FI81720C

FI81720C - Foerfarande foer inaktivering av oekningsbenaegna filterbara sjukdomsalstrare i blodprodukter.

Info

Publication number: FI81720C
Application number: FI850940A
Authority: FI
Inventors: Johann Eibl; Friedrich Dorner; Otto Schwarz; Fritz Elsinger; Gunter Woeber; Anton Philapitsch; Yendra Linnau; Karl Trambauer; Wolfgang Frechinger
Original assignee: Immuno Ag
Priority date: 1984-03-09
Filing date: 1985-03-08
Publication date: 1990-12-10
Also published as: DK162966C; JPS60215628A; ES8802273A1; DK107185A; FI850940A0; JPH0739348B2; DE3569473D1; ES540919A0; EP0159311B1; ATA323784A; DK162966B; CA1239583A; EP0159311A1; FI81720B; ATE42205T1; US4640834A; DK107185D0; FI850940L; AT389815B

Description

81 720

Menetelmä verituotteissa esiintyvien lisääntymiskykyisten suodatettavien taudinaiheuttajien inaktivoimiseksi

Keksinnön kohteena on menetelmä niiden verituotteissa esiintyvien lisääntymiskykyisten suodatettavien taudinaiheuttajien, etenkin hepatiittivirusten ja tuntemattomien taudinaiheuttajien inaktivoimiseksi, jotka mahdollisesti voivat aiheuttaa AIDS-tartunnan (acquired immune deficiency syndrome), käyttäen korotettua lämpötilaa sekä menetelmä verituotteiden valmistamiseksi käyttämällä tätä menetelmää.

Verituotteilla tarkoitetaan ihmisen tai eläimen verestä tai vastaavasti plasmasta valmistettuja tuotteita, jotka on tarkoitettu käytettäviksi terapeuttisesti, profylaktisesti tai diagnostisesti. Tällaiset tuotteet voivat sisältää entsyymejä, proentsyymejä mukaanlukien koaguloitumisaineita, entsyy-mi-inhibiittoreita, immunoglobuliinejä, albumiinia, plasmi-nogeeniä, fibrinogeeniä, fibronektiiniä tai plasmaa.

On olemassa laaja kirjallisuus, joka käsittelee verituotteissa esiintyvien lisääntymiskykyisten suodatettavien taudinaiheuttajien lämpöinaktivointia.

Erilaisiin menetelmiin kuuluu: - verituotteiden kuumentaminen vesipitoisessa liuoksessa, mahdollisesti lisäämällä virusidisisä aineita, - verituotteiden kuumentaminen vesipitoisessa liuoksessa stabilisaattoreiden läsnäollessa, - verituotteiden käsittely orgaanisilla liuottimilla, - verituotteiden säteilytys kiinteässä tilassa, - verituotteiden kuumentaminen kuivassa tilassa.

Kaikkien näiden inaktivointimenetelmien tarkoituksena on kumota valmisteiden mahdollinen tarttuvuus, mutta säilyttää pitkälti niiden biologinen aktiivisuus. Tämä päämäärä on 2 81720 voitu tähän mennessä kuitenkin saavuttaa vain albumiinival-misteiden kohdalla, nimittäin kuumentamalla vesipitoisia albumiiniliuoksia 60*C:n lämpötilassa 10 tuntia, koska albumiini on olennaisesti stabiilimpi kuumuuden vaikutuksen suhteen kuin kaikki muut veriproteiinit.

Erityisesti esitettäköön tekniikan tasosta esimerkiksi seu-raavat kirjallisuuskohdat: DE-hakemusjulkaisussa 29 61 711 on esitetty menetelmä koaguloitumistekijöitä sisältävien valmisteiden käsittelemiseksi vesipitoisessa liuoksessa käyttämällä 30 - 100eC:n lämpötilaa, jolloin koaguloitumistekijöiden liuokseen lisätään aminohappoa ja mono-, oligosakkaridia tai sokerialkoho-lia.

Julkaisussa EP-A2-0 053 338 esitetään menetelmä tekijää IX ja X sisältävissä valmisteissa olevien hepatiittivrusten inaktivoimiseksi, jolloin suoritetaan verivalmisteen vesipitoisen liuoksen lämmitys kalsiumionien ja mahdollisesti aminohapon ja/tai sakkaridin tai sokerialkoholin läsnäollessa korkeintaan 100*C:n lämpötiloissa.

Julkaisussa EP-A2-0 035 304 esitetään menetelmää sellaisten vesipitoisten proteiiniliuosten inaktivoimiseksi, jotka voivat sisältää tekijää Vili, fibronektiiniä, globuliiniä, fib-rinogeeniä ja muita proteiineja, jolloin koostumus sekoitetaan polyolin kanssa ja seos kuumennetaan 60 - 75eC:n lämpötilaan.

Julkaisussa EP-A2-0 052 827 esitetään menetelmä vesipitoisessa, tekijöitä II ja VII sisältävässä liuoksessa olevien hepatiittivirusten inaktivoimiseksi kelaattimuodostajan ja mahdollisesti aminohapon ja/tai sakkaridin tai sokerialkoholin läsnäollessa.

Julkaisussa US-A-4 379 085 on esitetty menetelmä plasmapro-teiinin, kuten Ci-inhibiittorin tai tekijän IX lämpöinakti-voimiseksi vesipitoisessa liuoksessa kalium- tai ammonium-sitraatin läsnäollessa.

Il 3 81720

Julkaisussa EP-A2-0 077 870 esitetään inaktivointimenetelmä, jossa vesipitoinen, tekijää VIII sisältävä liuos kuumennetaan aminohappojen, monosakkaridien, oligosakkaridien, soke-rialkoholien ja 3 - 10 hiiliatomia sisältävien hiilivety-tai hydroksyylihiilivetykarboksyylihappojen kanssa 50 -80eC:n lämpötilaan.

PCT-hakemuksessa W0 83/04371 on esitetty menetelmä hepatiittivirusten inaktivoimiseksi, jolloin virusta sisältävää valmistetta käsitellään 4 - 40eC:n lämpötilassa halogeenihiili-vedyllä, etenkin kloroformilla.

Julkaisussa EP-B1-0 015 055 on esitetty menetelmä verituotteen käsittelemiseksi, jolloin tuote alistetaan vedettömässä tilassa mikroaaltosäteilyyn esiintyvien mikro-organismien inaktivoimiseksi.

Rosenberg et ai. selostavat tutkielmassaan, joka on esitetty julkaisussa XII International Congress on Blood Transfusion, Abstracts, "MIR" Publishers, Moskova 1969, s. 473-475, menetelmää albumiinipitoisten valmisteiden ja fibrinogeenin inaktivoimiseksi kuivassa tilassa kuumentamalla niitä 10 tunnin ajan 60eC:ssa.

Julkaisussa EP-A2-0 094 611 on esitetty menetelmä tekijää VIII sisältävän koostumuksen käsittelemiseksi kuivassa tilassa, jolloin siinä on alle 5 paino-% (0,05) vettä, käyttämällä vähintään 60eC:n lämpötilaa esiintyvien hepatiittivirusten inaktivoimiseksi.

Julkaistussa PCT-hakemuksessa WO 82/03871 esitetään menetelmä verenkoaguloitumisentsyymiä sisältävien valmisteiden käsittelemiseksi, jolloin nämä kuumennetaan esiintyvien infek-tiovirusten inaktivoimiseksi kuivassa tilassa; kuivana tilana määritetään sellainen tila, jossa on alle 5 paino-% (0,05) vettä.

Kuten edellä olevasta katsauksesta käy ilmi, tunnetaan sekä menetelmiä, joissa käsiteltävä veriproteiineja sisältävä 4 81720 valmiste esiintyy suspendoituna vesipitoiseen liuokseen tai orgaaniseen liuottimeen, että myös menetelmiä, joissa valmiste alistetaan kuivassa tilassa, esim. lyofilisoituna inaktivointikäsittelyyn. Huolimatta kaikista tähänastisista yrityksistä ei ole tähän mennessä onnistuttu kehittämään inaktivointimenetelmää, joka - verrattuna verituotteen albumiinin inaktivointiin - takaa samalla tavalla varmuuden hepatiittivirusten ja muiden patogeenisten virusten tartuntaa vastaan ja varmistaa kulloinkin kyseessä olevan verituotteen biologisen aktiivisuuden. Jo 30 vuoden ajan on käytetty albumi inipi to is ia liuoksia, joita on kuumennettu sopivien sta-bilisaattoreiden läsnäollessa 10 tunnin ajan 60eC:seen, lukemattomia kertoja kliinisesti, ilman että siten olisi tartutettu infektiosairauksia. Kuten simpansseilla suoritetuissa kokeissa on voitu osoittaa, hepatiittivirukset, jotka on lisätty albumiinipitoisiin liuoksiin, inaktivoidaan täydellisesti kuumentamalla näitä liuoksia 60*C:seen 10 tunnin a j an.

Keksinnön tehtävänä on saada aikaan inaktivointimenetelmä, joka käsiteltävän verituotteen biologisen aktiivisuuden säilyttäen saa aikaan luotettavan varmuuden virusten, etenkin hepatiittivirusten suhteen, joka varmuus on samanarvoinen tai jopa parempi kuin albumiinipitoisten liuosten ainakti-voinnissa saavutettava tehokkuus.

Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaisesti alussa mainitun tyyppisessä menetelmässä siten, että verituotteet saatetaan kiinteässä tilassa vesi-, metanoli- tai etanolipitoi-suuteen, joka on yli 0,05 (5 paino-%) ja alle 0,70 (70 paino-%), edullisesti alle 0,40 (40 paino-%), ja niitä käsitellään suljetussa säiliössä 50...121eC:n lämpötilassa korottamalla veden, metanolin tai etanolin osahöyrynpainetta.

Koska verituotteiden hepatiittivirusinaktivoinnin tarpeellisia tutkimuksia ei voida suorittaa heti ihmisessä ja koska simpansseja on käytettävissä vain riittämättömästi, tapahtuu keksinnön mukaisesti inaktivoinnin tehokkuuden arviointi

II

5 81720 mallivirusten avulla. Malliviruksena käytetyn koiranhepa-tiittiviruksen esimerkillä on voitu osittaa, että alussa mainitut tunnetut menetelmät verituotteiden inaktivoimiseksi ovat pitkälti huonompia kuin inaktivointimenetelmä albumiinissa. Siten esim. proteiiniliuoksissa olevaa koiranhepa-tiittivirusta ei inaktivoida käytettäessä stabilisaattoreina 0,50 sakkaroosia ja 2M glysiiniä; samoin ei myöskään tekijä VIII-valmisteissa kuivassa tilassa kuumennettaessa 60eC:seen 10 tunnin ajan. Koiranhepatiittivirukset inaktivoituvat kuitenkin täysin albumiiniliuoksissa kuumennettaessa niitä 60eC:seen 10 tunnin ajan. Sama pätee E. Coli-bakteriofagi T4:ään.

Arvosteltaessa keksinnön mukaista menetelmää on osoittautunut, että koiranhepatiittivirus ja muut mallivirukset inaktivoituvat täydellisesti. E. Coli-bakteriofagi T4:n inakti-vointinopeus mielivaltaisissa verituotteissa kun hydroksyy-liryhmiä on läsnä keksinnön mukainen vaikuttava määrä on jopa suurempi kuin 60*C:seen kuumennetussa albumiiniliuok-sessa.

Edullisesti suoritetaan verituotteiden vesihöyrykäsittely 0,1...2 bar:n paineessa.

