FI68261B - FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV EN REKOMBINATIONS-DNA-MOLEKYL VILKEN HAR EN HUMANT - Google Patents

Description

6826168261

Menetelmä ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koo-daavan nukleotidisekvenssin sisältävän yhdistelmä-DNA-molekyy-lin valmistamiseksi 5 Jakamalla erotettu hakemuksesta 781676Method for preparing a recombinant DNA molecule comprising a nucleotide sequence encoding human fetal choroidal somatomammotropin 5 Partitioned from application 781676

Elävät organismit pystyvät syntetisoimaan mitä erilaisimpia proteiineja ja peptidejä. Useat proteiinit ja peptidit ovat käyttökelpoisia lääketieteessä, maatalou-10 dessa tai teollisuudessa. Eräät proteiinit ovat entsyymejä, jotka katalysoivat monimutkaisia kemiallisia reaktioita. Toiset toimivat hormoneina, jotka vaikuttavat eliön kasvuun ja kehitykseen tai kudosten toimintaan lääketieteellisesti merkittävällä tavalla. Tietyillä sideprote-15 iineilla saattaa olla kaupallista merkitystä, kun halutaan eristää ja puhdistaa aineita tai poistaa epäpuhtauksia. Sekä proteiinit että peptidit koostuvat lineaarisista ami-nohappojetjuista, ja jälkimmäistä termiä käytetään lyhyistä yksiketjuisista sekvensseistä ja edellistä pitkistä moni-20 ketjuisista aineista. Tämän keksinnön sisältämät periaatteet soveltuvat yhtä hyvin proteiineihin kuin peptideihin.Living organisms are able to synthesize a wide variety of proteins and peptides. Several proteins and peptides are useful in medicine, agriculture or industry. Some proteins are enzymes that catalyze complex chemical reactions. Others act as hormones that affect the growth and development of an organism or the function of tissues in a medically significant way. Certain binding proteins may be of commercial importance for the isolation and purification of substances or the removal of impurities. Both proteins and peptides consist of linear amino acid chains, and the latter term is used for short single-chain sequences and the former for long multi-chain substances. The principles contained in this invention apply equally well to proteins as to peptides.

Proteiinit ja peptidit ovat yleensä suurimolekyy-lisiä aineita joilla kullakin on spesifinen aminohappo-sekvenssi. Pieniä peptidejä lukuunottamatta on proteinien 25 ja peptidien kemiallinen synteesi usein epäkäytännöllistä, kallista ja aikaavievää ja jopa mahdotonta. Jotta halutulla proteiinilla olisi käytännön merkitystä, se pitää useimmiten ensin eristää organismista, joka valmistaa sitä. Usein on haluttua proteiinia läsnä vain pienenä pitoisuu-30 tena. Halutun proteiinin lähdettä on yleensä käytettävissä niin vähän, että proteiinia ei saada tarpeeksi. Näin ollen tietyille proteiineille on tiedossa useita maataloudellisia, teollisia ja lääketieteellisiä sovellutuksia joita ei ole voitu kehittää edelleen halutun proteiinin 35 tai peptidin riittämättömyydestä johtuen.Proteins and peptides are generally high molecular weight substances, each with a specific amino acid sequence. With the exception of small peptides, chemical synthesis of proteins and peptides is often impractical, expensive, time consuming, and even impossible. In order for a desired protein to have practical significance, it must most often first be isolated from the organism that produces it. Often, the desired protein is present only at a low concentration. The source of the desired protein is usually so limited that not enough protein is available. Thus, a number of agricultural, industrial, and medical applications are known for certain proteins that have not been able to be further developed due to the inadequacy of the desired protein or peptide.

2 682612 68261

Julkaisussa Ann. Rev. Biochem. 44 (1975) 45 (Gefter, Malcolm, l.) on selitetty DNA-replikoinnin periaate, eli DNA:n synteesi solussa, ja on mainittu tarvittavat entsyymit ja proteiinit. Julkaisussa Ann. Rev. Biochem. 44 5 (1975) 273 (Nathans, D. ja Smith, H.D.) on esitetty restrik-tioendonukleaaseja ja niiden käyttöä, mm. on mainittu näiden entsyymien luokitus, katkaisukohdat ja analyysimenetelmät, sekä entsyymien käyttö kromosomitutkimuksissa, geenien eristämisessä ja DNA:n kloonauksessa. Julkaisussa Am. Rev.In Ann. Rev. Biochem. 44 (1975) 45 (Gefter, Malcolm, I.) describes the principle of DNA replication, i.e. the synthesis of DNA in a cell, and mentions the necessary enzymes and proteins. In Ann. Rev. Biochem. 44 5 (1975) 273 (Nathans, D. and Smith, H.D.) disclose restriction endonucleases and their use, e.g. the classification of these enzymes, cleavage sites and methods of analysis, as well as the use of the enzymes in chromosome studies, gene isolation and DNA cloning are mentioned. In Am. Rev.

10 Biochem. 46 (1977) 415 (Sinsheimer, R.L.) on selitetty yh-distelmä-DNA-tekniikka; julkaisu koskee mm. plas-mideja, DNA:n modifiointia, kloonatun DNA:n eristämistä ym. Näissä julkaisuissa ei ole selitetty keksinnön mukaista menetelmää nukleotidifragmentin puhdistamiseksi, 15 jolloin ensin eristetään mRNA, sitten valmistetaan cDNA:n fragmentti, joka on oleellisesti puhdas, so. se ei sisällä kontaminoivia cDNA-sekvensseja. Julkaisussa Ann. Rev. Biochem. 47 (1978) 607 (Wu,R.) on selitetty menetelmä DNA-sekvenssin analysoimiseksi, tämän julkaisun mukaan DNA eristetään 20 ja puhdistetaan gradienttisentrifugoimalla ja restriktioendo-nukleaaseja käytetään DNA:n katkaisemiseksi analysoitavissa oleviin pätkiin. Julkaisussa on myös lyhyesti mainittu DNA:n kloonausta; erään menetelmän mukaan lähdetään suhteellisen puhtaasta mRNA:sta, ja saadaan 25 helposti kloonattavissa oleva cDNA, toisen menetelmän mukaan valmistetaan cDNA mRNA:ien seoksesta. Ei ole esitetty spesifisen cDNA:n eristämistä ja puhdistusta lähtien sellaisesta mRNA:ien seoksesta, jossa haluttua mRNA:a on läsnä vain pieniä määriä.10 Biochem. 46 (1977) 415 (Sinsheimer, R.L.) describes recombinant DNA technology; the publication concerns e.g. plasmids, DNA modification, isolation of cloned DNA, etc. These publications do not describe a method of the invention for purifying a nucleotide fragment by first isolating mRNA, then preparing a fragment of cDNA that is substantially pure, i. it does not contain contaminating cDNA sequences. In Ann. Rev. Biochem. 47 (1978) 607 (Wu, R.) describes a method for analyzing a DNA sequence, according to which this DNA is isolated and purified by gradient centrifugation, and restriction endonucleases are used to cleave the DNA into the fragments to be analyzed. The publication also briefly mentions DNA cloning; one method starts from relatively pure mRNA and yields easily clonable cDNA, another method prepares the cDNA from a mixture of mRNAs. No isolation and purification of specific cDNA has been reported from a mixture of mRNAs in which only small amounts of the desired mRNA are present.

30 Julkaisussa Science 196 (1977) 1313 - 1319 (Ullrich A., et ai) on selitetty menetelmä cDNA:n puhdistamiseksi. Tällä tunnetulla menetelmällä voitiin kuitenkin puhdistaa vain dominoiva cDNA, sensijaan ei voitu puhdistaa sellaista cDNA:ta, jota esiintyy vain niukasti, ja heterogeenisessä 35 populaatiossa. On yllättävää, että uudella menetelmällä voidaan tällainen minoriteetti-DNA puhdistaa selektiivisesti, jolloin ensimmäistä kertaa saadaan puhtaana ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaava DNA-fragmentti.Science 196 (1977) 1313-1319 (Ullrich A., et al.) Describes a method for purifying cDNA. However, only the dominant cDNA could be purified by this known method, whereas cDNA, which is sparse, could not be purified and in a heterogeneous population. Surprisingly, the novel method can selectively purify such minority DNA to obtain, for the first time, a pure DNA fragment encoding human fetal choroidal somatomammotropin.

3 682613 68261

Viime aikoina kehitetyt menetelmät (ks. esim.Recently developed methods (see e.g.

FI-hakemus n:o 781 675) antavat mahdollisuuden käyttää nopea- ja runsaskasvuisia mikro-organismeja kaupallisesti hyödyllisien proteiinien ja peptidien syntetisointiin 5 riippumatta siitä, mikä niiden lähde on luonnossa. Näillä menetelmillä voidaan sopivalle mikro-organismille antaa geneettinen kyky syntetisoida sellainen proteiini tai peptidi, joka normaalitapauksessa on jonkun muun organismin valmistama. Menetelmissä käytetään hyväksi sitä periaatet-10 ta, joka vallitsee kaikkien elävien organismien geneettisen materiaalin, tavallisesti DNA:n ja organismien syntetisoimien proteiinien välillä. Tämän periaatteen mukaisesti proteiinin aminohapposekvenssi määräytyy DNA:n nukleotidisekvenssin perusteella. Kullekin proteiineissa 15 tavallisimmin esiintyvistä 20 aminohaposta on olemassa yksi tai useampia spesifisiä trinukleotidisekvenssiryhmiä. Tietyn trinukleotidisekvenssin ja sitä vastaavan aminohapon välinen yhteys muodostaa geneettisen koodin. Uskotaan, että kaikissa elävissä organismeissa geneettinen koodi 20 on joko sama tai samantapainen. Näin ollen jokaisen proteiinin tai peptidin aminohapposekvenssi määräytyy vastaavasta nukleotidisekvenssistä tunnetulla tavalla. Lisäksi pystyy periaatteessa mikä tahansa elävä organismi tulkitsemaan tämän nukleotidisekvenssin.FI application No. 781 675) allow the use of fast and abundant microorganisms for the synthesis of commercially useful proteins and peptides 5, regardless of their natural source. These methods can be used to confer on a suitable microorganism the genetic ability to synthesize a protein or peptide that is normally produced by another organism. The methods utilize the principle that prevails between the genetic material of all living organisms, usually DNA, and proteins synthesized by the organisms. According to this principle, the amino acid sequence of a protein is determined by the nucleotide sequence of the DNA. For each of the 15 most common 20 amino acids in proteins, there are one or more specific groups of trinucleotide sequences. The link between a particular trinucleotide sequence and its corresponding amino acid forms the genetic code. It is believed that in all living organisms, the genetic code 20 is either the same or similar. Thus, the amino acid sequence of each protein or peptide is determined from the corresponding nucleotide sequence in a known manner. In addition, in principle, any living organism can interpret this nucleotide sequence.

4 682614 68261

Taulukko 1 Geneettinen koodiTable 1 Genetic code

5 Fenyylialaniini (Phe) TTK Histidiini (His) CAK5 Phenylalanine (Phe) RTD Histidine (His) CAK

Leusiini (Leu) XTY Glutamiini (Gin) CAJLeucine (Leu) XTY Glutamine (Gin) CAJ

Isoleusiini (Iso) ATM Asparagiini (Asn) AAKIsoleucine (Iso) ATM Asparagine (Asn) AAK

Metioniini (Met) ATG Lysiini (Lys) AAJMethionine (Met) ATG Lysine (Lys) AAJ

Väliini (Vai) GTL Asparagiinihappo (Asp) GAKVälin (Vai) GTL Aspartic acid (Asp) GAK

10 Seriini (Ser) QRS Glutamiinihappo (Glu) GAJ10 Serine (Ser) QRS Glutamic acid (Glu) GAJ

Proliini (Pro) CCL Kysteiini (Cys) TGKProline (Pro) CCL Cysteine (Cys) TGK

Treoniini (Thr) ACL Tryptofaani (Try) TGGThreonine (Thr) ACL Tryptophan (Try) TGG

Alaniini (Ala) GCL Arginiini (Arg) WGZAlanine (Lower) GCL Arginine (Arg) WGZ

Tyrosiini (Tyr) TAK Glysiini (Gly) GGLTyrosine (Tyr) TAK Glycine (Gly) GGL

15 Päätesignaali TAJ15 Terminal signal TAJ

Päätesignaali TGATerminal signal TGA

Avain: Jokainen kolmen kirjaimen tripletti edustaa DNA:n trinuk-leotidia, jossa on .5'-pää vasemmalla ja 3’-pää oikealla. Kirjaimet 20 tarkoittavat puriini- ja pyrimidiiniemäksiä, joista nukleotidisek-venssi koostuu.Key: Each three-letter triplet represents a DNA trinucleotide with a .5 'end on the left and a 3' end on the right. The letters 20 denote the purine and pyrimidine bases of which the nucleotide sequence consists.

A = adeniini J = A tai GA = adenine J = A or G

G = guaniini K = T tai CG = guanine K = T or C

C = sytosiini L = A, T, C tai GC = cytosine L = A, T, C or G

25 T = tyrniini M = A, C tai T25 T = tyrnine M = A, C or T

X = T tai C, jos Y on A tai G X = C, jos Y on C tai TX = T or C if Y is A or G X = C if Y is C or T

Y = A, G, C tai T, jos X on CY = A, G, C or T if X is C

Y = A tai G, jos X on TY = A or G if X is T

30 W = C tai A, jos Z on A tai G30 W = C or A if Z is A or G

W = C, jos Z on C tai TW = C if Z is C or T

Z = A, G, C tai T, jos W on CZ = A, G, C or T if W is C

Z = A tai G, jos W on AZ = A or G if W is A

QR = TC, jos S on A, G, C tai TQR = TC if S is A, G, C or T

35 QR = AG, jos S on T tai C35 QR = AG if S is T or C

S = A, G, C tai T, jos QR on TCS = A, G, C or T if QR is TC

S = T tai C, jos QR on AGS = T or C if QR is AG

5 682615 68261

Taulukon 1 trinukleotidit, joita nimitetään kodo-neiksi, ovat DNA:n trinukleotideja, jotka esiintyvät elävän organismin geneettisessä materiaalissa. Näiden kodonien informaation siirtyminen proteiinisynteesis-5 sä vaatii lähetti-RNA:n (mRNA) muodostumisen, kuten myöhemmin tarkemmin selostetaan. mRNA:n kodoneilla on sama sekvenssi kuin taulukon 1 DNA-kodoneilla paitsi, että tymiinin tilalla on urasiili. Komplementaariset DNA:n trinukleotidisekvenssit, joiden säikeiden polaari-10 suus on päinvastainen, ovat funktionaalisesti ekvivalentteja taulukon 1 kodonien kanssa, kuten alaan perehtyneet tietävät. Tärkeä ja tunnettu geneettisen koodin piirre on sen runsaus, sillä useimpia proteiinien valmistukseen tarvittavia aminohappoja koodaa useampi kuin 15 yksi nukleotiditripletti. Näin ollen useat nukleotidi-sekvenssit voivat koodata samaa aminohapposekvenssiä. Tällaisia nukleotidisekvenssejä pidetään funktionaalises-ti ekvivalentteina, koska ne voivat johtaa saman aminohapposekvenssin valmistukseen kaikissa organismeissa, 20 vaikkakin tietyt kannat voivat tulkita eräitä sekvenssejä tehokkaammin kuin muita. Joskus nukleotidisekvenssistä saattaa löytyä puriinin tai pyrimidiinin metyloitu muunnos. Tällaiset metyloinnit eivät vaikuta millään tavalla koodaus s uht ees een.The trinucleotides in Table 1, referred to as codons, are DNA trinucleotides present in the genetic material of a living organism. The transfer of information from these codons in protein synthesis requires the formation of messenger RNA (mRNA), as described in more detail later. The codons of the mRNA have the same sequence as the DNA codons of Table 1 except that thymine is replaced by uracil. Complementary DNA trinucleotide sequences with opposite strand polarity are functionally equivalent to the codons of Table 1, as known to those skilled in the art. An important and well-known feature of the genetic code is its abundance, as most of the amino acids required for the production of proteins are encoded by more than 15 single nucleotide triplets. Thus, multiple nucleotide sequences may encode the same amino acid sequence. Such nucleotide sequences are considered to be functionally equivalent because they can result in the production of the same amino acid sequence in all organisms, although certain strains may interpret some sequences more efficiently than others. Sometimes a methylated variant of a purine or pyrimidine may be found in the nucleotide sequence. Such methylations do not affect the coding ratio in any way.

25 Menetelmä, jolla mikro-organismi saatetaan kykene väksi syntetisoimaan uutta proteiinia, käsittää kolme päävaihetta: (1) puhdistetaan ja eristetään tietty geeni tai nukleotidisekvenssi, joka sisältää halutun proteiinin aminohapposekvenssin geneettisen informaation, (2) rekom-30 binoidaan eristetty nukleotidisekvenssi sopivan siirto- vektorin kanssa, joka yleensä on bakteriofagin tai plasmi-din DNA ja (3) siirretään vektori sopivaan mikro-organismiin ja näin saaduista mikro-organismeista valitaan kanta, joka sisältää halutun geneettisen informaation.The method of rendering a microorganism capable of synthesizing a new protein comprises three main steps: (1) purifying and isolating a particular gene or nucleotide sequence containing the genetic information of the amino acid sequence of the desired protein, (2) recombining the isolated nucleotide sequence into a suitable transfer vector. with, which is usually the DNA of a bacteriophage or plasmid, and (3) transferring the vector to a suitable microorganism and selecting a strain containing the desired genetic information from the microorganisms thus obtained.

35 Kun edellä pääpiirteissään kuvattu menetelmä ha- 6 68261 lutaan kehittää kaupalliseksi, perustavaa laatua olevat vaikeudet liittyvät ensimmäiseen vaiheeseen eli halutun geneettisen informaation eristämiseen ja puhdistamiseen. Kaikissa elävissä soluissa DNA esiintyy erittäin suuri-5 molekyylisinä nukleotidiketjuina. Solu saattaa sisältää yli 10 000 rakennegeeniä, jotka koodaavat yli 10 000 spesifisen proteiinin aminohapposekvenssiä, ja kunkin geenin sekvenssi voi sisältää monta sataa nukleotidia.35 When the method outlined above is to be developed commercially, the fundamental difficulties relate to the first step, namely the isolation and purification of the desired genetic information. In all living cells, DNA exists as very large-molecular nucleotide chains. A cell may contain more than 10,000 structural genes encoding more than 10,000 amino acid sequences of a specific protein, and the sequence of each gene may contain many hundred nucleotides.

Kaikki olemassa olevat sekvenssit koostuvat pääasiassa 10 neljästä eri nukleotidiemäksestä. Nämä ovat adeniini (A), guaniini (G), sytosiini (C) ja tyrniini (T). Tiettyjen proteiinien rakennegeenien sekvenssit ovat näin ollen hyvin samanlaisia kemialliselta rakenteeltaan ja fysikaalisilta ominaisuuksiltaan. Yhtä tällaista sekvenssiä 15 ei voida erottaa tavallisilla fysikaalisilla eikä kemiallisilla menetelmillä muista eristetyssä DNArssa läsnäolevista sekvensseistä.All existing sequences consist mainly of 10 four different nucleotide bases. These are adenine (A), guanine (G), cytosine (C) and thyrine (T). The sequences of the structural genes of certain proteins are thus very similar in chemical structure and physical properties. One such sequence 15 cannot be distinguished from other sequences present in the isolated DNA by conventional physical or chemical methods.

DNA:n nukleotidisekvenssi-informaatio muuttuu lähetti-RNA:n avulla proteiinin aminohapposekvenssiksi.The nucleotide sequence information of DNA is converted to the amino acid sequence of the protein by messenger RNA.

