FI57112C - Foerfarande foer framstaellning av antiinflammatoriska epsilon-n-karbamylorgoteiner - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av antiinflammatoriska epsilon-n-karbamylorgoteiner Download PDFInfo
- Publication number
- FI57112C FI57112C FI762566A FI762566A FI57112C FI 57112 C FI57112 C FI 57112C FI 762566 A FI762566 A FI 762566A FI 762566 A FI762566 A FI 762566A FI 57112 C FI57112 C FI 57112C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- orgotein
- organotein
- groups
- carbamylated
- amino groups
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
f53Fn ΓβΊ <11} KUULUTUSjULKA'80 - l J '; UTLÄOGNINOSSKRIFT 5/112 3¾¾ C Patentti siySnn·' U,y 10 06 19.10 ^ Patent meddelat ^ T ^ (S1) Ky.ik*/i"t.a.» C 07 G 7/0*1“ SUOMI —FINLAND (21) P»t«nttlh.k«mu»-P»*ntiM*tailni 762566 (22) H*k«ml*pUvl — Amttknlngidig 07·09·?6 ' (23) Alkupilvl — GIM|h«tadag 07.09.76 (41) Tullut |ulkb«k(l — BllvK offwttlig 10.03*77 I* ΝΙΜΜΜρμμ I. tl*»*». 00
Patent- och registerstyralMn ' ' Anastan utlatd odt utUkrlftM pubNcand 29.02.o0 (32)(33)(31) Pyydetty etuolkeu*—Segird prioritet 09·09·75 09-09.75 09.12.75 USA(US) 611657 611659 639076 (71) Diagnostic Data, Inc., 518 Logue Avenue, Mountain View, California 92+0^3, USA (US) (72) Wolfgang Huber, Atherton, California, Mark G. Saifer, Berkeley,
California, Lewis D. Williams, Menlow Park, California, USA(US) (7*0 Oy Roister Ab (5*+) Menetelmä tulehdusta estävien fc-N-karbamyyliorgoteiinien valmistamiseksi - Förfarande för framställning av anti-inflammatoriska fc-N-karbamylorgo-teiner Tämän keksinnön kohteena on menetelmä tulehdusta estävien £.-N-karbanyyli-orgoteiinien valmistamiseksi.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että annetaan orgoteii-nin, kuten naudan orgoteiinin, reagoida karbamylointiaineen, kuten alkalimetalli-syanaatin, alkyyli-isosyanaatin, alkyyli-isotiosyanaatin, aryyli-isosyanaatin tai aryyli-isotiosyanaatin kanssa N-karbamyloidun orgoteiinin tuottamiseksi, jossa on karbasyyliiyhmä ainakin yhdessä sen lysiinin g-amino- ryhmässä, ja jossa edullisesti on vähintään 2-10 karbaayloitua aminoryhmää molekyyliä kohti.
Orgoteiini on vesiliukoinen proteiinijohdaimainen oleellisesti puhtaassa, injektoitavassa muodossa, so. oleellisesti puhdas muista proteiineista, ks. US-patentti 3 758 682, sekä suomalaiset patentit 1*8 603, 1*8 7M*, 1*8 881*, 1*8 932, 1*9 Π0 ja 1*9 983.
Orgoteiinilla on luonteenomainen fysikaalisten, kemiallisten, biologisten ja farmakodynaamisten ominaisuuksien yhdistelmä. Se on pallomainen, puskuri- ja vesiliukoinen proteiiniyhdiste, jolla on erittäin luja natiivi rakenne, vaikka se 2 57112 onkin lämpölabiili, on se kuitenkin melko stabiili puskuriliuoksessa, jonka pH on U—10, ja kestää 65°C kuumentamisen useita minuutteja. Kemiallisesti orgoteiinille on luonteenomaista, että se sisältää yleensä kaikkia proteiini aminohappoja, pienen määrän hiilihydraattia, ei lainkaan lipidejä, 0,1 - 1,0 % metallia, eli 0-5 gramma-atomia (moolia kohti) yhtä tai useampaa kelatoitua kaksiarvoista metallia, jonka ionisäde on 0,60 - 1,00 A, eikä oleellisesti lainkaan kelatoimatonta yksiarvoista metallia eikä myrkyllistä metallia.
Orgoteiinijohdannaisten aminohappokoostumus on huomattavan yhdenmukainen riippumatta lähteestä, josta ne on eristetty.
Taulukossa I on esitetty orgoteiinin aminohappokoostumus.
