FI80466C

FI80466C - Synthetic Picornavirus vaccine and antigen

Info

Publication number: FI80466C
Application number: FI874930A
Authority: FI
Inventors: Richard A Lerner; James L Bittle
Original assignee: Scripps Cilinic And Research F
Priority date: 1982-04-14
Filing date: 1987-11-06
Publication date: 1990-06-11
Also published as: FI874930A; FI874930A0; FI80466B

Description

1 804661 80466

Picornaviruksen synteettinen rokote ja antigeeni Jakamalla erotettu hakemuksesta 834 590Picornavirus synthetic vaccine and antigen Separated from application 834 590

Esillä oleva keksintö kohdistuu rokotteisiin ja antigeenei-hin infektiotauteja vastaan ja erityisesti antigeeneihin, jotka ovat käyttökelpoisia heimon Picornavirus virusten aiheuttamien tautien, kuten suu- ja sorkkataudin ja poliomyelitiksen diagnosoinnissa ja käsittelyssä.The present invention is directed to vaccines and antigens against infectious diseases, and in particular to antigens useful in the diagnosis and treatment of diseases caused by the genus Picornavirus viruses, such as foot-and-mouth disease and poliomyelitis.

Suu- ja sorkkatauti on hyvin tarttuva, taloudellisesti hyvin merkityksellinen tauti, joka pääasiassa vaivaa kaksisorkkaisia eläimiä. Suu- ja sorkkataudista suoranaisesti johtuva kuolleisuus on yleensä suhteellinen alhainen, mutta nuorten eläinten kuolleisuus voi olla melko korkea. Taloudelliselta kannalta on merkityksellistä se, että tauti heikentää infektoituja eläimiä siinä määrin, ettei niitä voida taloudellisesti kasvattaa ja ruokkia. Ainoa yleisesti hyväksytty tehokas tapa infektion eliminoimiseksi, kun se kerran on havaittu, on tuhota kaikki infektoidut eläimet, desinfioida tilan koko se alue, jossa eläimet oleskelevat, ja hajottaa ruohot poltetussa kalkissa. Koska infektio leviää erittäin nopeasti voi kokonaisten yhdyskuntien tai alueiden taloudellinen perusta tuhoutua yhden laajan suu- ja sorkkataudin puhkeamisen seurauksena .Foot-and-mouth disease is a highly contagious, economically very significant disease that mainly affects dicotyledonous animals. Mortality directly due to foot-and-mouth disease is usually relatively low, but mortality in young animals can be quite high. From an economic point of view, it is important that the disease weakens infected animals to such an extent that they cannot be reared and fed economically. The only generally accepted effective way to eliminate the infection once it has been detected is to destroy all infected animals, disinfect the entire area of the holding where the animals are present, and break up the grasses in the burnt lime. Because the infection spreads very rapidly, the economic base of entire communities or regions can be destroyed as a result of a single large-scale outbreak of foot-and-mouth disease.

On valmistettu rokotteita, jotka tekevät eläimet immuuneiksi suu- ja sorkkatautia vastaan, pääasiassa inaktivoimalla tai heikentämällä virusta. Tällaisten rokotteiden on havaittu olevan tehokkaita tietyssä laajuudessa, mutta suu- ja sorkkataudin puhkeamisen syynä ovat olleet sellaiset rokotteet, joissa virusta ei ole inaktivoitu täydellisesti tai heikennetty riittävästi. Infektioiden syynä on myöskin ollut viruksen karkaaminen sellaisista välineitä, joita käytetään suu- ja sorkkataudin tutkimuksessa ja suu- ja sorkkatautirokotteiden valmistuksessa .Vaccines have been developed that make animals immune to foot-and-mouth disease, mainly by inactivating or attenuating the virus. Such vaccines have been found to be effective to some extent, but outbreaks of foot-and-mouth disease have been caused by vaccines in which the virus has not been completely inactivated or adequately attenuated. Infections have also been caused by the escape of the virus from devices used in foot-and-mouth disease research and in the manufacture of foot-and-mouth disease vaccines.

Suu- ja sorkkataudin (FHD) aiheuttaa sukuun aphthovirus kuuluva Picornavirus. On olemassa suu- ja sorkkautautiviruksen 2 80466 (FMDV) lukuisia virusserotyyppejä, joista yleisimmät tunnis-etetaan serotyyppimerkinnöillä A, 0 ja C, ja vähemmän yleiset tunnistetaan SAT-l:nä, SAT-2:na, SAT-3:na ja ASIA-l:nä. Näiden serotyyppien joukosta on myöskin tunnistettu lukuisia alatyyppejä ja alatyyppikantoja. Tunnistettuihin alatyyppeihin ja alatyyppikantoihin kuuluvat seuraavat: FMDV A, alatyyppi 10, kanta 61 ja alatyyppi 12, kannat 119, USA ja Pirbright; FMDV 0, alatyyppi 1, kanta Kaufbeuren; ja FMDV C, alatyyppi 3, kanta Indaial.Foot-and-mouth disease (FHD) is caused by Picornavirus, a genus of aphthovirus. There are numerous virus serotypes of foot-and-mouth disease virus 2 80466 (FMDV), the most common of which are identified by serotypes A, 0 and C, and the less common are identified as SAT-1, SAT-2, SAT-3 and ASIA- I. Numerous subtypes and subtype strains have also been identified among these serotypes. Identified subtypes and subtype strains include: FMDV A, subtype 10, strain 61 and subtype 12, strains 119, USA and Pirbright; FMDV 0, subtype 1, strain Kaufbeuren; and FMDV C, subtype 3, strain Indaial.

FMDV on kuvattu yksityiskohtaisemmin julkaisuissa; kts. esim. H.L. Backrach, Beltsville Symphosium on Agricultural Research, J.A. Romberger, Ed,. Allanheld, Montclair, N.J. (1977), ss.FMDV is described in more detail in the publications; see, e.g., H.L. Backrach, Beltsville Symphosium on Agricultural Research, J.A. Romberger, Ed ,. Allanheld, Montclair, N.J. (1977), ss.

3-32; Annual Reviews of Microbiology, 22, 201 (1966). Näiden virusten molekyylibiologiaa on kuvattu kirjassa R.R. Rueckert, Molecular Biology of Picornaviruses, R. Perex-Bercoff, Ed. Plenum, New York, (1979), s. 113. Viruksen molekyylikoko on noin 7 x 10^ daltonia ja se sisältää plus-juosterakenteisen RNA-genomin, joka sisältää arvioilta 8000 nukleotidia. Pico-rnavirusproteiineja on syntetisoitu infektoiduissa soluissa proteiiniprekursorina, joka jälkeenpäin muutetaan solu- ja viruskoodattujen proteaasien avulla neljäksi pääkuoriproteii-neiksi (VP-^, VP2, VP^ ja VP^) ja lukuisiksi kuorettomiksi proteiineiksi.3-32; Annual Reviews of Microbiology, 22, 201 (1966). The molecular biology of these viruses is described in R.R. Rueckert, Molecular Biology of Picornaviruses, R. Perex-Bercoff, Ed. Plenum, New York, (1979), p. 113. The virus has a molecular size of about 7 x 10 4 daltons and contains a plus-stranded RNA genome containing an estimated 8,000 nucleotides. Pico-viral proteins have been synthesized in infected cells as a protein precursor, which is subsequently converted by cellular and viral-encoded proteases into four major envelope proteins (VP-1, VP 2, VP 2 and VP 2) and numerous shellless proteins.

Kokonainen VP^-proteiini, kun sitä käytettiin sian rokottamiseen, sai aikaan neutraloivan vasta-ainereaktion ja suojasi sekä sikaa että karjaa infektiolta. /J. Laporte, et ai., C.R. Acad. Sei., 276: 3399 (1973); H.L. Backrach, et ai., J. Immunol., 115: 1636 (1975); ks. myös US-patentti n:o 4 140 76^/- Näihin tietoihin perustuen, Dennis G. Kleid, et ai. Science, 214: 1125-1129 (4. joukuk. 1981), pystyivät tuottamaan kloonatun virusproteiinirokotteen suu- ja sorkkatautia vastaan, joka rokote sai aikaan vasta-ainereaktion karjassa ja siassa.Total VP 2 protein, when used to vaccinate pigs, elicited a neutralizing antibody response and protected both pigs and cattle from infection. / J. Laporte, et al., C.R. Acad. Sci., 276: 3399 (1973); H. L. Backrach, et al., J. Immunol., 115: 1636 (1975); see. see also U.S. Patent No. 4,140,700 / - Based on this information, Dennis G. Kleid, et al. Science, 214: 1125-1129 (4th ed. 1981), were able to produce a cloned viral protein vaccine against foot-and-mouth disease, which vaccine elicited an antibody response in cattle and pigs.

On huomattava, että tämän alan kirjallisuudessa käytetään samoja nimiä tarkoittamaan erilaisia kuoriproteiineja. Näin 3 80.466 ollen edellä mainitut tutkijat käyttävät yleensä Yhdysvalloissa siitä kuoriproteiinista, josta tässä keksinnössä ja Euroopassa käytetään nimeä VP^, nimeä VP-j-kuori. ollaan kuitenkin yksimielisiä siitä, että se kuoriproteiini, josta tässä käytetään nimeä VP^ ja josta muut käyttävät nimeä VP^ , on immunologisesta aktiivinen kuoriproteiini.It should be noted that the literature in this field uses the same names to denote different shell proteins. Thus, 3 80,466, the aforementioned researchers generally use in the United States the shell protein referred to in this invention and in Europe as VP-j shell. however, it is agreed that the coat protein, referred to herein as VP ^ and others as VP ^, is an immunologically active coat protein.

Yhdistelmä-DNA-molekyylejä ja menetelmiä sellaisten proteiinien valmistamiseksi, joilla on suu- ja sorkkataudin virus-antigeenin spesifisyys, on kuvattu GB-patenttihakemuksessa 2 079 288A, 20.1. 1982. Katso myös Boothroyd et ai, Nature, 290: 800-802 (1981); Kleid et ai., Science, 214: 1125-1129 (1981); ja EPO-julkaisua n:o 0 068 693 2A, joka vastaa hakemusta n:o 82303040.8, jätetty 11,6. 82.Recombinant DNA molecules and methods for preparing proteins having foot-and-mouth disease virus antigen specificity are described in GB Patent Application 2,079,288A, 20.1. 1982. See also Boothroyd et al., Nature, 290: 800-802 (1981); Kleid et al., Science, 214: 1125-1129 (1981); and EPO Publication No. 0 068 693 2A, corresponding to Application No. 82303040.8, filed 11.6. 82.

K. Strohmaier et ai., Proc. 5th Int. Congress Virology, Strasbourg, 1981, näyttelyesitelmä, ovat käsitelleet VP^-proteiinia (josta he käyttävät nimeä VPThr) entsyymeillä sekä syaanibromidilla ja tuottaneet neutraloivia vasta-aineita käyttäen hajoamistuotteiden peptidifragmentteja. Nämä kirjoittajat ehdottivat, että aminohappotähdesekvenssit asemissa 146-155 ja 200-213 proteiinin aminopäätteestä laskettuna, saavat aikaan immunologisesti tärkeiden vasta-aineiden tuottamisen. Nämä kirjoittajat esittivät myöskin, että aminohappotähdesekvenssit asemissa 141-145 ja 155-161 ovat inaktiivisten, ei-tuottavien peptidien alueella. Tämä VP^-sekvenssi vastaa aikaisemmin Yhdysvalloissa kuvattua VP^-sekvenssiä, ks. Meloen, A.H. selitystä aikakausjulkaisussa J. Gen. Virol, 45:761-763 (1979).K. Strohmaier et al., Proc. 5th Int. Congress Virology, Strasbourg, 1981, exhibition presentation, have treated the VP ^ protein (which they call VPThr) with enzymes as well as cyanogen bromide and produced neutralizing antibodies using peptide fragments of degradation products. These authors suggested that amino acid residue sequences at positions 146-155 and 200-213, calculated from the amino terminus of the protein, induce the production of immunologically important antibodies. These authors also suggested that the amino acid residue sequences at positions 141-145 and 155-161 are in the range of inactive, non-producing peptides. This VP ^ sequence corresponds to the VP ^ sequence previously described in the United States, cf. Meloen, A.H. explanation in J. Gen. Virol, 45: 761-763 (1979).

Strohmaierin et al.:in yksityiskohtaisessa artikkelissa aikakausijulkaisussa J. Gen. Virol., 59:295-306 (1982) toistettiin edellä mainitussa näyttelyesitelmässä selostettu työ ja artikkelissa esitetään tämän alan tutkijoiden käyttämien eri kuoriproteiininimityksien välistä korrelaatiota. Tässä artikkelissa toistettiin näyttelyesitelmässä raportoidut havainnot, että kaksi syaanibromidilohkaisutuotetta, joita nimitetään CB^:ksi ja CB2:ksi, ja entsyymilohkaisutuote, 4 80466 jota nimitetään VPx:n A2:ksi, jotka vastaavat aminohappotähdettä asemissa 55-180, 181-213 ja vastaavasti 146-213 amino-päätteestä laskettuna, tuottavat neutraloivia vasta-aineita. Tämä artikkeli osoitti myöskin, että niillä alueilla, jotka menevät päällekkäin muiden lohkaisutuotteiden kanssa ja joihin sisältyvät alueet 141-145 ja 155-161, ei ole merkittävää vaikutusta. Nämä kirjoittajat lausuivat sivulla 303, että he pitävät "todennäköisenä, että vain kahdella pienellä alueella on olennaista merkitystä proteiinin immunisoivan vaikutuksen kannalta .In a detailed article by Strohmaier et al., J. Gen. Virol., 59: 295-306 (1982) repeated the work described in the above-mentioned exhibition presentation and the article presents the correlation between the different shell protein designations used by researchers in this field. This article reiterated the findings reported in the exhibition presentation that two cyanogen bromide cleavage products, designated CB1 and CB2, and an enzyme cleavage product, 480466, designated A2 of VPx, corresponding to amino acid residues at positions 55-180, 181-213, and 146, respectively. -213 of the amino terminus, produce neutralizing antibodies. This article also showed that those regions that overlap with other cleavage products and include regions 141-145 and 155-161 do not have a significant effect. These authors stated on page 303 that they consider “likely that only two small regions are essential for the immunizing effect of the protein.

Aikaisemmin antigeenejä on saatu useilla tavoin, kuten valmistamalla luonnontuotteista, liittämällä hapteeni kantajaan ja yhdistelmä-DNA-tekniikalla. Sela, et ai., Proc. Nat. Acad.In the past, antigens have been obtained in a number of ways, such as by preparation from natural products, by attachment of a hapten to a carrier, and by recombinant DNA technology. Sela, et al., Proc. Nat. Acad.

Sei., U.S.A., 68:1450-1455 (heinäkuu, 1971); Science, 166:1365-1374 (joulukuu 1960); Adv. Immun., 5:29-129 (1966) ovat myöskin kuvanneet tiettyjä synteettisiä antigeenejä.Sci., U.S.A., 68: 1450-1455 (July, 1971); Science, 166: 1365-1374 (December 1960); Adv. Immun., 5: 29-129 (1966) have also described certain synthetic antigens.

Luonnontuotteista johdettuja antigeenejä edustavat lukemattomat tunnetut luonnossa esiintyvät antigeenit, kuten veri-ryhmäantigeenit, HLA-antigeenit, erilaistuneet antigeenit, virus- ja bakteeriantigeenit ja sen kaltaiset. Tällä vuosisadalla on uhrattu huomattavasti työtä näiden antigeenien tunnistamiseksi ja tutkimiseksi.Antigens derived from natural products are represented by a myriad of known naturally occurring antigens, such as blood group antigens, HLA antigens, differentiated antigens, viral and bacterial antigens, and the like. Considerable efforts have been made in this century to identify and study these antigens.

Tiettyjä "synteettisiä" antigeenejä on valmistettu liittämällä pieniä molekyylejä kantajiin, kuten esim. naudan seerumialbu-miiniin, tuottaen näin antigeenejä, jotka saavat aikaan pienen liitetyn molekyylin vasta-aineen tuottamisen. Kantajamolekyyli on välttämätön, koska eläimen, johon pieni molekyyli injisoi-daan, immuunijärjestelmä ei "tunnistaisi" pelkkää pientä molekyyliä. Tätä tekniikkaa on myöskin käytetty yksittäisissä tapauksissa antigeenien valmistamiseksi liittämällä tunnettujen peptidien peptidifragmentteja kantajiin, kuten on kuvattu Sela et al.:n edellä viitatuissa artikkeleissa.Certain "synthetic" antigens have been prepared by attaching small molecules to carriers, such as bovine serum albumin, to produce antigens that result in the production of an antibody to the small attached molecule. The carrier molecule is necessary because the immune system of the animal into which the small molecule is injected would not "recognize" the small molecule alone. This technique has also been used in individual cases to prepare antigens by attaching peptide fragments of known peptides to carriers, as described in Sela et al., Supra.

Vaikkakin tämä hapteeni-kantaja-tekniikka on palvellut hyvin tutkimustyötä tutkittaessa immuunireaktion luonnetta, niin sillä ei ole ollut huomattavaa käyttöä sellaisten antigeenien valmistuksessa, joilla olisi merkitystä diagnostiikassa tai 5 80466 terapiassa. Tämän puutteellisuuden syyt ovat monet.Although this hapten-carrier technique has served research well in investigating the nature of the immune response, it has not had significant use in the preparation of antigens of relevance in diagnostics or therapy. There are many reasons for this shortcoming.

Ensiksi, jotta tällä tekniikalla voitaisiin valita ja rakentaa hyödyllinen antigeeninen determinantti patogeenistä, niin on määritettävä patogeenin koko proteiinisekvenssi, jotta onnistumisen mahdollisuus olisi kohtuullinen. Tämän tehtävän vaikeuksista johtuen se on harvoin, jos koskaan, toteutettu.First, in order for this technique to select and construct a useful antigenic determinant from a pathogen, the entire protein sequence of the pathogen must be determined to have a reasonable chance of success. Due to the difficulty of this task, it is rarely, if ever, accomplished.

Rokotteet valmistetaan klassisesti viemällä tapettuja tai heikennettyjä organismeja isäntään yhdessä sopivien apuaineiden kanssa organismien vastaisen normaalin immuunireaktion alulle panemiseksi, samalla kun toivottavasti vältytään organismin patogeenisiltä vaikutuksilta isännässä. Tämä tapa kärsii hyvin tunnetuista rajoituksista, jotka ilmenevät siinä, että on tuskin mahdollista välttää patogeenistä reagointia rokotteen kompleksisuudesta johtuen, joka rokote ei ainoastaan sisällä kiinnostuksen kohteena olevaa antigeenistä determinanttia vaan useita samantapaisia tai erilaisia vahingollisia aineita, jotka voivat, joissakin tai kaikissa yksilöissä, saada aikaan ei-toivotun reaktion isännässä.Vaccines are classically prepared by introducing killed or attenuated organisms into a host together with suitable excipients to initiate a normal immune response against the organism, while desirably avoiding the pathogenic effects of the organism in the host. This method suffers from the well-known limitations that it is hardly possible to avoid a pathogenic response due to the complexity of the vaccine, which not only contains the antigenic determinant of interest but several similar or different harmful agents that can, in some or all individuals, cause an adverse reaction in the host.

Klassisella tavalla valmistetut rokotteet voivat esimerkiksi sisältää kilpailevia antigeenejä, jotka ovat haitallisia toivotulle immuunireaktiolle, antigeenejä, jotka johtavat erilaisiin immuunireaktioihin, organismista tai viljelystä peräisin olevia nukleiinihappoja, endotoksiineja ja aineosia, joilla on tuntematon koostumus ja alkuperä. Näistä kompleksisista aineista aikaansaaduilla rokotteilla on luonnostaan suhteellisen suuri todennäköisyys synnyttää kilpailevia reaktioita, jopa kiinnostuksen kohteena olevasta antigeenistä. Lisäksi tällaiset tunnetut rokotteet FMDV:tä vastaan on pidettävä kylmässä ennen käyttöä ja jäähdyttäminen on yleensä vaikea toteuttaa syrjäisillä alueilla, joissa rokotteita käytetään.For example, classically prepared vaccines may contain competing antigens that are detrimental to the desired immune response, antigens that result in a variety of immune responses, nucleic acids from an organism or culture, endotoxins, and ingredients of unknown composition and origin. Vaccines derived from these complex agents are inherently relatively likely to elicit competitive reactions, even for the antigen of interest. In addition, such known vaccines against FMDV must be kept cold before use and refrigeration is generally difficult to implement in remote areas where vaccines are used.

Yhdistelmä-DNA-teknologia on avannut uusia mahdollisuuksia rokotusteknologialle, jonka etuna on, että valmistus lähtee 6 80466 monospesifisestä geenistä, mutta suurin osa tästä edusta menetetään kuitenkin antigeenin varsinaisessa valmistuksessa Escherichia colissa tai muissa mikro-organismeissa. Tämän menetelmän mukaan geenimateriaali viedään plasmidiin, joka sen jälkeen viedään E. coliin, joka tuottaa halutun proteiinin yhdessä muiden aineenvaihduntatuotteiden kanssa, jotka kaikki ovat seoksena ravintoaineen kanssa. Tämä tapa komplisoituu, koska on epävarmaa jos haluttu proteiini ekspres-soituu transformoidussa E. colissa.Recombinant DNA technology has opened up new possibilities for vaccination technology, which has the advantage of starting from 6 80466 monospecific genes, but most of this advantage is lost in the actual production of the antigen in Escherichia coli or other microorganisms. According to this method, the gene material is introduced into a plasmid, which is then introduced into E. coli, which produces the desired protein together with other metabolites, all of which are in admixture with the nutrient. This method is complicated because it is uncertain if the desired protein is expressed in transformed E. coli.

Lisäksi vaikkakin haluttua proteiinia saattaa muodostua on epävarmaa voidaanko se saada talteen tai ei ja tuhoutuuko se E. colin kasvuprosessin aikana. On esimerkiksi hyvin tunnet-tua, että E. coli hajottaa vieraita tai muuttuneita proteiine-* : ja. Vaikkakin proteiinia esiintyy riittävä määrä, jotta se y. olisi mielenkiinnon kohteena, se on kuitenkin vielä erotetta- va kaikista muista E. colin aineenvaihduntatuotteista# joihin sisältyvät sellaiset vahingolliset aineet kuten ei-toi-votut proteiinit, endotoksiinit, nukleiinihapot, geenit ja tuntemattomat tai arvaamattomat aineet.In addition, although the desired protein may be formed, it is uncertain whether it can be recovered or not and whether it will be destroyed during the E. coli growth process. For example, it is well known that E. coli degrades foreign or altered proteins. Although a sufficient amount of protein is present to make it y. however, it must still be distinguished from all other E. coli metabolites # which include harmful substances such as unwanted proteins, endotoxins, nucleic acids, genes, and unknown or unpredictable substances.

Lopuksi vaikkakin olisi mahdollista tai tulisi kehityksen myötä mahdolliseksi jollakin tekniikalla, joka pakostakin olisi hyvin kallis, erottaa haluttu proteiini E. colin muista aineenvaihduntatuotteista, niin rokote sisältää yhä kokonaisen proteiinin, joka saattaa sisältää ei-haluttuja antigeenisiä determinantteja, joista, kuten on tunnettua, muutamat synnyttävät hyvin merkittäviä, haitallisia reaktioita. On todellakin tunnettua, että tietyt proteiinit, joita muuten voitaisiin pitää rokotteina, sisältävät antigeenisen determinantin, joka synnyttää niin vakavia poikkireaktioita tai sivu-reaktioita, ettei näitä aineita voida käyttää rokotteena.Finally, although it would be possible or would be possible with development to separate the desired protein from other metabolites of E. coli by some technique, which would inevitably be very expensive, the vaccine still contains the entire protein, which may contain unwanted antigenic determinants, some of which are known. give rise to very significant, adverse reactions. Indeed, it is known that certain proteins that might otherwise be considered vaccines contain an antigenic determinant that produces such severe cross-reactions or side reactions that these agents cannot be used as a vaccine.

On myöskin mahdollista hybridooma-tekniikkaa käyttäen tuottaa vasta-aineita virusgeenituotteille. Pohjimmiltaan voidaan hybridomitekniikassa lähteä antigeenien kompleksisesta seoksesta ja valmistaa prosessin myöhemmässä vaiheessa monospesif isiä vasta-aineita. Vastakohtana tälle esillä oleva keksintö il 7 80466 edustaa päinvastaista prosessia, koska siinä lähdetään korkean puhtauden omaavasta antigeenideterminantista ja näin ollen vältytään välttämättömyydestä puhdistaa haluttua antigeeni-tuotetta .It is also possible to produce antibodies to viral gene products using hybridoma technology. In essence, in hybridoma technology, a complex mixture of antigens can be used to produce monospecific antibodies at a later stage in the process. In contrast, the present invention il 780466 represents the opposite process in that it starts from a high purity antigenic determinant and thus avoids the need to purify the desired antigen product.

On tunnettua, että hybridoomavasta-aineilla on alhainen aktiivisuus ja alhainen sitomisvakio ja tämän vuoksi niillä on vähäistä arvoa.It is known that hybridoma antibodies have low activity and low binding constant and therefore have little value.

Hybridoomatekniikassa on viime kädessä luotettava pahanlaatuisten solujen tuottamaan vasta-aineeseen kaikkine siihen liittyvine huolineen mitä tulee erottamistekniikkaan, puhtauteen ja varmuuteen.Hybridoma technology ultimately relies on the antibody produced by the malignant cells with all the associated concerns regarding separation technique, purity, and safety.

Hybridoomatuotanto perustuu kudosviljelyn tai aineen viemisen hiireen, jonka seurauksena tuotanto on kallista ja esiintyy myöskin luontaisia variaatioita erästä erään.Hybridoma production is based on tissue culture or delivery of the substance to the mouse, resulting in expensive production and also inherent variations from batch to batch.

Lisäksi on vaikeata valmistaa hybridi sellaisille molekyyleille, jotka muodostavat vain pienen osuuden siitä kompleksisesta seoksesta, josta on lähdettävä.In addition, it is difficult to prepare a hybrid for molecules that make up only a small fraction of the complex mixture from which to start.

