FI85503C - Foerfarande foer framstaellning av polyoler genom pao industriell skala baserad fermentation av socker. - Google Patents

Description

1 85503

Teollista mittakaavaa oleva sokerien fermentointiin perustuva polyolien valmistusmenetelmä

Keksintö koskee teollista mittakaavaa olevaa poly-5 olien, erityisesti erytritolin valmistusprosessia, jossa aerobisesti fermentoidaan sokeria sietävän sienen Monili-ella tomentosa pollinis:n kanssa.

Tiedetään, että aerobisesti fermentoimalla sopivaa sokeria hiivamaisen sienen Moniliella tomentosa var. polio linisrn kanssa, saadaan erytritolia; tämän esittivät ensimmäisinä G.J. Hajny, J.H. Smith ja J.C. Garver Applied Microbiology 12, sivut 240 - 246 (toukokuu 1964), jotka nimesivät mikrobin Torula I2A:ksi. Myöhemmin Antonie van Leeuwenhoek:ssa sivulla 107 - 118 (1971), L. Dooms, G.L. 15 Hennebert ja H. Verachtert luokittelivat sienen Moniliella tomentosa var. pollinis:ksi ja varmistivat sen kyvyn tuottaa erytritolia; kirjoittajat esittivät myös mikrobin täydellisen morfologisen kuvauksen, johon tässä viitataan. Lisäksi he havaitsivat, että Moniliella voi esiintyä kah-20 dessa eri muodossa hiivamaisena ja homemaisena muotona riippuen pääasiassa käytetyistä kasvatusolosuhteista; sivulla 110 he esittävät: "Agar-vinopinnoilla tuotetaan molempia muotoja. Stationaarisessa nestealustassa syntyy homemaista muotoa, jolla on runsaasti rihmastoa ja enemmän ____: 25 artrosporeja kuin blastosporeja. Ravistuspulloissa kasva- tetuissa kasvustoissa on vallitsevana hiivamainen muoto, !. .* jossa on pyöreitä, soikeita ja suorakulmaisia soluja, jot- * ka ovat muodostuneet koroutumalla ja jakautumalla, samalla ··-· kun rihmastoa ei muodostu".

30 Muutettaessa laboratorioprosesseja teolliseen mit takaavaan, on tietenkin tarpeellista tehdä toivotun tuot-teen tai toivottujen tuotteiden saannot mahdollisimman • :: suuriksi. Eräs tärkeä tekijä, joka tuli esille tutkimuk- sissamme, oli sokerin konsentraatio reaktioalustassa ja me . 35 havaitsimme muuttamalla tätä konsentraatiota, kuten myö- 2 85503 hemmin esitetään, että lopullista polyolikonsentraatiota fermentoimiselustassa voidaan kasvattaa.

Tutkiessamme prosessia me emme havainneet minkäänlaista polyolien aiheuttamaa inhibitiota vielä polyolikon-5 sentraatioalueella 25 - 30 % (paino/tilavuus). Valitettavasti tällaisen lopullisen konsentraation saamiseksi tarvitaan noin 50 % aloitussokerikonsentraatio. Käyttämilläm-me 35 %:a suuremmilla sokerikonsentraatioilla havaitsimme kuitenkin, että mikro-organismin kasvu hidastui, tekijä, 10 jonka arvelimme johtuvan alustan suuresta osmoottisesta paineesta.

Kyseinen keksintö koskee prosessia, jonka avulla saadaan korkea loppukonsentraatio ja jossa samalla ei tapahdu solukasvun inhibitiota.

15 Näin kyseinen keksintö on teollinen menetelmä poly olien, erityisesti erytritolin valmistamiseksi fermentoi-malla sokeria, muita ravintoaineita sekä mahdollisesti vaahdonestoainetta sisältävää fermentointialustaa mikro-organismin Moniliella tomentosa var. pollinis avulla, sa-20 maila ilmastaen happea sisältävällä kaasulla. Menetelmälle on tunnusomaista, että fermentointialustaan lisätyn sokerin kokonaismäärä on alueella 40 - 80 paino-% alustan tilavuudesta, jolloin fermentoinnin alussa lisätään sokeria noin 20-35 paino-% tilavuudesta, jonka jälkeen sokeria .25 lisätään alustaan vähitellen siten, että fermentoinnin lopussa lisätty kokonaissokerimäärä on vähintään 40 paino-% tilavuudesta.

Sopivia prosessissa käytettäviä sokereita ovat dekstroosi (glukoosi), sakkaroosi, fruktoosi ja maltoosi, : 30 dekstroosin ollessa erityisen edullinen.