20 Tämän prosessin ensimmäisessä vaiheessa, joka on nimeltään transskriptio, kopioidaan RNA:han se DNA-segmentti, jonka nukleotidisekvenssi spesifioi valmistettavan proteiinin. RNA on samanlainen polynukleotidi kuin DNA paitsi, että deoksiriboosin tilalla on riboosi ja ty-25 miinin tilalla on urasiili. RNA:n nukleotidiemäkset kykenevät asettumaan samanlaisiksi emäspareiksi, jollaisia tiedetään olevan komplementaaristen DNA-säikeiden välillä. A ja U (T) ovat komplementaarisia ja G ja C ovat komplementaarisia. DNA-nukleotidisekvenssin RNA-transskripti 30 on komplementaarinen kopioidun sekvenssin kanssa. Tätä RNA:ta kutsutaan lähetti-RNA:ksi (mRNA), koska se toimii välittäjänä solun geneettisen mekanismin ja proteiineja syntetisoivan mekanismin välillä. Yleensä solussa on tietyllä hetkellä läsnä vain sellaisia mRNA-sek-35 venssejä, jotka vastaavat sillä hetkellä syntetisoitavia 7 68261 proteiineja. Näin ollen erikoistunut solu, jonka toiminta kohdistuu pääasiassa yhden proteiinin syntetisointiin, sisältää pääasiassa tätä proteiinia vastaavaa RNArta. Tiettyä proteiinia koodaava nukleotidisekvenssi 5 voidaan eristää ja puhdistaa tietyissä tapauksissa siten, että tämän proteiinin valmistukseen erikoistuneista soluista erotetaan kyseinen mRNA.In the first step of this process, called transcription, the DNA segment whose nucleotide sequence specifies the protein to be produced is copied into the RNA. RNA is a polynucleotide similar to DNA except that deoxyribose is replaced by ribose and ty-25 mine is replaced by uracil. The nucleotide bases of RNA are capable of settling into similar base pairs as are known to exist between complementary strands of DNA. A and U (T) are complementary and G and C are complementary. The RNA transcript 30 of the DNA nucleotide sequence is complementary to the copied sequence. This RNA is called messenger RNA (mRNA) because it acts as a mediator between the genetic mechanism of the cell and the mechanism that synthesizes proteins. In general, only mRNA sequences corresponding to the 7,682,61 proteins currently being synthesized are present in a cell at a given time. Thus, a specialized cell whose function is primarily to synthesize a single protein contains an RNA that is primarily responsible for that protein. The nucleotide sequence 5 encoding a particular protein can be isolated and purified in certain cases by isolating that mRNA from cells specialized in the production of that protein.

Edellä mainitussa menetelmässä on se heikkous, että sitä voidaan soveltaa vain niihin melko harvinai-10 siin soluihin, jotka ovat erikoistuneet pääasiassa yhden proteiinin tuottamiseen. Suurinta osaa kaupallisesti mielenkiintoisista proteiineista ei syntetisoida tällaisella erikoistuneella tavalla. Haluttu proteiini saattaa olla yksi noin sadasta eri proteiinista, joita kudoksen 15 solut tai organismi tuottaa tietyllä hetkellä. mRNA:n eristysmenetelmä on kuitenkin hyödyllinen siksi, että solussa läsnäolevat RNA-lajit edustavat tavallisesti vain osaa DNA-sekvenssien kokonaismäärästä, ja tällä perusteella voidaan suorittaa alkupuhdistus. Jotta tällai-20 sesta puhdistuksesta olisi hyötyä, tarvitaan menetelmä, jolla pieninä kuten muutaman prosentin pitoisuuksina esiintyvät sekvenssit voidaan eristää hyvin puhtaina.The disadvantage of the above method is that it can only be applied to those rather rare cells that specialize mainly in the production of a single protein. Most commercially interesting proteins are not synthesized in such a specialized manner. The desired protein may be one of about one hundred different proteins produced by the cells or organism of the tissue at a given time. However, the method of isolating mRNA is useful because the RNA species present in the cell usually represent only a fraction of the total number of DNA sequences, and on this basis, initial purification can be performed. In order to benefit from such purification, a method is needed by which sequences present in small concentrations, such as a few percent, can be isolated in very pure form.

Tämän keksinnön kohteena on menetelmä yhdistelmä-DNA-molekyylin valmistamiseksi, joka sisältää ihmisen 25 sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaavan nukleo-tidisekvenssin, ja jota voidaan käyttää mikro-organismin transformoimiseen, jossa menetelmässä eristetään ihmisen istukkakudosta, eristetään pituuden ja sekvenssin suhteen heterogeenisten mRNA:ien populaatio mainitusta istukkaku-30 doksesta, syntetisoidaan käänteistransskriptaasin avulla cDNA:ien populaatio, joka on pituuden ja sekvenssin suhteen heterogeeninen, mainitusta mRANrista, puhdistetaan ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaava cDNA, ja saatetaan puhdistettu cDNA reagoimaan DNA-siirto-35 vektorin kanssa, jolloin mainittu puhdistettu cDNA edustaa pienehköä osaa mainitusta cDNA:ien populaatiosta ja ainakin osalla mainituista cDNA:ista on vähintään kaksi restrik-tiokohtaa.The present invention relates to a method for producing a recombinant DNA molecule comprising a nucleotide sequence encoding human fetal choroidal somatomammotropin, which can be used to transform a microorganism, which method isolates a population of mRNAs heterogeneous in length and sequence from human placental tissue. from a placental dose, a population of cDNAs heterogeneous in length and sequence is synthesized from said mRAN by reverse transcriptase, cDNA encoding human fetal choroidal somatomammotropin is purified, and the purified cDNA is reacted with said cDNA, wherein said cDNA is reacted with a DNA transfer vector. a minor portion of said population of cDNAs and at least some of said cDNAs have at least two restriction sites.

8 682618 68261

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaa-va cDNA puhdistetaan seuraavalla tavalla: a) mainittua pituuden ja sekvenssin suhteen heterogeenista cDNA-populaatiota käsitellään spesifisesti maini-5 tuissa restriktiokohdissa mainituille restriktiokohdille spesifisellä restriktioendonukleaasilla, esimerkiksi inku-boimalla mainittua populaatiota Hae III-endonukleaasin läsnäollessa pH:ssa noin 7,5 ja noin 37°C lämpötilassa 1-2 tunnin ajan, jolloin saadaan cDNA-fragmentteja, 10 b) kohdassa a) saadut cDNA-fragmentit fraktioidaan niiden pituuden mukaan esimerkiksi geelielektroforeesin avulla, jolloin saadaan pituudeltaan homogeenisia cDNA-fragmentteja sisältäviä fraktioita, ja c) kohdassa b) saaduista cDNA-fragmenteista pois-15 tetaan 5'-fosfaattipääteryhmät esimerkiksi inkuboimalla mainittuja fragmentteja alkalisella fosfataasilla pH:ssa noin 7,5 ja 60°C lämpötilassa noin 10 minuutin ajan, d) katkaistaan kohdan c) mukaisesti käsitellyt cDNA-fragmentit spesifisesti sikiön suonikalvon somatomammo- 20 tropiinin nukleotidisekvenssin sisällä olevassa restriktio-kohdassa ja restriktiokohdille spesifisen restriktioendonuk-leaasin avulla, joka ei ole sama kuin kohdassa a) käytetty, esimerkiksi inkuboimalla mainittuja fragmentteja Hha I:lla tai Hpa II:11a pH:ssa noin 7,6 37°C lämpötilassa noin 2 tun-25 tia, jolloin saadaan mainittujen fragmenttien osafragmentte-ja, 9 68261 e) fraktioidaan saadut osafragmentit pituuden mukaan, esimerkiksi geelielektroforeesia käyttäen, f) otetaan ihmisen sikiön suonikalvon somatomammo-tropiinia koodaavaa kahta DNA-osafragmenttia käsittävät frak- 5 tiot talteen, g) yhdistetään kohdan f) mukaiset osafragmentit entsymaattisesti toisiinsa kovalenttisidoksin DNA-ligaasin avulla, ATP:n läsnäollessa, esimerkiksi inkuboimalla pH:ssa 7,6 noin 15°C lämpötilassa noin 2 tunnin ajan, jolloin saadaan 10 ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaavia cDNA-fragmenttej a, h) kohdan g) mukaisesti saadut cDNA-fragmentit fraktioidaan pituuden mukaan, esimerkiksi geelielektroforeesia käyttäen, ja 15 i) otetaan kohdan h) mukaisesti saatu ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaavan cDNA:n fragmentteja sisältävä tuote talteen, jolloin mainitut fragmentit ovat jopa 99 %:isesti vapaita kontaminoivista cDNA-sekvensseistä, j) liitetään saatu puhdistettu ihmisen sikiön suoni- 20 kalvon somatomammotropiinin nukleotidisekvenssiä koodaava cDNA-fragmentti sinänsä tunnetulla tavalla siirtovektoriin, joka on bakteeriplasmidi, jolloin saadaan ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin nukleotidisekvenssin sisältävä yhdistelmä-DNA-molekyyli.The method of the invention is characterized in that the cDNA encoding human fetal choroidal somatomammotropin is purified as follows: a) said cDNA population heterogeneous in length and sequence is specifically treated at said restriction sites with in the presence of an endonuclease at a pH of about 7.5 and a temperature of about 37 ° C for 1-2 hours to obtain cDNA fragments, the cDNA fragments obtained in b) a) are fractionated according to their length, for example by gel electrophoresis to give homogeneous lengths c) fragments containing cDNA fragments, and c) the 5 'phosphate end groups are removed from the cDNA fragments obtained in b), for example by incubating said fragments with alkaline phosphatase at a pH of about 7.5 and 60 ° C for about 10 minutes; in accordance with point (c) k treated cDNA fragments specifically at a restriction site within the nucleotide sequence of the fetal choroidal somatomammotropin and by a restriction endonuclease specific for the restriction sites other than that used in a), for example by incubating said fragments with Hha I or Hpa II. at a temperature of about 7.6 to 37 ° C for about 2 hours to obtain subfragments of said fragments. (e) fractionating the obtained subfragments to length, for example using gel electrophoresis; (g) enzymatically combining the subfragments of f) with covalently linked DNA ligase in the presence of ATP, for example by incubation at pH 7.6 at about 15 ° C for about 2 hours to give 10 cDNA fragments encoding human fetal choroidal somatomammotropin according to h) g) the resulting cDNA fragments are fractionated by length, for example by gel electrophoresis, and i) recovering the product containing fragments of cDNA encoding human fetal choroidal somatomammotropin obtained according to h), said fragments being up to 99% free of contaminating cDNA sequences , j) inserting the obtained purified cDNA fragment encoding the human fetal choroidal somatomammotropin nucleotide sequence in a manner known per se into a transfer vector which is a bacterial plasmid to obtain a recombinant DNA molecule containing the human fetal choroidal somatomammotropin nucleotide sequence.

10 6826110 68261

Geneettisen koodin perusteella on olemassa äärellinen määrä nukleotidisekvenssejä, jotka voivat geneettisesti koodata tiettyä aminohappoa. Kaikki tällaiset ek-vivalenttiset nukleotidisekvenssit ovat käyttökelpoisia 5 vaihtoehtoisia kuvatuille sekvensseille, koska kaikki johtavat samaan proteiinihormoniin, jolla on sama aminohapposekvenssi, kun tapahtuu in vivo-transskriptio ja -translaatio.Based on the genetic code, there are a finite number of nucleotide sequences that can genetically encode a particular amino acid. All such equivalent nucleotide sequences are useful as alternatives to the sequences described, as they all result in the same protein hormone having the same amino acid sequence when in vivo transcription and translation occurs.

Seuraavassa taulukossa esitetään käytetyt symbolit 10 ja lyhenteet.The following table shows the symbols 10 and abbreviations used.

Taulukko 2 DNA deoksiribonukleiinihappo RNA ribonukleiinihappo cDNA komplementaarinen DNA (syntetisoitu entsymaattises-15 ti mRNA-sekvenssistä)Table 2 DNA deoxyribonucleic acid RNA ribonucleic acid cDNA complementary DNA (synthesized from enzymatic 15 mRNA sequence)

mRNA lähetti-RNAmRNA messenger RNA

dATP deoksiadenosiinitrifosfaatti dGTP deoksiguanosiinitrifosfaatti dCTP deoksisytidiinitrifosfaatti 20 dTTP tymidiinitrifosfaatti dT12_18 deoksitymidylaatti (12-18 emästä) HCS ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiini TCA trikloorietikkahappo HGH ihmisen kasvuhormoni 25 A adeniini T tyrniini G guaniini C sytosiini U urasiili 30 Tris 2-amino-2-hydroksietyyli-l,3-propaanidioli EDTA ety 1 eenidiamii ni tetraetikkahappo ATP adenosiinitrifosfaattidATP deoxyadenosine triphosphate dGTP deoxyguanosine triphosphate dCTP deoxycytidine triphosphate dTTP thymidine triphosphate 20 dT12_18 deoxythymidylate (12-18 bases) HCS human chorionic TCA trichloroacetic lactogen, human growth hormone HGH 25 A adenine G guanine T thymine U uracil, cytosine C, 30 Tris 2-amino-2-hydroxyethyl-L, 3-propanediol EDTA ethylenediamine tetraacetic acid ATP adenosine triphosphate

Hpa I-endonukleaasi restriktioendonukleaasi, joka katkai- ψ see kohdassa GTT AAC (nuoli osoittaa katkaisukohdan) 35 Hpa II-endonukleaasi restriktioendonukleaasi, joka katkaiHpa I endonuclease restriction endonuclease that cleaves at kohdassa GTT AAC (arrow indicates cleavage site) 35 Hpa II endonuclease restriction endonuclease that cleaves

see kohdassa C CGGsee section C CGG

68261 1168261 11

Hae ΙΙΙ-endonukleaasi restriktioendonukleaasi, joka katkai-Search for a β-endonuclease restriction endonuclease that cleaves

kohdassa GG^CCat GG ^ CC

Hha I-endonukleaasi restriktioendonukleaasi, joka katkaisi'Hha I-endonuclease restriction endonuclease that cleaved '

see kohdassa GCG Csee GCG C

5 Hsu I-endonukleaasi restriktioendonukleaasi, joka katkaisi see kohdassa A AGCTT . (15 Hsu I-endonuclease restriction endonuclease that cleaved it at A AGCTT. (1

Mbo II-endonukleaasi restriktioendonukleaasi, joka kat- ψ kaisee kohdassa GAAGA N8 ,„ CTTCT N7Mbo II endonuclease is a restriction endonuclease that cleaves at GAAGA N8, CTTCT N7

10 Alu I-endonukleaasi restriktioendonukleaasi, joka katkai-see kohdassa AG CT10 Alu I endonuclease restriction endonuclease that cleaves at AG CT

Eco RI-endonukleaasi restriktioendonukleaasi, joka katkaisiEco RI endonuclease restriction endonuclease that cleaved

see kohdassa G AATTCsee G AATTC

Hind ΙΙΙ-endonukleaasi restriktioendonukleaasi, joka kat-Hind β-endonuclease restriction endonuclease

15 kaisee kohdassa A^AGCTT15 in A ^ AGCTT

Hinf I-endonukleaasi restriktioendonukleaasi, joka kat- >1/ (2Hinf I endonuclease is a restriction endonuclease that cat-> 1 / (2

kaisee kohdassa G ANTCat G ANTC

Pvu I-endonukleaasi restriktioendonukleaasi, joka katkaisee kohdassa CGAT^CGPvu I endonuclease restriction endonuclease that cleaves at CGAT ^ CG

20 ----------------------- (1 Mbo II tunnistaa non-palindronisen sekvenssin, minkä takia on esitetty kumpikin DNA-ketju; ylemmän ketjun suunta on 5’ - 3* (ks. Watson, J. D. et ai., Recombinant DNA - a short course, Appendix A, W. H. Freeman 25 and Co., New York, 1983).20 ----------------------- (1 Mbo II recognizes a non-palindronic sequence, which is why both DNA strands are shown; the direction of the upper strand is 5 '- 3 * (see Watson, JD et al., Recombinant DNA - a short course, Appendix A, WH Freeman 25 and Co., New York, 1983).

(2 N merkitsee mitä tahansa nukleotidia.(2 N represents any nucleotide.

68261 1268261 12

Koska DNA:n replikaatiossa ja transkriptiossa vallitsee tunnettu emäsparijärjestelmä, vastaa sen mRNA:n eristäminen, joka sisältää tietyn proteiinin aminohapposekvenssiä koodaavan nukleotidisekvenssin, 5 saman sekvenssin tai geenin eristämistä itse DNA:sta.Because DNA replication and transcription have a known base-pair system, isolating an mRNA that contains a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of a particular protein, the same sequence, or a gene from DNA itself is equivalent to isolating it.

Jos mRNA transkriboidaan komplementaariseksi DNA:kseen (cDNA), saadaan rekonstruoiduksi DNA-sekvenssi, joka voidaan sopivilla menetelmillä siirtää toisen organismin geneettiseen materiaaliin. Tietyn sekvenssin komple-10 mentaariset muodot ovat näin ollen vaihtoehtoisia ja funktionaalisesta ekvivalentteja.If the mRNA is transcribed into complementary DNA (cDNA), a DNA sequence can be reconstructed that can be transferred to the genetic material of another organism by appropriate methods. Thus, the complementary forms of a particular sequence are alternative and functionally equivalent.

DNA:n ja RNA:n nukleotidiyksiköt ovat liittyneet toisiinsa fosfodiesterisidoksilla, jotka ovat toisen nukleotidisokerin 5'-asemassa ja viereisen nukleotidi-15 sokerin 3'-asemassa. Kun tällaiset sidokset muodostetaan uudelleen, saadaan lineaarinen polynukleotidi, joka on polaarinen siten, että toinen pää voidaan erottaa toisesta, 3'-päässä voi olla vapaa hydroksyyliryhmä tai hydroksyyliryhmä voi olla substituoitu fosfaatilla 20 tai jollakin monimutkaisemmalla rakenneyksiköllä. Tilanne on sama 5'-pään kohdalla. Eukaryoottisissa organismeissa eli niissä, joissa on erillinen tuma ja mdteettinen mekanismi, funktionaalisen mRNA:n synteesiin sisältyy tavallisesti polyadenyylihapon liittyminen 25 mRNA:n 3'-päähän. Tästä syystä mRNA voidaan erottaa muista eukaryoottisesta organismista eristetyistä RNA-tyypeistä pylväskromatografisesti selluloosalla, johon on liitetty polytymidyylihappoa, ks. Aviv, H. ja Leder, P., Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 69, 1408 (1972). Käyt-30 tökelpoisia ovat myös muut kromatografiset menetelmät, joissa käytetään hyväksi poly A:n ja kromatografisen täytemateriaalin emäspari-affiniteettia, kun täytemateriaali sisältää oligo-dT:tä, poly-U:ta tai jotakin poly-T:n ja poly-U:n yhdistelmää.The nucleotide units of DNA and RNA are joined together by phosphodiester bonds at the 5 'position of the second nucleotide sugar and at the 3' position of the adjacent nucleotide sugar. When such bonds are reconstituted, a linear polynucleotide is obtained that is polar so that one end can be separated from the other, the 3 'end may have a free hydroxyl group, or the hydroxyl group may be substituted with phosphate or a more complex moiety. The situation is the same at the 5 'end. In eukaryotic organisms, i.e., those with a separate nucleus and a genetic mechanism, the synthesis of a functional mRNA usually involves the incorporation of a polyadenylic acid at the 3 'end of the 25 mRNA. For this reason, mRNA can be separated from other types of RNA isolated from a eukaryotic organism by column chromatography on cellulose to which polytymidylic acid has been added, cf. Aviv, H. and Leder, P., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. 69, 1408 (1972). Also useful are other chromatographic methods that utilize the base pair affinity of poly A and the chromatographic packing material when the packing material contains oligo-dT, poly-U, or one of poly-T and poly-U. n combination.

35 Käänteistranskriptaasi katalysoi RNA-tempLaatti- 13 68261 säikeen kanssa komplementaarisen DNA:n synteesin RNA-templaatin, primerin, joka voi olla mikä tahansa komplementaarinen 3'-hydroksyylin sisältävä oligo- tai poly-nukleotidi, ja neljän deoksinukleosiditrifosfaatin 5 (dATP, dGTP, dCTP ja dTTP) läsnäollessa. Reaktio käynnistyy oligodeoksinukleotidiprimerin ei-kovalenttisel-la liittymisellä lähelle mRNA:n 3'-päätä ja sen jälkeen liitetään vaiheittain sopivia deoksinukleotideja mRNA-nukleotidisekvenssin määrittelemiseksi emäspareiksi 10 kasvavan ketjun 3'-päähän. Tuotteeksi saatua molekyyliä voidaan kuvailla hiusneularakenteeksi, jossa alkuperäisen RNA:n rinnalla on komplementaarinen DNA- vety-silloilla liittyneenä ja osittain toisesta päästä itsensä päälle taittuneena. DNA- ja RNA-säie eivät ole 15 liittyneet toisiinsa kovalenttisesti. Käänteistranskrip-taasi kykenee myös katalysoimaan samanlaisen reaktion käyttämällä yksisäikeistä DNA-hiusneulaa, jossa päitä yhdistää yksisäikeinen DNA, ks. Aviv, H. ja Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sei. USA,69> 1^08 (1972) ja 20 Efstratiadis, A., Kafatos, F.C., Maxam, A.M. ja Maniatis, T., Cell 7, 279 (1976).Reverse transcriptase catalyzes the synthesis of DNA complementary to the RNA template 1368261 strand, an RNA template, a primer which can be any complementary 3'-hydroxyl-containing oligo- or polynucleotide, and four deoxynucleoside triphosphate dTPP, dATP and dTTP). The reaction is initiated by non-covalent attachment of the oligodeoxynucleotide primer near the 3 'end of the mRNA and then stepwise coupling of appropriate deoxynucleotides to define the mRNA nucleotide sequence as base pairs at the 3' end of the growing chain. The resulting molecule can be described as a hairpin structure in which, alongside the original RNA, the DNA is complementary when joined by hydrogen bridges and partially folded over itself at one end. The DNA and RNA strands are not covalently linked. Reverse transcriptase is also capable of catalyzing a similar reaction using a single-stranded DNA hairpin in which the ends are joined by single-stranded DNA, cf. Aviv, H. and Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69> 1-08 (1972) and Efstratiadis, A., Kafatos, F.C., Maxam, A.M. and Maniatis, T., Cell 7, 279 (1976).

