FI79119C

FI79119C - Foerfarande foer framstaellning av en terapeutiskt anvaendbar hjaertfoermakpeptid.

Info

Publication number: FI79119C
Application number: FI850744A
Authority: FI
Inventors: Philip Needleman
Original assignee: Univ Washington
Priority date: 1984-05-04
Filing date: 1985-02-22
Publication date: 1989-11-10
Also published as: FI79119B; US4508712A; EP0162032A2; AU569776B2; IE57880B1; NO850709L; IL74426A0; EP0162032B1; DK81685A; IL74426A; JPS6127924A; DK81685D0; DK163930B; ATE68503T1; NO167295C; DE3584388D1; EP0162032A3; AU3907385A; FI850744A0; DK163930C

Description

1 79119

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen sydäneteispep- tidin valmistamiseksi

Keksinnön kohteena on menetelmä terapeuttisesti 5 käyttökelpoisen peptidin, jolla on seuraava aminohappo-sekvenssi : 5 10 15

Lys-Asn-Leu-Leu-Asp-His-Leu-Glu-Glu-Lys-Met-Pro-Val-Glu-Asp- 10 20 25 30

Glu-Val-Met-Pro-Pro-Gln-Ala-Leu-Ser-Glu-Gln-Thr-Asp-Glu-Ala- 35 40 45

Gly-Ala-Ala-Leu-Ser-Ser-Leu-Ser-Glu-Val-Pro-Pro-Trp-Thr-Gly- 15 50 55 60

Glu-Val-Asn-Pro-Ser-Gln-Arg-Asp-Gly-Gly-Ala-Leu-Gly-Arg-Gly- 65 70 75

Pro-Trp-Asp-Pro-Ser-Asp-Arg-Ser-Ala-Leu-Leu-Lys-Ser-Lys-Leu- 80 85 90

Arg-Ala-Leu-Leu-Ala-Gly-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys- 25 95 100 105

Phe-Gly-Gly-Arg-Ile-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly- 110

Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-COOH

30 tai sen fragmentin, joka sisältää em. peptidin aminohap pojen 19 - 111 sekvenssin, valmistamiseksi.

79119 2

Peptidi on sydäneteispeptidi, jolla on hyödyllinen natriureettinen, diureettinen ja verisuonia laajentava vaikutus.

On tunnettua, että eteissydänlihaksen solut nisäk-5 käissä sisältävät lukuisia membraanisidottuja varastojyvä-siä. Nämä luonteenomaiset eritysjyväset, joita on havaittu rotan, koiran, kissan ja ihmisen sydäneteisissä, muistuttavat niitä, joita on peptidiä hormonaalisesti tuottavissa soluissa [DeBold et ai., J. Histochem. Cytochem. 26 (1978), 10 ss. 1094 - 1102]. On selostettu, että eteissydänlihaksen raa'at kudosuutteet, kun niitä injektoitiin laskimonsisäisesti ei-diureettisiin rottiin, tuottivat nopean ja voimakkaan natriureettisen vasteen [DeBold et ai., Life Sciences 28 (1981), ss. 89 - 94]. Rotan sydäneteis-homogenaattien 15 osittaisen puhdistuksen lyhyellä keittovaiheella ja frak-tioinnilla Sephadeii^:llä suorittivat Trippodo et ai. [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 170 (1982), ss. 502 - 508]. Natri-ureettista vaikutusta nämä tutkijat löysivät kokonaismole-kyylipainoalueella 3 600 - 44 000 daltonia ja peptidija-20 keissa suurempien molekyylipainojen alueella 36 000-44 000 daltonia ja pienempien molekyylipainojen aluella 3 600 - 5 500 daltonia.

Rotan sydäneteisuutteita on myös fraktioitu pieni-molekyylipainoisiksi jakeiksi (alle 10 000 daltonia) ja 25 suurimolekyylipainoisiksi jakeiksi (20 000 - 30 000 daltonia), joista molemmat laukaisivat sileän lihaksen jännityksen in vitro ja olivat voimakkaita natriureettisia aineita, kun niitä annettiin laskimonsisäisesti rotille [Currie et ai., Science 221 (1983), ss. 71 - 73].

