FI84625B - Process for detecting the threshold value of the analyte - Google Patents
Process for detecting the threshold value of the analyte Download PDFInfo
- Publication number
- FI84625B FI84625B FI896314A FI896314A FI84625B FI 84625 B FI84625 B FI 84625B FI 896314 A FI896314 A FI 896314A FI 896314 A FI896314 A FI 896314A FI 84625 B FI84625 B FI 84625B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- analyte
- chromogen
- electron acceptor
- pqq
- dehydrogenase
- Prior art date
Links
Description
8462584625
MENETELMÄ ANALYYTIN KYNNYSARVON TOTEAMISEKSIMETHOD FOR DETERMINING THE ANALYTICAL THRESHOLD
Keksinnön kohteena on entsymaattinen menetelmä ja reagenssiyhdistelmä, jolla osoitetaan määrätyn kynnysarvon ylittävä tai alittava analyytin pitoisuus PQQ-dehydrogenaasien avulla.The invention relates to an enzymatic method and a reagent combination for detecting the concentration of an analyte above or below a certain threshold by means of PQQ dehydrogenases.
Kvantitatiivista kolorimetristä analyysiä käytetään usein orgaanisten tai epäorgaanisten aineiden (analyyttien) pitoisuuksien mittaamisessa näytteistä. Kemiallisessa reaktiossa muodostuvan värin voimakkuus vastaa tarkasti määritettävän analyytin pitoisuutta näytteessä. Tällaiset tarkat kvantitatiiviset määritykset ovat teknisesti vaativia suorittaa ja edellyttävät onnistuakseen monimutkaisia laitteistoja sekä laboratoriokoulutuksen saaneen henkilökunnan.Quantitative colorimetric analysis is often used to measure the concentrations of organic or inorganic substances (analytes) in samples. The intensity of the color formed in the chemical reaction corresponds exactly to the concentration of the analyte to be determined in the sample. Such accurate quantitative assays are technically demanding to perform and require complex equipment as well as laboratory-trained personnel to succeed.
Tärkein analytiikan alue, jossa hyödynnetään värinvoimak-kuuden tai värisävyn muutoksiin perustuvaa aineen pitoisuuden mittaamista, on ilman erityisiä mittalaitteita suoritettu pitoisuusmääritys, visuaaliset testit. Visuaalisiin testeihin perustuvan analytiikan käyttöaluetta on pyritty laajentamaan kehittämällä helppo- ja kertakäyttöisiä "joka miehen testejä", joiden suoritus ei vaadi koulutusta. Toteutukset ovat usein ns. kuivakemiaa, jossa nestemäinen näyte liuottaa testivälineeseen kuivatut tai kiinnitetyt reagenssit ja käynnistää reaktiot. Näyte voidaan myös laimentaa ennen määritystä. Visuaalisesti tulkittavassa testivälineessä syntyy tai häviää väriä, jonka sävy tai voimakkuus on riippuvainen analyytin pitoisuudesta näytteessä.The most important area of analysis, which uses the measurement of the concentration of a substance based on changes in color intensity or hue, is the determination of concentration without visual measuring equipment, visual tests. Efforts have been made to expand the scope of visual test-based analytics by developing easy-to-use, one-man tests that do not require training. Implementations are often so-called. dry chemistry, in which a liquid sample dissolves dried or attached reagents in a test device and initiates reactions. The sample can also be diluted before analysis. In a visually interpretable test device, a color is generated or lost, the hue or intensity of which depends on the concentration of the analyte in the sample.
Analyytin pitoisuutta vastaa siis testivälineen värisävyn, värinvoimakkuuden tai värjäytyneen alueen muutos.Thus, the analyte concentration corresponds to a change in the hue, intensity, or stained area of the test device.
Mitä tarkemmin värin muutos voidaan havaita, sitä varmemmin voidaan päätellä analyytin pitoisuus näytteessä.The more accurately the color change can be detected, the more confident the concentration of analyte in the sample can be deduced.
Visuaalisissa testeissä on kuitenkin harvoin tarvetta tarkasti tuntea analyytin pitoisuus. Käytännössä 2 84625 päätöksenteon pohjaksi riittää usein tieto siitä, ylittääkö analyytin pitoisuus tietyn rajan. Tämän tyyppisiä rajoja voivat olla esimerkiksi työ- tai asuinympäristön ilman epäpuhtauksien ylin sallittu pitoisuus (esim. formaldehydi-pitoisuus) tai veren alkoholipitoisuus liikenteessä, työpaikalla tai ensiapuasemalla. Ilman mittalaitteita suoritettava testi voi toimia halpana seulontatestinä, jonka tuloksesta riippuen voidaan tehdä päätös kalliin laboratoriomäärityksen suorittamisesta.However, in visual tests, there is rarely a need to accurately know the concentration of the analyte. In practice, 2 84625 decisions are often based on whether the concentration of the analyte exceeds a certain limit. These types of limits can be, for example, the maximum permissible concentration of air pollutants in the work or living environment (e.g. formaldehyde content) or the blood alcohol content in traffic, at the workplace or at the first aid station. A test performed without measuring equipment can act as an inexpensive screening test, depending on the result of which a decision can be made to perform an expensive laboratory assay.
Tähän tarkoitukseen sopivassa testivälineessä määrätty analyytin pitoisuus tai pitoisuudet aiheuttavat selkeän värisignaalin, joka ohjaa käyttäjän päätöksentekoa. Määrättyä pitoisuutta, kynnysarvoa, vastaa hyvin jyrkkä värin muutos, eräänlainen ΟΝ/EI -signaali. Tällainen analyytin vaste tulkitaan oikein, eikä se riipu havaitsijan subjektiivisista tulkinnoista kuten värien intensitetti- tai sävyeroihin perustuvissa analyysivälineissä.The concentration or concentrations of the analyte determined in a suitable test device produce a clear color signal that guides the user's decision-making. The specified concentration, the threshold value, corresponds to a very sharp change in color, a kind of ΟΝ / NO signal. Such an analyte response is correctly interpreted and does not depend on the observer's subjective interpretations, such as in analysis tools based on differences in color intensity or hue.
Kolorimetrisiin analyyseihin soveltuvat yleensä parhaiten biokemialliset entsyymejä hyväkseen käyttävät menetelmät. Tavanomaisiin kemiallisiin reaktioihin perustuviin menetelmiin verrattuna ovat biokemialliset analyysit spesifisempiä, kätevämpiä suorittaa ja ovat nopeita huoneenlämpötilassa. Biologisia molekyylejä määritetään yleisesti kahden tyyppisillä redox-entsyymeillä: 1. Dehydrogenaaseilla, jotka käyttävät koentsyyminään NAD(P)H:ta. NAD(P)H määrän muutos reaktiossa voidaan mitata suoraan UV-alueella 340 nm:ssä fotometrisesti absorbans-simuutoksena tai kytkeä reaktio toiseen usein toisen entsyymin katalysoimaan reaktioon, jossa muodostuu tai häviää väriä.Biochemical methods utilizing enzymes are generally best suited for colorimetric analyzes. Compared to methods based on conventional chemical reactions, biochemical analyzes are more specific, more convenient to perform, and are rapid at room temperature. Biological molecules are generally determined by two types of redox enzymes: 1. Dehydrogenases, which use NAD (P) H as their coenzyme. The change in the amount of NAD (P) H in the reaction can be measured directly in the UV range at 340 nm photometrically as a change in absorbance, or coupled to another reaction, often catalyzed by another enzyme, in which color is formed or lost.
2. Oksidaaseilla, joiden katalysoimassa reaktiossa muodostuu vetyperoksidia, jonka määrä voidaan mitata yleensä toisen entsyymin katalysoimalla väri reaktiolla.2. Oxidases which catalyze the formation of hydrogen peroxide, the amount of which can generally be measured by a color reaction catalyzed by another enzyme.
3 846253,84625
Tunnetaan runsaasti dehydrogenaaseja, jotka hapettavat tai pelkistävät NAD(P)(H):ta stökiömetrisessä reaktiossa substraatin kanssa. Patenttihakemus EP 154409 kuvaa testivälinettä ja menetelmää alkoholien määrittämiseksi, jossa NAD(P) alkoholidehydrogenaasin katalysoimassa reaktiossa pelkistyy alkoholin kanssa reagoidessaan. Syntyvä NAD(P)H pelkistää väriaineen diaforaasin katalysoimassa reaktiossa. Alkoholipitoisuus havaitaan visuaalisesti seuraamalla värinsävyn liukuvaa muutosta tai määrittämällä aika, jossa tietty värinmuutosaste tapahtuu. Tällaisen järjestelmän heikkoudet ovat ilmeisiä. Värin muutoksen selkeys mitattavalla analyytin pitoisuusalueella on oleellinen kysymys testivälineen luotettavuutta ja käyttökelpoisuutta arvioitaessa. Jos värin voimakkuuden tai värisävyn muutos on jatkuvasti liukuva, tämä johtaa voimakkaasti havaitsijasta ja suoritusolosuhteista riippuvaan tulkintaan. Värin voimakkuuserojen havaitseminen on hyvin subjektiivista. Tutkimusten mukaan eri henkilöiden tulkinta samalle vasteelle vaihtelee voimakkaasti näön, iän, vireystilan, valaistusolosuhteiden yms. mukaan. Värin intensiteettieroihin tai värisävyn muutoksiin perustuvien kertakäyttöisten testivälineiden tulokset eivät ole yksikäsitteisesti tulkittavissa. Ongelmat eivät ole pääasiassa laiterakenteissa, vaan reaktiokemiassa, jolla analyysiväline toteutetaan.Abundant dehydrogenases are known which oxidize or reduce NAD (P) (H) in a stoichiometric reaction with a substrate. Patent application EP 154409 describes a test device and method for the determination of alcohols in which NAD (P) in an alcohol-dehydrogenase-catalyzed reaction is reduced by reaction with an alcohol. The resulting NAD (P) H reduces the dye in a diphorase-catalyzed reaction. Alcohol content is detected visually by observing a sliding change in color tone or by determining the time at which a certain degree of color change occurs. The weaknesses of such a system are obvious. The clarity of color change over the measurable analyte concentration range is an essential issue in assessing the reliability and usefulness of a test device. If a change in color intensity or hue is continuously sliding, this will result in a strongly dependent observation and performance-dependent interpretation. Perceiving differences in color intensity is very subjective. According to studies, the interpretation of different individuals for the same response varies greatly depending on vision, age, alertness, lighting conditions, and so on. The results of disposable test devices based on differences in color intensity or changes in color tone are not unambiguously interpretable. The problems are not mainly in the device structures, but in the reaction chemistry with which the analytical instrument is implemented.