Prosessia kehitettäessä me olemme havainneet, että mikäli fermentointiin tarvittava sokeri lisätään tärk-.‘v. kelyshydrolysaatin muodossa, voi fermentointiväliaineella olla suhteellisen suuri kuiva-ainepitoisuus ilman, että 35 Moniliella tomentosa var. pollinis:n kasvu estyy. Me 3 85503 oletamme tämän vaikutuksen johtuvan hydrolysaatin molekyy-lipainoltaan suuremmista aineosista, jotka saavat aikaan suhteellisesti alhaisemman osmoottisen paineen. Tässä kehitystyössä lisätään maltodekstroosi fermentointialustaan 5 seen fermentoinnin alussa konsentraationa enemmän kuin 40 % liuenneita kiintoaineita, maltodekstroosi muuttuu asteittain paikan päällä sokeriksi, jota Moniliella tomen-tosa var. pollinis voi fermentoida, lisäämällä glukoamy-laasia fermentoimisalustaan. Tässä keksinnön muodossa so-10 kerisubstraatti tehdään asteittain käyttökelpoiseksi fer-mentointialustassa glukoamylaasientsyymin aktiivisuuden avulla.

Kyseisen keksinnön mukaisen prosessin toivottuja tuotteita ovat erityisesti erytritoli. Aikaisemmat tut-15 kijat ovat esittäneet glyserolin ja arabitolin tuottamisen rytritolin lisäksi fermentoimalla sokereita Moniliella tomentosa var. pollinis:n kanssa. Meidän prosessimme mukaisesti ei tuoteta arabitolia, mutta erytritolin ja glyserolin lisäksi saadaan ribitolia, näiden kolmen ollessa 20 ainoita muodostuneita polyoleja. Tyypillisesti fermentoin-nilla tuotetaan tuotetta, jossa on ribitolia, glyserolia ja erytritolia seuraavina osuuksina kokonaispolyoleihin perustuen: ribitolia 1 - 20 %, glyserolia 5 - 40 %, erytri tolin toimiessa tasapainottajana.

25 Moniliella tomentosa var. pollinis:ta toimittaa

Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS), Baarn, Hollanti, merkinnällä CBS 461,67 ja sitä oli myös tallennettuna ja on yleisesti saatavissa Commonwealth Mycological Institute Culture Collection (CMI cc), Ferry Lane, Kew, - 30 Richmond, Surrey TW9 3AF, Yhdistyneet Kuningaskunnat numerolla (CMI cc) 271 648.

'**'· Mikrobiologiset solut kasvatetaan kiinteässä alus tassa, jossa on mallasuutetta (4 %), hiivauutetta (0,2 %) agaria (2 %). Näin muodostunut kasvusto siirrostetaan sit-____- 35 ten steriloidulle alustalle, jossa on sokeria ja typpiläh- 4 85503 dettä. Selityksessä ja patenttivaatimuksissa ovat kaikki osuudet ja prosentit tilavuutta kohti, ellei toisin ilmoiteta.

Ilmaa käytetään fermenttorissa nopeudella, joka 5 rippuu fermentointiastian suuruudesta ja astian sisällön sekoitusasteesta, mutta se on tavallisesti alueella 0,1 - 1,5 litraa ilmaa/litra fermentointialustaa/minuutti. Esimerkiksi 2-litran astiassa ilman virtausnopeus oli 1 litra ilmaa/litra/minuutti sekoittimen nopeudella 400 - 800 10 kierrosta minuutissa, samalla, kun 600-litran astiassa virtausnopeus oli 0,5 - 1,0 litraa/litra/minuutti ilman muuta sekoitusta kuin ilmavirtauksen tuottama sekoitus. Fermentointi suoritetaan lämpötilassa 27 - 32 °C, aloitus-pH:n ollessa 3-6, edullisesti 4-5. Fermentointi lope-15 tetaan, kun kaikki sokeri on käytetty.

Hajnyn esittämässä aikaisemmassa prosessissa esitetään erilaisia typpilähteitä käytettäväksi fermentoin-nissa esim. hiivauute, urea, maissin liotusneste, mallas-idut, sokeriruokomelassi, mallasuute ja tislainten kuivat 20 liukenevat aineet. Kyseisen keksinnön prosessilla saadaan hyviä tuloksia käyttämällä 0,5 % hiivauutetta ja 0,1 % ureaa tai 2 % maissin liotusnestettä ja 0,02 % ureaa.