30 Muissa viimeaikaisissa julkaisuissa joukko tiedemie hiä on esittänyt erilaisia molekyylipainoltaan pieniä ja keskisuuria natriureettisia sydäneteispeptidejä, joissa on aminohapposekvenssejä alueelta n. 19 - 59 aminohappoa. Siten DeBold et ai., Fed. Proc. 42 (3), Abstract 1870 35 (1983), s. 611, esittävät natriureettisen sydäneteispep- 3 79119 tidin, jonka molekyylipaino on 5 150 daltonia ja sekvenssi 47 aminohappoa, ja jolle tutkijat antoivat nimeksi "Car-dionatrin I", puhdistamisen. Kolme lisähuippua natriureet-tiselle aktiivisuudelle saatiin suurtehonestekromatogra- 5 fia(HPLC)-menetelmillä.

Eräässä myöhemmässä julkaisussa Grammer et ai. [Biochem. Biophys. Res. Commun. 116 (2), Lokakuun 31. 1983, ss. 696 - 703] esittävät rotan sydäneteisnatriureettisen tekijän, jonka molekyylipaino on n. 3 800 ja joka sisältää 10 36 aminohappotähdettä, osittaisen puhdistamisen.

Vielä tuoreemmissa julkaisuissa esittävät Flynn et ai. [Biochem. Biophys. Res. Commun. 117 (3), Joulukuun 28. 1983, ss. 859 - 865] ja Kangawa ja Matsuo, Ibid. 118 (1), Tammikuun 13. 1984, ss. 131 - 139] rotan ja vastaavas-15 ti ihmisen natriureettisia sydäneteispeptidejä, joilla on 28 aminohapon sekvenssit.

Thibault et ai. [FEBS Letters 167 (1984), ss. 353-356] esittävät keskimolekyylipainoisen natriureettisen sydäneteispeptidin, jossa on 73 aminohappoa, puhdistamisen; 20 ja Kangawa et ai. [Biochem. Biophys. Res. Commun. 119 (3) (1984), ss. 933 - 940] esittävät keskimolekyylipainoisen beeta-rotan natriureettisen sydäneteispeptidin, jossa on 48 aminohappoa, puhdistamisen.

Hakijan US-patenteissa 4 496 544 ja 4 557 864 esite-25 tään sydäneteispeptidejä, joilla on pieni molekyylipaino ja joissa on n. 19 - n. 24 aminohappoa. Monia näistä peptideistä on edelleen esittänyt tutkimusryhmä, jota johti tämän keksinnön keksijä [Currie et ai., Science (1984), ss. 67 - 69].

4 79119

Keksinnön mukaisesti valmistetun peptidin rakenne-kaavassa aminohappokomponentit merkitään tavanomaisin lyhentein seuraavasti:

Aminohappo Lyhenne 5 L-alaniini Ala L-arginiini Arg L-asparagiinihappo Asp L-asparagiini Asn L-kysteiini Cys 10 L-glutamiinihappo Glu L-glutamiini Gin

Glysiini Gly L-histidiini His L-isoleusiini Ile 15 L-leusiini Leu L-lysiini Lys L-metioniini Met L-fenyylialaniini Phe L-proliini Pro 20 L-seriini Ser L-treoniini Thr L-tryptofaani Trp L-tyrosiini Tyr L-valiini Vai 25

Kyseinen peptidiaines on eristetty osittain puhdistetussa muodossa, jota ei esiintynyt rotan sydänlihaksessa, josta se aluksi saatiin; ts. se on valmistettu muotoon, joka on pääasiallisesti vapaa pienimolekyylipainoisista 30 peptideistä ja muista solukomponenteista ja kudosainekses-ta. Tällä uudella sydäneteispeptidillä on fysiologisia ominaisuuksia, jotka johdattavat mieleen, että se on tärkeä lääketieteelle sydäneteisten umpierityssysteemin tutkimuksessa nesteaineiden suhteen solunulkoisen tilavuuden, 35 natriumin ja verisuonivastuksen moduloimiseksi.

5 79119

Erityisesti tämän keksinnön mukaisesti valmistetulla peptidillä on terapeuttista käyttöä diureettisena, natri-ureettisena, munuaisverisuonia laajentavana ja sileän lihaksen jännitystä laukaisevana aineena; ts. sillä on 5 vaikutus natriumiin, virtsan tilavuuteen, munuaisverisuo-nien laajentumiseen ja sileän lihaksen jänteyteen.

