FI122200B - New peptides and processes for their preparation - Google Patents

New peptides and processes for their preparation Download PDF

Info

Publication number
FI122200B
FI122200B FI20090031A FI20090031A FI122200B FI 122200 B FI122200 B FI 122200B FI 20090031 A FI20090031 A FI 20090031A FI 20090031 A FI20090031 A FI 20090031A FI 122200 B FI122200 B FI 122200B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
peptide
polynucleotide
slit structure
sequence
structure according
Prior art date
Application number
FI20090031A
Other languages
Finnish (fi)
Swedish (sv)
Other versions
FI20090031A0 (en
FI20090031A (en
Inventor
Vos Willem Meindert De
Airi Palva
Ilkka Palva
Justus Reunanen
Ossowski Ingemar Von
Reetta Satokari
Satu Vesterlund
Matti Kankainen
Tuomas Salusjaervi
Soile Tynkkynen
Original Assignee
Valio Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Valio Oy filed Critical Valio Oy
Publication of FI20090031A0 publication Critical patent/FI20090031A0/en
Priority to FI20090031A priority Critical patent/FI122200B/en
Priority to RU2011136454/10A priority patent/RU2583579C2/en
Priority to CA2750576A priority patent/CA2750576C/en
Priority to DK10703916.6T priority patent/DK2391641T3/en
Priority to KR1020117020625A priority patent/KR101782170B1/en
Priority to AU2010209584A priority patent/AU2010209584C1/en
Priority to JP2011546898A priority patent/JP5792073B2/en
Priority to EP10703916.6A priority patent/EP2391641B1/en
Priority to PCT/FI2010/050059 priority patent/WO2010086512A2/en
Priority to CN201080006238.5A priority patent/CN102317311B/en
Publication of FI20090031A publication Critical patent/FI20090031A/en
Priority to ZA2011/05579A priority patent/ZA201105579B/en
Priority to IL214375A priority patent/IL214375A0/en
Application granted granted Critical
Publication of FI122200B publication Critical patent/FI122200B/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/335—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Lactobacillus (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/195—Proteins from microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G16B30/10—Sequence alignment; Homology search

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Uusia peptidejä ja menetelmiä niiden valmistamiseksiNovel peptides and methods for their preparation

Keksinnön alaField of the Invention

Esillä oleva keksintö liittyy biotieteiden ja elintarvike-, rehu- tai lääketeollisuuden aloihin. Erityisesti keksintö liittyy uusiin peptideihin, proteiinei-5 hin, pilusrakenteisiin, polynukleotideihin sekä vektoreihin, isäntäsoluihin, tuotteisiin ja farmaseuttisiin koostumuksiin, jotka käsittävät polynukleotideja, peptidejä, proteiineja tai pilusrakenteita. Keksintö liittyy myös geeniklustereihin ja vasta-aineisiin. Lisäksi esillä oleva keksintö liittyy menetelmiin peptidien, proteiinien tai pilusrakenteiden valmistamiseksi tai peptidejä, proteiineja tai pilusra-10 kenteita käsittävien tuotteiden valmistamiseksi. Lisäksi esillä oleva keksintö liittyy hoitoihin sekä käyttöihin ja menetelmiin bakteerikantojen seulomiseksi, patogeenisten bakteerien adheesion vähentämiseksi tai estämiseksi, bakteerisolujen adheesion edistämiseksi limaan ja/tai epiteeliin ja/tai kohteen immuunivasteen modifioimiseksi. Esillä oleva keksintö liittyy vielä menetelmiin 15 probioottisten bakteerikantojen tai tunnistettavien ja/tai estettävien patogeenisten kantojen havaitsemiseksi.The present invention relates to the life sciences and food, feed, or pharmaceutical industries. In particular, the invention relates to novel peptides, proteins, slit structures, polynucleotides, and vectors, host cells, products and pharmaceutical compositions comprising polynucleotides, peptides, proteins or slit structures. The invention also relates to gene clusters and antibodies. Furthermore, the present invention relates to methods of making peptides, proteins or pilus structures or to products comprising peptides, proteins or pilus structures. Furthermore, the present invention relates to therapies and uses and methods for screening bacterial strains, reducing or preventing pathogenic bacterial adhesion, promoting bacterial cell adhesion to the mucus and / or epithelium, and / or modifying the immune response of a subject. The present invention further relates to methods for detecting probiotic bacterial strains or pathogenic strains that are detectable and / or inhibited.

Keksinnön taustaBackground of the Invention

Bakteeripatogeenien invasiivista tarttumista isäntäkudoksiin helpottavat usein pitkänomaiset karvamaiset proteiinikuidut, joita kutsutaan piluksiksi 20 tai fimbrioiksi ja jotka ulkonevat mikrobin solupinnalta. Gramnegatiivisissa patogeenisissä bakteereissa piiusten rooli kolonisaation välittäjänä tunnetaan hyvin, ja piluskokoonpanon kokonaismekanismia on määritelty selkeästi tutkimuksissa yli viidenkymmenen vuoden ajan. Rakenteellisesti karakterisoiduim-mat gramnegatiiviset pilukset ovat tyypin I muotoa, jota esiintyy esimerkiksi en-^ 25 teropatogeenisessä E. coli -bakteerissa, ja tyypin IV muotoa, jota esiintyy esi- ° merkiksi Neisseria- ja Pseudomonas-lajeissa sekä E. colissa. Tyypillisesti § gramnegatiiviset pilukset ovat pitkiä (pituudeltaan 1 - 4 μιη) ja ohuita (leveydel- o tään 5 - 8 nm), ja niillä on myös sekä joustavia että vahvoja rakenteellisia omi- x naisuuksia. Nämä pilukset muodostuvat yleensä sarjasta ei-kovalenttisesti βίThe invasive adhesion of bacterial pathogens to host tissues is often facilitated by elongated hairy protein fibers, called piles 20 or fimbriae, which protrude from the cell surface of the microbe. In gram-negative pathogenic bacteria, the role of silicon as a mediator of colonization is well known, and the overall mechanism of the pilus assembly has been clearly defined in studies for more than fifty years. The most structurally characterized Gram-negative pili are the type I form found, for example, in the bacterial E. coli endopathogen, and the type IV form, for example, in Neisseria and Pseudomonas species and E. coli. Typically, the gram-negative slits are long (1-4 μιη in length) and thin (5-8 nm in width) and also have both elastic and strong structural properties. These piles usually consist of a series of non-covalent βί

