FI77939C - Askorbatstoerningsfri komposition, anordning och foerfarande foer bestaemning av peroxidativt aktiva substanser. - Google Patents

Description

1.1 1 77939

Askorbaattihäiriötön koostumus, väline ja menetelmä perok-sidatiivisesti aktiivisten aineiden määrittämiseksi Tämä keksintö koskee yleisesti peroksidatiivisesti 5 aktiivisten aineiden analyyttistä määrittämistä testinäyt-teistä ja erityisesti se koskee koostumusta, koestinta, välinettä ja menetelmää, joita voidaan käyttää tällaisissa määrityksissä ja joihin näytteessä mahdollisesti oleva as-korbiinihappo ei vaikuta häiritsevästi.

10 Tällä hetkellä on tarjolla useita analyyttisiä mene telmiä peroksidatiivisesti aktiivisten aineiden toteamiseksi biologisista näytteistä, kuten virtsasta, ulostesuspen-sioista ja ruoansulatuskanavan sisällöstä. Esim. hemoglobiini ja sen johdannaiset, jotka määritetään tavanomaisin 15 piiloveritestein, ovat tyypillisiä peroksidatiivisesti aktiivisia aineita, koska ne toimivat samalla tavoin kuin per-oksidaasientsyymi ja tästä syystä niitä kutsutaankin joskus pseudoperoksidaaseiksi. Peroksidatiivisesti aktiiviset aineet muistuttavat entsyymejä, koska ne pystyvät katalysoi-20 maan redoksreaktioita, jotka tapahtuvat peroksidien tai vetyperoksidien ja indikaattoriyhdisteiden, kuten bentsi-diinin, o-tolidiinin, 3,3',5,5'-tetrametyylibentsidiinin, 2,7-diaminofluoreenin ja vastaavien välillä, jolloin syntyy havaittavissa oleva vaste, esim. värinmuutos. Niinpä 25 useimmat menetelmät piiloverenvuodon toteamiseksi testi-näytteistä perustuu tähän pseudoperoksidaasiaktiivisuuteen.

On kehitetty lukuisia analyyttisiä menetelmiä peroksidatiivisesti aktiivisten aineiden määrittämiseksi, jotka perustuvat väriä muodostavien indikaattorien peroksidatii-30 visen hapettamisen entsymaattiseen katalysoimiseen. Nämä menetelmät muodostuvat lähinnä märkäkemiasta eli liuosme-nettelyistä ja ns. "kasta ja lue" -tyyppisistä, reagenssi-pitoisista liuskavälineistä. Tyypillisen esimerkin ensiksi mainituista ovat kuvanneet R.M. Henry et ai., Clinical 35 Chemistry Principles and Techniques, 2nd ed., 1124-1125 (Hagerstown, Maryland: Harper and Row, 1974). Tässä 2 77939 esimerkkimenetelmässä käytetään jääetikkaa (puskuri), di-fenyyliamiinia (indikaattori) ja vetyperoksidia. Joskin tällaiset märkäkemiamenettelyt ovat osoittautuneet analyyttisesti käyttökelpoisiksi, niihin liittyy useita haittoja, 5 joista mainittakoon reagenssin huono säilyvyys ja riittämätön herkkyys.

Toisessa menetelmässä peroksidatiivisesti aktiivisten aineiden määrittämiseksi, jota useimmat sairaala-analyytikot käyttävät tällä hetkellä, käytetään ns. "kasta ja lue" 10 -reagenssiliuskavälinettä. Tyypillinen tällainen "kasta ja lue" -väline on kaupallisesti saatavissa valmistajalta Ames Division of Miles Laboratories, Inc. kauppanimellä

O

HEMASTIX . Tämä väline muodostuu huokoisesta paperikanta-jasta, joka on kyllästetty orgaanisen vetyperoksidin ja in-15 dikaattorin puskuroidulla seoksella ja kiinnitetty tarttu-mispäänä toimivaan muoviliuskaan. Kastettaessa kantaja nesteeseen, joka sisältää hemoglobiilia, myoglobiinia, erytrosyyttejä tai muita peroksidatiivisesti aktiivisia aineita, kuten pseudoperoksidaaseja, kantajassa kehittyy sininen väri, 20 jonka intensiteetti on verrannollinen näytteessä olevan aineen konsentraatioon. Vertaamalla kantajassa kehittynyttä väriä standardiväriasteikkoon analyytikko pystyy määrittämään puolikvantitatiivisesti näytteessä olevan määritettävän aineen määrän.

25 Märkäkemiamenettelyihin verrattuna tällaisten rea- genssiliuskojen ensisijaiset edut ovat 1) liuskamuotoa on helpompi käyttää ja se ei edellytä reagenssien valmistusta eikä oheislaitteistoa ja 2) liuskamuoto edellyttää reagens-seilta suurempaa stabiilisuutta ja siten tarkkuus, herkkyys 30 ja taloudellisuus ovat parempia.

Riippumatta siitä, kummallako yllä kuvatulla tavalla peroksidatiivisesti aktiiviset aineet määritetään, molempiin liittyy erottamattomasti sama ongelma eli häiriö, joka johtuu näytteessä olevista pelkistimistä yleensä ja erityisesti 35 askorbiinihaposta tai askorbaatti-ionista (jota seuraavassa kutsutaan askorbaattihäiriöksi). Esim. analysoitaessa 3 77939 virtsaa nykyään suosittu ravinto, joka sisältää suuria määriä C-vitamiinia (askorbiinihappoa), on aiheuttanut vakavia askorbaattihäiriöongelmia määrättyjen virtsakompo-nenttlen, esim. piiloveren, määrityksissä. Tällaista ravin-5 toa nauttivien potilaiden virtsan askorbaattipitoisuus on tunnusomaisesta kohonnut.

Pelkistimien, kuten askorbaatin haittavaikutukset havaittiin jo vuonna 1938. R. Kohn ja R.M. Watrous, Journal of Biological Chemistry, 124, 163-168 (1938). Sama ongelma 10 vaivaa vieläkin tätä diagnostisen analytiikan osa-aluetta, mikä ilmenee ehdotuksesta vuodelta 1979, jonka mukaan samanaikaisesti piiloveren (joka on eräs pseudoperoksidaasi) analysoinnin kanssa olisi analysoitava askorbaatti piiloveren-määrityksen tarkkuuden parantamiseksi. L. Nielsen, P.J.

15 Jorgensen ja A. C. Hansen, Ugeskrift for Laeger, 141, 791-793 (1979) .

Kirjallisuudessa on kuvattu useita yrityksiä askor-baattihäiriön poistamiseksi testisysteemeistä, esim. glukoo-siherkkiä reagensseja sisältävistä systeemeistä. Glukoosi-20 herkissä määrityksissä on pyritty mm. poistamaan askorbaatti suodattamalla ennen kuin se joutuu kosketukseen rea-crenssien kanssa tai käyttämällä entsyymiä, joka hajottaa askorbaatin in situ.

Niinpä Dahlqvistin kanadalaisessa patentissa nro 25 844 564 julkistetaan väline glukoosin määrittämiseksi virt sasta tai muista väliaineista, jossa on huokoinen, normaaleilla glukoosille reagoivilla reagensseilla kyllästetty osa ja sen lisäksi osa, joka vastaanottaa testattavan virtsanäytteen. Näytteen vastaanottava osa muodostuu ioninvaih-30 tomateriaalista, jonka ainoana tehtävänä välineessä on adsorboida virtanäytteessä oleva askorbaatti.

Danningerin ja työryhmän US-patentissa nro 4 168 205 ehdotetaan askorbaattioksidaasientsyymin liittämistä testi-reagenssiformulaattiin. Tällöin askorbaattioksidaasi hapet-35 taa entsymaattisesti näytteessä olevan askorbaatin dehydro-askorbaatiksi eli yhdisteeksi, joka ei häiritse analyysiä.

4 77939

Toinen yritys askorbaattihäiriön vähentämiseksi ilmenee japanilaisesta väliaikaisesta patenttijulkaisusta nro 55757/1983, Jugi Zoki Seiyaki K.K. Tässä julkaisussa julkistetaan erilaisten ligandien, kuten etyleenidiamiinitetra-5 etikkahapon ja dietyleenitriamiinipentaetikkahapon muodostamien metallikelaattien käyttö näytteen esikäsittelemiseksi, josta sitten määritetään kolesteroli, glukoosi tai muita komponentteja, kuten virtsahappo.

Ku'lle myönnetyssä US-patentissa nro 3 411 887 kuva-10 taan askorbaattihäiriön poisto entsymaattisesti hapettaviin aineisiin, kuten glukoosioksidaasiin perustuvilla reagens-sisysteemeillä käyttämällä askorbaatin "loukkusysteemiä". "Loukkusysteemi" muodostuu ionisoituvasta raskasmetalliyhdis-teestä, jonka ionimuodon hapetus-pelkistyspotentiaali aset-15 tuu redoksindikaattoriväriaineen ja askorbaatin väliin. Esimerkkeinä sopivista metalleista mainitaan koboltti, rauta, elohopea ja nikkeli.

Magers'ille ja hänen työryhmälleen myönnetyssä US-patentissa nro 4 288 541, johon tässä monasti viitataan, 20 kuvataan merkuri-ionikompleksien, kuten merkurisarkosinaa-tin käyttöä askorbaatin vaikutuksen estämiseksi glukoosi/ glukoosioksidaasin määrityssysteemissä.

Yllä kuvattujen lisäksi on glukoositesteihin liittyvään askorbaattiongelmaan kiinnitetty huomiota seuraavissa 25 lähteissä: 1. H. Gifford et ai., J. Amer. Med. Assoc., 178, 149-150 (1961) 2. P. O'Gorman et ai., Brit. Med. J., 603-606 (1960) 3. R. Brandt et ai., Clin. Chem. Acta. 51, 103-104 30 (1974) 4. R. Brandt et ai., Am. J. Clin. Pathol., 68, 592-594 (1977)

Kuten yllä kuvattu Ku'n patentti, muukin kirjallisuus käsittelee askorbaatin kompleksoimista ja hapettamista ko-35 boltilla. Esim. G. Bragagnolo, Ann. Chim. Applicata, 31, 350-368, kuvaa askorbiinihappoliuosten hapettamista ilmalla 5 77939 kobolttimetallin läsnä ollessa. Samanlainen aktiivisuus on saavutettu CoiNH^)gCl^:11a, Tomokichi Iwasaki, Journal of the Chemical Society of Japan, 63, 820-826 (1942) .

Yllä kuvattu tekniikan taso käsittelee kylläkin laa-5 jasti glukoosin määrittämiseen liittyviä analyysisysteemejä, mutta ei lainkaan ehdota askorbaattihäiriöongelman ratkaisemista, joka liittyy peroksidatiivisesti aktiivisten aineiden, kuten peroksidaasin ja pseudoperoksidaasien, kuten piilove-ren (hemoglobiinin) määrittämiseen. Yllä mainitusta Ku'n 10 patentista huolimatta voidaan kuvatusta tekniikan tasosta päätellä, että metalli-ionit, esim. Co(III), ovat itse asiassa myös pseudoperoksidaaseja. Esim. Co(III)asetaattia käytetään kaupallisesti kumeenivetyperoksidin hajottamiseksi katalyyttisesti (The Merck Index, 9th ed., 311 (1976)).

