FI68078C - Foerfarande foer framstaellning av biologiskt aktiva mikroorganismmyceliepellets - Google Patents

Description

1 68078

Biologisesti aktiivisten mikro-organismimyseelipellettien valmistusmenetelmä

Keksinnön tausta 5 Keksinnön kohteena on kantajaytimen sisältävien, orgaanisten yhdisteiden biokatalyyttiseen konversioon käytettävien biologisesti aktiivisten mikro-organismi myseeli-pellettien valmistusmenetelmä.

Mikro-organismeja on jo kauan käytetty orgaanisten 10 yhdisteiden biokatalyyttisissä konversioreaktioissa. Esimerkkejä tällaisista konversioreaktioista ovat mm. yksinkertaisten sokereiden muuttaminen hyödyllisiksi tuotteiksi, kuten alkoholeiksi ja orgaanisiksi hapoiksi, entsyymien valmistus, antibioottisynteesi ja sokerien isomerointi. Eri 15 sokereiden konversioreaktioissa on tällöin käytetty osittain sieniä, mutta tämä käyttö on yleisesti rajoittunut ei-tuettuun vegetatiiviseen massaan. US-patenttijulkaisussa n:o 4 127 447 on kuvattu biokatalyyttinen reaktio, jossa käytetään kantaja-aineella täytettyä kolonnia ja jol-20 loin tarvittavat anaerobiset mikro-organismit on kiinnitetty kantaja-aineeseen. US-patenttijulkaisussa n:o 4 090 022 on kuvattu huokoisten selluloosahelmien käyttö, jolloin aktiivisia biologisia aineita (esim. entsyymejä) voidaan kiinnittää selluloosahelmiin kemiallisen sidok-25 sen avulla. Kussakin tapauksessa aktiivinen aine sidotaan kantajaan, jolloin kantajan valmistus on välttämätön, jotta haluttu aine voidaan siihen kiinnittää.

Sienimyseeleiden käyttö biokatalyyttisissä järjestelmissä on ollut rajoitettua, koska tällaisia massoja 30 on vaikea käsitellä. Vaikkakin kantajaan sidotut myseelit olisivat toivottavia, mitään tyydyttävää menetelmää ei ole kehitetty ennen esillä olevaa keksintöä, ja nykyisissä menetelmissä vaaditaan kantajan pinnan preparointi, jotta aktiivinen aine voitaisiin siihen kiinnittää. On 35 tunnettua, että eräät myseeleitä muodostavat sienet voivat muodostaa myseelipellettejä tavanomaisessa ravistus- 2 68078 viljelmässä. Vaikkakin tällainen pellettimuoto on toivottavampi kuin vapaasti kasvava vegetatiivinen massa, pelleteillä on eräitä haittoja. Esimerkiksi kolonnireaktoris-sa virtauksesta aiheutuvan paineen alaisena pelletti voi 5 painua kasaan aiheuttaen kolonnin tukkeutumisen. Lisäksi näiden pellettien käsittely ja regenerointi on hankalaa pellettien heikkojen fysikaalisten ominaisuuksien johdosta.

Sen jälkeen kun esillä oleva keksintö oli tehty, K. Gbewonyo ja D.I.C. Wang ovat esittäneet julkaisun mik-10 ro-organismimyseeleiden viljelystä pallon muotoisten pii-maahelmien pinnalla (abstrakti julkaisuista, jotka on esitetty 178:nnessa ACS-kokouksessa, Washington D.C., syyskuu 10-13, 1979 - American Chemical Society Division of Microbial and Biochemical Technology). Julkaisussa on ku-15 vattu Penicillium chrysogenum-kannan viljely huokoisten seliittipallojen pinnalla, jolloin hyyfit suuntautuivat ulospäin helmen pinnasta. Tällöin ei havaittu muodostuvan rakenteellisesti yhtenäistä pintakerrosta.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti on kehitetty 20 käyttökelpoisia pallon muotoisia myseelipellettejä, joilla on jäykkä ydinrakenne, jota ympäröi huokoinen verkkomainen mikro-organismimyseelejä sisältävä rakenteellisesti yhtenäinen kerros. Huokoinen verkkomainen kerros muodostaa täten rakenteellisesti yhtenäisen pallon muotoi-25 sen kotelon jäykän ytimen ympärille.

