Kodonien ryhmitys mRNA:n transloituessa aminohapposekvensseiksi. Translaation aikana oikea lukukehys täytyy säilyttää. Esimerkiksi sekvenssi GCTGGTTGTAAC voidaan transloida kolmessa lukukehyksessä eli faasissa, joista kukin tuottaa eri aminohapposekvenssin: 20 GCT GGT TGT AAG—Ala-Gly-Cys-Lys G CRG GRR GRA AG—Leu-Val-Val GC TGG TTG TAA G—Trp-Leu-(STOP)

Polypeptidi: Lineaarinen aminohappoketju, jossa aminohapot ovat liittyneet toisiinsa peptidisidoksella, joka 25 muodostuu viereisten aminohappojen Ot-aminoryhmän ja karbok-syyliryhmän välille.

Genomi: Solun tai viruksen DNA kokonaisuudessaan.

Se sisältää inter alia organismin polypeptidejä koodaavat rakennegeenit, sekä operaattorin, promootterin ja sekvens-30 sit ribosomeihin kiinnittymistä varten sekä ribosomivuoro-vaikutussekvenssit, mm. Shine-Dalgarno-sekvenssit.

Rakennegeeni: DNA-sekvenssi, joka koodaa muottinsa eli lähetti-RNA:n (mRNA) välityksellä kullekin polypepti-dille tyypillistä aminohapposekvenssiä.

35 Transskriptio: Prosessi, jolla mRNA muodostuu raken- negeenistä.

14 86 558

Translaatio: Prosessi, jolla polypeptidi muodostuu mRNArsta.

Ekspressio: Prosessi, jolla rakennegeeni aiheuttaa polypeptidin muodostumisen. Se on transskription ja tans-5 laation yhdistelmä.

Plasmidi: Ei-kromosomaalinen kaksijuosteinen DNA-sek-venssi, joka sisältää täydellisen "replikonin", jolloin plasmidi replikoituu isäntäsolussa. Kun plasmidi sijoitetaan yksisoluiseen organismiin, organismin ominaisuudet 10 voivat muuttua tai transformoitua plasmidin DNA:n ansiosta. Esimerkiksi plasmidi, joka sisältää tetrasykliiniresistens-sigeenin (Tet ), transformoi solun, joka on aikaisemmin ollut tetrasykliinisensitiivinen, tetrasykliiniresistentiksi. Plasmidin transformoimaa solua nimitetään "transformantiksi". 15 Fagi tai bakteriofagi: Bakteerivirus, joista monet muodostuvat proteiinivaippaan tai -kuoreen (kapsidiin) kapseloituneista DNA-sekvensseistä.

Kloonausvehikkeli: Plasmidi, fagi-DNA tai muu DNA-sekvenssi, joka pystyy replikoituinaan isäntäsolussa ja jolle 20 on tunnusomaista, että se sisältää yhden tai muutaman endo-nukleaasitunnistuskohdan, josta tällainen DNA-sekvenssi voidaan katkaista tietyllä tavalla ilman, että samalla DNA:n olennainen biologinen toiminta, esim. replikoituminen tai kuoriproteiinien muodostuminen häiriintyy tai promoottori-25 tai sitoutumiskohdat häviävät, ja joka sisältää markkerin, joka soveltuu käytettäväksi transformoitujen solujen identifioinnissa, esim. tetrasykliiniresistenssi- tai ampisil-liiniresistenssigeenin. Kloonausvehikkeliä nimitetään usein vektoriksi.

30 Kloonaus: Menetelmä organismi- tai DNA-sekvenssipo- pulaation tuottamiseksi lähtien yhdestä tällaisesta organismista tai sekvenssistä ilman sukusolujen käyttöä.

Yhdi^telmä-DNA-molekyyli tai hybridi-DNA: DNA-seg-mentcistä muodostuva molekyyli, jolloin DNA-scgmontit ovat 35 peräisin eri genomeista ja ovat liittyneet toisiinsa segmenttien päistä elävien solujen ulkopuolella ja jotka pystyvät infektoimaan osan isäntäsolusta ja pysyvät isäntäsolussa.

is 86 558

Ekspression säätelysekvenssi; Nukleotidisekvenssi, joka valvoo ja säätelee rakennegeenien ekspressoitumista operatiivisesti liittyneenä näihin geeneihin. Näihin kuuluu lac-järjestelmä, trp-järjestelmä, suurin osa λ-fagin 5 operaattori- ja promootterialueista, fd-vaippaproteiinin säätelyalue ja muut sekvenssit, joiden tiedetään säätelevän prokaryootti- tai eukaryoottisolujen ja niiden virusten geenien ekspressoitumista.

Kuvioon 1 viitaten siinä on esitetty kaaviokuva 10 eräästä yhdistelmä-DNA-molekyylien seoksen valmistusmenetelmän suoritusmuodosta, jolloin joillekin muodostuneille yh-distelmä-DNA-molekyyleille on tunnusomaista, että ne sisältävät niihin liitettyjä DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat polypeptidejä, joilla on ihmisen leukosyytti-interferonin 15 biologinen tai immunologinen aktiivisuus.

Ihmisen interferonin mRNA:n (IFN-otmRNA) sisältävän poly(A)RNA:n vaJmistus

Ihmisen leukosyyttejä indusoitiin viisi tuntia 37°C:ssa Sendai-viruksella, minkä jälkeen indusoitu seos 20 uutettiin, jolloin saatiin ihmisen leukosyytti-interferonin mRNA:ta ( "HuIFN-OCmRNA") sisältävä poly (A) RNA-seos. Indu-sointi suoritettiin Cantellin menetelmällä (The Interferon System, 130-131, ja sen sisältämät viitteet). Poly(A)RNA-seos on havainnollistettu kuviossa 1 ottamatta huomioon sen 25 sisältämien eri RNA-lajien todellisia osuuksia. Indusoidut leukosyytit otettiin talteen, ja 1011 solua suspendoitiin uudelleen yhteen litraan liuosta, joka sisälsi 8 g NaCl, 0,2 g KC1, 1,15 g Na2HP0^ x 21^0 ja 0,2 g Kf^PO^ liuotettuna yhteen litraan vettä ("PBS") ja liuos lisättiin hitaasti 30 samalla voimakkaasti sekoittaen 17 litraan liuosta, joka sisälsi 20 millimoolia Tris-HCl (pH 7,5) ja yhden milli-moolin EDTA ("TE-puskuri")/litra ja 2 % natriumdodekyyli-sulfaattia ("SDS") ja joka oli kaadettu 50 l:n erotussuppi-loon.

35 Hajoavaa pronaasia (Calbiochem) lisättiin niin, että sen pitoisuudeksi tuli 200 /ig/ml, ja seosta sekoitettiin yhden tunnin ajan huoneen lämpötilassa. 125I-globiini-mRNA:ta i6 8 6 5 5 8

(10 cpm) lisättiin merkkiaineeksi poly(A)RNA:n saannon määrittämiseksi ja mRNA:n hajoamisen seuraamiseksi myöhemmissä vaiheissa. Sen jälkeen lisättiin 2-m Tris-HCl-liuos-ta (pH 9) 1/20 seoksen kokonaistilavuudesta (1/20 til.), ja 5 seosta uutettiin voimakkaasti sekoittaen 15 1:11a uudelleen-tislattua fenolia 10 minuutin ajan. Seokseen lisättiin 3 1 kloroformia, ja seosta sekoitettiin viisi minuuttia. Faasien annettiin erottua 30 minuutin ajan, minkä jälkeen ve-sifaasi erotettiin ja uutettiin uudelleen fenolilla ja klo-10 roformilla. Muodostunut vesifaasi, jonka tilavuus oli yhteensä 19,1 1, yhdistettiin 60 g:aan SDS-liuosta. Nukleiinihapot saostettiin vesifaasista 3-m natriumasetaatilla (pH

5,5) (käytetty tilavuus 1/10 vesifaasin tilavuudesta) ja etanolilla (tilavuus 2 x vesifaasin tilavuus).

15 Saostuman annettiin laskeutua yön ajan -20°C:ssa, minkä jälkeen kuitumainen nukleiinihapposakka erotettiin suodattamalla muovisen teeseulan läpi. Sakkaan lisättiin 200 ml TNE-liuosta ^50 x 10 ^-m Tris-HCl (pH 7,5), 100 x 10 ^-m NaCl, 5 x 10 ^-m EDTA/, joka sisälsi 0,5 % SDS, 20 ja seosta sekoitettiin. Seokseen lisättiin vielä 350 ml samaa liuosta, jolloin sakka liukeni. Ei-kuitumainen sakka erotettiin sentrifugoimalla 1 litran Sorval1-pulloissa Sorvall-sentrifugissa 15 minuutin ajan kierrosnopeudella 5 000 rpm, minkä jälkeen sakka liuotettiin 350 ml:aan TNE, 25 joka sisälsi 0,5 % SDS. Saadut kaksi TNE-liuosta yhdistettiin, uutettiin kolme kertaa yhtä suurella tilavuudella fenolia, kolme kertaa 1/2 tilavuudella eetteriä ja kolme kertaa yhtä suurella tilavuudella eetteriä. RNA-saanto vesifaasista oli yhteensä 775 mg spektrometrisesti määritet-30 tynä (absorbanssi mitattu 260 nm:n kohdalta).

Poly(A)RNA-seos eristettiin adsorboimalla se useita kertoja oligo(dT)-selluloosaan (tyyppi 7, P-L Biochemicals, Inc.). 2,7 g oligo(dT)-selluloosaa lisättiin 500 ml:aan edellä valmistettu RNA-pitoista liuosta (noin puolet koko-35 naismäärästä). Seosta sekoitettiin tunnin ajan huoneen lämpötilassa, jolloin poly(A)RNA adsorboitui oligo(dT)-selluloosaan, minkä jälkeen selluloosa ja siihen sitoutunut IV 86558 RNA-seos erotettiin sentrifugoimalla, ja sen jälkeen tuote pestiin kerran 50 ml:11a TNE ja toisen kerran 15 ml:11a TNE. Sitoutunut poly(A)RNA eluoitiin sen jälkeen pesemällä sitä sisältävä selluloosa viisi kertaa peräkkäin 2 ml:11a 5 vettä. Saanto oli 860 ^ug poly(A)RNA:ta määritettynä optisen tiheyden mittauksen perusteella (valmiste A). Ensimmäisestä adsorptiovaiheesta saatu pintaneste (RNA:ta mukana) adsorboitiin vielä kahdesti edellä kuvatulla menetelmällä. Toisesta ja kolmannesta absorptiovaiheesta saatiin 600 ^ug 10 ja 170 ^,ug RNA:ta, ja nämä yhdistettiin (valmiste B) .

Näin valmistetusta RNA-tuotteesta määritettiin HuIFN-OCmRNA injektoimalla valmistetta Xenopus laevis -var-haismunasoluihin (The Interferon System, 93-95): RNA liuotettiin TNK-puskuriin /15 x 10 ^-m Tris-HCl (pH 7,5), 88 x 15 10 -m NaCl/ niin, että sen pitoisuudeksi tuli noin 1 mg/ml.

Tätä liuosta injektoitiin 50 ml kuhunkin 50 varhaismunaso-luun. Varhaismunasoluja inkuboitiin yön yli huoneen lämpötilassa Barth-väliaineessa /Gurdon, J. Embryol. and Exper. Morph., 20 (1968) 401-414 ja Barth, J. Embryol. and Exper.

20 Morph., 7 (1959) 210-222/. Inkuboidut varhaismunasolut huuhdottiin ja homogenisoitiin Pasteur-pipctillu L,5 ml:n -3

Eppendorf-sentrifugiputkessa 0,5 ml:ssa 52 x 10 -m Tris-glysiinipuskuria (pH 8,9). Seosta sentrifugoitiin kaksi minuuttia Eppendorf-sentrifugissa, pintaneste erotettiin 25 ja jäädytettiin -20°C:seen. IFN-OC-aktiivisuus määritettiin kokeella, jossa tutkittiin virusplakin kasvun estymistä ja jonka ovat kuvanneet H. Strander ja K. Cantell,

Production Of Interferon By Human Leukocytes In Vitro, Ann. Med. exp. Fenn. , 44 (1966) 265-273. Yksi IFN-oC-yksikkö vä-30 hentää virusplakke ja 50 %:lla. IFN-oc-valmis teen teho ilmaistaan suhteessa ihmisen standardi-interferoniin HuIFN-0C69/19 (International Symposium on Standardization of Interferon and Interferon Inducers, 1969). Vaihtoehtoisesti määritys suoritettiin menetelmällä, joka perustui syto-35 paattisen vaikutuksen vähenemiseen, tällöin käytettiin pääpiirteittäin samaa menetelmää, jonka ovat kuvanneet W.E. Stewart II ja S.E. Suikin, Interferon Production In Hamsters 18 V/ W w w U»

Experimentally Infected With Rabies Virus, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 123 (1966) 650-653, paitsi että käytettiin ihmisen CCL-23-soluja ja altistamiseen Mengo-virusta. Varhais-solu-uutteiden havaittiin sisältävän 300 IU IFN-^-aktiivisuut-5 ta yhtä ^ig:aa kohti injektoitua RNA:ta. Seuraavissa määrityksissä injektoituja varhaismunasoluja inkuboitiin 48 tuntia, ja ainoastaan inkubointiväliaine tutkittiin, koska varhais-munasolut erittivät siihen suurimman osan interferonista /A. Colman ja J. Morser, Export Of Proteins From Oocytes 10 Of Xenopus Laevis, Cell 18 (1979) 517-528/. Poly(A)RNA:ta puhdistettiin edelleen lisäämällä riittävä määrä 0,5-m etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA) poly(A)RNA-val- -3 misteeseen A, jotta EDTA:n pitoisuudeksi saatiin 5 x 10 Muodostunutta liuosta uutettiin kahdesti yhtä suurella ti-15 lavuudella TNE:llä kyllästettyä fenolia ja viisi kertaa yhtä suurella tilavuudella eetteriä. Sen jälkeen liuos johdettiin 0,1 ml:n Chelex-100-Rad-pylvään läpi, liuosta lämmitettiin 90 sekuntia 100°C:ssa, ja se lisättiin kerrokseksi 5-23 % sakkaroosigradientin pinnalle (13 ml), joka sisäl- 20 si 50 x 10 3-m Tris-HCl (pH 7,5), 1 x 10 3-m EDTA ja 0,2-m 32

NaCl. 10 000 cpm 5'-terminaalisesti P.llä merkittyjä DNA-fragmentteja, jotka oli valmistettu hajottamalla plas- midi pBR322 samanaikaisesti restriktioentsyymeillä Hindlll ja PstI (New England Biolabs), lisättiin koon merkkiaineik- 25 si. Seosta sentrifugoitiin SW40-roottorissa 10°C:ssa kier- rosnopeudella 35 000 rpm 16 tunnin ajan. Fraktiot (0,6 ml) kerättiin ISCO-gradienttikerääjällä nopeudella 1 ml/min.

Fraktioista määritettiin HuIFN-OCmRNA edellä kuvatulla mene- 32 telmällä, ja fraktioiden sijainti P-DNA-merkkiaineisnn 30 verrattuna merkittiin muistiin myöhempää käyttöä varten. Myöhemmissä sentrifugointivaiheissa HuIFN-OCmRNA:ta sisältävät fraktiot identifioitiin merkkiaineiden sijainnin perusteella. HuIFN-OCmRNA-aktiivisuutta sisältävät fraktiot sisälsivät 80 ^,ug poly (A) RNA: ta. Fraktioihin sekoitettiin 35 kaksinkertainen tilavuus TNE:tä, joka sisälsi 0,5 % SDS ja 0,02 % polyvinyylisulfaattia (myöhemmistä valmisteista polyvinyylisulfaatti jätettiin pois), ja ne lisättiin i9 86 558 50 ^,ul:n oligo (dT)-selluloosapylvääseen . Pylväs pestiin edellä kuvatulla tavalla, minkä jälkeen 40 ^ug RNA-seosta eluoitiin pesemällä neljä kertaa 0,6 ml :11a steriiliä tislattua vettä. RNA saostettiin etanolilla, ja liuotettiin _3 5 sen jälkeen 0,5 x 10 -m EDTA-liuokseen niin, että RNA:n pitoisuudeksi tuli 1 mg/ml.

HuIFN-OCmRNA:n aktiivisuus määritettiin edellä kuvatulla tavalla käyttämällä osaa poly(A)RNA-sakasta. Sen omi-naisaktiivuus oli 3600 IU interferonia/^ug injektoitua 10 RNA:ta. Täten HuIFN-QönRNA oli konsentroitunut sakkaroosigra-dientissa 10-kertaisesti. Toistettaessa sama käsittely sakkaroosigradientissa saatiin 40-kertaisesti konsentroitunut valmiste. Valmiste B puhdistettiin samalla tavalla, ja koska sen ominaisaktiivisuus oli sama kuin valmisteen A, 15 nämä kaksi yhdistettiin.

Tässä vaiheessa on huomattava, että sakkaroosigra-dientilla käsitelty poly(A)RNA-tuote sisältää vielä hyvin suuren määrän erilaista mRNArta. Lukuun ottamatta IFN-Ct:lle spesifistä mRNA:ta muut mRNA:t ovat ei-toivottavia epäpuh-20 tauksia (kuvio 1). Valitettavasti nämä epäpuhtautena olevat RNA:t käyttäytyvät samalla tavalla kuin HuIFN-oomRNA keksinnön mukaisessa kloonausmenetelmässä tästä lähtien. Täten niiden ollessa mukana poly(A)RNA:ssa muodostuu lopulta suuri määrä ei-toivottuja bakteeriklooneja, jotka sisäl-25 tävät muita polypeptidejä kuin IFN-Qt:aa koodaavia geenejä. Näistä epäpuhtauksista aiheutuu vaikeita ongelmia erotettaessa haluttuja IFN-Ä-hybridiklooneja muista muodostuneista kloonaustuotteista. IFN-Ofcn tapauksessa erotusta vaikeuttaa lisäksi se, että ei ole käytettävissä riittävästi puh-30 distettua HuIFN-OttnRNA-näytettä tai DNA-näytettä tai näytettä edes osasta niitä, joita voitaisiin käyttää seulontakoet-timena haluttujen kloonien idnetifioinnissa. Täten IFN-&-kloonien erotus on hyvin hidasta ja vaikeaa. Koska lisäksi oletettavasti ainoastaan hyvin pieni osa IFN-Ä-klooneista 35 ekspressoi IFN-Ä:n biologisesti tai immunologisesti aktiivisessa muodossa, aktiivisen kloonin eristys on "neulan etsimistä heinäsuovasta".

2o 86 55 8

Nyt voidaan kuitenkin yhdistelmä-DNA-tekniikalla valmistaa puhdistettu näyte HuIFN-CönRNA: ta tai cDNArta tai näyte näiden osasta. Tätä puhdistettua mRNA:ta tai cDNA:ta käyttämällä voidaan nopeasti testata hyvin suuri määrä bak-5 teeriklooneja ja siten saadaan nopeammin eristetyksi klooni, joka ekspressoi IFN-Ä:n aktiivisessa muodossa.

HuIFN-cCcDNA:n sisältävän cDNA-seoksen synteesi

Poly (A) RNA: ta, jossa IFN-ocmRNA oli konsentroitu- neessa muodossa (valmisteet A ja B), käytettiin muottina 10 valmistettaessa yksijuosteista komplementaarista DNA:ta (cDNA) (kuvio 1) (A. Efstratiadis et ai., Full Length

And Discrete Partial Reverse Transcripts Of Globin And

Chorion mRNAs, Cell (1975) 367-378 ja sen sisältämät viit- -3 teet). 800 ^,ul:n reaktioseoksessa oli 40 x 10 -m Tris-HCl 15 (pH 7,5) , 30 c 10 ^-m NaCl, 5 x 10 ^-m MgC^, 0,5 x 10 ^-m

DTT (Cal-Biochem), 20 ,ug/ml oligo(dT) 12-18 (P&L

Biochemicals), 5 x 10 -m dGTP (Schwarz), dCTP (laevosan) -3 32 ja dTTP (Sigma), 5 x 10 -m P-dATP (NEN, ominaisaktiivi-suus 100 000 cpm/nanomooli) , 60 ^,ug/ml poly (A) RNA ja 280 20 yksikköä linnun myeloblastosis-viruksesta eristettyä (AMV) käänteistransskriptaasia (lahja laitokselta Life Sciences, Inc., St. Petersburg, Florida). Seosta inkuboitiin yksi tunti 37°C:ssa, minkä jälkeen lisättiin 0,5-m EDTA ja 20 % SDS (uudelleenkiteytettyä) niin, että niiden pitoi-

_ T

25 suudeksi tuli 10 x 10 -m EDTA ja 0,l-%:inen SDS. Seos uutettiin yhtä suurella tilavuudella fenolia (tislattu). Fen-olifaasi pestiin 200 ^ulrlla puskuria, joka sisälsi 200 x 10 ^-m Tris-HCl (pH 7,5), 1 x 10 ^-m EDTA ja 0,l-%:inen SDS, ja vesifaasit yhdistettiin. Nämä uutettiin yhtä suu-30 rella tilavuudella eetteriä (Fluka, pro anal.) ja kromato-grafoitiin 5 ml:n Sephadex G-100 -pylväässä TNE:llä. Fraktioita (0,1 ml) kerättiin nopeudella 0,3 ml/min. Fraktiot, jotka osoittautuivat radioaktiivisiksi (Cerenkov-säteilyl-lä määritettynä), yhdistettiin, ja lisättiin 3-m natrium-35 asetaattia niin, että sen pitoisuudeksi tuli 0,3-m. Nukleiinihapot saostettiin 2,5-kertaisella tilavuudella etanolia. Saostuman annettiin laskeutua yön ajan -20°C:ssa, 2i 8 6 55 8 näytteet sentrifugoitiin ja pintaneste heitettiin pois.

Sakka liuotettiin 180 ^ul:aan tislattua vettä, ja liuos siirrettiin silikonoituun Eppendorf-kvartsiputkeen. Lisättiin 20yul 5-m NaOH, ja seosta pidettiin huoneen lämpötilassa 40 minuuttia. Sen jälkeen lisättiin 20^il 5-m natriumasetaat-tia, 100 ,ul tislattua vettä ja 500 ,ul etanolia. Seosta ' O ' jäähdytettiin yön yli -20 C:ssa, minkä jälkeen muodostunut sakka erotettiin sentrifugoimalla kierrosnopeudella 10 000 x g 20 minuuttia 0°C:ssa. Yksijuosteisen cDNA:n 10 saanto oli 10 y.ug.

On kuitenkin huomattava, että edellä saatu yksi-juosteinen cDNA-tuote on todellisuudessa monien hyvin erilaisten cDNA-sekvenssien seos, jolloin cDNArt ovat muodostuneet transskriptioprosessilla vastaavista poly(A)RNA-15 seoksessa olevista mRNA-sekvensseistä (kuvio 1). Vain hyvin harvat näistä cDNA-sekvensseistä koodaavat IFN-0(:aa eli ovat HuIFN-Ot-cDNA-sekvensse jä. On olemassa vielä eräs tekijä, joka tekee cDNA-scoksen entistä monimutkaisemmaksi: kaikkien poly (A) RNA-seoksen RNA-lajien transskriptio ei nimit-20 täin ole täydellinen. Sitä vastoin kullakin RNA-lajilla transskriptio voi päättyä ennen kuin mRNA-sekvenssi on käyty läpi kokonaan. Tästä syystä kustakin mRNA-lajista voi muodostua hyvin erilaisia cDNA-tuotteita (tätä ei ole esitetty kuviossa 1). Kukin cDNA-tuote käyttäytyy enemmän 25 tai vähemmän samalla tavalla kloonausprosessissa muodostaen bakteeriklooneja, jotka sisältävät DNA-molekyylejä, joissa on ainoastaan osa tiettyä proteiinia koodaavasta geenistä. Nämä fragmentteja sisältävät kloonit tekevät lopullisen halutun hybridikloonin erotusmenetelmän entistä monimutkai-30 semmaksi.

Erilaisten yksijuosteisten cDNA-sekvenssien koko määritettiin elektroforeettisesti pienestä näytteestä emäksisessä 2-%:isessa agaroosigeelissä käyttäen elektrolyytti- -3 -3 nä liuosta, joka sisälsi 30 x 10 -m NaOH ja 2 x 10 -m 35 EDTA /&.W. McDonell et ai., Analysis Of Restriction

Fragments Of T7 DNA And Determination Of Molecular Weights By Elektroprohoresis In Neutral And Alkaline Gels, J. Mol.

22 86558

Biol. 110 (1977) 119-146/. ^P-cDNA:n pituus oli 600 - 1 000 nukleotidia verrattuna koon merkitsemiseen käytettyi- 32 hin yksijuosteiseen globiinin cDNA:han ja P:llä merkittyihin DNA-fragmentteihin.

5 Kaksijuosteisen cDNA:n valmistus

Yksijuosteinen cDNA voidaan muuttaa kaksijuosteisek-si käsittelemällä sitä DNA-polymeraasilla I /T. Maniatis et ai., Amplification And Characterization of A /3rGlobin Gene Synthesized In Vitro, Cell 8 (1976) 163-182/. Edellä 10 saatu saostunut yksijuosteinen cDNA liuotettiin 200 ,ul:aan O ' vettä, liuosta lämmitettiin 100 C:ssa kaksi minuuttia ja sitä inkuboitiin sen jälkeen 500 ^ulrssa 0,1-m lämpödena-turoitua kaliumfosfaattipuskuria (pH 6,9), joka sisälsi 10 x 10 ^-m MgC^/ 10 x 10 ^-m DDT (Calbiochem) , 1 x 10 ^-m 15 dATP (Merck) , dGTP (Schwarz.) ja dCTP (Laevosan) , 1 x 10 ^-m 3 H-dTTP (NEN, ominaisaktiivisuus 100 000 cpm/mooli) ja 150 yksikköä/ml E. colin DNA-polymeraasia I (Boehringer-Mannheim). Seosta inkuboitiin 6,5 tuntia 15°C:ssa, ja sen jälkeen lisättiin 0,5-m EDTA ja 20-%:ista SDS niin, että _3 20 niiden pitoisuudeksi tuli 10 x 10 -m EDTA ja 0,l-%:inen SDS. Seos uutettiin sen jälkeen 500 ^ulrlla fenolia ja fen-olifaasi uutettiin uudelleen 250 ^ul:lla puskuria, joka si-saisi 20 x 10 ^-m Tris-HCl (pH 7,5) ja 5 x 10 ^-m EDTA ("TE-puskuri") . Näin saadut kaksi vesifaasia yhdistettiin 25 ja kromatografoitiin 5 ml:n Sephadex G-100 -pylväässä samoissa olosuhteissa kuin aikaisemmin on kuvattu. Lisättiin natriumasetaattia (3-m) niin, että sen pitoisuudeksi tuli 0,3-m sekä 2,5-kertainen tilavuus etanolia sekoittaen, jolloin DNA saostui. DNA:ta saatiin yhteensä 13 ^ug.

30 DNA käsiteltiin S^-nukleaasilla, joka oli valmistet tu R.C. Wiegandin et ai. kuvaamalla menetelmällä, "Spesificity Of The Nuclease From Aspergillus oryzae", J. Biol. Chem.

250 (1975) 8848-8855. Saostunut DNA liuotettiin 250 ,ul:aan

S.-puskuria /0,2-m NaCl, 50 x 10 -m natriumasetaattia (pH

-L _3 35 4,5), 10 x 10 -m sinkkisulfaattia/, ja liuosta lämmitet tiin 37°C:ssa 30 minuuttia. 1,5 .ui S.-entsyymiä (11 yk-

' O

sikköä/^ul) lisättiin, ja seosta inkuboitiin 37 C:ssa 23 86 558 30 minuuttia. Lisättiin SDS ja EDTA niin, että niiden pi- -3 toisuus oli 0,1-%:men SDS ja 5 x 10 -m EDTA, ja seos uutettiin 250 ^,ul:lla fenolia. Fenolifaasi pestiin 100 ^ulrlla TE-puskuria. Vesifaasit yhdistettiin ja kromatografoitiin 5 Sephadex G-100 -pylväässä (Pharmacia) TNE:llä, 0,1 ml:n fraktioita kerättiin nopeudella 0,3 ml/min, ja kunkin fraktion aiheuttama Cerenkov-säteily mitattiin. cDNA saos-tettiin edellä kuvatulla tavalla etanolilla ja natriumase-taatilla, jolloin saatiin 8 ^ug kaksijuosteista cDNA:ta.

10 Tässä vaiheessa on huomattava, että edellä saatu kaksijuosteinen cDNA-tuote on hyvin monien erilaisten cDNA-sekvenssien ja näiden fragmenttien seos, ja mukana on ainoastaan muutama HuIFN-o(cDNA tai sen fragmentti (kuvio 1) .

Kaksijuosteisen DNA:n kloonaus 15 Hyvin monia erilaisia isäntäorganismin ja kloonaus- vehikkelin yhdistelmiä voidaan käyttää kloonattaessa edellä valmistettu kaksijuosteinen cDNA. Käyttökelpoisia kloo-nausvehikkeleitä ovat esim. kromosomaaliset, ei-kromosomaa-lisct ja synteettiset DNA-sckvenss L L , kuten ori. Laiset t un-20 netut bakteeriplasmidit, esim. E. colin plasmidit col El, pCRL, pBR322 ja niiden johdannaiset, myös muissa isäntä-organismeissa esiintyvät plasmidit, kuten RP4, fagi-DNA, esim. lukuisat λ-fagin johdannaiset, kuten NM 989, ja plas-midien ja fagi-DNA-sekvenssien yhdistelmistä johdetut vek-25 torit, joihin on käytetty esim. plasmideja, joita on modi-fioitu käytettäväksi fagi-DNA:n tai muiden ekspressoitumista säätelevien sekvenssien kanssa, tai hiivaplasmideja, kuten ’·- 2 ^u-plasmidia tai sen johdannaisia. Käyttökelpoisia isän- täorganismeja ovat esim. bakteerit, kuten E. coli -kannat, 30 esim. E. coli HB 101, E. coli X1776, E. coli X2282 ja E. coli MRCI, hiivat ja eläinsoluviljelmät (mukaan lukien ihmisen soluviljelmät). Luonnollisesti kaikki isäntä/vek-tori-yhdistelmät eivät ole yhtä tehokkaita. Asiantuntijat pystyvät valitsemaan tiettyyn tarkoitukseen sopivan 24 8 6 558 isäntä/kloonausvektori-yhdistelmän tiettyjen periaatteiden mukaan poikkeamatta keksinnön suojapiiristä.

Lisäksi tietystä kloonausvehikkelistä voidaan valita eri kohtia, joihin kaksijuosteinen DNA liitetään. Nämä 5 kohdat määrää tavallisesti restriktioendonukleaasi, joka katkaisee DNA-sekvenssin tunnistuskohdistaan. Esimerkiksi pBR322-plasmidissa Pstl:n tunnistuskohta sijaitsee $-lak-tamaasia koodaavassa geenissä nukleotiditriplettien välissä, jotka koodaavat mainitun proteiinin aminohappoja 181 ja 10 182. Villa-Komaroff et ai. (edellä) käyttivät tätä kohtaa syntetisoidessaan proteiinia, jossa oli rotan proinsuliinin antigeenideterminantit. Toinen HindII:n kahdesta tunnistus-kohdasta on triplettien välissä, jotka koodaavat aminohappoja 101 ja 102, ja yksi useista Tag-endonukleaasin tunnis-15 tuskohdista on plasmidissa pBR322 tripletissä, joka koodaa /s- laktamaasin aminohappoa 45. Samoin EcoRI-katkaisukohta ja PvuII-katkaisukohta tässä plasmidissa sijaitsee koodaa-van alueen ulkopuolella, EcoRI-kohta sijaitsee tetrasykliini- ja ampisilliiniresistenssiä koodaavien geenien välissä. 20 Itakura et ai. ja Goeddel et ai. (edellä) ovat käyttäneet tätä kohtaa valmistaessaan synteettisesti yhdistelmä-DNA-molekyylejä. Asiantuntijat ovat hyvin perillä näiden kohtien käyttömahdollisuuksista. On kuitenkin huomattava, et-;;; tä keksinnön mukaisessa menetelmässä käyttökelpoisen kloo- 25 nausvektorin ei välttämättä tarvitse sisältää restriktio- endonukleaasin tunnistuskohtaa, jotta haluttu DNA-fragmentti voitaisiin siihen littää. Kloonausvektori voidaan nimittäin liittää fragmenttiin myös muilla menetelmillä.

