FI85285B - Tvaerbundet, vattenoloesligt glukosisomeras och foerfarande foer framstaellning daerav. - Google Patents

Tvaerbundet, vattenoloesligt glukosisomeras och foerfarande foer framstaellning daerav. Download PDF

Info

Publication number
FI85285B
FI85285B FI882249A FI882249A FI85285B FI 85285 B FI85285 B FI 85285B FI 882249 A FI882249 A FI 882249A FI 882249 A FI882249 A FI 882249A FI 85285 B FI85285 B FI 85285B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
isomerase
cross
crystals
glucose
crystalline
Prior art date
Application number
FI882249A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI882249A (fi
FI85285C (fi
FI882249A0 (fi
Inventor
Kalevi Visuri
Original Assignee
Stabra Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Stabra Ag filed Critical Stabra Ag
Publication of FI882249A0 publication Critical patent/FI882249A0/fi
Priority to FI882249A priority Critical patent/FI85285C/fi
Priority to ES89107659T priority patent/ES2059610T3/es
Priority to AT89107659T priority patent/ATE95232T1/de
Priority to EP89107659A priority patent/EP0341503B1/en
Priority to DE89107659T priority patent/DE68909488T2/de
Priority to IN322/MAS/89A priority patent/IN169420B/en
Priority to AU33816/89A priority patent/AU3381689A/en
Priority to IE143589A priority patent/IE63128B1/en
Priority to ZA893460A priority patent/ZA893460B/xx
Priority to KR1019890006309A priority patent/KR900018370A/ko
Priority to DK231989A priority patent/DK169039B1/da
Priority to CN89103117A priority patent/CN1038123A/zh
Priority to DD89328567A priority patent/DD297843A5/de
Priority to HU892393A priority patent/HU206134B/hu
Priority to CA000599582A priority patent/CA1320463C/en
Priority to JP1120220A priority patent/JP2599789B2/ja
Priority to NO89891943A priority patent/NO891943L/no
Publication of FI882249A publication Critical patent/FI882249A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI85285B publication Critical patent/FI85285B/fi
Publication of FI85285C publication Critical patent/FI85285C/fi
Priority to US08/149,158 priority patent/US5437993A/en
Priority to US08/425,027 priority patent/US5900364A/en
Priority to US08/425,970 priority patent/US5811280A/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