15 k. Lohs, Monatsber. Deut. Akad. Wiss. Berlin, 8, 657-659 (1966) (ks. Chem. Abstracts. 67, 120838z. 1967) mukaan eräät Co(III)kompleksit hajottavat katalyyttisesti peroksideja. Niinpä ammattimies saa selvästikin sen vaikutelman, että tällaisten metallikompleksien käyttö tyypillisessä analyytti-20 sessä formulaatissa peroksidatiivisesti aktiivisten aineiden määrittämiseksi, esim. formulaatissa, joka sisältää orgaanista vetyperoksidia ja indikaattoria, vaikuttaa haitallisesti vetyperoksidiin joko aiheuttamalla "virheellisesti positiivisia" tuloksia tai tekemällä se muulla tavoin kyke-25 nemättömäksi reagoimaan ko. peroksidatiivisesti aktiivisen aineen, esim. piiloveren kanssa. Näin ollen metallikompleksien käyttö näissä määrityksissä on hyödytöntä. Yritykset käyttää merkurikomplekseja, esim. merkurisarkosinaattia, piiloveritesteissä ovatkin epäonnistuneet.

30 Burkhardtille ja hänen työryhmälleen myönnetty US- patentti nro 4 310 626, johon tässä monasti viitataan, kos-kettelee yllä kuvattua ongelmaa kuvaamalla ammonium-Co(III)-kompleksien käyttöä askorbaattihäiriön poistamiseksi koostumuksissa peroksidatiivisesti aktiivisten aineiden määrit-35 tämiseksi. Tässä patentissa julkistetaan koostumuksia, jotka muodostuvat orgaanisesta petyperoksidista ja sopivasta 6 77939 indikaattorista/ esim. 3,31,5,5'-tetrametyylibentsidiinistä sekä ammonium-Co(III)-komplekseista, mm. Co(NH3)6C13:stä. Mutta nämä kompleksit eivät kaupallista kannattavuutta ajatellen pysty riittävästi poistamaan piiloveritestissä esiin-5 tyvää askorbaattihäiriötä.

Muista yrityksistä käsitellä peroksidatiivisesti aktiivisten aineiden analyyttisiin määrityksiin liittyvää askorbaattihäiriötä voidaan esimerkkinä mainita DE-patentti nro 2 907 628. Tämä DE-patentti koskee virtsan analysoimis-10 ta liuoksena/ jolloin näytettä esikäsitellään yhdellä tai useammalla hapettimella askorbaatin poistamiseksi ja saatetaan sitten kosketukseen asianmukaisten analyyttisten rea-genssien kanssa. Julkistetut hapettimet ovat natriumjodaat-ti, natriumperjodaatti, kalsiumvetykloriitti, kaliumtrijo-15 didi, natriumvetykloriitti/ klooriamiini ja bromisukkini-midi.

Todettakoon yhteenvetona, että erilaisiin yrityksiin poistaa peroksidatiivisesti aktiivisten aineiden määrittämiseen liittyvä askorbiinihappohäiriö kuuluvat mm. erilais-20 ten Co (III)ammoniumkompleksien käyttö näytteen esikäsittely hapettimilla sekä alkalimetallijodaattien lisääminen suoraan reagenssikoostumukseen.

Pseudoperoksidaaseja/ kuten hemoglobiinia tutkitaan usein vaihtoehtoisina peroksidaasisysteemeinä luonnonper-25 oksidaasien, esim. piparjuuresta ja perunasta saatavien per-oksidaasien vaikutusmekanismiin liittyvän tietämyksen lisäämiseksi. Askorbiinihappo on jo kauan tunnettu peroksidaasin klassisena substraatina ja askorbiinihapon hapettuminen pseu-doperoksidaaseina toimivien metallikelaattien läsnä ollessa 30 on tunnettu ilmiö. M. Khan ja A. Martell julkaisivat 1967 ja 1968 kinetiikkatutkimuksia, jotka koskivat askorbiinihapon hapettamista erilaisten ferri- ja kuprikelaattien läsnä ollessa pH-alueella 1,8 - 3,45 (Khan, M. ja Martell, A., J. Am. Chem. Soc., 89, 4176 (1967); J. Am. Chem. Soc., 89, 35 7104 (1067); J. Am. Chem. Soc., 90, 3386 (1968)). Nämä tut kimukset käsittivät useita kineettisiä ja termodynaamisia ^ 77939 parametrejä. Tuloksista ilmenee, että eri kelaatit voidaan askorbiinihapon hapettamiskykynsä perusteella asettaa paremmuusjärjestykseen. Tekijöiden tutkimasta neljästä amino-polykarboksyylihaposta osoittautui Fe^+:n ja N-(2-hydroksi-5 etyyli)etyleenidiamiinitrietikkahapon HEDTA) kelaatti nopeimmaksi hapettimeksi. Sekä Martellin työssä että Grinsteadin aikaisemmassa tutkimuksessa pidetään tätä as-korbiinihappoon kohdistuvaa hapetusaktiivisuutta "malli"-peroksidaasisysteeminä (Grinstead, R.R., J. Am. Chem. Soc., 10 82, 3464 (1960)). Yllä kuvattu Grinsteadin tutkimus ja muut vastaavat tutkimukset pyrkivät selvittämään peroksidaasi-mekanismia määrätyn ferrikelaatin avulla, jonka rakenne muistuttaa rautapitoisen hemin rakennetta, joka on todettu peroksidaasientsyymin aktiivikohdaksi. Tekijät käyttävätkin 15 sanontaa "malliperoksidaasisysteemi" toistuvasti artikkeleissaan. Tämän kelaatin ja muiden reaktiivisuudeltaan vastaavien kelaattien "malli"peroksidaasiaktiivisuuden takia ei varmastikaan kukaan voi hyväksyä tällaisten aineiden liittämistä orgaanisen vetyperoksidin ja indikaattorin muodosta-20 miin systeemeihin, esim. sellaisiin, joita nykyään tyypillisesti käytetään analyyttisissä reagenssikoostumuksissa ja välineissä peroksidaasin tai muiden peroksidatiivisesti aktiivisten aineiden määrittämiseksi. Lisäksi käsiteltävänä ____ olevan keksinnön siirron saajan peroksidaasin aktiivisuu- 25 teen liittyvät tutkimukset osoittavat, että indikaattoreilla, kuten 3,3',5,5,-tetrametyylibentsidiinillä (TMB) tai o-tolidiinilla (joita indikaattoreita tällä hetkellä tyypillisesti käytetään analyyttisissä systeemeissä peroksidatiivisesti aktiivisten aineiden määrittämiseksi) saavu-30 tetaan peroksidaasiaktiivisuus, joka ilmeisesti on 200 kertaa suurempi kuin askorbiinihapole on tarpeen. White-Stevens, R.H., Clin. Chem., 28, 578 (1982). Niinpä voidaan olettaa, että jos tällaiset peroksidatiivisesti aktiiviset metalli-kelaatit eli "malli"peroksidaasit pystyvät näin helposti 35 hapettamaan askorbiinihappoa - kuten Kahn, Martell ja

Grinstead olettavat - peroksidaasin reaktio indikaattorien, 8 77939 kuten TMB:n kanssa olisi vähintään yhtä nopea kuin askor-biinihapon kanssa, ellei peräti n. 200 kertaa nopeampi (kuten näissä jälkimmäisissä piparjuuriperoksidaasilla suoritetuissa tutkimuksissa oletetaan). Siten on selvää, että jos 5 äärimmäisen reaktiokykyinen analyytti lisätään itse reagens-siformulaattiin, jonka on aiheutettava värinmuutos mainitun analyytin läsnä ollessa, voidaan odottaa "virheellisesti positiivisia" tuloksia.

Aikaisemmista käsityksistä ja ehdotuksista poiketen 10 on nyt havaittu, että määrätyt peroksidatiivisesti aktiiviset metallikelaatit ja erityisesti määrätyt polykarboksial-kyyliamiinien metallikelaatit käytettyinä keksinnön mukaisesti tässä kuvatulla tavalla estävät odotettavissa olevien "virheellisesti positiivisten" tulosten syntymisen koostu-15 muksessa, joka muodostuu reagenssisysteemistä peroksidatiivisesti aktiivisten aineiden määrittämiseksi, ja tämän lisäksi ne ovat tällaisessa systeemissä jopa yllättäen edullisia, koska systeemi niiden ansiosta on määritettävän analyytin suhteen luotettava, stabiili ja herkkä. Lisäksi on 20 havaittu, että käsiteltävänä olevan keksinnön mukaisten me-tallikelaattien käytöllä voidaan erityisen edullisesti poistaa virheet, jotka johtuvat testinäytteessä olevan askorbaat-ti-ionin aiheuttamasta häiriöstä.

Niinpä käsiteltävänä oleva keksintö perustuu tähän 25 havaintoon ja kuten yllä on esitetty koskee yleisesti peroksidatiivisesti aktiivisten aineiden askorbaattihäiriötön-tä analyyttistä määrittämistä ja erityisesti sellaista määrittämistä, jossa käsiteltävänä olevan keksinnön mukaisesti käytetään koostumusta, joka muodostuu orgaanisesta vetyper-30 oksidista ja redoksindikaattorista, esim. o-tolidiinista tai 3,3',5,5'-tetrametyylibentsidiinistä sekä peroksidatiivisesti aktiivisesta metallikelaatista. Tällaisissa määrityksissä peroksidatiivisesti aktiivinen analyytti, koska se muistuttaa peroksidaasientsyymiä, katalysoi indikaattorin 35 ja orgaanisen vetyperoksidin välisen reaktion tai vaikuttaa siihen muulla tavoin. Reaktiossa syntyy väri tai muu 9 77939 todettavissa oleva vaste, jonka intensiteetti on verrannollinen analyytin konsentraatioon. Askorbaatti-ionin läsnäolo aiheuttaa vakavan häiriöongelman. On myös oletettavissa, että peroksidatiivisesti aktiivisen metallikelaatin läsnäolo 5 koostumuksessa myös häiritsee peroksidatiivisesti aktiivin analyytin analyyttistä määrittämistä. On kuitenkin havaittu, että uudet koostumukset, koestimet (ja välineet), joihin näytteessä oleva askorbiinihappo ei vaikuta häiritsevästi, voidaan menestyksellisesti formuloida peroksidatiivisesti 10 aktiivisen aineen toteamiseksi näytteestä; nämä koostumukset, koestimet (ja välineet) sisältävät polykarboksialkyyliamii-nijohdannaisten metallikelaatteja, jotka myös tunnetaan "mal-liperoksidaaseina".

Keksinnön koostumus muodostuu siis orgaanisesta ve-15 typeroksidistä, indikaattorista, joka pystyy synnyttämään todettavissa olevan vasteen, esim. värinmuutoksen, peroksidatiivisesti aktiivisen aineen ja peroksidin läsnä ollessa sekä lisäksi metallikelaatista, jona on polykarboksialkyyli-amiinijohdannainen, joka on yleistä kaavaa 20 C f ίχ 1 r*y 1 f1 r r3—N—Rp—N—Rq—n—r2 ^ n ^ / 25 jossa R^ on vety tai suoria tai haarautuneita, 2-3 hiiliatomia sisältäviä alkyylialkoholi- tai alkyylikarboksyylihappo- radikaaleja; R~, R_, R ja R ovat samoina tai erilaisina m «3 x y 30 suoria tai haarautuneita, 2-3 hiiliatomia sisältäviä alkyylialkoholi- tai alkyylikarboksyylihapporadikaaleja, jolloin vähintään kaksi radikaaleista R1, R2, R3, Rx ja Ry ovat näin määriteltyjä alkyylikarboksyylihapporadikaaleja; R ja R ovat samoina tai erilaisina suoria tai haarautuneita, 1-3 35 hiiliatomia sisältäviä alkyleeniradikaaleja tai kaksiarvoisia 1,2-sykloalifaattisia, 6-9 hiiliatomia sisältäviä radikaaleja; n on kokonaisluku 0 - 1, m on kokonaisluku 0-2, 10 77939 jolloin, jos m on suurempi kuin 0, toistuvat R - ja toistuvat R -radikaalit voivat olla samoja tai erilaisia ja M on Fe3+.q

Suositeltavia yhdisteitä ovat sellaiset, joissa m on 5 0; n on 0 tai 1 ja R on etyleeniradikaali. Erityisen suosi- Γ teltavia ovat polykarboksialkyyliamiinijohdannaisten metal-likelaatit, joissa alkyylikarboksyylihapporadikaalit ovat -ch2cooh.