εEεE

30 toutuneita useita proteiinialayksiköitä, joiden kokoonpano on riippuvainen here tyistä saperoniproteiineista, mutta on riippumaton mistään entsymaattisesta § aktiivisuudesta. Ominaisuuksiltaan adhesiivinen proteiini sijaitsee usein pilus-30 multiple protein subunits, the assembly of which is dependent on native saperone proteins but is independent of any enzymatic activity. The protein with adhesive properties is often located in

Oo

o ten kärjessä. Yleisesti katsotaan, että proteiinialayksiköiden etäisyys mikrobin pinnalta edesauttaa esteetöntä kontaktia adhesiivisen kärkiproteiinin ja vas-35 taavan isäntäsolun reseptorikohtien välillä, joita edustavat potentiaalisesti so- 2 lunulkoisen matriisin (ECM) tai glykoproteiinien ja glykolipidien tiettyjen hiilihyd-raattiosien komponentit (Scott J. R. ja Zähner D, 2006, Mol Microbiol 62, 320 -330; Telford, J. L. et ai. 2006, Nat Rev Microbiol 4, 509 - 519).o at the forefront. It is generally believed that the distance of the protein subunits from the microbial surface promotes unhindered contact between the adhesive tip protein and the receptor sites of the corresponding host cell, represented by the potential components of the extracellular matrix (ECM) or glycoproteins and thiol 2006 , Mol Microbiol 62, 320-330; Telford, JL et al., 2006, Nat Rev Microbiol 4, 509-519.

Grampositiivisten pilusmaisten rakenteiden olemassaolo havaittiin 5 varsinaisesti ensimmäisen kerran 1960-luvun lopussa Corynebacterium reilaten elektronimikroskooppisessa tutkimuksessa (Yanagawa, R. et ai. 1968, Jpn J Vet Res 16, 31 - 37), ja seuraavina vuosina piluksia löydettiin useista muista grampositiivisista bakteerilajeista, mukaan lukien hyvin äskettäinen piluslöytö kolmessa merkittävässä invasiivisessa, tautia ihmisille aiheuttavassa strepto-10 kokkipatogeenissa, jotka ovat Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalac-tiae ja Streptococcus pneumoniae (Telford, J. L. et al. 2006, Nat Rev Microbiol 4, 509 - 519). Grampositiivisten pilusten yksityiskohtaisimmat karakterisointi-tutkimukset on tehty korynebakteereista, streptokokeista ja patogeenisistä basilleista.The existence of gram-positive pilus-like structures was first discovered in an electron microscopic study of Corynebacterium reilate in the late 1960s (Yanagawa, R. et al. 1968, Jpn J Vet Res 16, 31-37), and in subsequent years, pili were found in several other gram-positive bacterial species, a very recent pili finding in three major invasive human strepto-10 cocculent pathogens, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae and Streptococcus pneumoniae (Telford, J.L. et al. 2006, Nat Rev Microbiol 4, 509-519). The most detailed characterization studies of gram-positive pili have been made on chorionic bacteria, streptococci and pathogenic bacilli.

15 Toisin kuin gramnegatiivisissa bakteereissa, grampositiivisissa bak teereissa olevat pilukset ovat leveydeltään paljon ohuempia (2 - 3 nm) ja vaikeammin havaittavissa, mikä myös viittaa siihen miksi näiden pilusten olemassaolo on saattanut jäädä huomaamatta monissa grampositiivisten bakteerien lajeissa (Kang, H. J. et ai. 2007, Science 318, 1625 - 1628). Tähän mennessä 20 tarkin piluskokoonpanoprosessin kuvaus, joka on myös pääpiirteittäin yleistettävissä kaikkiin grampositiivisiin piluksiin, on esitetty Corynebacterium diphthe-riae -bakteerin pilusbiogeneesin in vivo -karakterisointitutkimuksissa (Ton-That, H. ja Schneewind, O. 2004, Trends Microbiol 12, 228 - 234). Rakenteellisesti prototyyppipilukset esiintyvät polymeereinä, jotka muodostuvat kovalenttisesti 25 sitoutuneista proteiinialayksiköistä (joita kutsutaan nimellä piliinit), jotka ovat myös kovalenttisesti kiinnittyneet tyvestä soluseinän peptidoglykaanikompo-^ nenttiin, ja molemmat näistä kovalenttisista sidoksista ovat entsymaattisesti ™ riippuvaisia sortaasiperheeseen kuuluvien, membraaniin sitoutuvien eri trans- 00 9 peptidaasien, toisin sanoen piliinispesifisten ja vastaavasti housekeeping- ° 30 sortaasien, aikaansaamasta katalyysistä (Mandlik, A. et ai. 2008, Trends Mic- £ robiol 16, 33 - 40). Grampositiivinen pilus muodostuu tyypillisesti kolmesta pi-15 Unlike Gram-negative bacteria, the gills in Gram-positive bacteria are much thinner in width (2-3 nm) and less readily detectable, which also suggests why the existence of these gills may have been overlooked in many species of Gram-positive bacteria (Kang, HJ et al. 2007, Science 318, 1625-1628). To date, the 20 most accurate description of the pilus assembly process, which is also broadly generalizable to all gram-positive pili, has been presented in in vivo characterization studies of pilus biogenesis of Corynebacterium diphtheriae (Ton-That, H. and Schneewind, O. 2004, Trends Microbiol. ). Structurally, prototype piles occur as polymers of covalently bound protein subunits (called pilins), which are also covalently attached to the peptidoglycan component of the cell wall, and both of these covalently linked peptide-linked, that is, catalysis by pilin-specific and housekeeping sorta (30), respectively (Mandlik, A. et al. 2008, Trends Microbiol 16, 33-40). A gram-positive pilus typically consists of three pi-