Kulloinkin käytettävän vektorin tai kloonausvehik-30 kelin ja erikoisesti kohdan, johon haluttu DNA-fragmentti liitetään yhdistelmä-DNA-molekyylin muodostamiseksi, määräävät useat tekijät, esim. tietyn restriktioentsyymin tun-nistuskohtien lukumäärä, ekspressoitavan proteiinin koko, ekspressoitavan proteiinin taipumus hajota proteolyytti-35 sesti isäntäsolun entsyymien vaikutuksesta, ekspressoitavan proteiinin kontaminoituminen isäntäsolun proteiineilla, 25 8 6 5 5 8 jotka ovat vaikeasti poistettavissa puhdistusvaiheessa, eksprcssoitumisominaisuudet, kuten alku- ja päätekodonien sijainti suhteessa vektorisekvensseihin ja muut asiantuntijan hyvin tuntemat tekijät. Valittaessa vektoria ja koh-5 taa, johon tietty geeni liitetään, kaikki mainitut tekijät täytyy ottaa huomioon, kaikissa tapauksissa samat vektorit ja liittämiskohdat eivät ole yhtä sopivia.

Vaikkakin alalla tunnetaan useita menetelmiä, joilla vierasta DNA:ta voidaan liittää kloonausvehikkeliin tai 10 -vektoriin yhdistelmä-DNA-molekyylin muodostamiseksi, tämän keksinnön yhteydessä ensimmäisessä vaiheessa pidettiin parhaana menetelmää, jonka ovat kuvanneet Villa-Komaroff et ai., edellä, ja joka ilmenee kuviosta 1. Menetelmälle on tunnusomaista, että plasmidia (erikoisesti pBR322) käsitellään 15 restriktioentsyymillä (erikoisesti PstI), joka katkaisee plasmidin halutusta insertiokohdasta, minkä jälkeen liitetään dGMP-päät katkaisukohtiin terminaalisen transferaasin avulla. dGMP-päät liitetään katkaistun plasmidin 5'-päihin Pstl-kohdan regeneroimiseksi ja jotta cDNA-fragmentti, jos-20 sa on komplementaariset päät, voitaisiin liittää katkaisu-kohtaan. Vastaavasti kaksijuosteisen cDNA:n 3’-päihin liitetään dCMP-päät, jotta cDNA voitaisiin liittää dGMP-päitä sisältävään plasmidiin. Näin käsiteltyä plasmidia ja cDNA:ta yhdistetään, jolloin cDNA liittyy plasmidiin haluttuun koh-25 taan ja hybridi-DNA sulkeutuu renkaaksi kohesiivisten komplementaaristen päiden ansiosta (kuvio 1). Muodostunut yhdis-telmä-DNA-molekyyli sisältää nyt geenin haluttuun rostrik-tiokohtaan liitettynä (kuvio 1).

Luonnollisesti myös muut tunnetut menetelmät, joilla 30 DNA-sekvenssejä voidaan liittää kloonausvehikkeleihin yh-distelmä-DNA-molekyylien muodostamiseksi, ovat yhtä käyttökelpoisia keksinnön mukaisessa menetelmässä. Muita menetelmiä ovat mm. suora ligaatio, synteettisten linkkerimolekyy-lien käyttö, modifiointireaktiot, joissa käytetään ekso-35 nukleaaseja ja polymeraasiin liittyviä kor jausreaktioita ja joiden jälkeen suoritetaan ligaatio, tai DNA-juos teen pidentäminen DNA-polymeraasilla ja sopivalla yksijuosteisella muotilla, mitä seuraa ligaatio.

26 8 6 558

On tietenkin huomattava, että haluttuun kloonaus-vektorin kohtaan liitetty nukleotidisekvenssi tai cDNA-fragmentti voi sisältää nukleotideja, jotka eivät kuulu halutun polypeptidin varsinaiseen rakennegeeniin, tai se 5 voi sisältää ainoastaan osan halutun proteiinin täydellisestä rakennegeenistä. Vaaditaan ainoastaan, että mikä tahansa DNA-sekvenssi siirtäjävektoriin liitetään, transformoidun isäntäorganismin on tuotettava polypeptidiä, jolla on HuIFN-σθη biologinen tai immunologinen aktiivisuus 10 tai että DNA-sekvenssiä voidaan käyttää hybridisaatiomal-lina seulottaessa klooneja, jotka sisältävät DNA-sekvens-sejä, joita voidaan käyttää valmistettaessa polypeptidejä, joilla on HuIFN-ct:n immunologinen tai biologinen aktiivisuus .

15 Vieraan geenin sisältävää kloonausvehikkeliä tai -vektoria käytetään isäntäorganismin transformoimiseen, jolloin transformaation tuloksena isäntäorganismi pystyy ekspressoimaan hybridi-DNA:n koodaaman proteiinin tai sen osan. Sopivan isännän valintaan vaikuttavat myös alalla 20 tunnetut tekijät. Näitä ovat esimerkiksi isäntäorganismin soveltuvuus käytettäväksi yhdessä halutun vektorin kanssa, hybridiplasmidin koodaamien proteiinien myrkyllisyys, halutun proteiinin eristämismahdollisuudet, ekspressoitumis-ominaisuudet, bioturvallisuus ja taloudelliset kustannuk-25 set. Kaikki nämä tekijät täytyy ottaa huomioon huomioimalla samalla, että kaikki isäntäorganismit eivät ole yhtä tehokkaita ekspressoimaan tiettyä yhdistelmä-DNA-molekyyiiä.

Esillä oleva synteesissä käytettävä edullinen kloo-nausvektori on bakteeriplasmidi pBR322 ja edullinen restrik-30 tioendonukleaasikatkaisukohta plasmidissa on Pstl-kohta (kuvio 1). Kyseisen plasmidin molekyylipaino on pieni (noin 2,6 megadaltonia) ja plasmidi sisältää amplisilliini-(Amp)- ja tetrasykliini(Tet)resistenssigeenit. Plasmidi on kokonaan karakterisoitu /F. Bolivar et ai., Construction 35 And Characterization Of New Cloning Vehicles II. A Multi-Purpose Cloning System, Gene (1977) 95-113, J.G. Sutcligge, pBR322 Restriction Map Derived From The DNA Sequence: 2? 86558

Accurate DNA Size Markers Up To 4361 Nucleotide Pairs Long, Nucleic Acids Research 5 (1978) 2721-2728/. Liitettäessä DNA-tuote tähän kohtaan, muodostuu suuri määrä bakteeri-klooneja, joista kukin sisältää jonkin edellä valmistetus-5 sa DNA-tuotteessa olevista DNA-geeneistä tai sen fragmenteista. Mutta ainoastaan hyvin harvat näistä klooneista sisältävät IFN-a:aa koodaavan geenin tai osia siitä (kuvio 1). Edullinen kloonaukseen käytettävä isäntäorganismi on tämän keksinnön mukaisesti E. coli HB 101. Kokeita suoritettiin 10 myös kannalla E. coli X1776, joka on kuvattu GB-patentti-julkaisussa nro 1 516 458 ja joka on talletettu laitokseen American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, talletusnumerolla ATCC 31244.

1. Plasmidin pBR322 katkaiseminen Pstl-kohdasta ja 15 dGMP-päiden liittäminen katkaisukohtiin

Plasmidia pBR322 (20 ^ug) käsiteltiin 21 yksiköllä Pstl-endonukleaasia (MRE Porton Downs or New England _ 3

Biolabs) 150 ^ulrssa liuosta, joka sisälsi 10 x 10 -m Tris-HCl (pH 7,5), 6 x 10 MgCl„, 50 x 10 ^-m NaCl, _ 3 ^ 20 6 x 10 -m 2-merkaptoetanolia, 200 mg/^ul härän seerumin albumiinia ("BSA") (Calbiochem). Seosta inkuboitiin kaksi tuntia 37°C:ssa, seos uutettiin yhtä suurella tilavuudella fenoli/kloroformia (1:1) sekä yhtä suurella tilavuudella eetteriä, ja DNA saostettiin etanolilla.

25 Homopolymeeriset dGMP-päät (kuvio 1) liitettiin ava tun DNA:n päihin terminaalista deoksinukleotidyylitrans-feraasia (TdT) käyttäen /puhdistettu F.J. Bollumin mukaan, Deoxynucleotide Polymerizing Enzymes From Calf Thymus Gland, teoksessa Methods in Enzymology, toim. L. Grossman ja K.

30 Moldave, Academic Press, New York, 128 (1968) 591-611/ 328 -3 ^,ul:ssa liuosta, joka sisälsi 100 x 10 -m natriumkakody-laattia (pH 7,2), 10 x 10 ^-m NaH2?0^, 5 x 10 ^-m MgC^, 1 x 10 ^-m dGTP, 50 yug/^ul BSA ja 3-6 yksikköä TdT (puhdistettu kuten edellä) yhtä ^,ug:aa kohti DNA: ta. Seosta 35 inkuboitiin 37°C:ssa 20 minuuttia. Lisättiin EDTA:ta niin, -3 että sen pitoisuudeksi tuli 10 x 10 -m, minkä jälkeen seos uutettiin, kuten edellä ja dialysoitiin kahden päivän ajan TNE-puskurilla.

28 86 558 2. dCMP-päiden liittäminen DNA:hän

Kaksijuosteiseen DNA:hän liitettiin dCMP-päät standardimenetelmillä (esim. Villa-Komaroff et ai. edellä).

150 ng edellä mainittua kaksijuosteista cDNA:ta inkuboitiin -3 5 8 ^ul:ssa liuosta, joka sisälsi 100 x 10 -m natriumkako- dylaattia (pH 7,2), 2,5 x 10 3-m CoCl2, 50 yug/^ul BSA, 0,1 x 10 ^-m dCTP ja 3-6 yksikköä puhdistettua TdTrtä/^ug DNA:ta, 27°C:ssa kahdeksan minuutin ajan, minkä jälkeen inkubaatioseos jäädytettiin -20°C:seen. Tällöin muodostunut 10 DNA-tuote, jossa on dCMP päät, on erilaisten DNA-sekvens-sien seos, ainoastaan hyvin harvojen DNA-sekvenssien koodatessa IFN-interferonia (kuvio 1).

3. E. colin X1776 käsittely Ca++-ioneilla

Yksi E. colin X1776 pesäke siirrettiin 100 ml:aan 15 tryptonialustaa {c. Weissman ja W. Voll, Reduction Of

Possible Hazards In The Preparation Of Recombinant Plasmid DNA, Nature 261 (1976) 428-4297, joka sisälsi 100 ^ul/ml diaminopimeliinihappoa (Koch-Light Laboratories), 10 ^ug/ml nalidiksiinihappoa (Calbiochem) ja 10 .ug/ml tetrasyklii-20 niä (Achromycin'-', American Cyanamid). Bakteeria viljeltiin 37°C:ssa, kunnes viljelmän optinen tiheys oli 0,6 650 nm:ssä (OD^j-q) (mitattu Beckman-DB-spektrofotometrilla), ja sen jälkeen sitä jäähdytettiin jäähauteessa 30 minuuttia. Viljelmä sedimentoitiin kierrosnopeudella 4 000 rpm 25 Sorvall-H4-roottorissa, solut pestiin 50 ml:11a 10 x 10 -m NaCl, pelletoitiin uudelleen sentrifugoimalla ja suspendoi-tiin uudelleen 20 ml:aan 100 x 10 ^-m CaCl2. Suspensiota jäähdytettiin jäähauteessa 30 minuuttia, se pelletoitiin sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen 4 ml:aan 100 x _ 3 30 io -m CaCl2 ja säilytettiin jäähauteessa yön yli myöhempää käyttöä varten. Transformointia varten E. coli HblOl-kantaa käsiteltiin menetelmällä, jonka ovat kuvanneet M. Mandel ja A. Higa, Calcium-Dependent Bacteriophage DNA Infection, J. Mol. Biol . 53 (1970) 159-162. Näyt treitä f* »> (0,5 ml) säilytettiin jäädytettynä -70 C:ssu, jolloin nii den aktiivisuus säilyi ainakin kolme kuukautta.

29 86 558 4 - dGMP-päitä sisältävän plasmidin pBR322 ja dCMP-päitä sisältävän DNA:n hybridisointi

Pstl-restriktioendonukleaasilla katkaistun dGMP-päitä sisältävän pBR322-plasmidin ja dGMP-päitä sisältävän 5 cDNA:n hybridisointi suoritettiin käyttäen menetelmää, jonka ovat kuvanneet J. Van den Berg et ai., Comparison Of Gloned Rabbit And Mouse /3-globin Genes Showing Strong Evolutionary Divergence Of Two Homologous Pairs Of Introns, Nature 276 (1978) 37-44. 8 ng dCMP-päitä sisältävää DNA-tuotetta se-10 koitettiin 22 ngraan dCMP-päitä sisältävää Pstl-restriktio-endonukleaasilla katkaistua pBR322-plasmidia 50 ^ulrssa TNE-puskuria. Inkubointi suoritettiin neljässä vaiheessa tunnin jaksoissa 65°C:ssa, 46°C:ssa, 37°C:ssa ja 20°C:ssa.

_3

Lisättiin 20 ^ul liuosta, joka sisälsi 100 x 10 -m Tris-15 HC1 (pH 7,5), 100 x 10~3-m CaCl2, 100 x 10_3-m MgCl2 ja 50 ^,ul TNE-puskuria, ja seosta jäähdytettiin jäähauteessa 20 minuuttia.

Tuote on luonnollisesti monimutkainen seos erilaisia yhdistelmä-DNA-molekyylejä sekä kloonausvektoreita, 20 joihin haluttu DNA-sekvenssi ei ole liittynyt. Kukin muodostunut yhdistelmä-DNA-molekyyli sisältää kuitenkin cDNA-segmentin Pstl-kohdassa. Kukin tällainen DNA-segmentti voi sisältää geenin tai sen osan. Vain hyvin harvat cDNA-segmenteistä koodaavat IFN-interferonia tai osaa siitä (kuvio 1). 25 Valtaosa näistä cDNA-segmenteistä koodaa jotakin niistä muista proteiineista tai niiden osista, joita vastaavat mRNA:t sisältyivät keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettyyn poly(A)RNA-seokseen.

5. E. colin X1776 transfektio hybridiplasmideilla 30 E. colin X1776 transfektio yhdistelmä-DNA-mole- kyylien seoksella suoritettiin käyttäen menetelmää, jonka ovat kuvanneet J. Van den Berg et ai. (edellä). P3:a käytettiin transfektioprosessissa ja kaikissa myöhemmissä vaiheissa, joissa muodostuneita transformoituneita baktce- 35 reita käsiteltiin. Hybridisoituneet pBR322-yhdistelmä-DNA-mole- + + kyylit lisättiin 100 ^,ul:aan Ca -ioneilla käsiteltyä E. coli X1776 -viljelmää, ja seosta jäähdytettiin jäähau- 30 86558 teessä 20 minuuttia ja lämmitettiin sen jälkeen 20°C:ssa 10 minuuttia, minkä jälkeen lisättiin 0,6 ml tryptoniväli-ainetta. Seos siirrettiin kahden tryptoni/agar-kerroksen päälle, joissa oli samat lisäaineet kuin edellä. Transfek-5 tioteho oli 3,3 x 10^ pesäkettä yhtä/ug: aa kohti hybridi-soitua pBR32 2-DNA:ta, alkuperäisellä pBR322:lla saatiin 3 x 10^ pesäkettä/yug.

Koska pBR322-plasmidi sisältää tetrasykliiniresis-tenssigeenin, E. coli -isäntäorganismit, jotka ovat trans-10 formoituneet tämän geenin kokonaisuudessaan sisältävällä plasmidilla, lisääntyvät viljelmissä, jotka sisältävät mainittua antibioottia erotukseksi niistä bakteereista, jotka eivät ole tällä tavalla transformoituneet. Täten viljelemällä transformaatiotuotteita tetrasykliiniä sisältävässä 15 väliaineessa pystytään suuresta joukosta seulomaan ne isän-täbakteerit, jotka ovat transformoituneet yhdistelmä-DNA-molekyylillä tai uudelleensyklisoidulla vektorilla.

Bakteereita viljeltiin 48 tuntia 37°C:ssa, minkä jälkeen yksittäiset pesäkkeet erotettiin ja suspendoitiin 20 100 /ui:aan tryptonialustaa (sisälsi samat aineet kuin edellä) mikrotiitterilevyjen syvennyksissä (Dynatech). Pesäkkeitä inkuboitiin 37°C:ssa yön yli, ja sen jälkeen 100 yul 40-%:ista glyserolia sekoitettiin kuhunkin syvennykseen. Levyjä säilytettiin -20°C:ssa, ja valmistettiin 25 100 000 yksittäistä E. colin X1776 transformanttikloonia.

Nämä 100 000 kloonia sisältävät erilaisia yhdistelmä-DNA-molekyylejä, jotka ovat täydellisiä tai osittaisia kopioita IFN-interferonia tuottavista leukosyyteistä valmistetun poly(A)RNA-seoksen mRNA-sekvensseistä (kuvio 2). Suu-30 rin osa klooneista sisältää ainoastaan yhden yhdistelmä-DNA-molekyylin. Vain hyvin harvat näistä yhdistelmä-DNA-molekyyleistä koodaavat IFN-interferonia. Täten 100 000 kloonista täytyy seuloa erilleen IFN-interferonin ekspressoi-vat kloonit.

35 HuIFN-OfcDNA:n sisältävän kloonin seulonta

Ihmisen leukosyytti-interferonin cDNA:n (HuIFN-OCcDNA) sisältävien bakteerikloonien erotukseen on käytettä- 3i 86 558 vissä useita menetelmiä. Näitä ovat esim. RNA-selektiohybri-disointi (Alwine et ai., esitetty myöhemmin) differentiaalinen hybridisointi /ΐ.Ρ. St. John ja R.W. Davis, Isolation Of Galactose-Inducible DNA Sequences From Saccharomyces 5 Cerivisiae By Differential Plaque Filter Hybridization,

Cell 16 (1979) 443-452, Hoeijmakers et ai., edellä/, hybridisointi synteettisellä mallilla /B. Noyes et al., Detection And Partial Sequence Analysis Of Gastrin mRNA By Using An Oligodeoxynucleotide Probe, Proc. Natl. Acad. Sci 10 USA 76 (1979) 1770-1774.7 tai sellaisten kloonien seulonta, jotka tuottavat haluttua proteiinia käyttäen immunologisia (L. Villa-Komaroff et ai., edellä) tai biologisia (A.C.Y. Chang et ai., edellä) menetelmiä. Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä on käytetty RNA-selektiohybridi-15 sointia, koska se on osoittautunut kätevimmäksi ja lupaa-vimmaksi menetelmäksi IFN-0(cDNA:n sisältävien kloonien alustavaan seulontaan.

A. RNA-selektiohybridisointimääritys 1. Katsaus alustavaan määritykseen 20 Viitaten kuvioon 2 yhdistelmä-DNA eristettiin vil jelmästä, jossa oli inkuboitu edellä mainitusta 100 000 kloonin sarjasta erotetun 512 kloonin seosta (kaksi seosta, jotka muodostuivat kahdesta kloonista, on esitetty kuviossa 2) (vaihe A). Se, miksi juuri tämä kloonimäärä valittiin, 25 selitetään myöhemmin. Yhdistelmä-DNA-molekyylit pilkottiin, denaturoitiin ja hybridisoitiin edellä valmistetun leuko-syytti-poly (A) RNA:n kanssa, joka sisälsi IFN-OCmRNA: ta (vaihe B). Kaikki yhdistelmä-DNA-molekyylien ja poly(A)ENA:n hybridit erotettiin ei-hybridisoituneesta poly(A)RNA:sta 30 (vaihe C). Poly(A)RNA erotettiin hybrideistä ja puhdistettiin (vaihe D). Erotetusta RNA:sta määritettiin IFN-flönRNA-aktiivisuus, kuten edellä (vaihe E). Ainoastaan siinä tapauksessa, että yhdistelmä-DNA-molekyylien seos sisältää sellaisen yhdistelmä-DNA-molekyylin, johon on liittynyt 35 nukleotidisekvenssi, joka pystyy hybridisoitumaan poly(A)-RNA-seoksessa olevan IFNmRNA:n kanssa erittäin rajoittavissa hybridisointiolosuhteissa, tästä hybridistä vapautunut 32 86558 mRNA aiheuttaa IFN-0C:n muodostumisen varhaismunasoluissa, koska mistään muusta yhdistelmä-DNA-molekyylin ja poly (A) -RNA:n hybridistä vapautunut mRNA ei koodaa IFN-afcaa. Jos 512 kloonin ryhmästä saatiin positiivinen tulos, kloonit 5 ryhmiteltiin uudelleen kahdeksaan erään, joista kukin sisälsi 64 kloonia, ja kukin erä analysoitiin edellä kuvatulla tavalla. Määritystä jatkettiin, kunnes pystyttiin identifioimaan yksi ainoa klooni, joka antoi positiivisen tuloksen .

10 Ei voida taata sitä, että näin identifioidut yhdis- telmä-DNA-molekyylit ja niillä transformoitu bakteerikloo-ni sisältävät IFN-Cfcn täydellisen IFN-OCcDNA-sekvenssin tai sitä, että DNA-sekvenssi todella koodaa IFN-Ofcaa. Yhdistel-mä-DNA-molekyylit sisältävät kuitenkin varmasti pitkiä nuk-15 leotidisekvenssifragmentteja, jotka ovat IFN- mRNA:ta koo-daavalle sekvenssille komplementaarisia. Täten yhdistelmä-DNA-molekyyliä voidaan ainakin käyttää mallina seulottaessa nopeasti muita yhdistelmä-DNA-molekyylejä ja niillä transformoituja klooneja identifioitaessa muita klooneja, 20 jotka voivat sisältää autenttisen ja täydellisen IFN-ctaa koodaavan nukleotidisekvenssin.

2. Teoreettisia näkökohtia

Hybridisointiolosuhteet (vaihe B) ovat kriittiset. Yhdistelmä-DNA-molekyylin ja poly(A)RNA:n pitoisuudet ja 25 näiden suhde täytyy valita niin, että otetaan huomioon reaktionopeus ja stiökiometria. Oikea valinta on vaikea, koska IFN-OCmRNA:n osuutta poly (A) RNA-seoksessa ei tunneta. Jotta reaktiokinetiikka saataisiin sopivaksi, hybridisoin-ti suoritettiin olosuhteissa, joissa yhdistelmä-DNA-mole-30 kyylien DNA-sekvenssien pitoisuus oli suurempi kuin arvioitu IFN-otmRNA-pitoisuus. Seoksessa, joka sisältää mahdollisesti 512 erilaista yhdistelmä-DNA-molekyyliä, IFN-C(:aa koodaava DNA-sekvenssi (IFN-OCR-DNA) oi joko esiinny lainkaan (tulos negatiivinen) tai se muodostaa ainakin 1/512-35 osan yhdistelmä DNA-molekyyleistä. Yhdistelmä-DNA-molekyy-liseoksen ja täten mahdollisesti esiintyvän IFN-OCR-DNA:n pitoisuus voidaan siten säätää hybridisointivaiheessa sopivien 33 86558 hybridisointinopeuksien varmistamiseksi. Lisäksi IFN-o(R-DNA:n määrä reaktioseoksessa täytyy olla riittävä sitomaan tarpeeksi IFN-Q(mRNA: ta poly (A) RNA:sta, jotta IFN-Cf pystyttäisiin toteamaan injektoitaessa yhdistelmä-DNA-molekyvIin 5 ja poly(A)RNA:n hybridistä erotettu mRNA varhaismunasolui-hin.

Jotta IFN-tf pystyttäisiin toteamaan tällä hetkellä käytettävissä olevilla menetelmillä, sen pitoisuuden täytyy olla 100 IU/ml tai korkeampi. Koska määrityksiin tarvittava 10 näytemäärä on 0,5 ml, varhaismunasoluissa pitäisi syntyä 50 IU IFN-CC:aa. Indusoiduista leukosyyteistä valmistettu poly(A)RNA muodostaa noin 500 IU IFN-Cfcaa, kun sitä injektoidaan 1 yug varhaismunasoluihin. Tätä vähintään 0,1 ^ug poly(A)RNA:ta täytyy injektoida, jotta muodostuisi haluttu 15 50 IY:n määrä IFN-Ofcaa. Kaniinin globiinin mRNArn ja ka niinin /i-globiinin cDNA:n hybridiklooneilla suoritetut mal- 125 likokeet osoittivat, että I-globiini-mRNA:n kokonaissaan- 125 to varhaismunasoluissa verrattuna I-globiini-mRNA:hän, joka oli lisätty hybridisointiseokseen, oli noin 10 % ja 20 mRNA-aktiivisuussanto oli noin 5 %. Täten vähintään 0,1/ 0,05 = 2 ^,ug leukosyytti-poly (A) RNA: ta täytyy käyttää hyb-ridisointimääritykseen. Riittävän turvallisuusrajan varmistamiseksi yhtä määritystä kohti käytettiin 12 ^ug poly(A)-RNA:ta. Sen laskemiseksi, kuinka paljon yhdistelmä-DNA-mo-25 lekyylien DNA:ta tarvitaan sitomaan 12 ^ug:ssa poly(A)RNA:ta oleva IFN-€(mRNA, arvioitiin poly (A) RNA:n IFN-OtRNA-pitoisuus.

Yksi /Ug poly (A) RNA: ta muodostaa 500 IU IF:sää. IFN-oC:n 8 9 ominaisaktiivisuus on 2 x 10 - 2 x 10 IU/mg proteiinia.

500 IU IFN-flfcaa vastaa täten 500/2 x 10® = 2,5 x 10 ®mg 30 (2,5 ng - 500/10^ = 5 x 10 ^ mg (0,5 ng) interferonia.

Varhaismunasoluun injektoidun IFN-CCmRNA:n määrän ja muodostuneen IFN-0C-määrän suhdetta ei tunneta, ^-globiini-mRNA:n tapauksessa muodostuu noin 30 molekyyliä proteiinia yhtä mRNA-molekyyliä kohti tunnissa; vastaava arvo /3-gio-35 biinille on noin 6 /J.B. Gurdon et ai., Message Stability

In injected Frog Oocytes: Long Life Of Mammalian And /J-globin Messages, J. Mol. Biol. 80 (1973) 539-5517. Oletettaessa, 34 86558 että vastaava keskimääräinen arvo IFN-otlle on 20 ja että IFN-0(:n molekyylipaino on 18 000 ja IFN-QttnRNA:n molekyyli-paino 330 000, niin 24 mg (18 000/330 000 x 20 x 24) IFN-OC: aa pitäisi muodostua 24 tunnissa yhtä mg:aa kohti injektoitua 5 IFN-CtmRNA:ta. IFN-Ofcn ominaisaktiivisuuden ollessa 2 x 10^/mg (2 x 102 IU/ng) 1 ng IFN-OCmRNA: ta tuottaisi 26 x 2 x 102 = 3 9 5,2 x 10 IU IFN-ofcaa. Jos ominaisaktiivisuus on 10 /mg 3 4 (10 IU/ng), muodostuneen IFN- :n määrä olisi 2,6 x 104 IU.

Koska 1 ^ug leukosyytti-poly(A)RNA:ta tuottaa 500 IU IFN-<*:aa 10 edellä määritellyissä olosuhteissa, IFN-OCmRNA: n pitoisuus 1 ^ug:ssa poly (A) RNA: ta olisi 0,1 - 0,02 ng ja IFN-ctmRNA: n osuus leukosyytti-poly(A)RNA:ssa olisi 1:10 000 - 1:50 000.

Täten 12 ^,ug poly (A) RNA: ta sisältää noin 1,2 - 0,2 ng IFN-OCmRNA: ta.

15 Siinä tapauksessa, että IFN-OCmRNA:n translaatiosuh- de varhaismunasoluissa on yhtä kertalukua pienempi kuin globiini-mRNA:n keskimääräinen translaatiosuhde, poly (A) -RNA:n IFN-cCmRNA-pitoisuus olisi kymmenen kertaa suurempi kuin edellä on laskettu eli 1:1 000 - 1:5 000. Tällöin 20 12 ^ug poly (A) RNA: ta sisältäisi noin 12-2 ng IFN-OCmRNA: ta.

Toisaalta siinä tapauksessa, että IFN-ctmRNA:n translaatiosuhde varhaismunasoluissa on yhtä kertalukua suurempi kuin globiini-mRNA:n keskimääräinen translaatiosuhde, poly (A) -RNA:n IFN-OCmRNA-pitoisuus olisi kymmenen kertaa pienempi 25 kuin edellä on laskettu eli 1:100 000 - 1:500 000. Tällöin 12 ^,ug poly (A) RNA: ta sisältäisi 0,1 - 0,02 ng IFN-CCmRNA: ta.

Plasmidissa pBR322 on 4361 emäsparia. IFN-0CmRNA:n täydellinen cDNA lisäisi noin 800 - 1 000 emäsparia pBR322-plasmidiin pBR322-IFN-ofc:DNA:n muodostuessa, jolloin tuot-30 teessä on yhteensä noin 5 200 - 5 400 emäsparia. Sen molekyylipaino olisi täten noin 12 kertaa suurempi (2x5 200/ 800) kuin pelkän IFN-CtmRNA:n. Jotta tällöin saataisiin sidotuksi 12 ^,ug:aan poly (A) RNA: ta edellä laskettu määrä IFN-OCmRNA:ta, joka pystytään määrittämään, tarvitaan 12-ker-35 täinen määrä yhdistelmä-DNA-molekyylejä IFN-0CmRNA:n määrään verrattuna (stökiometrinen määrä).

35 86558

Koska yhdistelraä-DNA-molekyylien valmistukseen käytetyn poly(A)RNA:n IFN-OQnRNA-pitoisuus oli noussut 10-40-kertaiseksi raakaan poly(A)RNAzhan verrattuna, 512 kloonin ryhmässä pitäisi olla 10-40 -kertainen määrä klooneja, 5 jotka sisältävät halutun IFN-OdnRNA:n, edellä laskettuun määrään verrattuna.

Jos IFN-<XmRNA: ta on mukana yksi osa tuhannesta RNA-molekyylistä raa'assa poly(A)RNA:ssa, niin 12 ^ug poly(A)-RNA:ta sisältää 12 ng IFN-0(mRNA: ta ja IFN-C<cDNA-plasmidin 10 stökiometrinen määrä on 144 ng. Koska 512 kloonin ryhmä sisältää ainakin viisi kloonia, joihin IFN-OcDNA on liittynyt, tarvittava hybridiplasmidi-DNA:n kokonaismäärä on -3 14,8 yug (144 x 512/5 x 10 ). Jos IFN-amRNA:ta on mukana yksi osa 10 000:stn, niin 12 ^uq poly(Λ)RNA:ta sisältää 15 1,2 ng IFN-CCmRNA: ta ja tarvittava IFN-QficDNA-plasmidin määrä on 14,4 ng. 512 kloonin ryhmä sisältää joko yhden tai ei yhtään IFN-OCcDNA-sekvenssiä, joten tarvittava hybridiplas-midi-DNA:n kokonaismäärä on 7,4 ^ug (14,4 x 512 x 10 ^).

Jos IFN-CCmRNA: ta esiintyy yksi osa 100 000:ssa, niin tar-20 vittava hybridiplasmidi-DNA:n kokonaismäärä on 0,74 ,ug (1,44 x 512 x 10 ). Sen varmistamiseksi, että hybridi- sointireaktion aikana DNAzta on koko ajan ylimäärin mukana ‘ (yhdistelmä-DNA: ta on ylimäärin verrattuna poly (A) RNA: n määrään), reaktioon valittiin 20 ^ug seosta (noin 1,4 -25 30-kertainen ylimäärä).

