FI66022C

FI66022C - Foerfarande foer framstaellning av ett nytt antibiotikum a/16686 faktor a2 samt som parallell-produkter erhaollna nya antibiotika a/16686 faktor a1 och faktor a3

Info

Publication number: FI66022C
Application number: FI812496A
Authority: FI
Inventors: Bruno Cavalleri; Enrico Selva
Original assignee: Lepetit Spa
Priority date: 1980-08-16
Filing date: 1981-08-13
Publication date: 1984-08-10
Also published as: JPH0225919B2; NO812732L; FI812496L; PT73526A; MY8700106A; DK149337B; ES504749A0; GR74561B; JPS6254432B2; IL63478A; IE811869L; AU7355381A; HK97986A; DK149337C; MX6964E; PH17270A; AR225540A1; PT73526B; FI66022B; EP0046201A3

Description

! 6-:.022 MENETELMÄ VALMISTAA UUTTA ANTIBIOOTTIA A/16686 TEKIJÄ A? JA RINNAKKAISTUOTTEENA SAATAVIA ANTIBIOOTTEJA A/16586 TEKIJÄ Αλ JA A3 Tämä keksintö koskee menetelmää valmistaa uutta anti-5 bioottista ainetta, jota mielivaltaisesti kutsutaan antibiootti A/16686 tekijä A^rksi, ja rinnakkaistuotteena valmistettavia antibiootteja A/16686 tekijä A^ ja Tätä antibioottista ainetta tuotetaan viljelemällä kantaa, joka on tunnistettu taksonomisesti uudeksi Actino-10 planes-suvun lajiksi. Kanta on kuvattu FI-hakemuksessa No 80 0881.

Tämän kannan viljelmä, joka eristettiin Vagnalbod' issa (Intia) kerätystä maanäytteestä, on tallennettu tammikuun 30. päivänä 1979 ATCC:n pysyvään viljelmäkokoel-15 maan (American Type Culture Collection -12301, Parklawn Drive, Rockville - Maryland 20852 - USA), jossa sille on annettu liittymisnumero ATCC 33076.

Antibiootin A/16686 tekijä A^« joka on tämän viljel-män tuottaman antibiootti A/16686-kompleksin (FI-hakemus 20 80 0 881) päätekijä, lisäksi on eristetty ja erotettu uu- den Actinoplanes-viljelmän tuottamasta käynisliemestä kajc^ si muuta pienempää, yksittäistä antibioottista tekijää. Näitä yksittäisiä antibiootteja merkitään mielivaltaisesti antibiootit A/16686 tekijä A^ ja A^, 25 Antibioottia A/16686 tekijä A^ tuotetaan viljelemällä kantaa Actinoplanes sp. ATCC 33076 submersisissa aerobisissa käymisolosuhteissa kunnes on tuotettu huomattava määrä antibioottista aktiviteettia. Antibiootti A/16686 tekijä A^ otetaan talteen antibioottisena kompleksina yhdessä te-30 kijöiden A^ ja A3 kanssa uuttamalla sekä liemi että mysee-li polaarisilla, orgaanisilla liuottimilla ja sen jälkeen se erotetaan A/16686 kompleksista ja eristetään pääasiassa puhtaana, yksittäisenä antibioottisena yhdisteenä käyttäen 66022 kromatografisia menetelmiä, kuten korkeapainenestekromato-grafiaa (HPLC), pylväskromatografiaa ja preparatiivista ohut-kerroskromatografiaa. Samat menetelmät ovat hyödyllisiä myös erotettaessa rinnakkaistuotteina saatavia tekijöitä A^ ja A^.

5 Antibiootti A/16686 tekijä A^ , kuten myös rinnakkais tuotteet tekijä A^ ja A^ ovat luonteeltaan emäksisiä ja pystyvät täten muodostamaan happoadditiosuoloja. Tämän keksinnön piiriin kuuluvat myös fysiologisesti hyväksyttävät, antibiootin A/16686 tekijä A^ happoadditiosuolat sekä anti-10 bioottien A/16686 tekijät A^ ja A3 happoadditiosuolat.

"Fysiologisesti hyväksyttävät" happoadditiosuolat ovat suoloja, jotka ovat myös farmaseuttisesti hyväksyttäviä, t.s. suoloja, joissa yhdisteen myrkyllisyys kokonaisuutena ottaen ei ole lisääntynyt verrattuna ei-suolamuotoon. Edullisia ja 15 sopivia happoadditiosuoloja ovat additiosuolat orgaanisten tai epäorgaanisten happojen kanssa, kuten kloorivety-, bromi-vety-, rikki-, fosfori-, typpi-, viini-, etikka-, meripihka-, maito-, glutamiini-, metaanisulfonihapon ja muiden vastaavien happojen kanssa.

20 Antibiootit A/16686 tekijä A^, A^ ja A^ vapaina emäksi nä voidaan valmistaa vastaavista happoadditiosuoloista tai päinvastoin antibiootit A/16686 tekijä A^, A^ ja A^ happoad-ditiosuoloina voidaan valmistaa vastaavista vapaista emäksistä, käyttäen tavallisia menetelmiä. Antibioottien A/16686 te-25 kijä A^,A2 ja A3 vapaat emäkset saadaa vastaavista happoadditiosuoloista esimerkiksi käsittelemällä happoadditiosuolaliu-osta bariumhydroksidillä, kun taas saattamalla vapaat emäkset reagoimaan valitun orgaanisen tai epäorgaanisen hapon kanssa inertissä liuottimissa saadaan vastaavat happoadditiosuolat. 30 Jotta selitys olisi yksinkertaisempi, termiä "yh diste A/16686" on tässä käytetty tarkoittamaan yhdistettä, joka on antibiootti A/16686 tekijä A^, A^ tai A3 tai vastaava myrkytön, fysiologisesti hyväksyttävä happoadditio-suola.

35 Yhdisteet A/16686 estävät in vitro tiettyjen pato geenisten bakteereiden, erityisesti gram-positiivisten bakteerien kasvun-, lisäksi annostettaessa parenteraali- λ 6 :3 O 2 2 sesti A/l6686-yhdisteet antavat korkea-asteisen suojan kokeellisesti aikaansaatuja tulehduksia vastaan hiirissä. Lisäksi yhdisteet A/16686 ovat hyödyllisiä ehkäistäessä ja hoidettaessa hammasmätää.

5 Kuten edellä esitettiin antibiootteja A/16686 tuo tetaan viljelemällä Actinoplanes-suvun kantaa nimeltään Actinoplanes sp. ATCC 33076.

Tämän kannan tunnusmerkit on annettu seuraavissa kappalei ssa.

10 Morfologia

Kanta kasvaa hyvin erilaisilla väliaineilla oranssin värisellä substraattimyseelillä. 3e ei tuota pigmenttiä. ilmamyseeli puuttuu aina.

Mikroskooppisessa tutkimuksessa kasvumyseeli paijasit tuu haarautuneeksi hyphae'ksi, jonka halkaisija on noin 1 jim. I tiöpesäkkeitä muodostuu niukasti ainoastaan peruna--agarilla ja ne ovat pallomaisia, hyvin epäsäännöllisiä pinnaltaan ja halkaisija vaihtelee 5,0 - 9,0 μην. iin. Itiöiden vapautuminen havaitaan itiöpesäkkeen seinän mur-20 tumisen jälkeen. Subfääriset itiöt ovat liikkuvia (halkai sija 1,0 -1,5 μπϋ. Soluse.inän komponenttien analyysissä saadaan meso-diaminopimeliinihappoa ja u-tyyppiä olevaa sokerirakennetta (Lechevalier et ai. - Chemical eomposi-tion as a creterium in the classification of Actinomyce-25 tes, Adv. Applied Microbiology, 1*+, 1971, Academic Pre>s^ N.Y.).

Viljely tunnusmerkit

Taulukossa I on esitetty Actinoplanes ATCC 33076:n viljely tunnusmerkit viljeltäessä erilaisilla standardi-30 väliaineilla, joita ovat esittäneet Shirting & Gottlieb (Intern. <J . System. Bac. l6, 313-3^0, 1966) ja muilla väliaineilla, jotka ovat Waksman'in suosittelemia (The Actinomyces, voi. 1L - The 'Williams and Viilkins Co. 196l). Viljelytunnusmerkit määritettiin 6 - lä päivän inkuboin-35 nin jälkeen 30°0:ssa.

----- . Γ" h 6 βΟ22

TAULUKKO I

Viljelytunnusmerkit

Joidenkin viljelyväliaineiden kohdalla esitetyt numerot viittaavat Shirling'in ja Gottlieb'in käyttämiin 9 numeroihin Streptomyces-lajien karakterisointimenetelmis- sä - Intern. J. .System. Bac. 16, 313-390, 1966.

V i1j elyvaiia i ne V L1jely tunnu s merkit Väliaine No 2 (hiivauute- Runsasta kasvua, rypistynyt -mallas-agar) pinta, vaaleanruskea 1? H 12 10 Väliaine No 3 (kaurajauho- Niukkaa kasvua, ohut, vaalean-agar) oranssi 93 6 Väliaine No 9 (epäorgaani- Kohtuullista kasvua, rapea siä suoloja-tärkkelysagar) pinta, oranssi 11 L 12 Väliaine No 9 (glyseroli- Niukkaa kasvua, läpinäkyvä 19 -asparagi in: agar ) Väliaine No 6 (peptoni-hii- Niukkaa kasvua, läpinäkyvästä vauute-rauta-agar) - vaaleanruskeaan Väliaine No 7 (tyrosii.nl- Niukkaa kasvua, pehmeä pinta, agar) ruskea 6 u 11 20 Kaurajauhoagar (V.aksman'in Runsasta kasvua rypistynyt mukaan) pinta, oranssista ruskeaan 12 C 10

Hickey'n ja Tresner'in agar Runsasta kasvua, rapea pinta, oranssi 11 G 3 29 Czapeck-glukoosiagar Kohtuullista kasvua, rapea pinta, oranssi 11 G 3

Glukoosi-asparagiiniagar Niukkaa kasvua, rapea pinta, vaalean oranssi 11 E 6

Ravintoagar Kohtuullista kasvua, pehmeä <0 pinta, oranssi 11 G 8

Peruna-agar Runsasta kasvua, rypistynyt pinta, kullanruskeasta -ruskeaan 12 E 10

Bennett'in agar Runsasta kasvua, rypistynyt 39 pinta, oranssi 11 G 8

Kalsium-malaattiagar Kohtuullista kasvua, pehmeä pinta, vaalean oranssi 10 C 6

Kuorittu maitoagar Runsasta kasvua^ rypistynyt pinta, oranssi 9 L 2 9-0 Czapeck-agar Kohtuullista kasvua, rapea pinta, oranssi 10 0 7 5 O 'j Π ^ 9

Muna-agar Kohtuullista kasvua, pehmeä pinta, läpinäkyvästä - vaa-leanoranssiin

Peptoni-glukoosiagar Runsasta kasvua rypistynyt 5 pinta, oranssi 11 G 11

Agar Hyvin niukkaa kasvua, pehmeä pinta, läpinäkyvää

Loeffler-seerumi Hyvin niukkaa kasvua, pehmeä pinta, oranssi 10 Peruna Niukkaa kasvua, rapea, vaa leanruskea

Liivate Niukkaa kasvua, vaaleanorans- s i

Selluloosa Hyvin niukkaa kasvua, ohut, 15 läpinäkyvä

Kirjaimet ja numerot viittaavat väriin, joka on määritetty Maerz'in ja Paul'in mukaan - A dictionary of color - McGraw Hill Inc., New York, 1950.

