FI74978B - Foerfarande foer framstaellning av maennisko-gamma-interferon. - Google Patents

Description

74978 \

Menetelmä ihmisen gamma-interferonin valmistamiseksi Tämä keksintö koskee uutta ja parannettua menetelmää ihmisen gamma-interferonin valmistamiseksi.

5 Tunnettua on, että ihmisen leukosyytit tuottavat gamma-interferonia (immuuni-interferonia) mitogeenisten aineiden vaikutuksesta. Gamma-interferoni eroaa kuitenkin biologisilta ominaisuuksiltaan leukosyytti- (alfa-) ja fibroblasti- (beta-) interferoneista, joita leukosyytit 10 tuottavat virusinfektion tuloksena, ja vastaavasti joita muodostuu fibroblastista alkuperää olevissa soluissa synteettisten polynukleotidien vaikutuksesta. Koska gamma-interferonilla on kyky estää solujen jakautuminen ja vaikuttaa immuunijärjestelmän solujen toimintaan 15 sillä on merkittävästi enemmän toivottuja ominaisuuksia kuin alfa- ja beta-interferoneilla, ja tästä seuraa, että gamma-interferonia tullaanyhä laajenevassa mittakaavassa käyttämään syöpäsairauksien hoitamiseen (Nature 294, 6 (1981), Cellular Immunology 49, 390 (1980)).

20 Gamma-interferonia voidaan tuottaa erottamalla ve ren leukosyyttifraktio (valkosolukerros), poistamalla erytrosyytit gradienttisentrifugoinnin avulla tai edullisesti ammoniumkloridikäsittelyllä suoritetun hemolyysin avulla, inkuboimalla puhdistetut leukosyytit, käsittele-25 mällä näitä sopivilla aspesifisillä mitogeenisillä aineilla ja lopuksi eristämällä näin tuotettu gamma-interferoni sakan yllä olevasta nesteestä. Tunnetun tekniikan mukaisesti voidaan mitogeenisenä aineena käyttää concana-liini A:ta (Infect. Immun. 26, 36 (1979)), fytohemaglu-30 tiinia (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 16OI (1981)) tai enterotoksiinia (Int. Res. Commun. Sys. Med. Sei. 7, 595 (1979)).

Useita yrityksiä on tunnetusti tehty mitogeenisten aineiden aiheuttaman gamma-interferonituotannon lisäämi-35 seksi. Erään menetelmän mukaan gamma-interferonituotan-toa lisätään esikäsittelernällä leukosyyttejä 12-o-tetra- _____ . τ~ 74978 dekanoyyli-forbooli-13-asetaatilla (Vilcek et ai.: Biochemical Characterization on Lymphokines - Academia,

New York, sivu 323, (1980)). Mainitun menetelmän epäkohtana on se, että 12-o-tetradekanoyyli-forbooli-13-5 asetaatti on karsinogeeninen aine, ja siten näin tuotettu gamma-interferoni ei ilmeisesti sovellu käytettäväksi ihmisten hoitamiseen. Toisen viitejulkaisun mukaan (Nature 292, 842 (1981)) tekijät yrittivät lisätä gamma-inter-feronituotantoa käsittelemällä leukosyyttejä natrium-10 butylaatilla tai deksametasonilla, nämä yritykset eivät kuitenkaan onnistuneet.

Keksinnön tarkoituksena on lisätä mitogeenisten aineiden aiheuttamaa leukosyyttien gamma-interferonituotantoa, ja lisätä yksiköiden lukumäärää millilitraa 15 kohti.

Esillä olevan keksinnön mukaan saadaan aikaan menetelmä ihmisen gamma-interferonin valmistamiseksi, jonka menetelmän mukaan veren leukosyyttifraktio (valko-solukerros) erotetaan, erytrosyytit poistetaan, leuko-20 syytit suspendoidaan sopivaan kasvualustaan,näitä käsi tellään mitogeenisellä aineella ja interferonia sisältävä liuos erotetaan soluista, jolloin menetelmälle on tunnusomaista se, että leukosyyttejä esikäsitellään alfa- tai beta-interferonilla, jota on sopivimmin 25 200 - 20000 IU/ml, ennen kuin niitä käsitellään mito geenisellä aineella.