Ongelmana analyytin määrittämisessä suoraan näytematriisista on yleensä myös analyytin korkea pitoisuus, jolloin saatu värivaste on liian voimakas arvioitavaksi visuaalisesti tai mittalaitteilla. Tällöin joudutaan usein laimentamaan näyte ennen määritystä. Patenttijulkaisussa US 4490465 kuvataan systeemi, jossa on läsnä kaksi analyyttiä kuluttavaa entsyymiä, NAD(P):tä käyttävä dehydrogenaasi ja oksidaasi. Näin analyytistä muodostuu vähemmän kuin stökiömetrinen määrä NAD(P)H:ta, joka voidaan määrittää tunnetuilla menetelmillä. Analyytti johdetaan kahdeksi eri tuotteeksi kahden eri entsyymin katalysoimissa kilpailevissa reaktioissa.A problem in determining the analyte directly from the sample matrix is usually also the high concentration of the analyte, in which case the color response obtained is too strong to be assessed visually or by measuring equipment. In this case, it is often necessary to dilute the sample before analysis. U.S. Pat. No. 4,490,465 describes a system in the presence of two analyte consuming enzymes, NAD (P) using dehydrogenase and oxidase. Thus, less than a stoichiometric amount of NAD (P) H is formed from the analyte, which can be determined by known methods. The analyte is derived into two different products in competing reactions catalyzed by two different enzymes.
8462584625
Menetelmässä pyritään välttämään näytteen laimentamista.The method seeks to avoid sample dilution.
Värin muutoksen selkeyttä testivälineessä on pyritty parantamaan lisäämällä reaktioseokseen ns. kynnyskomponentti, joka estää värin muutokset ennen kuin analyytin pitoisuus ylittää määrätyn pitoisuuden. Kynnyskomponentin pitoisuutta muuttamalla voidaan analyytille säätää tietty raja-arvopi-toisuus, joka analyytin näytteessä on ylitettävä värisig-naalin syntymiseksi. Patenttihakemuksessa WO 88/04694 kuvataan laitetta ja menetelmää, jolla mitataan NAD(P)H:n pitoisuus tai välillisesti sellaisten orgaanisten yhdisteiden pitoisuus, jotka tuottavat NAD(P)H:ta reagoidessaan spesifisen dehydrogenaasin kanssa. Menetelmässä dehydrogenaasien katalysoimassa reaktiossa syntyvä NAD(P)H reagoi ensisijaisesti kilpailevan kynnysreagenssin kanssa, joka kuluu reaktiossa loppuun. Kynnyspitoisuuden mahdollisesti ylittävä NAD(P)H:n määrä aiheuttaa vasta värin muutoksen pelkistämällä väriaineen elektronikantajän välityksellä tai diaforaasin katalysoimassa reaktiossa. Tässä menetelmässä pyritään kynnysarvon asettamiseen analyytille, jolloin vaste olisi yksikäsitteinen ON/EI-värimuutos. Heikkoutena menetelmässä on huonosti säilyvän koentsyymin NAD(P):n käyttö. Sen säilymisen parantamiseksi joudutaan usein käyttämään mutkikkaita rakenteellisia ratkaisuja, esim. kuivaamaan se eri kerrokseen kuin muut kemikaalit. NAD(P) on kallista, joten sen määrän pienentäminen testivälineessä on taloudellinen kysymys. Toisaalta tavoitteena oleva NAD(P):n määrän oleellinen vähentäminen heikentää testivälineen säilyvyyttä ratkaisevasti. Diaforaasi toisena entsyyminä nostaa kustannuksia ja heikentää säilyvyyttä.Efforts have been made to improve the clarity of the color change in the test device by adding a so-called a threshold component that prevents color changes before the analyte concentration exceeds a specified concentration. By changing the concentration of the threshold component, a certain cut-off concentration can be set for the analyte, which must be exceeded in the analyte sample in order to generate a color signal. Patent application WO 88/04694 describes an apparatus and method for measuring the content of NAD (P) H or indirectly the content of organic compounds which produce NAD (P) H by reaction with a specific dehydrogenase. In the process, the NAD (P) H formed in the dehydrogenase-catalyzed reaction primarily reacts with a competing threshold reagent that is consumed in the reaction. The amount of NAD (P) H that possibly exceeds the threshold concentration only causes a color change by reduction of the dye via an electron support or in a reaction catalyzed by a phosphorase. The aim of this method is to set a threshold value for the analyte, in which case the response would be an unambiguous ON / OFF color change. A weakness of the method is the use of poorly preserved coenzyme NAD (P). To improve its preservation, it is often necessary to use complex structural solutions, e.g. to dry it on a different layer than other chemicals. NAD (P) is expensive, so reducing its amount in a test device is an economic issue. On the other hand, the targeted substantial reduction in the amount of NAD (P) significantly reduces the shelf life of the test device. Diaphorase as another enzyme increases costs and impairs shelf life.
Usein ongelmana entsymaattisia testiliuoskoja valmistettaessa on saada reaktio menemään riittävän nopeasti loppuun. Tämä ongelma koskee selvästi myös edellä esitettyjä ratkaisuja. Esimerkiksi NAD:sta riippuvan alkoholidehydrogenaasin Michaelsin vakio (etanolipitoisuus, jossa saavutetaan puolimaksimaalinen reaktionopeus) on melko korkea, noin 13 5 84625 mmol/l, joka vastaa suuruusluokaltaan veressä tai syljessä yleisesti esiintyvää etanolipitoisuutta. Tästä johtuen nopea ja jyrkkä värimuutos reagoivassa vyöhykkeessä on toteutettavissa vain käyttämällä suuria entsyymimääriä. Lisäksi NAD(P):stä riippuvien entsyymien reaktio on usein reversiibeli, molempiin suuntiin tapahtuva reaktio, jonka tasapaino esim. etanolimäärityksessä on lähtöaineen puolella. Tämän ongelman ratkaisuun voidaan käyttää erilaisia apukemikaaleja tai -entsyymejä, jotka reagoivat lopputuotteen kanssa ja auttavat reaktioita menemään loppuun. Tämä toisaalta monimutkaistaa reaktiokemiaa ja vaikeuttaa analyysivälineen toteutusta, sekä voi edellyttää yhteen sopimattomien reagenssien soveltamista laiterakenteeseen.Often the problem in preparing enzymatic test solutions is to complete the reaction quickly enough. This problem clearly also applies to the solutions presented above. For example, the Michaels constant for NAD-dependent alcohol dehydrogenase (ethanol concentration at which a half-maximal reaction rate is reached) is quite high, about 13 5 84625 mmol / l, which corresponds to the order of magnitude of the ethanol concentration commonly found in blood or saliva. As a result, rapid and abrupt color change in the reactive zone is only feasible using large amounts of enzyme. In addition, the reaction of NAD (P) -dependent enzymes is often a reversible, bi-directional reaction with an equilibrium, e.g. in the ethanol assay, on the starting material side. To solve this problem, various auxiliary chemicals or enzymes can be used that react with the final product and help the reactions to complete. This, on the other hand, complicates the reaction chemistry and complicates the implementation of the analytical instrument, and may require the application of incompatible reagents to the apparatus design.
NAD(P):tä käyttäviä entsyymejä sovellettaessa on usein ongelmana myös entsyymipreparattien epäpuhtaudet, reagenssien epästabiilisuus ja muut sivureaktioita aiheuttavat aineet ja entsyymit. NAD(P):tä käyttävät entsyymit ovat hyvin yleisiä biologisissa näytteissä. Edellä esitetyn valossa voidaan todeta, ettei tähän mennessä ole ollut saatavilla sopivaa entsymaattista okso- tai hydroksiryhmiä sisältävien analyyttien määritysmenetelmää, jonka pohjalta voitaisiin kehittää täysin luotettava, yksikäsitteisesti tulkittava, helppokäyttöinen ja hyvin säilyvä visuaalinen testiväline, jolla osoitetaan tietyn kynnysarvon ylittävä tai alittava analyytin pitoisuus.Impurities in enzyme preparations, instability of reagents and other substances and enzymes that cause side reactions are also often a problem when using enzymes using NAD (P). Enzymes using NAD (P) are very common in biological samples. In the light of the above, to date no suitable enzymatic method for the analysis of analytes containing oxo or hydroxy groups has been available to develop a fully reliable, unambiguous, easy-to-use and well-preserved visual test device for analyte concentrations above or below a certain threshold.
Keksinnön mukaisen menetelmän ja reagenssiyhdistelmän avulla saadaan aikaan ratkaiseva parannus edellä esitetyissä epäkohdissa. Tämän toteuttamiseksi keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa, ja keksinnön mukaiselle reagenssiyhdistelmälle se, mitä on esitetty patenttivaatimuksen 4 tunnusmerkkiosassa.The method according to the invention and the combination of reagents provide a decisive improvement in the above-mentioned drawbacks. To accomplish this, the method according to the invention is characterized by what is set forth in the characterizing part of claim 1, and the reagent combination according to the invention is characterized by what is set forth in the characterizing part of claim 4.
Keksinnön mukaisen menetelmän ja reagenssiyhdistelmän etuna on, että tietyn kynnysarvon ylittävä tai alittava analyytin pitoisuus voidaan osoittaa entsymaattisesti selkeällä ja jyrkällä väri reaktiolla. Kalliita ja helposti tuhoutuvia 6 84625 koentsyymejä kuten NAD(P):tä ei tarvita. Samalla interferoivien sivureaktioiden todennäköisyys vähenee. Edelleen keksinnön mukaisen menetelmän entsyymi reaktiot ovat irreversiibeleitä, ja nopeita myös pienillä analyytin pitoisuuksilla. Lisäksi analyytin määrittämiseen tarvitaan vain yhtä entsyymiä.An advantage of the method and reagent combination of the invention is that the concentration of analyte above or below a certain threshold can be detected enzymatically by a clear and sharp color reaction. Expensive and easily destroyable 6,84625 coenzymes such as NAD (P) are not required. At the same time, the likelihood of interfering side reactions is reduced. Furthermore, the enzyme reactions of the method of the invention are irreversible, and rapid even at low analyte concentrations. In addition, only one enzyme is required to determine the analyte.