60022

Hiilen hyväksikäyttö

Taulukossa II on esitetty hiil ilähteiclen hyväksikäyttö, joka on tutkittu Pridham'in ja Gottlieb^in menetelmällä (J . Bact. 56, 107, 19^8).

5 TAULUKKO 11

Hiililänteet Hyväksikäyttö lnositoli

Bruttoosi. +

Harmoosi + 10 Mannitoli

Ksyloosi +

Haffinoosi

Arabinoosi λ

Selluloosa - ^ 15 Sakkaroosi + /

Glukoosi 4 /

Maunoosi 4

Laktoosi

Salisiini 4 20 4 = positiivinen hyväksikäyttö - - ei kasvua 65022

Fysiologiset tunnusmerkit

Taulukossa III on esitetty kannan fysiologiset tunnusmerkit

TAULUKKO III

5 Testi Tulokset Tärkkelyksen hydrolyysi positiivinen ι1^3:η muodostuminen positiivinen

Tyrosiini-reaktio negatiivinen

Kaseiinin hydrolyysi positiivinen 10 Kalsiummalaatin liuottaminen negatiivinen

Liivatteen nesteyttäminen positiivinen koaguloiminen positiivinen

Lakmusmaidon peptonisoiminen negatiivinen 15 Selluloosan hajottaminen negatiivinen

Antibioottien A/16686 tuottamiseksi viljellään kantaa Actinoplanes sp. ATCC 33076 aerobisissa olosuhteissa, vesipitoisessa ravintoväliaineessa, joka sisältää assimiloituvan hiililähteen, assimiloituvan typpilähteen ja epä-20 orgaanisia suoloja. Mainittu viljelyväliaine voi olla mikä tahansa monista ravintoväliaineista, joita tavallisesti käytetään käymisessä, kuitenkin tietyt väliaineet ovat edullisia. Täten esimerkiksi, edullisia hiililähteitä ovat _ π ö 65022 glukoosi, fruktoosi, raannoosi, sakkaroosi ja vastaavat eri puhtausasteissa. Edullisia typpilähteitä ovat soija-papu jauho, peptoni, lihauute, hiivauute, tryptoni, aminohapot ja vastaavat. Epäorgaanisia suoloja, joita voivaan 5 lisätä viljelyväliaineisiin, ovat tavalliset, liukenevat suolat, jotka kykenevät tuottamaan natrium-, kalium-, rauta-, sinkki-, koboltti-, magnesium-,kalsium-, ammonium-, kloridi-, karbonaatti-, sulfaatti-, nitraatti- ja muita vastaavia ioneja.

10 Tavallisesti antibioottia tuottavaa kantaa esivil- jellään ravistuspullossa, jonka jälkeen viljelmää käytetään käy mi säätiöiden yrnppäykseen antibioottien A/16686 huomattavien määrien tuottamiseksi. Väliaine, jota käytetään esiviljelyssä, voi olla sama, jota käytetään suurern-15 missä käymisastioissa, mutta voidaan käyttää myös toista väliainetta.

Antibioottia A/16686 tuottava kanta voi kasvaa lämpötiloissa, jotka ovat noin 20°C - noin 37°0 ja mieluimmin lämpötiloissa, jotka ovat noin 28 - 30°C.

20 Käymisen kuluessa antibioottituotantoa voidaan seu rata ottamalla näytteitä liemestä tai kiinteän myseelin uutteista ja testaamalla näistä antibioottinen aktiviteetti.

Organismit, joiden tiedetään olevan sensitiivisiä 25 antibiooteille A/16686, ovat hyödyllisiä tähän tarkoitukseen. Eräs, erityisen hyödyllinen koeorganisrni on Saroina lutea ATCC 9381. Koe suoritetaan parhaiten käyttäen agar--diffuusi o-menetelmää agarlevyillä. Antibioottisen aktiviteetin maksimi-tuotto tapahtuu tavallisesti kolmannen ja 30 viidennen päivän välillä. Actinoplanes sp. ATCC 33076:n käymisen kuluessa tuottamat antibiootit ovat etupäässä myseelimassassa. Sen tähden eräs edullinen menetelmä antibioottien A/16686 talteenottamiseksi on erotetun myseelin uuttaminen.

35 Myseelimassan uuttaminen suoritetaan parhaiten meta- nolilla, mutta myöskin muut alempialkanolit ja asetoni ovat sopivia. Antibiootit A/16686 saadaan talteen uuttoliuotti- 9 6:5022 mesta tavallisella menetelmällä, jolloin saadaan antibioottien A/I6686 seos, A/l6686-kompleksi. A/l6686-kcmp-leksi puhdistetaan edelleen ja sen jälkeen eri tekijät erotetaan toinen toisistaan. A/l6686-kompleksin erotta-5 minen yksittäisiin komponentteihin voidaan suorittaa erilaisilla tunnetuilla menetelmillä, joita erityisesti ovat kromatografiset menetelmät. Edullisin menetelmä tekijöiden optimierottamiseen on käänteisfaasi-korkeapaineneste-kromatografia (HPLC). Tällaisessa HPLC-erotuksessa edul-10 linen kolonni on μ-Bondapack ja edullisia, liikku via faaseja ovat vesipitoisen HCOONII^in ja Cil^GN:n seokset erilaisissa suhteissa.

Erotettaessa antibioottia A/166 36 tekijä A0 suuressa mittakaavassa, käytetään mieluimmin pylväskromatogra-15 fiaa. Tällaisessa pylväserotuksessa edullinen adsorbentti on Amberlite® XAJ ja edullisia liuotinsysteemejä ovat veden ja asetonitriilin seokset ja ammoniumformiaatin ja asetonitriilin seokset. Pienempien tekijöiden A-^ ja A^ erottaminen voidaan suorittaa pylväskromatografisesti, 20 mutta se vaatii rikastettujen fraktioiden myöhemmin tapahtuvan pylväserottamisen. Tässäkin tapauksessa Amberlite aäu'—· on edullinen adsorbentti ja veden ja asetonitriilin seokset ja ammoniumformiaatin ja asetonitriilin seokset ovat edullisia liuotinsysteemejä.

25 Yhdiste A/16686 tekijä A,.,

Yhdiste a/16686 tekijä Ap on valkea, amorfinen jauhe, joka sulaa, samalla hajoten, noin 210-220°G:ssa.

Yhdiste A/16686 tekijä liukenee veteen, dimetyy-liformamidiin, vesipitoiseen metanoliin, 0,1N l!Cl:ään$ 30 se liukenee huonosti absoluuttiseen etanoliin ja n-buta-noliin; se saostuu vesipitoisesta liuoksesta lisättäessä NaHCOylla kyllästettyä liuosta.

Yhdisteen A/16686 tekijä Ä2 alkuaineanalyysi, kun yhdiste on ensin kuivattu noin ll+0°C:ssa inerttiatmosfää-35 rissa, antaa tulokseksi seuraavan likimääräisen prosenttisen koostumuksen (keskiarvoja): hiili 5k-,57$, vety 6,19$, typpi 10,83$.

10 6 6 0 2 2

Kloori analyysi, antaa seuraava n arvon: klooria 1,37$« Yhdisteen A/16636 tekijä infrapunaspektri nujo- lissa on esitetty liitteenä olevassa kuvassa 1. Havaitaan seuraavat absorptiomaksimit: 3290, 2930 ja 2060 (nujol), 9 1765, 1635, 1510, 1955 ja 1375 (nujol), 1290, 1175, 11.30, 1060, 1015, /75, 390 ja 815 cm"1.

Yhdisteen A/16686 tekijä A9 ultraviolettiabsorptio-spektri on esitetty liitteenä kuvassa 2, jossa on seuraavat absorptiomaksimit: 10 a) neutraalimetanolissa: 239 nm (b}/i’cra = 206) 268 nm (sV0 = 119) 1 cm b) metcnolissa, joka sisältää 0,1N HCl:ää 233 ™ = 192) 15 271 nm - 93) c) metanolissa, joka sisältää 0,1N Na0H:ta 251 nm (K^om = 275) ru 300 nm (olka).

Yhdiste A/16686 tekijä An antaa seuraavat signaalit ^0 270 MHz :n ii-HMii-spektrissä, kuva 3, joka spektri on re kisteröity jjiii’-dy/u^O-liuoksessa .1:1 (til. /til.) (sisäisenä standardina TMS <$0,00 ppm), laitteella Pulse Kourier Transform druker V/H 270 kryospektrometri: (i) signaaliryhmä 0,5-3 ppm vastaa noin 51 alifaattista 25 protonia, eritvisesti dublettien keskipisteet noin 1,53 ppm (J- 7 Hz), 1,20 ppm (J - 6 Hz) ja 1,07 pprn (J = 5 Hz); (ii) signaaliryhmä 3-6,5 ppm vastaa noin 93 protonia, jotka ovat oleofiinisia tai heteroatomeihin sitou-30 tuneiden hiiliatomien protoneja, erityisesti sing- letti noin 5,62 ppm; li C :30 2 2 11 (iii) signaaliryhmä 6,5-8 ppm vastaa noin 39 aromaattis-tyyppistä protonia, erityisesti dublettien keskipisteet noin 7,60 ppm (J = 8 Hz), 7,*+9 ppm (J = 8 Hz) ja 6,k-6 ppm (J = 8 Hz).