Lisääntymiskykyiset suodatettavat taudinaiheuttavat voivat olla mm. hepatiittiviruksia tai AIDS:n (acquired immune deficiency syndrome) aiheuttajia.

Keksinnön mukaisen lämpökäsittelyn kestoa voidaan vaihdella laajoissa rajoissa, käytetyn lämpötilan ja käsiteltävien verituotteiden laadun tai vastaavasti lämpöherkkyyden mukaan. Se voi olla 1 sek. - 100 tuntia.

Edullisen suoritusmuodon mukaan suoritetaan lämpökäsittely vesipitoisuudessa, joka on 0,06 (6 paino-%)...0,30 (30 paino-%), 50e...90*C:n lämpötilassa.

Keksinnön mukainen menetelmä voidaan myös toteuttaa siten, että verituotteiden lämpökäsittely suoritetaan hapettoman 6 81720 inertin suojakaasun, sopivimmin typen läsnäollessa ja mahdollisesti happeasitovien aineiden läsnäollessa.

Eräs toinen keksinnön mukaisen menetelmän edullinen sovellu-tusmuoto voi olla myös sellainen, että verituotteita lämpö-käsitellään nestemäisessä väliaineessa, johon ne eivät liukene. Nestemäisenä väliaineena voidaan käyttää kloroformia tai etikkahappoetyyliesteriä.

Keksinnön mukaista inaktivointitapaa voidaan edullisesti käyttää menetelmässä entsyymeistä, proentsyymeistä mukaanlukien koaguloitumistekijöistä, entsyymi-inhibiittoreista, im-munoglobuliineista, albumiinista, plasminogeenistä, fibrino-geenistä, fibronektiinistä tai plasmasta koostuvien verituotteiden tai yksittäisten verituotteiden seoksien valmistamiseksi, jolloin inaktivointi suoritetaan valmistusmenetelmän mielivaltaisessa vaiheessa, minkä jälkeen verituotteet mahdollisesti muunnetaan galeeniseksi valmisteeksi.

li 7 81720

Keksinnön mukaisen valmistusmenetelmän puitteisiin kuuluu myös se työtapa, että käytetään verituotetta, joka on sitoutunut kovalenttisesti veteen liukenemattomaan matriisiin. Esimerkiksi immunoglobuliini voidaan immobilisoida sefaroo-siin ja alistaa inaktivointiin. Toisaalta on mahdollista adsorboida verituote ei-kovalenttisesti kudoksen kanssa yhteensopivalle kantoaineelle, kuten kollageenikuitumatolle, ja suorittaa lämpökäsittely. Erityinen sovellutusmuoto fibrinogeenipitoisen valmisteen valmistamiseksi on sellainen, että kudoksen kanssa yhteensopivalle kantoaineelle, kuten kollageenikuitumatolle levitetään fibrinogeenipitoinen koostumus joka lärapöinaktivoidaan.

Keksinnön mukaisen valmistusmenetelmän puitteissa voidaan käyttää myös muita fraktiointitoimenpiteitä lämpöinaktivoi-tujen verituotteiden vapauttamiseksi lämpöaktivoinnin aikana mahdollisesti muodostuneista neoproteiineista tai neoanti-geeneistä.

Keksinnön mukaista inaktivointimenetelmää sekä verituotteiden valmistusta käyttämällä menetelmää, saavutettuja vaiku-tuksia ja paremmuutta tunnettujen menetelmien suhteen seli-f. tetään lähemmin seuraavissa esimerkeissä ja taulukoissa.

Esimerkki 1: a) Tekijä VIII-valmisteen valmistus 6660 ml tuoreena jäädytettyä plasmaa sulatettiin 0-+4°C:ssa. Muodostunut kryosaostuma erotettiin sentrifugoimalla ja liuotettiin 700 ml:aan trinatriumsitraattiliuosta, joka sisälsi 0,05 mg natriumpentosaanisulfaattia/ml ja 30 yksikköä aprotiniiniä/ml. Liuoksen pH-arvo saatettiin arvoon 6,3 ja lämpötila säädettiin +4°C:seen. Muodostunut sakka erotettiin sentrifugoimalla ja heitettiin pois.

Lisäämällä etanolia, kunnes konsentraatio oli 0,08, saostet-tiin tekijä VIII-pitoinen fraktio. Muodostunut sakka erotettiin sentrifugoimalla ja liuotettiin glysiini-sitraatti-NaCl-puskur iin.

β 81720 b) Malliviruksen inaktivointi

Esitetyllä tavalla saatu tekijä VIII-pitoinen liuos säädettiin 50 mg:aan proteiinia/ral, siihen lisättiin soluviljely-väliaineessa TCM 199 olevaa Sindbis-virussuspensiota, tai vastaavasti viruksetonta TCM 199:ä ja jäädytyskuivattiin. Jäähdytyskuivatettu tekijä VIII-konsentraatti säädettiin erilaisiin vesipitoisuuksiin, nimittäin arvoihin 0,08, 0,20, 0,30 ja 0,50 ja kuumennettiin suljetuissa säiliöissä 60 tai vastaavasti 80°C:n lämpötilaan eri pituisia aikoja. Kulloinkin kolme koetta otettiin ennen kuumentamista ja määrättyinä aikoina kuuraennustapahtuman takana toisaalta virustitterin ja toisaalta jäämäaktiivisuuden ja vesipitoisuuden mittaarai-seks i.

Virustitterin määritys suoritettiin seuraavalla tavalla:

Tekijän VIII:a sisältävä lyofilisaatti liuotettiin veteen ja laimennettiin sarjassa isotonisella keittosuolaliuoksella suhteessa 1:10. Sindbis-viruksen titteri määritettiin arvioimalla sen sensitiivisiin Vero-soluihin kohdistama sytopa-tinen vaikutus rnikrotitterilevyllä. Tulokset esitettiin tulkinnan tilastollisen käsittelyn jälkeen Reedin ja Muenchin kaavan mukaisesti logaritmina TCID50 (Reed J.L. and H. Mu-ench; Amer. J. Hyg. 27, 493 (1938).

c) Jäämäaktiivisuuden määritys virusvapaissa näytteissä Jäämäaktiivisuuden määritys suoritettiin tromboplastien muodostustestin avulla (2-vaihetesti). Tekijä VHI-jäämäak-tiivisuus laskettiin muodostamalla kuumennetun näytteen tekijä-VIII-aktiivisuuden ja vastaavan kuumentamattoman näytteen tekijä VIII-aktiivisuuden osamäärä.

d) Vesipitoisuuden määritys virusvapaissa näytteissä Jäähdytyskuivatettu tekijä VIII-konsentraattia uutettiin ennen lämpökäsittelyä ja sen jälkeen vedettömällä metanolilla. Metanoliliuoksen vesipitoisuus määritettiin Karl Fischerin

II

9 81720 mukaisesti titraattorissa ooulometrisesti (Scholz, E.: Fre-senius' Z. anal. Chem. 31^. 567-571, (1938)).

Suoritetun lämpökäsittelyn jälkeen mitatut virustitterit ja käsittelyn jälkeen vielä esiintyvä jäämäaktiivisuus on esitetty taulukossa I, josta selvästi nähdään, että inaktivoin-tinopeus on riippuvainen vesipitoisuudesta. Samalla kun käytettäessä 60°C:n lämpötilaa viruksen toteamisraja saavutetaan vesipitoisuudessa 0,08 3 tunnin kuluttua, tämä raja saavutetaan vesipitoisuudessa 0,20 ja 0,30 jo tunnin kuluttua ja vesipitoisuudessa 0,50 jo 0,3 tunnin kuluttua. Inak-tivointitehokkuus on riippuvainen myös lämpötilasta. 80°C:n lämpötilassa ja vesipitoisuudessa 0,08 saavutetaan viruksen näyttöraja jo 0,3 tunnin kuluttua.

Jäämäaktiivisuus inaktivointikäsittelyn jälkeen oli kaikissa näytteissä korkeintaan 0,30 vesipitoisuusarvolla vähintään arvolla 0,80 (8θί) tyydyttävä, jopa vesipitoisuusarvossa 0,50 oli jäämäaktiivisuus 3 tunnin kuluttua 60°C:ssa vielä 0,38 (38¾). Vertailuna tämän suhteen tekijä VIII-konsentraa-tit, jotka oli valmistettu samalla tavalla kuin yllä, käsiteltiin "kuivassa tilassa", so. tekniikan tason mukaisesti "kuivalle tilalle" järjestetyllä vesipitoisuudella, joka on :: alle 0,05 vettä. Tulokset on esitetty taulukossa I a), josta nähdään, että alhaisessa vesipitoisuudessa, joka vastaa "kuivaa tilaa", viruksen toteamisraja saavutetaan vesipitoisuudessa 0,015 vasta 10 tunnin kuluttua, vesipitoisuudessa 0,006 vasta 30 tunnin kuluttua. Tästä nähdään, että keksinnön mukainen menetelmä on 10-...100-kertaisesti tehokkaampi vähennettäessä virustitteriä 3 - kymmenpotenssilla.

Tämä keksinnön mukaisen menetelmän paremmuus tekniikan tason suhteen nähdään myös piirustuksen kuviossa 1 esitetyistä vi-rusinaktivointikäyristä, jolloin täydet viivat esittävät keksinnön mukaista inaktivointia vesipitoisuusarvoissa 0,50, 0,30, 0,20 tai vastaavasti 0,08 ja katkoviivoin merkityt .· käyrät virustitterin laskua "kuivassa tilassa", jolloin ve- sipitoisuusarvot ovat 0,015 ja 0,006. Kuvion 1 abskissat 10 81 720 esittävät käsittelyn kestoa tunneissa logaritmisessa mittakaavassa. Lisäksi kuviossa 1 on esitetty jäämäaktiivisuuden kulku, jolloin täysin viivoin esitetyt käyrät esittävät keksinnön mukaista vesipitoisuutta ja katkoviivoin merkityt käyrät jäämäaktiivisuuden kulkua kuivassa tilassa.

Esimerkki 2:

Esimerkissä 1 esitetyllä tavalla valmistettuun tekijä VIII-pitoiseen liuokseen lisättiin soluviljelyväliaineessa TCM 199 olevaa Sindbis-virussuspensiota tai vastaavasti virus-vapaata TCM 199:ä ja jäähdytyskuivatettiin. Jäähdytyskuivat-tu tekijä VIII-konsentraatti alistettiin metanolin läsnäollessa 60°C:n lämpötilassa inaktivointikäsittelyyn. Toiseen tekijä VIII-pitoiseen liuokseen lisättiin manniittia, liuos jäähdytyskuivatettiin ja lämpöinaktivoitiin samoin 60°C:ssa.

Suoritetun lämpökäsittelyn jälkeen mitatut virustitterit on esitetty taulukoissa II ja III, jolloin taulukoissa Ha ja lila on esitetty vertailutulokset ilman keksinnön mukaista hydroksyyliryhmäpitoisten yhdisteiden pitoisuutta. Jälleen nähdään keksinnönmukaisen työtavan paremmuus siinä, että tässä malliviruksen inaktivointinopeus on olennaisesti suurempi jäämäaktiivisuuden säilyessä.