1 85285
Ristisidottu, veteen liukenematon glukoosi-isomeraasi ja menetelmä sen valmistamiseksi
Keksintö koskee uudentyyppistä, veteen liukenema-5 tonta glukoosi-isomeraasia, jonka muodostaa ristisidonnal-la kiinteäksi muutettu kiteinen entsyymi. Keksintö koskee myös menetelmää ristisidotun, kiteisen glukoosi-isomeraa-sin valmistamiseksi.
Kiinteään kantajaan sidottujen eli immobilisoitujen 10 entsyymien käyttö jatkuvatoimisissa reaktoreissa on muodostumassa hallitsevaksi tekniikaksi, koska tämä mahdollistaa säästön entsyymikustannuksissa ja tuotteen puhdistuksessa. Esimerkkinä tällaisesta prosessista mainittakoon glukoosin muuntaminen fruktoosiksi immobilisoidulla 15 glukoosi-isomeraasilla.
Koska entsyymit yleensä ovat vesiliukoisia, on jatkuvassa prosessissa käytettävä erikoista entsyymin immobilisointitekniikkaa: entsyymi tulee tavalla tai toisella sitoa kiinteään faasiin, jotta se ei liukene 20 veteen, mutta se ei saa tällöin inaktivoitua. On kehitetty useita tekniikkoja: absorptio kantajaan, kovalent-tinen sidos kantajaan, ristisidonta kantajaan ja mikro-kapselointi; myös koko entsyymiä tuottava mikrobi on sidottu kiinteään faasiin. Hyvä yhteenveto käytetyistä 25 tekniikoista on esim. kirjassa: Moo-Young, M. (ed),
Comprehensive Biotechnology, Voi 2, Pergamon Press, London 1985, s. 191-211.
Tunnetuissa menetelmissä entsyymi sidotaan erikseen valmistettuun kantajamateriaaliin, mikä sinänsä saat-30 taa olla kemiallisen kinetiikan tai substraatin virtaus-tekniikan kannalta eduksi. Valitettavasti kuitenkin useimmiten kantajamateriaali on hyvin kallista, ja voi kustannuksiltaan jopa ylittää moninkertaisesti itse katalyyttinä toimivan entsyymin kustannukset, erityisesti silloin, 35 kun on kyseessä suuren mittakaavan massatuotanto, kuten 2 85285 esimerkiksi sokeriteollisuudessa. Vaihtoehtoisesti entsyymi immobilisoidaan ristisitomalla jonkin inertin massiivisen komponentin, esimerkiksi gelatiinin kanssa. Joka tapauksessa tähänastisessa tekniikassa itse katalyyttinä 5 toimiva entsyymi muodostaa murto-osan, yleensä alle 5 %, tavallisesti 1-2 %, kyseisessä prosessissa käytettävän materiaalin painosta ja tilavuudesta.
Ristisidonta glutaarialdehydillä on ollut teknisesti hyvin merkittävä menetelmä mm. glukoosi-isomeraasia im- 10 mobilisoitaessa; kuten tunnettua glutaarialdehydi on sallittu käytettäväksi elintarvikeprosesseissa käytettyjen entsyymien immobilisointiin.
Muita teknisesti käytettyjä menetelmiä ovat sitominen ioninvaihtajiin tai absorptio kiinteään kantajaan.
15 Esimerkki tällaisesta sovellutuksesta on US-patentissa 4,699,882 (K. Visuri; Stabilized glucose isomerase); tässä tunnetussa menetelmässä käytetty kantaja on kuitenkin suhteellisen kallis, ja lisäksi menetelmä vaatii suuren reaktorin.
20 Massiivisten kantajamateriaalien ja suurikokoisten laitteiden käytöstä seuraa monenlaisia kustannusvaikutuksia, jotka eivät välttämättä johdu itse käytettävästä entsyymistä lainkaan; tällaisia ovat: - prosessilaitteiden ja tehdastilojen rakennuskus- 25 tannukset, - kantajamateriaalin hankinta (uudelleenhankin-ta) kustannukset, - aktiivisuutensa menettäneen entsyymimateriaalin hävityskustannukset, 30 - reaktorien tyhjennyksestä ja täytöstä (tai kan tajan regeneroinnista) johtuvat työkustannukset, - reaktorien hitaudesta johtuvat sekundääriset kustannukset; niinpä pitkästä viipymäajasta usein seuraa ei-entsymaattisia haitallisia sivureaktioita, erityisesti 35 fruktoosin valmistuksessa.
3 85285
Tieteellisessä kirjallisuudessa on useita esimerkkejä kiteisten entsyymien ristisidonnasta glutaarialde-hydillä. Quiocho ja Richards (Proc.Natl.Acad.Sci (US) 52 (1964) s. 833 ja Biochemistry 5 (1966) s. 4062) käytti-5 vät ensimmäisinä glutaarialdehydiä karboksipeptidaasien ristisidontaan. Bishop ja Richards (J. Mol.Biol. 33 (1968) s. 415-421) ovat ristisitoneet kiteistä beta-laktoglobu-liinia l-% glutaarialdehydin vesiliuoksen avulla huoneenlämpötilassa. Kiteitä käytettiin entsyymin sähköisten 10 ominaisuuksien tutkimiseen. Haas (Biophysic.Journ. 8 (1968) s. 549-555) on ristisitonut lysotsyymikiteitä 4-% natriumnitraattiliuoksen läsnäollessa (pH 8), käyttäen 12 %:n glutaarialdehydipitoisuutta.
Dyer, Phillips ja Townsend (Thermochimica Acta 8 15 (1974) s. 456-464) ovat tutkineet glutaarialdehydillä ris- tisidotun kiteisen karboksipeptidaasin termostabiilisuut-ta. He totesivat, että ristisidonta johti stabiilisuuden kasvuun. TUchsen ja Ottesen (Carlsberg Res.commun. 42 (1977) s. 407-420) ovat tutkineet glutaarialdehydillä 20 natriumsulfaattiliuoksessa ristisidotun kiteisen subtili-siinin kineettisiä ominaisuuksia. Kiteiden aktiivisuus pienimolekyylisillä substraateilla oli korkea mutta suu-rimolekyylisillä vähäinen.
Wong et ai. (Biochem. and Biophysic. Research Com-25 munications 80 (1978) s. 886-890) ovat ristisitoneet glutaarialdehydillä mikrobiperäistä hapanta proteaasia am-moniumsulfaattiliuoksessa. Ristisidonnassa ammoniumsul-faatin läsnäoloa pidettiin teknisenä haittana.
Morozov ja Morozova (Biopolymers 20 (1981) s. 451-30 467) ovat ristisitoneet kiteistä lysotsyymiä, hemoglobii nia ja myoglobiinia käyttäen 2...6-% glutaarialdehydi-liuoksia ja 2-10 vuorokauden reaktioaikaa huoneenlämpötilassa. Lee et ai. (Bioorganic Chemistry 14 (1986) s. 202-210) ovat ristisitoneet alkoholidehydrogenaasin kiteitä 35 glutaarialdehydillä 2-metyyli-2,4-pentaanidiolin läsnäol- * 85285 lessa (25 %).
Näissä töissä entsyymikiteitä on ristisidottu perustutkimuksen tavoitteiden saavuttamiseksi. Usein ent-syymikiteet ovat rakenteeltaan niin heikkoja, että ne 5 eivät kestä röntgendiffraktiotutkimuksessa käytettävää sädesuihkua, mutta glutaarialdehydin avulla ne voidaan usein stabiloida näihin tarkoituksiin. Lisäksi kiteitä on ristisidottu stabiilisuutta ja katalyysin kinetiikkaa koskeviin tutkimustarkoituksiin. Niissä tapauksissa, jois-10 sa kiteiden ristisidonta on onnistunut, on käytetty yksinomaan glutaarialdehydiä ja väliaineena sitä liuosta, jossa entsyymi säilyy kiteisenä. Kaikesta päätellen liukenematon kide on syntynyt suoraan glutaarialdehydin ja entsyymiproteiinin keskinäisestä reaktiosta.
15 On tunnettua, että glutaarialdehydillä on usein vaikea saada aikaan liukenematonta entsyymiä, varsinkin, jos proteiini sisältää suhteellisen vähän lysiiniä. Tämä ongelma kierretään usein siten, että sekoitetaan kyseiseen entsyymiin jotain tunnetusti helposti liukenemattomaksi 20 ristisidottavissa olevaa proteiinia, kuten albumiinia (G.B. Broun, Methods in Enzymology, 44 (1976) s. 263). Tällainen inertin vieraan proteiinin lisääminen ei tietenkään tule kysymykseen silloin, kun yritetään ristisitoa kiteistä entsyymiä. Aikaisemmin ei ole esitetty keinoja, 25 joita voitaisiin käyttää silloin kun kiteen ristisitominen liukenemattomaksi yksin glutaarialdehydillä ei onnistu.
Kuten edellä on mainittu, glukoosi-isomeraasin immobilisointi glutaarialdehydillä on tunnettua. Tällöin isomeraasi ristisidotaan joko suoraan itse tuottajamik-30 robiin tai sen lisäksi esimerkiksi gelatiiniin. Tällaisia prosesseja on täydessä teollisessa käytössä. Sen sijaan glukoosi-isomeraasin kiteiden ristisitominen liukenemattomaan muotoon ei ole onnistunut eikä tällaista entsyymiä ole käytetty isomerointiprosessissa katalyyttinä.
35 Nyt on todettu, että on mahdollista ristisitoa 5 85285 glukoosi-isomeraasin kiteitä siten, että alkuperäinen kiteinen olomuoto säilyy ja myös entsyymin entsymaattinen aktiivisuus säilyy hyvin korkeana, jopa samana kuin alkuperäisen entsyymin. Keksinnön mukainen tuote ei liukene 5 mihinkään sellaisiin liuottimiin, jotka tulevat kysymykseen entsyymiä teknisesti käytettäessä. Ristisidottua kiteistä entsyymiä voidaan käyttää sellaisenaan teknisessä isomerointiprosessissa isomerointikolonnin täytteenä. Uuden ristisidotun kiteisen entsyymin avulla on mahdollista 10 suorittaa jatkuvatoiminen isomerointiprosessi nykyistä paljon pienemmissä ja tehokkaammissa kolonneissa.