Keksinnön kohteena on reaktiosysteemi, jota voidaan käyttää +/- -tyyppisessä testissä ennalta asetetun raja-arvon ylittävän tai alittavan analyytin pitoisuuden osoittamiseen. Keksinnön kohteena on myös kuvattuun reaktiosysteemiin perustuva reagenssiyhdistelmä, kitti tai testiväline, jota käyttäen analyytin pitoisuus voidaan määrittää tiettyjen ennalta asetettujen raja-arvojen välialueelle. Keksinnön mukaisen reaktiosysteemin antama vaste tapahtuu näkyvällä valon alueella, ja se voidaan tulkita mittalaitteella tai visuaalisesti.The invention relates to a reaction system which can be used in a +/- type test to detect the concentration of an analyte above or below a preset limit value. The invention also relates to a reagent combination, kit or test device based on the described reaction system, by means of which the concentration of the analyte can be determined in the range of certain preset limits. The response given by the reaction system according to the invention takes place in the visible range of light and can be interpreted by a measuring device or visually.
Keksinnön mukaisessa menetelmässä ja reagenssiyhdistelmässä käytetään hyväksi PQQ-entsyymejä. PQQ-entsyymit on äskettäin kuvattu uusi entsyymi ryhmä, joka käyttää prosteettisena ryhmänään pyrrolokinoliinikinonia (PQQ). PQQ-entsyymejä on löydetty lähes kaikista eliöryhmistä. Niitä on kuvattu mm. seuraavissa yleiskatsauksissa: Duine J A ja Jongejan J A,The method and reagent combination of the invention utilize PQQ enzymes. PQQ enzymes is a recently described new group of enzymes that use pyrroloquinoline quinone (PQQ) as their prosthetic group. PQQ enzymes have been found in almost all groups of organisms. They have been described e.g. in the following overviews: Duine J A and Jongejan J A,
Ann. Rev. Biochem. 5θι, 403 ( 1989); Anthony C, Adv. Microbial. Physiol. 2T_, 113, (1986); Duine et ai. Adv Enzymol. 59, 169, (1987) ja kirjassa "PQQ and Quinoproteins", toim. Jongejan J A ja Duine J A, Kluwer Academic Publishers, (1989). PQQ-dehydrogenaaseja on aikaisemmin käytetty eri analyyttien määrittämiseen fotometrisesti perinteisessä liuosanalytiikassa (esim. Ameyama M, Methods Enzymol. B_9, 20 (1982). Aikaisemmin ei ole kuvattu määritysmenetelmää, jossa olisi käytetty PQQ-entsyymejä ennalta asetetun kynnysarvon ylittävän tai alittavan ainemäärän määrittämiseen. PQQ-dehydrogenaasit voivat hapettaa analyytin useiden eri hapettimien avulla. PQQ-dehydrogenaasien elektroniakseptorina voivat toimia mm. Fe (III):n kelaatit, kuten esimerkiksi ferrisyanidi tai EDTA-kelaatti, sytokromi c, sekä useat 7 84625 kinoni-imiinivärit, kuten esimerkiksi indamiinit (Wursterin sininen), indofenolit (DCIP), atsiini- (PMS, PES, 1-metoksi-PMS), oksatsiini- (Meldolasini, Nilesini) ja tiatsiinijohdannaiset (tioniini ja metyleenisini). Tämä mahdollistaa PQQ-entsyymien käytön värinmuutoksiin perustuvassa analytiikassa suoraan, ilman muita indikaatiovaiheessa avustavia entsyymejä, tai lisättyjä epästabiileja koentsyymejä. Entsyymejä voidaan käyttää kineettisissä tai loppupistemittauksissa. Reaktiot ovat irreversiibeleitä ja nopeita, mitkä ovat analytiikan kannalta suuria etuja. Samoin etuna PQQ-entsyymejä käytettäessä on niiden suhteellisen matalat Michaelisin vakiot, esim. Acetobacter acetin MBADH:n (membraaniin sidottu alkoholidehydrogenaasi) Michaelisin vakio etanolille on 2 mmol/1 ja ferrisyanidille suuruusluokkaa 0.1 mmol/1.Ann. Rev. Biochem. 5, 403 (1989); Anthony C, Adv. Microbial. Physiol. 2T_, 113, (1986); Duine et al. Adv Enzymol. 59, 169, (1987) and in "PQQ and Quinoproteins", ed. Jongejan J A and Duine J A, Kluwer Academic Publishers, (1989). PQQ dehydrogenases have previously been used to determine various analytes photometrically in conventional solution assays (e.g., Ameyama M, Methods Enzymol. B_9, 20 (1982)). Dehydrogenases can oxidize the analyte with a variety of oxidants, including electron acceptors of PQQ dehydrogenases such as Fe (III) chelates such as ferricyanide or EDTA chelate, cytochrome c, and several 7,84625 quinoneimine dyes such as indurines. blue), indophenols (DCIP), azine (PMS, PES, 1-methoxy-PMS), oxazine (Meldolasin, Nilesin) and thiazine derivatives (thionine and methylene blue), which allows the use of PQQ enzymes in color change-based analysis directly, without further action. enzymes assisting in the indication phase, or added unstable k Enzymes can be used in kinetic or endpoint measurements. The reactions are irreversible and rapid, which are major advantages for analytics. Also advantageous when using PQQ enzymes are their relatively low Michaelis Constants, e.g. Acetobacter acetin MBADH (membrane bound alcohol dehydrogenase) has a Michaelis constant of 2 mmol / l for ethanol and an order of magnitude of 0.1 mmol / l for ferricyanide.
Yllättäen on nyt havaittu, että PQQ-dehydrogenaaseilla on selvä preferenssijärjestys eräiden elektroniakseptorien suhteen siten, että paremmin hapettuva kuluu olennaisesti loppuun ennen kuin reaktio alkaa tapahtua toisen elektroniakseptorin kanssa, ja tätä ominaisuutta voidaan käyttää raja-arvokemiaan perustuvassa indikaatiokemiassa. Keksinnön mukaisessa menetelmässä ja reagenssiyhdistelmässä käytetään okso- ja hydroksiryhmien hapetukseen osallistuvia PQQ-dehydrogenaaseja näitä ryhmiä sisältävien analyyttien määrittämisessä kynnysarvon asettavassa indikaatiokemiassa. Tällaisia analyyttejä ovat tyypillisesti mm. alkoholit, hiilihydraatit ja aldehydit.Surprisingly, it has now been found that PQQ dehydrogenases have a clear order of preference for some electron acceptors so that better oxidation is substantially consumed before the reaction begins to proceed with another electron acceptor, and this property can be used in limit chemistry-based indication chemistry. The method and reagent combination of the invention use PQQ dehydrogenases involved in the oxidation of oxo and hydroxy groups to determine analytes containing these groups in threshold chemistry. Such analytes typically include e.g. alcohols, carbohydrates and aldehydes.
Keksinnön mukaisesti PQQ:ta koentsyyminä käyttävää dehydrogenaasia käytetään tietyn määrän ylittävän analyytin pitoisuuden osoittamiseen värireaktiolla. Menetelmä perustuu kilpailevien hapettimien periaatteeseen, jossa ensimmäisessä vaiheessa kuluu ensimmäinen, olennaisesti nopeammin pelkistyvä elektroniakseptori ja sen loputtua mikäli analysoitavaa analyyttiä on jäljellä, alkaa tapahtua toinen reaktio, jossa tapahtuu havaittava värin muutos kromogeenin pelkistyessä. Ensimmäisen elektroniakseptorin määrää β 84625 muuttamalla voidaan menetelmä tai reagenssiyhdistelmä säätää osoittamaan tietyn raja-arvon ylittävää analyyttimäärää näytteessä. Samoin ensimmäistä elektroniakseptoria voidaan käyttää analyytin antaman värivasteen alentamiseen siten, että värireaktion nopeus tai värin määrä reaktion lopussa on mitattavissa analyysilaitteilla tai arvioitavissa silmämääräisesti.According to the invention, dehydrogenase using PQQ as a coenzyme is used to detect the concentration of an analyte in excess of a certain amount by a color reaction. The method is based on the principle of competing oxidants, in which a first, substantially faster-reducing electron acceptor is consumed in the first step, and at the end, if there is any analyte to be analyzed, a second reaction begins with a noticeable color change as the chromogen is reduced. By varying the amount of the first electron acceptor β 84625, the method or reagent combination can be adjusted to indicate the amount of analyte in the sample above a certain limit. Likewise, the first electron acceptor can be used to reduce the color response of the analyte so that the rate of the color reaction or the amount of color at the end of the reaction can be measured by analytical equipment or evaluated visually.
Analyytin pitoisuutta määritettäessä menetelmää voidaan käyttää PQQ-dehydrogenaasien kanssa myös kolmen elektroniakseptorin systeemissä, jossa ensimmäisessä vaiheessa kuluu raja-arvon olennaisesti määrittävä elektroniakseptori, toisessa vaiheessa häviää toisen elektroniakseptorin väri ja kolmannessa vaiheessa muodostuu kolmannesta elektroniakseptorista (kromogeenista) havaittava väri, joka mieluummin poikkeaa ensimmäisestä väristä. Näin saadaan aikaan värinmuutosketju, jota voidaan käyttää analyytin pitoisuuden arvioinnissa.To determine the analyte concentration, the method can also be used with PQQ dehydrogenases in a three-electron acceptor system in which the first electron acceptor essentially determines the cut-off, the second electron acceptor loses color, and the third electron acceptor (chromogenic) color is preferred in the third step. This provides a color change chain that can be used to estimate the analyte concentration.
Keksinnön mahdollisia sovellutusalueita ovat teollisuus (mm. elintarviketeollisuus), lääketiede, diagnostiikka, ympäristöhygienia, työterveyshuolto, liikennevalvonta jne., joissa on usein tärkeää tietää ylittääkö vai alittaako analyytin pitoisuus jonkin määrätyn arvon. Keksinnön tärkeä sovellutusalue on "joka miehen" käyttöön soveltuvat kertakäyttöiset analyysivälineet. Alan ammattimiehelle on selvää, että keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää myös perinteisessä nestekemiaa edustavassa laboratorioanalytiikassa.Possible fields of application of the invention include industry (e.g. food industry), medicine, diagnostics, environmental hygiene, occupational health care, traffic control, etc., where it is often important to know whether the analyte concentration exceeds or falls below a certain value. An important area of application of the invention is disposable analysis devices suitable for "every man" use. It is clear to a person skilled in the art that the method according to the invention can also be used in a conventional laboratory analysis representing liquid chemistry.