Esimerkki 3: a) Osittaista protrorabiinikompleksia sisältävän valmisteen valmistus

Koaguloitumistekijöiden II, IX ja X sisältävä valmiste saatiin julkaisussa Vox. Sang. 37-50 (1977) esitetyn menetelmän mukaisesti ihmisen plasmasta adsorboimalla DEAE-Sephadexiin, pesemällä ioninvaihdin ja eluoimalla kompleksi.

b) Malliviruksen inaktivointi

Eluaatti dialysoitiin, jäähdytyskuivatettiin ja siitä valmistettiin osittaisen protrorabiinikorapleksin vesipitoinen liuos, jossa oli 50 mg proteiinia/ml. Liuokseen lisättiin li 81720 bakteriofagi T4:n suspensiota, joka oli Escherichia coli 11303:n viljelyväliaineessa, tai vastaavasti virusvapaata viljelyvällainetta ja jäähdytyskuivatettiin. Jäähdytyskuiva-tettu konsentraatti saatettiin vesipitoisuuteen 0,09. Suljettuja säiliöitä, joissa on jäädytyskuivatettuja osittais-protrombiinikorapleksi-näytteitä - viruksen kanssa ja ilman -kuumennettiin 60°C:n lämpötilassa eri pituisen ajan. Kulloinkin kolme näytettä otettiin ennen kuumentamista ja määrättyinä aikoina kuumentamistapahtuman aikana toisaalta virustitterin ja toisaalta jäämäaktiivisuuden ja vesipitoisuuden mittaamiseksi.

Virustitterin määritys suoritettiin seuraavalla tavalla:

Osittaista protrombiinikompleksia sisältävä lyofilisaatti liuotettiin lämpökäsittelyn jälkeen veteen ja laimennettiin sarjassa 1 mM:lla MgCl2:a suhteessa 1:10. Seos, jossa on 3 ml 0,7t:sta Bacto-agaria, 43-45°C, 100 1 nesteväliai- neessa olevaa E. coli suspensiota ja 200 1 bakteriofagipi- toista näytettä tai laimennosta, sekoitettiin ja kaadettiin nopeasti ravinneagarlevylle (ATCC 129). Inkuboitiin yön yli : 37°C:ssa, minkä jälkeen laskettiin laskinlaitteen avulla li- ·:- sääntymiskykyisten virushiukkasten tuottama plakki yhteen sulaneessa solupinnassa (PFU, plaque-forming units). Tulokset on esitetty arvona logio PFU.

-- : c) Jäämäaktiivisuuden määritys virusvapaissa näytteissä

Tekijä IX-aktiivisuuden määritys tapahtui lisäämällä testattava näyte tekijä IX-puutosplasmaan ja määrittämällä aktivoitu osittainen tromboplastiiniaika (1-vaihetesti). Kuumennetun näytteen tekijä IX-jääraäaktiivisuus laskettiin muodos-tamalla kuumennetun näytteen tekijä IX-aktiivisuuden ja vastaavan kuumentamattoman näytteen tekijä IX-aktiivisuuden osamäärä.

12 81 720 d) Vesipitoisuuden määritys virusvapaissa näytteissä Tämä määritys tapahtui samalla tavalla kuin esimerkissä 1.

Suoritetun lämpökäsittelyn jälkeen mitatut virustitterit ja käsittelyn jälkeen vielä esiintyvä jäämäaktiivisuus on esitetty taulukossa IV, josta nähdään, että viruksen näyttöraja saavutettiin jo lyhyen ajan - alle tunnin - kuluttua, jolloin jäämäaktiivisuus säilyi täysin. Vertailuna tämän suhteen nähdään taulukosta IVa, että osittaisprotrombiinikomp-leksivalmisteiden lämpökäsittelyssä "kuivassa tilassa" vesi-pitoisuusarvossa 0,004 jopa kymmenentuntisen käsittelyn jälkeen virustitteri oli arvolla 2,0 vielä suhteellisen korkea, jopa käytettäessä korkeampia, 80 ja 90°C:n lämpötiloja.

Tämän esimerkin mukaiset virusinaktivointikäyrät ja jäämäak-tiivisuuden kulku on esitetty kuviossa 2 samalla tavalla kuin kuviossa 1 täysin viivoin, jota vastoin tekniikan tason mukaisesti kuivassa tilassa saadut käyrät on esitetty katkoviivoin.

Esimerkki 4: a) Kokonaista protrombiinikompleksia sisältävän valmisteen valmistus

Koaguloitumistekijää VII sisältävä valmiste valmistettiin AT-patenttijulkaisussa 359*646 esitetyn menetelmän mukaisesti ihmisen sitraattiplasmasta. Kryosaosteen erottamisen ja DEAE-Sephadex-käsittelyn jälkeen adsorboitiin tekijä VII Al(0H>3:ssa. AKOHJj alistettiin pesuprosessiin ja tekijä VII-eluointiprosessiin korotetussa ionivahvuudessa. Tekijä VII-pitoinen eluaatti dialysoitiin ja sekoitettiin dialysoi-dun osittaisprotrorabiinikompleksi-valmisteen kanssa, joka oli valmistettu esimerkin 3 mukaisesti, sellaisessa suhteessa, että tekijöiden II, IX ja XII koaguloitumisaktiivisuudet olivat suunnilleen yhtä korkeat.

Il 13 81 720 b) Malliviruksen inaktivointi

Esitetyllä tavalla saatu kokonaisen protrombiinikorapleksin liuos säädettiin 50 mg:aan proteiinia/ml ja siihen lisättiin soluviljelyväliaineessa TCM 199 olevaa Sindbis-virussuspen-siota tai vastaavasti virusvapaata TCM 199:ä ja jäädytyskui-vatettiin. Jäädytyskuivatettu konsentraatti saatettiin vesi-pitoisuusarvoon 0,07· Suljettuja säiliöitä, joissa on jäädy-tyskuivatettuja kokonaisprotrombiinikorapleksin näytteitä -viruksen kanssa ja ilman - kuumennettiin 60°C:n lämpötilassa eripituisia aikoja. Kulloinkin kolme näytettä otettiin ennen kuumentamista ja määrättyinä aikoina kuuraentamistapahtuman aikana toisaalta virustitterin ja toisaalta jäämäaktiivisuu-den ja vesipitoisuuden mittaamiseksi.

Virustitterin määritys tapahtui samalla tavalla kuin esimerkissä 1.

c) Jäämäaktiivisuuden määritys virusvapaissa näytteissä

Tekijä IX-aktiivisuuden määritys tapahtui lisäämällä testattava näyte tekijä IX-puutosplasmaan ja määrittämällä akti-j voitu osittainen tromboplastiiniaika (1-vaihe-testi ). Kuu- mennetun näytteen tekijä IX-aktiivisuus laskettiin muodostamalla osamäärä kuumennetun näytteen tekijä IX-aktiivisuudes-·;' ta ja vastaavan kuumentamattoman näytteen tekijä IX-aktiivi- : suudesta.

d) Vesipitoisuuden määritys virusvapaissa näytteissä Tämä määritys tapahtui samalla tavalla kuin esimerkissä 1.

Suoritetun lämpökäsittelyn jälkeen mitatut virustitterit ja käsittelyn jälkeen vielä esiintyvä jäämäaktiivisuus on esi-•· tetty taulukossa V, josta nähdään, että 3 tuntia kestävän ··' käsittelyä jän jälkeen saavutettiin viruksen näyttöraja, jol loin jäämäaktiivisuus säilyi olennaisesti.

1* 81720

Esimerkki 5: a) FEIBA-valroisteen valmistus FEIBAa sisältävä valmiste valmistettiin tuoreena jäädytetystä ihraisen sitraattipalsmasta julkaisussa AT-PS 368.883 esitetyn menetelmän mukaisesti siten, että plasman sulattami-sen, tällöin saadun kryosaosteen erottamisen ja FEIB-aktii-visuuden tuottamisen jälkeen koaguloitumistekijät saatiin adsorboimalla ioninvaihtimessa ja eluoimalla.

b) Malliviruksen inaktivointi

Saatu FEIBA-pitoinen liuos säädettiin 50 ragiaan proteii-nia/ml ja siihen lisättiin soluviljelyväliaineessa TCM 199 olevaa Sindbis-virussuspensiota tai vastaavasti virusvapaata TCM 199:ä ja jäädytyskuivatettiin. Jäädytyskuivatettu FEIBA-konsentraatti säädettiin erilaisiin vesipitoisuuksiin, nimittäin arvoihin 0,07, 0,08 tai vastaavasti etanolipitoisuu-sarvoon 0,10 ja kuumennettiin suljetuissa säiliöissä erilaisissa lämpötiloissa, nimittäin 60 ja 90°C:ssa eripituisia aikoja. Kulloinkin kolme näytettä otettiin ennen kuumentamista ja määrättyinä aikoina kuumennustapahtuman aikana toisaalta virustitterin mittaamiseksi ja toisaalta jäämäaktii-visuuden ja vesipitoisuuden määrittämiseksi.

Virustitterin määritys tapahtui samalla tavalla kuin esimer-! kissä 1.

c) Jääraäaktiivisuuden määritys virusvapaissa näytteissä FEIB-jäämäaktiivisuuden määritys tapahtui julkaisussa AT-PS 350.726 esitetyllä tavalla lisäämällä testattava näyte tekijä VIII-inhibiittoriplasraaan ja määrittämällä aktivoitu osittainen tromboplastiiniaika (1-vaihe-testi). Kuumennetun näytteen FEIB-aktiivisuus laskettiin muodostamalla osamäärä kuumennetun näytteen FEIB-aktiivisuudesta ja vastaavan kuumentamattoman näytteen FEIB-aktiivisuudesta.

Il d) Vesipitoisuuden määritys virusvapaissa näytteissä 15 81 720 Tämä määritys tapahtui samalla tavalla kuin esimerkissä 1.

Suoritetun lämpökäsittelyn jälkeen mitatut virustitterit ja käsittelyn jälkeen vielä esiintyvä jäämäaktiivisuus on esitetty taulukossa VI, josta nähdään, että inaktivointinopeus on riippuvainen sekä vesipitoisuudesta että inaktivointiläm-pötilasta. Vesipitoisuusarvossa 0,07 ja 60°C:n lämpötilassa viruksen näyttöraja savutettiin 3 tunnin kuluttua ja vesipitoisuusarvossa 0,08 ja 90°C:n lämpötilassa se saavutettiin jo 0,2 tunnin kuluttua. Jäämäaktiivisuus on kaikissa tapauksissa tyydyttävä.

Vertailuna tämän suhteen on taulukossa Via esitetty vertai-luesimerkki, jolloin FEIBA-näyte käsiteltiin "kuivassa tilassa" vesipitoisuusarvolla 0,009 60°C:ssa. Virus-titteri on jopa 30 tunnin käsittelyn jälkeen vielä arvolla 1,7 suhteellisen korkea.

Tämän esimerkin mukaisesti valmistetun FEIBA-valraisteen inaktivointi tarkastettiin lisäksi toisella malliviruksella, nimittäin koiranhepatiitti-viruksella, jolloin jäädytyskui-vatettu FEIBA-konsentraatti säädettiin vesipitoisuusarvoon ·’' 0,07 ja käsittelylämpötila oli 60 tai vastaavasti 80°C. Suo ritetun lämpökäsittelyn jälkeen mitatut virustitterit näh-· dään taulukosta VII. Koiranhepatiittiviruksen titteri raääri- : ·’ tettiin arvioimalla sytopatinen vaikutus sensitiivisiin MDCK- soluihin mikrotitterilevyllä. Tulokset esitettiin tulkinnan statistisen käsittelyn jälkeen Reedin ja Muenchin kaavan mukaisesti logaritmilla TCID50 (Reed J.L. and H. Muench; Amed.