3 57112
• H MOI^O CO O VO LCN O l— LT\ CO
Ai O OJ 00 r- CO tf\ (VJ Γ- tvj A '.Cl OS r- CO CU C\J -J CO τι n >· I I I I I I 1 1' I I I I I I I I I I CO
01 L COU) 0\A r- t-A A CM CO r· O ΓΊΌ O O O' I
i*J E 1— CM CM tf\ r- r- r «- <-»-«— CM -3f
O
E CO
tl E
01 OJ
E CM CO f~ OO CO *- --t C— O CO r- CO CM 0\ CO CM A! O CO
• H CM CO CM ia r- r- CM CM . r- r- T- P, CO <- A -3
··* M H
•H
4> Ή
Jr a) ei
0 X
X -H
O
Id) O. CO CO VO O VO VO t - ΙΓΝ ΙΛ r- CO CO CO UN CO t- CM o •rl rl w m r- OI 1Λ r- <- (\| ·- >- r- CO t- H E »-
£ S
AI «
01 H
0 H 3 •rl 10
E "rl E CMCO-M-y ON CO LP. CO C— O CM CC> CM CO t— *H CM ON
•H a E CM (O CM ΙΓΝ »“* 1— t— CM r r· r- «: m o
•rl ·H i»' CO
01 ·Η -P 01 o +> t? S ^ Wt-OOCO-i O^CMCOA'OOCOt-'HWtr' ^
,ο tl +1 CM ro (η UN c\l «- r- r- I- n— r- Φ CO
O O CO
3 CC
Ai 3
3 r— -P
H Ή oi 0 « Cd ·Η 01 Ai « c cd* o oi ·η Onco h. no ι/Λ-a i— mo on T- co ctn co co »- ·η _ j- u-\ J5 O -P E r o CMlArrrtM r r (M O . Π
O IA M Cl CO
B Ή « •H CM 3 0 CO H ,
a O
>— 3 tn cd O
+J ·Η E <- >
01 41 t ·Η VO CO ON NO O CO IA CO NO O VO CO O O O ·Η CM r- ' O
3 041 O r- CM CO UN r Γ- ^ CM ·— CM CM 41 CO CO cd g +» > « ·Η 3 0 J Ai
1* E Ai W
ω o +J fi oi O E m E ·π t- Ai
O · H · H X CO CO r- VO CO CM NO NO VO CO CM CO O CO C— cd H Ov O
M Ai (d UI · H r m (M UNr· r- ^ M r f- CM H CM (O E
BPt ·Η ω 41
1 ·Η cd «rl M
Ai Λ H E 41 Ai .Ί oi J, 3 >>
3 A3 K A e -P
H O A1 41 · -H
3 E Cl E E E
Cd ‘rl H O covo UNVO O r OACOVO CM ONO A Ό-rt: On icd £4 g O > i— CO COLCNCM·— r-CM ·-*-*- E A O icd 3 E 41 H CO g su
EE -H E
• rl .rl 41 01 SE u) U)
•rl -rl Cd Ai "H
•rl .rl' G E · tl 0101 g to O UN NO CM A H CO t^COCM t— LCN-uJ O-h cm 1— NO +3 43 +1 cd r-.-CO CM UN r r Γ- (M «-«-AS CO O 01 O O 1-1 H ro e
tiC tu O
ti tl Ή +3 O O - 01 o icd Oh
Ai · * O
ti onconovococmvoco t— *- cmoo to un ai cm cm u-n e icd r .CO CM IA t- t- r- CM r- «- A E CO I- +> W -H CO Ai S 41 _ I ha
E tl "rl CO
+> O E *h tn
tn -h oi >» E
E E 3 "rl +3 -o ιοί tn +1 01 ON CO t—NOr-CONOCOt— CMCMCOCMt—NO · CM CO ·Η
tl Ai EP r- to CU UN r r r CM r r (M Ai (O f— tl E
E E E O E r- :cd ·Η 33 g tn bO Ή CO lE tn
E B S
H i»,
EH
O "rl 01 E
AO "rl 41 EE
AA E «rl E
E A *H cm ti O
Ai A E »rl. . +3 A
•rl ^ .E "rl E "H 01 A
o E r- -h .,4 E , -H td E HE
A Ή *rl I ti E *cl E r-l »H E *H »rl Ä
A .rl E .rl ·Η ·,Η ·.-( ·, I ·Η -rl -H E ·Η E E E · lE E O
E E 'rl ω E -.4 E '-I 01 π Ή ·rl ·Η E "rl -rl 0-1 "rl -rl 01 O E
A3 ·Η ·Η E ·Η f] ·Η tj 3 .,4 fi E H ’rt E -rl o .,1 E E H Ή O ‘rl ti E -rl ClJ ·rl ·Η E ·Η ·Η O i>, "rl ·Η E 41 UI "rl E O g E E -rl Cd 43 i> UI 4l H ω -rl Ή H -rl O Ui O ·Η E S3 -¾ •H E l.o A w 3 t-, ui O 3 M 43 ti O' ti E :·> ti H 43 tl rl il w i'» H r-l ·,! 01 E E E tl 41 tl tl >, E A3 '3! o; -·< «t i*i o o U3 h pj r-i :·: (· 1 Ρι ω tu r ι ι·ι :· >4 1- a 57112
U
Taulukosta I voidaan nähdä· että orgoteiinilla on 18-26 ja tavallisesti 20-23 lysiiniiyhmuä, joissa kaikissa paitsi l-3issa on trinitrobenseenisulfoniha- polla titrattavat t-aminoryhmät. Nämä voidaan alkyloida tai karbamyloida.
Luonnon orgoteiinilla on muun muassa tulehduksia vastustavaa aktiivisuutta (ks. US-patentti 3 758 682). Sillä on myöa erittäin suuri peroksididismutaasiak-tiivisuus (ks. McCord & Fridovich, J.Biol.Chem., 2kk, 6,176» (1970); ibid, 2U6, 2,875 (1971))· On yllättävää,: ettei N-karbamylointi vaikuta käytännöllisesti katsoen lainkaan keksinnön mukaisesti valmistetun orgoteiinijohdannaisen tulehduksia vastustavaan aktiivisuuteen. Näin ollen tämän keksinnön mukaisesti valmistetut orgoteiinijohdannaiset ovat erittäin käyttökelpoisia esim. nisäkkäillä tai muilla eläimillä esiintyvien tulehdustilojen hoitoon. Huomattava osa luonnon orgoteiinin peroksididismutaasiaktiivisuudesta (20-100 %*) säilyy myös.