Keksinnön mukaisessa menetelmässä PQQ-entsyyminä toimii edullisesti PQQ-alkoholidehydrogenaasi tai PQQ-aldehydidehydrogenaasi, joiden eristys voidaan suorittaa kirjallisuudesta tunnettujen proseduurien mukaan, esim. Ameyama, M., Methods Enzymol. 89, 20 (1982). Määritettäväksi soveltuvan analyyttijoukon laajuus on riippuvainen kulloinkin valitun PQQ-entsyymin substraattispesifisyydestä. PQQ-alkoholidehydrogenaasia käytettäessä analyyttinä voi olla 9 84625 esimerkiksi etanoli, n-propanoli, n-butanoli tai 1,4-butyyliglykoli. PQQ-aldehydidehydrogenaasia käytettäessä analyyttinä voi olla esimerkiksi formaldehydi tai asetaldehydi. Ainoa ehto keksinnön mukaisella menetelmällä määritettävälle analyytille on, että se voi toimia menetelmässä kulloinkin käytetyn PQQ-entsyymin substraattina.In the method according to the invention, the PQQ enzyme is preferably PQQ alcohol dehydrogenase or PQQ aldehyde dehydrogenase, the isolation of which can be carried out according to procedures known from the literature, e.g. Ameyama, M., Methods Enzymol. 89, 20 (1982). The extent of the set of analytes to be determined depends on the substrate specificity of the PQQ enzyme selected in each case. When PQQ alcohol dehydrogenase is used, the analyte may be, for example, 9,84625 ethanol, n-propanol, n-butanol or 1,4-butyl glycol. When PQQ aldehyde dehydrogenase is used, the analyte may be, for example, formaldehyde or acetaldehyde. The only condition for the analyte to be determined by the method according to the invention is that it can serve as a substrate for the PQQ enzyme used in the method.
Kuviot 1-7 esittävät raja-arvoperiaatteen toimivuutta keksinnön mukaisen menetelmän eräillä suoritusmuodoilla. Absorbanssit (A) ajan suhteen on esitetty suhteellisina yksikköinä (optinen matka < 1 cm).Figures 1-7 show the functionality of the limit value principle in some embodiments of the method according to the invention. Absorbances (A) with respect to time are expressed in relative units (optical distance <1 cm).
Seuraavaksi kuvataan kaavamaisesti keksinnön mukaisen menetelmän erilaisia suoritusmuotoja, joissa PQQ-dehydrogenaaseja käytetään tietyn kynnysarvon ylittävän tai alittavan analyytin pitoisuuden osoittamiseen. .Keksintö ei rajoitu esitettyihin suoritusmuotoihin. Alan ammattimiehelle ilmeisiä variaatioita ja modifikaatioita voidaan suorittaa poikkeamatta keksinnön hengestä tai laajuudesta.Various embodiments of the method of the invention will now be schematically described, in which PQQ dehydrogenases are used to detect the concentration of analyte above or below a certain threshold. The invention is not limited to the embodiments shown. Variations and modifications apparent to those skilled in the art may be made without departing from the spirit or scope of the invention.
Keksinnön mukaisen menetelmän ensimmäinen suoritusmuoto voidaan kuvata seuraavasti:A first embodiment of the method according to the invention can be described as follows:
E-PQQE-PQQ
(1) , d + Slox ► A0 x + Slred(1), d + Slox ► A0 x + Slred
E-PQQE-PQQ
( 3 ) Ar , d + S2 0 x * A0 x + S2 r e d jossa E-PQQ on PQQ-entsyymi, Slox ja Slred on kynnysarvon asettavan ensimmäisen elektroniakseptorin S2 hapettunut ja pelkistynyt muoto, S2ox ja S2ced on vastaavasti kromogeenin S2 hapettunut ja pelkistynyt muoto, Ar#d ja Aox on analyytin pelkistynyt ja hapettunut muoto, S2 on E-PQQ:lie parempi hapetin kuin S2. Tällöin ensimmäisessä vaiheessa kuluu ensimmäinen elektroniakseptori S2 loppuun, ja jos analyyttiä on tämän jälkeen jäljellä, alkaa vasta kulua kromogeeni S2.(3) Ar, d + S2 0 x * A0 x + S2 red where E-PQQ is the PQQ enzyme, Slox and Slred are the oxidized and reduced forms of the first electron acceptor S2 setting the threshold, S2ox and S2ced are the oxidized and reduced forms of chromogen S2, respectively , Ar # d and Aox are the reduced and oxidized form of the analyte, S2 is a better oxidant than S2 for E-PQQ. In this case, in the first step, the first electron acceptor S2 is consumed, and if there is any analyte left, the chromogen S2 only begins to run out.
10 8462510 84625
Sx:n määrä reaktiossa on raja-arvoa määräävä. Sx on väritön tai värillinen. S2:n määrä on reaktiossa suhteellisen pieni, ja sen pelkistyessä tapahtuu helposti havaittava värinmuutos, jonka havaitsemisesta ei haittaa mahdollinen Sx:n väri. Toivottavaa on, että S2:n molaarinen absorptiviteetti on mahdollisimman suuri. Substraatin S3 määrää muuttamalla voidaan menetelmä säätää osoittamaan tietyn raja-arvon ylittävää analyyttimäärää (Ared) näytteessä. Slred ja S2ox voivat myös reagoida keskenään:The amount of Sx in the reaction is critical. Sx is colorless or colored. The amount of S2 in the reaction is relatively small, and when it is reduced, there is an easily detectable color change, the detection of which is not hindered by the possible color of Sx. It is desirable that the molar absorbance of S2 be as high as possible. By changing the amount of substrate S3, the method can be adjusted to indicate the amount of analyte (Ared) in the sample exceeding a certain limit. Slred and S2ox can also react with each other:
E-PQQE-PQQ
(!) Ar.d + Slox > Aox + Slred (2) slred + s2ox < slox + s2red(!) Ar.d + Slox> Aox + Slred (2) slred + s2ox <slox + s2red
E-PQQE-PQQ
(3) Ar # d + S2ox * A0 x + S2ted Tällöin reaktiotasapainon pitää olla erittäin voimakkaasti vasemmalla. Reaktiossa aluksi kuluu S3 , ja jos Ar,d:iä on ylimäärin, tapahtuu värinmuutos S2:n pelkistyessä.(3) Ar # d + S2ox * A0 x + S2ted In this case, the reaction equilibrium must be very strongly to the left. The reaction initially consumes S3, and if Ar, d is present in excess, a color change occurs as S2 is reduced.
Yllä esitetyissä reaktioissa (1)-(3) Sj voi olla jokin Fe(III):n kelaatti, edullisesti ferrisyanidi, S2 voi olla indofenoliväri, edullisesti DCIP (dikloorifenoli-indofenoli ) tai oksatsiiniväri, edullisesti Meldolasini.In the above reactions (1) to (3), S 1 may be a chelate of Fe (III), preferably ferricyanide, S 2 may be an indophenol dye, preferably DCIP (dichlorophenol-indophenol) or an oxazine dye, preferably Meldolasin.
Keksinnön mukaisen menetelmän toista suoritusmuotoa voidaan kuvata seuraavasti:Another embodiment of the method according to the invention can be described as follows:
E-PQQE-PQQ
Ared + Slox Aox + SlredAred + Slox Aox + Slred
E-PQQE-PQQ
(5) Ared + S2ox * Aox + S2red (6) S2r,d + S3ox S2ox + s3red S3 on ensimmäinen elektroniakseptori, joka kuluu loppuun ennenkuin S2 alkaa toimia hapettimena. S2 toimii tässä redoxkatalyyttinä Ared:n ja kromogeenin S3 :n välillä. Tässä 11 84625 suoritusmuodossa St voi olla jokin Fe(III):n kelaatti, edullisesti ferrisyanidi, tai indofenoliväri, edullisesti DCIP. S2 voi olla fenatsiiniväri, edullisesti PMS (fenatsiinimetosulfaatti), 1-metoksi-PMS tai PES (fenatsiinietosulfaatti), tai oksatsiiniväri, edullisesti Meldolasini. S3 voi olla tetratsoliumväri, edullisesti MTT (tiatsolyylisininen) tai INT (p-jodonitrotetratsolium-violetti), tai indofenoliväri (edellyttäen että S2 ei ole indofenoliväri), edullisesti DCIP.(5) Ared + S2ox * Aox + S2red (6) S2r, d + S3ox S2ox + s3red S3 is the first electron acceptor that runs out before S2 begins to act as an oxidant. Here, S2 acts as a redox catalyst between Ared and the chromogen S3. In this embodiment of 11,84625, St may be a chelate of Fe (III), preferably ferricyanide, or an indophenol dye, preferably DCIP. S2 may be a phenazine dye, preferably PMS (phenazine methosulfate), 1-methoxy-PMS or PES (phenazine ethosulfate), or an oxazine dye, preferably Meldolasin. S3 may be a tetrazolium dye, preferably MTT (thiazolyl blue) or INT (p-iodonitrotetrazolium violet), or indophenol dye (provided that S2 is not an indophenol dye), preferably DCIP.
Keksinnön mukaisen menetelmän kolmannessa suoritusmuodossa indikaatiokemiaa voidaan käyttää myös kolmen kilpailevan substraatin systeeminä, jolloin voidaan saada aikaan eri värejä ja värisävyjä testivyöhykkeessä.In a third embodiment of the method according to the invention, the indication chemistry can also be used as a system of three competing substrates, whereby different colors and shades of color can be obtained in the test zone.