CLCL

liinialayksiköstä ja C. diphtheriaen tapauksessa geeneistä, joita kutsutaan o SpaA:ksi (sortase-mediated pilin assembly), suurempaa piliinialayksikköä var- co § ten, joka muodostaa ainoastaan piluksen varren tai pääketjun, SpaB:ksi avus-lineage subunit and, in the case of C. diphtheriae, the genes called oAspA (sortase-mediated Pilin assembly), a larger pilin subunit with varroa that forms only the pilus stem or backbone, SpaB

Oo

35 tavaa pienempää piliinialayksikköä varten ja SpaC:ksi toista pienempää ominaisuuksiltaan adhesiivista piliinialayksikköä varten, joka sijaitsee piluksen kär- 3 jessä (kuvio 1). Geenit, jotka koodaavat näitä kolmea piliinialayksikköä, sijaitsevat samassa lokuksessa piliinigeeniklusterina ja sen läheisyydessä sijaitsee ainakin yksi geeni, joka koodaa piliinispesifistä sortaasia. Piliiniklusterissa olevia geenejä myös usein reunustavat molemmissa päissä siirrettävissä olevat 5 elementit, mikä viittaa horisontaalisen geeninsiirron alkuperään. Kaikkien näiden geenien transkriptio on samansuuntainen ja indikoi operonin säädeltyä ohjausta (Scott J.R. ja Zähner D, 2006, Mol Microbiol 62, 320 - 330).35 ways for a smaller pilin subunit and SpaC for another smaller pilin subunit with adhesive properties located at the tip of the pilus (Figure 1). The genes encoding these three pilin subunits are located in the same locus as a pilin gene cluster and at least one gene encoding pilin-specific sorpase is located in its vicinity. Genes in the pilin cluster are also often flanked by transferable elements at both ends, indicating the origin of the horizontal gene transfer. The transcription of all of these genes is parallel and indicates regulated control of the operon (Scott J.R. and Zähner D, 2006, Mol Microbiol 62, 320-330).

Grampositiivisen piluskokoonpanon kokonaisprosessin tarkistettu malli, joka on riippuvainen kunkin piliinialayksikön primaarisekvensseissä ole-10 vista useista eri konservoituneista alueista ja domeeneista, käsittää neljä perusvaihetta (Mandlik, A. et ai. 2008, Proc Natl Acad Sei USA 105, 14147 -14152; Telford, J. L. et ai. 2006; Nat Rev Microbiol 4, 509 - 519) (kuvio 1). Ensimmäisessä vaiheessa piliiniproteiinit, joista kukin sisältää N-terminaalisen signaalipeptidin, eritetään bakteerisolumembraanin läpi Sec-riippuvaisella reitil-15 läjä pidetään sitten solumembraanissa C-terminaalisen membraanin läpi ulottuvan domeenin avulla, joka muodostuu noin 20 tähteen hydrofobisesta alueesta ja positiivisesti varautuneesta hännästä.A revised model of the overall process of a gram-positive pilus assembly dependent on a plurality of different conserved regions and domains in the primary sequences of each pilin subunit encompasses four basic steps (Mandlik, A. et al. 2008, Proc Natl Acad Sci USA 105, 14147-14142; Telford, JL); et al. 2006; Nat Rev Microbiol 4, 509-519 (Figure 1). In a first step, the pilin proteins, each containing an N-terminal signal peptide, are secreted through a bacterial cell membrane by a Sec-dependent pathway-15, then maintained in the cell membrane by a C-terminal membrane domain consisting of a hydrophobic region of about 20 residues.

Kokoonpanoprosessin toisessa vaiheessa soluseinämän lajittelusig-naali (CWSS), edullisesti LPXTG-motiivi, joka välittömästi edeltää membraanin 20 läpäisevää domeenia, tulee saataville solumembraaniin kiinnittyneiden piliini-proteiinien sortaasi-riippuvaista pilkkomista varten. Piliinispesifinen sortaasi pilkkoo tämän viiden tähteen motiivin treoniini- (T) ja glysiinitähteiden (G) väliltä ja muodostaa asyylientsyymivälimuodon, jossa on kovalenttinen tioeste-risidos treoniinitähteen karboksyyliryhmän ja sortaasin katalyyttisessä taskussa 25 esiintyvän kysteinyylitiolin välillä.In a second step of the assembly process, a cell wall sorting signal (CWSS), preferably an LPXTG motif immediately preceding the membrane 20 transmembrane domain, becomes available for sorption-dependent cleavage of cell membrane-bound pilin proteins. The pilin-specific sorption cleaves the motif of these five residues between the threonine (T) and glycine residues (G) and forms an acylic enzyme intermediate having a covalent thioester linkage between the carboxyl group of the threonine residue and the cysteine present in the catalytic pocket.