Hybridisointi täytyy suorittaa sellaisissa olosuhteissa, joissa voidaan varmistautua siitä, että (a) poly-(A)RNA:n hybridisoitunut osa saadaan talteen vahingoittumattomana ja biologisesti aktiivisessa muodossa, (b) että 30 ei-spesifisten DNA-mRNA-hybridien muodostuminen estetään ja (c) että hybridisointireaktio etenee loppuun ainakin 75-%:isesti. Nämä olosuhteet mitä todennäköisimmin saavutetaan suorittamalla hybridisointi reaktioväliaineessa, joka sisältää 80 t formamidia ja 0,4-m NaCL /j. Casey ja 35 n. Davidson, RAtes Of Formation And Thermal Stability Of RNA: DNA And DNA .‘DNA Duplexes At high Concentrations Of Formamide, Nucleic Acids Res. 4 (1977) 1539-1552/. Tällai- 36 8 6 558 sessa liuoksessa hybridisointi voidaan suorittaa noin 40°C:n lämpötilassa (ilman formamidia tarvittava lämpötila on 60-70°C). Alemmat lämpötilat ovat edullisia poly(A)RNA:n hajoamisen estämiseksi. Esillä olevan hybridisointireaktion 5 lämpötilaksi valittiin 56°C. Tämä on noin 3°C alhaisempi kuin T | ^ j · ('<u;cy ja N. Davidson, edellä) ja noin ΙΟΙ 3°C ailiaisempi kuin T^^ ^ (Hamaguchi & Geidushek, J. Amer. Chem. Soc. 84 1392) . Täten tässä lämpötilassa sekvenssien, jotka ovat vähemmän kuin 87-%:isesti homologisia, ei pitäisi 10 hybridisoitua, koska l-%:inen epähomologisuus alentaa

Tl/2 (3-arvoa l°C:ssa /Ί·.Ρ. Bonner et ai., Reduction In The Rate Of DNA Reassociation By Sequence Divergence, J. Mol. Biol. 81 (1973) 123-135/.

Esillä olevassa tapauksessa DNA:DNA-hybridien muo-15 dostuminen ei ole olennainen ongelma, koska käytettävä DNA-seos koostuu samasta vektorista (pBR322) ja erilaisista cDNA-sekvensseistä. Täten suurin osa DNA-sekvensseistä tulee olemaan heteroduplekseja, joissa DNA-fragmentit ovat käytettävissä poly(A)RNA:n kanssa muodostuvaan hybridi-20 tuotteeseen. On erittäin epätodennäköistä, että komplementaariset cDNA-fragmentit, jotka muodostavat osan duplek-seista, reagoisivat toistensa kanssa topologisten esteiden johdosta. Joka tapauksessa käytetyissä reaktio-olosuhteissa DNA:DNA-hybridien muodostuminen on saatu minimoidukai (J.

25 Casey ja N. Davidson, edellä).

Reaktioaika, jolla varmistetaan reaktion eteneminen 75-%:isesti loppuun, määritettiin käyttämällä toisen kertaluvun reaktionopeusyhtälöä: 30 Co - Ro + Ro (1 - ^-)

i KO

....... ’ ’ R

(1 - ~-) Co -kR (&T= "ro)- =3'9h 35 jossa R = hybridisoidun RNA:n nukleotidien moolipitoisuus, 37 86 558

Co = alkuperäisen hybridisoitavan DNA:n nukleotidien moolipitoisuus,

Ro = alkuperäisen hybridisoitavan RNA:n nukleotidien moolipitoisuus, 5 k = RNA-DNA-hybridisoinnin nopeusvakio, t = aika (sek), ja — = 0,75 (reaktio edennyt 75-%:isesti loppuun)

RO

-^q kR = 472 (kR = 1/12 kD (J. Casey ja N. Davidson, edellä), joss.i k^ = toisen kertaluvun nopeusvakio DNA:lie käytetyissä hybridisointiolosuhteissa, ja 15 kd = 1,7 x 105 x L1^2 x N-1 /J.R. Hutton ja J.G.

Wetmur, Renaturation Of Bacteriophage X174 DNA-RNA Hybrid: RNA Length Effect And Nucleation Rate Constant, J. Mol. Biol., 77 (1973) 495-500./, L = 900 (ketjun pituus emäspareissa ilmaistuna; 2o noin 900 emäsparia on mukana koko IFN-o(cDNA-insert issä) , N = 900 (hybridiketjun kompleksisuus emäspareissa ilmaistuna; tässä tapauksessa kompleksisuus on 900, koska ' / IFN-ocmRNA:n 900 nukleotidiä liittyy IFN-flCcDNA-insertin komplementaarisiin 900 nukleotidiin), 25 Co 2,5 x 10 ^ (perustuu siihen, että reaktiossa käytetään 40 ^ul liuosta, joka sisältää aikaisemmin määri- ____ tetyn 20 ^ug:n määrän yhdistelmä-DNA-molekyylejä, jolloin oletetaan, että IFN-OCcDNA-fragmenttia on mukana 1/12 yh-distelmä-DNA-molekyylin määrästä ja että se esiintyy aina-30 kin yhdessä kloonissa 512 kloonin ryhmästä ja että yhden DNA-emäsparin keskimääräinen molekyylipaino on 662) “8

Ro = 8,7 x 10 (perustuu siihen, että reaktiossa käytetään 40 ^,ul liuosta, joka sisältää aikaisemmin määritetyn 12 ^,ug:n määrän poly (A) RNA: ta , jolloin oletetaan, 35 että poly(A)RNA sisältää 1/10 000 IFN-OfmRNA: ta (suuresta RNA:n ylimäärästä johtuen erilaisella osuudella ei ole 38 8 6 5 5 8 juuri vaikutusta hybridisointinopeuteen) ja että RNA:n yhden ribonukleotidin keskimääräinen molekyylipaino on 343) .

3. Alustavan määrityksen suoritus 5 Vaihe A: Yhdistelmä-DNA-molekyyliseoksen valmistus ja molekyylien katkaisu

Haluttu määrä bakteeriklooneja siirrostettiin agar-maljoille tryptonialustalle, jossa oJi samat lisäaineet kuin edellä, siirtämällä maljalle näyte kunkin mikrotiitteri-10 levyn syvennyksestä mekaanisesti. Klooneja inkuboitiin 37°C:ssa, jolloin kukin klooni oli muodostanut pesäkkeen, jonka halkaisija oli useita millimetrejä. Kaikki pesäkkeet huuhdottiin irti levyiltä ja yhdistettiin siirrokseksi, jolla sitten siirrostettiin 2 l:n erlenmeyerpullossa oleva tryptoni-15 elatusaine (tilavuus 1 litra, samat lisäaineet kuin edellä). Siirrosta viljeltiin ravistusvil jelmänä 37°C: ssa , kunnes sen OD65o-arv° oli noin 0,8 (arvioitu visuaalisesti). Viljelmään lisättiin yhtä suuri tilavuus tryptonielatusainetta lisä-aineineen ja kloramfenikolia niin, että sen pitoisuudeksi 20 tuli 170 yug/ml ja viljelmää ravisteltiin edelleen 37°C:ssa 16 tuntia. Sen jälkeen lisättiin 20 ml kloroformia, ja viljelmää ravisteltiin taas 37°C:ssa 10 minuuttia bakteerien tuhoamiseksi (C. Weissmann ja W. Voll, edellä). Kloroformi dekantoitiin erilleen viljelmästä, ja solut erotettiin 25 sentrifugoimalla (Sorvali GS3 -roottori) 15 minuuttia kier-rosnopeudella 6 000 rpm 4°C:ssa. Noin 1-2 g soluja saatiin kustakin yhden l:n valmisteesta. Solut suspendoitiin 30 ml:aan 20 x 10 ^-m Tris-HCl (pH 7,5), suspensiota sentri-fugoitiin 20 minuuttia kierrosnopeudella 5 000 rpm 4°C:ssa 30 (Sorvali SW -roottori) ja sen jälkeen solut suspendoitiin - 3 uudelleen 30 ml:aan 50 x 10 -m Tris-HCl (pH 7,5). Suspensioon lisättiin 0,25-kertainen tilavuus lysotsyymiliuosta /10 mg/ml 50 x 10 ^-m Tris-HCl-puskurissa (pH 7,5)_7, seosta jäähdytettiin 10 minuuttia 0°C:ssa, minkä jälkeen li-35 sättiin 0,33-kertainen tilavuus (laskettu alkuperäisen _ 3 50 x 10 -m Tris-HCl-viljelmäsuspension tilavuudesta) 0,5-m EDTA:ta (pH 8,0) varovasti sekoittaen ravistelematta.

39 86 558

Seosta jäähdytettiin uudelleen 10 minuuttia 0°C:ssa, minkä jälkeen lisättiin 1/16-kertainen tilavuus (laskettuna taas alkuperäisestä tilavuudesta) 2-%:ista Triton-X-100 -liuosta. 60 minuutin kuluttua näytettä sentrifugoitiin 60 minuuttia 5 kierrosnopeudol1 a 10 000 rpm 0°C:ssa Sorvali SW -roottorissa. Pintaneste siirrettiin magneettisekoittajalla varustettuun dekantterilasiin, ja sen jälkeen lisättiin 3-m NaOH sekoittaen, kunnes liuoksen pH oli 12,5 20°C:ssa mitattuna käyttäen lasielektrodia ja Orion Research Model 601 pH-mit-10 taria ja standardoimisaineena Beckman pH 10 -karbonaatti- puskuristandardia (nro 3505). Liuosta sekoitettiin 10 minuuttia 20°C:ssa, minkä jälkeen liuoksen pH säädettiin 8,5:teen. Liuosta sekoitettiin edelleen kolme minuuttia, ja sen jälkeen lisättiin 1/9-kertainen tilavuus 5-m NaCl ja yksi tila-15 vuus fenolia (tislattu ja tasapainotettu 9,5-m NaCl:lla) ja sekoitettiin voimakkaasti viisi minuuttia. Faasit erotettiin sentrifugoimalla (GSA Sorvali -roottori) kierrosnopeu-della LO 000 rpm 0°C:ssa 10 minuutin ajan. Pintancste, joka sisälsi muotoa I olevan DNA:n (renkaanmuotoinen kaksi-20 juosteinen DNA), erotettiin varovasti interfaasista (joka sisältää yksijuosteisen DNA:n) ja uutettiin kolme kertaa kloroformilla. (Fenoli täytyy poistaa suurimmaksi osaksi tässä vaiheessa.) Muotoa I oleva DNA-fraktio sisältää ne yhdistelmä-DNA-molekyylit (liitetty -BR322-cDNA), joita on 25 alunperin käytetty transformoitaessa niitä isäntäsoluja, jotka muodostavat osan reaktioon käytetyistä 512 kloonista.

Haiman RNA:aasia A (5 mg/ml, esi lämmitetty 10 minuuttia 85°C:ssa) lisättiin muotoa I olevaan DNA:han niin, että sen pitoisuudeksi tuli 20 yug/ml, ja seosta inkuboi-50 tiin 60 minuuttia 37°C:ssa. 1/5-kertainen tilavuus 5-m NaCl lisättiin, ja sen jälkeen lisättiin 30-7.: ista polyetyleeni-glykolia 6000 (Union Carbide, autoklaavikäsitelty 20 minuuttia 120°C:ssa) niin, että sen lopulliseksi pitoisuudeksi tuli 7,5 %. Seosta pidettiin 2-6 tuntia -10°C:ssa, minkä 35 jälkeen muodostunut saostuma erotettiin sentrifugoimalla Sorvali SW -roottorissa 20 minuuttia kierrosnopeudella 8 000 rpm 0°C:ssn, sen jälkeen sakka liuotettiin liuokseen, 40 86 558 joka sisälsi 0,075-m NaCl ja 0,0075-m Na-sitraattia, kunnes liuoksen absorbanssi oli 20 260 nm:n kohdalta mitattuna, ja liuoksen SDS-pitoisuus säädettiin 0,5-%:iseksi. Liuosta inkuboitiin 30 minuuttia 37°C:ssa 0,5 mg/ml-pitoisessa pro-5 naasissa (hajotettu pitoisuudessa 20 mg/ml kaksi tuntia 37°C:ssa), minkä jälkeen tuote uutettiin kolme kertaa yhtä suurella tilavuudella tislattua fenolia ja kaksi kertaa yhtä suurella tilavuudella kloroformia. Näyte (korkeintaan 2 ml DNA-liuoksesta, jonka pitoisuus oli 1 mg/ml) sentrifu- _ o 10 goitiin käyttäen 5-23-%: ista sakkaroosigradienttia 50 x 10 -m _ 3

Tris-HCl-puskurissa (pH 7,5), jossa oli mukana 1 x 10 -m EDTA, 15 tunnin ajan kierrosnopeudcila 21 000 rpm L5°C:ssa SW 27 Beckman -roottorissa. Fraktiot erotettiin, ja niiden OD260-arvo DNA:ta sisältävät fraktiot yhdistet- 15 tiin, ja DNA saostettiin natriumasetaatilla ja etanolilla. SEntrifugoimalla saatiin 20-100 ^ug seosta, jossa DNA oli muodossa I.

20 ,ug puhdistettua DNA:ta (muodossa I) käsiteltiin / -3 seoksella, jossa oli 150 ^ul 10 x 10 -m Tris-HCl (pH 7,5), 20 6 x 10 ^-m MgCl2, 50 x 10 ^-m NaCl, 6 x 10 3-m 2-merkapto- etanolia, 200 ^ug/ml BSA:ta tai gelatiinia ja 20 yksikköä Hindlll-restriktioendonukleaasia (New England Biolabs). Hindlll-restriktioentsyymi katkaisee muotoa I olevan DNA:n kohdasta, joka sijaitsee pBR322-fragmentissa (on epätoden-25 näköistä, että myös cDNA-osa hajoaa, mutta jos näin tapahtuu, sen ei pitäisi olennaisesti vaikuttaa määritykseen). Käsittelyaika oli kaksi tuntia 37°C:n lämpötilassa, minkä jälkeen reaktioseoksesta otettiin näyte (1 %), joka analysoitiin elektroforeettisesti käyttäen l-%:ista agaroosigeeliä liuok- 30 sessa, joka sisälsi 50 x 10 -m Tris-asetaattia (pH 7,8) ja -3 2 x 10 -m EDTA, yhden tunnin ajan 50 mA:lla, sen varmistamiseksi, että hajotus olisi täydellinen. Jos DNA ei ollut täydellisesti hajonnut, Hindlll-restriktioentsyymiä lisättiin ja inkubointia jatkettiin kaksi tuntia. Kun renkaan-35 muotoinen DNA oli muuttunut täydellisesti lineaariseen muotoon, pronaasia (Calbiochem), EDTA:ta ja SDS:ää lisättiin -3 niin, että niiden pitoisuudet olivat 0,5 mg/ml, 10 x 10 -m *1 86558 ja 0,5 %. Seosta inkuboitiin 30 minuuttia 37°C:ssa, minkä jälkeen liuos uutettiin 30 ,ul:lla fenoli/kloroformi-seosta -3 (1:1). Orgaaninen faasi pestiin 50 ,ul:lla 20 x 10 -m Tris- f - 3 HCl-puskuria (pH 7,5), jossa oli mukana 1 x 10 -m EDTA, 5 vesifaasit yhdistettiin ja uutettiin kolme kertaa eetterillä, suodatettiin 0,1 ml:n Chelex-pylvään läpi, kerättiin Pyrex®-putkeen, jossa oli keitetty EDTA:ta, lisättiin 1/10-kertainen tilavuus 3-m natriumasetaattia ja 2,5-kertainen tilavuus etanolia, jolloin DNA saostui. Reaktioseoksen an-10 nettiin olla yön yli -20°C:ssa, minkä jälkeen DNA erotettiin sentrifugoimalla.

Vaihe B: DNA:n ja poly(A)RNA:n hybridisointi Valmistettiin kaksi hybridisointiseosta. Seos I sisälsi 4 ^,ul 10-kertaisesti konsentroitua hybridisointipus-15 kuria /4-m NaCl, 0,1 PIPES (pH 6,4), 1,4-piperatsiinidietaa- -3 nisulfonihappo, Sigma/, 50 x 10 -m EDTA, 0,5 ,ul (noin 125 ' 5 ng) I-globiini-mRNA:ta (5 000 cpm) ja 6 yUl indusoitua leukosyytti-poly (A) RNA: ta (2 ^ug/^,ul) , joka määrä tarvittiin muodostamaan 6 000 IU IFN-interferonia varhaismuna-20 soluihin injektoitaessa. Seos II sisälsi 10 ^,ug HindTll-rcstriktioentsyymillä hajotettua DNA:ta (saatu edellä) ja 0,1 yug Pstl-restriktioentsyymillä hajotettua Z-pBR322(H3)/ Rc/JG-4.13 (pBR322-johdannainen , joka s i sä L tää /3-globi i ni-sekvenssin Hindlll-katkaisukohdassa) /Mantei et ai., Rabbit 25 /J-globin mRNA Production In Mouse L Cells Transformed With

Cloned Rabbit /3-globin Chromosomal DNA, Nature 281 (1979) ... 125

40-4(j7. Seoksessa I I-globiini-mRNA:n ja seoksessa II

$-globiini-DNA:n tarkoitus on toimia hybridisoinnin sisäisinä positiivisina standardeina. Molemmat seokset kuivatko tiin typpikaasuvirrassa. 40 ^,ul 80-%:ista formamidia lisättiin seoksen II jäljelle jääneeseen osaan, ja liuos denaturoitiin 10 minuutin ajan 100°C:ssa ja jäähdytettiin nopeasti jäähauteessa. Denaturoitua liuosta käytettiin seoksen I jäljellä olevan osan liuotukseen, ja näin muodostunutta 35 liuosta inkuboitiin 56°C:ssa neljä tuntia.

42 86558

Vaihe C: Hybridisoituneen poly(A)RNA-DNA:n erotus ei-hybridisoituneesta poly(A)RNA:sta

Edellisestä vaiheesta saatu liuos laimennettiin 1 ml:ksi kylmällä liuoksella, joka sisälsi 0,9-m NaCl ja 5 0,09-m Na-sitraattia, ja formamidilla (100 %) niin, että sen pitoisuudeksi tuli 4 % (tilavuus), minkä jälkeen liuos suodatettiin nopeudella 0,5 ml/min Millipore-suodattimen läpi (huokoskoko 0,45 ^,um) , tällöin käytettävän suodattimen kyky pidättää RNA-DNA-hybridejä oli etukäteen testattu, 10 koska kaikki valmistajalta saadut suodattimet eivät olleet yhtä tehokkaita.

Vaihe D: Hybridisoituneen poly(A)RNA:n puhdistus

Edellä mainittu suodatin, johon poly(A)RNA-hybri-dit olivat kiinnittyneet, upotettiin 1 ml:aan puskuria, jo-15 ka sisälsi 0,15-m NaCl, 0,015-m Na-sitraattia ja 0,5 % SDS, 10 minuutiksi 37°C:n lämpötilassa, ja suodatin huuh- - 3 deltiin sen jälkeen liuoksella, joka sisälsi 50 x 10 -m Tris-HCl (pH 7,5), 10 x 10_3-m MgCl2 ja 2 x 10~3-m CaCl2, ja asetettiin sitten 0,6 ml:aan tuoretta puskuria. Lisät-20 tiin 5 ^ul jodiasetaatilla käsiteltyä DNA:aasia (5 mg/ml) /S.B. Zimmermann ja G. Sandeen, Anal. Biochem. 14 (1966) 269, P.A. Price et ai., Alkylation Of A Histidine Residue At The Active Site Of Bovine Pancreatic Deoxyribonuclease, J. Biol. Chem. 244 (1969) 924-932J7, ja suodatinta inkuboi-25 tiin 37°C:ssa 10 minuuttia.

Suodatin poistettiin inkubointiliuoksesta, ja inku-bointiliuos uutettiin yhtä suurella tilavuudella fenolia sekä yhtä suurella tilavuudella eetteriä ja johdettiin sen jälkeen 0,1 ml:n Chelex-pylvään läpi. Liuokseen lisättiin 30 5 yug kantaja-RNA:ta (puhdistettua hiivan RNA:ta), ja RNA

saostettiin natriumasetaatilla ja etanolilla. Sakka erotettiin sentrifugoimalla kierrosnopeudella 10 000 g, liuotet- -3 tiin 100 ^ul:aan 1 x 10 -m EDTA:ta, liuosta kuumennettiin 90 sekuntia 100°C:ssa, minkä jälkeen lisättiin TNE ja SDS 35 niin, että niiden pitoisuudet olivat 2 x TNE ja 0,5 % SDS. RNA adsorboitiin 100 ^ul:n oligo(dT)selluloosapylvääseen, eluoitiin pesemällä neljä kertaa 0,3 ml:11a tislattua vettä 43 86 558 ja saostettiin natriumasetaatilla ja etanolilla. Seoksen annettiin olla 16 tuntia -20°C:ssa, minkä jälkeen saostunut RNA erotettiin sentrifugoimalla ja liuotettiin sen jälkeen 2 ^,ul:aan TNK-puskuria.

5 Vaihe E: IFN-OmRNA-aktiivisuuden määritys

Edellisestä vaiheesta saatua poly(A)RNA-liuosta injektoitiin 40 varhaismunasoluun (noin 50 nl kuhunkin). Var-haismunasoluja inkuboitiin 23°C:ssa 24-48 tuntia, ne homogenisoitiin ja sentrifugoitiin (tai inkubointiväliaine ero-10 tettiin), minkä jälkeen IFN-Ä-aktiivisuus määritettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla.

4. Hybridisointi suodattimeen sitoutuneeseen DNA:hän Suurin osa seuraavista yksittäisestä kloonista peräisin olevaa yhdistelmä-DNA-molckyyliä koskevista kokeista 15 suoritettiin käyttäen DBM:ää tai DTP-paperiin sidottua DNA:ta, koska koeolosuhteet eivät enää olleet kriittisiä ja koska tällainen koemenetelmä on helpompi suorittaa. DTP-paperia käytettäessä tausta vaikutti hyvin vähän tuloksiin, ja sitä käytettiin edullisesti. DBM-paperi valmis-20 tettiin J.C. Alwinen et ai. kuvaamalla menetelmällä,

Method For Detection Of Specific RNAs In Agarose Gels By Transfer To Diazobenzyl Oxymethyl-Paper And Hybridisation With DNA Probes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 14 (1977) 5350-5354. ATP-paperi valmistettiin B. Seedin kuvaamalla mene-25 telmällä (henkilökohtainen tiedonanto): Whatman 540 -pape-rilevyjä (20 g) käsiteltiin 16 tunnin ajan 20°C:ssa seoksella, joka sisälsi 70 ml 0,5-m NaOH, 2 mg/ml NaBH^ ja 30 ml 1,4-butaanidiolidiglysidyylieetteriä. Paperi siirrettiin sitten liuokseen, jossa oli 10 ml 2-aminotiofenolia 30 ja 40 ml asetonia, ja sekoitettiin 10 tunnin ajan. Paperi pestiin perusteellisesti asetonilla, 0,1-n HCl:llä, vedellä, 0,1-n HCl:llä sekä vedellä ja kuivattiin. ATP-paperi diatsotoitiin DBM-paperiin ABM:n muuttamiseksi DBM-paperik-si (Alwine et ai., edellä).

-i- 2 DNA (korkeintaan 15 ^ug) sidottiin 50 mm :n alueelle diatsotoitua ABMrää (DBM) tai diatsotoitua ATP (DTP)-paperia J.H.J. Hoeijmakersin et ai. kuvaamalla menetelmällä ** 865S8 /The Isolation Of Plasmids Containing DNA Complementary To Messenger RNA For Variant Surface Glycoproteins Of Trypanosoma Brucei, Gene (1980) (painossa)/, joka kuvataan seuraavassa.

5 Hybridiplasmidi-DNA käsiteltiin Pstl-restriktioen- donukleaasilla ja sen jälkeen 500 ,ug:lla pronaasia/ml -3 ' (mukana 0,5-% SDS sekä 10 x 10 -m EDTA), 30 minuutin ajan 37°C:ssa, seos uutettiin fenolilla ja eetterillä, johdettiin 0,1 ml:n Chelex-pylvään läpi ja saostettiin etanolil- 10 la. Lämpödenaturoitua DNA:ta (korkeintaan 5 ,ug:n näyte, 32 johon oli lisätty pieni määrä P-DNA:ta merkkiaineeksi) inkuboitiin yön yli 0°C:ssa DBM- tai DTP-paperin (1 cm^) -3 läsnäollessa 200 yUl:ssa 25 x 10 -m kaliumfosfaattipusku-ria (pH 6,5). Suodattimet pestiin kolme kertaa viiden mi-15 nuutin ajan huoneen lämpötilassa 50 x 10 -m kaliumfosfaat-tipuskurilla (pH 6,5), jossa oli mukana 1 % glysiiniä, ja kolme kertaa 99-%:isella uudelleenkiteytetyllä formamidilla. Suodattimia inkuboitiin 99-%:isessa formamidissa kahden minuutin ajan 68°C:ssa, minkä jälkeen ne pestiin kolme kertaa 20 50 x 10 -m kaliumfosfaattipuskurissa (pH 6,5) 20°C:ssa ja kaksi kertaa 0,4-m NaOH:ssa 37°C:ssa 10 minuutin ajan. Noin 40-60 % radioaktiivisuudesta pysyi suodattimilla. Suodattimia inkuboitiin kolme tuntia 38°C:ssa esihybridisointi-väliaineessa A, johon oli lisätty 1 % glysiiniä, käyttäen 25 330 ^,ul väliainetta yhtä suodatinta kohti. Väliaine A si sälsi 50 % formamidia, 5 x SSC, 0,04 % polyvinyylipyrroli-donia, 0,04 % Ficoll (Pharmacia), 0,1 % SDS, 25 ^ug poly(A) (P & L) ja 100 yug hiivan RNA:ta (BDH, uutettu kuusi kertaa fenolilla ja saostettu etanolilla) . Suodattimet pestiin 30 kahdesti väliaineessa A, minkä jälkeen ne hybridisoitiin : 16 tunnin ajan 38°C:ssa poly(A)RNA:n kanssa (tavallisesti 5-8 yug) väliaineessa A parafiiniöljyn suojaamana. RNA lisättiin seuraavasti: yksi märkä DNA-suodatin kuivattiin imupaperilla ja asetettiin steriiliin petrimaijaan, 20-35 40 ^ul RNA-liuosta pipetoitiin tälle suodattimelle ja toi nen DNA-suodatin (joko rinnakkaisnäyte tai standardinäyte) asetettiin sen päälle, ja päällimmäinen suodatin päällystet- 45 8 6 5 58 tiin steriilillä parafiiniöljyllä. Hybridisoinnin jälkeen suodattimet pestiin peräkkäin väliaineella A (kaksi kertaa), -3 liuoksella, joka sisälsi 1 x SSC, 0,2 % SDS ja 1 x 10 -m EDTA (kolme kertaa 20°C:ssa, kukin kerta 10 minuuttia), vä-5 liaineella A (kaksi tuntia 38°C:ssa) ja liuoksella, joka sisälsi 50 % formamidia, 2 x SSC ja 0,1 % SDS (kolme kertaa 20°C:ssa, kukin kerta 10 minuuttia). Hybridisoitunut RNA eluoitiin kuumentamalla suodattimia yhden minuutin ajan 100°C:ssa 200 ^ul:ssa liuosta, joka sisälsi 10 x 10 3-m 10 Tris-HCl (pH 7,4), 1 x 10-3-m EDTA ja 0,1 % SDS. Eluointi suoritettiin kahdesti, eluaatit yhdistettiin, lisättiin 2 yug hiivan RNA:ta (puhdistettu kuten edellä), ja RNA saostettiin etanolilla. Pelletti pestiin ja kuivattiin tyhjössä, liuotettiin 3 ^uliaan vettä ja injektoitiin varhaisia munasoluihin. IFN-ot-aktiivisuus määritettiin kuten aikaisemmin on kuvattu.

5. Tulokset RNA-selektiohybridisointimäärityksestä Kahdeksan ryhmää (512 kloonia kussakin) osoittautui negatiiviseksi (ryhmät T, Y, j, K, ·, O, £ ja TT). Neljä ryh-20 mää osoittautui positiiviseksi (ryhmät I,<5 , N ja λ) · Positiiviset tulokset on ilmoitettu seuraavassa muodossa: yksikköinä IU/ml IFN-OC, jonka poly (A) RNA-DNA-hybridistä vapautunut RNA on muodostanut (standardihybridisointimääri-tys, jossa käytettiin Z-pBR322 (H3)/Rc/iG-4.13, edellä), ko-25 keet, joista saatiin taustastandardia korkeammat tulokset, on alleviivattu.

Ryhmä lU/ml I <60 (<60) ; 3Λ0 (<20) ; <110 «110); <110 (<110) ; <35 (<35) 30 5 20 (<20) N 35 (<20); <110 (<110); 200 (<110) \ <60 (<60) ; 60 «20); <110 «110); <110 (<110)

Ryhmä A. jaettiin edelleen kahdeksaan alaryhmään, joista kussakin oli 64 kloonia, minkä jälkeen suoritettiin 35 hybridisointi ja aktiivisuusmääritys, kuten edellä. Alaryhmistä saatiin sournavat tulokset, jotka on esitetty samassa muodossa kuin edellä: 46 86 558

Alaryhmä IU/ml λ - I <35 (<35); <35 (<35) λ- II 130 «30); <45 «45) λ- III 225 «35) ; 35 «30) ; 35 (<30) ; 600 (<30) ; 5 <20 «20) A - IV 85 (<35) ; <25 «25) λ - V <35 (<35) λ- VI <35 «35) λ- VII <35 «35) 10 λ.- VIII <35 «35)

Alaryhmä λ,-Ιΐΐ jaettiin kahdeksaan kahdeksan kloonin muodostelmaan jakeeseen, ja suoritettiin hybridisointi ja aktiivisuusmääritys kuten edellä:

Jae IU/ml 15 \-III-l <20 «20); <20 (60); 35 «30) λ-ΙΙΙ-2 <35 «35); <30 (<30) ; 150 «20); 600 «35); 110 (60) λ-ΙΙΙ-3 <25 (<25) ; <30 {<30) λ-ΙΙΙ-4 30 «30) ; <20 «20) ; <20 (60) 20 λ-ΙΙΙ-5 30 (?) «35) ; <20 «20); <35 (60) A-II1-6 <30 (<30) ; <20 «20) λ-ΙΙΙ-7 <30 «20) λ,-ΙΙΙ-8 <30 «20)

Koska ensimmäinen positiivinen tulos saatiin jakees-25 taA.-IH”4, tämän ryhmän yksittäiset pesäkkeet (merkitty A-H) hybridisoitiin, ja niistä suoritettiin aktiivisuusmääritys : λ.-ΙΙΙ-4-B <35X (<35) ; <20 (60) λ.-ΙΙΙ-4-C 35 (60) ; 60X (<35); 111X (<11); llx (<11); 30 20 «20) xTässä määrityksessä käytettiin DBM-paperimonetelmää.

Täten klooni λ.-ΙΙΙ-4-C sisältää yhdistelmä-DNA-mole-kyylin, joka pystyy hybridisoitumaan IFN-amRNA:n kanssa.

35 Tämän kloonin yhdistelmä-DNA-molekyyliä merkitään seuraavasti: Z-pBR322(Pst)/HcIF-4C ("Hif-4C"), ja sitä sisältävää bakteerikantaa merkitään: E. coli X1776 (Z-pBR322 47 B 6 5 5 8 (Pst)/HcIF-4C) ("E. coli Hif-4C"). Nämä nimitykset osoittavat, että yhdistelmä-DNA-molekyyli on peräisin Zurichistä (Z) ja että se on plasmidi pBR322, joka sisältää Pstl-kat-kaisukohdassa HIFN-OCcDNA: n ("HcIF") ja että kyseinen yhdis-5 telmä-DNA-molekyyli on peräisin kloonista λ.-ΙΙΙ-4-C ("4C").