Yhteenveto keksinnöstä

Kun myseeleitä muodostavia mikro-organismeja, kuten sieniä, viljellään nestemäisessä väliaineessa, niiden my-seelit muodostavat löyhän puuvillamaisen massan. Tässä 30 yhteydessä myseeleitä muodostavilla mikro-organismeilla tarkoitetaan sellaisia eläviä mikro-organismeja, joiden vegetatiivinen osa muodostaa lankamaisia hyyfejä. Tällaisiin myseeleitä muodostaviin mikro-organismeihin kuuluu erilaisia sieniä (näihin kuuluu eräitä hiivoja), baktee-35 reja (esim. Actinomyces) ja leviä, kuten siniv.ihreät levät.

n 3 68078

Erikoisen tärkeitä ovat myseeleitä muodostavat sienet, erikoisesti Rhizopus- ja Mucor-suvut.

Eräät myseeleitä muodostavat sienet voivat muodostaa pellettejä viljeltäessä niitä pyöritysviljelylaittees-5 sa. Pellettien muodostuessa solutiheys kasvaa edistäen so-lumassan erottumista nestemäisistä tuotteista. Valitettavasti kaikki sienet eivät pysty muodostamaan tällaisia myseelipellettejä pyöritysviljelylaitteessa. On toivottavaa valmistaa myseelit pelletin muotoon käytettäessä nii-10 tä fermentointiprosessissa, erikoisesti jatkuvatoimisessa fermentointiprosessissa. Jatkuvatoimisessa fermentointiprosessissa virtausominaisuudet ja solutiheys määräävät fermentointiprosessin tehokkuuden. Tavanomaisissa pyöritysvil jelmissä valmistetut sienimyseelipelletit ovat löy-15 hiä ja hauraita kolonnireaktoriin pakattaessa. Ne rikkoutuvat helposti alhaisessa paineessa, joka voi muodostua reaktiosubstraatin virtauksesta.

Esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä mik-ro-organismimyseelipellettien valmistamiseksi kaikentyyp-20 pisistä myseeleitä muodostavista mikro-organismeista, erikoisesti sienistä, jolloin pelletin keskellä on jäykkä kantaja. Sellaiset sienet, jotka eivät pysty muodostamaan myseelipellette jä tavanomaisissa ravistusviljelmissä, voivat muodostaa myseelipellettejä esillä olevaa menetelmää 25 käytettäessä.

Näin valmistetut pelletit sisältävät jäykän kanta-jaytimen ja täten niillä on hyvät virtausominaisuudet jatkuvatoimisessa fermentointireaktorissa käytettäessä . Ravinteiden diffuusio tavanomaisten myseelipellettien sisään 30 ja solutuotteiden diffuusio niistä ulos on melko hidasta. Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut myseelipelletit, jotka sisältävät kantajan, kasvavat pyöreiksi pelleteiksi, joissa on huokoinen verkkomainen myseelikerros, jonka paksuus on yleensä noin 0,1-5 mm 35 (edullisesti 1-3 mm); tällöin verkkomainen kerros muodos- 4 68078 taa rakenteellisesti yhtenäisen, pallon muotoisen kotelon jäykän ytimen ympärille. Kantajaytimen ja myseelikerrok-sen välinen etäisyys on 0-1 cm (edullisesti noin 5 mm) riippuen alkuperäisestä itiöpitoisuudesta ja inkubointi-5 ajasta. Pelleteissä, joiden rakenne muodostuu tällaisista myseelikerroksista, ravinteet pystyvät helposti dif-fundoitumaan pellettien sisään ja solutuotteet pääsevät niistä helposti ulos.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistetuissa 10 myseelipelleteissä on ulompi myseelikerros, jolla on leik-kausvoimalle resistentti erittäin tekstiilikudosmainen rakenne. Tavanomaisilla menetelmillä valmistetuilla my-seelipelleteillä on löyhä myseelirakenne, joka voi rikkoutua jatkuvatoimisessa reaktorissa käytettävien suurien 15 virtausnopeuksien ansiosta. Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut myseelipelletit voidaan regeneroida suurenkin virtausnopeuden vaikuttaessa reaktorissa, koska "siemen-itiöt" yhä ovat jäljellä helmiytimessä.