9 Singletit 8, 2,85 .ia 3,01 ppm ja singletti lt,73 ppm vastaavat vastaavasti i)MF:ää ja HD0:ta, joita on läsnä liuotinseoksessa.

Yhdisteen A/16686 tekijä A2 ominaiskierto on = + 73 + >+° (c = 0,1+9, H20).

10 Yhdisteen A/16666 tekijä A^ Rj.-arvot erilaisissa pa- perikromatografiasysteemeissä, käyttäen B.substilis ATGC 6633:a osoitusorganismina, on esitetty seuraavassa taulukossa :

TAULUKKO IV

15 Yhdisteen A/16686 tekijä A0 kromatografinen käyttäy- tyminen (Whatman No 1 paperi):

Kluointisysteemi R^-arvo 1) Sorensen puskurilla pH 6,0 kyllästetty n-butanoli 0,00 20 2) vedellä, joka sisältää 2$ p-tolueenisulfoni- happoa, kyllästetty n-butanolia 0,00 3) vedellä joka sisältää 2% ammoniumhydroksi- dia, kyllästetty n-butanoli 0,00 *+) n-butanolilla kyllästetty Sorensen 25 puskuri pH 6,0 0,05 5) n-butanoli:metanoli :vesi , ^:1:2 0,*+8 6) vedellä kyllästetty etyyliasetaatti 0,00

S

7) n-butanoli :etikkahappo:vesi, 2:1:1 0,!+i+ / M. Laskeva kromatografia 30 Ajomatka:b0 cm Määrät: 50 μg yhdistettä liuotettuna seokseen H^O^i^CK, 1:1 (til./tii.)(2 mg/ml).

65022 12

Yhdisteen A/16686 tekijä A2 Rf.-arvot erilaisissa ohutkerroskromatografiasysteeroeissä on lueteltu seuraa-vassa taulukossa: (olosuhteet on esitetty taulukon jälkeen)

TAULUKKO V

5 Eluointisysteemi (til./til./til.) R^.-arvo

1) vesipitoinen 2,5 % HCOONHc :CH-jCN

(6 5:15)* 5 0,36 2) n-butanoli ;etikkahappo:vesi, !+:2:5 0,80 3) n-butanol i: etikkahappo :vesi , k: 2: 5 0,52 10 h) n-propanoli:n-butanoli: IN NHiOH, 2:3:^ (ylempi faasi) 0,12 5) n-butanoli :eti kkahappo: vesi, ^+:1:5 0,15

Ajomatka; noin ll+0 mm Määrät: 2-5 μΐ liuosta (lrr.g/ml) seoksessa CH^CN:H20, 15 1:1 (tii./til.).

Näkyväksi tekeminen: a) jodihövry b) UV-valo aallonpituudella 255-nm. Levyt 1 ja 2 ovat silanoitu.ia piihappogeeli 60 -levy.iä (Merck): näkyväksi tekeminen menetelmät a) ja b); 20 levyt 3, ^ -'a 5 ovat piihappogeeli 60 F^^-levyjä (Merck): näkyväksi tekeminen menetelmällä a).

(*Sisäiset standardit: kaffei.ini R^ 0,60; kortisono Rj.

0,35; deksametasoni 0,30).

Yhdisteellä A/16686 tekijä havaitaan seuraavat 25 karakteristiset reaktiot: ninhydriini (3$ etanolinen liuos) positiivinen

Molish nositiivinen

Biureetti positiivinen

Millon negatiivinen 30 1% FeCl-j - 1/ K-^Fe(CN)^ vesipitoinen vihreä väri KMnO^ (hapan) positiivinen

HpSO^ väk. negatiivinen

Yhdisteen A/16686 tekijä A^ aminohappoanalyysi, hap-pohydrolyysin jälkeen 6N kloorivetyhapossa 110°C:ssa 6 tun-35 tia, osoitti ainakin seuraavien aminohappojen esiintymisen: alaniini, leusiini, glysiini, asparagiinihappo, fenyyliala-niini, ornitiini, p-hydroksifenyyliglysiini ja hydroksi-, 65022 13 kloori-substituoitu fenyyliglysiini. Yhdisteen A/16686 tekijä A2 happohydrolysaatin, 2 tuntia 2N l^SO^issä lio° C:ssa, analyysi osoittaa, että läsnä on neutraalia hiilihydraattia, J-mannoosia.

5 Antibiootin A/16686 tekijä A^ HPLC-analyysi, jossa käytettiin μ-Bondapack® C^g-kolonnia (3,9 mm In x 300 mm) ja liikkuvana faasina seosta HCOONH^ 0,025M / CH^CN, 60/k0 (til./til.), virtausnopeutena 2ml/min., osoitti, että yhdisteen retentioaika t^ on b' 99/100" (sisäiset stan-10 dardit: antraseeni tR 35' 18/100"; «x-nitronaftaleeni t^ 11' lk/lOO"; tolueeni t^ 8" 6k/100").

Yhdiste A/16686 tekijä A-^

Yhdiste A/16686 tekijä A^ on valkea, amorfinen jauhe, joka sulaa, samalla hajoten, noin 210-220°C:ssa. Se 15 on hyvin liukeneva veteen, dimetyyliformamidiin ja vesipitoiseen metanoliin; liukeneva metanoliin ja etanoliin; mutta on liukenematon etyylieetteriin, petrolieetteriin ja bentseeniin.

Yhdisteen A/16686 tekijä A^ alkuaineanalyysi, kun 20 yhdistettä oli ensin kuivattu noin ll+0°C:ssa inerttiat-mosfäärissä, antaa tulokseksi seuraavan likimääräisen prosenttisen koostumuksen (keskiarvoja): hiiltä 50,31#, vetyä 6,00 typpeä 9,92 #, jäännös 6,07 %.

Yhdisteen A/16686 tekijä A^ kloorianalyysi antaa 25 seuraavat tulokset klooria (kokonaispitoisuus) l,6l#, kloori-ioneja 0,90 %.

Yhdisteen A/16686 tekijä A-^ infrapuna-absorptio-spektri nujolissa on esitetty liitteenä olevassa kuvassa >+. Havaitaan seuraavat absorptiomaksimit: 3290, 2930 ja 30 2860 (nujol), 1765, I63O, 1510, 1b55 ja 1375 (nujol), 1260, 1235, 1175, 1150, 1130, 1060, 1015, 975, 850 ja 810 cm-·*-.

Yhdisteen A/16686 tekijä A1 ultravlolettiabsorptio-spektri on esitetty liitteenä olevassa kuvassa 5, siinä 35 esiintyvät seuraavat absorptiornaksiir.it: 65022 Γ"

IA

a) neutraalimetanolissa: 233 nm (E^cm = 20?) 266 nm = 106) b) metanolissa, joka sisältää 0,1N HCl:ää: 6 232 nm (E^cm - 219) 270 nm (E^ = 110) 1 cm c) rnetanolissa, joka siältää 0,1N NaOHita: 261 nm (E^ = 26*+) l cm rU 290 ntn (olka).

10 Yhdisteen A/16686 tekijä ominaiskierto on = + 57 - U° (c = °, 53., U20).

Yhdisteen A/166Ö6 tekijä A^ ftj.-arvot erilaisissa paperi kromatografiasysteemeissä, käyttäen osoitusorganismina B.subtilis ATCC 6633ia, on esitetty seuraavassa tau-15 lukossa:

TAULUKKO VI

Yhdisteen a/16686 tekijä A-, kromatografinen käyttäy- U *“ tyminen (Whatman No l naperi) :

Eluointlsysteemi Rj.-arvo 20 1) Sorensen puskurilla pH 6,0 kyllästetty n-butanoli 0,00 2) vedellä, joka sisältää 2j* p-tolueenisulfo- nihappoa, kyllästetty n-butanoli 0,00 3) vedellä, joka sisältää 2% ammoniumhydrok- 25 sidia, kyllästetty n-butanoli 0,00 !+) n-butanoli 11a kyllästetty Sorensen puskuri oil 6,0 0,05 5) n-butanoli :metanoli :vesi, h: 1:2 0,M3 6) vedellä kyllästetty etyyliasetaatti 0,00 30 7) n-butanoli:etikkahappo:vesL, 2:1:1 0,hh * Laskeva kromatografia Ajomatka: 90 cm Määrät: 50 μ g yhdistettä liuotettuna seokseen H^O^H^CN, 1:1 (til./til.)(2 mg/ml).

15 6:3022

Yhdisteen A/I6686 tekijä A^ Rj.-arvot erilaisissa ohutkerroskromatografiasysteemeissä on lueteltu seuraa-vassa taulukossa (olosuhteet on esitetty tauLukon jälkeen):

TAULUKKO VEI

5 Eluointisysteemi (til./til./til.) Rj.-arvo

1) vesipitoinen 2,5 $ HCOONH^: CH^CN 65:35* 0,UO

2) n-butanoli:etikkahappo:vesi, ^:2:5 0,80 3) n-butanoli :etikkahappo:vesi, 2: 5 0,52 ä·) n-propanoli :n-butanoli: IN NIL OH, 10 2:3 A (ylempi faasi) 0,12 5) n-butanoli:etikkahappo:vesi, ^+:1:5 0,15

Ajomatka: noin AO mrn Määrät: 2- 5 μΐ liuosta (1 mg/ml) seoksessa Cll-^CN:H^0, 1:1 (til./til.).

15 Näkyväksi tekeminen: a) jodihöyry$ b) UV-valo aallonpituudella 25^ nm. Levyt 1, 2 silanoituja piihappogeeli 60 T^^-levyjä (Merck): näkyväksi tekeminen menetelmät a) ja b); levyt 3, b ja 5 piihappogeeli 60 F^^-levyjä (Merck): näkyväksi tekeminen 20 menetelmä a). (^Sisäiset standardit: kaffeiini H^. 0,60$ kortisoni 0,35$ deksametasoni Rj. 0,30).

Yhdisteen A/16686 tekijä aminohappoanalyysi, hap-pohydrolyysin jälkeen 6N kloorivetyhapossa 110°C:ssa 6 tuntia, osoittaa, että ainakin seuraavat aminohapot ovat läs-25 nä; alaniini, leusiini, glysiini, asparagiinihappo, fenyy-lialaniini, ornitiini, p-hydroksi-fenyyliglysiini ja hyd-roksi-, kloori-substituoitu fenyyliglysiini.