Keksinnön mukaisen menetelmän mukaan glukoosi-isomeraasin kiteet ristisidotaan dialdehydin, kuten glutaa-rialdehydin, ja vähintään yhden aminoryhmän sisältävän yh-15 disteen, kuten ammoniumyhdisteen, amiinin tai aminohapon, edullisesti ammoniumsuolan tai lysiinin, avulla. Useat amiinit ja aminohapot soveltuvat käytettäväksi. Samoin on ilmeistä, että glutaarialdehydin lisäksi useat muut dialdehydit ja aminoryhmien kanssa reagoivat aineet, jot-20 ka tunnetaan ristisidontareagensseina, soveltuvat käytettäväksi menetelmässä.
Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetun kiinteän kiteisen entsyymin aktiivisuus on käytännöllisesti katsoen sama kuin vapaan entsyymin. Kiinteää, kiteistä 25 entsyymiä voidaan sellaisenaan käyttää kolonnitäytteenä jatkuvassa prosessissa. Se on erittäin stabiili ja kestää hyvin mekaanista rasitusta.
Haluttaessa voidaan ristisidotut kiteet sitoa edelleen suuremmiksi kappaleiksi, pallomaisiksi, levymäisiksi 30 tai nauhamaisiksi tai muuhun muotoon sinänsä tunnetuin kemiallis-fysikaalisin keinoin. Näin saadut entsyymituot-teet kestävät hyvin erilaista mekaanista käsittelyä.
Seuraavassa kuvataan keksinnön mukaista menetelmää yksityiskohtaisemmin.
6 85285
Raaka-aineena käytetyn kiteisen qlukoosi-isomeraa-sin valmistus
Glukoosi-isomeraasiliuokseen (1-10 paino-% isome-raasia kuivaksi proteiiniksi määritettynä) liuotetaan am-5 moniumsulfaattia (noin 10 paino-%). Jäähdytetään liuos hitaasti noin 0-2°C lämpötilaan, jatkuvasti sekoittaen. Tällöin isomeraasi kiteytyy käytännöllisesti katsoen täydellisesti (yli 95 %). Ammoniumsulfaatin sijasta kiteytysai-neena voidaan käyttää esimerkiksi magnesiumsulfaattia tai 10 natriumsulfaattia. Käytettyjen suolojen pitoisuus voi vaihdella laajoissa rajoissa, esimerkiksi 5-25 paino-%. Kitey-tysprosessiin tarvittava aika vaihtelee laajoissa rajoissa, esimerkiksi 1 tunti - useita vuorokausia. Isokokoisten kiteiden valmistamiseksi on edullista käyttää hidasta jääh-15 dytystä ja mahdollisimman puhdasta isomeraasia. Kiteytys on kuvattu US-patentissa 4 699 882 (Visuri).
Kiteytyksen jälkeen erotetaan kidemassa sedimen-toimalla tai linkoamalla emäliuoksestaan. Tarvittaessa kidemassa pestään puhtailla ammoniumsulfaatin, magnesiumsul-20 faatin tai muun kiteytykseen soveltuvan aineen liuoksilla. Ristisidontaa varten käytetään tiukaksi sedimentoitu-nutta tai lingottua kidemassaa, joka ei sisällä vapaata ylimääräistä emäliuosta. Tällaisen kidemassan tyypillinen aktiivisuus on 10 000 GlU/g. Se sisältää puhdasta entsyy-25 miproteiinia kuivaksi aineeksi määritettynä 20-30 paino-%. On syytä todeta, että entsyymikiteet menettävät rakenteensa, jos ne kuivataan.
Rlstisitomlnen
Kidemassa lietetään sellaiseen suolaliuokseen, jo-30 hon kiteet eivät liukene. Entsyymikiteiden pitoisuus liuoksessa voi vaihdella laajalti, esimerkiksi 2-17 paino-% kuivaksi aineeksi määritettynä.
Liuokseen lisätään ammoniumsuolaa, ellei suolaliuos jo alunperin sisällä ammoniumia, tai sopivaa amiinia tai 35 aminohappoa, esimerkiksi lysiiniä. Seoksen pH säädetään 5 7 85285 ja 9 välille, edullisesti arvoon 7-8, lisäämällä esimerkiksi natriumhydroksidiliuosta. Happamuuden kontrolliin voidaan edullisesti käyttää esimerkiksi fosfaattipuskuria, esimerkiksi 0,05-m natriumfosfaattia. Lisätyn amiinin 5 tai aminohapon käyttökelpoinen pitoisuus vaihtelee laajalla alueella ja on riippuvainen muiden komponenttien pitoisuudesta. Keksinnön mukaista tuotetta on valmistettu hyvällä saannolla amiini- tai aminohappopitoisuuksilla 1-15 % seoksen loppupainosta.
10 Tämän jälkeen seokseen lisätään glutaarialdehydiä, jolloin ristisidontareaktio käynnistyy. Glutaarialdehy-din annostusta voidaan vaihdella laajoissa rajoissa, 1-45 paino-%, kosteasta entsyymikidemassasta laskettuna. Edullisin annos riippuu m.m. seoksessa olevan amiinin pitoi-15 suudesta. Yleensä edullinen pitoisuus on 3-4,5 g glutaari-aldehydiä/3 g isomeraasia kuivaksi entsyymiksi laskettuna. Reaktion aikana seosta sekoitetaan jatkuvasti; lämpötila on 2-25°C. Alhainen lämpötila on eduksi, mutta kovin suurta merkitystä lämpötilalla ei näytä olevan. Reaktio 20 voi tapahtua varsin nopesti, muutamassa minuutissa, erityisesti korkeammissa lämpötiloissa. Alhaisessa lämpötilassa reaktioaika saattaa olla 20 tuntia.
Reaktion jälkeen liukenemattomat kiteet erotetaan seoksesta sedimentoimalla tai linkoamalla. Kidemassa pes-25 tään liettämällä veteen tai sopivaan suolaliuokseen ja jälleen linkoamalla. Pesu toistetaan useita kertoja, kunnes kidemassa on riittävän puhdasta käytettäväksi katalyyttinä. Pesun yhteydessä on edullista myös huuhtoa pois hienojakoista saostumaa.
30 Saatua kidemassaa ei tulisi kuivata, jos sitä on tarkoitus käyttää katalyyttinä entsymaattisessa prosessissa. Kostea kidemassa säilyy täysin aktiivisena ainakin kuusi kuukautta ilman erityisiä toimenpiteitä.
Lopputuotteen karakterisointi 35 Keksinnön mukaisesti valmistetut ristisidotut ki teet ovat ulkomuodoltaan ja kooltaan samanlaisia kuin ai- β 35285 kuperäiset raaka-ainekiteet. Kiteiden koko ei ole kriittinen. Tekniseen käyttöön soveltuvat erikoisesti 100-200 fim läpimittaiset kiteet.
Keksinnön mukaisten kiteiden tärkein ominaisuus on 5 liukenemattomuus veteen, suolaliuoksiin ja sokeriliuoksiin. Erityisen tärkeätä on, että isomeraasikiteet eivät liukene väkeviin glukoosin ja fruktoosin liuoksiin edes korkeissa lämpötiloissa. Teollisuusprosesseissa käytetään yleisesti 60°C lämpötilaa ja 45 paino-% sokeripitoisuut-10 ta. Ristisidotut kiteet eivät liukene tällaisissa olosuhteissa, eivätkä myöskään missään muussa sokeripitoisuudessa, eikä korkeammissa lämpötiloissa (aina 100°C saakka).
Ristisidottujen kiteiden aktiivisuus on samaa suuruusluokkaa kuin alkuperäisen entsyymin. Teknisesti mer-15 kittävää ja edullista on, että niiden aktiivisuus on moninkertainen inerttiin kantajaan immobilisoituun entsyymiin verrattuna.
Ristisidottaessa entsyymiä kiteisenä saavutetaan erityinen lisäetu sen seurauksena, että itse kiteessä val-20 litsevat kidettä luonnostaan koossa pitävät voimat stabiloivat merkittävästi entsyymiä.
Lähtöaineen 1a lopputuotteen karakterisointiin käytetyt menetelmät
Isomeraasin aktiivisuus määritettiin kansainväli-25 sinä glukoosi-isomeraasiyksikköinä, lyhenne GIU, 1 g kohti kuivattua entsyymivalmistetta. Yksi yksikkö (GIU) on sellainen määrä entsyymiä, joka muuttaa glukoosia fruktoosiksi nopeudella 1 /imol/min seuraavissa olosuhteissa: glukoosipitoisuus 2,0 mol/1, pH 7,0 ja lämpötila 60°C.
30 Aktiivisuusmääritystä varten sekoitettiin 0,1-1 g entsyymituotetta (alkuperäistä kidemassaa tai hyvin pestyä ristisidottua kidemassaa) ylläesitettyyn substraatti-liuokseen (100 ml). Sopivan ajan, esim. 10 minuutin kuluttua, määritettiin liuoksen fruktoosipitoisuus ja lasket-35 tiin aktiivisuus yllämainittuina yksikköinä. Entsyymimää- 9 85285 rä ja reaktioaika valittiin siten, että fruktoosia muodostui vähemmän kuin 5 % kokonaissokeripitoisuudesta, jotta mittaustulos koskisi reaktion alkunopeutta. Lähtöaineen ja tuotteen kuiva-ainepitoisuus määritettiin tavanomaisella 5 menetelmällä kuivaamalla näytteitä 105°C:ssa vakiopainoon.
Isomerointiprosessi
Kiteinen ristisidottu entsyymi sopii käytettäväksi tavalliseen tapaan panosisomerointiprosessissa, jolloin reaktion jälkeen käytetty entsyymi erotetaan, esi-10 merkiksi suodattamalla, ja voidaan haluttaessa käyttää uudelleen.
Edullisempaa on teollisuusmittakaavassa kuitenkin suorittaa isomerointi jatkuvatoimisena prosessina, jolloin isomeroitava sokeriliuos saa virrata entsyymikolon-15 nin läpi. Viiveaikaa ja/tai lämpötilaa muuttamalla voidaan isomerointiprosessia helposti säädellä. Entsyymi toimii laajalla lämpötila-alueella, jäätymispisteestä yli 100°C:n lämpötilaan. Matalissa lämpötiloissa on hitaan reaktion lisäksi kuitenkin haittana sokerin (glukoosi-20 ja fruktoosihydraattien) kiteytyminen. Korkeissa lämpötiloissa taas sekä entsyymin että fruktoosin tuhoutuminen nopeutuvat tuntuvasti.
