FI56388C - Foerfarande foer framstaellning av en ny terapeutiskt anvaendbar 1-n-ny-amino-alfa-hydroxibutyryl-substituerad kanamycin(a eller b)-foerening - Google Patents

Description

Ι-ιΤί—Ί ΓβΙ rt1xKUU«-UTUSjULKAISU ΓΛΑηρ VST* ibj <") UTLÄGGNINGSSKR1FX bbJoo C (4S) Patentti myönnetty 10 01 1990 dfirig2, Patent oeddelat V v ' (51) Kv.lk.*/lnt.CI.* C 07 H 15/22 (21) Puenttlhak«mu$ — Ptt«nUnsöknlng 1988/72 (22) Hakemlipilvl — An«6knlng*dag 12.07*72 (Fl) (23) AlkupUvi — Glltlghetidag 12.07*72 (41) Tullut (ulklt·ktf — Bllvlt ©ffentilg 1^.01.73

Patentti· Ja rekl*terlhallltu* (44) Nlhtlvlktlptnon fa kuuLjulkitaun pvm. —

Patent* och registerstyralMn Antflkan utligd och utl.tkrifMn publlcerad 2o.09*79 (32)(33)(31) Pyydetty «tuolkeui—Begird priorltet 13.07*71 27.01.72 USA(US) 162315, 221378 (71) Bristol-Myers Company, 3^5 Park Avenue, New York, N.Y. , USA(US) (72) Hiroshi Kawaguchi, Tokyo, Takayuki Naito, Tokyo, Susumu Nakagawa,

Tokyo, Japani-Japan(JP) (7*0 Oy Kolster Ab (5h) Menetelmä uuden, terapeuttisesti käytettävän l-N-Y-amino-Q£-hydroksi- butyryyli-substituoidun kanamysiini (A tai B)-yhdisteen valmistamiseksi - Förfarande för framställning av en ny terapeutiskt användbar l-N-K-amino-Ctf-hydroxibutyryl-substituerad kanamycin (A eller B)-förening Tämä keksintö koskee menetelmää uuden, terapeuttisesti käytettävän l-y*-amino-of-hydroksibutyryyli-substituoidun kanamysiini (A tai B)-yhdisteen valmistamiseksi, jonka kaava on HO -6' K ch2-nh2 \ ' ho^ IT j ^ NH2 (I.) l: tt s~ ' \ V" ,ΟΗρΟΗ H° 0 / 5" / '—NH-C-CH-CH„-CH0-NH0 \ —*-0V / , 2 2 2

\3" 2" Y / °H

NH2' / HO 1"^ / 0 3 563ϋό 2 jossa R on OH- tai NH2~ryhmä, tai sen myrkyttömien, farmaseuttisesti hyväksyttävien happoadditiosolojen valmistamiseksi.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että suojataan kanamysiini A:n tai kanamysiini B;n 6'-hiilessä oleva amino-ryhmä tavallisella amino-suojaryhmällä Y, jotta saadaan yhdiste, jolla on kaava:

HO--H* ,CH_-NH-Y

\ 3' "" °.

V,

HO /\V

,s 6" H° OH OH / --NH_ H°—/ \ 3" ®v / NH2—- / HO \/ 3 . ...

jossa R ja Y merkitsevät samaa kuin edellä, asyloidaan kaavan II mukaisen yhdisteen 1-asemassa oleva aminoryhmä asylointlaineella, jolla on kaava:

OH

W - NH - CH2 - CH2 - CH - COOH (III) sanotun asylointiaineen ollessa johdettu L-( —)—y^-amino-ct-hydroksibutyyrihaposta, jossa kaavassa W on tavallinen amino-suojaryhmä, tai sen funktionaalisella ekvivalentilla, jotta saadaan yhdiste, jolla on kaava: rv· 6* 3 583oc

HO---vl+' . CH2-NH-Y

Υ\^5*

Vl* 2^° H0^ /\\Χ’ (IV) 6" H0 5 /''xW 2 HO_ *" <Χ0Η . / ^ nh-c-ch-ch2-ch2-nh \\ / „ // OH w \ —--0 / \3" 2" \ / ™r—/ HO \ / 07 3 jossa R , Y ja W merkitsevät samaa kuin edellä; ja poistetaan suojaavat ryhmät W ja Y yleisesti tunnetuilla menetelmillä, jotta saadaan kaavan I mukainen 1-N-K-ami.no-<X -hydroksibutyryyli-substituoitu kanamysiini (A tai B)-yhdiste, ja haluttaessa muutetaan saatu tuote sinänsä tunnetulla tavalla farmaseuttisesti hyväksyttäväksi happoadditiosuolaksi.

Kanamysiinit ovat tunnettuja antibiootteja ks. Merck Index, B. painos sivut 597-59Θ. Kanamysiini A on yhdiste, jolla on kaava °Xa 1.— V—7\\ Ia Ησ 0 —BH^ 1,0 \/

563ÖC

Kanamysiini B on yhdiste, jolla on kaava: HO —\ H2N j Ib I nh2

HO' /^NA

CH20H / ^ NH2 -?w HO \ / 0 IUPAC:n "Amikacin”: lie suosittama nimitys on 0-3-amino-3-deoksi-<*-D-gluko-

O

pyranosyyli(1* 4)-0- Q5-amino-6-deoksi-«* -D-glukopyranosyyli Cl-> 6)D-N-(4-amino-L-2-hydroksibutyryyli)-2-deoksi-L-streptamiiniJ tämä on kaavan IV mukainen yhdiste, jota saadaan kanamysiini A:sta keksinnön mukaisella menetelmällä. Kanamysiini A:n nimitys on 0-3-arnino-3-deoksi-<*-D-glukopyranosyyli (1-» 4)-0-Q6-amino-6-deoksi-<*-D-glukopyranosyyli Cl-> 6)3-L-streptamiini.

Sanonta "myrkytön, farmaseuttisesti hyväksyttävä happoadditiosuola" tarkoittaa mono-, di-, tri- tai tetrasuolaa, joka on muodostettu antamalla 1 moolin yhdistettä IV ja 1-4 moolin myrkytöntä farmaseuttisesti hyväksyttävää happoa vaikuttaa toisiinsa. Näitä happoja ovat etikka-, kloorivety-, rikki-, manteli-, maleiini-, fosfori-, typpi-, bromivety-, askorbiini-, omena- ja sitruunahappo ja ne muut hapot, joita käytetään yleisesti amiinipitoisten farmaseuttisten suolojen valmistukseen.