Suositeltava metallikelaatti on N-(2-hydroksietyyli)-10 etyleenidiamiinitrietikkahapon ferrikelaatti (Fe-HEDTA).

Keksinnön suositeltavassa toteuttamismuodossa koostumus on yhdistetty kantajamatriisiin, esim. imukykyiseen paperiin muodostamaan koestin, joka voidaan kiinnittää inert-tiin tukeen muodostamaan testausväline. Lisäksi keksintö 15 tarjoaa menetelmän koestimen (ja välineen) valmistamiseksi ja tavan niiden käyttämiseksi.

Liittämällä mukaan tässä kuvatun keksinnön mukainen metallikelaatti saadaan koostumuksia, koestimia (ja välineitä) , jotka eivät vain erinomaisen hyvin poista askorbaatti-20 häiriötä, vaan jotka myös ovat odottamattoman stabiilejä, josta osoituksena ovat kokeellisesti todettu hyvä varastointi- ja korkealämpötilastabiilisuus ja "virheellisesti positiivisten" tulosten poisjääminen.

Käsiteltävänä olevan keksinnön kehittelyn alussa suo-25 ritetut märkäkemialliset kokeet, joissa käytettiin vain N-(2-hydroksietyyli)etyleenidiamiinitrietikkahapon ferri-kelaattia (josta tässä käytetään nimitystä Fe-HEDTA; tätä merkintätapaa käytetään pelkästään mukavuussyistä tarkoittamatta sitä, että metalli-ionin ja polykarboksialkyyliamii-30 nijohdannaisen välissä olisi kovalenttisidos), askorbiini-happoa ja puskuria, osoittivat todeksi nopeuden, jolla as-korbiinihappo hapettuu tämän kelaatin läsnäollessa. Tämä tulos oli odotettavissa Khanin ja Martellin edellä kuvattujen raporttien perusteella. Niinpä ottaen huomioon sen, 35 kuinka paljon nopeammin TMB:n on osoitettu hapettuvan per-oksidaasipitoisissa koostumuksissa verrattuna tällaisten koostumusten kykyyn hapettaa askorbiinihappoa, oli 11 77939 odotettavissa, että orgaanista vetyperoksidia, hapettuvaa indikaattoria, kuten TMBttä ja lisäksi tällaista metallike-laattia sisältävä koostumus olisi erittäin pysymätön ja antaisi nopeasti "virheellisesti positiivisia" tuloksia.

5 Mutta kokeita jatkettaessa havaittiin, että voidaan formuloida koostumus, joka sisältää tällaisia metallikelaat-teja, joka sopii peroksidatiivisesti aktiivisen aineen toteamiseen ja joka lisäksi on adaptoitavissa kuivaan kiinto-muotoon, joka omaa hyvän reagenssistabiilisuuden valmistuk-10 sen ja varastoinnin aikana ja joka ei anna "virheellisesti positiivisia" tuloksia joutuessaan kosketukseen tunnetun hemoglobiini-negatiivisen virtsan kanssa. Tämä käsiteltävänä olevan keksinnön suorituskyky saattaa epäilyksenalaisiksi kaikki edellä selostetut tekniikan tason ehdotukset, joissa 15 kuvatulla tavalla ehdotetaan metallikelaattien, kuten

Fe-HEDTA:n käyttöä "malliperoksidaaseina" ja jotka kelaatit siten olisivat sopimattomia käytettäviksi koostumuksessa peroksidatiivisesti aktiivisen analyytin konsentraation määrittämiseksi.

20 On havaittu, että virtsan epänormaalin suuret askor- biinihappopitoisuudet eivät vaikuta keksinnön uudesta koostumuksesta valmistettuihin koestimiin (ja välineisiin) mää--·- ritettäessä piiloveri, ts. hemoglobiini, biologisista nes- - teistä, kuten virtsasta. Kuten yllä on kuvattu askorbiini- ” 25 hapon aiheuttama inhibitio on vakava ongelma, erityisesti siksi, että n. 25 % virtsanäytteistä voidaan olettaa sisältävän askorbiinihappoa enemmän kuin 10 mg per desilitra (mg/dl). On havaittu, että niinkin pienet askorbiinihappo-konsentraatiot kuin 5 mg/dl inhiboivat tavallisesti (ts.

30 epäherkistävät hemoglobiinin läsnäollessa) tavanomaiset piiloveren määritysvälineet, jotka eivät sisällä jonkin tyyppistä askorbaattihäiriötä vähentävää ainetta. Tällaisiin tavanomaisiin välineisiin verrattuna käsiteltävänä olevan keksinnön mukaisesti valmistetut välineet ovat askor-35 baattihäiriön kestokyvyltään erittäin edullisia, koska niillä voidaan todeta peroksidatiivisesti aktiiviset aineet ,2 77939 nesteistä/ jotka sisältävät suhteellisen suuria määriä as-korbiinihappoa, esim. n. 50 mg/dl.

Käsiteltävänä oleva keksintö tarjoaa siis koostumuksia/ koestimia (ja välineitä) ja menetelmiä peroksidatii-5 visesti aktiivisten aineiden määrittämiseksi biologisista nesteistä, kuten virtsasta. Hemoglobiinin lisäksi voidaan keksinnön koostumuksilla, koestimilla (ja välineillä) todeta muita peroksidatiivisesti aktiivisia aineita, esim. per-oksidaasi, myoglobiini, erytrosyytit ja muut pseudoperoksi-10 daasit. Keksinnössä käytetään metallikelaattia, joka on johdettu polykarboksialkyyliamiinista ja jota myös kutsutaan "malliperoksidaasiksi" ja jonka tehtävänä on biologisilla nesteillä suoritetuissa analyyttisissä määrityksissä vähentää tai eliminoida askorbiinihapon haittavaikutukset. Tämä 15 tapahtuu siten, että metallikelaatti edistää mainituissa nesteissä mahdollisesti olevan askorbaatti-ionin hapettumista.

On havaittu, että keksinnön koostumukset, koestimet (ja välineet) ovat olennaisesti epäherkempiä askorbaatti-20 häiriölle ja että ne synnyttävät silmin tai instrumentaali-sesti todettavissa olevan vastaan, esim. värivasteen, hemoglobiinin hivenmäärille, jotka ovat luokkaa 0,03 mg/dl tai jopa pienempiä.

Keksinnön koostumuksessa käytettäväksi aiottu orgaa-25 ninen vetyperoksidi voidaan valita monista tunnetuista orgaanisista vetyperoksideista. Valitun peroksidin on kuitenkin pystyttävä reagoimaan peroksidatiivisesti aktiivisen aineen kanssa indikaattorin läsnä ollessa siten, että syntyy todettavissa oleva vaste, esim. värinmuutos tai muutos valon mää-30 rässä, jonka testikoostumus absorboi tai heijastaa. Erityisen sopivia vetyperoksideja ovat kumeenivetyperoksidi, tert-butyylivetyperoksidi, di-isopropyylibentseenivetyperoksidi, 2,5-dimetyyliheksaani-2,5-divetyperoksidi, paramentaanivety-peroksidi ja muut tunnetut vetyperoksidit, joilla käytetty 35 indikaattori voidaan hapettaa sekä tällaisten yhdisteiden 13 77939 seokset. Yllä mainituista suositeltavin on kumeenivetyperok-sidi.

Monet indikaattorit sopivat käytettäviksi keksinnön koostumuksessa, mikäli ne pystyvät reagoimaan niin, että syn-5 tyy todettavissa oleva vaste orgaanisen vetyperoksidin ja peroksidatiivisesti aktiivisen aineen läsnäollessa. Näihin indikaattoreihin kuuluvat esim. ns. "bentsidiinityyppiset" yhdisteet bentsidiini, o-tolidiini, 3,3',5,5'-tetra(alempi-alkyyli)bentsidiini, 2,7-diaminofluoreeni ja näiden seokset 10 tai monet muut. Tässä käytetyllä sanonnalla "alempi-alkyyli" tarkoitetaan 1-6 hiiliatomia sisältävää alkyyliradikaalia, mm. metyyliä, etyyliä, n-propyyliä ja isopropyyliä sekä erilaisia butyyli-, pentyyli- ja heksyyli-isomeerejä. Indikaattori 3,31,5,5'-tetrametyylibentsidiini (TMB) on erityisen 15 suositeltava.

Määrätyn metallikelaatin käyttökelpoisuus ei riipu vain sen kyvystä edistää askorbiinihapon hapettumista, vaan myös sen yhteensopivuudesta koostumuksen muiden aineosien kanssa. Niinpä tällaisiin sopiviin kelaatteihin on havaittu 20 kuuluvan polykarboksialkyyliamiinijohdannaisten metalli-kelaatit, jotka ovat yleistä kaavaa c u m i v ) r H—N—V_‘N—Ri—N— Käsiteltävänä olevassa keksinnössä käyttökelpoisten 30 metallikelaattien esimerkkejä ovat siten ferrikelaatit, joi-den muodostajina ovat N- (2-hydroks ie tyyli) etyleenidiamiini-* trietikkahappo (Fe-HEDTA), etyleenidiamiinitetraetikkahappo (FE-EDTA), sykloheksyleenidiamiinitetraetikkahappo (Fe-CDTA), ·*.'·: nitrilotrietikkahappo (Fe-NTA) , iminodietikkahappo (Fe-IMDA) , 35 etyleenidiamiinidietikkadipropionihappo (Fe-EDDP) (sekä CC-että /h-muoto) ja hydroksietyyli-iminodietikkahappo (Fe-HIMDA) 14 77939 sekä niiden seokset. Ferrikelaattimuodot ovat yleensä suositeltavia; suositeltavimmat ovat Fe-HEDTA ja Fe-EDTA ja aivan erityisesti Fe-HEDTA. Mutta kuten tähän kuvaukseen perehtynyt keskivertoammattimies havaitsee, monet sopivat ke-5 laatit kuuluvat käsiteltävänä olevan keksinnön piiriin tässä erityisesti mainittujen lisäksi.

On siis kokeellisesti havaittu, että keksinnön koostumuksiin, koestimiin (ja välineisiin) lisätyllä Fe-HEDTA:11a ja Fe-EDTA:11a, erityisesti Fe-HEDTA:11a, saavutetaan erin-10 omaisia tuloksia, koska ne tekevät piiloveritestit mitä suurimmassa määrin askorbiinihappohäiriöttömiksi (mahdollistaen hemoglobiinin määrittämisen), aikaansaavat hyvän reagenssi-stabiilisuuden ennen käyttöä ja estävät "virheellisesti positiiviset" tulokset. Lisäksi muut tässä spesifioidut metal-15 likelaattiyhdisteet ja monet muutkin toimivat asianmukaisella tavalla. On kuitenkin odotettavissa, että käytettäessä näitä muita yhdisteitä, peroksidatiivisesti aktiivisen aineen toteamisnopeus vaihtelee huomattavasti, koska askor-baatti hapettuu vaihtelevalla nopeudella. Siten on selvää, 20 että käsiteltävänä olevassa keksinnössä käyttökelpoisiksi metallikelaateiksi voidaan valita mitkä tahansa, jotka kuuluvat yllä kuvatun yhdisteluokan polykarboksialkyyliamiini-johdannaisiin, ja että kaikkien näiden yhdisteiden voidaan olettaa toimivan kelvollisina askorbaattihapettimina eli 25 ne voidaan laskea kuuluviksi käsiteltävänä olevan keksinnön piiriin. Mutta monet nämä ehdot täyttävät kelaatit toimivat hitaasti ja siten ne sopivat vähemmän hyvin kaupalliseen käyttöön eivätkä ole suositeltavia.