Lyhyesti esitettynä tämä uusi peptidi on saatu fraktioimalla rotan sydäneteisuutteita geelisuodatuskroma-tografiällä antamaan suuri- ja pienimolekyylipainoinen 10 jae, joista kummallakin on hyödyllinen natriureettinen vaikutus.

Pienimolekyylipainoinen jae erotettiin ja puhdistettiin useaksi pienimolekyylipainoiseksi natriureettiseksi sydäneteispeptidiksi, kuten tämän keksinnön keksijän edellä 15 mainituissa US-patenteissa on selostettu.

Suurimolekyylipainoinen jae (atriopeptigeeni-APG), joka saatiin edellä mainitulla rotan sydäneteisuutteiden geelisuodatuskromatografiällä, fraktioitiin tämän keksinnön mukaisesti isoelektrisellä fokusoinnilla ja käänteisfaasi-20 HPLC:lla osittain puhdistetun APG:n saamiseksi. Osittain puhdistetun suurimolekyylipainoisen jakeen syaanibromidi-uutteiden puhdistamisesta oli tuloksena yksinkertaisen biologisesti aktiivisen syaanibromidipilkkoutumispeptidin eristäminen, jossa peptidissä on 93 aminohappoa, jotka 25 ovat aminohapot 19 - 111 edellä mainitusta APG:stä. Näiden peptidien sekvenssianalyysit yhdessä viimeaikaisten selostusten kanssa keskimolekyylipainoisten sydäneteispeptidien sekvenssianalyyseistä [Thibault et ai., FEBS Letters 167 (1984), ss. 352 - 356; ja Kangawa et ai., Biochem. Biophys. 30 Res. Commun. 119 (1984), ss. 933 - 940] antavat edellä mainitun 111 tähteen APG:n täydellisen primäärisen rakenteen.

6 79119 Tässä seuraa keksinnön edullisten suoritusmuotojen kuvaus yksityiskohtaisesti.

Geelisuodatuskromatografiällä on rotan sydäneteis-uutteiden natriureettista ja diureettista aktiivisuutta 5 havaittu suurimolekyylipainoisissa (20 000 - 30 000) ja pienimolekyylipainoisissa (alle 10 000) jakeissa, joilla on myös sileän lihaksen jännitystä laukaiseva vaikutus in vitro (1). Trypsiinin osittaisproteolyysin vaikutuksen perusteella pääteltiin, että suurimolekyylipainoinen jae 10 on pienimolekyylipainoisen jakeen prekursori. Suurimolekyy-lipainoisen jakeen trypsiinikäsittely lisäsi merkittävästi spasmolyyttistä vaikutusta. Aktiiviset tuotteet, jotka kulkevat yhdessä pienimolekyylipainoisen jakeen kanssa geelisuodatuksessa (2), ovat atriopeptiinejä I, II ja III 15 (3) käänteisfaasi-HPLC:n mukaan. Siten suurimolekyylipai- noisen jakeen aktiiviset komponentit on nimetty atriopep-tigeeneiksi (APG), atriopeptiinien prekursoreiksi (AP), pienimolekyylipainoisiksi bioaktiivisiksi sydäneteispep-tideiksi. Nämä atriopeptiinit käsittävät seuraavat osasek-20 venssit täydestä 111 aminohapon atriopeptigeenistä, kuten on selostettu keksijän edellä mainituissa US-patenteissa: AP 1 = aminohapot 88 - 108, AP II aminohapot 88 - 119, ja 25 AP III = aminohapot 88 - 111

Suurimolekyylipainoisten sydäneteispeptidien ja niiden johdannaisten puhdistuksessa suoritettiin jokaisen jakeen sileälihasbioanalyysi aktivoimisen jälkeen osit-30 täisellä trypsiiniproteolyysillä (1, 2). Aktiiviset jakeet sisältävät pienimolekyylipainoisten atriopeptiinien sekvenssin (3). Ensimmäisenä vaiheena suurimolekyylipainoisen jakeen (saatu G-75 Sephade^-kromatograf iällä) puhdistuksessa oli isoelektrinen fokusointi, joka osoitti jakeen 35 olevan bioaktiivisten lajien seos (näennäiset isoelektriset 7 79119 pisteet pH-arvoissa 4,91, 5,01, 5,17, 5,34 ja 6,03). Bioaktiivisten lajien pääosa (pH välillä 4,6 - 5,4) saatettiin, amfolyyttien ja sakkaroosin poistamisen jälkeen, käänteisfaasi-HPLCraan. Tyypillinen kromatogrammi osoitti 5 kasautuneiden bioaktiivisten peptidien moniaineista seosta 31 ja 34 % asetonitriilillä. Näistä yksi vallitseva komponentti oli riittävän puhdas geelianalyysin mukaan (näennäinen molekyylipaino 17 000) ja se valittiin atriopep-tigeeniksi lisäpuhdistamista ja luonnehdintaa varten.