Jatkuvatoiminen isomerointi suoritetaan tyypillisesti siten, että kolonnitäytteenä on 100 - 300 pm kokoiset, 25 ristisidotut entsyymikiteet. Kolonnin kokoa ja korkeutta voidaan vaihdella kapasiteettitarpeen mukaan. Pienessä kolonnissa 5 - 50 cm petikorkeus on sopiva. Lämpötilaa voidaan myös vaihdella laajoissa rajoissa. Helposti toteutettava on huoneenlämpötila. Jos mikrobiologiset kon-30 taminaatiot ovat ongelmana, ne on eliminoitavissa nostamalla lämpötila vähintään noin + 60°C:een.
Lineaarista virtausnopeutta muuttamalla säädellään prosessia helposti. Lineaari virtausnopeus pienellä kolonnilla on 2 - 30 cm/min. Tuoreella entsyymillä sopiva 35 viiveaika on 1 - 2 min. Toimitaan atmosfäärisessä painees- 10 8 5285 sa. Painehäviö on vähäinen (<0,2 bar/50 cm peti). Viive-aikaa säädellään kolonnin petikorkeudella sekä virtausnopeudella. Lämpötilan korottaminen nopeuttaa isomeroitu-misreaktiota.
5 Tavallisessa teollisessa prosessissa on nykyisin useimmiten tavoitteena sokeriliuos, jossa 40-45 % sokerista on fruktoosia. Entsyymin aktiivisuuden alentuessa kolonnin vanhetessa haluttu taso ylläpidetään hidastamalla virtausnopeutta.
10 Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä tarkemmin:
Esimerkki 1
Punnittiin 850 g glukoosi-isomeraasin kidemassaa, joka oli kiteytetty 10-% ammoniumsulfaattiliuoksessa US-patentin 4 699 882 mukaisesti. Tähän lisättiin 1000 ml 15 10-% ammoniumsulfaattiliuosta, joka oli puskuroitu 0,5-% natriumfosfaatilla happamuuteen pH 7,4. Seos jäähdytet-tiinlämpötilaan 10°C. Seosta sekoitettiin jatkuvasti pot-kurisekoittajalla käyttäen alhaista kierroslukua, 200-400 r/min, kiteiden rikkoutumisen vähentämiseksi. Seokseen li-20 sättiin 160 ml 25-% glutaarialdehydiä. Yhden tunnin kuluttua reaktio lopetettiin lisäämällä seokseen 20 1 puhdasta vettä. Sekoitus lopetettiin heti ja annettiin kidemassan laskeutua astian pohjalle 2 tunnin ajan. Emäliuos dekan-toitiin eroon varoen kiteiden huuhtoutumista pois. Kide-25 massaan sekoitettiin jälleen 20 1 puhdasta vettä ja pesuvesi poistettiin dekantoimalla. Pesu vedellä suoritettiin vielä kolmannen kerran. Näin saatua, 3 kertaa vedellä pestyä, kosteaa isomeraasikidemassaa käytettiin sellaisenaan isomerointikokeissa ja aktiivisuusmäärityksissä ym. tut-30 kimuksissa.
Näin valmistettu ristisidottu glukoosi-isomeraasi oli kiteisessä olomuodossa (mikroskooppinen tarkastelu). Kiteet olivat liukenemattomia veteen, erilaisten suolojen laimeisiin vesiliuoksiin (pH-alueella 2-9 ), laimeisiin hap-35 poihin (1 mol/1), kuumaan veteen ja kuumiin suolaliuoksiin “ 85285 aina 100°C saakka, ja väkeviin glukoosi-, fruktoosi- ja sokeriliuoksiin aina 100°C saakka. Kiteiden ulkonäkö pysyi muuttumattomana kaikissa edellä mainituissa olosuhteissa, kun sen sijaan ristisitomaton kiteinen isomeraasi 5 liukeni, tai saostui amorfisena sakkana. Ristisidotun iso-meraasin entsymaattinen aktiivisuus oli 52 % alkuperäisen, ristisitomattoman isomeraasin aktiivisuudesta, eli kun alkuperäisen isomeraasin aktiivisuus on 40 000 GlU/g, niin vastaavasti ristisidottujen kiteiden aktiivisuus on yli 10 20 000 GlU/g, laskettuna kuivattua entsyymiproteiinia koh ti.
Esimerkki 2
Esimerkin 1 mukaisella järjestelyllä valmistettiin 25°C lämpötilassa seuraava reaktioseos: 15 14 g isomeraasia puhtaaksi entsyymiproteiiniksi laskettuna 10 g ammoniumsulfaattia 1,5 g glutaarialdehydiä (n. 8 ml 25-% liuosta) 0,05-m natriumfosfaattipuskuria (seoksen pH 7,4) 20 100 ml vettä
Yhden tunnin reaktioajan jälkeen seoksesta poistettiin vapaa liuos laboratoriosentrifugilla sentrifugoi-malla 5 minuuttia kierrosluvulla 1000 r/min. Muodostunut kidemassa lietettiin 200 ml:aan puhdasta vettä ja sentri-25 fugoitiin jälleen kuten edellä. Pesu vedellä toistettiin vielä kerran kuten edellä. Kostea pesty kidemassa otettiin talteen ja käytettiin jatkotutkimuksiin. Näin valmistetun kidemassan aktiivisuus oli 49 % alkuperäisen ki-demassan aktiivisuudesta.
30 Esimerkit 3-8
Esimerkin 1 mukaisella järjestelyllä valmistettiin 10°C:ssa reaktioseoksia, joiden alkukoostumus oli sama kuin esimerkissä 2. Eripitoisten reaktioaikojen jälkeen reaktio lopetettiin ja kidemassa pestiin, jonka jälkeen 35 kidemassojen aktiivisuudet määritettiin. Tulokset on esitetty taulukossa I: i2 85285
Taulukko I
Reaktioaika Aktiivisuus (%:na alkuperäisen kidemassan aktiivisuudesta ) 5 Esimerkki 3 10 min 45
Esimerkki 4 30 min 46
Esimerkki 5 60 min 49
Esimerkki 6 90 min 48
Esimerkki 7 2 h 40 10 Esimerkki 8 3 h 40
Tuloksista päätellen reaktio menee loppuun hyvin nopeasti ja aktiivisuus ei muutu merkittävästi reaktioai-kojen pidetessä.
Esimerkit 9-16 15 Esimerkin 1 mukaisella järjestelyllä valmistettiin 10°C:ssa reaktioseoksia, joiden alkukoostumus oli seuraava: 14 g glukoosi-isomeraasiproteiinia (kiteisenä) 10 g ammoniumsulfaattia 90 ml 0,5-m natriumfosfaattiliuosta (pH 6,0, 7,0, 20 8,0 tai 8,4, kuten taulukossa II on esitetty) glutaarialdehydiä 0,12, 0,5, 2,0, 3,5 tai 4,12 g (kuten taulukossa II on esitetty).
Reaktioaika oli 1 tunti. Saatujen kidemassojen aktiivisuus (%:na alkuperäisen kidemassan aktiivisuudesta) 25 on esitetty taulukossa II).
i3 85285
Taulukko II
pH Glutaari- Aktiivisuus (%) aldehydiä (g)
Esimerkki 9 6,0 0,5 22 5 Esimerkki 10 6,0 3,5 24
Esimerkki 11 7,0 0,12 60
Esimerkki 12 7,0 2,0 65
Esimerkki 13 7,0 4,12 59 10
Esimerkki 14 8,0 0,5 41
Esimerkki 15 8,0 3,5 44
Esimerkki 16 8,4 2,0 39
Tuloksista voidaan päätellä, että glutaarialdehydi-15 määrää voidaan vaihdella melko laajoissa rajoissa ja silti saavuttaa hyviä aktiivisuuksia. Sen sijaan happamuudella on voimakas vaikutus tulokseen; edullisin pH-arvo on noin 7,0, tosin käyttökelpoista tuotetta voidaan valmistaa koko tutkitulla pH-alueella, 6,0 - 8,4.
20 Esimerkit 17-27
Suoritettiin edellisten esimerkkien kaltainen koesarja, jolloin kuitenkin lämpötila oli 2°C ja reaktioaika 18 tuntia. Reaktioseoksen koostumus oli seuraava: 3 g isomeraasikiteitä kuivaksi proteiiniksi las-25 kettuna 50 ml vettä väliaineena 7,5 g suolaa (natriumsulfaattia, magnesiumsulfaattia ja/tai ammoniumsulfaattia (ks. taulukko III) natriumhydroksidia pH: n säätämiseksi arvoon 7,0 30 (korkeintaan 2 mekv, eli 80 mg) glutaarialdehydiä 0,125 - 2,5 g (ks. taulukko III).
i4 85285
Taulukko III
Suolaa (g) Glutaari- Aktiivi- (NH4)2S04 MgS04 Na2 S04 aldehydiä suus (%) (g) 5 Esimerkki 17 7,5 0,5 0
Esimerkki 18 7,5 2,5 0
Esimerkki 19 7,5 0,125 0
Esimerkki 20 7,5 0,5 0 10 Esimerkki 21 7,5 0,75 0
Esimerkki 22 7,5 1,25 0
Esimerkki 23 0,45 7,05 0,75 20
Esimerkki 24 0,90 6,6 0,75 19 15 Esimerkki 25 1,8 5,7 0,75 28
Esimerkki 26 3,75 3,75 0,75 40
Esimerkki 27 7,5 0,75 60 20 Tuloksista voidaan päätellä, että ristisidottaessa ilman ammoniumsuolan läsnäoloa, ei saada syntymään liukenemattomia kiteitä korkeallakaan glutaarialdehydipitoisuu-della. Sensijaan jo pienikin määrä ammoniumsuolaa edistää liukenemattoman kiteen muodostumista.
25 Esimerkit 28-38
Liukenemattomia isomeraasikiteitä valmistettiin useita eri typpiyhdisteitä käyttäen seuraavan yleisohjeen mukaisesti: 3 g kiteistä isomeraasia kuivaksi proteiiniksi 30 laskettuna 7.5 g magnesiumsulfaattia 10 mmol typpiyhdistettä (ks. taulukko IV) 2.5 g glutaarialdehydiä (100 %:ksi laskettuna) Lämpötila 2°C ja reaktioaika 18 tuntia 15 85285
Taulukko IV
Typpiyhdiste Määrä (g) Aktiivisuus (%) Esimerkki 28 lysiini 1,83 80
Esimerkki 29 arginiini 1,74 17 5 Esimerkki 30 histidiini 1,55 26
Esimerkki 31 glutamiini 1,46 18
Esimerkki 32 leusiini 1,31 21
Esimerkki 33 isoleusiini 1,31 18
Esimerkki 34 proliini 1,15 10 10 Esimerkki 35 metioniini 1,49 27
Esimerkki 36 fenylalaniini 1,65 17
Esimerkki 37 tryptofaani 2,04 44
Esimerkki 38 betaiini 1,17 23
Tuloksista on pääteltävissä, että lukuisilla eri-15 laisilla amiineilla on samankaltainen vaikutus ristisidon-taprosessiin.
Esimerkit 39-51