Käsiteltävänä olevassa keksinnössä käyttökelpoiset 30 metallikelaatit voidaan valmistaa tavanomaisin laboratorio-menettelyin käyttäen polykarboksialkyyliamiinijohdannaisia, jotka ovat saatavissa Aldrich Chemical Co.:sta, Sigma Chemical Companyistä tai muista yrityksistä. Esim. metalli-kelaatti Fe-HEDTA voidaan valmistaa sekoittamalla ekvimoo-35 liset määrät kaupallista HEDTAsa ja FeCl^·ö^Osta vesiliuoksessa, jolloin saadaan Fe-HEDTA-liuos, jossa raudan ja ib 77939 kelaatin moolisuhde on 1:1. Voidaan helposti valmistaa muita metallin ja kelaatin suhteita omaavia liuoksia pelkästään muuttamalla sekoitettujen liuosten ko. konsentraatioi-ta. On havaittu, että askorbaattihäiriön poistamisen suhteen 5 parhaat tulokset saadaan, kun metalli-ionin ja polykarboksi-alkyyliamiinijohdannaisen moolisuhde kelaatissa on n. 1:1.

Eri toteuttamismuodoissa voi määrätyn metallikelaatin suositeltava konsentraatioalue vaihdella suuresti. Esim. käytettäessä Fe-HEDTA:a tässä suositeltava konsentraatio-10 alue on n. 0,5 millimoolista (mmol) n. 50 millimooliin käytettäessä koostumuksessa, joka sisältää orgaanista hydro-peroksidia ja tetra(alempi-alkyyli)bentsidiini-indikaatto-ria. Tämä alue on määritetty häiriön kestokyvyn optimiksi askorbaattikonsentraatioon n. 50 mg/dl saakka virtanäytteis-15 sä. Lisäksi on todettu kokeellisesti, että eräiden sopivien ferrikelaattien pienemmät konsentraatiot mahdollistavat hemoglobiinin suhteellisen nopean toteamisen, kun taas samojen tai muiden kelaattien suuremmat konsentraatiot ovat vähemmän tehokkaita. Näitä ilmeisen anomaalisia tuloksia käsi-20 tellään yksityiskohtaisemmin alempana. Tulokset osoittavat, että keksinnön koostumuksessa kelaattikonsentraation ja funktionaalisuuden tai sopivuuden välillä ei ole yleistä korrelaatiota.

On havaittu kokeellisesti, että useimmissa sopivissa, 25 keksinnön koostumuksessa hyvin toimivissa metallikelaateis-sa on rakenteessaan alkyyliamiini- tai amiinikeskusryhmä ja lisäksi karboksyylihapporadikaali -CI^COOH. Mutta muutkin kelaatit, joissa ei ole tällaisia rakenneosia, mutta kuuluvat edellä esitettyjen yhdisteiden yleiseen piiriin, voivat 30 yleisesti ottaen olla tehokkaita askorbaattihäiriön poista-: : jia ja omata riittävän herkkyyden ja stabiilisuuden ja siten olla käyttökelpoisia.

On huomattava, että käytännössä määrätyn, keksinnön yleisiin periaatteisiin perustuvan koostumuksen, koestimen 35 (ja välineen) toteuttamismuodon suorituskyky riippuu monista ; erilaisista tekijöistä. Koska tyypillinen virtanäyte, joka ιβ 77939 on saatu suuria määriä askorbiinihappoa (C-vitamiinia) jatkuvasti nauttivasta ihmiskohteesta* usein sisältää 25-100 mg/dl tai enemmän askorbaattia, on tutkimusta varten askorbaatin vertailutasoksi valittu n. 50 mg/dl. On todettu, että 5 keksinnön askorbaattihäiriöttömän koostumuksen, koestimen (ja välineen) ja menetelmän suositeltavat toteuttamismuodot mahdollistavat peroksidatiivisesti aktiivisten aineiden toteamisen tällaisista näytteistä ei vain askorbaatin vertai-lutasolla n. 50 mg/dl, vaan myös erilaisilla muilla askor-10 baattitasoilla. Vasteaika saattaa useimmissa tapauksissa pidentyä, kun askorbaatin konsentraatio on paljon suurempi kuin kelaatin konsentraatio. Kuten alla kuvataan on kokeellisesti havaittu, että "viiveajat", ts. havaittavan vasteen syntymiseen kuluva aika, vaihtelevat vähemmässä kuin kolmasosami-15 nuutissa n. puoleen tuntiin keksinnön erilaisia kelaatti-konsentraatioita sisältävillä suositeltavilla toteuttamismuodoilla, joita testattiin hemoglobiinin toteamiseksi virtsasta, jonka askorbaattipitoisuus oli 50 mg/dl.

Eräässä suositeltavassa toteuttamismuodossa keksinnön 20 koostumuksen avulla valmistetaan koestimia (ja välineitä) : peroksidatiivisesti aktiivisen aineen määrittämiseksi. Täl laisessa suositeltavassa toteuttamismuodossa koostumus voidaan liittää sopivaan kantajamatriisiin muodostamaan koestin. Kantajamatriisin muoto voi vaihdella suuresti, esim. siten 25 kuin on julkistettu US-patentissa nro 3 846 247 (huopa, huokoiset keraamiset liuskat ja lasikuitukudokset tai -matot) . Sopivia ovat myös matriisit, jotka on kuvattu US-patentissa nro 3 552 928 (puutikut, kangas, sienimateriaali ja savet). Synteettisten muovineulosten ja lasikuituhuopien 30 käyttöä kantajamatriisina ehdotetaan GB-patentissa nro 1 369 139; toisessa GB-patentissa nro 1 349 623 ehdotetaan ohuista filamenteista muodostuvaa kevyttä ja läpäisevää verkkorakennetta alla olevan paperimatriisin peitekerroksena. Polyamidikuituja on julkistettu ranskalaisessa patentissa 35 nro 2 170 397. Näistä julkistuksista poiketen tavallisesti kantajamatriisina käytetyt ainekset, jotka myös ovat ,7 77939 käsiteltävänä olevassa keksinnössä erityisen suositeltavia ja sopivia/ ovat imukykyisiä materiaaleja/ kuten suodatinpaperi ja vastaavat. On kuitenkin huomattava, että kantaja-matriisin fysikaalinen muoto voi olla kuten yllä on kuvattu 5 tai muunkinlainen ja kaikki nämä muodot ovat käsiteltävänä olevassa keksinnössä sopivia ja siinä käytettäviksi tarkoitettuja.

Keksinnön koestinta valmistettaessa voidaan koostumuksen aineosat liittää kantajamatriisiin monellakin taval-10 la. Aineosat voidaan esim. liuottaa tai suspendoida veteen tai muuhun sopivaan liuottimeen, mieluiten orgaaniseen liuottimeen, kuten etanoliin, asetoniin tai dimetyyliform-amidiin (DMF) ja myös näiden ja muiden liuottimien seoksiin. Sitten liuoksella tai suspensiolla voidaan kyllästää imu-15 kykyinen suodatinpaperi, liuos tai suspensio voi sisältää « painoväriä, jolloin reagenssit painetaan sopivalle matriisille tai vaihtoehtoisesti voidaan kantajamatriisi kastaa koostumukseen tai se voidaan päällystää koostumuksella esim. teräpäällystimellä.

20 Tällä hetkellä suositeltava menetelmä koostumuksen aineosien liittämiseksi kantajamatriisiin on kyllästää imu-kykyinen suodatinpaperi aineosien kahdella tai useammalla liuoksella tai suspensiolla. Tällainen kyllästäminen suoritetaan kastamalla suodatinpaperipala kaksi tai useita kerto-25 ja tällaisiin liuoksiin tai suspensioihin ja kuivaamalla kastettu paperi jokaisen kaston jälkeen lämpökaapissa. Näin muodostunut koestin laminoidaan sitten kaksipuolisen teippi-arkin toiselle puolelle, laminaatti leikataan liuskoiksi ja jokainen liuska kiinnitetään pitkänomaiseen, tukena toi-30 mivaan muovikalvoon (esim. polystyreenistä valmistettuun), joka sitten viilletään lyhyemmän sivunsa suuntaisesti muodostamaan pitkänomainen väline, jonka toisessa päässä on kyllästetty paeri ja toinen pää on tarttumista varten. Näin saatu testausväline muodostuu kahdesti kuivatusta ja kylläs-"* 35 tetystä koestimesta, jonka toinen pää kiinnittyy pitkänomai- 18 ?7939 sen muovi tuen toiselle puolelle, jokai siten muodostaa kätevän tarttumispään.

Suositeltava menetelmä keksinnön koestimen valmistamiseksi on esim. menetelmä, jossa Fe-HEDTA ja orgaaninen ve-5 typeroksidi lisätään suodatin paperiin, mutta ennen indikaattorin lisäämistä, ensimmäisessä vesiliuskastossa. Näin suodatinpaperi voidaan ensin kyllästää Fe-HEDTA:n ja vetyperoksidin vesiliuoksella yhden tai useamman sopivan liuottimen ja/tai puskurin, esim. trietanoliamiiniboraatin ja 10 tris(hydroksimetyyli)aminometaanimalonaatin (jota seuraavas-sa kutsutaan TRIS-malonaatiksi) kera, kuiva, kyllästää uudelleen indikaattorin sopivassa liuottimessa, esim. etanolissa, olevassa toisessa kastoliuoksessa ja kuivata toistamiseen. On havaittu, että tällaisella "kaksikasto"menette-15 lyllä, jossa metallikelaatti ensin kyllästetään paperiin ennen muita aktiivisia aineosia, saadaan testausväline, joka omaa erinomaisen askorbaattihäiriöttömyyden ja varastointi-kestävyyden.

Erityisen suositeltava menetelmä keksinnön koestimen 20 formuloimiseksi on metallikelaatin ja reagenssien, indikaattoria lukuun ottamatta, lisääminen suodatinpaperiin kastamalla paperi, kuten yllä on kuvattu ensimmäiseen reagenssi-: liuokseen, paperin kuivaaminen, siten indikaattorin lisää minen kastamalla kuivattu paperi indikaattorin ja sakeutus-25 aineen, kuten polyvinyylipyrrolidonin liuokseen sopivassa liuottimessa ja lopuksi kuivaaminen toistamiseen.

Yllä kuvattujen testikoostumusreagenssien ja muiden reagenssien lisäksi voidaan käsiteltävänä olevan keksinnön koostumukseen, koestimeen (ja välineeseen) myös lisätä mui-30 ta komponentteja, kuten erilaisia sakeuttamisaineita, kos-tutusaineita, puskureita, emulgointiaineita ja tunnettuja apuaineita. Niinpä voidaan sakeuttamisaineina käyttää erilaisia aineksia polyvinyylipyrrolidonin lisäksi tai sen asemasta, kuten gelatiinia, algiinia, karrageenia, kaseiinia, 35 albumiinia, metyyliselluloosaa ja vastaavia. Suositeltava kostutusaine on natriumdodekyylisulfaatti, mutta voidaan i9 77939 myös käyttää kaikkia pitkäketjuisia orgaanisia sulfaatteja tai sulfonaatteja, kuten dioktyylinatriumsulfosukkinaattia tai natriumdodekyylibentseenisulfonaattia. Trietanoliamiini-boraatin ja TRIS-malonaatin lisäksi voidaan puskuroivina 5 systeemeinä käyttää tartraattia, fosfaattia, ftalaattia, sitraattia, asetaattia, sukkinaattia tai muita puskureita.