J. Hyg. 27, 1493 (1938). Virustitterimäärityksestä saatiin tuloksena, että vesipitoisuusarvossa 0,07 ja 60°C:n lämpötilassa viruksen toteamisraja saavutettiin tunnin kuluttua, 80°C:n lämpötilassa jo 0,1 tunnin kuluttua.

Taulukossa Vila on esitetty jälleen vertailuesiraerkki, jolloin käsittely tapahtui "kuivassa tilassa", sillä tuloksella, että vielä 30 tuntia kestävän käsittelyäjän jälkeen inaktivointi oli riittämätön.

ie 81720

Kuviossa 3 on esitetty samalla tavalla kuin kuviossa 1 tämän esimerkin mukaiset virusinaktivointikäyrät ja jäämäaktiivi-suudet.

Esimerkki 6: a) Immunoglobuliini-pitoisen valmisteen valmistus

Immunoglobuliini-pitoinen valmiste valmistettiin J.L. Oncle-yn julkaisussa Journal of Amer. Chem. Soc., _71_, 541-550 (1949) esitetyn alkoholi-fraktiointimenetelmän mukaisesti ihmisen plasmasta. Liuos sisälsi 100 mg proteiinia, 14 mg glysiiniä ja 1,9 mg NaCl:a/ml.

b) malliviruksen inaktivointi

Saatuun vesipitoiseen liuokseen lisättiin soluviljelyväli-aineessa TCM 199 olevaa Sindbis-virussuspensiota tai vastaavasti virusvapaata TCM 199:ä ja jäädytyskuivatettiin. Jäädy-tyskuivatettu immunoglobuliinikonsentraatti säädettiin vesi-pitoisuuteen 0,054 ja kuumennettiin suljetuissa säiliöissä -viruksen kanssa ja ilman - 60°C:n lämpötilassa eri pituisia aikoja. Kulloinkin kolme näytettä otettiin ennen kuumentamista ja määrättyinä aikoina kuumentamistapahtuman aikana toisaalta virustitterin mittaamiseksi ja toisaalta molekyyli koskemattomuuden ja vesipitoisuuden määrittämiseksi.

Virustitterin määritys tapahtui samalla tavalla kuin esimerkissä 1.

c) Molekyylikoskeraattomuuden määritys virusvapaissa näytteissä Määritys tapahtui vertaamalla kuumennetun ja kuumentamattoman näytteen proteiinikoostumuksia, jolloin proteiiniseosten erotus tapahtui sähkökentässä oj) selluloosa-asetaatti-elektroforeesilla ja 02) SDS-polyakryyliamidi-geeli-elektro-foreesilla (SDS-PAGE).

Il it 81720 c1) Mikroalue-elektroforeesi selluloosa-asetaatti-kalvolla (Beckman-järjestelmä)

Elektroforeesi suoritettiin Beckman-järjestelmän mukaisesti (Microzone Electrophoresis Manual, Beckman Instructions 015-O8363O-C, 1977), jolloin näytteet levitettiin veronaalipus-kurilla (pH 8,6) tasapainotetulle selluloosa-asetaatti-kal-volle ja tämän jälken erotettiin proteiinit 250 V:ssa (vir-ranvoiraakkuus 3 - ^ mA/kalvo, ajoaika 20 min.). Kiinnityksen jälkeen tapahtui värjäys Ponceau Sillä, kuivatus ja kalvon densitoraetrinen arviointi.

02) SDS-polyakryyliamidi-geeli-elektroforeesi (SDS-PAGE)

Natrium-dodekyylisulfaatilla (SDS) kuormitettujen proteiinien elektroforeettinen erotus tapahtui 5i:sessa polyakryy- li-geelissä Weberin ja Osbornin otsikolla "The Reliability of Molecular Weight Determination by Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoreses" julkaisussa J. Biol. Chera. 2¾¾, 4406 (1969) esittämän menetelmän mukaisesti. Erotettujen proteiinien värjäys tapahtui Merrill et ai.iin otsikolla "Ultrasensitive Stain for Proteins in Polyacrylamide Gels Shows Regional Variation in Cerebrospinal Fluid Proteins" *:*. julkaisussa Science 21 1 , 1437 (1981 ) esittämän menetelmän mukaisesti firman BIO-RAD hopeavärjäysreagenssisarjän avulla (Bulletin 1089).

d) Vesipitoisuuden määritys virusvapaissa näytteissä Tämä määritys tapahtui samalla tavalla kuin esimerkissä 1. Suoritetun lämpökäsittelyn jälkeen mitatut virustitterit ja molekyylikoskemattomuusmäärityksen tulos nähdään taulukosta VIII.

18 81 720

Esimerkki 7: a) C-|-esteraasi-inhibiittori-valraisteen valmistus C-j-esteraasi-inhibiittori-valmiste valmistettiin ihmisen plasmasta julkaisussa Vox. Sang. 26, 118 (1974) esitetyn menetelmän mukaisesti adsorboimalla anioninvaihtiraessa (DEAE-Sephadex) ja eluoimalla tämän jälkeen. Suolansaostuksen jälkeen ei-toivottujen proteiinien erottamiseksi puhdistettu C1-esteraasi-inhibiittori-valmiste jäädytyskuivatettiin.

b) Malliviruksen inaktivointi C-]-esteraasi-inhibiittori-valraisteen lyofilisaatista saatu vesipitoinen liuos säädettiin 50 mg:aan proteiinia/ml ja siihen lisättiin soluviljelyväliaineessa TCM 199 olevaa Sindbis-virussuspensiota tai vastaavasti virusvapaata TCM 199:ä ja jäädytyskuivatettiin uudestaan. Konsentraatti säädettiin vesipitoisuuteen 0,10 ja kuumennettiin suljetuissa säiliöissä - viruksen kanssa ja ilman - 60°C:n lämpötilassa. Kulloinkin kolme näytettä otettiin ennen kuumentamista ja määrättyinä aikoina kuumentamistapahtuman aikana toisaalta virustitterin ja toisaalta jäämäaktiivisuuden ja vesipitoisuuden mittaamiseksi.

Virustitterin määritys tapahtui samalla tavalla kuin esimerkissä 1.

c) Jäämäaktiivisuuden määritys virusvapaissa näytteissä

Ci-esteraasi-inhibiittorin aktiivisuus määritettiin sen kyvystä estää kroraogeenisen substraatin C1-1-(Pentapharm) hydrolyysi C-|-esteraasin johdosta, julkaisun M. Kleindel, H. Lang, A. Philapitsch, G. Wober, "Thrombosis and Haemostasis", 50, 244 (1983).

Il d) Vesipitoisuuden määritys virusvapaissa näytteissä 19 81 720 Tämä määritys tapahtui samalla tavalla kuin esimerkissä 1.

Suoritetun lämpökäsittelyn jälkeen mitatut virustitterit ja käsittelyn jälkeen vielä esiintyvä jäämäaktiivisuus nähdään taulukosta IX.

Esimerkki 8: a) Plasrainogeeni-pitoisen valmisteen valmistus

Plasminogeeni-pitoinen valmiste valmistettiin D.G. Deutschin ja E.T.Mertzin julkaisussa Science 170. 1095 (1970) esittämän menetelmän mukaisesti. 50 ml lysiini-Sepharoosia tasapai-noitettiin pylväässä 0,1 M fosfataasilla, pH 7,4. 340 ml plasmaa laimennettiin vedellä 640 raitaan ja pylväs täytettiin tällä liuoksella. Saattoproteiinien poistamisen jälkeen, joka suoritettiin pesemällä 0,3 M fosfaattiliuoksella (pH 7,4), plasminogeeni eluoitiin 0,2 M 6-arainokapronihapol-la (pH 7,4). Plasminogeeniä sisältävä liuos dialysoitiin 6-aminokapronihapon poistamiseksi ja tämän jälkeen se jäädy-tyskuivatettiin.

b) Malliviruksen inaktivointi

Plasminogeenin lyofilisaatista valmistettu vesipitoinen li-: uos säädettiin 50 mgtaan proteiinia/ml ja siihen lisättiin soluviljelyaineessa TCM 199 olevaa Sindbis-virussuspensiota tai vastaavasti virusvapaata TCM 199:M ja jäädytyskuivatet-tiin uudestaan. Konsentraatti säädettiin vesipitoisuuteen 0,08 ja kuumennettiin suljetuissa säiliöissä - viruksen kanssa ja ilman - 60°C:n lämpötilassa. Kulloinkin kolme näytettä otettiin ennen kuumentamista ja määrättyinä aikoina kuumentamistapahtuman aikana toisaalta virustitterin ja toisaalta jäämäaktiivisuuden ja vesipitoisuuden mittaamiseksi.

Virustitterin määritys tapahtui samalla tavalla kuin esimerkissä 1.

o) Jäämäaktiivisuuden määritys virusvapaissa näytteissä 20 81 720 Tämä määritys tapahtui sillä tavalla, että plasrainogeeni-pitoinen näyte aktivoitiin K.C. Robbinsin ja L. Summarian julkaisussa Methods in Enzymology, J_9, 184-186 ( 1970) esittämän menetelmän mukaisesti streptokinaasilla plasmiiniksi ja vapautettu plasmiiniaktiivisuus määritettiin muodostamalla osamäärä kaseiinista vapautetuista TCA-liukoisista loh-kaisutuotteista.

Suoritetun lämpökäsittelyn jälkeen mitatut virustitterit ja käsittelyn jälkeen vielä esiintyvä jäämäaktiivisuus nähdään taulukosta X, mistä nähdään, että viruksen toteamisraja saavutettiin tyydyttävällä jäämäaktiivisuudella 5 tunnin kuluttua.

Esimerkki 9: a) Plasmavalmisteen valmistus

Nuorien luovuttajien veri otettiin verenluovutuspussiin, joka sisälsi trinatriumsitraatti-liuosta. Sen jälkeen kun seosta oli hieman sekoitettu, se sentrifugoitiin. Päällä oleva plasma dekantoitiin pois; 400 ml plasmaa sekoitettiin 15 i:sen glysiiniliuoksen kanssa, jota liuosta oli 22 ml, pH = 3,6.

b) Maliiviruksen inaktivointi

Glysiinillä puskuroituun plasmaan sekoitettiin soluviljely-väliaineessa TCM 199 olevaa Sindbis-virussuspensiota tai vastaavasti virusvapaata TCM 199:ä, jäädytyskuivatettiin ja säädettiin vesipitoisuuteen 0,08. Suljettuja säiliöitä, joissa oli kuivaplasraanäytteitä - viruksen kanssa ja ilman virusta - kuumennettiin 60°C:ssa eri pituisia aikoja. Kulloinkin kolme näytettä otettiin ennen kuumentamista virus-titterin ja toisaalta jäämäaktiivisuuden ja vesipitoisuuden mittaamiseksi.

Virustitterin määritys tapahtui samalla tavalla kuin esimerkissä 1.

li 21 81720 c) Jäämäaktiivisuuden määritys virusvapaissa näytteissä Tämä määritys tapahtui siten, että selvitettiin plasman aktivoitu osittainen troraboplastiiniaika (aPTT) siten, että mitattiin seoksen koaguloitumisaika, jossa seoksessa oli 0,1 ml plasmaa, kaoliini/fosfolipidi-suspensiota ja 0,025 molaa-rista kalsiumkloridia. Kuumennetun näytteen jäämäaktiivi-suus laskettiin muodostamalla osamäärä kuumentamattoman näytteen aPTTtstä ja vastaavan kuumennetun näytteen aPTTrstä.