Z-pBR322(Pst)/HcIF-4C:n uudelleenkloonaus ja karakterisointi

Koska tramsformoitujen solujen primääriset kloonit sisältävät satunnaisesti useamman kuin yhden yhdistelmä-DNA-10 molekyylilajin /Efstratiadis et ai., The Primary Structure Of Rabbit /J-globin mRNA As Determined From Cloned DNA, Cell 10 (1977) 571-585/, Hif-4C eristettiin bakteerikannasta E. coli X1776 (Hif-4C) ja puhdistettiin aikaisemmin kuvatulla menetelmällä. Hif-4C- ja pBR322-näytteet hajotettiin 15 Pstl-restriktioendonukleaasilla, ja hajoamistuotteet analysoitiin elektroforeettisesti l-%:isolla agaroosigeelillä. Hif-4C antoi tulokseksi kaksi vyöhykettä, toisen liikkuvuus vastasi Pst-endonukleaasilla katkaistua pBR322:ta ja toisen liikkuvuus vastasi noin 320 emäsparin pituista 20 sekvenssiä.

E. coli HB101 transformoitiin eristetyllä Hif-4C:llä edellä kuvatulla tavalla. Tranformaatiotuotteista erotettiin kuusi tetrasykliiniresistenttiä kloonia, näitä viljeltiin, ja muotoa I oleva DNA puhdistettiin ja analysoitiin hajot-25 tamalla se Pstl-restriktioendonukleaasilla ja tutkimalla hajoamistuotteet agaroosigeelielektroforeettisesti, kuten edellä. Kaikkien näytteiden hajoamistuotteet olivat samanlaisia kuin IIif-4C:tä saadut. Yhdelle näistä uudelleenkloo-natuista yhdistelmä-DNA-molekyyleistä annettiin nimi 30 Z-pBR322(Pst)/HcIF-4c (Hif-4c), ja sitä käytettiin myöhempiin kokeisiin. Pieni kirjain c merkitsee uudelleenkloo-nattua DNA-molekyyliä.

Sen määrittämiseksi, pystyykö Hif-4c ja sen cDNA-sekvenssi hybridisoitumaan IFN-Q£mRNA:n kanssa, Hif-4c 35 (115 ^ug) hajotettiin täydellisesti 125 yksiköllä Pstl- restriktioendonukleaasia, hajoamistuotteet uutettiin fenolilla ja kloroformilla ja saostettiin etanolilla edellä 48 86 558

kuvatulla tavalla. 10 ^.ug:n näyte merkittiin 5'-terminaali-sesti (se toimi merkkiaineena myöhemmissä vaiheissa) liuottamalla se 100 ^ul:aan 50 x 10 ^-m Tris-HCl (pH 7,5), johtamalla se 0,1 ml:n Chelex 100 -pylvään läpi ja käsittele-5 mällä sitä 0,6 yksiköllä bakteriaalista alkalista fosfataa-sia yhden tunnin ajan 65°C:ssa. Kymmenkertaisesti konsentroitua TNE:tä (40 ^ul) lisättiin, ja liuos uutettiin kolme kertaa yhtä suurella tilavuudella fenolia ja kolme kertaa yhtä suurella tilavuudella kloroformia. DNA saostettiin 10 kahdella tilavuudella etanolia -20°C:ssa yön yli ja erotettiin sentrifugoimalla. Lisäpuhdistus suoritettiin adsorboimalla 0,5 ml:aan TNA:ta liuotettu näyte 0,25 ml:n DEAE-sel-luloosapylvääseen (Whatman DE52) esipesty 2 ml:11a liuosta, joka sisälsi 150 x 10 ^-m NaCl, 50 x 10 ^-m Tris-HCl (pH

_3 15 7,5) ja 2 x 10 -m EDTA (NET-puskuri), pesemällä pylväs 2 ml:11a NET-puskuria, eluoimalla näyte 0,4 ml:11a liuosta, joka sisälsi 1,5-m NaCl, 20 x 10 ^-m Tris-HCl (pH 7,5) ja -3 2 x 10 -m EDTA, ja saostamalla tuote etanolilla. DNA in-32 kuboitiin Y- P-ATP:n (ominaisaktiivisuus noin 5000 Ci/ 20 mooli) ja polynukleotidikinaasin seoksessa /A.M. Maxam ja W. Gilbert, A New Method For Sequencing DNA, Proc. Natl.

Sei. USA 74 (1977) 560-564^ ja puhdistettiin kromatografi- sesti 3 ml:n Sephadex-G50-pylväässä TNE:ssä. Eluoidut frak- 32 tiot yhdistettiin, ja P-DNA saostettiin etanolilla kuten η 25 edellä, saanto oli noin 10 dpm.

Ei-merkitty Pstl-restriktioendonukleaasilla hajotet- 5 tu Hif-4c-DNA (90 /Ug) sekoitettiin 6 x 10 dpm:ään edellä 32 ' saatua P-merkittyä Pstl-endonukleaasilla hajotettua Hif-4c-DNA:ta, ja seos analysoitiin elektroforeettisesti 2-%:isella 30 agaroosigeelillä (10 x 20 x 0,7 cm) 50 x 10 -m Tris-ase-taattipuskurissa (pH 7,8) käyttäen 2,5 cm:n aukonleveyttä. Röntgenfilmi asetettiin geelille ja 320 emäsparin pituisen fragmentin sijainti määritettiin. Se geelin osa, joka si- 5 sälsi radioaktiivisen vyöhykkeen (1,3 x 10 dpm), leikat-35 tiin irti, murskattiin puristamalla se 2 ml:n muoviruiskun läpi ja uutettiin yön yli 4°C:ssa 10-kertaisella tilavuudella NET-puskuria (laskettu geelin tilavuudesta) sekoittaen 49 8 6 5 5 8 DNA adsorboitiin 0,1 ml:n hydroksiapatiittipylvääseen (esipesty 1 ml:11a NET-puskuria). Pylväs pestiin 1 ml:11a 0,1-m kaliumfosfaattipuskuria (pH 7,5) ja DNA eluoitiin 0,2 ml:lla 1-m kaliumfosfaattipuskuria. Eluaatti laimennet-5 tiin 10-kertaisesti steriilillä tislatulla vedellä, DNA adsorboitiin DEAR-pylvääseen ja eluoitiin siitä sekä saostet-tiin etanolilla kuten edellä. Tätä DNA:ta nimitetään "Hif-4c-fragmentiksi".

Hif-4c-fragmentti (120 ng) sidottiin DPT-paperiin 10 (0,5 x 0,5 cm) aikaisemmin kuvatulla tavalla. Standardina käytettiin 120 ng /J-globiini-cDNA-fragmenttia, joka oli katkaisu Hindlll-restriktioendonukleaasilla hybridiplasmi-dista Z-pBR322 (H3) RC/3G-4.13 /f1. Meyer et ai., Transposition Of AT-linked, Cloned DNA From One Vector To Another, 15 Experimentia 35 (1979) 35, ja N. Mantei et ai., edellä7, ja joka käsiteltiin samalla tavalla. Suodatinparit hybri-disoitiin poly(A)RNA:hän (20 ^ul), suodattimet pestiin ja RNA otettiin suodattimista telteen edellä kuvatulla tavalla. RNA injektoitiin varhaismunasoluihin, jolloin havait-20 tiin seuraavat IFN-Cfc-aktiivisuudet: DNA-fragmentti leukosyyt- hybridi- IFN- -aktiivisuus ti-poly(A)- sointiaika (IU/ml)xx (suori- RNA:n määräx tettu rinnakkais- (yug) määritys

Hif-4c 2,5 16 h 250;100 25 /3-globiini-cDNA 2,5 16 h 4;1

Hif-4c 7,5 16 h 3000;1000 /3~globiini-cDNA 7,5 16 h 4; 30

Hif-4c 7,5 5 h 1000;1000 ^-globiini-cDNA 7,5 5 h 10 ;1 30 X1 ,ug tätä RNA: ta tuotti 4 600 IU/ml IFN-OC-interferonia.

XX '

Varhaismunasoluviljelmästä 48 tunnin inkuboinnin jälkeen erotettu pintaneste, aktiivisuus määritetty menetelmällä, joka perustuu sytopaattisen vaikutuksen vähenemisen määritykseen (w.E. Stewart, II ja S.E. Suikin, edellä).

35 Täten Hif-4c sisältää sekvenssin, joka pystyy hybridisoitu-maan IFN-OC-mRNA:n kanssa.

so 86558

Sellaisten E. coli -kloonien identifiointi, jotka sisältävät Hif-4c;n insertin kanssa ristiin hybridisoitu-via yhdistelmä-DNA-molekyylejä

Koska yhdistelmä-DNA-molekyylin Hif-4c cDNA-insertti 5 sisälsi ainoastaan noin 320 emäsparia eli 1/3 IFN-rtmRNA:n arvioidusta koosta, edellä saatua puhdistettua Hif-4c-fragmenttia käytettiin mallina seulottaessa bakteerikloo-neja, jotka sisältävät yhdistelmä-DNA-molekyylejä, joissa on samoja hybridi-DNA-sekvenssejä (kuvio 3).

10 Aikaisemmin mainitun alaryhmän λ-ΙΙΙ muodostavat 64 bakteerikloonia kiinnitettiin Millipore-kalvolle (halkaisija 8 cm), kalvot sijoitettiin agarlevylle (johon oli lisätty diaminopimeliinihappoa, nalidiksiinihappoa ja tetrasykliiniä, kuten edellä), ja niitä inkuboitiin 24 tuntia 15 37°C:ssa. Suodatin asetettiin 0,75 ml:n päälle 0,5-m

NaOHrta, ja 2-3 minuutin kuluttua se asetettiin paperipyyh-keen päälle ylimääräisen nesteen poistamiseksi, ja tämä vaihe toistettiin. Suodatin neutralisoitiin käyttäen 1-m Tris-HCl (pH 7,5) ja pestiin liuoksella, joka sisälsi 1,5-m 20 NaCl ja 0,5-m Tris-HCl (pH 7,4), samalla tavalla kuin edellä ja kuivattiin ilmassa. Suodatin kastettiin 0,3-m NaClrssa, kuivattiin ilmassa ja lämmitettiin 80°C:ssa kaksi tuntia tyhjössä.

32

Hif-4c:n Pst-fragmentti (30 nq) merkittiin P:llä -...· 25 käyttäen nick-translaatiota [k. J. Jeffreys ja R. A. Fla- veli, The Rabbit ^-globin Gene Contains A Large Insert In *:·*: The Coding Sequence, Cell 12 (1977) 1097-110§7 Ä-^-P- :V: dATP:n ja ΟΙ-^^ρ-^ςτρ.n avulla (ominaisaktiivisuus 40 Ci/ millimooli kullakin). Suodatin, joka sisälsi λ.-111-pesäk-30 keet, esihybridisoitiin seitsemän tunnin ajan 68°C:ssa väliaineessa, joka sisälsi 4 x SET (SET = 0,15-m NaCl, 30 x 10 ^-m Tris-HCl (pH 8,0) ja 1 x 10 3-m EDTA), 0,1 % (pai-no/tilavuus) Ficoll, 0,1 % polyvinyylipyrrolidonia, 0,1 % (paino/tilavuus) BSA, 0,5 % SDS ja 200 y.ug/ml denaturoitua 35 fragmentoitua lohen sperman DNA:ta, ja sen jälkeen suori- 32 tettiin varsinainen hybridisointi P-merkityn Hif-4c-frag-mentin kanssa (2 x 10^ cpm) väliaineessa, joka sisälsi si 86558 4 x SET, 0,02 % (paino/tilavuus) Ficoll, 0,02 % polyvinyy-lipyrrolidiinia, 0,02 % (paino/tilavuus) BSA, 0,5 % SDS ja 200 yug/ml denaturoitua lohen sperman DNA:ta, 68°C:ssa 16 tunnin ajan. Suodatin huuhdeltiin SET-liuoksella, jossa oli 5 mukana 0,5 SDS, huoneen lämpötilassa, pestiin kaksinkertaisella tilavuudella SET-liuosta, jossa oli mukana 0,5 % SDS, viiden tunnin ajan 68°C:ssa, jolloin liuos vaihdettiin uu- _3 teen yhden kerran ja 3 x 10 -m Trizma-emäksellä huoneen lämpötilassa neljän tunnin ajan, jolloin liuos myös vaih-10 dettiin uuteen yhden kerran. Suodatin kuivattiin, minkä jälkeen röntgenfilmi asetettiin suodattimelle 80 tunnin ajaksi käyttäen kansiota. Kolmesta pesäkkeestä saatiin voimakas positiivinen reaktio, nimittäin pesäkkeistä X-III-7D, A.-III-2H ja A-III-4C, sen sijaan kahden pesäk-15 keen (λ.-111-ΙΕ ja JL-III-3D) reaktio oli heikko. Hif-4c-klooneja viljeltiin, muotoa I oleva DNA puhdistettiin, katkaistiin Pstl-restriktioentsyymillä ja analysoitiin elektroforeettisesti agaroosigeelillä, kuten edellä. Kaikista muotoa I olevista DNA-sekvensseistä muodostui suurem-20 pi fragmentti (vastasi plasmidia pBR322) ja pienempi fragmentti (hybridisekvenssi) . X,-III-2H-pesäkkeen yhdistelmä-DNA-molekyylistä vapautui suurin fragmentti, jonka pituus oli 900 emäsparia. Tälle yhdistelmä-DNA-molekyylille annettiin nimi Z-pBR322(Pst)/HcIF-2H ("Hif-2H") ja siihen siir-25 retylle fragmentille nimi ,'Hif-2H-fragmentti".

Hif-2H:n kyky sitoa IFN-fltm.RNA testattiin sitomalla 2 se DPT-paperiin (4 ^,ug/100 mm ) ja hybridisoimalla se poly- (A)RNA:han (0,3 ^ug/^ul) reaktioajan ollessa 16 tuntia ja määrittämällä IFN-CCmRNA-aktiivisuus: 30 DNA-näyte IFN- -aktiivisuus (IU/ml)x

Hif-2H 250ί50 (4 määrityksen keskiarvo) Z-pBR322 (H3)/RC/3G-4.13 30 (2 määrityksen keskiarvo) pBR322 20 35 Sytopaattisen vaikutuksen vähenemiseen perustuva määritys.

52 86 55 8

Hif-2H kloonattiin uudelleen samalla tavalla kuin Hif-4C:n yhteydessä on kuvattu, ja kloonille annettiin nimi Hif-2h.

Seuraavaksi valmistettiin uusi erä E. coli -kloone-5 ja, jotka sisälsivät yhdistelmä-DNA-molekyylejä, ja pesäkkeet, jotka hybridisoituivat merkittyjen Hif-4c-fragmenttien kanssa, identifioitiin. Jotta saataisiin suuri määrä plas-mideja, jotka sisältäisivät pitkiä cDNA-sekvenssejä, osa leukosyytti-poly(A)RNA:sta (sama cDNA-valmiste, joka oli 10 mainittu edellä) entsymaattisesti valmistetusta kaksijuos-32 teisestä P-merkitystä leukosyytti-cDNA:sta fraktioitiin koon mukaan sentrifugoimalla sakkaroosigradientissa käyttäen samaa menetelmää kuin poly (A) RNA: ta sentrifugoitaessa. Fraktiot, jotka sisälsivät cDNA:ta, jonka sedimentoitumisno-15 peus vastasi 600 emäsparin DNA-fragmenttia tai suurempaa, yhdistettiin ja cDNA erotettiin saostamalla etanolilla. cDNArhan liitettiin dCMP-päät, hybridisoitiin Pstl-restrik-tioendonukleaasilla katkaistuihin pBR322-fragmentteihin, jolliin oli Liitetty clC.MP-päät, ja hybridi-ΠΝΛ: Lii käytettiin 20 transformoimaan E. coli, kuten aikaisemmin, paitsi että käytettiin kantaa E. coli HB101. Bakteerit levitettiin Millipore-suodattimille, joiden halkaisija oli 8 cm, suodattimet siirrettiinagarmaljoille, jotka sisälsivät trypto-nialustaa ja 10 yug/ml tetrasykliiniä, ja bakteereja vil-: 25 jeltiin, kunnes muodostui pieniä pesäkkeitä. Suodattimen kaksoiskappale valmistettiin puristamalla tuore kostea Millipore-suodatin bakteeripesäkkeitä sisältävän suodattimen päälle, irrottamalla kaksoiskappale suodattimesta ja asettamalla se agarmaljalle, joka sisälsi 4,4 % glyserolia, 30 ja inkuboimalla sitä, kunnes pieniä pesäkkeitä ilmestyi. Tämän pesäkkeitä sisältävän suodattimen päälle asetettiin toinen Millipore-suodatin, yhdistelmä jäähdytettiin -55°C:seen ja varastoitiin (D. Hanahan ja M. Medelson. A Protocoil For High Density Plasmid Screening, syyskuu 1978, 35 henkilökohtainen tiedonanto). Valmistettiin 18 suodatinta, joissa oli yhteensä noin 5 000 pesäkettä. Kunkin suodatti- 32 men toisella kaksoiskappaleella hybridisoitiin P-merkitty 53 86 558

Pstl-restriktioendonukleaasilla katkaistu Hif-4c-DNA-frag-mentti, kuten edellä on kuvattu. Autoradiografisesti identifioitiin noin 185 positiivista pesäkettä, jotka kloonattiin uudelleen Millipore-suodattimilla, ja kloonaustuotteet 5 identifioitiin vielä kerran hybridisoimalla. 96 kloonille, joiden hybridisointireaktio oli voimakkain, annettiin nimi Z-pBR322(Pst)/HcIF-SNl - SN95, ja niitä käytettiin jatkotutkimuksiin .

Koska Hif-2h pystyy tuottamaan polypeptidiä, jolla 10 on HuIFN:n immunologinen tai biologinen aktiivisuus, on luonnollisesti selvää, että Hif-2H-sekvenssiä tai muita sitä läheisesti muistuttavia DNA-sekvenssejä, esim. Hif-4c:tä voidaan käyttää seulottaessa myös muita klooneja, jotka sisältävät DNA-sekvenssejä, jotka on valmistettu yh-15 distelmä-DNA-tekniikalla tai synteettisesti tai jotka ovat peräisin luonnosta tai valmistettu jollakin näiden yhdistelmällä, tai käytettäessä klooneja, jotka sisältävät DNA-sekvensse jä, jotka ovat muodostuneet mistä tahansa edellä mainituista sekvensseistä mutaatioiden avulla (yksinker-20 täiset ja moninkertaiset mutaatiot, emässubstituutiot, insertiot, inversiot tai deleetiot), seulomaan muita DNA-sekvensse jä ja klooneja, jotka myös koodaavat HuIFN-in-terferonia. Täten tällaiset DNA-sekvenssit ja niiden identifiointi kuuluu myös esillä olevan keksinnön suojapiiriin. 25 On myös ymmärrettävä, että DNA-sekvenssit, joiden seulonnassa edellä mainituilla DNA-sekvensseillä ei saada positiivisia tuloksia, mutta jotka nukleotidijärjestyksensä ansiosta koodaavat ekspressoituessaan polypeptidejä, joita edellä mainitut DNA-sekvenssit ekspressoituessaan koodaa-30 vat, kuuluvat myös esillä olevan keksinnön suojapiiriin.

Hif-2h-DNA-fragmentin jatkokarakterisointi

Kuten edellä on kuvattu, yhdistelmä-DNA-molekyyliin Hif-2h on liittynyt noin 900 emäsparin pituinen sekvenssi, ja se hybridisoituu ihmisen leukosyytti-interferonin 35 mRNArn kanssa. Lisäksi yhdistelmä-DNA-molekyyliä karakterisoitiin seuraavasti.

54 86 558 1. Hybridin estämä translaatio

Kun mRNA hybridisoidaan kloonatun, komplementaarisen cDNA:n kanssa, mRNA:n translaatio estyy, mutta denaturoitaessa hybridi lämpökäsittelyllä vapautuu kuitenkin 5 transloituvaa mRNA:ta /k.M. Paterson et ai., Structural

Gene Identification And Mapping By DNA-mRNA Hybrid-Arrested Cell-Free Translation, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 4370-43747. 2,2 ^,ug Pstl-restriktioendonukleaasilla katkaistua Hif-2h:ta ja vertailuaineena 2 ^,ug Hindlll-restriktio-10 endonukleaasilla katkaistua Z-pBR322 (H3)/Rc^G-4.13 ("Rc/3G") denaturoitiin 10 -ulrssa 80-%:ista (tilavuus/tilavuus) de- ' -3 ionisoitua formamidia, joka sisälsi 20 x 10 -m PIPES-pus-kuria (pH 6,4) , 10 minuutin ajan 80°C:ssa. Liuos lisättiin Eppendorf-putkeen, joka sisälsi leukosyytti-poly(A)-15 RNA:ta (5 ^ug), NaCl (4 ^umoolia) ja EDTA (10 nanomoolia), jotka oli kuivattu. Seosta kuumennettiin seitsemän tuntia 48°C:ssa parafiiniöljykerroksen suojaamana, minkä jälkeen se jäähdytettiin ja laimennettiin 200 ^,ul:lla vettä. Mainitut kaksi näytettä jaettiin kahteen yhtä suureen osaan, 20 ja toista kummastakin kuumennettiin 100°C:ssa 30 sekuntia. Nukleiinihapot saostettiin etanolilla, liuotettiin 3 ^ulraan vettä ja niiden IFN-OCmRNA-aktiivisuus varhaismunasoluissa määritettiin, kuten edellä: DNA Le-poly(A)- Käsittely IFN- (IU/ 25 RNA-määrä ml)1

Hif-2h (1,1 ^ug) 2,5 ^,ug hybridisoitu 400

Hif-2h (1,1 ^,ug) 2,5 ^ug hybridisoitu ja 2000 denaturoitu

Rc/3G (1 ^,ug) 2,5 ^ug hybridisoitu 3000 30 Rc/3G (1 y-ug) 2,5 ^,ug hybridisoitu ja 3000 denaturoitu

Hif-2h (0,5 ^ug) 1 ^.ug ilman käsittelyä 2000 1 yug ilman käsittelyä 3000 1 ^,ug ilman käsittelyä 2000 35

Varhaismunasoluväliaine analysoitiin 48 tunnin inkubointi-ajan jälkeen sytopaattisen vaikutuksen vähenemiseen perustuvalla menetelmällä.

55 86558 Täten Hif-2h esti poly(A)RNA:n kanssa hybridisoituna IFN-0(mRNA:n translaation poly(A)RNA:ssa, mutta denaturoimalla hybridi IFN-flönRNA saatiin jälleen transloituvaksi. Tämä koe tukee sitä käsitystä, että Hif-2h sisältää 5 IFN-OmRNA:lie komplementaarisia sekvenssejä.

2. Hif-2h;n analysointi hajottamalla se restriktio-entsyymeillä ja nukleotidi/aminohapposekvenssien määritys sekä restriktiokartta

Hif-2h hajotettiin erilaisilla restriktioentsyymeil-10 lä (New England Biolab), ja hajoamistuotteet analysoitiin elektroforeettisesti agaroosigeelillä. Alleviivatut fragmentit eivät ole yhteisiä pBR322:lle ja Hif-2h:lle: Restriktioentsyymi Fragmenttien koot

Hif-2hx pBR322XX

15 PstI 885+20, 4361 4361

EcoRI 1426, 3820 4361

Bglll 5246 ei pilkkoontunut

EcoRI + Bglll 3^6, 4960 4361

EcoRI + PstI 209, 67^, 748 748, 3611 20 3611

BspI 921, 587, 540, 587, 540, 504 504, 457 457, 434, 2 x 434, 267, 231 234 25 +14 fragmenttia +14 fragmenttia 200 emäsparia 200 emäsparia MboII 1616, 884 ja muita 30 Näiden fragmenttien koko määritettynä nukleotidisekvenssi- tietojen avulla ilmenee kuvioista 8-10.

xxSaatu Sutcliffeltä (edellä).

32

Lisäksi 51-terminaalisesti P-merkitty Pstl-restriktio-endonukleaasilla katkaistu Hif-2h katkaistiin useilla 35 restriktioentsyymeillä, ja tämän yhdistelmä-DNA-molekyy-lin cDNA-sekvenssistä peräisin olevien radioaktiivisten fragmenttien koko määritettiin: 56 8 6 55 8 3P x

Restriktioentsyymi 'P-fragmentit

EcoRI 676, 209

Hindi! ei pilkkoontunut

BspI 799, 86 5 Hpall ei pilkkoontunut

Hhal ei pilkkoontunut

BamHI ei pilkkoontunut

Hinf 210, 62

Bglll 545, 340 10 xkatkaisukohtien sijainti ja näiden fragmenttien koko, määritettynä nukleotidisekvenssitietoja analysoimalla, ilmenevät kuvioista 8-10.

15 Näiden tietojen perusteella laadittiin Hif-2h:n restriktio-kartta (kuvio 4). Kuviossa 4 esitettyjen katkaisukohtien sijainti perustuvat fragmenttien kokolajitteluun agaroosi-geelielektroforeesin avulla, ja siirretyn sekvenssin MboII-katkaisukohdat voivat olla epätäydellisiä. Ainoastaan siir-20 rettyä sekvenssiä lähinnä olevat katkaisukohdat on merkitty näkyviin pBR322-osaan. Nuoli osoittaa IFN-0LCDNA:n koo-daavan juosteen orientaation.

Vaikkakaan asiantuntijan ei tarvitse tuntea keksinnön mukaisten kloonien Hif-2h-fragmentin tai muiden sekvenssien 25 todellista rakennetta tai näiden fragmenttien koodaamien polypeptidien aminohapposekvenssiä tai rakennetta pystyäkseen käyttämään esillä olevaa keksintöä, edellä mainitut tiedot ja restriktiokartta on otettu alkuperäiseen hakemukseen mukaan, koska ne ovat parhaiten kuvanneet fragmentin 30 rakennetta alkuperäistä hakemusta jätettäessä. Sen jälkeen näitä Hif-2h-fragmenttia koskevia tietoja ja sen restrik-tiokarttaa on tarkennettu käyttäen tunnettuja menetelmiä, joilla nukleotidisekvenssi voidaan määrittää, sekä restrik-tioanalyysiä./Katso esim. A.M. Maxam ja W. Gilbert, A New 35 Method For Sequencing DNA, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 560-56^. Plasmidi-DNA valmistettiin menetelmällä B βα. M. Wilkie et ai., Hybrid Plasmids Containing An Active Thymidine Kinase Gene Of Herpex Simplec Virus 1, Nucleic Acid Research 7 (1979) 859-877/ ja hajotettiin 57 86558 erilaisilla restriktioentsyymeillä käytännöllisesti katsoen standardimenetelmällä, paitsi että entsyymipuskureissa härän seerumin albumiini korvattiin 200 ^ug/ml:lla gelatiinia. (EcoRI oli saatu lahjaksi W. Bollilta, BspI A. Kissiltä ja 5 muut entsyymit oli saatu yhtiöstä New England Biolabs.).

Restriktioentsyymeillä hajotettu DNA (20 ^,ug) uutettiin fenolilla, saostettiin etanolilla, liuotettiin 0,05-m Tris-HCl-puskuriin (pH 8) ja johdettiin pienen Chelex-100-pylvään läpi. Fragmentit, jotka sisälsivät 5'-esiintyönty-10 viä päitä, defosforyloitiin käsittelemällä niitä 0,2 yksiköllä vasikan suoliston alkalista fosfataasia (Boehringer) yhtä moolia kohti DNA:n 5'-päitä 200 ^ul:ssa 0,05-m Tris-HCl-puskuria (pH 8) 60 minuutin ajan 37°C:ssa. Entsyymi inaktivoitiin lämmittämällä seosta 60 minuuttia 65°C:ssa.

15 DNA-fragmentit, jotka sisälsivät 3'-esiintyöntyviä päitä, käsiteltiin bakteriaalisella alkalisella fosfataasilla (Worthington) A.M. Maxamin ja W. Gilbertin kuvaamalla menetelmällä (edellä), paitsi että inkubointi suoritettiin 65°C:ssa 30 minuutin ajan. Defosforyloitu DNA puhdistet-20 tiin adsorboimalla se DEAE-selluloosaan ja eluoimalla siitä /W. Muller et ai., Site-Directed Mutagenesis In DNA: Generation Of Point Mutations In Cloned /J-Globin Complemen--- tary DNA At The Positions Corresponding To Amino Acids 121- 123, J. Mol. Biol. 124 (1978) 343-3587, tai se käsiteltiin ... 25 elektroforeettisesti polyakryyliamidigeelillä tarvittaessa.

-" Polyakryyliamidigeelistä (tai agaroosigeelistä) saadut fragmentit (0,15-m NaCl, 0,05-m Tris-HCl, pH 8) adsorboitiin 0,1 ml:n hydroksiapatiittipylvääseen (Biorad HTP), pestiin neljä kertaa 1 ml:11a 0,1-m kaliumfosfaattipuskuria 30 (pH 7) ja eluoitiin 0,3 ml:11a 1-m kaliumfosfaattipuskuria (pH 7). Liuos laimennettiin kymmenkertaiseksi, ja DNA adsorboitiin DEAR-selluloosaan ja erotettiin siitä W. Mullerin et ai. kuvaamalla menetelmällä (edellä).

DNA saostettiin etanolilla, ja merkittiin 5'-termi-35 naalisesti ATP:llä (12-34 ^uCi yhtä pikomoolia kohti DNA:n 5’-päitä) ja polynukleotidikinaasilla (New England Biolabs tai P-L Biochemicals Ind.) käytännöllisesti 58 8 6 55 8 katsoen A.M. Maxamin ja W. Gilbertin kuvaamalla menetelmällä (edellä), paitsi että DNA:ta ei denaturoitu ennen kinaa-sireaktiota. Näin saadut ominaisaktiivisuudet olivat 1 - 1,5 ^uCi /32P7-fosfaattia yhtä pikomoolia kohti DNA:n 5 5'-päitä.

Sekvenssin määritystä varten merkityt fragmentit hajotettiin toisella restriktioentsyymillä, ja tuotteet erotettiin elektroforeettisesti käyttäen 5-%:ista polyakryy-liamidigeeliä ja tris-boraatti-EDTA-puskuria. Halutut frag-10 mentit uutettiin geelistä ja puhdistettiin (Muller et ai., edellä). Eri fragmentit, joiden avulla sekvenssi määritettiin, valmistettiin seuraavasti (numero ilmaisee fragmentin nimellispituuden emäspareissa, merkitty kohta on ilmaistu tähdellä): 15 (1) Hif-2h:n hajotus Bspl:llä, BspI-BspI-232-frag- mentin ja BspI-BspI-949-fragmentin eristys elektroforeettisesti 5-%:isella polyakryyliamidigeelillä käyttäen Loeningin puskuria /ϋ.Ε. Loening, The Fraction Of High Molecular Weight Ribonucleic Acid By Polyacrylamide Gel 20 Elektrophoreses, J. Biochem. (1967) 1027; (2) Hif-2h:n hajotus Bspl:llä, merkitseminen, hajotus Pstl:llä, BspIX-PstI-83-fragmentin ja BspIX-PstI-827-fragmentin eristys; : (3) Hif-2h:n hajotus BflII:lla, merkitseminen, ha- 25 jotus Pstl:llä, BfHIx-PstI-336-fragmentin ja BglIIX-PstI-570-fragmentin eristys; (4) Hif-2h:n hajotus MboII:lla, merkitseminen, hajotus Pstlrllä ja Hinduilla (häiritsevän 350 emäsparin pituisen pBR322-fragmentin katkaisemiseksi), MboIIx-PstI-519- y : 30 fragmentin ja MboII -PstI-351-fragmentin eristys; (5) Hif-2h:n hajotus EcoRI:llä, merkitseminen, hajotus Pstlrllä, EcoRIx-PstI-708-fragmentin ja EcoRIX-PstI- ---- 198-fragmentin eristys; (6) Hif-2h:n hajotus Pstlrllä, merkitseminen, hajo-35 tus Bglllrlla, PstIx-BglII-570-fragmentin ja PstIx-BglII- - fragmentin eristys; 59 86 558 (7) Hif-2h:n hajotus AvaII:lla, merkitseminen, hajotus Pstl:llä ja BglII:lla, AvaIIx-PstI-186-fragmentin ja

X

Avail -BgII-147-fragmentin eristys; (8) Hif-2h:n hajotus PvuIIrlla, merkitseminen, ha-5 jotus Pstl:llä ja BglII:lla, PvuIIX-PstI-486-fragmentin eristys.