On suositeltavaa puskuroida koostumukset pH-arvoon n. 6,0 - 7,0. Emulgointiaineena voidaan käyttää polyvinyylialkoholia, arabikumia, karboksivinyylipolymeerejä ja vastaavia. Indi-10 kaattorin suspendoimisessa käyttökelpoisia orgaanisia liuottimia ovat useimmat reagoimattomat orgaaniset haihtuvat liuottimet, kuten etanoli, asetoni, DMF, kloroformi, ety-leenidikloridi, bentseeni, etyyliasetaatti ja vastaavat. Muiden sopivien liuottimien valinta riippuu tietenkin käsi-15 teltävänä olevaan julkistukseen perehtyneen ammattimiehen asiantuntemuksesta.

Koestinta (tai testausvälineetä) voidaan käyttää siten, että se kastetaan testattavaa ainesta sisältävään nesteeseen tai nestesuspensioon ja vedetään välittömästi pois 20 tai neste-, kiinto- tai puolikiinteässä muodossa oleva näy- ____ te voidaan lisätä koestimeen (tai välineeseen). Näytteessä olevan peroksidatiivisesti aktiivisen aineen läsnä ollessa testikoostumus synnyttää värinmuutoksen tai muun todettavissa olevan vasteen. Jos vasteena on väri, sitä voidaan 25 verrata esikalibroituihin väristandardeihin näytteessä olevan peroksidatiivisesti aktiivisen aineen määrän kvantifioi-miseksi. Inaktit peroksidatiivisesti aktiiviset aineet, kuten punasolut voivat näkyä väripilkkuina tai -täplinä muuten värittömässä matriisissa. Visuaalisen vertailun lisäksi 30 voidaan myös käyttää erilaisia instrumentteja muodostuneen värin tai muun vasteen laadun määrittämiseksi, jolloin voidaan parantaa testin tarkkuutta subjektiiviseen ihmissilmin suoritettuun määritykseen verrattuna.

Seuraavat esimerkit selventävät tässä julkistetun 35 keksinnön periaatteita ja etuja keksinnön piiriä rajoitta- 2o 779 3 9 matta. Vain oheisia patenttivaatimuksia pidetään rajoittavina.

Esimerkit

A. TestikööstUirtus 5 Esimerkki I

Fe-HEDTA

Suoritettiin koe, jossa valmistettiin käsiteltävänä olevan keksinnön koostumus/ jolla pystytään toteamaan per-oksidaasin tai muun peroksidatiivisesti aktiivisen aineen, 10 erityisesti hemoglobiinin läsnäolo testinäytteessä. Koostumus sisälsi askorbaattihäiriötä hidastavana aineena N-(2-hydroksietyyli)etyleenidiamiinitrietikkahapon ferrikelaat-tia moolisuhteessa 1:1 (seuraavassa mooli:mooli = m:m). Fe-HEDTA-kelaatti valmistettiin liuottamalla 0,278 grammaa 15 (g) HEDTAra 100 millilitraan (ml) tislattua vettä, jolloin saatiin 10 millimoolinen (mmol) HEDTA-liuos, ja liuottamalla sitten 0,270 g FeCl^·61^0:ta 10 millimooliseen HEDTA-liuok-seen. Koostumukseen lisättiin askorbiinihappoa konsentraa-tiona 5 mmol sellainen määrä, että konsentraatio lopulli-20 seen tilavuuteen säädetyssä liuoksessa oli 50 mikromoolia. Koostumuksen aineosat ja askorbiinihappo yhdistettiin seuraavassa taulukossa ilmoitetussa järjestyksessä ja ilmoitettuina määrinä. Lopullinen koostumusliuos sisälsi 100 mikromoolia (^umol) Fe-HEDTA:a. Tämä pitoisuus kuten muidenkin 25 mukana olevien aineosien pitoisuudet ovat huomattavasti pienempiä kuin käytettäisiin keksinnön vastaavassa koostumuksessa, joka lisätään kiintomuodossa olevaan koestimeen tai testivälineeseen.

0,2-m (moolista) natriumsitraattipuskuria 9,5 ml 30 10 millimoolista Fe-HEDTA:a 0,1 ml 10 g/dl* natriumdodekyylisulfaattia 0,1 ml 1-m kumeenivetyperoksidia 0,1 ml 10 millimoolista 3,3',5,5'-tetrametyyli- bentsidiiniä 0,1 ml 35 5 millimoolista askorbiinihappoa 0,1 ml *grammaa per desilitra 2i 77939

Havaittiin/ että näin valmistettu keksinnön koostumus synnytti sinisen värin, kun lisättiin verinäytteestä määräosa, joka saatiin laimentamalla vedellä lopulliseen konsentraa-tioon 0,139 mg/dl hemoglobiinia. Näin voitiin osoittaa, että 5 koostumuksella voidaan todeta hemoglobiinin läsnäolo, vaikka askorbaatin konsentraatio näytteessä oli 50 mikromoolia.

Esimerkki II

Fe-EDTA

Toistettiin esimerkin I koe sillä erolla, että käy-10 tettiin Fe-HEDTA:n asemasta 10 millimoolista etyleenidiamii-nitetraetikkahappoferrikelaatin (Fe-EDTA) liuosta. Fe-EDTA valmistettiin olennaisesti, kuten esimerkissä I liuottamalla 0,292 g EDTA:a 100 ml:aan tislattua vettä ja lisäämällä FeCl2‘6H20:ta, kuten esimerkissä I. Näin valmistettu koostu-15 mus synnytti, kuten esimerkissä I sinisen värin, kun läsnä oli 0,139 mg/dl hemoglobiinia ja 50 ^umol askorbaattia.

Esimerkki III

Fe-CDTA

Toistettiin esimerkin I koe sillä erolla, että käy-20 tettiin Fe-HEDTA;n asemasta 10 millimoolista sykloheksylee-nidiamiinitetraetikkahappoferrikelaatin (Fe-CDTA) liuosta. Fe-CDTA-liuos valmistettiin liuottamalla 0,346 CDTA:a 100 ml:aan tislattua vettä ja lisäämällä FeCl2*6H20ita, kuten esimerkissä I. Näin valmistettu koostumus synnytti, ku-25 ten esimerkissä I sinisen värin, kun läsnä oli 0,139 mg/dl hemoglobiinia ja 50 yumol askorbaattia.

Esimerkki IV

Fe-IMDA

Toistettiin esimerkin I koe sillä erolla, että käy-30 tettiin Fe-HEDTA:n asemasta 10 millimoolista iminodietikka-. . happoferrikelaatin (Fe-IMDA) liuosta. Fe-IMDA-liuos valmis tettiin liuottamalla 0,133 g IMDA:a 100 ml:aan tislattua vettä ja lisäämällä FeCl^ö^Orta, kuten esimerkissä I. Näin valmistettu koostumus synnytti, kuten esimerkissä I sinisen 35 värin, kun läsnä oli 0,139 mg/dl hemoglobiinia ja 50 ^umol askorbaattia.

22 77939

Esimerkki V

Toistettiin esimerkin I koe sillä erolla, että käytettiin Fe-HEDTA:n asemasta 10 millimoolista nitrilotri-etikkahappoferrikelaatin (Fe-NTA) liuosta. Fe-NTA-liuos val-5 niistettiin liuottamalla 0/191 g NTA:a 100 mitään tislattua vettä ja lisäämällä FeCl^· 61^0: ta, kuten esimerkissä I. Näin valmistettu koostumus synnytti, kuten esimerkissä I sinisen värin, kun läsnä oli 0,139 mg/dl hemoglobiinia ja 50 ^umol askorbaattia.

10 Esimerkki VI

Fe-EDDP^

Toistettiin esimerkin I koe sillä erolla, että käytettiin Fe-HEDTA:n asemasta 10 millimoolista ofc-etyleenidi-amiinidietikkadipropionihappoferrikelaatin (Fe-EDDP ) 15 liuosta. Fe-EDDP^ -liuos valmistettiin liuottamalla 0,320 g EDDP^ia 100 ml:aan tislattua vettä ja lisäämällä FeCl^· öHjOtta, kuten esimerkissä I. Näin valmistettu koostumus synnytti, kuten esimerkissä I, sinisen värin, kun läsnä oli 0,139 mg/dl hemoglobiinia ja 50 ^umol askorbaattia.

20 Esimerkki VII

Fe-EDDP/J

Toistettiin esimerkin I koe sillä erolla, että käytettiin Fe-HEDTA:n asemasta 10 millimoolista /3-etyleenidi-amiinidietikkadipropionihappoferrikelaatin (Fe-EDDP ) liuos-25 ta. Fe-EDDIft-liuos valmistettiin liuottamalla 0,320 g EDD^jsa 100 ml saan tislattua vettä ja lisäämällä FeCl^· 6H20:ta, kuten esimerkissä I. Näin valmistettu koostumus synnytti, kuten esimerkissä I sinisen värin, kun läsnä oli 0,139 mg/dl hemoglobiinia ja 50 ^umol askorbaattia.

30 Esimerkki VIII

Fe-HIMDA

Toistettiin esimerkin I koe sillä erolla, että käytettiin Fe-HEDTA:n asemasta 10 millimoolista hydroksietyyli-iminodietikkahappoferrikelaatin (Fe-HIMDA) liuosta. Fe-HIMDA-35 liuostvalmistettiin liuottamalla 0,177 g HIMDAra 100 mlraan tislattua vettä ja lisäämällä FeCl^·61^0:ta, kuten 23 7 7 9 3 9 esimerkissä I. Näin valmistettu koostumus synnytti/ kuten esimerkissä I sinisen värin, kun läsnä oli 0,139 mg/dl hemoglobiinia ja 50 yumol askorbaattia.

Esimerkit ix-xvi 5 Suoritettiin kokeita olennaisesti, kuten yllä on ku vattu esimerkeissä I-VIII keksinnön mukaisten koostumusten valmistamiseksi, mutta sillä erolla, että kaikissa tapauksissa käytettiin 9,4 ml 0,2-m natriumsitraattipuskuria 9,5 ml:n asemasta ja 0,2 ml kutakin ferrikelaattia 0,1 ml:n 10 asemasta. Tällä tavoin jokaisen koostumuksen ferrikelaatti-pitoisuudeksi tuli 200 mikromoolia. Havaittiin, että 200 ^uinol ferrikelaattia sisältävät, yllä kuvatulla tavalla testatut koostumukset synnyttivät kaikissa tapauksissa sinisen värin, kun läsnä oli 0,139 mg/dl hemoglobiinia ja 50 ^umol askor-15 baattia. Tämä oli osoituksena koostumusten kyvystä todeta hemoglobiini näytteessä olevasta askorbaatista huolimatta. Voitiin kuitenkin havaita eroja värinmuodostusajoissa testattaessa samalla tavoin esimerkkien I-VIII 100 yumol ferri-kelaattikoostumuksia. Kaikki värinmuodostusajat, joita kut-20 sutaan "viiveajoiksi”, ilmenevät seuraavasta taulukosta.

Niistä voi päätellä, kuten aikaisemminkin, että ei ole ole-massa mitään yleistä riippuvuussuhdetta eli korrelaatiota --- metallikelaatin, esim. jonkin yllä mainitun, keksinnön koos- '· tumuksessa käytetyn ferrikelaatin konsentraation ja koostu- 25 muksen kyvyn välillä sietää askorbaattihäiriötä ja mahdol-listaa peroksidatiivisesti aktiivisen aineen toteamisen.