N-karbamyloitu orgoteiini
Kuten yllä esitettiin orgoteiinijohdannaiset sisältävät 18-26 lysiini-ryhmää. Koska orgoteiinimolekyyli muodostuu kahdesta identtisestä peptidiketjusta (alayksiköstä), puolet lysiiniryhraistä on kussakin ketjussa, jotka ovat voimakkaasti (tosin ei-kovalenttise3ti) sitoutuneet toisiinsa laajalla lämpötila- ja pH-alueella. Vain muutaman lysiinin £-arainoryhmä ei ole titrattavissa trinitrobenseenisulfoniha-polla (TNBS); näitä äminoryhmiä ei voida karbamyloida muilla kuin erittäin voimakkailla karbamylointiaineilla, esim. dimetyylisulfaatilla alkaalisessa liuoksessa. Karbamyloitumisaste voidaan määrittää TNBS:n avulla. Tällöin on otettava huomioon, että kaikki aminoryhmät eivät ole titrattavissa (esimerkiksi naudan orgoteiinia titrattaessa vai 18 sen 20-22 lysiiniryhmistä reagoi); lisäksi on pidettävä mielessä, että monoalkyloidut lysiinit ovat vielä asyloitavissa.
Lysiiniryhnien karbamylointia voidaan seurata laskemalla varauksen muutos, joka esiintyy N-karbamyloidun tuotteen elektroforeesissa. Esimerkiksi orgoteiini, joka oli N-karbamyloitu metyyli-isotiosyanaatilla pH-arvossa 9» osoitti varauksen muutosta -2 1*5 minuutin kuluttua.
Kuten tiedetään ionin elektroforeettinen liikkuvuus on sähkökentän voimakkuuden, ionin nettovarauksen (mukaanluettuna sitoutuneet vastaionit) ja kitkaker-toimen funktio (ks. esimerkiks.i C. Tanford "Physical Chemistry of Macromolecules Wiley, New York (1966)). Koska kitkakerroin riippuu molekyylin koosta ja muodosta ja liuoksen koostumuksesta, eri proteiinien vertailut eivät ole kovin informatiivisia. Kuitenkin vertailemalla kooltaan ja muodoltaan samanlaisia proteiineja, 5 57112 tässä tapauksessa orgoteiinimolekyylejä, jotka on modifioitu suhteellisen pienillä ryhmillä, identtisissä elektroforeesiolosuhteissa ainoa muuttuja, joka vaikuttaa tähän elektroforeettiseen liikkuvuuteen, on nettovaraus·
Useiden kemiallisesti modifioitujen orgoteiinimolekyylien elektroforeettis-ten analyysitulosten vertailu on yhdenmukainen tämän johtopäätöksen kanssa.
Naudan orgoteiini liikkuu pääasiassa yhtenä nauhana (nauha l); vain pieniä ainemääriä liikkuu nopeammin (nauhat 2, 3 jne.), nämä edustavat orgoteiinimolekyylejä, joilla on suurempi -COOHZ-NH^-ryhmien suhde kuin pääosalla orgoteiinimolekyyleistä (nauha 1). Naudan orgoteiinin käsittely suurenevilla etikkahappoanhydridin väkevyyksillä pH:ssa 7» tai metyyli-isotiosyanaatilla pH-arvolla 9, johtaa peräkkäin anodisempien (vaeltavat kohti anodia) elektroforeettisten nauhojen sarjan muodostumiseen, sitä mukaa kuin useampia orgoteiinimolekyylien vapaita aminoryhmiä karhamyloituu. Käsiteltäessä vastaavasti dimetyylisulfaati11a saadaan nauhasarja, joka on siirtynyt katodiin päin.
Käyrä, jossa esitetään nauhan kulkema matka vs. nauhanumero, on suhteellisen lineaarinen pienillä -COOH- tai -NHg-modifiointiasteilla, mutta alkaa poiketa suorasta suuremmeillä modifiointiasteella. Varsinkin liuoksen ioni vahvuuden ollessa suuri nopeiden ionien kulkunopeus huomattavasti hidastuu. Koska useamman kuin noin kahden nauhan sijainnin ekstrapolointi ei ole tarkkaa, täsmällinen varauksen laskeminen vaatii, että käytetään sisäistä standardia.
Kaikki tavanomaiset proteiinin modifiointireaktiot, joita on sovellettu orgoteiinimolekyylille tähän saakka, ovat olleet yhdenmukaisia tämän tulkinnan kanssa, nimittäin että nauhojen sijainnit vastaavat itsenäisiä varauksen muutoksia luonnon orgoteiinimolekyy Iissä. Kerb amy loi nti ja N-metyy lit iokarbamyloint i antavat nauhat 2,3,1+,5 jne. osoittaen, että 1,2,3 ja U vapaata aminoryhmää samassa järjestyksessä on kemiallisesti modifioitu. Samalla tavoin sukkimylointi, joka muuttaa ·~ΝΗ®-ryhmät /^NHCCH.CH -ryhmiksi, antaa nauhat 3,5,7,9 jne., ja laajempi J \\ d d 0 karbamylointi tai tiokarbamylointi, joka muuttaa vielä enemmän ^NHC-NH-R ja
II
S o tl ^NHC-NH-R-ryhmiä, antaa nauhat 6,7,8,9 jne.
Vain 2-U lysiiniryhmistä ovat sellaisia, joita ei voida karbanyloida lievillä alkylointiaineilla. Vain suunnilleen yksi TNBS:lla titrattavista lysiiniryhmistä jokaisessa orgoteiinin peptidialayksikössä on sellainen, jota ei voida polykarbamyloida käyttäen voimakkaampia olosuhteita.