Keksinnön mukaista menetelmää kuvataan seuraavalla reaktiokaaviolla: ΙΙ3Θ6

l) Kanamysiini A N-(bentsoyylioksikarbonyylioksi) Q

(la) tai —ΓΤ":—:—^ n sukkimmidi H0 CHo-NH-C-0-CHo-C.H_

Kanamysuni B ^ ^ d 0 ->

,lb> KL

0 V nh2 (6’-N-monobentsyylioksidikarbonyylikanarnysiini A tai B) \^\/ * >1 H2B Λ--yvA / ho A /

563GC

6 2) kohdassa l) L-(-)-/-bentsyylioksikarbonyyliamino-o(-hydroksi- saatu yhdiste butyyrihapon N-hydroksisukkinimidiesteri_^ 0 HO—K CH2m-i-°-CH2-C6B3 | WH2

—NH

H0 / f=°

CHpOH / S°jE

*>—vJU—\ / Γ2 2 \ / CHo-NH-C-0-CHo-C.H[- — | J / 2 2 O ? h2n^^ ho ^

HP/Pd/C CH NH

3) kohdassa 2) ^ HO-^ 2 n2 saatu yhdiste ΓΧ / HO-i___^0

"VI

H0—^----- \ CH OH 7\ \ HO -i V \\

\__\ // NH

NH- X I

2 HO^ C=0

' ✓ HO-CH

0 I

CH? i 2 CH„ I 2 ,, ; nh Λ '' *- M;'

7 563ÖG

Käyttökelpoisia asylointiaineita ovat ne, joista saadaan labiilit amiinia suojaavat ryhmät, ja joita käytetään yleisesti peptidien synteesissä. Labiilit suojaavat ryhmät on voitava helposti poistaa alalla yleisesti tunnetuilla menetelmillä. Esimerkkejä tällaisista labiileista suojaavista ryhmistä ja niiden poistamisesta on löydettävissä A. Kapoor’in artikkelista, J. Pharm. Sciences 59, sivut 1-27 (1970). Sopivia primaaristen amiiniryhmien asylointiaineita ovat seu-raavat: karboksyylihappokloridit ja -bromidit sekä anhydridit, anhydridiseokset mukaanluettuna, ja erityisesti ne anhydridiseokset, jotka on valmistettu vahvemmista hapoista, kuten hiilihapon ja alkyyli- ja aryylisulfonihappojen ja estyneempien happojen, kuten difenyylietikkahapon, alemmista alifaattisista monoestereistä. Lisäksi voidaan käyttää happoatsidia tai aktiivista esteriä tai tioesteriä (esim. p-nitrofenolin, 2,4-dinitrofenolin, tiofenolin tai tioetikka-hapon kanssa), tai vapaa happo itse voidaan kytkeä kanamysiinijohdannaisen (II) kanssa, kun sanotun vapaan hapon on ensin annettu reagoida Ν,Ν'-dimetyyli-kloroforminiumkloridin kanssa (vrt. englantilainen patentti 1 008 170 ja Novak ja Weichet, Experientia XXI/6, 360 (1965) tai käyttämällä entsyymejä tai Ν,Ν-karbonyylidiimidatsolia tai Ν,Ν'-karbonyyliditriatsolia (vrt. Sheehan ja Hess, 3. Amer.Chem.Soc., 77 1067, (1955) tai alkynyyliamiinireagenssia (vrt.

R. Buijile ja H.G. Viehe, Angew. Chem., International Edition 3, 582 (1964)) tai keteeni-imiinireagenssia (vrt. C.L. Stevens ja N.E. Monk, J. Amer. Chem. Soc. 80, 4065 (1958)) tai isoksatsoliumsuolareagenssia (vrt. R.B. Woodward, R.A. Olofson ja H. Mayers, 3. Amer. Chem. Soc., 83, 1010 (1961)). Toinen happokloridia vastaava aine on vastaava atsolidi, so. vastaavan hapon amidi, jonka amidityppi on jäsen puoliaromaattisessa, viisijäsenisessä renkaassa, joka sisältää vähintään kaksi typpiatomia, so. imidatsoli, pyratsoli, triatsolit, bentsimidatsoli, bentsotri-atsoli ja niiden substituoidut johdannaiset. Esimerkkinä atsolidin valmistuksen yleisestä menetelmästä N,N’-karbonyylidi-imidatsolin annetaan reagoida karbok-syylihapon kanssa ekvimolaarisessa suhteessa huoneenlämpötilassa tetrahydro-furaanissa, kloroformissa, dimetyyliformamidissa tai vastaavassa inertissä liuottimessa, jolloin muodostuu käytännöllisesti katsoen kvantitatiivisella saannolla karboksyylihappoimidatsolidia ja vapautuu hiilidioksidia ja yksi mooli imidatsolia. Dikarboksyylihapoista saadaan di-imidatsolideja. Sivutuote imidatsoli saostuu ja voidaan erottaa ja imidatsolidi eristää, mutta tämä ei ole välttämätöntä. Nämä reaktiot tunnetaan alalla hyvin (vrt. amerikkalaiset patentit n:o 3 079 314, 3 117 126 ja 3 129 224 ja englantilaiset patentit n:o 932 644, 957 570 ja 959 054).

Valmistettaessa 6’-suojattua aminokanamysiiniä on suositeltavaa säätää reagenssien moolisuhteet siten, että asylointiainetta käytetään suhteessa 1 mooli tai vähemmän moolia kohti 6'-suojattua aminokanamysiiniä. Asylointiaineen θ 56386 määrän lisääminen johtaa halutun välituotteen pienempiin saantoihin johtuen kilpailevien sivureaktioiden lisääntymisestä, jotka tuottavat epäpuhtauksina polyasyylijohdannaisia.

Lämpötila ei ole kovin kriittinen. Huomattavasti korkeampien lämpötilojen (yli noin 5Q°C korkeampien) käyttö ei kuitenkaan ole suositeltavaa, koska sivureaktioiden osuus silloin nousee merkittäväksi.

Keksinnön mukaisesti valmistetulla yhdisteellä 1-N-(L-(-)-X'-amino-'*--hydroksibutyryyli)-kanamysiini A:11a, on erinomaiset bakteereja tappavat ominaisuudet, jotka osoittautuvat paremmiksi kuin itse kanamysiini A:11a.

Alla esitetään kaksi taulukkoa, jotka osoittavat kanamysiini A:n ja mainitun keksinnön mukaisesti valmistetun yhdisteen pienempiä inhibitoivia pitoisuuksia (MIC) erilaisia gram-positiivisia ja gram-negatiivisia bakteereja vastaan, jotka arvot on saatu Steers’in agar-laimennusmenetelmällä (taulukko 1) ja kaksinkertaisella laimennusmenetelmällä (taulukko 2). Mueller-Hinton-agarväliainetta käytettiin taulukon 1 tutkimuksessa ja Heart-hauderavintoliuosta käytettiin taulukon 2 tutkimuksessa.

5 6 3 o l

Taulukko 1 9

Kanamysiini A:n ja keksinnön mukaisesti valmistetun yhdisteen pienin inhiboiva pitoisuus

Pienin vaikuttava pitoisuus (mg/mlj

Organismi Kanamysiini A 1-N-(L-(-)-V"_amino-o(-

hydroksibutyryyli-kanamysiini A

erä n:o 4 1. Alk. faecalis A-9423 16 8 2. ” " A-2064B >125 > 125 3. Ent. cloacae A-9656 4 4 4. " laji A-20364 >125 2 5. " hafniae 1 A-20674 1 1 6. E. coli A-0636 2 1 7. " A-20664 16 4 8. " A-20665 >125 1 9. " A-20507 32 2 10. " A-20520 >125 4 11. ” A-20365 >125 1 12. " A-20684 2 2 13. " A-20682 > 125 2 14. " Α-206Θ3 >125 8 15. " Α-206Θ1 > 125 2 16. ” A—15119 4 4 17. K. pneumoniae Α-9Θ67 4 4 18. ” laji A-20328 ) 125 2 19. " " A-20330 32 32 20. ” ” A-20634 >125 4 21. " pneunnoniae A-20680 >125 4 22. " " A-9977 1 1 23. Pr. mirabilis A-9900 2 2 24. Pr. morganii A-15153 2 2 25. " vulgaris A-9555 2 1 26. ’’ rettgeri A-9636 0,25 0,25 27. ” mirabilis A-20645 4 4 28. " mirabilis A-20454 2 2 29. Providencia stuartii A-20615 2 1 30. ” alkalifaciens A-20676 1 1 563υϋ 10