Yhdisteen A/16686 tekijä A^ happohydrolysaatin, 2 tuntia 2N H^SO^ssä 100°C:ssa, analyysi osoittaa, että 30 läsnä on neutraalia hiilihydraattia, u-mannoosia.

antibiootin A/16606 tekijä A·^ UPLC-analyysi käytettäessä μ-Bondapack® C-, ^-kolonnia (3,9 mm IL y 300 mm) ja seosta IICOONH^ 0,025M / CH^CN 60AO (til./til.) liikkuvana faasina, virtausnopeutena 2 ml/min., antaa retentioaja.n 85 t·^ 3* 8L-/100" (sisäiset standardit: antraseeni tg 35' 18/ 100"·, o( -nitrona f taleeni tp li' lL/100"; tolueeni tD 8' ,. . Λ 7 li 6U-/100" ).

f· Ιό 66022

Yhdiste A/16686 tekijä A^

Yhdiste A/16686 tekijä A., on valkea, amorfinen jau-he, joka sulaa, samalla hajoten, noin 220 C:ssa. Se on hyvin liukeneva veteen, uimetyyliformamidiin ja vesipi-5 toiseen metanoiiin; liukeneva rnetanoliin ja etanoliin, mutta liukenematon etyylieetteriin, petrolieetteriin ja bentseeni in.

Yhdisteen A/16686 tekijä A-, alkuaineanalyysi, kun

3 Q

yhdistettä ensin kuivataan noin 1^0 C:ssa inerttiatmos- 10 fäärissä, antaa tulokseksi seuraavan likimääräisen prosenttisen koostumuksen (keskiarvoja): hiiltä 88,8-1^, vetyä 5,81+ fu^ typpeä 9,09 #, jäännös 9,1 %· Kloorianalyysi antaa seuraavat tulokset: klooria (kokonaispitoisuus) 1,68 ;0, kloor L - ioneja l,lo /.

15 Yhdisteen A/16686 tekijä infrapuna-absorptiospekt- ri nujolissa on esitetty liitteenä olevassa kuvassa 6. Havaitaan seuraavat abscrptiomaksimi t: 3290, '::>930 ja 2860 (nujoi), 1765, 1635, 1510, 18+55 ja 1375 (nujol), 1200, 12L+0, 1175, 1100, 1060, 1020, 976, 8*+0 ja 805 cm'1.

20 Yhdisteen A/16686 tekijä A-, ultravlolettiabsorptio- spektrissä, joka on esitetty liitteenä olevassa kuvassa 7, on seuraavat absorptiomaksimit: a) neutraalimetanolissa: 23^ nm (6^cm = 16?) 25 267 nm (61^ = 7>+) b) metanolissa, joka sisältää 0,1N HCl:ää: 232 m = 13?) 27° nm (E^cm = 76) c) metanolissa, joku sisältää 0,1N Na0H:ta: 30 250 nm = 202) co 295 nm (olka)

Yhdisteen A/16686 tekijä ominaiskierto H 2° * + 50 + b° (c = 0,1+8, iiCl N/100).

17 6:5022

Antibiootin A/16686 tekijä R^-arvot erilaisissa paperikrornatografiasysteemeissä, käytettäessä osoitusor-ganismina B.subtilis ATCC 6633ia, on esitetty seuraavassa taulukossa: 5 TAULUKKO Vili

Yhdisteen A/16686 tekijä A^ kromatografinen käyttäytyminen (Whatman No 1 paperi)*:

Eluointisysteemi R^-arvo 1) Sorensen puskurilla pH 6,0 kyllästetty 10 n-butanoli 0,00 2) vedellä, joka sisältää 2% p-tolueenisulfo- nihappoa, kyllästetty n-butanoli 0,00 3) vedellä, joka sisältää 2/i ammoniumhydrok- sidia, kyllästetty n-butanoli 0,00 15 k-) n-butanolilla kyllästetty Sörensen puskuri pH 6,0 0,05 5) n-butanoli:metanoli:vesi, k:l:2 0,k-8 6) vedellä kyllästetty etyyliasetaatti 0,00 7) n-butanoli :etikkahappo:vesi , 2:1:1 0,k-k- 20 * Laskeva kromatografia

Ajomatka: *+0 cm Määrät: 50 }ig yhdistettä liuotettuna seokseen II^O; CH^CN, 1:1 (til./til.)(2 mg/ml).

Yhdisteen A/16686 tekijä A^ R^-arvot erilaisissa 25 ohutkerroskromatografiasysteemeissä on annettu seuraavassa taulukossa (olosuhteet on esitetty taulukon jälkeen):

TAULUKKO IX

Eluointisysteemi R^-arvo 1) vesipitoinen 2,57° HCOONH^:CE^CN (65: 35)^ 0,32 30 2) n-butanoli:etikkahappo:vesi, k:2:5 0,80 3) n-butanoli:etikkahappo:vesi, k:2:5 0,52

k-) n-propanoli:n-butanoli:IN NIL OH

2:3:k- (ylempi faasi) 0,12 5) n-butanoli:etikkahappo:vesi, k:l:5 0,15 35 Ajomatka: noin IkO rma Määrät: 2-5 pl liuosta (1 mg/ml) seoksessa CII^CNtH^O, 1:1.

Näkyväksi tekeminen: a) jodihöyryj b) UV-valo aallonpituudella 25k nm.

18 C '3022

Levvt 1 ja 2 ovat silanoituja piihappogeeli 60 F0(^--levyjä (Merck): näkyväksi tekeminen menetelmillä a) ja b); levyt 3, k ja 5 ovat piihappogeeli 60 F2^-levy.iä (Merck): näkyväksi tekeminen menetelmällä a). (*3isäiset standar-5 dit: kaffeiini 0,60$ kortisoni 0,35; deksametasoni Rf 0,30).

Yhdisteen A/16686 tekijä aminohappoanalyysi, hap-

•D Q

pohydrolyysin jälkeen 6N kloori.vetyhapossa. 110 C:ssa 6 tuntia, osoitti ainakin seuraavien aminohappojen olevan 10 läsnä: alaniLni, leusiini, glysiini, asparagjinihappo, fenyyllalaniini, ornitiini, p-hydroksifenyyliglysiini ja hydroksi-, kloori-substi tuoitu fenvy1iglysiini.

Yhdisteen A/16636 tekijä A^ happchydrolysaatin, 2 tuntia 2N H.,B0u:ssä 100°C:ssa, analyysi osoittaa, että 15 läsnä on neutraalihiilihyuraattia, .--raannoosia.

Antibiootin A/16686 tekijä I!PLC-analyvsi, käytet-taessa p-Bondapack^- C-^-kolonnia (3,9 mm Ij x 300 mm) ja liikkuvana faasina seosta HC00NH.+ 0,025M /CII^CN, 60/k0 (til./til.), virtausnopeuden ollessa 2 rnl/min. , antoi 20 retentioajaksi t^ 6' 8k/100".( Sisäiset standardit: antraseeni t^ 35* 18/100"$ -ni tronaf taleeni. 11'’ lh/ 100"j tolueeni t^ 8' 6U/100").

Antibiootti A/16686 tekijä sekä tekijät ja A^, ovat antimikrobisia aineita ja erityisesti aktiivisia 25 gram-positiivisia tnikro-organismeja vastaan. Erityisesti antibioottien Α/Ί6686 in vitro aktiviteetti kirjo on esitetty seuraavassa taulukossa: 19 66022

TAULUKKO X

Organismit Pienin estävä konsentraatio (μς/οιΐ) tekijä tekijä tekijä A ^ ^0 *3 5 3. aureus ATCC 6538 0,1 0,1 1,6 S. aureus Tour (inoculum 10^/ml) 0,2 0,2 1,6 3. aureus Tour (inoculum 10 /ml) 0,L 0,8 3,1 3, aureus Tour {+ 30$ bovine serum) 0,L 0,8 1,6 10 3. pyogenes G 203 SKF 13L00 0,012 0,012 0,012 3. pneumoniae Felton UC Ll 0,029 0,029 0,029 3. foecium ATCG 109^1 0,1 0,09 0,1 £. coil 3KF 12lL0 >100 >100 >100 antibioottien A/16686 on myös havaittu omaavan kor- 19 kean aktiviteetin erilaisia patogeenisiä organismeja vastaan. Antibioottien A/16686 tehokkuus käy selvästi ilmi taulukosta XI, jossa on esitetty ED^-arvot hiirillä kahta erilaista mikro-organismia vastaan.

TAULUKKO Xi 20 Eu^o mg/rnl päivä s.c.

S. pyogenes 3. pneumoniae C203 SKF I3L0O Felton UC Li A/16686 0,0Ll 0,19 tekijä (0,012-0,06L) (0,17-0,lL) 29 A/16686 0.0L8 0,16 tekijä A2 (0,026-0,070) (0,20-0,16) A/16686 0 lL 0,Li tekijä (0,096-0,21) (0,L6-0,36)

Yhdisteet A/16686 estävät myös sellaisten mikro-orga- 30 nismien kasvun, jotka edesauttavat hammassairauksien kehittymistä. Tämä yhdisteiden A/16686 tärkeä ominaisuus todet- _______ Γ" 20 6 502 2 tiin testien avulla, joissa käytettiin keinotekoista Streptococcus mutans ÄTCG 25*175 täpläsysteemiä (plaque system). Näissä kokeissa yhdisteet Ä/16686 estivät täplien muodostumisen hyvin alhaisilla konsentraatioilla.

5 Täten yhdisteitä A/16686 voidaan käyttää näille yhdisteille herkkien, patogeenisten organismien aiheuttamien sairauksien hoidossa. Esimerkiksi hoidettaessa streptokokkien tai stafylokokkien aiheuttamia tulehduksia tai ehkäistäessä tai hoidettaessa hammasmädästä johtuvaa ham-10 päiden kiilteen tai haramasluun liukenemista ja hajoamista.

Tällaisissa hoidoissa yhdisteitä A/16686 voidaan käyttää vapaina emäksinä tai vastaavina, myrkyttöminä, fysiologisesti hyväksyttävinä happoadditiosuoloina. Lisäksi niitä voidaan käyttää yksittäisinä tekijöinä tai, 15 huomioonottaen niiden aktiivisuuksien samankaltaisuuden, niitä voidaan myös käyttää seoksina, joissa on kaksi tai kaikki kolme tekijää, missä tahansa suhteessa.