Kun kaikkia titrattavista lysiiniaminoryhmistä ei karbamyloida, orgoteiini-molekyylissä olevien karbamyyliryhmien alkyyliosien jakautuma on todennäköisesti sattumanvarainen, sillä mikään titrattavista lysiiniaminoryhmistä ei osoittaudu 6 57112 epänormaalin helposti muutettaviksi karbamyloiduiksi aminoryhmiksi. Koska orgo-teiinimolekyyli koostuu kahdesta identtisestä peptidiketjusta, osittain karbamy-loidun orgoteiinin N-karbanyloidut aminoryhmät jakautuvat enemmän tai vähemmän sattumanvaraisesti pitkin jokaista peptidin alayksikköä, mutta enemmän tai vähemmän tasaisesti näiden kahden katjun välille. Koska tavallisesti käytetään vain yhtä karbaoylointiainetta, karbamyloidut aminoryhmät ovat kaikki identtisiä. On kuitenkin mahdollista valmistaa karbamyloituja orgoteiineja, joiden molekyylissä ja jopa jokaisessa sen ketjussa on kaksi tai useampia erilaisia alkyyliryhmiä.
Eräs tapa valmistaa seka-N-karbamyloitu orgoteiini on karbamyloida vaiheittain eri karbamylointiaineilla. Esimerkiksi osa titrattavista lysiinin f-amino-ryhmistä voidaan karbamyloida kohtalaisen reaktiokykyisellä karbamylointlaineella, esim. KNCO:lla ja loput reaktiokykyisistä aminoryhmistä voidaan karbamyloida reak-tiokykyisemmällä karbamylointiaineella, esim. metyyli-isosyanaatilla. Karbamylointi-aineen reaktiokyky riippuu suhteellisista reaktionopeuksista proteiinin amino-ryhmien ja reaktioliuottimen kanssa ja riippuu näin ollen reaktion pH-arvosta ja karbamylointiaineesta ja vähäisemmässä määrin puskurista ja lämpötilasta.
Tämän keksinnön mukaisesti valmistetuilla t -N-karbaayyliorgoteiineilla näyttää olevan oleellisesti samat ominaisuudet kuin luonnon orgoteiinimolekyylillä. Kelatoitunut Cu ja Zn -pitoisuus (gramma-atomia/mooli) on suunnilleen sama kuin orgoteiinilla. Kuten orgoteiinikin ne ovat erittäin kestäviä pronaasi- ja muuta proteolyyttistä entsyymihajoamista vaataan. Peroksididismutaasin (SOD) entsymaattinen aktiivisuus vähenee suhteessa karbamylointiasteeseen.
Vaikka vallitseva luonnon orgoteiinin rakennemuutos, joka tapahtuu sen karbanyloinnissa alkaalisella pH-arvolla, on sen lysiinien £-aminoryhmien muuttuminen, muutkin molekyylissä olevat aktiiviset ryhmät, erityisesti -OH ja imidateoli-typpi ja mahdollisesti myös guanidinotyppi, -SH, -SCH^ jne. voivat myös samanaikaisesti karbamyloitua, riippuen käytetyistä olosuhteista ja karbanylointiaineen reaktiivisuudesta.
N-karbamyyliryhmien tarkka luonne enempää kuin niiden lukumääräkään ei ole kriittinen sikäli kuin karbamyyliradikaali on fysiologisesti hyväksyttävä. Johtuen orgoteiinimolekyylin korkeammasta molekyylipainosta silloinkin kun orgoteiini-molekyyli on täysin karbamyloitu karbamyyliryhmillä, joilla on kohtuullinen mole-kyylipaino, esim. ssj.00, vaikutus kemialliseen kckonaiskoostumukseen on suhteellisen pieni, so. alle 10 %. Karbamyloinnilla ei myöskään ole ilmeistä merkittävää vaikutusta molekyylin tiiviiseen avaruusrakenteeseen eikä saatuun stabiilisuuteen, esim. lämmitettäessä tunnin ajaksi 6o°C:een, eikä proteolyyttisten entsyymien vaikutukseen.
On selvää, että karbamyyliryhmän on myös oltava peräisin sellaisesta karbamylointiaineesta, joka kykenee karbamyloimaan aminoryhmän vedessä tai puskuriliuoksessa, sillä reaktio suoritetaan tavallisesti niissä.
τ 57112
Esimerkkejä sopivista karbamylointiaineista ovat alkalimetallisyanaatit, esim. NaNCO, KNCO; alkyyli-isosyanaatit ja alkyyli-isotiosyanaatit, esim. RNCO ja RNCS, joissa R = CH^» CgH^, n_C3H7* n-cl;H9» n_G8Hl7 » Ja aryyli-isosyanaatit ja isotiosyanaatit, esim. fenyyli-isosyanaatti ja fenyyli-isotiosyanaatti.
Vaikka metallisyanaatit reagoivat monien sivuketjutyyppien kanssa, vain se reaktio aminoryhmien kanssa, joka muuttaa ne urearyhmiksi, tuottaa stabiilin tuotteen.
Alkyyli-isosyanaattien ja -isotiosyanaattien reaktio orgoteiinin kanssa on täysin analoginen sen ja syanaattien välisen reaktion kanssa, mutta paljon nopeampi. Pitkäketjuiset isosyanaatit ovat vähemmän reaktiivisia kuin lyhyt-ketjuiset isosyanaatit.