Aikaisempia tutkimuksia, Arnon et ai., Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 68:1450 (1971), Atassi, Immunochemistry 12:423 (1975) ja Vyas et ai., Science 178:1300 (1972) on tulkittu näiden kirjoittajien toimesta osoittaen, että lyhyet lineaariset aminohapposekvenssit ovat epätodennäköisiä synnyttämään vasta-aineita, jotka ovat reaktiivisia luonnon proteiinira-kenteiden kanssa. Ajateltiin, että useimpien molekyylien useimpien alueiden kohdalla, aminohappotähteistä saadut anti-geenideterminantit erottuvat hyvin lineaarisessa sekvenssissä, mutta vasta-aineiden synnyttämiseen käytettyjen peptidien rakenteen uskottiin olevan kriittinen useimmissa tapauksissa, jopa niille antigeeneille, joissa aminohapot ovat lähellä toisiaan sekvenssissä. Lerner et ai., Cell 23;109-110, (1931); Nature 287:801-805 (1980), havaitsivat, että lineaaristen peptidien vasta-aineet reagoivat luonnon molekyylien e 80466 kanssa. Monimutkaiset biosynteesit tulivat näin ollen tarpeettomiksi, epätaloudellisiksi ja vanhanaikaisiksi.Previous studies, Arnon et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. 68: 1450 (1971), Atassi, Immunochemistry 12: 423 (1975) and Vyas et al., Science 178: 1300 (1972) have been interpreted by these authors to indicate that short linear amino acid sequences are unlikely to give rise to antibodies that are reactive. with natural protein fields. It was thought that for most regions of most molecules, antigenic determinants derived from amino acid residues differ in a very linear sequence, but the structure of peptides used to generate antibodies was believed to be critical in most cases, even for antigens with amino acid sequences close to each other. Lerner et al., Cell 23; 109-110, (1931); Nature 287: 801-805 (1980), found that antibodies to linear peptides reacted with natural molecules e 80466. Complex biosyntheses thus became unnecessary, uneconomical, and old-fashioned.

Huolimatta siitä, että on olemassa käyttökelpoisia inaktivoi-tuja tai heikennettyjä virusrokotteita suu- ja sorkkatautia vastaan, niin on olemassa suuri taloudellinen ja käytännöllinen tarve ja suuri teoreettinen kiinnostus kehittää sellainen rokote suu- ja sorkkatautia vastaan, joka olisi ilman niitä vaaroja, jotka tähän saakka ovat liittyneet taudinaiheuttajan FMDV:n valmistukseen ja käsittelyyn. Kloonattujen viruspro-teiinien käyttökelpoisuus voi hyvinkin olla merkittävä edistysaskel vanhempiin hyvin vaarallisiin menetelmiin nähden.Despite the existence of useful inactivated or attenuated viral vaccines against foot-and-mouth disease, there is a great economic and practical need and great theoretical interest in developing a vaccine against foot-and-mouth disease that would be without the risks hitherto involved in the production and processing of the pathogen FMDV. The utility of cloned viral proteins may well be a significant advance over older very hazardous methods.

Kloonattuun virusproteiinirokotteeseen perustuvalla tavalla on kuitenkin myöskin useita luontaisia haittapuolia, rajoituksia ja riskejä. Biosynteesisysteemin vaihtelut voivat sinänsä aiheuttaa vaihteluita proteiinien ekspressoitumisessa ja näin vaikuttaa antigeenien puhtauteen, saantoihin, tehoon jne. Lisäksi muiden proteiinien läsnäolo ja vaikeat ja tehottomat erottamiset viittaavat siihen, että kloonatulla virus-proteiinimenetelmällä valmistetut rokotteet eivät todennäköisesti ole monospesifisiä. Näin ollen tällä tekniikalla valmistettujen tuotteiden päähuolenaiheena on puhtaus, tehokkuus ja varmuus.However, in a manner based on a cloned viral protein vaccine, there are also a number of inherent disadvantages, limitations, and risks. Variations in the biosynthetic system may in themselves cause variations in protein expression and thus affect antigen purity, yields, potency, etc. In addition, the presence of other proteins and difficult and inefficient separations suggest that vaccines prepared by the cloned viral protein method are unlikely to be monospecific. Therefore, the main concerns of products made with this technology are purity, efficiency and safety.

Vaikkakin synteettisten antigeenien valmistuksen yleiset periaatteet, lähtien joko tunnetusta peptidisekvenssistä tai genomista,on kuvattu ja vaikkakin sellaisten sopivan pituuden omaavien peptidien valmistus, joita voidaan käyttää antigeenisissä materiaaleissa, on nykyään aika hyvin tunnettu, on olemassa hyvin laaja antigeeni-vasta-aine-teknologian ala, jota edelleen on mahdotonta hallita. Vaikkakin tunnetaan joitakin suuntaviivoja ja ehdotuksia koskien mahdollisia antigeenisekvenssejä, on tälle alueelle kuitenkin edelleen ominaista spekulaatiot, yritykset ja erehdykset. Vaikkakin tiedetään, että pitkä sekvenssi saattaa sisältää antigeenisestä aktiivisia aineosia, esiintyy suurta epävarmuutta ja li 9 80466 arvailua siitä, tarvitaanko koko sekvenssi vai vain osa siitä antigeenisyyden saavuttamiseksi ja siitä onko sekvenssin pienemmällä osalla suurempi tai pienempi antigeeni-syys.Although the general principles for the production of synthetic antigens, starting with either a known peptide sequence or the genome, have been described and although the production of peptides of suitable length that can be used in antigenic materials is now quite well known, there is a very broad field of antigen-antibody technology. which is still impossible to control. Although some guidelines and suggestions regarding possible antigen sequences are known, this region is still characterized by speculation, trial and error. Although it is known that a long sequence may contain antigenically active ingredients, there is great uncertainty and speculation as to whether the entire sequence or only a portion of it is required to achieve antigenicity and whether a smaller portion of the sequence has greater or lesser antigenicity.

Esillä oleva keksintö kohdistuu menetelmään spesifisen synteettisen, antigeenisen peptidin valmistamiseksi, joka sisältää noin kahdenkymmenen aminohappotähteen patenttivaatimuksen 1 mukaisen sekvenssin. Keksinnölle on tunnusomaista se, mikä esitetään patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa. Tähän antigeeniseen peptidiin sisältyy aminohappotähteen sekvenssi, joka vastaa antigeenisen Picornaviruksen kuo-riproteiinin tiettyä aluetta. Tämä alue sijaitsee etäisyydellä, joka on noin 60 - noin 75 % antigeenisen kuoriprote-iinin aminohappojäännössekvenssin koko pituudesta laskettuna sen aminopäätteestä. Tämä peptidi kykenee, kun se on sidottu avaimenreikämaljakotilo-hemosyaniinikantajaan konjugaattina ja viety tehokkaana määränä rokotteena isäntäeläimeen, synnyttämään vasta-aineiden tuotannon isäntäeläimessä, jotka vasta-aineet immuunireagoivat Picornaviruksen kanssa suojaten isäntäeläintä Picornaviruksen aiheuttamalta infektiolta. Peptidillä on edullisesti positiivinen nettoionivaraus, lukuunottamatta päätteinä olevien peptidien amino- ja/tai karboksyyliryhmien ionivarauksia.The present invention is directed to a method of making a specific synthetic antigenic peptide comprising the sequence of claim 1 of about twenty amino acid residues. The invention is characterized by what is set forth in the characterizing part of claim 1. This antigenic peptide includes an amino acid residue sequence corresponding to a particular region of the antigenic Picornavirus chimeric protein. This region is located at a distance of about 60 to about 75% of the total length of the amino acid residue sequence of the antigenic coat protein, calculated from its amino terminus. This peptide, when bound to a keyhole vase-hemocyanin carrier as a conjugate and delivered in an effective amount to a vaccine in a host animal, is capable of producing antibodies in the host animal that immunoreact with Picornavirus to protect the host animal from Picornavirus. The peptide preferably has a net positive ionic charge, with the exception of the ionic charges of the amino and / or carboxyl groups of the terminal peptides.

Erään toisen suoritusmuodon mukaan tämä keksintö kohdistuu synteettiseen, antigeeniseen peptidiin, joka sisältää noin kahdenkymmenen aminohappotähteen sekvenssin, joka vastaa FMDVsn VPi-kuoriproteiinin aminohappotähdesekvenssiä asemasta noin 141 noin 160:een. Tämä peptidi kykenee, kun se on sidottu avaimenreikämaljakotilo-hemosyaniinikantajaan konju-gaattina ja viety tehokkaana määränä rokotteena isäntäeläimeen, immuunireagoimaan suu- ja sorkkaviruksen kanssa suojaten isäntäeläintä tämän viruksen aiheuttamalta infektiolta.In another embodiment, the present invention is directed to a synthetic, antigenic peptide comprising a sequence of about twenty amino acid residues corresponding to the amino acid residue sequence of FMDV's VPi coat protein from position 141 to about 160. This peptide, when bound to a keyhole vase hemocyanin carrier as a conjugate and delivered in an effective amount as a vaccine to a host animal, is capable of reacting immune with foot-and-mouth virus, protecting the host animal from infection by this virus.

Tämän keksinnön mukaisia synteettisiä antigeenisiä peptidejä voidaan käyttää yhdessä fysiologisesti hyväksyttävien laimentimien, kuten veden ja/tai lisäaineiden kanssa sellai- 10 80 466 sissa rokotteissa, jotka kykenevät suojaamaan eläimiä Picor-naviruksen aiheuttamia tauteja, kuten suu- ja sorkkatautia, vastaan, tai kasvattamaan vasta-aineita, jotka ovat käyttökelpoisia sellaisten antigeenisten proteiinien läsnäolon havaitsemiseksi, jotka liittyvät Picornaviruksen aiheuttamiin tauteihin.The synthetic antigenic peptides of this invention may be used in combination with physiologically acceptable diluents, such as water and / or additives, in vaccines capable of protecting animals against diseases caused by Picoravirus, such as foot-and-mouth disease, or for raising antibodies. substances useful for detecting the presence of antigenic proteins associated with diseases caused by Picornavirus.

Suu- ja sorkkatautiin liittyvän synteettisen peptidin aminohappotähteen, joka on aseman noin 130 ja aseman noin 160 välisellä alueella, eräs edullinen noin kahdenkymmenen aminohappotähteen sekvenssi on valittu siitä aminohappotähde sekvenssistä, joka vastaa niitä aminohappotähdesekvenssejä kirjoitettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäät-teestä karboksipäätettä kohti, jotka on esitetty seuraavas-sa: (141)A preferred sequence of an amino acid residue of a synthetic peptide associated with foot-and-mouth disease between about position 130 and position about 160, selected from about twenty amino acid residues, is selected from the sequence corresponding to those amino acid residue sequences written from left to right and in the amino acid direction. presented in (141)

Val(Ser tai Gin tai X)Pro(Gly tai Y)Asn(Z)Leu(Arg tai Val)Arg(Ser tai Ala)GlyAspLeu(Met tai Phe)Gln(Gly) (150)Val (Ser or Gln or X) Pro (Gly or Y) Asn (Z) Leu (Arg or Val) Arg (Ser or Ala) GlyAspLeu (Met or Phe) Gln (Gly) (150)

Val(Thr tai Ser tai His)Leu(Ile)AlaGln(Ala tai Pro)Lys(Arg tai Ala)Val(His)Ala(Val)Arg(Thr tai Lys) (160)Val (Thr or Ser or His) Leu (Ile) AlaGln (Ala or Pro) Lys (Arg or Ala) Val (His) Ala (Val) Arg (Thr or Lys) (160)

Thr(Gln tai His)LeuPro jossa jokainen suluissa esitetyistä tähteistä X, Y tai Z voi yksitellen korvata välittömästi sulkujen vasemmalla puolella olevan viereisen aminohappotähteen, X ja/tai Y ja/tai Z peptidin aminohappohappotähdesekvenssis-sä merkitsee itsenäisesti aminohappotähteen puuttumista välittömästi sulkujen vasemmalla puolella olevassa aminohappotähteen asemassa, jolloin peptidin pituus vastaavasti lyhenee yhden, kahden tai kolmen aminohappotähteen verran, ja suluissa olevat numerot määrättyjen aminohappotähteiden yläpuolella yllä olevassa sekvenssissä ilmaisevat suu- ja sorkkatautiviruksen, Tubingen tyyppi 0, alatyyppi 1, kanta Kaufbeuren FMDV, VPx-kuoriproteiinin määrättyjen aminohappotähteiden asemat aminotähteen suhteen.Thr (Gln or His) LeuPro wherein each of the residues X, Y or Z in parentheses may individually individually replace an adjacent amino acid residue immediately to the left of the parentheses, X and / or Y and / or Z in the amino acid residue sequence of the peptide independently means the absence of an amino acid residue immediately in the left parentheses in the position of the amino acid residue, whereby the length of the peptide is shortened by one, two or three amino acid residues, respectively, and the numbers in parentheses above certain amino acid residues in the above sequence indicate foot-and-mouth disease virus, Tubingen type 0, subtype amino acid residue regarding.

u il 8G466 Nämä numerot on esitetty vain vertailumielessä.u il 8G466 These numbers are given for reference only.

Kaikkein edullisimmat yksittäiset peptidit ovat ne, jotka vastaavat olennaisesti suu- ja sorkkatautivirusten (1) Tubingen tyyppi 0, alatyyppi 1, kantaa Kaufbeuren, (2) tyyppi A, alatyyppi 10, kanta 61 ja (3) tyyppi A, alatyyppi 12, kanta 119, aminohappotähdesekvenssejä, jotka sijaitsevat asemissa noin 141:stä noin 160:een, katsottuna vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäätteestä karboksipäätettä kohti, ja ne on valittu sueraavista sekvensseistä: (1) ValProAsnLeuArgGlyAspLeuGlnValLeuAlaGln LysValAlaArgThrLeuPro; (2) SerArgSerGlyAspLeuGlySerlleAlaAlaArg ValAlaThrGlnLeuPro, ja (3) SerGlyValArgGlyAspPheGlySerLeuAlaProArg ValAlaArgLeuPro.The most preferred individual peptides are those substantially corresponding to foot-and-mouth disease viruses (1) Tubingen type 0, subtype 1, strain Kaufbeuren, (2) type A, subtype 10, strain 61 and (3) type A, subtype 12, strain 119 , amino acid residue sequences located at positions from about 141 to about 160, viewed from left to right and in the direction from the amino terminus to the carboxy terminus, and are selected from the following sequences: (1) ValProAsnLeuArgGlyAspLeuGlnValLeuAlaGla (2) SerArgSerGlyAspLeuGlySerlleAlaAlaArg ValAlaThrGlnLeuPro, and (3) SerGlyValArgGlyAspPheGlySerLeuAlaProArg ValAlaArgLeuPro.

Esillä olevalla keksinnöllä saavutetaan huomattavaa hyötyä ja etua, erityisesti kun tämän keksinnön mukaisia peptidejä käytetään rokotteissa Picornaviruksen aiheuttamia tauteja vastaan ja diagnostiikassa, jossa määritetään näiden tautien tai virusten esiintymistä eläimissä, ihminen mukaanluettuna.The present invention provides considerable benefit and advantage, especially when the peptides of this invention are used in vaccines against Picornavirus-induced diseases and in diagnostics for determining the presence of these diseases or viruses in animals, including humans.

Näin ollen yksi huomattava etu on se, että synteettiset peptidit voivat muodostaa osan sellaisesta rokotteesta, joka suojaa eläimiä näiltä taudeilta.Thus, one significant advantage is that synthetic peptides can form part of a vaccine that protects animals from these diseases.

Keksinnöllä saavutettava erityinen höyty on siinä, ettei rokotteita, jotka on valmistettu käyttäen synteettistä peptidiä, tarvitse tehokkaan rokotuksen aikaansaamiseksi säilyttää kylmässä ennen käyttöä.A particular advantage of the invention is that vaccines prepared using a synthetic peptide do not need to be refrigerated prior to use to provide effective vaccination.

Esillä olevan keksinnön eräs toinen etu saavutetaan diagnostiikan alueella, jossa synteettisen peptidin antiseerumissa tuotetut vasta-aineet immuunireagoivat Picornaviruksiin, kuten suu- ja sorkkatautiin liittyvien antigeenisten proteiinien ja vasta-aineiden kanssa ja niitä voidaan käyttää näiden läsnäolon havaitsemiseksi.Another advantage of the present invention is achieved in the field of diagnostics, where antibodies produced in the antiserum of a synthetic peptide are immunoreactive with antigenic proteins and antibodies associated with Picornaviruses such as foot-and-mouth disease and can be used to detect their presence.

12 8046612 80466

Lisähyödyt ja -edut ovat alan ammattimiehelle ilmeiset seuraavan yksityiskohtaisen selityksen, esimerkkien ja patenttivaatimusten perusteella.Additional advantages and advantages will be apparent to those skilled in the art from the following detailed description, examples, and claims.

Piirustuksissa, jotka muodostavat tämän selityksen osan:In the drawings which form part of this explanation:

Kuvio 1 esittää suu- ja sorkkatautivirusten VPi-kuoren kahdeksaa aminohappotähdesekvenssiä aminohappotähteen asemissa 130-160, käyttäen tavallista kolmikirjainkoodia jokaiselle aminohappotähteelle. Sekvenssit luetaan vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäätteestä karboksipäätettä kohti. Numerot 130, 140, 150 ja 160 esittävät aminohappotähteen asemat viruksen (Olk), Tiibingen tyyppi 0, alatyyppi 1, kanta Kaufbeuren, aminopäätteen suhteen, jossa viruksen VPx-kuorten jäljellä olevat aminohappotähdesekvenssit on ilmaistu sisällyttämällä kuvioon yksi tai useampi yhdysviiva, niin että näiden sekvenssien välinen homologia on selvempi. Virusten lyhennykset Olk:n lisäksi ovat seuraavat: 01c = tyyppi 0, alatyyppi 1, kanta Campos; AIO = tyyppi A, alatyyppi 10, kanta 61; A12 = tyyppi A, alatyyppi 12, kanta 119; A24 = tyyppi A, alatyyppi 24; A27 = tyyppi A, alatyyppi 27; A79 = tyyppi A, alatyyppi 79; ja C3 = tyyppi C, alatyyppi 3, kanta Indaial.Figure 1 shows the eight amino acid residue sequences of the VPi envelope of foot-and-mouth disease viruses at amino acid residue positions 130-160, using a standard three-letter code for each amino acid residue. The sequences are read from left to right and in the direction from the amino terminus to the carboxy terminus. Numerals 130, 140, 150 and 160 show the amino acid residue positions of the virus (Olk), Tiibingen type 0, subtype 1, strain Kaufbeure, with respect to the amino terminus, where the remaining amino acid residue sequences of the viral VPx shells are expressed by including one or more hyphens in the figure. the homology between is clearer. Abbreviations for viruses in addition to Olk are as follows: 01c = type 0, subtype 1, strain Campos; AIO = type A, subtype 10, strain 61; A12 = type A, subtype 12, strain 119; A24 = type A, subtype 24; A27 = type A, subtype 27; A79 = type A, subtype 79; and C3 = type C, subtype 3, strain Indaial.

11 13 8046611 13 80466

Esillä olevan keksinnön mukaan on hyvin odottamattomasta ja hyvin yllätyksellisesti keksitty, että erityinen, suhteellisen lyhyt synteettinen peptidisekvenssi on antigeenisesti erittäin aktiivinen. Synteettinen peptidi sisältää aminohappo-tähdesekvenssin, jonka pituus on noin 20 happoa. Peptidin aminohappotähdesekvenssi vastaa ainakin antigeenisen Picor-naviruksen proteiinin sen alueen aminohappotähdesekvenssiä, joka sijaitsee etäisyydellä joka on noin 60 - noin 75 % antigeenisen kuoriproteiinin aminohappotähdesekvenssin kokonaispituudesta, mitattuna sen aminotähteestä. Synteettisellä peptidillä on netto ionivaraus, joka on nolla tai positiivinen, lukuunottamatta ionivaraukset, jotka aiheutuvat amino-ja/tai karboksyylipääteryhmieh läsnäolosta.According to the present invention, it has been very unexpectedly and very surprisingly discovered that a particular, relatively short synthetic peptide sequence is antigenically highly active. The synthetic peptide contains an amino acid residue sequence of about 20 acids in length. The amino acid residue sequence of the peptide corresponds at least to the amino acid residue sequence of the region of the antigenic Picor navirus protein located at a distance of about 60 to about 75% of the total length of the amino acid residue sequence of the antigenic coat protein as measured from its amino residue. The synthetic peptide has a net ionic charge of zero or positive, except for ionic charges due to the presence of amino and / or carboxyl end groups.

Lisäksi ovat synteettiset antigeenit, jotka sisältävät jäljempänä kuvatut peptidisekvenssit, monospesifisiä Picorna-virusten, kuten suu- ja sorkkatautiviruksen tiettyjen sero-tyyppien, alatyyppien ja kantojen suhteen ja ne ovat myöskin polyspesifisiä, vaikkakin pienemmässä määrin useiden näiden virusten serotyyppien, alatyyppien ja kantojen suhteen.In addition, synthetic antigens containing the peptide sequences described below are monospecific for certain serotypes, subtypes and strains of Picorna viruses, such as foot-and-mouth disease virus, and are also polyspecific, albeit to a lesser extent, for several serotypes and strains of these viruses.

Synteettisiä peptidejä, jotka liittyvät Picornavirukseen, joka aiheuttaa suu- ja sorkkataudin (FMD), rokotteita ja diagnostisia aineita, joissa käytetään tällaisia peptidejä tullaan käsittelemään mallikelpoisina synteettisinä peptideinä, rokotteina ja diagnostisina aineina, joita voidaan valmistaa. On kuitenkin ymmärrettävä, että tässä FMDV:lle esitetyt yleiset periaatteet, menettelytavat ja määritelmät voidaan soveltaa sellaisiin synteettisiin peptideihin, jotka liittyvät Picorna-virusheimon muihin sukuihin. Spesifiset aminohapposekvenssit, jotka vastaavat FMDV:n VP^.-kuoren aminohappotähdesekvenssin asemia, liittyvät vain tähän virukseen, sama pätee myöskin spesifisille aminohappotähdesekvensseille, jotka vastaavat polion VP^-kuoren aminohappotähteen asemia.Synthetic peptides associated with Picornavirus that causes foot-and-mouth disease (FMD), vaccines, and diagnostic agents using such peptides will be treated as exemplary synthetic peptides, vaccines, and diagnostic agents that can be prepared. It is to be understood, however, that the general principles, procedures, and definitions set forth herein for FMDV are applicable to synthetic peptides associated with other genera of the Picorna viral family. The specific amino acid sequences corresponding to the positions of the amino acid residue sequence of the VPD shell of FMDV are related only to this virus, the same is true for the specific amino acid residue sequences corresponding to the positions of the amino acid residue of the polio VP ^ shell.

On erityisesti havaittu, että noin kaksikymmentä aminohappoa sisältävä synteettinen peptidi, joka vastaa FMDVrn VP^- 14 8 O 4 6 6 proteiinin, kuten sellaisen, joka on saatu viruksesta Tubingen tyyppi 0, alatyyppi 1, kanta Kaufbeuren, aminohappotäh-desekvenssiä, joka sijaitsee asemissa noin 141:stä noin 160:een aminopäätteestä, osoittaa paljon korkeampaa antigeenistä tehokkuutta ja aktiivisuutta, kuin koskaan olisi voitu uskoa tai ennustaa aikaisempien tutkimusten perusteella. Keksinnön mukainen peptidi suoraketjuisena, syklisenä renkaana, polymeerinä, jossa peptidiyksiköt on sidottu viereisten peptidien hapetettujen kysteiinitähteiden avulla, tai kantajaan sidottuna konjugaattina, on potentti immunologinen reaktori (antigeeni) suu-ja sorkkatautia vastaan, kuten seuraavassa esitetään yksityiskohtaisemmin.In particular, it has been found that a synthetic peptide of about twenty amino acids corresponding to the amino acid residue sequence of FMDV's VP ^ - 14 8 O 4 6 6 protein, such as that obtained from Tubingen virus type 0, subtype 1, strain Kaufbeure, located at positions from about 141 to about 160 amino termini, shows much higher antigenic potency and activity than would have ever been believed or predicted from previous studies. The peptide of the invention in the form of a straight-chain, cyclic ring, a polymer in which the peptide units are bound by oxidized cysteine residues of adjacent peptides, or a carrier-bound conjugate is a potent immunological reactor (antigen) against foot-and-mouth disease, as described in more detail below.

Tässä käytetään ilmaisua "asemasta noin 141 asemaan noin 160" aminopäätteestä ja samankaltaisia ilmaisuja. Nämä aminohappotähteen asemat määrätään referenssin suhteen, joka on FMDVsn VPi-kuoriproteiinin tyyppi 0, alatyyppi 1, kanta Kaufbeuren.As used herein, the term "from position about 141 to about 160" is used for the amino terminus and similar terms. These amino acid residue positions are determined relative to the reference, which is type 0, subtype 1, strain Kaufbeuren of FMDV's VPi coat protein.

On huomattava, että muutamat tämän alan tutkijat, kuten Kleid et ai., EPO-julkaisussa 0 068 693 A2, ovat siirtäneet VPi- (VP3-, käsitelty edellä) kuoriproteiinin aminohappotähteiden asemat alueella 130-160 yhden aminohappoasemanume-ron verran karboksipäätettä kohti, verrattuna tässä esitettyihin asemanumeroihin, johtuen siitä, että esiintyy yksi ylimääräinen aminohappo (Vai) Asp-53:n jälkeen tyypin C alatyypin 3 VPisn kuoren sekvenssissä, jossa muut kuoret eivät sisällä aminohappotähdettä. Näin ollen tietyssä asemassa, kuten 140 oleva aminohappo tässä keksinnössä, on asemassa 141 edellä mainitun EPO-hakemuksen mukaan. Näin ollen esiintyy alakohtaista eroavaisuutta yhden tai useamman aminohapon aseman suhteen, kun eri tutkijat ilmoittavat saman proteiinimolekyylin sekvenssit.It should be noted that a few researchers in this field, such as Kleid et al., EPO Publication No. 0 068 693 A2, have shifted the amino acid residue positions of the VP1 (VP3, discussed above) shell protein by 130 to 160 one amino acid position number per carboxy terminus, compared to to the position numbers disclosed herein, due to the presence of one additional amino acid (Val) after Asp-53 in the envelope sequence of type C subtype 3 VPis, where the other envelopes do not contain an amino acid residue. Thus, an amino acid at a certain position, such as amino acid 140 in the present invention, is at position 141 according to the above-mentioned EPO application. Thus, there is a sectoral difference in the position of one or more amino acids when different researchers report the sequences of the same protein molecule.

