FI64600B - LITHUANIAN CLAVULANATE FOR OIL DEVELOPMENT OF RAVING AV KLAVULANSYRA OCH DESS DERIVAT - Google Patents

Description

\ l-Vyn,—-1 rBl KUULUTUSjUUKAlSU / < /;λλ\ l-Vyn, —- 1 rBl ADVERTISEMENT / </; λλ

Wa [bj (11) utläggningsskrift 6 4oUUWa [bj (11) utläggningsskrift 6 4oUU

^ (51) K'r.iw.^nt.a3 C 07 D 4-98/04- SUOMI—FINLAND (21) Pfflttlh»k«mu« — Pitt>w«efcnln| 802142 (22) H»k*ml*ptlyt —An»0knlnf»d·* 03-07.00 (23) AtkupUvt—Glltljh*t*dtf 06.02.76 (41) Tullut julkiseksi — Bllvlt offsntllj 03.07.80^ (51) K'r.iw. ^ Nt.a3 C 07 D 4-98 / 04- FINLAND — FINLAND (21) Pfflttlh »k« mu «- Pitt> w« efcnln | 802142 (22) H »k * ml * ptlyt —An» 0knlnf »d · * 03-07.00 (23) AtkupUvt — Glltljh * t * dtf 06.02.76 (41) Has become public - Bllvlt offsntllj 03.07.80

Patentti· ja reklsterihallfan (44) Nthttvtkslpanon js kuuLJulk»i»uii pvm. — οι nfiThe date of publication of the Patent and Advertising Office (44) and the date of publication. - οι nfi

Patent· och regifterstyreleen 7 AmOkan utlajd oeh utUkrHten publlcurad JX.uu.uj (32)(33)(31) Pyydetty utuolkuu*—B«flrd prtoritut 07-02.75 17.03.75 Englanti-England(GB) 5^09/75 11076/75 (71) Glaxo Laboratories Limited, Greenford, Middlesex, Englanti-England(GB) (72) Ian Dunlop Fleming, Chalfont St. Peter, Buckinghamshire, David Noble,Patent · och regifterstyreleen 7 AmOkan utlajd oeh utUkrHten publlcurad JX.uu.uj (32) (33) (31) Requested utuolkuu * —B «flrd prtoritut 07-02.75 17.03.75 English-England (GB) 5 ^ 09/75 11076 / 75 (71) Glaxo Laboratories Limited, Greenford, Middlesex, England-England (GB) (72) Ian Dunlop Fleming, Chalfont St Peter, Buckinghamshire, David Noble,

Marlov, Buckinghamshire, Hazel Mary Noble, Marlow, Buckinghamshire,Marlov, Buckinghamshire, Hazel Mary Noble, Marlow, Buckinghamshire,

Wilfred Frank Wall, High \tycomhe, Buckinghamshire, Englanti-England(GB) (7M Oy Kolster Ab (54) KL a viilaani hapon ja sen johdannaisten puhdistamisessa käytettävä litium-klavulanaatti - Litiumklavulanat för användning vid rening av klavulan-syra och dess derivat (62) Jakamalla erotettu hakemuksesta 760285 (patentti 63580) -Avdelad fr in ansökan 760285 (patent 63580) Tämä keksintö käsittelee puhtaan klavulaanihapon tuottamiseen käytettävää kiteisessä muodossa olevaa litiumklavulanaattia, joka on käyttökelpoinen välituote valmistettaessa puhdasta klavulaani-happoa tai sen johdannaisia.Wilfred Frank Wall, High \ tycomhe, Buckinghamshire, England-England (GB) (7M Oy Kolster Ab (54) KL lithium clavulanate for the purification of filanic acid and its derivatives - Lithium clavulan for the purpose of refining the clavulan-cyanide and derivatives ( This invention relates to lithium clavulanate in crystalline form for the production of pure clavulanic acid, which is a useful intermediate in the preparation of pure clavulanic acid or its derivatives.

Streptomyces clavuligerus-kantaa NRRL 3$85 viljelemällä saadaan useita antibiootteja. GB-patentissa 1 315 177 on kuvattu Streptomyces clavuligerus-kannan NRRL 3585 viljely ja viljelyliemestä eristetyt antibiootit A 16886 I ja A 16886 II.Culturing of Streptomyces clavuligerus strain NRRL 3 $ 85 yields several antibiotics. GB patent 1,315,177 describes the cultivation of Streptomyces clavuligerus strain NRRL 3585 and the antibiotics A 16886 I and A 16886 II isolated from the culture broth.

Samaa organismia viljelemällä voidaan saada vielä yksi antibiootti, nimittäin (2R, 5R, Z)-3-(2-hydroksietylideeni)-7-okso-4-oksa-l-atsabisyklo^3,2,0_7“heptaani-2-karboksyylihappo, jolla on kaava I:By culturing the same organism, another antibiotic can be obtained, namely (2R, 5R, Z) -3- (2-hydroxyethylidene) -7-oxo-4-oxa-1-azabicyclo [3.2.0] heptane-2-carboxylic acid, of formula I:

? JCL CH0OH? JCL CH0OH

rViT‘^v. / .rViT '^ v. /.

/ - ' c», \ i 64600 ja jota seuraavassa nimitetään klavulaanihapoksi./ - 'c », \ i 64600 and hereinafter referred to as clavulanic acid.

Klavulaanihappo muodostaa suoloja emästen kanssa. Näistä voidaan mainita alkalimetallisuolat, esim. natrium-, kalium- ja li-, tiumsuolat; maa-alkalimetallisuolat, esim. kalsium-, magnesium-ja bariumsuolat; ammoniumsuola; ja orgaanisten emästen muodostamat suolat, esimerkiksi primäärisistä, sekundäärisistä tai ter-tiäärisistä N-kvaternäärisistä amiineista johdetut, esim. mono-f di- tai trialkyyliammoniumsuolat kuten metyyliammonium- ja tri-etyyliammoniumsuolat ja heterosyklisten emästen muodostamat suolat kuten piperidiinisuolat.Clavulanic acid forms salts with bases. Of these, alkali metal salts may be mentioned, e.g. sodium, potassium and lithium salts; alkaline earth metal salts, e.g. calcium, magnesium and barium salts; ammonium salt; and salts formed by organic bases, for example those derived from primary, secondary or tertiary N-quaternary amines, e.g. mono-f di- or trialkylammonium salts such as methylammonium and triethylammonium salts and salts formed by heterocyclic bases such as piperidine salts.

( Epäorgaanisten emästen muodostamat suolat ja useimmat orgaa- t t nisten emästen muodostamista suoloista ovat yleensä stabiilimpia vesiliuoksessa kuin vapaa klavulaanihappo. Suolat voivat esiintyä i f solvaattien muodossa, so. niiden kiderakenne voi sisältää vettä ί ja/tai muuta liuotinta.(Salts formed by inorganic bases and most of the salts formed by organic bases are generally more stable in aqueous solution than free clavulanic acid. The salts may exist in the form of solvates, i.e. their crystal structure may contain water and / or other solvent.

| Klavulaanihapon ja sen suolojen tuottaminen puhtaina on tä- I hän asti ollut vaikeata.Se on yleensä sisältänyt jopa 25 %, tavaili lisemmin noin 15 % painosta valmistuksen yhteydessä syntyneitä epä- ί puhtauksia ja isomeerejä.| The production of clavulanic acid and its salts in pure form has hitherto been difficult. It has generally contained up to 25%, more preferably about 15% by weight, of the impurities and isomers formed during the preparation.

| Puhtaamman klavulaanihapon tuottaminen on siten olennai- l nen edistysaskel. On todettu, että esimerkiksi puhtaudeltaan 98-%: | sta tai sitäkin puhtaampaa klavulaanihappoa saadaan valmistamalla \ litiumklavulinaattia kiteisessä muodossa. Sen puhtausastetta osoit- f * tavat molaarinen ekstinktiokerroin, joka on vähintään 16,200 määri- I ^ ; tettynä 259-1 nm alueella 0,1-m NaOH-vesiliuoksessa, molaarinen s kiertokyky vesiliuoksessa, joka on vähintään +137-5°, suclas- ' D ^ | ta vapautetun hapon ekstinktiokerroin, E. 0,1-n NaOH-vesiliuok-‘ lcm 24 | sessa, 590 tai suurempi ja optinen ominaiskierto /b( /D dimetyyli- f o sulfoksidissa, joka on noin +54 . On huomattava, että klavulaanihapon tuottaminen näin puhtaana on tärkeätä tuotteita käytettäessä farmaseuttisissa ja eläinlääketieteellisissä valmisteissa ja on erittäin suotavaa sitä käytettäessä välituotteena. Termi "puhtaus" tässä käytettynä tarkoittaa klavulaanihapon ja/tai sen suolan pai-noprosenttiosuutta koko kiinteän aineen painosta, jolloin tuotteeseen sitoutunutta vettä tai muuta liuotinta ei oteta huomioon kokonaispainossa.| The production of purer clavulanic acid is thus an essential step forward. It has been found, for example, to be 98% pure: or purer clavulanic acid is obtained by preparing \ lithium clavulinate in crystalline form. Its degree of purity is indicated by a molar extinction coefficient of at least 16,200 as determined; carried out in the range of 259 to 1 nm in 0,1 m aqueous NaOH, molar rotation in an aqueous solution of at least + 137-5 °, suclas- 'D ^ | extinction coefficient of the liberated acid, E. 0.1 cm aqueous NaOH 24 cm 24 | 590 or greater and an optical specific rotation / b (/ D in dimethylfo-sulfoxide of about +54. It should be noted that the production of clavulanic acid in such purity is important when used in pharmaceutical and veterinary preparations and is highly desirable when used as an intermediate. The term " "purity" as used herein means the percentage by weight of clavulanic acid and / or its salt in the total weight of the solid, the water or other solvent bound to the product being disregarded in the total weight.

Klavulaanihapolla ja sen suoloilla on antibakteerinen vai- 64600 kutus joukkoon gram-negatiivisia ja gram-positiivisia mikro-organismeja, esimerkiksi Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shighella sonnei, Enterobacter cloacae, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis.Clavulanic acid and its salts have antibacterial activity against a number of gram-negative and gram-positive microorganisms, for example Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shighella sonnei, Enterobacter cloacae, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis.

Klavulaanihappo ja sen suolat voidaan eristää Streptomyces clavuligerus kannan NRRL 3585 viljelyliemestä GB-patentissa 1 315 177 kuvatulla menetelmällä, jossa fraktiointimenettelyä käyttämällä epäpuhtaudet, kuten proteiinit, entsyymit ja erityisesti muut β-laktaamiantibiootit poistetaan liuoksesta. Tässä puhdistusmenetelmässä ei kuitenkaan erilaisia β -laktaamikarboksyyli-happoja, kuten edellä mainittujen antibiootteja A 16886 I ja II samanlaisesta käyttäytymisestä johtuen saada erotettua. Antibiootin eristäminen voidaan kuitenkin suorittaa helposti muuttamalla klavulaanihappo tai sen suola litiumklavulanaatiksi ja saostamalla litiumklavulanaatti kiteisessä muodossa. Klavulanaatti-ionien ja litiumionin välisestä suuresta affiniteetista johtuen saostuu mukana vähän tai ei lainkaan merkittäviä epäpuhtauksia, kuten muita /3 -laktaameja. Eristämällä suoraan suola, ts välttämällä kla-vulaanihapon muuttaminen orgaaniseksi johdannaiseksi kuten esteriksi ja siitä uudelleen hapoksi, voidaan välttää klavulaanihapon toisiintuminen isomeereiksi. On huomattu, että klavulaanihappo-estereiden pelkistävässä lohkaisussa voi muodostua jopa 15 % isomeeristä ainetta.Clavulanic acid and its salts can be isolated from the culture broth of Streptomyces clavuligerus strain NRRL 3585 by the method described in GB Patent 1,315,177, in which impurities such as proteins, enzymes and especially other β-lactam antibiotics are removed from solution using a fractionation procedure. However, in this purification method, various β-lactam carboxylic acids, such as the above-mentioned antibiotics A 16886 I and II, cannot be separated due to their similar behavior. However, isolation of the antibiotic can be easily performed by converting clavulanic acid or a salt thereof to lithium clavulanate and precipitating the lithium clavulanate in crystalline form. Due to the high affinity between clavulanate ions and lithium ion, little or no significant impurities, such as other β-lactams, precipitate. By directly isolating the salt, i.e. by avoiding the conversion of clavulanic acid to an organic derivative such as an ester and re-acidifying it, the conversion of clavulanic acid to isomers can be avoided. It has been found that in the reductive cleavage of clavulanic acid esters, up to 15% of the isomeric substance can be formed.

Olisi huomattava, että käymisliuoksissa ja muissa liuoksissa suunnilleen neutraalissa pH:ssa klavulaanihapon ja sen yhden tai useamman kationin kanssa muodostamien suolojen välillä on tasapainotila ja klavulaanihapon ja/tai sen suolojen eristysmenet-tely riippuu pHtsta ja muista olosuhteista. Yleensä klavulaanihappo ja sen suolat ovat melko epästabiileja vesiliuoksissa pH-alueen 5,5-8 ulkopuolella ja alla kuvatuissa menettelyissä on tarpeellista pitää pH tällä alueella ja edullisesti lähellä noin pHIt should be noted that in fermentation and other solutions at approximately neutral pH, there is an equilibrium between clavulanic acid and its salts with one or more cations, and the method of isolating clavulanic acid and / or its salts depends on pH and other conditions. In general, clavulanic acid and its salts are quite unstable in aqueous solutions outside the pH range of 5.5-8, and in the procedures described below it is necessary to maintain the pH in this range and preferably close to about pH.

6,5, mikäli toisin ei ole ilmoitettu.6.5 unless otherwise stated.

Epäpuhtauksien poistamiseksi klavulaanihappo ja/tai sen suola saatetaan reagoimaan vesiliuoksessa olevan ionisoituneen li-tiumyhdisteen kanssa, jolloin saadaan vesiliuos, joka sisältää litiumklavulanaattia, joka voidaan saostaa ja erottaa vesiliuoksesta.To remove impurities, clavulanic acid and / or its salt is reacted with an ionized lithium compound in aqueous solution to give an aqueous solution containing lithium clavulanate, which can be precipitated and separated from the aqueous solution.

4 646004 64600

Yleensä ionisoituva litiumyhdiste on suola. Litiumkloridi on edullinen, mutta sopivia ovat myös litiumbromidi, -jodidi tai -sulfaatti tai litiumkarboksylaatit, kuten asetaatti, propio-naatti, formiaatti, bentsoaatti tai laktaatti. Suoloin valintaan voivat vaikuttaa muut läsnäolevat aineet. Jos klavulaanihappo on esimerkiksi bariumsuolana, voidaan edullisesti käyttää litium-sulfaattia, jolloin bariumsulfaatti saostuu ennen litiumklavula-naatin saostumista.Generally, the ionizable lithium compound is a salt. Lithium chloride is preferred, but lithium bromide, iodide or sulfate or lithium carboxylates such as acetate, propionate, formate, benzoate or lactate are also suitable. The choice of salts may be influenced by other substances present. For example, if the clavulanic acid is in the form of a barium salt, lithium sulfate can be advantageously used, whereby the barium sulfate precipitates before the lithium clavulanate precipitates.