Eeuraavat esimerkit kuvaavat tätä keksintöä lähemmin: 20 Esimerkki 1

Actinoplanes sp. ATCC 33076 kannan käyminen Actinoplanes sp. ATCC 33076 viljelmää esiviljellään kasvattamalla kantaa ravistuspulloissa, joista jokainen sisältää 100 rnl vesipitoista rav Lnt oväl lainetta, jolla on 25 seuraava koostumus (g/ml:ssa): lihauutetta 3 g/l hiivauutetta 5 g/l tryptonia 5 g/l liukenevaa tärkkelystä 2b g/l 30 glukoosia 1 g/.i

GaCO^ia A g/p

Pulloja ravistellaan noin fj6 tunnin ajan 28-30°C:ssa ja sen jälkeen kaadetaan käytnLsastiaan, joka sisältää A litraa samaa kasvuvällainetta, ja esiviljellään tunnin 35 ajan samassa lämpötilassa. 3 litraa tästä esiviljelmästä käytetään sen jälkeen suuremman käymisastian, joka sisältää 30 litraa samaa edellä esitettyä ravintovälia.lnetta, ymp- 21 6*5022 päämiseen ja esiviljellään aerobisesti 2b tuntia 23°C:ssa. Lopuksi 20 litraa tästä esiviljelraästä käytetään Lankki-käyrnisastioiden ymppäämiseen, jotka sisältävät 200 litraa vesipitoista ravintoväliainetta, jolla on seuraava koos-5 tumus: lihauutetta U g/1 peptonia k- g/1 hiivauutetta 1 g/1 natriumkloridia 2,5 g/1 10 soijapapujauhoa 10 g/1 glukoosia 25 g/1

CaCOya 5 g/1 Käymiserää inkuboidaan aerobisesti, samalla hämmentäen, 2S-30°C:ssa. Tietyin väliajoin antibioottinen akti-15 viteetti testataan mikrobiologisesti agar-diffuusiomene-telmällä, käyttäen testiorganismina Sareina lutea ATCC 93^1:tä. Maksimi aktiviteetti saavutetaan 72-120 tunnin käymisen jälkeen.

Ssimerkki 2 20 Antibioottisen A/16686 kompleksin erottaminen koko käymisliemi (170 1), joka valmistetaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla, jäähdytetään 10°C:een ja pH säädetään arvoon 3,5 1¾ /:11a iICl:llä. Saatu hapan liemi suodatetaan käyttäen mukana suodatusapuainetta (Olarcel 25 Flow-Ma) ja myseelikakku pestään vedellä.

Metanolia (30 1) käytetään myseelimassan uuttamiseen, joka suodatuksen jälkeen uutetaan uudestaan seoksella me-tanoli/vesi (30 litraa metanolia plus 5 litraa vettä).

Uutettu myseelimassa hylätään ja kaksi metanoliuu-30 tetta konsentroidaan tyhjössä lämpötilassa, joka on alle lf0°C:n, jolloin saadaan vesipitoinen konsentraatti (6 1). Tämä vesipitoinen konsentraatti uutetaan kolme kertaa, käyttäen joka kerta 10 litraa n-butanolia, butanoliuut-teet yhdistetään ja konsentroidaan pieneen tilavuuteen 35 tyhjössä.

Tämä konsentraatti lisätään petrolieetterj in ja muodostunut sakka erotetaan dekantoimalla ja lisätään vielä _ Γ 22 6:3022 toiseen petrolieetterimäärään. 3akka erotetaan suodattamalla ja kuivataan tyhjössä huoneen lämpötilassa, jolloin saadaan 60 g antibioottista A/16686 kompleksia raakana-teriaalina, jonka pienin estävä konsentraatio (MIC) kan-5 taa S. pneumoniae 1C ^1 vastaan on 0,1 ^g/ml.

Esimerkki λ

Antibioottisen A/16686 kompleksin puhdistaminen a) ^7,7 g raakaa antibioottista A/16686 kompleksia, joka saadaan esimerkin 2 mukaisesti, käsitellään 10 l,ä litralla seosta, jossa on kloroformi {etanoli jvesi (k-:7:2) (til./til./til.) , ja öljytnäinen tuote, joka muodostuu, erotetaan liuoksesta dekantoimalla. Sen jälkeen lisätään vielä 70 ml edellä esitettyä seosta öljymäiseen tuotteeseen ja erotus toistetaan. Käsittelemällä oljy-15 mäistä tuotetta vedellä (M+0 ml), se kiteytyy ja erotetaan sentrifugoimalla tai suodattamalla:

Kiinteä aine, joka erotetaan, suspendoidaan veteen (I70 ml), liuotetaan lisäämällä metanolia (kOO ml) ja suodatetaan. Vesipitoisen metanoliliuoksen pH säädetään 20 arvoon 3,5 lisäämällä IN HCl:ää, sen jälkeen liuottimet poistetaan tyhjössä lisäämällä n-but,anolia lämpötilassa, joka on aina alle 35°C:n, jolloin saadaan noin 50 ml:n butanolikonsentraatti. Lisäämällä dietyylieetteriä (500 ml) muodostuu sakka, joka erotetaan suodattamalla ja kui-25 vataan tyhjössä huoneen lämpötilassa, jolloin saadaan 1,012 g melko puhdasta antibioottista A/16686 kompleksia, jonka MlC-arvo kantaa S. pyogenes vastaan on 0,025 μg/vnl.

b) 1,58 g antibioottista A/16686 kompleksia, joka saadaan edellä kuvatulla tavalla, liuotetaan 100 ml:aan 30 seosta, jossa on asetonitri ili :11^0, 1:1 (til./til.) ja saatu liuos laitetaan pylvääseen, joka sisältää !+30 g pii-happogeeliä 60 (Merck 0,06-0,2 mm) ja joka valmistetaan käyttäen samaa seosta. Pylväs kehitetään käyttäen ensin samaa asetonitriili/vesi-seosta ja keräämällä 70 fraktio-35 ta, joista jokainen 20 ml, ja sen jälkeen käyttäen seosta asetonitriili: N/100 HC1, 1:1 (til./til.) ja keräämällä edelleen 290 fraktiota, joista jokainen 20 ml.

23 66022

Pylvään eluointia seurataan ohutkerroskromatografi-sesti 60 F^^-piihappogeelilevyillä ja testaamalla fraktioita Sareina lutea'a vastaan. Fraktiot I3O-265 yhdistetään ja liuottimet poistetaan tyhjössä n-butanolilla, jol-5 loin saadaan 20 ml:n n-butanolikonsentraatti. Tämä jäännös kaadetaan suureen määrään etyylieetteriä ja muodostunut sakka erotetaan suodattamalla ja kuivataan tyhjössä huoneen lämpötilassa P2°5:n päällä, jolloin saadaan 1,015 g antibioottista A/16686 kompleksia.

10 c) 0,67 g edellä olevaa ainetta liuotetaan 2.k ml: aan vettä ja 76 ml:aan etanolia. Saatu liuos laitetaan pylvääseen, joka on 3,0 x 62,0 cm ja sisältää 220 g Sep-hadex LH-20:tä, valmistettu seoksella metanoli:vesi, 7s3 (til./til·.). Pylväs kehitetään samalla seoksella, kerä-15 tään 10 ml:n fraktioita. Fraktiot, jotka sisältävät antibioottisen A/16686 kompleksin, yhdistetään ja liuottimet poistetaan tyhjössä lämpötilassa, joka on alle 35°C, n-butanolilla, jolloin saadaan jäännökseksi noin 10 ml:n n-butanolikonsentraatti. Tämä liuos lisätään etyylieet-20 teriin puhtaan antibioottisen A/16636 kompleksin saosta-miseksi. Sakka erotetaan suodattamalla, pestään etyyli-eetterillä ja kuivataan tyhjössä päällä, huoneen lämpötilassa, jolloin saadaan 0,26 g puhdasta antibioottista A/16686 kompleksia.

25 Täten saatu antibioottinen A/16686 kompleksi on valkea, kiteinen aine, heikosti hygroskooppinen, joka sulaa 22b-226°C:ssa. Se on hyvin liukeneva veteen ja dime-tyyliformamidiin, liukenava metanoliin, etanoliin, pro-panolii.n ja butanoliin, mutta liukenematon etyylieette-30 riin, petrolieetteriin ja bentseeniin. Antibioottisen A/ 16686 kompleksin alkuaineanalyysi, jota ennen yhdistettä kuivataan l1+0°C:ssa inerttiatmosfäärissä, antaa tulokseksi seuraavan limimääräisen prosenttisen koostumuksen (useiden analyysien keskiarvo): hiiltä 51,73 vetyä 6,31+ 35 typpeä 9,96 #, jäännös 1%.

Kloorianalyysi antaa seuraavat tulokset: klooria (kokonaispitoisuus) 5,^8 /; kloori-ioneja U-,7*+ %· __ r: 28 6:3022

Inf ranuna-absorptiospektri ssä, nujolissa, es Lintvy seuraavat absnrptiomaksimit (cm :ssa): 3?90, 3070, 2930 ia 2860 (nujol), 1769, I63O, 1510, 1995 ja 1375 (nujol), I23O, 1179, UPO, 1065, 1030, 1015, 930, 9 08O ja 820.

Esimerkissä 3 esitetyllä tavalla saadun antibioottisen A/16686 kompleksin ultraviolettiabsorptiospektris-sä on seuraavat absorptiomaksimit: a) me ta nelissä 10 232 nm = 178) 265 nm (E^c!n = 107) b) metanolissa, joka sisältää 0,1N HClrää 231 nm (E^cm = 167) 270 nm (Ej1^ = %) 19 c) metanolissa, joka sisältää 0,1 N NaOH:ta 250 nm = 232) 295 nm (olka) d) metanolissa, joka sisältää puskuria pH 7,38 231 nm = 167) lem 2° 270 nm 96)

Kompleksin ominaiskierto 1_ J ^ = + '+9,7 (c = 0 ,83 % t»MF: ssä).