24 77939

H

> >1 >1 X P P O P I P P

P O X Q) <D

P E H P P

d d -H -H

(O \ p M M G

U P :d :d P β β fi P o M :d :d g β fi P P -h β O M g g P P g g g <D (N <u in g g m g -H P V o σι o

^ β P 0) Q)<Nr~tn<-*— (N

d O oi •h x ω +1 p β

d -H

(0 P

Λ (0

Vl d H

0 P H

X Q) r-l H

01 AI o >

d -H g I

p d h P r-l \ β β β β

O m P β β P -Η Ρ -H

g Ρ O Ρ 01 01 P P g g g g p a» o m g g \ g r- 00 P Hl Λ 1- o <U<f- li n Hl r r— Π ΓΊ 0 g in -rl ·. W ai p ω a) d οι λ;

Ai Ή O (0 r-l ai : 3 > Ρ P — ai -h g o > ·· x g ·* 'e*’ 01 d T-

P

01 Τ Ο

Ό P

O P

d p p < 8 O <

E a +j ftftQ

β d P QEnHQriJ QQS

P P d WQQSHQQH

M Old aWUHZWWffi

»S M P 1 » 1 I I I I I

> P S) + + + + + + + + ρ Ai rommnnnnp p i aiaiaiaiaiaiaiai d + tapLifahhfofafo P ΓΟ ai ai g k

H

>

0 H H H > > X

U X H H H X

β XX X H X d H d X d ΤΊ • d ·ο d d -p g d -p -p d ·ρ h

P -p H -p H H

01 H H > H H H

W HHHH>>>> 25 77939 B. Testiväline

Esimerkki xvn

Suoritettiin koe, jossa valmistettiin keksinnön mukainen kiinteä testiväline. Väline muodostui paperikantajamat-5 riisistä ja siinä olevasta yllä esimerkissä I kuvatusta keksinnön koostumuksesta sillä erolla, että aineosien kon-sentraatiot oli muutettu vastaamaan kiintovälinemuotoa. Koostumuksen liittäminen matriisiin ja testivälineen valmistus tapahtui seuraavasti: 10 Valmistettiin 50 millimoolinen N-(2-hydroksietyyli)- etyleenidiamiinitrietikkahappoferrikelaatin (Fe-HEDTA, moo-lisuhde 1:1) liuos liuottamalla 1,39 g N-(2-hydroksietyyli)-etyleenidiamiinitrietikkahappoa 100 ml:aan tislattua vettä ja lisäämällä tämän jälkeen liuokseen 1,35 g FeCl^·61^0:ta.

15 Valmistettiin kaksi liuosta (koostumukset alla). Tes tivälineen valmistamiseksi Whatman 3 MM suodatinpaperipala, jonka mitat olivat suunnilleen 15 x 10 cm, kyllästettiin rea-genssiliuoksilla siten, että paperi sisälsi maksimimäärän reagenssikoostumusta toisen kaston jälkeen. Tässä menette-20 lyssä kyllästys tapahtui siten, että paperi kastettiin ensimmäiseen liuokseen, kyllästetty paperi kuivattiin, sitten kuivattu paperi kyllästettiin toistamiseen kastamalla toiseen liuokseen ja kuivattiin lopuksi. Kuivaaminen tapahtui ilmankierrätyksellä varustetussa lämpökaapissa 105°C:ssa n.

25 kahdeksan minuuttia ensimmäisen kyllästyksen jälkeen ja 50°C:ssa n. viisi minuuttia toisen kyllästyksen jälkeen.

Ensimmäinen reagenssiliuos valmistettiin sekoittamalla seuraavat aineosat:

Tislattua vettä 74,0 ml 30 i-m TRIS-malonaattipuskuria, pH 6,5 10,0 ml 5,5-m kumeenivetyperoksidia 4,0 ml I ! 10 g/dl natriumdodekyylisulfaattia 2,0 ml 50 millimoolista Fe-HEDTA:a (valmistettu, : kuten yllä on kuvattu) 10,0 ml *:**: 35 Toinen reagenssiliuos valmistettiin sekoittamalla ·' seuraavat aineosat: 26 7 7 9 3 9

Etanolia 79,4 ml 6-metoksikinoliinia, vapaa emäsmuoto 0,6 ml 20 p/t-%:ista polyvinyylipyrrolidoni- vesiliuosta (molekyylipaino 40 000) 20,0 ml 5 3,3',5,5'-tetrametyylibentsidiiniä 0,6 g

Kuivattu, kyllästetty paperi laminoitiin kaksipuolisen teippiarkin toiselle puolelle, valmistaja 3M Company,

St. Paul, Minn. 55144. Sitten laminaatti viillettiin liuskoiksi, joiden mitat olivat n. 15 x 0,5 cm. Yksi liuskoista 10 kiinnitettiin toisen liimapinnan avulla polystyreenikalvoon, jonka mitat olivat n. 9 x 15 cm, ja muodostunut laminaatti viillettiin lyhyemmän sivunsa suuntaisesti testivälineiksi, jotka muodostuivat 9 cm pitkästä polystyreeniliuskasta, jonka toisessa päässä on neliömäinen kyllästetty paperi ja toi-15 nen pää toimii tarttumispäänä.

Kun esimerkin XVII menetelmän mukaan valmistettua välinettä testattiin virtsanäytteillä, jotka sisälsivät vaihtelevia määriä hemoglobiinia ja 50 mg/dl askorbaattia, välineessä muodostui toisistaan helposti erottuvia siniväri-20 intensiteettejä, jotka vastasivat eri hemoglobiinipitoisuuksia. Tämä oli osoituksena välineen kyvystä todeta näytteissä oleva hemoglobiini suurista askorbaattikonsentraa-tioista huolimatta.

Esimerkki XVIII

: 25 Toistettiin esimerkin XVII koe sillä erolla, että en simmäisessä reagenssiliuoksessa käytettiin 10,0 ml 50 milli-moolista Fe-EDTA-liuosta Fe-HEDTA:n asemasta.

Esimerkin XVIII mukaan valmistetut välineet testattiin yllä kuvatulla tavalla virtanäytteillä, jotka sisäl-30 sivät vaihtelevia määriä hemoglobiinia ja 50 mg/dl askorbaattia ja saatiin toisistaan helposti erottuvia siniväri-intensiteettejä, jotka vastasivat eri hemoglobiinipitoisuuksia.

Esimerkki XIX

35 Toistettiin esimerkin XVII koe sillä erolla, että ensimmäisessä reagenssiliuoksessa käytettiin 10,0 ml 50 mil-limoolista Fe-CDTA-liuosta Fe-HEDTA:n asemasta.

27 77939

Esimerkin XIX mukaan valmistetut välineet testattiin yllä kuvatulla tavalla virtsanäytteillä, jotka sisälsivät vaihtelevia määriä hemoglobiinia ja 50 mg/dl askorbaattia ja saatiin toisistaan helposti erottuvia siniväri-intensi-5 teettejä, jotka vastasivat eri hemoglobiinipitoisuuksia.

Esimerkki XX

Toistettiin esimerkin XVII koe sillä erolla, että ensimmäisessä reagenssiliuoksessa käytettiin 10,0 ml 50 mil-limoolista Fe-IMDA-liuosta Fe-HEDTA:n asemasta.

10 Esimerkin XX mukaan valmistetut välineet testattiin yllä kuvatulla tavalla virtsanäytteillä, jotka sisälsivät vaihtelevia määriä hemoglobiinia ja 50 mg/dl askorbaattia ja saatiin toisistaan helposti erottuvia siniväri-intensi-teettejä, jotka vastasivat eri hemoglobiinipitoisuuksia.

15 Esimerkki XXI

Toistettiin esimerkin XVII koe sillä erolla, että ensimmäisessä reagenssiliuoksessa käytettiin 10,0 ml 50 mil-limoolista Fe-NTA-liuosta Fe-HEDTA:n asemasta.

Esimerkin XXI mukaan valmistetut välineet testattiin 20 yllä kuvatulla tavalla virtsanäytteillä, jotka sisälsivät vaihtelevia määriä hemoglobiinia ja 50 mg/dl askorbaattia " ja saatiin toisistaan helposti erottuvia siniväri-intensi- teettejä, jotka vastasivat eri hemoglobiinipitoisuuksia.

Esimerkki XXII 25 Fe-DTPA

Suoritettiin koe, jossa valmistettiin keksinnön mu-kainen koostumus, jonka avulla voidaan osoittaa peroksidaa-sin tai jonkin muun peroksidatiivisesti aktiivisen aineen, erityisesti hemoglobiinin läsnäolo koenäytteessä. Koostu-30 raus sisälsi askorbaattiahäiriötä hidastavana aineena diety-leenitriamiinipentaetikkahapon ferrikelaattia (Fe-DTPA) (moolisuhde 1:1). Fe-DTPA-kelaatti valmistettiin liuottava maila 0,387 g DTPA:ta 100 ml saan tislattua vettä, jolloin saatiin 10 millimoolinen (mmol) DTPA-liuos, ja liuottamal-m\ 35 la sitten 0,270 g FeClg.öI^Osta 10 millimooliseen DTPA- liuokseen. Koostumukseen lisätään askorbiinihappoa kon-sentraationa 5 mmol sellainen määrä, että konsentraatio : lopulliseen tilavuuteen säädetyssä liuoksessa oli 28 779 3 9 50 mikromoolia. Koostumuksen aineosat ja askorbiinihappo yhdistettiin seuraavassa taulukossa ilmoitetussa järjestyksessä ja ilmoitettuina määrinä. Lopullinen koostumus-liuos sisälsi 100 mikromoolia (pmol) Fe-DTPA:ta. Tämä pi-5 toisuus kuten muidenkin mukana olevien aineosien pitoi suudet ovat huomattavasti pienempiä kuin ne pitoisuudet, joita käytettäisiin vastaavassa keksinnön mukaisessa koostumuksessa, joka lisätään kiintomuodossa olevaan koesti-meen tai testivälineeseen.

10 0,2-m (moolista) natriumsitraattipuskuria 9,5 ml 10 millimoolista Fe-DTPA:ta 0,1 ml 10 g/dl natriumdodekyylisulfaattia 0,1 ml 1-m kumeenivetyperoksidia 0,1 ml 15 10 millimoolista 3,3'-5,5'-tetrametyyli- bentsidiiniä 0,1 ml 5 millimoolista askorbiinihappoa 0,1 ml

Havaittiin, että näin valmistettu keksinnön mukai-20 nen koostumus synnytti sinisen värin, kun lisättiin veri näytteestä määräosa, joka saatiin laimentamalla vedellä lopulliseen konsentraatioon 0,139 mg/dl hemoglobiinia. Näin voitiin osoittaa, että koostumuksella voidaan todeta hemoglobiinin läsnäolo, vaikka askorbaatin konsentraatio näyt-25 teessä oli 50 mikromoolia.

Samanlaiset tulokset saatiin, kun meneteltiin muutoin analogisesti edellä kuvatulla tavalla, mutta käytettiin trietyleenitetramiiniheksaetikkahappoa dietyleenitri-amiinipentaetikkahapon tilalla.

30 C. Testivälineen askorbaattlhäiriön sietokyky ja sta biilisuus

Suoritettiin lisäkokeita sen varmistamiseksi, että yllä esimerkissä XVII kuvatulla tavalla valmistetulla testi-välineellä pystytään toteamaan hemoglobiini virtsasta as-35 korbaatin läsnä ollessa rasituksen jälkeen, joka vastasi pitkäaikaista varastointia. Kokeet suoritettiin eräillä välineillä välittömästi niiden valmistamisen jälkeen ja eräillä sitten, kun niitä oli varastoitu määrätyn pitkiä 29 77939 aikoja kohotetussa lämpötilassa. Välineistä testattiin ja vertailtiin erityisesti suorituskyky välittömästi valmistuksen jälkeen ympäristölämpötilassa (n. 23°C) ja kymmenen (10) ja kahdenkymmenenkahdeksan (28) vuorokauden jälkeen 5 "lämpörasitettuina" n. 50°C:ssa lämpökaapissa.