Orgoteiinin reaktio isosyanaattien ja isotiosyanaattien kanssa voidaan todeta käyttämällä reagenssia, joka tuo molekyyliin fluoresoivan ryhmän, esim. fluoreseiini-isosyanaattia. Tämä reagenssi on samanlainen kuin alkyyli-isosyanaatit ja reagoi orgoteiinin aminoryhmien kanssa tuottaen substituoituja tioureoita. Kuitenkin pienikin määrä substituointia pienentää orgoteiinin SOD-aktiivisuutta huomattavasti johtuen fluororeseiinin suuruudesta. Mono- ja di-substituoidut orgoteiinit eivät ole stabiileja liuoksessa ja muuttuvat hitaasti heterogeenisemmiksi johtuen alayksiköiden vaihtumisesta ja hydrolysoitumisesta.
Tämän keksinnön mukaisesti karbamyloidut orgoteiinit ovat orgoteiini-johdannaisia, mukaanluettuna naudan, lampaan, hevosen, sian, rotan, koiran, kaniinin, marsun, kananpojan ja ihmisen orgoteiinit, joiden titrattavista amino-ryhmistä vähintään yksi, esim. 1,2,3,5 ja jopa kaikki (noin 18-26) on karbamy-loitu, so. sisältää substituoimattoman tai substituoidun -CONH- tai -CSNH-ryhmän.
Suositeltavassa toteutusmuodossa karbanyloidut aminoryhmät ovat niitä, joilla on kaava:
X
-NHCNHR
jossa X on 0 tai S ja R on CH^, CgH^, n-C^H^, iso-C^H^, n-CgH^ tai muu korkeintaan 12 hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä, Ph tai, kun X on 0, myös vetyatomi ja Ph on substituoimaton fenyyliryhmä tai fenyyliryhmä, jossa on 1-3 yksinkertaista substituenttia, esim. metyyli-, kloori-, bromi-, nitro-, amido- ja metoksi-ryhmää, karbometoksi- tai karboetoksiryhmää, esim. p-tolyyli, sym.-ksylyyli-, p-amidofenyyli-, m-kloorifenyyli- ja p-metoksifenyyliryhma. Tällaisilla orgoteii-neilla on kaava:
X
(H-N) -Org-(NHCNH-R) ei m. n 8 57112 jossa n on kokonaisluku 1 - noin 26, mieluummin vähintään 2 ja kaikkein mieluummin noin 6-10 ja summa m + n on titrattavien vapaiden aminoryhmien kokonaismäärä modifioimattomassa johdannaisessa, X on 0 tai S, R merkitsee samaa kuin yllä, mieluummin H-atomia tai 1-8 hiiliatomia sisältävää alkyyliryhmää ja "Org" on loppuosa orgoteiinimolekyylista.
Erityisen suositeltavia karbanyloituja orgoteiineja ovat alkyylikarbamyyli-ja alkyylitiokarbanyyliorgoteiinit, joissa alkyyliryhmä on 1-8 hiiliatomia sisältävä substituoimaton alkyyliryhmä, esim. metyyli-, etyyli-, propyyli-, isopropyyli-, butyyli- ja oktyyliryhmä.
Koska karbamyyliryhmän tarkka kemiallinen luonne ei ole kriittinen, sikäli kilin se ei ole fysiologisesti myrkyllinen orgoteiinimolekyy Iissä ja voidaan muodostaa lysiinin £-aminoryhmiin, ajateltavissa olevia korvikkeita yllä kuvatuille suositeltaville alkyylikarbamyyliorgoteiineille, sikäli kuin ne voidaan muodostaa ovat ne, jotka muutoin vastaavat yllä olevaa kaavaa, jossa R on syklo-pentyyli-, sykloheksyyli-, mentyyli yms. sykloalkyyliryhmä, sykloheksyylimetyyli--syklopentyylipropyyli yms. sykloalkyylialkyyliryhmä, bensyyli-, p-ksylyyli- ja fenyyli- yms. aralkyyliryhmä. Korvikkeina ovat myös ajateltavissa ne, joissa R on alkyyliryhmä, jossa on 1-6 ja mieluummin 1-U hiiliatomia, ja kaikkein mieluimmin metyyli- tai etyyliryhmä, jossa on yksi tai useampia, mieluummin yksi muu substituentti, esim. fluoreseinyyliryhmä.
Jäljempänä olevien esimerkkien N-karbanyloidun "nauta"-orgoteiinin lisäksi muita esimerkkejä tämän keksinnön N-karbamyyli~nauta-orgoteiineista ovat vastaavat N-karbamyyliorgoteiini, N-propyylikarbamyyliorgoteiini, N-etyylikarbamyyli-orgoteiini ja N-metyylitiokarbamyyliorgoteiini, joissa kaikissa tapauksissa on 9 tällaista karbamyyliryhmää molemmissa kahdessa orgoteiinimolekyyIin alayksikössä, ja vastaavat orgoteiinit, joissa on keskimäärin 1, 6 tai 10 tällaista karbamyyliryhmää kummassakin tällaisessa alayksikössä ja vastaavat jokaisen näiden ihmis-, lammas-, hevos-, sika-, koira-, kaniini-, marsu-, kananpoika- ja rottaorgoteiini-johdannaiset.
Orgoteiinijohdannaiset voidaan eristää reaktioliuoksesta, mieluummin vieraiden ionien poistamiseksi tapahtuvan dialyysin jälkeen, tavanomaisella lyöfili-soinnilla esim. US-patentissa 3 658 682 kuvatulla tavalla. Haluttaessa orgoteiini-johdannainen voidaan ensin puhdistaa ioninvaihtohartsikromatografiällä, elektroforeesilla ja/tai geelisuodatuksella käyttäen polymeeriä, joka toimii molekyyli-seulana.