Esillä olevan keksinnön mukaisella myseelipellet-20 tien valmistusmenetelmälle on tunnusomaista, että siihen kuuluu seuraavat vaiheet: (a) liuotetaan hydrolysoituva selluloosajohdannainen , joka on seiluloosa-asetaattia, selluloosatriasetaat-tia tai selluloosanitraattia, inerttiin orgaaniseen, ve- 25 teen sekoittuvaan liuottimeen, jolloin muodostuu liuos, jonka tiheys on suurempi kuin saostusliuoksen; (b) sekoitetaan myseeleitä muodostavan mikro-organismin itiöitä mainittuun liuokseen ja dispergoidaan muodostunut liuos pienten pisaroiden muodossa saostusliuok- 30 seen tai kylmään ilmaan, jolloin mainittu seiluloosajohdannainen saostuu yhtenäisen huokoisina helminä, jotka sisältävät mainittuja itiöitä: (c) saostusliuosta käytettäessä erotetaan saostuneet helmet siitä; 35 (d) inkuboidaan saostuneita huokoisia helmiä vesi pitoisessa viljelyvällaineessa sellainen aika, jossa muodostuu pyöreä pelletti, jolle on tunnusomaista jäykkä pal- 5 68078 lon muotoinen huokoinen helmiydin, jota ympäröi huokoinen yhtenäinen verkkomainen kerros, joka muodostaa rakenteellisesti yhtenäisen pallomaisen kuoren jäykän ytimen ympärille ja joka koostuu myseelejä muodostavan mikro-or-5 ganismin lankamaisista hyyteistä.

Menetelmä perustuu osittain US-patenttijulkaisussa 4 090 022 kuvattuun menetelmään.

Inertti orgaaninen veteen sekoittuva liuotin voi olla yksi ainoa neste tai eri nesteiden seos, kuten on kuvat-10 tu edellä mainitussa US-patenttijulkaisussa n:o 4 090 022 sekä sitä edeltävässä US-patenttijulkaisussa n:o 4 063 017.

Tässä yhteydessä termillä "saostusliuos" tarkoitetaan liuosta, johon selluloosajohdannainen ei liukene ja joka sekoittuu edellä mainittuun inerttiin orgaaniseen, ve-15 teen sekoittuvaan liuottimeen. Saostusliuos voi olla esimerkiksi vesi tai vesiliuos, Saostusliuos sekoittuu täten liuo-tinkomponentteihin. Täten liuotettaessa selluloosajohdannainen orgaaniseen liuottimeen ja sen jälkeen lisättäessä pisara muodostunutta liuosta saostusliuokseen, selluloosa-20 johdannainen koaguloituu ja saostuu liuoksesta selluloosa johdannaiselle tapahtuvan faasi-inversion johdosta täten muodostaen halutun huokoisen selluloosahelmen.

Käytettäessä vesipitoista saostusliuosta, liuotin-komponentiksi (a) voidaan edullisesti valita asetoni, form-25 amidi, asetonin ja metanolin seos, metyyliasetaatti, mety-leenikloridin ja metanolin seos, metyylietyyliketoni tai dimetyylisulfoksidi. Liuotinkomponentiksi (b) voidaan edullisesti valita dimetyylisulfoksidi, formamidi, metyyliasetaatti, sykloheksanoni, metyleenidikloridi, etyleenidiklo-30 ridi, metyleenidikloridin ja metanolin seos tai etyleeni-dikloridin ja metanolin seos.

Edullinen saostusliuos, johon selluloosajohdannaisen liuos dispergoidaan, on yleensä vesi, mutta se voi olla myös vesiliuos, joka sisältää sopivia määriä ei-ionisia tai io-35 nisiä pinta-aktiivisia yhdisteitä, joiden tarkoitus on vähentää saostusliuoksen pintajännitystä ja edistää huokoisten helmien muodostumista.