Antibioottisen A/16686 komp)eKsin H^-arvot erilaisissa paperikromatografiasysteemeissä, käytettäessä osoi- 29 tusorganisraina 3. aureus ATCC 653^ iaa, on esitetty seu-raavassa taulukossa: 95 65022

TAULUKKO XL I

Anti bioottisen A/16686 kompleksin kromatografinen käyttäytyminen (khatman No 1 paperi)

Elutointi systeemi H^.-arvo 5 1) Sorensen puskurilla pH 6,0 kyllästetty n-butanoli 0,00 2) vedellä, joka sisältää 2% p-tolueenisul- fonihappoa, kyllästetty n-butanoli 0,00 3) vedellä, joka sisältää 2% ammonium- 10 hydroksidia, kyllästetty n-butanoli 0,00 k) n-butanolilla kyllästetty Sorensen puskuri pH 6,0 0,35 5) n-butanolijmetanoli:vesi, 5:1:2 0,k3 6) vedellä kyllästetty etyyliasetaatti 0,00 15 7) n-butanoli:etikkahappo:vesi, 2:1:1 0,52 8) n-butanoli:pyridiini:vesi, 5:3:7 0,^7 *· Laskeva kromatografia Ajomatka: *+0 cm Määrät: 20 pg yhdistettä liuotettuna vesi/metanoliin 20 (2 mg/ml).

Antibioottisen A/16686 kompleksin K^-arvot erilaisissa ohutkerroskromatografiasysteemeissä on esitetty seuraavassa taulukossa (olosuhteet on annettu taulukon jälkeen): 25 TAULUKKO Xl I i.

Eluoiritisysteemi (til./til./til.) A^-arvo l) n-propanoli:n-butanoli:N ammonium- hvdroksidi, 2:3:5 (ylempi faasi) 0,15 2) n-butanoli:etikkahappo:vesi, 5:2:5 0,61 30 3) n-butanoli:etanoli:0,IN kloorivetyhappo 0,6l 5) kloroformi:etanoli:10$ etikkahappo, 5:7:2 0,00 5) n-butanoli:etikkahappo:vesi, 5:1:5 3,17 6) me tanoli;10# vesipitoinen ammoniumasetaat- ti*.10/i ammoniumhydroksi di, 10:9:1 0,52 35 7) n-butanoli:pyridiini:vesi:etikkahappo 6:5:3:1 0,35 8) metanoli:10/ vesipitoinen ammoniumasetaat- ti:10% ammoniumhydroksidi., 10:9:1 0,11 9) 0.25M vesipitoinen NalLjPO),:ase tonitriili , 50 l!l e 4 0,68 _ r; 26 6-5022 10) metanoli:10% vesipitoinen ammoniumase- taatti 1:1 ' 0,65 11) n-butanol i :etikkahappo:vesi., k: 2: 5 0,77

Ajomatka: noin lhQ mm 5 Määrät: 2-5 μΐ yhdisteen liuosta (1 mg/ml) aseto- nitri ilI-vedessä, 1:1 (til./tll.).

Näkyväksi tekeminen: a) bioautografia agarlevyilla, jotka on ympätty kannalla B. subtilis ATCC 6633; 10 b) karbonjsointi kuumentamalla -naltolirikkihapon kanssa^ c) jodihöyryj d) kloori-toluidiini-reagenssi; e) UV-valo aallonpituudella 25'·+ nm.

15 Levyt 1-7 ovat piihappogeeli 60 F^^-levy jä (Merck): näkyväksi tekeminen menetelmillä a), b), c), d) ja e); levyt 8 ja 9 ovat piihanpogeeli 60 F^^-levyja, jotka ovat siianoituja (Merck): näkyväksi tekeminen menetelmällä e); levyt 10 ja 11 ovat selluloosa F-levyjä (Merck): näkyväksi 20 tekeminen menetelmillä a) ja e).

Antibioottisen A/16686 kompleksin, joka eristetään ja puhdistetaan esimerkissä 3 kuvatulla tavalla, HFLC--analyysi osoittaa, että läsnä on kolme tekijää, joita nimitetään antivluotit A/16686 tekijä A^, A,, ja A^, jois-;?5 ta suurin teK.ljä, määrältään .noin 70-87/«, on antibiootti a/16686 tekijä A^. HPLC-analyystn tulokset ja olosuhteet, joissa analyysi suoritettiin, on lähemmin kuvattu, seuraa-vassa taulukossa (sisäisinä standardeina käytettiin tolu-eenia, ^-nitronaftaleenia ja antrascenia): v 27 6:5022

TAULUKKO XIV

piikin L'o A1 3 8Lf/i00" A2 ^100" 5 6' ÖV-j^QQ,, tolueeni 8' 6W/-^qq„ -nitronaftaleeni li' l^ioo" antraseeni 35* -^3/^qq,,

Kolonni: ^-Bondapack ® C-^g (3,9 mm ID x 300 mm); 10 Liikkuva faasi: iIC00NH1+ 0,025M : CI^CN, 60:^0 (til./til·.); Virtausnopeus: 2 ml/min.;

Paine: 2000 psi; uetektori: UV 25^- nm.

Esimerkki b 15 Antibioottien A/16686 tekijät A^, ja A^ erottaminen A/l6686-kompleksi (169 mg), joka saadaan esimerkissä 3 3 kuvatulla tavalla, liuotetaan Ο,ΟΙΝ kloorivetyhappoon (6,5 ml) ja tislattuun veteen (10,*+ ml). Käänteisfaasisel-la lIPLC-tekniikalla jkolonni :p-Bondapack® C-^g (7,8 mm ID 20 x 300 mm) - virtausnopeus:*+ ml/min - paine: 2000 psi - liikkuva faasi: HCOONH^ 0,025M : CH^CN, 65:35 (til./til.)] injektoimalla toistuvasti edellä esitettyä liuosta 1 ml tai 2 ml kerätään yksittäiset tekijät sisältävät fraktiot ja nämä edelleen tarkistetaan analyyttisellä IIPLC-mene-25 telmällä. Fraktiot konsentroidaan tyhjössä lämpötilassa, joka on alle 35°C:n lisäämällä butanolia vaahdon muodostuksen vähentämiseksi. Jäännöksinä saadut liuokset lyofi-lisoidaan ja saadut kiinteät aineet erikseen liuotetaan tislattuun veteen ja lyofilisoidaan taas uudestaan, joi-30 loin saadaan antibioottia A/16686 tekijä A-^ (lo mg), A2 (95 mg) ja A3 (12 mg).

Lyofilisoimalla antibiootin A/16686 tekijä A^ hydro-kloridiliuos, joka valmistetaan edellä esitetyllä tavalla, saadaan vastaava hydrokloridi amorfisena, val<eana jauhee- - Γ" 28 C '3022 na, j oka ha j ο,αα 250° C: s sa. esimerkki 5

Antibiootin A/16686 tekijä erottaminen Antibioottinen a/16686 kompleksi (100 mg), joka saadaan esimerkissä Ib) kuvatulla tavalla (ti ! tteri: ^'aO/i), liuotetaan 0,1N kloorivetyhappoon (15 ml). Näin saatu liuos laitetaan pylvääseen, joka on täytetty Amber-lite^ XAu-pjila (136 ml, täytteen korkeus 60 cm), pylväs pestään etu Käteen CH^CN:llä ja tislatulla vedellä. Pyl-10 väs kehitetään suorittamalla eluointi lineaarisella gradient!] la O-jh/ CH^GN/vesi (til./tii.), kerätään ?50 10 ml:n fraktioita.

Fraktiot 185-225, jotka sisältävät pelkkää yhdistettä A/16686 tekijä k yhdistetään ja konsentroidaan it tyhjössä lämpötilassa, joka on alle 35°G, lisäämällä bu-tanolla vaahdon muodostumisen vähentämiseksi. Jäännöksenä saatu liuos lyofilisoidaan, jolloin saadaan antibioottia A/166B6 tekijä i\ (6,7 mg).

Esimerkki 6 20 Antibiootin A/16686 tekijä k0 erottaminen

Antibioottinen kompleksi A/16686 (100 mg), joka saadaan esimerkissä 3a) kuvatulla tavalla (tii tteri: 53,57-), liuotetaan 10 ml:aan seosta, jossa on CK^CN/0,0?5M vesipitoinen HCOCNiiv, 27/73 (til./til. ). Näin saatu liuos la ite-25 taan pylvääseen, jossa on täytteenä Amberli t.p ® aAj-2 (200 ml - täytteen korkeus: 52 cm), pylväs pestään etukäteen ensin 0,02pM lIC00NH^:llä ja sen jälkeen seoksella CK^CN/0,Q25M IICOONII^ 27/73 (tii./til.). Pylväs kehitetään eluoimalla lineaarisella gradient! 11a 27-]k)% GH^CN/0, 30 KCOONH^, kerätään 10 ml: n fraktioita '*00 ml jaan asti. ja sen jälkeen 6 ml:n fraktioita, kunnes eluoitujen fraktioiden kokonaistilavuus on 2 litraa. Eluoldut fraktiot tarkistetaan analyyttisellä liPLC-menetelmälla, yhdistetään tekiiäpitoisuuden mukaan ja t i t ra taa n H PL C-mene t e1mä11ä, 35 jolloin saadaan seuraavat tulokset: 29 6:3022

Fraktiot /0 A/16686 ')l A/16686 / A/16686 tekijä tekijä A? tekijä 31-91 90,1 9,9 0 >+2-50 53,9 >+6,1 0 5 51-59 17,9 82,1 0 60-65 V' 93,7 1,9 66-75 O 99-,2 5,8 76-80 O 83,7 16,3 31-99 O 96,1 53,3 10 100-110 O 6,7 93,3

Fraktiot 60-75, jotka sisältävät 99-/ puhdasta antibioottia A/16686 tekijä A^, konsentroi daan tyhjössä lämpötilassa, joka on alle 35°0, lisäämällä butanol ia ja jäännöksenä saatu liuos lyofilisoidaan, liuotetaan tislattuun 15 veteen ia lyofilisoidaan uudestaan, jolloin saadaan 19,7 mg antibioottia A/16686 tekijä Ap.

Esimerkki 7

Antibioottien A/1.6686 tekijä ja A0 erottaminen

Antibioottisen A/16686 kompleksin (650 mg), joka 20 saadaan esimerkissä 3a) esitetyllä tavalla (tiitteri: 53,5/), liuos liuotetaan seokseen, jossa on CII^CM/HCOONil^ 0,025H, 26/79 (til./til.) ja saatu liuos perkoloidaan, noin 9 ml/min. virtausnopeudella, Amberlite XAu-?®-pylvään läpi (1900 ml - täytteen korkeus: 130 cm), joka pyl-25 väs on etukäteen pesty samalla liuotinseoksella.