Suodattaminen mikrohuokossuodattimen läpi, jonka huokoskoko on 0,01 - 0,22 mikronia, aseptisella tavalla steriileihin lääkepulloihin valinnaisesti senjälkeen, kun ionivahvuus on säädetty NaCl:11a ja/tai natriumfosfaatilla esim. isotoniseen 9 57112 pisteeseen, saa aikaan bakteeri- ja virusopillisesti tai bakteeriopillisesti steriilin liuoksen, joka sopii annettavaksi ruiskeena. Suodattaminen 0,1 mikronin huokossuodattimen läpi vähentää tai poistaa myös liuoksessa olevat pyrogeenit.
Esimerkki 1
Substituoimaton karbamyloitu orgoteiini
Liuosta, jossa oli 3,7 mg orgoteiinia (naudasta peräisin) ja lU mg KNCOia 2 ml:ssa pH-arvoltaan 7,5 olevaa 0,025-m natriumfosfaattipuskuria, pidettiin U°Cissa. Osanäytteiden elektroforeesi 5^ päivän aikana osoitti SOD-aktiivisten kaistojen sarjan ilmestymistä, jotka olivat anodisempia kuin luonnon orgoteiini. Keskimääräinen varauksen muutos yhdessä aktiivisten kaistojen alueen kanssa keskiarvon molemmin puolin esitetään näytteille alla.
Aika (päiviä): 0,75 3,8 27 51*
Reagoineet lysiinit 0 0,8 5+2 8,5 + 3,5
Esimerkki 2
Alkyylikarbaayloidut orgoteiinit 50 piin jakeiden orgoteiinia (naudasta peräisin) pH-arvoltaan 7,6 olevassa 0,1-m tris- tai fosfaattipuskurissa väkevyydellä 10 mg/ml annettiin reagoida U°C:ssa 1 piin kanssa joko propyyli-isosyanaattia tai oktyyli-isosyanaattia eri aikoja. Kahdessa tapauksessa lisättiin 2 p1 lisää propyyli-isosyanaattia kahden päivän kuluttua. Liittyneiden propyylikarbamyyli- ja oktyylikarbamyyli-ryhmien lukumäärä määritettiin keskimääräisen varauksen muutoksen avulla määritettynä elektroforeesilla alla esitetyllä tavalla.
Keskimääräinen varauksen muutos_
Reagenssi 2 min. 2 h. 1 päivä 2 päivää + 2 f* xsosya- __ _ _ _ __ _ naattia______
Propyyli-isosyanaatti/tris 8 8 ND x) ND 10
Propyyli-isosyanaatti/fosfaatti 8 8 ND ND >15
Oktyyli-isosyanaatti/tris 0,2 1,0 6 6
Oktyyli-isosyanaatti/fosfaatti 0 0,2 2,5 3 x) Ei tehty
Esimerkki 3
Alkyylikarbamyloidut orgoteiinit
Esimerkin 2 menettely toistettiin käyttäen 10 mg orgoteiinia 1 mlissa pH-arvoltaan 7,6 olevaa 0,1-m fosfaattipuskuria ja 1 mlissa propyyli- tai oktyyli-isosyanaattia. Liuoksia pidettiin 25°C:ssa U tuntia ja tutkittiin elektroforeet-tisesti. Tämän jälkeen lisättiin jokaiseen vielä 1 ml isosyanaattia. Kun liuoksia oli pidetty yli yön H°C:ssa, ne tutkittiin jälleen elektroforeettisesti ja dialyeoitiin. Karbangrloidut proteiinit olivat vähemmän liukenevia ionivaihdettuun ίο 57112 veteen ja saostuivat osittain dialyysissä, mutta olivat liukenevia 0,15~ni suolaliuokseen. Karbamyloitujen lysiiniryhmien lukumäärä esitetään alla.
GAPM
Isosyanaatti Reagoineet lysiinit Me££Llipitoi^ius % alkuperäisestä k h yli yön Cu Zn SOD-aktiivisuudesta
Propyyli 10+U >15 2,2 1,5 suunnilleen 50 %
Oktyyli 3+.3 6+5 2,1 1,8 suunnilleen 25 %
Esimerkki U
N-metyylitiokarbamyyliorgoteiini
Liuokseen, jossa oli 5 mg orgoteiinia U ml:ssa pH-arvoltaan 9 olevaa 0,075-m Na2B^0^:a, lisättiin 10 pl CH^NCSsa ja seosta ravisteltiin minuutin ajan, kunnes CH^NCS liukeni. Tietyin väliajoin 50 yal:n näytteet poistettiin ja lisättiin 0,U ml pH-arvoltaan 5,3 olevaa 0,1-m natriumasetaattipuskuria. Valkoinen rikin sakka (jota osoitti sen haju poltettaessa ja sen liukoisuus CS2:en) ilmestyi 6 ja 22 tunnin välillä. 22 tunnin kuluttua huoneenlämpötilassa jäljellä oleva reaktioseos käsiteltiin 0,5 ml:11a pH-arvoltaan 1-M asetaattipuskuria ja dialysoitiin veden useita vaihtoja vastaan 2 päivän ajan. Dialysoitu liuos sentrifugoitiin lyhyesti liuoksen valkoisen sameuden poistamiseksi.
Liuoksesta otettujen näytteiden elektroforeesi osoitti lisääntyvästi anodisempien SOD-aktiivikaistojen sarjan muodostumista. Näytteiden analyysi pH-arvoltaan 7»8 olevalla sytokromi c-kokeella (McCord & Fridovich, J. Biol. Chem. 60U9-6055 (1969))osoitti SOD-aktiivisuuden laskua mitä suurempi orgoteiinin modifiointi oli.