6 68078

Vaihtoehtoisesti kantajan sisältävät pelletit voidaan valmistaa seuraavien vaiheiden kautta: (a) valmistetaan huokoinen kantaja ytimeksi (esim. valmistetaan helmiä selluloosasta tai selluloosajohdannai- 5 sesta); (b) absorboidaan sieni-itiöitä näihin helmiin, ja (c) inkuboidaan helmiä sekoittaen (esim. pyöritys-viljelmäinkubaattorissa).

Myseelipellettien fysikaalisia ja mekaanisia ominai-10 suuksia voidaan parantaa silloittamalla myseelit tai impregnoimalla myseelipelletti selluloosalla tai selluloosajohdannaisilla tai muilla halvoilla polymeereillä. Sopivia käytettäviä silloitusaineita ovat mm. glutaraldehydi ja di-isosyanaatti.

15 Biologisesti aktiivisia myseelipellettejä voidaan valmistaa myös agariin erään toisen esillä olevan keksinnön suoritusmuodon mukaisesti. Agar on hiilihydraatti, ja sen liuos sulaa 90°C:ssa ja jähmettyy noin 45°C:ssa. Koska se on inertti useimmille mikro-organismeille, agaria käyte-20 tään nestemäisen viljelyväliaineen kiinteyttämiseen. Näitä agarin ominaisuuksia voidaan hyödyntää käyttämällä sitä ytimessä kantajamateriaalina, jolloin se sulkee sisäänsä my-seeleitä muodostavien mikro-organismien itiöitä ja muodostaa myseelipellettejä.

25 Yleisesti agaria voidaan käyttää kantajamateriaali na myseelipellettejä valmistettaessa seuraavasti: (a) liuotetaan agar kuumaan veteen agarliuoksen muodostamiseksi ; (b) jäähdytetään agarliuos lämpötilaan, joka on kor-30 keampi kuin 45°C, mutta alhaisempi kuin lämpötila, jossa vaiheessa (c) lisättävät itiöt tuhoutuisivat (jäähdytysläm-pötila on yleensä noin 45°:n ja 80°C:n välillä ja edullisesti noin 50°C); (c) sekoitetaan vaiheesta (b) saatu agarliuos my-35 seeleitä muodostavan mikro-organismin itiöihin ja disper- goidaan muodostunut seos pienten pisaroiden muodossa kylmään ilmaan tai vesipitoiseen saostuslluokseen alle 45°C:n il 7 68078 lämpötilassa, jolloin agar saostuu yhtenäisinä helminä, jotka sisältävät mainittuja itiöitä; (d) saostusliuosta käytettäessä erotetaan agarhel-met saostusliuoksesta tai vaihtoehtoisesti voidaan käyttää 5 samaa liuosta sekä saostukseen että inkubointiin; ja (e) inkuboidaan agarhelmiä sekoittaen (esim. pyöri-tysviljelyinkubaattorissa) sellainen aika, jossa muodostuu pyöreä pelletti, jolle on tunnusomaista jäykkä pyöreä agar-ydin, jota ympäröi huokoinen verkkomainen rakenteellisesti 10 yhtenäinen mikro-organismimyseelikerros.

Myseeleitä muodostavien sienien inkubointi suoritetaan esillä olevan keksinnön mukaisesti käyttäen sekoitusta ja sellaisia ravinteita sekä pH- ja lämpötilaparamet.ro ja, jotka ovat tavanomaisia käytetyille mikro-organismeille.

15 Yleensä ravinnevällaineena käytetään vesiliuosta,joka sisältää olennaisia alkuaineita (esim. hiiltä ja typpeä) mik-ro-organismihyyfien kasvun edistämiseksi. Yleensä ravinne-väliaineessa voidaan käyttää glukoosia ja ammoniakkia. Väliaineen pH voi vaihdella yleensä välillä 3-8, mutta edulli- 20 nen alue on 4,5-6,5. Inkubointilämpötila voi myös vaihdella laajalla alueella mikro-organismista riippuen (esim. välillä 0-70°C, edullisesti välillä noin 20-38°C).