Kaaviona tämä suoritusmuoto voidaan esittää seuraavasti:As a diagram, this embodiment can be represented as follows:
E-PQQE-PQQ
("7) Ar · d + ®lox * ^ox + ®lnd (E-PQQ) (8) Ar.d + S2ox “* Aox + S2r.d (tai slr.d + s2ox slox + s2r.d) (9) Ar · d + ®3ox * Ao x + 83red S2 ja S2 on väritön tai värillinen. S3:n määrä on reaktiossa suhteellisen pieni, ja sen pelkistyessä tapahtuu helposti havaittava värinmuutos, jonka havaitsemista ei haittaa mahdollinen S2:n ja S2:n väri. Substraatin S2 tai S2 määrää muuttamalla voidaan menetelmä säätää osoittamaan tietyn raja-arvon ylittävää analyytin määrää näytteessä. Aluksi reaktiossa kuluu ensimmäinen elektroniakseptori S2. Tämän jälkeen alkaa kulua toinen elektroniakseptori S2 ja lopuksi "huonoin" substraatti S3, joka on kromogeeni (tai redoxkatalyytti + kromogeeni), ja muuttaa pelkistyessään väriä. Edellytyksenä indikaation onnistumiselle on, että i2 84625 pelkistyneet St ja S2 eivät aiheuta S3:n värinmuutosta.("7) Ar · d + ®lox * ^ ox + ®lnd (E-PQQ) (8) Ar.d + S2ox" * Aox + S2r.d (this is slr.d + s2ox slox + s2r.d) ( 9) Ar · d + ®3ox * Ao x + 83red S2 and S2 are colorless or colored, the amount of S3 in the reaction is relatively small, and when it is reduced, an easily detectable color change occurs, the detection of which is not hindered by possible S2 and S2 By changing the amount of substrate S2 or S2, the method can be adjusted to indicate the amount of analyte in the sample above a certain limit, first the first electron acceptor S2 is consumed in the reaction, then the second electron acceptor S2 is consumed and finally the "worst" substrate S3 is chromogenic (or redox catalyst + chromogen), and changes color as it is reduced.A prerequisite for successful indication is that i2 84625 reduced St and S2 do not cause discoloration of S3.
Sj voi olla tässä jokin Fe(m):n kelaatti, edullisesti ferrisyanidi, S2 voi olla indofenoliväri, edullisesti DCIP (dikloorifenoli-indofenoli), S3 voi olla yhdistelmä fenatsiiniväri (redoxkatalyytti) + tetratsoliumväri (kromogeeni), edullisesti PMS + INT (p-jodonitrotetratsolium-violetti ) .S 1 here may be a chelate of Fe (m), preferably ferricyanide, S 2 may be an indophenol dye, preferably DCIP (dichlorophenol-indophenol), S 3 may be a combination of a phenazine dye (redox catalyst) + a tetrazolium dye (chromogen), preferably PMS + INT (p- iodonitrotetrazolium violet).
Keksinnön mukaisen menetelmän tarpeelliset komponentit tai reagenssit saatetaan yhteen sopivassa väliaineessa, kuten esimerkiksi liuoksessa, mutta edullisimmin ne impregnoidaan kiinteään kantajaan. Tällaiset kiinteät kantajat ovat tunnettuja kirjallisuudesta. Tyypillisesti keksinnön mukainen testiväline tai reagenssiyhdistelmä analyytin määrittämiseen on kertakäyttöinen ja se sisältää kaikki yllä mainitut keksinnön mukaisen menetelmän tarpeelliset reagenssit ja entsyymit sekä kiinteän kantajan. Tyypillisesti testi suoritetaan saattamalla näyte yhteen kiinteän kantajan kanssa, joka sisältää tarpeelliset reagenssit ja entsyymit. Näytemateriaali voi olla kaasumainen tai nestemäinen, esim. elimistön neste, kuten sylki, plasma tai virtsa, tai uloshengitysilma, työpaikan tai asuinympäristön ilma.The necessary components or reagents of the process of the invention are brought together in a suitable medium, such as a solution, but most preferably they are impregnated on a solid support. Such solid carriers are known in the literature. Typically, the test device or reagent combination of the invention for analyte determination is disposable and includes all of the above reagents and enzymes necessary for the method of the invention, as well as a solid support. Typically, the test is performed by contacting the sample with a solid support containing the necessary reagents and enzymes. The sample material may be gaseous or liquid, e.g., a body fluid such as saliva, plasma, or urine, or exhaled air, workplace or residential air.
Testissä raja-arvon ylitys tai alitus näkyy herkkänä ON/EI-tyyppisenä helposti tulkittavana värin muutoksena.In the test, exceeding or falling below the limit value is shown as a sensitive ON / OFF type with an easy-to-interpret color change.
Värin muutos voidaan todeta silmämääräisesti, mutta myös sopivan instrumentaation avulla, esimerkiksi kolorimetrisesti tai fluorometrisesti.The color change can be detected visually, but also by suitable instrumentation, for example colorimetrically or fluorometrically.
Menetelmään kuuluvat reagenssit tai komponentit voidaan tunnetuilla tekniikoilla yhdistää kantajaan, esim. kuivata erilaisille pinnoille tai imeyttää huokoisiin materiaaleihin ennen kuivausta. Kuivaa reagenssivyöhykettä valmistettaessa voidaan lisäksi käyttää yleisesti tunnettuja inerttejä kuivausta helpottavia apuaineita, reagenssien liukenemista nopeuttavia aineita sekä entsyymin stabilaattoreita ja detergenttejä.The reagents or components of the process can be combined with a carrier by known techniques, e.g., dried on various surfaces or impregnated into porous materials prior to drying. In addition, well-known inert drying aids, reagent dissolution accelerators, and enzyme stabilizers and detergents can be used in the preparation of the dry reagent zone.
Testivälineeseen sopiviin kantajamateriaaleihin kuuluvat i3 84625 kaikki tämän tyyppisissä testeissä yleisesti käytetyt materiaalit. Tyypillisimpiä materiaaleja ovat lasi, puu, metalli, tekstiili, gelatiini, filtteripaperi, huokoiset selluloosatuotteet ja muovimateriaalit. Kantajan materiaali ei ole keksinnössä kriittinen, vaan periaatteessa se voi olla mikä hyvänsä materiaali, joka pystyy toimimaan kantajana systeemin reagensseille ja komponenteille.Suitable carrier materials for the test device include the i3 84625, all materials commonly used in this type of test. The most typical materials are glass, wood, metal, textile, gelatin, filter paper, porous cellulose products and plastic materials. The carrier material is not critical to the invention, but can in principle be any material capable of acting as a carrier for the reagents and components of the system.
Määrityksen suorittamista varten voidaan testivälineessä myös käyttää hyväksi tunnettuja järjestelmiä, joiden avulla kantajaan saadaan määrätty toisinnettavissa oleva määrä nestemäistä näytettä. Tällainen järjestelmä voi perustua esim. hydraatioon tai kapillaari-ilmiöön, ja niitä on esitetty mm. patenttijulkaisussa WO 88/04694. Toisaalta keksinnön mukaista menetelmää ja testivälinettä voidaan soveltaa myös siten, ettei kantajan kanssa kosketuksiin joutuvan näytteen määrän tarvitse olla vakiomittainen.For the purpose of the assay, the test device may also use well-known systems to provide a predetermined amount of liquid sample to the support. Such a system can be based on e.g. hydration or capillary action, and they have been shown e.g. in WO 88/04694. On the other hand, the method and test device according to the invention can also be applied in such a way that the amount of sample in contact with the carrier does not have to be constant.
Tällöin määrityksessä seurataan, tapahtuuko testivälineessä värinmuutos tietyn aikavälin kuluessa. Tällaista sovellutusta voidaan tyypillisesti käyttää esim. ilman formaldehydipitoisuuden mittauksessa.In this case, the assay monitors whether a color change occurs in the test device over a period of time. Such an application can typically be used e.g. in the measurement of the formaldehyde content of the air.
Keksinnön mukaisessa testivälineessä voi myös olla erillisiä kuivattuja indikaattorialueita, jotka osoittavat kukin erillistä määrättyä raja-arvoa. Eräs menetelmän sovellutus on aplikoida raja-arvon määrittävä reagenssi jatkuvasti muuttuvassa pitoisuudessa (pitoisuusgradientti) indikaattori-vyöhykkeeseen, jolloin alueen, jossa analyytin raja-arvo ylittyy ja alueen, jossa se alittuu, välille muodostuu värinmuutoskohta. Tällöin voidaan saada näytteen analyyttipitoisuuden tarkka numeerinen arvo vertaamalla värinmuutoskohtaa ennalta kalibroituun asteikkoon.The test device according to the invention may also have separate dried indicator areas, each of which indicates a separate defined limit value. One application of the method is to apply a limiting reagent at a continuously varying concentration (concentration gradient) to the indicator zone, thereby forming a color change point between the region where the analyte limit is exceeded and the region where it falls below. In this case, the exact numerical value of the analyte content of the sample can be obtained by comparing the color change point with a pre-calibrated scale.
Keksintöä havainnollistetaan seuraavilla esimerkeillä rajoittamatta keksintöä kuitenkaan niihin.The invention is illustrated by the following examples without, however, limiting the invention thereto.
14 8462514 84625
Esimerkki 1Example 1
Etanolin määritys Acetobacter acetin PQQ-alkoholidehydro-genaasilla (MBADH).Determination of ethanol by Acetobacter acetin PQQ alcohol dehydrogenase (MBADH).
Sx eli raja-arvon asettajana toimiva ensimmäinen elektroniakseptori on ferrisyanidi ja kromogeeninä toimiva S2 on DCIP (dikloorifenoli-indofenoli). Ferrisyanidi ja DCIP ovat molemmat MBADH:n substraatteja ja sen lisäksi ne ovat redox-tasapainossa keskenään tasapainon ollessa voimakkaasti vasemmalla pH 6:ssa. Jos reaktiossa jää kulumatonta ferrisyanidia (ylimäärin etanoliin verrattuna) DCIP pysyy hapettuneessa muodossa S2ox, joka on voimakkaan sininen. Pelkistynyt muoto S2red on väritön. A.acetin PQQ-aldehydidehydrogenaasi (MBALDH) käyttäytyy kokeessa analogisesti.Sx, i.e. the first electron acceptor acting as a threshold, is ferricyanide and S2 as a chromogen is DCIP (dichlorophenol-indophenol). Ferricyanide and DCIP are both substrates of MBADH and, in addition, are in redox equilibrium with each other being strongly left at pH 6. If unused ferricyanide (excess compared to ethanol) remains in the reaction, DCIP remains in the oxidized form S2ox, which is strongly blue. The reduced form S2red is colorless. A.acet's PQQ aldehyde dehydrogenase (MBALDH) behaves analogously in the experiment.