Formuloitiin sarja testivirtsaliuoksia, jotka sisälsivät vaihtelevia määriä hemoglobiinia. Valmistettiin myös kaksi hemoglobiiniliuosta/ jotka sisälsivät 50 mg/dl askorbaattia.

10 Valmistettiin perusliuos, joka sisälsi 15,4 mg/dl hemoglobiinia, laimentamalla kokoverta tislatulla vedellä konsentraatioon 15,4 mg hemoglobiinia per 100 ml vettä. Kokoveren hemoglobiinimäärä oli tätä ennen määritetty tavanomaisin menetelmin. Kokoomavirtsanäyte, joka ennalta oli 15 todettu negatiiviseksi hemoglobiinin ja askorbiinihapon suhteen, asetettiin syrjään nollanäytteenä. Sitten valmistettiin testiliuoksia pipetoimalla määräosia veriliuosta kokoomavirtsaan muodostamaan virtsaliuoksia, joissa oli 0,015, 0,031, 0,062 ja 0,139 mg/dl hemoglobiinia. Osa virt-20 saliuoksista, joissa oli 0,031 ja 0,062 mg/dl hemoglobiinia, otettiin erillisiin säilytysastioihin ja lisättiin vä-littömästi ennen testausta niin paljon askorbiinihappoa, että liuosten askorbaattipitoisuudeksi tuli 50 mg/dl.

; Esimerkin XVII mukaan valmistettua välinesarjaa samoin ' I 25 kuin välinesarjaa, joka oli valmistettu mainitun esimerkin mukaan, mutta ilman Fe-HEDTA:a, testattiin nollaliuoksessa ·;·; ja kussakin hemoglobiinivirtsaliuoksessa. Välineet kastet- *·'·' tiin hetkeksi kuhunkin liuokseen, poistettiin liuoksesta ja värinmuutos välineessä luettiin yhden minuutin kuluttua.

30 Mudoostuneet värit verrattiin visuaalisesti toisiinsa ja standardiväriasteikkoon suhteellisen intensiteetin määrit-:Y: tämiseksi minuutti kaston jälkeen. Värit vaihtelivat värit- tömyydestä (nollaliuos) tumman vihertävänsiniseen liuoksel-; la, jossa oli 0,139 mg/dl hemoglobiinia.

’* ; 35 Tämän testauksen tulokset, jotka ilmenevät yhteenve tona alla olevasta taulukosta, osoittavat, että käsiteltä-vänä olevan keksinnön testivälineet, jotka testattiin kah-dessa askorbaattipitoisessa hemoglobiininäytteessä sekä vastavalmistettuina että oltuaan 50°C:ssa 10 vuorokautta, 30 77939 synnyttivät hemoglobiinin läsnä ollessa vasteita, jotka vastasivat välineiden vasteita, joilla testattiin virtsanäytteitä ilman askorbaattia. Tulokset vastaavasta testauksesta, jossa käytettiin Fe-HEDTA:a sisältämättömiä kontrolliväli-5 neitä, osoittivat, että näytteessä oleva askorbaatti inhiboi lähes täysin kontrollivälineiden vasteen. Sen sijaan pystyttiin keksinnön tämän suositeltavan toteuttamismuodon mukaan valmistetuilla välineillä helposti toteamaan hemoglobiini konsentraatioina 0,031 ja 0,062 mg/dl siitä huoli-10 matta, että askorbaatin konsentraatio oli 50 mg/dl. Siten Fe-HEDTA:n läsnäolo näyttää dramaattisesti poistavan askor-baattihäiriön.

3i 77939 • ·

I Ή M

01 -H 4-> 3 -μ fi

•H :0 O

rH Oi Ai I I

B ^ cm c m c :<e m -P i o Ό P rl * +) m -p ^ +i (< ai m o = en a) · EH oi 3 o g

-POiQocMomo oo <d +» «-01 g W t- (N ΓΟ ΓΟ r*· r- 1- CC = LO

-H >1 K 3 O >1 *- g I -P >1 O o rH d) d) -H Id -P > *·

id C Pn O-P-PPO

> -rt P -P -H (ti m rH e λ m -h -h -p :m m -h r-ι m ή 01 > g rH -rl 01 <l) cmm>H mP0)w ·· oi > a: -h m :m to m m e 3 > -p -p

Eh 3 :m m P -P · QOiaiCJ >i · -n m 3 <d

M -H CO AI O A! 3 -H

rCrH-HO >ι <u · -H oi e

I -H rH in Ai -P O P -H -H

d) -H :id 01 p e :(0 O -p (ΡΛ > · -k o m (N o co o oo 3 <d h > -P Λ

td m-P^T-T-oimm cn cn +>> -HO

* -P Ai 01 p -H * S) Λ H

Coioim> ptdoioictr d) 3 P o -rt 0) CO <u o •n C -H <d oo 3 O -H ad > g 3 O P > N 01 ^ P tt Ή 0)

P Ό οι O Λ JC

P ·Η C 3 -P

aiaiaio <d -h m e e ή

PC CO «UrHPO-PO

01 -H -H O C -h o -P C ^ H iH rH ΙΛ -H P Λ P -H O’ g Md Md rHQ)(dCd-Hg rH > >· * O O UI O O (NO Uti > ij > Λ (d(d IdU^r-NNM^ (N ro >0 O o > Ai Ai ui p id h oi :td rH m ui ui td > ^•hoj-pö'»- H 3 3 P 01-HHWO**

•P -H -H (d o 3 a -H -H g O

CO r-l |3 > T- -H £ g ti) 0) -H rH <d :td J3 m CO +) -H 01 m -P ·γϊ •H 01 dl * -P01O-P(d

(ddJC-P 01-H*H(dVO

Ai -P · -H :0 d) > C P -P n· 3 g rH Oi -P iti O Md -P o -- g e rH Md g -p -h :jd ·Η * d) (d>:(dooiT)CNN· in n -P id oi g o o ..... C -H >idrH^(N(Nnn n n id id -H a! :0 > id Ai >oi>CP-h

C Md -P en · id-Hdiid-P

C -P 01 3 a -PCQP-PW

---- -HrHld-Hg (d 01 O 0) (ti oi :id > H >, O 3 01>=> - - - M oi Oi OiddlOoid 0) -H Oi dl AI E h N Id

«01 (d Oi<-Hs+J

JC -P Tl -H 01 — id ·Η O Id O. - m HO C > ' -P 01 >

Ό Oi -h PtdrHdSO

\ Oi *H Id rl Id X H ·Ρ

Cn n) » Λ o ή *i~i m 3 id g xi iti P P <d id Eh -P >

'-'•Hd) O dJ+J-PWO

- - - 3 Ai a: g p 01 <c e

-H-HOlfir-CMOOlrlN 3 id -H S d) O

dlC-Hoit-covomidfnvo e Ai 6 W C n·

Ρ-ιΗΛ'-'ΟΟΟ’- O O -H H K -H

.. >1 -H P - ~ - rH - «· C P Id > Id - · ιιΰΛΟοοοοοΌοο o :id > e -h -n : ·. e o a: ^ a; > d) -h

(dHOl CT 3 ·<Η (d 0) .p O

oitjiid g rHOoicoidn -PO 3 P oi 0) O' p g -h o id id -h d) ai id .‘I -H d> ti) m Eh Ό > -P C ·η ... > se ~ — * 32 7 7 9 3 9

Yllä olevan taulukon tulokset osoittavat, että erot reaktiivisuudessa olivat pieniä käsiteltävänä olevan keksinnön testivälineillä, jotka toisaalta olivat vastavalmistettu-ja ja toisaalta varastoitu 50°C:ssa 10 tai 28 vuorokautta.

5 Tämä tulos on päinvastainen odotettavissa olevalle tulokselle eli ferrikelaatin ja vetyperoksidin samassa testiväli-neessä tapahtuvan reaktion pitäisi huonontaa välineen reaktiivisuutta nopeammin lämpörasituksen alaisena kuin varastoitaessa ympäristölämpötilassa. Tämä osoittaa keksinnön 10 koostumuksen ja välineen hyvän stabiilisuuden ja suotuisan varastointikestävyyden. Kuten arvoista käy ilmi, orgaaninen vetyperoksidi ja Fe-HEDTA, Fe-HEDTA ja indikaattori ja nämä aineosat sekä liuskan muut aineosat sopivat täysin tai lähes täysin yhteen jopa varastoitaessa pitkään kohotetussa 15 lämpötilassa. Lisäksi metallikelaatti(Fe-HEDTA) pitoiset testivälineet ja samalla tavoin valmistetut välineet ilman Fe-HEDTA:a olivat olennaisesti yhtä herkkiä testiliuosten hemoglobiinille ilman askorbaattia ja ne eivät synnyttäneet "virheellisesti positiivisia" tuloksia, mikä on merkkinä 20 reagenssien erinomaisesta yhteensopivuudesta. Testiliuosten **: sisältämä askorbaatti pystyi käytännöllisesti katsoen täy sin inhiboimaan ilman Fe-HEDTA:a valmistetut välineet. Tähän verrattuna askorbaatti inhiboi paljon vähemmän keksinnön Fe-HEDTA-pitoisia liuskoja, jotka itse asiassa pystyivät rea-; 25 goimaan visuaalisesti toisistaan erottuvilla väreillä minuu- tin kuluttua niinkin pieniin hemoglobiinipitoisuuksiin kuin 0,031 ja 0,062 mg/dl.

Käsiteltävänä olevan keksinnön etujen edelleensel-ventämiseksi suoritettiin yllä kuvatun kaltaisia lisäkokei-30 ta esimerkissä XVII kuvatulla tavalla valmistetuilla väli-r.: neillä, ts. välineillä, jotka sisälsivät Fe-HEDTA:a. Mutta : : visuaalisen tekniikan asemasta käytettiin "Rapid Scanner" ‘ nimistä laitetta. Tämä on skannaava heijastusspektrofoto- - metri liitettynä laboratoriomikrotietokoneeseen. Laitteella 35 voidaan nopeasti mitata näkyvän alueen heijastuspektrejä. Tietokone pystyy tallentamaan spektriarvot ja suorittamaan 33 77939 laskutoimituksia. Reagenssiliuskojen suorituskyvyn mittaamiseen Rapid Scannerilla liittyy samojen liuskojen visuaaliseen arviointiin verrattuna esim. seuraavat edut: 1. Valonlähde ja olosuhteet näytteen ympärillä säi-5 lyvät samoina. Arvioitaessa visuaalisesti valonlähteessä saattaa esiintyä vaihteluja ei vain aallonpituuden vaihteluiden, vaan myös sen ja arvioitavan liuskan sijainti vaihtelujen vuoksi.

2. Detektoriarvot säilyvät samoina. Visuaalisessa 10 arvioinnissa detektori (ts. havainnon tekijän silmä) voi vaihdella henkilöstä toiseen ja samalla henkilöllä päivästä toiseen.

3. Rapid Scanner mahdollistaa arvojen tarkemman kvan-tifioinnin kuin visuaalinen lukeminen ja siten tuloksia voi- 15 daan verrata toisiinsa objektiivisemmin.

Rapid Scanneria valmistaa Ames Division of Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana, jolta saa tarkemmat tiedot laitteen rakenteesta ja suorituskyvystä. Ks. myös M.A. Genshaw ja R.W. Rogers, Anal. Chem., Voi. 53, s. 1949-20 1952 (1981).