Kolmas vaihe edustaa piliinialayksiköiden polymerisaatiota isopepti- ^ disidosten muodostumisella ja käsittää tioesterisidoksen pilkkomisen ja sortaa- ^ sin vapautumisen piliinialayksiköstä s-aminoryhmän nukleofiilisellä hyökkäyk- 00 9 sellä lysiinitähteen (K) sivuketjusta, joka lysiinitähde on konservoitunut toisena ° 30 olevan piliinialayksikön piliinimotiivissa (WXXXVXVYPKN). Amidisidoksen aja- o. teilaan muodostuvan ensimmäisessä piliinialayksikössä olevan treoniinitähteenThe third step represents the polymerization of the pilin subunits by the formation of isopeptide bonds and comprises the cleavage and sorption of the thioester bond from the pilin subunit by nucleophilic attack of the? Amide bond time. threonine residue in the first pilin subunit formed in the slime

CLCL

C-terminaalisen karboksyyliryhmän ja toisesta piliinialayksiköstä peräisin ole-o van piliinimotiivin lysiinin sivuketjun aminoryhmän välille, joka on yhä sitoutunutBetween the C-terminal carboxyl group and the lysine side chain amino group of the pilin motif from the second pilin subunit, which is still bound

Oo

§ kovalenttisena tioesterinä toiseen piliinispesifiseen sortaasiin (Budzik, J. M. et ° 35 ai. 2008, Proc Natl Acad Sei USA 105, 10215 - 10220). Tässä piluskokoonpa non mallissa kasvavaa polymeerirakennetta syötetään piliinilisäalayksiköillä 4 piluksen tyvessä, ja kokonaispituutta säätelee saatavilla olevien piliinispesifisiin sortaaseihin liittyvien piliinialayksiköiden määrä. Koska piliinimotiivi on suurempien piliinialayksiköiden (SpaA) ja avustavien pienempien (SpaB) piliinialayksiköiden tunnusomainen piirre mutta puuttuu ominaisuuksiltaan adhesiivisten 5 pienempien piliinialayksiköiden (SpaC) primaarisekvenssistä, tämä piliinialayk-sikkö sijaitsee todennäköisesti piluksen varren kärjessä ja on ensimmäisen pi-liinialayksikkö, joka aloittaa piluksen polymerisaation.As a covalent thioester to another pilin-specific sorpase (Budzik, J.M. et al. 35, 2008, Proc Natl Acad Sci USA 105, 10215-10220). In this pilus configuration model, the growing polymer structure is fed by pilin subunits at the base of the pilus, and the overall length is controlled by the number of pilin subunits available for pilin-specific sorpases. Since the pilin motif is a hallmark of larger pilin subunits (SpaA) and helper smaller (SpaB) pilin subunits but lacks the primary sequence of the 5 smaller pilin subunits (SpaC) with adhesive properties, this pilin subunit is probably located at the apex of the first pilus stem.

Polymeroidun piluksen kiinnittyminen solun seinämään edustaa kokoonpanoprosessin neljättä vaihetta. Tässä avustava pienempi piliinialayksikkö 10 (SpaB) signaloi piluksen polymeroinnin lakkaamista mutta vain housekeeping-sortaasien yhteydessä, joiden geeni on koodattuna jossain muualla genomis-sa. Loppuvaiheessa suurempien piliinialayksiköiden (SpaA) kasvava polymee-rirakenne siirretään piliinispesifisen sortaasin kanssa olevasta tioesterisidok-sesta amidisidoksen muodostamiseksi pienemmän SpaB piliinialayksikön pilii-15 nimotiivissa olevan lysiinin sivuketjun kanssa, joka yhdistetään housekeeping-sortaasi-asyylientsyymi välituotteeksi. Peptidoglykaanin esiaste lipidi ll:n pen-tapeptidin aminoryhmän nukleofiilinen hyökkäys sallii täten housekeeping-sortaasin katalysoida SpaB-piliiniin sitoutuneen piluspolymeerin kiinnittymisen soluseinämään. E-laatikko edustaa kolmatta ja vähemmän karakterisoitua 20 konservoitua primaarisekvenssialuetta (YXLXETXAPXGY), jota esiintyy piliinialayksiköiden LPXTG- ja piliinimotiivien välissä monissa grampositiivissa bakteereissa.The attachment of the polymerized pilus to the cell wall represents the fourth step of the assembly process. Here, the auxiliary smaller pilin subunit 10 (SpaB) signals the termination of pilus polymerization, but only in the case of housekeeping sorts whose gene is encoded elsewhere in the genome. In the final step, the growing polymer structure of the larger pilin subunits (SpaA) is shifted from the thioester linkage with the pilin-specific sorpase to form an amide bond with the lysine side chain of the smaller pilin-15 nomenclature of the SpaB pilin subunit, which is joined by housekeeping. Peptidoglycan precursor lipid II nucleophilic attack of the penapeptide amino group thus allows housekeeping sorption to catalyze the attachment of a SpaB-pilin-bound bilayer polymer to the cell wall. The E box represents the third and less characterized 20 conserved primary sequence region (YXLXETXAPXGY) that occurs between the LPXTG and pilin motifs of the pilin subunits in many gram-positive bacteria.

Tähän mennessä kolmiulotteisten (3-D) rakenteiden määritykset röntgensädekristallografialla ovat paljastaneet vain kahden grampositiivisen 25 piliinialayksikköproteiinin kokoonpanoa ja funktiota koskevia rakenteellisia näkemyksiä. Krishnan et ai. (2007, Structure 15: 893 - 903) olivat ratkaisseet ^ Streptococcus agalactiaen pienemmän piliini-GBS52:n kiderakenteen ja paljas- ^ taneet kahden IgG:n kaltaisen domeenilaskoksen läsnäolon, jotka ovat raken- 00 o teellisesti samankaltaisia kuin S. aureuksen kollageeniin sitoutuva proteiini ° 30 Cna, mikä osoittaa, kuinka myös tämä pienempi piliinialayksikkö voisi helpotin taa piluksen tarttumista spesifiseen isäntäkudokseen. Streptococcus pyogene-To date, determinations of three-dimensional (3-D) structures by X-ray crystallography have revealed structural insights into the composition and function of only two gram-positive pilin subunit proteins. Krishnan et al. (2007, Structure 15: 893-903) had resolved the crystal structure of the smaller pilin-GBS52 of Streptococcus agalactiae and revealed the presence of two IgG-like domain folds structurally similar to S. aureus collagen binding protein 30 ° C, indicating how also this smaller pilin subunit could facilitate the adhesion of the pilus to specific host tissue. Streptococcus pyogene-

CLCL

sin suuremman piliinin Spy0128 kiderakenne, jonka ratkaisivat Kang et ai.the crystal structure of the larger pilin Spy0128 solved by Kang et al.

o (2007, Science 318, 1625 - 1628), on osoittanut, kuinka itsestään syntyneet o g molekyylinsisäiset isopeptidisidokset lysiinin sivuketjujen ja asparagiinitähtei- ^ 35 den välillä piliinialayksikössä voisivat myös edesauttaa sortaasikatalysoituja 5 molekyylien välisiä isopeptidisidoksia pilusten kokonaisvahvuuden ja -vakauden ylläpitämiseksi.o (2007, Science 318, 1625-1628), has shown how self-generated o g intramolecular isopeptide bonds between lysine side chains and asparagine residues in a pilin subunit could also promote sorpase catalyzed intermolecular interruption and isopeptide bonding.