Restriktioendonukleaasit ovat entsymeejä, jotka kykenevät hydrolysoimaan DNA:n fosfodiesterisidoksia ja siten katkaisemaan DNA-säikeen. Jos DNA on suljettu 25 rengas, se muuttuu tämän entsyymin vaikutuksesta lineaariseksi. Restriktioentsyymin pääominaisuus on siinä, että sen hydrolyyttinen vaikutus kohdistuu vain sellaiseen kohtaan, jossa on tietty nukleotidisekvenssi. Tällainen sekvenssi on nimeltään restriktioendonukleaasin 30 lunnistuskohta. Restriktioendonukleaaseja on eristetty useista lähteistä ja ne on tunnistettu restriktiokoh-tiensa nukleotidisekvenssin perusteella. Kaksisäikeistä DNA:ta hydrolysoidessaan eräät restriktioendonukleaasit katkaisevat fosfodiesterisidoksen samasta kohdasta 35 kummassakin säikeessä niin, että syntyy tylppä pää.Restriction endonucleases are enzymes capable of hydrolyzing phosphodiester bonds in DNA and thus cleaving the DNA strand. If the DNA is a closed ring, it becomes linear under the influence of this enzyme. The main feature of a restriction enzyme is that its hydrolytic effect is directed only at a site with a specific nucleotide sequence. Such a sequence is called the restriction endonuclease 30 recognition site. Restriction endonucleases have been isolated from several sources and identified by the nucleotide sequence of their restriction sites. Upon hydrolysis of double-stranded DNA, some restriction endonucleases cleave the phosphodiester bond at the same site 35 in each strand to form a blunt end.

14 6826114 68261

Toiset puolestaan katalysoivat sellaisten sidosten hydrolyysin, joita muutama nukleotidi erottaa toisistaan, ja näin muodostuu vapaat yksisäikeiset alueet katkaisu-kohtaan. Tällaiset yksisäikeiset päät ovat itsekomple-5 mentaarisia ja siten kohesiivisiä ja niitä voidaan käyttää hydrolysoidun DNA:n uudelleenkytkentään. Koska tällainen entsyymi katkaisee minkä tahansa DNA:n vain samasta restriktiokohdasta, syntyy samat kohesiiviset päät, ja tämä antaa mahdollisuuden liittää heterogeenisiä 10 DNA-sekvenssejä toisiinsa, kunhan ne on ensin käsitelty samalla restriktioentsyymillä. Restriktioendonukleaasit nimitetään bakteerikantalähteen mukaan; käytetään sukunimen ensimmäistä kirjainta ja lajinimen kahta ensimmäistä kirjainta, ja mikäli samasta kannasta on saatu 15 enemmän kuin yksi endonukleaasi, lisätään vielä roomalainen luku. Esimerkiksi Hae III tarkoittaa yhtä kolmesta Haemophilus aegyptius-restriktioendonukleaasista. Nimessä saattaa olla tämän lisäksi muitakin kirjaimia, mikäli täytyy ilmoittaa lisäksi erikoinen isolaatti 20 tai serotyyppi. (Ks. Roberts, R.J., Crit. Rev. Biochem.Others, in turn, catalyze the hydrolysis of bonds separated by a few nucleotides to form free single-stranded regions at the cleavage site. Such single-stranded ends are self-complementary and thus cohesive and can be used to reattach hydrolyzed DNA. Because such an enzyme cleaves any DNA from only the same restriction site, the same cohesive ends are created, and this allows heterogeneous DNA sequences to be ligated together as long as they have first been treated with the same restriction enzyme. Restriction endonucleases are named according to the bacterial strain source; the first letter of the surname and the first two letters of the species name are used, and if more than one endonuclease is obtained from the same strain, a Roman numeral is added. For example, Hae III means one of three Haemophilus aegyptius restriction endonucleases. The name may contain other letters in addition to this, if a special isolate 20 or serotype must also be reported. (See Roberts, R.J., Crit. Rev. Biochem.

4, 123 (1976)).4, 123 (1976)).

On havaittu, että tietyn entsyymin restriktio-kohtia on melko harvassa ja ne ovat epätasaisesti jakautuneina. On tutkittava kokeellisesti, esiintyykö tiet-25 ty restriktiokohta jossakin segmentissä. Kuitenkin eri lähteistä on voitu eristää lukuisa ja yhä kasvava määrä restriktioendonukleaaseja, joilla on toisistaan poikkeava restriktiokohta spesifisyys, ja näin voidaan olettaa, että esimerkiksi jokin tietty tuhannen nukleotidin 30 sekvenssi sisältää yhden tai useampia restriktiokohtia.It has been found that restriction sites for a particular enzyme are quite sparse and unevenly distributed. It must be investigated experimentally whether a tie-25 ty restriction site exists in any segment. However, a large and growing number of restriction endonucleases with differing restriction site specificities have been isolated from various sources, and thus it can be assumed that, for example, a particular sequence of one thousand nucleotides contains one or more restriction sites.

Tämä keksintö kohdistuu uuteen menetelmään, jolla voidaan puhdistaa halutun nukleotidisekvenssin omaava cDNA, joka on komplementaarinen tietylle mRNA:lle. Menetelmässä katkaistaan restriktioendonukleaasin avulla 35 sellainen cDNA, joka on transkriboitu heterogeenisesta mRNA-seoksesta. Menetelmä ei edellytä RNA:n tarkkaa puh- 68261 15 distamista, mutta sen sijaan siinä käytetään hyväksi RNA:n transkriboimista cDNA:ksi, tämän cDNA:n spesifistä jakamista yhdellä tai kahdella restriktioendonukleaasil-la fragmenteiksi ja näiden cDNA-fragmenttien eristä-5 mistä pituuden perusteella. Restriktioendonukleaaseja käyttämällä vältytään heterogeeniselta koolta ja saadaan samanpituisia DNA-fragmentteja mistä tahansa cDNA:sta, josta ainakin osa sisältää vähintään kaksi restriktiokohtaa. Alun perin heterogeenisesta cDNA-transkriptipopulaatiosta saa-10 daan samankokoisia fragmentteja, joilla on haluttu sekvenssi. Fragmenttien pituus voi olla useita satoja nukleotideja ja joissakin tapauksissa ne voivat sisältää halutun proteiinin koko rakennegeenin. Fragmentin pituus riippuu restriktiokohtien välillä olevien nuk-15 leotidien lukumäärästä, joka tavallisesti on erilainen DNA:n eri kohdissa. Kun erottaminen suoritetaan pituuden perusteella, saadaan homogeenisia fragmenttipopu-laatioita, joilla on haluttu sekvenssi. Fragmentit saadaan kooltaan homogeenisina ja nukleotidisekvenssil-20 tään erittäin puhtaina. Tämän keksinnön sisältämällä erotus- ja analysointimenetelmillä on mahdollista erottaa sellaisia cDNA-fragmentteja, jotka ovat peräisin vastaavista mRNA-lajeista, määrän ollessa n. 2 % transskri-boitavan RNA:n massasta. Jos mRNA puhdistetaan ennen 25 transskriptiota ennestään tunnetuilla RNA:n fraktiointi-menetelmillä, saadaan alarajaksi vähemmän kuin 2 % organismista erotetusta kokonais-mRNA:sta.This invention relates to a novel method for purifying a cDNA having a desired nucleotide sequence that is complementary to a particular mRNA. The method uses a restriction endonuclease to cleave a cDNA transcribed from a heterogeneous mRNA mixture. The method does not require precise purification of the RNA, but instead utilizes the transcription of the RNA into a cDNA, the specific division of this cDNA by one or two restriction endonucleases into fragments, and the isolation of these cDNA fragments by length. by. Restriction endonucleases are used to avoid heterogeneous size and to obtain DNA fragments of the same length from any cDNA, at least some of which contain at least two restriction sites. From the initially heterogeneous population of cDNA transcripts, fragments of the same size with the desired sequence are obtained. The fragments can be several hundred nucleotides in length and in some cases may contain the entire structural gene of the desired protein. The length of the fragment depends on the number of nucleotides between the restriction sites, which is usually different at different sites in the DNA. When the separation is performed on the basis of length, homogeneous populations of fragments with the desired sequence are obtained. The fragments are obtained as homogeneous in size and very pure in nucleotide sequence. With the separation and analysis methods of the present invention, it is possible to separate cDNA fragments derived from the corresponding mRNA species in an amount of about 2% by weight of the RNA to be transcribed. If the mRNA is purified before transcription by known RNA fractionation methods, a lower limit of less than 2% of the total mRNA isolated from the organism is obtained.

Edellä pääpiirteissään selostetulla menetelmällä puhdistettujen spesifisten sekvenssien puhdis-30 tusta voidaan vielä jatkaa siten, että annetaan toisen restriktioendonukleaasin katkaista haluttu sekvenssi jostakin keskikohdasta. Tämä katkaisu johtaa kahteen rakenteeltaan haluttuun alafragmenttiin, jotka voidaan pituuden perusteella erottaa toisistaan. Alafragmentit· 35 erotetaan katkeamattomista ja spesifisesti katkenneista epäpuhtaussekvensseistä, joiden alkuperäinen koko on 16 6 82 61 ollut käytännöllisesti katsoen sama. Menetelmä perustuu restriktioendonukleaasin restriktiokohtien harvinaisuuteen ja satunnaiseen sijaintiin, sillä sen vuoksi on erittäin epätodennäköistä, että alun perin samanpituinen 5 epäpuhtausfragmentti katkeaa fragmenteiksi, jotka ovat samanpituisia kuin sekvenssiltään halutut alafragmentit. Kun epäpuhtauksista on päästy eroon, sekvenssiltään halutut alafragmentit voidaan yhdistää toisiinsa tunnetuilla menetelmillä ja näin rekonstruoida alkuperäinen 10 sekvenssi. Kahden alafragmentin liittyminen toisiinsa alkuperäiseen sekvenssiin nähden käänteisesti pitää estää. Tämän keksinnön yhteydessä selostetaan menetelmä, jolla alafragmentit saadaan liitetyksi toisiinsa oikeassa järjestyksessä.Purification of specific sequences purified by the method outlined above can be further continued by allowing a second restriction endonuclease to cleave the desired sequence from one of the sites. This cleavage results in two subfragments of the desired structure that can be separated by length. The subfragments · 35 are separated from unbroken and specifically broken impurity sequences with an original size of 16 6 82 61 which was practically the same. The method is based on the rarity and random location of restriction endonuclease restriction sites, as it is therefore highly unlikely that the impurity fragment of the same length will be broken into fragments of the same length as the desired subfragments. Once the impurities have been removed, the subfragments of the desired sequence can be joined together by known methods to reconstruct the original sequence. Joining of the two subfragments to each other in reverse to the original sequence must be prevented. In the context of the present invention, a method is described by which the subfragments are joined together in the correct order.

15 Edellä selostettuja menetelmiä voidaan muunnel la ja yhdistää sopiviin merkintämenetelmiin niin, että eristettyjen sekvenssien puhtaudesta ja määrästä saadaan tarkat tiedot. Yhdistetyillä menetelmillä on voitu valmistaa tunnettu nukleotidisekvenssi, jonka puhtaus-20 aste on yli 99 %.The methods described above can be modified and combined with appropriate labeling methods to provide accurate information on the purity and amount of sequences isolated. Combined methods have made it possible to prepare a known nucleotide sequence with a purity of more than 99%.

Kuvatuilla menetelmillä eristetty ja puhdistettu cDNA voidaan rekombinoida sopivan siirtovektorin kanssa ja siirtää tunnetuilla menetelmillä sopivaan isäntämikro-organismiin.The cDNA isolated and purified by the methods described can be recombined with a suitable transfer vector and transferred to a suitable host microorganism by known methods.

25 Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään lähtöaineena polyadenyloitua, epäpuhdasta tai osittain puhdistettua lähetti-RNA:ta, jonka sekvenssisisältö ja molekyylikoko voivat olla heterogeeniset. On tärkeätä, että menetelmän lähtöaineeksi valitaan sopiva haluttua 30 mRNArta sisältävä kudos. Valinta tapahtuu usein sen seikan perusteella, että vain erilaistuneen organismin tietyt erikoistuneet kudokset tuottavat mielenkiinnon kohteena olevaa proteiinia. Näin on asia esimerkiksi sellaisten peptidihormonien kuin kasvuhormonin ja ihmisen sikiön suo-35 nikalvon somatomammotropiinin ollessa kyseessä. Muissa tapauksissa taas voidaan todeta, että monet solutyypit tai mikrobilajit voivat toimia halutun mRNA:n lähteinä.The method of the present invention uses polyadenylated, impure or partially purified messenger RNA as a starting material, which may have heterogeneous sequence content and molecular size. It is important that a suitable tissue containing the desired 30 mRNA be selected as the starting material for the method. The choice is often made on the basis that only certain specialized tissues of the differentiated organism produce the protein of interest. This is the case, for example, with peptide hormones such as growth hormone and human fetal membrane somatomammotropin. In other cases, it can be seen that many cell types or microbial species can serve as sources of the desired mRNA.

17 6 8 2 6117 6 8 2 61

Kun RNA on erotettu soluista, voidaan halutut mRNA-sekvenssit rikastaa käyttämällä esipuhdistuksessa tavanomaisia RNA:n fraktiointimenetelmiä. Kaikki sellaiset menetelmät ovat käyttökelpoisia, joissa RNA ei hajoa.Once the RNA has been separated from the cells, the desired mRNA sequences can be enriched using conventional RNA fractionation techniques for pre-purification. All methods in which RNA is not degraded are useful.

5 Erittäin sopivia menetelmiä ovat preparatiivinen sedi-mentointi sakkaroosigradientissa ja geelielektroforeesi.Highly suitable methods include preparative sedimentation in a sucrose gradient and gel electrophoresis.

mRNA tulee eristää lähdesoluista sellaisissa olosuhteissa, joissa se ei hajoa. Varsinkin ribonukleaasi-entsyymien toiminta pitää estää, sillä nämä hajottavat 10 RNA:n nukleotidisekvenssiä hydrolyyttisesti. Jos yksi sidos hydrolysoituu, kyseinen sekvenssi rikkoutuu ja se fragmentti menetetään, joka sisältää sekvenssin alkuperäisen 5'-pään. FI-patenttihakemuksessa n:o 781 675 selostetaan sopivaa menetelmää, jolla ribonukleaasi 15 saadaan inhiboiduksi uuton aikana. Menetelmässä käytetään 4-molaarista guanidiniumtiosyanaattia ja 1-molaa-rista merkaptoetanolia solujen rikkomisvaiheessa. Eristettävän RNA:n hajoamista ribonukleaasin vaikutuksesta voidaan vielä vähentää, jos käytetään matalaa lämpöti-20 laa ja pH:ta, joka on lähellä arvoa 5.mRNA should be isolated from source cells under conditions where it does not degrade. In particular, ribonuclease enzymes must be inhibited because they hydrolytically degrade the nucleotide sequence of 10 RNAs. If one bond is hydrolyzed, that sequence is broken and the fragment containing the original 5 'end of the sequence is lost. FI patent application No. 781,675 describes a suitable method for inhibiting ribonuclease 15 during extraction. The method uses 4 molar guanidinium thiocyanate and 1 molar mercaptoethanol in the cell disruption step. The degradation of the RNA to be isolated by ribonuclease can be further reduced by using a low temperature of 20 ° C and a pH close to 5.

Ennenkuin keksinnön mukaista menetelmää voidaan soveltaa, mRNA täytyy saada puhdistetuksi epäpuhtaus-proteiineista, DNA:sta, polysakkarideista ja lipideistä. Tähän puhdistukseen käytetään ennestään tunnettuja 25 menetelmiä. Näin saatu RNA sisältää sekä mRNA:ta että muuta RNA:ta.Before the method of the invention can be applied, the mRNA must be purified from impurity proteins, DNA, polysaccharides and lipids. Prior art methods are used for this purification. The RNA thus obtained contains both mRNA and other RNA.

Edullinen eukaryoottisen mRNA:n eristysmenetelmä on pylväskromatografia oligo-dT-selluloosan avulla tai jonkun muun oligonukleotidisubstituoidun täytemateriaalin 30 avulla, sillä tällöin voidaan käyttää hyväksi vetysidos-spesifisyyttä, joka aiheutuu eukaryoottisen mRNA:n 3'-päässä olevasta polyadenyylihaposta.The preferred method of isolating eukaryotic mRNA is column chromatography with oligo-dT cellulose or some other oligonucleotide-substituted filler material, as this can take advantage of the hydrogen bond specificity due to the 3 'end of the eukaryotic mRNA of the eukaryotic mRNA.

Tämän keksinnön sisältämän menetelmän ensimmäisessä vaiheessa muodostetaan DNA, joka on kompiementaa-35 rinen eristetyille heterogeenisille mRNA-sekvensseille. Tähän reaktioon valitaan entsyymiksi käänteistranskrip-taasi, vaikka periaatteessa voidaan käyttää mitä ta- ib 68261 hansa sellaista entsyymiä, joka pystyy muodostamaan komplementaarisen DNA-kopion mRNA-templaatille. Reaktio voidaan suorittaa ennestään tunnetuissa olosuhteissa käyttämällä mRNA:ta templaattina ja neljän deoksinukleosidi-5 trifosfaatin seosta (dATP, dGTP, dCTP ja dTTP) DNA-säi-keen prekursoreina. On edullista, jos yksi deoksinukleo- siditrifosfaatti on merkitty radioisotoopilla, esimer-32 kiksi *U- P:llä, sillä sen avulla voidaan seurata reaktion kulkua, se toimii merkkinä, kun tuote otetaan tal-10 teen esimerkiksi kromatografisen tai elektroforeettisen erotuksen jälkeen, ja sen avulla voidaan tehdä kvantitatiivisia arvioita talteenotosta, ks. Efstratiadis, A., et ai., edellä.In the first step of the method of the present invention, DNA is generated that is complementary to the isolated heterogeneous mRNA sequences. Reverse transcriptase is selected as the enzyme for this reaction, although in principle any enzyme capable of making a complementary copy of DNA to an mRNA template can be used. The reaction can be performed under conditions known in the art using mRNA as a template and a mixture of four deoxynucleoside-5 triphosphates (dATP, dGTP, dCTP and dTTP) as DNA strand precursors. It is preferred that one deoxynucleoside triphosphate is labeled with a radioisotope, for example * U-P, as it can be used to monitor the progress of the reaction, it serves as a marker when the product is recovered after, for example, chromatographic or electrophoretic separation, and it can be used to make quantitative estimates of recovery, cf. Efstratiadis, A., et al., Supra.

Käänteistranskriptaasin avulla valmistetut 15 cDNA-transkriptit ovat hieman heterogeenisia mitä tulee 5’-päähän ja 3'-päähän sillä alku- ja päätepiste mRNA-templaatin suhteen saattaa vaihdella. 5'-pään vaihtelevuuden ajatellaan johtuvan siitä, että synteesin käynnistämisessä käytetty oligo-dT-primeri kykenee kiinnit-20 tymään useihin eri kohtiin mRNA:n polyadenyloidulla alueella. cDNA:n synteesi alkaa määrittelemättömästä kohdasta poly-A-alueelta, ja vaihteleva matka poly-A-aluetta transkriboidaan riippuen oligo-dT-primerin alkuperäisestä liittymiskohdasta. Tältä epämääräisyy-25 deltä voidaan välttyä käyttämällä primeriä, joka sisältää yhden tai kaksi itse RNA-sekvenssin nukleotidia, sillä näin muodostuu primeri, jolla on edullinen ja määritelty liittymiskohta transkriptioreaktion käynnistämisessä.The 15 cDNA transcripts prepared by reverse transcriptase are slightly heterogeneous at the 5 'end and 3' end as the start and end points with respect to the mRNA template may vary. The variability at the 5 'end is thought to be due to the ability of the oligo-dT primer used to initiate the synthesis to attach to several different sites in the polyadenylated region of the mRNA. cDNA synthesis begins at an unspecified site in the poly-A region, and a variable distance from the poly-A region is transcribed depending on the original junction of the oligo-dT primer. This ambiguity can be avoided by using a primer containing one or two nucleotides of the RNA sequence itself, as this will form a primer with a preferred and defined junction for initiating the transcription reaction.