Suoritetun lämpökäsittelyn jälkeen mitatut virustitterit ja käsittelyn jälkeen vielä esiintyvä jäämäaktiivisuus nähdään taulukosta XI, josta nähdään, että viruksen toteamisraja on saavutettu jo 0,3 tunnin kuluttua jäämäaktiivisuuden säilyessä tyydyttävänä.

Esimerkki 10: a) Fibrinogeeni- ja fibronektiini-pitoisen valmisteen ; valmistus

Kryosaosteen ja protrombiinikompleksi-komponenttien erotta-*; misen jälkeen ihmisen plasmasta saatava emäliuos jäähdytet- :: tiin 0°C:seen ja lisättiin sekoittaen niin paljon etanolia, että saatiin loppukonsentraatioksi 0,08 (8¾). Lämpötila säädettiin -2°C:seen ja pH-arvo arvoon 7,0. Suspensio sent-rifugoitiin ja saatua pastamaista sakkaa, joka sisälsi fibrinogeeniä ja fibronektiiniä, pestiin niin kauan sitraatti-glukoosilla, pH 6,9 - puskuroidulla 6,5i:sella etanoliliuoksella, kunnes emäliuoksessa voitiin osoittaa enää 0,5 mg proteiinia/ml. Puhdistettu fibrinogeeni jäädytettiin ja jäädytyskuivatettiin etanolin poistamiseksi.

22 81 720 b) Malliviruksen inaktivointi

Lyofilisaatin vesipitoinen liuos säädettiin 50 mg:aan pro-teiinia/ml ja siihen lisättiin soluviljelyväliaineessa TCM 199 olevaa Sindbis-virussuspensiota tai vastaavasti virusva-paata TCM 199:ä ja jäädytyskuivatettiin uudelleen. Konsent-raatti säädettiin vesipitoisuuteen 0,08 ja kuumennettiin suljetuissa säiliöissä - viruksen kanssa ja ilman - 60°C:n lämpötilassa. Kulloinkin kolme näytettä otettiin ennen kuumentamista ja määrättyinä aikoina kuumentamistapahtuman aikana toisaalta virustitterin ja toisaalta jäämäaktiivisuuden ja vesipitoisuuden määrittämiseksi.

Virustitterin määritys tapahtui samalla tavalla kuin esimerkissä 1.

c) Jäämäaktiivisuuden määritys virusvapaissa näytteissä Tämä määritys tapahtui c·)) tehokkuustestin avulla (trombiiniaika), jolloin fibrino-geeniliuoksen tehokkuus määritettiin julkaisun U-S-Pharma-copeia, 16. Revision (USP XVI, 1960), s. 298 mukaisesti siten, että fibrinogeeniliuoksen näyte sekoitettiin kalsiumk-loridin ja trombiinin kanssa ja koaguloitumisaika määritettiin. Jäämäaktiivisuus laskettiin muodostamalla osamäärä kuumentamattoman näytteen koaguloitumisajasta ja kuumennetun näytteen koaguloitumisajasta. ja C2) määrittämällä koaguloituva näyte

Fibrinogeeniliuoksen koaguloituva proteiini määritettiin julkaisun USP XVI, s. 298 mukaisesti siten, että (1) määritettiin fibrinogeeniliuoksen koko proteiinipitoisuus (Kjeldahlin mukainen typpimääritys) ja (2) määritettiin trombiinilisäyksen jälkeen koaguloituvan fibriinin proteiinipitoisuus saman menetelmän mukaisesti (Kjeldahl). Fibriinin proteiiniarvosta (2) ja koko proteiinin proteiiniarvosta (1) muodostettu osamäärä antoi tuloksena koaguloituvan proteiinin.

Il 23 81 720 Jäämäaktiivisuus laskettiin muodostamalla osamäärä kuumennetun näytteen koaguloituvasta proteiinista ja kuumentamattoman näytteen koaguloituvasta proteiinista.

d) Vesipitoisuuden määritys virusvapaissa näytteissä

Vesipitoisuuden määritys tapahtui samalla tavalla kuin esimerkissä 1.

Suoritetun lämpökäsittelyn jälkeen mitatut virustitterit ja käsittelyn jälkeen viellä esiintyvä jäämäaktiivisuus nähdään taulukosta XII, josta nähdään, että viruksen toteamisraja on saavutettu 5 tunnin kuluttua, jolloin esitettyjen menetelmien mukaiset jäämäaktiivisuudet olivat tyydyttäviä.

Esimerkki 11: a) Alburaiini-pitoisen valmisteen valmistus 10 litraan ihmisen veriplasmaa lisättiin pH-arvossa 7,0 ja -2°C:n lämpötilassa 0,08 etanolia, jolloin saostui sakka, joka sisälsi fibrinogeeniä. Sakan erottamisen jälkeen korotettiin etanolin konsentraatio arvoon 0,25 ja lämpötila laskettiin -6°C:seen. Saostava sakka, joka sisälsi immunoglobu-;· liiniä, erotettiin ja eraäliuoksen etanolikonsentraatio ko rotettiin pH-arvossa 6,5 ja -8°C:n lämpötilassa arvoon 0,40, jolloin tapahtui toinen saostuminen. Sakka erotettiin ja : heitettiin pois. Albumiinin saostamiseksi saatettiin samassa lämpötilassa emäliuoksen pH arvoon 5,4. Sakka erotettiin sentrifugoimalla ja alistettiin toiseen puhdistusvaiheeseen siten, että se liuotettiin veteen ja etanolikonsentraatio saatettiin pH-arvossa 4,8 ja -2°C:n lämpötilassa arvoon 0,10. Saostunut globuliini erotettiin ja heitettiin pois. Emäliuoksen etanolikonsentraatio nostettiin arvoon 0,40, lämpötila laskettiin -8°C:seen ja pH saatettiin arvoon 5,1. Sakka on albumiinia ja se kerättiin sentrifugoimalla ja jäädy tyskuivatett iin .

2M 81720 b) Malliviruksen inaktivointi

Lyofilisaatin vesipitoinen liuos säädettiin 50 mg:aan prote-iinia/ml ja siihen lisättiin koiranhepatiittivirusta, joka oli soluviljelyväliaineessa TCM 199, tai vastaavsti virusva-paata TCM 199:ä ja jäädytyskuivatettiin. Jäädytyskuivatettu albumiinikonsentraatti säädettiin vesipitoisuuteen 0,07 ja kuumennettiin suljetuissa säiliöissä - viruksen kanssa ja ilman - 60°C:ssa eri pituisia aikoja. Kulloinkin kolme näytettä otettiin ennen kuumentamista ja määrättyinä aikoina kuumennustapahtuman aikana toisaalta virustitterin ja toisaalta molekyylikoskemattomuuden ja vesipitoisuuden mittaamiseksi.

Virustitterin määritys tapahtui samalla tavalla kuin esimerkissä 5. Molekyylikoskemattomuuden, nimittäin selluloosa-asetaatti-elektroforeesissa ja SDS-polyakryyliaraidi-geeli-elektroforeesissa esiintyvän käyttäytymisen määritys tapahtui samalla tavalla kuin esimerkissä 6.

c) Vesipitoisuuden määritys virusvapaissa näytteissä Tämä määritys tapahtui samalla tavalla kuin esimerkissä 1.

Suoritetun lämpökäsittelyn jälkeen mitatut virustitterit ja raolekyylikoskeraattorauus nähdään taulukosta XIII, josta nähdään, että viruksen toteamisraja saavutettiin jo tunnin kuluttua ja molekyylikoskemattomuus ei osoittanut mitään muutosta verrattuna kuumentamattomiin kontrollinäytteisiin.

Esmerkki 12:

Verivalmisteiden valmistus käytettäessä nestemäistä väliainetta, johon ne eivät liukene

Esimerkin 1a) mukaisesti valmistettu tekijä VIII-valraiste säädettiin 50 mgraan proteiinia/ral, siihen lisättiin Sindbis-virussuspensiota, joka oli soluviljelyväliaineessa TCM 199, tai vastaavasti virusvapaata TMC 199:ä ja jäädytyskuivatettiin. Jäädytyskuivatettu tekijä VIII-valraiste sääli 25 8 1 7 2 0 dettiin vesipitoisuuteen 0,09. Useihin säiliöihin, joissa oli jäädytyskuivatettuja tekijä VHI-näytteitä - viruksen kanssa tai ilman - lisättiin jokaiseen 10 ml vesikyllästettyä kloroformia (jotta näytteiden vesipitoisuus ei muuttuisi), ne suljettiin ja niitä kuumennettiin 10 tunnin ajan 60°C:ssa. Kulloinkin kolme näytettä otettiin ennen kuumentamista ja määrättyinä aikoina kuumentamistapahtuman aikana toisaalta virustitterin ja toisaalta jäämäaktiivisuu-den ja vesipitoisuuden mittaamiseksi.

Ennen virustitterin ja jäämäaktiivisuuden määritystä vapautettiin näytteet liuottimesta imemällä tyhjössä.

Virustitterin ja vesipitoisuuden määritys tapahtui esimerkissä 1 esitetyllä tavalla.

Suoritetun lämpökäsittelyn jälkeen mitatut virustitterit ja käsittelyn jälkeen esiintyvä jäämäaktiivisuus on esitetty taulukossa XIV, josta nähdään, että virustitteri laski 3 tunnin kuluttua totetamisajän alapuolella, kun taas jäämä-aktiivisuus oli 0,85.

·;’ Samalla tavalla tarkastettiin koiranhepatiittiviruksen inak- tivointi FEIBA- tai osittaisprotrorabiinikorapleksivalmistees-sa, jolloin FEIBA-valmiste valmistettiin esimerkin 5a) rau-..· kaisesti ja osittaisprotrombiinikorapleksi-valrasite esimerkin 3a) mukaisesti. Virustitterin määritys tapahtui esimerkissä 5 esitetyllä tavalla. Suoritetun lämpökäsittelyn jälkeen mitatut virustitterit nähdään taulukosta XIV.

Seuraavissa esimerkeissä on esitetty verituotteiden valmistusta, jolloin käytetään keksinnön mukaista inaktivointia mahdollisesti esiintyvien lisääntymiskykyisten suodatettavien taudinaiheuttajien tekemiseksi vaarattomiksi.

26 81 720

Esimerkki 13:

Tekijä Vlll-valmisteen valmistus 100 1 tuoreena jäädytettyä plasmaa sulatettiin 0 - +4°C:ssa. Muodostunut kryosaoste erotettiin sentrifugoimalla ja se liuotettiin 10,5 litraan trinatriumsitraatti-liuosta, joka sisälsi 50 mg natriumpentosaanisulfaattia/1 ja 30 000 yksikköä aprotiniiniä/1. Liuoksen pH saatettiin arvoon 6,3 ja lämpötila säädettiin +4°C:seen. Muodostunut sakka erotettiin sentrifugoimalla ja heitettiin pois.

Lisäämällä etanolia, kunnes konsentraatio oli 0,08, saostet-tiin tekijä VIII-pitoinen fraktio. Muodostunut sakka erotettiin sentrifugoimalla, liuotettiin glysiini-sitraatti-NaCl-puskuriin, jäädytyskuivatettiin, säädettiin vesipitoisuuteen 0,08 ja kuumennettiin 10 tunnin ajan 60°C:ssa. Tekijä VIII-aktiivisuusmääritys kuumennustapahtuman jälkeen tuotti jää-mäaktiivisuudeksi 0,92 (92¾) verrattuna kuumentamattomaan materiaaliin.