Valmistettiin erilaisilla glutaarialdehydin ja lysiinin annostuksilla liukenemattomia isomeraasikiteitä 20 seuraavan perusohjeen mukaisesti: 3 g kiteistä isomeraasia kuivaksi proteiiniksi laskettuna 7,5 g magnesiumsulfaattia 0,47-2,34 g lysiiniä (ks. taulukko V) 25 pH:n säätö arvoon 8,0 natriumhydroksidiliuoksen avulla 0,5-1,25 g glutaarialdehydiä (100-%:na; ks. taulukko V)
Annettiin reagoida 18 tuntia 2°C:ssa.
16 8 52 85
Taulukko V
Glutaarl- Lysiiniä Aktiivisuus aldehydiä (g) (g) (%)
Esimerkki 39 0,5 0,47 67 5 Esimerkki 40 0,5 0,94 77
Esimerkki 41 0,5 1,40 60
Esimerkki 42 0,75 0,47 72
Esimerkki 43 0,75 0,94 83 10 Esimerkki 44 0,75 1,40 92
Esimerkki 45 0,75 1,87 81
Esimerkki 46 0,75 2,34 75
Esimerkki 47 1,25 0,47 68 15 Esimerkki 48 1,25 0,94 78
Esimerkki 49 1,25 1,40 90
Esimerkki 50 1,25 1,87 102
Esimerkki 51 1,25 2,34 100
Tuloksista ilmenee, että lysiinin ja glutaarialde-20 hydin annostusten suhteella on vaikutus liukenemattomien kiteiden syntyyn, eli kullakin glutaarialdehydin annostus-tasolla on nähtävissä optimaalinen lysiiniannostaso. Esimerkit 52-57
Isomeraasikiteitä ristisidottiin ammoniumsulfaatin 25 ja lysiinin seoksissa seuraavan yleisohjeen mukaisesti: 10 g isomeraasikiteitä 10-% ammoniumsulfaatissa (eli 3,72 g puhdasta isomeraasiproteiinia kuiva-aineeksi laskettuna, 0,63 g ammoniumsul faattia ja 5,65 g vettä) 30 5 g ammoniumsulfaattia 45 g vettä 1,25 g glutaarialdehydiä 100 %:ksi laskettuna, lysiiniä 0-3 g (ks. taulukko VI)
Reaktioseoksen kaikkien komponenttien pH säädettiin 35 8,0:ksi natriumhydroksidilla ennen sekoittamista.
17 85285
Seoksia sekoitettiin + 3°C:ssa 18 tuntia.
Taulukko VI
Lysiiniä (g) Aktiivisuus (%)
Esimerkki 52 0 40 5 Esimerkki 53 0,3 62
Esimerkki 54 0,6 66
Esimerkki 55 1,2 72
Esimerkki 56 1,8 92
Esimerkki 57 3,0 96 10 Tuloksista ilmenee, että lysiinillä on hyvin edul linen vaikutus ristisidonnan saantoon. Ammoniumsulfaatilla ei ole kovinkaan suurta merkitystä tulokseen silloin kun lysiiniä on saatavilla, vaikka ammoniumsulfaatti yksinään antaakin tyydyttävän tuloksen.
15 Esimerkit 58-69
Pidettiin isomeraasin ja lysiinin määrä vakiona ja muita komponentteja vaihdeltiin taulukon VII mukaisesti: 3 g glukoosi-isomeraasia kuivaksi laskettuna 1 g lysiiniä 20 0,01 g natriumhydroksidia (seoksen pH 8).
Reaktioaika oli 18 tuntia ja lämpötila 2°C.
ie 8 5285
Taulukko VIII
Glutaari- MgS04 Vettä Reaktio- Aktii-aldehydiä seosta visuus (g) (g) (g) yht.(g) (%) 5 Esimerkki 58 0,5 2,1 11,9 18,5 39
Esimerkki 59 0,5 2,7 15,3 22,5 70
Esimerkki 60 0,5 4,2 23,8 32,5 70
Esimerkki 61 0,5 5,3 32,7 42,5 73
Esimerkki 62 0,5 10,2 57,8 72,5 75 10 Esimerkki 63 0,5 16,2 91,8 112,5 77
Esimerkki 64 1,25 2,1 11,9 19,25 86
Esimerkki 65 1,25 2,7 15,3 23,25 99
Esimerkki 66 1,25 4,2 23,8 33,25 101 15 Esimerkki 67 1,25 5,3 32,7 43,25 89
Esimerkki 68 1,25 10,2 57,8 73,25 83
Esimerkki 69 1,25 16,2 91,8 113,25 89
Tuloksista ilmenee, että reaktioseoksen väkevyydellä on verraten vähäinen vaikutus lopputulokseen. Paljon 20 suurempi merkitys on reaktioon osallistuvien aineiden (entsyymin, lysiinin (tai amiinin) ja glutaarialdehydin) keskinäisillä painosuhteilla.
Esimerkki 70 1 g vedellä pestyä ristisidottua glukoosi-isome-25 raasimassaa (esimerkistä 56; 0,4 g kuiva-ainetta) sekoitettiin 100 g:aan 40-% glukoosiliuosta, jonka pH oli säädetty 7,Oraan. Seosta sekoitettiin jatkuvasti 60°C:ssa. Seoksesta otettiin ajoittain näytteitä, joiden fruktoosi-pitoisuus määritettiin polarimetrilla ja glukoosipitoi-30 suus entsymaattisesti heksokinaasilla. Liuoksen fruktoo-sipitoisuus nousi 42 %:iin seoksen kokonaissokeripitoi-suudesta (glukoosi + fruktoosi = 100 %) 3 tunnin aikana. Kokeen jälkeen ristisidottu isomeraasi erotettiin seoksesta suodattamalla ja pestiin vedellä. Talteenotetulle ki-35 demassalle tehtiin aktiivisuusmääritys ja kuiva-ainepitoi- 19 85285 suuden määritys ja voitiin todeta, että aktiivista entsyymiä ei ollut kokeessa lainkaan liuennut tai hävinnyt. Samalla entsyymierällä voitiin toistaa tämä koe lukuisia kertoja.
5 Esimerkki 71
Esimerkin 1 mukaisesti valmistettu kidemassa pestiin hienojakoisen sakan ja mahdollisen prosessissa hienoksi jauhautuneen kidemurskeen poistamiseksi liettämällä veteen ja dekantoimalla (3 kertaa). Näin valmistettu suurikokoinen 10 kidejae, keskikooltaan 100 /um, pakattiin sylinterinmuotoiseen reaktoriin, jonka halkaisija oli 2,6 cm ja korkeus 5 cm. Kolonnin läpi pumpattiin 60°C:ssa glukoosiliuosta, jonka koostumus oli seuraava: 582 g glukoosimonohydraattia 15 590 g vettä 0,37 g MgS04 . 7 H20 0,19 g NaHS03 pH 6,9 (1-m NaOH, kulutus alle 1 ml)
Kokeen alussa virtausnopeus oli 11 ml/min, jolloin 20 kolonnista poistuvan liuoksen fruktoosipitoisuus oli noussut 42 %:iin kokonaissokeripitoisuudesta. Koetta jatkettiin 200 tuntia, jonka kuluttua virtausnopeutta oli alennettava 9 ml:aan minuutissa alkuperäisen konversion (fruktoosipitoisuus 42 %) ylläpitämiseksi. Näinollen entsyymin 25 aktiivisuus oli tänä aikana laskenut 81 %:iin alkuperäisestä. Kidemassan vähenemistä ja liukenemista ei voitu havaita kokeen aikana.
Esimerkit 72-76
Punnittiin 43,42 g kosteata vedellä pestyä aktiivis-30 ta isomeraasikidemassaa (valmistettu esimerkin 67 mukaisella menetelmällä; 10,0 g entsyymiä kuiva-aineena).
Kidemassan päälle kaadettiin 200 ml esimerkin 71 mukaisesti valmistettua glukoosiliuosta. Seosta ravisteltiin 60°C:ssa eripituisia aikoja ja sen jälkeen seos suo-35 datettiin suodatinpaperikiekon läpi. Paperin päälle jää- 20 8 52 85 nyt kidemassa pestiin huolellisesti vedellä kaiken liukoisen aineksen poistamiseksi. Kidemassa kuivattiin lämpökaa-pissa 105°C:ssa ja punnittiin. Havainnot esitetään taulukossa Vili:
5 Taulukko VIII
Sekoitusaika Kidemassan kuivapaino kokeen jälkeen (g)
Esimerkki 72 10 min 9,9
Esimerkki 73 2 h 11,0 10 Esimerkki 74 4 h 10,9
Esimerkki 75 6 h 10,7
Esimerkki 76 21 h 10,4
Tuloksista ilmenee, että keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettu ristisidottu kiteinen isomeraasi ei 15 liukene substraattiin tavanomaisissa teollisissa käyttö-olosuhteissa .
Esimerkki 77
Ristisidottua kiteistä isomeraasia, DEAE-selluloo-saan sidottua ja alkuperäistä vapaata liukoista isomeraasia 20 vertailtiin keskenään pitämällä niitä identtisissä kemiallisissa ja fysikaalisissa olosuhteissa. Olosuhteet valittiin siten, että kaikki entsyyminäytteet menettivät aktiivisuuttaan mitattavissa määrin kohtuullisen lyhyessä ajassa, muutamissa kymmenissä tunneissa. 5 g kutakin ent-25 syymivalmistetta sekoitettiin 150 ml:aan 0,05-m natrium-fosfaattipuskuria (pH 6,0), Jossa lisäksi oli 1,5 mmol/1 MgS04 ja 2 mmol/1 NaHS03. Seosta ravisteltiin useita tunteja 70°C:ssa. Seoksesta otettiin ajoittain näytteitä, joista määritettiin jäljellä oleva isomeraasin aktiivi-30 suus. Aktiivisuuden aleneman perusteella laskettiin kunkin entsyyminäytteen puoliintumisaika (so. aika jona aktiivisuus vähenee puoleen alkuperäisestä). Tulokset on esitetty taulukossa IX: 21 85285
Taulukko IX
Entsyyminäyte Puoliintumisaika (h)
Alkuperäinen liukoinen isomeraasi 2,2 DEAE-selluloosaan sidottu isomeraasi 3,3 5 Ristisidottu kiteinen isomeraasi 19,0
Tuloksista ilmenee, että entsymaattinen aktiivisuus säilyy ristisidotuissa kiteissä oleellisesti paremmin kuin vapaassa entsyymissä tai tunnetulla tavalla immobili-soidussa entsyymissä.
10 Esimerkki 78
Ristisidottua kiteistä isomeraasia ja DEAE-selluloosaan sidottua isomeraasia pakattiin sylinterinmuotoiseen pylväsreaktoriin esimerkin 71 mukaisesti. Pylväiden läpi pumpattiin jatkuvasti glukoosiliuosta, jonka koos-15 tumus oli sama kuin esimerkissä 71, paitsi että pH oli säädetty arvoon 6,0. Pylväiden lämpötila kokeen aikana oli 60°C. Pylväissä olevan entsyymin aktiivisuus laskettiin virtausnopeuden ja läpitulleen liuoksen fruktoosi-pitoisuuden perusteella. Tulokset on esitetty taulukossa 20 X.
Taulukko X
Reaktorin täyte Aktiivisuuden puoliin tumisaika (h)
Ristisidottu isomeraasikidemassa 120 25 DEAE-selluloosaan sidottu isomeraasi 36
Tuloksista ilmenee, että ristisidotuissa kiteissä entsyymin aktiivisuus säilyy erinomaisesti.
30