Kyveteissä olivat seuraavat reagenssipitoisuudet: DCIPThe cuvettes contained the following reagent concentrations: DCIP
0.16 mmol/1, etanolia 0.45 mmol/1, Mcllvainen puskuri pH0.16 mmol / l, ethanol 0.45 mmol / l, Mclainen buffer pH
6.0 40 mmol/1, Triton X-100 1.3 %, MBADH 620 U/l sekä ferrisyanidia kyveteissä 1-6: 0, 0.31 , 0.94, 1.09, 1.25 ja 1.56 mmol/1. Kuvassa 1 on esitetty absorbanssimittauksen tulokset kyveteissä 1-6 mittausaallonpituuden ollessa 570 nm. Kyveteissä 1 ja 2 DCIP:n väri hävisi suhteellisen nopeasti, kyvetissä 3 väheni, mutta säilyi voimakkaana ja kyveteissä 4, 5 ja 6 säilyi voimakkaan sinisenä. Kyvetissä 2 ja 3 havaitaan viiveaika, jolloin DClP:n määrä ei muutu, mutta ferrisyanidia kuluu.6.0 40 mmol / l, Triton X-100 1.3%, MBADH 620 U / l and ferricyanide in cuvettes 1-6: 0, 0.31, 0.94, 1.09, 1.25 and 1.56 mmol / l. Figure 1 shows the results of the absorbance measurement in cuvettes 1-6 at a measurement wavelength of 570 nm. In cuvettes 1 and 2, the color of DCIP disappeared relatively rapidly, in cuvette 3 it decreased but remained strong, and in cuvettes 4, 5, and 6 it remained strongly blue. In cuvettes 2 and 3, a delay time is observed when the amount of DClP does not change, but ferricyanide is consumed.
Esimerkki 2Example 2
Kun esimerkin 1 mukaiseen reaktioseokseen lisätään 0,3 mmol/1 PMS:ää tai 0,6 mmol/1 l-metoksi-PMS:ää, DCIP:n pelkistymisnopeus noin kaksinkertaistuu. Ferrisyanidin pelkistymisnopeuteen eivät fenatsiinivärilisäykset sen sijaan vaikuta.When 0.3 mmol / l PMS or 0.6 mmol / l 1-methoxy-PMS is added to the reaction mixture of Example 1, the rate of reduction of DCIP is approximately doubled. The rate of reduction of ferricyanide, on the other hand, is not affected by phenazine color additions.
15 8462515 84625
Esimerkki 3Example 3
Esimerkki kuvaa keksinnön mukaisen menetelmän toista suoritusmuotoa, jossa ensimmäisenä elektroniakseptorina S3 on DCIP, redoxkatalyyttinä S2 on PMS ja kromogeeninä S3 on INT. Kyveteissä olivat seuraavat reagenssipitoisuudet: PMS 0,3 mmol/1, INT 0,32 mmol/1, etanolia 0,5 mmol/1, Mcllvainen puskuri (pH 7) 40 mmol/1, Triton X-100 1,3 %, MBADH 700 U/l sekä DCIP:iä kyveteissä 1 - 6: 0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12 ja 0,16 mmol/1. Kuvassa 2 on esitetty absorbanssimittauksen tulokset kyveteissä 1-6 mittausaallonpituuden ollessa 450 nm, jossa DCIP:n sininen väri ei vaikuta merkittävästi absorbanssiin. Kuvasta nähdään, että punaista 450 nm:ssä absorboivaa formatsaaniväriä muodostuu vasta kun sininen DCIP on kulunut reaktioseoksesta pois. Tämä voitiin havaita kyveteistä myös visuaalisesti.The example illustrates another embodiment of the process according to the invention, in which the first electron acceptor S3 is DCIP, the redox catalyst S2 is PMS and the chromogen S3 is INT. The cuvettes contained the following reagent concentrations: PMS 0.3 mmol / l, INT 0.32 mmol / l, ethanol 0.5 mmol / l, Mclpain buffer (pH 7) 40 mmol / l, Triton X-100 1.3%, MBADH 700 U / l and DCIP in cuvettes 1 to 6: 0, 0.02, 0.04, 0.08, 0.12 and 0.16 mmol / l. Figure 2 shows the results of the absorbance measurement in cuvettes 1-6 at a measurement wavelength of 450 nm, where the blue color of DCIP does not significantly affect the absorbance. It can be seen from the figure that a red formazan dye absorbing at 450 nm is formed only after the blue DCIP has passed out of the reaction mixture. This could also be observed visually from the cuvettes.
Lisäkokeessa etanolin määrä laskettiin puoleen ja DCIP:n määrä nostettiin kolminkertaiseksi. Tällöin kun molaarinen DCIP/EtOH-suhde oli 1:1, saatiin vaalean ruskea siirtymäväri, joka muodostui alle 10 minuutissa ja oli stabiili vähintään 30 min. Kun DCIP-pitoisuus oli alle etanolipitoisuuden, reaktioseos muuttui nopeasti punaiseksi, ja määräsuhteiden ollessa toisinpäin reaktioseos jäi siniseksi. Nämä värit olivat stabiileja.In a further experiment, the amount of ethanol was halved and the amount of DCIP was tripled. When the molar DCIP / EtOH ratio was 1: 1, a light brown transition color was obtained which formed in less than 10 minutes and was stable for at least 30 minutes. When the DCIP concentration was below the ethanol content, the reaction mixture rapidly turned red, and with the proportions reversed, the reaction mixture remained blue. These colors were stable.
Esimerkki 4Example 4
Etanolin raja-arvokoe käyttäen MBADH/MBALDH-kombinaatiota.Ethanol limit test using the MBADH / MBALDH combination.
Kyveteissä olivat seuraavat reagenssipitoisuudet: MTT 0.2 mmol/1, PMS 0.18 mmol, ferrisyanidia 43 mmol/1, 0.3 mol/1 meripihkahappopuskuri pH 4.5, Triton X-100 0.07 % sekä etanolia kyveteissä 1-6 9.7, 9.7, 10.2, 10.77, 11.3 ja 11.8 mmol/1. Entsyymiaktiivisuus kyveteissä oli: MBADH:ta 35000 U/l ja MBALDH:ta 5700 U/l. Kyvetissä 2 ei ollut ie 84625 entsyymiä. Kuvassa 3 on esitetty absorbanssimittauksen tulokset kyveteissä 1-6 mittausaallonpituuden ollessa 570 nm. Reaktion loputtua kyvetit 1, 2 ja 3 olivat värittömiä, kyvetissä 4 näkyi häivä sinistä ja kyvetit 5 ja 6 olivat voimakkaan sinisiä. Sinisen värin muodostuminen alkoi, kun neljä ferrisyanidimolekyyliä oli kulunut yhtä etanoli-molekyyliä kohti. Määrityssysteemissä etanoli muuttui etikka-hapoksi. Tässä esimerkissä pystyttiin visuaalisesti erottamaan alle 5 %:n etanolipitoisuuserot käytetyissä olosuhteissa.The cuvettes had the following reagent concentrations: MTT 0.2 mmol / l, PMS 0.18 mmol, ferricyanide 43 mmol / l, 0.3 mol / l succinic acid buffer pH 4.5, Triton X-100 0.07% and ethanol in cuvettes 1-6 9.7, 9.7, 10.2, 10.77, 11.3 and 11.8 mmol / l. The enzyme activity in the cuvettes was: MBADH 35,000 U / l and MBALDH 5700 U / l. Cuvette 2 did not contain the 84625 enzyme. Figure 3 shows the results of the absorbance measurement in cuvettes 1-6 at a measurement wavelength of 570 nm. Upon completion of the reaction, cuvettes 1, 2, and 3 were colorless, cuvette 4 showed a fading blue, and cuvettes 5 and 6 were intense blue. The formation of a blue color began after four molecules of ferricyanide were consumed per molecule of ethanol. In the assay system, ethanol was converted to acetic acid. In this example, differences in ethanol content of less than 5% could be visually distinguished under the conditions used.
Esimerkki 5Example 5
Etanolin raja-arvokoe lähes puhtaalla MBADH-preparaatilla.Limit test for ethanol with almost pure MBADH preparation.
••
Kyveteissä olivat seuraavat reagenssipitoisuudet: MTT 0.2 mmol/1, PMS 0.18 mmol/1, etanoli 1.95 mmol/1, 0.28 mol/1 sukkinaattipuskuri pH 4.5, Triton X-100 1.1 % ja MBADH-aktiivisuus 2300 U/l. Kyveteissä 1-6 vaihdeltiin ferrisyanidin määrää: 0, 1.11, 3.34, 3.89, 4.44 ja 5.56 mmol/1. Kuvassa 4 on esitetty absorbanssimittauksen tulokset kyveteissä 1-6 mittausaallonpituuden ollessa 570 nm. Kyveteissä 1, 2 ja 3 muodostui sinistä väriä sitä hitaammin, mitä enemmän ferrisyanidia oli. Kyvetissä 4 värinmuodostus oli hyvin hidasta ja kyveteissä 5 ja 6 ei muodostunut sinistä väriä.The cuvettes had the following reagent concentrations: MTT 0.2 mmol / l, PMS 0.18 mmol / l, ethanol 1.95 mmol / l, 0.28 mol / l succinate buffer pH 4.5, Triton X-100 1.1% and MBADH activity 2300 U / l. In cuvettes 1-6, the amount of ferricyanide was varied: 0, 1.11, 3.34, 3.89, 4.44 and 5.56 mmol / l. Figure 4 shows the results of the absorbance measurement in cuvettes 1-6 at a measurement wavelength of 570 nm. In cuvettes 1, 2 and 3, the more blue ferricyanide was formed the slower the blue color. In cuvette 4, color formation was very slow and in cuvettes 5 and 6 no blue color was formed.
Sinistä väriä alkoi muodostua kokeessa, kun etanolimolekyyliä kohti oli kulunut kaksi molekyyliä ferrisyanidia ja reaktioseoksessa oli vielä jäljellä etanolia. Etanoli hapettui reaktiossa asetaldehydiksi.A blue color began to form in the experiment when two molecules of ferricyanide had been consumed per molecule of ethanol and ethanol was still present in the reaction mixture. Ethanol was oxidized in the reaction to acetaldehyde.
Esimerkki 6 17 84625Example 6 17 84625
Asetaldehydin raja-arvokoe aldehydidehydrogenaasilla.Limit test for acetaldehyde with aldehyde dehydrogenase.