Litiumklavulanaatin väkevyys ennen saostusta on yleensä vähintään 0,1 paino-% painosta, edullisesti vähintään 2 paino-%, ja suuremmat väkevyydet, esimerkiksi 12 %:iin tai jopa 20 %:iin painosta saakka antavat luonnollisesti suurempia prosentuaalisia saantoja.The concentration of lithium clavulanate before precipitation is generally at least 0.1% by weight, preferably at least 2% by weight, and higher concentrations, for example up to 12% or even 20% by weight, naturally give higher percentage yields.

Puhdistettava klavulaanihapon suola voi olla esimerkiksi alkalimetallisuola (kuten natrium- tai kaliumsuola tai jopa litium-suola, jos tämä on läsnä vähäisenä aineosana klavulaanihappomate-riaalissa), maa-alkalimetallisuola (esim. kalsium-, barium- tai magnesiumsuola) tai orgaanisen emäksen muodostama suola, kuten yllä on kuvattu, tai suola, joka on muodostettu emäksisen ionin-vaihtohartsin kanssa.The salt of clavulanic acid to be purified may be, for example, an alkali metal salt (such as a sodium or potassium salt or even a lithium salt if present as a minor component in the clavulanic acid material), an alkaline earth metal salt (e.g. a calcium, barium or magnesium salt) or an organic base. as described above, or a salt formed with a basic ion exchange resin.

Litiumklavulanaatin saostumista helposti erittäin puhtaana voidaan käyttää hyödyksi monella tavalla.The precipitation of lithium clavulanate easily in high purity can be utilized in many ways.

Litiumklavulanaatin ulos suolausLithium clavulanate out of salting

Menetelmän erään sovellutuksen mukaan litiumklavulanaattia sisältävä vesiliuos voi myös sisältää riittävän määrän ionisoitunutta litiumyhdistettä, tavallisesti litiumklavulanaatin muodostamiseen käytettyä litiumsuolaa, jälkimmäisen suoloittamiseksi nostamalla litiumionien väkevyyttä niin, että mainitussa lämpötilassa litiumklavulanaatin liukoisuustulo ylitetään suuresti. Koska klavulanaatti on niukkaliukoisempi alemmissa lämpötiloissa, on yleensä edullista alentaa liuoksen lämpötilaa saostumisen maksimoimiseksi, esimerkiksi noin välille 0-5°C.According to one embodiment of the process, the aqueous solution containing lithium clavulanate may also contain a sufficient amount of an ionized lithium compound, usually the lithium salt used to form lithium clavulanate, to salt the latter by increasing the concentration of lithium ions so that at said temperature the lithium clavulanate solubility product is exceeded. Because clavulanate is sparingly soluble at lower temperatures, it is generally preferred to lower the temperature of the solution to maximize precipitation, for example, between about 0-5 ° C.

Tällaiseen suoloitukseen on ionisoituvan litiumyhdisteen väkevyys litiumklavulanaattia sisältävässä vesiliuoksessa edullisesti 4-10-m, vaikka väkevyydet aina kyllästymiseen asti ovat käyttökelpoisia; edullisempi alue on 5-8-m.For such salting, the concentration of the ionizable lithium compound in the aqueous solution containing lithium clavulanate is preferably 4 to 10 μm, although concentrations up to saturation are useful; a more preferred range is 5-8 m.

Kun ensimmäinen litiumklavulanaattierä on korjattu, saattaa 5 64600 olla edullista väkevöidä liuos edelleen ja korjata toinen erä.After the first batch of lithium clavulanate has been repaired, it may be advantageous to further concentrate the solution and repair the second batch.

Muiden klavulanaattien muuttaminen litiumklavulanaatiksi Litiumklavulanaattia sisältävä liuos voidaan muodostaa yksinkertaisesti liuottamalla veteen klavulaanihapon muu kuin litiumsuo-la, esimerkiksi natrium-, kalium-, magnesium-, barium-, kalsium-tai ammoniumsuola, ja lisäämällä liuokseen vesiliukoinen litium-suola, kuten litiumkloridi. Bariumsuolan ollessa kysymyksessä suuren litiumkloridiväkevyyden käyttö voi johtaa bariumkloridin samanaikaiseen saostumiseen litiumklavulanaatin kanssa. Bariumklo-ridi voidaan kuitenkin poistaa helposti liuottamalla seos uudelleen veteen ja lisäämällä litiumsulfaattia bariumsulfaatin saosta-miseksi, joka voidaan poistaa esimerkiksi suodattamalla, jota seuraa litiumkloridin lisäys puhtaan litiumklavulanaatin saostamiseksi. Litiumklavulanaatin muodostaminen ioninvaihtohartsin avulla Erittäin edullisesti saadaan litiumklavulanaatin vesiliuos, kun klavulaanihapon suola, joka on muodostettu emäksisen ioninvaihto-hartsin kanssa, saatetaan yhteyteen litiumsuolan vesiliuoksen kanssa. Hartsi on tavallisesti pylväässä, johon täytetään epäpuhdas klavu-laanihappo ja/tai sen suola, ja josta litiumklavulanaatin vesi-liuos eluoidaan käyttäen vesiliukoisen litiumsuolan, esim. litiumkloridin, vesiliuosta. Hartsi pestään tavallisesti, esim. vedellä, ennen eluointia.Conversion of Other Clavulanates to Lithium Clavulanate A solution containing lithium clavulanate can be formed simply by dissolving a non-lithium salt of clavulanic acid in water, for example a sodium, potassium, magnesium, barium, calcium or ammonium salt, and adding a water-soluble lithium salt such as lithium chloride. In the case of the barium salt, the use of a high concentration of lithium chloride may lead to the co-precipitation of barium chloride with lithium clavulanate. However, barium chloride can be easily removed by redissolving the mixture in water and adding lithium sulfate to precipitate barium sulfate, which can be removed, for example, by filtration followed by the addition of lithium chloride to precipitate pure lithium clavulanate. Formation of Lithium Clavulanate by Ion Exchange Resin An aqueous solution of lithium clavulanate obtained by contacting an salt of clavulanic acid with a basic ion exchange resin with an aqueous solution of lithium salt is very preferably obtained. The resin is usually in a column packed with crude clavulanic acid and / or a salt thereof, from which an aqueous solution of lithium clavulanate is eluted using an aqueous solution of a water-soluble lithium salt, e.g. lithium chloride. The resin is usually washed, e.g. with water, before elution.

Hartsissa on yleensä amino- tai tertiäärisiä aminoryhmiä (heikosti emäksisiä) tai kvaternäärisiä ammoniumryhmiä (vahvasti emäksisiä). Hartsi voi olla esimerkiksi polystyreeni-, polyakryyli-, epoksi-polyamiini-, fenolipolyamiini- tai haarautunut dekstraani-hartsi ja se voi olla makroverkkoutettu tai mikroverkkoutettu.The resin generally has amino or tertiary amino groups (weakly basic) or quaternary ammonium groups (strongly basic). The resin may be, for example, a polystyrene, polyacrylic, epoxy-polyamine, phenol-polyamine or branched dextran resin, and may be macro-crosslinked or micro-crosslinked.

Termiin "hartsi" sisältyvät tässä myös selluloosajohdannaiset ja yllämainitut dekstraanijohdannaiset, jotka on johdettu luonnossa esiintyvistä polymeereistä. Tyypillisiä heikosti emäksisiä ioninvaihtohartseja ovat Amberlite IRA68 (mikroverkkoutettu: poly-akrylaatti verkkouttajana divinyylibentseeni: tertiäärisiä aminoryhmiä) , Amberlite IRA93 (makroverkkoutettu: polystyreeni verkkouttajana divinyylibentseeni: tertiäärisiä aminoryhmiä), (Rohm &The term "resin" as used herein also includes cellulose derivatives and the aforementioned dextran derivatives derived from naturally occurring polymers. Typical weakly basic ion exchange resins are Amberlite IRA68 (microcrosslinked: polyacrylate crosslinker divinylbenzene: tertiary amino groups), Amberlite IRA93 (macrocrosslinked: polystyrene crosslinker divinylbenzene) tertiary amino groups

Haas (U.K.) Ltd.). Tyypillisiä vahvasti emäksisiä ioninvaihtohartseja ovat Zerolit FF ja Zerolit FF(IP) (Zerolit Co. Ltd.).Haas (U.K.) Ltd.). Typical strongly basic ion exchange resins are Zerolit FF and Zerolit FF (IP) (Zerolit Co. Ltd.).

6 646006 64600

Emäksiset ioninvaihtohartsit ovat edullisesti suolan muodossa, kun ne saatetaan epäpuhtaan klavulaanihapon ja/tai suolan kanssa kosketukseen; anioni on edullisesti sama kuin eluenttina käytetyssä litiumsuolassa, sopivasti kloridi-ioni, mutta eri anio-neja voidaan käyttää ilman merkittäviä haittavaikutuksia.Basic ion exchange resins are preferably in the form of a salt when contacted with impure clavulanic acid and / or a salt; the anion is preferably the same as the lithium salt used as eluent, suitably the chloride ion, but different anions can be used without significant side effects.

Eluenttina käytetyn litiumsuolan vesiliuoksen väkevyys on edullisesti 0,02-8-m alempien väkevyyksin antaessa kuitenkin hyvin laimeita litiumklavulanaattiliuoksia ja aiheuttaessa seuraa-van saostumisen vaikeutumisen. Yleensä väkevyydet alueella 0,5-2,5-m ovat edullisia.However, the concentration of the aqueous solution of the lithium salt used as eluent is preferably 0.02-8 m at lower concentrations, giving very dilute lithium clavulanate solutions and causing the subsequent precipitation to be difficult. In general, concentrations in the range of 0.5-2.5 m are preferred.

Kun adsorbointi/eluointi-menettely yleensä suoritetaan siten, että haluttu tuote erotetaan kromatografisesti muusta adsorboituneesta aineesta, niin tässä tapauksessa seuraavan saostamisvaiheen ollessa erittäin tehokas erotettaessa litiumklavulanaatista häiritsevät epäpuhtaudet, on yleensä edullista käyttää eluentissa suhteellisen suuria litiumsuolaväkevyyksiä. Näin pylvääseen saadaan kapea klavulanaattivyöhyke, joka voidaan eluoida suhteellisen pienellä eluenttitilavuudella, mikä mahdollistaa seuraavan saostami-sen.When the adsorption / elution procedure is generally carried out in such a way that the desired product is chromatographically separated from the other adsorbed material, in this case the next precipitation step is very effective in separating interfering impurities from lithium clavulanate, it is generally advantageous to use relatively high lithium salt concentrations in eluent. This gives the column a narrow zone of clavulanate which can be eluted with a relatively small volume of eluent, which allows the next precipitation.

Eluaatti sisältää yleensä litiumsuolaa, esim. litiumklori-dia väkevyydessä 0,5-2,5-m, kun taas pois suolauksella saadaan tehokkaimmillaan väkevyyksiä 5-10-m. Siksi on edullista väkevöi-dä eluaatti esimerkiksi haihduttamalla tyhjössä, esim. noin 5-ker-taisesti. Litiumklavulanaatin liukoisuus noin 20°C:ssa eri väkevyyksissä litiumkloridin vesiliuoksissa on annettu seuraavassa taulukossa:The eluate generally contains a lithium salt, e.g. lithium chloride at a concentration of 0.5-2.5 m, while off-salting gives concentrations of 5-10 m at its most effective. Therefore, it is preferable to concentrate the eluate, for example by evaporation in vacuo, e.g. about 5 times. The solubility of lithium clavulanate at about 20 ° C in various concentrations in aqueous lithium chloride solutions is given in the following table:

Taulukko 1table 1

LiCl-molaarisuus Litiumklavulanaatin liukoisuus _mg/ml (suunnilleen)_ 2.5 23,5 3,75 10,2 5,0 4,1 6,25 1,8 7.5 0,8LiCl molarity Solubility of lithium clavulanate _mg / ml (approximately) _ 2.5 23.5 3.75 10.2 5.0 4.1 6.25 1.8 7.5 0.8

Edellämainittu väkevöinti on litiumsuolalisäystä edullisempi, koska myös litiumklavulanaatti väkevöityy, ja emäliuos- 7 64600 tappiot siten vähenevät. Adsorboituneiden epäpuhtauksien eluoituulisen vähentämiseksi hartsista voi olla edullista sisällyttää eluenttiin veteen sekoittuvaa orgaanista liuotinta väkevänä. Vaihtoehtoisesti, kun eluointi on suoritettu käyttämättä tällaista liuotinta, tämä voidaan lisätä eluaattiin eluoitujen epäpuhtauksien saostamiseksi ja sakka erottaa ennen jatkokäsittelyä. Liuotin voi olla esimerkiksi ketoni, kuten asetoni, alkoholi, kuten meta-noli, etanoli, isopropyylialkoholi tai etyleeniglykoli, eetteri, kuten dioksaani tai tetrahydrofuraani tai substituoitu amidi, imi-di tai sulfoksidiliuotin kuten dimetyyliformamidi tai dimetyylisulf-oksidi. Yleensä alkoholit ovat edullisia tällaisina liuottimina, esim. etanoli tai isopropyylialkoholi. Tällaisten tarpeettomien epäpuhtauksien erottamiseksi alkoholin edullinen väkevyys eluentissa tai eluaatissa alkoholilisäyksen jälkeen on välillä 70-97 % tilavuudesta.The above-mentioned concentration is more advantageous than the addition of lithium salt, because lithium clavulanate is also concentrated, and thus the losses of the mother liquor are reduced. To reduce the elution of adsorbed impurities from the resin, it may be advantageous to include a water-miscible organic solvent in the eluent in concentrated form. Alternatively, when elution is performed without the use of such a solvent, this can be added to the eluate to precipitate the eluted impurities and the precipitate is separated before further processing. The solvent may be, for example, a ketone such as acetone, an alcohol such as methanol, ethanol, isopropyl alcohol or ethylene glycol, an ether such as dioxane or tetrahydrofuran or a substituted amide, imide or sulfoxide solvent such as dimethylformamide or dimethyl sulfoxide. In general, alcohols are preferred as such solvents, e.g. ethanol or isopropyl alcohol. To separate such unnecessary impurities, the preferred concentration of alcohol in the eluent or eluate after the addition of alcohol is between 70-97% by volume.