Ytimiä muodostavaan väliaineeseen lisättävä itiömää-rä ei ole kriittinen, mutta sen pitäisi olla sellaisella 25 alueella, että riittää ainakin yksi itiö kutakin muodostunutta tai impregnoitua helmiydintä kohti. Yleensä pitoi-suus, joka on ainakin noin 10 itiötä 100 ml:aa kohti ytimiä muodostavaa väliainetta, riittää optimaalisen itämisen aikaansaamiseen.

30 Esillä olevan keksinnön mukaisille myseelipelleteil- le on lisäksi tunnusomaista, että niissä ytimen pinnan ja verkkomaisen myseelikerroksen välinen alue on käytännöllisesti katsoen ontto alkuperäisestä itiöpitoisuudesta ja in-kubointiajasta riippuen. Alueen paksuus voi olla jopa 1 cm 35 mitattuna ytimen pinnasta verkkomaiseen kerrokseen riippuen helmiytimessä olevien itiöiden määrästä ja inkubointiajasta-Viitattaessa käytännöllisesti katsoen onttoon tilaan, on ymmärrettävä, että jotkut sienien kasvaessa muodostuneista hyyteistä voivat jäädä kiinni ytimeen muodostaen tällöin s 68078 lankamaisten liitosten verkoston helmiytimen ja sitä ympäröivän verkkomaisen myseelikerroksen välille.

Seuraavia materiaaleja ja menetelmiä on käytetty esillä olevan keksinnön kokeellisessa osassa.

5 Mucor-sienilajin eristys ja yl 1 äpito

Useita kiinalaisia hiivavalmisteita saatiin eri puolilta Taiwanin saarta. Kuivan pyöreän kakun muodossa olevat kiinalaiset hiivaviljelmät murskattiin ensin ja sen jälkeen hienonnettiin hienoksi jauheeksi. Tämä jauhe suspen-10 doitiin steriiliin veteen ja levitettiin kerrokseksi peruna-tärkkelysagarlevyjen (PDA) päälle, jotka sisälsivät 0,02 % ruusubengaalia (Sigma). Ruusubengaali estää hiivojen ja bakteerien kasvun, mutta nopeasti kasvavien homeiden kasvua se estää vähäisemmässä määrin. PDA:ta ja ruusubengaalia si-15 sältäviä levyjä inkuboitiin 30°C:ssa 48 tuntia, ja sen jälkeen sienipesäkkeen myseeleitä sisältävä osa erotettiin.

Sitten eristettiin yksittäisiä itiöitä itiöpesäkkeistä.

Useat eristetyistä itiöistä identifioitiin kuuluviksi Rhisopus-lajeihin ja loput Mucor-lajeihin.

20 Viljelmiä ylläpidettiin 4°C:ssa PDA-vinopinnoilla, ja ne siirrostettiin kuukausittain.

Ymppäys- ja vi1jelyolosuhteet

Sekä kasvavia että ei-kasvavia myseelijärjestelmiä käytettiin. Kasvava myseelijärjestelmä oli seuraavanlainen: 25 Pieniä määriä itiöpesäkkeiden itiösuspensiota lisät tiin ympiksi 250 ml:n Erlenmeyer-pulloihin, jotka sisälsivät 100 ml perussuoloja sisältävää väliainetta (BSM), jossa oli 2,0 g KI^PC^, 1,4 g (NH4)2SO^, 0,3 ureaa, 0,3 g

CaCl», 0,3 g MgSO.*7H90, 1,0 g peptonia (Difco), 10,0 g ^ 4 1 2+2+ 30 joko glukoosia tai ksyloosia, 1,0 mg Fe , 0,5 mg Mn , 2+ 2+ 0,8 mg Zn ja 0,5 mg Co yhtä litraa kohti viljelyväli-ainetta sekä 0,011 moolia/litra natriumsitraattipuskuria (pH 5,8). Näitä viljelmiä inkuboitiin 30°C:ssa yön yli käyttäen edestakaista sekoitusta ja tuote otettiin talteen 35 suodattamalla.