Fragmentit hajotettiin A.M. Maxamin ja W. Gilbertin kuvaamalla menetelmällä (edellä) käyttäen modifikaatioita, joita samat tekijät ovat kuvanneet syyskuussa 1978. Tuot-10 teet fraktioitiin 12-%:isillä polyakryyliamidigeeleillä (0,1 x 25 x 36 cm) (akryyliamidi/bisakryyliamidi = 18/1) _3 käyttäen väliainetta, joka sisälsi 50 x 10 -m tris-boraat- -3 tia ja 1 x 10 -m EDTA (pH 8,3), käsittelyaikojen ollessa 2, 8, 18 ja 26 tuntia (900 V) ja esikäsittelyajan ollessa 15 kuusi tuntia 700 V:ssa. Parhaat tulokset saatiin pidettäessä geelejä huoneen lämpötilassa 2-3 päivän ajan ennen käyttöä .

Siirretyn cDNA-sekvenssin kunkin fragmentin nukle-iinihappojärjestys määritettiin kummastakin juosteesta kus-20 takin restriktiokohdasta alkaen käyttäen fragmenttia, joka kattoi sen. Näin määritetty nukleotidisekvenssi ilmenee kuvioista 8-10. Odotetusti tämän sekvenssin eri restriktio-.ΓΓ kohtien sijainti on saatu tarkemmin esiin kuin käytettäessä ainoastaan restriktioentsyymeillä suoritettavaa hajotusta ;;; 25 (kuvio 4) .

Kyseisen sekvenssin heteropolymeerista osaa seuraa 5‘-päässä 23G-ryhmät ja 3’-päässä 7A-ryhmät (luultavasti vastaten mRNA:n poly (A)-päätä) , joita seuraa 15C-ryhmät (kuviot 8-10). Sekvenssi on numeroitu alkaen dG-päätä seu-30 raavasta ensimmäisestä nukleotidista ja jatkuen viimeiseen nukleotidiin ennen poly A-ryhmiä. ATG-initiaatiotripletti kohdassa 57-59 ja TAA-terminaatiotripletti kohdassa 624-"·· 626 määrittelevät lukusuunnan, joka ei sisällä nonsense- kodoneita. Molemmat muut lukusuunnat tällä sekvenssin alu-35 eella sisältävät 18 ja 12 nonsens-kodonia. Lisäksi eri lu-kukehyksissä olevat muut sekvenssit, joita seuraa ATG tai GTG ja terminaatiosignaali ja jotka koodaavat 25 tai useamman 60 86 558 aminohapon pituista polypeptidiä, sijaitsevat nukleotidien 226 ja 304, 640 ja 778 sekä 683 ja 743 välissä. Täten nukleotidien 57 ja 626 välinen alue mitä todennäköisimmin sisältää Hif-2h-fragmentin nukleotidisekvenssin, joka koodaa 5 polypeptidiä, jolla on IFN-Cfcn biologinen tai immunologinen aktiivisuus.

On luonnollisesti ymmärrettävä, että polyA-RNA:sta tavanomaisilla menetelmillä valmistettu kloonattu cDNA (A. Efstratiadis et ai., edellä) ei sisällä 5'-terminaali-10 siä nukleotideja ja voi sisältää jopa keinotekoisia sekvenssejä /R.I. Richards et ai., Molecular Cloning And Sequence Analysis Of Adult Chicken B-Globin cDNA, Nucleic Acids Research 7 (1979) 1137-11467· Täten ei ole varmaa, että nukleotideissa 57-59 sijaitseva ATG olisi todellisuudessa 15 autenttisen mRNA:n ensimmäinen ATG. Kuitenkin seuraavaa kuvausta silmällä pitäen oletetaan, että nukleotidien 57-59 ATG on autenttisen mRNArn ensimmäinen ATG.

Verrattaessa sekvenssin tämän alueen koodaamaa polypeptidiä vastaavaan ihmisen autenttisen lymfoblastoidi-in-20 terferonin 35 aminohapon pituiseen sekvenssiin SerAspLeu-ProGlnThrHisSerLeuGlyAsnArgArgAlaLeuIleLeuLeuAlaGln-MetGlyArglleSerLeuPheSerCysLeuLysAspArgHisAsp, jonka ovat määrittäneet K.C. Zoon et ai. (edellä) ja M. Hunkapiller : V et ai. (edellä), näyttää siltä, että valittu lukukehys on : 25 ollut oikea ja että nukleotidit 57-124 voivat koodata sig- naalisekvenssiä, joka edeltää kypsää polypeptidiä koodaavaa nukleotidisekvenssiä, sillä esillä olevan keksinnön mukai-sessa sekvenssissä (aminohaposta 24 eteenpäin) ja edellä mainitussa tunnetussa sekvenssissä samoja aminohappoja esiin-- - 30 tyy samoissa kohdissa (35 aminohaposta 26 samaa aminohappoa esiintyy samoissa kohdissa) .

Eukaryoottisolujen mRNArssa ensimmäinen AUG-trip-_ ; letti 5'-päästä lukien on tavallisesti proteiinisynteesin : initiaatiokohta /M. Kozak, How Do Eukaryotic Ribosomes ·-' 35 Select Initiation Regions In Messenger RNA, Cell 16 (1978) 1109-11257. Hif-2h-fragmentin kodoni, joka vastaa lymfo-blastoidi-interferonin ensimmäistä aminohappoa, sijaitsee 61 86558 22 kodonin päässä ensimmäisestä AUG:stä (14 kodonin päässä toisesta), mikä osoittaa, että interferonia koodaavaa sekvenssiä mahdollisesti edeltää sekvenssi, joka määrittelee 23 (tai vähemmän todennäköisesti 15) aminohapon pituisen 5 signaalipeptidin. Pitempi oletetuista signaalisekvensseistä sisältää keskeytymättömän 11 hydrofobisen aminohapon sarjan (ja lyhyempi kuuden hydrofobisen aminohapon sarjan).

Tämä hydrofobisten ryhmien kasaantuminen on tunnusomaista signaalisekvensseille /B.D. Davis ja P.C. Tai, The Mechanism 10 Of Protein Secretion Across Membranes, Nature 283 (1980) 433-4387.

Nukleotidisekvenssi, joka todennäköisesti vastaa kypsää IFN-ft-polypeptidiä, koostuu 498 nukleotidistä, jotka koodaavat 155 aminohappoa. Oletettaessa, että karboksiter-15 minaalista prosessia ei esiinny, interferonipolypeptidin molekyylipaino on 19 388. Koodaavan sekvenssin emäskoostumus on 50 % GC. Kodonien tehtävät interferonia koodaavassa sekvenssissä ovat samantapaisia kuin imettäväisten mRNA-sek-venssien yleensä /R. Grantham et ai., Codon Catalog Usage 20 And The Genome Hypothesis, Nucleic Acids Research 8 (1980) 49-527. Poikkeamia on havaittu hyvin vähän.

Kuvioissa 8-10 esitetyssä Hif-2h-fragmenttia vastaa-van polypeptidin rakenteessa ei ole otettu huomioon modi-^ - fikaatioita, joita polypeptidiin voi aiheutua sen reagoi- 25 dessa in vivo -entsyymien kanssa, esim. glykosyloinnissa. Täten on ymmärrettävä, että tämä rakenne ei mahdollisesti ole identtinen IFN-Cfcn kanssa, joka on muodostunut in vivo, mutta että sillä on hyvin samankaltaisia, joskaan ei identtisiä, biologisia ja immunologisia ominaisuuksia kuin luon-30 non IFN-0c:lla. On myös mahdollista, että tämän rakenteen muut modifikaatiot, kuten mutaatiot, yksinkertaiset ja moninkertaiset mutaatiot, emässubstituutiot, deleetiot, in-sertiot, inversiot ja kemiallisten johdannaisten muodostus tuottavat yhdisteitä, joilla myös on IFN-&-aktiivisuus.

; 35 3. Insertoidun IFN-OfcDNA:n plus-juosteen sekvenssi- määritys DNA-juostetta, jonka sekvenssi on sama kuin mRNA:n, nimitetään plus-juosteeksi ja sen komplementtia miinus- 62 86 558 juosteeksi. Insertoidun IFN-Cfc:DNA:n plus-juoste identifioitiin kuviossa 5 esitetyllä tavalla. Hif-2h-DNA katkais- 32 tiin restriktioentsyymillä Bflll, päät merkittiin P-fos-faatilla (samalla tavalla kuin edellä on kuvattu Pstl-5 restriktioentsyymillä katkaistujen päiden yhteydessä), ja DNA hajotettiin Pstl:llä, jolloin saatiin pitempiä /545 emäsparia (570 emäsparia, määritetty edellä kuvatulla tarkemmalla analyysimenetelmällä)./ ja lyhyempiä /340 emäsparin pituisia (336 emäsparia, määritetty edellä kuvatulla tar-10 kemmalla analyysimenetelmällä^ radioaktiivisia fragmentteja. Nämä fragmentit denaturoitiin ja hybridisoitiin indusoiduista leukosyyteistä valmistetun poly(A)RNA:n kanssa väliaineessa, joka sisälsi 80 % formamidia ja 0,4-m NaCl, eli sellaisissa olosuhteissa, joissa DNA-DNA-liittymistä 15 ei tapahdu (edellä). Nukleiinihapot hajotettiin Sl-nukleaa- silla, joka hajottaa kaikki yksijuosteiset nukleiinihapot, 32 erikoisesti ei-hybridisoituneen P-DNA:n ja tuotteet fraktioitiin polyakryyliamidigeelillä /R.F. Weaver ja C. Weissmann, Mapping Of RNA By A Modification Of The Berk-20 Sharp Procedure, Nucleic Acid Research 7 (1979) 1175-11937« Autoradiogrammista ilmeni, että ainoastaan lyhyempi nukleo-tidifragmentti oli hybridisoitunut poly(A)RNA:n kanssa ja että 5'-merkitty lyhyempi nukleotidijuoste kuului miinus-juosteeseen. Plus-juosteen orientaatio ilmenee kuvioista 25 4 ja 5 (suuntautuu oikealle).

4. Koe, jolla osoitetaan, että ei-indusoiduista ihmisen leukosyyteistä valmistettu poly(A)RNA ei hybridisoi-du Hif-2h-DNA:n kanssa

Suoritettiin samanlainen koe kuin edellisessä kap-30 paleessa, paitsi että käytettiin poly(A)RNA:ta, joka oli valmistettu ei-indusoiduista ihmisen leukosyyteistä samalla menetelmällä kuin Sendai-viruksella indusoitujen leukosyyttien tapauksessa. Merkitty DNA ei hybridisoitunut havaittavissa määrin. Verrattaessa tuloksia edellisessä kappaleessa 35 saatuihin, havaitaan, että ei-indusoiduista soluista valmistettu poly(A)RNA sisältää vähemmän kuin 1/20 Hif-2h:n kanssa hybridisoituvaa mRNA:ta verrattuna indusoiduista 63 S6 558 soluista valmistetun poly(A)RNA:n sisältämään vastaavaan määrään.

Sellaisen polypeptidin synteesi, jolla on interferonin aktiivisuus E. colin avulla, joka sisältää Z-pBR322-5 (Pst)/HcIF-4c:tä vastaavia yhdistelmä-DNA-molekyylejä pBR322-plasmidin Pstl-katkaisukohta sijaitsee $-lak-tamaasigeenissä (penisillinaasigeenissä). Kun koodaava DNA-segmontti (esim. cDNA, joka sisältää osan geenistä tai kokonaisen geenin) liitetään kyseiseen kohdaan oikealla ta-10 valla orientoituna ja oikeassa lukusuunnassa, muodostuu sekaproteiini. Proteiini koostuu tällöin /3-laktamaasin amino-terminaalisesta osasta, jonka jälkeen seuraa aminohapposekvenssi, jota inseroitu DNA-sekvenssi koodaa (L. Villa-Komaroff et ai. , edellä). Jos insertoitu DNA-segmentti sisäl-15 tää DNA-sekvenssin, jossa on mukana sen oma initiaatiosig-naali, ja jos se sisältää sekvenssin, jota edeltää termi-naatiosignaali, joka on samassa faasissa /3“la^tamaas:i-sek-venssin kanssa, terminaatio ja uusi initiaatio voi tapahtua toisen initiaatiosignaalin kohdalla, jolloin voi muodostua 20 ei-fuusioitunut aktiivinen proteiini (A.C.Y. Chang et ai., edellä). Sen varmistamiseksi, että Hif-4c:tä vastaava DNA-sekvenssi liitetään oikeassa lukukehyksessä, jotta se ekspressoituisi βτ laktamaasigeenissä, käytettiin pBR322-plasmidin johdannaisia (pKT279, pKT280 ja pKT287, jotka on 25 valmistanut K. Talmadge, henkilökohtainen tiedonanto 1979). Kullakin näistä johdannaisista on Pstl-katkaisukohta sellaisessa paikassa, että tähän kohtaan liitetty DNA-insert-ti on eri lukukehyksessä kuin muiden mainittujen johdannaisten Pstl-katkaisukohtaan liitetty DNA-insertti (kuvio 6).

30 Täten näiden johdannaisten avulla on mahdollista liittää DNA $-laktamaasigeeniin kaikissa kolmessa lukukehyksessä. Hif-2h katkaistiin Pstl-restriktioendonukleaasilla, kuten Hif-4c-fragmentin yhteydessä on kuvattu. Hif-2h:n Pst-fragmentti (10 ng) sekoitettiin Pstl-rostriktioendonuklcaa-35 silla katkaistun pBR322-, pKT279-, pKT280- ja pKT287-plas- midin kanssa (10 ng kussakin tapauksessa) 20 ,ul:ssa väli- -3 ainetta, joka sisälsi 10 x 10 -m Tris-HCl (pH 7,5), 64 8 6 55 8 6 x 10 ^-m MgCl9, 100 x 10 ^-m NaCl, 6 x 10 ^-m Λ-merkapto- Δ _ 3 etanolia, 200 ^,ug/ml gelatiinia ja 0,1 x 10 -m ATP, ja seosta inkuboitiin 0,1 yksikön kanssa T^-DNA-ligaasia (New England Biolabs) 16 tunnin ajan 10 C:ssa. Muodostuneita 5 yhdistelmä-DNA-molekyylejä merkittiin ZpBR322(Pst)/HcIF-2h, Z.-pKT279 (Pst)/IlcIF-2h, Z-pKT280 (Pst) /HcIF-2h ja Z-pKT287 (Pst)/HcIG-2h. E. coli HB101 transformoitiin kullakin näistä yhdistelmä-DNA-molekyyleistä, ja transformoidut pesäkkeet erotettiin ei-transformoiduista tetrasykliiniä sisältävillä 10 agarmaljoilla aikaisemmin kuvatulla tavalla. Koska transformoitujen bakteerien tetrasykliiniresistentit kloonit voivat sisältää myös uudelleensyklisoituneen vektorin, bak- teeripesäkkeitä viljeltiin Millipore-suodattimilla ja pesäk- 32 keet, jotka hybridisoituivat P-merkityn Hif-4c-fragmentin 15 kanssa, identifioitiin ja erotettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla. Näitä kantoja merkittiin seuraavasti: E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-2h-AHl) - (-AH3); E. coli HB101 (Z-pKT279(Pst)/HcIF-2h-AHl) - (-AH8); E. coli HB101 (Z-pKT280(Pst)/HcIF-2h-AHl) - (-AH8); 20 E. coli HB101 (Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AHl) - (pAH8).

Muutamia edellä mainituista kannoista sisältävien uutteiden sekä muutamia kannoista Z-pBR322(Pst)/HcIF-SNl -95 sisältävien uutteiden IFN-06-aktiivisuus testattiin. Bakteereita viljeltiin tryptonialustassa, kunnes kasvu 25 oli stationäärivaiheessa bakteerit erotettiin ja pestiin 1/20-kertaisella tilavuudella (laskettu viljelmän tilavuudesta) liuosta, joka sisälsi 50 x 10 ^-m Tris-HCl (pH 8) ja 30 x 10 ^-m NaCl, ja jäädytettiin. Sulatuksen jälkeen solut suspendoitiin uudelleen edellä mainittuun tilavuuteen 30 samaa liuosta, ja lisättiin lysotsyymiä niin, että sen pitoisuudeksi tuli 1 mg/ml. Suspensioita pidettiin 60 minuuttia 0°C:ssa, minkä jälkeen se jäädytettiin (etanoli-jäähau- de), sulatettiin 37°C:ssa viisi kertaa ja sentrifugoitiin 10 minuuttia kierrosnopeudella 12 000 rpm GSA Sorvali -root-35 torissa. Muutamissa tapauksissa osaa pintanesteestä (S30) sentrifugoitiin edelleen kierrosnopeudella 100 OOOxg Xpinco-roottorissa (tyyppi 65) ja pintanesteet (S100) 65 86 558 otettiin talteen. Pintanesteiden IFN-Oi-aktiivisuus testattiin kokeella, jossa määritettiin sytopaattisen vaikutuksen väheneminen (koe 1). Pesäkkeet, joista saatiin positiivinen tulos, analysoitiin uudelleen, samoin kuin 49 kloo-5 nia sarjasta Z-pBR322/HcIF-SNl - 95 (laimennettuna) (koe 2). Uutteen alkuperä: E. coli HB101, joka oli trans- Valmiste IFN-OC-aktiivi-formoitu seuraavilla yhdistel- suus (IU)ml) mä-DNA-molekyyleillä:

Koe lx 10 Z-pBR322(Pst)/HcIF-2h S30 ?

Z-pHU )22 (l>:;L )/Ik: I F-2h-AII- I - 3 S JO V

Z-pKT279(Pst)/HcIF—2h-AH—1 - 7 S30 ? Z-pKT279(Pst)/HcIF-2h-AH-8 S30 positiivinen 15 Z-pKT280(Pst)/HcIG-2h-AH-2,6,7 S30 ? Z-pKT280(Pst)/HcIF-2h-AH-l,3,4,5 S30 positiivinen Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH-l,2,3,4,5,8 S30 ? Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH-6,7 S30 positiivinen

Uutteen alkuperä: 20 E. coli HB101, joka oli trans- Valmiste IFN-©(-aktiivi-formoitu: suus (IU/ml)

Koe 2XX

Z-pKT279/HcIF-2h-AH-8 S30 ja 300 S 100 25 Z-pKT280/HclF-2h-AH-l,3,4,5 S30 ja 300 S100 Z-pKT287/HcIF-2h-AH-6 ja 7 S30 ja 300 S100 Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN-4,5,7,9, S30 neg (<10) 30 10,11,13 - 16 Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN-18 - 22, S30 neg (<10) 24,25,27,30 - 34 Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN-38 - 41, S30 neg (<10) 43 - 48 35 Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN-1 - 3,6, S30 10 8,12,17,23,26 66 86 558 Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN-28,29,36, S30 10 37,49 Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN-35,42 S30 200 5 x Koe 1: Uutteet analysoitu lopullisen laimennuksen ollessa 1:190.

XX

Koe 2: Uutteet analysoitu lopullisen laimennuksen ollessa 1:6.

10 Muutamat aktiivisimmista pesäkkeistä tutkittiin yksityiskohtaisemmin. Pesäkkeitä viljeltiin, kunnes kasvu oli myöhäisessä logaritmisessa vaiheessa (°Dg5Q noin 0,9) (suurempia IFN-öl:aa tuottavia viljelmiä voidaan kasvattaa 3 000 litran tilavuuteen saakka ilman, että IFN-aktiivisuus hä-15 viää), minkä jälkeen solut hajotettiin, kuten edellä 1/50-kertaisessa tilavuudessa (laskettu viljelyväliaineen tilavuudesta) väliainetta. Tällöin havaittiin seuraavat aktiivisuudet käyttäen negatiivisena vertai 1uyhdis teenä Z-pBR322(Pst)/HclF-SN32:ta: 20 Uutteen alkuperä: E. coli HB101, joka oli Valmiste IFN-OC-aktiivi- transformoitu seuraavilla suus* (IU/ml) yhdistelmä-DNA-molekyy- (suoritettu rin- leillä: nakkaiskoe) Z-pKT279(Pst)/HcIF-2h-AH8 S30, S100 100; 300 25 Z-pKT280(Pst)/HcIF-2h-AH3 S30, S100 1000; 1000 Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH6 S30, S100 200; 200 Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35 S30, S100 1000; 1000 Z-pBR322(Pst)/HCIF-SN42 S30, S100 300; 100 Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN32 S30, S100 0; 0 30

On ymmärrettävä, että edellä mainittu ekspressoituminen saattaa merkitä sitä, että interferonia tuottavat geenit, jotka ovat penisillinaasin ekspression säätelysekvenssin vaikutuspiirissä.

On ymmärrettävä, että näiden kantojen tuottamaa varsinaista proteiinia ei ole analysoitu rakenteellisesti sen selvittä- 35 67 86 558 miseksi, onko se muodostunut fuusioitumalla sellaisiin aminohappoihin, jotka eivät vastaa IFNrää tai osaa IFN:n signaalisekvenssiä tai koko IFN:n signaalisekvenssiä. Mutta muodostuipa mikä tahansa proteiini, sillä on IFN:n immuno-5 loginen tai biologinen aktiivisuus. Täten proteiini ekspres-soituessaan on hyödyllinen. Tärkeintä on, että proteiinin aktiivisuus osoittaa sitä koodaavan DNA-sekvenssin olevan HuIFN-Cfcaa vastaava DNA-sekvenssi. Täten asiantuntija pystyy esillä olevan DNA-sekvenssin avulla tunnistamaan muita 10 HuIFN-fl£:aa vastaavia DNA-sekvenssejä ja valmistamaan sen avulla muita sekvenssejä, jotka ekspressoivat kypsän interferonin tai muita sen muunnelmia, tai parantamaan halutun ekspressoidun proteiinin saantoa.

Muodostuneen proteiinin määrään vaikuttaa kaksi pää-15 tekijää: sitä koodaavan geenin kopioiden määrä solussa ja se, miten tehokkaasti näiden geenikopioiden transskriptio ja translaatio tapahtuu. Transkription ja translaation tehokkuus (nämä yhdessä saavat aikaan ekspressoitumisen) riippuu puolestaan nukleotidisekvensseistä, jotka tavalli-20 sesti sijaitsevat halutun koodaavan sekvenssin edellä. Nämä nukleotidisekvenssit eli ekspression säätelysekvenssit määräävät muun muassa kohdan, josta RNA-polymeraasi aloittaa transskription (promoottorisekvenssi) ja johon riboso-mit kiinnittyvät ja jossa ne reagoivat mRNArn (transkrip-25 tiotuote) kanssa aloittaen translaation. Kaikki tällaiset ekspression säätelysekvenssit eivät toimi yhtä tehokkaasti. Täten on edullista erottaa haluttua proteiinia koodaava spesifinen sekvenssi viereisistä nukleotidisekvensseistä ja liittää se sen sijaan muihin tunnettuihin ekspression 30 säätelysekvensseihin, joiden ekspressiotehokkuus on korkea. Näin valmistettu uusi DNA-fragmentti voidaan siirtää solussa monena kopiona esiintyvään plasmidiin tai bakteriofagi johdannaiseen , jolloin geenikopioiden määrä solussa kasvaa ja ekspressoidun proteiinin saanto kasvaa.

35 On olemassa useita ekspression säätelysekvenssejä, joita voidaan käyttää edellä mainitulla tavalla. Näitä ovat esim. E. colin laktoosioperonin ("lac-järjestelmä") 68 86 558 operaattori- ja promootterisekvenssit sekä sekvenssit, jotka saavat aikaan ribosomien kiinnittymisen ja reagoimisen mRNA:n kanssa (näitä ovat esim. Shine-Dalgarno-sekvens-sit), E. colin tryptofaania syntetisoivan järjestelmän 5 ("trp-systeemi") vastaavat sekvenssit, λ-fagin tärkeimmät operaattori- ja promootterialueet (0TPT ja OdpL· , fd-fagin kuoriproteiinin säätelyalue tai muut sekvenssit, jotka säätelevät prokaryootti- tai eukaryoottisolujen ja niiden virusten geenien ekspressiota. Täten haluttaessa lisätä tietyn 10 polypeptidin tuotantoa sopivassa isäntäorganismissa tätä polypeptidiä koodaava geeni voidaan valmistaa aikaisemmin esitetyllä tavalla, poistaa yhdistelmä-DNA-molekyylistä ja siirtää uudelleen yhdistelmä-DNA-molekyyliin lähemmäksi sen aikaisempaa ekspression säätelysekvenssiä tai jonkin edel-15 lä mainitun eksprcssiosäätelysekvenssin vaikutusalueelle. Tällaiset menetelmät ovat alalla tunnettuja.

Haluttujen tuotteiden saanto solussa saadaan kasvamaan myös siten, että lisätään solussa sellaisten geenien lukumäärää, jotka voidaan hyödyntää. Tämä voidaan suorit-20 taa esim. siten, että aikaisemmin kuvatulla tavalla valmistettuja yhdistelmä-DNA-molekyylejä liitetään temperaatti-bakteriofagiin λ. (NM989), yksinkertaisimmalla tavalla katkaisemalla plasmidi restriktioentsyymillä, jolloin saadaan lineaarinen molekyyli, joka sitten käsitellään restriktio-25 entsyymillä käsitellyllä fagiXrkloonausvehikkelillä /esim. sellaisella, jonka ovat kuvanneet N.E. Murray et ai., Lambdoid Phages That Simplify The Recovery Of In Vitro Recombinants, Molec. Gen. Genet. 150 (1977) 53-61 ja N.E. Murray et al., Molecular Cloning Of The DNA Ligase Gene 30 From Bakteriophage T4, J. Mol. Biol. 132 (1979) 493-5057, ja yhdistelmä-DNA-molekyyli valmistetaan inkuboimalla tuotetta DNA-ligaasin läsnäollessa. Haluttu yhdistelmäfagi erotetaan sitten aikaisemmin kuvatulla tavalla, ja sillä lysogenisoidaan E. colin isantäkanta.

35 Erikoisen käyttökelpoisia λ,-kloonausvektoreita saa daan lämpöherkästä mutaatiosta repressiogeenissä cl ja supressiomutaatiosta S-geenissä, jolloin muodostuvaa tuo- 69 86558 tetta tarvitaan isäntäsolun hajotukseen, ja E-geenissä, jolloin muodostuva tuote on virusten tärkein kapsidiprote-iini. Tällöin lysogeenisiä soluja viljellään 32°C:ssa, minkä jälkeen ne kuumennetaan 45°C:seen, jolloin profagin 5 katkaisu saadaan indusoiduksi. Viljeltäessä soluja pitkä aika 37°C:ssa, muodostuu suuria määriä proteiinia, joka pysyy solun sisällä, sillä solut eivät hajoa fagigeenituot-teidcn vaikutuksesta tavanomaisella tavalla, ja koska fagi-geenisekvenssi ei ole kapseloitunut, sitä on jatkuvasti 10 käytettävissä lisätranskriptioon. Hajotettaessa solut keinotekoisesti, haluttua tuotetta vapautuu suuri määrä.

Yritettäessä valmistaa suurempia määriä polypepti-diä, jolla on ihmisen leukosyytti-interferonin biologinen tai immunologinen aktiivisuus ja joka on valmistettu 15 Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35:llä transformoidusta isäntäorganis-mista edellä kuvatuilla menetelmillä, laadittiin aluksi hybridiin liitetyn DNA-sekvenssin restriktiokartta. Kartasta havaittiin, että verrattuna Hif-2h-sekvenssiin, Hif-SN35-sekvenssistä puuttui Pstl-katkaisukohta, joka 20 seurasi sekvenssin 3'-päätä, osa signaalisekvenssistä puuttui (kodoniin 7 saakka se mukaan luettuna) ja signaalisek-venssin Avall-katkaisukohdan tilalla oli Bspl-katkaisukoh-ta. Täten Hif-SN35 on todennäköisesti Hif-2h:n polymorfinen tai alleelinen muunnelma.

25 Plasmidi Hif-SN35 avattiin Pstl-restriktioendonuk- leaasilla, muodostuneen DNA-juosteen päät käsiteltiin standardimenetelmillä, LAC-Alu-Fragmentti liitettiin kat-kaisukohtaan, ja plasmidi suljettiin uudelleen renkaaksi. Täten modifioidun plasmidin todellinen rakenne (plasmidi 30 merkittiin Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35-AHL6) ja tästä E. colis-sa muodostuneen proteiinin aminoterminaalisen pään aminohapposekvenssi on määritetty. Nukleotidisekvenssistä ilmenee, että LAC-Alu-fragmentti oli kiinnittynyt kohtaan, joka sijaitsi yhden aminohapon päässä IFN-Ctl (SN35) : n ensim-35 mäisestä aminohaposta. E. colissa muodostuneen proteiinin aminoterminaalisen osan aminohapposekvenssistä ilmeni, että oli muodostunut sekaproteiini, jossa kuusi aminohappoa oli 70 8 6 5 5 8 liittynyt IFN-Pfl (SN35) -sekvenssiin. Kuitenkin isäntäorga-nismit, jotka oli transformoitu modifioidulla plasmidilla, tuottavat noin 100 kertaa enemmän polypeptidiä, jolla on ihmisen leukosyytti-interferonin biologinen tai immunolo-5 ginen aktiivisuus, kuin isäntäorganismit, jotka on transformoitu modifioimalla Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35-plasmidilla.

Myös kuvion 25 mukaisella menetelmällä yritettiin valmistaa suurempia määriä polypeptidiä, jolla on ihmisen leukosyytti-interferonin immunologinen tai biologinen ak-10 tiivisuus ja joka on valmistettu Z-pBR322(Pst)/HcIG-SN35-plasmidilla (SN35 kuviossa 25) transformoitujen isäntäor-ganismien avulla. Hybridiplasmidi pilkottiin Bspl-restrik-tioendonukleaasilla (lahja tohtori A. Kissiltä) käyttäen standardimenetelmiä. Restriktioentsyymi inaktivoitiin läm-15 pökäsittelyllä (65°C, 30 min), minkä jälkeen seokseen lisättiin Tris-HCl-puskuria (pH 8), niin että sen pitoisuu-deksi tuli 50 x 10 -m ja seosta kuumennettiin (37°C, 30 min). Reaktioseos uutettiin fenolilla ja eetterillä, ja sen jälkeen seoksen suurin fragmentti ctlcDNA-f ragmentti, 20 eristettiin alhaisessa lämpötilassa qeeliytyvuL]ä agaroo-silla (0,8 %) ja fragmenttiin liitettiin Hindlll-linkkerit. Modifioitu fragmentti liitettiin sitten HindIII:lla pilkottuun plasmidiin HS-pBR322(Eco)/lacUV5-150 ("LAC-150") ^Tämä plasmidi sisältää 202 emäsparin pituisen lac-promoot-25 terin Haelll /W. Gilbert et ai., Lactose Operator Sequences And The Action Of Lac Repressor, teoksessa "Protein Ligand Interactions", toim. H. Sund ja G. Bauer, Berlin, Walter de Gruyter, s. 193-206, ja K. Backman et al., Maximizing Gene Expression On A Plasmid Using Recombination In Vitro, 30 Cell 13 (1978) 65-7^7, jota seuraa EcoRI-linkkeri sen 3'-päässä^ (lahja H. Schallerilta) sulattamalla fragmentteja sisältävät geelisegmentit (noin 20 ^ul kukin) 65°C:ssa, jäähdyttämällä tuote 37°C:seen ja lisäämällä 20 yksikköä T4-DNA-ligaasia yhtä mikrolitraa kohti sulatettua tuotetta. 35 Seosta pidettiin 16 tuntia 15°C:ssa, jolloin ligaatio tapahtui geelin jähmettyessä (H. Lehrach, henkilökohtainen tiedonanto). Näytteeseen lisättiin 1/10-kertainen tilavuus 7i 36558 -3 puskuria, joka sisälsi 100 x 10 -ra Tris-HCl (pH 7,5), 100 x -3 -3 10 -m MgCl2 ja 100 x 10 -m CaCl2, ja seosta lämmitettiin viisi minuuttia 65°C:ssa, minkä jälkeen se jäähdytettiin 37°C:seen. Näytteitä käytettiin sen jälkeen transformoi- 2 + 5 maan Ca -ioneilla käsitelty E. coli HB101, jolloin seosta inkuboitiin 0°C:ssa 20 minuuttia, lämmitettiin 42°C:ssa yhden minuutin ajan ja 20°C:ssa 10 minuuttia. Näytteisiin lisättiin yksi mooli tryptonialusta, ja niitä inkuboitiin 60 minuuttia 37°C:ssa, minkä jälkeen näytteet siirret-10 tiin ampisilliinia sisältäville agarmaljoille.