Esillä oleva keksintö perustuu siihen havaintoon, että gamma-interferonin tuotantoa voidaan merkittävästi lisätä - noin 500 - 1000 prosentilla - alistamalla leuko-30 syytit alfa- tai beta-interferoniesikäsittelyyn ennen kuin niitä käsitellään mitogeenisellä aineella.

Esikäsittelyssä käytetään alfa- tai beta-interfe-ronia määrissä 200 - 20000 IU/ml, sopivimmin 500 - 5000 IU/ml. (IU = International Unit, kansainvälinen yksikkö). 35 Menetelmämme edullisen suoritusmuodon mukaisesti suoritetaan mainittu käsittely käyttämällä alfa-inter- 3 74978 feronia määrässä 1000 - 2000, erityisesti määrässä 1500 IU/ml.

Menetelmämme erään toisen edullisen suoritusmuodon mukaisesti suoritetaan mainittu käsittely käyttämällä 5 beta-interferonia määrässä 2000 - 3000, erityisesti määrässä 2500 IU/ml.

Esikäsittely suoritetaan sopivimmin 1-12 tuntia, erityisesti 2-8 tuntia, ja erityisen edullisesti 4 tuntia ennen käsittelyä mitogeenisellä aineella.

10 Alfa- tai beta-interferonikäsittely suoritetaan edullisesti 1-12 tunnin, erityisesti noin 4 tunnin ajan. Esikäsittelyn lämpötila on edullisesti 35-39°C, erityisesti 37°C.

Interferoni poistetaan edullisesti alfa- tai beta-15 interferonikäsittelyn jälkeen ja ennen kuin mitogeeninen aine lisätään. Tämä vaihe voidaan edullisesti suorittaa pesemällä solut, etenkin Hanks'in liuoksella. Esikäsittelyssä käytetty interferoni voidaan jatkettaessa myös jättää solujen kasvualustaan. Tässä tapauksessa tuotettu 20 gamma-interferoni on eristettävä esikäsittelyvaiheessa käytetystä alfa- tai beta-interferonista.

Eristäminen voidaan suorittaa tunnettujen menetelmien mukaisesti, esim. lasikromatografiällä.

Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä 25 voidaan kasvualustana käyttää eri aminohappoja ja vitamiinejä sisältäviä kudoskasvualustoja, (esim. mainittakoon seuraavat: Eagle-tyyppinen MEM, RPMI 1640, Dulbecco-tyyppi-nen MEM, Glasgow-muunnettu MEM, j.ne.). On edullista käyttää kasvualustaa, jolla on seuraava koostumus; tämän 30 kasvualustan etuna on se, että se on halpa ja yksinkertainen, ja että sitä voidaan hyvin käyttää autoklaavissa.

Komponentti Määrä

Kalsiumkloridi 175-350 mg/1 35 Kaliumkloridi 300-500 mg/1 .----- ' TT" " 74978

Magnesiumsulfaatti tai vastaava määrä magnesium- kloridia 175-500 mg/1

Natriumkloridi 5000-7000 mg/1 5 Natriumvetykarbonaatti 200-3500 mg/1

Natriumdivetyfosfaatti 30-150 mg/1

Glukoosi 5ΟΟ-55ΟΟ mg/1

Rauta(III)nitraatti 0-0,2 mg/1

Seerumi 0,5-10 mg/1 10

Gamma-interferonin tuotanto suoritetaan eri eläin-tai ihmisveriseerumien tai gamma-globuliinista vapaan plasman läsnäollessa (0,5-10 %).

Esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän 15 mukaan käytetään lähtöaineena leukosyyttejä (valkosolu- kerrosta), jotka on saatu korkeintaan 72 tuntia 0-8°C:ssa säilytetystä ihmisverestä, jonka koagulointi on estetty.

Koaguloimisen estävänä aineena voidaan käyttää ACD-liuosta (liuos, joka sisältää sitruunahappoa ja deks-20 troosia) tai ACD-liuosta, jota on täydennetty erilaisilla emäksillä (esim. adeniinillä tai guaniinillä). Kerätyt leukosyytit voidaan poistaa gradienttisentrifugoinnin avulla (esim. ruotsalaisen Pharmcia-yhtiön valmistamien tuotteiden Ficoll tai Percoll avulla), tai edullisesti 25 ammoniumkloridilla suoritetun hemolyysin avulla. Voi daan edullisesti edetä sekoittamalla konsentroituun leukosyyttisuspensioon 0,5-1 %:sta - edullisesti 0,83 $:sta -ammoniumkloridiliuosta 0-10°C:n lämpötilassa tilavuus/ tilavuus-suhteessa 1 : 3-20, edullisesti 1 : 5. Suspensiota 30 inkuboidaan 5-20 minuuttia - edullisesti noin'10 minuuttia - 0-8°C:ssa sekoittaen tai sekoittamatta. Leukosyytit ero -tetaan disintegroituneista erytrosyyteistä esim. sentrifu-goinnin avulla. Voidaan edullisesti jatkaa toistamalla ammoniumkloridikäsittely käyttämällä 10 tilavuusosaa 35 ammoniumkloridiliuosta solususpension paino-osaa kohti.