Ei-kasvava myseelijärjestelmä oli seuraavanlainen: 9 68078

Tuoreet myseelit, jotka oli otettu talteen kasvavasta myseelijärjestelmästä, siirrettiin 250 ml:n erlen-meyerpulloon, joka sisälsi 100 ml BSM-viljelyvällainetta, jossa oli joko 20,0 glukoosia tai 10 g ksyloosia 100 ml:aa 5 kohti, ja myseeleitä inkuboitiin 30°C:ssa New Brunswickin psykrotermi-inkubaattoriravistimessa. Näitä viljelmiä pidettiin typpiatmosfäärissä sopivan pituinen aika. Jollei toisin ole mainittu, sokerit ja BSM-väliaine autoklavoitiin erikseen ja yhdistettiin ennen ymppäystä.

10 Myseeleiden kuivapainon määritys

Viljelmät suodatettiin nukattomien Miracloth-suodat-timien (Chicopee Mills, Inc.) läpi, suodattimille jääneet myseelit pestiin tislatulla vedellä, puristettiin kuiviksi, ja niiden annettiin lopullisesti kuivua 80°C:isessa uunissa 15 yön yli.

Seuraavat esimerkit kuvaavat täydellisemmin keksintöä .

Esimerkki 1 5 g selluloosa-asetaattia liuotettiin 40 ml:aan liuo-20 tinta (6 osaa asetonia ja 4 osaa dimetyylisulfoksidia), jolloin muodostui 10 %:inen (paino/tilavuus) liuos. Rhizopus-suvun itiöitä (0,1 g) sekoitettiin selluloosa-asetaattiin tasaisesti. Omatekoisella suihkutuslaitteella selluloosa-liuos suihkutettiin sen jälkeen vesiastiaan. Selluloosa-25 asetaattihelmet koaguloituivat vesiastiassa ja saostuivat astian pohjalle. Helmet otettiin talteen ja pestiin vesijohtovedellä ja sen jälkeen perusteellisesti steriloidulla vedellä. Pestyjä helmiä inkuboitiin sitten selektiivisessä nestemäisessä väliaineessa pyöritysinkubaattorissa. Kolmen 30 vuorokauden kuluttua myseelipelletit olivat muodostuneet.

Esimerkki 2

Selluloosahelmet valmistettiin ja otettiin talteen esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, minkä jälkeen itiöitä sisältävät selluloosa-asetaattihelmet regeneroitiin selluloo-35 sahelmiksi NaOH-liuoksessa (1-n) yhden tunnin ajan ja pestiin sen jälkeen perusteellisesti steriloidulla vedellä.

1! ίο 6B078

Niitä inkuboitiin kolme vuorokautta pyöritysinkubaattorissa, jolloin myseelipelletit olivat muodostuneet.

Esimerkki 3

Esimerkkien 1 ja 2 mukaiset menetelmät toistettiin, 5 paitsi että sieni-itiöt olivat peräisin Aspergillus niger -lajista. Kuten edellisessä esimerkissä, tällöin muodostui myseelipellettejä, joilla oli jäykkä ydin, jota ympäröi rakenteellisesti yhtenäinen A. nigeriä sisältävä huokoinen kerros.

10 Esimerkki 4

Valmistettiin selluloosa-asetaatti- ja selluloosa-helmiä, ja sen jälkeen sieni-itiöt lisättiin helmiin. Sekoituksen ja pesun jälkeen osa itiöistä oli absorboitunut helmiin. Kumpaakin helmilaatua inkuboitaessa muodostui my- 15 seelipellettejä, joilla oli esillä olevassa keksinnössä esitetty rakenne, vaikkakin huokoinen verkkomainen myseeli-kerros oli löyhempi kuin esimerkeissä 1-3 muodostunut mysee-likerros.

Esimerkki 5 20 1 g agaria liuotettiin 50 ml:aan vettä kiehuvassa vesihauteessa. Agarliuos jäähdytettiin 50°C:seen. 50 mg Mucor-suvun itiöitä lisättiin liuokseen ja sekoitettiin. Liuos suihkutettiin kylmään vesiastiaan (15°C). Kohdatessaan veden pinnan agar jähmettyi pieninä pisaroina ja pisa- 25 rat vajosivat astian pohjalle. Itiöitä sisältävät agarhel-met otettiin talteen ja pestiin perusteellisesti steriloidulla vedellä, minkä jälkeen helmiä inkuboitiin nestemäisessä väliaineessa pyöritysinkubaattorissa kolmen vuorokauden ajan, jolloin myseelipelletit muodostuivat.