Taulukko 1 (jatkoa)

Organismi Kanamysiini A 1-N-(L-(-)-y“-amino-c<-

hydroksibutyryyli-kanamysiini A

31. Ps. aeruginosa A-20229 32 2 32. " " A-9843A 125 16 33. " " A-20653 ) 125 32 34. " laji A-20601 125, 63 16 35. " " A-20621 >125 >125 36. " maltophilia A-20620 32 >125 37. Sal. enteritidis A-9531 1 0,5 38. " derby A-20087 >125 1 39. Ser. marcescens A-20019 2 4 40. " " A-9933 4 8 41. " " A-20460 > 125 4 2 42. " " A-20459 4 16 43. Shig. flexneri Α-9Θ64 4 4 44. Aeromonas sp. A-20670 2 2 45. Arizona sp. A-20671 2 1 46. Sitrobacter sp. A-20673 4 4 47. Edwardsiella sp. A-20678 4 4 48. Staph, aureus A-9606 1 1 49. " ” A-4749 0,5 1 50. " " A-9537 2 1 51. " ” A-20610 >125 2 52. " " A-20240 >125 8 53. " ” A-15197 1 2

Mueller-Hinton-väliaine + 4 % lampaanverta 54. Str. faecalis A-9854 63 63 55. " " A-9575 125 > 125 56. " pyogenes A-20200 32, 16 32 57. " " A-9604 125 125 58. " ” A-15040 125 125 59. ” " A-20065 125 125 60. D-pneumoniae A-9585 63, 32 63 61. ” " A-20159 >125 >125

Taulukko 2 563ο o 11

Pienin vaikuttava pitoisuus (mg/ml)

Organismi Kanamysiini A 1 -N-CL-C-3- K'-amino-t* -

hydroks ibutyryy1i-kanamysiini A

1. D. pneumoniae + 5 % veriheraa Α-95Θ5 63 63 2. Str. pyrogenes + 5 % veriheraa A-9604 125 125 3. Staph, aureus Smith A-9537 0,5 0,5 4. Staph, aureus A-9497 0,5 0,5 5. Staph, aureus A-20239 >125 4 6. Staph, aureus A-20240 >125 4 7. Enter, cloacae A-0656 2 2 8. Enter, laji A-20364 >125 2 9. K. pneumoniae Α-9Θ67 2 4 10. E. coli K.-12 ML1410 A-20361 2 4 11. E. coli K-12 ML1630 A-20363 >125 2 12. E. coli K-12 A-9632 2 1 13. E. coli A-20664 32 Θ 14. E. coli A-20665 >125 8 15. Pr. mirabilis A-9900 2 16 16. Pr. morganii A-15153 4 16 17. Pr. vulgaris A-9436 1 2 18. Ps. aeruginosa A-20227 4 1 19. Ps. laji A-20499 63 4 20. Ps. aeruginosa A-20653 > 125 4 21. Ps. laji A-20621 >125 > 125 22. Ser. marcescens A-20019 2 4 23. Ser. marcescens A-20141 16 16

12 563iiL

Ylläolevat koetulokset osoittavat, että 1-N-CL-C-)- /'-amino-*. -hydroksibutyryyli) -kanamysiini A:n aktiivisuus on selvästi parempi kuin kanamysiini A:n erityisesti kanamysiini A:ta sietäviä organismeja vastaan.

MIC-tulokset sopivat hyvin yhteen myös in vivo-tulosten kanssa kaikilla niillä kolmella organismilla, joita vastaan kanamysiini A:ta ja l-N-CL-C-)-^'-amino-* -hydroksibutyryyli)-kanamysiini A:ta kokeiltiin.

1 —N— CL— C-D - /"-amino-** -hydroksibutyryyli)-kanamysiini A ja kanamysiini A olivat yhtä tehokkaita, kanamysiini A:lie herkkien E. coli A 15119- ja Staph, aureus A 9537-lajien aiheuttamille tartunnoille hiirillä. Vaikka CD^-arvot (parantava annos 50 %:lle kuolettavasti tartutettuja hiiriä) näyttävät osoittavan, että 1—N— CL— C —D — /'-amino-*< -hydroksibutyryyli)-kanamysiini A on hieman vähemmän aktiivinen kuin kanamysiini A, tämä pieni ero ei oletettavasti ole merkittävä, koska annospitoisuudet olivat kaukana toisistaan (5 x -laimennukset).

Kanamysiinia sietävää E. coli A 20520-lajia vastaan kanamysiini ei odotetusti ollut tehokas in vivo, kun taas 1-N-(L-(-)-V"-amino-o<-hydroksibutyryyli)-kanamysiini A osoitti huomattavaa suojaavaa vaikutusta, ollen suunnilleen 10 kertaa aktiivisempi tätä E. coli-lajia vastaan, kun sitä annettiin nelihoito-kuurina eikä kaksihoitokuurina.

Taulukko 3

Keksinnön mukaisesti valmistetun yhdisteen ja kanamysiini A:n in vitro-ja in vivo-aktiivisuuksien vertailu

Yhdisteet Koe- Staphylococcus Escherichia coli Escherichia coli _numero aureus A 9537 A 15119_A 20520_ MICaiCD50b)MIC CD5QMIC C05Q 1-N-CL-C-)- Γ-amino- 1 1 2;0 x 2 22x2 2 66 x 2 -hydroksibutyryyli- 2 -c) - - -5x4

kanamysiini A

Kanamysiini A 1 2 0,5 x 2 44x2 125 200 x 2 2 - - - - - 200 x4 a) MIC = pienin vaikuttava pitoisuus ^ug/ml). Kokeet suoritettu Chrisholm et al.:n esittämällä tavalla (Antimicrob. agents and Chemotherapy - 1969, s. 244, 1970) käyttäen koeväliaineena Mueller-Hinten-agaria.

13 5 6 3 b it b) CD^q = Parantava annos, 50 % (mg/kg/käsitelty x käsittelyjen lukumäärä). Hiiriä käsiteltiin ihonalaisesti 1 ja 4 tunnin kuluttua tartunnasta, kun käytettiin 2 hoitokertaa ja 0,2, 4 ja 6 tunnin kuluttua tartunnasta, kun käytettiin 4 hoitokertaa. Kokeen muut osat suoritettiin Price et al.sn esittämällä tavalla (0. of Antibiotics 22:1 1969).

c) = ei testattu

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut uudet yhdisteet ovat arvokkaita bakteereja tappavia aineita, lisäravintona eläinten rehuissa, hoitoaineina siipikarjalle ja muille eläimille ihminen mukaanluettuna ja ovat erityisen arvokkaita hoidettaessa grarrrpositiivisten ja gram-negatiivisten bakteerien aiheuttamia tarttuvia tauteja.

Uudet yhdisteet ovat suun kautta annettuina käyttökelpoisia lisähoitoaineina suoliston leikkausta edeltävässä steriloinnissa. Sekä aerobiset että anaerobiset organismit, jotka ovat herkkiä näille lääkkeille, vähenevät paksusuolessa. Kun niiden kanssa käytetään riittävää mekaanista puhdistusta, ne ovat hyödyllisiä valmistauduttaessa paksusuolen leikkaukseen.

Uudet yhdisteet ovat tehokkaita hoidettaessa elimistön bakteeritartuntoja, kun niitä annetaan ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta n. 250 - n. 3000 mg:n annostusmäärä päivässä jaettuina annoksina kolme tai neljä kertaa päivässä. Yleensä nämä yhdisteet ovat tehokkaita, kun niitä annetaan annoksena n. 5,0 - 7,5 mg/kg ruumiinpainoa 12 tunnin välein.