Lisäksi muutamien suu- ja sorkkatautivirusten kuori-proteiinit eivät sisällä aminohappotähdettä alueen 130-160 yhdessä tai useammassa asemmassa, joka alue liittyy tyypin 0, alatyyppi 1, il is 80466 kanta Kaufbeuren VP·^-tyyppiin, kuten on esitetty kuviossa 1 ja osoitettu kirjaimilla "X", "Y" ja "X" jäljempänä esitetyn kaavan I mukaisessa sekvenssissä. Huomioon ottaen tällaiset puuttumiset muutamat tutkijat ilmoittavat aminohappojen asemat määritettynä proteiinista tai tämän proteiinin DNA-mole-kyylin koodauksesta huomioimatta näitä puuttumisia. Muut tutkijat havainnollistavat VP-^-kuorten välistä homologiaa merkitsemällä aminohapon puuttuminen yhdysviivalla, kirjaimella tai muilla merkinnöillä ja numeroimalla jäljellä olevien aminohappotähteiden asemat ikään kuin poistetut tähteet olisivat läsnä, kuten tässä selityksessä tehdään. Näin ollen esiintyy pieni alakohtainen lisävariaatio ilmoitettaessa aminohapon asemia.In addition, the coat proteins of a few foot-and-mouth disease viruses do not contain an amino acid residue at one or more positions in region 130-160, which region is associated with type 0, subtype 1, strain 80466 of the Kaufbeure VP · ^ type, as shown in Figure 1 and indicated by the letters " X "," Y "and" X "in the sequence of formula I below. In view of such deficiencies, a few researchers report amino acid positions as determined from a protein or the DNA-molecule encoding of that protein without regard to those deficiencies. Other researchers illustrate the homology between VP - ^ shells by marking the absence of amino acid with a hyphen, letter, or other markings and numbering the positions of the remaining amino acid residues as if the deleted residues were present, as is done in this specification. Thus, there is little additional sectoral variation in the reporting of amino acid positions.

Näin ollen sana "noin" käytettynä yllä olevissa ja samankaltaisissa ilmaisuissa, on tarkoitettu osoittavan, että amino-happotähdesekvenssi voi alkaa tai päättyä aminohappotähteeseen, joka on jopa kolmen tähteen verran merkittyjen asemien jommal-la kummalla puolella, jotta sallittaisiin yhden tai kahden numeron poikkeavuus aseman suhteen, kuten alalla on ilmoitettu tietyn aminohappotähteen suhteen missä tahansa erityisessä peptidisekvenssissä, ja jotta otettaisiin huomioon se tosiseikka, että tietyt aminohappotähteet puuttuvat joissakin VP^-kuoriproteiineissa.Thus, the word "about" as used in the above and similar expressions is intended to indicate that an amino acid residue sequence may begin or end with an amino acid residue up to three residues on either side of the positions to allow one or two digits to deviate from the position. , as reported in the art for a particular amino acid residue in any particular peptide sequence, and to account for the fact that certain amino acid residues are absent in some VP1 coat proteins.

Esillä oleva keksintö käsittää useita synteettisiä peptidejä.The present invention encompasses a number of synthetic peptides.

- Jokainen näistä synteettisistä peptideistä sisältää noin 20 aminohappotähdettä käsittävän sekvenssin, joka vastaa tai vastaa olennaisesti FMDV:n VP^-proteiinin samanpituista amino-happotähdesekvensslä alueessa, joka sijaitsee asemasta noin 141 asemaan noin 160.Each of these synthetic peptides contains a sequence of about 20 amino acid residues that corresponds to or substantially corresponds to the amino acid residue sequence of the same length of the FMDV VP1 protein in the region from about position 141 to about position 160.

Kuten jo on mainittu, on olemassa useita FMDV:n tyyppejä, alatyyppejä ja kantoja. Tämän vuoksi tässä kuvatut peptidi-sekvenssit tullaan, vertailun helpottamiseksi käsittelemään viittaamalla VP^-proteiiniin, joka on peräisin määrätystä tyypistä, alatyypistä ja kannasta, nimittäin seuraavasta: 16 80 466 FMDV:n Tubingen tyyppi O, alatyyppi 1, kanta Kaufbeuren, josta tässä myöskin käytetään nimeä tyyppi 0, alatyyppi 1, kanta Kaufbeuren ja Olk. Näin ollen käyttämällä referenssinä yhden määrätyn FMDV-proteiinin aminohapposekvenssiä/ voidaan kuvata muita käyttökelpoisia peptidisekvenssejä, jotka sisältävät substituoituja tai pois jääneitä aminohappotähteitä määrätyissä kohdissa pitkin peptidiketjua.As already mentioned, there are several types, subtypes and strains of FMDV. Therefore, for ease of comparison, the peptide sequences described herein will be discussed with reference to a VP ^ protein derived from a particular type, subtype, and strain, namely, the following: Tubingen type O, subtype 1, strain Kaufbeuren of 16 80 466 FMDV, including used the name type 0, subtype 1, strain Kaufbeuren and Olk. Thus, using the amino acid sequence of one particular FMDV protein as a reference /, other useful peptide sequences containing substituted or omitted amino acid residues at specific sites along the peptide chain can be described.

Kuviossa 1 on esitetty kahdeksan FMD-viruksen VPx-kuoripro-teiinin peptidisekvenssiä asemissa noin 130:stä noin 160:een, käyttäen referenssinä tyypin Olk-proteiinin nume-rointisysteemiä. Keksinnön piiriin kuuluvat synteettiset, edullisesti vesiliukoiset peptidit, jotka kukin sisältävät noin 20 aminohappoa, joilla kullakin on aminohappotähdesek-venssit, jotka vastaavat tai vastaavat olennaisesti kuviossa 1 esitettyjä aminohappotähdesekvenssejä ja jotka kukin täyttävät jäljempänä esitetyn yksikkökokeen ehdot.Figure 1 shows the peptide sequences of eight FMD virus VPx envelope proteins at positions from about 130 to about 160, using a type Olk protein numbering system as a reference. The invention encompasses synthetic, preferably water-soluble peptides, each containing about 20 amino acids, each having amino acid residue sequences corresponding to or substantially corresponding to the amino acid residue sequences shown in Figure 1, each meeting the conditions of the unit experiment set forth below.

Edullinen peptidi, jolla on aminohappotähdesekvenssi, joka vastaa aminohappotähdettä asemissa noin 140 - noin 160, laskettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäätteestä karboksipäätettä kohti, on esitetty seuraavassa kaavassa I:A preferred peptide having an amino acid residue sequence corresponding to an amino acid residue at positions about 140 to about 160, calculated from left to right and in the direction from the amino terminus to the carboxy terminus, is shown in the following formula I:

Kaava IFormula I

(141)(141)

Val(Ser tai Gin tai X)Pro(Gly tai Y)Asn(Z)Leu(Arg tai Val)Arg(Ser tai Ala)GlyAspLeu(Met tai Phe)Gln(Gly) (3.50)Val (Ser or Gln or X) Pro (Gly or Y) Asn (Z) Leu (Arg or Val) Arg (Ser or Ala) GlyAspLeu (Met or Phe) Gln (Gly) (3.50)

Thr(Gln tai His)LeuPro jossa jokainen suluissa esitetyistä aminohappotähteistä X, Y tai Z voi itsenäisesti korvata välittömästi sulkujen vasemmalla puolella olevan viereisen aminohappotähteen, tl 17 80466 ts. aminohappotähteen, joka on lähempänä aminopäätettä; X ja/tai Y ja/tai Z peptidin aminohappohappotähdesekvenssis-sä merkitsee itsenäisesti aminohappotähteen puuttumista välittömästi sulkujen vasemmalla puolella olevassa aminohappotähteen asemassa (lähempänä aminopäätettä), jolloin peptidin pituus vastaavasti lyhenee yhden, kahden tai kolmen aminohappotähteen verran, ja suluissa olevat numerot määrättyjen aminohappotähteiden yläpuolella edellä olevassa sekvenssissä ilmaisevat FMDV:n, Tiibingen tyyppi 0, alatyyppi 1, kanta Kaufbeuren, VPi-kuori-proteiinin määrätyn aminohappotähteen asemat aminopäättees-tä. Nämä numerot on esitetty vain vertailumielessä.Thr (Gln or His) LeuPro wherein each of the amino acid residues X, Y, or Z in parentheses can independently replace the adjacent amino acid residue immediately to the left of the parentheses, tl 17 80466, i.e., an amino acid residue closer to the amino terminus; X and / or Y and / or Z in the amino acid residue sequence of the peptide independently means the absence of an amino acid residue immediately to the left of the parentheses (closer to the amino terminus), the length of the peptide being shortened by one, two or three amino acid residues above the numbers and the numbers in parentheses in the sequence in Figure 1 indicate the positions of the specific amino acid residue of FMDV, Tiibingen type 0, subtype 1, strain Kaufbeuren, VPi shell protein at the amino terminus. These numbers are presented for comparison purposes only.

FMDV-suvun tyyppien, alatyyppien ja kantojen polyspesifi-syyttä ja ristireaktiivisuutta on parannettu käyttämällä tämän keksinnön mukaista peptidiä, jonka aminohappotähdesek-venssi vastaa FMDV-suvun ainakin useamman kuin yhden kannan, ja edullisemmin useamman kuin yhden alatyypin tai serotyy-pin, aminohappotähdesekvenssiä. Saattaa olla, että tällaisen peptidin aminohappotähdesekvenssi ei täysin vastaa minkään viruksen aminohappotähdesekvenssiä, mutta siitä huolimatta se synnyttää, kun sitä annetaan rokotteena isäntäeläimeen, vasta-aineiden tuotannon, jotka vasta-aineet immuunireagoivat useiden virustyyppien, -alatyyppien tai -kantojen kanssa suojaten isäntäeläintä useammalta kuin yhdeltä näistä viruksista.The polyspecificity and cross-reactivity of FMDV genus types, subtypes and strains has been improved by using a peptide of the present invention having an amino acid sequence corresponding to at least more than one strain of the FMDV genus, and more preferably more than one subtype or serotype. It may be that the amino acid residue sequence of such a peptide does not fully correspond to the amino acid residue sequence of any virus, but nevertheless, when administered as a vaccine to a host animal, produces antibodies that immunoreact against multiple virus types, subtypes or strains. of these viruses.

Polyspesifisellä peptidillä, jonka aminohappotähdesekvenssi vastaa FMDVsn ainakin useamman kuin yhden kannan aminohappotähdesekvenssiä, saattaa olla edellä olevan kaavan I mukainen aminohappotähdesekvenssi, jossa kaavassa yksi tai useampi suluissa esitetty aminohappotähde X, Y tai Z voi korvata välittömästi sulkujen vasemmalla puolella olevan viereisen aminohappotähteen, toisin sanoen viereisen aminohappotähteen, ie 80 466 joka on aminotähdettä kohti. Substituoinnit ja poistot aminohappotähteen alueen kohdissa noin 141:stä noin 155:een ovat edulliset polyspesifisyyden aikaansaamiseksi peptidissä, jossa on yksi ainoa aminohappotähdesekvenssi. Tällainen polyspe-sifinen peptidi voidaan valmistaa ja sitä voidaan käyttää samalla tavalla kuin keksinnön mukaisia muita peptidejä.A polyspecific peptide having an amino acid residue sequence corresponding to the amino acid residue sequence of at least more than one strain of FMDV may have an amino acid residue sequence of formula I above, wherein one or more amino acid residues X, Y or Z in parentheses may immediately replace , ie 80 466 which is per amino residue. Substitutions and deletions at positions in the amino acid residue region from about 141 to about 155 are preferred to provide polyspecificity in a peptide having a single amino acid residue sequence. Such a polyspecific peptide can be prepared and used in the same manner as other peptides of the invention.

Kaikkein edullisimmalla yksittäisillä peptideillä, jotka vastaavat olennaisesti seuraavien peptidien aminohappotähde-sekvenssejä: (1) Tubingen tyyppi 0, alatyyppi 1, kanta Kaufneuren, (2) tyyppi A, alatyyppi 10, kanta 61 ja (3) tyyppi A, alatyyppi 12, kanta 119 asemissa noin 141:stä noin 160:een. laskettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa amino-päätteestä karboksipäätettä kohti, on seuraavat sekvenssit: (1) ValProAsnLeuArgGlyAspLeuGlnValLeuAlaGln LysValAlaArgThrLeuPro; 1 (2) SerArgSerGlyAspLeuGlySerlleAlaAlaArgWith the most preferred individual peptides that substantially correspond to the amino acid residue sequences of the following peptides: (1) Tubingen type 0, subtype 1, strain Kaufneuren, (2) type A, subtype 10, strain 61, and (3) type A, subtype 12, strain 119 stations from about 141 to about 160. calculated from left to right and in the direction from the amino terminus to the carboxy terminus, are the following sequences: (1) ValProAsnLeuArgGlyAspLeuGlnValLeuAlaGln LysValAlaArgThrLeuPro; 1 (2) SerArgSerGlyAspLeuGlySerlleAlaAlaArg

ValAlaThrGlnLeuPro, ja : (3) SerGlyValArgGlyAspPheGlySerLeuAlaProArgValAlaThrGlnLeuPro, and: (3) SerGlyValArgGlyAspPheGlySerLeuAlaProArg

ValAlaArgLeuPro.ValAlaArgLeuPro.

Ilmaisua "vastaa olennaisesti" sen erilaisissa kieliopillisissa muodoissa käytetään tässä selityksessä ja patenttivaatimuksissa Picornavirukseen liittyvien peptidisekvenssien yhteydessä tarkoittamaan, että esitetty peptidisekvenssi voi sisältää plus tai minus 1-3 aminohappotähdettä toisessa tai molemmassa amino- ja karboksipäätteessä ja että se sisältää vain tavanomaisia substituointeja peptidisekvenssin määrätyis- ** sä aminohappotähteissä. Ilmaisua "vastaa" sen erilaisissa kieliopillisissa muodoissa käytetään tässä selityksessä ja patenttivaatimuksissa Picornaviruksiin liittyvien peptidisek-venssien yhteydessä tarkoittamaan, että esitetty peptidisekvenssi voi sisältää plus tai minus 1-3 aminohappotähdettä toisessa tai molemmissa amino- ja karboksipäätteessä ja että se sisältää tavanomaisia substituointeja sekä myöskin tavanomaisia radikaalisubstituointeja määrätyissä aminohappotähteissä ja että siitä myöskin puuttuu määrättyjä il 19 80466 aminohappotähteitä tai että se myöskin sisältää määrättyjä ylimääräisiä aminohappotähteitä pitkin peptidisekvenssiä.The term "substantially equivalent" in its various grammatical forms is used in this specification and claims in connection with Picornavirus-related peptide sequences to mean that the disclosed peptide sequence may contain plus or minus 1-3 amino acid residues at one or both amino and carboxy termini and that it contains only conventional substitutions. * in amino acid residues. The term "equivalent" in its various grammatical forms is used in this specification and claims in connection with Picornavirus-related peptide sequences to mean that the disclosed peptide sequence may contain plus or minus 1-3 amino acid residues at one or both amino and carboxy termini and includes conventional substitutions as well as radical substitutions at certain amino acid residues and that it also lacks certain il 80806 amino acid residues or that it also contains certain additional amino acid residues along the peptide sequence.

Ilmaisun "tavanomainen substituointi" edellä käytettynä on tarkoitettu osoittamaan, että yksi aminohappotähde on korvattu toisella, biologisesti samanlaisella tähteellä. Esimerkkejä tavanomaisista substituoinneista ovat hydrofobisen tähteen, kuten Ile, Vai, Leu tai Met subtituointi toisella tähteellä, tai polaarisen tähteen substituointi toisella tähteellä, kuten Arg ja Lys, Glu ja Asp tai Gin ja Asn, ja sen tapaisten välinen substituointi.The term "conventional substitution" as used above is intended to indicate that one amino acid residue has been replaced by another, biologically similar residue. Examples of conventional substitutions include substitution of a hydrophobic residue such as Ile, Val, Leu or Met with another residue, or substitution of a polar residue with another residue such as Arg and Lys, Glu and Asp or Gln and Asn, and the like.

Joissakin tapauksissa on ionisen tähteen korvaaminen ioni- sella tähteellä, jolla on vastakkainen varaus, kuten Asp:n korvaaminen Lys:llä, nimetty tavanomaiseksi tällä alalla, koska näistä ionisista ryhmistä on ajateltu olevan vain hyötyä liukenemisen suhteen. Yleisesti ottaen, koska tässä käsitellyt korvaukset kuitenkin liittyvät suhteellisen lyhyisiin synteettisiin peptidiantigeeneihin, verrattuna koko proteiiniin, katsotaan tässä yhteydessä ionisen tähteen korvaaminen toisella ionisellä tähteellä, jolla on vastakkainen varaus, olevan "radikaali korvaus", kuten ovat korvaukset ei-ionisten ja ionisten tähteiden välillä, ja suurten tähteiden, kuten Phe:n, Tyr:n tai Trp:n ja pienempien tähteiden, kuten Gly;n, Ile:n ja Val:n välillä.In some cases, replacement of an ionic residue with an ionic residue having the opposite charge, such as replacement of Asp with Lys, has been named conventional in the art because these ionic groups are thought to be only beneficial in terms of dissolution. In general, however, since the substitutions discussed herein relate to relatively short synthetic peptide antigens relative to the protein as a whole, substitution of an ionic residue with another ionic residue having the opposite charge is considered a "radical substitution", such as substitutions between nonionic and ionic residues. and between large residues such as Phe, Tyr or Trp and smaller residues such as Gly, Ile and Val.

Ilmaisuja "ei-ioniset" ja "ioniset" tähteet käytetään tässä selityksessä niiden tavallisessa merkityksessä tarkoittamaan sellaisia aminohappotähteitä, joilla fysiologisilla pH-arvoilla tavallisesti joko ei ole varausta tai vastaavasti on varaus. Esimerkkejä ei-ionisista tähteistä ovat Thr ja Gin, kun taas Arg ja Asp ovat esimerkkejä ionisista tähteistä.The terms "nonionic" and "ionic" residues are used in this specification in their ordinary sense to mean amino acid residues which are usually either uncharged at physiological pH values or have a charge, respectively. Examples of nonionic residues are Thr and Gln, while Arg and Asp are examples of ionic residues.

Kuviossa I esitettyyn sekvenssiin, joka vastaa FMDV:n VP^-kuo-ren asemia noin 141:stä noin 160 reen, sisältyy suuri määrä yksittäisiä peptidejä, jotka kaikki, kun niiden pituus on noin 20 80 466 20 aminohappotähdettä, ovat keksinnön mukaisia peptidejä. Valmistetut synteettiset peptidit, joiden aminopääte alkaa kuoren asemasta 141, voivat esimerkiksi alkaa aminopäätteellä, jona on Vai-, Ser- tai Gln-tähde.The sequence shown in Figure I, which corresponds to positions from about 141 to about 160 in the VPD envelope of FMDV, includes a large number of individual peptides, all of which, when about 20 80 466 20 amino acid residues in length, are peptides of the invention. For example, prepared synthetic peptides having an amino terminus starting at position 141 of the shell may begin with an amino terminus having a Vai, Ser, or Gln residue.

Lisäksi, kun aminohappotähteen aminopäätteen asema on merkitty X:llä osoittaen aminohappotähteen puuttumista välittömästi sulkujen vasemmalla puolella kaavassa I, voi peptidin aminopääte alkaa kuoren asemasta 142 aminohappotähteellä Pro,In addition, when the amino terminus position of an amino acid residue is denoted by X, indicating the absence of an amino acid residue immediately to the left of the parentheses in Formula I, the amino terminus of the peptide may begin at the envelope position 142 with amino acid residue Pro,

Gly tai Y, jossa Y itsenäisesti merkitsee Pro:n ja Gly:n puuttumista, jolloin peptidin aminopääte alkaa aminohappotähteellä, joka vastaa 01k:n asemaa 143 asemien 141 tai 142 sijasta. Tarkasteltaessa kaavaa I havaitaan lisäksi, että kuoritähde asemassa 143 voi olla Asn tai Z ja siten jäännös voi myös puuttua.Gly or Y, where Y independently means the absence of Pro and Gly, wherein the amino terminus of the peptide begins with an amino acid residue corresponding to position 143 of 143 instead of positions 141 or 142. Looking at formula I, it is further observed that the shell residue at position 143 may be Asn or Z and thus the residue may also be absent.

Näin ollen peptidi, jonka sekvenssi vastaa kuoren asemia noin 141:stä noin 160:een, voi alkaa kuoren asemasta 144.Thus, a peptide having a sequence corresponding to shell positions from about 141 to about 160 may start at shell position 144.

Kuten on korostettu edellä, voivat peptidisekvenssit, jotka vastaavat kuvattua sekvenssiä, sisältää plus tai miinus 1-3 aminopäätetähdettä jommalla kummalla päätteellä. Edellä kuvattu peptidi, jonka aminohappotähdesekvenssi itse asiassa alkaa asemasta 144 suhteessa tyypin Olk VP^.kuoriproteiiniin, kuuluu niihin peptideihin, joiden sekvenssit "sisältävät miinus 1-3 aminohappotähdettä toisessa tai molemmassa amino- ja karboksipäätteessä..." *: Esillä olevan keksinnön mukaiset tyypilliset peptidit kuu luvat FMDV-proteiinien, tyyppiin 0, alatyyppi 1, kanta Kaufbeuren ja tyyppiin A, alatyyppi 12, kanta 119, alueeseen noin 130:sta noin 160:een (ilmaistu käyttäen tyypin 0 asema-numerointia ja nimitetty 01k:ksi ja Al2:ksi), ja tyypin C, SAT-l:n, SAT-2:n, SAT-3:n ja ASIA-l:n vastaaviin alueisiin. Kaksi esimerkkiä tällaisista peptideistä on esitetty alla, käyttäen Olk-viruksen asemanumerointia ja yhdisviivaa osoittamaan aminohappotähteen puuttumista.As highlighted above, peptide sequences corresponding to the described sequence may contain plus or minus 1-3 amino terminal residues at either end. The peptide described above, whose amino acid residue sequence actually begins at position 144 relative to the Olk VP1 shell protein, belongs to those peptides whose sequences "contain minus 1-3 amino acid residues at one or both amino and carboxy termini ..." *: Typical compounds of the present invention The peptides belong to the range of FMDV proteins, type 0, subtype 1, strain Kaufbeuren and type A, subtype 12, strain 119, from about 130 to about 160 (expressed using type 0 position numbering and designated 01k and Al2: ksi), and the corresponding areas of type C, SAT-1, SAT-2, SAT-3, and ASIA-1. Two examples of such peptides are shown below, using Olk virus position numbering and a hyphen to indicate the absence of an amino acid residue.

ti 21 80 466ti 21 80 466

Esimerkki 1Example 1

Tyyppi Olk (130) (140)Type Olk (130)

TyrAsnGlyGluCysArgTyrAsnArgAsnAlaValProAsnLeuArg (150) (160)TyrAsnGlyGluCysArgTyrAsnArgAsnAlaValProAsnLeuArg (150) (160)

GlyAspLeuGlnValLeuAlaGlnLysValAlaArgThrLeuProGlyAspLeuGlnValLeuAlaGlnLysValAlaArgThrLeuPro

Tyyppi Ai2 (130) (140)Type Ai2 (130)

TyrAsnGlyThrAsnLysTyrSerAlaSerGlySerGly - ValArgGlyAsp 150 161TyrAsnGlyThrAsnLysTyrSerAlaSerGlySerGly - ValArgGlyAsp 150 161

PheGlySerLeuAlaProArgValAlaArgGlnLeuProAla ··. On osoitettu, että kuoren aminohappotähdesekvenssi alueessa noin 141:stä noin 160:een on hyvin odottamattomasti antigee-nisesti hyvin aktiivinen ja tehokas, kuten jäljempänä esi-'. tetään yksityiskohtaisemmin.PheGlySerLeuAlaProArgValAlaArgGlnLeuProAla ··. It has been shown that the amino acid residue sequence of the shell in the range of about 141 to about 160 is very unexpectedly antigenically very active and efficient, as described below. in more detail.

Peptidit, joilla on noin kahdenkymmenen aminohapon sekvenssi alueella noin 141:stä noin 160:een, ja joihin voidaan lisätä amino-tai karboksipääte Cys tai muu aminohappo, jotta mahdollistettaisiin niiden kiinnittymistä kovalenttisen sidoksen välityksellä ylimääräisellä synteesivaiheella kantajaan, esimerkiksi avaimenreikämaljakotilo-hemosyaniiniin (KLH), jos tahdontaan käyttää kantajaa, muodostavat erään keksinnön mukaisen suoritusmuodon, jonka muodostavat myöskin edellä mainittujen peptidien variaatiot yksittäisten aminohappojen peptidipituu-’· den tai substituointien tai poistojen suhteen, jotka variaa tiot eivät tuhoa eivätkä olennaisesti muuta keksinnön mukaisten FMDV:n monospesifisten ja polyspesifisten synteettisten antigeenisten determinanttipeptidien ainutlaatuista ja tehokasta antigeenisyyttä. ! Nämä sekvenssit, erotettuina muista antigeenisestä aktiivisista tai antigeenisestä peitetyistä sekvensseistä, muodostavat vielä erään keksinnön mukaisen suoritusmuodon. Antigeenit, jotka sisältävät useamman kuin yhden edellä esitetyistä 22 80 466 antigeenisesti aktiivisista sekvensseistä, ja jotka on erotettu antigeenisestä häiritsevistä tai peittävistä sekvensseistä, ja jotka on kemiallisesti liitetty tai sekoitettu muiden aineosien kanssa, muodostavat vielä erään toisen keksinnön mukaisen muodon. Antigeenit, jotka sisältävät kantajan, johon yksi tai useampi edellä esitetyistä antigeenisesti aktiivisista aminohapposekvensseistä on kiinnitetty, muodostavat vielä erään keksinnön mukaisen suoritusmuodon. Esillä oleva keksintö käsittää tietenkin myöskin rokotteen, joka sisältää keksinnön mukaisen antigeenisen peptidin yksinään tai sidottuna kantajaan yhdessä fysiologisesti hyväksyttävän laimentimen kanssa. Fysiologisesti hyväksyttävien laimentavien apuaineiden käyttö on valinnaista.Peptides having a sequence of about twenty amino acids in the range of about 141 to about 160, to which an amino or carboxy terminus Cys or other amino acid may be added to allow covalent attachment via an additional synthetic step to a support, e.g., a keyhole vase (KL). if a carrier is intended to be used, constitute an embodiment of the invention which also comprises variations in the peptide lengths or substitutions or deletions of individual amino acids of the above peptides which do not destroy or substantially alter the monospecific and polyspecific deterministic synthetic antigen of the FMDV of the invention. unique and effective antigenicity. ! These sequences, distinguished from other antigenically active or antigenically coated sequences, form a further embodiment of the invention. Antigens comprising more than one of the 22 80 466 antigenically active sequences set forth above, separated from antigenic interfering or masking sequences, and chemically linked to or mixed with other ingredients, form yet another aspect of the invention. Antigens comprising a carrier to which one or more of the above antigenically active amino acid sequences are attached constitute a further embodiment of the invention. Of course, the present invention also encompasses a vaccine comprising an antigenic peptide of the invention alone or bound to a carrier together with a physiologically acceptable diluent. The use of physiologically acceptable diluents is optional.