30 Esimerkki 6

Rhizopus-suvun itiöitä sisältäviä helmiä valmistettiin esimerkissä 5 kuvatulla tavalla. Myseelipellet tejä muodostui .

Esimerkki 7 35 Rhizopus-suvun itiöitä sekoitettiin agarhelmiin, jotka oli valmistettu esimerkissä 5 kuvatulla tavalla, paitsi että itiöitä ei lisätty agarliuokseen. Pesun jälkeen 11 68078 pieni määrä itiöitä absorboitui agarhelmien pinnalle. Helmiä inkuboitiin nestemäisessä väliaineessa pyöritysinku-baattorissa, ja myseelipelletit muodostuivat kolmen vuorokauden kuluessa. Pellettien myseelikerroksen rakenne oli 5 kuitenkin löyhempi kuin esimerkeissä 5 ja 6.

Esillä olevan keksinnön mukaisia myseelipellettejä voidaan soveltaa hyvin monilla eri tavoilla orgaanisten yhdisteiden biokatalyyttisiin konversioreaktioihin. Halutusta konversioreaktiosta ja myseeleitä muodostavan mikro-10 organismin valinnasta riippuen voidaan suorittaa seuraavia reaktioita: (a) alkoholien ja/tai orgaanisten happojen valmistus sokereista; (b) spesifisten entsyymien valmistus; 15 (c) antibioottisynteesi (esim. penisi1 liinisynteesi) ; ja (d) orgaanisten yhdisteiden (esim. sokerien) isome- rointi.

Esillä olevan keksinnön mukaiset myseelipelletit 20 soveltuvat erikoisen hyvin kolonnireaktoreissa käytettäväksi, koska niiden avulla on mahdollista parantaa virtaus- ja massansiirto-ominaisuuksia kolonneissa, jotka on varustettu myseelipelleteillä tai ei-tuetuilla myseelipelleteillä. My-seelipellettejä voitaisiin myös käyttää pellettejä sisältä-25 van kotifermentointioperaatioihin soveltuvan kolonnireak-torin valmistukseen.

Tällaista kolonnia, joka sisältää myseeleitä, jotka pystyvät fermentoimaan sokeriliuoksia alkoholiksi, voidaan säilyttää alhaisessa lämpötilassa (tai vaihtoehtoises-30 ti myseelipelletit voidaan kylmäkuivata), ja kolonnia käytettäessä siihen yksinkertaisesti johdetaan sokeriliuosta (esim. greippimehua tai siideriä) alkoholijuoman valmistamiseksi.

Claims (19)

1. Kantajaytimen sisältävien, orgaanisten yhdisteiden biokatalyyttiseen konversioon käytettävien biologisesti 5 aktiivisten mikro-organismi myseelipellettien valmistusmenetelmä, tunnettu siitä, että siihen kuuluu seuraavat vaiheet: (a) liuotetaan hydrolysoituva selluloosajohdannainen, joka on selluloosa-asetaattia, selluloosatriasetaattia tai selluloosanitraattia, inerttiin orgaaniseen, veteen se- 10 koittuvaan liuottimeen, jolloin muodostuu liuos, jonka tiheys on suurempi kuin saostusliuoksen; (b) sekoitetaan myseeleitä muodostavan mikro-organismin itiöitä mainittuun liuokseen ja dispergoidaan muodostunut liuos pienten pisaroiden muodossa saostusliuokseen tai 15 kylmään ilmaan, jolloin mainittu selluloosajohdannainen saostuu yhtenäisen huokoisina helminä, jotka sisältävät mainittuja itiöitä; (c) saostusliuosta käytettäessä erotetaan saostuneet helmet siitä; 20 (d) inkuboidaan saostuneita huokoisia helmiä vesi pitoisessa viljelyväliaineessa sellainen aika, jossa muodostuu pyöreä pelletti, jolle on tunnusomaista jäykkä pallon muotoinen huokoinen helmiydin, jota ympäröi huokoinen yhtenäinen verkkomainen kerros, joka muodostaa rakenteellisesti 25 yhtenäisen pallomaisen kuoren jäykän ytimen ympärille ja joka koostuu myseelejä muodostavan mikro-organismin lankamai-sista hyyteistä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu mikro-organismi on sieni, 30 joka kuuluu Rhizopus- tai Mucor-sukuun.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheesta (c) saatu, huokoisten helmien muodossa oleva selluloosajohdannainen hydrolysoidaan selluloosaksi ja sen jälkeen pestään steriilillä vedellä ennen inkubointia.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että saostetut huokoiset helmet pestään steriilillä vedellä ennen inkubointia. n i3 68078