Litiumklavulanaatln saostamlnen käyttäen veteen sekoittuvaa liuotintaPrecipitation of lithium clavulanate using a water-miscible solvent

On huomattava, että mikäli veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen ja litiumsuolojen väkevyys edelläkuvatussa menettelyssä on liian korkea, voi litiumklavulanaatti saostua liian aikaisin. Itse asiassa on mahdollista saostaa litiumklavulanaatti vesi-liuoksesta käyttämällä hyvin suuria väkevyyksiä sellaisia liuottimia ottamalla täten käyttöön vaihtoehtoinen menettelytapa, joka käyttää hyväkseen yllä kuvattua litiumklavulanaatin valikoivan saostuksen etuja. Siten klavulaanihappo ja/tai sen suola voidaan saattaa yhteyteen litiumsuolan kanssa suhteellisen matalassa väkevyydessä joko pylväästä eluoimalla tai liuottamalla suolat yhteen liuokseen ja saamalla haluttu saostuminen tapahtumaan väke-vöimättä lisäämällä veteen sekoittuvaa liuotinta. Täten esimerkiksi alkoholiliuokset väkevyycfeItään vähintään 90 % edullisesti vähintään 95 % ovat tehokkaita litiumklavulanaatin saostamiseksi. Saattaa olla tarpeellista korjata ensimmäinen sato litiumklavula-naattia ja sitten väkevöidä tyhjössä, esim. nelinkertaiseksi, toisen sadon saamiseksi.It should be noted that if the concentration of the water-miscible organic solvent and lithium salts in the above procedure is too high, lithium clavulanate may precipitate too early. In fact, it is possible to precipitate lithium clavulanate from an aqueous solution using very high concentrations of such solvents, thus introducing an alternative procedure which takes advantage of the advantages of selective precipitation of lithium clavulanate described above. Thus, clavulanic acid and / or its salt can be contacted with the lithium salt at a relatively low concentration either by eluting from the column or by dissolving the salts in a single solution and causing the desired precipitation to occur without concentration by adding a water-miscible solvent. Thus, for example, alcohol solutions with a concentration of at least 90%, preferably at least 95%, are effective in precipitating lithium clavulanate. It may be necessary to harvest the first crop of lithium clavulate and then concentrate in vacuo, e.g., fourfold, to obtain a second crop.

Klavulaanihapon suolan valmistus ioninvaihtohartsin avulla Emäksinen ioninvaihtohartsi, johon edellä on viitattu, voidaan täyttää klavulaanihapolla ja/tai suolalla käyttämällä suo- 8 64600 raan käymisliuosta, josta kiinteä aine on aikaisemmin poistettu, esim. suodattamalla tai sentrifugoimalla. Tämä mahdollisuus on olemassa seuraavan litiumsaostusaskeleen huomattavan puhdistus-vaikutuksen ansiosta. Kuitenkin saattaa olla edullista käsitellä liuos kiinteiden aineiden poistamisen jälkeen adsorboivalla hiilellä klavulaanihapon ja/tai suolan adsorboimiseksi; tämä auttaa muiden suolojen erottamista klavulanaatista ja välttää emäksisen ionin-vaihtohartsin turhaa täyttymistä tarpeettomalla ionisoituvalla aineella.Preparation of the clavulanic acid salt by means of an ion exchange resin The basic ion exchange resin referred to above can be filled with clavulanic acid and / or salt using a previously fermented broth solution, e.g. by filtration or centrifugation. This possibility exists due to the significant cleaning effect of the next lithium precipitation step. However, after removal of solids, it may be advantageous to treat the solution with adsorbent carbon to adsorb clavulanic acid and / or salt; this helps to separate other salts from the clavulanate and avoids unnecessary filling of the basic ion exchange resin with unnecessary ionizable material.

Yleensä kirkas liuos voidaan johtaa hiilikerroksen läpi esim. pylväässä, edullisesti käyttäen juuri riittävää määrää hiiltä kaiken halutun klavulaanihapon ja/tai suolan adsorboimiseksi, tavallisesti suhteessa noin 1 osa tilavuudesta hiiltä 3-10 osaa tilavuudesta kirkasta liuosta kohti. Tavallinen hiili on sopivaa eikä ole tarpeellista käyttää erittäin aktiivia ainetta. Hiili voidaan sitten puhdistaa käyttämällä veteen sekoittuvan liuottimen vesiliuosta, esim. ketonia kuten metyylietyyliketoni, metyyli-iso-butyyliketoni tai edullisesti asetoni, edullisesti väkevyydessä ketonia 30-95 %, edullisesti 50-70 %. Ennen puhdistusta hiili edullisesti pestään esim. vedellä käymisliuosjätteiden poistamiseksi.In general, the clear solution can be passed through a carbon bed, e.g. in a column, preferably using just enough carbon to adsorb any desired clavulanic acid and / or salt, usually in a ratio of about 1 part by volume of carbon to 3 to 10 parts by volume per clear solution. Ordinary carbon is suitable and it is not necessary to use a highly active substance. The carbon can then be purified using an aqueous solution of a water-miscible solvent, e.g. a ketone such as methyl ethyl ketone, methyl iso-butyl ketone or preferably acetone, preferably at a concentration of ketone of 30-95%, preferably 50-70%. Prior to purification, the carbon is preferably washed, e.g., with water, to remove fermentation broth waste.

Toinen muunnos ylläkuvatusta menetelmästä on valmistaa klavulaanihapon hartsisuola, kuten yllä on kuvattu, ja eluoida tämä jollain muulla kuin litiumsuolalla, esim. natrium-, kalium-, magnesium- tai kalsiumsuolalla esimerkiksi kloridilla tai asetaa-tilla, tai ammonium- tai pyridiinisuolalla, esim. ammoniumformiaa-tilla tai -asetaatilla tai pyridiinihydrokloridilla, jolloin saadaan vastaavan klavulanaatin vesiliuos; sitten voidaan lisätä ylimäärin vesiliukoista litiumsuolaa eluaattiin ja saostaa litium-klavulanaatti yllä kuvatulla tavalla.Another variation of the process described above is to prepare a resin salt of clavulanic acid as described above and elute it with a non-lithium salt, e.g. sodium, potassium, magnesium or calcium salt, e.g. chloride or acetate, or an ammonium or pyridine salt, e.g. ammonium formate. or acetate or pyridine hydrochloride to give an aqueous solution of the corresponding clavulanate; then excess water-soluble lithium salt can be added to the eluate and lithium clavulanate precipitated as described above.

Litiumklavulanaatin valmistus uuttamalla klavulaanihapon fenolipitoista liuostaPreparation of lithium clavulanate by extraction of a phenolic solution of clavulanic acid

Erään menetelmävaihtoehdon mukaan litiuroklavulanaattia sisältävä vesiliuos voidaan saada uuttamalla klavulaanihapon fenolipitoista liuosta litiumhydroksidin vesiliuoksella, jonka jälkeen litiumklavulanaatin saostuminen saadaan aikaan yllä kuvatulla tavalla, edullisesti jäljelle jääneen fenolipitoisen liuottimen poiston jälkeen uuttamalla vesiliuos veteen sekoittamattomalla 9 64600 liuottimena kuten eetterillä, kloroformilla tai hiilitetraklo-ridilla.According to an alternative, an aqueous solution containing lithium clavulanate can be obtained by extracting a phenolic solution of clavulanic acid with an aqueous solution of lithium hydroxide, followed by precipitation of lithium clavulanate as described above, preferably by removing the remaining phenol-containing solvent.

Ylläkuvattua tekniikkaa voidaan myös käyttää valmistettaessa muita klavulaanihapon suoloja kuin litiumsuolaa uuttamalla fenolipitoinen liuos sopivalla emäksellä, esim. maa-alkalimetalli-hydroksidilla kuten kalsium- tai bariumhydroksidi. Kaikki muodostuva sakka, esim. bariumsulfaatti, tulisi poistaa ja sen jälkeen suola voidaan eristää, esim. pakastekuivaarnalla. Sen jälkeen voidaan suorittaa puhdistus litiumsuolaksi muuttamalla, kuten yllä on kuvattu.The technique described above can also be used to prepare salts of clavulanic acid other than the lithium salt by extracting the phenolic solution with a suitable base, e.g. an alkaline earth metal hydroxide such as calcium or barium hydroxide. Any precipitate formed, e.g. barium sulphate, should be removed and then the salt can be isolated, e.g. by freeze-drying. Purification can then be performed by conversion to the lithium salt as described above.

Yleensä fenolipitoisen liuottimen uuttaminen suoritetaan edullisesti sellaisella tavalla, että vesifaasi saadaan noin pH:ssa 6,5.In general, the extraction of the phenolic solvent is preferably carried out in such a way that the aqueous phase is obtained at a pH of about 6.5.

Fenolipitoinen uute voidaan tuottaa uuttamalla vesipitoinen eluaatti yllä kuvatunlaisesta hiili- tai hartsiadsorbaatista fenolipitoisella liuottimena yleensä eluaatin väkevöimisen jälkeen ja haluttaessa orgaanisten haitallisten epäpuhtauksien saostami-sen jälkeen, joka suoritetaan lisäämällä yhtä tai useampia veteen sekoittuvia orgaanisia liuottimia ja/tai poistamalla sellaiset epäpuhtaudet uuttamalla veteen sekoittumattomalla liuottimella.The phenolic extract can be produced by extracting an aqueous eluate from a carbon or resin adsorbate as described above as a phenolic solvent, generally after concentrating the eluate and, if desired, after precipitating the organic harmful impurities by dissolving the solvent by removing one or more water-miscible organic solvents.

Siten esimerkiksi tämän tyyppisessä menettelyssä eluaatti joko hiilestä tai hartsista väkevöidään edullisesti haihduttamalla alennetussa paineessa. Yleensä käsittely puhdistuksen aikana suoritetaan edullisesti pH-alueella 6,0-7,0 esim. noin 6,5:ssä, hajoamisen minimoimiseksi. Sitten eluaatti voidaan edelleen puhdistaa saostamalla haitalliset aineet veteen sekoittuvalla ketonilla kuten asetonilla, edullisesti antaen ketonille väkevyyden 50-90 % tilavuudesta, edullisesti noin 85 %. pH tällä askeleella on edullisesti noin 6,5 ja mikäli vesiliuos jo sisältää veteen sekoittuvaa ketonia, tämä poistetaan edullisesti pH-mittauksen mahdollistamiseksi. pH voidaan säätää emästä lisäämällä, esim. alkalimetalli-hydroksidia kuten natriumhydroksidia.Thus, for example, in this type of process, the eluate from either carbon or resin is preferably concentrated by evaporation under reduced pressure. In general, the treatment during purification is preferably performed in the pH range of 6.0 to 7.0, e.g., at about 6.5, to minimize degradation. The eluate can then be further purified by precipitating the harmful substances with a water-miscible ketone such as acetone, preferably giving the ketone a concentration of 50-90% by volume, preferably about 85%. The pH in this step is preferably about 6.5 and if the aqueous solution already contains a water-miscible ketone, this is preferably removed to allow pH measurement. The pH may be adjusted by the addition of a base, e.g. an alkali metal hydroxide such as sodium hydroxide.

Puhdistus edelleen voidaan suorittaa liuottimella uuttamis-askeleella tarpeettomien epäpuhtauksien poistamiseksi esim. väke-vöimällä ja säätämällä suodoksen pH ketonisaostuksesta noin 4:ään lisäämällä mineraalihappoa, kuten rikkihappoa tai kloorivetyhappoa 10 64600 ja uuttamalla n-butanolilla tai suurempi molekyylipainoisella nestemäisellä alkoholilla. Sopivasti voidaan käyttää 1-8 tilavuutta liuotinta.Further purification can be performed with a solvent extraction step to remove unnecessary impurities, e.g., by concentrating and adjusting the pH of the filtrate from ketone precipitation to about 4 by adding a mineral acid such as sulfuric acid or hydrochloric acid and extracting with n-butanol or higher molecular weight liquid. Suitably 1-8 volumes of solvent may be used.

Tämän uuttamisen jälkeen vesifaasi väkevöidään edullisesti noin pH 6,5:ssä ja voidaan puhdistaa edelleen uuttamalla haluttu antibiootti fenolipitoiseen liuottimeen, esim. fenoliin itseensä tai kresoliin, edullisesti sen jälkeen, kun pH on laskettu noin 4tään mineraalihapolla. Fenolipitoinen liuotin sisältää edullisesti emästä, kuten Ν,Ν-dimetyylianiliinia, ja veteen sekoit-tumatonta liuotinta, kuten kloroformia tai hiilitetrakloridia. Uuttaminen suoritetaan edullisesti useita kertoja käyttäen 2/3 liuotintilavuutta kutakin uuttamista varten. Uutteet voidaan sitten yhdistää ja vettä lisätä noin 1/15 liuotintilavuudesta erillisen faasin muodostamiseksi. Sitten antibiootti voidaan uuttaa takaisin lisäämällä vesifaasiin emästä, edullisesti alkalimetalli-hydroksidia, esim. litiumhydroksidia, tai maa-alkalimetalli-hydroksidia, esim. barium- tai kalsiumhydrokefidia, noin pHrhon 6,5. Vesikerros erotetaan fenolikerroksesta ja takaisinuuttamis-menettely kerrataan edullisesti yhdistäen sen jälkeen vesiuutteet. Sen jälkeen, kun kaikki sakka on erotettu, esim. bariumsulfaatti, kaikki jäljelle jäänyt fenoliliuotin voidaan poistaa vesiliuoksesta uuttamalla veteen sekoittumattomalla liuottimena kuten eetterillä, kloroformilla tai hiilitetrakloridilla, ja antibioottisuo-lan talteen ottamiseksi vesifaasi voidaan pakastekuivata tai suihkukuivata pH:ssa 6,5.After this extraction, the aqueous phase is preferably concentrated to about pH 6.5 and can be further purified by extracting the desired antibiotic into a phenolic solvent, e.g. phenol itself or cresol, preferably after lowering the pH to about 4 with mineral acid. The phenolic solvent preferably contains a base such as Ν, Ν-dimethylaniline, and a water-immiscible solvent such as chloroform or carbon tetrachloride. The extraction is preferably performed several times using 2/3 of the solvent volume for each extraction. The extracts can then be combined and water added to about 1/15 of the solvent volume to form a separate phase. The antibiotic can then be re-extracted by adding a base to the aqueous phase, preferably an alkali metal hydroxide, e.g. lithium hydroxide, or an alkaline earth metal hydroxide, e.g. barium or calcium hydroxide, at a pH of about 6.5. The aqueous layer is separated from the phenol layer and the back-extraction procedure is preferably repeated, then combining the aqueous extracts. After all the precipitate has been separated, e.g. barium sulphate, any remaining phenol solvent can be removed from the aqueous solution by extraction with a water-immiscible solvent such as ether, chloroform or carbon tetrachloride, and the aqueous phase can be freeze-dried or spray-dried to recover the antibiotic salt.