Keksinnön mukaisesti valmistetulla yhdisteellä, l-N-iL-f-l-^-amino-·^-hydroksibutyryyli)-kanamysiini B:llä, on erinomaiset bakteereja tappavat ominaisuudet. Alla esitetään taulukko 4, joka osoittaa kanamysiini A:n ja mainitun yhdisteen pienempiä inhibitoivia väkevyyksiä erilaisia grarrrpositiivisia ja gram-negatiivisia bakteereja vastaan (Steers'in agar-laimennusmenetelmä ravinto-agar-„ väliaineellaj KM = kanamysiini A ja GM = gentamysiini).

1^ r c ^ ·' r 563υ t

Taulukko ^

Keksinnön mukaisesti valmistetun yhdisteen ja kanamysiini A:n vertailu

Pienin vaikuttava pitoisuus (mg/ml)

Organismi Aine,jolle 1—(L—(—)—J^-amino- Kanamysiini A

vastustus- oL -hydroksihutyryyli)

kykyinen -kanamysiini B

E. coli N1HJ 0,U 0,8 " Juhl A-15119 1,6 0,8 " A-15169 1,6 1,6 " A-20363 KM 0,8 50 " A-98UU 0,8 0,8 " A-20365 KM 0,U >50

" K-12 0,8 0,U

" K-12 A-20664 KM 0,8 3,1 " K-12 A-20665 KM 0,8 50 K. pneumoniae Dl 1 0,2 0,2 " A-9678 0,8 0,8 S. marcescens A-20019 1,6 1,6

Ps. aeruginosa D15 3,1 12,5 " D113 KM 50 >50 " A-9923 1,6 25 " A-9930 0,8 6,3 " A-15150 6,3 25 " A-1519^ 1,6 12,5 " A-20U79 KM 1,6 50 " A-20616 KM 3,1 25 " A-20653 KM 25 50 " A-98U3 1,6 12,5

Pseudomonas sp. A-20355 1,6 6,3 " A-20358 KM 3,1 12,5 " A-2O368 GM 50 25 " A-20598 GM 6,3 25 " A-2O6OO GM 3,1 12,5 (j atkuu) 15 5630(,

Taulukko U (jatkoa)

Pienin vaikuttava pitoisuus (mg/ml)

Organismi Aine,jolle 1-(L-(-)- ^amino- Kanamysiini A

vastustus- aC -hydroksibutyryyli) kykyinen -kanamysiini B

Pseudomonas sp. A-20603 GM 6,3 >50 " A-20618 GM 50 50

Pr. vulgaris A-9U36 1,6 0,8 " A-9526 0,8 0,8

Pr. mirabilis A~955^ 1,6 1,6 A-99OO 1,6 1,6

Pr. morganii A-9553 1,6 1,6 " A-20031 6,3 3,1

Pr. rettgeri A-15167 0,8 . 0,8 S. aureus 209P 1,6 0,8

" Smith 0,8 0,U

" 209P 1,6 0,8 " A-20239 KM 1,6 25 S. lutea PCI-1001 1,6 3,1 M. flavus 0,U 0,8 B. subtilis PCl-219 0,1 0,1

St. pyogenes S-23 25 25 " Dick 1 ,6 1,6 " Digonnet A-960k 12,5 25 " A-20065 25 25 D. pneumoniae 50 25 itycobacterium 607 6,3 0,8 " 607 D105 KM >100 >100 " 607 D107 KM >100 >100 " phlei 1,6 1,6 " ranae 6,3 1,6

" H37RV (putkilaimennusmenetelmällä) 0,8 0,U

Ylläolevat tulokset osoittavat, että uuden yhdisteen aktiivisuus on selvästi parempi kuin kanamysiini A:n, erityisesti kanamysiini A:ta kestäviä organismeja vast aan.

16

5638C

Uuden yhdisteen in vivo-aktiivisuuden arviointi suoritettiin sekä kanamy-siini B:lle herkkiä että niitä sietäviä E. coli- ja Ps. aeruginosa-lajeja vastaan.

Uuden yhdisteen in vivo-aktiivisuuden arviointi suoritettiin sekä kanamy-siini B:lle herkkiä että niitä sietäviä E. coli- ja Ps. aeruginosa-lajeja vastaan. Organismeja nimitetään seuraavasti:

Koodi n:o Kanamysiini-herkkyys E. coli A 15119 herkkä E. coli ML-163O A 20363 kestävä (fosforylointi)

Ps. aeruginosa D 15 - melko kestävä

Ps. aeruginosa D 113 - erittäin kestävä (fosfo rylointi) 1-(L-(-)-/'-amino-«^-hydroksihutyryyli)-kanamysiini B ja kanamysiini B olivat yhtä tehokkaita E. coli Juhl A 15119~lajia vastaan hiirillä annoksella 6,3 mg/kg. Uusi yhdiste oli tehokkain kanamysiini B:tä kestävää E. coli ML-1630-lajia vastaan annoksella 6,3 mg/kg verrattuna kanamysiini B:n annoksen 100-U00 mg/kg.

1-(L-(-)- J^-amino-·*. -hydroksibutyryyli )-kanamysiini B:n aktiivisuus osoittautui hieman paremmaksi melko kestävää Ps. aeruginosa D 15~lajia vastaan kuin kanamysiini B:n aktiivisuus. Uusi yhdiste osoittautui aktiivisuudeltaan olennaisesti paremmaksi erittäin kestävää Ps. aeruginosa D-113_lajia vastaan kuin kanamysiini B (ks. taulukko 5)·

17 S 6 3 8 O

Taulukko 5

Uuden yhdisteen ja kanamysiini B:n vertailu E. coli Juhl A 15119 E. coli ML-1630

Annos (se) 1 -(L-(-)- /-amino- Kanamy- 1 -(L-(-)-l^-amino- Kanamy-

-hydroksibutyryyli) siini »A -hydroksibutyryyli)siini B

-kananysiini B B -kanamysiini B

1+00 mg/kg - - 2/5 100 5/5 5/5 5/5 2/5 25 5/5 5/5 5/5 0/5 6.3 5/5 5/5 5/5 0/5 1.6 0/5 0/5 2/5 CD^q (mg/kg) 3,1 3,1 1,8 ca 300

Ps. aeruginosa D15 Ps. aeruginosa D-113

Annos (se) 1-(L-(-)-/'-amino- Kanamy- Annos 1 — (L— (—) — /"-amino- Kana- »<.-hydroksibutyryyli) siini (se) ^-hydroksibutyryyli) nysiini

-kanamysiini B B -kanamysiini B B

100 mg/kg 5/5 5/5 1+00 mg/kg - 0/5 25 1/5 0/5 200 3/5 6.3 1/5 0/5 50 1/5 1.6 0/5 0/5 12,5 0/5 3,1 0/5 CD (mg/kg) 38 50 CD50(mg/kg) 11+5 >1+00

Merkinnät 0/5, 1/5, 5/5 jne. ilmoittavat henkiin jääneiden eläinten lukumäärää viittä altistettua eläintä kohti\ esimerkiksi 5/5 osoittaa viiden eläimen viidestä selviävän hengissä altistusorganismin kuolettavasta annoksesta.