Kerätään 100 ml:n tilavuus, sen jälkeen nylvästä kehitetään samalla liuotinsysteemillä, samalla virtausnopeudella ja kerätään 300 ml:n fraktioita, kunnes el 110itujen fraktioiden tilavuus on 18,3 1 ja tämän jälkeen kerk-30 tään 500 ml:n fraktioita, kunnes kokonaistilavuus on 31,3 1. Eluoidut fraktiot tarkistetaan analyyttisellä llPLC-menetelmällä, yhdistetään tekijäpitoisuuden mukaan ja tiirataan UPLC-menetelmällä, jolloin saadaan seuraa-vat tulokset: 30 6υ022 en •H J- ro o \D CO rH O Cv o ro C :co ω i ·- J- O J- oo <AJ j- o ,_t ir, vo h O ίι E ,-± .—i r—I c\) ro m o ~t ro

OM :nj '-sr'"* rH

o :ctj <M

..V. E* M

-----:exJ

+ rO -H

+ t; O- VL) < O C\l O- Λ 0) CO ''~N· ·" ·“·«-**+>

vc -s ω o I I I I I I I rO rH rO CO

'-O -H E ,J CM vO

i—· OM v—' ι-Γι

'' - 1' VO

£ +-> M) r-t + cv, ^ + <d cl -e. λ φ CC :cc ·- i—I CO CM v£) rH CO O vO ΓΟ Q) VO *' L Cuj vO I r- r- r~ *' ' r- r * r- p vO -H F: -O CM r-l CT) O- ΓΟ O- O Λ CO ro tn rH CM , M CM ro O J- -rl \ 0) rH Ti

< P

CCS

,π ai

"f" I—I I—1 -P

+ -< d) -M

vO U\ J- CM sD Uv TO CM 0) H

CP :cd '— r' r r· , r- r r p Q) \D ·ο ω co Λ an co o\ J- rH i ι ι ι i tn om O -H F '-O rH 3 f-,

f—I -is! —p O

\ CL· <D

t, p p, — --------------------- ___ ----------------------=___ c: £ ·.· + CD Λ!

vO CO O -H

CO M 0 .r-, vC vQ ro CM U'· pf 0) P, Ό :cC - ~ „ - ^ _y Ή —4 , h CO O O O O CO o to CO vO 0' o cc Ό -H rH r\| VO, no C CD CL)

S -O OM tn O

(D -H +J

p C r-ι h

------— ------------ - _ — _ Ci) f—I CD

•h cu + o<! ai c

vO CM OM -PO

CO -0 -n ,C M

Ό O CM CO vD tO— CO -o -H c

Otcd ·' r· r r- ·-·,».*- p, (Λ il

rH "-3 r-< OO^Ot>-VlA\OOCMO OM o -H

\ H P- CM CM Uh CO O O O' O- „T rH C cO Λ! M OM I— I CU rH -rt

CD P rH -H

Λ P> tn ai Q.

•H F

-------------------------------------------------- rH 03 Cl

+ rH CO CD

O rH. φ -p CD

^ ‘M CD P p

VL) Λ CO CM _.f -P Q) -P

VD) -Cd * r, «, r, . CI p> p rH --J ΓΗ, O o ro CM Vrv rO O O O O O 0 '.en 'P ·Η ι—I CA CO D— -O- r I tn !>ä Cl

Cj 00. rH -P -rl cu :3 vh Ό " M p p ω ρ ----------------------------------------——- — -— p ttj , CU -rH Ό HD Λ -H .O HD rH lr\ rC‘ ro αθ .H rn Ον! P Cl m -¾ ^ ς M VH .J OJ CM es·, ro rr·) _j vrv -o 'O vO en :cd a3

'Ό Φ ™ CO M 2 03 -.cd P

mo ’g.'o · .a +1 ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι rH n w 1—^ F *' ^ m § ® U! \ o S S 'K -¾ 0 rrv un o. exj cm ho σ, av av o , j + + .H^cncncDE^rHCMCMCMrOrOrOpt'IPvOvO +

Claims

6:5022

1. Sörensen-puskurilla pH 6,0 kyllästetty n-butanoli 0,00 30 2) vedellä, joka sisältää 2% p-tolueenisulfoni- happoa»kyllästetty n-butanoli 0,00 6-3022 3. vedellä, joka sisältää 2% ammoniumhydrok- sidia, kyllästetty n-butanoli 0,00 4. n-butanoiilla kyllästetty Sörensen- puskuri pH 6,0 0,05 5 5) n-butanoli:metanoli:vesi 4:1:2 0,48 6. vedellä kyllästetty etyyliasetaatti 0,00 7. n-butanoli:etikkahappo:vesi 2:1:1 0,44 ; H) seuraavat R^-arvot piihappogeeli-ohutkerroskromato-grafiasysteemeissä:

10 Eluointisysteemi (til./til./til.) R^-arvo I) vesipitoinen 2,5% HCOONHu:CH3CN , 65: 35* 0,32 2. n-butanoli:etikkahappo:vesi 4:2:5 0,80 3. n-butanoli:etikkahappo:vesi 4:2:5 0,52 4. n-propanoli:n-butanoli:IN NH^OH 0,12 15 5) n-butanoli:etikkahappo:vesi 4:1:5 0,15 levyt 1 ja 2 ovat silanoituja piihappogeeli 60 ^254' levyjä; levyt 3, 4 ja 5 ovat piihappogeeli 60 ς4~levyjä; (* sisäiset standardit: kaffeiini 0,60, kortisoni R^-0,35, deksametasoni R^. 0,30);

20 I) aminohappoanalyysi, happohydrolyysin jälkeen 5N kloorivetyhapossa 110°C:ssa 6 tuntia, osoittaa ainakin seuraavien aminohappojen esiintymisen: alaniini, leusiini, glysiini, asparagiinihappo, fenyylialaniini , ornitiini, p-hydroksifenyyliglysiini ja hydroksi-, kloori-substituoitu 25 fenyyliglysiini ; J) happohydrolysaatin, 2 tunnin kuluttua 2N H^SO^^sä 100°C:ssa, hiilihydraattianalyysi osoittaa, että läsnä on D-mannoosia; K) retentioaika (tR) 6' 84^qqi» » analysoitaessa kään- 30 teisfaasi-korkeapainer.estekromatografisesti käyttäen ei- -polaarista, oktadekyylisilaani-käänteisfaasi-kolonnia (3,9 mm ID x 300 mm) ja seosta HCOONH^ 0,025M / CH3CN, 60/40 (til./til.) liikkuvana faasina, virtausnopeuden ollessa 2 ml/min (sisäiset standardit: antraseeni tD 35' 35 18/loo” * °^“nitronaftaleeni tR 11' Roineeni tR 8* 64/10qi1), 38 6:3022

1. Sörensen-puskurilla pH 6,0 kyllästetty 25 n-butanoli 0,00 2. vedellä, joka sisältää 2 % p-tolueenisulfoni- happoa, kyllästetty n-butanoli 0,00 3. vedellä, joka sisältää 2 % ammoniumhydroksi- dia, kyllästetty n-butanoli 0,00 30 4) n-butanolilla kyllästetty Sörensen- puskuri pH 6,0 0,05 5. n-butanoli:metanoli:vesi 4:1:2 0,48 6. vedellä kyllästetty etyyliasetaatti 0,00 6 .)022 7. n-butanoli:etikkahappo:vesi 2:1:1 0,44 ; H) seuraavat Rf-arvot piihappogeeli-ohutkerroskromato-grafiasys teemeissu : Liuoin tisys teerni (til./'til./til.) R^-arvo 5 1) vesipitoinen 2,5% KCOONH^: Cii CN, 65:35* 0,40 2. n-butanoli:etikkahappo:vesi 4:2:5 0,80 3. n-butanoli:etikkanappo:vesi 4:2:5 0,52 4. n-propanoli : n-butanoli : IN Nil OH 2:3:4 ylempi faasi 0,12 1C 5) n-butanoli:etikkahappo:vesi 4:1:5 0,13 levyt 1 ja 2 ovat silanoituja piihappogeeli 60 F^^-le-vyjä, levyt 3, 4 ja 5 ovat piihappogeeli 60 levyjä; (* sisäiset standardit: kaffeiini 0,60¾ kortisoni 0,35¾ deksametasonL 0,30)¾

15 I) aminohappoanalyysi, happohydrolyysin jälkeen 6N kloorivetyhapossa 110°C:ssa 6 tuntia, osoittaa ainakin seuraavien aminohappojen esiintymisen: alaniini, leusii-ni, glysiini, asparagiinihappo, fenyylialaniini, orni-tiini, p-hydroksi-fenyyliglysiini ja hydroksi-, kloori-20 -substituoitu fenyyliglysiini¾ J) happonydrolysaatin, 2 tunnin kuluttua 2N HLÖ: o . . . ^ ssä 100 C:ssa, hnlihydraattianalyysi osoittaa, että D-mannoosia on läsnä*, K) retentioaika (t.,) 3* 34/ ,,, analysoitaessa K -LUU 25 käänteisfaasi-korkeapainenestekromatografisesti käyttäen ei-polaaris ta, ok fedekyyli silaani-kää nteis f aasi-kolonnia (3,9 mm ID x 300 mm) ja seosta HCOONh^ 0,025M/CH, 60/40 (til./til.) liikkuvana faasina, virtausnopeuden ollessa 2 ml/min (sisäiset standardit: antraseeni t0 35' )8/,-,,,,¾ 30 c<-nitronaftaieeni tR 1]' i4/1CQii·» tolueeni tR 8' 6 4/ Q,, ), ja naiuttessa, uusi antibiootti A/1C686 tekijä vapaana emäksenä tai myrkyttömänä fysiologisesti hyväksyttävänä nappoadditiosuolana, jolla antibiootilla on vapaan emäksen muodossa seuraavat tunnusmerkit:

36 A) valkea, amorfinen jauhe, joka sulaa, samalla hajoten, noin 220^:333¾ - — - r ·: 36 6 502 2 Β) hyvin liukeneva veteen, dimetyyliformamidiin ja vesipitoiseen metanoliin, liukeneva metanoliin ja etanoliin, mutta liukenematon etyylieetteriin, petrolieetteriin ja bentseeniin;