30 cDNA-transkriptin 3'-pään epämääräisyys johtuu useista käänteistranskriptaasin reaktioon vaikuttavista tekijöistä ja RNA-templaatin mahdollisesta osittaisesta hajoamisesta. Pituudeltaan maksimaalisten spesifisten cDNA-transkriptien eristämistä voidaan helpot-35 taa suuresti, jos käänteistranskriptaasin reaktio-olosuhteet valitaan siten, että tasapaino asettuu täysi- 19 68261 pitkien ketjujen synteesin puolelle lyhyiden DNA-ket-jujen syntetisoitumisen jäädessä vähemmälle. Linnun myeloblastosisviruksen käänteistranskriptaasin edulliset reaktio-olosuhteet on esitetty esimerkkien yhteydes-5 sä. Reaktiolämpötila, suolakonsentraatio, entsyymimäärä, primerin ja templaatin konsentraatioiden suhde ja reaktioaika ovat parametreja, joita muuttamalla voidaan vaikuttaa siihen, että syntyy mahdollisimman paljon samanlaisia DNA-transkripteja.The ambiguity of the 3 'end of the 30 cDNA transcript is due to several factors affecting the reverse transcriptase reaction and the possible partial degradation of the RNA template. The isolation of specific cDNA transcripts of maximum length can be greatly facilitated if the reverse transcriptase reaction conditions are chosen so that the equilibrium is on the side of the synthesis of full-length long chains with less synthesis of short DNA strands. Preferred reaction conditions for avian myeloblastosis virus reverse transcriptase are set forth in the Examples. Reaction temperature, salt concentration, amount of enzyme, ratio of primer to template concentrations, and reaction time are parameters that can be altered to produce as many identical DNA transcripts as possible.

10 Lämpötila ja suolakonsentraatio valitaan siten, että oligo-dT-primerin ja RNA-templaatin polyadenyloi-dun osan välinen spesifinen emäsparimuodostus saadaan optimoiduksi. Oikein valituissa olosuhteissa primer kykenee sitoutumaan RNA-templaatin polyadenyloituun 15 osaan ja vältytään oleellisesti sellaisilta ei-spesi-fisiltä käyntiinpanoreaktioilta, jotka johtuvat primerin sitoutumisesta muihin templaatin kohtiin, kuten lyhyihin A-pitoisiin sekvensseihin. Lämpötilan ja suolan vaikutukset ovat riippuvaisia toisistaan. Korkeat läm-20 pötilat ja pienet suolakonsentraatiot vähentävät spesifisen emäsparivuorovaikutuksen pysyvyyttä. Reaktioaika pidetään mahdollisimman lyhyenä, jotta vältyttäisiin ei-spesifisiltä käynnistymisiltä ja hajoaminen jäisi mahdollisimman vähäiseksi. Reaktioaika ja lämpötila 25 ovat toisistaan riippuvaisia siten, että matala lämpötila vaatii pitemmän reaktioajan. 42°C:ssa on 1-10 minuutin välillä oleva reaktioaika sopiva. Primeriä pitäisi olla läsnä 50-500-kertainen molaarinen ylimäärä RNA-templaattiin verrattuna ja entsyymiä pitäisi olla 30 samansuuruinen ylimäärä RNA-templaattiin verrattuna. Entsyymi- ja primeriylimäärä edesauttavat reaktion käynnistymistä ja cDNA-ketjun kasvua siten, että lyhyen reaktioajan kuluessa muodostuu tehokkaasti pitkäketjui-sia cDNA-transkripteja.The temperature and salt concentration are selected to optimize the specific base pair formation between the oligo-dT primer and the polyadenylated portion of the RNA template. Under properly selected conditions, the primer is capable of binding to the polyadenylated portion of the RNA template and substantially avoiding non-specific priming reactions due to binding of the primer to other sites in the template, such as short A-containing sequences. The effects of temperature and salt are interdependent. High temperatures and low salt concentrations reduce the persistence of the specific base pair interaction. The reaction time is kept as short as possible to avoid non-specific starts and to minimize decomposition. The reaction time and the temperature 25 are interdependent, so that the low temperature requires a longer reaction time. At 42 ° C, a reaction time of 1 to 10 minutes is suitable. The primer should be present in a 50-500-fold molar excess over the RNA template and the enzyme should be present in an equal 30 excess over the RNA template. Excess enzyme and primer promote the initiation of the reaction and the growth of the cDNA strand, so that long-chain cDNA transcripts are efficiently formed within a short reaction time.

20 6826120 68261

Usein on mahdollista suorittaa tämän keksinnön mukaisen puhdistusmenetelmän loppuosa käyttämällä mRNArsta transkriboituja yksisäikeisiä cDNA-sekvenssejä. Kuten myöhemmin selostetaan, saattaa olla niin, että 5 haluttu restriktioentsyymi katkaisee vain kaksisäikeis-tä DNA:ta. Tällöin voidaan kaksisäikeinen DNA syntetisoida käyttämällä templaattina edellä kuvatulla tavalla valmistettua cDNA:ta ja entsyymeinä DNA-polymeraasia, kuten käänteistranskriptaasia, ja yksisäikeistä DNA:ta IQ hydrolysoivaa nukleaasia. Kaksisäikeisen DNA:n valmistusta tällä tavalla on selostettu kirjallisuudessa, ks. esim. Ullrich, A., Shine, J., Chirgwin, J., Pictet, R., Tischer, E., Rutter, W. J. Ja Goodman, H.H.,It is often possible to perform the remainder of the purification method of this invention using single-stranded cDNA sequences transcribed from mRNA. As will be described later, it may be that the desired restriction enzyme cleaves only double-stranded DNA. In this case, double-stranded DNA can be synthesized using cDNA prepared as described above as a template and DNA polymerase such as reverse transcriptase and single-stranded DNA IQ hydrolyzing nuclease as enzymes. The preparation of double-stranded DNA in this way has been described in the literature, cf. e.g., Ullrich, A., Shine, J., Chirgwin, J., Pictet, R., Tischer, E., Rutter, W. J., and Goodman, H.H.,

Science 196, 1313 (1977).Science 196, 1313 (1977).

15 Heterogeenisista mRNA-sekvensseistä transkriboi tu heterogeeninen cDNA käsitellään senjälkeen yhdellä tai kahdella restriktioendonukleaasilla. Endonukleaasin valinta riippuu ensi sijassa siitä, mitä entsyymin restriktiokohtia eristettävä cDNA-sekvenssi sisältää.Heterogeneous cDNA transcribed from heterogeneous mRNA sequences is then treated with one or two restriction endonucleases. The choice of endonuclease depends primarily on which restriction sites of the enzyme are contained in the cDNA sequence to be isolated.

20 Menetelmä riippuu kahden tällaisen kohdan olemassa olosta. Yksi entsyymi riittää, jos kohdat ovat identtisiä. Haluttu sekvenssi katkaistaan kummastakin kohdasta ja muodostuu pituudeltaan homogeeninen molekyyli- eli fragment-tipopulaatio, jolla on haluttu sekvenssi ja homogeeninen 25 pituus, ainakin halutun cDNA-sekvenssin kohdassa. Jos restriktiokohdat poikkeavat toisistaan, tarvitaan haluttujen, pituudeltaan homogeenisten fragmenttien valmistamiseen kaksi entsyymiä.20 The method depends on the existence of two such points. One enzyme is sufficient if the sites are identical. The desired sequence is cleaved at each site and a homogeneous population of molecules or fragments of length having the desired sequence and homogeneous length is formed, at least at the site of the desired cDNA sequence. If the restriction sites differ, two enzymes are required to produce the desired homogeneous fragments.

Koko haluttua proteiinia tai vain osaa siitä k.oo-30 daavan nukleotidisekvenssifragmentin valmistukseen tarvittava restriktioentsyymi (tai resktriktioentsyymit) on valittu kokeellisesti. Jos halutun proteiinin aminohappo-sekvenssi tunnetaan, on mahdollista verrata keskenään restriktioendonukleaasin katkaisemien, pituudeltaan homo-35 geenisten nukleotidifragmenttien nukleotidisekvenssiä ja sen koodaamaa aminohapposekvenssiä, sillä tunnettu geneettinen koodi on yhteinen kaikille elänönmuodoille. Halutun proteiinin täydellinen aminohapposekvenssi ei ole tarpeen, sillä osittaisen sekvens- 21 68261 sin perusteella voidaan tehdä verrattain tarkka identifiointi. Jos halutun proteiinin aminohapposekvenssiä ei tunneta, restriktioendonukleaasin avulla valmistettuja pituudeltaan homogeenisia polynukleotideja 5 voidaan käyttää näytteinä, joiden avulla voidaan syntetisoida proteiini sopivalla in vitro-menetelmällä ja identifioida se. Vaihtoehtoisesti voidaan mRNA puhdistaa affiniteettikromatografisesti. Alaan perehtyneiden tiedossa saattaa olla muita tähän tarkoitukseen sopivia 10 menetelmiä.The restriction enzyme (or restriction enzymes) required to produce all or part of the desired protein nucleotide sequence fragment has been selected experimentally. If the amino acid sequence of the desired protein is known, it is possible to compare the nucleotide sequence of restriction endonuclease-cleaved, homologous-35 nucleotide fragments with the amino acid sequence encoded by it, since the known genetic code is common to all life forms. The complete amino acid sequence of the desired protein is not necessary, as a relatively accurate identification can be made based on the partial sequence. If the amino acid sequence of the desired protein is not known, homogenous length polynucleotides 5 prepared by restriction endonuclease can be used as samples to synthesize and identify the protein by a suitable in vitro method. Alternatively, the mRNA can be purified by affinity chromatography. Other methods suitable for this purpose may be known to those skilled in the art.

Käyttökelpoisten restriktioentsyymien lukumäärä riippuu siitä, käytetäänkö yksisäikeistä vai kaksisäikeistä cDNA:ta. Edullisia entsyymejä ovat ne joiden vaikutus kohdistun siihen yksisäikeiseen DNAthan, joka on 15 mRNA:n käänteisen transkription välitön reaktiotuote.The number of restriction enzymes useful depends on whether single-stranded or double-stranded cDNA is used. Preferred enzymes are those that act on the single-stranded DNA, which is the direct reaction product of reverse transcription of 15 mRNA.

Tällä hetkellä tunnetaan vain eräitä sellaisia restrik-tioendonukleaaseja, joiden vaikutus kohdistuu yksisäikeiseen DNA:hän, esimerkiksi Haelll ja HhaI. Restriktio-endonukleaasikäsittelyä varten valmistettava cDNA voidaan 20 merkitä radioaktiivisesti niin, että se voidaan tunnistaa myöhempien erotusvaiheiden jälkeen. On edullista sisällyttää radioaktiivinen merkki, kuten (X- P, yhteen neljästä deoksinukleosiditrifosfaattiprekursorista. Suurin aktiivisuus saadaan, jos radioaktiivisen perkursorin väkevyys 25 on suuri ei-radioaktiivisen osan väkevyyteen verraituna. Jokaisen deoksinukleosiditrifosfaatin kokonaisväkevyy-den pitäisi kuitenkin olla yli 30 pm mol/], jotta kään- 22 68261 teistranskriptaasin katalysoimassa reaktiossa saavutettaisiin mahdollisimman pitkä cDNA. ks. Efstratiadis, A., Maniatis, T., Kafatos, F. C., Jeffrey, A. ja Vournakis, J.N., Cell H, 367 (1975). cDNA:n nukleotidi- 5 sekvenssin määritystä varten on 5'-päät hyvä merkitä 3 2 ^ zP:llä käyttämällä hyväksi polynukleotidikinaasin katalysoimaa reaktiota, ks. Maxam, A.M. ja Gilbert, W., Proc. NatL Acad. Sei. USA, 74, 560 (1977).Currently, only a few restriction endonucleases are known to act on single-stranded DNA, such as HaellI and HhaI. The cDNA to be prepared for restriction endonuclease treatment can be radiolabeled so that it can be identified after subsequent separation steps. It is preferred to include a radiolabel such as (X-P, in one of the four deoxynucleoside triphosphate precursors. The highest activity is obtained if the concentration of the radioactive precursor is high compared to the concentration of the non-radioactive moiety. However, the total concentration of each deoxynucleoside triphosphate should be The longest possible cDNA would be obtained in a reaction catalyzed by reverse transcriptase, see Efstratiadis, A., Maniatis, T., Kafatos, FC, Jeffrey, A. and Vournakis, JN, Cell H, 367 (1975). For 5 sequence determination, the 5 'ends should be labeled with 3 2 ^ zP utilizing a polynucleotide kinase catalyzed reaction, see Maxam, AM and Gilbert, W., Proc. NatL Acad. Sci. USA, 74, 560 (1977).

Fragmentit, jotka ovat syntyneet restriktioent-10 syymin vaikutuksesta tai kahden restriktioentsyymin yhdistelmän vaikutuksesta, voidaan erottaa toisistaan ja heterodispersseistä sekvensseistä, joissa ei ole tunnistamis kohtaa , niiden pituuden perusteella. Tämä voidaan tehdä useilla elektroforeettisella menetelmällä 15 ja sedimentointimenetelmällä ultrasentrifugia käyttäen. Geelielektroforeesi on asetettava etusijalle, sillä sen avulla saavutetaan paras resoluutio polynukleotidin pituuden perusteella. Lisäksi menetelmällä on helppo saada erotetut aineet talteen kvantitatiivisesti. Edullisia 20 geelielektroforeerimenetelmiä on selostettu seuraavis-sa julkaisuissa: Dingman, C.W. ja Peacock, A.C., Biochemistry 7, 659 (1968) ja Maniatis, T., Jeffrey, A., ja van de Sande, H., Biochemistry 14, 3787 (1975).Fragments generated by a restriction enzyme or a combination of two restriction enzymes can be distinguished from each other and from heterodisperse sequences without a recognition site by their length. This can be done by several electrophoretic methods and sedimentation methods using an ultracentrifuge. Gel electrophoresis must be given priority as it provides the best resolution based on the length of the polynucleotide. In addition, the method makes it easy to recover the separated substances quantitatively. Preferred gel electrophoresis methods are described in Dingman, C.W. and Peacock, A.C., Biochemistry 7, 659 (1968) and Maniatis, T., Jeffrey, A., and van de Sande, H., Biochemistry 14, 3787 (1975).

Ennen restriktioendonukleaasikäsittelyä ovat 25 useimmista lähteistä saadut cDNA-transkriptit pituudeltaan heterodisperssejä. Kun sopivasti valitun restriktioendonukleaasin tai restriktioendonukleaasipa-rin annetaan vaikuttaa polynukleotidiketjuihin, jotka sisältävät halutun sekvenssin, ketju katkeaa vastaavis-30 ta restriktiokohdista, ja saadaan yhtä pitkiä polynukleot idifragmentteja. Geelielektroforeesissa nämä havaitaan selvästi erottuvina viivoina. Restriktiokohtien 23 6 8 2 61 läsnäolosta tai puuttumisesta riippuen voidaan myös muista sekvensseistä saada erillisiä viivoja, joiden sisältämien sekvenssien pituudet kuitenkin todennäköisesti poikkeavat halutun sekvenssin pituudesta. Näin 5 ollen restriktioendonukleaasin vaikutuksen seurauksena saadaan geelielektroforeesissa esiin yksi tai useampia erillisiä viivoja ja loput cDNA:sta jää heterodis-persiksi. Kun suurin osa läsnäolevista polynukleoti-disekvensseistä on haluttua cDNArta, saadaan elektro-10 foreesin tuloksena yksi ainoa cDNA-viiva.Prior to restriction endonuclease treatment, cDNA transcripts from most sources are heterodisperse in length. When an appropriately selected restriction endonuclease or restriction endonuclease pair is allowed to act on polynucleotide chains containing the desired sequence, the chain is cleaved at the corresponding restriction sites to give polynucleotide idif fragments of equal length. In gel electrophoresis, these are observed as distinct lines. Depending on the presence or absence of restriction sites 23 6 8 2 61, separate lines may also be obtained from other sequences, however, the lengths of the sequences contained in them are likely to differ from the length of the desired sequence. Thus, the effect of restriction endonuclease results in gel electrophoresis revealing one or more distinct lines and leaving the remainder of the cDNA heterodispersed. When most of the polynucleotide sequences present are of the desired cDNA, electrophoresis results in a single cDNA line.

Vaikka onkin epätodennäköistä, että restriktio-entsyymit katkaisevat kaksi erilaista sekvenssiä siten, että syntyy käytännöllisesti katsoen samanpituisia fragmentteja, on kuitenkin toivottavaa, että tietynpituis-15 ten fragmenttien puhtaus voidaan jollakin menetelmällä varmistaa. Elektroforeesiviivan sekvenssianalyysillä voidaan ilmaista epäpuhtaudet, joita on 10 % tai sitä enemmän kaistan materiaalissa. Niinpä on kehitetty menetelmä, jolla voidaan ilmais-20 ta edellä mainittua pienemmätkin epäpuhtaudet, ja menetelmä perustuu samoihin seikkoihin kuin edellä kuvattu erotusmenetelmä. Menetelmä edellyttää sitä, että haluttu nukleotidisekvenssifragmentti sisältää sellaisen restriktioendonukleaasin restriktiokohdan, jota ei 25 ole käytetty ensimmäisessä erotuksessa. Sopivia restrik-tioendonukleaaseja on selitetty edellä. Kun elektrofo-reesiviivasta eluoitu polynukleotidimateriaali käsitellään sellaisella restriktioendonukleaasilla, joka pystyy katkaisemaan halutun sekvenssin sisäisesti, saadaan 30 kaksi alafragmenttia, jotka hyvin todennäköisesti ovat· eripituisia. Elektroforeesissa nämä alafragmentit muodostavat pituuttaan vastaaviin kohtiin kaksi erillistä viivaa, joiden sisältämien fragmenttien pituuksien summa on yhtä suuri kuin polynukleotidin pituus ennen kat-35 kaisua. Alkuperäisen viivan sisältämien epäpuhtauksien, < 24 68261 joihin restriktioentsyymi ei vaikuta, voidaan odottaa kulkeutuvan alkuperäiseen kohtaan. Epäpuhtaudet, joissa on yksi tai useampia restriktiokohtia, hajoavat kahdeksi tai useammaksi alafragmentiksi. Koska restrik-5 tiokohtien sijaintia pidetään satunnaisena, on hyvin epätodennäköistä, että epäpuhtauksista syntyy samankokoisia alafragmentteja kuin halutusta sekvenssistä.Although it is unlikely that restriction enzymes will cleave two different sequences to produce fragments of substantially the same length, it is desirable that the purity of fragments of a certain length be ensured by some method. Sequence analysis of the electrophoresis line can detect impurities of 10% or more in the band material. Thus, a method has been developed which can detect impurities even smaller than the above, and the method is based on the same considerations as the separation method described above. The method requires that the desired nucleotide sequence fragment contain a restriction endonuclease restriction site that has not been used in the first separation. Suitable restriction endonucleases have been described above. When the polynucleotide material eluted from the electrophoresis line is treated with a restriction endonuclease capable of cleaving the desired sequence internally, two subfragments are obtained which are very likely to be of different lengths. In electrophoresis, these subfragments form two distinct lines at their respective positions, the sum of the lengths of the fragments contained being equal to the length of the polynucleotide before cleavage. Impurities in the original line, <24 68261 not affected by the restriction enzyme, can be expected to migrate to the original site. Impurities with one or more restriction sites degrade into two or more subfragments. Because the location of the restriction site 5 is considered random, it is highly unlikely that the impurities will result in subfragments of the same size as the desired sequence.

Minkä tahansa viivan sisältämä radioaktiivisesti merkityn polynukleotidin määrä voidaan mitata kvantitatiivi-10 sesti radioaktiivisuusmittauksella tai millä tahansa muulla sopivalla menetelmällä. Halutun sekvenssin fragmenttien kvantitatiivinen mitta saadaan vertaamalla halutun sekvenssin alafragmenttien kaistojen ainemääriä kokonaisainemäärään.The amount of radiolabeled polynucleotide contained in any line can be quantified by radioactivity measurement or any other suitable method. A quantitative measure of fragments of a desired sequence is obtained by comparing the amounts of material in the bands of subfragments of the desired sequence to the total amount of material.