10 Ottaen huomioon atriopeptigeenien monimutkaisuus verrattuna niistä johdettujen antriopeptiinien ainoaan sekvenssiin, pääteltiin, että atriopeptigeenit voivat vuorostaan olla jonkun suuremman peptidin johdannaisia. Näin ollen tutkittiin kemiallisen pilkkoutumisen vaikutuk-15 set. Valittiin syaanibromidipilkkoutuminen, mikä johtuu metiotiinin puuttumisesta pienimolekyylipainoisen atrio-peptiinin sekvenssistä (5). Syaanibromidipilkkoutuminen tapahtuu atriopeptigeenin täyden 111 aminohapon sekvenssin asemassa 18 olevan metioniinin kohdalla, jolloin saadaan 20 suurimolekyylipainoinen 93 aminohappoa käsittävä peptidi- fragmentti. Aloitusvaihe suurimolekyylipainoisen kokonais-jakeen syaanibromidiuutteen fraktioinnissa antoi bioaktiivisen aineksen (löytyi 30 - 31 % asetonitriilillä), joka puhdistettiin käänteisfaasi-HPLC:llä antamaan HPLCrn mukai-25 sesti yksi ainoa komponentti, jonka näennäinen molekyyli-paino oli 9 500 geelielektroforeesilla.

Sekvenssitiedot kummallekin peptidille esitetään seuraavassa. Näiden peptidien sekvenssien limittäminen Thibault'in et ai., FEBS Letters 167 (1984), ss. 352- 30 356 ja Kangawa'n et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun.

119 (1984), ss. 933 - 940 sekvenssien kanssa antaa 111 tähteen atriopeptigeenin primäärisen rakenteen. C-pääteana-lyysien tulokset ovat yhtäpitäviä tämän kanssa. APG:n karboksipeptidaasikäsittely poisti nopeasti Phe:n vapaut-35 tamatta havaittavaa Tyr:a tai Arg:a. Toisaalta syaanibro- 8 79119 midipilkkoutumispeptidin samanlainen käsittely vapautti nopeasti Tyr:n, Arg:n ja Phe:n (taulukko I), osoittaen siten, että tämä valmiste koostuu kolmesta peptidistä, joilla on samat sekvenssit, jotka päättyvät Tyrissä, 5 Argissa ja Pheissä.

Tämä 111 aminohappotähteen sekvenssi yhdistää C-päätteellään pienimolekyylipainoiset peptidit, jotka on äskettäin selostettu (alleviivattuina seuraavassa sekvenssissä) yhdessä parin emäksisen aminohappotähteen kanssa 10 (tässä tapauksessa Arg-Arg), jotka tyypillisesti muodostavat pilkkoutumiskohdan erittyneiden peptidien ja proteiinien erilaisissa prekursoreissa.

9 79119 5 10 15

Lys-Asn-Leu-Leu-Asp-His-Leu-Glu-Glu-Lys-Met-Pro-Val-Glu-Asp- A

20 20 30

Glu-Val-Met-Pro-Pro-Gln-Ala-Leu-Ser-Glu-Gln-Thr-Asp~Glu-Ala- A

Pro-Pro-Gln-Ala-Leu-Ser-Glu-Gln-Thr-Asp-Glu-Ala- B

35 40 45

Gly-Ala-Ala-Leu A

Gly-Ala-Ala-Leu-Ser-Ser-Leu-Ser-Glu-Val-Pro-Pro-Trp-Thr-Gly- B

Glu-Val-Pro-Pro-Trp-Thr-Gly- C

50 55

Glu-Val-Asn-Pro-Ser-Gln-Arg-Asp-Gly-Gly-Ala-Leu- B

Glu-Va1-Asn-Pro-Ser-Gln-Arg-Asp-Gly-Gly-Ala-Leu-Gly-Arg-Gly- C

65 70 75

Pro-Trp-Asp-Pro-Ser-Asp-Arg-Ser-Ala-Leu-Leu-Lys-Ser-Lys-Leu- C

Pro-Ser-Asp-Arg-Ser-Ala-Leu-Leu-Lys-Ser-Lys-Leu- D

80 85 90

Arg-Ala-Leu-Leu-Ala-Gly-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys- C