S 6 3 8 € 18 Lähtöaineiden valmistus A. L-(-)- ^-bentsyylioksikarbonyyliamino-cC -hydroksibutyyrihapon valmistus L-(-)-V"-amino-<»<-hydroksibutyyrihappoa (T>^ g, 0,062 moolia) lisättiin liuokseen, jossa oli 5,2 g (0,13 moolia) natriumhydroksidia 50 ml:ssa vettä. Sekoitettuun liuokseen lisättiin tipoittain 0-5°C:ssa 0,5 tunnin aikana 11,7 g (0,068 moolia) bentsoksikarboksikloridia ja seoksen sekoittamista jatkettiin tunnin ajan samassa lämpötilassa. Reaktioseos pestiin 50 ml:11a eetteriä, sen pH säädettiin arvoon 2 laimealla kloorivetyhapolla ja uutettiin neljällä 80 ml:n erällä eetteriä. Eetteriuutteet yhdistettiin, pestiin pienellä määrällä kyllästettyä natrium-kloridiliuosta, kuivattiin vedettömällä natriumsulfaatilla ja suodatettiin.

Suodos haihdutettiin tyhjössä ja saatu jäännös kiteytettiin bentseenistä, jolloin saatiin 11,6 g (7U %) värittömiä levyjä", sulamispiste 78,5 - 79,5°C, (·^ )D = *+»5 (c = 2, CH30H). Infrapuna (IR) (KBr): IR(KBr)y^_o I7U0, 1690 cm"1. Ydinmagneetti-nen resonanssi (NMR) (asetoni-dg)5 (ppm TM5:stä) 2,0 (2H,m), 3,29 (2H, d-d, J=6,7 ja 12 Hz), H,16 (lH,d-d, J = U,5 ja 8 Hz), U,99 (2H,s), 6,2 (2H, leveä), 721 (5 H,s).

Analyysi: laskemalla kaavasta C^H^NO^: C, 56,91» H, 5,97l N, 5,53 kokeellisesti: C, 36,66’, H, 5»979 N, 5,1+7· B. L-(-)-),'-bentsyylioksikarbonyyliamino-oi.-hydroksibutyyrihapon N- hydroksisukkinimidiesteri

Liuos, jossa oli 10,6 g (0,0l+2 moolia) kohdassa A saatua yhdistettä ja U,8 g (0,0U2 moolia) N-hydroksisukkinimidiä (G.W. Anderson et ai., J.Am.Chem.Soc. , 86,1839 (196U)) 200 ml:ssa etyyliasetaattia, jäähdytettiin 0°C:een, jonka jälkeen lisättiin 8,6 g (0,0U2 moolia) disykloheksyylikarbodi-imidiä. Seosta pidettiin . yli yön jääkaapissa. Erottunut disykloheksyyliurea suodatettiin pois ja suodos väkevöitiin n. 50 ml:ksi alipaineessa ja suodatettiin, jolloin saatiin 6,U g otsikossa mainittua tuotetta värittöminä kiteinä, sp. 121-122,5°C. Suodos haihdutettiin kuiviin tyhjössä ja kiteinen jäännös pestiin 20 ml:11a bentseenin ja n-heksaanin seosta, jolloin saatiin vielä lisää mainittua tuotetta. Kokonaissaalis oli 13,!+ g (92 *). («0D 1,5° (c = 2, OHI ) IR(KBr))^=o 1810, 1755, 17^0, 1680 cm . NMR (asetoni-dg)<£ (ppm TMS:stä) 2,0 (2H,m), 2,83 (1+H,s), 3,37 (2H, d-d, J = 6,5 ja 12,5 Hz), 1+,56 (1H,m), U,99 (2H,s), 6,3 (2H, leveä), 7,23 (5H, s).

Analyysi: laskemalla kaavasta C^H^N^^: C, 5*+,85", H, 5,18", N, 8,00 kokeellisesti C, 5I1,79*. 51*.70; H, 5,21, 5,20", N, 8,lU, 8,12.

19 S6388 C. N-(bentsyylioksikarbonyylioksi)sukkinimidin valmistus N-hydroksisukkinimidiä (G.W. Anderson et ai., J.Am.Chem.Soc., 86,1839 (196M (23 g, 0,2 moolia) liuotettiin liuokseen, jossa oli 9 g (0,22 moolia) natriumhyd-roksidia 200 ml:ssa vettä. Sekoitettuun liuokseen lisättiin tipoittain 3*+ g (0,2 moolia) bentsoksikarboksikloridia vedellä jäähdyttäen ja sen jälkeen seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa yli yön bentsoksikarboksijohdannaisen erottamiseksi, joka otettiin talteen suodattamalla, pestiin vedellä ja kuivattiin ilmalla. Saalis U1,1 g (82 %). Kiteyttämällä uudelleen bentseenin ja n-heksaanin seoksesta (10: 1) saatiin värittömiä prismoja, jotka sulivat 78“79°C:ssa.

D. 6,-N-karbobentsoksikanamysiini A:n valmistus

Liuos, jossa oli U2,5 g (90 mmoolia) kanamysiini A:n vapaata emästä U50 ml:ssa vettä ja 500 ml:ssa dimetyyliformamidia (DMF) jäähdytettiin alle 0°C:een ja sekoitettiin voimakkaasti. Liuokseen lisättiin tipoittain n. kahden tunnin aikana liuos, jossa oli 22,U g (90 mmoolia)N-bentsyylioksikarbonyylioksi-sukkinimidä 500 ml:ssa DMF:a. Seosta sekoitettiin -10 - 0°C:ssa yli yön ja sitten huoneen lämpötilassa yhden päivän ajan. Reaktioseos haihdutettiin alipaineessa alle n. 50°C:ssa. Öljy-mäinen jäännös liuotettiin seokseen, jossa oli 500 ml vettä ja 500 ml butanolia ja seos suodatettiin liukenemattoman aineen poistamiseksi ja se erottui kahdeksi kerrokseksi. Butanoli- ja vesiliuoksia käsiteltiin tässä järjestyksessä butanolilla kyllästetyllä vedellä (2 x 500 ml) ja vedellä kyllästetyllä butanolilla (2x500 ml) käyttäen vastavirtajakamista vastaavaa tekniikkaa. Kaikki kolme vesikerrosta yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin alipaineessa, jolloin saatiin öljymäinen jäännös, josta osa kiteytyi seistessään huoneen lämpötilassa. Kiteitä sisältävään jäännökseen lisättiin n. 100 ml metanolia, joka liuotti öljyn ja erotti sen kiteistä. Kun oli lisätty n. 300 ml etanolia, seosta pidettiin huoneen lämpötilassa yli yön ja saatiin kiteinen massa, joka otettiin talteen suodattamalla. Se painoi UU g. Tuote sisälsi pienen määrän kanamysiini A:ta mikä osoitettiin ohutlevykromatog-rafialla käyttäen liuotinsysteemiä n-propanoli-pyridiinietikkahappovesiseosta (15:10:3:12) ja ninhydriiniä sumutusreagenssina.

Epäpuhdas tuote liuotettiin 300 ml:aan vettä ja kromatografoitiin kolonnissa (halkaisija 30 mm), jossa oli CG-50 ioninvaihtohartsia (NH^+-tyyppiä, 500 ml). Kolonni kastettiin 0,1-n ammoniakilla ja eluaatti kerättiin talteen 10 ml:n jakeina. Haluttu tuote sisältyi putkiin numerot 10-100, kun taas kanamysiini A saatiin talteen hitaammin liikkuvista jakeista ja tuotteen paikkaisomeeri(t) näyttivät sisältyvän nopeammin liikkuviin jakeisiin. Jakeet 10-110 yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin alipaineessa, jolloin saatiin 2h,6 g (i+5 %) väritöntä 6'-karbobentsoksikanamysiini A-tuotetta ^'-Cbz-kanamysiini A), joka alkoi sulaa ja värjäytyä 20U°C:ssa ja hajosi 212°C:ssa kehittäen kaasua. U)^=+106° (c=2*, HgO).