Tarkasteltaessa esillä olevaa keksintöä, on tärkeätä ottaa huomioon antigeenisesti aktiivisten aminohappotähdesekvens-sien seuraavat määritelmät, joiden sekvenssien on katsottava muodostavan erään keksinnön suoritusmuodon. Esimerkiksi sekvenssi, joka vastaa tyypin 0, alatyyppi 1, kanta Kaufburen, asemia 141:stä 160:een, katsottuna vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäätteestä karboksipäätettä kohtiIn considering the present invention, it is important to consider the following definitions of antigenically active amino acid residue sequences, which sequences are to be considered as forming an embodiment of the invention. For example, the sequence corresponding to type 0, subtype 1, strain Kaufburen, positions 141 to 160, viewed from left to right and in the direction from the amino terminus to the carboxy terminus

ValProAsnLeuArgGlyAspLeuGlnValLeuAlaGlnLysValValProAsnLeuArgGlyAspLeuGlnValLeuAlaGlnLysVal

AlaArgThrLeuPro erotettuna muista peptideistä, geenifragmenteista, aminohapoista ja aminohapposekvensseistä, jotka pyrkivät peittämään tai häiritsemään tai ristireagoimaan tai komplisoimaan kyseessä olevan peptidin antigeenistä tehokkuutta, muodostaa esillä olevan keksinnön spesifisen suoritusmuodon. Näin ollen, vaikkakin löydettäisiin tarkoin määrätty sekvenssi esimerkiksi suuren proteiinin tai suuremman peptidisisällön osana, sisältäen noin 30 aminohappoa tai enemmän, niin tällaiset suuremmat materiaalit eivät sisälly esillä olevaan keksintöön, koska proteiinilla tai suuremmalla peptidillä ei olisi sellaista aktiivisuutta, epätavallisen ja odottamattoman korkeaa, olennaisesti monospesifisen antigeeniaktiivisuuden tasoa, jonka keksinnön mukainen, noin 20 aminohappoa pitkä peptidi omaa.AlaArgThrLeuPro, distinguished from other peptides, gene fragments, amino acids, and amino acid sequences that seek to mask or interfere with or cross-react with or complicate the antigenic efficacy of the peptide in question, constitutes a specific embodiment of the present invention. Thus, although a well-defined sequence would be found, for example, as part of a large protein or higher peptide content, containing about 30 amino acids or more, such larger materials are not included in the present invention because the protein or larger peptide would not have such activity, an unusually and unexpectedly high, substantially monospecific the level of antigenic activity of the peptide of the invention of about 20 amino acids.

tl 23 80466tl 23 80466

Ilmaisulla "FMDV:n monospesifinen, synteettinen, antigeeninen determinanttipeptidi" tarkoitetaan sellaista määrättyä peptidiä, joka on tarkoin määritetty edellä ja joka saadaan kemiallisesta synteesistä, joka eliminoi geeni-, oleiini-tai peptidifragmentit, tai minkä tahansa aminohappoyhdisteen, joka on peräisin suoranaisesti tai epäsuorasti FMDVrstä, ja joka peptidi on vapaa sellaisista peptidi- tai aminohappo-sekvensseistä, jotka voisivat häiritä tai muuttaa määrätyn peptidin monospesifista antigeeniaktiivisuutta, ja siten estää vasta-aineiden tuotannon FMDVitä vastaan eläimissä. On huomattava, että vaikkakin ilmaisua "monospesifinen" käytetään tässä, niin yksittäiset peptidit omaavat myöskin polyspesi-fisen antigeenisen aktiivisuuden useiden FMDV-tyyppien, alatyyppien ja kantojen suhteen. Tämä laaja spesifisyys on erityisesti havaittavissa, kun suoritetaan radikaali-substituoin-ti sellaisessa peptidissä, jonka sekvenssi muuten vastaa olennaisesti määrätyn FMDV-kuoren aminohappotähdesekvenssiä ja kun radikaalilla substituoitu aminohappotähde on sellainen tähde, joka esiintyy toisen viruskannan substituointikohdassa. Näin ollen ilmaisun "monospesifinen" käytön kuvaus on lyhyt kuvaus keksinnön mukaisten peptidien laajasta spesifisyydestä.The term "monospecific, synthetic, antigenic determinant peptide of FMDV" means a specific peptide, as defined above, obtained by chemical synthesis that eliminates gene, olein, or peptide fragments, or any amino acid compound derived directly or indirectly from FM. , and which peptide is free of peptide or amino acid sequences that could interfere with or alter the monospecific antigenic activity of a particular peptide, and thus inhibit the production of antibodies against FMDV in animals. It should be noted that although the term "monospecific" is used herein, individual peptides also have polyspecific antigenic activity for several FMDV types, subtypes, and strains. This broad specificity is particularly noticeable when radical substitution is performed on a peptide whose sequence otherwise substantially corresponds to the amino acid residue sequence of a particular FMDV envelope, and when the radical-substituted amino acid residue is a residue present at the substitution site of another viral strain. Thus, the description of the use of the term "monospecific" is a brief description of the broad specificity of the peptides of the invention.

Keksinnön mukaiset synteettiset antigeeniset peptidit kykenevät yksinään suoraketjuisessa tai syklisessä muodossa, polymeerinä, jossa viereiset toistuvat peptidiyksiköt on sidottu yhteen hapotetuilla kysteiinitähteillä, tai kantajaan sidottuna konjugaattina, annettuna tehokkaassa määrässä rokotteena, synnyttämään vasta-aineiden tuotannon isäntäeläimessä, jotka vasta-aineet immuunireagoivat sensukuisen Picornaviruksen kanssa suojaten isäntäeläintä Picornaviruksen aiheuttamalta infektiolta. Tämän keksinnön mukaista peptidiä voidaan kuitenkin lisämääritellä sen antigeenisiä ominaisuuksia kuvaavalla yksikkökokeella, joka on riippumaton siitä muodosta, jossa peptidiä lopullisesti käytetään, eli suoraketjuisena, syklisenä renkaana, polymeerinä tai sidottuna konjugaattina. Tämän yksikkökokeen mukaan keksinnön mukainen peptidi kykenee suoraketjuisessa muodossa, kun se on sidottu avaimenreikamalja- 24 8 0 4 6 6 kotilo-hemosyaniinikantajaan konjugaattina ja viety tehokkaana määränä rokotteena isäntäeläimeen, synnyttämään vasta-aineiden tuotannon, jotka vasta-aineet imuunireagoivat sen sukuisen Picornaviruksen kanssa suojaten tätä isäntäeläintä tältä virukselta. Peptidin ja kantajan määrät ja konjugointireak-tion spesifiset reaktio-olosuhteet ja rokotevalmisteet on esitetty aikakausijulkaisussa Bittle et ai., Nature, 298:30-33 (heinäkuu, 1982).The synthetic antigenic peptides of the invention are capable, alone, in a straight-chain or cyclic form, as a polymer in which adjacent repeating peptide units are linked by acidified cysteine residues, or as a carrier-bound conjugate with an effective dose of host animal from Picornavirus infection. However, the peptide of this invention can be further defined by a unit assay describing its antigenic properties, independent of the form in which the peptide is finally used, i.e., as a straight chain, cyclic ring, polymer, or bound conjugate. According to this unit test, the peptide of the invention is capable of producing a production of antibodies in a straight chain form when conjugated to a keyhole dish-conchemic hemocyanin carrier as a conjugate and administered in an effective amount as a vaccine to a host animal. host animal from this virus. The amounts of peptide and carrier and the specific reaction conditions and vaccine preparations for the conjugation reaction are described in Bittle et al., Nature, 298: 30-33 (July, 1982).

Rokotteena, esillä oleva keksintö käsittää tehokkaan määrän peptidiantigeeniä, joka saattaa yksinään soveltua rokotteeksi, kun läsnä on fysiologisesti hyväksyttävä laimennin, kuten vesi tai suolaliuos. Rokote voi sisältää kantajan, joka voi olla mikä tahansa useista kantajista, kuten avaimenreikämalja-kotilo-hemosyaniini (KLH), jäykkäkouristustoksoidi, poly-L-(Lys:Glu), maapähkinäagglutiini, ovalbumiini, soijapapuagglu-tiini, nautaseerumialbumiini (BSA) ja sentapainen, johon FMDV:n . monospesifinen, synteettinen determinattipeptidi on sidottu.As a vaccine, the present invention comprises an effective amount of a peptide antigen that may alone be suitable as a vaccine in the presence of a physiologically acceptable diluent such as water or saline. The vaccine may contain a carrier which may be any of a number of carriers such as keyhole conch hemocyanin (KLH), tetanus toxoid, poly-L- (Lys: Glu), peanut agglutin, ovalbumin, soybean agglutin, bovine serum albumin to which FMDV. the monospecific, synthetic determinant peptide is bound.

Polymeeri, joka on valmistettu sitomalla useita tämän keksinnön mukaisia peptidejä hapetettujen kysteiinipääteryhmien päästä-päähän-sidosten välityksellä, saattaa myös käsittää ! eksogeenisen, kantajasta vapaan rokotteen yhdessä fysiolo gisesti hyväksyttävän laimentimen kanssa. Kaikissa tapauksissa tämän keksinnön mukainen peptidi toimii spesifisenä antigeenisenä determinanttina.A polymer prepared by linking several peptides of this invention via end-to-end linkages of oxidized cysteine end groups may also comprise! an exogenous, carrier-free vaccine together with a physiologically acceptable diluent. In all cases, the peptide of this invention acts as a specific antigenic determinant.

Antigeenisen peptidin "tehokas määrä" riippuu useista teki-*: jöistä. Näihin tekijöihin sisältyy suojattavan isäntäeläimen ruumiinpaino ja laji, kantaja, kun sitä käytetään, apuaine, : kun sitä käytetään, se lukumäärä rokotuksia, jota halutaan 1 käyttää, ja eläimelle halutun suojan kestoaika. Yksittäiset rokotteet sisältävät yleensä noin 20 mikrogrammaa - noin 2 milligrammaa synteettistä antigeenistä peptidiä, lukuunottamatta kantajaa, johon peptidi voi olla sidottu.The "effective amount" of an antigenic peptide depends on several factors. These factors include the body weight and species of the host animal to be protected, the carrier when used, the adjuvant, when used, the number of vaccinations desired to be used, and the duration of protection desired for the animal. Individual vaccines generally contain from about 20 micrograms to about 2 milligrams of a synthetic antigenic peptide, excluding a carrier to which the peptide may be bound.

Kun tämän keksinnön mukainen antigeeninen rokote viedään haluttuun isäntäeläimeen, se panee alulle vasta-aineiden li 25 80 466 tuotannon isäntäeläimessä edellä mainitulle antigeeniselle peptidille ja sen sukuiselle Picornavirukselle, kuten FMDV:lle. Rokotteet, jotka sisältävät tehokkaita määriä tämän keksinnön mukaisia peptidejä, eivät ainoastaan pane alulle vasta-aineiden tuotannon isäntäeläimessä, vaan näitä vasta-aineita tuotetaan riittävässä määrässä suojaamaan isäntäeläintä FMDV:n tai jonkun toinen Picornaviruksen aiheuttamalta infektiolta. Isäntäeläimen suojaus voidaan määrätä kasvatettujen vasta-aineiden neutralointitason avulla ja/tai neutralointi-indeksin avulla, kuten jäljempänä tarkemmin esitetään.When the antigenic vaccine of the present invention is introduced into a desired host animal, it initiates the production of antibodies li 25 80 466 in the host animal to the aforementioned antigenic peptide and its related Picornavirus, such as FMDV. Vaccines containing effective amounts of the peptides of this invention not only initiate the production of antibodies in a host animal, but also produce these antibodies in an amount sufficient to protect the host animal from infection by FMDV or someone else's Picornavirus. The protection of the host animal can be determined by the neutralization level of the cultured antibodies and / or the neutralization index, as described in more detail below.

Keksintö käsittää myöskin sellaisia antigeenejä, joissa koko tai osa kokonaisesta kantajasta on antigeeninen. Näin ollen voidaan käyttää, tai olla käyttämättä, erillistä kantajaosaa. Synteettinen antigeeni, joka on valmistettu sitomalla FMDV:n monospesifinen, synteettinen, antigeeninen determinanttipep-k tidi antigeenikantajaan, sekä myöskin menetelmät tällaisten synteettisten antigeenien valmistamiseksi, ovat esillä olevan : keksinnön spesifisiä aspekteja.The invention also encompasses antigens in which all or part of the total carrier is antigenic. Thus, a separate carrier part can be used, or not used. A synthetic antigen prepared by binding a monospecific, synthetic, antigenic determinant peptide of FMDV to an antigen carrier, as well as methods for preparing such synthetic antigens, are specific aspects of the present invention.

Yleensä voidaan muodostaa synteettinen antigeeni seuraavilla vaiheilla: valmistetaan Picornavirussukuinen peptidi, kuten FMDV:n monospesifinen, synteettinen, antigeeninen determi-nanttipeptidi, joka immunologisesti vastaa tai vastaa olennaisesti FMDV:n antigeenisiä determinantteja, ja liitetään synteettinen determinantti farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan erillisellä synteettisellä vaiheella.In general, a synthetic antigen can be generated by the steps of: preparing a Picornavirus-related peptide, such as a monospecific, synthetic, antigenic determinant peptide of FMDV that immunologically or substantially corresponds to the antigenic determinants of FMDV, and attaching the synthetic determinant to a pharmaceutically acceptable carrier.

Menetelmä rokotteiden valmistamiseksi käsittää FMDV:n mono-spesifisen, synteettisen antigeenisen determinanttipeptidin syntetisoinnin, joka peptidi antigeenisestä on FMDV:n VP^-- proteiinin tarkoin määrätyn determinanttiosan kaksoiskappale tai olennaisesti sen kaksoiskappale. Synteettinen peptidi voi olla, muttei aina tarvitse olla, sidottu kantajaan, jctza saataisiin antigeeni, jonka antigeenisyys on sama kuin FMDV:n monospesifisen antigeenisen determinanttipeptidin, ja joka vietynä isäntäeläimeen yhdessä fysiologisesti siedettävän laimentimen kanssa, panee aluelle vasta-aineiden tuotan- 26 80 466 non FMD-virukselle.A method of making vaccines comprises synthesizing a mono-specific, synthetic antigenic determinant peptide of FMDV, which peptide of the antigen is a duplicate or substantially a duplicate of a well-defined determinant portion of the VPD protein of FMDV. The synthetic peptide may, but need not always, be bound to a carrier to provide an antigen having the same antigenicity as the FMDV monospecific antigenic determinant peptide, which, when introduced into a host animal together with a physiologically tolerable diluent, results in the production of antibodies. FMD virus.

Menetelmässä vasta-aineiden valmistamiseksi/ edellä kuvattua rokotetta injisoidaan isäntäeläimeen ja proteiiniantigeenia vastaan, isäntäeläimessä kasvatetut vasta-aineet otetaan talteen isän-täeläimen nesteistä, joita vasta-aineita käytetään tavanomaisissa diagnostisissa menetelmissä proteiinin vasta-aineiden esiintymisen osoittamiseksi tai terapeuttisina aineina passiivista immuuniprofylaksiaa varten.In the method for producing antibodies / the vaccine described above is injected into a host animal and against a protein antigen, the antibodies grown in the host animal are recovered from the host animal fluids used in conventional diagnostic methods to detect the presence of protein antibodies or as therapeutic agents for passive immune prophylaxis.

On ymmärrettävä, että vaikkakin keksinnön mukaisten rokotteiden ja vasta-ainevalmisteiden valmistukseen sisältyy useita menetelmävaiheita, kuten jäljempänä esitetään yksityiskohtaisesti, niin keksintö ei ole rajoitettu minkään erityisen vaiheen tai reagenssin tai olosuhteen käyttöön, vaan keksintö ; on pikemminkin käsitettävä sellaiseksi kuin se on esitetty edellä ja määritelty yksityiskohtaisesti oheisissa patenttivaatimuksissa.It is to be understood that although the preparation of the vaccines and antibody preparations of the invention involves several process steps, as detailed below, the invention is not limited to the use of any particular step or reagent or condition, but the invention; rather, it is to be understood as set forth above and defined in detail in the appended claims.

I. Peptidisynteesi : : Jäljempänä esitetyt peptidit syntetisoitiin käyttäen tunnettuja menetelmiä /ks, esim. Marglin, A, ja Merrifield, R.B., Ann.I. Peptide Synthesis: The following peptides were synthesized using known methods / see, e.g., Marglin, A, and Merrifield, R.B., Ann.

Rev. Biochem. , 39^841-866 {1970)7- Peptidit liitettiin pro- teiinikantajaan KLH kysteiinitähteen välityksellä, joka kys- teiinitähde tavallisesti liitettiin peptidin karboksipäättee-seen, ellei toisin mainita. Synteettinen sitomisvaihe, jossa peptidi sidottiin proteiinikantajaan, suoritettiin, ellei toisin esitetä, liittämällä kysteiinin rikkiatomi kantajan ja N-maleimidobentsoyyli-N-hydroksi-sukkiini-imidiesterin (MBS) välisen reaktiotuotteen kaksois s idok seen, noudattaen yleistä menetelmää, joka on esitetty aikakausijulkaisussa Lieu et ai, Biochemistry, 18:690-697 (1979).Rev. Biochem. , 39-841-866 (1970) 7- Peptides were attached to a protein carrier via a KLH cysteine residue, which was usually attached to the carboxy terminus of the peptide, unless otherwise noted. The synthetic binding step in which the peptide was bound to a protein carrier was performed, unless otherwise indicated, by attaching a sulfur atom of a cysteine to the double bond of the reaction product between the carrier and N-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS) according to the general procedure described in the prior art. ai, Biochemistry, 18: 690-697 (1979).

Alhaisen molekyylipainon omaava peptidi, joka luultavasti on syklinen, valmistettiin syntetisoimalla peptidi, jolla on Olk:n VP^:n aminohapposekvenssi asemissa 141-160 (kuvuo 1) ja liittämällä kysteiini (Cys)-tähteitä sekä amino- että karboksipäätteeseen (diCys-peptidi). Tämän jälkeen liuotettiinThe low molecular weight peptide, which is probably cyclic, was prepared by synthesizing a peptide having the amino acid sequence of Olk's VP ^ at positions 141-160 (Figure 1) and attaching cysteine (Cys) residues to both the amino and carboxy termini (diCys peptide). . It was then dissolved

IIII

27 80 466 10 mg diCys-peptidiä (joka sisälsi Cys-tähteen hapettumatto-massa muodossa) 250 ml:aan 0,1-molaarista ammoniumbikarbo-naattipuskuria dekantterilasissa. Liuennut diCys-peptidi hapetettiin sitten ilmalla sekoittamalla saatua liuosta noin 18 h. Tämän ajanjakson lopussa Ellmanin reaktio osoitti, ettei läsnä ollut vapaata merkaptaania. /Ellman, Arc. Bio-chem. Biophys., 82:70-77 (1959]_7.27 80 466 10 mg of diCys peptide (containing the Cys residue in non-oxidized form) in 250 ml of 0.1 molar ammonium bicarbonate buffer in a beaker. The dissolved diCys peptide was then oxidized with air to stir the resulting solution for about 18 h. At the end of this period, the Ellman reaction showed the absence of free mercaptan. / Ellman, Arc. Bio-chem. Biophys., 82: 70-77 (1959] _7.

Saatu liuos pakastekuivattiin. Näin valmistetulla kuivatulla aineella, jota jäljempänä kutsutaan sykliseksi peptidiksi tai sykliseksi rengaspeptidiksi, on edellä mainittu 01k:n VP^-kuoren aminohapposekvenssi, joka sijaitsee kohdissa 141-160, jonka aineen uskotaan olevan yhteensidottu aminopäättees-tään ja karboksipäätteestään hapetetuilla kysteiinitähteillä, ts. yhdellä kysteiinitähteellä, joka sisältää disulfoksidi- '7 sidoksen. Kaksi tai useampia diCys-peptideja voi myöskin ol- .! la sidottu yhteen muodostaen syklisen rengaspeptidin.The resulting solution was lyophilized. The dried substance thus prepared, hereinafter referred to as a cyclic peptide or a cyclic ring peptide, has the above-mentioned amino acid sequence of the 01k VP1 shell located at positions 141-160, which is believed to be linked by cysteine residues oxidized at its amino terminus and carboxy terminus. containing a disulfoxide bond. Two or more diCys peptides may also be. 1a linked together to form a cyclic ring peptide.

; ΐ; ΐ

Valmistettiin myöskin kaksi polymeeripeptidiä yllä olevasta peptidistä, joka sisältää hapettumattomia Cys-tähteitä molem-massa peptidipäätteessä (diCys-peptidi) ja joka sidottiin näihin päätteisiin peptidiamidisidoksilla. Näitä polymeeri-peptidejä kutsutaan jäljempänä polymeeripeptideiksi A ja B.Two polymer peptides were also prepared from the above peptide containing non-oxidized Cys residues at both peptide terminals (diCys peptide) and linked to these terminals by peptide amide bonds. These polymer peptides are hereinafter referred to as polymer peptides A and B.

Polymeeripeptidi A valmistettiin diCys-peptidistä liuottamalla tämä peptidi edellä mainittuun ammoniumbikarbonaatti-puskuriin väkevyyteen 5 mg/ml. Edellä mainitulla tavalla suoritettu ilmahapetus tuotti aineen, joka Ellmanin reaktion mukaan ei sisältänyt vapaata merkaptaania. Reaktioliuos ei hapetuksen jälkeen sisältänyt hiukkasmaista ainetta, ja se pakastekuivattiin, jolloin saatiin polymeeripeptidiä A kuivassa muodossa.Polymer peptide A was prepared from diCys peptide by dissolving this peptide in the above-mentioned ammonium bicarbonate buffer at a concentration of 5 mg / ml. Air oxidation carried out as described above yielded a substance which, according to the Ellman reaction, did not contain free mercaptan. After oxidation, the reaction solution contained no particulate matter and was lyophilized to give polymer peptide A in dry form.

Polymeeripeptidi B valmistettiin samassa puskurissa samoissa hapetusolosuhteissa kuin polymeeripeptidiä A ja syklistä peptidiä. Tällöin oli kuitenkin hapetuksen aikana käytetty diCys-peptidiväkevyyttä 23,4 mg/1,2 mg puskuria.Polymer peptide B was prepared in the same buffer under the same oxidation conditions as polymer peptide A and cyclic peptide. However, a diCys peptide concentration of 23.4 mg / 1.2 mg buffer was used during the oxidation.

28 80 46628 80 466

Ellmanin reaktion avulla ei hapetusreaktion jälkeen havaittu vapaata merkaptaania, mutta havaittiin, että reaktioseoksessa esiintyi pieni määrä sakkaa. Reaktioseos pakastekuivattiin, jolloin saatiin talteen polymeeripeptidi B, joka sisälsi sakan.No free mercaptan was detected by the Ellman reaction after the oxidation reaction, but a small amount of precipitate was found in the reaction mixture. The reaction mixture was lyophilized to recover polymer peptide B containing a precipitate.

Jokaista edellä valmistettua kuivattua kiinteätä ainetta (syklinen peptidi ja polymeeripeptidit A ja B) käytettiin ilman lisäpuhdistusta. Näistä kuivatuista kiinteistä aineista valmistettiin rokotteita suspendoimalla ne täydelliseen Freund'in apuaineeseen väkevyyksissä, jotka ovat riittäviä saamaan aikaan 100 mikrogrammaa peptidiä rokotusta kohti.Each of the dried solids prepared above (cyclic peptide and polymer peptides A and B) was used without further purification. Vaccines were prepared from these dried solids by suspending them in complete Freund's adjuvant at concentrations sufficient to provide 100 micrograms of peptide per vaccination.

III. Immunisointi A. Rokotukset Tässä käytetyt rokotteet sisältävät ilmoitetun määrän peptidiä yksinään suoraketjuisessa tai syklisessä muodossa, polymeerinä, jossa yksittäiset peptidit on sidottu hapetettu jerky steiinitähteiden (kystiini) välityksellä tai kantajaan sidottuna. Ilmoitetuilla peptidimäärillä tarkoitetaan peptidin painoa lukuunottamatta kantajan paino, kun kantajaa käytetään.III. Immunization A. Vaccinations The vaccines used herein contain the indicated amount of peptide alone in a straight-chain or cyclic form, as a polymer in which the individual peptides are bound via oxidized jerky stein residues (cystine) or bound to a carrier. The amounts of peptide reported refer to the weight of the peptide, excluding the weight of the carrier, when the carrier is used.

Rokotteet sisältävät myöskin fysiologisesti siedettävän lai-mentimen, kuten vettä tai suolaliuosta, ja lisäksi niihin sisältyy yleensä apuaine. Täydellinen Freund'in apuaine (CFA) ja epätäydellinen Feund'in apuaine (IFA) ovat aineita, joita tunnetaan hyvin alalla ja ne ovat kaupallisesti saatavissa useista lähteistä. Saponiini, joka on kasvin tuottama glykosidi, on myöskin hyvin tunnettu apuaine, joka on kaupal" lisesti saatavissa yhtiöltä Berghausen Chemical Company, Cincinnati, Ohio, liuoksena, joka sisältää 5 kiinteätä aihetta, ja sitä käytetään tässä yhdessä alumiinihydroksidin kanssa.Vaccines also contain a physiologically tolerable diluent, such as water or saline, and generally also contain an adjuvant. Complete Freund's Excipient (CFA) and incomplete Feund's Excipient (IFA) are substances well known in the art and are commercially available from a variety of sources. Saponin, a plant-produced glycoside, is also a well-known excipient commercially available from Berghausen Chemical Company, Cincinnati, Ohio, as a solution containing 5 solids and is used herein in conjunction with aluminum hydroxide.

Rokotteen perusliuoksia valmistettiin IFA:n ja CFA:n kanssa seuraavasti: sellainen määrä synteettistä peptidiä, polynee-ripeptidiä tai konjugaattia, joka riittää aikaansaamaan hai-" tun määrän peptidiä rokotusta kohti, liuotettiin fosfaatti-Vaccine stock solutions were prepared with IFA and CFA as follows: an amount of synthetic peptide, polyneepeptide, or conjugate sufficient to provide the desired amount of peptide per vaccine was dissolved in phosphate.