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että inkubointi suoritetaan sekoittaen.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että dispergointi suoritetaan suihkuttaen.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että saostusliuos on vesi, heksaani, syk-loheksaani, oktaani, bentseeni tai veden ja etanolin tai veden ja metanolin seos.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, t u n-10 n e t t u siitä, että mainittu saostusliuos on vesi.

9. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu selluloosajohdannainen on selluloosa-asetaatti ja hydrolyysi suoritetaan emäksisessä liuoksessa.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että mainittu liuotin on seuraavien aineosien seos: (a) asetoni, asetonin ja metanolin seos, asetonin ja etanolin seos, metyyliasetaatti, metyleenidikloridin ja 20 metanolin seos, metyylietyyliketoni, formamidi tai dimetyy-lisulfoksidi; (b) dimetyylisulfoksidi, formamidi, metyyliasetaatti, sykloheksanoni, metyleenidikloridi, etyleenidikloridi, metyleenidikloridin ja metanolin seos tai etyleenidiklori- 25 din ja metanolin seos.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu liuotin on dimetyylisulfoksidi, formamidi tai metyyliasetaatti.

12. Biologisesti aktiivisten mikro-organismimysee-30 lipellettien valmistusmenetelmä, tunnettu siitä, että siihen kuuluu seuraavat vaiheet: (a) liuotetaan agaria kuumaan veteen agarliuoksen muodostamiseksi; (b) jäähdytetään agarliuos lämpötilaan, joka on kor-35 keampi kuin 45°C, mutta alhaisempi kuin lämpötila, jossa vaiheessa (c) lisättävät itiöt tuhoutuisivat; 14 68078 (c) sekoitetaan vaiheessa (b) saatu agarliuos mysee-leitä muodostavan mikro-organismin itiöihin, jotka ovat Rhi-zopus- tai Mucor-sukuun kuuluvia sieniä, ja dispergoidaan muodostunut seos pienten pisaroiden muodossa kylmään ilmaan 5 tai vesipitoiseen saostusliuokseen alle 45°C:n lämpötilassa, jolloin agar saostuu yhtenäisinä helminä, jotka sisältävät mainittuja itiöitä; (d) inkuboidaan agarhelmiä vesipitoisessa viljely-väliaineessa sellainen aika, jossa muodostuu pyöreä pellet- 10 ti, jolle on tunnusomaista jäykkä pyöreä agarydin, jota ympäröi rakenteellisesti yhtenäinen myseeleitä muodostavaa mikro-organismia sisältävä huokoinen verkkomainen kerros.

12 68078

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että agarhelmet pestään steriilillä 15 vedellä ennen inkubointia.

14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun seoksen dispergointi suoritetaan suihkuttamalla.

15. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että jäähdytys vaiheessa (b) suoritetaan lämpötilassa, joka on noin 45°C:n ja 80°C:n välillä.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että väliaineliuos jäähdytetään noin 50°C;seen.

17. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesipitoinen saostusliuos toimii vesipitoisena viljelyliuoksena.

18. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että dispergointi pieniksi pisaroik- 30 si suoritetaan suihkuttamalla kylmään ilmaan.

19. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että dispergointi pieniksi pisaroiksi suoritetaan suihkuttamalla kylmään veteen. Il is 68078