20 56380 TLC (silikageeli F,>^: Rf-arvo

Liuotinsysteemi 6'-N-karbobentsoksi- Kanamysiini A

kanamysiini A

n-PrOH-pyridiini-AcOH-HgO 0,*+2 (0,33^ 0,15/ 0,0.1+ (15:10:3:12) (pää) pienempiä

Asetoni-AcOH-HgO 0,2*t 0,1*+ (20:6:7*+) CHC^-MeOH-c.NHj^OH-HgO 0,76 0,50 (1:1+:2:1)

AcOMe-n-ProOH-c.NH.OH 0,22* 0,0U* (1+5:105:60) * Havaittu antroni-rikkihapon avulla.

Yhdellä kokeilluista liuotinsysteemeistä havaittiin TLC-analyysillä lopulliseen tuotteeseen liittyneen kaksi pienempää komponenttia. Kuitenkin lopullista tuotetta käytettiin enempää puhdistamatta 1-N-(L-(-)- /'-amino-oi -hydroksibutyryyli)-kanamysiini A:n valmistukseen.

E. 6'-karbobentsoksikanamysiini B:n valmistus Jäähdytettyyn liuokseen, jossa oli 8,1 g (0,0l68 moolia) kanamysiini B:tä 120 ml:ssa vettä ja 80 ml:ssa 1,2-dimetoksietaania, lisättiin tipoittain ja sekoittaen liuos, jossa oli 1+ ,2 g (0,0l68 moolia) N-bentsyylioksikarbonyylioksi)sukkin-imidiä 1+0 ml:ssa 1,2-dimetoksietaania. Reaktioseosta sekoitettiin yli yön ja haihdutettiin kuiviin alipaineessa. Jäännös liuotettiin 100 ml:aan vettä ja ravistettiin kahdesti 50 ml :11a vedellä kyllästettyä n-butanolia. Vesikerros erotettiin ja adsorpoitiin kolonniin, jossa oli 100 ml CG-50-hartsia (NH^-tyyppiä). Kolonni pestiin 200 ml:11a vettä ja eluoitiin 0,05-n ammoniakilla.Eluaatti kerättiin 10 ml:n jakeina talteen. Jakeet 121-180 otettiin talteen, haihdutettiin ja pakastekuivat-tiin, jolloin saatiin 1,58 g (15 %) haluttua tuotetta. Jakeet 1-120 haihdutettiin ja krcmatografoitiin uudelleen CG-50-hartsilla (NH^+), jolloin saatiin 1,21 g (12 %) ko. tuotetta. Sp. 151-152°C (hajoaa) .(qf)^ +10Ho (c = 2,5, H2°^^c=0 ^10 <™_1· Analyysi, laskemalla kaavasta ^26¾3^1+^12: 50*56; H, 7,02; N, 11,3*+ kokeellisesti: C, 50,71; H, 7,38; N, 11,*+8.

TLC (silikageeli )» Rf 0,03 n-PrOH-AcOH-H^O-seoksessa (15:10:3:12);

Rf 0,l6 asetoni-AcOH-HgO-seoksessa (20:6:7*+)· F. 1- (L- (-) -Ί^βηΐ syylioksikarbonyyliamino^-hydroksibutyryyli) -6' -karbo-bentsoksikanamysiini B:n (III b) valmistus

Sekoitettuun liuokseen, jossa oli 1,85 g (3,0 mmoolia) 6'-karbobentsoksi-kanamysiini B:tä *+0 ml:ssa Hg0:a ja 50 ml:ssa 1,2-dimetoksietaania, lisättiin yhdellä kertaa 5°C:ssa 1,1 g (3,1 mmoolia) N-iL-T-karbobentsoksiamino-c^-hydroksi-butyryylioksi)sukkinimidiä. Reaktioseosta sekoitettiin yli yön huoneen lämpötilassa ja sille suoritettiin hydrogenolyysi eristämättä karbobentsoksijohdannaista (III b). TLC (silikageeli F 25*+), Rf 0,06 (lähtöaine), 0,*+l, 0,57 (n-PrOH-pyri-diini-AcOH-H^O = 15:10:3:12). Rf 0,11 (lähtöaine) 0,21, 03*+, 0*+6 (asetoni-Ac0H-H20 = 20:6:7*+)· :·>;! ' ·' 21

S6 3 b G

F. L-(-)~/'-eunino-"<-hydroksibutyyrihapon valmistus DL-«<-hydroksi-ftaali-imidobutyyrihaposta (a) Dehydroabietyyliammonium-L-<< -hydroksi-/"^-ftaali-imidobutyraatti: Liuokseen, jossa oli 25 g (0,1 moolia) 2-hydroksi-/"-ftaali-imidobutyyri- happoa (Y. Saito et. ai., Tetrahedron Letters, 1970, UÖ63) 200 ml:ssa etanolia, lisättiin liuos, jossa oli 29 g (0,1 moolia) dehydroabietyyliamiinia 130 ml:ssa etanolia. Liuosta sekoitettiin voimakkaasti minuutin ajan ja se seisoi huoneenlämpötilassa viisi tuntia, jona aikana hienoja neulasia kiteytyi liuoksesta.

Kiteet kerättiin talteen suodattamalla, pestiin 50 ml:lla etanolia ja kuivattiin ilmalla, jolloin saatiin 30,1 g (56 %) dehydroabietyyliamiinisuolan diastereo-meeria. Sp. 93~9^°C. (o< )^ + 15° (c = 2,5, metanoli). Kiteyttämällä uudelleen 300 ml:sta etanolia saatiin 23,2 g (k3 %) puhdasta tuotetta. Sp. 9^~95°C.

(> )^+10,8 ( c = 2,5 MeOH). Uudelleen kiteyttäminen ei muuttanut sulamispis tettä eikä ominaiskiertokykyä.

Analyysi, laskemalla kaavasta Ο^Η^Ν^Ο^.Η^Ο: C, 69,5^» H, 8,02’, N, 5,07 kokeellisesti: C, 69,58*, H, 8,88’, N, 5,07 (b) L-(-)-Ϋ'-amino--hydroksibutyryylihappo: Liuokseen, jossa oli 1,5 g (0,014 moolia) natriumkarbonaattia U0 ml:ssa vettä, lisättiin 5,3 g (0,01 moolia) dehydroabietyyliammonium-L-<< -hydroksi- ^-ftaali-imidobutyraattia ja 60 ml eetteriä. Seosta ravisteltiin voimakkaasti, kunnes kaikki kiinteä aine oli liuennut. Eet-terikerros erotettiin. Vesikerros pestiin kahdesti 20 ml:n eetterierällä ja haihdutettiin 15 ml:ksi alipaineessa. Konsentraattiin lisättiin 10 ml väkevää kloori-vetyhappoa ja seosta refluksoitiin kymmenen tuntia. Jäähdytyksen jälkeen erottunut ftaalihappo poistettiin suodattamalla. Suodos haihdutettiin alipaineessa. Jäännös liuotettiin 10 ml:aan vettä ja liuos haihdutettiin kuiviin. Tämä operaatio toistettiin kahdesti ylimäärin olevan kloorivetyhapon poistamiseksi. Jäljelle jäänyt siirappi liuotettiin 10 ml:aan vettä ja suodatettiin pienen liukenemattoman ftaalihappomäärän poistamiseksi. Suodos absorpoitiin IR-120-kolonniin (H+, 1 cm x 35 cm), kolonni pestiin 300 ml:lla vettä ja eluoitiin 1-n ammoniakilla. Eluaatti kerättiin talteen 15 ml:n jakeina. Ninhydriinille positiiviset jakeet 10—16 yhdistettiin ja haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin siirappi, joka kiteytyi vähitellen. Kiteitä hierrettiin etanolilla, suodatettiin ja kuivattiin tyhjiöeksikaattorissa, jolloin saatiin 0,78 g (66 %) L-(-)-/"-amino-^-hydroksibutyyrihappoa. Sp. 206-207°C («( )^-29° (c = 2,5, HgO). IR-spektri oli identtinen luotettavan näytteen kanssa, joka saatiin ambutyrosiinistä.