Kyveteissä olivat seuraavat reagenssipitoisuudet: MMT 0.19 mmol/1, PMS 0.17, asetaldehydi 0.42 mmol/11, 0.27 mmol/1 sukkinaattipuskuri pH 4.5, Triton X-100 1.1 % sekä aldehydidehydrogenaasiaktiivisuus oli 2000 U/l. Ferrisyanidin määrä oli kyveteissä 1-6: 0, 0.22, 0.67, 0.78, 0.89 ja 1.11 mmol/1. Kuvassa 5 on esitetty absorbanssimittauksen tulokset kyveteissä 1-6 mittausaallonpituuden ollessa 570 nm. Kyveteissä 1-4 havaittiin melko nopea voimakas värinmuodostuminen. Kyvetissä 5 alkoi muodostua pitkän viiveen jälkeen hitaasti hailakka sininen väri ja kyvetti 6 säilyi keltaisena.The cuvettes had the following reagent concentrations: MMT 0.19 mmol / l, PMS 0.17, acetaldehyde 0.42 mmol / 11, 0.27 mmol / l succinate buffer pH 4.5, Triton X-100 1.1% and aldehyde dehydrogenase activity was 2000 U / l. The amount of ferricyanide in the cuvettes was 1-6: 0, 0.22, 0.67, 0.78, 0.89 and 1.11 mmol / l. Figure 5 shows the results of the absorbance measurement in cuvettes 1-6 at a measurement wavelength of 570 nm. In cuvettes 1-4, a fairly rapid strong color formation was observed. After a long delay, a slowly pale blue color began to form in cuvette 5 and cuvette 6 remained yellow.
Esimerkki 7Example 7
Formaldehydin määrittäminen aldehydidehydrogenaasilla nestemäisestä näytteestä.Determination of formaldehyde by aldehyde dehydrogenase from a liquid sample.
Kyveteissä olivat seuraavat reagenssipitoisuudet: MTT 0.19 mmol/1, PMS 0.17 mmol/1, formaldehydi 0.42 mmol/1, 0.27 mmol/1 sukkinaattipuskuria pH 4.5, Triton X-100 1.1 % sekä kyveteissä 1- 6 aldehydidehydrogenaasiaktii-visuutta (määritettynä asetaldehydidehydrogenaasiaktiivi-suutena) 2100 U/l. Kyvetissä 7 ei ollut formaldehydia. Ferrisyanidimäärä oli kyveteissä 1 - 7: 0, 0.21, 0.64, 0.72, 0.85, 1.06 ja 0.21 mmol/1. Kuvassa 6 on esitetty absorbanssimittauksen tulokset kyveteissä 1-7 mittausaallonpituuden ollessa 570 nm. Kyveteissä 1-5 tapahtui sinisen värin muodostuminen. Absorbanssin hidas kasvu esim. kyveteissä 6 ja 7, joissa ei ollut sinisen värin muodostumista, johtui kyvetteihin muodostuneesta vaaleasta sakasta.The cuvettes had the following reagent concentrations: MTT 0.19 mmol / l, PMS 0.17 mmol / l, formaldehyde 0.42 mmol / l, 0.27 mmol / l succinate buffer pH 4.5, Triton X-100 1.1%, and cuvettes 1-6 aldehyde dehydrogenase activity (determined by acetaldehyde dehydrogenase hydrogenation) ) 2100 U / l. Cuvette 7 was free of formaldehyde. The amount of ferricyanide in the cuvettes was 1 to 7: 0, 0.21, 0.64, 0.72, 0.85, 1.06 and 0.21 mmol / l. Figure 6 shows the results of the absorbance measurement in cuvettes 1-7 at a measurement wavelength of 570 nm. In cuvettes 1-5, a blue color formed. The slow increase in absorbance, e.g. in cuvettes 6 and 7, which did not form a blue color, was due to the pale precipitate formed in the cuvettes.
18 8462518 84625
Esimerkki 8Example 8
Etanolin raja-arvomääritys: kuivakemian sovellutus.Limit determination of ethanol: application of dry chemistry.
Polystyreenipinnalle aplikoitiin 13 μΐ reaktioseosta, joka sisälsi : sukkinaattipuskuria 0.5 mol/1 pH 4.5 760 μΐ MTT 8.7 mmol/1 30 μ PMS 7.8 mmol/1 30 μ ferrisyanidia 0.5 mol/1 58 μA 13 μΐ reaction mixture was applied to the polystyrene surface containing: succinate buffer 0.5 mol / l pH 4.5 760 μΐ MTT 8.7 mmol / l 30 μ PMS 7.8 mmol / l 30 μ ferricyanide 0.5 mol / l 58 μ
Triton X 100 10 % 10// MBADH 180000 300 μ Välittömästi reaktioseos ilmakuivattiin 40°:ssa ilmaa puhaltamalla.Triton X 100 10% 10 // MBADH 180000 300 μ Immediately the reaction mixture was air dried at 40 ° by blowing air.
Kuivattuihin reagensseihin pipetoitiin 13 μΐ etanoliliuoksia, joissa oli etanolia 8.3 ja 6.2 mmol/1. Ensimmäiseen muodostui sininen väri noin kahdessa minuutissa ja toiseen ei muodostunut sinistä väriä. Pitoisuus, jossa värinmuutos tapahtuu, on säädettävissä muuttamalla ferrisyanidin pitoisuutta ylläkuvatussa esimerkissä.13 μΐ ethanolic solutions of 8.3 and 6.2 mmol / l ethanol were pipetted into the dried reagents. The first formed a blue color in about two minutes and the second did not form a blue color. The concentration at which the color change occurs is adjustable by changing the concentration of ferricyanide in the example described above.
Esimerkki 9Example 9
Aldehydidehydrogenaasin käyttö ilman formaldehydipitoisuuden määrittämisessä. Värin muutosnopeuteen vakiotormaldehydipi toisuudessa voidaan vaikuttaa ferrisyanidin määrää muuttamalla tai kantajamateriaalin valinnoilla.Use of aldehyde dehydrogenase in the determination of air formaldehyde content. The rate of color change in standard toraldehyde dipality can be affected by changing the amount of ferricyanide or by the choice of carrier material.
Koe 1Test 1
Formaldehydipitoisuus kammion ilmatilassa oli noin 130 mg/m3 (* 100 x HTP15 min formaldehydille).The formaldehyde concentration in the chamber air was about 130 mg / m3 (* 100 x HTP15 min for formaldehyde).
Käytetyt liuokset: 19 84625Solutions used: 19,84625
Sukkinaattipuskuri 0.5 mol/1, pH 4,5 MTT 3.6 mg/ml PMS 2,5 mg/ml Triton X 100 10 %Succinate buffer 0.5 mol / l, pH 4.5 MTT 3.6 mg / ml PMS 2.5 mg / ml Triton X 100 10%
Ferrisyanidi 10 mmol/1 ALDH:ta 16000 U/lFerrisyanide 10 mmol / l ALDH 16000 U / l
Reaktioseos:The reaction mixture of:
Sukkinaattipuskuri 125 μΐSuccinate buffer 125 μΐ
Triton X 100 25 " MTT 30 " PMS 10 " 38 //l:aan seosta lisättiin 20 μ\ ALDH: ta ja kulloinkin käytetty ferrisyanidimäärä (2 μΐ, 3 μΐ ja 4μ1). Tästä seoksesta otettiin PVC-muovissa olevaan kuoppaan (=TK), UltraBind MSV-450-paperiliuskalle (=UB) ja lasikuitu-paperiliuskalle <»LK) 5 μΐ.To Triton X 100 25 "MTT 30" PMS 10 "38 μl of the mixture was added 20 μl of ALDH and the amount of ferricyanide used in each case (2 μΐ, 3 μΐ and 4μ1). From this mixture was taken into a well in PVC plastic (= TK ), UltraBind for MSV-450 paper strip (= UB) and fiberglass paper strip <»LK) 5 μΐ.
Reaktioseoksen pipetoimisen jälkeen indikaattorivyöhykkeet asetettiin formaldehydia ilmatilassaan sisältävään kammioon. Värin muutosajat otettiin ylös. Tulokset on esitetty . taulukossa 1.After pipetting the reaction mixture, the indicator zones were placed in a chamber containing formaldehyde in their atmosphere. Color change times were taken up. The results are presented. in Table 1.
Taulukko 1 Värin muutosajat formaldehydin määrityksessä:Table 1 Color change times in the formaldehyde determination:
Ferrisyanidi/ Värin muutosaika/sFerrisyanide / Color change time / s
mmol x 10-6 koe UB LK TKmmol x 10-6 tissue UB LK TK
1.7 20 25 45 2.5 40 35 70 3.4 55 45 801.7 20 25 45 2.5 40 35 70 3.4 55 45 80
Vastaavassa kokeessa liuskaan, jossa ei ollut entsyymiä, ei muodostunut väriä. Taulukosta nähdään, että värin muutosaika on riippuvainen vakioformaldehydipitoisuudessa indikaattori- 20 84625 vyöhykkeen ferrisyanidimäärästä sekä käytetystä kantajamateriaalista.In a similar experiment, no color formed on the enzyme-free strip. It can be seen from the table that the color change time depends on the amount of ferricyanide in the indicator zone at a constant formaldehyde content and on the support material used.
Koe 2.Test 2.
Tässä kokeessa testattiin indikaattorivyöhykkeen värin muutosnopeutta hyvin pienellä formaldehydipitoisuudella ilmassa. Formaldehydipitoisuus kammion ilmatilassa oli noin 1,3 mg/m3 (=HTP15 min formaldehydille).In this experiment, the rate of color change of the indicator zone was tested with a very low formaldehyde concentration in air. The formaldehyde concentration in the chamber air was about 1.3 mg / m3 (= HTP15 min for formaldehyde).
Käytetyt liuokset olivat muuten samat, paitsi MTT:n pitoisuus oli 0.6 mg/ml ja PMS:n pitoisuus 1,20 mg/ml.The solutions used were otherwise the same, except that the MTT concentration was 0.6 mg / ml and the PMS concentration was 1.20 mg / ml.
Reaktioseos:The reaction mixture of:
Sukkinaattipuskuri 31,25 μΐ MTT 7,5 " PMS 2,5 "Succinate buffer 31.25 μΐ MTT 7.5 "PMS 2.5"
Triton X 100 6,25 "Triton X 100 6.25 "
Ferrisyanidi 4,0 " ALDH 15,0 "Ferrisyanide 4.0 "ALDH 15.0"
Yhteensä 66,5 μΐA total of 66.5 μΐ
Reaktioseos voi sisältää lisäksi stabilaattoreita.The reaction mixture may additionally contain stabilizers.