Suurin osa probioottisista mikrobeista kuuluu grampositiivisiin lakto-basilleihin ja bifidobakteereihin, ja niillä on pitkä perinne käymisprosessilla 5 valmistettujen ruoka-aineiden ja meijerituotteiden tuottamisessa (Goldin, B.R. ja Gorbach, S. L. 2008, Clin Infect Dis 46, S96 - S100; Ljungh, A. ja Wadstrom, T. 2006, Curr Issues Intest Microbiol 7, 73 - 89; Salminen, S. et ai. 1998, Br J Nutr 80, S147-S171). Probioottisten laktobasillien pilusrakennetta tai näitä pi-lusrakenteita koodaavia geenejä ei ole kuvattu kirjallisuudessa. Pilusmaisten 10 rakenteiden tai polynukleotidien läsnäoloa ei ole koskaan osoitettu Lactobacillus rhamnosuksessa.Most of the probiotic microbes belong to gram-positive lactobacilli and bifidobacteria and have a long tradition in the production of fermented food and dairy products (Goldin, BR and Gorbach, SL 2008, Clin Infect Dis 46, S96- S100; Ljungh, A. and Wadstrom, T. 2006, Curr Issues Intest Microbiol 7, 73-89; Salminen, S. et al. 1998, Br J Nutr 80, S147-S171). The pili structure of probiotic lactobacilli or the genes encoding these pili structures have not been described in the literature. The presence of piloid-like structures or polynucleotides has never been demonstrated in Lactobacillus rhamnosus.

Keksinnön lyhyt selostusBrief Description of the Invention

Esillä olevan keksinnön tavoitteena on saada aikaan uusia piluspep-tidejä sekä niitä koodaavia polynukleotideja. Lisäksi keksinnön tavoitteena on 15 saada aikaan uusia pilusrakenteita. Vielä keksinnön tavoitteena on saada aikaan uusia menetelmiä, käyttöjä ja tuotteita, jotka liittyvät yllä mainittuihin pep-tideihin, polypeptideihin, proteiineihin, pilusrakenteisiin ja polynukleotideihin.An object of the present invention is to provide novel pili peptides as well as polynucleotides encoding them. It is a further object of the invention to provide new slit structures. Another object of the invention is to provide novel methods, uses and products related to the above-mentioned peptides, polypeptides, proteins, slit structures and polynucleotides.

Esillä oleva keksintö koskee peptidejä, joille on tunnusomaista, että ne käsittävät sekvenssin, jolla on ainakin 91 %:n sekvenssi-identtisyys sek-20 venssin SEQ ID NO:4 (GG00444) kanssa ja joka on osa pilusrakennetta.The present invention relates to peptides, characterized in that they comprise a sequence having at least 91% sequence identity to SEQ ID NO: 4 (GG00444) and which is part of a slit structure.

Esillä olevassa keksinnössä kuvataan myös peptidejä, jotka käsittävät sekvenssin, jolla on ainakin 94 %:n sekvenssi-identtisyys sekvenssin id-nro 1 (GG00441) kanssa, ainakin 94 %:n sekvenssi-identtisyys sekvenssin id-nro 2 (GG00442) kanssa, ainakin 84 %:n sekvenssi-identtisyys sekvenssin id-nro 3 25 (GG00443) kanssa, ainakin 83 %:n sekvenssi-identtisyys sekvenssin id-nro 5 = (GG02369) kanssa, ainakin 94 %:n sekvenssi-identtisyys sekvenssin id-nro 6 o cm (GG02370) kanssa, ainakin 93 %:n sekvenssi-identtisyys sekvenssin id-nro 7 o (GG02371) kanssa tai ainakin 93 %:n sekvenssi-identtisyys sekvenssin id-nro ° 8 (GG02372) kanssa, tai niiden fragmentteja tai variantteja, x 30 Esillä oleva keksintö koskee myös pilusrakennetta, joka käsittää keksinnön ainakin yhden peptidin, tuotetta, joka käsittää keksinnön ainakin yh-g den peptidin tai pilusrakenteen, ja farmaseuttista tai ravintokoostumusta, joka § käsittää keksinnön ainakin yhden peptidin tai pilusrakenteen.The present invention also describes peptides comprising a sequence having at least 94% sequence identity to SEQ ID NO: 1 (GG00441), at least 94% sequence identity to SEQ ID NO: 2 (GG00442), at least 84% sequence identity to SEQ ID NO: 3 (GG00443), at least 83% sequence identity to SEQ ID NO: 5 = (GG02369), at least 94% sequence identity to SEQ ID NO: 6 o cm (GG02370), at least 93% sequence identity to SEQ ID NO: 7 o (GG02371), or at least 93% sequence identity to SEQ ID NO: 8 (GG02372), or fragments or variants thereof The present invention also relates to a slit structure comprising at least one peptide of the invention, a product comprising at least one peptide or slit structure of the invention, and a pharmaceutical or nutritional composition comprising at least one peptide or slit structure of the invention.