Aika (h) Keskimääräinen SOD-aktiivisuus % varauksen muutos o (0) (100 %) 0,08 0,5 Hl 0,25 1 118 0,75 2 91 1,9 U 86 6 9,5 ^3 22 16 20
Reaktiotuote, jota oli dialysoitu 22 tuntia , elektroforesoi nopeasti liikkuvana anodisena kaistana, säilytti 18 % luonnon orgoteiiniproteiinin SOD-aktiivisuudesta ja sisälsi 2,06 GAPM Zn** ja 1,76 GAPM Cu** (verrattuna modifioi-mattomassa orgoteiinissa oleviin arvoihin 2,26 GAPM Zn ja 2,08 Cu ). Kaikki +Φ ft tuotteet ovat liukoisia, säilyttävät kelat oituneen Cu :n ja Zn ;n ja ainakin osan modifioimattoman proteiinin peroksidi-disrautaasiaktiivisuudesta.
11 5711 2
Esimerkki 5 N-fluoreseinyylikarbamyyliorgoteiini
Liuosta, jossa oli 100 mg orgoteiinia (naudasta peräisin) ja 6 mg fluo-reseiini-isotiosyanaattia 10 ml:ssa pH-arvoltaan 8,5 olevaa 0,lU-M fosfaatti-puskuria, pidettiin U°C:ssa 18 tuntia. Reaktioseos johdettiin mikrohuokoista silloitettua dekstraania (Sephadex G-50, Pharmacia, Upsala, Sweden) sisältävään kromatografikolonniin ja eluoitiin siitä pH-arvoltaan 8 olevalla boraattipuskuroi-dulla suolaiiuokselia (0,15_M). Keltaisen proteiinin eluoidut jakeet diälysoitiin vettä vastaan. Dialysoitu proteiini, joka saostui (20 mg), oli voimakkaan keltainen ja fluoresoiva ja oli helposti liukeneva pH-arvossa 8 olevaan boraatti-puskuroituun suolaliuokseen. Elektroforeesi osoitti, että ko. 96 mg liukoista proteiinia oli noin puoleksi monokarbamyloitua orgoteiinia (-3 varauksen muutos), jossa oli jonkin verran kaksois- ja kolmoiskarbamyloitua orgoteiinia (-6 ja -9 varauksen muutos) ja reagoimatonta orgoteiinia. Uudelleen liuotettu sakka osoittautuu olevan voimakkaammin modifioitua proteiinia.
Liukoinen proteiini kromatografoitiin heikosti emäksisellä (DEAE-selluloosa) ioninvaihtokolonnilla pH-arvolla 6 käyttäen fosfaattipuskurin lineaarista gradienttia välillä 0,01 - 0,2 M. Monokarbanyloitu ja dikarbany-loitu orgoteiini eristettiin, dialysoitiin ja lyofilisoitiin.
Monokarbanyloitu orgoteiini oli SOD-aktiivinen elektroforeesissa ja NBT-riboflaviinilla värjättävissä pH-arvoltaan 7*5 olevan sytokromi c-kokeen mukaan sen SOD-aktiivisuus oli H8 % luonnon orgoteiinista. Ungar-biokokeessa tämä proteiini osoitti noin 50 % luonnon orgoteiinin aktiivisuudesta.
Monokarbamyloidun orgoteiinin liuos, jota säilytettiin U°C:ssa 2 viikkoa, muuttui seokseksi, jossa oli orgoteiinia, monokarbamyloitua orgoteiinia ja di-karbamyloitua orgoteiinia (ilmeisesti hybridisoitumisen tulos) ja jonkin verran ei-proteiinista, fluoresoivaa yhdistettä (ilmeisesti karbamyloidun orgoteiinin tioryhmän hydrolyysitulos, joka antaa vapaata aminofluoreseiinia).
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FI800396A FI800396A (fi) | 1975-09-09 | 1980-02-08 | Foerfarande foer framstaellning av antiinflammatoriska orgoteinderivat |
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US61165775 | 1975-09-09 | ||
US61165975 | 1975-09-09 | ||
US05/611,659 US4022888A (en) | 1975-09-09 | 1975-09-09 | Esterified orgotein |
US05/611,657 US4042689A (en) | 1975-09-09 | 1975-09-09 | Alkylated orgotein |
US63907675 | 1975-12-09 | ||
US05/639,076 US4070459A (en) | 1975-12-09 | 1975-12-09 | N-carbamylated orgotein |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI762566A FI762566A (fi) | 1977-03-10 |
FI57112B FI57112B (fi) | 1980-02-29 |
FI57112C true FI57112C (fi) | 1980-06-10 |
Family
ID=27417063
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI762566A FI57112C (fi) | 1975-09-09 | 1976-09-07 | Foerfarande foer framstaellning av antiinflammatoriska epsilon-n-karbamylorgoteiner |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
CA (1) | CA1090782A (fi) |
CS (1) | CS203992B2 (fi) |
DD (1) | DD128695A5 (fi) |
DE (1) | DE2637778A1 (fi) |
DK (1) | DK396376A (fi) |
FI (1) | FI57112C (fi) |
FR (2) | FR2323395A1 (fi) |
GB (1) | GB1561295A (fi) |
IE (1) | IE43701B1 (fi) |
IL (1) | IL50287A (fi) |
IT (1) | IT1068221B (fi) |
NL (1) | NL7610003A (fi) |
NO (1) | NO763075L (fi) |
SE (3) | SE7609978L (fi) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE202009017709U1 (de) | 2009-12-31 | 2011-09-02 | Heinz-Dieter Matuschak | Zellenradschleuse sowie Förderanlage zum Fördern von Schüttgut |
-
1976
- 1976-08-17 IL IL50287A patent/IL50287A/xx unknown
- 1976-08-20 FR FR7625354A patent/FR2323395A1/fr active Granted
- 1976-08-21 DE DE19762637778 patent/DE2637778A1/de not_active Withdrawn
- 1976-09-02 DK DK396376A patent/DK396376A/da not_active Application Discontinuation
- 1976-09-07 FI FI762566A patent/FI57112C/fi not_active IP Right Cessation