IIII

29 80466 puskuroituun suolaliuokseen (PBS). Peptidilluokseen sekoitettiin sitten yhtä suuri tilavuus CFA:ta tai IFA:ta, jolloin saatiin rokote, joka sisälsi peptidiä, vettä ja apuainetta ja jossa vesi:öljysuhde oli 1:1. Tämän jälkeen seos homogenisoitiin, jolloin saatiin rokotteen perusliuos.29 80466 in buffered saline (PBS). An equal volume of CFA or IFA was then mixed into the peptide solution to obtain a vaccine containing peptide, water and excipient with a water: oil ratio of 1: 1. The mixture was then homogenized to give a stock solution of vaccine.

Rokotteen perusliuoksia saponiini-alumiinihydroksidin kanssa valmistettiin seuraavasti: alumiinihydroksidia määrässä 10 milligrammaa millilitraa kohti suspendoitiin natriumkloridin 0,85 prosenttiseen vesiliuokseen. Sellainen määrä synteettistä peptidiä, polymeeripeptidiä tai konjugaattia, joka riittää aikaansaamaan halutun peptidimäärän rokotusta kohti, laimennettiin 20 %:iin ja sekoitettiin tämän jälkeen alumiinihydrok-sidisuspension kanssa ja annettiin adsorboitua alumiinihydrok-sidihiukkasiin 2-3 tunnin ajan. Yksi osa näin valmistettua suspensiota laimennettiin sitten neljän osan kanssa edellä laimennettua saponiiniliuosta, jolloin saatiin rokotteen perusliuos, joka sisälsi 0,125 paino-% saponiinia.Stock solutions of the vaccine with saponin-aluminum hydroxide were prepared as follows: aluminum hydroxide in an amount of 10 milligrams per milliliter was suspended in 0.85% aqueous sodium chloride solution. An amount of synthetic peptide, polymer peptide, or conjugate sufficient to provide the desired amount of peptide per vaccination was diluted to 20% and then mixed with the aluminum hydroxide suspension and allowed to adsorb to the aluminum hydroxide particles for 2-3 hours. One part of the suspension thus prepared was then diluted with four parts of the saponin solution diluted above to obtain a stock solution of the vaccine containing 0.125% by weight of saponin.

Alustavia suojauskokeita, jotka on esitetty entsyymiin sidotun immuunisorboivan aineen kokeena (ELISA), kuten on selitetty aikakausijulkaisussa Bittle et ai., Nature, 298:30-33 (heinäkuu 1982), on sisällytetty tähän viitteenä, jossa kokeessa mitattiin peptidi-antipeptidi-vasta-aineen immuunireaktioita. Viruksen neutralointi-indeksin mittaukset, joissa mitattiin viruksen inaktivoitumista synnytettyjen vasta-aineiden ja elävien virushiukkasten välisten immuunireaktioiden avulla, suoritettiin myöskin Bittle et ai.:in kuvaamalla tavalla. Käytetyn tekniikan yksityiskohdat ja sillä saadut tulokset, jotka liittyvät FMDV:llä suoritettuun työhön, ilmenevät Bittle et al.:in artikkelista.Preliminary shielding experiments, presented as an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) as described in Bittle et al., Nature, 298: 30-33 (July 1982), are incorporated herein by reference in which the peptide-anti-peptide antibody was measured. immune reactions to the substance. Measurements of the virus neutralization index, which measured virus inactivation by immune responses between generated antibodies and live virus particles, were also performed as described by Bittle et al. The details of the technique used and the results obtained with it, relating to the work performed on the FMDV, are apparent from the article by Bittle et al.

B. Vasta-aineita peptidejä vastaan, jotka peptidit ovat homologisia määrätyille FMD-viruksille__B. Antibodies to peptides homologous to specific FMD viruses__

Reagoinnit FMDV:n, tyyppi 0, alatyyppi 1, kanta Kaufbeuren, VP-^:n erilaisten peptidialueiden suhteen on esitetty taulukossa 1. Nämä tulokset ovat yhteenveto kanien vasta-aincreaktiois-ta, käyttäen tavanomaisia protokolleja ja ne kuvaavat FMD- 30 8 0 4 66 viruksen, joka sisältää aminohapposekvenssin, joka on homologinen immunisointiin käytetylle peptidille, neutraloitumista. (Malliprotokollien yksityiskohtien suhteen, ks. Lerner et ai.:in US-patenttihakemus n:o 248 059, jätetty 27.3.Reactions with different peptide regions of FMDV, type 0, subtype 1, strain Kaufbeure, VP - ^ are shown in Table 1. These results are a summary of rabbit antibody responses, using standard protocols, and describe FMD- 8 8 0 4 66 neutralization of a virus containing an amino acid sequence homologous to the peptide used for immunization. (For details of model protocols, see Lerner et al., U.S. Patent Application No. 248,059, filed March 27.

1981, ja Bittle et ai., katso yllä).1981, and Bittle et al., Supra).

Taulukko 1table 1

Vasta-ainereagoinnit erilaisten peptidien suhteen yksittäisissä kaneissa K^H . ,. Neutralointi- peptidi- ^ antigeeni indeksi^, (log^) 9-24 < 0,3 9-24 < 0,3 17-32 < 0,5 17-32 < 0,9 25-41 < 0,5 25-41 < 0,9 1-41 < 0,9 1-41 < 0,7 141-160 < 3,9 141-160 < 3,7 151-160 < 2,9 151-160 < 1,1 200-213 < 3,5 200-213 < 3,1 ^Numerot viittaavat 01k:n VP^-kuoren aminohappotähteen asemaan, joka alkaa aminopäätteestä ja jota synteettisten peptidien aminohappotähdesekvenssit olennaisesti vastaavat.Antibody responses to various peptides in individual rabbits K ^ H. ,. Neutralization peptide ^ antigen index ^, (log ^) 9-24 <0.3 9-24 <0.3 17-32 <0.5 17-32 <0.9 25-41 <0.5 25- 41 <0.9 1-41 <0.9 1-41 <0.7 141-160 <3.9 141-160 <3.7 151-160 <2.9 151-160 <1.1 200-213 <3.5 200-213 <3.1 ^ The numbers refer to the position of the amino acid residue of the 01k VP ^ shell, starting at the amino terminus and substantially corresponding to the amino acid residue sequences of the synthetic peptides.

2 Näiden tulosten saamiseksi käytettyjen menetelmien erityiset yksityiskohdat ilmenevät Bittle et ai.:in artikkelista, katso yllä.2 Specific details of the methods used to obtain these results can be found in the article by Bittle et al., Supra.

On korostettava, että peptidien, joiden aminohappotähdesek-venssi on alueella 141-160 taulukossa 1, neutralointi-indeksit olivat suurempia kuin 3,9 ja vastaavasti 3,7, kun taas alueella 200-213 olevien peptidien indeksit osoittautuivat 31 80466 olevan 3,5 ja vastaavasti 3,5. Molemmat synteettiset peptidit, joiden aminohappotähdesekvenssit vastaavat olennaisesti aminohappotähteiden määrättyjä alueita 141-160 ja 200-213, neutraloivat viruksia. Tämän keksinnön mukaisten peptidien, joiden sekvenssit vastasivat olennaisesti aminohappotähde-sekvenssiä, joka sijaitsee asemissa 141-160, neutralointi-indeksit olivat kuitenkin itse asiassa suurempia kuin esitetyt indeksit. Neutralointi-indeksien todellisten eroavaisuuksien suuruus on esitetty jäljempänä esitetyssä taulukossa 4 eräälle toiselle vertailulle, käyttäen samoja, kaneihin istutettuja peptidejä, jolloin suoritettiin tarkempia neutraloinnin päätepistemäärityksiä.It should be noted that peptides with amino acid residue sequences in the range 141-160 in Table 1 had neutralization indices greater than 3.9 and 3.7, respectively, while peptides in the range 200-213 were found to have indices of 3.5 and respectively 3.5. Both synthetic peptides, whose amino acid residue sequences substantially correspond to certain regions of amino acid residues 141-160 and 200-213, neutralize viruses. However, the neutralization indices of the peptides of this invention, the sequences of which substantially corresponded to the amino acid residue sequence located at positions 141-160, were in fact higher than the indices shown. The magnitude of the actual differences in neutralization indices is shown in Table 4 below for another comparison, using the same peptides implanted in rabbits, where more accurate neutralization endpoint assays were performed.

Osoitettiin, että yksi ainoa antigeenirokotus oli tehokas tuottamaan neutraloivia vasta-aineita eläimissä ja suojaamaan niitä tartuntaa vastaan. Taulukossa 2 on esitetty yhteenveto näistä tuloksista, jotka kokeet suoritettiin marsuille käyttäen tavanomaista protokollaa (katso Lerner et ai.:in patenttihakemusta ja Bittle et al.:in artikkelia, yllä). Taulukko 2 osoittaa antigeenien tehokkuutta ja myöskin VP^-proteiinin selvästi yllätyksellistä antigeenisyyttä alueella 141-160. Neutralointi-indeksi, joka on noin 1,5 tai suurempi, osoittaa, että eläin oli suojattu virusta vastaan.It was shown that a single antigen vaccination was effective in producing neutralizing antibodies in animals and protecting them against infection. Table 2 summarizes these results performed on guinea pigs using a standard protocol (see Lerner et al. 'S patent application and Bittle et al., Supra). Table 2 shows the potency of the antigens and also the clearly surprising antigenicity of the VP 2 protein in the range of 141-160. A neutralization index of about 1.5 or greater indicates that the animal was protected against the virus.

32 80 46632 80 466

Taulukko 2Table 2

Marsujen suojaus suu- ja sorkkatautiviruksen tartuntaa vastaan synteettisten peptidien rokotuksellaProtection of guinea pigs against foot-and-mouth disease virus infection by vaccination with synthetic peptides

Neutralointi-neutralization

Annos indeksi2 peptidi-^ ( Ug) . (login) c 3 antigeeni y ^ Apuaine J10_ Suojaus 141-160 20 Al(OH)3 2,1 3/4 200 Al(OH)3 2,7 3/3 20 Freund* 2,1 1/4 200 Freund*^ >3,3 4/4 200-213 20 Ai(OH)3 1,1 1/3 200 Al(OH)3 0,7 2/4 20 Freund^ 1,1 0/4 200 Freund^ 0,5 0/4 ^Katso taulukkoa 1, alaviite 1.Dose index2 peptide-^ (Ug). (login) c 3 antigen y ^ Excipient J10_ Protection 141-160 20 Al (OH) 3 2.1 3/4 200 Al (OH) 3 2.7 3/3 20 Freund * 2.1 1/4 200 Freund * ^> 3.3 4/4 200-213 20 Al (OH) 3 1.1 1/3 200 Al (OH) 3 0.7 2/4 20 Freund ^ 1.1 0/4 200 Freund ^ 0.5 0/4 ^ See Table 1, footnote 1.

^ *^ *

Neutralointiaktiivisuus käyttäen yhdistettyä seerumia kah- j deksasta eläimestä. Katso Bittle et ai., yllä. | 3Neutralization activity using pooled serum from eight animals. See Bittle et al., Supra. | 3

Suojattujen eläinten lukumäärä/tartutettujen eläinten lukumäärä .Number of animals protected / number of infected animals.

4 Täydellinen Freund:in apuaine.4 The perfect Freund's aid.

Yllä olevat tulokset osoittavat, että erityisen edullinen peptidi, jonka aminohapposekvenssi on 01k:n VP^-kuoren aminohappotähteen asemissa 141-160, sisältää aminohappotähteitä sen peptidin asemien 146-154 kummallakin puolella, jonka Strohmaier et ai., katso yllä, ennustivat omaavan antigeenistä aktiivisuutta tätä kuoriproteiinia vastaan. Lisäksi sisältää peptidi, jonka sekvenssi on 01k:n asemissa 141-160, sellaisia aminohappotähdesekvenssejä, joiden ennustettiin Strohmeier et ai.:in mukaan, katso yllä, olevan inaktiivisia, ei-tuottavia peptidejä.The above results indicate that a particularly preferred peptide having the amino acid sequence at positions 141-160 of the amino acid residue of the 01k VP1 shell contains amino acid residues on either side of positions 146-154 of the peptide predicted by Strohmaier et al., Supra, to have antigenic activity. against this shell protein. In addition, a peptide having a sequence at positions 141-160 of 01k contains amino acid residue sequences predicted by Strohmeier et al., Supra, to be inactive, non-producing peptides.

Yllä olevien taulukoiden 1 ja 2 tulokset osoittavat, että Strohmaier et ai. olivat väärässä ennustuksissaan koskien aminohappotähdesekvenssin niitä kohtia, joissa neutraloivia il 33 80466 vasta-aineita voidaan tuottaa tai ei voida tuottaa. Tulokset alla olevassa taulukossa 3, jossa tämän keksinnön mukaista erityisen edullista peptidiä, jonka aminohappotähdesekvenssi on 01k:n VP^n asemissa 141-160, verrataan Strohmaier et ai.:in mukaiseen peptidiin, jonka sekvenssi on 01k:n VP^:n asemassa 146-155, osoittavat, että tämän keksinnön mukainen peptidi on noin 1000 - noin 100 000 kertaa aktiivisempi tuottamaan neutraloivia vasta-aineita kuin Stromaier et ai.,: in ennustamat peptidit. Näiden tulosten keskiarvo osoittaa myöskin, että Strohmaier et ai:in mukainen peptidi ei saa aikaan vasta-aineiden tuotantoa, joka olisi riittävä suojaamaan isäntäeläintä (neutralointi-indeksit 1,1 ja 1,5), kun taas tämän keksinnön mukainen peptidi saa aikaan suuria määriä suojaavia vasta-aineita (neutralointi-indeksit yhtä kuin tai suuremmat kuin 4,3 ja 2,7).The results in Tables 1 and 2 above show that Strohmaier et al. were in their erroneous predictions regarding those sites in the amino acid residue sequence where neutralizing il 33 80466 antibodies may or may not be produced. The results are shown in Table 3 below, in which a particularly preferred peptide of the present invention having an amino acid residue sequence at positions 141-160 of the 01k VPI is compared to a peptide of Strohmaier et al. Having the sequence at the 146k position of the VPk. -155, show that the peptide of this invention is about 1,000 to about 100,000 times more active in producing neutralizing antibodies than the peptides predicted by Stromaier et al. The average of these results also indicates that the peptide of Strohmaier et al. Does not induce the production of antibodies sufficient to protect the host animal (neutralization indices 1.1 and 1.5), whereas the peptide of the present invention induces large amounts protective antibodies (neutralization indices equal to or greater than 4.3 and 2.7).

Taulukko 3Table 3

Vasta-ainereagoinnit erilaisten peptidien suhteen yksittäisissä kaneissaAntibody responses to various peptides in individual rabbits

Neutralointi-indeksi, (log^g) KLH-peptidi- Virus- ^ antigeeni2 serotyyppi Kani n:o 1 Kani n:o 2 141-160 0 > 4,3 2,7 C141-1601 2 0 3,3 > 4,3 141-160 A3 1,3 2,9 146-1554 0 1,1 1,5 130-161 0 <1,0 < 1,0 ^Vasta-ainereagointi ja virusneutralointiprotokollat suoritettiin kuten on esitetty taulukossa 1.Neutralization index, (log ^ g) KLH peptide- Virus ^ antigen2 serotype Rabbit No. 1 Rabbit No. 2 141-160 0> 4.3 2.7 C141-1601 2 0 3.3> 4, 3 141-160 A3 1.3 2.9 146-1554 0 1.1 1.5 130-161 0 <1.0 <1.0 ^ Antibody reaction and virus neutralization protocols were performed as shown in Table 1.

22

Katso taulukko 1, alaviite 1.See Table 1, footnote 1.

Virusserotyyppi, jonka aminohappotähdesekvenssiä käytettiin antigeenisen peptidin ja viruksen valmistamiseksi, joita vastaan neutralointi määritettiin.A viral serotype whose amino acid residue sequence was used to produce the antigenic peptide and virus against which neutralization was determined.

2 32 3

Kantaja-sidoksen Cys-tähde sijoitettiin aminopaatteeseen karboksipäätteen sijasta, kuten oli asianlaita muiden pepti 4 dien kohdalla.The Cys residue of the carrier bond was placed in the amino terminus instead of the carboxy terminus, as was the case for the other peptides.

34 80466 ^FHDV:n serotyyppi A, alatyyppi 10, kanta 61.34 80466 ^ FHDV serotype A, subtype 10, strain 61.

6Aminohappotähteen alue, jonka Strohmaier et ai. ennustivat olevan aktiivinen, katso yllä.6 The amino acid residue region described by Strohmaier et al. predicted to be active, see above.

Yllä olevan taulukon tulokset osoittavat, että 32 aminohapon peptidi, jonka sekvenssi on 01k:n VP^:n asemissa 130-161, on inaktiivinen tuottamaan neutraloivia vasta-aineitä. Tulokset, jotka liittyvät KLH-peptidiantigeeniin, jota nimitetään C141-160:ksi osoittavat, että neutraloivan vasta-aineen tuotanto ei ole riippuvainen siitä kumpi peptidipääte on sidottu kantajaan.The results in the table above show that the 32 amino acid peptide having the sequence at positions 130-161 of the 01k VP1 is inactive to produce neutralizing antibodies. The results associated with the KLH peptide antigen, designated C141-160, indicate that the production of a neutralizing antibody does not depend on which peptide terminal is bound to the carrier.

C. Antigeenisten peptidien ristireaktiivisuus heterologis- ten FMD-virusten kanssa_ Tämän keksinnön mukaiset antigeeniset peptidit ovat monospe-sifisiä, kuten edellä on määritelty. Näissä peptideissä esiintyy kuitenkin myös vaihteleva määrä ristireaktiivisuutta sellaisten virusserotyyppien kanssa, joiden aminohapposekvenssit ovat heterologisia tietyn peptidin määrätylle aminohapposekvenssille; Näin ollen peptidit ovat myöskin polyspesifisiä vaihtelevassa laajuudessa.C. Cross-Reactivity of Antigenic Peptides with Heterologous FMD Viruses The antigenic peptides of this invention are monospecific as defined above. However, these peptides also exhibit varying amounts of cross-reactivity with viral serotypes whose amino acid sequences are heterologous to a particular amino acid sequence of a particular peptide; Thus, the peptides are also polyspecific to varying degrees.

Alla olevan taulukon 4 tulokset kuvaavat sellaisia antigeenisiä peptidikonjugaatteja vastaan tuotettujen vasta-aineiden ristireaktiivisuutta, joiden sekvenssi on Olk:n VP^:n asemissa 141-160 ja vastaavasti 200-213, joita kumpaakin sekvenssiä käytetään kahden kanin immunisoimiseksi. Neutralointi-indeksit määrättiin homologista virusta (Olk) ja heterologi-siä virustyyppejä A ja C vastaan. Nämä tulokset osoittavat, että seerumin, joka on aikaansaatu synteettisellä antigeenisellä peptidirokotteella, serotyyppispesifisyys osoittaa mimikrytä sen spesifisyyden suhteen, joka on saatu seerumilla • koko viruksen suhteen. Ristineutraloinnin on ajateltu kuvaa van sekvenssin homologiaa erilaisten serotyyppien välillä, kuten ilmenee kuviosta 1.The results in Table 4 below illustrate the cross-reactivity of antibodies raised against antigenic peptide conjugates having the sequence at positions 141-160 and 200-213, respectively, of the Olk VP1, each of which is used to immunize two rabbits. Neutralization indices were determined against homologous virus (Olk) and heterologous virus types A and C. These results indicate that the serotype specificity of the serum obtained with the synthetic antigenic peptide vaccine indicates a mimicry in terms of the specificity obtained with the serum for the whole virus. Cross-neutralization has been thought to describe sequence homology between different serotypes, as shown in Figure 1.

Il 35 80466Il 35 80466

Taulukko 4Table 4

Kanin anti-peptidivasta-aineiden serotyyppinen spesifisyysSerotypic specificity of rabbit anti-peptide antibodies

Neutralointi-indeksi (log^) FMD-viruksiin3 nähden_Neutralization index (log ^) for FMD viruses3

Peptidialueen Oik2 C33 AIO4 vastaseerumit _ _ _ 141-160 4,3 -0,1 1,1 141-160 >6,3 1,9 2,3 200-213 2,9 -0,1 1,5 200-213 3,3 0,3 1,5 ^Viruksen neutralointiprotokollat on esitetty taulukon 1 yhteydessä.Antibodies to the peptide region Oik2 C33 AIO4 _ _ _ 141-160 4.3 -0.1 1.1 141-160> 6.3 1.9 2.3 200-213 2.9 -0.1 1.5 200-213 3.3 0.3 1.5 ^ Virus neutralization protocols are shown in connection with Table 1.

22

Tubingen tyyppi 0, alatyyppi 1, kanta Kaufbueren.Tubingen type 0, subtype 1, strain Kaufbueren.

3Tyyppi C, alatyyppi 3, kanta Indaial.3Type C, subtype 3, strain Indaial.

44

Tyyppi A, alatyyppi 10, kanta 61.Type A, subtype 10, strain 61.

Taulukko 4 osoittaa myös suuren eron neutralointi-indeksissä Olk nähden niiden synteettisten peptidien välillä, joiden amino»-, happotähdesekvenssi vastaa pääasiassa 01k:n asemia 141-160 vastaavasti 200-213. Tällöin edellä esitetyistä tiedoista ilmenee, että peptidi, jonka myös edellä mainitut Strohmaier et ai ennustivat olevan immunologisesti aktiivisen ja jonka amino-happotähdesekvenssi vastaa pääasiassa 01k:n asemissa 200-213, antoi neutralointi-indeksiarvoja, jotka olivat samanlaisia kuin samalla peptidillä samoissa olosuhteissa saadut taulukossa 1 esitetyt arvot. Keksinnön mukaisella peptidillä, jonka amino-happotähdesekvenssi vastaa pääasiassa 01k:n asemia 141-160, saadut neutralointi-indeksit olivat kuitenkin 1-3 yksikön verran suurempia, mikä vastaa noin 10-1000-kertaista neutraloinnin parannusta.Table 4 also shows a large difference in the neutralization index Olk with respect to synthetic peptides whose amino acid sequence corresponds mainly to positions 01k 141-160 and 200-213, respectively. In this case, the above data show that the peptide, which was also predicted to be immunologically active by the above-mentioned Strohmaier et al. And whose amino acid residue sequence corresponds mainly to positions 200-213 of 01k, gave neutralization index values similar to those obtained with the same peptide under the same conditions. 1 values shown. However, the neutralization indices obtained with the peptide according to the invention, the amino acid residue sequence of which corresponds mainly to positions 141-160 of 01k, were 1 to 3 units higher, which corresponds to an approximately 10-1000-fold improvement in neutralization.

D. Vasta-aineet kystiini-sidotuista peptideistä Rokotteiden kantaliuoksia, jotka sisälsivät kolme kystiini-sidottua peptidiä (syklinen peptidi ja polvmeeriset peptidit A ja B) valmistettiin epätäydelliseen Freund'in apuaineeseen 36 80 466 edellä esitetyllä tavalla. Näiden rokotteiden peptidikonsentraa-tio oli 100 ^ug peptidiä rokotusta kohti.D. Antibodies from Cystine-Binded Peptides Stock solutions of vaccines containing three cysteine-bound peptides (cyclic peptide and polymeric peptides A and B) were prepared in incomplete Freund's adjuvant 36 80 466 as described above. The peptide concentration of these vaccines was 100 ug of peptide per vaccination.

Marsujen yhden rokotuksen alustavat tulokset osoittivat neutralointi-indeksin (log^Q) arvoja noin 2,3-3,0 kaikilla kolmella rokotteella. Keskimääräinen neutralointi-indeksi oli noin 2,5, joka osoittaa, että jokainen kystiinidisulfidi-sidotuista peptideistä suojasi isäntää Olk FMDV-tartunnalta.Preliminary results from a single vaccination of guinea pigs showed values of the neutralization index (log ^ Q) of about 2.3–3.0 for all three vaccines. The mean neutralization index was about 2.5, indicating that each of the cystine disulfide-bound peptides protected the host from Olk FMDV infection.

Monomeerisen, konjugoimattoman peptidin, jonka aminohappotähde-sekvenssi vastaa pääasiassa Olk FMDV:n asemia noin 141:stä noin 160:een, tyypillinen neutralointi-indeksiarvo on noin 0,5. Nämä tulokset osoittavat tämän vuoksi, että mahdollisesti ei tarvita kantajaa eläinten suojaamiseksi suu- ja sorkkataudilta.A monomeric, unconjugated peptide with an amino acid residue sequence corresponding primarily to positions from about 141 to about 160 in Olk FMDV has a typical neutralization index value of about 0.5. These results therefore indicate that a carrier may not be required to protect animals from foot-and-mouth disease.

IV. Kantajat ja apuaineet A. Vaihtoehtoiset kantajat : ' Edellä esitetyt tulokset saatiin rokottamalla KLH-peptidikonju- gaatilla yhdessä fysiologisesti hyväksyttävän laimentimen, kuten veden kanssa ja apuaineiden, kuten Freund'in täydellisen apu-aineen (CFA), Freund'in epätäydellisen apuaineen (IFA) ja/tai alumiinihydroksidin kanssa. KLH on hyväksyttävä kantaja käytettäväksi eläimissä, mutta se on hyvin kallis käytettäväksi teollisessa mittakaavassa. Tutkittiin myös vaihtoehtoisten kantajien käyttöä, joista mainittakoon soijapapuagglutiniini, naudan seerumialbumiini (BSA), olvalbumiini, maapähkinäaggluti-niini, tetanustoksoidi ja poly-L-lysiini.IV. Carriers and excipients A. Alternative carriers: The above results were obtained by vaccination with KLH peptide conjugate in combination with a physiologically acceptable diluent such as water and excipients such as Freund's complete excipient (CFA), Freund's incomplete excipient (IFA) and / or aluminum hydroxide. KLH is an acceptable carrier for use in animals, but it is very expensive for use on an industrial scale. The use of alternative carriers such as soybean agglutinin, bovine serum albumin (BSA), olvalbumin, peanut agglutinin, tetanus toxoid and poly-L-lysine was also investigated.

Edellä esitetyt tulokset saatiin myös sitomalla antigeeninen .. peptidi KLH-molekyyliin vielä peptidin amino- tai karboksipäät- teeseen lisätyn kysteiinitähteen (Cys) välityksellä. Cys-tähde saatettiin sitten reagoimaan KLH:n ja N-maleimidobentsoyyli-N- hydroksisukkiini-imidiesterin (MBS) reaktiotuotteen kanssa, kuten edellä mainitut Bittle et ai ovat esittäneet. Jäljempänä esitetyissä tuloksissa käytettiin sekä MBS että glutaarialdehydiä kytkentäaineina. Synteettisen peptidin kytkeminen KLH:iin ja II- 37 8 O 4 66 BSA:iin glutaarialdehydillä suoritettiin noudattamalla Avrameas'in, Immunochemistry, 6:13-52 (1969), esittämällä yleisellä menetelmällä.The above results were also obtained by binding the antigenic peptide to the KLH molecule via a cysteine residue (Cys) added to the amino or carboxy terminus of the peptide. The Cys residue was then reacted with the reaction product of KLH and N-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS) as described by Bittle et al., Supra. In the results presented below, both MBS and glutaraldehyde were used as coupling agents. Coupling of the synthetic peptide to KLH and II-37 8 O 4 66 BSA with glutaraldehyde was performed following the general method of Avrameas, Immunochemistry, 6: 13-52 (1969).