... Arg-Ala-Leu-Leu-Ala-Gly-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys- D

95 100

Phe-Gly-Gly-Arg-Ile-Asp C

Phe-Gly-Gly-Arg-Ile-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Glv- D

HO

Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-COOH D

10 791 1 9

Edellisessä 111 aminohapon atriopeptigeenin täydellinen primäärinen rakenne johdettiin: A:sta, atriopeptigeenin 34 ensimmäisen tähteen aminohapposekvenssistä, 5 B:stä, syaanibromidipilkkoutumispeptidin 39 ensimmäisen tähteen aminohapposekvenssistä, C:stä, "natriureettisen sydäneteistekijän välituote Mr -muodon" aminohapposekvenssistä (11), ja D:stä, "beeta-rotan natriureettisen sydäneteispolypeptidin" 10 täydellisestä aminohapposekvenssistä (12).

Taulukko I

Syaanibromidipilkkoutumispeptidin karboksyylipääte-15 sekvenssin analyysi

Aminohappo- pmoolia tuotetta tähde 20 s 2 min 10 min 60 min 20 Tyr 10 18 45 62

Arg 23 26 55 74

Phe 26 27 65 89 25 Seuraava esimerkki kuvaa suurimolekyylipainoisen (20 000 - 30 000) jakeen edellä esitetyn komponentin (111 aminohappoa) ja tästä jakeesta johdetun syaanibromidipep-tidifragmentin (93 aminohappoa) puhdistamista ja osittais-luonnehdintaa ja lisäksi kuvataan natriureettista, diureet-30 tista ja verisuonia laajentavaa vaikutusta.

Esimerkki

Atriopeptigeenin valmistus

Valmistettiin uute 1200 rotan sydäneteisistä ja kromatografoitiin G-75 Sephadei^:llä yleisellä menetelmäl-35 lä, kuten edellä selostettiin (3).

n 79119

Suurimolekyylipainoinen jae lyofilisoitiin, liuotettiin pH:ltaan 4-6 Ampholind^-kantaja-amfolyytteihin (LBK Instruments Inc., Rockville, Maryland) ja elektrofokusoi-tiin 110 ml:n sakkaroositiheysgradienttipylväässä (LBK) 5 1000 V:lla 40 tuntia (4). Pylväs tyhjennettiin sitten nopeudella 48 ml/h ja kerättiin 2 ml:n jakeita. pH-määri-tyksen jälkeen py1väsjakeiden tasaosien (50μ1) pH säädettiin arvoon 8 lisäämällä 450 μΐ 0,1 M tris-puskuria (pH 8,4) ja inkuboitiin trypsiinin kanssa (Sigma Chemical Co., 10 St. Louis, Missouri; 1 yksikkö/ml) 1 tunti 22°C:ssa. Nämä preparaatit analysoitiin kananpojan peräsuolen jännityksen laukaisuaktiivisuuden suhteen yleisellä menetelmällä, kuten aikaisemmin on selostettu (1, 2). Yhdistetyt pylväsjakeet (pH 4,5 - 5,4), jotka sisältävät bioaktiivisuuden pääosan 15 (n. 30 ml), kromatografoitiin G-50 Sephadea^:llä (80 x 2,7 cm) 0,5 M etikkahapossa amfolyyttien ja sakkaroosin poistamiseksi. Pakkaskuivaamisen jälkeen tämä aines saatettiin käänteisfaasi-HPLC:aan käyttäen Brownlee RP-300 Aquapordt-pylvästä ja aikaisemmin selostettua liuotinsys-20 teemiä (3). Gradientti käsitti (a) 0 - 24 % A 8,8 minuuttia, (b) 24 - 28 % A 25 minuuttia, (c) 28 - 36 % A 100 minuuttia. HPLC-pylväsjakeiden tasaosia (50μ1) kuivattiin tyhjössä, koottiin 500 pl:aan 0,1 M tris, pH 8, trypsinoi-tiin ja bioanalysoitiin kuten edellä.