Puhdistetut leukosyytit suspendoidaan sopivaan 5 74978 kasvualustaan (kasvualustoina tulevat kyseeseen esim.

Eagle-tyyppinen MEM, RPMI 16^0, Dulbecco-tyyppinen MEM,

Glasgow-modifioitu MEM jne.) tai yllä kuvattuun halpaan kasvualustaan (joka ei sisällä aminohappoja eikä vita- 6 8 5 miinejä), ja solujen määrä asetetaan arvoon 10° - 10° solua/ml. Menetelmän edullisessa suoritusmuodossa käytetään yllä kuvattua halpaa kasvualustaa, joka ei sisällä aminohappoja eikä vitamiineja, sekä solujen uudelleensus-pendoimiseen että solujen lukumäärän asettamiseen. Käy-10 tettävää kasvualustaa tai kasvuliuosta täydennetään eläin- tai ihmisveriseerumilla tai edullisesti gammaglobuliinista vapaalla ihmisplasmalla (0,5-10 %). On edullista lisätä antibioottia kasvualustaan tai -liuokseen; tähän tarkoitukseen voidaan edullisesti käyttää neo-15 mysiiniä konsentraatiossa noin 10-50 pg/ml, erityisesti konsentraatiossa 25 yg/1.

Solut alistetaan tämän jälkeen alfa- tai beta-interferonikäsittelyyn. Tätä tarkoitusta varten voidaan käyttää induktorivapaata viruksista tai synteettisistä 20 polynukleotidöistä vapaata) raakaa tai puhdistettua alfa-tai beta-interferonia määrissä 200 - 20000 IU/ml. Mainittu esikäsittely suoritetaan 35-39°C:n, erityisesti 37°C:n lämpötilassa, noin 1-12 tunnin, edullisesti tunnin ajan.

25 Mainitussa esikäsittelyvaiheessa käytetty inter feroni voidaan poistaa soluista, sopivimmin pesemällä.

Tämä vaihe voidaa suorittaa edullisesti käyttämällä Hanks'in liuosta. Kun interferoni on pesty solusta pois solukonsentraatio asetetaan alkuperäisarvoon ihmis- tai 30 eläinseerumia tai gamma-globuliinista vapaata plasmaa, erityisesti gamma-globuliinista vapaata ihmisseerumia käyttämällä.

Ei ole ehdottoman välttämätöntä pestä interferoni tuotteesta, koska alfa- tai beta-interferonin läsnäolo 35 ei vaikuta gamma-interferonin tuotantoon ei-suotavalla tavalla. Tässä tapauksessa tuotettu gamma-interferoni 6 74978 erotetaan läsnäolevasta alfa- tai beta-interferonista tunnettujen menetelmien avulla.

Solut saatetaan tämän jälkeen kosketuksiin sopivan interferoni-induktorin kanssa. Tähän tarkoitukseen voidaan ·/ sopivimman käyttää concanavaliina A:ta, fytohem^eglutiinia, ^ stafylococcusta, enterotoksiinia jne. joihin viitattiin yllä. Esillä olevan keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaan käytetään induktorina concanavaliini A:ta, sopi-vimmin konsentraatiossa 2,5-30 yg/ml, edullisesti 15 yg/ml. Induktio suoritetaan yleensä noin 5-^8 tunnin ajan, ^0 sopivammin 10-12 tunnin ajan 35-39°C:n edullisesti 37°C:n lämpötilassa. Tietyn ajan kuluttua (noin tunnin jälkeen) induktori voidaan poistaa pesemällä; tämä vaihe voidaan kuitenkin jättää pois, koska induktori ei läsnäolollaan häiritse gamma-interferonin tuotantoa. Induktoria ei sen ^ takia yleensä poisteta.