22 56388

Esimerkki 1 1-N-(L-(-)-/'-amino-.4.-hydroksibutyryyli)-kanamysiini A:n valmistus

Liuos, jossa oli 1,6 g(U,6 mmoolia)L-(-)-V^bentsyylioksikarbonyyliamino-^-hydroksivoihapon N-hydroksisukkinimidiesteriä UO ml:ssa etyleeniglykolidimetyyli-eetteriä (DME), lisättiin tipoittain sekoitettuun liuokseen, jossa oli 2,6 g (H,2 mmoolia)6'-monobentsyylioksikarbonyylikananysiini Aita i+0 mlissa 50-¾ etyleeniglykolidimetyylieetterin vesiliuosta ja seosta sekoitettiin yli yön. Reaktioseos haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin 1-N-(L-(-)-V*"-bentsyyli-oksikarbonyyliamino-*<-hydroksibutyryyli-ö^N-karbobentsoksikanamysiini A:n ruskea jäännös, jota käytettiin seuraavassa reaktiossa enempää puhdistamatta.

Saatu epäpuhdas tuote liuotettiin U0 ml:aan 50-¾ dioksaanin vesiliuosta ja pieni määrä liukenematonta ainetta poistettiin suodattamalla. Suodokseen lisättiin 0,8 ml jääetikkaa ja 1 g 10-¾ palladiumhiilikatalyyttiä ja seosta hydrattiin huoneen lämpötilassa 2k tuntia Parr-hydrauslaitteessa. Reaktioseos suodatettiin palladiumkatalyytin poistamiseksi ja suodos haihdutettiin kuiviin tyhjössä. Jäännös liuotettiin 30 ml:aan vettä ja kromatgorafoitiin kolonnissa, jossa oli CG-50-ioninvaihtohartsia (NH^ -tyyppiä, 50 cm x 1,8 cm). Kolonni pestiin 200 ml:lla vettä ja eluoitiin sitten 800 ml:lla 0,1-N NH^OHia, 500 ml:lla 0,2-N NH^OHia ja lopuksi 500 ml:lla 0,5~N NH^OHia. Kymmenen ml:n jakeet otettiin talteen ja jakeet 1U6-15U sisälsivät 552 mg otsikossa mainittua yhdistettä, raakana tuotteena", sp. 18T°C (hajoaa). Suhteellinen teho B, subtilis-lajia (agar-levy) vastaan = 560 mcg/mg (standardi: Kanamysiini A:n vapaa emäs).

Liuos, jossa oli 250 mg saatua raakaa tuotetta 10 ml:ssa vettä, kromatog-rafoitiin kolonnissa, jossa oli CG 50-hartsia (NH-^-tyyppiä, 30 cm x 0,9 cm).

Kolonni pestiin 50 ml:lla vettä ja eluoitiin sitten 0,2-N ammoniakilla. Kymmenen ml:n jakeet otettiin talteen. Jakeet 50-63 yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin alipaineessa, jolloin saatiin 98 mg puhdasta tuotetta", sp. 19U°C (hajoan).

(c< )^1= +85° (c = 2. H^O). Suhteellinen teho B. subtilis-lajia (agar-levy) vastaan = 960/xg/mg (standardi-kanamysiini A:n vapaa emäs).

Analyysi: laskemalla yhdisteestä CggH^gNj-O^SHgCO : C, Uo,62", H, 6,68", N, 9,87 kokeellisesti: C, Uo,21", 39,79*, H, 6,96*, 6,87*, N, 9,37, 9,fc9- 23 56388

Esimerkki 2 1-N-(L-(-)-/"-amino-»^.-hydroksibutyryyli )-kanamysiini B:n valmistus

Sekoitettuun liuokseen, jossa oli 1,85 g (3,0 mmoolia) 6'-karbobentsoksi-kanamysiini B:tä 1+0 ml:ssa H^0:a ja 50 ml:ssa 1,2-dimetoksietaania, lisättiin yhdellä kertaa 5°C:ssa 1,1 g (3,1 mmoolia) N-(L-/^karbobentsoksiamino-^-hydroksi-butyryylioksi)sukkinimidiä. Reaktioseosta sekoitettiin yli yön huoneen lämpötilassa ja sille suoritettiin hydrogenolyysi eristämättä muodostunutta 1-N-(L-(-)-/”-bent syy li ok s ikarbonyy li amino--hydroksibutyryyli )-6 '-N-karbobentsoksikanamysiini B:a. TLC (silikageeli F 25*+), Rf 0,06 (lähtöaine), 0,1+1 ja 0,57 (n.PrOH-pyridiini-AcOH-HgO suhteessa 15:10:3:12). Rf 0,11 (lähtöaine), 021, 0,3*+ ja 0,1+6 (asetoni-AcOH-HgO suhteessa 20:6:71+).

Saatuun liuokseen lisättiin 0,2 g 10-% palladiumhiilikatalyyttiä. Kun seosta oli hydrattu normaalipaineessa 5 tuntia lisättiin vielä 0,1 g 10-% palladiumhiilikatalyyttiä ja 10 ml vettä. Hydrausta jatkettiin yli yön. Reaktioseos suodatettiin, suodos haihdutettiin alipaineessa, jäännös liuotettiin 50 ml:aan vettä ja kromatografoitiin CG-50-kolonnissa (NH^, 1,2 cm x 50 cm). Kolonni pestiin 200 ml:11a vettä ja eluoitiin sitten 500 ml:11a 0,1-n ammoniakkia, 500 ml:11a 0,2-n ammoniakkia, 900 ml:lla 0,5~n ammoniakkia ja 500 ml:lla 1-n ammoniakkia. Poistovirta otettiin talteen 10 ml:n jakeina. Kanamysiini B saatiin talteen jakeista 60-76 32 %:n saannolla (1+59 mg). Jakeet 128-138 otettiin talteen, haihdutettiin alipaineessa ja pakastekuivattiin, jolloin saatiin 318 mg (17 % laskettuna karbobentsoksikananysiini B:stä) otsikossa mainittua yhdistettä’, sp. 186-187°C (hajoaa). (* )^9= +78° (c = 1,15, Ho0)V^ 16U0 cm"1.

u d 9 c=0

Analyysi: laskemalla kaavasta C22Hl+l+W6°12‘H2C03: C, 1+2,72’, H, 7,17’, N, 13,00 kokeellisesti: C, 1+2,23*, H, 7,19', N, 12,37 TLC (silikageeli F^^, ninhydriini), Rf 0,11 asetoni-AcOH-H^O-seoksessa (20:6:71+)’, Rf 0,19 CHC1 -MeOH-väkevä NH^OH-^O-seoksessa (1:1+:2:1).