Aloitus-pH:n tulisi olla noin 3,0 - 6,0 ja se laskee noin 2,0 - 3,5reen fermentoinnin aikana. L. Hanssens, .25 A. Van Regelmortel ja H. Verachtert, Applied Microbiology, Voi 24, nro 5. sivut 831 - 833 (Marraskuu 1972) esittävät, ; että pidettäessä laboratoriofermenttoreja erilaisissa : kiinteissä pH-arvoissa saatiin oleellisesti erilaisia ko- konaispolyoli- ja erytritolisaantoja. Me olemme havain-* 30 neet, että toimittaessa suuremmilla fermentoreilla (2-lit-raa tai suurempi) eivät erytritoli- ja kokonaispolyoli-·;··.· saannot ole yhtä herkkiä aloitus-pH: lie alueella 4,0 - 6,0. Kontaminoitumisongelman poistamiseksi tai sen tekemiseksi mahdollisimman pieneksi, on edullinen aloitus-pH 4 -35 5. Fermentointia jatketaan, kunnes kaikki sokeri on käy- 5 8 5 5 O 3 tetty (fermentointiaika on tavallisesti 4 - 12 päivää riippuen käytetyn sokerin määrästä), jonka jälkeen kasvatus lopetetaan ja solut poistetaan kasvatusliuoksesta esim. sentrifugoimalla. Soluista vapaa kasvatusliuos, jos-5 sa on erytritolia, ribitolia ja glyserolia, voidaan käyttää sellaisenaan joko puhdistettuna tai ilman puhdistusta (esim. ultrasuodatus ja demineralisointi) tiettyihin sovellutuksiin, kuten polymeeriteollisuudessa. Puhdistettu kasvatusliuos voidaan myös konsentroida liuenneiden kiin-10 toaineiden pitoisuuteen 60 - 80 % ja erytritoli kiteytetään siitä esim. menetelmällä, jonka ovat esittäneet J.M. Roxburg, J.F.T. Spencer ja H.R. Sallens, Canadian Journal of Technology, Voi 34, sivut 248 - 353 (1956). Erytritoli-kiteiden talteenoton jälkeen jäävä liuos, joka siis sisäl-15 tää (kiteytymätöntä) erytritolia, ribitolia ja glyserolia, voidaan myös käyttää sopivan käsittelyn jälkeen.

Keksinnön mukainen prosessi suoritetaan edullisesti siten, että läsnä on polysakkaridi ksantaanikumi, jolla on kyky säilyttää Moniliella tomentosa var. pollinis:n solut 20 fermentointialustassa ja estää niiden häviämistä vaahdon välityksellä, jota muodostuu fermentoinnin aikana. Edullisesti läsnä on 100 - 500 ppm ksantaanikumia ja erinomaisia tuloksia saadaan noin 300 ppm:11a. Voidaan käyttää enemmän '·*; kumia kuin olisi tarpeellista solujen säilyttämistä varten 25 fermentointialustassa (siis enemmän kuin 500 ppm), mutta tällainen ylimäärä on epätaloudellista.

Kokonaisprosessia on parannettu myös lisäämällä fermentointialustaan konventionaalista vaahtoamisenestoai-netta. Edullisempia ovat synteettiset vaahtoamisenestoai-30 neet (esim. silikonityyppi tai rasva-alkoholit) kuin luonnon tuotteet (esim. sianihraöljy), koska niitä voidaan käyttää pienempinä määrinä ja koska lopullista fermentoin-tiliuosta ei tarvitse tehokkaasti puhdistaa niiden poistamiseksi. Useimmilla synteettisillä vaahtoamisenestoaineil-. 35 la on 200 - 300 tai 400 ppm riittävä optimaaliselle vaah- 6 85503 toami skontrol1i1le.

Seuraavat esimerkit pyrkivät esittämään keksinnön käytännöllistä puolta.

Silrrosvlljelmän valmistaminen 5 500-ml:n Erlenmeyereihin, joissa oli 50 ml kasva tusalustaa, jossa oli 20 % dekstroosia, 0,5 % hiivauutet-ta, 0,1 % ureaa ja 300 ppm ksantaanikumia, siirrostettiin kasvusto kiinteästä alustasta ja kasvatusta jatkettiin 3 -4 päivää aloittaen pH:sta 5 lämpötilassa 30 °C ja edesta-10 kaisella sekoituksella 100 heilahdusta minuutissa. Näitä kasvustoja voitiin käyttää sellaisenaan fermentoinnissa tai niitä voitiin käyttää siirrostettaessa suurempia kasvustoja biomassan lisäämiseksi suurempia fermentointeja varten.