25 Syaanibromidipeptidin valmistus suurimolekyylipai- noisesta jakeesta

Lyofilisoitu suurimolekyylipainoinen jae, joka oli saatu kromatografiällä G-75 Sephadeji® : 11a 600 rotan sydämen eteisten (1, 3) uutteesta liuotettuna 10 ml:aan 70-%:ista 30 muurahaishappoa, lisättiin 500 mg:aan syaanibromidia (Eastman Organic Chemicals, Rochester, N.Y.) lasitulppaputkesse (5). 16 tunnin kuluttua 22°C:ssa lisättiin 90 ml vettä ja liuos lyofilisoitiin. Jäännös saatettiin käänteisfaasi-HPLC:aan käyttäen edellä selostettua systeemiä, käyttäen 35 (a) 0 - 27,2 % A 10 minuuttia, mitä seurasi (b) 27,2 - 32 % i2 791 1 9 A 60 minuuttia. Bioaktiiviset jakeet, jotka saatiin 29,6- 31,2 %:lla A, haihdutettiin tyhjössä kuiviin ja puhdistettiin toisen pöytäkirjan mukaisesti käyttäen liuottimen A' (0,l-%:inen trifluorietikkahappo propanoli-l:ssä) ja liuot-5 timen B (0,l-%:inen trifluorietikkahappo vedessä) seosta nopeudella 0,67 ml/min, käsittäen a) 0 - 15 % A’ 5 minuuttia, mitä seurasi b) 15 - 24 % A' 90 minuuttia. Bioaktiiviset jakeet 22 - 22,5 %:lla A') haihdutettiin tyhjössä kuiviin ja saatettiin sitten kolmannen pöytäkirjan mukai-10 seen prosessiin käyttäen liuottimia A" (0,085-%:ista fos-forihappoa propanoli-1:ssä) ja B" (0,085-%:ista fosforihap-poa vedessä) nopeudella 0,67 ml/min, käsittäen 0 - 50 % A", 50 minuuttia. Bioaktiivinen tuote (saatu 32,1 %:lla A") vietiin sitten HPLC:n läpi uudelleen kahdesti käyttäen 15 toista edellisistä pöytäkirjoista, jolloin lopuksi saatiin 110 pg (proteiinia) yhtä ainoata bioaktiivista komponenttia (havaittu 215 nm:ssä) 22,1 %:lla A’.

Peptidien analyysi

Aminohappoanalyysi suoritettiin hydrolysoimalla 1 20 nmooli peptidiä 6-n HCl:ssä 22 tunnin aikana 110°C:ssa. Hydrolysaatti lyofilisoitiin ja saatettiin Waters-aminohap-po-analyysisysteemiin käyttäen o-ftaalialdehydi-esikolonni-derivitisaatiota (6), mitä seurasi käänteisfaasi-HPLC.

Peptidisekvenssointi - N-päätesekvenssointi suori-25 tettiin 2-4 moolilla peptidiä peräkkäisellä Edman-degra-: daatiolla käyttäen Applied Biosystems model 470A-kaasufaa-

sisekvenssoijaa (7) havaiten fenyylitiohydantoiinijohdannaiset HPLC:llä (8). Keskimääräiset toistuvat saannot ylittivät 93 %. C-päätesekvenssointi suoritettiin lisäämäl-30 lä karboksipeptidaasi Y:tä (2pg, 20 μΐ, Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA) 1-2 nmooliin peptidiä liuotettuna 280 pl:aan 50 nM natriumasetaattipuskuria, pH

5,5. Väliajoin lisättiin 50 μ1:η tasaosia 25 pl:aan l-%:ista trifluorietikkahappoa (9) ja vapautuneet aminoha-35 pot määritettiin aminohappoanalyysillä (kuten edellä).

i3 791 1 9

Geelianalyysi - Peptidien (1 - 2 pg) elektroforeesi suoritettiin 15-%:isella polyakryyliamidigeelillä (0,4 % bis-akryyliamidia) Laemmli'n mukaisesti (10). Geeliä värjättiin 0,8-%:isella hopeanitraatilla 20 minuuttia, pestiin 5 ja kehitettiin liuoksella, jossa oli 0,005 % sitruunahappoa ja 0,2 % formaldehydiä.