5 C) likimääräinen alkuaineanalyysi: 48,41% hiiltä; 5,84% vetyä; 9,09% typpeä; 1,68% klooria (kokonaispitoisuus); 1,16% kloori-ioneja; jäännös 9,1%; D) infrapuna-absorptiospektrissä nujolissa seuraavat havaittavat absorptiomaksimit: 3290, 2930 ja 2860 (nujoli), 10 1765, 1635, 1510, 1455 ja 1375 (nujoli), 1260, 1240, 1175, 1100, 1060, 1020, 975, 840 ja 805 cm"1; E) ultraviolettiabsorptiospektrissä seuraavat absorptiomaksimit: a) neutraalimetanoiissa 15 234 nm (Ε*% = 147) lcm 267 nm (E?-% = 74) lcm b) metanolissa, joka sisältää 0,1N HCl:ää 2 32 nm (E*% = 132) lcm 270 nm (εΓ* = 76) xcm 20 c) metanolissa, joka sisältää 0,1M NaOHita 1 nm (il= 202 ) lcm 29. nm (o Ik a) ; F) ominaiskierto = + 50 +_ 4° (c = 0,48, HC1 N/100); G) seuraavat Rj.-arvot paperikromatografiässä Whatman

25 No 1 paperilla, käytettäessä osoitusorganismina B.subtilis ATCC 6633:a : Eluointisysteemi (til./til./til.) Rj.-arvo

1. Sörensen-puskurilla pH 6,0 kyllästetty n-butanoli 0,00 2. vedellä, joka sisältää 2% p-tolueenisulfo- 15 nihappoa, kyllästetty n-butanoli 0,00 3. vedellä, joka sisältää 2% ammoniumhydrok- sidia, kyllästetty n-^utanoli 0,00 4. n-butanolilla kyllästetty Sörensen- -puskuri pH 6,0 0,05 20 5) n-butanoli:metanoli:vesi 4:1:2 0,48 6. vedellä kyllästetty etyyliasetaatti 0,00 7. n-butanoli:etikkahappo:vesi 2:1:1 0,44 ; H) seuraavat R^-arvot piihappogeeli ohutkerroskroma-tografiasys teemeissä:

25 Eluointisysteemi (til./ til./til.) R^-arvo 1. vesipitoinen 2,5% HCOONH^:CHgCN , 65:35* 0,36 2. n-butanoli:etikkahappo:vesi, 4:2:5 0,80 3. n-butanoli:etikkahappo:vesi, 4:2:5 0,52 4. n-propanoli:n-butanoli:IN NH.OH 2:3:4 30 (ylempi faasi) 0,12 5. n-butanoli:etikkahappo:vesi 4:1:5 0,15 levyt 1 ja 2 ovat silanoituja piihappogeeli 60 F^^^'levy-jä, levyt 3,4 ja 5 ovat piihappogeeli 60 F^^^-levyjä; (* sisäiset standardit: kaffeiini R^ 0,60, kortisoni R^ 35 0,35 , deksametasoni R^. 0,30) \ 6 502 2 I) aminohappoanalyysi, happohydrolyysin jälkeen 6N kloori vetyhapossa 110°C:ssa 6 tuntia, osoittaa ainakin seuraa-vien aminohappojen olevan läsnä: alaniini, leusiini, gly-siini, asparagiinihappo, fenyylialaniini, ornitiini, p-hyd- 5 roksifenyyliglysiini ja hydroksi-, kloori-substituoitu fenyy liglysiini; J) happonydrolysaatin, 2 tunnin kuluttua 2N J^SO^issä 100°C:ssa, hiilihydraattianalyysi osoittaa, että läsnä on D-mannoosia^

10 K) seuraavat tunnusomaiset reaktiot: ninhydriini (3% etanoliliuos) positiivinen Molish positiivinen Biureetti positiivinen Millon negatiivinen 15 1 % FeCl» - 1% K.Fe(CN)_vesipitoinen vihreä väri o o b KMnO^ (hapan) positiivinen !iS0^ väk. negatiivinen, ja L) retentioaika (tR) on 4' 99/100", analysoitaessa 20 käänteisfaasi-korkeapainenestekromatografisesti, käyttäen ei-polaaris ta, oktadekyylisilaani-käänteis faasi-kolonnia (3,9 mm ID x 300 mm) ja seosta HCOONH^ 0,025M / CH^CN, 60/40 (til./til.) liikkuvana faasina, virtausnopeuden ollessa 2 ml/min (sisäiset standardit: antraseeni tR 35' 25 18//100"’ o<-nitronaftaleeni tR 11' l^igo"’ tolueeni tR 8' 6M/100„), ja hydrokloridin muodossa seuraava tunnusmerkki: M) sulamispiste noin 250°C (samalla hajoten), ja haluttaessa, uusi antibiootti A/16686 tekijä vapaana 30 emäksenä tai myrkyttömänä fysiologisesti hyväksyttävänä happoadditiosuolana, jolla antibiootilla on vapaan emäksen muodossa seuraavat tunnusmerkit: A) valkea, amorfinen aine, joka sulaa, samalla hajoten, noin 210-220°C:ssa;

35 B) hyvin liukeneva veteen, dimetyyliformamidiin ja vesipitoiseen metanoliin; liukeneva metanoliin ja etanoliin^ mutta liukenematon etyylieetteriin, petrolieetteriin ja bentseeniin\ _ Γ" 6:5022 C) likimääräinen alkuaineanalyysi; 50,31% hiiltä, 6% vetyä, 9,92% typpeä, 1,61% klooria (kokonaispitoisuus), 0,90% kloori-ioneja, jäännös 6,07%; D) infrapuna-absorptiospektrissä nujolissa havaitaan 5 seuraavat absorptiomaksimit: 3290, 2930 ja 2860 (nujoli), 1765, 1630, 1510, 1455,ja 1375 (nujoli), 1260, 1235, 1175, 1150, 1130, 1060, 1015, 975, 840 ja 810 cm"1; E) ultraviolettiabsorptiospektrissä on seuraavat ab sorptiomaksimit : 10 a) neutraalimetanolissa 233 nm (E1' = 202) lcm 266 nm (E1% = 106) lcm b) metanolissa, joka sisältää 0,1N HCl:ää 232. nm (E1^ = 219) 15 270 nm (E1% = 110) lcm c) metanolissa, joka sisältää 0,1N NaOHita 251 nm (E1% = 264) lcm rv 290 nm (olka) F) ominaiskierto = + 57 + 4° (c = 0,51, H20);

20 G) seuraavat R^-arvot paperikromatografiässä Whatman No 1 paperilla, käytettäessä^soitusorganl smina B.sub-tilis ATCC 6633:a : Eluointisysteemi (til,/til./til.) Rf-arvo

1. Menetelmä valmistaa uutta antibioottia A/16686 tekijä Aj sekä rinnakkaistuotteina saatavia antibiootteja A/16686 tekijä A^ ja A3 viljelemällä kantaa Actinoplanes sp. ATCC 5 33076 submersisissa, aerobisissa käymisolosuhteissa, vesi pitoisessa ravintoväliaineessa, joka sisältää assimiloituvan hiili- ja typpilähteen ja epäorgaanisia suoloja, kunnes on tuotettu huomattava määrä antibioottista aktiviteettia, joka otetaan talteen käymisen lopussa uuttamalla 10 myseelimassa orgaanisella liuottimena, joka on jokin alem pi alkanoli tai asetoni, tunnettu siitä, että saadusta antibioottisesta kompleksista A/16686 erotetaan kromatografisesta uusi antibiootti A/16686 tekijä A^ ja eristetään pääasiassa puhtaana yksittäisenä antibioottina, 15 joka on vapaa emäs tai myrkytön fysiologisesti hyväksyttävä happoadditicsuola ja jolla on vapaan emäksen muodossa seuraavat tunnusmerkit: A) valkea,amorfinen jauhe, joka sulaa, samalla hajoten, noin 210-220°C:ssa; 20 6) hyvin liukeneva veteen, dimetyyliformamidiin, vesipitoi seen metanoliin ja 0,1N HCl:ään; heikosti liukeneva absoluuttiseen etanoliin ja butanoliin; ja saostuu vesipitoisesta liuoksesta lisättäessä NaHCO^.'lla kyllästettyä liuosta; C) likimääräinen alkuaineanalyysi: 54,57% hiiltä, 6,19 % 25 vetyä, 10,88 % typpeä ja 1,37 % klooria; D) infrapuna-absorptiospektrissä nujolissa havaitaan seuraavat absorptiomaksimit: 3290, 2930 ja 2860 (nujoli), 1765, 1635,1510, 1455 ja 1375 (nujoli), 1240, 1175, 1130, 1060, 1015, 975, 840 ja 815 cm”1;

30 E) ultraviolettiabsorptiospektrissä on seuraavat absorptiomaksimit: a) neutraalimetanolissa 1% 234 nm (K =206) lcm 1% 268 nm (E = 114) lcm __ π:: 6-5022 b) metanolissa, joka sisältää 0,1N HCl:ää 233 nm (eJ-% = 192) lcm 271 nm (E** = 93) lcm c) metanolissa, joka sisältää 0,1N NaOH:ta 5 251 nm (E*% = 275) lcm 300 nm (olka) \ F) ominaiskierto = + 73 + 4° (c = 0,49, H^O); G) seuraavat R^-arvot paperikromatografiässä Whatman Mo 1 paperilla, käytettäessä osoitusorgnisminä

10 E.subtilis ATCC 6633:a : Eluointisysteemi (ti 1./ti 1./ti 1.) R^-arvo

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että uuttoliuotin on metancli.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antibiootti A/16686 tekijä A2 5 erotetaan pylväskromatografisesti, käyttäen synteettis tä, ristiinkytkettyä polystyreeni-polymeeri-pylvästä ja eluointisysteeminä veden ja asetonitriiIin seoksia tai vesipitoisen ammoniumformiaatin ja asetonitriilin seoksia.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että kaikki kolme tekijää A^ , A^ ja A^ eristetään erikseen.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai *+ mukainen menetelmä, tunne ttu siitä, että erottaminen suoritetaan kään-15 teisfaasi-korkeapainenestekromatografisesti, käyttäen ei- -polaarista, oktadekyylisilaarti-käänteisfaasikolonnia ja vesipitoisen ammoniumformiaatin ja asetonitriilin seoksia erilaisissa suhteissa liikkuvana faasina. i 6 -5022 PATEMTKRAV