Taulukossa 5 esitetyt tulokset saatiin kytkemällä keksinnön mukainen peptidi, jolla oli 01k FMDV VP^-kuoren asemien 141-160 aminohappotähdesekvenssi (peptidi 65), esitettyyn kantajaan käyttämällä MDS:a. Rokotteet valmistettiin Freund'in epätäydelliseen apuaineeseen. Jokainen kuudesta marsusta rokotettiin kerran rokotteella, joka sisälsi riittävän määrän konjugaattia antamaan 100 ^,ug peptidiä. Esitetyt peptidin vasta-ainetiitte-rit ovat niiden kuuden arvon keskiarvoja, jotka saatiin neljä viikkoa rokotuksen jälkeen käyttäen edellä mainitun Bittle et ai:n ELISA-menetelmää.The results shown in Table 5 were obtained by coupling a peptide of the invention having the amino acid residue sequence of positions 141-160 of the 01k FMDV VP1 shell (peptide 65) to the carrier shown using MDS. Vaccines were prepared in Freund's incomplete excipient. Each of the six guinea pigs was vaccinated once with a vaccine containing a sufficient amount of conjugate to give 100 ug of peptide. The peptide antibody titers shown are the averages of the six values obtained four weeks after vaccination using the ELISA method of Bittle et al., Supra.

Taulukko 5Table 5

Vasta-ainereagointi eri kantajiin kytkettyyn peptidi 65:een Kantaja Peptidivasta-ainetiitteriAntibody Response to Peptide 65 Coupled to Different Carriers Carrier Peptide Antibody Titer

Peptidi 65 (ei kantajaa) 30 KLH 60 KLH 120Peptide 65 (no carrier) 30 KLH 60 KLH 120

Maapähkinäagglutiniini 50Peanut agglutinin 50

Olvalbumiini 40Olvalbumin 40

Soijapapuagglutiniini <10Soybean agglutinin <10

Tetanustoksoidi 60Tetanus toxoid 60

Nautaseerumialbumiini 130Bovine serum albumin 130

Edellä esitetyt tulokset osoittavat, että useat kantajat ovat melkein yhtä aktiivisia kuin KLH, kun taas nautaseerumialbumiini sai aikaan paremman vasta-ainetiitterin.The above results show that several carriers are almost as active as KLH, whereas bovine serum albumin produced a better antibody titer.

Alustavat tutkimukset osoittivat myös, että peptidi 65:n ja tetanustoksoidin käyttö glutaarialdehydin kanssa kytkentäai-neena sai aikaan erittäin hyvän vasta-ainereagoinnin yhdellä ainoalla rokotuksella. Kytkentäreaktioita varten valmistettiin 38 80 466 liuos, joka sisälsi 24,5 mg peptidi 65:tä ja 26 mg tetanustoksoi-dia 12,5 ml:ssa fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS, pH 7,2). Tätä liuosta hämmennettiin lievästi samalla kun siihen lisättiin 1,6 ml liuosta, joka sisälsi 0,38 % glutaarialdehydiä PBS:ssa. Seosta hämmennettiin noin 18 tuntia huoneen lämpötilassa, dialysoitiin veteen molekyylipaino 12 000 erottavissa dialyysiputkissa ja pakkaskuivattiin sitten, jolloin saatiin 45 mg kuivattua konjugaattia.Preliminary studies also showed that the use of peptide 65 and tetanus toxoid with glutaraldehyde as a coupling agent produced a very good antibody response with a single vaccination. For the coupling reactions, a solution of 38 80,466 was prepared containing 24.5 mg of peptide 65 and 26 mg of tetanus toxoid in 12.5 ml of phosphate buffered saline (PBS, pH 7.2). This solution was gently stirred while 1.6 ml of a solution containing 0.38% glutaraldehyde in PBS was added. The mixture was stirred for about 18 hours at room temperature, dialyzed against water with a molecular weight of 12,000 in separate dialysis tubes and then lyophilized to give 45 mg of dried conjugate.

B. ApuaineetB. Excipients

Tutkittiin myös apuainejärjestelmiä käyttämällä edellä esitettyjä peptidi 65:llä kytkettyjä kantajia. Taulukossa 6 esitetyt tulokset osoittavat vaikutuksia, kun kantajana on KLH tai BSA, kytkentäaineena on MBS tai glutaarialdehydi, ja apuaineena on Freund'in epätäydellinen apuaine (IFA) ja saponiini-alumiinihydrok-sidi, josta taulukossa 6 käytetään nimitystä saponiini. Jokainen kuudesta marsusta rokotettiin ihonalaisesti rokotteella, joka sisälsi 100 ^ug peptidi 65 tä ja apuainetta, kahdesti neljän viikon välein. Tulokset esittävät kuuden eläimen keskiarvoja ja ne on ilmaistu samalla tavalla kuin taulukossa 5.Excipient systems were also studied using the peptide 65-coupled carriers described above. The results shown in Table 6 show the effects when the carrier is KLH or BSA, the coupling agent is MBS or glutaraldehyde, and the excipient is Freund's incomplete excipient (IFA) and saponin-aluminum hydroxide, referred to in Table 6 as saponin. Each of the six guinea pigs was vaccinated subcutaneously with a vaccine containing 100 ug of peptide 65 and adjuvant, twice every four weeks. The results represent the means of six animals and are expressed in the same way as in Table 5.

ti 39 80 466ti 39 80 466

Taulukko 6Table 6

Marsun vasta-ainereagointi peptidi 65:een: kantajien, kytkentäaineiden ja apuaineiden^" vertailuGuinea pig antibody response to peptide 65: a comparison of carriers, coupling agents and excipients

Kantaja Kytkentä- Apuaine Viikot immunisoinnin jälkeen _ menetelmä _ _j_ _L2_ _20_ KLH MBS Saponiini 2,9 4,2 3,5 255 1020 1060 400 KLH MBS IFA 3,1 3,5 2,5 123 1024 550 435 BSA MBS Saponiini - 730 >640 145 BSA MBS IFA - 620 340 170 KLH Glutaari- Saponiini 2,5 >4,7 _4,0 aldehydi 50 960 >1056 1280 KLH Glutaari- IFA 2,8 3,2 1,7 aldehydi 12 356 190 65 BSA Glutaari- Saponiini - - - aldehydi - 1024 >800 480 BSA Glutaari- IFA - aldehydi - <10 8 10 ^Nimikkeen "Viikot immunisoinnin jälkeen" alla ensimmäisessä vaakarivissä olevat arvot esittävät kunkin rokotteen kohdalla neutralointi-indeksiarvoja (log^Q), kun taas sen alla oleva vaakarivi esittää ELISA-tekniikalla saatuja peptidin vasta-ainetiitteriarvoja. Arvot on saatu edellä mainitun Bittle et ai:in esittämällä tavalla.Carrier Coupling Excipient Weeks after immunization _ Method _ _j_ _L2_ _20_ KLH MBS Saponin 2.9 4.2 3.5 255 255 1020 1060 400 KLH MBS IFA 3.1 3.5 2.5 123 1024 550 435 BSA MBS Saponin - 730 > 640 145 BSA MBS IFA - 620 340 170 KLH Glutar Saponin 2.5> 4.7 _4.0 aldehyde 50,960> 1056 1280 KLH Glutar IFA 2.8 3.2 1.7 aldehyde 12,356 190 65 BSA Glutar - Saponin - - - Aldehyde - 1024> 800 480 BSA Glutar IFA - Aldehyde - <10 8 10 ^ The values in the first horizontal row under the heading "Weeks after immunization" represent the neutralization index values (log ^ Q) for each vaccine, while its the horizontal row below shows the antibody titer values of the peptide obtained by ELISA. The values have been obtained as described by Bittle et al.

Edellä esitetyt tiedot osoittavat, että saponiini-alumiinihvdrok-sidi saa aikaan paremman ja pitempiaikaisen vasta-ainereagoin-nin kuin epätäydellinen Freund'in apuaine riippumatta siitä, oliko peptidi kytketty glutaarialdehydilla vai MBS :11a vai oliko kantajana KLH vai BSA.The above data indicate that saponin-aluminum hydroxide provides a better and longer duration of antibody reaction than incomplete Freund's adjuvant, regardless of whether the peptide was coupled with glutaraldehyde or MBS or whether it was supported by KLH or BSA.

Alla olevassa taulukossa 7 esitetyt arvot osoittavat vasta-ainetiitterireagointia ja neutraloimistuloksia, käytettäessä edellä esitettyä tekniikkaa, kun rokotteena käytettiin peptidi 65:tä kytkettynä KLH:i.n yhdessä kahden apuainejärjestelmän kanssa.The values shown in Table 7 below indicate the antibody titer reaction and neutralization results using the above technique when peptide 65 coupled to KLH was used as a vaccine in combination with the two adjuvant systems.

40 8 0 46640 8 0 466

Kunkin rokotteen ensimmäinen vaakarivi sisältää neutralointi-indeksiarvot (log^Q), kun taas sen alla oleva arvojen vaakarivi esittää ELISA:11a saatuja peptidin vasta-ainetiittereitä.The first horizontal row of each vaccine contains the neutralization index values (log ^ Q), while the horizontal row of values below it shows the peptide antibody titers obtained by ELISA.

Taulukko 7Table 7

Marsujen vasta-ainereagointi peptidi 65-KLH-konjugaattiin kahta apuainetta vertailemallaGuinea pig antibody response to peptide 65-KLH conjugate by comparing two excipients

Annos Apuaine Viikot immunisoinnin jälkeen (/ug) _ _J5_ 12 16 20 200 CFA1 >6,3 >3,6 >3,9 >6,3 IFA >1024 >1024 >2560 1280 AI(OH)3 200 Saponiini2 >6,3 >3,9 >3,7 3,3 >1024 960 240 480 1000 Saponiini2 5,3 >3,9 >3,9 3,5 7680 240 200 240 ^Peptidin määrä annoksessa käytettäessä edellä mainitun Bittle et al:n taulukon 1 alla esitettyjä kolmea apuainejärjestelmää.Dose Excipient Weeks after immunization (/ ug) _ _J5_ 12 16 20 200 CFA1> 6.3> 3.6> 3.9> 6.3 IFA> 1024> 1024> 2560 1280 Al (OH) 3 200 Saponin2> 6, 3> 3.9> 3.7 3.3> 1024 960 240 480 1000 Saponin2 5.3> 3.9> 3.9 3.5 7680 240 200 240 ^ Amount of peptide per dose using the above-mentioned Bittle et al. 1 of the three excipient systems shown below.

22

Peptidin määrä annoksessa saponiini-alumiinihydroksidissa rokotettuna ihonalaisesti päivinä O, 14 ja 21.Amount of peptide per dose in saponin-aluminum hydroxide vaccinated subcutaneously on days 0, 14 and 21.

Edellä esitetyt tulokset osoittavat, että rokotteet, jotka sisälsivät kolme apuainejärjestelmää, saivat aikaan suuremman määrän vasta-ainetta pitempiaikaisesti kuin saponiini-alumiini-hydroksidia sisältävät rokotteet. Näytti myös siltä, että on vain vähän eroa kahden saponiini-alumiinihydroksidissa annetun annoksen välillä.The above results indicate that vaccines containing the three adjuvant systems produced higher levels of antibody over a longer period of time than vaccines containing saponin-aluminum hydroxide. There also appeared to be little difference between the two doses administered in saponin-aluminum hydroxide.

Taulukoissa 8 ja 9 esitetyt arvot osoittavat erirotuisen karjan ja sikojen reagointia useampikertaisiin rokotuksiin rokotteilla, jotka sisälsivät peptidi 65-KLH-konjugaattia (MBS-kytketty) ja saponiini-alumiinihydroksidia. Nämä tulokset osoittavat, että molemmat eläintyypit reagoivat synteettisiin antigeenipeptideihin kehittämällä vasta-ainetta suojaavaksi katsottuina määrinä.The values shown in Tables 8 and 9 show the response of different breeds of cattle and pigs to multiple vaccinations with vaccines containing peptide 65-KLH conjugate (MBS-linked) and saponin-aluminum hydroxide. These results indicate that both types of animals respond to synthetic antigenic peptides by developing the antibody in amounts considered protective.

ii 41 80466ii 41 80466

Kummassakin taulukossa kunkin eläimen kohdalla esitettyjen arvojen ensimmäinen vaakarivi on neutralointi-indeksiarvoja (log^Q), kun taas arvojen toinen vaakarivi on ELISA:lla saatuja peptidin vasta-ainetiittereitä.In both tables, the first horizontal row of values for each animal is the neutralization index values (log ^ Q), while the second horizontal row of values is the peptide antibody titers obtained by ELISA.

Taulukko 8Table 8

Karjan vasta-ainereagointi peptidi 65-KLH-konjugaattiin^Cattle antibody response to peptide 65-KLH conjugate

Eläin n:o Viikot immunisoinnin jälkeen _ _3_ __4_ _6_ 10 18 26 28 1 2,3 2,3 2,7 - 2,1 - >3,7 >1280 >1280 480 40 <10 30 2 3,3 3,3 >3,9 - 2,1 - >3,7 >5120 >5120 480 120 <10 960 3 2,3 >3,7 2,1 - 1,1 - >3,7 120 120 10 10 <10 10 ^Rokote koostui peptidi 65:stä kytkettynä KLHdin MBSrlla 2 mgraan peptidiä saponiini-alumiinihydroksidissa annosta kohti ja annettuna ihonalaisesti viikkona O, 3 ja 26.Animal No. Weeks after immunization _ _3_ __4_ _6_ 10 18 26 28 1 2.3 2.3 2.7 - 2.1 -> 3.7> 1280> 1280 480 40 <10 30 2 3.3 3.3 > 3.9 - 2.1 -> 3.7> 5120> 5120 480 120 <10 960 3 2.3> 3.7 2.1 - 1.1 -> 3.7 120 120 10 10 <10 10 ^ The vaccine consisted of peptide 65 coupled with KLH's MBS to 2 mg of peptide in saponin-aluminum hydroxide per dose and administered subcutaneously at weeks 0, 3 and 26.

Taulukko 9 |Table 9

Sian vasta-ainereagointi peptidi 65-KLH-konjugaattiin^Porcine antibody response to peptide 65-KLH conjugate

Eläin n:o Viikot immunisoinnin jälkeen _ 3 4 5 13 26 1 1,7 2,1 - 160 120 480 120 80 2 1,5 2,3 240 240 480 30 10 3 2,3 3,1 480 320 960 80 15 "''Rokote koostui peptidi 65:stä kytkettynä KLHdin MBS:lla 2 mg:aan peptidiä saponiini-alumiinihydroksidissa annosta kohti ja annettuna ihonalaisesti viikkona O, 3 ja 26.Animal No. Weeks after immunization _ 3 4 5 13 26 1 1.7 2.1 - 160 120 480 120 80 2 1.5 2.3 240 240 480 30 10 3 2.3 3.1 480 320 960 80 15 The vaccine consisted of peptide 65 coupled with KLH's MBS to 2 mg of peptide in saponin-aluminum hydroxide per dose and administered subcutaneously at weeks 0, 3 and 26.

42 8046642 80466

Edellä taulukossa 8 esitetyt tulokset karjassa osoittavat aranr.es-tistä reagointia, sillä kuuden kuukauden vahvistusrokotus laukaisi neutraloivien vasta-aineiden;B-muistisolujen tuotannon.The results in Table 8 above in the herd show an aranr.esthetic response, as six months of booster vaccination triggered the production of neutralizing antibodies, B memory cells.

Yleisesti katsottuna keksinnön eräänä kohteena on näin ollen menetelmä FMDV-rokotteiden valmistamiseksi, joilla on aikaisemmin tunnettujen rokotteiden koko immunisointivaikutus, mutta joilla ei ole lainkaan kilpailevia eli ristiin vaikuttavia immunologisia sivuvaikutuksia.In general, therefore, an object of the invention is a method for preparing FMDV vaccines which have the full immunizing effect of previously known vaccines but which have no competing, i.e. cross-acting, immunological side effects.

Edellä esitetyt tulokset rokotuksesta keksinnön mukaisilla synteettisillä antigeenisillä peptideillä saatiin käyttämällä kussakin tulosryhmässä vain yhden sekvenssien peptidejä. Taulukon 3 tulokset osoittavat, että todettiin tiettyä ristireagoin-tia ja monispesifisyyttä.The above results of vaccination with the synthetic antigenic peptides of the invention were obtained using peptides of only one sequence in each result group. The results in Table 3 show that some cross-reactivity and multi-specificity were observed.

Keksinnön erään toisen sovellutusmuodon mukaan saadaan aikaan ristireagointia ja monispesifisyyttä rokotuksilla, joissa käytetään useita keksinnön mukaisia peptidejä, joista jokainen on monospesifinen ainakin yhteen samaan sukuun kuuluvaan erilaiseen viruskantaan nähden, tai samaan sukuun kuuluviin erilaisiin serotyyppeihin tai kantoihin nähden. Näin ollen rokotus keksinnön mukaisia peptidejä sisältävällä rokotteella, joiden peptidien aminohapposekvenssit vastaavat pääasiassa sekä tyypin Olk että tyypin A alatyyppi 10, kanta 61 (AIO, 61) asemia noin 141 - noin 160, saa aikaan suojan molempia tyyppejä Olk ja AIO, ·': 61 vastaan. Vastaavasti polymeerinen peptidi, kuten edellä esi tetyt peptidit A ja B, voidaan valmistaa kopolymeeripeptidinä, ' jonka toistuvia peptidiyksikköjä on läsnä likimain yhtä suurin määrin ja joiden aminohappotähdesekvenssit vastaavat pääasiassa Olk:n ja AIO, 61:n aminohappotähdeasemia noin 141 - noin 160.According to another embodiment of the invention, cross-reactivity and multi-specificity are achieved by vaccinations using several peptides of the invention, each of which is monospecific for at least one different virus strain belonging to the same genus, or for different serotypes or strains belonging to the same genus. Thus, vaccination with a vaccine comprising the peptides of the invention, the amino acid sequences of the peptides corresponding substantially to both type Olk and type A subtype 10, strain 61 (AIO, 61) positions from about 141 to about 160, provides protection for both types Olk and AIO, against. Accordingly, a polymeric peptide, such as the above peptides A and B, can be prepared as a copolymer peptide having approximately equal repeating peptide units and having amino acid residue sequences substantially corresponding to about 141 to about 160 amino acid residues of Olk and A10, 61.

Il 43 8 O 4 6 6 VII. Picomavirusta koskevat synteettiset peptidit Edellä esitetyt FNDV-viruksen antigeenisillä kuoriproteii-neilla saadut tulokset edustavat laajemman keksinnön kahta spesifistä sovellutusmuotoa, joka keksintö kohdistuu yleisesti Picornavirusten heimoon eikä vain spesifiseen sukuun, FMDV-virukseen. Tämä laajempi keksintö koskee synteettisiä antigeenisiä peptidejä, joista jokainen sisältää noin 20 aminohappotähteen sekvenssin, joka ainakin aminohappotähteiden sekvenssin osalta vastaa Picornaviruksen antigeenisen kuoriproteiinin aluetta, joka löytyy noin 60-75 %:n päässä aminohappotähteiden sekvenssin pituudesta antigeenisen kuoriproteiinin aminopäätteestä. Nämä synteettiset peptidit ovat neutraaleja ja niissä on neutraali tai mieluummin positiivinen nettoionivaraus fysiologisissa pH-arvoissa, lukuunottamatta mahdol- 44 8 0 4 6 6 lista karboksyyli- tai alfa-aminopääteryhmistä johtuvaa varausta. Neutraalin tai positiivisen nettovarauksen olemassaolo voidaan helposti määrittää elektroforeesimäärityksellä fysiologisissa pH-arvoissa tai tutkimalla aminohappotähdesekvenssiä ja tuntien erillisten aminohappotähteiden pK -arvot.Il 43 8 O 4 6 6 VII. Synthetic Peptides for Picomavirus The above results obtained with FNDV virus antigenic coat proteins represent two specific embodiments of the broader invention, which is directed generally to the Picornavirus family and not just to a specific genus, FMDV. This broader invention relates to synthetic antigenic peptides, each containing a sequence of about 20 amino acid residues, corresponding at least in amino acid residue sequence to the region of the Picornavirus antigenic envelope protein found at about 60-75% of the amino acid residue sequence length of the antigenic envelope protein. These synthetic peptides are neutral and have a neutral or, preferably, a positive net ion charge at physiological pH values, with the exception of a possible charge due to carboxyl or alpha-amino terminal groups. The existence of a neutral or positive net charge can be readily determined by electrophoretic determination at physiological pH values or by examining the amino acid residue sequence and the pK values of the individual amino acid residues for hours.

Edellä esitettyjä synteettisiä peptidejä voidaan käyttää yksin polymeerinä, jossa peptidiyksiköt on kytketty yhteen hapetetuilla kysteiinitähteillä, tai kytketty kantajaan konjugaattina yhdessä fysiologisesti siedettävien laimentinien, kuten veden tai apuaineen kanssa rokotteen muodostamiseksi, -joka annettuna isäntäeläimeen tehokkaana määränä kykenee synnyttämään vasta-aineiden tuotannon, jotka reagoivat sen Picornaviruksen kanssa, jonka kuoriproteiinin sekvenssiä peptidi vastaa tai pääasiassa vastaa, suojaten täten isäntää tältä Picornavirukselta. Tätä synteettistä peptidiä, joko yksin polymeerinä tai konjugaatti-na, voidaan myös käyttää edellä esitetyllä tai jäljempänä esitettävällä tavalla niitä noin 20 aminohappotähdettä sisältäviä peptidejä varten, joiden sekvenssit vastaavat tai pääasiassa vastaavat aminohappotähdesekvenssiä asemasta noin 141 asemaan noin 160 FMDV VP^-kuoren aminopäätteestä.The above synthetic peptides can be used alone as a polymer in which the peptide units are coupled together with oxidized cysteine residues, or coupled to a carrier as a conjugate with physiologically tolerable diluents such as water or an excipient to form a vaccine capable of producing With a Picornavirus whose envelope protein sequence corresponds or substantially corresponds to the peptide, thus protecting the host from this Picornavirus. This synthetic peptide, either as a polymer alone or as a conjugate, can also be used as described above or below for peptides of about 20 amino acid residues whose sequences correspond to or substantially correspond to the amino acid residue sequence from position 141 to about 160 of the amino terminus of the FMDV VP1 shell.

Tutkittaessa Picornaviruksen antigeenisen kuoren aktiivisia vasta-aineita aikaansaavia alueita huomataan, että FMDV VP^:n eräs determinenttialue, jolla neutraloivia vasta-aineita voidaan synnyttää, vastaa kuoren aminohappotähdeasemia noin 141:stä noin 160:een aminopäätteestä. VP^-kuoreen sisältyy noin 213 aminohappotähdettä aminopäätteestä karboksipäätteeseen, kun Olk VP^-virusta käytetään vertailuproteiinina.Examining the active antibody-producing regions of the Picornavirus antigenic envelope, it is found that one determinant region of the FMDV VP1 in which neutralizing antibodies can be generated corresponds to about 141 to about 160 amino-terminal amino acid residue positions in the envelope. The VP ^ shell contains approximately 213 amino acid residues from the amino terminus to the carboxy terminus when the Olk VP ^ virus is used as a reference protein.

Näin ollen proteiinin alue, jolla neutraloivien vasta-aineiden determinantti alkaa, sijaitsee noin 60 %:n etäisyydellä (130/213 x 100 % = 61 %) proteiinin aminopäätteestä aminohapco-tähdesekvenssissä. Tämä neutraloivia vasta-aineita tuottavan determinantin alue päättyy aminonappotähdeasemassa noin 160, joka vastaa noin 75 1 aminohappotähdesekvenssistä aminopäätteestä laskien. Mieluummin käytetyissä peptideissä, ^otxa vastaavatThus, the region of the protein where the neutralizing antibody determinant begins is located at a distance of about 60% (130/213 x 100% = 61%) from the amino terminus of the protein in the amino acid residue sequence. This region of the determinant producing neutralizing antibodies terminates at the amino acid residue position of about 160, which corresponds to about 75 l of amino acid residue sequence from the amino terminus. Preferably in the peptides used,

IIII

80466 45 pääasiassa FMDV VP^-kuoren aminohappotähdeasemia noin 141:stä noin 160:een, neutraloivia vasta-aineita tuottava determinantti-alue sijaitsee sillä alueella, joka vastaa noin 66-75 % koko aminohappotähdesekvenssistä aminopäätteestä.80466 45 mainly from about 141 to about 160 amino acid residue positions in the FMDV VP1 shell, the neutralizing antibody-producing determinant region is located in the region corresponding to about 66-75% of the total amino acid residue sequence at the amino terminus.

Tutkittaessa edellä esitetyn tyyppiä 1 olevan polioviruksen arvoja huomataan, että peptidejä, joiden sekvenssit vastaavat pääasiassa kuoren aminohappotähdeasemia noin 182:sta noin 20l:een aminopäätteestä laskien, ovat huomattavia neutraloivien vasta-aineiden tuottajia tätä virusta vastaan. Synteettinen peptidi määrittelee tällöin tyyppiä 1 olevan polioviruksen neutraloivia vasta-aineita tuottavan determinanttialueen.Examining the values of the above type 1 poliovirus, it is found that peptides whose sequences correspond mainly to the amino acid residue positions of the shell from about 182 to about 20 l of amino terminals are significant producers of neutralizing antibodies against this virus. The synthetic peptide then defines a determinant region that produces neutralizing antibodies to type 1 poliovirus.

Tyyppiä 1 olevan polioviruksen antigeeninen kuori sisältää yhteensä 302 aminohappotähdettä sekvenssissään. Tyyppiä 1 olevan polioviruksen neutraloivia vasta-aineita tuottava determinantti sijaitsee täten alueella noin 60-66 %:n etäisyydellä tämän antigeenisen kuoren aminohappotähdesekvenssin aminopäätteestä, laskettuna edellä esitetyllä tavalla.The antigenic envelope of a type 1 poliovirus contains a total of 302 amino acid residues in its sequence. The determinant producing neutralizing antibodies to the type 1 poliovirus is thus located in a range of about 60-66% of the amino terminus of the amino acid residue sequence of this antigenic envelope, calculated as described above.