- 1976-09-07 CA CA260,685A patent/CA1090782A/en not_active Expired
- 1976-09-07 DD DD7600194658A patent/DD128695A5/xx unknown
- 1976-09-07 IT IT51154/76A patent/IT1068221B/it active
- 1976-09-08 NO NO763075A patent/NO763075L/no unknown
- 1976-09-08 IE IE2001/76A patent/IE43701B1/en unknown
- 1976-09-09 NL NL7610003A patent/NL7610003A/xx not_active Application Discontinuation
- 1976-09-09 GB GB37431/76A patent/GB1561295A/en not_active Expired
- 1976-09-09 CS CS765859A patent/CS203992B2/cs unknown
- 1976-09-09 SE SE7609978A patent/SE7609978L/ not_active Application Discontinuation
-
1977
- 1977-10-28 FR FR7732803A patent/FR2362864A1/fr active Granted
-
1980
- 1980-08-25 SE SE8005934A patent/SE8005934L/sv unknown
- 1980-08-25 SE SE8005933A patent/SE8005933L/sv unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK396376A (da) | 1977-03-10 |
NL7610003A (nl) | 1977-03-11 |
FR2323395A1 (fr) | 1977-04-08 |
FR2323395B1 (fi) | 1979-06-22 |
SE8005934L (sv) | 1980-08-25 |
DE2637778A1 (de) | 1977-03-17 |
DD128695A5 (de) | 1977-12-07 |
SE7609978L (sv) | 1977-03-10 |
FR2362864B1 (fi) | 1981-01-16 |
CS203992B2 (en) | 1981-03-31 |
CA1090782A (en) | 1980-12-02 |
NO763075L (fi) | 1977-03-10 |
FR2362864A1 (fr) | 1978-03-24 |
FI762566A (fi) | 1977-03-10 |
IE43701L (en) | 1977-03-09 |
IE43701B1 (en) | 1981-05-06 |
SE8005933L (sv) | 1980-08-25 |
FI57112B (fi) | 1980-02-29 |
IT1068221B (it) | 1985-03-21 |
IL50287A (en) | 1979-11-30 |
GB1561295A (en) | 1980-02-20 |
IL50287A0 (en) | 1976-10-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Ji | The application of chemical crosslinking for studies on cell membranes and the identification of surface reporters | |
US5342940A (en) | Polyethylene glycol derivatives, process for preparing the same | |
Deeley et al. | Vitellogenin synthesis in the avian liver. Vitellogenin is the precursor of the egg yolk phosphoproteins | |
Work et al. | Chemical modification of proteins | |
Wiley et al. | The structure of vitellogenin. Multiple vitellogenins in Xenopus laevis give rise to multiple forms of the yolk proteins. | |
Grossberg et al. | Effect of iodination on the active site of several antihapten antibodies | |
DE69026306T2 (de) | Verfahren für die Herstellung von Polyethylenglykolderivate und modifizierte Proteine. | |
Weaver et al. | The structural basis of ankyrin function. II. Identification of two functional domains. | |
EP0417191B1 (en) | Formulation for antibody reagents | |
Han et al. | Chemical cross-links of proteins by using bifunctional reagents | |
FI57112B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av antiinflammatoriska epsilon-n-karbamylorgoteiner | |
Fontana et al. | [40] Sulfenyl halides as modifying reagents for polypeptides and proteins | |
Kolodny et al. | Conjugation of synthetic peptides to proteins: quantitation from S-carboxymethylcysteine released upon acid hydrolysis | |
Dolder et al. | 3-(Trifluoromethyl)-3-(m-isothiocyanophenyl) diazirine: synthesis and chemical characterization of a heterobifunctional carbene-generating crosslinking reagent | |
US6790942B1 (en) | Biologically active conjugates having a detectable reporter moiety and method of identification of the derivative | |
Aquilina et al. | Kynurenine binds to the peptide binding region of the chaperone αB-crystallin | |
Botes | Snake venom toxins: The reactivity of the disulphide bonds of Naja nivea toxin α | |
FI57761C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av antiinflammatoriskt vattenloesligt injicerbart tvaerbundet orgotein | |
US5153308A (en) | S-sulfonated calcitonin derivatives | |
Chong et al. | The interaction of phenyldichloroarsine with erythrocytes | |
Kripalani et al. | Metabolism of captopril-L-cysteine, a captopril metabolite, in rats and dogs | |
Malte-Sørenssen | Recent progress in the biochemistry of choline acetyltransferase | |
Kusiak et al. | Mapping of mammalian β-adrenoreceptors by use of macromolecular alprenolol derivatives: A comparison with amphibian erythrocyte receptors | |
Hiratsuka et al. | Localization and isolation of the peptides in cardiac myosin that contain the lysyl residues accessible to labeling with a fluorescent reagent, N-methyl-2-anilino-6-naphthalenesulfonyl chloride | |
Bernatowicz et al. | The N-hydroxysuccinimide ester of Boc-[S-(3-nitro-2-pyridinesulfenyl)]-cysteine: a heterobifunctional cross-linking agent |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM | Patent lapsed |
Owner name: DIAGNOSTIC DATA, INC. |