Plasmidi-DNA eristettiin näistä viljelmistä, kuten edellä ja hybridiplasmidi, jossa IFN-Otl-sekvenssi oli 5'-päästään liittynyt LAC-fragmenttiin, identifioitiin käyttäen restriktioanalyysiä. Plasmidi pilkottiin sen jälkeen 15 EcoRI-restriktioendonukleaasilla tavanomaisia menetelmiä käyttäen ja käsiteltiin sitten eksonukleaasilla BAL-31 (0,06 yksikköä/ml, 2-4 minuuttia 30°C:ssa), jolloin LAC-fragmentin esiintyöntyvä EcoRI-pää saatiin poistetuksi ja $-galaktosidaasia koodaava sekvenssi lyhennetyksi.

20 Sen varmistamiseksi, että näin käsitelty plasmidi sisälsi täydellisen IFN-Od-interferonia koodaavan sekvenssin, se pilkottiin Bglll-restriktioendonukleaasilla tavanomaisia menetelmiä käyttäen ja modifioitiin, kuten edellä, minkä jälkeen suurin fragmentti eristettiin agaroosigeelil-25 lä (0,8 %). Tämä fragmentti yhdistettiin sitten Bspl-Bglll-fragmenttiin, joka oli saatu plasmidista Z-pBR322(Pst)/ HcIF-SN35, ja näin muodostuneella hybridiplasmidilla transformoitiin E. coli HB101, kuten edellä. Transformoitujen pesäkkeiden IFN-aktiivisuus määritettiin, ja näistä eris-30 tettiin yksi klooni, jonka IFN-aktiivisuus oli korkea. Tätä kloonia merkittiin E. coli HB101 (C8-IFN-A1) ja sen hyb-ridiplasmidia C8-IFN-«1.

Suoritettaessa C8-IFN-flCL:n DNA-sekvenssianalyysi, ilmeni, että initiaattoritriplettiä seuraava koodisekvens-35 si koodasi /3-galaktosidaasin seitsemää ensimmäistä aminohappoa, fuusioitumalla muodostunutta Pro-jäännöstä, IFN-0CL:n signaalisekvenssin aminohappoja 16-23 ja 72 8 6 5 3 8 IFN-0& (SN35)-sekvenssiä. Hybridiplasmidilla C8-IFN-0Q transformoidut E. colin minisolukannat (DS410) tuottavat noin 50 miljoonaa yksikköä IFN-interferonia litraa kohti eli noin 2 500 kertaa enemmän polypeptidiä, jolla on 5 HuIFN-interferonin immunologinen tai biologinen aktiivisuus kuin modifioimattomalla Z-pBR322(Pst)/HifSN35-plasmi-dilla transformoidut minisolut. Määritettäessä plasmidin C8-IFN-0Q. avulla valmistetun polypeptidin aminohappojärjestys, saatiin vahvistetuksi, että tuote on sekaproteiini, 10 joka sisältää seitsemän $-galaktosidaasista peräisin olevaa aminohappoa, yhden fuusioitumalla muodostuneen aminohapon ja IFN-0(l-signaalisekvenssin aminohapot 16-2 3, jotka ovat fuusioituneet IFN-OCL-interferoniin.

Lisäesimerkkejä proteiinisaantojen lisäämisestä 15 esillä olevan keksinnön mukaisesti on esitetty muiden IFN-Ot-muotojen yhteydessä (myöhemmin) .

Eri tekijöiden vaikutus hybridiplasmideilla transformoidun E. colin interferoniaktiivisuuteen 1. Trypsiinin vaikutus IFN-OCraktiivisuuteen 20 50 /Ulrn näytteet autenttista HuIFN-Ot-interferonia 6 (ominaisaktiivisuus 1,2 x 10 yksikköä/mg, 50 U) ja E. colin HB101 (Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH6) S100-uutetta (Hif-287- 6-uutteet) (200 yksikköä/ml, 10 U) sekä E. colin HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35) (Hif-35-uutteet) S100-uutetta 25 (1 000 yksikköä/ml, 50 U) inkuboitiin erilaisten trypsii- nimäärien läsnäollessa, kuten edellä on esitetty, 30 minuutin ajan 37°C:ssa. Koska S100-uutteiden proteiinipitoisuus on suuri, kun taas HuIFN-Cfcn ei ole, HuIFN-oCn ja S100-vertailu-uutteen Hif-32 seos testattiin samanaikai-30 sesti: 35 73 86 558 IFN-ot-valmiste Trypsiini (,ug) IFN-QL-aktiivi- ' suus (yksikköä)

HuIFN-OC (20 yksikköä 50 ^,ul:ssa

Hif-32 SlOO-uutetta) 0 50 5 0,1 50 1 50 10 5 50 0

Hif-287-6 SlOO-uute 10 (10 yksikköä) 0 15 0,1 15 1 5 10 1 50 0 15 Täten uutteiden IFN-0C on herkkä trypsiinin vaikutuk selle ja täten se on proteiini.

Hif-35 SlOO-uute (50 yksikköä) 0 30 0,1 20 1 20 20 10 2 50 0 2. Kromatografinen käyttäytyminen Sephadex G-100-pylväässä

Hif-35-uute (1 ml) ja E. colin HB101 (Z-pBR322(Pst)/ 25 HcIF-SN32) SlOO-uute (Hif-32-uutteet) kromatografoitiin 32 ml:n Sephadex G-100-pylväässä 4°C:ssa käyttäen 50 x -3 10 -m kaliumfosfaattipuskuria (pH 7,4). Sytokromi c:tä (0,2 mg) lisättiin sisäiseksi merkkiaineeksi. Eluointi-nopeus oli 2 ml/h ja kerättiin 1,0 ml:n fraktioita. Ab-30 sorbanssi 280 nm:ssa ja 405 nm:ssa (sytokromi c) sekä IFN-OC-aktiivisuus määritettiin. Kuviosta 7 ilmenee, että Hif-35-uutteiden IFN-öC-aktiivisuus eluoitui ennen sytokromi c:tä, kD-arvon ollessa noin 0,45. Täten yhdisteen todennäköinen molekyylipaino oli 20 000 - 30 000 (molekyylipaino, 35 joka on saatu nukleotidisekvenssin määrityksen perusteella ja olettaen, että karboksiterminaalista prosessia ei ole, on 19 388), vertailuyhdisteen Hif-32 uutteita edustavissa fraktioissa aktiivisuutta ei havaittu.

74 86 538 3. Hif-35:n ja Hif-287-6:n interferoniaktiivisuuden tuhoaminen vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä ihmisen leukosyytti-interferonille

HuIFN-OC-uutteita (ominaisaktiivisuus 1,2 x 10 5 IU/mg) ja Hif-35/Hif-287-6-S100-uutteita inkuboitiin, jolloin mukana oli erilaisia määriä HuIFN-ot: lie spesifistä lampaan antiseerumia (valm. K. Kantell, 24. helmikuuta 1976, ominaisaktiivisuus 450 000 yksikköä/ml) , 100 ^,ul:ssa modifioitua Eagles-väliainetta (MEM), johon oli lisätty 10 10 % vasikan seerumia, inkubointiajän ollessa 30 minuuttia 37°C:ssa, minkä jälkeen inkubointiseoksesta otettiin 45 ^ul:n näyte, josta määritettiin IFN-of-aktiivisuus (perustui sytopaattisen vaikutuksen vähenemiseen). (Vasta-aine itse ei aiheuttanut sytopaattista vaikutusta): 15 IFN-oi-valmiste Anti-leukosyytti- Jäljelle jäänyt (yksikköä) interferonivasta- IFN-a-aktiivisuus aine (yksikköä) (IU) IFN-OC (10) 0 5 0,18 *O,5 20 9 <0,1 450 <0,1

Hif-35-uute (25) 0 15 0,18 15 9 <0,1 25 450 <0,1

Hif-287-6-uute (25) 0 15 0,18 15 9 <0,1 450 <0,1 30 ei mitään 0 <0,1 450 <0,1

Sen osoittamiseksi, että vasta-aineen vaikutus ei aiheutunut mistään ei-spesifisestä ilmiöstä, kuten proteolyyt-tisestä hajoamisesta, samanlainen koe suoritettiin käyttä-35 mällä hiiren interferonijärjestelmää: 75 86 558 IFN-valmiste (yksikköä) Anti-leukosyytti- IFN-aktiivisuus interferonivasta- (yksikköä) hii-aine ren järjestelmä hiirestä eristetty 4 500 100 5 valmiste (100 yksikköä) 90 100 13 100 Täten HuIFNrlle spesifiset vasta-aineet spesifisesti tuhoavat sellaisten polypeptidien IFN-ct-aktiivisuuden, jotka on valmistettu HcIF-2h-DNA-sekvenssin sisältävillä tietyillä 10 yhdistelmä-DNA-molekyyleiliä transformoidussa E. colissa. Vasta-aineen affiniteetti on selvästi pienempi E. colissa valmistetulla IFN-Ä.:lle, mikä saattaa johtua tämän ja luonnon HuIFNOfcn välisistä rakenteellisista eroista, esim. siitä, että hiilihydraattiosa puuttuu, signaalisekvenssi on 15 mukana tai siitä, että synteettinen HuIFN-Ot on fuusioitunut osaan fir laktamaasisekvenssiä.

4. Hif-35- ja Hif-287-6-uutteiden pienentynyt aktiivisuus hi iren soluis s a

Ihmisen CCL23-soluja hiiren L929-soluja käsiteltiin 20 E.coli -uutteilla, HuIFN-Oklla (valm. K. Kantell, ominais-

C

aktiivisuus 1,2 x 10 yksikköä/mg) ja hiiren IF:llä (N.I.H-standardi) ja sen jälkeen viruksella (Mengo-virusta käytettiin ihmissoluille ja VSV-virusta hiiren soluille), minkä jälkeen IFN-OG-aktiivisuus määritettiin (sytopaattisen vai-25 kutuksen vähenemiseen perustuvalla menetelmällä):

Lisätty IFN-aktiivisuus (yksikköä) ihmisen hiiren soluissa soluissa hiiren interferoni (120 yks./ml) - 120 3q Hif-35-uutteet 100 13 1000 120

Hif-287-6-uutteet 30 4 300 40

HuIFN-OC. (100 yksikköä/ml) 100 4 35 HuIFN-OL (100 yksikköä/ml) 1000 40 76 86 55 8

Tulokset osoittavat, että Hif-35- ja Hif-287-6-uut-teilla on suojaava vaikutus viruksia vastaan ihmissoluissa ja ainoastaan vähäinen suojaava vaikutus (noin 10 %) hiiren soluissa, mikä on tyypillistä ihmisen interferonille.

5 5. Vaikutukset eräisiin solun toimintoihin E. colin HB101 (Z-BR322(Pst)/Hif-SN35-AHL6) uutteita ja autenttista IFN-interferonia vertailtiin siinä suhteessa, miten ne vaikuttivat eräisiin solun toimintoihin.

E. colissa valmistetulla IFN-0C:lla havaittiin olevan seu-10 raavat luonnon IFN-ct;n ominaisuudet: (1) se lisää ihmisen lymfosyyttien luonnollista tuhoavaa vaikutusta, (2) se lisää vasta-aineista riippuvaa soluvälitteistä solumyrkyllisyyttä, 15 (3) se ehkäisee antigeeneillä ja mitogeeneilla in dusoidun leukosyyttien migraation inhiboinnin, (4) se estää IFN:lle sensitiivisten Burkitt-lymfoo-masolujen kasvun.

Nämä ominaisuudet osoittavat, että E. colissa syntetisoi-20 dulla IFN-0U:llä on ihmisen kasvaimia ja syöpää tuhoava aktiivisuus.

6. Sellaisen IFN-0t:n aktiivisuus, joka ei sisällä aminoterminaalisia sekvenssejä IFN-Ä, joka ei sisällä aminoterminaalisia sekvens-25 sejä, on myös syntetisoitu E. colissa, ja sillä on havaittu olevan IFN:n kaltainen aktiivisuus.

Sopiva yhdistelmä-DNA-molekyyli valmistettiin siten, että plasmidi Hif-2h (edellä) pilkottiin osittain EcoRI-ja BamHI-restriktioendonukleaaseilla, fragmentti, joka si-30 sälsi IFN-0tL:tä koodaavan sekvenssin, eristettiin agaroosi-geelillä ja yhdistettiin ei-IFN-(Xl: tä koodaavaan sekvenssiin, joka oli saatu pilkkomalla plasmidi Hif-SN35 EcoRI-ja BamHI-restriktioentsyymeillä, jolloin käytetylle plasmi-dille oli tunnusomaista, että Pstl-katkaisukohta hybridi-35 sekvenssin 3'-pään vierestä puuttui verrattaessa Hif-2h-plasmidiin (edellä). Muodostunut plasmidi käsiteltiin sitten restriktioentsyymeillä PstI ja Bgll, jolloin osa 77 8 6 558 IFN-CLL:tä koodaavan sekvenssin aminoterminaalisesta osasta saatiin poistetuksi. Sen paikalle liitettiin sarja IFN-otL-fragmentteja, jotka oli valmistettu hajottamalla Hif-2h-plasmidi PvuII:lla, käsittelemällä hajoamistuotteita Bal-5 eksonukleaasilla, liittämällä Pstl-linkkerit näiden päihin ja käsittelemällä tuotetta Bglll-restriktioentsyymillä.

Näin muodostuneet plasmidit sisälsivät täten sarjan IFN-OCl:tä koodaavia sekvenssejä, joiden aminoterminaalisis-ta sekvensseistä puuttui osia. Yksi näistä plasmideistä 10 (plasmidi 2H-M8) avattiin Pstl-restriktioendonukleaasilla, ja tuotteen nukleotidisekvenssi määritettiin. Sekvenssi-analyysi osoitti, että plasmidi 2H-M8 sisälsi useita nukleotideja Pst-katkaisukohdan ja IFN-0d:n ensimmäisen kodo-nin (CYS) välissä. Pstl:llä avattu plasmidi 2H-M8 käsi-15 teltiin T4-polynukleaasi/dATP:llä ja Sl-eksonukleaasilla sekä pilkottiin Sali:llä. Tässä käsittelyssä muodostui sarja fragmentteja, joiden IFN~C(l:tä koodaavat sekvenssit olivat niiden aminoterminaalisen pään puuttuvia osia. Nämä fragmentit saatettiin sitten LAC-säätelyn alaisiksi liittä-20 mällä ne operatiivisesti GUA-LAC-fragmenttiin, joka oli valmistettu Lac3V8-plasmidista pilkkomalla se EcoRIrllä, käsittelemällä liittymistuotetta Sl-eksonukleaasilla ja hajottamalla se sen jälkeen Sällillä. Muodostuneet plasmidit sisälsivät täten IFN -oa :tä koodaavia sekvenssejä, joiden amino-25 terminaalisista päistä puuttui erilaisia osia ja jotka olivat kiinnittyneet vastapäivään AUG:n välityksellä fragmenttiin, joka sisälsi LAC-promootterin.

Muutamille mainituista plasmideista suoritettiin sekvenssianalyysi. Yksi alkoi IFN-Äl:n viidennestä amino-30 haposta ja yksi IFN-otl:n kymmenennestä aminohaposta. E. colin minisoluissa (DS410) molemmat plasmidit tuottivat polypeptidejä, joilla oli IFN-aktiivisuus. Täten IFN-ak-tiivisuuden ekspressoituminen ei vaadi IFN-al-proteiinia kokonaisuudessaan.

35 78 8655 8

Sellaisten E. colin kloonien identifiointi, jotka sisältävät yhdistelmä-DNA-molekyylejä, joiden DNA-insertit hybridisoituvat ristiin heikosti Hif-4c:n liitettyyn fragmenttiin ja joi11a on erilainen restriktiokartta kuin Hif-5 2h-fragmcntilla

Verrattaessa autenttisen lymfoblastoidi-interferonin 35 ensimmäistä aminohappoa (Zoon et ai., edellä ja M. Hunkapiller ja L. Hood, edellä) Hif-2h:sta peräisin olevaan sekvenssiin havaitaan yhdeksän erilaista kohtaa. Kaikissa 10 tapauksissa toisistaan eroavien aminohappojen kodonit voidaan muuttaa samanlaisiksi yhden emäksen muutoksilla. Myös autenttisen lymfoblastoidi-interferonin ja Hif-2h-fragment-tia vastaavan proteiinin aminohappokoostumukset eroavat huomattavasti toisistaan glysiinin, proliinin, kysteiinin 15 ja metioniinin osalta. Nämä erot ovat liian suuria, jotta niiden voitaisiin katsoa aiheutuvan polymorfiasta. Sen sijaan ne mitä todennäköisimmin kuvastavat ainakin kahden ei-alleellisen geenin esiintymistä, koska näiden kahden proteiinin eroavuusaste (26 %) on samaa suuruusluokkaa kuin 20 esimerkiksi eroavuus ihmisen ja lampaan /?-globiinin välillä (23 %). Täten kloonit, jotka hybridisoituivat heikosti Hif-4c-fragmenttiin, tutkittiin yksityiskohtaisemmin ja klooni E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-II-206 identifioitiin.

25 Tämän kloonin hybridiplasmidi Z-pBR322(Pst)/HcIF- 11-206 ("HcIH-II-206") ja siihen liitetty DNA-sekvenssi ("Hif-II-206-fragmentti) hybridisoituivat heikosti Hif-4c-ja Hif-2h-fragmenttiin. Plasmidilla Hif-II-206 transformoitu E. coli tuottaa polypeptide jä, joilla on HuIFN-c(:n bio-30 loginen tai immunologinen aktiivisuus. Hif-lI-206-fragmen-tin restriktiokartta on erilainen kuin Hif-2h-fragmentin. Kuviossa 11 on verrattu näitä kahta restriktiokarttaa. Laatimalla ainoastaan restriktiokartta Hif-II-206-fragmentin restriktiokohtien tarkkaa sijaintia ei saada selville. Suo-35 rittamalla lisäksi nukleotidisekvenssianalyysi käyttäen edellä kuvattuja standardimenetelmiä, restriktiokohdat voidaan sen sijaan paikallistaa tarkemmin. Koska kuitenkin 79 865Ξ8

Hif-II-206-fragmentin ja Hif-2h-fragmentin restriktiokartat ovat erilaisia, on selvää, että näiden kahden fragmentin interferonigeeneillä on erilaiset nukleotidisekvenssit.

Kuvioissa 12-16 on esitetty HcIF-G:hen liitetyn DNA-5 sekvenssin (Hif-II-206-fragmentin) nukleotidisekvenssi sekä HcIF-E:hen liitetyn DNA-sekvenssin (Hif-2h-fragmentin) nuk-Icotidisckvenssi sekä näiden nukleotidisekvenssien koodaamien proteiinien vastaavat aminohapposekvenssit. Hif-II-206-fragmentin nukleotidisekvenssi /plasmidi-DNA:n Pst-I-10 fragmentti (790 emäsparia), joka on eristetty HcIF-G:stä käyttäen menetelmää: B, N.M. Wilkie et ai., Nucl. Acids Res. 7 (1979) 859-8777 määritettiin käyttäen A.M. Maxamin ja W. Gilbertin standardimenetelmää (esitetty edellä). Menetelmä, jota sekvenssin määrityksessä käytettiin, on 15 esitetty kuviossa 17.

Restriktioentsyymillä käsitelty DNA (tavallisesti noin 10 ^,ug) merkittiin 5'-terminaalisesti /N. Mantei et ai., Gene 10 (1980) 1-1Q7. Merkityt fragmentit pilkottiin toisella restriktioentsyymillä, tuotteet fraktioitiin elek-20 troforeettisesti 5-%:isolla polyakryyliamidigeelillä Tris-boraatti-EDTA puskurissa /A.C. Peacock ja C.W. Dingman, Biochem. 6 (1967) 1818-18277, uutettiin geelistä ja puhdistettiin W. Mullerin et ai. mukaisella menetelmällä /J. Mol. Biol. 124 (1978) 343-358/.

25 Seuraavat fragmentit, joiden sekvenssi määritettiin, valmistettiin seuraavasti (kuvio 17) : 25 ja 26 -- Hif-II-206:n hajotus Pstlrllä, merkitseminen, hajotus Bglllrlla, PstIx-BglII-fragmentin (257 emäs-paria) "25") ja PstIx-BglII-fragmentin (279 emäsparia) 30 ("26") eristys; 21, 22 ja 23 — Hif-II-206:n hajotus PvuIIrlla, merkitseminen, hajotus BglII:lla, PvuIIX-BglII-fragmentin (88 emäsparia) ("21"), PvuIIXBglII-fragmentin (176 emäsparia) ("22") ja PvuIx-BglII-fragmentin (214 emäsparia) 35 ("23") eristys; 11, 12, 13 ja 14 — Hif-II-206:n hajotus BglII:lla, merkitseminen, hajotus Pstlrllä, BglIIx-PstI-fragmentin so 86538 (279) emäsparia( ("14") sekä BglIIX-PstI-fragmentin ja Bglll -Bglll -fragmentin (eivät erottuneet) muodostaman seoksen eristys. Seoksen hajotus PvuIIilla ja BglIIx-PstI-fragmentin (257 emäsparia) ("13"), BglIIx-PvuII-fragmentin 5 (176 emäsparia( ("12") ja BglIIx-PvuII-fragmentin (88 emäs- paria) ("11") eristys.

27L, 27U, 41, 43, 44 ja 45 - Hif-II-206:n hajotus Hinfl:llä, merkitseminen, välituotefragmenttien eristys:

HinfIX-HinfIX (113 emäsparia) ("27P"), HinfIx-HinfIX 10 (146 emäsparia( ("28P"), HinfIX-HinfIX (159 emäsparia) ("30P"), HinfIx-Hinfx (397 emäsparia( ("31P") ja Hinflx-Hinflx (1522 emäsparia ("32P"). 28P-fragmentin hajotus MboII:lla ja HinfIx-MboII-fragmentin (112) emäsparia) ("41") eristys. 30P-fragmentin hajotus MboII-.lla ja Hinflx-15 MboII-fragmentin (126 emäsparia) ("43") eristys. 31P-frag-mentin hajotus Pstlrllä ja Hinf -Pstl-fragmentin (151 emäs-paria ( ("44") erishys. 32Ρ-.Γragmentin hajotus l’sU:Jlä ja Hinfx-PstI-fragmentin (139 emäsparia) ("45") eristys. 27P-fragmentin juosteet erotettiin toisistaan, jolloin saatiin 20 kaksi juostetta ("27U" ja "27L").

Kaikkien segmenttien, paitsi 27U:n ja 27L:n, molempien juosteiden nukleotidisekvenssi määritettiin niiden restriktiokohtien yli, jotka toimivat sekvenssin määrityksessä alkukohtina, lukuun ottamatta Bglll-katkaisukohtaa 25 asemassa 185.

Verrattaessa näiden kahden fragmentin koodaamia aminohapposekvenssejä on ilmeistä, että Hif-II-206-fragmentti koodaa interferonin kaltaista proteiinia, joka sisältää yhden aminohapon vähemmän kuin Hif-2h-fragmentin koodaama 30 proteiini /aminohappo 44 (Asp), jonka Hif-2h sisältää, puuttuu Hif-II-206:sta/. Lisäksi 10 % näiden kahden fragmentin sisältämistä nukleotideistä ja 17 % niiden koodaamista ami-nohapporyhmistä on eri asemissa.

Lisäksi verrattaessa samoja fragmentteja lymfoblas-35 toidi-interferoniin, jonka aminopäästä on määritetty 35 aminohappoa /k.C. Zoon et ai., Science 207 (1980) 527-528/, Hif-II-206 koodaa proteiinia, joka eroaa lymfoblastoidi- 8i 86 558 interferonin sisältämästä 35 aminohaposta viiden aminohapon osalta. Täten täytyy olla olemassa vähintään kolme erilaista leukosyytti tyypin (0C- tyypin) IFN-geeniä: Hif-2h-fragmentti, Hif-II-206-fragmentti ja geeni, joka vastaa Zoonin 5 määrittämää IFN:ää. Uuden interferoninimistön mukaisesti näiden geenien koodaamia proteiineja merkitään tästä lähtien seuraavasti: IFN-geenin alkuperä Proteiini

Hif-2h IFN—«1 10 Hif-II-206 IFN-0C2

Lymfoblastoidisoluista eristetty IFN lFN-0(3 (Zoon et ai. edellä) IFN-0Cl:n ja IFN-<X2:n väliset erot ilmenevät myös siinä, että niiden vaikutus ihmisen CCL23-soluihin ja härän 15 sikiön munuaissoluihin (BEK) on erilainen:

Uute Suhteellinen IFN-aktiivisuusx CCL23 BEK Suhde

Hif-II-206 (IFN-CC2) 1,7 1,0 1,7:J

Hif-SN35XX (IFN-0C1) 0,05 1,0 1:20 20

Hybridiplasrnidin sisältävää F. colin HM IOJ-kantaa viljeltiin tryptonielatusaineessa ravisteluviljelmänä, kunnes viljelmän 0Dg,-Q oli noin 1-2. Solut erotettiin, punnittiin ja suspendoitiin uudelleen 1/100- tai 1/20-osaan alkuperäisen 25 viljelmän tilavuudesta, minkä jälkeen solut hajotettiin lysotsyymi/syväjäädytys/sulatus-menetelmällä /S. Nagata et ai., Nature 284 (1980) 316-320/. S30-pintanesteet testattiin mikrotiitterilevyn syvennyksissä menetelmällä, joka perustui CPE:n vähenemisen määritykseen. Vertailusoluista 30 saadut uutteet osoittautuivat negatiivisiksi (<1 IU/ml). Ihmisen CCL23-soluja ja härän sikiön munuaissoluja (BEK) (FLOW) viljeltiin MEM-väliaineessa, joka sisälsi 10 % vasikan sikiöseerumia. Viljelmien annettiin olla IFN:ää sisältävien uutteiden kanssa kosketuksessa 24 tuntia. Solut 35 infektoitiin sopivalla määrällä Mengo-virusta ja värjättiin 24 tuntia myöhemmin. Tulokset arvioitiin silmämääräisesti verrattuna osittain puhdistettuun laukosyytti-IFN-valmis-teeseen (valmiste PIF, lahja K. Cantellilta), jonka 82 86558 pitoisuus tunnettiin. Tämä valmiste oli noin kolme kertaa aktiivisempi ihmisen soluissa kuin härän soluissa.

XX

Verrattaessa Hif-SN35:n ja Hif-2h:n restriktiokarttoja, havaitaan, että Hif-SN35 ja Hif-2h ovat toistensa polymor-5 fisia muunnelmia (edellä).

Täten IFN-OCl:n aktiivisuus ihmisen soluissa on noin 30 kertaa pienempi kuin IFN-flC2:n. Molemmat ovat kuitenkin suunnilleen yhtä aktiivisia härän soluissa. Täten IFN-10 interferoneja voidaan käyttää mahdollisesti myös eläinten virustautien, kasvainten ja syövän hoitoon ihmisiin kohdistuvan käytön lisäksi. Esimerkiksi HuIFN-0(-valmisteita voitaisiin mahdollisesti käyttää tavanomaisilla tavoilla (edellä) karjassa esiintyvän FMDV-infektion tai muiden hy-15 vin tunnettujen virusinfektioiden hoitoon. Erikoisesti IFN-CXl on tässä mielessä käyttökelpoinen, koska sen vaikutus härän soluihin on noin 20 kertaa suurempi kuin ihmisen soluihin.

Koska IFN-Äl:lle saatiin parempi saanto käytettäessä 20 C8-modifikaatiota (edellä), samanlainen modifikaatio valmistettiin IFN-OC2:lle. Z-pBR322 (pst)/Hif-II-206 pilkottiin täydellisesti Bspl:llä ja osittain PvuII:lla (Pl-kohdasta), ja 867 emäsparin pituinen fragmentti eristettiin 6-%:isesta polyakryyliamidigeelistä. Tämä fragmentti liitettiin sitten 25 C8-IFN-011:stä /C8-IFN-0C1 sisältää kolme PvuII-katkaisukoh- taa (kuvio 28). 2 590 emäsparin pituinen fragmentti sijaitsee P1:n ja P3:n välissä/ PvuTJ:l.La katkaistuun 2 590 emäsparin pituiseen fragmenttiin. Muodostuneella hybridi-plasmidilla transformoitiin E. coli HB101, ja kloonien 30 IFN-aktiivisuus määritettiin. Yksi klooni, jonka IFN-aktii-visuus oli korkea, erotettiin ja sitä merkittiin E. coli HB101 (C8-IFN-0C2) .

Suoritettaessa hybridiplasmidin C8-IFN-0(2 sekvenssianalyysi, havaittiin, että siinä, samoin kuin C8-IFN-0C1:ssä 35 oli initiaattoritripletin jälkeen /J-galaktosidaasin seitsemää ensimmäistä aminohappoa koodaava sekvenssi, fuusioitumalla muodostunutta Pro-jäännöstä koodaava sekvenssi sekä S3 86553 IFN-oC2:n signaalisekvenssin aminohappoja 16-23 koodaava sekvenssi. Tällöin ekspressoituu todennäköisesti IFN-a2:n sisältävä sekaproteiini.

Tällä plasmidilla transformoidut minisolut tuotti-5 vat 100-200 miljoonaa yksikköä IFNtää yhtä litraa kohti eli saanto oli 20 000 - 40 000 -kertainen verrattuna modi-fioimattomalla Z-pBR322(Pst)/Hif-II-206-plasmidilla transformoiduilla minisoluilla saatuun. C8-IFN-0Q:n ja C8-IFN-0(2 :n saantojen keskinäinen suhde (C8-IFN-C&: llä noin 50 x 10 106 yksikköä/litra ja C8-IFN-C(2:11a noin 100-200 miljoonaa yksikköä/litra) vaikuttaa ensi näkemältä hämmästyttävältä, koska IFN- OQ on havaittu noin 30 kertaa aktiivisemmaksi kuin IFN-OCL ihmisen soluissa (edellä) . Analysoitaessa kuitenkin kvantitatiivisesti mainitulla kahdella plasmidilla 15 transformoitujen minisolujen tuottamien proteiinien määrä havaittiin, että C8-IFN-0CL:ssä muodostui noin 5-6 kertaa enemmän proteiinia kuin C8-IFN-Ä2 : ssa . Koska C8-IFN-OCL tuotti huomattavasti suuremman määrän proteiinia, saannoista saatiin IFN-aktiivisuuden perusteella määritettynä vir-20 heellinen käsitys.