Kuvissa 1 ja 2 esitettyjä aminohappotähdesekvenssejä ja helposti saatavia asiaan kuuluvia pK -arvoja tutkittaessa huomataan, että cl kunkin sekvenssin niiden tähteiden, joilla on positiivinen ioni-varaus fysiologisissa pH-arvoissa (Arg, Lys ja His), lukumäärä on suurempi kuin niiden tähteiden, joilla on negatiivinen ioni-varaus näissä pH-arvoissa (Asp ja Glu), lukumäärä kaikissa sekvensseissä paitsi yhdessä. Tällä sekvenssillä, FMDV tyyppi A, alatyyppi 10, kanta 61 (AIO, 61), on neutraali ionivaraus. Huomataan kuitenkin, että AlO-kuoren erikoisen edullinen alue, joka vastaa pääasiassa aminohappotähdealuetta noin 141:sta noin 160:een, on nettovaraukseltaan positiivinen.Examining the amino acid residue sequences and readily available relevant pK values shown in Figures 1 and 2, it is observed that the number of residues cl in each sequence that have a positive ion charge at physiological pH values (Arg, Lys and His) is greater than that of residues is the negative ion charge at these pH values (Asp and Glu), the number in all sequences except one. This sequence, FMDV type A, subtype 10, strain 61 (AIO, 61), has a neutral ionic charge. It is noted, however, that a particularly preferred region of the AlO shell, corresponding primarily to the amino acid residue region from about 141 to about 160, has a positive net charge.

Tämän keksinnön mukaisilla synteettisillä antigeenisillä peptideillä on tyypillisesti neutraali tai positiivinen nettovaraus, : lukuunottamatta amino- ja/tai karboksyylipääteryhmien aiheuttamia : mahdollisia ionivarauksia. Mieluimmin näillä peptideillä on positiivinen nettoionivaraus. Nämä peptidit ovat myös mieluimmin « 80466 vesiliukoisia. Näyttää kuitenkin siltä, että synteettisen antigeenisen peptidin neutraali tai positiivinen nettoionivaraus ei ole yhtä tärkeä peptidin antigeenisyyteen nähden kuin se seikka, että peptidin aminohappotähdesekvenssi vastaa ainakin neutraloivia vasta-aineita tuottavan antigeenisen kuoren amino-happotähdesekvenssiä, joka sijaitsee alueella noin 60-75 % sekvenssin pituudesta aminopäätteestä.The synthetic antigenic peptides of this invention typically have a net neutral or positive charge, with the exception of possible ionic charges caused by amino and / or carboxyl end groups. Preferably, these peptides have a positive net ion charge. These peptides are also preferably water soluble. However, it appears that the neutral or positive net ion charge of a synthetic antigenic peptide is not as important to the antigenicity of the peptide as the fact that the amino acid residue sequence of the peptide corresponds at least to the amino acid residue sequence of the neutralizing antibody-producing antigenic shell. .

VIII. DiagnostiikkaVIII. diagnostic

Keksinnön mukaisia menetelmiä voidaan käyttää diagnoosikokeiden, kuten immuunikokeiden, valmistamiseen, joissa on välttämätöntä, että on käytettävissä löydettävän organismin vasta-aine tai synteettinen antigeeni, joka jäljentää löydettävän organismin determinanttia. Tällainen diagnostiikka käsittää esimerkiksi entsyymi-immuunikokeet, fluoresenssi-immuunikokeet ja muun tekniikan, jossa joko vasta-aine tai antigeeni on merkitty todettavalla merkkiaineella.The methods of the invention can be used to prepare diagnostic assays, such as immunoassays, in which it is necessary to have an antibody or synthetic antigen of the organism to be detected that mimics the determinant of the organism to be detected. Such diagnostics include, for example, enzyme immunoassays, fluorescence immunoassays, and other techniques in which either an antibody or antigen is labeled with a detectable label.

Käytettäessä esimerkiksi Voller et ai:in, "Enzyme Immune Assays in Diagnostic Medicine", Bulletin of the World Health Organization, Vol. 53, s. 55-65 (1976), esittämää kaksoisvasta-ainetekniikkaa voidaan käyttää ELISA-koetta diagnoosikokeen aikaansaamiseksi.For example, using the double antibody technique described by Voller et al., "Enzyme Immune Assays in Diagnostic Medicine", Bulletin of the World Health Organization, Vol. 53, pp. 55-65 (1976), an ELISA can be used to provide a diagnostic test.

Edellä esitetyt vasta-peptidin vasta-ainetiitteriarvot saatiin käyttämällä kaksoisvasta-aine-ELISA:a samoin kuin edellä esitetyn Bittle et ai:in taulukossa 1 esitetyt arvot. Tiedot tästä ELISA:sta on esitetty Bittle et ai:in taulukon 1 alla.The above antibody peptide antibody titer values were obtained using a double antibody ELISA as well as the values shown in Table 1 of Bittle et al., Supra. Data for this ELISA are shown in Table 1 of Bittle et al.

Tämän keksinnön mukainen diagnostinen järjestelmä Picornaviruksen antigeenin läsnäolon toteamiseksi sisältää keksinnön mukaisen peptidin avulla muodostettuja vasta-aineita biologisesti aktiivisessa muodossa yhdessä välineen kanssa immuunireaktion toteamiseksi. Sekoitettaessa ruumiinkomponenttiin, kuten seerumiin, virtsaan tai kudosuutteeseen, vasta-aineet immuunireagoivat Picornaviruksen antigeenin kanssa muodostaen immuunireaktantin, ja indikaatioväline ilmaisee tämän immuunireaktion.The diagnostic system of the present invention for detecting the presence of a Picornavirus antigen comprises antibodies generated by a peptide of the invention in a biologically active form together with a means for detecting an immune response. When mixed with a body component such as serum, urine, or tissue extract, the antibodies immunoreact with the Picornavirus antigen to form an immune reactant, and the indicating device detects this immune response.

tl 47 80466tl 47 80466

Ruumiinkomponentti voidaan esimerkiksi päällystää ELISA-koe-putkelle ja inkuboida keksinnön mukaisilla vasta-aineilla, kuten kaneissa synnytetyillä, käyttämällä hyvin tunnettua tekniikkaa. Kun kaikki mahdollisesti ei-immuunireagoineet vasta-aineet on puhdistamalla poistettu, lisätään toinen entsyv-misidottu vasta-aine, joka on muodostettu ensin mainittua tyyppiä olevan vasta-aineen avulla, kuten vuohi-vastakani-vasta-aineita, jotka sisältävät sidottua alkaalista fosfataa-sia, ja inkuboidaan ELISA-putkessa. Toisten vasta-aineiden mahdollinen ylimäärä poistetaan puhdistamalla jättäen kaikki ne fosfataasisidotut vuohi-vastakani-vasta-aineet, jotka sitoutuvat keksinnön mukaiseen vasta-aineeseen, ELISA-putkeen. Entsyymisubstraatin, kuten p-nitrofenyylifosfaatin myöhempi sekoittaminen saa aikaan merkin immuunireaktantin muodostumisesta ja täten että ruumiinkomponenttiin sisältyi Picornaviruksen antigeeni.For example, the body component can be coated on an ELISA tube and incubated with antibodies of the invention, such as those generated in rabbits, using well known techniques. After all potentially non-immune-reacted antibodies have been removed by purification, another enzyme-linked antibody formed with an antibody of the former type, such as goat anti-rabbit antibodies containing bound alkaline phosphatase, is added. , and incubated in an ELISA tube. Any excess of other antibodies is removed by purification, leaving all phosphatase-bound goat anti-rabbit antibodies that bind to the antibody of the invention in an ELISA tube. Subsequent mixing of an enzyme substrate such as p-nitrophenyl phosphate provides an indication of the formation of an immune reactant and thus that the Picornavirus antigen was included in the body component.

Keksinnön mukaiseen vasta-aineeseen voidaan sitoa radioaktiivi- 125 nen alkuaine, kuten J, inkubointivälineen muodostamiseksi. Tällöin voidaan esimerkiksi ruumiinkomponentti esipäällystää koeputkelle, minkä jälkeen inkuboidaan radioaktiivisilla vasta-aineilla ja vasta-aineiden ylimäärä poistetaan puhdistamalla putkesta. Putkeen puhdistuksen jälkeen jäävä radioaktiivisuus muodostaa merkin immuunireaktantin syntymisestä.A radioactive element, such as J, can be bound to an antibody of the invention to form an incubation medium. In this case, for example, the body component can be pre-coated on a test tube, after which it is incubated with radioactive antibodies and the excess antibodies are removed by cleaning the tube. The radioactivity remaining in the tube after cleaning is an indication of the formation of an immune reactant.

Tämän keksinnön eräs toinen sovellutusmuoto koskee diagnostista järjestelmää Picornaviruksen antigeenin läsnäolon toteamiseksi edellä esitetyn tapaisessa ruumiinkomponentissa. Tämä järjestelmä on erikoisen edullinen kilpailevissa kokeissa ja se käsittää eri säiliöissä olevan ensimmäisen reagenssin ja toisen reagenssin.Another embodiment of the present invention relates to a diagnostic system for detecting the presence of Picornavirus antigen in a body component as described above. This system is particularly advantageous in competitive experiments and comprises a first reagent and a second reagent in different containers.

Ensimmäinen reagenssi sisältää keksinnön mukaisen synteettisen antigeenisen peptidin biologisesti aktiivisessa muodossa. Toinen reagenssi sisältää biologisesti aktiivisessa muodossa olevia vasta-aineita, jotka reagoivat tällaisen peptidin kanssa, kuten peptidin avulla muodostettujen vasta-aineiden kanssa. Järjestelmään sisältyy myös väline peptidin ja vasta-aineiden välisen 48 80 466 immuunireaktion osoittamiseksi, joko eri säiliössä, kun käytetään fosfataasisidottuja vuohi-vastakani-vasta-aineita ja tämän substraattia, tai yhdessä vasta-aineiden kanssa, kun radioaktiivisia alkuaineita on sidottu vasta-aineisiin.The first reagent contains a synthetic antigenic peptide of the invention in a biologically active form. The second reagent contains antibodies in biologically active form that react with such a peptide, such as antibodies formed with the peptide. The system also includes means for detecting a 48 80 466 immune response between the peptide and the antibodies, either in a separate container when using phosphatase-bound goat anti-rabbit antibodies and a substrate thereof, or in combination with antibodies when radioactive elements are bound to the antibodies.

Ennalta määrättyjen ensimmäisen ja toisen reagenssin määrien sekoittaminen koestettavan ruumiinkomponentin ennalta määrätyn määrän läsnäollessa saa aikaan tietyn laajuisen immuunireaktion, jonka ilmaisuväline osoittaa. Immuunireaktion määrä on erilainen kuin tunnetun immuunireaktion määrä, kun ruumiin komponenttiin sisältyy Picornaviruksen antigeeni.Mixing predetermined amounts of the first and second reagents in the presence of a predetermined amount of the body component to be tested elicits an immune response of a certain magnitude as indicated by the detection means. The amount of immune response is different from the amount of a known immune response when a body component contains Picornavirus antigen.

Tavanomaisessa käytännön suorituksessa ruumiinkomponentti esi-inkuboidaan vasta-aineella ja tämä koostumus inkuboidaan sitten ELISA-putken seinään sidotulla peptidillä. Putken puhdistaminen vasta-aine-Picornavirusantigeenikompleksin poistamiseksi jättää peptidin ja vasta-aineen immuunireaktantin, jonka läsnäolo ja määrä voidaan osoittaa ilmaisuvälineen avulla.In a conventional practice, the body component is pre-incubated with the antibody and this composition is then incubated with the peptide bound to the wall of the ELISA tube. Purification of the tube to remove the antibody-Picornavirus antigen complex leaves a peptide and antibody immune reactant, the presence and amount of which can be indicated by a detection device.

Kokonaisten, koskemattomien, biologisesti aktiivisten vasta-aineiden käyttö ei ole välttämätön monessa diagnostisessa järjestelmässä, kuten edellä esitetyssä kilpailevassa kokeessa. Pikemmin tarvitaan vain vasta-ainemolekyyIin biologisesti aktiivista idiotyyppiä sisältävää, antigeeniä sitovaa tunnustus-osaa. Idiotyyppiä sisältäviä vasta-aineosia havainnollistavat Fab:na ja F(ab')2:na tunnetut vasta-aineosat, joita valmistetaan tyypillisesti kokonaisilla vasta-aineilla suoritetuilla hyvin tunnetuilla entsymaattisilla reaktioilla.The use of whole, intact, biologically active antibodies is not necessary in many diagnostic systems, such as the competitive assay described above. Rather, only an antigen-binding recognition moiety containing a biologically active idiotype for the antibody molecule is required. Idiotypic antibodies are illustrated by antibodies known as Fab and F (ab ') 2, which are typically prepared by well-known enzymatic reactions with whole antibodies.

Kokonaisia, vahingoittumattomia vasta-aineita, Fab-, Fiab'J^-osia ja sen tapaisia, jotka sisältävät vasta-aineiden idiotyyp-pisiä alueita, kutsutaan tässä idiotyyppiä sisältäviksi polyamideiksi. Sanontaa "idiotyyppiä sisältävä polyamidi" käytetään oheisissa patenttivaatimuksissa kattamaan tällaisten diagnostisissa tuotteissa tai menetelmissä hyödyllisten molekyylien ryhmän. Vaikkakin Fab- tai F(ab')2~vasta-aineosia voidaan käyttää diagnostisen menetelmän tai tuotteen idiotyyppiä sisältä- li « 80466 vässä polyamidissa, käytetään tavallisesti mieluummin kokonaisia, koskemattomia vasta-aineita, senkin takia, että vasta-aineen Fab- tai F(ab')2-osan valmistaminen edellyttää lisäreaktioita ja seerumien puhdistusta.Whole, intact antibodies, Fab, Fiab'J, and the like containing idiotypic regions of antibodies are referred to herein as idiotypic polyamides. The phrase "idiotypic polyamide" is used in the appended claims to cover a group of such molecules useful in diagnostic products or methods. Although Fab or F (ab ') 2 antibody components can be used in polyamide containing an idiotype of a diagnostic method or product, whole, intact antibodies are usually preferred, also because the Fab or F The preparation of (ab ') Part 2 requires further reactions and purification of sera.

IX. Menetelmät ja kirjallisuus Tälle keksinnölle ainutlaatuisia menetelmiä ja aineita selostetaan viittaamalla kulloinkin kyseiseen menettelyyn. Yleensä ovat kuitenkin laboratoriotekniikka, menetelmät ja käytetyt aineet samoja kuin molekyylibiologiassa ja biokemiassa yleisesti käytetyt .IX. Methods and Literature Methods and materials unique to this invention are described with reference to each particular procedure. In general, however, the laboratory techniques, methods, and materials used are the same as those commonly used in molecular biology and biochemistry.

Viitataan erityisesti seuraaviin teoksiin METHODS IN ENZYMOLOGY, Colowick, S.P. ja Kaplan, N.O., Editors, Academic Press, New York; METHODS IN IMMUNOLOGY AND IMHU'TOCHEMISTRY, Academic Press, HANDBOOK OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, Chemical Rubber Publishing Company, ja CELL BIOLOGY: A COMPREHENSIVE TREATISE, Goldstein ja Prescott, Academic Press, N.Y., N.Y. mielenkiintoa olevien yleisten aineiden ja menetelmien selostamiseen nähden.Reference is made in particular to the following works METHODS IN ENZYMOLOGY, Colowick, S.P. and Kaplan, N.O., Editors, Academic Press, New York; METHODS IN IMMUNOLOGY AND IMHU'TOCHEMISTRY, Academic Press, HANDBOOK OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, Chemical Rubber Publishing Company, and CELL BIOLOGY: A COMPREHENSIVE TREATISE, Goldstein and Prescott, Academic Press, N.Y., N.Y. general substances and methods of interest.

Seuraavat julkaisut esittävät erityisiä tunnettuja vaiheita ja menetelmiä samoin kuin tekniikan nykyistä tasoa: 50 80466The following publications present specific known steps and methods as well as the state of the art: 50 80466

Kirjallisuus 1. Baltimore, D., Cold Spring Harbor Symp., Quant. Biol. 39, 1187-1200 (1974).Literature 1. Baltimore, D., Cold Spring Harbor Symp., Quant. Biol. 39, 1187-1200 (1974).

2. Oskarsson, M.K., Elder, J.H., Gautsch, J.W., Lerner, R.A. and Vande Woude, G.F., Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A. 75, 4694-4698 (1978).2. Oskarsson, M.K., Elder, J.H., Gautsch, J.W., Lerner, R.A. and Vande Woude, G.F., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 75, 4694-4698 (1978).

3. Gautsch, J.W., Elder, J.H., Schindler, J. ,3. Gautsch, J.W., Elder, J.H., Schindler, J.,

Jensen, F.C., ja Lerner, R.A., Proc. Natl. Acad. Sei. , U.S.A. 75, 4170-4174 Π 978).Jensen, F.C., and Lerner, R.A., Proc. Natl. Acad. Sci. , U.S.A. 75, 4170-4174 Π 978).

4. Jamjoon, G.A., Naso, R.B. ja Arlinghaus, R.B., Virol. 78, 11-34 (1977).4. Jamjoon, G.A., Naso, R.B. and Arlinghaus, R.B., Virol. 78, 11-34 (1977).

5. Famulari, N.C., Buchhagen, D.L., Klenk, H.D., ja Fleissner, E., J. Virol. 20, 501-508 (1976).5. Famulari, N.C., Buchhagen, D.L., Klenk, H.D., and Fleissner, E., J. Virol. 20, 501-508 (1976).

6. Witte, O.N., Tsukamoto-Adey, A. ja Weissman, L.L., Virol. 76, 539-553 (1977).6. Witte, O.N., Tsukamoto-Adey, A. and Weissman, L.L., Virol. 76, 539-553 (1977).

7. Fan, H. and Verma, I.M., J. Virol. 26, 468-478 (1978) .7. Fan, H. and Verma, I.M., J. Virol. 26, 468-478 (1978).

8. Sutcliffe, J.G., Shinnick, T.M., Lerner, R.A., Johnson, P. ja Verma, I.M., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 44, in press (1979).8. Sutcliffe, J.G., Shinnick, T.M., Lerner, R.A., Johnson, P. and Verma, I.M., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 44, in press (1979).

9. Sutcliffe, J.G., Shinnick, T.M., Verma, I.M. ja Lerner, R.A., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. in press (1980).9. Sutcliffe, J.G., Shinnick, T.M., Verma, I.M. and Lerner, R.A., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. in press (1980).

10. .Marglin, A. ja Merrifield, R.B., Ann. Rev. Biochem. 39, 841-866 (1970).10. Marglin, A. and Merrifield, R.B., Ann. Rev. Biochem. 39, 841-866 (1970).

11. Pederson, F.S. ja Haseltine, W.A., J. Virol. 33, 349-365 (1980).11. Pederson, F.S. and Haseltine, W.A., J. Virol. 33, 349-365 (1980).

12. Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5, Sup. 3, M.O. Dayhoff, ed., Natl. Biomed, Res. Found., pub. Washington, D.C. (1978).12. Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5, Sup. 3, M.O. Dayhoff, ed., Natl. Biomed, Res. Found., Pub. Washington, D.C. (1978).

13. Dayhoff, M.O., Schwartz, R.M. ja Orcutt, B.C., pp. 352, op. cit.13. Dayhoff, M.O., Schwartz, R.M. and Orcutt, B.C., p. 352, op. cit.

14. Fisher, R.A., The General Theory of Natural Selection, Clarendon Press, Oxfore (1930).14. Fisher, R.A., The General Theory of Natural Selection, Clarendon Press, Oxfore (1930).

15. Elder, J.H., Gautsch, J.W., Jensen, F.C., Lerner, R.A., Harley, J.W. ja Rowe, W.P., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 74, 4676-4680 (1977).15. Elder, J.H., Gautsch, J.W., Jensen, F.C., Lerner, R.A., Harley, J.W. and Rowe, W.P., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 74, 4676-4680 (1977).

11 si 80466 16. Lerner, R.A., Jensen, F.C., Kennel, S.J., Dixon, F.J., Roches, G.D. ja Francke, U., Proc. Nat. Acad. Sei., U.S.A. 69, 2965-2969 (1972).11 si 80466 16. Lerner, R.A., Jensen, F.C., Kennel, S.J., Dixon, F.J., Roches, G.D. and Francke, U., Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A. 69, 2965-2969 (1972).

17. Niman, H.L. ja Elder, J.H., Proc. Nat. Acad.17. Niman, H.L. and Elder, J.H., Proc. Nat. Acad.

Sci., U.S.A., in press (1980).Sci., U.S.A., in press (1980).

18. Edwards, S.A. ja Fan, H., J. Virol. 30. 551-563 (1979) .18. Edwards, S.A. and Fan, H., J. Virol. 30. 551-563 (1979).

19. Kitagawa, T. ja Ailawa, T., J. Biochem. (Tokvo) 79, 233 (1976) .19. Kitagawa, T. and Ailawa, T., J. Biochem. (Tokvo) 79, 233 (1976).

20. Liu, F., Zinnecker, M., Hamaoka, T. ja Katz, D.H. Biochem. 18, 690 (1979).20. Liu, F., Zinnecker, M., Hamaoka, T., and Katz, D.H. Biochem. 18, 690 (1979).

21. Katz, David H., U.S. Patent No. 4,191,668,21. Katz, David H., U.S. Pat. Patent No. 4,191,668,

March 4, 1980.March 4, 1980.

22. J. Exp. Med., 134; 201-203 (1971) .22. J. Exp. Med., 134; 201-203 (1971).

23. J. Exp. Med. , 136: 426-438, 1404-1429 (1972).23. J. Exp. Med. , 136: 426-438, 1404-1429 (1972).

24. J. Exp. Med., 138: 312-317 (1973).24. J. Exp. Med., 138: 312-317 (1973).

25. J. Exp. Med. , 139: 1446-1463 (1974).25. J. Exp. Med. , 139: 1446-1463 (1974).

26. Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 71: 3111-3114.26. Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 71: 3111-3114.

27. Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 73: 2091-2095 (1976).27. Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 73: 2091-2095 (1976).

28. J. Immunol. 144: 872-876 (1975) .28. J. Immunol. 144: 872-876 (1975).

29. J. Immunol. 120: 1824-1827 (1978).29. J. Immunol. 120: 1824-1827 (1978).

30. J. Exp. Med., 139: 1464-1472 (1974) .30. J. Exp. Med., 139: 1464-1472 (1974).

31. Humphrey, J.H. ja White, R.G., Immunology for Students of Medicine, Blackwell, Oxford (1970).31. Humphrey, J.H. and White, R. G., Immunology for Students of Medicine, Blackwell, Oxford (1970).

32. Katz, David H. and Benacerraf, Baruj,32. Katz, David H. and Benacerraf, Baruj,

Immunological Tolerance, Mechanisms and Potential Therapeutic Applications, Academic Press (1974) .Immunological Tolerance, Mechanisms and Potential Therapeutic Applications, Academic Press (1974).

33. Newsweek, March 17, 1980, pp. 62-71.33. Newsweek, March 17, 1980, p. 62-71.

34. Chemical & Engineering News, June 23, 1980, p. 10.34. Chemical & Engineering News, June 23, 1980, p.10.

35. Milstein, C., Differentiation 13: 55 (1979).35. Milstein, C., Differentiation 13:55 (1979).

36. How’ard, J.C., Butcher, G.W., Galfre', G.f Milstein, C. ja Milstein, C.P., Immunol. Rev.36. How'ard, J.C., Butcher, G.W., Galfre ', G.f. Milstein, C. and Milstein, C.P., Immunol. Rev.

47: 139 (1979).47: 139 (1979).

37. Hammerling, G.J., Hammerling, U., ja Lemke, H.,37. Hammerling, G.J., Hammerling, U., and Lemke, H.,

Immunogenetics 8: 433 (1978).Immunogenetics 8: 433 (1978).

38. Shulman, M., Wilde, C.D., ja Kohler, G., Nature 276: 269 (1978).38. Shulman, M., Wilde, C.D., and Kohler, G., Nature 276: 269 (1978).

52 80 466 39. Kohler, G. ja Milstein, G., Nature 256: 495 (1975) .52 80 466 39. Kohler, G. and Milstein, G., Nature 256: 495 (1975).

40. Ledbetter, J.A. ja Herzenberg, L.A., Immunol.40. Ledbetter, J.A. and Herzenberg, L.A., Immunol.

Rev. 47: 63 (1979).Rev. 47: 63 (1979).

41. Gefter, M.L., Margulies, D.H. ja Scharff, M.D.,41. Gefter, M.L., Margulies, D.H. and Scharff, M.D.,

Somatic Cell Genetics 3: 231 (1977).Somatic Cell Genetics 3: 231 (1977).

42. Kohler, G. ja Milstein, C., Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976) .42. Kohler, G. and Milstein, C., Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976).

43. J. Biol. Chem., 241: 2491-2495 (1966).43. J. Biol. Chem., 241: 2491-2495 (1966).

44. J. Biol. Chem., 241; 555-557 (1967).44. J. Biol. Chem., 241; 555-557 (1967).

45. Koprowski, Hilary et ai., U.S. Patent No. 4,196,265, April 1980.45. Koprowski, Hilary et al., U.S. Pat. Patent No. 4,196,265, April 1980.

46. Science 209, No. 4463, pp. 1319-1438 (September 1980 - entire numberr).46. Science 209, no. 4463, p. 1319-1438 (September 1980 - entire numberr).

47. Davis, B.D., Dulbecco, R. Eisen, H.N., Ginsbert', H.S., Wood, W.B. Jr., ja McCarty, M.,47. Davis, B.D., Dulbecco, R. Eisen, H.N., Ginsbert ', H.S., Wood, W.B. Jr., and McCarty, M.,

Microbiology, Harper & Row, Hagerstown, Md., 1973.Microbiology, Harper & Row, Hagerstown, Md., 1973.

48. Morgan, J. ja Whelan, W.J., Recombinant DNA And Genetic Experimentation, Pergamon Press, New York, 1979.48. Morgan, J. and Whelan, W.J., Recombinant DNA And Genetic Experimentation, Pergamon Press, New York, 1979.

49. Goldstein, L. ja Prescott, D.M., Cell Biology, A Comprehensive Treatise Vois. 1, 2 & 3, Academic Press, San Francisco.49. Goldstein, L. and Prescott, D.M., Cell Biology, A Comprehensive Treatise Vois. 1, 2 & 3, Academic Press, San Francisco.