15 Edellä selostetun erotuksen jälkeen haluttu sek venssi voidaan rekonstruoida. Tähän tarkoitukseen sopii DNA-ligaasi, joka katalysoi DNA-fragmenttien päiden liittymisen toisiinsa. Halutun sekvenssin alafragmentit voidaan eluoida erikseen geelielektroforeesiviivoista 20 ja yhdistää sopivissa olosuhteissa DNA-ligaasin läsnäollessa, ks. Sgaramella, V., Van de Sande, J.H. ja Khorana, H.G. Proc. Nat. Acad. Sei. USA 67, 1468 (1970). Jos yhdistettävät sekvenssit eivät ole tylppäpäisiä, voidaan käyttää E.colin ligaasia, ks. Modrich, P. ja Lehman, 25 I.R., J. Biol. Chem. 245, 3626 (1970).After the separation described above, the desired sequence can be reconstructed. A DNA ligase that catalyzes the annealing of the ends of DNA fragments is suitable for this purpose. Subfragments of the desired sequence can be eluted separately from the gel electrophoresis lines 20 and pooled under appropriate conditions in the presence of DNA ligase, cf. Sgaramella, V., Van de Sande, J.H. and Khorana, H.G. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 67, 1468 (1970). If the sequences to be joined are not blunt-ended, E. coli ligase can be used, cf. Modrich, P. and Lehman, 25 I.R., J. Biol. Chem. 245, 3626 (1970).

Alkuperäisen sekvenssin rekonstruointi lähtien restriktioendonukleaasikäsittelyssä syntyneistä ala fragmenteista paranee huomattavasti, jos väärien sekvenssien muodostuminen saadaan estetyksi. Haitalliselta loppuiu-30 lokselta vältytään, jos halutun sekvenssin sisältävä, pituudeltaan homogeeninen cDNA-fragmentti käsitellään ennen restriktioendonukleaasikäsittelyä sellaisella reagenssilla, joka pystyy poistamaan 5'-päätefosfaat-tiryhmät cDNA:sta. Emäsfosfataasi on edullinen entsyy-35 mi tähän tarkoitukseen. DNA-ligaasi pystyy katalysoimaan 25 68261 katkenneiden fragmenttien liittymisen toisiinsa vain siinä tapauksessa, että 5'-päätefosfaattiryhmä on läsnä. Näin ollen sellaisia päitä ei voida yhdistää, joissa ei ole 5T-päätefosfaattia. DNA-alafragmentit voidaan 5 liittää vain sellaisiin päihin, jotka sisältävät 5'-fosfaatin, joka on syntynyt restriktioendonukleaasin katkaistessa erotettuja DNA-fragmentteja. Tätä menetelmää on selostettu yksityiskohtaisesti FI-patenttihakemuksessa n:o 781 675.Reconstruction of the original sequence from the restriction endonuclease treatment-derived subfragments is greatly improved if the formation of false sequences is prevented. A detrimental final solution is avoided if a homogeneous length cDNA fragment containing the desired sequence is treated prior to restriction endonuclease treatment with a reagent capable of removing the 5 'terminal phosphate groups from the cDNA. Base phosphatase is the preferred enzyme for this purpose. DNA ligase is only able to catalyze the association of 25,6261 truncated fragments with each other in the presence of a 5 'terminal phosphate group. Thus, ends without 5T terminal phosphate cannot be joined. DNA subfragments can only be ligated to ends containing 5'-phosphate generated by restriction endonuclease cleavage of separated DNA fragments. This method is described in detail in FI Patent Application No. 781,675.

10 Käytetyissä olosuhteissa on suurin osa cDNA- transkripteistä johdettu siitä mRNA-alueesta, joka sisältää mRNA-templaatin 5'-pään käyttämällä tässä templaa-tissa primerinä fragmenttia, joka on saatu restriktioendonukleaasin katalysoimassa katkaisussa. Tällä ta-15 valla voidaan edellä kuvatulla menetelmällä saada sekä sellaisia fragmentteja, jotka sisältävät vain osan halutun proteiinin koodaavasta nukleotidisekvenssistä, että koko nukleotidisekvenssi.Under the conditions used, most of the cDNA transcripts are derived from the mRNA region containing the 5 'end of the mRNA template using a fragment obtained by restriction endonuclease-catalyzed cleavage as a primer in this template. In this way, both fragments containing only a part of the nucleotide sequence encoding the desired protein and the entire nucleotide sequence can be obtained by the method described above.

Ihmisen geenien kloonauksessa on puhdistusmene-20 telmä erittäin tärkeä, sillä vallitsevien määräysten mukaan ihmisen geeni tulee ennen rekombinointia DNA:n kanssa ja sen siirtämistä bakteeriin puhdistaa erittäin huolellisesti, ks. USA:n "Federal Register", Voi.In the cloning of human genes, the purification method is very important, because according to the prevailing regulations, the human gene must be purified very carefully before recombination with DNA and its transfer into the bacterium, cf. U.S. Federal Register, Vol.

41, no 131, 1967-07-07, ss. 27902-27943. Tämän keksinnön 25 mukaisella menetelmällä on onnistuttu tuottamaan riittävän puhtaita ihmisen geenejä, jotka sisältävät pääosan ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia kooda-vasta rekenteesta. Edellä kuvatulla menetelmällä eristetty ja puhdistettu ihmisen geneettinen materiaali 30 voidaan rekombinoida'plasmideihin tai muihin siirto-vektoreihin.41, no 131, 1967-07-07, ss. 27902-27943. The method of this invention has succeeded in producing sufficiently pure human genes that contain a major portion of the human fetal choroidal somatomammotropin-encoding structure. Human genetic material isolated and purified by the method described above can be recombined into plasmids or other transfer vectors.

26 6826126 68261

Edellä kuvatuilla puhdistus- ja analyysimenetelmillä on voitu eristää suurin osa ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin rakennegeenin nukleotidisekvenssistä, jolloin puhtausaste on ollut yli 99 %. On syntetisoitu uu-5 siä plasmideja, jotka sisältävät ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaavan nukleotidisekvenssin. On valmistettu uusia mikro-organismeja, joiden geneettisen rakenteen osana on ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaava nukleotidisekvenssi.The purification and analysis methods described above have been able to isolate most of the nucleotide sequence of the human fetal choroidal somatomammotropin structural gene with a purity of greater than 99%. New plasmids containing the nucleotide sequence encoding human fetal choroidal somatomammotropin have been synthesized. New microorganisms have been prepared whose genetic structure includes the nucleotide sequence encoding human fetal choroidal somatomammotropin.

10 Liitteenä olevilla kuvilla ja piirroksilla valais taan tämän keksinnön sisältämiä esimerkkejä.The accompanying drawings and drawings illustrate the examples of the present invention.

Kuva 1 esittää autoradiogrammia geelielektroforeesi- 3 2 sarjasta, joka on suoritettu OL P-merkitylle cDNA:lle, ja jota selostetaan yksityiskohtaisesti esimerkissä 1.Figure 1 shows an autoradiogram of a gel electrophoresis series performed on OL P-labeled cDNA and described in detail in Example 1.

15 Kuva 2 on kaavioesitys ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin nukleotidisekvenssikoodista ja siinä näkyvät eri restriktiokohtien suhteelliset sijainnit, kuten esimerkissä 1 selostetaan yksityiskohtaisesti.Figure 2 is a schematic representation of the nucleotide sequence code of human fetal choroidal somatomammotropin and shows the relative locations of the various restriction sites, as described in detail in Example 1.

3 23 2

Kuva 3 on autoradiogrammi OL P:llä merkityllä 20 cDNA:lla tehdyistä geelielektroforeeseista (ks. esimerkki 2).Figure 3 is an autoradiogram of gel electrophoresis on 20 cDNAs labeled with OL P (see Example 2).

3 23 2

Kuvat H ja 5 ovat autoradiogrammeja OL P:llä merkityllä cDNA:lla tehdyistä geelielektroforeeseista (ks. esimerkki 3).Figures H and 5 are autoradiograms of gel electrophoresis performed on OL P-labeled cDNA (see Example 3).

68261 2768261 27

Esimerkki 1 Tässä kuvataan tietyn cDNA-sekvenssin yleistä erotusmenetelmää ottamalla esimerkiksi ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaavan alueen 5 sekvenssiosan erottaminen istukkakudosuutteesta.Example 1 A general method for separating a particular cDNA sequence is described herein, for example, by separating the sequence portion of the human fetal choroidal somatomammotropin coding region 5 from a placental tissue extract.

mRNArn uuttaminen istukoistaExtraction of mRNA from placenta

Keisarinleikkauksessa saadut ihmisen täysiaikaiset istukat jäähdytettiin nopeasti nestemäisessä types-sä ja säilytettiin -60°C:ssa. Kokonais-RNA:n uuttamisek-10 si 40 g jäähdytettyä istukkakudosta hienonnettiin ja liuotettiin 0°C:ssa 140 ml:aan vastavalmistettua liuosta, joka sisälsi 7 mol/1 guanidinium-HCl:ää (Cox, R.A., Medhods in Enzymology 12, 120 (1968), 20 mmol/1 tris-HC1 (pH 7,5), 1 mmol/1 EDTA ja 1 % sarkosyyliä (Ciba-15 Geigy Corp., Greensboro, N.C.). Tämän jälkeen kutakin ml:a liuosta kohti lisättiin 0,5 g CsCl, ja syntynyttä tummanruskeaa liuosta kuumennettiin 5 minuuttia 65°C:ssa, jäähdytettiin nopeasti jäällä ja kerrostettiin nitro-selluloosaputkissa (2,54 x 8,89 cm), joiden pohjalla 20 oli 5 ml liuosta, joka sisälsi 5,7 mol/1 CsCl, 10 mmol/1 tris-HCl (pH 7,5) ja 1 mmol/1 EDTA, sentrifugoimalla 16 tuntia 15°C:ssa nopeudella 27 000 r/min SW27-roottorilla (Beckman Instruments Corp., Fullerton, California), ks. Clisin, V., Grkvenjakov, R. ja Ryus, C., Biohem 25 13, 2633 (1974). Sentrifugoinnin jälkeen putkien sisäl löt dekantoitiin, putket kuivattiin ja alimpana puolen cm RNA-hiukkaset sisältävä kerros leikattiin irti partaterällä. Aine liuotettiin 20 ml:aan liuosta, jossa oli 10 mmol/1 tris-HCl, pH 7,5, 1 mmol/1 EDTA, 5 % 30 sarkosyyliä ja 5 % fenolia steriilissä erlenmeyer- pullossa. Tämän jälkeen liuokseen lisättiin NaCl pitoisuudeksi 0,1 mol/1 ja sen jälkeen ravistettiin voimakkaasti 40 ml:n kanssa seosta, joka sisälsi 50 % fenolia ja 50 % kloroformia. RNA saostettiin vesifaasista eta-35 nolilla natriumasetaatin (0,2 mol/1, pH 5,5) läsnäollessa. RNA-tuote pestiin 95 % etanolilla, kuivattiin 28 68261 ja liuotettiin steriiliin veteen. Tavallisesti 40 g:sta istukkakudosta saatiin noin 30 mg RNA:ta, ja tästä taas noin 300 ^ug polyadenyloitua RNA:ta, kun kromatogra-foitiin kahdesti oligo-dT-selluloosalla (ks. Aviv ja 5 Leder, edellä).Full-time human placenta obtained by caesarean section was rapidly cooled in liquid types and stored at -60 ° C. To extract total RNA, 40 g of chilled placental tissue was minced and dissolved at 0 ° C in 140 ml of freshly prepared solution containing 7 M guanidinium HCl (Cox, RA, Medhods in Enzymology 12, 120 (1968), 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, and 1% sarcosyl (Ciba-15 Geigy Corp., Greensboro, NC). .5 g CsCl, and the resulting dark brown solution was heated at 65 ° C for 5 minutes, rapidly cooled with ice, and layered in nitrocellulose tubes (2.54 x 8.89 cm) with 5 mL of a solution containing 5.7 g at the bottom. mol / l CsCl, 10 mmol / l tris-HCl (pH 7.5) and 1 mmol / l EDTA, centrifuged for 16 hours at 15 ° C at 27,000 rpm on a SW27 rotor (Beckman Instruments Corp., Fullerton, California), see Fig. Clisin, V., Grkvenjakov, R., and Ryus, C., Biohem 25 13, 2633 (1974) containing. after centrifugation, the tubes included Löt decanted, the tubes were dried, and the bottom side of the RNA-cm layer of particles le scraped off with a razor blade. The substance was dissolved in 20 ml of a solution of 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 5% sarcosyl and 5% phenol in a sterile Erlenmeyer flask. NaCl was then added to the solution to a concentration of 0.1 mol / L, and then a mixture containing 50% phenol and 50% chloroform was shaken vigorously with 40 ml. RNA was precipitated from the aqueous phase with ethanol-35 in the presence of sodium acetate (0.2 mol / L, pH 5.5). The RNA product was washed with 95% ethanol, dried to 28,686,21 and dissolved in sterile water. Usually, about 30 mg of RNA was obtained from 40 g of placental tissue, and again about 300 μg of polyadenylated RNA when chromatographed twice with oligo-dT cellulose (see Aviv and 5 Leder, supra).

cDNA-synteesicDNA synthesis

Analyyttiset reaktiot suoritettiin 5 ^ulissa liuosta, joka sisälsi 50 uuno 1/1 tris-KCl (pH 8,3), 0,1 mmol/1 EDTA, 7 mmol/1 MgClgj 20 mmol/1 KC1, 10 mmol/1 10 /^-merkaptoetanolia, 40 ^umol/1 dCTP (50 000 laskinyk-sikköä/min/pmol„^P), DGTP, dATP ja dTTP (500 ^umol/1 kutakin), 100 ^ug/ml polyadenyloitua RNA:ta, 20 ^ug/ml oligo-dT^2_]_g (toimittaja Collaborative Research,Analytical reactions were performed in 5 μl of a solution containing 50 Uuno 1/1 tris-KCl (pH 8.3), 0.1 mmol / l EDTA, 7 mmol / l MgCl 2 and 20 mmol / l KCl, 10 mmol / l 10 / β-mercaptoethanol, 40 μmol / l dCTP (50,000 cc / min / pmol β P), DGTP, dATP and dTTP (500 μmol / l each), 100 μg / ml polyadenylated RNA, ^ ug / ml oligo-dT ^ 2 _] _ g (edited by Collaborative Research,

Waltham, Mass), ja 100 yksikköä/ml linnun Myeloblastosis-15 viruksen käänteistranskriptaasia. Tätä entsyymiä toimittaa D.J. Beard, Life Science Incorporated, St.Waltham, Mass.), And 100 units / ml avian Myeloblastosis-15 virus reverse transcriptase. This enzyme is supplied by D.J. Beard, Life Science Incorporated, St.

Petersburg, Florida, joka valmistaa entsyymiä National Institutes of Health'in kanssa tekemällään sopimuksella seuraavalla menetelmällä: Kacian, D.L. ja Spiegelman, 20 S., Methods in Enzymology 29, L. Grossman ja K. Moldave, eds. Academic Press, N.Y. (1974), s. 150. Reaktiot aloitettiin lisäämällä entsyymi 0°C:ssa ja synteesi kesti 6 minuuttia 42°C:ssa. Näissä olosuhteissa noin 10 las-kinyksikköä/min ^ P saatiin sisällytetyksi TCA:lla 25 saostuvaan materiaaliin, ja kukin ^ug RNA:ta antoi noin 50 ng cDNA. Jotta sekvenssianalyysiä varten olisi saatu riittävästi cDNA:ta, reaktiotilavuus nostettiin 100 ,ug:aan ja dCTP-väkevyys 250 ,umol/l:ksi 32 (ominaisaktiivisuus 500 laskinyksikköä/min/pmolOt P).Petersburg, Florida, which manufactures the enzyme under contract to the National Institutes of Health by the following method: Kacian, D.L. and Spiegelman, 20 S., Methods in Enzymology 29, L. Grossman and K. Moldave, eds., Academic Press, N.Y. (1974), p. 150. Reactions were initiated by the addition of enzyme at 0 ° C and synthesis lasted 6 minutes at 42 ° C. Under these conditions, about 10 counting units / min ^ P was incorporated into the TCA-precipitating material, and each ug of RNA yielded about 50 ng of cDNA. In order to obtain sufficient cDNA for sequence analysis, the reaction volume was increased to 100 μg and the dCTP concentration to 250 μmol / l 32 (specific activity 500 counter units / min / pmolOt P).

30 Näissä olosuhteissa saatiin cDNA:han sisällytetyksi 3? noin 200 000 1/min ^ P:llä merkittyä dCTPitä. Restriktioendonukleaasikäsittely Restriktioendonukleaasikäsittelyä varten analyyttiset reaktiot pysäytettiin siten, että lisät- * 35 tiin 20 ^ul jääkylmää vettä, keitettiin 2 minuuttia, 29 6 8 2 61 jäähdytettiin nopeasti jäällä ja lisättiin sen verran magnesiumkloridia, että pitoisuudeksi tuli 7 mmol/1.Under these conditions, 3? about 200,000 rpm dCTPs. Restriction endonuclease treatment For the restriction endonuclease treatment, the analytical reactions were stopped by adding 20 μl of ice-cold water, boiling for 2 minutes, cooling rapidly with ice and adding magnesium chloride to a concentration of 7 mmol / l.

5 Näytteitä (5 ^ul, noin 2 a 10 1/min) käsiteltiin ylimäärällä restriktioendonukleaasia Hae III (voidaan 5 myös käyttää HhaI tai HaeIII:n ja Hhal:n seosta, ks. kuvio 1) 1 tunti 37°C:ssa. Haelll valmistettiin seu-raavalla menetelmällä: Middleton, J.H., Edgell, M.H. ja Hutchinson, C.A.III, J. Virol. 10, 42 (1972). New England Bio-Labs, Beverly, Mass., toimitti entsyymit 10 HhaI ja Hpall. Viimeksimainittu toimittaa myös entsyymiä Haelll. Koetulosten perusteella käytettiin entsyymiä enemmän kuin mitä tarvitaan restriktiosensitiivisen DNA:n täydelliseen käsittelyyn identtisissä reaktio-olosuhteissa. Reaktiot pysäytettiin lisäämällä 5 ^ul 15 liuosta, joka sisälsi 20 mmol/1 EDTA, 20 % sakkaroosia ja 0,05 % bromifenolisinistä, ja kuumentamalla 1 minuutti 100°C:ssa, ja sen jälkeen suoritettiin analyysi polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Tuotteet erotettiin polyakryyliamidiyhdistelmälevygeelillä (4,5 % -20 10 %) tris-boraatti-EDTA-puskurissa (2,5 tuntia, 150 V) (ks. Dingman, C.W. ja Peacock. A.C., edellä) ja visualisointiin autoradiografisesti kuivasta geelistä.Samples (5 μl, about 2 a 10 l / min) were treated with excess restriction endonuclease Hae III (HhaI or a mixture of HaeIII and Hhal can also be used, see Figure 1) for 1 hour at 37 ° C. Haelll was prepared by the following method: Middleton, J.H., Edgell, M.H. and Hutchinson, C.A.III, J. Virol. 10, 42 (1972). New England Bio-Labs, Beverly, Mass., Supplied the enzymes 10 HhaI and HpaI. The latter also supplies the enzyme Haelll. Based on the experimental results, more enzyme was used than is required for complete processing of restriction-sensitive DNA under identical reaction conditions. Reactions were stopped by the addition of 5 of a solution containing 20 mmol / l EDTA, 20% sucrose and 0.05% bromophenol blue, and heating for 1 minute at 100 ° C, followed by analysis by polyacrylamide gel electrophoresis. Products were separated on a polyacrylamide composite plate gel (4.5% -20 10%) in tris-borate-EDTA buffer (2.5 hours, 150 V) (see Dingman, C.W. and Peacock. A.C., supra) and visualized autoradiographically on a dry gel.