Puhdistus edelleen voidaan suorittaa tavallisilla tavoilla kuten kromatografisesti käyttäen erikoisesti aineita kuten Sephadex Pharmacia Ltd.). Täten antibiootti, joka tässä vaiheessa on yleensä suolan muodossa, esim. bariumsuolana, voidaan lisätä Sephadexpylvääseen, esim. Sephadex G 15 ja uuttaa vedellä, jolloin merkittävästi antibioottisesti aktiiviset fraktiot yhdistetään seuraavaa suolan talteenottomenettelyä varten, joka tapahtuu esim. pakastekuivaarnalla.Further purification can be carried out in the usual ways such as chromatography using especially substances such as Sephadex Pharmacia Ltd.). Thus, the antibiotic, which at this stage is generally in the form of a salt, e.g. a barium salt, can be added to a Sephadex column, e.g. Sephadex G15 and extracted with water, combining the significantly antibiotically active fractions for the next salt recovery procedure, e.g.

Litlumklavulanaatln muuttaminen klavulaanihapoksi ja muiksi suoloiksiConversion of litlum clavulanate to clavulanic acid and other salts

Edellä mainitulla menettelyllä valmistettu puhdistettu li-tiumklavulanaatti voidaan muuttaa muiksi suoloiksi ioninvaihto- 11 64600 menettelyillä käyttäen esim. ioninvaihtohartsia. Siten esimerkiksi litiumsuolan vesiliuos voidaan lisätä kationin vaihtohartsiin, esim. Bio Rad AG50X8; (Bio Rad Laboratories, Richmond California) kationimuodossa, jolloin kationi on se klavulaanihapon suola, jota halutaan, esim. natrium tai kalium, jota seuraa eluointi vedellä. Vapaa klavulaanihappo voidaan muodostaa esim. tekemällä esim. natriumkloridilla tai ammoniumsulfaatilla kyllästetty litium-suolan vesiliuos jossa on suuri ionivahvuus happamaksi noin pH:hon 2,6, veteen sekoittumattoman klavulaanihapon liuottimen läsnäollessa, esim. esteriliuotin kuten etyyliasetaatti. Tarvittaessa vesi-faasi voidaan edelleen uuttaa liuottimena ja uutteet yhdistää. Yleensä mikä tahansa happo, jolla saadaan riittävän alhainen pH, on sopiva happamaksi tekemiseen, esim. mineraalihappo kuten kloo-rivetyhappo. Liuotin voidaan sitten poistaa vapaan hapon saamiseksi, yleensä öljyn muodossa. Vapaan hapon liuos veteen sekoittumat-tomassa liuottimessa voidaan käyttää laajan suolasarjan valmistamiseksi uuttamalla sopivan emäksen vesiliuoksella, ja erottamalla suola siitä. Saattaa olla tarpeellista suodattaa kiinteä aine vesi-faasista ennen kuin suolan eristämiseen ryhdytään. Koska vapaa happo on suhteellisen pysymätön, se olisi edullisesti käytettävä, esimerkiksi suolojen tai muiden johdannaisten valmistamiseksi, niin pian kuin mahdollista muodostumisensa jälkeen.The purified lithium clavulanate prepared by the above-mentioned procedure can be converted into other salts by ion-exchange procedures using, e.g., an ion-exchange resin. Thus, for example, an aqueous solution of a lithium salt may be added to a cation exchange resin, e.g. Bio Rad AG50X8; (Bio Rad Laboratories, Richmond California) in cationic form, wherein the cation is the salt of clavulanic acid that is desired, e.g., sodium or potassium, followed by elution with water. Free clavulanic acid can be formed, e.g., by making, for example, an aqueous solution of a lithium salt saturated with sodium chloride or ammonium sulfate having a high ionic strength acidic to about pH 2.6, in the presence of a water-immiscible clavulanic acid solvent, e.g., an ester solvent such as ethyl acetate. If necessary, the aqueous phase can be further extracted as a solvent and the extracts combined. In general, any acid with a sufficiently low pH is suitable for acidification, e.g. a mineral acid such as hydrochloric acid. The solvent can then be removed to give the free acid, usually in the form of an oil. A solution of the free acid in a water-immiscible solvent can be used to prepare a wide range of salts by extracting the appropriate base with aqueous solution, and separating the salt therefrom. It may be necessary to filter the solid from the aqueous phase before proceeding to isolate the salt. Because the free acid is relatively unstable, it should preferably be used, for example, to prepare salts or other derivatives, as soon as possible after formation.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä. Klavulaanihappo-pitoisuuksien määrityksiin käytettiin seuraavia menetelmiä: 1. UV-spektroskopiaThe following examples illustrate the invention. The following methods were used to determine clavulanic acid concentrations: 1. UV spectroscopy

Klavulaanihapolla ja sen suolojen vesiliuoksilla on hyvin matala UV-absorptio 230 nm yläpuolella ja esimerkiksi molaarinen ekstinktiokerroin 280 nm:ssä on noin 60. Emäkseen liuotettuna kuitenkin voimakas UV-absorptio kehittyy nopeasti kohdalla Amax295-^ ja tätä voidaan käyttää klavulaanihapon ja/tai sen suolojen määrittämiseen. Koetta varten kiinteä aine punnitaan tarkasti ja liuotetaan laimeaan natriumhydroksidiin (0,1-m) , jolloin saadaan tunnettu tilavuus liuosta, joka vastaa noin 0,01 mg/ml klavulaani-happoa. Liuoksen optinen tiheys absorptiomaksimikohdalla tai noin 259 nm mitattiin sopivalla spektrofotometrillä; kiinteän aineen puhtaudet voidaan laskea edellyttäen klavulaanihapolle £ olevan 12 64600 16 700. Molaariset eksinktiokertoimet voidaan laskea E^-arvoista, se on ekstinktiokertoimet 1 % liuoksella 1 cm kyvetissä. Samoin käyttönesteet orgaanisten liuottimien tarvittaessa poiston jälkeen laimennettiin tarkasti laimealla natriumhydroksidilla, jolloin saatiin samanlaiset emäksen ja kalvulaanihapon väkevyydet, josta klavulaanihapon väkevyys alkuperäisessä nesteessä määritettiin kuten yllä. Raakojen kiinteiden aineiden ja käyttönesteiden arvot korjattiin epäpuhtauksien absorptiot huomioiden käyttäen samanväke-vyisiä liuoksia vedessä.Clavulanic acid and aqueous solutions of its salts have a very low UV absorption above 230 nm and, for example, a molar extinction coefficient at 280 nm of about 60. However, when dissolved as a base, strong UV absorption develops rapidly at Amax295- and can be used to determine clavulanic acid and / or its salts. . For the test, the solid is accurately weighed and dissolved in dilute sodium hydroxide (0.1-m) to give a known volume of solution corresponding to about 0.01 mg / ml clavulanic acid. The optical density of the solution at the absorption maximum or about 259 nm was measured with a suitable spectrophotometer; the purities of the solid can be calculated provided that for clavulanic acid £ 12,646,600. The molar excitation coefficients can be calculated from the E 1 values, i.e. the extinction coefficients with a 1% solution in a 1 cm cuvette. Likewise, the working fluids, after removal of the organic solvents if necessary, were diluted accurately with dilute sodium hydroxide to give similar concentrations of base and calvulanic acid, from which the concentration of clavulanic acid in the original liquid was determined as above. The values of the crude solids and working fluids were corrected for the absorptions of the impurities using equally concentrated solutions in water.

2. Biologinen aktiivisuus Määritettiin vertaamalla tunnetun klavulaanihappopitoisuuden kiinteän aineen liuoksia agar petrimaljakokeessa Acinetobacter-la-jiin seuraten oleellisesti Lees ja Tootill-menetelmää (Lees, K.A.2. Biological activity Determined by comparing solid solutions of known clavulanic acid content in an agar petri dish with Acinetobacter species essentially following the method of Lees and Tootill (Lees, K.A.

& Tootill, J.P.R., Analyst, 1955, 80 (947), 95-110* ibid 110-123; 80 (952) , 531-535).& Tootill, J.P.R., Analyst, 1955, 80 (947), 95-110 * ibid 110-123; 80 (952), 531-535).

Esimerkki 1 1) Kalsiumsuolan valmistus a) Streptomyces clavuligerus-kannan NRRL 3585 viljelyliemestä eristetty raaka klavulaaikihapon bariumsuola (8,83 g) lisättiin 50 mitään (NH^jSO^ kyllästettyä vesiliuosta. Etyyliasetaattia (50 ml) lisättiin ja seosta sekoitettiin. pH-mittari asetettiin seokseen ja pH säädettiin pHtsta 6,8 pHthon 2,6 noin 15 ml:11a IM H2SO4. Vesiliuos erotettiin etyyliasetaatista ja sekoitettiin uudelleen tuoreeseen etyyliasetaattiannokseen (50 ml). Nämä kaksi etyyliasetaattiuutetta yhdistettiin, tislattua vettä (100 ml) lisättiin ja seosta sekoitettiin pH-mittarissa. Noin 40 ml kyllästettyä kalsiumhydroksidiliuosta lisättiin seoksen pH:n säätämiseksi 6,6:ksi. Vesiliuos erotettiin etyyliasetaatista, suodatettiin suodatinmassan läpi ja pakastekuivattiin, jolloin saatiin 1,44 g kiinteää kalsiumsuolaa.Example 1 1) Preparation of calcium salt a) Crude clavulanic acid barium salt (8.83 g) isolated from the culture broth of Streptomyces clavuligerus strain NRRL 3585 was added to 50% saturated aqueous solution (NH 4 SO 4), ethyl acetate (50 ml) was added and the mixture was stirred to pH. The aqueous solution was separated from ethyl acetate and mixed again with a fresh portion of ethyl acetate (50 ml) .The two ethyl acetate extracts were combined, distilled water (100 ml) was added and the mixture was stirred at pH 6.8. About 40 ml of saturated calcium hydroxide solution was added to adjust the pH of the mixture to 6.6.The aqueous solution was separated from ethyl acetate, filtered through a filter pad and lyophilized to give 1.44 g of solid calcium salt.

b) Kohdan (a) kiinteä aine liuotettiin 15 ml:aan tislattua vettä, suodatettiin Milliporesuodattimen läpi ja siirrettiin Sep-hadex G15 sisältävään pylvääseen, joka oli tehty veteen, jolloin oli saatu 15 cm korkea ja 2,5 cm halkaisijaltaan kerros. Eluointi suoritettiin tislatulla vedellä ja kerättiin 20 ml fraktiot. Fraktiot tutkittiin ohutlevykromatografisesti (selluloosa, Eastman Kodak 6065 levyt; liuotin asetonitriili-vesi, 7:3 tilavuudelta) 13 64600 ajaen agar-ravintoliuoksella, joka sisälsi Staphylococcus aureus-ta. Fraktiot 33-37 yhdistettiin ja pakastekuivattiin, jolloin saatiin 490 mg. Kiinteä aine kuivattiin P20^:llä tyhjössä 60 tunnin ajan. (b):stä saadulla kalsiumsuolalla oli seuraavat ominaisuudet: pKa:b) The solid from (a) was dissolved in 15 ml of distilled water, filtered through a Millipore filter and transferred to a column containing Sep-hadex G15 made of water to give a layer 15 cm high and 2.5 cm in diameter. Elution was performed with distilled water and 20 ml fractions were collected. Fractions were examined by thin layer chromatography (cellulose, Eastman Kodak 6065 plates; solvent acetonitrile-water, 7: 3 by volume) on 13,60000 agar medium containing Staphylococcus aureus. Fractions 33-37 were combined and lyophilized to give 490 mg. The solid was dried over P 2 O 4 in vacuo for 60 hours. The calcium salt obtained from (b) had the following properties: pKa:

Suola potentiometrisesti titrattaessa todettiin vastaavan hapon pKa-arvon olevan noin 2,4.By potentiometric titration of the salt, the corresponding acid was found to have a pKa of about 2.4.

Optinen kierto: £ci.JD 22°C:ssa, +44,9° (väkevyys, 0,287 g/100 ml vettä) .Optical rotation: ε ci.JD at 22 ° C, + 44.9 ° (concentration, 0.287 g / 100 ml water).

UV-spektri: Näytteellä (0,00148 g), joka oli liuotettu 100 ml:aan 0,1M NaOH, oli absorptiomaksimi (Λ max) kohdalla 258 nm E^-arvon ollessa noin 550.UV spectrum: A sample (0.00148 g) dissolved in 100 ml of 0.1 M NaOH had an absorption maximum (Λ max) at 258 nm with an E 2 value of about 550.

IR-spektri: Näytteen infrapunaspektrissä nujolissa oli absorptiomak-simit aaltoluvuilla (cm ^): 3300 s,br 2330 w 1788 s 1692 m 1604 s 1404 s 1305 s 1190 m 1118 m 1082 m 1060 m 1042 m 1012 m 992 m 968 m 892 m 848 w 790 w 740 m 654 w (s, m, nr ja w = voimakas, keskinkertainen, leveä ja heikko intensiteetti vastaavasti).IR spectrum: The infrared spectrum of the sample in nujol had absorption maxima at wavenumbers (cm -1): 3300 s, br 2330 w 1788 s 1692 m 1604 s 1404 s 1305 s 1190 m 1118 m 1082 m 1060 m 1042 m 1012 m 992 m 968 m 892 m 848 w 790 w 740 m 654 w (s, m, nr and w = strong, medium, wide and weak intensity, respectively).

Koko spektri on esillä liitteenä olevien piirrosten kuviossa 3.The full spectrum is shown in Figure 3 of the accompanying drawings.

NMR-spektri: Näyteliuoksen protonin ydinmagneettisen resonanssin spektri raskaassa vedessä näytti huippuryhmät CC -arvot) kohdilla noin 4,31, 5,10, 5,85, 6,46, 6,91.NMR spectrum: The proton nuclear magnetic resonance spectrum of the sample solution in heavy water showed peak groups (CC values) at about 4.31, 5.10, 5.85, 6.46, 6.91.

Ohutlevykromatografia: Näyteannokset veteen liuotettuina sijoitettiin lähtöviivalle joko Eastman-Rodak selluloosa TL-levyille (muovitaustainen, EK 6065) tai Eastman-Kodak selluloosa-TL-levyille (muovitaustainen, EK 6065) tai Eastman-Kodak silikageeli-TL-levyille (muovitaustainen, EK 6060) . Levyt kehitettiin liuottimena huoneen lämpöti- 14 64600 lassa, ilmakuivattiin sitten ja ajettiin agar-ravintoliuoksella, joka sisälsi Staphylococcus aureusta. Rf-arvot, jotka laskettiin ehkäistyneen bakteerikasvun etäisyytenä kunkin vyöhykkeen alkupisteestä keskipisteeseen jaettuna etäisyydellä alkupisteestä liuotin-rintamaan, on annettu alla viidelle systeemille.Thin layer chromatography: Sample aliquots dissolved in water were placed on the starting line on either Eastman-Rodak cellulose TL plates (plastic backed, EK 6065) or Eastman-Kodak cellulose TL plates (plastic backed, EK 6065) or Eastman-Kodak silica gel TL plates (plastic backed, EK 60 ). The plates were developed as a solvent at room temperature, then air dried and run on an agar medium containing Staphylococcus aureus. Rf values calculated as the distance of inhibited bacterial growth from the starting point to the midpoint of each zone divided by the distance from the starting point to the solvent front are given below for the five systems.