Solut poistetaan sen jälkeen sakan yllä olevasta nesteestä sentrifugoinnin avulla. Sakan yllä oleva liuos sisältää raakagamma-interferonin, joka voidaan varastoida alhaisessa lämpötilassa (noin -20°C:ssa) tai puhdistaa 2q tunnettujen menetelmien mukaisesti.

Esillä olevan keksinnön etuna on se, että alfa- tai beta-interferonilla suoritetun esikäsittelyn ansiosta saadaan gamma-interferonin tuotanto korotettua viisin- tai kymmenkertaiseksi. Esillä olevan keksinnön mukaisen mene- 2r telmän avulla tuotetun gamma-interferonin fysiokemialliset ^ o ominaisuudet (pH 2-herkkyys, stabilisuus mitattuna 56 C:ssa ja 37°C:ssa) ja sen biolooginen aktiivisuus (antiviraalinen ja antisellulaarinen vaikutus) ovat täysin vastaavat ja samanlaiset kuin tavallisilla menetelmillä tuotetun jq gamma-interferonin ominaisuudet.

Esillä olevan keksinnön lisäyksityiskohtia esitetään seuraavissa esimerkeissä ilman, että keksinnön soveltuvuutta rajoitettaisiin mainittuihin esimerkkeihin.

35 7 74978

Esimerkki ACD-liuoksessa (vesipitoinen liuos, joka sisältää sitruunahappoa ja'dekstroosia) saatu veri varastoidaan +4°C:ssa kolmen tunnin ajan. Valkosolukerros kerätään talteen sentrifugoinnin avulla ja sen annetaan seistä yön yli +4°C:ssa. Näin saa-5 dusta leukosyyttikonsentraatista sekoitetaan 1 tilavuus-osa 5 paino-osaan ammon.iumkloridin 0,83 ?:sta vesiliuosta (lämpötila: +4 C). Suspension annetaan seistä +4 C:ssa kunnes erytrosyytit liukenevat (5-10 minuuttia) ja leukosyytit erotetaan sentrifugoimalla. Leukosyytit suspendoidaan 10 kasvualustaan, jonka koostumus on seuraava:

Komponentti Määrä (mg/1)

Kalsiumkloridi 265

Rauta (III)nitraatti 0,1

Kaliumkloridi 400 15 Magnesiumsulfaatti-heptahydraatti 200

Natriumkloridi 6400

Natriumvetykarbonaatti 2750

Natriumdivetyfosfaatti-dihydraatti 140 Glukoosi 4500 20

Erytrosyyttien liuottamista yllä mainitulla menetelmällä toistetaan sillä erotuksella, että ammoniumkloridin 0,83 5?:sta vesiliuosta käytetään 10 paino-osaa. Leukosyytit suspendoidaan kasvuliuokseen, jolla on yllä mainittu koostu-25 mus, ja solujen lukumäärä asetetaan arvoon 10 solua/ml.

Kasvuliuos sisältää 2 mg/ml ihmisen gamma-seerumia ja 25 yg/ml neomysiiniä. Soluja käsitellään 37°C:ssa 4 tunnin ajan jatkuvan sekoituksen alaisina pH 2-käsittelyllä (sendai-viruk-sesta vapaaksi tehdyllä) konsentroidulla alfa-interferonilla, 30 jota on 1500 IU/ml. Sen jälkeen esikäsittelyyn käytetty alfa-interferoni poistetaan pesemällä Hanks’in liuoksella kahdesti. Soluja käsitellään concanavaliini A:11a, jota on 15 yg/ml ja ne inkuboidaan 37°C:ssa 12 tunnin ajan jatkuvan sekoituksen alaisina. Sakan yllä olevan liuoksen gamma-35 interferonipitoisuus on 50000 U/ml.

__-____ - X“ 8 74978

Vertailun vuoksi suoritetaan yllä mainittu esimerkki ilman että leukosyyttejä ensin käsiteltäisiin alfa-interferonilla ennen induktorin lisäystä. Näin saatu gamma-inter-feronitiitteri on ainoastaan 6500. U/ml.

5

Esimerkki 2

Menetellään kuten esimerkin 1 kohdalla on selitetty, mutta kasvualustana on Glasgow-tyyppinen MEM-kasvualusta (Virology 14, 359, (1961)). Näin saadun raakagamma-interfe-10 ronin aktiivisen aineksen määrä on ^8000 U/ml.