Kuviossa 1 nähdään geelielektroforeesi- ja auto-3 2 radiograf.iatulokset oi, P:llä merkitystä cDNA:sta, joka 25 on valmistettu edellä kuvatulla tavalla. Näytetäplät kulkeutuivat alkupisteestään elektroforeettisesti ensin 4,5-% akryyliamidin ja sitten 10-% äkryy 1 iamiöin läpi. Kuvan vasemmassa laidassa oleva viiva osoittaa kahden geelialueen välistä rajaa. Kaista A edustaa koko cDNA-transskriptin 30 elektroforeettista liikkuvuutta. Kaista B esittää Hha-entsyymillä käsitelty cDNA:n liikkuvuutta. Kaista C esittää sekä HhaI-entsyymillä että Haelll-entsyymillä käsitellyn koko cDNA:n liikkumista. Kaista E esittää sen materiaalin elektroforeettista liikkumista, jonka viiva 35 on voimakkain kaistassa C. Kaista F esittää kaistan C voimakkaimmasta viivasta eristetyn materiaalin liikku- 3o 68261 vuutta, kun se on ensin käsitelty Hhal-entsyymillä. Koko- standardina käytettiin yksisäikeistä fagin M13 DNA:ta, 32 jonka 5'-pää oli merkittyc*£. P:llä, ja joka oli katkaistu HaelII-entsyymillä (Horiuchi, K. ja Zinder, N.D., 5 Proc. Nat. Acad. Sei. Usa, 72, 2555 (1975) ja sen liikkuvuus näkyy kaistassa G. Näiden DNA-fragmenttien nukleotidisekvenssien keskimääräiset pituudet on merkitty numeroilla oikealle.Figure 1 shows the results of gel electrophoresis and auto-3 2 radiography of oi, P-labeled cDNA prepared as described above. The sample spots were electrophoretically passed from their starting point first through 4.5% acrylamide and then 10% acrylamide. The line on the left side of the image shows the boundary between the two gel areas. Lane A represents the electrophoretic mobility of the entire cDNA transcript. Lane B shows the mobility of Hha-treated cDNA. Lane C shows the movement of the entire cDNA treated with both HhaI and HaellI. Lane E shows the electrophoretic movement of the material with the strongest line 35 in lane C. Lane F shows the mobility of the material isolated from the strongest line in lane C when first treated with Hhal. Single-stranded phage M13 DNA 32 with a 5 'end was labeled as a size standard. P, which was truncated with the enzyme HaelII (Horiuchi, K. and Zinder, ND, 5 Proc. Nat. Acad. Sci. Usa, 72, 2555 (1975)) and its mobility is shown in lane G. The nucleotide sequences of these DNA fragments average lengths are numbered to the right.

Kaistan A tuloksesta voidaan todeta, että täysi-10 aikaisen istukan mRNA:n cDNA-transkripti on heterodis- perssi. Käsittely entsyymillä HhaI, kaista B, tai entsyymillä Haelll, kaista C, johtaa tietynpituisten poly-nukleotidien kasautumiseen. Tällaisten erillisten viivojen syntyminen todistaa sitä, että heterogeenisessa 15 cDNA-transkriptipopulaatiossa on läsnä useampana kappaleena vähintään yhtä sekvenssiä, jossa on kaksi HhaI:n ja HaeIII:n tunnistamiskohtaa. HhaI-käsittely tuottaa fragmentin, jonka pituus on noin 470 nukleotidia, ja Haelll-käsittely tuottaa fragmentin, jonka 20 pituus on noin 550 nukleotidia. Käsittely molemmilla entsyymeillä tuottaa kolme fragmenttia, joiden pituudet ovat 90 nukleotidia (A), 460 nukleotidia (B) ja noin 10 nukleotidia (C). Pienen kokonsa vuoksi fragmentti C kulkeutuu pois geeliltä kuvan 1 olosuhteissa.From the result of lane A, it can be seen that the cDNA transcript of the full-time placental mRNA is heterodispersed. Treatment with HhaI, lane B, or Haell1, lane C, results in the accumulation of polynucleotides of a certain length. The emergence of such distinct lines proves that at least one sequence with two HhaI and HaeIII recognition sites is present in multiple copies in a heterogeneous population of cDNA transcripts. HhaI treatment yields a fragment of about 470 nucleotides in length, and HaellI treatment yields a fragment of about 550 nucleotides in length. Treatment with both enzymes yields three fragments of 90 nucleotides (A), 460 nucleotides (B), and about 10 nucleotides (C) in length. Due to its small size, fragment C migrates away from the gel under the conditions of Figure 1.

25 10-% ja 4,5-% geelin rajalla oleva viiva edustaa hete rogeenista materiaalia, joka on liian suurikokoista siirtyäkseen 10-prosenttiseen geeliin ja joka kerääntyy sen vuoksi rajalle. Kaistan D viivoista päätellen näyttäisivät fragmentit A ja B olevan lähtöisin samasta 30 cDNA-molekyylistä. Tämä johtopäätös varmistettiin eluoi-malla geelistä suurempi Haelll-fragmentti, joka liikkui kaistalla E näkyvällä tavalla, ja käsittelemällä se entsyymillä HhaI. Tämä käsittely tuotti kaksi fragmenttia, joiden liikkuvuus oli sama kuin niillä, jotka 35 saatiin käsiteltäessä joko cDNA samanaikaisesti Haelll:11a 31 68261 ja Hhal:llä, kuten voidaan havaita vertaamalla kaistoja D ja F. Koko cDNA:n hajoamistuotteessa, kaista D, autoradiografinen densiteetti, joka on viivan sisältämän kokonaisradioaktiivisuuden mitta, on suurempi 5 fragmentilla A kuin fragmentilla B, vaikka koon perusteella voitaisiin olettaa päinvastaista. Tämän havainnon perusteella voidaan arvioida, että fragmentti A on transkriboitu lähempänä mRNA:n 3’-päätä kuin fragmentti B.The line at the 10% and 4.5% gel boundaries represents a heterogeneous material that is too large to migrate to the 10% gel and therefore accumulates at the boundary. Judging from the lines in lane D, fragments A and B would appear to be from the same 30 cDNA molecules. This conclusion was confirmed by eluting a larger HaellI fragment from the gel, which moved in a visible manner in lane E, and treating it with the enzyme HhaI. This treatment yielded two fragments with the same mobility as those obtained by treating either the cDNA simultaneously with Haelll: 11a 31 68261 and Hhal, as can be seen by comparing lanes D and F. Total cDNA in the degradation product, lane D, autoradiographic density , which is a measure of the total radioactivity contained in the line, is larger for fragment A than for fragment B, although the size would suggest otherwise. Based on this observation, it can be estimated that fragment A is transcribed closer to the 3 'end of the mRNA than fragment B.

Kuva 2 on kaavioesitys cDNA-molekyylistä ja 10 Haelll- ja HhaI-i^estriktiokohdat näkyvät siinä suhteessa toisiinsa. Samasta cDNA-molekyylistä johdetut DNA-fragmentit A ja B luokiteltiin suhteellisen intensi-teettinsä mukaan, joka oli saatu kuvan 1 kaistan D autoradiogrammista. Fragmentin C olemassaolo pääteltiin 15 kuvan 1 kaistoissa B ja D olevan viivan erilaisesta elektroforeettisesta liikkuvuudesta. DNA-fragmentin A koko tunnetaan tarkoin nukleotidisekvenssimäärityksen perusteella, ks. Maxam, A. ja Gilbert, W. edellä. DNA-fragmentin B koko määritettiin vertaamalla kuvan 1 20 kaistan G M13-DNA-kokomerkkeihin.Figure 2 is a schematic representation of the cDNA molecule and the 10 HaellI and HhaI inhibition sites are shown in relation to each other. DNA fragments A and B derived from the same cDNA molecule were classified according to their relative intensities obtained from the autoradiogram of lane D in Figure 1. The existence of fragment C was inferred from the different electrophoretic mobility of the line in lanes B and D of Figure 1. The size of DNA fragment A is well known from nucleotide sequencing, cf. Maxam, A. and Gilbert, W. supra. The size of DNA fragment B was determined by comparison to the M13 DNA size markers of lane G in Figure 1.

Nukleotidisekvenssit DNA-fragmentille A ja osalle fragmentin B 5'-päätä määritettiin Maxamin ja Gilbertin menetelmällä, ks. edellä. Koska ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin aminohapposekvenssi 25 tunnetaan, voitiin näiden kahden fragmentin nukleoti-disekvenssejä verrata aminohapposekvenssiin tunnetun geneettisen koodin perusteella. Vertailun perusteella voitiin todeta, että sekvenssit todella koodasivat ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin osia 30 ja tämä vahvisti myös kuvassa 2 esitettyä fragmentti-järjestystä.Nucleotide sequences for DNA fragment A and a portion of the 5 'end of fragment B were determined by the method of Maxam and Gilbert, cf. above. Because the amino acid sequence of human fetal choroidal somatomammotropin is known, the nucleotide sequences of the two fragments could be compared to the amino acid sequence based on a known genetic code. By comparison, it was found that the sequences actually encoded portions of human fetal choroidal somatomammotropin 30 and this also confirmed the fragment sequence shown in Figure 2.

Esimerkki 2Example 2

Seuraavassa kuvatulla rekonstruointikokeella osoitetaan, kuinka tämän keksinnön mukaisella menetel-35 mällä voidaan puhdistaa haluttu nukleotidisekvenssi, 32 6 8 2 61 jota on alunperin vain pieni määrä koko nukleotidi-sekvenssipopulaatiossa. Koostumukseltaan tunnettuja RNA-seoksia, jotka sisältivät puhdistettua rotan glo-biinin RNA:ta ja ihmisen polyadenyloitua istukan RNA:ta, 5 käytettiin käänteistranskriptaasin templaatteina et P- 5 dCTP:n läsnäollessa (lopullinen ominaisaktiivisuus 10' laskinyksikköä/min/pmol. cDNA-tuotteet katkaistiin Haelll-endonukleaasi11a ja fragmentit erotettiin toisistaan polyakryyliamidiyhdistelmägeelilevyillä (4,5 % -10 10 %). cDNA-fragmentit visualisoitiin suorittamalla autoradiografia kuivatuille geeleille.The following reconstruction experiment demonstrates how the method of the present invention can purify a desired nucleotide sequence, 32 6 8 2 61 which is initially only a small amount in the entire nucleotide sequence population. Mixtures of RNAs of known composition containing purified rat globin RNA and human polyadenylated placental RNA were used as reverse transcriptase templates in the presence of et P-5 dCTP (final specific activity 10 'counter units / min / pmol. CDNA). the HaellI endonuclease 11a was digested and the fragments separated on polyacrylamide recombinant gel plates (4.5% -10 10%) The cDNA fragments were visualized by autoradiography on dried gels.

Koetulokset on esitetty kuvassa 3. Geelielektro-foreesi suoritettiin oleellisilta osiltaan esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Kaistoilla A ja H on ajettu 15 kokoa ilmaisevat merkit, jotka on valmistettu katkaisemalla fagin M13 DNA Haelll-endonukleaasilla ja merkit - 3 2 semällä näin saatujen fragmenttien 5'-päät eC -P:llä. Näiden DNA-fragmenttien nukleotidisekvenssien keskimääräiset pituudet on merkitty numeroilla vasemmalle puo-20 lelle. Kaistoilla B-G on elektroforeesikuviot, jotka on saatu käynnistämällä edellämainitut reaktiot seoksilla, jotka sisälsivät globiinin RNArta ja istukan RNA:ta seuraavassa taulukossa esitetyissä suhteissa.The experimental results are shown in Figure 3. Gel electrophoresis was performed essentially as described in Example 1. Lanes A and H are run with 15 size-indicating tags prepared by digestion of phage M13 DNA with HaellI endonuclease and tags-3 2 by digestion of the 5 'ends of the fragments thus obtained with eC-P. The average lengths of the nucleotide sequences of these DNA fragments are numbered to the left. Lanes B-G have electrophoretic patterns obtained by initiating the above reactions with mixtures containing globin RNA and placental RNA in the ratios shown in the following table.

Kaista Globiinin RNA Istukan RNALane Globin RNA Placental RNA

ng ng 25 B 300 0 C 60 240 D 30 270 E 15 2 35 F 7,5 292,5 30 G 0 300ng ng 25 B 300 0 C 60 240 D 30 270 E 15 2 35 F 7,5 292,5 30 G 0 300

Voidaan havaita, että 320 nukleotidia sisältävä Haelll-fragmentti on peräisin globiinin cDNA:sta. Globiinin cDNA-transkripti voidaan vielä havaita, vaikka globiinin RNA:ta on koko RNA:ssa läsnä vain 2-5 %. (Jos 35 eristetyssä RNA-seoksessa on haluttua RNA-laatua niin 33 68261 vähän, ettei tämä analyysimenetelmä sovi, voidaan suorittaa esipuhdistus jollakin tunnetulla RNA:n puhdistus-menetelmällä niin, että halutun RNA-laadun pitoisuudeksi tulee noin 2-5 %).It can be seen that the 320 nucleotide HaellI fragment is derived from globin cDNA. The cDNA transcript of the globin can still be detected, although only 2-5% of the globin RNA is present in the total RNA. (If the 35 RNA mixtures contain the desired RNA quality so little that this method of analysis is not suitable, pre-purification can be performed by any known RNA purification method to a concentration of about 2-5% of the desired RNA quality).

5 Esimerkki 3 Tämä esimerkki valaisee sellaisen nukleotidi-sekvenssifragmentin puhdistuksen, joka sisältää noin 550 emäsparia, ja joka koodaa osaa ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinista, ja menetelmän, jol-10 la voidaan määrittää eristetyn sekvenssin puhtaus. Puhdistetun fragmentin puhtausasteeksi saatiin yli 99 %.Example 3 This example illustrates the purification of a nucleotide sequence fragment containing about 550 base pairs encoding a portion of human fetal choroidal somatomammotropin and a method by which the purity of the isolated sequence can be determined. The purity of the purified fragment was over 99%.

Ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin komplementaarisen DNA:n puhdistus Esimerkissä 1 kuvatulla tavalla erotettu poly-15 adenyloitu istukan RNA rikastettiin ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin mRNA:n suhteen sentrifu-goimalla 4°C:ssa 16 tuntia 25 000 r/min Beckman Instruments-ultrasentrifugin SW 27-roottorissa sakka-roosigr’adientissa (5 % - 20 % paino/ti lav.) . Gradientin 20 llS-14S-alue otettiin talteen ja 100 ^ug tästä RNArsta käytettiin kaksisäikeisen cDNA:n syntetisointiin (ks.Purification of human fetal choroidal somatomammotropin complementary DNA The poly-15 adenylated placental RNA isolated as described in Example 1 was enriched for human fetal choroidal somatomammotropin mRNA by centrifugation at 4,000 C / min for 4 hours at 25,000 rpm Beckman Instruments rotor in a sediment-rose gradient (5% to 20% w / w lav.). The 20 μl-14S region of the gradient was recovered and 100 μg of this RNA was used to synthesize double-stranded cDNA (see

Ullrich, A., et ai., edellä). Toisen säikeen synteesi pysäytettiin uuttamalla reaktioseos tilavuudellaan etanolia -70°C:ssa. cDNA hajoitettiin 50 ^ulissa liuosta, 25 joka sisälsi 6 mmol/1 tris-HCl, (pH 7,5), 6 mmol/1 MgC^ ja 6 mmol/1 /»-merkaptoetanolia, 2 Haell-yksiköllä 37°C:ssa 2 tunnin aikana ja sen jälkeen lisättiin 0,1 yksikköä bakteeriperäistä emäsfosfataasia (BAPF-tyyppi, Worthington Biohemical Corp., Freehold, 30 N.J., yksikkö on tuottajan määrittelemä), jonka annet tiin vaikuttaa 10 minuuttia 60°C:ssa. Tämän jälkeen reaktioseos uutettiin yhdellä tilavuusosalla fenolin kyllästettyä kloroformiliuosta, DNA seostettiin kahdella tilavuudella etanolia -70°C:ssa ja liuotettiin 20 ^ul:aan 35 liuosta, joka sisälsi 10 mmol/1 tris-HCl (pH 8) ja 1 mmol/1 > 34 68261 EDTA, ja sen jälkeen suoritettiin elektroforeesi poly-akryyliamidigeelillä (6 % paino/tilav.). Kuvassa H (F) on edellä mainitun reaktioseoksen elektroforeesikuvio, jossa näkyy yksi viiva, joka vastaa noin 550 emäsparin 5 nukleotidisekvenssiä. Kun 550 parin fragmentti leikattiin irti geelistä ja eluoitiin elektroforeettisesti, saatiin kuvassa 4 (F) näkyvä tulos.Ullrich, A., et al., Supra). The synthesis of the second strand was stopped by extracting the reaction mixture with a volume of ethanol at -70 ° C. The cDNA was digested in 50 of a solution containing 6 mmol / l Tris-HCl (pH 7.5), 6 mmol / l MgCl 2 and 6 mmol / l / mercaptoethanol, with 2 Haell units at 37 ° C. During 2 hours and thereafter, 0.1 units of bacterial alkaline phosphatase (BAPF type, Worthington Biohemical Corp., Freehold, 30 NJ, unit as defined by the manufacturer) was added and allowed to act for 10 minutes at 60 ° C. The reaction mixture was then extracted with one volume of a saturated chloroform solution of phenol, the DNA was mixed with two volumes of ethanol at -70 ° C and dissolved in 20 μl of a solution containing 10 mmol / l Tris-HCl (pH 8) and 1 mmol / l> 34 68261 EDTA, followed by electrophoresis on a polyacrylamide gel (6% w / v). Figure H (F) is an electrophoretic pattern of the above reaction mixture showing a single line corresponding to a nucleotide sequence of about 550 base pairs. When a 550 pair fragment was excised from the gel and eluted electrophoretically, the result shown in Figure 4 (F) was obtained.

Kuvassa 4 (E) näkyvää 550 emäsparia vastaavaa materiaalia käsiteltiin 2 tuntia 37°C:ssa 4 yksiköllä 10 Hhal-endonukleaasia 50 ^ul:ssa samaa puskuria, jota käytettiin Haelll-endonukleaasikäsittelyssä. Sen jälkeen uutettiin etanoli-kloroformiseoksella, saostettiin etanolilla ja hajoamistuotteet erotettiin elektroforeettisesti polyakryyliamidigeelillä (6 % paino/tilav.). 15 Tulos nähdään kuvassa 4(D).The material corresponding to 550 base pairs shown in Figure 4 (E) was treated for 2 hours at 37 ° C with 4 units of 10 Hhal endonucleases in 50 of the same buffer used in the HaellI endonuclease treatment. It was then extracted with ethanol-chloroform, precipitated with ethanol and the decomposition products were separated electrophoretically on a polyacrylamide gel (6% w / v). 15 The result is shown in Figure 4 (D).

Molemmat fragmentit eluoitiin elektroforeettisesti ja liitettiin toisiinsa inkuboimalla 2 tuntia 15°C:ssa 20 ^ulissa seosta, joka sisälsi 66 mmol/1 tris-HCl, (pH 7,6), 6 mmol/1 MgCl2, 15 mmol/1 ditio-20 tritolia, 1 mmol/1 ATP ja 20 ^ug/ml T4 DNA-ligaasia.Both fragments were eluted electrophoretically and pooled by incubation for 2 hours at 15 ° C in 20 μl of a mixture containing 66 mmol / l Tris-HCl, (pH 7.6), 6 mmol / l MgCl 2, 15 mmol / l dithio-20 tritol, 1 mmol / l ATP and 20 μg / ml T4 DNA ligase.

Tämän jälkeen reaktioseos laimennettiin 200 ^uliksi 0,1-m natriumkloridiliuoksella, uutettiin yhdellä tilavuudellaan fenoli-kloroformiseosta ja DNA saostettiin 2 tilavuudella etanolia. Tuote suspendoitiin 20 ^ul: 25 aan liuosta, joka sisälsi 10 mmol/1 tris-HCl (pH 8), ja ImM EDTA,ja erotettiin elektroforeettisesti polyakryy-liamidigeelillä (6 % paino/tilav.). Tulos näkyy kuvassa 4(C). Kuvan 4(C) elektroforeesikuviosta voidaan havaita, että 550 nukleotidin fragmentti saatiin rekonstruoiduksi 30 ligaasikäsittelyllä. Emäs fosfataasiesikäsittelyllä varmistettiin se, että HhaI-fragmentit liittyivät toisiinsa oikein päin alkuperäiseksi 550 nukleotidin segmentiksi. Kuvassa 4(C) näkyvät lisäviivat johtuvat Hhal-fragmenttien välisestä dimeerimuodostuksesta, jota ei 35 68261 voida estää emäsfosfataasikäsittelyliä.The reaction mixture was then diluted to 200 with 0.1 M sodium chloride solution, extracted with one volume of phenol-chloroform, and the DNA was precipitated with 2 volumes of ethanol. The product was suspended in 20 μl of a solution containing 10 mmol / l Tris-HCl (pH 8) and ImM EDTA and separated by electrophoresis on a polyacrylamide gel (6% w / v). The result is shown in Figure 4 (C). It can be seen from the electrophoresis pattern of Figure 4 (C) that a 550 nucleotide fragment was reconstructed by 30 ligase treatments. Base phosphatase pretreatment confirmed that the HhaI fragments were correctly aligned to the original 550 nucleotide segment. The additional lines shown in Figure 4 (C) are due to dimer formation between Hhal fragments, which cannot be prevented by base phosphatase treatment.

Rekonstruoitu 550 nukleotidin fragmentti leikattiin irti geelistä ja eluoitiin elektroforeettisesti. Eluoidun materiaalin elektroforeesikuvio on kuvassa 4(B).The reconstructed 550 nucleotide fragment was excised from the gel and eluted electrophoretically. The electrophoretic pattern of the eluted material is shown in Figure 4 (B).