oo

(M(M

66

Lisäksi esillä oleva keksintö koskee tuotetta, joka käsittää keksinnön ainakin yhden peptidin tai pilusrakenteen, käytettäväksi lääkkeenä tai ripulin, kohonneen verenpaineen, verisuonitautien, allergioiden, syövän, atooppisten tautien, virustautien, infektiotautien, virtsatieinfektioiden, hengitystieinfektioi-5 den, karieksen, ärtyvän suolen oireyhtymän (IBS), tulehduksellisen suolistosairauden (IBD), limakalvon tulehduksen, suolen läpäisevyyshäiriöiden, liikalihavuuden, metabolisen oireyhtymän, oksidatiivisen stressin tai vatsakipujen estämiseen tai hoitamiseen.Further, the present invention relates to a product comprising at least one peptide or pilusrakenteen invention, for use as a medicament or diarrhea, high blood pressure, cardiovascular diseases, allergies, cancer, atopic diseases, viral diseases, infectious diseases, urinary tract infections, hengitystieinfektioi-5 den, caries, irritable bowel syndrome ( IBS), inflammatory bowel disease (IBD), mucosal inflammation, intestinal läpäisevyyshäiriöiden, obesity, metabolic syndrome, oxidative stress or abdominal pain prevention or treatment.

Lisäksi esillä oleva keksintö koskee keksinnön ainakin yhden pepti-10 din tai pilusrakenteen käyttöä valmistettaessa lääkettä ripulin, kohonneen verenpaineen, verisuonitautien, allergioiden, syövän, atooppisten tautien, virustautien, infektiotautien, virtsatieinfektioiden, hengitystieinfektioiden, karieksen, IBS:n, IBD:n, limakalvon tulehduksen, suolen läpäisevyyshäiriöiden, liikalihavuuden, metabolisen oireyhtymän, oksidatiivisen stressin tai vatsakipujen hoi-15 tamiseen tai estämiseen.The present invention further relates to the use of at least one peptide or slit structure of the invention in the manufacture of a medicament for diarrhea, hypertension, vascular disease, allergies, cancer, atopic disease, viral disease, infectious diseases, urinary tract infections, respiratory tract infections, caries, IBS, IBD: inflammation, intestinal läpäisevyyshäiriöiden, obesity, metabolic syndrome, oxidative stress or abdominal pain hoi-15 jointing or prevention.

Esillä oleva keksintö koskee vielä polynukleotidia, joka käsittää sekvenssin id-nro 12 tai sen degeneroituneen muodon ja koodaa tässä määriteltyä peptidiä, vektoria, joka käsittää keksinnön mukaisen polynukleotidin, isän-täsolua, joka käsittää keksinnön mukaisen polynukleotidin tai peptidin, ja gee-20 niklusteria, joka käsittää keksinnön mukaisen ainakin yhden polynukleotidin.The present invention further relates to a polynucleotide comprising SEQ ID NO: 12 or a degenerate form thereof and encoding a peptide as defined herein, a vector comprising a polynucleotide of the invention, a host cell comprising a polynucleotide or peptide of the invention, and comprising at least one polynucleotide of the invention.

Esillä oleva keksintö koskee myös vasta-ainetta/vasta-aineita keksinnön mukaisia peptidejä tai niiden funktionaalisia domeeneja vastaan.The present invention also relates to antibody (s) against the peptides of the invention or their functional domains.

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää sellaisten bakteerikantojen seulomiseksi, jotka käsittävät ainakin yhden keksinnön mukaisen polynuk-25 leotidin tai sen fragmentin, jolloin menetelmä käsittää: i) tarjotaan käyttöön DNA tai RNA bakteerikannoista; ^ ii) hybridisoidaan alukkeet tai koettimet, jotka ovat spesifisiä keksin- ^ nön mukaiselle polynukleotidille tai sen fragmentille, vaiheen i) DNA:n tai 00 9 RNA:n kanssa, ja valinnaisesti monistetaan polynukleotidi tai sen fragmentti; ? 30 iii) havaitaan ainakin yksi polynukleotidi tai sen fragmentti, joka on £ homologinen sekvenssin id-nro 12 mukaisen polynukleotidin kanssa.The present invention relates to a method for screening bacterial strains comprising at least one polynucleotide or fragment thereof according to the invention, comprising: i) providing DNA or RNA from bacterial strains; ii) hybridizing primers or probes specific for the polynucleotide or fragment thereof of the invention with the DNA of step i) or the RNA of step I9, and optionally amplifying the polynucleotide or fragment thereof; ? Iii) detecting at least one polynucleotide or fragment thereof which is homologous to the polynucleotide of SEQ ID NO: 12.

Q_Q_

Esillä oleva keksintö koskee ainakin yhden keksinnön mukaisen po- o lynukleotidin tai sen fragmentin tai keksinnön mukaisen ainakin yhden vasta-The present invention relates to at least one polynucleotide or fragment thereof of the invention or at least one antibody of the invention.

Oo

§ aineen käyttöä bakteerikantojen seulomiseksi.§ use of the substance to screen for bacterial strains.

oo

(M(M

77

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää sellaisten bakteerikantojen seulomiseksi, jotka käsittävät keksinnön mukaisen ainakin yhden peptidin tai pilusrakenteen, käyttämällä keksinnön mukaista ainakin yhtä vasta-ainetta, jolloin menetelmä käsittää: 5 i) tarjotaan käyttöön proteiineja bakteerikannoista; ja ii) havaitaan ainakin yksi polypeptidi, pilusrakenne tai niiden fragmentti käyttämällä vasta-ainetta/vasta-aineita.The present invention relates to a method for screening bacterial strains comprising at least one peptide or slit construct of the invention using at least one antibody of the invention, the method comprising: i) providing proteins from bacterial strains; and ii) detecting at least one polypeptide, slit structure, or fragment thereof using the antibody (s).

Esillä oleva keksintö koskee keksinnön mukaista ainakin yhtä peptidiä ja/tai pilusrakennetta patogeenisten bakteerien adheesion vähentämiseksi 10 tai estämiseksi kohteen maha-suolikanavaan, epiteeliin tai limaan.The present invention relates to at least one peptide and / or slit structure of the invention for reducing or preventing adhesion of pathogenic bacteria to the gastrointestinal tract, epithelium or mucus of a subject.