Yllä mainittu menettely toistetaan mutta alfa-inter-feronikäsittely jätetään pois. Näin saadun raakagamma-inter-feronin aktiivisen aineksen määrä on ainoastaan 6200 U/ml.

15 Esimerkki 3

Menetellään kuten esimerkin 1 kohdalla on selostettu, mutta esikäsittelyssä käytettyä alfa-interferonia ei poisteta. Kun alfa-interferonikäsittely on saatettu loppuun inku-boidaan solut jatkuvasti sekoittaen concanavaliini A:n 20 läsnäollessa 37°C:ssa 12 tunnin ajan. Sakan yllä olevan liuoksen interferonipitoisuus on 52000 U/ml.

Näin saatu tuote, joka sisältää alfa- ja gamma-interferonia, erotetaan komponenteikseen CPG-lasikromatografiän avulla. Raakatuote täytetään CPG-lasilla täytettyyn pylvää-25 seen, alfa-interferoni ja epäpuhtaudet valuvat pylvään läpi gamma-interferonin sitoutuessa. Gamma-interferoni eluoidaan vesiliuoksella, joka sisältää 20 tilavuusosaa eteeniglykolia, 150 millimoolia natriumkloridia ja 20 millimoolia fosfaatti-puskuria .

30

Esimerkki 4

Menetellään kuten esimerkissä 1 on selostettu, mutta esikäsittelyvaiheessa käytetään alfa-interferonin tilalla beta-interferonia, jota on 2500 IU/ml. Näin tuotetun gamma-35 interferonin pitoisuus raakatuotteessa on 56000 U/ml.

Yllä mainittu menetelmä toistetaan sillä erotuksella, 9 74978 että beta-interferonikäsittely jätetään pois. Näin saadun raakagamma-interferonin aktiivisen aineksen pitoisuus on 6800 U/ml.

*

Claims (8)

1. Menetelmä ihmisen gamma-interferonin valmistami- 5 seksi, jonka menetelmän mukaan veren leukosyyttifraktio (valkosolukerros) erotetaan, erytrosyytit poistetaan, leukosyytit suspendoidaan sopivaan kasvualustaan, niitä käsitellään mitogeenisellä aineella ja interferonia sisältävä liuos erotetaan soluista, tunnettu siitä, että leukosyyt- 10 tejä esikäsitellään alfa- tai beta-interferonilla ennen mitogeenisellä aineella suoritettavaa käsittelyä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että esikäsittely suoritetaan käyttämällä alfa-interferonia määrässä 1000 - 2000 IU/ml, sopivimmin 15 1500 IU/ml.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että esikäsittely suoritetaan käyttämällä beta-interferonia määrässä 2000 - 3000 IU/ml, sopivimmin 2500 IU/ml.

4. Jonkin patenttivaatimuksien 1-3 mukainen menetel mä, tunnettu siitä, että alfa- tai beta-interfero-nikäsittely suoritetaan 1-12 tunnin, edullisesti 4 tunnin ajan.

5. Jonkin patenttivaatimuksien 1-4 mukainen menetel- 25 m^> tunnettu siitä, että esikäsittelyssä käytetty alfa- tai beta-interferoni poistetaan pesemällä ennen mitogeenisellä aineella suoritettua käsittelyä.

6. Jonkin patenttivaatimuksien 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mitogeenisenä aineena käy- 30 tetään concanavaliini A:ta, fytohemagglutiinia tai entero-toksiinia.

7. Jonkin patenttivaatimuksien 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että erytrosyytit poistetaan valkosolukerroksesta ammoniumkloridilla suoritetun hemolyy- 35 sin avulla.

8. Jonkin patenttivaatimuksien 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kasvualustana käytetään 74978 vesiliuosta, joka sisältää 175-350 mg/1 kalsiumkloridia; 300-500 mg/1 kaliumkloridia; 175-500 mg/i magnesiumsulfaattia tai magnesiumkloridia ekvivalenttinen määrä; 5000-7000 og/l natriumkloridia; 200-3500 mg/1 natriumvetykarbo-5 naattia; 30-150 mg/1 natriumdivetyfosfaattia; 500-5500 mg/1 glukoosia ja valinnanvaraisesti 0,05-0,2 mg/1 rauta(III)nit-raattia ia 0,5-10¾ seerumia. 74978