Näistä seoksista pipetoitiin 10 μΐ PVC-muovissa olevaan kuoppaan (»TK) ja 3 μΐ seuraaville paperiliuskoille:Of these mixtures, 10 μΐ was pipetted into a well (»TK) in PVC and 3 μΐ on the following strips of paper:
Whatman 3 mm-kromatografiapaperi (=W)Whatman 3 mm chromatography paper (= W)
UltraBind-paperi (=UB)UltraBind paper (= UB)
Lasikuitupaperi (»LK)Fiberglass paper (»LK)
Paperiliuskat ja PVC-kuopat asetettiin formaldehydiä ilma-tilassan sisältävään kammioon. Värin muutosajat otettiin ylös. Tulokset on esitetty taulukossa 2.Paper strips and PVC wells were placed in a chamber containing formaldehyde in the air space. Color change times were taken up. The results are shown in Table 2.
21 8462521 84625
Taulukko 2 Värin rauutosajat formaldehydin määrityksessä käytettäessä erilaisia kantajamateriaaleja.Table 2 Color shrinkage times in the determination of formaldehyde using different support materials.
Kantajamateriaali LK UB W TKCarrier material LK UB W TK
min s min s min s min s Värin muutosaika 3 00 5 10 1 50 6 30min s min s min s min s Color change time 3 00 5 10 1 50 6 30
Esimerkki 10 Tämä esimerkki kuvaa keksinnön mukaisen menetelmän kolmatta suoritusmuotoa kolmen kilpailevan substraatin reaktiosysteemissä, jossa ensimmäisenä elektroniakseptorina Sx on ferrisyanidia, toisena elektroniakseptorina S2 on DCIP ja redoxkatalyytti+kromogeeni -yhdistelmänä on PMS + INT (S3). Tässä systeemissä aluksi tapahtuu ferrisyanidin kuluminen ja sitten DCIP:n sinisen värin häviäminen (väri muuttuu sinisen ja vihreän kautta keltaiseksi). Jos etanolia on yli stökiömetrisen määrän, PMS/INT alkaa muodostaa punaista väriä. Väri muuttui tällöin puhtaan keltaisesta oranssin kautta punaiseksi. Esimerkki tämänkaltaisista värimuutoksista on esitetty kuvassa 7, jossa minuutin välein on ajettu spektrit (1-12) reaktioseoksesta, joka sisälsi:Example 10 This example illustrates a third embodiment of the process of the invention in a reaction system of three competing substrates in which the first electron acceptor Sx is ferricyanide, the second electron acceptor S2 is DCIP and the redox catalyst + chromogen combination is PMS + INT (S3). In this system, wear of ferricyanide first occurs and then the blue color of DCIP disappears (the color changes to yellow through blue and green). If there is more than a stoichiometric amount of ethanol, PMS / INT will begin to form a red color. The color then changed from pure yellow through orange to red. An example of such color changes is shown in Figure 7, in which the spectra (1-12) of a reaction mixture containing:
Mcllvainen 0.1 mol/1 sitraatti/ fosfaattipuskuria pH 7 2 mlMcllvainen 0.1 mol / l citrate / phosphate buffer pH 7 2 ml
Triton X 100 10 % 0.4 mlTriton X 100 10% 0.4 ml
Etanoli 0.2 % 0.15 ml DCIP 15 mmol/1 0.016 mlEthanol 0.2% 0.15 ml DCIP 15 mmol / l 0.016 ml
Kaliumferrisyanidi 0.1 mol/1 0.030 ml PMS 7.8 mmol/1 0.1 ml INT 8 mmol/1 0.1 ml MBADH 120000 U/l 0.030 mlPotassium ferricyanide 0.1 mol / l 0.030 ml PMS 7.8 mmol / l 0.1 ml INT 8 mmol / l 0.1 ml MBADH 120000 U / l 0.030 ml
Aluksi noin 420 nm:n kohdalla havaitaan ferrisyanidin 22 84625 vähenemisestä aiheutuva absorbanssin alenema. Kun ferrisyanidi on käytännöllisesti katsoen loppunut, DCIP:n sininen väri alkaa hävitä (maksimi lähellä 640 nm:ä). Kun DCIP on loppunut (jäljellä PMS:n keltainen väri), alkaa muodostua INTrstä punainen väri (katkoviivakäyrissä, maksimi lähellä 440 nm:ä).Initially, at about 420 nm, a decrease in absorbance due to a decrease in ferricyanide 22,84625 is observed. When the ferricyanide is practically depleted, the blue color of the DCIP begins to disappear (maximum near 640 nm). When the DCIP is depleted (the yellow color of the PMS remains), a red color begins to form from the INT (in dashed curves, maximum near 440 nm).
Esimerkki 11Example 11
Esimerkin 10 reaktion värinmuutoksia seurattiin myös silmämääräisesti. Tässä kokeessa DCIP:n määrä oli kaksinkertaistettu ja entsyymin määrä 15-kertaistettu: t (s) väri 0 vihreä 10 sininen 30 vihreä 45 keltainen 60 oranssi 75 punainenThe color changes of the reaction of Example 10 were also monitored visually. In this experiment, the amount of DCIP was doubled and the amount of enzyme was 15-fold: t (s) color 0 green 10 blue 30 green 45 yellow 60 orange 75 red
Keksintöä on kuvattu edellä viitaten tiettyihin edullisiin suoritusmuotoihin ja reagenssikombinaatioihin. On kuitenkin selvää, että alan ammattimiehelle ilmeisiä variaatioita, modifikaatioita ja reagenssien ekvivalenttista korvaamista voidaan suorittaa ilman kohtuutonta kokeilutyötä poikkeamatta keksinnön hengestä tai laajuudesta. Esimerkiksi kirjallisuuden perusteella on hyvin tunnettua, että fenat-siinivärit toimivat elektronikantajina useille väriaineille, joita voidaan soveltaa esitetyn kaltaisessa keksinnössä (kts. Michal, G. et ai., Methods of Enzymatic Analysis, Voi I, 197, toim. Bergfmeyer H.U., Verlag Chemie 1983).The invention has been described above with reference to certain preferred embodiments and reagent combinations. However, it will be apparent to those skilled in the art that variations, modifications, and equivalent substitutions of reagents may be made without undue experimentation without departing from the spirit or scope of the invention. For example, it is well known in the literature that phenazine dyes act as electron carriers for a variety of dyes that can be applied to an invention such as that described (see Michal, G. et al., Methods of Enzymatic Analysis, Vol. I, 197, ed. Bergfmeyer HU, Verlag Chemie 1983).
Claims (18)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI896314A FI84625C (en) | 1989-12-28 | 1989-12-28 | Method for detecting the analyte threshold |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI896314A FI84625C (en) | 1989-12-28 | 1989-12-28 | Method for detecting the analyte threshold |
| FI896314 | 1989-12-28 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI896314A0 FI896314A0 (en) | 1989-12-28 |
| FI896314A FI896314A (en) | 1991-06-29 |
| FI84625B true FI84625B (en) | 1991-09-13 |
| FI84625C FI84625C (en) | 1991-12-27 |
Family
ID=8529607
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI896314A FI84625C (en) | 1989-12-28 | 1989-12-28 | Method for detecting the analyte threshold |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FI (1) | FI84625C (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992007953A1 (en) * | 1990-10-29 | 1992-05-14 | Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus | Method for enzymatic determination of aldoses |
-
1989
- 1989-12-28 FI FI896314A patent/FI84625C/en active IP Right Grant
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992007953A1 (en) * | 1990-10-29 | 1992-05-14 | Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus | Method for enzymatic determination of aldoses |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI84625C (en) | 1991-12-27 |
| FI896314A (en) | 1991-06-29 |
| FI896314A0 (en) | 1989-12-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5036000A (en) | Threshold color control system | |
| US5126247A (en) | Method, system and devices for the assay and detection of biochemical molecules | |
| US3298789A (en) | Test article for the detection of glucose | |
| CA1144456A (en) | Indicator composition and test device containing amine oxide and method of use | |
| US4361648A (en) | Color fixed chromogenic analytical element | |
| RU2015513C1 (en) | Agent for colorimetric determination of analyte | |
| JP3118029B2 (en) | Compositions and methods for assaying ketone bodies | |
| KR20030013257A (en) | Methods and devices for use in analyte concentration determination assays | |
| KR20030041810A (en) | Stabilized tetrazolium reagent compositions and methods for using the same | |
| JPS5948099A (en) | Glucose test composition for ascorbate resistant wide concentration region, test tool and method | |
| US3453180A (en) | Test article | |
| FI75432C (en) | COMPOSITION, ANALYSIS AND FOERFARANDE FOER BESTAEMNING AV EN ANALYT I ETT PROV. | |
| FI81120C (en) | FOERFARANDE FOER BESTAEMNING AV GLUKOS UR BIOLOGISKA VAETSKA SAMT REAGENSBLANDNING FOER TILLAEMPNING AV FOERFARANDET. | |
| FI77896C (en) | KOMPOSITION FOER BESTAEMNING AV URINSYRA ELLER KOLESTEROL I ETT VAETSKEPROV. | |
| Zhu et al. | Application of thiamine as a fluorogenic substrate in the determination of hydrogen peroxide based on the catalytic effect of hemin | |
| Jablonski et al. | Properties and uses of immobilized light-emitting enzyme systems from Beneckea harveyi. | |
| CA2404421A1 (en) | Reagent systems for detecting the presence of a reduced cofactor in a sample and methods for using the same | |
| MX2007002224A (en) | Method for determining the concentration of analytes in samples by direct mediation of enzymes. | |
| FI84625B (en) | Process for detecting the threshold value of the analyte | |
| Kayamori et al. | Enzymatic method for assaying uric acid in serum with a new tetrazolium salt produces water-soluble formazan dye | |
| JP2008148656A (en) | Dry analytical element | |
| JPS62239999A (en) | Method for half determination of nad(p)h | |
| Kanaya et al. | Application of the “Micro-Stopped-Flow Time Difference Analysis” Technique to a Dehydrogenase-Catalyzed Reaction for Rapid and Sensitive Determination of Pyruvate | |
| JPS6191570A (en) | Assay of reducing type nicotinamide adenine dinucleotide and reducing type nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | |
| JPH0223887A (en) | Measurement of content of oxygen of biological fluid and apparatus for measuring the content by dry type chemical treatment |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Owner name: ORION-YHTYMAE OY |