Värieroarvojen (ΔΕ) laskemiseksi käytettiin Rapid ; : Scannerin antamia kolmiärsytysarvoja, joista on sovittu julkaisussa "Supplement Nro 2 to Comission Internationale de L'Eclairage (Paris, France), Publication No. 15, 25 Colorimetry, (E.-1.3.1) 1971”. Niinpä tämän laitteen antamat arvot on alla rekisteröity ΔΕ-yksikköinä eli värieroyk-sikköinä.

Keksinnön mukaisista, Fe-HEDTA:a sisältävistä testi-liuskoista testattiin yllä kuvatuin menetelmin kyky todeta 30 hemoglobiinipitoisuudet 0,031 mg/dl ja 0,062 mg/dl. Eräitä välineitä testattiin virtsanäytteissä, jotka sisälsivät :V: 50 mg/dl askorbaattia, eräitä samoissa näytteissä, jotka eivät sisältäneet askorbaattia, eräitä välittömästi valmistuksen jälkeen ympäristölämpötilassa sekä eräitä ympäristö-35 lämpötilassa ja 50°Csssa 11 ja 28 vuorokautisen varastoinnin jälkeen.

34 7 7 9 3 9

Rapid Scannerin antamat värieroyksiköt (ΔΕ) vastasivat eri hemoglobiinipitoisuuksia. Kun Fe-HEDTA:a sisältävät välineet testattiin virtsanäytteissä, jotka sisälsivät 0,031 ja 0,062 mg/dl hemoglobiinia askorbaatin kera tai 5 ilman sitä, saatiin tuloksia, jotka ilmenevät seuraavasta taulukkosarjasta:

Vastavalmistettu väline Virtsanäyte

Hemoglobiini Askorbiinihappo Pikaskannaustulokset (£E) 10 (mg/dl) (mg/dl) Testiväline 0,031 0 21,89 0,031 50 15,75 0,062 0 29,78 0,062 50 22,84 15 Ympäristölämpötilassa 28 vrk varastoitu väline

Virtsanäyte

Hemoglobiini Askorbiinihappo Pikaskannaustulokset (ΔΕ) (mg/dl) (mg/ml) Testiväline 0,031 0 15,50 20 0,031 50 13,29 0,062 0 26,31 0,062 50 18,20 50°C:ssa 11 vrk varastoitu väline Virtsanäyte 25 Hemoglobiini Askorbiinihappo Pikaskannaustulokset (ΔΕ) (mg/dl) (mg/dl) Testiväline 0,031 0 20,86 0,031 50 12,36 0,062 0 30,04 30 0,062 50 27,26 35 77939 50°C:ssa 28 vrk varastoitu väline Virtsanäyte

Hemoglobiini Askorbiinihappo Pikaskannaustulokset (ΔΕ) (mg/dl) (mg/dl) Testiväline 5 0/031 0 10,31 0,031 50 7,78 0,062 0 20,86 0,062 50 16,38

Yllä instrumentaalisin kokein saadut arvot vahvista-10 vat edellä esitetyt visuaaliset arvot. Arvot osoittavat keksinnön välineiden stabiilisuuden ja merkitsevän askor-baattihäiriön torjumisen tällaisissa välineissä jopa pitkäaikaisen varastoinnin ja kohotetussa lämpötilassa tapahtuneen varastoinnin jälkeen.

15 Testattiin vielä visuaalisesti sarja testivälineitä, jotka oli valmistettu keksinnön mukaisesti yllä esimerkissä XVIII kuvatulla tavalla, ts. välineitä, jotka sisälsivät Fe-EDTA:a. Välineiden valmistuksen jälkeen niitä testattiin virtsanäytteissä, jotka sisälsivät vaihtelevia määriä hemo-20 globiinia tai ei lainkaan hemoglobiinia sekä kahden hemo-globiinipitoisuuden näytteistä, joissa oli 50 mg/dl askor-baattia. Eräitä välineitä testattiin välittömästi valmistuksen jälkeen ja eräitä lämpökaapissa 50°C:ssa kahdenkymmenen-kahdeksan (28) vuorokauden varastoinnin jälkeen. Tämän tes-25 tauksen tulokset ilmenevät seuraavasta taulukosta, jossa numeroarvot vastaavat visuaalisia väriarvoja, jotka saatiin

R

vertaamalla yllä mainittuun HEMASTIX -standardivärikarttaan. Kaikki nämä testit suoritettiin yllä kuvatulla tavalla.

36 7 7 9 3 9

Keksinnön mukaisesti valmistettujen, Fe-EDTA:a sisältävien testiliuskavälineiden stabiilisuus

Hemoglobiini (mg/dl) Vastavalmistettu lius- Liuskaväline 5 (ei askorbiinihappoa) kaväline ymp. lämpöt. varast. 50° C:ssa 28 vrk 0 10 20 0,015 12 11 0,031 20 15 10 0,062 30 22 0,139 35 30 (50 mg/dl askorbiinihappoa) 0,031 20 14 0,062 30 22 15 Näiden jälkimmäisten testien tulokset vahvistavat, että keksinnön kuvatun lisätoteuttamismuodon mukaan valmistetut välineet ovat stabiileja, ne eivät anna virheellisesti positiivisia tuloksia ja ne ovat olennaisesti epäherkkiä askorbaatin aiheuttamalle inhibitiolle.

20 On selvää, että keksinnön suositeltavia, erityisesti julkistettuja toteuttamismuotoja voidaan monin tavoin modifioida ja varioida poikkeamatta keksinnön hengestä ja pa-tenttisuojapiiristä. Niinpä vain seuraavia patenttivaatimuksia pidetään keksintöä rajoittavina.

Claims (10)

37 779 39

1. Koostumus peroksidatiivisesti aktiivisen aineen toteamiseksi testinäytteestä, joka koostumus muodostuu or- 5 gaanisesta vetyperoksidista ja indikaattorista, joka pystyy synnyttämään todettavissa olevan vasteen peroksidatiivisesti aktiivisen aineen ja peroksidin läsnäollessa, tunnettu siitä, että koostumus lisäksi sisältää polykarb-oksialkyyliamiinijohdannaisen metallikelaattia, joka on 10 yleistä kaavaa /Pr r r, i ( I* ly I1 i. /M - dj jyr jossa (a) on vety tai suora tai haarautunut, 2-3 hii-20 liatomia sisältävä alkyylialkoholi- tai alkyylikarboksyyli-happoradikaali; R2, Rj, Rx ja R^ ovat samoina tai erilaisina suoria tai haarautuneita, 2-3 hiiliatomia sisältäviä alkyylialkoholi- tai alkyylikarboksyylihapporadikaaleja, jolloin vähintään kaksi radikaaleista R1, R0, R^, R ja R 25 ovat näin määriteltyjä alkyylikarboksyylihapporadikaaleja; - (b) R ja R ovat samoina tai erilaisina suoria tai P <1 haarautuneita, 1-3 hiiliatomia sisältäviä alkyleeniradikaa-leja tai kaksiarvoisia 1,2-sykloalifaattisia, 6-9 hiiliatomia sisältäviä radikaaleja; 30 (c) n on kokonaisluku 0-1; m on kokonaisluku 0-2, jolloin, jos m on suurempi kuin 0, toistuvat R - ja toistu- r vat Rg-radikaalit voivat olla samoja tai erilaisia; ja (d) M on Fe3+.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, t u n - : 35 n e t t u siitä, että (a) m on 0 ja (b) Rp on etyleeniradikaali. 38 77939

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että vähintään kaksi radikaaleista Hj, 1*2' ^3' 3a merkitsee alkyylikarboksyylihappo-radikaalia -CH2COOH.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tun nettu siitä, että metallikelaatti valitaan ryhmästä N-(2-hydroksietyyli)etyleenidiamiinitrietikkahapon, ety-leenidiamiinitetraetikkahapon, sykloheksyleenidiamiinitet-raetikkahapon, nitrilotrietikkahapon, iminodietikkahapon, 10 Ä-etyleenidiamiinidietikkadipropionihapon, /3-etyleenidi-miinidietikkadipropionihapon, hydroksyylietyyliaminodi-etikkahapon ja niiden seosten ferrikelaatit.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1 - 4 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että orgaaninen vetyperoksidi 15 on kumeenivetyperoksidi ja indikaattori on 3,31,5,51-tetra-metyylibentsidiini.

6. Koestin peroksidatiivisesti aktiivisen aineen toteamiseksi testinäytteestä, tunnettu siitä, että se muodostuu kantajamatriisista liitettynä jonkin patentti- 20 vaatimuksista 1-5 mukaiseen koostumukseen.

7. Menetelmä koestimen valmistamiseksi, jolla todetaan peroksidatiivisesti aktiivisen aineen läsnäolo testinäytteestä, joka koestin ei ole herkkä näytteessä mahdollisesti olevan askorbaatin aiheuttamille häiriöille, t u n - 25. e t t u siitä, että : a) valmistetaan ensimmäinen reagenssiliuos, joka si sältää orgaanista vetyperoksidia ja polykarboksialkyyli-amiinijohdannaisen metallikelaattia, joka on yleistä kaavaa “ (Ti- 1 h' ( 3 P q 2/J -·«u m sy *! 35 3, 7 7 9 3 9 jossa (i) R^ on vety tai suora tai haarautunut, 2-3 hiiliatomia sisältävä alkyylialkoholi- tai alkyylikarboksyyli-happoradikaali, R9, R.,, R ja R ovat samoina tai erilaisi-5 na suoria tai haarautuneita, 2-3 hiiliatomia sisältäviä alkyylialkoholi- tai alkyylikarboksyylihapporadikaaleja, jolloin vähintään kaksi radikaaleista R^ , R2, R-j, βχ ja Ry ovat näin määriteltyjä alkyylikarboksyylihapporadikaaleja; (ii) R ja R ovat samoina tai erilaisina suoria tai Γ '’d 10 haarautuneita, 1-3 hiiliatomia sisältäviä alkyleeniradikaa-leja tai kaksiarvoisia 1,2-sykloalifaattisia, 6-9 hiiliatomia sisältäviä radikaaleja; (iii) n on kokonaisluku 0-1; m on kokonaisluku 0-2, jolloin, jos m on suurempi kuin 0, toistuvat R - ja toistu- 15 vat R -radikaalit voivat olla samoja tai erilaisia; ja 3 3 + (iv) M on Fe ; b) liitetään ensimmäinen reagenssiliuos kantajamat-riisiin kostuttamalla matriisi ensimmäisellä liuoksella; c) kuivataan kostutettu matriisi, jolloin siihen jää 20 metallikelaattia ja vetyperoksidia; d) valmistetaan toinen reagenssiliuos, joka sisältää indikaattoria ja liuotinta, joka indikaattori pystyy synnyttämään todettavissa olevan vasteen peroksidin ja peroksi-datiivisesti aktiivisen aineen läsnäollessa; 25 e) liitetään toinen reagenssiliuos kuivattuun kanta- jamatriisiin kostuttamalla matriisi toisella reagenssiliuok-sella? ja f) kuivataan matriisi, jolloin siihen jää yhdistyneinä metallikelaattia, vetyperoksidia ja indikaattoria.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että indikaattori on 3,3',5,5'-tetra-metyylibentsidiini. 40 7 7 9 3 9

9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että orgaaninen vetyperoksidi on kumeen1vetyperoksidi.

10. Menetelmä peroksidatiivisesti aktiivisen aineen 5 toteamiseksi testinäytteestä, tunnettu siitä, että näyte saatetaan kosketukseen jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukaisen koostumuksen kanssa ja luetaan todettavissa oleva vaste. 41 77939