Claims (10)

  1. 22 S5285
  2. 1. Veteen liukenematon, kiteinen glukoosi-isomeraa-si, tunnettu siitä, että kiteinen, liukoinen 5 glukoosi-isomeraasi on ristisitomalla saatettu veteen liukenemattomaan muotoon a) lisäämällä isomeraasin kiteitä sisältävään suspensioon dialdehydiä, sekä vähintään yhden aminoryhmän sisältävää yhdistettä, kuten ammoniumsuolaa, amiinia tai 10 aminohappoa, joko ennen dialdehydin lisäystä tai ris-tisidontareaktion aikana, ja b) pesemällä ristisidotut kiteet vedellä tai muulla nesteellä reagenssijäämien poistamiseksi.
  3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen glukoosi-isome- 15 raasi, tunnettu siitä, että se on laimeisiin happoihin ja emäksiin pH-alueella 1-10 liukenematon.
  4. 3. Patenttivaatimusten 1 ja 2 mukainen glukoosi-isomeraasi, tunnettu siitä, että se on liukenematon glukoosin, fruktoosin ja muiden sokereiden vesi- 20 liuoksiin.
  5. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen glukoosi-isomeraasi, tunnettu siitä, että kiteet eivät liukene korotetuissa lämpötiloissakaan, aina 90°C saakka, mainittuihin sokeriliuoksiin.
  6. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen glukoosi-isome raasi, tunnettu siitä, että se katalysoi luonnollisten substraattiensa, nimittäin glukoosin, fruktoosin ja ksyloosin isomeroitumista näiden sokereiden väkevissäkin liuoksissa, ja lämpötiloissa 0-110°C.
  7. 6. Patenttivaatimusten 1-5 mukainen glukoosi-isome raasi, tunnettu siitä, että kiteet on kemiallisesti tai fysikaalisesti sidottu edelleen suuremmiksi kappaleiksi, pallomaisiksi, levymäisiksi, nauhamaisiksi tai muiksi yhdistelmiksi. .35 7. Menetelmä veteen liukenemattoman, kiteisen glu- 23 85285 koosi-isomeraasin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) isomeraasin kiteitä sisältävään suspensioon lisätään dialdehydiä, sekä vähintään yhden aminoryhmän si- 5 sältävää yhdistettä, kuten ammoniumsuolaa, amiinia tai aminohappoa, ennen dialdehydin lisäystä tai ristisidonta-reaktion aikana, ja b) ristisidotut kiteet pestään vedellä tai muulla nesteellä reagenssijäämien poistamiseksi.
  8. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että dialdehydi on glutaarialde-hydi.
  9. 9. Patenttivaatimusten 7 ja 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glutaarialdehydin määrä on 15 0,4-8 paino-%.
  10. 10. Patenttivaatimuksen 7 mukaisella menetelmällä ristisidotun kiteisen isomeraasin käyttö katalyyttinä a) isomeroitaessa glukoosia fruktoosiksi, tai b) isomeroitaessa ksyloosia tai muuta isomeraasin 20 substraattia, jolloin c) isomerointi tapahtuu korkeissa, jopa 100°C lämpötiloissa. 24 8 5285
FI882249A 1988-05-13 1988-05-13 Tvaerbundet, vattenoloesligt glukosisomeras och foerfarande foer framstaellning daerav. FI85285C (fi)