Galeenisen valmisteen valmistamiseksi liuotettiin inaktivoitu jauhe tislatulla vedellä lisäämällä glysiini-trinatrium-sitraatti-NaCl:a siten, että saatiin liuos, jossa oli 25 IE tekijä VIII:a/ml, 10 g glysiini/1, 10 g trinatriumsitraat-ti*2H20:ta/l ja 5 g natriumkloridia/1. Säädettiin pH arvoon 7,0, minkä jälkeen liuos suodatettiin steriilisti, täytettiin 20 ml:lla/pullo loppusäiliöihin ja jäädytyskuivatettiin. Jäädytyskuivatetun materiaalin tekijä VIII-aktiivisuusmääri-tys loppusäiliössä tuotti tuloksena 480 IE tekijä VIII:a/pullo.

Il 27 81 720

Esimerkki 14:

Tekijä VIII-valmisteen valmistus inaktivoinnin aikana muodostuneiden neoproteiinien poistamisen jälkeen 46 1 tuoreena jäädytettyä plasmaa sulatettiin 0 - +4°C:ssa. Muodostunut kryosaoste erotettiin sentrifugoimalla ja liuotettiin 960 ml:aan tri-natriumsitraatti-liuosta 37°C:ssa. Muodostunut sakka erotettiin sentrifugoimalla ja heitettiin pois. Tekijä VIII-pitoinen emäliuos jäädytyskuivatettiin, lyofilisaatti saatettiin vesipitoisuuteen 0,075 (7,5¾) ja lämpöaktivoitiin 10 tunnin ajan 60°C:ssa mahdollisesti esiintyvien lisääntymiskykyisten suodatettavien taudinaiheuttajien, kuten hepatiittivirusten tekemiseksi luotettavasti vaarattomiksi. Tekijä VIII-aktiivisuusraääritys kuumentamisen jälkeen tuotti tuloksena jäämäaktiivisuuden 0,95 (95i) tekijä VIII:a verrattuna kuumentamattomaan materiaaliin.

Kuumentamattoman ja kuumennetun jäädytyskuivatun tekijä VIII-valraisteen näytteitä tutkittiin SDS-polyakryyliamidi-geeli-elektroforeesilla. Kuumentamattoman näytteen kohdalla saatiin kuviossa 4 kirjaimella a merkitty kaistakuvio. Kuumentamattoman näytteen kohdalla saatiin kuviossa 4 kirjaimella b merkitty kaistamalli, jossa esiintyi kirjaimilla Ni, “ N2 ja N3 merkityt kaistat, jotka johtuvat neoproteiinien esiintymisestä inaktivointilämpökäsittelyn aikana. Nämä neo-proteiinit on poistettava keksinnön mukaisesti suorittamalla kuumennettujen tekijä VIII-valmisteiden jälkikäsittely tai vastaavasti fraktioinnit tapahtuivat liuottamalla kuumennettu tekijä VIII-valmiste 900 ml:aan vettä ja lisäämällä etyylialkoholia, kunnes konsentraatio oli 0,10. Tällöin saostui tekijä VIII-pitoinen fraktio, joka erotettiin sentrifugoimalla ja liuotettiin glysiini-sitraatti-NaCl-puskuriin. Liuos muunnettiin galeeniseksi valmisteeksi esimerkissä 13 esitetyllä tavalla.

Puhdistetun fraktion SDS-polyakryyliamidi-geeli-elektrofo-reesi tuotti kuviossa 4 kirjaimella d merkityn kaistakuvion: 2β 81720 O,10-alkoholisaostuksen emäliuoksen tutkimus tuotti kirjaimella c merkityn kaistakuvion. Siitä nähdään, että neoprote-iinit Ν·|, N2 ja Ng pysyivät alkoholisaostuksen eraäliuoksessa, kun taas puhdistettu tekijä VIII-valmiste ei enää sisältänyt näitä kaistoja. Esitetyssä alkoholifraktioinnissa poistetaan myös muut proteiinit. Fraktioidussa valmisteessa oleva tekijä VIII-aktiivisuus on olennaisesti säilynyt, nimittäin arvossa 0,70.

Keksinnön mukaista lämpöinaktivointikäsittelyä voidaan pidentää 100 tuntiin asti kadottamatta aktiivisuuksia. Tärkeiden koaguloitumistekijöiden stabiliteetti kuumennettaessa 100 tuntiin asti määrätyissä, keksinnön puitteissa noudatettavissa lämpötila- ja vesipitoisuuksissa nähdään taulukosta XV.

Esimerkki 15:

Tekijä VIII-valraisteen valmistus käytettäessä suojakaasua

Esimerkissä 1 esitetyllä tavalla valmistettuun tekijä VIII-pitoiseen liuokseen lisättiin Sidbis-virussuspensiota, joka oli soluviljelyväliaineessa TCM 199, tai vastaavasti virus-vapaata TCM 199:ä.

Jäädytyskuivatettu tekijä VHI-konsentraatti säädettiin vesipitoisuuteen 0,08 (8-paino-i), saatettiin evakuoimalla kolme kertaa 100 mbaariin ja kaasukäsittelemällä tämän jälkeen ilmalla, typellä, heliumilla tai vastaavasti argonilla erilaisiin "atmosfääreihin" ja kuumennettiin suljetuissa säiliöissä 80°C:n lämpötilassa eri pituisia aikoja. Jokaisesta muunnelmasta otettiin kulloinkin kolme näytettä ennen kuumentamista ja määrättyinä aikoina kuuraennustapahtuman aikana toisaalta virustitterin ja toisaalta tekijä VIII:n jää-mäaktiivisuuden ja vesipitoisuuden mittaamiseksi.

Virustitterin, tekijä VIII:n jäämäaktiivisuuden ja vesipitoisuuden määritys tapahtui esimerkissä 1 esitetyllä tavalla; tulokset nähdään taulukosta XVI. Siitä nähdään, että

II

29 8 1 7 2 0 tekijä Villin jäämäaktiivisuudet tai vastaavasti saannot kuumennettaessa inertin kaasun (typen, heliumin, argonin) atmosfäärissä ovat olennaisesti korkeammat kuin kuumennettaessa ilmassa. Virusinaktivoinnin nopeus on sitä vastoin riippumaton atmosfääristä, jossa se kuumennettiin.

Esimerkki 16:

Osittaista protrombiinikompleksia sisältävän valmisteen valmistus käytettäessä suojakaasua

Esimerkissä 3 esitetyllä tavalla valmistettuun valmisteeseen, joka sisälsi koaguloitumistekijöitä II, IX ja X, lisättiin Sindbis-virussuspensiota, joka oli soluviljelyväli-aineessa TCM 199, tai vastaavasti virusvapaata TCM 199:ä ja jäädytyskuivatettiin. Jäädytyskuivatettu konsentraatti säädettiin vesipitoisuuteen 0,08, saatettiin evakuoimalla kolme kertaa 100 mbaariin ja kaasukäsittelemällä tämän jälkeen ilmalla, typellä, heliumilla ja argonilla erilaisiin "atmos-fääreihin" ja kuumennettiin suljetuissa säiliöissä 90°C:n lämpötilassa eri pituisia aikoja. Jokaisesta muunnelmasta otettiin kulloinkin kolme näytettä ennen kuumentamista ja määrättyinä aikoina kuumentamistapahtuman aikana toisaalta virustitterin ja toisaalta tekijä XI:n jäämäaktiivisuuden ja vesipitoisuuden mittaamiseksi.

Virustitterin ja vesipitoisuuden määritys tapahtui esimerkissä 1 esitetyllä tavalla, tekijä IX:n jäämäaktiivi-suuden määritys tapahtui esimerkissä 3 esitetyllä tavalla.

Tulokset on esitetty taulukossa XVII. Siitä nähdään, että tekijä IX:n jäämäaktiivisuudet tai vastaavasti saannot kuumennettaessa inertin kaasun (typen, heliumin, argonin) atmosfäärissä ovat olennaisesti korkeammat kuin kuumennettaessa ilmassa. Virusinaktivointi on sitä vastoin riippumaton atmosfääristä, jossa se kuumennettiin.

30 81 720 c

to W

l 1 - g g <0 1-1 _ o o •H :<e S -

> .r-ι lH I—I

•H

•τΊ C ° °

u ^ O

^ « _ * IB -Η ° ή 1-1 :« B 1—1 0 «9 :n> u _ :c0 c co o cn o

ι-j qj CO CO ON O

p ΓΟ s " · · c 3 Ο Ο Ο r-1 .. 3 i_i wo m o on m m co on o oo m e 1—1 »>.*.» * > 4) o o o .—I o 0) :« c „ _ ..-, :q o m o o r>

H 4J CO CO ON O O ON

OS ' ' » ' » ·“

ψφΟ O O r—I i O

H JS

9 ^ rH

«g v v

M C

O <U *2 H 4) 18 __ H OH° ~ ^ '

i S ΐ o V

·* ° „ 3 r- * 3 v. a) CO !—I Ή I rH r-l 3 - - 3 C» V V V v v ^ ^ nj

ZL .W «H Ä Z

, ,5 u σ ο <e r- «r

** -. 0 Ή Ή r—{ Ή ·» r—I H

« *j V V V ™ V coco

; xj C

.... .HO) g cn σ\ ^ ό * qo9^ www

'-** 3 3 O <-H CM ΓΟ Γ0 rH

. · . V. x V V

• H

> c * . . | ^) »H VO Ρ“* : « a> * * * •H C ° ^ ^ -0 :« - * Ό u ¢3¾ rHCVJrHO ON Γ-*· r—< • H <U ^ *w w. *w ·. w. <w w.

& m in in in ^ m ^ Φ _:----

4J

Cfi .* * 0 .h ^4 ^ '" a -° oooo o oo ___ > -O VO VO VO VO 00 vovo 1 0.0 M B « M :(β

M >J

. .·. > ---- ... :w I 0» •Ό 3

-.-* ·* Q. 3 in VD

-H CO OOOCO CO »H o • _ ; « to .H in Γ0 (N o o oo * - - H 0)0 . . . . . . .

>4J oooo o oo mom

*“H rH

II

3i 81720

c ] I I

CO

O 0) 3 Jrf 00 Ή :<e > ·—> •m ,h ° ^ 4J 4i -id OJ ° td ·Η O ITl r-l :co B ^ ‘ 8 <0 ® :<u aj :co c

·*-> a> O

g O O H

C 3 ή "

..3 I—I

Μ Λ

M O

I—I 0 O

3> n) ΓΠ te rH

V I—I

:<8 c ··) :<g o H AJ o

Ji «0 r-l h H

aj οι r-i H m

-1 AJ

O = ° «

—I B /-N

^ Ξ <o 3 in r-l

HJ 'H Ji ° - M

V. m >—( m (N

* c V

O^Q) ® ji " ί _ «n * V ·η _ o » Ji * s " :5 B -« ^ 3 f» -H Ϊ « <S> V ^ 3 3 a Q) 3 03 1/1 «13

H 'Γ* Λ! -H ^ - H

> ;„, m ^r » '"L c"> n •f* ^ — r—| ·. ^ £ a *> * ™ S · 0 w M < tn <e

•H

<u " aj :o o o n ex a vd vd • rt S» e 3 rj «e--- ► i i m m m -H o o

*-< to O O

M ai to - -

> > 3 O O

ltd , — φ---- -

•'"l -W .H

•f· <-t o

·* O XI

« C -H O

H te a ·-< U ' m o S _ m o

»H

32 81720 c

to V

3 V U

3 M O O

co ^ O O O

•H 1*0 ΓΟ * ·.