_Liuotin_Pinnoite_Rf__Liuotin_Pinnoite_Rf_

Propan-l-oli:vesi (7:3) selluloosa 0,60Propan-1-ol: water (7: 3) cellulose 0.60

Butan-l-oliretikkahappo:vesi (3:1:1) " 0,64Butan-1-ol-acetic acid: water (3: 1: 1) "0.64

Asetonitriili:vesi (7:3) " 0,68Acetonitrile: water (7: 3) "0.68

Asetonitriili:vesi:propan-2-oli (1:1:1) " 0,87Acetonitrile: water: propan-2-ol (1: 1: 1) "0.87

Butan-l-oli:etikkahappo:vesi (3:1:1) pii 0,63Butan-1-ol: acetic acid: water (3: 1: 1) silicon 0.63

Paperl-ionoforeesl: Näyteannoksille suoritettiin ionoforeesi Whatman 541 paperilla 1 tunnin ajan käyttämällä 400 V 20 cm:lle.Paper I-iontophoresis: Sample aliquots were subjected to ionophoresis on Whatman 541 paper for 1 hour using 400 V for 20 cm.

Aktiivisuus, joka todettiin ajamalla ilmakuivattu paperi agar-ravintoliuoksella, joka sisälsi Staphylococcus aureusta, sai aikaan syaanokobalamiiniin verrattuna 4,5 cm liikkeen kohti anodia pH:ssa 4,8 (O,IM asetaatti), pH:ssa 6,9 (0,01M fosfaatti) ja pH:ssa 9,5 (0,01M pyrofosfaatti).The activity observed by running the air-dried paper on an agar medium containing Staphylococcus aureus produced a 4.5 cm movement per anode at pH 4.8 (0.1 M acetate) compared to cyanocobalamin, at pH 6.9 (0.01 M phosphate) and at pH 9.5 (0.01 M pyrophosphate).

ii) Litiumsuolan valmistus(ii) Preparation of lithium salt

Kohdan (i) (b) mukaan valmistettua kalsiumsuolaa (1 g; UV-kokeen mukaan puhdasta) liuotettiin 10 ml:aan vettä ja 10 ml kyllästettyä litiumkloridin vesiliuosta lisättiin. Kiteytyminen tapahtui raaputtamatta ja suoloittamatta. Kun seos oli jäähdytetty 0°:seen, kiteet suodatettiin, pestiin 5 ml:11a etanolia, 5 ml:11a asetonia ja 2 x 5 ml:11a dietyylieetteriä. Kiteet kuivattiin alennetussa paineessa (0,1 mmHg) silikageelillä 2 tunnin ajan, jolloin saatiin 495,5 mg kiinteää litiumsuolaa. Tällä suolalla oli seuraa-vat ominaisuudet:The calcium salt prepared according to (i) (b) (1 g; pure by UV test) was dissolved in 10 ml of water, and 10 ml of saturated aqueous lithium chloride solution was added. Crystallization occurred without scratching and salting. After cooling to 0 °, the crystals were filtered, washed with 5 ml of ethanol, 5 ml of acetone and 2 x 5 ml of diethyl ether. The crystals were dried under reduced pressure (0.1 mmHg) on silica gel for 2 hours to give 495.5 mg of a solid lithium salt. This salt had the following properties:

Alkuaineanalyysi:Elemental analysis:

Saatu (keskiarvot on annettu suluissa): C 45,5, 45,8; (45,65); H 3,8, 3,8 (3,8); N 7,0, 7,2 (7,1); Li, 3,2 %. Rikkiä ei todettu menetelmällä N.Dl Cheronis & J.B. Entrikin (1947) Semimicro Qualitative Analysis, s. 93. Crowell, New York.Found (averages in parentheses): C 45.5, 45.8; (45,65); H 3.8, 3.8 (3.8); N 7.0, 7.2 (7.1); Li, 3.2%. Sulfur was not detected by the method of N.Dl Cheronis & J.B. Entrikin (1947) Semimicro Qualitative Analysis, p. 93. Crowell, New York.

64600 1564600 15

CgHgNOgLi.1/4 H20 vaatii C 45,84; H 4,06; N 6,68; Li 3,31 % Yllämainittu Li analyysiarvo, (3,2 %), määritettiin atomiabsorp-tiospektrofotometrisesti. Sulfaattituhkaa oli 26,8 %,josta laskettuna LijSO^rksi, se on ekvivalentti 3,38 % litiumin kanssa.C 9 H 9 NO 9 Cl 4/4 H 2 O requires C, 45.84; H 4.06; N 6.68; Li 3.31% The above Li analytical value, (3.2%), was determined by atomic absorption spectrophotometry. The sulphate ash was 26.8%, of which, calculated as LijSO 4, it is equivalent to 3.38% lithium.

pKa:pK

Suolan potentiometrisellä titrauksella todettiin vastaavan hapon pKa-arvon olevan noin 2,3.By potentiometric titration of the salt, the corresponding acid was found to have a pKa of about 2.3.

Optinen kierto: 0,145 % paino/tilavuus vesiliuoksen arvo 24 C:ssa oli +66,0°.Optical rotation: 0.145% w / v The value of the aqueous solution at 24 ° C was + 66.0 °.

Ultravioletti spektri: 0,00091 % liuoksen 0,1M natriumhydroksidissa UV-absorp-tiospektrissä oli absorptiomaksimi (Amax) kohdalla 258 nm E^ -arvon ollessa 788.Ultraviolet Spectrum: The UV absorption spectrum of a 0.00091% solution in 0.1 M sodium hydroxide had an absorption maximum (Amax) at 258 nm with an Emax of 788.

Infrapunaspektri:Infrared spectrum:

Nujolissa ajetulla infrapunaspektrillä oli absorptiohuiput (cm^) noin kohdilla': 3420 m 1402 s 1200 w 1026 m 880 w 3012 w 1338 m 1129 m 992 m 850 w 1765 s 1325 s 1101 m 976 m 734 m 1683 s 1300 m 1062 m 950 s 708 w 1618 s 1224 w 1048 s 900 roThe infrared spectrum driven in Nujol had absorption peaks (cm -1) at approximately '3420 m 1402 s 1200 w 1026 m 880 w 3012 w 1338 m 1129 m 992 m 850 w 1765 s 1325 s 1101 m 976 m 734 m 1683 s 1300 m 1062 m 950 s 708 w 1618 s 1224 w 1048 s 900 ro

Koko spektri näkyy liitteenä olevien piirustusten kuviossa 1.The full spectrum is shown in Figure 1 of the accompanying drawings.

NMR-spektri:NMR Spectrum:

Litiumsuolan 100 MHz protonin NMR-spektrissä raskaassa vedessä oli huiput -arvot sekä huippujen lukumäärät ja kytkentä-vakiot (Hz) suluissa), joiden keskipisteet olivat noin 4,26 (d,3), 5,05 (t,8), 5,06 (s), 5,81 (d,8), 6,43 (dd,3 ja 17) ja 6,89 (d,17).The 100 MHz proton NMR spectrum of the lithium salt in heavy water had peaks as well as peak numbers and coupling constants (Hz) in parentheses) with centers of about 4.26 (d, 3), 5.05 (t, 8), 5, 06 (s), 5.81 (d, 8), 6.43 (dd, 3 and 17) and 6.89 (d, 17).

(s,d,dd,t ja m = singletti dubletti, kaksoisdubletti, tri-pletti ja multipletti vastaavasti).(s, d, dd, t, and m = singlet doublet, double doublet, triplet, and multiplet, respectively).

Esimerkki 2Example 2

Litiumsuolan uudelleen kiteytysRecrystallization of lithium salt

Esimerkissä 1 (ii) valmistettua litiumsuolaa (0,1 g) liuotettiin veteen (1,0 ml) ja laimennettiin varovaisesti isopropano-lilla (19 ml). Tuote kiteytyi hitaasti 0°:ssa ja kerättiin kahtena 64600 saantona keittämällä alennetussa paineessa 5 ml:ksi toista saantoa varten. Litiumsuolakiteet kuivattiin silikageelillä tyhjössä 3 päivän ajan.The lithium salt (0.1 g) prepared in Example 1 (ii) was dissolved in water (1.0 ml) and carefully diluted with isopropanol (19 ml). The product slowly crystallized at 0 ° and was collected in two 64,600 yields by boiling under reduced pressure to 5 ml for a second crop. The lithium salt crystals were dried over silica gel under vacuum for 3 days.

Saanto 1 20.0 mg Λ max 259 nm ε| = 814 natriumhydroksidiliuoksessa (0,1M) 10 ^ug/ml. Alkuaineanalyysissä saatiin: C 46,2, 46,0; H 4,10, 3,85; N 6,8, 6,7 %Yield 1 20.0 mg Λ max 259 nm ε | = 814 in sodium hydroxide solution (0.1M) 10 μg / ml. Elemental analysis found: C 46.2, 46.0; H 4.10, 3.85; N 6.8, 6.7%

CgHgN05Li.l/4 H20 vaatii C 45,84; H 4,06; N 6,68 %C 9 H 9 NO 5 Li / 4 H 2 O requires C, 45.84; H 4.06; N 6.68%

Saanto 2 67.0 mg /\ max 259 nm e| = 800 natriumhydroksidissä (0,1N) 10 ^,ug/ml. Alkuaineanalyysissä saatiin: C 46,15, 46,5; H 3,9, 4,0; N 6,65, 6,5; litium 3,4 % (sulfaatti-tuhka) .Yield 2 67.0 mg / λ max 259 nm e | = 800 in sodium hydroxide (0.1N) 10 μg / ml. Elemental analysis found: C 46.15, 46.5; H 3.9, 4.0; N 6.65, 6.5; lithium 3.4% (sulfate-ash).

CgHgNOgLi 1/4 H20 vaatii: C 45,84; H 4,06; N 6,68; Li 3,31 %C 9 H 9 NO 9 L 1/4 H 2 O requires: C, 45.84; H 4.06; N 6.68; Li 3.31%

Esimerkki 3Example 3

Raakaa bariumsuolaa (vert. esim. 1) (30 g; 274) liuotettiin veteen (40 ml) ja lisättiin kyllästettyä ammoniumsulfaattiliuosta (300 ml). Liuoksen pH säädettiin 2,4:ksi rikkihapolla (20 %, 23,0 ml) ja uutettiin sitten etyyliasetaatilla (2 x 300 ml). Vettä (200 ml) lisättiin yhdistettyihin uutteisiin. Seosta sekoitettiin voimakkaasti ja natriumhydroksidiliuosta (IM; 89,3 ml) lisättiin, kunnes pH oli 6,8 vesifaasi erotettiin ja tislattiin alennetussa paineessa 33 mlrksi. Butan-l-olia (770 ml) lisättiin vesiväkevöit-teeseen ja sekoitettiin sitten, lämmitettiin 40°C:seen ja ravistettiin voimakkaasti. Liukenematon aine suodatettiin pois ja uutettiin uudelleen vesi:butan-l-oli-seoksella (1:23 til/til) kunnes kaikki oli liuennut. Yhdistetyt liuokset jäähdytettiin 4°C:seen yli yön. Muodostunut kiteinen kiinteä aine otettiin talteen suodattamalla, pestiin butan-l-olilla ja asetonilla ja ilmakuivat-tiin, jolloin saatiin 3,34 g natriumsuolaa (E^ 648).The crude barium salt (cf. e.g. 1) (30 g; 274) was dissolved in water (40 ml) and saturated ammonium sulphate solution (300 ml) was added. The pH of the solution was adjusted to 2.4 with sulfuric acid (20%, 23.0 mL) and then extracted with ethyl acetate (2 x 300 mL). Water (200 ml) was added to the combined extracts. The mixture was stirred vigorously and sodium hydroxide solution (1M; 89.3 ml) was added until the pH was 6.8. The aqueous phase was separated and distilled under reduced pressure to 33 ml. Butan-1-ol (770 mL) was added to the aqueous concentrate and then stirred, warmed to 40 ° C and shaken vigorously. The insoluble matter was filtered off and re-extracted with water: butan-1-ol (1:23 v / v) until all was dissolved. The combined solutions were cooled to 4 ° C overnight. The formed crystalline solid was collected by filtration, washed with butan-1-ol and acetone and air-dried to give 3.34 g of the sodium salt (E 2 648).

2,92 g tätä natriumsuolaa liuotettiin veteen (20 ml) ja suodatettiin. Suodosta sekoitettiin 0°C:ssa, samalla kun litiumklo-ridiliuosta (20 ml, kyllästetty 20°C:ssa) lisättiin 5 minuutin aikana. Sekoittamista ja jäähdyttämistä jatkettiin 1 tunnin ajan, jonka jälkeen kiteet kerättiin suodattamalla, pestiin etanolilla (20 ml), asetonilla (2 x 20 ml), dietyylieetterillä (2 x 25 ml) ja ilmakuivattiin, jolloin saatiin litiumsuola (2,275 g) valmiina pitkulaisina Iitteinä kiteinä (E^ 770).2.92 g of this sodium salt was dissolved in water (20 ml) and filtered. The filtrate was stirred at 0 ° C while lithium chloride solution (20 mL, saturated at 20 ° C) was added over 5 minutes. Stirring and cooling were continued for 1 hour, after which the crystals were collected by filtration, washed with ethanol (20 ml), acetone (2 x 20 ml), diethyl ether (2 x 25 ml) and air dried to give the lithium salt (2.275 g) as finished elongated crystals. (E ^ 770).

64600 1764600 17

Esimerkki 4Example 4

Raakaa bariumsuolaa (vrt. esim. 1) (7,99 g; 288) liuo tettiin veteen (60 ml) ja suodatettiin. Suodosta käsiteltiin annoksittain litiumsulfaatilla (4,0 g) sekoittaen ympäröivässä lämpötilassa, kunnes bariumille ei saatu toteamisreaktiota natrium-roditsonaatilla. Suspensio kirkastettiin sentrifugoimalla ja neste kaadettiin pois ja keitettiin kokoon noin 35 ml:ksi alennetussa paineessa. Litiumkloridia (9,0 g) lisättiin annoksittain sekoittaen ja jäähdyttäen; 1 tunnin kuluttua 0°:ssa litiumsuola kerättiin suodattamalla, pestiin etanolilla (10 ml), asetonilla (2 x 25 ml), dietyylieetterillä (2 x 20 ml) ja iomakuivattiin suo-datinsuppilossa, jolloin saatiin 1,590 g valkeita kiteitä (E^ 790).The crude barium salt (cf. e.g. 1) (7.99 g; 288) was dissolved in water (60 ml) and filtered. The filtrate was treated portionwise with lithium sulfate (4.0 g) with stirring at ambient temperature until a detection reaction of barium with sodium rhodizonate was obtained. The suspension was clarified by centrifugation and the liquid was poured off and boiled to about 35 ml under reduced pressure. Lithium chloride (9.0 g) was added portionwise with stirring and cooling; After 1 h at 0 °, the lithium salt was collected by filtration, washed with ethanol (10 mL), acetone (2 x 25 mL), diethyl ether (2 x 20 mL) and dried in a filter funnel to give 1.590 g of white crystals (E ^ 790). .