Yhdisteiden terapeuttinen vaikutus

Syaanibromidi-suurimolekyylipainoista rotan sydän-eteispeptidiä, joka oli puhdistettu kuten edellä esimerkis-10 sä selostettiin, testattiin natriureettisen aktiivisuuden suhteen koirissa.

Suurimolekyylipainoista peptidiä annettiin ruiskeena joko yksinään tai trypsiinikäsittelyn jälkeen. Trypsiini-inkubointi (1 yksikkö/ml) suoritettiin 60 minuutissa huo-15 neen lämpötilassa 100 pg:n kanssa puhdistettua syaanibro-midi-suurimolekyylipainoista peptidiä. Atriopeptiini I.*tä ja II:ta saatiin firmasta Peninsula Labs., San Carlos, Kalifornia, USA. Atriopeptiini III:a ja Ser-Leu-Arg-Arg-Atriopeptiinin III:a (Flynn et ai.-peptidi, Viite 13) 20 syntetisoitiin automaattisella peptidisynteesillä.

Sekarotuisia koiria (kumpaakin sukupuolta) nukutettiin laskimonsisäisesti pentobarbitaalinatriumilla (30 mg/kg). Suoritettiin kyljen avaus oikean munuaisen vat-sakalvontakaista paljastusta varten. Virtsanjohdin kanyloi-25 tiin PE160 (Clay Adams)-putkella, joka oli yhdistetty jakeen kerääjään virtsan talteenottamiseksi. Sähkömagneettinen virtausanturi (läpimitta 8 mm; Carolina Instruments) pantiin oikean munuaisvaltimon ympärille munuaisverivir-tauksen mittaamiseksi. 22 kaliiperin neula (liitetty PE50-30 putkeen ja ruiskuun) pantiin väliin munuaisvaltimoon virtausanturin yläpuolelle. Koira sai tiputuksena jatkuvasti suolaliuosta (0,9 % NaCl) nopeudella 1,3 ml/min. Virtsanäytteitä kerättiin 5 minuutin välein ja analysoitiin tilavuuden, natriumin, kaliumin ja osmoottisuuden suhteen.

i4 791 1 9

Peptidejä annettiin ruiskeena (valtimonsisäisesti munuaisvaltimoon) 30 minuutin välein.

Tulokset

Suurimolekyylipainoinen (syaanibromidi)peptidi 5 aiheutti väkevyydestä riippuvan diureesin, joka ei merkitsevästi muuttunut trypsinoinnilla. Kynnysvaste (50 %:n lisäys virtsan tilavuudessa) saavutettiin 0,3 nmoolilla, kun taas 450 %:n lisäys virtsavirtauksessa saavutettiin 3 nmoolilla. Vertailu peptidimäärään, joka tarvittiin aikaan-10 saamaan 200 %:n lisäys virtsan tilavuuteen, osoittaa, että Ser-Leu-Arg-Arg-APIII vaatii 0,3 nmoolia, suurimolekyylipainoinen + trypsiini vaatii 0,5 nmoolia, suurimolekyylipainoinen yksinään 0,7 nmoolia, atriopeptiini II ja III vaativat 10 nmoolia; ja 30 nmoolia antiopeptiiniä I lisäsi 15 virtsatilavuutta ainoastaan 50 %:lla. Tehokkuuden arvojärjestys laajentamiselle vertaamalla annosta, joka tarvitaan aikaansaamaan 20 ml/min lisäys munuaisverivirtaukseen, on seuraava: Ser-Leu-Arg-Arg-APIII vaatii yhden nmoolin, syaanibromidi-suurimolekyylipainoinen peptidi (trypsiini-20 esikäsittelyllä tai ilman sitä) vaatii 2 nmolia, atriopeptiini III vaatii 8 nmoolia, atriopeptiini II vaatii 17 nmoolia; kun taas 30 nmoolia atriopeptiini l:tä aikaansai vain 6 ml/min muutoksen munuaisverivirrassa. Jokaista peptidiä testattiin 3-5 eri koirassa.