> rH rH

H

•H C

u v «0 O o *0 -M o o :«β B o

e *0 rH rH rH

.‘<0 -O

:<o c •Ό 4» 5 C 3

••3 O O

*-* Λ O o M n v -

^ O rH rH

> 0) 4» :«o g *>“> ifl)

•r* O O

CO O O

® * rH r

H -* rH H

__ 2 a

60 ® CM

0 tj ° rH

-· S ^ v 04 M w S ►"·

M Ξ M

M ·Η ~ l-l

K ~ O O

o 4) * O * o - M U _ rH »T -sr J«! ·υ .. Ji 3 "« % 3

r-l iJ * rH

3 ® ·« ° 3 σ> CO 37; ro q «

Hl v· _ c m H m

• H * V

> ® 4) 1 ·* Ji vo Λ /'“s* rH ^ ^

•rl O I® ΙΛ VO

.0 m ·ό

T3 Q

e m e vo q· •rl O 41 O ..

CO H CO VO VO

G

r-H

4J

a> :o o o •u cl o CO 60 •h :co

β -J

*o--- >

1 · ΓΗ (N

M 'H O O

I-· ® o o

M 4) X

> > * O O

:q I 3 •^ u---3--- •H Ή « .* ·Η ·η _

4) C O S

H C « H.

q -H -H

X u O. 0 m o in

rH rH

II

33 81 720 a v α>

a M

3 -f 3 :ce (0 ·<-»

•H

> e • i-l 3) •r-l 0)

v> -rJ vi CO O O

JC 0 00 O O

«8 (8 O «. * »

CGJ JJ -“H CO H H

S e

:cg V

:<o S

3 3 in o o c j* σι o o ·· n ·. *> *·

X C O ι-H iH

M 01 0) :w c ·<-> :<8 o •H J-l o

Ji e ^ ·.

<U <U rH

H JC

C

V

•ι-f -y U --1 « a

M M O O

•M c o o v «.

o " " -t O OM (N

ji p « .* 3 * ® 3 -H td 3 > u 3 r- cb ® no <o -

H H S H CM (N

3 Τ'. —< 3 a « ^ "* nr- 5 * =3 r-l O - -· (M rs «η ο cv ω ·τ4 Q}

β> Vi O C

V t ! ; I -

I « 2 l M

M PQ w jrf •H " ” .5 • H -1

£> ‘H

B <u " O vi *® t, to a. a o o o jj -H B o M0 CO σι

OS

Vi ^ ^ :: o. at >·___ «8 . vi :«a 00 > •h :<8 to VI I «0 u *—I ·Η 3 vi :<8 °* 3 "T -a-

•H 05 -H 01 O O

05 -H to -rH O O O

o « ij ° - - > " o o o m o in r—( *—l 34 81 720

C

V

9)

co M

O rM

3 :<o co

H

> C

• H 9) •<-i en 4J *l-t 0 ij r-

co CO

:« 4j m

Bo o :*o v

:a> B

"-I 3 3

C JO

·* O

X! C O

M <U rH

_ « -t :«o c ••n :<o

•H 4J

Ji CB

0) V

H JO

O

r—^ 60 xj

O

^ n h

e V

> -H « ^ u <u ^ o * „ Ji ^ *

Ji * c _ n J* " « :«d s " 4) -< ~ e n co 3 03 :<0 C ~ co ” 4J 4, O *· H £ « «e •H *

> “ S

; CO rH CM

_ 4J * " ,H o c o m X, m oi ^ a s

e i—I 3 <H

O 3 O

0) M H Λ VO

4J

CO ____

•H

8

I »H

•H ίβ * C > ^ 5 > :° o S 2 Ϊ n ^ :aj :«d j o n u *h

Ou CO —_ <0 cd 4J .r4

CO CO

•H * «e 4) ^ 3 a -i “· 3 O CL ·γ4 «0 I" jt B « ·η o O o · o * .tf > -U o m

II

35 81 720 *J o » a 05 o 3 n, o - ·

3 05 ro O rH

°> -rl > S _ ° ° 1 «e ° XJ rH r-H r-1 ·* c 00 u α) o σ> o Ϊ S ^

*3 rH O rH

:2 3 .S ^ o o o :2 ή * * *·

C rH rH CO rH

<u CO

OJ c (H

C C OI - ° ” :oj - « j* .no o

Ph

4J

n-

O rH

m ν' rH

ID

^ O rH

o V ^ m

Se®5 ro ·

0 „ m > rH rH

H oj og V V

o ή in rH co

H M H r H rH

60 Π ΓΜ V ^ rH C 1—1

<y *► ^ rH CO

►H oj o r) \s M

> ·Η -H >

_ l-l B

O qj cfl fN rH O

4J u *· \/ M

•X U G ° Hl ___ 3 ·Η 0) 3

Ή tl E rH

3 gg 3 rH 00 3 •e a a ·. - co

H ^ ^ o m H

• H

·:·. > e - - i <p in <0 0) O <r ' ‘ . .h e * cm ...' λ :« o

o XJ 05 rH 1" (N

C w r r - - ; r -h u o m h1 «j· in . . CO Ji e

•H

XJ

:o o o o o

Q. U ID id 05 lO

m S « " :<0 . . ' 00

• H

B -H

r-1 rH 00

« 0 3 P

> 0 3 1-1 1 «to * <! XJ -H ° 03 0). O___ ►H xj w I -H Γ" O'

Ph .h ex O Γ'· CO o 00 o o o o

0) *. X *. X

J* o o o o m o 36 81 720 cc 3 a 3 ® ΓΟ Ή "H eo

•H AJ

JJ C 0 JC .

„ "I -

.“SS

2 2 3 §5 S s 5 - 4 o-

^ r-( O

XJ

c <"0 QJ O ·«

Oj m (N

•H J4

iJ i-H

0» :ce «ey 4J ··—»O % 4-» f-H ΓΟ • H β

«u D cd O

M n CO M «.

M 3 ·Η n i-\ r-< M ^ > V- B VV >

0 > j-l O (N

Ji ·Η (J r-i <ΗΉ JÄ AJ a> v> V .* m· 3 aj~ s ^ 3

r-C ·> O 3 f-C

3 -H ui 3 Π r-l 3

cg tl Q « «iH CO

H CO M o CM V H

o-ο a

0) H <U

Λ 01 .-H VO

C O C * «. rH

* ή :«o <n w eo tj •rt O CO m Id 00

Oh «o ^ *.

ro CO «0«

CO

pH

• H 4J

a» :o υ

u O- O

® Θ o o o •h :aj vD co vo

8 i-J

CO

> --- < ta I m >-> -H 3 ω as bt ·η <» (h. r> m <0 ·Η O O r-l vo . o > tJ o o o uo o

»H

II

37 81 720

4J

c cc Π •h o) aj o σ'* 00 i ·η c u r-( - 9 US -H JM o

9 VO C M

S > u e v :v o -u -rt » :« v -i w 9 tN ' S*. «CO -H ^ 3 ^

JM -rt 3 U > -rt JM

0) B « « *rt 4J

i—I 4J c *rt AJ C

O ·η <o o « q V

£ V M JM JM 9 V

«wc —— — — :<e aj :co c θ « « Ξ? » S S .2 " ° O g -- CO *-» Ä

Mu ° « 0 e o r-t 77 ^ V rH «1/ O Ή M g \r O -j .

M ξ X r-, ^ V

M -rt " > VJ ^ o 3

4) Tj" ». o ·"-* V O

o «e n JM U V -sr JM«S * * S w n JM M i 3 " V ^ 3«_ T3> '-'«_·<β ,—1 ® :q (N * 3 ·<β ^ 9 3 u q< 3 u *« „ Ν 9 w tl H * " C ^ H M ω 2 V « > JM m * £ * 1 M ^ M * M o ... oo C ιλ >Sr—I·.

— O v oj 1 * 1/1 JOU-3V 2 ®Λ " 3 Ό Q JM — _ ·ιΗ o 9 t? c M M * Λ IA V q.

“ -H υ :q ^ 0 ·° Q S o

S (OH -n ® q m 9 VO

B " ·η O 9

·· "2__3 CO H JM

• · td k : : > » l- ----1- c « H « 0) M o w

c ·-< « .H

•rt « « JJ

o :o o m ._ « O. CJ VO -rt rv ro _

•rt B o ja S* βυ O

o. :« -rt B 0 VO

•rt hJ JS 2 c c

•H *H

* I I . - I.I.I-- II.' .11 ·ρ4 o »-- jo m O te -« ' ; u i oo 60 -rt 9 V .rt 9 ° rt 2 " O. 9 Π -rt » ® .rt m * * "1 en V « E « ° o ' V o ° E > « .. —1 > 4_i ·~·

M O U

..o in o rrt ^ 3s 81720 at a a t> 3 0)

tt JO

•H t—< U (sg

> :<o O 10 C

m 3 a; ΓΗ 3 « JJ C 10 ·* ^ v -π a <0 to > <0

:« *H I iH

aa -h c :* * ^ " S u g N °*· 3 3 ! ah c B ° -S5 - j o •h 3 :to c 3 :<o c 4) JO —i 41 ® ® 3 I Γ'· 60 = B B a> ^ s; Οβ> ·. MO 9) ^ ^ c « H *J jo 0 0 •H c , . H « ^ Θ :« 1 a. a> :to to JJ to JO ··“> to a r-t HI "7^

(V, JO O

--ir\ a M c o « <» »-H H 4» 60 * O M O'-· ^ 4J x :to x '— in ?? 1-1 c v o ° Ο -H 2 m ^ * r: s v 4) ·* V 3 » ~ jj C -< ^ 3 .H ® ^ ^ « ® * « : 5 c - μ sr S ® ® ^ jj a ^ .1-1

4) ·Η 1/1 «0 3 V

> j< a H 3 3

f «0 ^ W JO

""o' * > = Ί H

• So S ° i 5= V

JJ c “ 3 1/1 -J c ^ ® .H o B Λ :«o ^ •s - - * 1 : o « ·“· -'- -rJ 4) j

® to jo I

> «0 j I

C r-t «0 J

® .rt -.

e xj .* ,rH :o __ jj ° a u ° :o _ jj S o ^ a. u ° ••J :« a o I vs j o. ,j a> :«o •h JJ j C to 43 ·* 4)--a-- 60 r-l O I «0 a > ~ •-I I O> <0 I to B .n a eo B ·η 3 j

» 0.3 ΙΠ «0 Q. 3 j iN

4 ·η 0) Ο «β ·Η β LO

^ (¾ ·Η * ·"· 00 ·Η Ο C^4 d) O O Cu <υ ο «» > ϋ > u ο ΙΛ

II

39 81 720 -- cg θ

<8 C

^ η aj -H

« 3 C ·Η w " ° « g 2 « = s " s 5 S Is

'H cg X

•ί B a cg :cg ^ ·η > jd ^ c cg -d cg s ^ Π o c •U -rl AJ 3 ^ :« Jd 3 a c ·* « „ :cg aj

-H o V C AJ C AJ

cg -f-c r-t C β» O <—( -H -rt CD

:« λ a :<e v ω σ> Ξ e u B a m u j^h » ·. B Bu :rtoee»^· oo .* 0 « W U O 9) *8) *"%—t '"’fsj g u > >“} AJ Jd Jd ‘’“I U U -;-- __ 0 o O r-f tn « c q « « " -u v O β -r4 ·* _< cg u 1-1 ^ 1-1