Priority Applications (20)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI882249A FI85285C (fi) 1988-05-13 1988-05-13 Tvaerbundet, vattenoloesligt glukosisomeras och foerfarande foer framstaellning daerav.
ES89107659T ES2059610T3 (es) 1988-05-13 1989-04-27 Glucosa-isomerasa reticulada.
AT89107659T ATE95232T1 (de) 1988-05-13 1989-04-27 Vernetzte glukose-isomerase.
EP89107659A EP0341503B1 (en) 1988-05-13 1989-04-27 Cross-linked glucose isomerase
DE89107659T DE68909488T2 (de) 1988-05-13 1989-04-27 Vernetzte Glukose-Isomerase.
IN322/MAS/89A IN169420B (fi) 1988-05-13 1989-04-27
AU33816/89A AU3381689A (en) 1988-05-13 1989-04-28 Cross-linked glucose isomerase
IE143589A IE63128B1 (en) 1988-05-13 1989-05-02 Cross-linked glucose isomerase
ZA893460A ZA893460B (en) 1988-05-13 1989-05-10 Cross-linked glucose isomerase
KR1019890006309A KR900018370A (ko) 1988-05-13 1989-05-11 가교 결합된 글루코우즈 이소머라제
DK231989A DK169039B1 (da) 1988-05-13 1989-05-12 I vand uopløselig tværbundet krystallinsk glucoseisomerase og fremgangsmåde til fremstilling deraf samt fremgangsmåder til isomerisering af et subtra t og til kontinuerlig fremstilling af fructose under anvendelse heraf
CN89103117A CN1038123A (zh) 1988-05-13 1989-05-12 交联葡萄糖异构酶
DD89328567A DD297843A5 (de) 1988-05-13 1989-05-12 Verfahren zur herstellung eines wasserunloeslichen, vernetzten kristallinen enzyms und seine verwendung
HU892393A HU206134B (en) 1988-05-13 1989-05-12 Process for producing cross-bonded, water-insoluble, crystalline glycose isomerase
CA000599582A CA1320463C (en) 1988-05-13 1989-05-12 Cross-linked glucose isomerase
JP1120220A JP2599789B2 (ja) 1988-05-13 1989-05-12 水―不溶性グルコースイソメラーゼ結晶およびその製造法
NO89891943A NO891943L (no) 1988-05-13 1989-05-12 Fornettet glukoseisomerase.
US08/149,158 US5437993A (en) 1988-05-13 1993-11-08 Preparation of cross-linked glucose isomerase crystals
US08/425,970 US5811280A (en) 1988-05-13 1995-04-19 Cross-linked glucose isomerase
US08/425,027 US5900364A (en) 1988-05-13 1995-04-19 Cross-linked glucose isomerase