15 Esimerkki 1 600 litran fermenttori, jossa oli 450 litraa fer-mentointialustaa, jossa oli 32 % dekstroosia, 2 % maissin liotusnestettä, 0,02 % ureaa, 300 ppm SAG 471® vaahtoamis-enestoainetta (dimetyylipolysiloksaani Union Carbidilta) 20 ja 300 ppm ksantaanikumia, siirrostettiin 9 %:lla siirros-viljelmää. Ilman syöttö oli 0,7 litraa ilmaa/ litra kasva-tusalustaa/minuutti. Aloitus-pH oli 3,9. 4 - 9 päivästä alkaen fermenttoriin syötettiin jatkuvasti dekstroosia Ja ureaa, kunnes fermenttoriin lisätyn dekstroosin kokonais-25 määrä oli 50 % fermentointialustan aloitustilavuudesta ja fermenttoriin lisätyn urean kokonaismäärä oli 0,1 %. 13 päivän kuluttua oli dekstroosi kokonaan käytetty Ja lopullinen erytritolikonsentraatio oli 16 % ja kokonaispolyoli-konsentraatio oli 26,4 %.

30 Esimerkki 2

Kolme 50 ml:n erlenmeyeripulloa sisälsi 50 ml fer-mentointialustaa, jossa oli 0,5 % hiivauutetta, 0,1 % • · · V : ureaa ja vastaavasti 30 %, 40 % ja 50 % dekstroosiekviva- lentin (D.D. ) 12 maltodekstriiniä. Jokaisessa pullossa oli ____: 35 myös 0,1 % paino/paino glukoamylaasia perustuen maltodeks- • » 7 85503 triiniin. Pulloihin siirrostettiin 9 % siirrosviljelmää ja pidettiin lämpötilassa 30 °C edestakaisin sekoittaen nopeudella 100 heilahdusta/minuutti. Fermentointeja jatkettiin 7, 10 ja 14 päivää ja tämän ajan lopussa analysoitiin 5 liuokset. Tulokset annetaan seuraavassa taulukossa.

30 % malto- 40 % malto- 50 % malto-__dekstriiniä dekstriiniä dekstriiniä

Fermentointiaika 7 päivää 10 päivää 14 päivää

Ribitoli g/litra 2,5 3,1 6,75

Erytritoli g/litra 96,5 127,2 149,7

Glyseroli g/litra 3,7 4,1 12,7

Etanoli g/litra 3,6 4,3 3,4 15 Kokonais- polyolit g/litra 102,7 134,4 169,15

Claims (10)

1. Teollinen menetelmä polyolien, erityisesti ery-tritolin valmistamiseksi fermentoimalla sokeria, muita 5 ravintoaineita sekä mahdollisesti vaahdonestoainetta sisältävää fermentointialustaa mikro-organismin Moniliella tomentosa var. pollinis avulla, samalla ilmastaen happea sisältävällä kaasulla, tunnettu siitä, että fermentointialustaan lisätyn sokerin kokonaismäärä on 10 alueella 40 - 80 paino-% alustan tilavuudesta, jolloin fermentoinnin alussa lisätään sokeria noin 20 - 35 paino-% tilavuudesta, jonka jälkeen sokeria lisätään alustaan vähitellen siten, että fermentoinnin lopussa lisätty koko-naissokerimäärä on vähintään 40 paino-% tilavuudesta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sokeri on dekstroosi, sakkaroosi, fruktoosi tai maltoosi.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sokeria käytetään tärkkelys- 20 hydrolysaatin muodossa ja glukoamylaasientsyyminä, joka muuttaa asteittain hydrolysaatin sokeriksi.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ilmaa tai happi/ inerttikaasu-seosta, joka on koostumukseltaan ilman kal- V 25 täistä, syötetään fermentointiin nopeudella 0,1 - 1,5 lit-" '· raa/litra fermentointialustaa/minuutti.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen me- ***; netelmä, tunnettu siitä, että pH fermentoinnin alussa säädetään arvoon 3-6, edullisesti arvoon 4-5. .-.-.30

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen me netelmä, tunnettu siitä, että ksantaanikumia on läsnä määrässä 100 - 500 ppm fermentointialustasta.

* / 7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen me- *·' ‘ netelmä, tunnettu siitä, että fermentointiin li- ·;*·; 35 sätään myös tavanomaista vaahdonestoainetta. 9 85503

8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikro-organismiso-lut poistetaan fermentointiliemestä, joka valinnaisesti puhdistetaan ja jonka sisältämät polyolit ovat ainoastaan 5 ribitoli, glyseroli ja erytritoli, seuraavina osuuksina perustuen kokonaispolyoleihin: ribitolia 1 - 20 %, glyserolia 5 - 40 %, ja loput erytritolia.

8 85503

9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikro-organismi- 10 solut poistetaan fermentointiliemestä, joka puhdistetaan ja konsentroidaan, ja erytritoli kiteytetään ja poistetaan liemestä, jolloin kiteytyksen jälkeen liuoksessa olevat polyolit ovat ribitoli, glyseroli ja erytritoli seuraavina osuuksina perustuen kokonaispolyoleihin: ribi-15 tolia 5 - 30 %; glyserolia 30 - 60 % ja loput erytritolia.

10 85503