Esillä oleva keksintö koskee keksinnön mukaista ainakin yhtä peptidiä tai pilusrakennetta bakteerisolujen adheesion tai minkä tahansa muun aineen adheesion edistämiseksi limaan tai epiteeliin.The present invention relates to at least one peptide or slit structure of the invention for promoting adhesion of bacterial cells or any other substance to mucus or epithelium.

Esillä oleva keksintö koskee keksinnön mukaista ainakin yhtä pepti-15 diä tai pilusrakennetta immuunivasteen modifioimiseksi.The present invention relates to at least one peptide or slit structure of the invention for modifying the immune response.

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää keksinnön mukaisen tuotteen valmistamiseksi, jolloin menetelmä käsittää vaiheen, jossa muodostetaan keksinnön mukainen ainakin yksi peptidi tai pilusrakenne tuotteeseen.The present invention relates to a process for the preparation of a product according to the invention, the process comprising the step of forming at least one peptide or slit structure according to the invention in the product.

Esillä oleva keksintö koskee myös menetelmää keksinnön mukaisen 20 ainakin yhden peptidin tai pilusrakenteen valmistamiseksi, jolloin menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: i) tarjotaan käyttöön keksinnön mukainen ainakin yksi polynukleotidi; ii) transformoidaan isäntäsolu polynukleotid(e)illa; iii) viljellään vaiheen ii) isäntäsolua peptidi(e)n tai pilusrakenteen 25 valmistamiseksi; iv) valinnaisesti otetaan talteen peptidi(t) tai pilusrakenne.The present invention also relates to a process for the preparation of at least one peptide or slot construct of the invention, the method comprising the steps of: i) providing at least one polynucleotide of the invention; ii) transforming the host cell with polynucleotide (s); iii) culturing the host cell of step ii) to prepare peptide (s) or slit structure; iv) optionally recovering the peptide (s) or slit structure.

^ Lisäksi esillä oleva keksintö koskee menetelmää keksinnön mukai- o ^ sen ainakin yhden peptidin tai pilusrakenteen valmistamiseksi, jolloin mene- 00 9 telmä käsittää seuraavat vaiheet: ° 30 i) rikotaan keksinnön mukaisen ainakin yhden peptidin tai pilusra- kenteen valmistava tai käsittävä solu;The present invention further relates to a method of producing at least one peptide or slit structure according to the invention, the method comprising the steps of: i) disrupting a cell producing or comprising at least one peptide or slice structure according to the invention;

CLCL

ii) valinnaisesti otetaan talteen peptidi(t) tai pilusrakenne.ii) optionally recovering the peptide (s) or slit structure.

00 o o σ> o o00 o o σ> o o

(M(M

88

Esillä oleva keksintö koskee myös menetelmää keksinnön mukaisen ainakin yhden peptidin valmistamiseksi, jolloin menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: i) tarjotaan käyttöön aminohappoja; 5 ii) valmistetaan ainakin yksi keksinnön mukainen peptidi syntetisoi malla vaiheen i) aminohapoista ainakin yksi peptidi.The present invention also relates to a process for the preparation of at least one peptide of the invention comprising the steps of: i) providing amino acids; Ii) preparing at least one peptide of the invention by synthesizing at least one peptide from the amino acids of step i).

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää potentiaalisten probioottis-ten bakteerikantojen havaitsemiseksi käyttämällä bioinformatiikan lähestymistapoja, jolloin menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: 10 i) tarjotaan käyttöön keksinnön mukaisen ainakin yhden peptidin tai keksinnön mukaisen polynukleotidin sekvenssi; ii) verrataan vaiheen i) sekvenssiä sekvenssikokoelmien sekvens- seihin; ja iii) havaitaan sekvenssejä, joissa esiintyy merkittäviä osumia vai-15 heen i) peptidi(e)n tai polynukleotidi(e)n kanssa samanlaisia peptidisekvensse- jä, polynukleotidisekvenssejä tai pilusrakenteitaThe present invention relates to a method of detecting potential probiotic bacterial strains using bioinformatics approaches, the method comprising the steps of: i) providing a sequence of at least one peptide of the invention or a polynucleotide of the invention; ii) comparing the sequence of step i) with that of the sequence collections; and iii) detecting sequences that exhibit significant hits with peptide sequences, polynucleotide sequences, or slot structures similar to the peptide (s) or polynucleotide (s) of step i).

Esillä oleva keksintö koskee myös menetelmää sellaisten pato-geenikantojen havaitsemiseksi, joita vastaan keksinnön mukaiset peptidit tai pilusrakenteet vaikuttavat, käyttämällä bioinformatiikan lähestymistapoja, jol-20 loin menetelmä käsittää: i) tarjotaan käyttöön keksinnön mukaisen ainakin yhden peptidin tai keksinnön mukaisen polynukleotidin sekvenssi; ii) verrataan vaiheen i) sekvenssiä sekvenssikokoelmien sekvens- seihin; ja 25 iii) havaitaan sekvenssejä, joissa esiintyy merkittäviä osumia vai heen i) peptidi(e)n tai polynukleotidi(e)n kanssa samanlaisia peptidisekvensse-jä, polynukleotidisekvenssejä tai pilusrakenteita.The present invention also relates to a method for detecting strains of pathogens that are targeted by peptides or slit constructs of the invention using bioinformatics approaches, wherein the method comprises: i) providing a sequence of at least one peptide or polynucleotide of the invention; ii) comparing the sequence of step i) with that of the sequence collections; and iii) detecting sequences that exhibit significant hits with peptide sequences, polynucleotide sequences, or slit structures similar to the peptide (s) or polynucleotide (s) of step i).