50. Scott, W.A. ja Werner, R., Molecular Cloning of Recombinant DNA, Academic Press, New York, 1977.50. Scott, W.A. and Werner, R., Molecular Cloning of Recombinant DNA, Academic Press, New York, 1977.

51. Wu, Ray (Ed.), Colowick, Sidney P., ja Kaplan, Nathan 0., Methods in Enzymology, generally and Vol. 68, "Recombinant DNA" in particular,51. Wu, Ray (Ed.), Colowick, Sidney P., and Kaplan, Nathan 0, Methods in Enzymology, in general and Vol. 68, "Recombinant DNA" in particular,

Academic Press, New York.Academic Press, New York.

52. Cooper, Terrance G., The Tools of Biochemistrv, John Wiley & Sons, New York, 1977.52. Cooper, Terrance G., The Tools of Biochemistry, John Wiley & Sons, New York, 1977.

53. Sela, Michael, Science 166? 1365-1374 (1969).53. Sela, Michael, Science 166? 1365-1374 (1969).

54. Arnon, R., Elchanan, M., Sela, M. ja Anfinsen, C.B., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 68: 1450 (1971).54. Arnon, R., Elchanan, M., Sela, M., and Anfinsen, C.B., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 68: 1450 (1971).

IIII

53 80466 55. Sela, M., Adv. Inunun. 5: 29-19 (1966).53 80466 55. Sela, M., Adv. Inunun. 5: 29-19 (1966).

56. Sela, M., Arnon, R. , ja Chaitchik, S., U.S. Patent No. 4,075,194, February 21, 1978.56. Sela, M., Arnon, R., and Chaitchik, S., U.S. Pat. Patent No. 4,075,194, February 21, 1978.

57. Cohen, S.N., ja Boyer, H.W., U.S. Patent No. 4,237,224, December 2, 1980.57. Cohen, S.N., and Boyer, H.W., U.S. Pat. Patent No. 4,237,224, December 2, 1980.

58. Lerner, R.A., Sutcliffe, J.G. ja Shinnick, T.M.58. Lerner, R.A., Sutcliffe, J.G. and Shinnick, T.M.

(1981) Cell 23; 109-110.(1981) Cell 23; 109-110.

59. Wilson, I.A., Skehel, J.J. ja Wiley, D.C.59. Wilson, I.A., Skehel, J.J. and Wiley, D.C.

(1981), Nature 289; 366-373.(1981), Nature 289; 366-373.

60. Sutcliffe, J.G., Shinnick, T.M., Green, N., Liu, F-T, Niman, H.L., ja Lerner, R.A. (1980), Nature 287: 801-805.60. Sutcliffe, J.G., Shinnick, T.M., Green, N., Liu, F-T, Niman, H.L., and Lerner, R.A. (1980), Nature 287: 801-805.

61. Kleid, D.G., Yansura, D., Small, B., Dowbenko, D., Moore, D.M., Grubman, M.J., McKercher, P.D., Morgan, D.O., Robertson, B.H., Bachrach, H.L., Science 214: 1125-1129 (1981).61. Kleid, DG, Yansura, D., Small, B., Dowbenko, D., Moore, DM, Grubman, MJ, McKercher, PD, Morgan, DO, Robertson, BH, Bachrach, HL, Science 214: 1125- 1129 (1981).

62. CELL BIOLOGY, A COMPREHENSIVE TREATISE,62. CELL BIOLOGY, A COMPREHENSIVE TREATISE,

Goldstein, L., ja Prescott, D.M., Eds., Academic Press, N.Y., 1977 et. seq.Goldstein, L., and Prescott, D.M., Eds., Academic Press, N.Y., 1977 et. seq.

63. MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, 3rd Ed., Watson, J.D., W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA. 1977.63. MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, 3rd Ed., Watson, J.D., W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA. 1977.

64. Scientific American, "Recombinant DNA" W.H. Freeman and Company, San Francisco 1978.64. Scientific American, "Recombinant DNA" W.H. Freeman and Company, San Francisco 1978.

65. Nofschneider, P., Heinz, S., Kupper, H.A.,65. Nofschneider, P., Heinz, S., Kupper, H.A.,

Keller, W., UK Patent Application GB 2 079 288 A, published 20 Jan. 1982.Keller, W., UK Patent Application GB 2,079,288 A, published 20 Jan. 1982.

66. Kupper, H., Keller, W., Kunz, C., Forss, S., Scholler, H., Franze, R., Strohmair, K., Marquardt, O., Zaslovsky, V.G., ja Hofschneider, P.H., "Cloning of cDNA of major antigen of foot and mouth disease virus and expression in E.66. Kupper, H., Keller, W., Kunz, C., Forss, S., Scholler, H., Franze, R., Strohmair, K., Marquardt, O., Zaslovsky, VG, and Hofschneider, PH , "Cloning of cDNA of major antigen of foot and mouth disease virus and expression in E.

Coli.Nature 289: 555-559 (1981).Coli. Nature 289: 555-559 (1981).

67. Walter, G., Scheidtmann, K., Carbone, A.,67. Walter, G., Scheidtmann, K., Carbone, A.,

Laudano, A.P., Doolittle, R.F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5197-5200 (1980) .Laudano, A.P., Doolittle, R.F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5197-5200 (1980).

54 80466 68. Fracastorius, H. DeContagione et Contagiosis morbis et Curatione, Libri iii. (1546) 69. King., A.M.Q., Underwood, B.O., McCahon, D., Newman, J.W.I. and Brown, F. Nature, 293, 479-480 (1981).54 80466 68. Fracastorius, H. DeContagione et Contagiosis morbis et Curatione, Libri iii. (1546) 69. King., A.M.Q., Underwood, B.O., McCahon, D., Newman, J.W.I. and Brown, F. Nature, 293, 479-480 (1981).

70. Cooper, P.D. et al. Intervirology 1(), 165-180 (1978) .70. Cooper, P.D. et al. Intervirology 1 (), 165-180 (1978).

71. Wild, T.F., Burroughs, J.N. ja Brown, F., J.Gen. Virol. 4, 313-320 (1969) .71. Wild, T.F., Burroughs, J.N. and Brown, F., J.Gen. Virol. 4, 313-320 (1969).

72. Laporte, J., Grosclaude, J., Wantyghem, J., ja Rouze, P., C.r. hebd. Acad.Sci.Seanc. Paris, 276, 3399-3401 (1973).72. Laporte, J., Grosclaude, J., Wantyghem, J., and Rouze, P., C.r. Hebd.Seances. Acad.Sci.Seanc. Paris, 276, 3399-3401 (1973).

73. Bachrach, H.L., Moore, D.M., McKercher, P.D. ja Polatnick, J., J. Immun. 115, 1636-1641 (1975).73. Bachrach, H.L., Moore, D.M., McKercher, P.D. and Polatnick, J., J. Immun. 115, 1636-1641 (1975).

74. Kaaden, O.R., Adam, K-H, ja Strobmaier, K., J.Gen. Virol. 34, 397-400 (1977).74. Kaaden, O.R., Adam, K-H, and Strobmaier, K., J.Gen. Virol. 34, 397-400 (1977).

75. Melven, R.H., Rowlands, D.J. ja Brown, F., J.Gen. Virol. 45, 761-763 (1979).75. Melven, R.H., Rowlands, D.J. and Brown, F., J.Gen. Virol. 45, 761-763 (1979).

76. Boothroyd, J.C. et al. Nature 290, 800-802 (1981).76. Boothroyd, J.C. et al. Nature 290, 800-802 (1981).

77. Boothroyd, J.C., Harris, T.J.R., Rowlands, D.J. ja Lowe, P.A. Gene (in press).77. Boothroyd, J.C., Harris, T.J.R., Rowlands, D.J. and Lowe, P.A. Gene (in press).

78. Kurz, C., Forss, S., Kupper, H., Strohmaier, K. ja Schaller , H., Nucleic Acids Res. 9, 1919-1931 (1981) .78. Kurz, C., Forss, S., Kupper, H., Strohmaier, K., and Schaller, H., Nucleic Acids Res. 9, 1919-1931 (1981).

79. Strohmaier, K., Franze, R. ja Adam, K-H. Proc.79. Strohmaier, K., Franze, R., and Adam, K-H. Proc.

5th Int. Congress Virology, Strasbourg (1981).5th Int. Congress Virology, Strasbourg (1981).

80. Houghten, R.A., Chang, W.C. ja Li, C.H., Int.J.Pept.Prot-Res. 16, 311-320 (1980).80. Houghten, R.A., Chang, W.C. and Li, C.H., Int.J.Pept.Prot-Res. 16, 311-320 (1980).

81. Houghten, R.A. ja Li, C.H., Anal.Biochem. 9£, 36-46 (1979).81. Houghten, R.A. and Li, C.H., Anal. Biochem. 9 £, 36-46 (1979).

f .55 8 O 4 6 6 X. Päätelmäf .55 8 O 4 6 6 X. Conclusion

Lerner et ai ovat jo kauan tutkineet FMDV ja he luulivat jo jonkin aikaa, että he olivat identifioineet FMDV:n optimaalisesti spesifisen antigeenisen determinantti-peptidifragmentin, todetakseen kuitenkin, että oletetusti antigeenisesti aktiivinen osa ei pystynyt tuottamaan FMDV:n vasta-aineita tai tuotti vasta-aineita vain niin pienin määrin, että sillä oli vain vähäistä tai ei lainkaan käytännöllistä arvoa. Olimme tietoisia siitä, että edellä mainitut Strohmaier et ai olivat tehneet jonkinlaisia johtopäätöksiä heidän (VP^) FMDV serotyyppi 0 geeniensä antigeenisesti aktiivisista osista ja että Kelid et ai olivat määrittäneet VP-j (VP^) FMDV serotyyppi A, alatyyppi 12 geenien nukleotidisekvenssin /Science, 214:1125-1129 (1981)/. Oli tietenkin mahdotonta vetää nukleotidisekvenssien perusteella johtopäätös siitä, mikä peptidifragmentti tai -fragmentit olisivat antigeenisiä, ja etenkin oli mahdotonta ennustaa tai edes arvata millä peptidifragmenteilla olisi optimaalinen antigeeni-syys FMDV-virukseen nähden. Kuten edellä on osoitettu, edellä mainitun Strohmaier et ai:in ennustama Olk VP^-kuoren vasta-aineita synnyttävä alue todettiin paljon vähemmän aktiiviseksi kuin tässä esitetty suhteellisesti pitempi alue, johon sisältyy alueita, jotka Strohmaier et ai ennustivat olevan suojaavia vasta-aineita tuottamattomia.Lerner et al have long studied FMDV and thought for some time that they had identified an optimally specific antigenic determinant peptide fragment of FMDV, however, to state that the putatively antigenically active moiety was unable to produce antibodies to FMDV or produced antibodies. substances only to such a small extent that it had little or no practical value. We were aware that the aforementioned Strohmaier et al had drawn some conclusions about the antigenically active portions of their (VP 2) FMDV serotype 0 genes and that the nucleotide sequence of VP-j (VP 2) FMDV serotype A, subtype 12 genes had been determined by Kelid et al. , 214: 1125-1129 (1981). Of course, it was impossible to draw a conclusion from the nucleotide sequences as to which peptide fragment or fragments would be antigenic, and in particular it was impossible to predict or even guess which peptide fragments would have optimal antigenicity for FMDV virus. As indicated above, the antibody-generating region of the Olk VP1 shell predicted by the aforementioned Strohmaier et al. Was found to be much less active than the relatively longer region disclosed herein, which includes regions predicted by Strohmaier et al. Not to produce protective antibodies.

Syntetisoitiin joukko peptidejä sidottuina kantajaan, esimerkiksi KLHdin, ja syntyneitä antigeenejä ruiskutettiin eläimiin. Eläimistä saatuja vasta-aineita koestettiin sitten FMDV:n kanssa sen määrittämiseksi, oliko antigeeni antigeenisesti tehokas synnyttämään tartuttavan organismin vasta-aineita.A number of peptides bound to a carrier, for example KLHd, were synthesized and the resulting antigens were injected into the animals. Antibodies from animals were then tested with FMDV to determine if the antigen was antigenically effective in generating antibodies to the infecting organism.

Oli täysin odottamaton löydös, että niinkin suhteellisesti pieni peptidifragmentti kuoren asema-alueella noin 130:stä noin 160:een, esimerkiksi noin 20 tähdettä pitkä peptidi, kuten asemia noin 141:stä noin 160:een vastaava sekvenssi, oli erittäin antigeeninen. On tietenkin mahdotonta päätellä, onko vai ei olemassa mahdollisesti vielä enemmän antigeenisiä nukleotidisekvenssejä 56 80466 FMDV-geenissä, vaikkakaan ei ole mitään syytä ennustaa, että näin olisi. Tämän löydöksen mukaan näyttää siltä, että täysin ennustamattomalla ja hyvin yllättävällä tavalla noin 20 aminohappotähteen sekvenssi VP^-kuoren aminohappotähdesekvenssistä 130-160 näyttää olevan optimaalinen ja todennäköisesti lopullinen FMDVteen nähden monospesifinen synteettinen antigeenideter-minanttipeptidi, joskin tämä saattaa vaihdella yhden tai kahden (mahdollisesti kolmen) aminohappotähteen verran.It was a completely unexpected finding that such a relatively small peptide fragment in the position range of about 130 to about 160 in the shell, for example a peptide about 20 residues long, such as the sequence corresponding to positions from about 141 to about 160, was highly antigenic. It is, of course, impossible to conclude whether or not there are possibly even more antigenic nucleotide sequences in the 56 80466 FMDV gene, although there is no reason to predict that this would be the case. According to this finding, it appears that in a completely unpredictable and very surprising manner, the sequence of about 20 amino acid residues from amino acid sequence sequence 130-160 of the VP1 shell appears to be optimal and probably the final FMDV monospecific synthetic antigenic determinant peptide with three or two amino acid residue.

Tällä hetkellä ei tiedetä paljonko voidaan poiketa tarkasta peptidistä menettämättä rokotteen tai antigeenin erittäin odot-matonta aktiivisuutta, jonka rokotteen tai antigeenin determinantti on FMDV-monospesifinen synteettinen antigeenidetermi-nantti. Tidetään kuitenkin kokemuksesta, että (1) peptidiä voidaan pidentää muutamalla aminohappoyksiköllä, (2) voidaan tehdä ainakin yksi tai kaksi, mahdollisesti jopa neljä tai viisi substituutiota, ja (3) peptidisekvenssiä voidaan hieman lyhentää, todennäköisesti kahden tai kolmen, mahdollisesti neljän verran menettämättä keksinnön ainutlaatuisuutta. Tiedetään, että tällaiset vähemmän tärkeät poikkeamat ovat periaatteessa mahdollisia poikkeamatta esitetystä ajatuksesta ja tehdystä löydöksestä.It is currently unknown how much can be deviated from the exact peptide without losing the highly unexpected activity of a vaccine or antigen whose determinant is an FMDV monospecific synthetic antigenic determinant. However, it is known from experience that (1) the peptide can be extended by a few amino acid units, (2) at least one or two, possibly even four or five substitutions can be made, and (3) the peptide sequence can be slightly shortened, probably by two or three, possibly four without losing the invention. uniqueness. It is known that such minor deviations are in principle possible without departing from the idea presented and the finding made.

Näin ollen tällaisia vähäisempiä muunnelmia katsotaan keksinnön ekvivalenttisiksi muunnelmiksi.Accordingly, such minor variations are considered to be equivalent variations of the invention.

Tulokset osoittavat selvästi, että yksi ainoa noin kahdestakymmenestä aminohappotähteestä alueella 130-160, esimerkiksi alueella 141-160, muodostuvalla synteettisellä peptidillä suoritettu rokotus synnyttää riittävästi virusta neutraloivia vasta-aineita antaakseen suojan viruksen tartunnalta. Peptidin aikaansaama suoja on monta suuruusluokkaa suurempi kuin kuoriproteiinilla VP^ suoritetulla immunisoinnilla saadut parhaat tulokset, riippumatta siitä onko tämä tehty viruspartikkeleita hajottamalla vai puristamalla E.coli-soluista. Oletetaan todella, että pieni vapaa peptidi saattaa kyetä mukautumaan siten, että se tunkeutuu viruspartikkeliin, mikä ei ole todennäköistä kun sitä rajoittavat viereiset aminohappotähteet väärällä tavalla laskostetussaThe results clearly show that a single vaccination with a synthetic peptide of about twenty amino acid residues in the region 130-160, for example 141-160, generates sufficient virus neutralizing antibodies to provide protection against viral infection. The protection afforded by the peptide is many orders of magnitude higher than the best results obtained by immunization with the envelope protein VP1, regardless of whether this was done by disrupting or compressing viral particles from E. coli cells. Indeed, it is hypothesized that a small free peptide may be able to adapt to penetrate a viral particle, which is unlikely when it is bounded by adjacent amino acid residues in a misfolded

IIII

57 80466 VP^:ssä. Vaihtoehtoinen selitys on, että VP^:n immuunidominoi-vat alueet saattavat olla haudattuina virukseen ollen neutralointiin nähden irrelevantteja.57 80466 in VP ^. An alternative explanation is that the immunodominant regions of VP1 may be buried in the virus, being irrelevant to neutralization.

Keksinnön mukaisen synteettisen peptidin eräs selvä etu on sen aktiivisuus suojaavaan vasta-ainereaktion aikaansaamiseen nähden yhdellä ainoalla rokotuksella. Tällainen hyvä reaktio yhteen ainoaan rokotukseen on hyvin tärkeä, sillä kentällä suoritettava immunisointi suu- ja sorkkatautia vastaan on riippuvainen siitä, että rokotteet ovat riittävän tehokkaita saamaan aikaan suojaa-van reaktion yhdellä ainoalla rokotuksella. Alustavat kokeet naudan ja sikojen kanssa ovat todella osoittaneet, että synteettinen peptidi voi saada aikaan vasta-ainereaktion, joka on riittävä suojaamaan tältä taudilta.A clear advantage of the synthetic peptide of the invention is its activity over the induction of a protective antibody response by a single vaccination. Such a good response to a single vaccination is very important, as field immunization against foot-and-mouth disease depends on the vaccines being sufficiently effective to elicit a protective response with a single vaccination. Preliminary experiments with cattle and pigs have indeed shown that a synthetic peptide can elicit an antibody reaction sufficient to protect against this disease.

Teollinen sovellutus Tämän keksinnön mukaisten antigeenien ja niistä tehtyjen rokotteiden ja vasta-ainepreparaattien soveltamisella diagnostisiin ja terapeuttisiin tarkoituksiin on suuri teollinen ja taloudellinen merkitys. Eläimiä, kuten nautaa ja sikoja, ja myös ihmistä voidaan suojata Picornaviruksen aiheuttamilta ; kulkutaudeilta, kuten suu- ja sorkkataudilta ja poliolta, minkä johdosta voidaan lisätä ihmiskunnan ruuansaantia ja, mikä on tärkeätä, proteiinin saantia, ja ihmissuku voidaan vapauttaa lamauttavasta taudista.Industrial Application The application of the antigens of this invention and vaccines and antibody preparations made therefrom for diagnostic and therapeutic purposes is of great industrial and economic importance. Animals such as cattle and pigs, as well as humans, can be protected from those caused by Picornavirus; communicable diseases such as foot-and-mouth disease and polio, which can increase human food intake and, importantly, protein intake, and free the human race from crippling disease.

Edellä esitetty on tarkoitettu havainnollistamaan keksintöä rajoittamatta sitä. Voidaan suorittaa lukuisia muunnelmia poikkeamatta keksinnön ajatuksesta ja puitteista. On ymmärrettävä, että mitään rajoituksia ei ole tarkoitettu tässä esitettyihin spesifisiin peptideihin, vasta-aineisiin, niiden koostumuksiin ja käyttöön nähden eikä sellaisia rajoituksia tule soveltaa. Keksintö on määritelty oheisissa patenttivaatimuksissa.The foregoing is intended to illustrate the invention without limiting it. Numerous variations can be made without departing from the spirit and scope of the invention. It is to be understood that no restrictions are imposed on the specific peptides, antibodies, compositions and uses set forth herein, and such restrictions should not apply. The invention is defined in the appended claims.

Claims

1. Förfarande för framställning av en syntetisk, terapeu-tiskt aktiv antigenisk peptid, vars aminosyrarestsekvens tecknad frän vänster tili höger och i riktning frän amino-syraändan mot karboxyländan utgörs av följande: Val(Ser eller Gin eller X)Pro(Gly eller Y)Asn(Z)Leu(Arg eller Val)Arg(Ser eller Ala)GlyAspLeu(Met eller Phe)Gln-(Gly)Val(Thr eller Ser eller His)Leu(Ile)AlaGln(Ala eller 60 8 0 466 Pro)Lys(Arg eller Ala)Val(His)Ala(Val)Arg(Thr eller Lys)-Thr(Gln eller His)LeuPro; där varje inom parentes angivna aminosyrasekvens, X, Y eller Z envar kan ersätta den invidliggande aminosyraresten ome-delbart till vänster om parentesen, och X och/eller Y och/-eller Z i peptidens aminosyrarestsekvens självständigt betecknar avsaknad av en aminosyrarest i den invidliggande aminosyrarestens läge omedelbart till vänster om parentesen, varvid peptidens längd minskar med respektive en, tvä eller tre aminosyrarester, eller en väsentlig del därav, kännetecknat av att det innefattar stegen, där: a) man utgär frän ett olösligt harts med ett stort antal klormetylgrupper, b) hartsen förestras med Boc-(MeoBzl)-Cys-OH, c) Boc-gruppen avlägsnas för ästadkommande av en fri amino-grupp vid Cys-resten, d) den fria aminogruppen omsätts med ett överskott av en annan aminosyra, som innehäller: (i) en fri karboxylgrupp, (ii) aminogruppen är bunden tili en Boc-grupp och (iii) en reaktiv grupp är bunden tili en skyddsgrupp, varvid en amidbindning uppkommer, e) överskottet av den andra aminosyran avlägsnas, f) den sistnämnda Boc-gruppen avlägsnas för ästadkommande av en fri aminogrupp, g) stegen d), e) och f) upprepas tills en skyddad peptid syntetiserats, som förutom förstnämnda Cys-rest innehäller en sekvens av cirka tjugo aminosyrarester motsvarande en amino syrarestsekvens i VPl-skalproteinet hos mul- och klövsjukaviruset, vilken sekvens är belägen i positionerna cirka 141 tili 160 frän aminoandan räknat, h) den syntetiserade, skyddade peptiden avlägsnas frän hartset, skyddsgrupperna avlägsnas för ästadkommande av peptiden, och i) polypeptiden kopplas vid behov tili en proteinbärare och/eller oxideras. Il ei 804661. A process for producing a synthetic, therapeutically active antigenic peptide, whose amino acid residue sequence is drawn from left to right and in the direction from the amino acid end to the carboxy end is the following: Val (Ser or Gin or X) Pro (Gly or Y) Asn (Z) Leu (Arg or Val) Arg (Ser or Ala) GlyAspLeu (Met or Phe) Gln- (Gly) Val (Thr or Ser or His) Leu (Ile) AlaGln (Ala or 60 8 0 466 Pro) Lys (Arg or Ala) Val (His) Ala (Val) Arg (Thr or Lys) -Thr (Gln or His) LeuPro; wherein any amino acid sequence, X, Y or Z indicated in parentheses can each immediately replace the adjacent amino acid residue to the left of the parenthesis, and X and / or Y and / or Z in the peptide amino acid residue sequence independently denote the absence of an amino acid residue in the adjacent amino acid residue. position immediately to the left of the parenthesis, wherein the length of the peptide decreases with one, two or three amino acid residues, respectively, or a substantial portion thereof, characterized in that it comprises the steps of: a) removing from an insoluble resin with a large number of chloromethyl groups; b ) the resin is esterified with Boc- (MeoBzl) -Cys-OH, c) The Boc group is removed to provide a free amino group at the Cys residue, d) the free amino group is reacted with an excess of another amino acid containing: (i) a free carboxyl group, (ii) the amino group is attached to a Boc group and (iii) a reactive group is attached to a protecting group, whereby an amide bond is formed, e) the excess of the second amino acid is removed, f) the latter Boc group is removed to provide a free amino group, g) steps d), e) and f) are repeated until a protected peptide is synthesized which, in addition to the first Cys residue, contains a sequence of about twenty amino acid residues corresponding to an amino acid residue sequence in the VP1 shell protein of the foot-and-mouth disease virus, which sequence is located at positions of about 141 to 160 from the amino spirit count; h) the synthesized protected peptide is removed from the resin, the protecting groups are removed for the ester site, i) the polypeptide is coupled to a protein carrier and / or oxidized if necessary. Il 80806

2. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat av att, stegen d), e) och f) upprepas sä, att den erhällna sek-vensen av aminosyrarester är (a) ValProAsnLeuArgGlyAspLeuGlnValLeuAlaGlnLysValAlaArgThr-LeuPro; (b) SerArgSerGlyAspLeuGlySerlleAlaAlaArgValAlaThrGlnLeuPro; (c) SerGlyValArgGlyAspPheGlySerLeuAlaProArgValAlaArgLeuPro.2. A method according to claim 1, characterized in that, steps d), e) and f) are repeated such that the obtained sequence of amino acid residues is (a) ValProAsnLeuArgGlyAspLeuGlValLeuAlaGlnLysValAlaArgThr-LeuPro; (b) SerArgSerGlyAspLeuGlySerlleAlaAlaArgValAlaThrGlnLeuPro; (c) SerGlyValArgGlyAspPheGlySerLeuAlaProArgValAlaArgLeuPro.

3. Förfarande enligt patentkravet 1 eller 2, kännetecknat av att det dessutom bestär av stegen, där: (i) ett överskott av en skyddad Cys-aminosyra med en fri karboxylgrupp ännu fore steg (h) omsätts med den fria ami-nogruppen ur steget (g) för ästadkommande av en amidbindning sä, att en skyddad peptid med en Cys-rest bäde vid amino-och karboxyländan ästadkommes; och (ii) den efter steget (h) syntetiserade peptiden oxideras tills peptiden ej mera innehäller fri merkaptan, varvid en polymer med flera repetationsenheter erhälls, bestäende av ett flertal vid varandra medelst oxiderade Cys-rester bundna peptider.3. A method according to claim 1 or 2, characterized in that it further comprises the steps, wherein: (i) an excess of a protected Cys amino acid with a free carboxyl group is still reacted with step (h) of the free amino group from the step (g) for effecting an amide bond such that a protected peptide having a Cys residue at the amino and carboxyl ends is obtained; and (ii) the peptide synthesized after step (h) is oxidized until the peptide no longer contains free mercaptan, whereby a polymer having multiple repeating units is obtained, consisting of a plurality of bonded peptides bonded to each other.