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI882249 1988-05-13
FI882249A FI85285C (fi) 1988-05-13 1988-05-13 Tvaerbundet, vattenoloesligt glukosisomeras och foerfarande foer framstaellning daerav.

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI882249A0 FI882249A0 (fi) 1988-05-13
FI882249A FI882249A (fi) 1989-11-14
FI85285B true FI85285B (fi) 1991-12-13
FI85285C FI85285C (fi) 1992-03-25

Family

ID=8526447

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI882249A FI85285C (fi) 1988-05-13 1988-05-13 Tvaerbundet, vattenoloesligt glukosisomeras och foerfarande foer framstaellning daerav.

Country Status (18)

Country Link
US (3) US5437993A (fi)
EP (1) EP0341503B1 (fi)
JP (1) JP2599789B2 (fi)
KR (1) KR900018370A (fi)
CN (1) CN1038123A (fi)
AT (1) ATE95232T1 (fi)
AU (1) AU3381689A (fi)
CA (1) CA1320463C (fi)
DD (1) DD297843A5 (fi)
DE (1) DE68909488T2 (fi)
DK (1) DK169039B1 (fi)
ES (1) ES2059610T3 (fi)
FI (1) FI85285C (fi)
HU (1) HU206134B (fi)
IE (1) IE63128B1 (fi)
IN (1) IN169420B (fi)
NO (1) NO891943L (fi)
ZA (1) ZA893460B (fi)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991008288A1 (en) * 1989-11-23 1991-06-13 Novo Nordisk A/S An immobilized enzyme preparation whereby a basic amino acid has been incorporated and a process for the isomerization of glucose or xylose
US5801022A (en) * 1990-08-03 1998-09-01 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Method of producing a product with crosslinked crystals of thermolysin
IE912767A1 (en) * 1990-08-03 1992-02-12 Vertex Pharma Use of crosslinked crystals as a novel form of enzyme¹immobilization
US5618710A (en) * 1990-08-03 1997-04-08 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Crosslinked enzyme crystals
AU7926194A (en) * 1993-10-01 1995-05-01 Uab Research Foundation, The Chemical separation using crystals of biological macromolecules
US6207437B1 (en) * 1996-03-11 2001-03-27 Genencor International, Inc. Crystalline protease and method for producing same
US6265201B1 (en) * 1997-01-17 2001-07-24 Regents Of The University Of Minnesota DNA molecules and protein displaying improved triazine compound degrading ability
US6140475A (en) * 1997-04-11 2000-10-31 Altus Biologics Inc. Controlled dissolution crosslinked protein crystals
US6500933B1 (en) 1997-09-05 2002-12-31 Altus Biologics Inc. Methods of preparing carbohydrate crosslinked glycoprotein crystals
ES2306477T3 (es) 1997-09-05 2008-11-01 Altus Pharmaceuticals Inc. Cristales de glicoproteina reticulados por carbohidratos.
WO2001055409A2 (en) * 2000-01-25 2001-08-02 Regents Of The University Of Minnesota Microbes and methods for remediation
US8835143B2 (en) 2004-10-28 2014-09-16 Clea Technologies Bv Method for preparing hybrid cross-linked enzyme-silica aggregates
NL1027360C2 (nl) * 2004-10-28 2006-05-01 Clea Technologies B V Werkwijze voor de bereiding van vernette enzymaggregaten met verbeterde eigenschappen.
WO2010025483A1 (de) 2008-09-04 2010-03-11 Sciotec Diagnostic Technologies Gmbh Behandlung von fruktose-malabsorption
CA2803959C (en) 2010-06-30 2021-01-19 Codexis, Inc. Chemically modified carbonic anhydrases useful in carbon capture systems
KR102133795B1 (ko) * 2012-09-10 2020-07-14 지티 어드밴스드 씨제트 엘엘씨 연속적인 초크랄스키 방법 및 장치
US20140144371A1 (en) * 2012-11-29 2014-05-29 Solaicx, Inc. Heat Shield For Improved Continuous Czochralski Process
CN103849927A (zh) * 2012-11-30 2014-06-11 有研半导体材料股份有限公司 一种直拉法生长低电阻率单晶硅用掺杂装置及掺杂方法
GB201409451D0 (en) 2014-05-28 2014-07-09 Ipabc Ltd Antimicrobial preparations, methods for preparing the same and uses thereof to combat microorganisms
CN105063747A (zh) * 2015-07-21 2015-11-18 李剑 一种液态连续加料多晶硅铸锭设备及其生产方法
CN106012010A (zh) * 2016-08-15 2016-10-12 江苏协鑫硅材料科技发展有限公司 一种二次添加掺杂剂的方法和装置
CN108301038A (zh) * 2017-01-12 2018-07-20 新疆知信科技有限公司 一种单晶硅提拉炉和生长单晶硅的拉制方法
WO2021050342A1 (en) 2019-09-13 2021-03-18 Danisco Us Inc Thermostable glucose isomerase variants
CA3240889A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 Zhongmei TANG Compositions and methods for producing allulose

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2773002A (en) * 1955-03-31 1956-12-04 Nat Dairy Res Lab Inc Purification of lactase enzyme and spray-drying with sucrose
US3666627A (en) * 1968-10-14 1972-05-30 Corning Glass Works Method of stabilizing enzymes
US3980521A (en) * 1974-08-28 1976-09-14 Novo Industri A/S Immobilization of glucose isomerase
US4237231A (en) * 1979-11-13 1980-12-02 Uop Inc. Method of purifying glucose isomerase and a composition for storing same
US4567142A (en) * 1982-06-30 1986-01-28 Nabisco Brands, Inc. Process for isomerizing glucose
US4411996A (en) * 1982-06-30 1983-10-25 Nabisco Brands, Inc. Process for isomerizing glucose
FI85284C (fi) * 1982-10-06 1992-03-25 Novo Nordisk As Foerfarande foer framstaellning av ett immobiliserat enzympreparat med hjaelp av ett tvaerbindningsmedel.
DE3408299A1 (de) * 1984-03-07 1985-09-12 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Verfahren zur immobilisierung von zellen und enzymen
US4683203A (en) * 1984-04-14 1987-07-28 Redco N.V. Immobilized enzymes, processes for preparing same, and use thereof
DK8502857A (fi) * 1984-06-25 1985-12-26
US5120650A (en) * 1989-10-13 1992-06-09 Stabra Ag Method for producing crystalline glucose isomerase

Also Published As

Publication number Publication date
US5811280A (en) 1998-09-22
DK231989D0 (da) 1989-05-12
EP0341503B1 (en) 1993-09-29
JPH02291265A (ja) 1990-12-03
DK169039B1 (da) 1994-08-01
CA1320463C (en) 1993-07-20
IN169420B (fi) 1991-10-12
EP0341503A2 (en) 1989-11-15
IE63128B1 (en) 1995-03-22
EP0341503A3 (en) 1990-06-13
ATE95232T1 (de) 1993-10-15
FI882249A (fi) 1989-11-14
DE68909488T2 (de) 1994-01-20
US5437993A (en) 1995-08-01
ES2059610T3 (es) 1994-11-16
IE891435L (en) 1989-11-13
KR900018370A (ko) 1990-12-21
US5900364A (en) 1999-05-04
CN1038123A (zh) 1989-12-20
NO891943D0 (no) 1989-05-12
JP2599789B2 (ja) 1997-04-16
DD297843A5 (de) 1992-01-23
NO891943L (no) 1989-11-14
FI85285C (fi) 1992-03-25
DE68909488D1 (de) 1993-11-04
DK231989A (da) 1989-11-14
HU206134B (en) 1992-08-28
ZA893460B (en) 1990-01-31
FI882249A0 (fi) 1988-05-13
AU3381689A (en) 1989-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI85285B (fi) Tvaerbundet, vattenoloesligt glukosisomeras och foerfarande foer framstaellning daerav.
Mosbach et al. Entrapment of enzymes and microorganisms in synthetic cross-linked polymers and their application in column techniques
JPS5836959B2 (ja) 固定化α−グルコシルトランスフエラ−ゼによるパラチノ−スの製造法
JP2004000230A (ja) 新規な酵素固定化形態としての架橋結合された結晶の使用
DK169587B1 (da) Fremgangsmåde til krystallisation af glucoseisomerase
US3767531A (en) Preparation of insolubilized enzymes
CN113009184A (zh) 一种基于低共熔溶剂制备冷冻电镜检测样品的方法
Cousineau et al. Formation of amino acid from urea and ammonia by sequential enzyme reaction using a microencapsulated multi-enzyme system
US20050163903A1 (en) Method for preparing crystalline isomaltulose and hydrogenated isomaltulose
FI78117B (fi) Foerfarande foer framstaellning av ett stabilt glukosisomeraskoncentrat.
GB2152503A (en) Process for producing L-phenylalanine
US6218138B1 (en) Synthesis of beta-lactam antibiotics with immobilized penicillin amidase
US4675292A (en) Stabilization of glucose isomerase
CN110129391A (zh) 一种采用固定双酶制备n-乙酰神经氨酸的方法
Tong et al. Optimization of Cephalosporin C Acylase Immobilization
SU1041567A1 (ru) Способ получени водорастворимого иммобилизованного протеолитического комплекса
Maxim et al. Ionic binding of biologically active proteins on cross‐linked acrylic macromolecular supports
JPH06508529A (ja) Ｄ−アミノ酸またはｄ−アミノ酸誘導体の製造法
JP2778975B2 (ja) マルトシル―サイクロデキストリンの製造方法
Han et al. Affinity immobilization of dextransucrase on dextran-based support and the production of leucrose
JPH01132394A (ja) 固定化菌体の熱処理方法
Vuolanto Cross-linked protein crystal technology in bioseparation and biocatalytic applications
JPS62278983A (ja) 固定化フラクトシルトランスフエラ−ゼ
JPS6349996B2 (fi)
CN113125482A (zh) 一种用于冷冻电镜制样的低共熔溶剂及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Owner name: STABRA AG

MA Patent expired