M u V V

o O aj ·->

.-J v M AJ

w E i-c c 3 t-ι u ^ •H 3 AJ X ® " W * 3 '2 v in <—( o u B nj ^

AJ O V/· M *rj V

AJ V Jtf > “

•Ί 9) 3 -H C

aj o m —< aj 2

CO :<e (M - 3 AJ ^ S

3 " rH « -Ί o ° "m * ? H -H ^ ®

.S. ·Ί « AJQ ^ H rH

> * O «M _ V

•LS! · - B VH » ·.·* -M O v J= 2 ..•ii A in ® C 0.5 : -h *5 o ·* σ> « 01 --¾ c c m -Ί o u oe “ : ? .H .h 0 :« v .u o » o m - £ -u crt H —> « o “ - - -*^-1 AJ AJ X >* * . ^--oo

Φ M *H

c _ B

o s * ·* I. *“·4

A -o > .U

£ 2· « S « :o o <u .5 « o. o o

cg aj j C Θ A

m -* ·ί :cfl

•U o .J

-.. I B---“

• f» f-I *H

c cg o.-------

AJ ^ *H

. - i * i ® a SO C ··· 3 -u o S a 3 -H I «e -· 2 - ·Ί CO E ·Ί 3 - - ·5 .5 * ·Η £ 3 A 3 • .- u o ® ° S A -H « r~ . . A AJ > AJ ^ CO-rJ 0

- Ή -H O < «O

b a __ > aj 0 40 81 720 a a e »3 v 3 β» „ 3

3 J< s/ a JC

<o ’-t -ft :« ;(β 3 :« > ""i .,-, to

ce <H

·1 e 3 c > c u a> so» -no» ·1 « « m -π «β

«0 --) ,H AJ

··« s > g jsc θ

Bd) -H (0 <0 (0 :« u .h aj :« aj :« C u c Bo •-να) 1 m :<β 0) 8 « g :<o 8 3 3 :<e 3 -^3 m ^ ^ 1/1 .g 1 1j ro a M <"

M 00 :2 ·1 00 . . aj CO

m c ^ ^ xc >5 ° ° m5^° 3 BO) 3 :« β · C :(0 3 •'“i :<o ,3 :¾ ·1-> :¾

•H AJ PQ AJ ‘M AJ

-1 (O m CO -1 <0 3 0) Ca> 0) 3 3

H SC f14 M H M

O

ι/Ί Q B -

* O 0) S

u 3 v - > H « ·1 ^ M 1 |j >-) Vi <-) X ° ^ 0) :« o) :3

Μ -- " '^AA AJ —IAJ

O « ^ AJ AJ

·1 ° _ -H c CO -H I -Η ε ΓΟ —I

JC^OaJ AJ 3 V I AJ 3 V

3 W0) to to « eo —1 . 2 ΓΟ —< 3 ** t-t I 3—1 2 pH V g g-H ' j U 8 I—I r-t

3~g ·1 1 (N I —13V

H 3 3 > AJ >aj

AJ _ 34 ·-) β , -H B

. . S'-Η - ^ 22 ΓΟ ° AJ 3 m ajS (N aj ^ 8 „ a φ AJ e ‘ -π

-Ξ 'H ° 3 O CM AJ —1030 V

2 2 'H J 00-)^)3 .hajQA! > S o · h S- ° - s1 g s-i - ;...: - · « o s° - > 1 o s° - 5 3 - 2 ? 2 1 ·: 2 5 3 B«° - ‘oJ2 2° 1 1 -0 30 H« ^ u ^ ™ ™

W JC

----- CX.--

* 8 *J 3 «, O

B u ·1 c ·1 £ '&. u o a ” O -H ° o 3 .-2 g :g : --to --- --- .w o -.¾ B £ Λ 3 · Λ s .· .· 5 -"'5 .21 S ON I .g1 g 03« 0.3 C0 -h 2 .2 ° < 2 -2 °a 2 ·: .2 > ° o S « O O 30 o

^ AJ ω > AJ a > AJ

II

- __! (I.____ o __ 4i 81720

M

M XX

C > UM

OI

oj :<o •'Ί :<e M —I < —I ·.« M * ·* :ca Λί m Λ j< ·-) 0) M « «

H tn H H

(0 C -u 3 oi t" p* co m 3 05 O *3" <D ro ro 00 «rl O * . - *·

rl B Ή O O O O

> «8 •rl u •ι-t a 4J Q> .y B 1/1 (N σι ro «es 03 co r-~ r- :«e s o - - . * S M ro o o o o :«o :<o c ι-o v v c :co

4J

m β) uo ι-h co ji o σ> σι σι αο r-H *· . * .

Ο Ο Ο Ο > X__ ο s 2 - ΐ 3 :ο ο «ο α ο ο ο ο ο

Η g VO VO VO

'* ‘. :« ... ·Η .. I xj___________ ... ta : : a; 9) ... oj I ·Η I 00

* ^ ·Η O

. ' . «H O· 3 «O *H as CO r-* r- θ'» ce » »h o o o o . . XJ O ·. ^ n «

co >- 4J O O O O

c 9) Ό •H f | :o S 8 •Ό o o ·* i w m •K c 4J .u « o o -h o ή - - m ^ h n u n «οι i a ji o. jo : -n *j m at <u E o h*.ri Ci-ie-i SS h jj OI 0) o*

" H > n» a 0 a B

\ . CO *rl O-^O

.. o :<o co « jo «o jo

-I .r-, U C β ·Η 4J -H

s .H 4J «O O C n> S

0C ^ C M Ä ·Η ·Η ·Η O a) 01 W O ·»* « *»*1

O H a Ex. X Xl O "S

m o

rH

42 81 720 c CD α> r— O— <U--h---, O M 09 •h :«d > ,rn «h

G

u 0;

.10 (a <-> 00 O (N (N

CO »H (N VO VO VO

:« S O v *· «. v.

g <0 —I O O O O

:efl 4j :«d a <—1 <ϋ ΓΟ ΓΊ LT» 1/0

g I/O 00 00 CO

C 3 ro v * « *

-73 O O O O

m m m oo mc co σ> σ\ o\ > V H *· ** ·» ^

0) O O O O

:nj c •r-| :ce

•H 4J

Jrf tt 0) 0) H Jtf “’o---“- m 2 a - o <u

H 0) O

^ rH rH r—4 f*H »H

O -H V N<r V V» :ce bO **“i 0

—< G

>«✓ 0> m r-H »H »H rH

M co V V V V

^ »m

X U B

V <0

O 4J 4J

2C 4J d rH rH rH (-H rH

Ji ·Η0) V v V

9 4J g rH CO 3 3 3 3

« H M

H -h ro

> d - rH rH rH rH

1 a» o v V- v V

CO V •H C

«o :co 0 -u oo o r~ oo d es » ^ ^ rl 1) O H*· UO HT Ό" V) 3i__ 1 e CO ·η ·Η 3 c

O Vl co '** O

g :« g o- rH 60 4J :ce rH X 0) Ih C VlH -H 4J J3 co

V

4J__ tt

CQ

e ^ <0 f a o o o o o

M Be 00 00 CO CO

m :co

rH rJ

> _ _ !h 1 * H -H 9 •f O. 3 r_, -HO) CO CO 00 oo

es H O O O O

«O „ > *-* o o o o

'' ' .1—1 . f — -J

in o

rH

II

43 81 720 e v 3 to ^

3 rH

3_:3 ____________

αι Η-•H

> c 4J I" (N CN

® O (N rH rH

® O - * - »

" 'g rH O o O O

3 3

:2 O U"> I" CN

•S?· ΓΟ LTI 3· T

:2 2 m -05 ® o o o o

•n D

_ 5 ΓΛ (N m O

Z \a co σ Γ" 11 — Ή - - - * M 5 ° ° ° ° 0> :co c ·*—* :ce

• H AJ

M » 0) 0) H M _ 'o ΙΛ c *j Q 5 *- i o

C-^ r—( rH rH (—C rH

H -H ^ V V V

0 :2,

“ C

H ., Ο Λ) m rH rH rH r-t

M ® C?· · VV'v'V

> " -r -rt

X " * B

a 3 3

O HJ HJ

_ 4J C Ή rH rH rH rH

Hi S -h « >✓ v v* v

3 ^ 4J B

^ :3 * 3 3 .> 3 3 « :3 * ^

H jj ·η rH

> C iH Ή rH rH

:co I Φ o V N/ V

oi «3 .:. .Η -H e οι jo :3 Ό HJ σι H 00 ¢33 v • rH -H 3 O 3· T in «3· 3 CO Hi id 4) 1 e

o. * -rH 3 O

B a U 3 α ·η o o 2 -3 B o, rH 60

Hi 5 :2 rH >, 3 u £ -° * •H ‘ ~ - “ ‘ — "' - - — I ..

• H

,r\ CQ

a *-* o ·* μ ^ hj :o o o o o ο & ο σσσσ u Θ o o. :®

rJ

3---

4H

3 •H I 3 3 ·Η 3 AJ O. 3 JJ ·Η 3 CO CO 00 00

* _ -rt 3 *rl O O O O

3 3 0 «. v «. «.

• O > HJ o o o o in o m rH r—i

Claims

44 81 720

1. Menetelmä lisääntymiskykyisten, suodatettavien taudinaiheuttajien inaktivoimiseksi verituotteissa käyttämällä korotettua lämpötilaa, tunnettu siitä, että verituotteet saatetaan kiinteässä tilassa vesi-, metanoli- tai etanolipitoisuuteen, joka on yli 0,05 (5 paino-%) ja alle 0,70 (70 paino-%), edullisesti alle 0,40 (40 paino-%), ja niitä käsitellään suljetussa säiliössä 50...121*C:n lämpötilassa korottamalla veden, metanolin tai etanolin osahöyryn-painetta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että verituotteiden käsittely vesihöyryllä suoritetaan 0,1...2 bar:n paineessa.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisääntymiskykyiset suodatettavat taudinaiheuttajat ovat hepatiittiviruksia tai AIDS-tartunnan (acquired immune deficiency syndrome) aiheuttajia.

4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että verituotteita käsitellään 1 s... 100 h.

5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely suoritetaan tuotteissa, joiden vesipitoisuus on 0,06 (6 paino-%)...0,30 (30 paino-%), 50e...90eC:n lämpötilassa.

6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että verituotteiden käsittely suoritetaan hapettoman inertin suojakaasun, edullisesti typen, läsnäollessa ja mahdollisesti happea sitovien aineiden läsnäollessa .

7. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että verituotteita käsitellään vesihöyryllä tai kaasumaisella metanolilla tai vastaavasti etanolilla. Il 45 81 720

8. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että verituotteita käsitellään sellaisessa nestemäisessä väliaineessa, johon ne eivät liukene.

9. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään verituotetta, joka on sitoutunut matriisiin kovalenttisesti tai ei-kovalenttisesti.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että inaktivoidut verituotteet vapautetaan muilla fraktiointitoimenpiteillä lämpöinaktivoinnin aikana mahdollisesti muodostuneista neoproteiineista tai neoanti-geeneistä.

11. Menetelmä entsyymeistä, proentsyymeistä mukaanlukien koaguloitumistekijöistä, entsyymi-inhibiittoreista, immuno-globuliineista, albumiinista, plasminogeenistä, fibrinogee-nistä, fibronektiinistä tai plasmasta koostuvien verituotteiden tai yksittäisten verituotteiden seoksien valmistamiseksi, jossa menetelmässä käytetään patenttivaatimusten 1 -10 mukaista menetelmää, tunnettu siitä, että inak-tivointi suoritetaan valmistusmenetelmän mielivaltaisessa vaiheessa, minkä jälkeen verituotteet muunnetaan mahdollisesti galeeniseksi valmisteeksi. 46 81 720