IFN-0C2:n saantoa yritettiin parantaa myös käyttämällä toista modifikaatiota (kuvio 26). Aluksi valmistettiin LAC-Alu-fragmentin sisältävä ekspressioplasmidi käsittelemällä tunnettua lac-promootteria Alul-restriktioentsyymil-25 lä ja liittämällä kuviossa 27 esitettyyn fragmenttiin (esitetty ainoastaan toinen pää) EcoRI-linkkerit. Näin käsitelty fragmentti liitettiin sitten pBR322-plasmidiin EcoRI-katkaisukohtaan, ja pieni EcoRI-EcoRI-fragmentti hävitettiin rakenteesta. Muodostunut plasmidi, jota on merkitty 30 numerolla 404 kuviossa 26, pilkottiin HindIII:lla ja

PvuII:lla, minkä jälkeen pilkkoutumistuotteisiin liitettiin IFN-e(2:n sisältävä fragmentti. IFN-flC2-fragmentti valmistettiin hajottamalla osittain Z-pBR322(Pst)/HcIF-II-206-plas-midi ('^Οβ" kuviossa 26) Sau3A-restriktioentsyymillä, liit-35 tämällä Sau3A-fragmenttiin Hindlll-linkkerit (kuvio 27) ja hajottamalla tuote Bspl:llä. Tämä fragmentti liitettiin HindIII:lla ja PvuII:lla pilkottuun plasmidiin 404, minkä 84 86 558 jälkeen muodostunutta plasmidia käsiteltiin restriktio-entsyymeillä Hindlll ja EcoRI sekä sen jälkeen Sl-nukleaa-silla, jotta LAC-promootteri saataisiin lähemmäksi IFN-c(2“ geeniä, ja ligaatio suoritettiin uudelleen. Tässä rakentees-5 sa, joka identifioitiin plasmidi LAC-AUG (0.2) : ksi, IFN-fi(2-DNA-sekvenssi on LAC-promootterin säätelyn alaisena. Lisäksi IFN-ö£2~sekvenssi seuraa välittömästi promootterin AUG-initiaatiokodonia (katso kuvio 27). Täten ainakin osa näiden plasmidicn tuottamasta IFNrstä on kypsää IFN:ää 10 (IFN, joka ei sisällä signaalisekvenssin koodaamia aminohappoja). Minisoluissa LAC-AUG(«2)-plasmidi11a saatu IFN-Odn saanto oli 5-10 miljoonaa yksikköä litraa kohti.

Valmistettiin myös toinen IFN-o£2-modifikaatio samoja liittämismenetelmiä. Tällöin pBR322-plasmidin penisil-15 linaasin ekspressiota säätelevä sekvenssi liitettiin AUG-initiaatiokodonin välityksellä Hif-II-206:sta eristettyyn IFN-«2-geeniin. /Tämä rakenne voidaan parhaiten valmistaa hajottamalla pBR322-plasmidi osittain MboII-restriktio-entsyymillä, käsittelemällä hajoamistuotteita SI:llä, kiin-20 nittämällä niihin EcoRI-linkkerit, kuten edellä ja siirtämällä fragmentti uudelleen pBR322-plusmidin FeoU1-kai kai jatkoiltaan ja poistamalla yksi EcoRI-katkaisukohta. Muodostunut plasmidi (73-lac-AUG-plasmidi") voidaan sitten liittää Hif-II-206-fragmenttiin, joka on katkaistu Bspl:llä, käsi-25 telty Sl:llä (lievä käsittely) ja johon on liitetty

Hindlll-linkkerit, kuten edellä. Tuote katkaistaan EcoRI:llä ja käsitellään Siiliä sekä fosfataasilla, minkä jälkeen ekspressioplasmidi /3- lac-AUG(Q(2) eristetään. Modifikaatioita, joihin on liitetty muita geenejä, voidaan valmistaa 30 samalla tavalla käyttämällä hyväksi pelkästään valmistettua A- lac-AUG-plasmidia, johon liitetään muita geenejä tai muita rakenteita, tai edullisemmin käyttämällä hyväksi Sau3A-katkaisukohtaa /J-lac-AUG (0(2) -plasmidissa itsessään._/ Transformoitaessa tällä plasmidilla /Jpr lac-AUG (0(2)/7 isäntä-35 soluja voidaan valmistaa IFN-d(2-interferonia, joka ei sisällä lisäksi muita proteiinisekvenssejä (ei fuusioitumista). Minisoluissa saanto on ollut 50-100 miljoonaa yksikköä 85 86 558 litraa kohti. Tämä plasmidi on edullisin esillä olevan keksinnön mukaisesti käytettävä plasmidi. Sitä voidaan käyttää myös edullisesti muiden tässä mainittujen IFN-Ot-geenien yhteydessä. Edullisin esillä olevassa keksinnössä käytettä-5 vä isäntäorganismi on E. coli SD140 (ara azide TonA lac y Tsx min a min b gal Λ. xyl step ). Tämä kanta on talletettu talletuslaitokseen, kuten myös näyte edullisesta plasmidis-ta/3-lac-AUG (0(2) talletus tunnuksella HcIF-K.

Samoilla menetelmillä ja periaatteilla voidaan valio mistaa myös muita modifikaatioita, jolloin käytetään hyväksi eri promootterisekvenssejä, ribosomien kiinnittymiskoh-tia, Shine-Dalgarno-sekvenssejä ja DNA-sekvenssejä promoot-terin ja AUG-initiaatiokodonin välissä ja käyttäen erilaisia IFN-Ot-geenejä. Nämä modifikaatiot ovat luonnollises-15 ti itsestään selviä tämän keksinnön perusteella ja kuuluvat esillä olevan keksinnön suojapiiriin.

IFN-C£L:n ja IFN-0C2:n hybridimolekyylit Eräitä IFN-0(l:n ja IFN-ot2:n hybridimolekyylejä on valmistettu. Yllättäen on havaittu, että näillä hybridi-20 rakenteilla on kvantitatiivisesti erilaiset ominaisuudet ja aktiivisuudet kuin rakenteilla, joista ne ovat muodostuneet eli IFN-otl:llä ja IFN-ö(2:lla.

Kuviossa 28 on esitetty kaavion muodossa neljän mainitun hybridimolekyylin rakenne. Hybridimolekyylit on mer-25 kitty seuraavasti: plasmidit I, II, III ja IV. Näitä rakenteita valmistettaessa käsittely rest:riktioentsyymcillä (Biolabs, lukuun ottamatta BspI, joka o Li saatu lahjaksi tohtori Kissiltä) suoritettiin käytännöllisesti katsoen standardimenetelmien mukaan. Hajotettaessa DNA vain osit-30 tain, käytettiin pienempiä määriä entsyymejä. Restriktio-entsyymi inaktivoitiin lämpökäsittelyllä (65°C, 30 min), minkä jälkeen näytteisiin lisättiin Tris-HCl-puskuria _ 3 (pH 8) niin, että sen pitoisuudeksi tuli 50 x 10 -m, ja tarvittaessa lisättiin vasikan suoliston alkalista fosfa-35 taasia (Bohringen) (yksi tilavuus yhtä ,ug:aa kohti

' O

DNArta). Näytteitä pidettiin 30 minuuttia 37 C:ssa, ja sen jälkeen no uutettiin fenolilla ja eetterillä. Useimmissa 86 8 6 558 tapauksissa DNA-fragmentit erotettiin alhaisessa lämpötilassa geeliytyvällä agaroosilla (0,8-%). Ligaatiota varten geelipaloja sisältävä fragmentti (noin 20 ^ul kukin) sulatettiin 65°C:ssa, jäähdytettiin 37°C:seen, minkä jälkeen 5 lisättiin 20 yksikköä T4-DNA-ligaasia yhtä ^ul:aa kohti näytettä. Seosta pidettiin 15°C:ssa 16 tuntia, jolloin li-gaatio tapahtui kiinteytyneessä geelissä (H. Lehrach, henkilökohtainen tiedonanto 1980). Lisättiin 1/10-kertainen -3 tilavuus liuosta, jossa oli 100 x 10 -m Tris-HCl (pH 7,5), -3 -3 10 100 x 10 -m CaCl2 ja 100 x 10 -m MgC^, ja näytettä läm mitettiin viisi minuuttia 65°C:ssa ja jäähdytettiin sen jälkeen 37°C:seen. Näytteet siirrettiin sitten CaZ -ioneilla käsiteltyyn minisoluviljelmään, niitä inkuboitiin 0°C:ssa 20 minuuttia, lämmitettiin yhden minuutin ajan 42°C:ssa ja 15 10 minuuttia 20°C:ssa, minkä jälkeen lisättiin 1 ml tryp- tonialustaa . Inkuboitiin 60 minuuttia 37°C:ssa, minkä jälkeen viljelmät siirrettiin agarmaljoille, jotka sisälsivät sopivia antibiootteja. Kaikki plasmidit karakterisoitiin suorittamalla nukleotidisekvcnssiana lyysi 1 FN-sckvens-20 sissä olevan liitoskohdan yli.

Hybridimolekyyli I, OC-1 (PvuII) 0fc-2-hybridi , valmistettiin katkaisemalla C8-IFN-CU (edellä) (C8-o(l kuviossa 28) osittain PvuII:11a, minkä jälkeen se defosforyloitiin ja katkaistiin Pstlrllä ja 1 346 emäsparin pituinen Pstl-25 PvuII(P2)-fragmentti eristettiin. Tämä fragmentti liitettiin 2 135 emäsparin pituiseen PstI(a)-PavuII(P2)-fragmenttiin, joka oli valmistettu katkaisemalla C8-IFN-&2 (edellä) (C8-Q62 kuviossa 28) täydellisesti PvuII :11a ja osittain PstI:llä.

30 Hybridimolekyyli II, 06-1 (Bglll) ofc-2-hybridi , valmis tettiin hajottamalla hybridimolekyyli I BglII:lla. Tämän jälkeen suoritettiin defosforylointi, ja suuri Bglll-frag-mentti eristettiin ja liitettiin pieneen fragmenttiin, joka oli valmistettu hajottamalla C8-IFN-0<2 BgllI-restriktio-35 endonukleaasilla. Kloonauksen jälkeen hybridiplasmidi, joka sisälsi pienen Bglll-fragmentin oikealla tavalla orientoituneena, identifioitiin restriktioanalyysillä.

87 8 6 55 8

Hybridimolekyyli III, Ot-2 (PvuII) α-1-hybridi, valmistettiin hajottamalla C8-IFN-0C1 osittain PvuII: 11a, minkä jälkeen suoritettiin defosforylaatio, tuote hajotettiin Aval:llä ja 1 686 emäsparin pituinen PvuII(?2^-AvaI-frag-5 mentti ja 3 233 emäsparin pituinen PvuII(P^-Aval-frag-mentti eristettiin. Nämä fragmentit liitettiin sitten 300 emäsparin pituiseen PvuII(P^)-PvuII(P2)-fragmenttiin, joka oli peräisin HcIF-II-206:sta (edellä) (SN206 kuviossa 28), ja pienen PvuII-fragmentin sisältävä plasmidi identifioi-10 tiin määrittämällä transformoiduista E. colin kannoista niiden IFN-OC-aktiivisuus.

Hybridimolekyyli IV, 0C-2 (Bglll) ot-l-hybridi, valmistettiin hajottamalla C8-IFN-Ä1 BglII:lla ja Aval:llä, minkä jälkeen 1 776 emäsparin pituinen fragmentti eristettiin. 15 Tämä fragmentti liitettiin sitten 3543 emäsparin pituiseen BglII-AvaI-fragmenttiin, joka oli peräisin hybridimole-kyylistä III.

Myös eri interferonilajien biologinen aktiivisuus (toisiinsa verrattuna) määritettiin. Eri plasmideilla trans-20 formoituja minisoluja (DS410) viljeltiin ja bakteerit erotettiin sentrifugoimalla, pestiin PBS:llä, suspendoitiin PBSrään (noin 1/20 alkuperäisestä tilavuudesta) ja inkuboi- tiin 60 minuuttia 0°C:ssa väliaineessa, joka sisälsi 1 mg/ml -3 lysotsyymiä ja 10 x 10 -m EDTA, inkubointituote jäädytet-25 tiin ja sulatettiin neljä kertaa sekä murskattiin johtamalla se viisi kertaa injektioneulan läpi, minkä jälkeen suoritettiin erotus sentrifugoimalla.

Aktiivisuudet ihmisen, hiiren, marsun ja härän soluissa olivat seuraavat: 30 35 88 8 6 5 5 8

Suhteellinen IFN-aktiivisuus

Proteiinin Ihminen Härkä Hiiri (L) Marsu alkuperä (FS4) (BEK) C8-IFN-02 1 1 0,01 0,03 5 C8-IFN-<U 0,03 1 0,3 0,03

Hybridi I 0,001 1 0,003-0,008 0,003-0,01

Hybridi II 0,001 i 0,001 0,01

Hybridi III 1 1 1 0,3

Hybridi IV 0,1 1 2 0,1-0,005 10 Negatiivinen vertailunäyte -

Yllättäen on havaittu, että kaikilla tutkituilla interferonilajeilla on suunnilleen samanlainen aktiivisuus härän soluissa, mutta IFN-cCl:llä ja niillä kahdella hybri-15 di-IFN:llä (I ja II), jotka sisältävät IFN-flCL:n aminoter-minaalisen osan, on noin 10-1 000 kertaa pienempi aktiivisuus ihmisen soluissa kuin IFN- 2:11a ja niillä kahdella hybridi-IFN:Llä (ΤΤΓ ja IV), jotka sisältävät. I FN-0(2: n aminoterminaalisen osan. On vieläkin siimiinpistävämpää, 20 että niillä kahdella hybridi-IFN:llä (I ja II), jotka sisältävät IFN -oa :n aminoterminaalisen osan, on alle 10 kertaa pienempi aktiivisuus ihmisen soluissa kuin IFN-OCl:llä itsellään. Sen sijaan yhdellä hybridillä (III), joka sisältää IFN-Ct2:n aminoterminaalisen osan, on suunnilleen sama 25 aktiivisuus ihmisen soluissa kuin IFN-C(2:lla.

IFN-ofc-interferonia koodaavien kromosomaalisten geenien identifiointi

Valmistettiin sarja hybriditageja ihmissikiön kro-mosomaalisen DNA:n fragmenteista, jotka oli valmistettu ha-30 jottamalla DNA osittain Haelllrlla ja Alulrllä, minkä jälkeen hajoamistuotteet oli liitetty EcoRI-linkkerciden avulla A.-Charon-4A-ulokkeisiin /R.M. Lawn et ai., Cell 15 (1978) 1157-1174/. Tämä sarja seulottiin in situ -menetelmällä /W.D. Benton ja R.W. Davis, Science 196 (1977) 35 180-182, T. Manitis et ai., Cell 15 (1978) 678-7017 käyt- 32 täen mallina P-merkittyä IFN-ÄlcDNA-fragmenttia, joka oli katkaisu pBR322(Pst)/Hif-2h-plasmidista. 15 fagikloonia 89 36 558 antoi positiivisen hybridisointituloksen ja nämä eristettiin 240 000 pesäkkeestä puhdistamalla pesäkkeet toistuvasti (T. Maniatis et ai., edellä). Näistä hybriditagi-DNA-valmisteista 10 hajotettiin HindIII:lla, Tacl:llä, Hhaltllä, 5 BamHI:llä, EcoRIrllä ja BglII:lla ja fragmentit erotettiin elektroforeettisesti agaroosigeelillä, siirrettiin Millipo-re-kalvolle /£.M. Southern, J. Mol. Biol., 98 (1975) 503-51lJ ja hybridisoitiin P-merkityn Hif-2h-cDNA-fragmentin kanssa. Kuvioon 18 on koottu tulokset osittaisten restrik-10 tiokarttojen ja erilaisten taulukoiden muotoon. Näistä ilmenee, että kullakin hybridifagi-DNA-valmisteella oli ainakin muutama tunnusomainen restriktiokohta; kaavioon on merkitty myös alue (alueet), jotka hybridisoituvat IFN-ai-geenimal-lin kanssa (musta nuoli) (varjostettu alue chr-16:ssa ku-15 vioissa 18 ja 24 esittää sekvenssiä, joka hybridisoituu heikosti Hif-2h-cDNA:n kanssa, mutta jossa ei esiinny R-silmukointia).

Kuvioista 18-24 ilmenee, että kloonit chr-3 ja chr-26 mahdollisesti edustavat DNA-segmenttejä, joissa 20 esiintyy laajoja overlap-alueita, koska niillä on useita yhteisiä EcoRI- ja HindIII-fragmentteja. Lisäksi chr-l:n hybridisoituva osa ja yksi chr-10:n hybridisoituvista osista voivat olla samoja, koska Hindlll-Hindlll- ja EcoRI-EcoRI-fragmentit, jotka hybridisoituvat His-2h-mallin kans-25 sa, ovat samanpituisia (3,2kb ja 0,95kb). Näyttää myös siltä, että chr-16:n "oikealle orientoituva" hybridisointiosa (merkitty "r" kuviossa 18) on mahdollisesti, identtinen chr-35:n hybridisoituvan osan kanssa, vaikkakin on orientoitunut vastakkaiseen suuntaan, koska kumpikin näistä 30 kahdesta kloonista tuottaa l,4kb:n BglII-BglII-fragmentin ja 2kb:n EcoRI-EcoRI-fragmentin, jotka hybridisoituvat Hif-2h-cDNA-mallin kanssa. Täten mitä todennäköisimmin chr-16- ja chr-35-fragmentit menevät osittain päällekkäin.

Täten näyttää siltä, että 11 kromosomaalisen DNA-35 hybridin 13 hybridisoituvaa osaa kuuluu ainakin 10 erilliseen luokkaan: chr-1, chr-3, chr-12, chr-13, chr-16 (vasemmalle orientoitunut, merkitty "1" kuviossa 18), chr-26, chr-30, chr-35, chr-19 ja chr-27.

qn Q < c. *: q 0 J o )

Kuviossa 24 on esitetty chr-l:n, chr-3:n, chr-10:n ja chr-26:n overlap-alueet sekä chr-16:n ja chr-35:n over-lap-alueet. Näistä tiedoista voidaan vetää se johtopäätös, että yksittäisen ihmisen genomi sisältää ainakin 10 eri-5 laista DNA-sekvenssiä, jotka hybridisoituvat Hif-2h:n kanssa. Tätä johtopäätöstä vahvistaa se, että Hif-2h-fragment-tin koodaavia sekvenssejä esiintyy kloonipankissa suhteessa 1:16 000. Oletettaessa, että ihmisen haploidinen genomi 9 sisältää 3 x 10 emäsparia, todennäköinen esiintymistiheys 10 yksittäiselle geenikopiolle, jonka keskimääräinen DNA- fragmenttikoko on 16kb (tutkittujen kloonien keskimääräinen arvo), on noin 1:190 000. Täten Hif-2h:ta koodaavien geenien esiintymistiheys on 12 kertaa suurempi kuin yhdelle geenille on oletettu. Lawn et ai. (edellä) tutkivat 300 000 näy-15 tettä samasta geenipankista /3-globiini-cDNA-mallilla, jolloin saatiin ainoastaan kaksi positiivista kloonia ja tällöin vastaava oletettu arvo on 1,6:300 000. Täten ihmisen genomissa voi olla 10-15 erillistä kromosomaalista DNA-segmenttiä, jotka hybridisoituvat Hif-2h-fragmentin eli 20 IFN-oQcDNA: n kanssa.

Hifpchr-3 5:n 1isäkarakterisointi

Havainnollisuuden vuoksi hybridisoituvaa sekvenssiä chr-35 ("hif-chr 35") karakterisoitiin tarkemmin. On ymmärrettävä, että aikaisemmin kuvattujen kromosomaalisten hyb-25 ridifagien hybridisoituvia osia voidaan samalla tavalla karakterisoida ja käsitellä poikkeamatta sillä olevan keksinnön suojapiiristä.

Hybridisoituva osa chr-35:stä ("hif-chr 35") (ja Hif-chr-16:n oikealle orientoitunut segmentti, jonka kanssa 30 se hyvin todennäköisesti on identtinen) on ainoa hybridisoituva kromosomaalinen DNA-osa Bglll-katkaisukohdassa.

Koska IFN-cil- ja IFN-0(2-cDNA-fragmentit sisältävät toinen yhden ja toinen kaksi Bglll-katkaisukohtaa koodisekvensseis-sään, näyttää todennäköiseltä, että llif-chr-35 vastuu tois-55 ta kahdesta aikuisemmin kloonatusta interferonigcenistä. Hif-chr-35 hybridisoituu voimakkaasti 3’-terminaaliseen Hif-2h-cDNA-fragmenttiin (joka sisältää ainoastaan 3’-ei- 91 S 6 5 5 8 koodaavan alueen), kun taas toinen kromosomaalinen DNA hyb-ridisoituu tämän mallin kanssa heikommin, mikä tulee sitä käsitystä, että Hif-chr35 ja Hif-2h todennäköisesti vastaavat toisiaan /f. Kafatos et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.

5 USA 74 (1977) 5618-5622J.

Jotta Hif-chr35 saataisiin tarkemmin analysoiduksi, tästä katkaistiin HindIII-BamHi-fragmentti. Tämä fragmentti (3,4kb) sisältää chr-35:n hybridisoituvan osan ("Hif-chr 35"). Tämä fragmentti kloonattiin pBR322-plasmi-10 din Pstl-katkaisukohtaan käyttäen hyvin tunnettuja "dC-dG-tailing" -menetelmiä (L. Villa-Komaroff et ai., edellä), ja E. coli HB101 transformoitiin muodostuneella yhdistelmä-DNA-molekyylillä käyttämällä hyvin tunnettuja menetelmiä /esim. S. Nagata et ai., Nature 284 (1980) 316-3207.

15 Nämä transformanttikloonit tutkittiin in situ -pesä- kehybridisointimenetelmää käyttäen /D. Hanahan ja M. Meselson, Gene 10 (1980) 63-677 ^P-merkityllä Hif-2h-frag-mentilla (edellä) ja positiivisista klooneista erotettiin sen jälkeen plasmidi-DNA: Z-pBR322 (pst)/IIchrIF-35HB 20 "HchrIF-35HB" /N.m. Wilkie et ai., Nucleic Acids Res. 7 (1979) 859-877, menetelmä β7· Plasmidin sisältämän hybri-disekvenssin "HchrIF-35HB" orientaatio pBR322-plasmidin β-laktamaasigeenin suhteen määritettiin hajottamalla plas-midi EcoRI-restriktioentsyymillä ja määrittämällä muodos-25 tuneiden fragmenttien koko. Sekvenssiä, jonka orientaatio oli sema kuin fir laktamaasin, merkittiin colla ja vastakkaisesti orientoitunutta yj:lla.

Näitä positiivisia klooneja viljeltiin, kunnes viljelmien 0°g5Q oli 0,8, minkä jälkeen bakteerit erotettiin 30 ja hajotettiin lysotsyymi-jäädytys-sulatus-menetelmällä (S. Nagata et ai., edellä). Tutkituista 10 kloonista seitsemällä IFN-OC-aktiivisuus oli 75-500 yksikköä yhtä grammaa kohti soluja (sytopaattisen vaikutuksen vähenemiseen perustuva määritysmenetelmä). Yksi mainitusta seitsemästä 35 iFNrää tuottavasta insertista /E. coli HB101 (Z-pBR322 (Pst) / HchrIF-35HBOfL7 karakterisoitiin lisäksi restriktioanalyysin avulla ja määrittämällä kloonin nukleotidisekvenssi. Kloo- 92 86558 nista valmistettiin plasmidi-DNA (HchrIF-35HBac) aikaisemmin kuvatulla tavalla ja plasmidin restriktiokohdat määritettiin Smith-Birnstiel -menetelmällä /H.O. Smith ja M.L. Birnstiel, Nucl. Acid. Res. 3 (1976) 2387-23987 seuraavas-5 ti: HchrIF-35HBot hajotettiin EcoRI-restriktioentsyymillä, 5'-päät merkittiin, ja tuotteet hajotettiin edelleen Bglllrlla (sekä Pstl:llä, jotta noin lkb:n pituinen ei-toivottu fragmentti saataisiin poistetuksi). l,04kb:n EcoRI-Bglll-fragmentti (3'-proksimaalinen) ja 0,96kb:n 10 EcoRI-BglII-fragmentti (5'-proksimaalinen) eristettiin elektroforeettisesti agaroosigeelillä /A.C. Peacock ja C.W. Dingman, Biochemistry 6 (1967) 1818-1827_/. Molemmat fragmentit hajotettiin osittain Hinflrllä, Bsplrllä ja MboII:lla ja hajoamistuotteet fraktioitiin l-%:isella 15 agaroosigeelillä käyttäen Tris-asetaattipuskuria (pH 7,8), joka sisälsi 1 ^,ug/ml etidiumbromidia. Suoritettiin radioaktiivinen merkintä, minkä jälkeen radioaktiiviset vyöhykkeet saatiin näkyviin autoradiofragisesti. BstNI- ja HgiAI-katkaisukohdat määritettiin samalla tavalla l,03kb:n frag-20 mentista (3'-proksimaalinen). Analyysitulokset ilmenevät kuviosta 19.

Nukleotidisekvenssin määritystä varten HchrIF-35HBflt hajotettiin eri restriktioentsyymeillä, tuotteet fraktioitiin elektroforeettisesti 5-%:isella polyakryyliamidigee-25 Iillä käyttäen Tris-boraatti-EDTA-puskuria (A.C. Peacock ja C.W. Dingman, edellä) ja uutettiin geelistä sekä puhdistettiin W. Mullerin et ai. mukaisella menetelmällä fj. Mol. Biol. 124 (1979) 343-3587-

Menetelmä, jota nukleotidisekvenssin määrittämisessä 30 käytettiin, ilmenee kuviosta 19 ja on kuvattu seuraavassa: 1 ja 2 — HchIF-35HBö(;n hajotus Bglllrlla, merkitseminen, hajotus EcoRI:llä ja Pstlrllä sekä BglIIx-EcoRI-fragmentin (940 emäsparia) ("1") ja BglIIX-EcoRI-fragmentin (360 emäsparia) ("2") eristys; 35 3 ja 4 — HchrIF-35HB0(:n hajotus EcoRIrllä, merkit- scminen, hajotus Bsplrllä ja KcoRI -Bspl-fragmcntin (680 emäsparia) ("3") ja EcoRIx-BspI-fragmentin (880 emäspari) ("4") eristys; S3 8 6 5 Ξ 8 5, 6, 7 ja 8 — HchrIF-35HB0On hajotus PvuIIrlla, merkitseminen, hajotus Bglllrlla ja EcoRI:llä sekä PvuIIx-EcoRI-fragmentin (780 emäsparia) ("δ”), PvuIIx-BglII-frag-mentin (215 emäsparia) ("6"), PvuIIx-BglII-fragmentin (90 5 emäsparia) ("7") ja PvuIIX-EcoRI-fragmentin (290 emäsparia) ("8") eristys; 9 ja 10 — HchrIF-3 5HBOC:n hajotus EcoRIrllä, 1 300 emäsparin pituisen EcoRI-EcoRI-fragmentin eristys l-%:isel-la agaroosigeelillä elektroforeettisesti Tris-boraatti-EDTA-10 puskurissa, hajotus Hinfl:llä ja Hinf-Hinf-fragmentin (450 emäsparia) sekä HinfI-HinfI-fragmentin (180 emäsparia) eristys. Merkitsemällä suurempi HinfI-HinfI-fragmentti ja hajottamalla se MboII:lla saatiin eristetyksi HinfIx-MboII-fragmentti (190 emäsparia) ("9"). Merkitsemällä pienempi 15 HinfI-HinfI-fragmentti ja hajottamalla se Avail:11a, saa-tiin eristetyksi Hinfl -Avall-fragmentti (150 emäsparia) ("10"); 11 — HchrIF-35HB0t:n hajotus MboII:lla, merkitsemä-nen, hajotus BglII:lla ja MboII -BglII-fragmentin (465 20 emäsparia) eristys; 12, 13 ja 14 — HchrIF-35HBei:n hajotus Bsplrllä ja Bglllrlla, 1 200 emäsparin pituisen BspI-BflII-fragmentin eristys agaroosilla elektroforeettisesti, kuten edellä ja (a) hajotus HgiAI:llä, merkitseminen, hajotus MboII:11a ja 25 HgiAIx-MboII-fragmentin (300 emäsparia) ("12") sekä HgiAIx-MboII-fragmentin (360 emäsparia) ("13") eristys, tai (b) hajotus BstNI:llä, merkitseminen, hajotus EcoRI:llä ja BstNIx-EcoRI-fragmentin (380 emäsparia) ("14") eristys.

Eri fragmenttien nukleotidisekvenssi määritettiin 30 Maxam-Gilbertin menetelmällä (edellä). Nukleotidisekvenssi määritettiin kaikkien fragmenttien molemmista juosteista niiden restriktiokohtien yli, jotka toimivat sekvenssin määrityksessä alkupisteinä.

Verrattaessa nukleotidisekvensse jä Hc:lirIF-35 HBtf:n 35 koodaavalla alueella sekä Hif-2h:n koodaavalLa alueella havaitaan, että ne ovat identtiset (kuviot 8-10 verrattuna kuvioihin 20-23) . Erikoisesti on hämmästyttävää, että ei 94 8 ί558 ole havaittavissa mitään merkkejä siitä, että HchrIF-35HBQCr fragmentin koodaavalla alueella eli 5'-ei-koodaavalla alueella sijaitsevan HinfI-katkaisukohdan ja 3'-ei-koodaavalla alueella sijaitsevan EcoRI-katkaisukohdan välisellä alueel-5 la esiintyisi introneja.

Täten introneita ei ole löydetty kypsää IFN-0(mRNA: ta koodaavasta kromosomisekvenssistä.

Hif-chr-26:n ja Hif-chr-3:n lisäkarakterisointi chr-3:n ja chr-26:n geenejä sisältävistä segmen-10 teistä, jotka heterodupleksianalyysin perusteella vaikuttavat samanlaisilta, mutta eroavat ainakin yhden Bglll-kat-kaisukohdan osalta, määritettiin nukleotidisekvenssit. 725 emäsparissa havaittiin eroja viidessä nukleotidissa. Näistä ainoastaan kaksi esiintyi koodaavissa sekvensseissä. Koska 15 geenien lisäksi ainakin 3,5 niitä edeltävää K-emäsparia ja 6,0 niitä seuraavaa K-emäsparia muodostivat täydellisen heterodupleksin ja koska muutettaessa sekvenssissä kaksi aminohappoa, muutos on suhteellisen pieni, näyttää siltä, että Hif-chr-3 ja Hif-chr-26 ovat saman geenin alleelisia 20 muotoja. Näitä on merkitty IFN-0C4a (Hif-chr-3) ja IFN-Ct4b (Hif -chr-26). IFN—0C4b:n nukleotidisekvenssi ja vastaava aminohapposekvenssi, jotka on määritetty tavanomaisilla menetelmillä, ilmenevät kuvioista 29-32.

Verrattaessa kuvioita 29-32 kuvioihin 8-10, 12-16 25 ja 29-23, havaitaan, että kunkin sekvenssin koodaamat proteiinit eroavat toisistaan noin 15-%risesti. Tällainen eroavuus on tyypillistä ei-alleelisten geenien tuotteille, jolloin ei-alleeliset geenit ovat alkaneet kehittyä eri suuntiin noin 20-90 miljoonaa vuotta sitten.

30 Hif-chr-35:n ekspressoituminen hiiren soluissa

Hif-chr-35-fragmentti, jonka ekspressoitumista hiiren soluissa tutkittiin, oli peräisin plasmidista Z-pBR322(Pst)/HchrIF-35HBot (edellä). Plasmidi käsiteltiin Pstl-restriktioentsyymiiiä ja sen jälkeen 5'-eksonukleaa-35 silla 5'-dG-päiden poistamiseksi. Tämä fragmentti liitettiin sitten myös 5'-eksonukleaasilla käsiteltyyn Kpnl-frag-menttiin, joka oli peräisin plasmidista, joka oli valmistettu 95 86 558 liittämällä pBR322-plasmidin BamHI-BamHI-fragmentteja poly-ooma-DNA:han. Muodostuneella vektorilla transformoitiin hiiren 3T3-soluja kalsiumfosfaattimenetelmää käyttäen /N. Mantei et ai.. Nature 281 (1979) 40-467- Näitä transformoisi tuja soluja merkittään mukavuuden vuoksi "Hiiren 3T3 (poly-ooma-Hif-chr-35)". IFN-Ä-aktiivisuusmäärityksissä havaittiin 20-40 tunnin kuluttua aktiivisuus 300 yksikköl/ml ihmisen soluissa ja noin 3 000 yksikköä/ml härän soluissa.