5 Kuvassa 4(A) on kokostandardin elektroforeesikuvio, . 3 2 joka saatiin ^ P:llä merkitystä kaksisäikeisen M13-DNA:n Haelll-hajoitustuotteesta. Elektroforeettiset analyysit suoritettiin polyakryyliamidigeelissä (6 % paino/tilav.) 2 tunnin aikana 100 V jännitteessä liuok-10 sessa, joka sisälsi 50 mmol/1 tris-boraattia (pH 8) ja 1 mmol/1 EDTA. Elektroforeesin jälkeen geeli kuivattiin ja autoradiogrammit valmistettiin kuvaamalla Kodak NS2T-röntgenfilmille.Figure 4 (A) shows the electrophoresis pattern of the full standard,. 3 2 obtained from the HaellI digestion product of double-stranded M13 DNA. Electrophoretic analyzes were performed on a polyacrylamide gel (6% w / v) for 2 hours at 100 V in a solution containing 50 mmol / l tris-borate (pH 8) and 1 mmol / l EDTA. After electrophoresis, the gel was dried and autoradiograms were prepared by imaging on Kodak NS2T X-ray film.

Ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin 15 cDNA:n rekonstruoidun 550 nukleotidia sisältävän fragmentin puhtaus.Purity of the reconstructed 550 nucleotide fragment of human fetal choroidal somatomammotropin 15 cDNA.

Eristetyt rekonstruoidut ihmisen sikiön suoni-kalvon somatomammotropiinin cDNA:n Haelll-fragmentit merkittiin 5’-päästään P:llä käyttäen apuna polynuk-20 leotidikinaasia, joka oli saatu bakteriofagi-T4:llä infektoidusta E. colista seuraavalla menetelmällä:The isolated reconstituted Haelll fragments of the human fetal vascular membrane somatomammotropin cDNA were labeled at the 5 'end with P using polynucleotide leotide kinase obtained from bacteriophage-T4-infected E. coli by the following method:

Panet, A. et. ai., Biochemistry 12, 5045 (1973). P-L Biochemical, Milwaukee, Wisconsin, toimittaa myös poly-nukleotidikinaasia. Sen jälkeen fragmenttia käsiteltiin 25 2 tuntia 37°C:ssa joko Hhal:llä tai Hpall:11a 50 ^ulissa liuosta, jossa oli 6 mmol/1 tris-HCl (pH 7,6), 6 mmol/1 MgC^ ja 6 mmol/1 y^-merkaptoetanolia. Sen jälkeen reak-tioseos uutettiin tilavuudellansa fenoli-kloroformi-seosta, DNA-saostettiin 2 tilavuudella etanolia -70°C:ssa, 30 suspendoitiin 20 ^ul:aan liuosta, jossa oli 10 mmol/1 tris-HCl (pH 8) ja 1 mM EDTA, suoritettiin elektroforeesi ja geeli kuvattiin röntgenfilmille edellä kuvatulla tavalla niin, että merkityt fragmentit saatiin visualisoiduiksi.Panet, A. et. ai., Biochemistry 12, 5045 (1973). P-L Biochemical, Milwaukee, Wisconsin, also supplies polynucleotide kinase. The fragment was then treated for 2 hours at 37 ° C with either Hhal or HpaI in 50 μl of a solution of 6 mmol / l Tris-HCl (pH 7.6), 6 mmol / l MgCl 2 and 6 mmol / 1 γ-mercaptoethanol. The reaction mixture was then extracted with a volume of phenol-chloroform, DNA was precipitated with 2 volumes of ethanol at -70 ° C, suspended in 20 μl of a solution of 10 mmol / l Tris-HCl (pH 8) and 1 μl of mM EDTA, electrophoresis was performed, and the gel was imaged on X-ray film as described above so that the labeled fragments were visualized.

35 Tulokset on esitetty kuvassa 5. Kuvat 5(B) ja 5(E) 36 68261 esittävät 550 nukleotidin fragmentille tehtyjä rinnakkaisajoja ennen restriktioentsyymikäsittelyä. Kuvan 5(0 kuvio esittää HhaI-katkaisua ja kuva 5(D) Hpall-kat-kaisua.35 The results are shown in Figure 5. Figures 5 (B) and 5 (E) 36 68261 show parallel runs performed on a 550 nucleotide fragment prior to restriction enzyme treatment. Figure 5 (0) shows the HhaI cleavage and Figure 5 (D) the HpaI cleavage.

5 550 nukleotidin fragmentin puhtaus mitattiin si ten, että restriktioentsyymin katkaisutuotteiden auto-radiogrammi skannattiin ja fragmenttiviivojen radioaktiivisuus j akau tuma tulkittiin kvantitatiivisesti. Mittaukset osoittavat, että ihmisen sikiön suonikalvon 10 samatomammotropiinin cDNA:n rekontruoidun Haelll-fragmentin puhdistuksessa saavutettiin yli 99 % puhtausaste.The purity of the 5,550 nucleotide fragment was measured by scanning the auto-radiogram of the restriction enzyme cleavage products and quantifying the radioactivity and accumulation of the fragment lines. The measurements show that the purification of the reconstituted HaellI fragment of the human fetal choroidal 10 samatomammotropin cDNA was more than 99% pure.

Esimerkki 4 Tässä esimerkissä syntetisoidaan plasmidi, joka sisältää 550 emäsparin nukleotidisekvenssin, joka koodaa 15 suurinta osaa ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotro-piinista.Example 4 In this example, a plasmid containing a 550 bp nucleotide sequence encoding most of the human fetal choroidal somatomammotropin is synthesized.

Ihmisen sikiön suonikalvon somatcmammotropiinin cDNA:n 550 nukleotidia sisältävä fragmentti, jonka puhtausaste oli yli 99 %, valmistettiin esimerkissä 3 ku-20 vatulla tavalla. 5'-päätefosfaattiryhmät liitettiin suorittamalla inkubointi 37°C:ssa 2 tunnin aikana reak-tioseoksessa, joka sisälsi 50 mmol/1 tris-HCl (pH 8,5), 10 mmol/1 MgC^, 0,1 mmol/1 spermidiiniä, 5 mmol/1 -merkaptoetanolia, 5 % (paino/tilav.) glyserolia, 333 25 pmol ATP ja 5 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia, ja jonka lopullinen tilavuus oli 40 ^ul. DNA erotettiin reaktioseoksesta uuttamalla ensin fenolilla ja saosta-malla sen jälkeen etanolilla. Synteettiset dekanukleo-tidit, jotka sisälsivät EcoRI:n restriktiokohdan, ja 30 joiden sekvenssi oli 5’-CCGAATTCGG-3', ja jotka oli valmistettu edellä mainitulla Scheller, et al:n menetelmällä, liitettiin ihmisen sikiön suonikalvon somato-mammotropiinin DNA:hän moolisuhteessa noin 50:1 50 ^ulissa liuosta, joka sisälsi 66 mmol/1 tris-HCl (pH 7,6) 9 mmoi/1 35 MgC^ , ja 15 mmol/1 ditiotreitolia, 1 mmol/1 ATP ja 20 37 6 8 2 61 yUg/ml T4-DNA-ligaasia. Restriktiokohtasekvenssejä toimittaa Collaborative Research, Waltham, Massachusetts. Reaktioseosta inkuboitiin 18 tuntia 4°C:ssa ja sen jälkeen reaktio pysäytettiin fenoli-kloroformiuutolla.A 550 nucleotide fragment of human fetal choroidal somatcmammotropin cDNA with a purity of greater than 99% was prepared as described in Example 3-20. The 5 'terminal phosphate groups were joined by incubation at 37 ° C for 2 hours in a reaction mixture containing 50 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM MgCl 2, 0.1 mM spermidine, 5 mmol / l mercaptoethanol, 5% (w / v) glycerol, 333 25 pmol ATP and 5 units of T4 polynucleotide kinase, with a final volume of 40. DNA was separated from the reaction mixture by first extraction with phenol and then precipitation with ethanol. Synthetic decanucleotides containing the EcoRI restriction site and having the sequence 5'-CCGAATTCGG-3 ', prepared by the above-mentioned method of Scheller, et al., Were ligated in human fetal choroidal somato-mammotropin DNA in molar ratio. about 50: 1 in 50 μl of a solution containing 66 mmol / l tris-HCl (pH 7.6) 9 mmol / l 35 MgCl 2, and 15 mmol / l dithiothreitol, 1 mmol / l ATP and 20 37 6 8 2 61 μg / ml T4 DNA ligase. Restriction site sequences are provided by Collaborative Research, Waltham, Massachusetts. The reaction mixture was incubated for 18 hours at 4 ° C, and then quenched with phenol-chloroform extraction.

5 Tuote saostettiin etanolilla, sakka liuotettiin 50 ^ul:aan liuosta, joka sisälsi 100 mmol/1 NaCl, 50 mmol/1 tris-HCl (pH 7,6), ja 7 mmol/1 MgCl2, ja käsiteltiin 2 tuntia 37°C:ssa 50 yksiköllä EcoRI-endonukleaasia. Endonukleaasikäsittelyssä dekameerien EcoRI-kohta kat-10 kesi, ja syntyi ihmisen sikiön suonikalvon somatomammot-ropiinin cDNA:ta, jossa oli EcoRI-kohesiiviset päät, sekä katkenneita reagoimattomia dekanukleotideja ja itseensä liittyneitä dekanukleotideja. Koska katkenneet dekameerit sisälsivät myös EcoRI-päät ja näin ollen 15 olisivat ihmisen sikiön suonikalvon somatomammctropii-nin cDNA:n kilpailijoita plasmidin kanssa tapahtuvassa rekombinoinnissa, ihmisen sikiön suonikalvon somatomam-motropiinin cDNA erotettiin geelielektroforeettisesti ennen siirtovektorin kanssa tapahtuvaa reaktiota. Edel-20 lä kuvatun dekanukleotidiliitännän käyttö on edullista siksi, että ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotro-piinin cDNA-fragmentti voidaan erottaa plasmidista uudelleen muodossa joka on identtinen alkuperäisen fragmentin kanssa.The product was precipitated with ethanol, the precipitate was dissolved in 50 μl of a solution containing 100 mmol / l NaCl, 50 mmol / l tris-HCl (pH 7.6), and 7 mmol / l MgCl 2, and treated for 2 hours at 37 ° C. in 50 units of EcoRI endonuclease. In endonuclease treatment, the EcoRI site of the decamers was disrupted, resulting in human fetal choroidal somatomammotropin cDNA with EcoRI-cohesive ends, as well as truncated unreacted decanucleotides and self-associated decanucleotides. Since the truncated decamers also contained EcoRI ends and thus were competitors of human fetal choroidal somatomammopropin cDNA for recombination with the plasmid, human fetal choroidal somatomam-motropin cDNA was separated by gel electrophoresis prior to gel electrophoresis. The use of the decanucleotide linkage described above is advantageous because the somatomammotropin cDNA fragment of the human fetal choroid can be re-separated from the plasmid in a form identical to the original fragment.

25 Siirtovektorina käytettiin bakteeriplasmidia 0 pMB-9, jonka molekyylikoko oli 3,5 x 10 , ja joka sisälsi yhden EcoRI-kohdan, ja joka oli valmistettu seuraa-valla menetelmällä: Rodriquez, R.L., Bolivar, F.,The transfer vector used was the bacterial plasmid 0 pMB-9 with a molecular size of 3.5 x 10 and containing one EcoRI site, prepared by the following method: Rodriquez, R.L., Bolivar, F.

Goodman, H.M., Boyer, H.W. ja Betlach, M., ICN-UCIA 30 Symposium On Molecular and Genetic Biology, D.P. Wierlich, W.J. Rutter ja C. F. Fox, (Academic press, New York, 1976) ss. 471-477. Plasmidia pMB-9 toimittaa Bethesda Research Labs, Rockville, Maryland. Jos E. coli-kanta on infektoitunut pMB-p:llä, sillä on vastus-35 tuskyky tetrasykliinin suhteen. DNA:n liittäminen 38 6 8 2 61 pMB-9:n EcoRI-kohtaan ei vaikuta tetrasykliinin vastustuskykyyn eikä mihinkään muuhunkaan plasmidin ominaisuuteen. Näin ollen ei rekombinoidun ja normaalin plasmidin fenotyypissä ole eroa. Tästä syystä EcoRI:llä kat-5 kaistu pMB-9 käsiteltiin ensin emäsfosfataasilla käyttämällä menetelmää, joka on tarkemmin kuvattu FI-patenttihakemuksessa n:o 781 675 ks. myös Ullrich, et ai., EcoRI:llä käsitellyistä päistä, ja näin plasmidi-DNA:n ligaatio itsensä kanssa estyy ja renkaanmuodostus ja 10 samalla transformaatio tapahtuu vain, jos 5'-fosfory- loidun pään sisältävää DNA-fragmenttia on mukana. Emäs-fosfataasikäsittely suoritettiin 30 minuutin aikana 65°C: ssa reaktioseoksessa, joka sisälsi 1,0 entsyymiyksikköä plasmidi-DNA-grammaa kohti 25 millimoolisessa tris-HCl-15 liuoksessa, pH 8, ja sen jälkeen fosfataasi poistettiin fenoliuutolla ja DNA saostettiin etanolilla. Ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin cDNA:n liittäminen edellä kuvatulla tavalla käsiteltyyn pMB-9:ään suoritettiin 50 ^ulissa reaktioseosta, joka sisälsi 60 20 mmol/1 tris-HCl (pH 8), 10 mmol/1 y^-merkaptoetanolia, 8 mmol/1 MgCl2, 10-50 ng puhdistettua ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin cDNA:ta ja noin 500 ng EcoRI:llä katkaistua 5'-defosforyloitua plasmidi-DNA:ta. Reaktiot aloitettiin lisäämällä TU-DNA-ligaasia 5 ^,ug/ml, 25 niiden annettiin jatkua 1 tunti 15°C:ssa ja sen jälkeen seokset laimennettiin 0,25 ml:ksi liuoksella, joka oli 120 millimolaarinen natriumkloridin suhteen ja 1 millimolaarinen EDTA:n suhteen. Laimennettu reaktio-seos käytettiin sellaisena E. coli X-1776:n transfor-30 mointiin.Goodman, H.M., Boyer, H.W. and Betlach, M., ICN-UCIA 30 Symposium On Molecular and Genetic Biology, D.P. Wierlich, W.J. Rutter and C. F. Fox, (Academic press, New York, 1976) p. 471-477. Plasmid pMB-9 is supplied by Bethesda Research Labs, Rockville, Maryland. If an E. coli strain is infected with pMB-β, it has resistance to tetracycline. Insertion of DNA into the EcoRI site of 38 6 8 2 61 pMB-9 does not affect tetracycline resistance or any other plasmid property. Thus, there is no difference in the phenotype of the recombinant and normal plasmid. Therefore, EcoRI-cleaved pMB-9 was first treated with base phosphatase using the method described in more detail in FI Patent Application No. 781,675, cf. also from Ullrich, et al., EcoRI-treated ends, and thus inhibition of plasmid DNA with itself is inhibited and ring formation and at the same time transformation occurs only in the presence of a DNA fragment containing a 5 'phosphorylated end. The base phosphatase treatment was performed for 30 minutes at 65 ° C in a reaction mixture containing 1.0 enzyme units per gram of plasmid DNA in 25 mM Tris-HCl-15 solution, pH 8, and then the phosphatase was removed by phenol extraction and the DNA was precipitated with ethanol. Coupling of human fetal choroidal somatomammotropin cDNA to pMB-9 treated as described above was performed in 50 of a reaction mixture containing 60 mmol / l tris-HCl (pH 8), 10 mmol / l γ-mercaptoethanol, 8 mmol / l 1 MgCl 2, 10-50 ng purified human fetal choroidal somatomammotropin cDNA and approximately 500 ng EcoRI-digested 5 'dephosphorylated plasmid DNA. Reactions were initiated by the addition of 5 μg / ml TU DNA ligase, allowed to proceed for 1 hour at 15 ° C, and then the mixtures were diluted to 0.25 ml with a solution of 120 mM sodium chloride and 1 mM EDTA. with respect to n. The diluted reaction mixture was used as such to transform E. coli X-1776.

E. coli X-1776 (ATCC 31 391) on erityisesti rekombinaatti-DNA-työskentelyyn kehitetty kanta (National Institutes of Health, EK-2-kanta). Kantaa toimittaa Roy Curtiss III, University of Alabama, Department 35 of Microbiology, Birmingham, Alabama. Bakteeria kasvatet- 39 6 8 2 61 tiin 150 ml:ssa ravintolientä, johon oli lisätty 100 yUg/ml diaminopimeliinihappoa (DAP) ja 40 ^ug/ml tymii-niä, solutiheyteen noin 2 x 10^ solua/ml. Solut sentri-fugoitiin talteen, pestiin 60 ml: 11a 10 mi Himo laari s-5 ta NaCl, sentrifugoitiin uudelleen ja suspendoitiin 60 ml:aan transformointipuskuria, joka sisälsi 10 mmol/1 tris-HCl (pH 8), 140 mmol/1 NaCl ja 75 mmol/1 CaCl^· Solususpensioita pidettiin 15 minuuttia jäässä, solut sentrifugoitiin talteen ja suspendoitiin 1,5 ml:aan salo maa transformointipuskuria. 0,5 ml solususpensiota lisättiin jäässä, sen jälkeen 4 minuuttia 25°C:ssa ja lopuksi 30 minuuttia jäässä. 0,2 ml solususpensiota laitettiin suoraan ravinneagarlevyille, joihin oli lisätty 100 yUg/ml DAP ja 40 ^ug/ml tymiiniä ja 20 ^ug/ml tetra-15 sykliiniä. Saatiin neljä transformaattia, jotka kaikki sisälsivät 550 emäsparin fragmentin, joka irtosi plas-midi-DNA:sta joko EcoRI- tai Haelll-käsittelyllä.E. coli X-1776 (ATCC 31 391) is a strain specifically developed for recombinant DNA work (National Institutes of Health, strain EK-2). Position provided by Roy Curtiss III, University of Alabama, Department 35 of Microbiology, Birmingham, Alabama. The bacterium was grown in 150 ml of nutrient broth supplemented with 100 μg / ml diaminopimelic acid (DAP) and 40 μg / ml thymine to a cell density of about 2 x 10 6 cells / ml. The cells were centrifuged, washed with 60 ml of 10 ml of lust s-5 NaCl, recentrifuged and resuspended in 60 ml of transformation buffer containing 10 mM Tris-HCl (pH 8), 140 mM NaCl. and 75 mmol / l CaCl 2 · The cell suspensions were kept on ice for 15 minutes, the cells were centrifuged and suspended in 1.5 ml of Salo earth transformation buffer. 0.5 ml of the cell suspension was added on ice, followed by 4 minutes at 25 ° C and finally 30 minutes on ice. 0.2 ml of the cell suspension was applied directly to nutrient agar plates supplemented with 100 μg / ml DAP and 40 μg / ml thymine and 20 μg / ml tetra-15 cyclin. Four transformants were obtained, all containing a 550 bp fragment that was cleaved from the plasmid DNA by either EcoRI or HaellI treatment.