Esimerkki 5Example 5

Natriumsuolan valmistusPreparation of sodium salt

Esimerkin 1 (ii) mukaan valmistettua litiumsuolaa (3,5 g) liuotettiin 20 ml:aan tislattua vettä ja siirrettiin pylvääseen, joka sisälsi 5Q ml AG50x8 kationinvaihtohartsia (Bio-Rad, Na+; 200-400 mesh koko). Eluointi suoritettiin vedellä ja 8 ml fraktiot kerättiin. Fraktiot tutkittiin paperille aplikoituina annoksina ajamalla agar-ravintoliuoksella, joka sisälsi Staphylococcus aureus-ta. Aktiiviset fraktiot (4-13) yhdistettiin ja pakastekuivattiin. Pakastekuivattu kiinteä aine liuotettiin tislattuun veteen, jolloin saatiin 19 ml liuosta, ravisteltiin butan-l-olin (450 ml) kanssa ja lämmitettiin (vesihaude), kunnes liuos oli melkein kirkas. Lämmin liuos suodatettiin sintterin läpi keltaisen kiinteän aineen poistamiseksi ja suodosta pidettiin 4°C:ssa 60 tunnin ajan. Muodostuneet kiteet suodatettiin, pestiin butan-l-olilla (2 x 10 ml), sitten asetonilla (2 x 10 ml) ja kuivattiin alennetussa paineessa 40°C:ssa 1 tunnin ajan, jolloin saatiin 2,18 g kiinteää ainetta. Kiinteä aine kiteytettiin uudelleen vesi-butan-l-olista (1:23,3 tilavuudelta) kuvatulla tavalla. Kiteet kuivattiin alennetussa paineessa silikageeIillä 44°C:ssa 1,5 tunnin ajan, jolloin saatiin 1,8 g kiinteää natriumsuolaa.The lithium salt (3.5 g) prepared according to Example 1 (ii) was dissolved in 20 ml of distilled water and applied to a column containing 50 ml of AG50x8 cation exchange resin (Bio-Rad, Na +; 200-400 mesh size). Elution was performed with water and 8 ml fractions were collected. Fractions were examined in paper-applied doses run on agar medium containing Staphylococcus aureus. The active fractions (4-13) were combined and lyophilized. The lyophilized solid was dissolved in distilled water to give 19 ml of a solution, shaken with butan-1-ol (450 ml) and heated (water bath) until the solution was almost clear. The warm solution was filtered through a sinter to remove a yellow solid and the filtrate was kept at 4 ° C for 60 hours. The formed crystals were filtered, washed with butan-1-ol (2 x 10 ml), then acetone (2 x 10 ml) and dried under reduced pressure at 40 ° C for 1 hour to give 2.18 g of a solid. The solid was recrystallized from water-butan-1-ol (1: 23.3 by volume) as described. The crystals were dried under reduced pressure on silica gel at 44 ° C for 1.5 hours to give 1.8 g of a solid sodium salt.

Kiinteä aine oli hygroskooppista. Se jauhettiin survimessa ja huhmaressa ja sen annettiin imeä ilmakehän vesi 18°C:ssa. Kun noin 22 % (paino/paino) vettä oli imeytynyt, oli saavutettu tasapaino. Tällä suolalla oli seuraavat ominaisuudet.The solid was hygroscopic. It was ground in a pestle and mortar and allowed to soak up atmospheric water at 18 ° C. After approximately 22% (w / w) water had been absorbed, equilibrium had been reached. This salt had the following properties.

18 6460018 64600

Alkuaineanalyysi (tasapainossa oleva kostea aine)Elemental analysis (equilibrium moist substance)

Saatu (keskiarvot on annettu suluissa): C 33,3, 33,2 (33,25); H 4,6, 4,6 (4,6); N 4,6, 4,7 (4,65); Na 7,3 (absorptiospektrofotometrisesti), 7,9 (laskettu sulfaattituhkasta); vettä, 2195 %.Found (averages in parentheses): C 33.3, 33.2 (33.25); H 4.6, 4.6 (4.6); N 4.6, 4.7 (4.65); Na 7.3 (absorption spectrophotometrically), 7.9 (calculated from sulphate ash); water, 2195%.

CgH805NNa.4H20 vaatii C 32,76? H 5,46; N 4,78; Na 7,8; vettä 24,57% Metallianalyysi: 1) Saatu atomiabsorptiospektrofotometrisestiiCgH805NNa.4H2O requires C, 32.76? H 5.46; N 4.78; Na 7.8; water 24.57% Metal analysis: 1) Obtained by atomic absorption spectrophotometry

Na 7,3 - 0,2 % (tämä arvo on ilmoitettu alkuaineanalyysin kohdalla) 2) Olettaen, että sulfaattituhka on Na2S04, laskettiin Na-pitoisuus 7,9 %.Na 7.3 to 0.2% (this value is reported for elemental analysis) 2) Assuming that the Sulphate Ash is Na 2 SO 4, the Na content was calculated to be 7.9%.

Optinen kierto; 0,134 % (paino/tilavuus) vesiliukoisen arvo 24°C:ssa oli +47°.Optical rotation; The value of 0.134% (w / v) water solubility at 24 ° C was + 47 °.

Ultravioletti spektri: 0,00098 % liuoksen 0,1M NaOHrssa UV-absorptiospektrissä oli absorptiomaksimi ( Λ max) kohdalla 258 nm -arvon ollessa 555.Ultraviolet spectrum: The UV absorption spectrum of a 0.00098% solution in 0.1M NaOH had an absorption maximum (Λ max) at 258 nm of 555.

Infrapunaspektri:Infrared spectrum:

Nujolissa ajetussa IR-spektrissä oli absorptiohuiput (cm ^) noin kohdilla: 3400 s 1592s 1288 m 1080 w 986 s 850 w 3300 s 1396 s 1206 w 1060 m 967 m 802 w 1792 s 1348 m 1190 m 1048 m 945 w 753 m 1690 s 1310 s 1138 m 1015 s 902 m 1665 m 1302 sh 1120 m 998 m 880 wThe IR spectrum in Nujol had absorption peaks (cm -1) at approximately: 3400 s 1592s 1288 m 1080 w 986 s 850 w 3300 s 1396 s 1206 w 1060 m 967 m 802 w 1792 s 1348 m 1190 m 1048 m 945 w 753 m 1690 s 1310 s 1138 m 1015 s 902 m 1665 m 1302 sh 1120 m 998 m 880 w

Koko spektri on esitetty liitteenä olevien piirroksien kuviossa 2.The full spectrum is shown in Figure 2 of the accompanying drawings.

NMR-spektri:NMR Spectrum:

Liuoksen protonin NMR-spektrissä raskaassa vedessä oli huippuryhmät (^-arvot), joiden keskipisteet olivat noin 4,28, 5,07, 5,82, 6,44 ja 6,88.The proton NMR spectrum of the solution in heavy water had peak groups (^ values) with centers of about 4.28, 5.07, 5.82, 6.44, and 6.88.

Esimerkki 6Example 6

Kaliumsuolan valmistusManufacture of potassium salt

Esimerkin 1 (ii) mukaan valmistettua litiumsuolaa (3,0 g) liuotettiin veteen (100 ml) ja ajettiin läpi Dowex 50W x 2-pylvään 19 64600 (450 ml; kaliumkierto. Esieluaatti (150 ml) hävitettiin. Seuraa-va 400 ml eluaattia kerättiin ja haihdutettiin 15 ml:ksi alennetussa paineessa. Butan-l-olia (340 ml) lisättiin ja seosta lämmitettiin ja ravistettiin hyvin. Hiukan liukenematonta kiinteää ainetta suodatettiin pois. Suodos tislattiin alennetussa paineessa 200 ml:ksi, varastoitiin sitten 4°C:ssa yli yön. Kiteinen sakka suodatettiin pestiin butan-l-olilla (2 x 10 ml), asetonilla (2 x 50 ml) ja dietyylieetterillä (2 x 50 ml) ja kuivattiin lopulta vakuumieksikkaattorissa ympäröivässä lämpötilassa. Saanto 2,34 g kaliumsuolaa. (E^ = 704). E^ määritettiin liuottamalla 7,1 mg kaliumsuolaa 100 ml:aan vettä. Tämä liuos laimennettiin yhdestä kymmeneen 0,1-m natriumhydroksidilla, jolloin saatiin lopullinen liuos 7,1 yug/ml.The lithium salt (3.0 g) prepared according to Example 1 (ii) was dissolved in water (100 ml) and passed through a Dowex 50W x 2 column 19 64600 (450 ml; potassium circulation. The pre-eluate (150 ml) was discarded. collected and evaporated to 15 ml under reduced pressure, butan-1-ol (340 ml) was added and the mixture was warmed and shaken well, a slightly insoluble solid was filtered off, the filtrate was distilled under reduced pressure to 200 ml, then stored at 4 ° C. The crystalline precipitate was filtered, washed with butan-1-ol (2 x 10 ml), acetone (2 x 50 ml) and diethyl ether (2 x 50 ml) and finally dried in a vacuum desiccator at ambient temperature to give 2.34 g of potassium salt. ^ = 704) .E 2 was determined by dissolving 7.1 mg of potassium salt in 100 ml of water, which was diluted from one to ten with 0.1 M sodium hydroxide to give a final solution of 7.1 μg / ml.

Alkuaineanalyysi:Elemental analysis:

Saatu: (keskiarvot on annettu suluissa) C 4Q,0, 40,14 (40,07)? H 3,5, 3,55 (3,53)? N 6,0, 5,82 (5,91); K (absorptiospektrofotometrisesti) 16,0 (sulfaattituhkana) 15,9; vettä 1,75, 1,95 (1,85 %).Found: (averages are given in parentheses) C 4Q, 0, 40.14 (40.07)? H 3.5, 3.55 (3.53)? N 6.0, 5.82 (5.91); K (absorption spectrophotometrically) 16.0 (as sulfate ash) 15.9; water 1.75, 1.95 (1.85%).

CgHgNOgK.1/4 H20 vaatii C 39,7? H 3,5? N 5,8? K 16,2? vettä 1,96 %.CgHgNOgK.1 / 4 H 2 O requires C 39.7? H 3.5? N 5.8? K 16.2? water 1.96%.

Optinen kierto: 0,276 % paino/tilavuus vesiliuoksen /G{ /^3 -arvo oli +58,4°.Optical rotation: 0.276% w / v aqueous solution / G {/ ^ 3 value was + 58.4 °.

Klavulaanihapon kalsium-, barium- ja magnesiumsuolat valmistettiin samalla tavalla litiumklavulanaatista ja niillä todettiin olevan E^ -arvot 530, 576 ja 713 vastaavasti.The calcium, barium and magnesium salts of clavulanic acid were similarly prepared from lithium clavulanate and were found to have E 1 values of 530, 576 and 713, respectively.

Esimerkki 7Example 7

Vapaan klavulaanihapon valmistusPreparation of free clavulanic acid

Esimerkin 1 (ii) mukaan valmistettu litiumsuola (500 mg) jaettiin etyyliasetaatin (10 ml) ja kyllästetyn natriumkloridin vesiliuoksen (10 ml) välillä. 2-n kloorivetyhappoa (1 ml) lisättiin ja seosta sekoitettiin nopeasti. Vesifaasi erotettiin, pestiin etyyliasetaatilla (10 ml) ja yhdistetyt orgaaniset uutteet pestiin kyllästetyllä natriumkloridin vesiliuoksella (15 ml). Saatu orgaaninen liuos kuivattiin natriumsulfaatilla ja haihdutettiin melkein kuiviin, jolloin saatiin vapaa happo öljynä (352 mg), joka sisälsi noin 0,5 moolia etyyliasetaattia. Yhdisteellä oli seuraavat ominaisuudet. /,y /^4 (c 1,0: DMSO) + 54,5°, Λ max 0,00098 % liuokselle υ 1 0,1-n vesiliuoksessa on 258 nm (E^ 590). Nujolissa on infrapuna- 20 64600 ) l \ \ huippuja kohdilla 3350, 1790 ja 1722 cm NMR-huippuja (DMSO-dg) kohdilla £^4,31 (d, 3 Hz), 4,99 (s) , 5,23 Xt, 7Hz) , 5,97 (d,7 Hz), 6,37 ja 6,93 (dd, 3 ja 17 Hz; d, 17 Hz); huiput, joiden keskipiste on kohdilla 8,82, 8,00 ja 5,95 osoittavat, että näyte sisälsi noin 0,5 moolia etyyliasetaattia klavulaanihappomoolia kohti. Nämä arvot osoittavat, että näyte sisälsi vähintään 85 % painosta klavulaanihappoa.The lithium salt (500 mg) prepared according to Example 1 (ii) was partitioned between ethyl acetate (10 ml) and saturated aqueous sodium chloride solution (10 ml). 2N Hydrochloric acid (1 ml) was added and the mixture was stirred rapidly. The aqueous phase was separated, washed with ethyl acetate (10 ml) and the combined organic extracts were washed with saturated aqueous sodium chloride solution (15 ml). The resulting organic solution was dried over sodium sulfate and evaporated to near dryness to give the free acid as an oil (352 mg) containing about 0.5 moles of ethyl acetate. The compound had the following properties. [.alpha.] D @ 20 (c 1.0: DMSO) + 54.5 DEG C., .alpha. Nujol has infrared peaks at 3350, 1790 and 1722 cm NMR peaks (DMSO-d 6) at ε 4.31 (d, 3 Hz), 4.99 (s), 5.23 X , 7Hz), 5.97 (d, 7 Hz), 6.37 and 6.93 (dd, 3 and 17 Hz; d, 17 Hz); peaks with centers at 8.82, 8.00, and 5.95 indicate that the sample contained about 0.5 moles of ethyl acetate per mole of clavulanic acid. These values indicate that the sample contained at least 85% by weight of clavulanic acid.