On luonnollisesti ymmärrettävä, että nukleotidisek-10 vensseissä, jotka ovat esitetty kuvioissa 8-10, 12-16, 20-23 ja 29-32 ei ole otettu huomioon mitään nukleotidisekvens-sien modifikaatioita, joita voi syntyä esimerkiksi mutaatioiden: yksinkertaisten ja moninkertaisten mutaatioiden, emässubstituutioiden, insertioiden, inversioiden ja delee-15 tioiden seurauksena. Sitä paitsi sekvensseissä ei ole otettu huomioon mahdollisia substituutioita muilla kodoneilla, jolloin uusi kodoni koodaa samaa aminohappoa kuin näissä kuvioissa esitetty kodoni. Täten on ymmärrettävä, että tällaiset modifioidut sekvenssit, jotka koodaavat polypeptide-20 jä, joilla on IFN-OC-interferonin immunologinen tai biologinen aktiivisuus, kuuluvat myös keksinnön suojapiiriin.

Lisäksi on ymmärrettävä, että kuvioissa 8-10, 12-16, 20-23 ja 29-32 esitetyissä aminohapposekvensseissä ei ole otettu huomioon polypeptideissä tapahtuvia modifikaatioita, 25 jotka syntyvät niiden reagoidessa in vivo tai in vitro eri aineiden kanssa, esim. in vivo glykosylaatioentsyymien kanssa. Täten on ymmärrettävä, että näiden polypeptidien fragmentit ja johdannaiset, joilla on IFN-flt-interferonin immunologinen tai biologinen aktiivisuus, kuuluvat myös esil-30 lä olevan keksinnön suojapiiriin.

Sellaisten polypeptidien valmistus, joilla on interferonin immunologinen tai biologinen aktiivisuus, bakteeri-isäntäorganismeissa

Koska sytopaattisen vaikutuksen vähenemiseen perustu-35 valla määritysmenetelmällä /W.E. Stewart II ja S.E. Suikin, S.E. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 123 (1966) 650-6537 voidaan todeta hyvin pieniä määriä IFNiää (vähemmän kuin yksi ak- 96

V O W V V

tiivinen solu bakteerisolua kohti). E. coli HB101 -lysaa-teista, jotka oli infektoitu kymmenellä hybridi-X-fagilla (kuvattu aikaisemmin), määritettiin IFN-pitoisuus. Seitsemällä käytetyistä 11 fagista (kaikki paitsi chr-10, chr-12, 5 chr-19 ja chr-27) saatiin tulokseksi lysaatteja, joissa IFN-aktiivisuutta esiintyi (3-50 yksikköl/ml). chr-10:n ja chr-12:n tapauksessa Hif-2h:n kanssa hybridisoituvat Hindlll-Hindlll- ja EcoRI-EcoRI-fragmentit, jotka oli kloonattu pBR322-plasmidin Pstl-restriktiokohtaan (kuvattu ai- 10 kaisemmin), tuottivat IFN-Ofc-aktiivisuutta E. colissa. Koska todennäköisesti K. coli ei pysty silmukoimaan mRNArta /0. Mercereau-Puijalon ja P. Kourilsky, Nature 279 (1979) 647-6497, nämä IFN-Ot-kromosomigeenit mitä todennäköisimmin eivät sisällä koodaavalla alueellaan introneja.

15 On eristetty sarja yhdistelmä-DNA-molekyylejä, jot ka sisältävät cDNA:ta, joka on peräisin Sendai-viruksella käsitellyistä (indusoiduista) ihmisen leukosyyteistä eristetystä poly(A)RNA:sta, jolloin näillä yhdistelmä-DNA-molekyy leiliä on seuraavat ominaisuudet: 20 (1) Ne hybridisoituvat poly(A)RNA:hän, joka on eris tetty indusoiduista, mutta ei indusoimattomista ihmisen leukosyyteistä.

(2) Ne hybridisoituvat IFN-QCmRNA: hän, mitä osoittaa se, että ne pystyvät erottamaan tämän RNA:n eri RNA-sek- 25 venssien seoksesta ja että ne pystyvät estämään (reversiibe-listi) interferoni-mRNA:n translaation hybridin estämässä translaatiossa.

(3) E. coli, joka sisältää tiettyjä jäseniä tästä sarjasta, tuottaa yhdisteen, jolla on seuraavat ominaisuu- 30 det: (a) Se on sensitiivinen trypsiinille.

(b) Sillä on IFN-0C-aktiivisuutta ihmissoluissa, mutta ainoastaan heikko aktiivisuus hiiren soluissa.

(c) Sen molekyylipaino on 20 000 - 30 000 (19 388 35 nukleotidisekvenssin perusteella määritettynä (kuviot 8-10).

(d) IFN-K-aktiivisuus tuhoutuu spesifisesti ihmisen leukosyytti-interferonille spesifisen vasta-aineen vaikutuksesta.

97 Bo 558 (4) Tämän keksinnön mukaisiin hybridiplasmideihin liitetyt DNA-insertit pystyvät erottamaan IFN-QtmRNA: n eri RNA-sekvenssien seoksesta ja sen lisäksi ne pystyvät erottamaan IFN-ÄDNA:n seoksista, jotka voivat olla peräisin 5 eri kohteista, esim. cDNA-seoksista ja kromosomaalisen DNA:n hybridifagigeenipankeista.

(5) IFN-0(:lla esiintyy muutamia erilaisia kromoso-maalisia geenejä. On yllättävää, että nämä geenit eivät sisällä introneja ja että niiden avulla interferonia ja in- 10 terferonin kaltaisia polypeptidejä voidaan tuottaa suoraan sopivissa isäntäorganismeissa.

(6) Ainakin kolme näihin yhdistelmä-DNA-molekyylei-hin liitettyjen DNA-inserttien nukleotidisekvensseistä on erilaisia, mistä voidaan vetää se johtopäätös, että on 15 olemassa ainakin kolme ei-alleellista IFN-OC-geeniä.

(7) Näiden kolmen nukleotidisekvenssin koodaamat proteiinit ovat erilaisia kuin autenttisen lymfoblastoidi-interferonin 35 aminohapon muodostama proteiini.

(8) Hybridiproteiineilla, jotka vastaavat IFN-OC-gee-20 nisegmenttien erilaisia kombinaatioita, on kvantitatiivisesti erilaiset ominaisuudet kuin proteiineilla, joista hybridit on valmistettu ja proteiinit, joiden IFN-Ä-frag-menttiin on liittynyt muita aminohappoja sekä proteiinit, joiden IFN-Qt-fragmentista puuttuu osa aminoterminaalisesta 25 sekvenssistä, ovat IFN-aktiivisia.

Nämä ominaisuudet osoittavat, että tämän keksinnön mukaiset yhdisteJ.mä-DNA-inolekyylit sisältävät ainakin osan ihmisen leukosyytti-interferonia koodaavasta sekvenssistä ja että jotkut näistä plasmideista tuottavat E. colissa 30 polypeptidiä, jolla on ihmisen leukosyytti-interferonin immunologinen tai biologinen aktiivisuus. Pitäisi myös olla itsestään selvää, että esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettuja polypeptidejä voidaan fraqmentoidn, modifioida tai niistä voidaan muodostaa johdannaisia, kuten on hy-35 vin tunnettua proteiinikemian alalla, poikkeamatta esillä olevan keksinnön suojapiiristä.

98 86 558

Esillä olevien menetelmien mukaisesti valmistetuista mikro-organismeista ja yhdistelmä-DNA-molekyyleistä on talletettu näyte talletuslaitokseen "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen", Gottingen, Länsi-Saksa, tammikuun 7 päi-5 vänä 1980, ja näytteet on identifioitu HcIF-A-E: A: E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-4c) B: E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-2h) C: E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35) D: E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN42) 10 E: E. coli HB101 (Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH6) Näille viljelmänäytteille annettiin talletusnumerot DSM 1699 - 1703.

Lisäksi «'Sillä olevan menetelmän mukaisesti valmistetuista mikro-organismeista ja yhdistelmä-DNA-molekyy-15 leistä on talletettu näyte talletuslaitokseen "the American Type Culture Collection", Rockville, Maryland, maaliskuun 27 päivänä 1980, ja niille on annettu ATCC-talletusnumerot 31633 - 31634: G: E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-I1-206) 20 H: E. coli HB101 (Z-pBR322 (Pst)/HcIF-SN35-AllL6)

Muista esillä olevien menetelmien mukaisesti valmistetuista mikro-organismeista on talletettu näyte talletuslaitokseen "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen", Gottingen, Länsi-Saksa, lokakuun 1 päivänä 1980 ja ne on identifioitu tun-25 nuksilla HchrTF-A-J; niille on annettu myös ta 1letusnume-rot DSM 1914 - 1923: A. subkloonattu chr-3:n HindIII-fragmentti kannassa E. coli HB101} B. subkloonattu chr-12:n EcoRI-fragmentti kannassa 30 E. coli HB101; C. subkloonattu chr-12:n HindiII-fragmentti kannassa E. coli HB101; D. subkloonattu chr-13:n EcoRI-fragmentti kannassa E. coli HB101; 35 E. subkloonattu chr-23:n EcoRI-fragmentti kannassa E. coli HB101; " 8 6 5 E β F. subkloonattu chr-23:n Hindlll-fragmentti kannassa E. coli HB101; G. subkloonattu chr-26:n EcoRI-fragmentti kannassa E. coli HB101; H. subkloonattu chr-26:n Hindlll-fragmentti kannassa E. coli HB101; I. subkloonattu chr-35rn Hindlll/BamHI-fragmentti kannassa E. coli HB101; J. subkloonattu chr-35:n BamHI-fragmentti kannassa 10 E. coli HB101.

Esillä olevien menetelmien mukaisesti valmistetuista mikro-organismeista on talletettu näyte talletuslaitokseen "the American Type Culture Collection", Rockville, Maryland, 15 päivänä joulukuuta 1980, näytteet on identi-15 fioitu tunnuksilla HchrIF-K - HchrIF-Q ja HcIF-I - HcIF-K, ja niille on annettu talletusnumerot 31760 HchrIF-K, 31761 HchrIF-L, 31762 HchrIF-M, 31763 HchrIF-N, 31764 HchrIF-0, 31765 HchrIF-P, 31766 IIchrIF-Q, 31767 HchrIF-I, 31768 HchrIF-J ja 31769 HchrIF-K: 20 K. subkloonattu chr-23:n Tac-Tac-fragmentti kannassa E. coli HB101; L. subkloonattu chr-101:n BglII-BglII-fragmentti kannassa E. coli JIV101; M. subk.luonaLtu chr-10.r:n Hind 1 1 I-Hindi 11-fragmentti 25 kannassa E. coli HB101; N. subkloonattu chr-26:n Bglll-Bglll-fragmentti kannassa E. coli HBlOlj O. Subkloonattu chr-30:n Hindlll-Hindlll-fragmentti kannassa E. coli HB101; P. subkloonattu chr-13:n Bglll-Tac-fragmontti kannassa E. coli HB101; Q- subkloonattu chr-161:n Bglll-Tac-fragmentti kannassa E. coli HB101.

HcIF-I: E. coli DS410 (C8-IFN-<*2) 35 HcIF-J: E. coli DS410 /LAC-AUG(0(.2)7

HcIF-K: E. coli DS310 -Lac-AUG (cQ)J.

loo 3 6 5 5 8

Keksinnön kuvauksen yhteydessä on esitetty muutamia esillä olevan keksinnön suoritusmuotoja, mutta on kuitenkin itsestään selvää, että perusmenetelmiä voidaan muuttaa, jolloin saadaan muita suoritusmuotoja, joissa käytetään hy-5 väksi keksinnön mukaisia menetelmiä ja koostumuksia.

Claims (16)

1. Yhdistelmä DNA-molekyyli, joka on käyttökelpoinen DNA-sekvenssin kloonauksessa tai ilmentämisessä bak- 5 teerissä, hiivassa tai eläinsolussa, tunnettu siitä, että siinä on DNA-sekvenssi, joka on valittu seu-raavista: a) Z-pBR322(Pst)/HcIF-4c:n [DSM 1699], Z-pBR322(Pst)/HcIF-2h:n [DSM 1700], Z-pBR322(Pst)/HcIF-

2. CTCCCCTGATGAATGCGGACTCCATCTTGGCTGTGAAGAAATACTTCCGAAGAATC ACTCTCTATCTGACAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGC AGAAATCATGAGATCCCTCTCTTTATCAACAAACTTGCAAGAAAGATTAAGGAGGA AGGAA, ja joka on käyttökelpoinen mainitun DNA-sekvenssin kloonaa-30 misessa tai ilmentämisessä bakteerissa, hiivassa tai eläinsolussa ja IFN-a-tyyppiä olevaa polypeptidiä koodaa-vien DNA-sekvenssien seulomisessa.

2. ATGGCCTCGCCCTTTGCTTTACTGATGGTCCTGGTGGTGCTCAGCTGCAAGTCAA GCTGCTCTCTGGGCTGTGATCTCCCTGAGACCCACAGCCTGGATAACAGGAGGAC CTTGATGCTCCTGGCACAAATGAGCAGAATCTCTCCTTCCTCCTGTCTGATGGAC AGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCAGAAG GCTCCAGCCATCTCTGTCCTCCATGAGCTGATCCAGCAGATCTTCAACCTCTTTA

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA-20 molekyyli, joka on käyttökelpoinen DNA-sekvenssin kloonauksessa tai ilmentämisessä bakteerissa, hiivassa tai eläinsolussa, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi b), joka hybridisoituu DNA-insertin a) kanssa on valittu seuraavista: 25 d) Z-pBR322(Pst)/HcIF-II-206:n [ATCC 31633] ja ZpBR322(Pst)/HcIF-SN35-AHL6:n [ATCC 31634] DNA-insertit, e) DNA-sekvenssit, jotka hybridisoituvat minkä tahansa edellä mainitun DNA-insertin kanssa ja jotka koo-daavat IFN-a-tyyppiä olevaa polypeptidiä, ja 30 f) DNA-sekvenssit, jotka ovat degeneroituneet ge neettisen koodin tuloksena kohdissa d) ja e) määriteltyjen DNA-sekvenssien ja -inserttien suhteen ja jotka koo-daavat IFN-a-tyyppiä olevaa polypeptidiä.

3. GCTGCAAGTCAAGCTGCTCTGTGGGCTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGG TAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCC 108 8 6 5 8 3 TGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGT TCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAA TCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAA TTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGG 5 GGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAG GAAATACTTCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGT GCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACT TGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAA tai TGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTG 10 ATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACA TGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCA TCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGAC TCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTACCA GCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTC 15 CCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCAC TCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAG AAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAG GAA, ja joka on käyttökelpoinen mainitun DNA-sekvenssin kloonaa-20 misessa tai ilmentämisessä bakteerissa, hiivassa tai eläinsolussa ja IFN-α-tyyppiä olevaa polypeptidiä koodaa-vien DNA-sekvenssien seulomisessa.

3. CCACAAAAGATTCATCTGCTGCTTGGGATGAGGACCTCCTAGACAAATTCTGCAC CGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACTTGGAAGCCTGTGTGATGCAGGAGGAGAGG GTGGGAGAAACTCCCCTGATGAATGCGGACTCCATCTTGGCTGTGAAGAAATACT TCCGAAGAATCACTCTCTATCTGACAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAC AACAAACTTGCAAGAAAGATTAAGGAGGAAGGAA 35 tai TGTGATCTCCCTGAGACCCACAGCCTGGATAACAGGAGGACCTTG ATGCTCCTGGCACAACTCTCCTTCCTCCTGTCTGATGGACAGACATGACTTTGGAT 103 8 ^ 5 o 3 TTCCCCAGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCCAGCCATCTCTGTC CTCCATGAGCTGATCCAGCAGATCTTCAACCTCTTTACCACAAAAGATTCATCTGC TGCTTGGGATGAGGACCTCCTAGACAAATTCTGCACCGAACTCTACCAGCAGCTGA ATGACTTGGAAGCCTGTGTGATGCAGGAGGAGAGGGTGGGAGAAACTCCCCTGATG 5 AATGCGGACTCCATCTTGGCTGTGAAGAAATACTTCCGAAGAATCACTCTCTATCT GACAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGA GATCCCTCTCTTTATCAACAAACTTGCAAGAAAGATTAAGGAGGAAGGAA.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen yhdistel-35 mä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että DNA-sek- 102 8 6 5 5 8 venssi b) tai e), joka hybridisoituu DNA-insertin a) tai d) kanssa on valittu seuraavista: g) kromosomaalisten DNA-segmenttien HchrIF-A, E. colin HB101 (DSM 1914) chr3:n subkloonattu 5 HindiII-fragmentti, HchrIF-B, E. colin HB101 (DMS 1915) chr 12:n subkloonattu EcoRI-fragmentti, HchrIF-C, E. colin HB101 (DSM 1916) chr 12:n subkloonattu HindIII-fragmentti,

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen yh-distelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että siinä on seuraava iFN-al-tyyppistä polypeptidiä koodaava DNA-sekvenssi:

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen yh- distelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että siilo nä on seuraava IFN-a2-tyyppistä polypeptidiä koodaava DNA-sekvenssi: TTACTGGTGGCCCTCCTGGTGCTCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTGTGGGCTGTG ATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACA GATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTT 15 CCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCC ATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGC TTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAAT GACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGA AGGAGGACTCCATTCTCGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTCTATC 20 TGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCAT GAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAA tai TGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTG ATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACA TGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCA 25 TCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGAC TCATCTGC TGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTACC AGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACT CCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCAC TCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAG 30 AAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAG GAA.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen yh-distelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että siinä on seuraava IFN-a4B-tyyppistä polypeptidiä koodaava

35 DNA-sekvenssi: 104 8 6 5 o 8 ATGGCCCTGTCCTTTTCTTTACTGATGGCCGTGCTGGTGCTCAGCTACAAATCCA TCTGTTCTCTGGGCTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAATAGGAGGAC CTTGATACTCCTGCAACAAATGGGAAGAATCTCTCATTTCTCCTGCCTGAAGGAC AGACATGATTTCGGATTCCCCGAGGAGGAGTTTGATGGCCACCAGTTCCAGAAG 5 ACTCAAGCCATCTCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAATCTCTTCA GCACAGAGGACTCATCTGCTGCTTGGGAACAGAGCCTCCTAGAAAAATTTTCCAC TGAACTTTACCAGCAACTGAATGACCTGGAAGCATGTGTGATACAGGAGGTTGGG GTGGAAGAGACTCCCCTGATGAATGTGGACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAATACT TCCAAAGAATCACTCTTTATCTAACAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGA 10 GGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCCTCTCGTTTTCAACAAACTTGCAAAAA AGATTAAGGAGGAAGGAT tai TGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAATAGGAGGACCTTG ATACTCCTGCAACAAATGGGAAGAATCTCTCATTTCTCCTGCCTGAAGGACAGACA TGATTTCGGATTCCCCGAGGAGGAGTTTGATGGCCACCAGTTCCAGAAGACTCAA 15 GCCATCTCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAATCTCTTCAGCACAG AGGACTCATCTGCTGCTTGGGAACAGAGCCTCCTAGAAAAATTTTCCACTGAACTT TACCAGCAACTGAATGACCTGGAAGCATGTGTGATACAGGAGGTTGGGGTGGAAGA GACTCCCCTGATGAATGTGGACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAA TCACTCTTTATCTAACAGAGAAGAATACAGCCCTTGTGGTTTTCAACAAACTTG 2 0 CAAAAAAGATTAAGGAGGAGGAAGGAT.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen yh-distelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi on toiminnallisesti liittynyt yhdistelmä-DNA-molekyylissä olevaan ekspression säätelysekvenssiin.

8. Menetelmä a-tyyppiä olevan interferonin valmis tamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheen, Jossa viljellään patenttivaatimuksen 7 mukaisella yhdistelmä-DNA-molekyylillä transformoitua isäntää, joka on bakteeri, hiiva tai eläinsolu.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että a-tyyppiä oleva interferoni on valittu polypeptideistä, joilla on kaava: MetAlaSerProPheAlaLeuLeuMetValLeuValValLeuSerCysLysSer SerCysSerLeuGlyCysAspLeuProGluThrHisSerLeuAspAsnArgArg 35 ThrLeuMetLeuLeuAlaGlnMetSerArglleSerProSerSerCysLeuMet 105 8 6 55 8 AspArgHisAspPheGlyPheProGlnGluGluPheAspGlyAsnGlnPheGln LysAlaProAlalleSerValLeuHisGluLeuIleGlnGlnllePheAsnLeu PheThrThrLysAspSerSerAlaAlaTrpAspGluAspLeuLeuAspLysPhe CysThrGluLeuTyrGlnGlnLeuAsnAspLeuGluAlaCysValMetGlnGlu 5 GluArgValGlyGluThrProLeuMetAsnAlaAspSerlleLeuAlaValLys LysTyrPheArgArglleThrLeuTyrLeuThrGluLysLysTyrSerProCys AlaTrpGluValValArgAlaGluIleMetArgSerLeuSerLeuSerThrAsn LeuGlnGluArgLeuArgArgLysGlu tai CysAspLeuProGluThrHisSerLeuAspAsnArgArgThrLeu 10 MetLeuLeuAlaGlnMetSerArglleSerProSerSerCysLeuMetAspArg HisAspPheGlyPheProGlnGluGluPheAspGlyAsnGlnPheGlnLysAla ProAlalleSerValLeuHisGluLeuIleGlnGlnllePheAsnLeuPheThr ThrLysAspSerSerAlaAlaTrpAspGluAspLeuLeuAspLysPheCysThr GluLeuTyrGlnGlnLeuAsnAspLueGluAlaCysValMetGlnGluGluArg 15 ValGlyGluThrProLeuMetAsnAlaAspSerlleLeuAlaValLysLysTyr PheArgArglleThrLeuTyrLeuThrGlu LysLysTyrSerProCysAlaTrp GluValValArgAlaGluIleMetArgSerLeuSerLeuSerThrAsnLeuGln GluArgLeuArgArgLysGlu.

10 CCCACAGCCTGGATAACAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAAATGAGCAGAAT CTCTCCTTCCTCCTGTCTGATGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAG TTTGATGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCCAGCCATCTCTGTCCTCCATGAGCTGA TCCAGCAGATCTTCAACCTCTTTACCACAAAAGATTCATCTGCTGCTTGGGATGA GGACCTCCTAGACAAATTCTGCACCGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACTTGGAA 15 GCCTGTGTGATGCAGGAGGAGAGGGTGGGAGAAACTCCCCTGATGAATGCGGACT CCATCTTGGCTGTGAAGAAATACTTCCGAAGAATCACTCTCTATCTGACAGAGAA GAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCCTC TCTTTATCAACAAACTTGCAAGAAAGATTAAGGAGGAAGGAA tai TGTGATCTCCCTGAGACCCACAGCCTGGATAACAGGAGGACCTTG 20 ATGCTCCTGGCACAAATGAGCAGAATCTCCCTTCCTCCTGTCTGATGGACAGACAT GACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCCAGC CATCTCTGTCCTCCATGAGCTGATCCAGCAGATCTTCAACCTCTTTACCACAAAAG ATTCATCTGCTGCTTGGGATGAGGACCTCCTAGACAAATTCTGCACCGAACTCTAC CAGCAGCTGAATGACTTGGAAGCCTGTGTGATGCAGGAGGAGAGGGTGGGAGAAA

10 MetAlaLeuSerPheSerLeuLeuMetAlaValLeuValLeuSerTyrLysSer IleCysSerLeuGlyCysAspLeuProGlnThrHisSerLeuGlyAsnArgArg ThrLeuIleLeuLeuGlnGlnMetGlyArglleSerHisPheSerCysLeuLys AspArgHisAspPheGlyPheProGluGluGluPheAspGlyHisGlnPheGln LysThrGlnAlalleSerValLeuHisGluMetlleGlnGlnThrPheAsnLeu 15 PheSerThrGluAspSerSerAlaAlaTrpGluGlnSerLeuLeuGluLysPhe SerThrGluLeuTyrGlnGlnLeuAsnAspLeuGluAlaCysVallleGlnGlu ValGlyValGluGluThrProLeuMetAsnValAspSerlleLeuAlaValArg LysTyrPheGlnArglleThrLeuTyrLeuThrGluLysLysTyrSerProCys AlaTrpGluValValArgAlaGluIleMetArgSerLeuSerPheSerThrAsn 20 LeuGlnLysArgLeuArgArgLysAsp tai CysAspLeuProGlnThrHisSerLeuGlyAsnArgArgThrLeu IleLeuLeuGlnGlnMetGlyArglleSerHisPheSerCysLeuLysAspArg HisAspPheGlyPheProGluGluGluPheAspGlyHisGlnPheGlnLysThr GlnAlalleSerValLeuHisGluMetlleGlnGlnThrPheAsnLeuPheSer 25 ThrGluAspSerSerAlaAlaTrpGluGlnSerLeuLeuGluLysPheSerThr GluLeuTyrGlnGlnLeuAsnAspLeuGluAlaCysVallleGlnGluValGly ValGluGluThrProLeuMetAsnValAspSerlleLeuAlaValArgLysTyr PheGlnArglleThrLeuTyrLeuThrGluLysLysTyrSerProCysAlaTrp GluValValArgAlaGluIleMetArgSerLeuSerPheSerThrAsnLeuGln 30 LysArgLeuArgArgLysAsp.

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että α-tyyppiä oleva interferoni on valittu polypeptideistä, joilla on kaava: LeuLeuValAlaLeuLeuValLeuSerCysLysSerSerCysSerValGlyCys AspLeuProGlnThrHisSerLeuGlySerArgArgThrLeuMetLeuLeuAla GlnMetArgArglleSerLeuPheSerCysLeuLysAspArgHisAspPheGly 25 PheProGlnGluGluPheGlyAsnGlnPheGlnLysAlaGluThrlleProVal IleuHisGluMetlleGlnGlnllePheAsnLeuPheSerThrLysAspSerSer AlaAlaTrpAspGluThrLeuLeuAspLysPheTyrThrGluLeuTyrGlnGln LeuAsnAspLeuGluAlaCysVallleGlnGlyValGlyValThrGluThrPro LeuMetLysGluAspSerlleLeuAlaValArgLysTyrPheGlnArglleThr 30 LeuTyrLeuLysGluLysLysTyrSerProCysAlaTrpGluValValArgAla GluIleMetArgSerPheSerLeuSerThrAsnLeuGlnGluSerLeuArgSer LysGlu tai CysAspLeuProGlnThrHisSerLeuGlySerArgArgThrLeu MetLeuLeuAlaGlnMetArgArglleSerLeuPheSerCysLeuLysAspArg 35 HisAspPheGlyPheProGlnGluGluPheGlyAsnGlnPheGlnLysAlaGlu ThrlleProValLeuHisGluMetlleGlnGlnllePheAsnLeuPheSerThr 106 8 6 558 LysAspSerSerAlaAlaTrpAspGluThrLeuLeuAspLysPheTyrThrGlu LeuTyrGlnGlnLeuAsnAspLeuGluAlaCysVallleGlnGlyValGlyVal ThrGluThrProLeuMetLysGluAspSerlleLeuAlaValArgLysTyrPhe GlnArglleThrLeuTyrLeuLysGluLysLysTyrSerProCysAlaTrpGlu 5 ValValArgAlaGluIleMetArgSerPheSerLeuSerThrAsnLeuGlnGlu SerLeuArgSerLysGlu.

10 HchrIF-D, E. colin HB101 (DSM 1917) chr 13:n subkloonattu EcoRI-fragmentti, HchrIF-E, E. colin HB101 (DSM 1918) chr 23:n subkloonattu EcoRI-fragmentti, HchrIF-F, E. colin HB101 (DSM 1919) chr 23:n subkloonattu 15 Hindu I-fragmentti, HchrIF-G, E. colin HB101 (DSM 1920) chr 26:n subkloonattu EcoRI-fragmentti, HchrIF-H, E. colin HB101 (DSM 1921) chr 26:n subkloonattu HindiII-fragmentti, 20 hybridisoituvat osat.

10 SN35:n [DSM 1701], Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN42:n [DSM 1702] ja Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH6:n [DSM 1703] DNA-insertit, b) DNA-sekvenssit, jotka hybridisoituvat minkä tahansa edellä mainitun DNA-insertin kanssa ja jotka koo-daavat IFN-α-tyyppiä olevaa polypeptidiä, ja 15 c) DNA-sekvenssit, jotka ovat degeneroituneet ge neettisen koodin tuloksena kohdissa a) ja b) määriteltyjen DNA-sekvenssien ja -inserttien suhteen ja jotka koo-daavat IFN-a-tyyppiä olevaa polypeptidiä.

11. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että a-tyyppiä oleva interferoni on valittu polypeptideistä, joilla on kaava:

12. Menetelmä DNA-sekvenssin valitsemiseksi, joka koodaa a-tyyppiä olevaa interferonia, ryhmästä DNA-sek-venssejä, tunnettu siitä, että siihen kuuluu vaihe, jossa määritetään mitkä mainituista DNA-sekvensseistä 35 hybridisoituvat minkä tahansa patenttivaatimuksen 1(a):n, 2(d):n tai 3(g):n mukaisen DNA-sekvenssin kanssa. 107 86 558

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että seulottu DNA-sekvenssi valitaan luonnosta peräisin olevista DNA-sekvensseistä, synteettisistä DNA-sekvensseistä, yhdistelmä-DNA-molekyy- 5 lien DNA-sekvensseistä ja DNA-sekvensseistä, jotka ovat edellä olevien DNA-sekvenssien yhdistelmiä.

14. DNA-sekvenssi, joka on valittu DNA-sekvensseistä, joilla on kaava: ATGGCCTCGCCCTTTGCTTTACTGATGGTC CTGGTGGTGCTCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTCTGGGCTGTGATCTCCCTGAGA

15. DNA-sekvenssi, joka on valittu DNA-sekvensseistä, joilla on kaava: TTACTGGTGGCCCTCCTGGTGCTCA

16. DNA-sekvenssi, joka on valittu DNA-sekvens-seistä, joilla on kaava: ATGGCCCTGTCCTTTTCTTTACTGA 2 5 TGGCCGTGCTGGTGCTCAGCTACAAATCCATCTGTTCTCTGGGCTGTGATCTGCC TCAGACCCACAGCCTGGGTAATAGGAGGACCTTGATACTCCTGCAACAAATGGGA AGAATCTCTCATTTCTCCTGCCTGAAGGACAGACATGATTTCGGATTCCCCGAGG AGGAGTTTGATGGCCACCAGTTCCAGAAGACTCAAGCCATCTCTGTCCTCCATGA GATGATCCAGCAGACCTTCAATCTCTTCAGCACAGAGGACTCATCTGCTGCTTGG 30 GAACAGAGCCTCCTAGAAAAATTTTCCACTGAACTTTACCAGCAACTGAATGACC TGGAAGCATGTGTGATACAGGAGGTTGGGGTGGAAGAGACTCCCCTGATGAATGT GGACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTTTATCTAACA GAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGAT CCCTCTCGTTTTCAACAAACTTGCAAAAAAGATTAAGGAGGAAGGAT 35 tai TGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAATAGGAGGACCTTG ATACTCCTGCAACAAATGGGAAGAATCTCTCATTTCTCCTGCCTGAAGGACAGACA 109 8 6 558 TGATTTCGGATTCCCCGAGGAGGAGTTTGATGGCCACCAGTTCCAGAAGACTCAAG CCATCTCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAATCTCTTCAGCACAGAG GACTCATCTGCTGCTTGGGAACAGAGCCTCCTAGAAAAATTTTCCACTGAACTTTA CCAGCAACTGAATGACCTGGAAGCATGTGTGATACAGGAGGTTGGGGTGGAAGAGA 5 CTCCCCTGATGAATGTGGACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATC ACTCTTTATCTAACAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAG CAGAAATCATGAGATCCCTCTCGTTTTCAACAAACTTGCAAAAAAGATTAAGGAGG AAGGAT, ja joka on käyttökelpoinen mainitun DNA-sekvenssin kloonaa-10 misessa tai ilmentämisessä bakteerissa, hiivassa tai eläinsolussa ja IFN-α-tyyppiä olevaa polypeptidiä koodaa-vien DNA-sekvenssien seulomisessa. 110 86 553