Sekvenssianalyysiin valittiin transformaatti-klooni, jolle annettiin nimitys pHCS-1. E coli X-1776-20 pHCS-l-kantaa kasvatettiin sopivassa elatusaineessa, plasmidi-DNA eristettiin siitä ja katkaistiin EcoRI-endonukleaasilla. 550 emäsparin fragmentti erotettiin lineaarisesta pMB-9:stä (ATCC 40 002) suorittamalla elektroforeesi 6 % polyakryyliamidigeelissä ja sen jäl-25 keen DNA:n sekvenssi analysoitiin Maxam'in ja Gilbert'in menetelmällä, ks. edellä. Ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin alafragmentit. valmistettiin inku-boimalla Hpall-restriktioendonukleaasin kanssa ja 5'-päät merkittiin käyttämällä '/'^P-ATP:tä ja polynukleo-30 tidikinaasia. Ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin kloonatun DNA:n nukleotidisekvenssi määritettiin Maxam'in ja Gilbert1inmenetelmällä. Vertailemalla ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin tunnettuun aminohapposekvenssiin voitiin todeta, että 557-35 nukleotidin sekvenssi edusti aminohappojen 24-191 välis- 40 6 8 2 61 tä mRNA:n koodialuetta, ja lisäksi oli 3*-päässä 50 nukleotidin alue, jossa ei tapahtunut translaatiota, ks. Niall, H.D. Hogan, M.L., Sauer, R., Rosenblum, I.Y. ja Greenwood, F.C., Proc. Nat. Acad. Sei USA 68, 5 866 (1971). Taulukossa 3 on esitetty ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin mRNA:n primäärira-kenne kloonatun pHCS-l:n DNA-fragmentista määritettynä ja sen perusteella arvioitu aminohapporakenne, kun arvioinnissa käytetään hyväksi tunnettua geneettis-10 tä koodia. Nukleotidisekvenssin perusteella määritetty aminohapposekvenssi on identtinen aikaisemmin julkaistun kemiallisilla menetelmillä määritetyn aminohappo-sekvenssin kanssa. Tämä osoittaa, että alunperin eristetty ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropii-15 nin mRNA on toisiintunut hyvin tarkasti in vitro ja ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin kloonattu DNA-fragmentti on toisiintunut transformoiduissa bakteereissa hyvin tarkasti.A transformant clone designated pHCS-1 was selected for sequence analysis. E. coli X-1776-20 strain pHCS-1 was grown in an appropriate medium, plasmid DNA was isolated therefrom and digested with EcoRI endonuclease. The 550 bp fragment was separated from linear pMB-9 (ATCC 40,002) by electrophoresis on a 6% polyacrylamide gel and then the DNA sequence was analyzed by the method of Maxam and Gilbert, cf. above. Human fetal choroidal somatomammotropin subfragments. was prepared by incubation with HpaI restriction endonuclease and the 5 'ends were labeled using' / '^ P-ATP and polynucleo-thidine kinase. The nucleotide sequence of cloned human fetal choroidal somatomammotropin DNA was determined by the method of Maxam and Gilbert. Comparing the known amino acid sequence of human fetal choroidal somatomammotropin, it was found that the sequence of 557-35 nucleotides represented the coding region of mRNA between amino acids 24-191, and in addition there was a 50 nucleotide region at the 3 * end where no translation occurred. see. Niall, H.D. Hogan, M.L., Sauer, R., Rosenblum, I.Y. and Greenwood, F.C., Proc. Nat. Acad. Sci USA 68, 5,866 (1971). Table 3 shows the primary structure of human fetal choroidal somatomammotropin mRNA as determined from the DNA fragment of cloned pHCS-1 and the estimated amino acid structure based thereon using a well-known genetic code. The amino acid sequence determined from the nucleotide sequence is identical to the previously published chemically determined amino acid sequence. This indicates that the originally isolated human fetal choroidal somatomammotropin-15 mRNA was highly accurately reproduced in vitro and the cloned DNA fragment of human fetal choroidal somatomammotropin was very accurately reproduced in the transformed bacteria.

Taulukko 3 20 Kloonatusta pHCS-l:stä saadun ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin yhden DNA-säikeen nukleotidisekvenssi. Numerot tarkoittavat aminohappo-sekvenssiä aminopäästä lähtien. DNA-sekvenssi vastaa ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinin 25 mRNA-sekvenssiä siten, että mRNA:ssa T:n kohdalla on U. Kohtien 1-23 välinen aminohapposekvenssi on myös merkitty näkyviin.Table 3 Nucleotide sequence of a single strand of DNA from human fetal choroidal somatomammotropin obtained from cloned pHCS-1. Numbers refer to the amino acid sequence from the amino terminus. The DNA sequence corresponds to the mRNA sequence of human fetal choroidal somatomammotropin 25 such that the mRNA has a U at the T. The amino acid sequence between positions 1-23 is also marked.

41 6 8261 3 3 5, c £ μ 30 w t < •5 8 ^ U H H <0 5 2 5 8 υυ 3 2 2 8 ,3 5 3o too 5 8 ^ υ > υ o 2 5 2 5 8 ^ .3¾ S η 3¾ 3 δ SL ^ 3-¾ °° >3 ^ 52 58 £241 6 8261 3 3 5, c £ μ 30 wt <• 5 8 ^ UHH <0 5 2 5 8 υυ 3 2 2 8, 3 5 3o too 5 8 ^ υ> υ o 2 5 2 5 8 ^ .3¾ S η 3¾ 3 δ SL ^ 3-¾ °°> 3 ^ 52 58 £ 2

<υ 3 < ο c u too 0.0 (3 CT<υ 3 <ο c u too 0.0 (3 CT

3 μη 8 2 2 5 3 32 « < 5 8 0) ·Η< u < < <ο ο 6 7 Ä ° 5¾ 52 >> ο μη ομο c 30 3¾ 3 3 Öu “3 00«Η r-< <Ι»Η **<**· U U π- Ο »—*ί>0 2 ι-ΐυ u u coo u o en · ., ., I rt) f s _j »% »»f ^ U U U f**i •3 5 2 «38 ^ 5 5 5 5 * ^H £3 5 g 3 0 MO »u !3 μη 8 2 2 5 3 32 «<5 8 0) · Η <u <<<ο ο 6 7 Ä ° 5¾ 52 >> ο μη ομο c 30 3¾ 3 3 Öu“ 3 00 «Η r- <<Ι »Η ** <** · UU π- Ο» - * ί> 0 2 ι-ΐυ uu coo uo en ·.,., I rt) fs _j »%» »f ^ UUU f ** i • 3 5 2 «38 ^ 5 5 5 5 * ^ H £ 3 5 g 3 0 MO» u!

On) l·* O H 3 2 5 n £ C MOOn) l · * O H 3 2 5 n £ C MO

f MH 22 3 2 H O MO CO u M 5,2 °° MH 3 2 2 7 H H 2 3 3 g 2 3 3 0 au 2 5 wo ou wc Öu 5 3 £1-4 o rj >, c ^ o u < < pl. f-ι u I -1^ 32 MO 0)U WC WC uf MH 22 3 2 HO MO CO u M 5.2 °° MH 3 2 2 7 HH 2 3 3 g 2 3 3 0 au 2 5 wo ou wc Öu 5 3 £ 1-4 o rj>, c ^ ou < <pl. f-ι u I -1 ^ 32 MO 0) U WC WC u

3 CO HC CC £ £ £2 -3 0 H3 CO HC CC £ 2 £ 2 -3 0 H

Ή O H C ^ ^ HC H < u 3 Tj-oo 3 C 30 o >, O rs m in 2 2 5-¾ « 3 2 222 52 22 2 35 <0 2¾ 52 23 oh wtJ 2 3 £8 ° υ ^ h 2 o £2 > 2 2 7 · J ^ 32 f? g 22 * o «o 2 W oc “< Cu nn ^3 >>C o ω wo ^ u oo n C oc uΉ OHC ^ ^ HC H <u 3 Tj-oo 3 C 30 o>, O rs m in 2 2 5-¾ «3 2 222 52 22 2 35 <0 2¾ 52 23 oh wtJ 2 3 £ 8 ° υ ^ h 2 o £ 2> 2 2 7 · J ^ 32 f? g 22 * o «o 2 W oc“ <Cu nn ^ 3 >> C o ω wo ^ u oo n C oc u

1' ^ U 3 0 H U 3 C MU p. O H1 '^ U 3 0 H U 3 C MU P. O H

2 22 >0. " ö «< <2 2 3 M c M O O o' O, O w O ij n £ 2 £2 « hÖ 5 2 £2 5¾ 2 o. wo £ 8 22 ΙΊ 2¾ 2 25 .25 « 3 2 2 2 §5 1 2 ° ° 22 2-2 30 O MO M O 2 3 2 5 « H 2 52 2 2^5 5¾ g £ U U ^ H MO MU CO cu n J3 3 2 52 22 53 | g 22 22> 0. "ö« <<2 2 3 M c MOO o 'O, O w O ij n £ 2 £ 2 «hÖ 5 2 £ 2 5¾ 2 o. wo £ 8 22 ΙΊ 2¾ 2 25 .25« 3 2 2 2 § 5 1 2 ° ° 22 2-2 30 O MO MO 2 3 2 5 «H 2 52 2 2 ^ 5 5¾ g £ UU ^ H MO MU CO cu n J3 3 2 52 22 53 | g 2

U H ~ * u hJCJ CX, H OU H ~ * u hJCJ CX, H O

5 ^ H 5 2 22 tL2 « ^ «oo o n 3o w h 00 2" 2 [i H >> o c « rl C u HH MC OH h o OO 0.0 4)0 an _. ,, I MC >—t t-i ,„ ^ 3 0 M u ·~ι a) u5 ^ H 5 2 22 tL2 «^« oo is 3o wh 00 2 "2 [i H >> oc« rl C u HH MC OH ho OO 0.0 4) 0 an _. ,, I MC> —t ti, „ ^ 3 0 M u · ~ ι a) u

3 CO C o 2¾ 52 nn ,£ < O' .C H3 CO C o 2¾ 52 nn, £ <O '.C H

O H C ^ O OO H H n a. i-· 2 ου 5 2 32 s*g *8 3 μ m.O H C ^ O OO H H n a.i- · 2 ου 5 2 32 s * g * 8 3 μ m.

2 2 5,¾ MH 3Ö 52 2 8 5ö 2 8 1 I iö ^ ^ is as ie 2 k 5-¾ s-^ 5 2 5 8 2 8 5¾ £ 2 <CJ 58 5 8 H o «O O M o >.u H e «h H H 5 2 5 2 5 8 2>*< 2-8 7 M< 58 58 3 μ mu cu cu - -« 30 52 HC £ 8 3¾ ^ - ·. 5¾2 2 5, ¾ MH 3Ö 52 2 8 5ö 2 8 1 I iö ^ ^ is as ie 2 k 5-¾ s- ^ 5 2 5 8 2 8 5¾ £ 2 <CJ 58 5 8 H o «OOM o>. u H e «h HH 5 2 5 2 5 8 2> * <2-8 7 M <58 58 3 μ mu cu cu - -« 30 52 HC £ 8 3¾ ^ - ·. 5¾

rt'tr-iu ^ HC WC CC OOrt'tr-iu ^ HC WC CC OO

> ^ < ° 5 8 ff 8 Ä 8 SN U MO HO> ^ <° 5 8 ff 8 Ä 8 SN U MO HO

0 HC 58 52 28 ^3 } <0 OO >-2 < >0 1 10 HC 58 52 28 ^ 3} <0 OO> -2 <> 0 1 1

•-O• -O

Claims (2)

1. Menetelmä yhdistelmä-DNA-molekyylin valmistamiseksi, joka sisältää ihmisen sikiön suonikalvon somatomam-5 motropiinia koodaavan nukleotidisekvenssin, ja jota voidaan käyttää mikro-organismin transformoimiseen, jossa menetelmässä eristetään ihmisen istukkakudosta, eristetään pituuden ja sekvenssin suhteen heterogeenisten mRNA:ien populaatio mainitusta istukkakudoksesta, syntetisoidaan käänteis-10 transskriptaasin avulla cDNA:ien populaatio, joka on pituuden ja sekvenssin suhteen heterogeeninen, mainitusta mRNA:ista, puhdistetaan ihmisen sikiön suonikalvon somato-mammotropiinia koodaava cDNA, ja saatetaan puhdistettu cDNA reagoimaan DNA-siirtovektorin kanssa, jolloin mainittu 15 puhdistettu cDNA edustaa pienehköä osaa mainitusta cDNA:ien populaatiosta ja ainakin osalla mainituista cDNA:ista on vähintään kaksi restriktiokohtaa, tunnettu siitä, että ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaava cDNA puhdistetaan seuraavalla tavalla: 20 a) mainittua pituuden ja sekvenssin suhteen hetero geenista cDNA-populaatiota käsitellään spesifisesti mainituissa restriktiokohdissa mainituille restriktiokohdille spesifisellä restriktioendonukleaasilla, esimerkiksi inku-boimalla mainittua populaatiota Hae III-endonukleaasin läs-25 näollessa pH:ssa noin 7,5 ja noin 37°C lämpötilassa 1 - 2 tunnin ajan, jolloin saadaan cDNA-fragmentteja, b) kohdassa a) saadut cDNA-fragmentit fraktioidaan niiden pituuden mukaan esimerkiksi geelielektroforeesin avulla, jolloin saadaan pituudeltaan homogeenisia cDNA- 30 fragmentteja sisältäviä fraktioita, ja c) kohdassa b) saaduista cDNA-fragmenteista poistetaan 51-fosfaattipääteryhmät esimerkiksi inkuboimalla mainittuja fragmentteja alkalisella fosfataasilla pH:ssa noin 7,5 ja 60°C lämpötilassa noin 10 minuutin ajan, 35 d) katkaistaan kohdan c) mukaisesti käsitellyt cDNA-fragmentit spesifisesti sikiön suonikalvon somatomammo-tropiinin nukleotidisekvenssin sisällä olevassa restriktio- 43 68261 kohdassa restriktiokohdille spesifisen restriktioendonuk-leaasin avulla, joka ei ole sama kuin kohdassa a) käytetty, esimerkiksi inkuboimalla mainittuja fragmentteja Hha I:lla tai Hpa 11:11a pH:ssa noin 7,6 37°C lämpötilassa noin 2 tun-5 tia, jolloin saadaan mainittujen fragmenttien osafragmentte-ja, e) fraktioidaan saadut osafragmentit pituuden mukaan, esimerkiksi geelielektroforeesia käyttäen, f) otetaan ihmisen sikiön suonikalvon somatomammo- 10 tropiinia koodaavaa kahta DNA-osafragmenttia käsittävät fraktiot talteen, g) yhdistetään kohdan f) mukaiset osafragmentit entsymaattisesti toisiinsa kovalenttisidoksin DNA-ligaasin avulla, ÄTP:n läsnäollessa, esimerkiksi inkuboimalla pH:ssa 7,6 15 noin 15°C lämpötilassa noin 2 tunnin ajan, jolloin saadaan ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaavia cDNA-fragmenttej a, h) kohdan g) mukaisesti saadut cDNA-fragmentit fraktioidaan pituuden mukaan, esimerkiksi geelielektroforeesia 20 käyttäen, i) otetaan kohdan h) mukaisesti saatu ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaavan cDNArn fragmentteja sisältävä tuote talteen, jolloin mainitut fragmentit ovat jopa 99-%:isesti vapaita kontaminoivista cDNA-sekvensseistä, ja 25 j) liitetään saatu puhdistettu ihmisen sikiön suoni- kalvon somatomammotropiinin nukleotidisekvenssiä koodaava cDNA-fragmentti sinänsä tunnetulla tavalla siirtovektoriin, joka on bakteeriplasmidi, jolloin saadaan ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaavan nukleotidisekvenssin 30 sisältävä yhdistelmä-DNA-molekyyli. 682611. menetelmä yhdistelmä DNA molekyylin valmistamiseksi, joka sisältää ihmisen sikiön suonikalvon somatomam-5 motropiinia koodaavan nukleotidisekvenssin, yes iota voidaan käyttää micro-organismin transformoimiseen, jossa menetelmässä eristetään ihmisen istukkakudosta, eristetään pituuden yes sekvenssin suhteen heterogeenisten mRNA ien populaatio mainitusta istukkakudoksesta, syntheticis käänteis-10 transcriptasein avulla cDNA: one populatio, joka on pituuden ja sequensin suhteen heterogeneous, mainitusta mRNA: ista, puhdistetaan ihmisen sikiön suonikalvon somato-mammotropiinia koodaava cDNA, ja saatetaan puhd pienehköä osaa mainitusta cDNA: one populatiosta ja ainakin osalla mainituista cDNA: ista on vähintään kaksi restrictioniota, tunnettu siitä, etä ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaava cdtna a hetero gene cDNA populatiota käsitellään specifisesti mainituissa restrictioniohdissa mainituille restrictioniohdille specificl restrictionendonucleaasilla, esimerkiksi inku-boimalla mainittua populaatiota Hae III endonucleaasin read-25 cDNA-fragmentteja, b) kohdassa a) saadut cDNA-fragmentite fractioidane niiden pituuden mukaan esimerkiksi geelielectrophoreesin avulla, jolloin saadaan pituudeltaan homogeenisia cDNA- fragmentteja sisältäviä fractiota, ja c) kohdassa alkaline cell phosphatase acid pH: ssa noin 7.5 ja 60 ° C suitable mass noin 10 minutin ajan, 35 d) catkaistaan kohdan c) mukaisesti cheese cell surface cDNA fragmentite specification suonicone residue specification dirioendonuk-leaasin avulla, joka ei ole sama kuin kohdassa osafragmentte-yes, e) fraktioidaan saadut osafragmentit pituuden mukaan, esimerkiksi geelielektroforeesia käyttäen f) otetaan ihmisen sikiön suonikalvon somatomammo- 10 tropiinia koodaavaa kahta DNA osafragmenttia käsittävät fraktiot talteen g) yhdistetään kohdan f) mukaiset osafragmentit entsymaattisesti toisiinsa kovalenttisidoksin DNA ligaasin avulla , ETAs read-no-lesson, esimerkiksi incuboimalla pH: ssa 7.6 15 noin 15 ° C suitable mass noin 2 tunnels ajan, jolloin saadaan ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropiinia koodaavia cDNA fragment tej a, h) kohdan gut mukaisesti , esimerkiksi geelielelectrophoresia 20 käyttäen, i) otetaan kohdan h) mukaisesti saatu ihmisen sikiön suonikalvon somatomam motropiinia koodaavan cDNArn fragmentteja sisältävä tuote talteen, jolloin mainitut fragmentit ovat jopa 99 -%: isesti vapaita contaminoivista cDNA sequence seistä, ja 25) , jolloin saadaan ihmisen sikiön suonikalvon somatomammotropininia koodaavan nucleotide sequence sequence sisältävä yhdistelmä DNA moleculei. 68261 1. Förfarande för framställning av en rekombina-tions-DNA-molekyl, som innehäller för humant korionsomato-mammotropin kodande nukleotidsekvens, och som kan användas 5 för transformation av en mikroorganism, i vilket förfarande man isolerar human placentavävnad, fran nämnda placenta-vävnad isolerar en mRNA-population som är heterogen med avseende pä längd och sekvens, ur nämnda mRNA syntetiserar med hjälp av ett reverstransskriptas en cDNA-population, 10 som är heterogen med avseende pä längd och sekvens, renar det för humant korionsomatomammotropin kodande cDNA:et, och omsätter det renade cDNA:et med en DNA-överföringsvektor, varvid nämnda renade cDNA representerar en mindre del av nämnda cDNA-population och ätminstone en del av nämnda 15 cDNA har ätminstone tvä restriktionsställen, k ä n n e - t e c k n a t därav, att man isolerar och renar det nämnda för humant korionsomatomammotropin kodande cDNA pä föl-jande sätt: a) man behandlar nämnda cDNA-population, som är 20 heterogen med avseende pä längd och sekvens, specifikt pä nämnda restriktionsställen med en restriktionsendonuk-leas, som är specifik för nämnda restriktionsställen, t.ex. genom att inkubera nämnda population i närvaro av Hae III-endonukleas vid ett pH av ca 7,5 och en temperatur av 25 ca 37°C under 1-2 timmar, varvid erhälles cDNA-fragment, b) fraktionerar de i punkt a) erhällna cDNA-fragment efter deras längd t.ex. genom tillhjälp av gel-elektrofores, varvid erhälles fraktioner, vilka innehäller med avseende pä längd homogena cDNA-fragment, och 30 c) avlägsnar frän de i punkt b) erhällna cDNA- fragmenten 5'-fosfatändgrupperna, t.ex. genom inkubering av nämnda fragment med basiskt fosfatas vid ett pH av ca 7,5 och 60°C temperatur under ca 10 minuter, d) kapar de enligt punkt c) behandlade cDNA-35 fragmenten specifikt pä ett restriktionsställe inn&nför nukleotidsekvensen för humant korionsomatomammotropinA method of producing a recombination DNA molecule containing for human chorionic atomotropin coding nucleotide sequence and which can be used to transform a microorganism in which isolating human placental tissue from said placental tissue isolates an mRNA population heterogeneous in length and sequence, from said mRNA, synthesizing a cDNA population heterogeneous in length and sequence by a reverse transcriptase, purifying it for human cation atomomammotropin encoding the cDNA, and reacting the purified cDNA with a DNA transfer vector, wherein said purified cDNA represents a minor portion of said cDNA population and at least a portion of said cDNA has at least two restriction sites, characterized by isolating and purifying the cDNA coding for human chorion atom mammotropin as follows: a) treating said cDNA population which is heterogeneous with in length and sequence, specifically at said restriction sites with a restriction endonuclease specific for said restriction sites, e.g. by incubating said population in the presence of Hae III endonuclease at a pH of about 7.5 and a temperature of about 37 ° C for 1-2 hours to obtain cDNA fragments, b) fractionating the ones obtained in (a) cDNA fragments by their length e.g. by using gel electrophoresis to obtain fractions containing in length homogeneous cDNA fragments, and c) removing from the 5'-phosphate end groups cDNA fragments obtained in point b), e.g. by incubating said fragment with basic phosphatase at a pH of about 7.5 and 60 ° C temperature for about 10 minutes;