Esimerkki 8Example 8

Ammoniumsuolan valmistusPreparation of ammonium salt

Dowex 50W-pylväs (240 ml) muutettiin ammoniumkiertoon käsittelemällä ammoniumsulfaatilla ja pestiin puhtaaksi sulfaatista vedellä. Litiumsuola (1,0 g) liuotettiin veteen (15 ml), siirrettiin pylvääseen ja pylväs kehitettiin vedellä. Reaktioita (25 ml) kerättiin ja kokeiltiin UV-absorptiolla 0,1-n natriumhydroksidissa. Aktiiviset fraktiot (4-7) yhdistettiin ja tislattiin lähes kuiviin (2 ml) alennetussa paineessa ja n-butanolia (85 ml) lisättiin. Seos tislattiin varovaisesti 25°C:ssa 0,1 mm paineessa, kunnes kiteinen aine saostui. Ammoniumsuola kerättiin suodattamalla, pestiin hyvin pienellä määrällä etanolia, asetonia ja lopuksi pestiin di-etyylieetterillä ja kuivattiin 0,1 mm:ssä 6 tunnin ajan, jolloin saatiin valkeita kiteitä (0,54 g) . (c 0,39 % vedessä) +60,1°;The Dowex 50W column (240 mL) was converted to ammonium circulation by treatment with ammonium sulfate and washed free of sulfate with water. The lithium salt (1.0 g) was dissolved in water (15 ml), transferred to a column and the column developed with water. Reactions (25 mL) were collected and tested by UV absorption in 0.1 N sodium hydroxide. The active fractions (4-7) were combined and distilled to near dryness (2 ml) under reduced pressure, and n-butanol (85 ml) was added. The mixture was carefully distilled at 25 ° C under 0.1 mm pressure until a crystalline substance precipitated. The ammonium salt was collected by filtration, washed with a very small amount of ethanol, acetone and finally washed with diethyl ether and dried at 0.1 mm for 6 hours to give white crystals (0.54 g). (c 0.39% in water) + 60.1 °;

Xmax (0,1N natriumhycfiroksidi, 8,8 yUg/ml) 258 nm (E^ 745); IR-huippuja nujolissa oli kohdilla 3360, 1780, 1700 ja 1580 cm (5 % D20) arvoihin kuuluivat 4,27 (d, 3Hz), 5,08 (s),5,09 (t,7Hz), 5,84 (d, 7Hz), 6,43 (dd, 17Hz, 3Hz) ja 6,89 (d, 17Hz).Λmax (0.1N sodium hydroxide, 8.8 μg / ml) 258 nm (λmax 745); The IR peaks in the nujol at 3360, 1780, 1700, and 1580 cm (5% D 2 O) were 4.27 (d, 3Hz), 5.08 (s), 5.09 (t, 7Hz), 5.84 ( d, 7Hz), 6.43 (dd, 17Hz, 3Hz) and 6.89 (d, 17Hz).

Saatu: C 44,4; H 5,6; N 13,3 % CgHgNOgNH^ vaatii C 44,4; H 5,6; N 13,0 %. Karl Fischer-analyysillä todettiin jäänteitä vedestä (0,6 %) .Found: C, 44.4; H 5.6; N 13.3% C 9 H 9 NO 9 NH 4 requires C, 44.4; H 5.6; N 13.0%. Residues from water (0.6%) were detected by Karl Fischer analysis.

Esimerkki 9Example 9

Metyyliamiinisuolan valmistusPreparation of methylamine salt

Amberlite IR 12Q H -pylväs (20Q ml) muutettiin metyyliammo-niummuotoon käsittelemällä 0,5M metyyliamiiniliuoksella vedessä.The Amberlite IR 12Q H column (20 mL) was converted to the methylammonium form by treatment with a 0.5M solution of methylamine in water.

Tämä pestiin neutraaliksi vedellä ja metyyliammoniumkloridia (3,0 g) vedessä (10 ml) lisättiin. Pylväs pestiin vapaaksi kloridista vedellä ja oli valmis käyttöön.This was washed neutral with water and methylammonium chloride (3.0 g) in water (10 ml) was added. The column was washed free of chloride with water and ready for use.

Litiumsuola (1,50 g) liuotettiin veteen (15 ml) ja kaadettiin pylvään yläpinnalle. Pylväs kehitettiin vedellä ja fraktiot 64600 21 (25 ml) kerättiin. Fraktiot 3-7 yhdistettiin (161 ml pesuliuok-sineen), tislattiin 35°/l,0 mm:ssa noin 2 ml:ksi ja n-butanolia (200 ml) lisättiin. Kirkas liuos tislattiin samanlaisissa olosuhteissa 20 ml:ksi, jolloin kiteytyminen tapahtui. Kiteet kerättiin suodattamalla 1 tunnin kuluttua 2°:ssa, pestiin dietyylieetterillä (2 x 15 ml) ja kuivattiin 3 tunnin ajan 1 mmissä, jolloin saatiin metyyliamiinisuola (1,2 g) valkeina pitkulaisina kidekimppuina.The lithium salt (1.50 g) was dissolved in water (15 ml) and poured onto the top of the column. The column was developed with water and fractions of 64600 21 (25 ml) were collected. Fractions 3-7 were combined (161 ml with washing solution), distilled at 35 ° / 1.0 mm to about 2 ml and n-butanol (200 ml) was added. The clear solution was distilled under similar conditions to 20 ml, whereupon crystallization occurred. The crystals were collected by filtration after 1 hour at 2 °, washed with diethyl ether (2 x 15 ml) and dried for 3 hours at 1 mm to give the methylamine salt (1.2 g) as white oblong crystals.

(c 0,23 % vedessä) +56,1°, Λ max (0,1-n natriumhydroksidi, 9,5 ^,ug/ml) 260 nm, (E1 584) ; IR-huippuja nujolissa oli kohdilla 2500, 1790, 1692, 1632 ja 1576 cm ^? ^*(8 % DjO) arvoja olivat 6,40 ja 6,86 (dd, 17Hz, 3Hz; d, 17 Hz), 4,24 (d, 3Hz), 5,06 (t, 7Hz), 5,78 (d, 7Hz), 5,08 (s), 7,42 (s). Saatu C 46,7? H 6,1; N 12,5 %. vaatii C 47,0; H 6,1 ja N 12,2 %.(c 0.23% in water) + 56.1 °, λ max (0.1 N sodium hydroxide, 9.5 μg / ml) 260 nm, (E1 584); There were IR peaks in the nujol at 2500, 1790, 1692, 1632 and 1576 cm -1. ^ * (8% DjO) values were 6.40 and 6.86 (dd, 17Hz, 3Hz; d, 17Hz), 4.24 (d, 3Hz), 5.06 (t, 7Hz), 5.78 (d, 7Hz), 5.08 (s), 7.42 (s). Received C 46.7? H 6.1; N 12.5%. requires C 47.0; H 6.1 and N 12.2%.

Esimerkki 10Example 10

Piperidllnisuolan valmistus (R) oninvaihtohartsipylväs (200 ml Bio-Rad Laboratories, AG 50Wx2, 100-200 mesh H -muoto) muutettiin piperidiinimuotoon piperi-diiniliuoksella (75 ml)vedessä (1500 ml). Hartsi pestiin neutraaliksi vedellä ja käsiteltiin piperidiinikloridilla (3 g) vedessä (10 ml). Pylväs pestiin vapaaksi kloridista vedellä ja oli valmis käyttöön.Preparation of the piperidine salt (R) An onion exchange resin column (200 ml Bio-Rad Laboratories, AG 50Wx2, 100-200 mesh H form) was converted to the piperidine form with a solution of piperidine (75 ml) in water (1500 ml). The resin was washed neutral with water and treated with piperidine chloride (3 g) in water (10 mL). The column was washed free of chloride with water and ready for use.

Litiumsuola (1,50 g) kaadettiin pylvään yläpinnalle vedessä (15 ml) ja pylväs kehitettiin vedessä ottaen 25 ml fraktiot. Fraktiot 3-6 yhdistettiin pesuliuosten kanssa (172 ml).Lithium salt (1.50 g) was poured onto the top of the column in water (15 ml) and the column was developed in water taking 25 ml fractions. Fractions 3-6 were combined with washings (172 mL).

Liuos haihdutettiin lähes kuiviin 35°/l,0 mm:ssä ja puhdasta tolueenia lisättiin, öljymäinen suspensio haihdutettiin kuiviin alennetussa paineessa kuten yllä ja kiteinen kiinteä aine, joka näin saatiin, jauhettiin hienoksi etyyliasetaatissa (90 ml). Kiteinen piperidiinisuola kerättiin suodattamalla, pestiin etyyliasetaatilla (3 x 30 ml) ja jäljelle jäänyt liuotin poistettiin 0,1 mmHg paineessa 3 tunnin aikana, jolloin saatiin 1,775 g hiukan likaisenThe solution was evaporated to near dryness at 35 ° / 1.0 mm and pure toluene was added, the oily suspension was evaporated to dryness under reduced pressure as above and the crystalline solid thus obtained was triturated in ethyl acetate (90 ml). The crystalline piperidine salt was collected by filtration, washed with ethyl acetate (3 x 30 mL), and the remaining solvent was removed at 0.1 mmHg over 3 hours to give 1.775 g of a slightly dirty

valkoisia kiteitä. /jbC/^ (c 0,35 % vedessä) +42,2°; ^\max (0,1Nwhite crystals. [α] 25 D (c 0.35% in water) + 42.2 °; λ max (0.1 N

u 1 natriumhydroksidi, 10 ^,ug/ml) 259,5 nm (E^ 474); IR-huippuja nujolissa oli kohdilla 3380, 2540, 1782 ja 1608 cm "S '“ZT(8 % D2O) arvoja oli 6,90 (d, 17Hz), 6,44 (dd3, 17Hz), 4,28 (d, 2Hz), 4,28 (d, 2Hz), 5,08 (s), 5,84 (d, 8Hz), 5,08 (t, 7Hz), 6,84 (monimutkainen multipletti), 8,0-8,5 (monimutkainen multipletti).u 1 sodium hydroxide, 10 μg / ml) 259.5 nm (E ^ 474); The IR peaks in the nujol at 3380, 2540, 1782, and 1608 cm -1 "ZT (8% D 2 O) were 6.90 (d, 17Hz), 6.44 (dd3, 17Hz), 4.28 (d, 2Hz), 4.28 (d, 2Hz), 5.08 (s), 5.84 (d, 8Hz), 5.08 (t, 7Hz), 6.84 (complex multiplet), 8.0-8 .5 (complex multiplet).

6460064600

Saatu C 52,8; H 7,2; N 9,3 % C13H20N2°5*^'6 H2° vaatii c 52#9; H 7,4; ja N 9,5 %.Found C 52.8; H 7.2; N 9.3% C 13 H 20 N 2 O 5 * · 16 H 2 ° requires c 52 # 9; H 7.4; and N 9.5%.

Esimerkki 11Example 11

Trietyyliamiinlsuolan valmistusPreparation of triethylamine salt

Esimerkissä 10 kuvattu ioninvaihtohartsipylväs (Bio-Rad (R) AG 50W) muutettiin trietyyliammoniummuotoon trietyyliamiinin vesiliuoksella (0,5N, 1,5 1) ja pestiin neutraaliksi vedellä. Tri-etyyliammoniumkloridin (3 g) vesiliuosta (15 ml) lisättiin pylvääseen. Pylväs pestiin vapaaksi kloridista vedellä ja se oli valmis käyttöön.The ion exchange resin column described in Example 10 (Bio-Rad (R) AG 50W) was converted to the triethylammonium form with aqueous triethylamine (0.5N, 1.5 L) and washed neutral with water. An aqueous solution of triethylammonium chloride (3 g) (15 ml) was added to the column. The column was washed free of chloride with water and was ready for use.

Litiumsuola (1,5 g) kaadettiin pylvään yläpinnalle vedessä (15 ml) ja pylväs kehitettiin vedellä ottaen 25 ml fraktiot. Fraktiot 4-9 kerättiin yhteen (175 ml pesuliuoksineen).The lithium salt (1.5 g) was poured onto the top of the column in water (15 ml) and the column was developed with water taking 25 ml fractions. Fractions 4-9 were collected together (175 ml with washings).

Liuos keitettiin kokoon alennetussa paineessa (35°/l,0 mm), jolloin saatiin öljy, joka keitettiin kokoon kolme kertaa toluee-nin kanssa samoissa olosuhteissa. Saadut kiteet rikottiin etyyliasetaatissa (50 ml), kerättiin suodattamalla, pestiin kahdesti dietyylieetterillä (2 x 20 ml) ja vapautettiin jäljelle jääneestä liuottimesta eksikkaattorissa 3 tunnin ajan 0,1 mm:ssä jolloin saatiin trietyyliammoniumsuola (1,588 g) hiukan likaisenvalkoi-sina kiteinä. (c 0,22 % vedessä) +44,3°; X max (0,1-n nat- riumhydroksidi, 9,7 ^,ug/ml) 258 nm (E1 485); IR-huippuja nujolis-sa on kohdilla 3250, 2080, 1784, 1700 ja 1640 cm"1; ^(10 % D20) arvoja on 6,41 ja 6,87 (dd 17Hz, 3Hz:d 17Hz), 4,26 (d, 3Hz), 5,07 (t,7Hz), 5,78 (d, 7Hz), 5,07 (s), 8,74 (t, 7Hz) ja 6,78 (q, 7Hz). Saatu C 55,2; H 7,9; N 9,2 %. C14H24N205.1/4 H20 vaatii C 55,2; H 8,0 ja N 9,2 %.The solution was boiled under reduced pressure (35 ° / 1.0 mm) to give an oil which was boiled three times with toluene under the same conditions. The resulting crystals were broken up in ethyl acetate (50 ml), collected by filtration, washed twice with diethyl ether (2 x 20 ml) and freed from the remaining solvent in a desiccator for 3 hours at 0.1 mm to give the triethylammonium salt (1.588 g) as slightly off-white crystals. (c 0.22% in water) + 44.3 °; Λ max (0.1 N sodium hydroxide, 9.7 μg / ml) 258 nm (E1 485); The IR peaks in nujolis at 3250, 2080, 1784, 1700 and 1640 cm -1; (10% D 2 O) are 6.41 and 6.87 (dd 17Hz, 3Hz: d 17Hz), 4.26 ( d, 3Hz), 5.07 (t, 7Hz), 5.78 (d, 7Hz), 5.07 (s), 8.74 (t, 7Hz) and 6.78 (q, 7Hz). 55.2, H 7.9, N 9.2%, C 14 H 24 N 2 O 5 .1 / 4 H 2 O requires C 55.2, H 8.0 and N 9.2%.

Esimerkki 12Example 12

Streptomyces clavuligerus-kannan NRR4 3585 viljelyliemestä eristetty hiilieluaattinäyte väkevöitiin alennetussa paineessa asetonin poistamiseksi. Saatu väkevöite (1 1; joka biokokeen mukaan sisälsi 1,28 g klavulaanihappoa) kaadettiin IRA68-hartsipylvääseen (kloridikierto; 100 ml). Pylväs pestiin vedellä (300 ml) ja eluoi-tiin 5 % (paino/tilavuus) litiumkloridin vesiliuoksella keräten eluaatti 100 ml fraktioina.A sample of carbon eluate isolated from the culture broth of Streptomyces clavuligerus strain NRR4 3585 was concentrated under reduced pressure to remove acetone. The resulting concentrate (1 L; which contained 1.28 g of clavulanic acid according to the bioassay) was poured onto an IRA68 resin column (chloride cycle; 100 mL). The column was washed with water (300 mL) and eluted with 5% (w / v) aqueous lithium chloride collecting the eluate in 100 mL fractions.