25 Yhteenvetona suurimolekyylipainoisen atriopeptigee- nin puhdistetun syaanibromidifragmentin suora injektointi aikaansai voimakkaan diureetin, joka on erotettavissa tehokkaimmilla pienimolekyylipainoisilla peptideillä aikaansaadusta. Tämä heijastaa peptidin silmänräpäyksellistä 30 muuttumista munuaisissa tai munuaisten suoraa ehyen peptidin tunnistamista. Erilaisuus peptidien tehokkuuden arvojärjestyksessä munuaisverisuonien laajentumisena natri-ureesia vastaan johdattaa mieleen, että nämä vasteet ovat erillisten reseptorien välittämiä. Pääasiallisesti saman-35 lainen diureesi saatiin, kun osittain puhdistettua 111 1R 79119 ίο aminohapon atriopeptigeeniä (ennen syaanibromidipilkkoutu-mista) testattiin koirissa.

Seuraavat kirjallisuusviitteet, jotka on mainittu edellä esitetyssä keksinnön yksityiskohtaisessa selityk-5 sessä julkaistujen menetelmien esittämiseksi, esitetään tässä vertailua varten.

Kirjallisuusviitteet 1) Currie et ai., Science 221 (1983), ss. 71 -73 2) Currie et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 81 (1984), ss.

10 1230 - 1233 3) Currie et ai., Science 223 (1984), ss. 67 - 69 4) Geller et ai., Biochem. J. 127 (1972), ss. 865 - 874 5) Gross and Witkop, J. Biol. Chem. 237 (1962), ss. 1856-1860 15 6) Hill et ai., Anal. Chem. 51 (1979), ss. 1338 - 1341 (?) 7) Hunkapiller et ai., Methods Enzymol. 91 (1983), ss.

399 - 413 8) Hunkapiller and Hood, Ibid., ss. 486 - 493 9) Hayashi, Methods Enzymol. 47 (1977), ss. 84 - 93 20 10) Laemmli, Nature 227 (1970), ss. 680 - 685 11) Thibault et ai., FEBS Letters 167 (1984), ss. 352 - 356 12) Kangawa et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun, 119 (1984), ss. 933 - 940 13) Flynn et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun 117 (1983), 25 ss. 859 - 865.

Claims

16 79 1 1 9

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin, jolla on seuraava aminohapposekvenssi: 5 5 10 15 Lys-Asn-Leu-Leu-Asp-His-Leu-Glu-Glu-Lys-Met-Pro-Val-Glu-Asp- 20 25 30 Glu-Val-Met-Pro-Pro-Gln-Ala-Leu-Ser-Glu-Gln-Thr-Asp-Glu-Ala- 10 35 40 45 Gly-Ala-Ala-Leu-Ser-Ser-Leu-Ser-Glu-Val-Pro-Pro-Trp-Thr-Gly- 50 55 60 Glu-Val-Asn-Pro-Ser-Gln-Arg-Asp-Gly-Gly-Ala-Lcu-Gly-Arg-Glv- 15 65 70 75 Pro-Trp-Asp-Pro-Ser-Asp-Arg-Ser-Ala-Leu-Leu-Lys-Ser-Lys-Leu- 80 85 90 20 Arg-Ala-Leu-Leu-ALa-Gly-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys- 95 100 105 Phe-Gly-Gly-Arg-Ile-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly- 25 110 Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-COOH tai sen fragmentin, joka sisältää em. peptidin aminohappojen 19 - 111 sekvenssin, valmistamiseksi, tunnet-t u siitä, että 30 a) nisäkkään sydäneteisuutteita fraktioidaan an tamaan suuren molekyylipainon ja pienen molekyylipainon omaavat fraktiot, b) suuren molekyylipainon omaava fraktio fraktioidaan atriopeptigeenin, jolla on edellä esitetty 11 amino-35 hapon sekvenssi, saamiseksi, ja haluttaessa 17 791 1 9 c) atriopeptigeeni hajotetaan syaanibromidilla ja syaanibromidiuutteesta eristetään atriopeptigeenin fragmentti, joka sisältää aminohappojen 19 - 111 sekvenssin,

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että kohdan a) fraktiointi suoritetaan geelisuodatuksen avulla.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohdan b) fraktiointi suoritetaan isoelektrisen fokusoinnin ja käänteisfaasi-HPLC:n 10 avulla. 18 791 1 9