Esimerkki 3 1—N—(L—(—)— /^-amino-X.-hydroksibutyryyli) kanamysiini A:n tai B:n monosul-faattisuolan valmistus

Yksi mooli 1 —N— (L— (—) — ^-amino--hydroksibutyryyli) kanamysiini A:ta tai B:tä liuotettiin 2 l:aan vettä. Liuos suodatettiin liukenemattomien kiinteiden aineiden poistamiseksi. Jäähdytettyyn ja sekoitettuun liuokseen lisättiin 1 mooli rikkihappoa liuotettuna 500 ml:aan vettä. Seoksen annettiin sekoittua 30 min, jonka jälkeen seokseen lisättiin kylmää etanolia, kunnes saostuminen 2k 56306 tapahtui. Kiinteät aineet kerättiin talteen suodattamalla ja niiden todettiin olevan haluttua monosulfaattisuolaa.

Esimerkki k l-N-tL-i-J-^-amino-^-hydroksibutyryyliJkanamysiini A:n disulfaattisuolan valmistus 35 g 1-N-(L-(-)-^-amino-*4-hydroksibutyryyli)kanamysiini A:ta (monobikarbo-naatin trihydraattina) liuotettiin 125 ml:aan ionivaihdettua vettä. Havaittiin pH-arvon olevan n. 9,0.pH alennettiin arvoon 7~7,5 50-$ (v/v) rikkihapolla.

Lisättiin 8,5 g aktiivihiiltä ("Darco G-βθ") ja seosta ravistettiin ympäristön lämpötilassa 0,5 tuntia. Hiili poistettiin suodattamalla ja pestiin 1+0 ml:lla vettä. Pesuvesi lisättiin suodokseen.

Ylläolevan yhdistetyn suodos-pesuliuoksen pH säädettiin välille 2,0-2,6 50-$ (v/v) rikkihapolla. Kehittyi suuri määrä hiilidioksidia. Liuoksen annettiin vielä seistä 20 minuuttia alipaineessa hiilidioksidijäännösten poistamiseksi. Lisättiin 8,5 g aktiivihiiltä ("Darco G-60") kaasuista puhdistettuun liuokseen. Seosta ravistettiin 0,5 tuntia huoneen lämpötilassa. Hiili poistettiin suodattamalla ja pestiin 35 ml:11a ionivaihdettua vettä. Vesi lisättiin suodokseen.

Yhdistetty suodos ja pesuliuos säädettiin pH-arvoon 1-1,3 50-$ (v/v) rikkihapolla. Tämä liuos lisättiin nopeasti sekoittaen 10 minuutin aikana 600-800 ml:aan metanolia (3~^ tilavuusosaa metanolia). Seosta sekoitettiin 5 min. pH-arvolla 1-1,3, johdettiin 100 mesh'in seulan läpi, sekoitettiin 2 min. ja annettiin laskeutua 5 min. Suurin osa yläpuolella olevasta nesteestä dekantoi-tiin. Jäljelle jäänyt liete suodatettiin sopivasti, pestiin 200 ml:lla metanolia ja kuivattiin tyhjössä 50°C:ssa 2k tuntia. Otsikossa mainitun tuotteen saalis oli 32-3*+ g", (^ )p H^O = +7^,75, hajoaminen 220-230°C:ssa.

Alkuaineanalyysi (kuivapainosta)*

Kokeellisesti Teoriassa $ C 32,7, 33,5, 32,3 33,5 $ N 8,78, 8,7, 8,2, 8,8 8,97 $ S 8,75, 8,9, 7,8, 8,85 8,2 $ tuhkan ei lainkaan ----- x Karl Fosher-vesipitoisuus: 2,33, 1,79, 2,87 $ (teoriassa monohydraatti sisältää 2,25 $ vettä). Tämä suola on hygroskooppista, muttei vetistyvää. Kun pientä osaa oli säilytetty ilmassa huoneen lämpötilassa 18 tuntia, vesipitoisuus nousi 9,55, 9,89 $:iin (teoriassa pentahydraatti sisältää 10,33 $ vettä).

Claims (1)

1. 563B8 Patenttivaatimus: Menetelmä uuden, terapeuttisesti käytettävän l-N-^-amino-^-hydroksibutyryyli-substituoidun kanamysiini (A tai B)-yhdisteen valmistamiseksi, jonka kaava on HO_ 4’ 6’ yV. ch2-nh2 \ 3 ’ 0 ho^ ΑΛ m 1,3 4 NHj HO \ C M /^SNS\^ \ 1 0 ^ / XSSss\ n H0 4» /CH20H / ^^NH-C-CH-CH2-CH2-NH2 g / OH νη2Λ^-^\ / ho x r y 3 jossa R on OI- tai l\IH2-ryhma, tai sen myrkyttömien, farmaseuttisesti hyväksyttävien happoadditiosuolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että suojataan kanamysiini A:n tai kanamysiini B:n 6’-hiilessä oleva aminoryhmä tavallisella amino-suojaryhmällä Y, jotta saadaan yhdiste, jolla on kaava: HO __4’ CH2-NH-Y HO --\ 3/ 1» R I 4 NH2 (II) 6” \ , HO _5 /Η2°Η /^^NH2 / \3»_2" \ / / H0 A / o 26 3 S63ÖC jossa R ja Y merkitsevät samaa kuin edellä, asyloidaan kaavan II mukaisen yhdisteen 1-asemassa oleva aminoryhmä asy-lointiaineella, jolla on kaava: □H W - NH - CH2 - CH2 - CH - COOH (III) sanotun asylointiaineen ollessa johdettu l_-(-)-V^-amino-<^ -hydroksivoihaposta, jossa kaavassa W on tavallinen amino-suojaryhmä, tai sen funktionaalisella ekvivalentilla, jotta saadaan yhdiste, jolla on kaava: 6' H0 4’ CH2-NH-Y HO '°\ «VI r3/ nh2 hct 1 \ o H0 4" W20H / \Lnh-c-ch-ch2-ch2-nh _o, / 0H w \ 3” 2” \ / NH2 —'--7^A / Hu rj / jossa R , Y ja W merkitsevät samaa kuin edellä, ja poistetaan suojaavat ryhmät W ja Y yleisesti tunnetuilla menetelmillä, jotta saadaan kaavan I mukainen 1-N-K-amino_<k -hydroksibutyryyli-substituoitu kanamy-siini (A tai B)-yhdiste ja haluttaessa muutetaan saatu tuote sinänsä tunnetulla tavalla farmaseuttisesti hyväksyttäväksi happoadditiosuolaksi. 4/ 563ϋε • Patentkrav: Förfarande för framställning av en ny, terapeutiskt användbar 1-N- V”-amino--hydroxibutyrylsubstituerad kanamycin (A eller B)-förening med formeln HO 4’ 6' Vs. /CH2-NH2 1 ' (I) R ^ 4 NH2 ΗΟ^δ^-^ \ 6” /\\ 1 0 PH ΓΊΗ / \\ ' »» H0 4„ / 2 n / NH-C-CH-CH2-CH2-NH2 \ 3" 7" \ / NH2.—/ HO / 1 \ / 0 3 där R är en OH- eller NH2-grupp, och icke-toxiska, farmaceutiskt godtagbara syraadditionssalter därav, kännetecknat därav, att aminogruppen i 6'-ställning av kanamycin A eller B blockeras med en konventionell aminoskyddande grupp Y för erhällande av en förening med formeln HO -J*' / CH2-NH-Y HO TvA R3 ^^4 NHZ (ID o —\2 6" HD 5^ , HO_NH2 nh2 —7^\ / HO 1„ \ / 0