23 6460023 64600

Fraktiot 1 ja 2 yhdistettiin (200 ml), haihdutettiin alennetussa paineessa 40 ml:ksi ja jätettiin 4°C:seen yli yön. Muodostuneet kiteet suodatettiin, pestiin peräkkäin etanolilla (lo ml), asetonilla (50 ml) ja dietyylieetterillä (50 ml) ennen kuivaamista tyhjössä, jolloin saatiin 530 mg valkoista kiinteää ainetta (E^ 802), joka tarkoitti 40,8 % saantoa hiilieluaatista.Fractions 1 and 2 were combined (200 ml), evaporated under reduced pressure to 40 ml and left at 4 ° C overnight. The formed crystals were filtered, washed successively with ethanol (10 ml), acetone (50 ml) and diethyl ether (50 ml) before drying in vacuo to give 530 mg of a white solid (E 2 802), which represented a yield of 40.8% of the carbon eluate.

Saman tilavuuden kyllästettyä litiumkloridin vesiliuosta lisääminen emäliuoksiin, jota seurasi varastointi 4°C:ssa, tuotti toisen sadon, edellä kuvatulla tavalla valmistettuna 178 mg (E^ 740), joka tarkoitti 12,7 % lisäsaantoa.Addition of an equal volume of saturated aqueous lithium chloride to the mother liquors, followed by storage at 4 ° C, afforded a second crop, prepared as described above, 178 mg (E ^ 740), representing an additional yield of 12.7%.

Sarjassa samanlaisia kokeita litiumkloridieluentin väkevyyttä, ioninvaihtohartsia ja eluenttikätionin ja vastaavan anio-nin luonnetta muuteltiin, jolloin saatiin taulukoidut tulokset.In a series of similar experiments, the concentration of the lithium chloride eluent, the ion exchange resin, and the nature of the eluent ion and the corresponding anion were modified to give tabulated results.

Hartsi Kierto Eluentti (molaarisuus) Tuotteen 6aanto $ *)Resin Rotation Eluent (Molarity) Product Yield 6 $ *)

Amberlite kloridi litiurakloridi 750 51»8 IRA 68 (0,5M)Amberlite Chloride Lithium Chloride 750 51 »8 IRA 68 (0.5M)

Amberlite kloridi litiumkloridi 760 55»6 IRA 95 (1»0M)Amberlite Chloride Lithium Chloride 760 55 »6 IRA 95 (1» 0M)

Amberlite kloridi litiumkloridi 640 44,5 IRA 95 (0,5M)Amberlite chloride lithium chloride 640 44.5 IRA 95 (0.5M)

Amberlyst kloridi litiumkloridi 650 54,5 A 21 (1,0M)Amberlyst chloride lithium chloride 650 54.5 A 21 (1.0M)

Amberlite asetaatti 0 litiumasetaatti 660· 56,8 IRA 68 (0,5M)Amberlite acetate 0 lithium acetate 660 · 56.8 IRA 68 (0.5M)

Amberlite formiaatti 0 ammoniumformiaatti 520 55,9 IRA 68 (0,5M) k) 'Tuotteen saanto on laskettu hiilieluaatin lähtömäärästä.Amberlite formate 0 ammonium formate 520 55.9 IRA 68 (0.5M) k) 'The yield of the product is calculated from the starting amount of carbon eluate.

^Näissä kokeissa litiumsuola oli valmistettu väkevöimällä eluaatit x 6 ja lisäämällä sama tilavuus 5Q % (paino/tilavuus) litium-kloridiliuosta. Saadut litiumsuolat käsiteltiin kuten edellä.In these experiments, the lithium salt was prepared by concentrating the eluates x 6 and adding the same volume of 50% (w / v) lithium chloride solution. The resulting lithium salts were treated as above.

24 64 60024 64 600

Esimerkki 13Example 13

Hiilieluaattinäyte (vrt. esim. 12) (4 litraa) ajettiin IRA68-pylvään (kloridikierto; 250 ml) läpi, joka sitten pestiin vedellä (250 ml) ja eluoitiin 5 % (paino/tilavuus) litiumkloridi-liuoksella. 200 ml eluaattia, joka sisälsi 73 % lähtöaineen biologisesta aktiivisuudesta, kerättiin. Näyte (70 ml) tätä eluaat-tia käsiteltiin 5 tilavuudella propan-2-olia sekoittaen, jolloin saatiin tervamainen sakka. Neste kaadettiin pois ja väkevöitiin alennetussa paineessa 7 ml:ksi. Seisottuaan 4°C:ssa yli yön kiteinen tuote suodatettiin, pestiin peräkkäin etanolilla, asetonilla ja dietyylieetterillä ennen kuivaamista tyhjössä. Kuiva kiinteä aine (870 mg) todettiin puhtaaksi biokokeella, ja se edusti 94 % saantoa hartsipylvään eluaatista.A sample of carbon eluate (cf. e.g. 12) (4 liters) was passed through an IRA68 column (chloride cycle; 250 ml) which was then washed with water (250 ml) and eluted with 5% (w / v) lithium chloride solution. 200 ml of eluate containing 73% of the biological activity of the starting material was collected. A sample (70 ml) of this eluate was treated with 5 volumes of propan-2-ol with stirring to give a tarry precipitate. The liquid was poured off and concentrated under reduced pressure to 7 ml. After standing at 4 ° C overnight, the crystalline product was filtered, washed successively with ethanol, acetone and diethyl ether before drying in vacuo. The dry solid (870 mg) was found to be pure by bioassay and represented 94% yield of the resin column eluate.

Esimerkki 14 IRA68-hartsipylväs (kloridikierto; 50 ml) täytettiin hiili-eluaatilla (vrt. esim. 12) (840 ml), joka oli valmistettu valmis tuksen 3 tavalla, pestiin vedellä (100 ml) ja eluoitiin 5 % (paino/-tilavuus) litiumkloridilla propan-2-oli:vesiseoksessa (5:1). Ensimmäiset 5 pylvään tilavuutta väkevöitiin alennetussa paineessa, antibiootti kiteytettiin kuten esimerkissä 13. Kiinteä aine painoi 292 mg, (Biokoe: 970 mg litiumklavulanaattia/mg kiinteää ainetta) ja vastasi 45 % saantoa hiilieluaatista.Example 14 An IRA68 resin column (chloride cycle; 50 ml) was packed with carbon eluate (cf. e.g. 12) (840 ml) prepared in Preparation 3, washed with water (100 ml) and eluted with 5% (w / v). ) with lithium chloride in propan-2-ol: aqueous (5: 1). The volumes of the first 5 columns were concentrated under reduced pressure, the antibiotic was crystallized as in Example 13. The solid weighed 292 mg, (Bioassay: 970 mg lithium clavulanate / mg solids) and corresponded to a 45% yield of carbon eluate.

Esimerkki 15Example 15

Streptomyces clavuligerus-kannan NRRL 3585 viljelyliemen suodatettu näyte (1 1), joka sisälsi 0,43 g klavulaanihappoa (biologinen koe) ajettiin IRA93-hartsipylvään läpi (kloridikierto; 100 ml). Pylväs pestiin laimealla etikkahapolla (0,25 M; 200 ml), vedellä (750 ml) ja eluoitiin litiumkloridin vesiliuoksella (IM). Ensimmäinen 150 ml eluaattia, joka sisälsi 0,28 g klavulaanihappoa (biologinen koe) väkevöitiin alennetussa paineessa 15 ml:ksi ja varastoitiin 4°C:ssa yli yön. Tuote suodatettiin, pestiin peräkkäin etanolilla, asetonilla ja dietyylieetterillä ennen kuivaamista ilmassa, jolloin saatiin 668 mg kiinteää ainetta (E^ 245), joka tarkoitti 47 % saantoa suodatetusta liuoksesta.A filtered sample (1 L) of a culture broth of Streptomyces clavuligerus strain NRRL 3585 containing 0.43 g of clavulanic acid (biological experiment) was passed through an IRA93 resin column (chloride cycle; 100 ml). The column was washed with dilute acetic acid (0.25 M; 200 mL), water (750 mL) and eluted with aqueous lithium chloride (1M). The first 150 ml of eluate containing 0.28 g of clavulanic acid (biological test) was concentrated under reduced pressure to 15 ml and stored at 4 ° C overnight. The product was filtered, washed successively with ethanol, acetone and diethyl ether before air drying to give 668 mg of a solid (E 2 245) which represented a 47% yield of the filtered solution.

Esimerkki 16Example 16

Viljelyliemen suodatettu näyte (vrt. esim. 15) (2 1), joka sisälsi 1,23 g klavulaanihappoa (biologinen koe) ajettiin IRA93- 64600 25 hartsipylvään läpi (kloridikierto; 240 ml). Pylväs pestiin vedellä (500 ml), propan-2-oli:vesiseoksella (5:1; 400 ml) ja eluoitiin sitten 5 % (paino/tilavuus) litiumkloridillä propan-2-oli:vesi-seoksessa (5:1). Ensimmäiset 97Q ml eluaattia väkevöitiin alennetussa paineessa 100 ml:ksi ja varastoitiin 4°C:ssa 2 päivän ajan. Tuote suodatettiin ja pestiin kuten esimerkissä 15, jolloin saatiin 286 mg kiinteää ainetta (E^ 662) joka vastasi 19 % saantoa suo datetusta liuoksesta.A filtered sample of the culture broth (cf. e.g. 15) (2 L) containing 1.23 g of clavulanic acid (biological test) was passed through an IRA93-64600 resin column (chloride cycle; 240 ml). The column was washed with water (500 mL), propan-2-ol: water (5: 1; 400 mL) and then eluted with 5% (w / v) lithium chloride in propan-2-ol: water (5: 1). The first 97 ml of eluate was concentrated to 100 ml under reduced pressure and stored at 4 ° C for 2 days. The product was filtered and washed as in Example 15 to give 286 mg of a solid (E 2 662) corresponding to a 19% yield of the filtered solution.

Esimerkki 17Example 17

Viljelyliemen suodatettu näyte (vrt. esim. 15) (500 ml) täytettiin IRA93-pylvääseen (kloridikierto; 50 ml). Pylväs pestiin vedellä (50 ml) ja 95 % etanolin vesiliuoksella (100 ml) ennen eluointia litiumkloridilla (1 % paino/tilavuus 95 % etanolin vesi-liuoksessa; 50 ml fraktiot). Fraktiot 2 ja 3 yhdistettiin ja haihdutettiin alennetussa paineessa, kunnes kiinteä aine alkoi saostua. Väkevöite jäähdytettiin +4°C:seen 3/4 tunnin ajaksi ja kiinteä aine kerättiin sintterisuodattimelle. Kiinteä aine pestiin etanolilla, asetonilla ja dietyylieetterillä ja kuivattiin 1/2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa tyhjöuunissa, jolloin saatiin 89 mg litiumkalvu-lanaattia (E^ 770), joka vastaa 32 % saantoa suodatetusta liuoksesta.A filtered sample of the culture broth (cf. e.g. 15) (500 ml) was loaded onto an IRA93 column (chloride cycle; 50 ml). The column was washed with water (50 ml) and 95% aqueous ethanol (100 ml) before eluting with lithium chloride (1% w / v in 95% aqueous ethanol; 50 ml fractions). Fractions 2 and 3 were combined and evaporated under reduced pressure until a solid began to precipitate. The concentrate was cooled to + 4 ° C for 3/4 hours and the solid was collected on a sinter filter. The solid was washed with ethanol, acetone and diethyl ether and dried for 1/2 hour at room temperature in a vacuum oven to give 89 mg of lithium membrane lanate (E ^ 770), corresponding to a 32% yield of the filtered solution.

Esimerkki 18Example 18

Hiilieluaatti (vrt. esim. 12) (5 litraa) ajettiin IRA68 pylvään (500 ml tilavuudeltaan) kloridikierrossa 1 litran tuntivauhtia. Pylväs pestiin vedellä (1 litra) ja eluoitiin 0,5M natrium-kloridiliuoksella. Ensimmäinen eluaattilitra väkevöitiin pyörö-haihduttimessa 90 ml:ksi. Annos väkevöitettä (10 ml) käsiteltiin propan-2-olilla (50 ml) sekoittaen. Neste kaadettiin tervamaisesta muodostuneesta sakasta, väkevöitiin pyöröhaihduttimella 3 ml tilavuuteen ja käsiteltiin 3 ml:11a 30 % paino/tilavuus litiumklo-ridiliuoksella. Seisottuaan 4°C:ssa yli yön tuote suodatettiin, pestiin peräkkäin etanolilla ja dietyylieetterillä ja kuivattiin valkean jauheen saamiseksi, 280 mg, E^ 770.The carbon eluate (cf. e.g. 12) (5 liters) was run on a chloride circuit of an IRA68 column (500 ml volume) at a rate of 1 liter per hour. The column was washed with water (1 liter) and eluted with 0.5M sodium chloride solution. The first liter of eluate was concentrated on a rotary evaporator to 90 ml. A portion of the concentrate (10 mL) was treated with propan-2-ol (50 mL) with stirring. The liquid was poured from the tar-like precipitate, concentrated on a rotary evaporator to a volume of 3 ml and treated with 3 ml of 30% w / v lithium chloride solution. After standing at 4 ° C overnight, the product was filtered, washed successively with ethanol and diethyl ether and dried to give a white powder, 280 mg, E 770.

Esimerkki 19Example 19

Litiumklavulanaattia (E^ 667; 2,0 g valmistettu kuten esimerkissä 15, jota seurasi käsittely isopropyylialkoholilla) liuotettiin veteen (16 ml) ja suodatettiin; etanolia (64 ml) lisättiin 64600 26 varovaisesti ja seosta sekoitettiin ympäröivässä lämpötilassa 1 tunnin ajan. Aluksi muodostunut sakka ei sisältänyt litiumklavu-lanaattia UV-spektroskooppisesti tutkittuna ja se hävitettiin. Neste laimennettiin kyllästetyllä litiumkloridiliuoksella (16 ml) ja asetettiin syrjään kiteytymään 2 1/2 tunniksi. Kiteet kerättiin suodattamalla, kuivattiin imulla, pestiin asetonilla (2 x 15 ml), dietyylieetterillä (2 x 20 ml) ja kuivattiin tyhjössä vakio-painoon (1,350 g) 735).Lithium clavulanate (E 2 667; 2.0 g prepared as in Example 15 followed by treatment with isopropyl alcohol) was dissolved in water (16 mL) and filtered; ethanol (64 ml) was added carefully to 64600 26 and the mixture was stirred at ambient temperature for 1 hour. The precipitate initially formed did not contain lithium clavonate as examined by UV spectroscopy and was discarded. The liquid was diluted with saturated lithium chloride solution (16 mL) and set aside to crystallize for 2 1/2 hours. The crystals were collected by filtration, dried by suction, washed with acetone (2 x 15 ml), diethyl ether (2 x 20 ml) and dried in vacuo to constant weight (1.350 g) (735).