Oo

^ Keksinnön mukaiset peptidit, pilusrakenteet ja polynukleotidit tarjoa- o vat työkaluja elintarvike-, rehu-, kosmetiikka- ja lääketeollisuuden jatkokehityk- ? 30 seen. Esillä oleva keksintö mahdollistaa nopeat ja tehokkaat seulontamene- telmät sekä monien bakteerikantojen luotettavan ja tarkan joko kvalitatiivisenThe peptides, slit structures and polynucleotides of the invention provide tools for further development of the food, feed, cosmetics and pharmaceutical industries. 30 fungus. The present invention enables rapid and efficient screening methods and reliable and accurate assay of many bacterial strains, either qualitatively

CLCL

tai kvantitatiivisen analyysin. Näin ollen keksinnön mukaiset menetelmät ja vä-g lineet mahdollistavat uusien probioottisten bakteerikantojen löytymisen sekäor quantitative analysis. Thus, the methods and tools of the invention allow the discovery of new probiotic bacterial strains as well as

Oo

g uusien tuotteiden (mm. ainesosien, lisäravinteiden ja ravintotuotteiden), lääk- 35 keiden ja terapeuttisten menetelmien löytymisen. Lisäksi esillä olevan keksinnön avulla tulee saataville tehokkaampia ja täsmällisempiä hoitoja.g discovery of new products (including ingredients, nutritional and nutritional products), medicines and therapeutic methods. In addition, the present invention provides more effective and accurate therapies.

99

On olemassa jatkuva, ilmeinen tarve tarjota kuluttajille uusia tuotteita, jotka ovat selvästi osoittaneet terveysvaikutuksia ja jotka on valmistettu muodossa, joka mahdollistaa niiden käytön sellaisenaan tai jonkin toisen tuotteen, kuten lääke- tai elintarvike- tai rehutuotteen, osana. Esillä olevan keksin-5 nön mukaisesti tuotteet voidaan toteuttaa kapseleina, pillereinä tai tabletteina, joita voidaan käyttää sujuvasti esimerkiksi jokapäiväisen ruokavalion tai lääkityksen osana tai lisänä.There is a continuing, evident need to provide consumers with new products that have clearly demonstrated health benefits and are prepared in a form that allows them to be used on their own or as part of another product, such as a pharmaceutical, food or feed product. According to the present invention, the products may be presented as capsules, pills or tablets, which may be used smoothly, for example, as part of or as an adjunct to a daily diet or medication.

Kuvioiden lyhyt selostusBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Kuviot 1a ja 1b esittävät piluskokoonpanon malleja ja kovalenttista 10 kiinnittymistä soluseinämään grampositiivisissa korynebakteereissa.Figures 1a and 1b show the patterns of cleft assembly and covalent attachment to the cell wall in gram-positive corynebacteria.

Kuvio 2 esittää Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) -pilusklustereita, jotka käsittävät geenejä, jotka koodaavat piliinispesifisiä sortaaseja, suurempia piluksen varren proteiineja, pienempiä piluksen varren proteiineja ja päässä olevia pilusproteiineja. CWSS osoittaa soluseinämään ohjaavan lajittelusignaa-15 iin, toisin sanoen konservoituneen alueen, jota esiintyy monissa grampositiivisissa bakteereissa, piliinimotiivi ja E-laatikko osoittavat myös konservoituneita motiiveja, joita esiintyy monissa grampositiivisissa bakteereissa.Figure 2 shows Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) slit clusters comprising genes encoding pilin-specific sorpases, larger piloside proteins, smaller piloside proteins, and end-pilus proteins. The CWSS shows the pilin motif and E box in the cell wall directing the sorting signal, i.e., the conserved region present in many gram-positive bacteria, as well as the conserved motifs present in many gram-positive bacteria.

Kuvio 3 esittää esimerkkejä polyklonaalisista vasta-aineista, jotka sitoutuvat LGG-pilusrakenteen peptideihin GG00442, GG00443, GG00444, 20 GG02370, GG02371 ja GG02372.Figure 3 shows examples of polyclonal antibodies that bind to peptides GG00442, GG00443, GG00444, GG02370, GG02371 and GG02372 of the LGG pilus construct.

Kuvio 4 esittää faasikontrasti-atomivoimamikroskooppikuvaa LGG:n ulkonevista pilusrakenteista.Figure 4 shows a phase contrast atomic force microscope image of protruding slit structures of LGG.

Kuviot 5a ja 5b esittävät rekombinanttihistidiinimerkittyjen LGG-pro-teiinien, toisin sanoen SpaA-, SpaB-, SpaC-, SpaD- ja SpaF-piliiniproteiinien, 25 in vitro -sitoutumista ihmisen suoliston limaan. Resektoidusta ihmisen suolisto-^ kudoksesta saatu lima kiinnitettiin polystyreenimikrotiitterilevylle. Sitoutuneet ^ proteiinit havaittiin entsyymikytketyllä immunosorbenttianalyysillä.Figures 5a and 5b show in vitro binding of recombinant histidine-labeled LGG proteins, i.e., SpaA, SpaB, SpaC, SpaD and SpaF pilin proteins, to human intestinal mucus. The mucus from resected human intestinal tissue was fixed on a polystyrene microtiter plate. Binding proteins were detected by enzyme-linked immunosorbent assay.

o Kuviot 6a ja 6b esittävät LGG:n seinämäfraktioiden Western-tunnis- o tuksia SpaA- ja SpaC-piliiniproteiinispesifisillä polyklonaalisilla vasta-aineilla x 30 vastaavasti. Negatiivisena kontrollina oli L. rhamnosus LC705 (LC705) joka on kasvatettu mTSB-alustassa tai MRS-alustassa, jossa on 0,6 % häränsappea. g Kuvio 6a esittää SpaA:ta sisältävien pilusten ja SpaA-monomeerien läsnäoloa § LGG:ssä, ja kuvio 6b esittää SpaC:tä sisältävien pilusten ja SpaC-mono-Figures 6a and 6b show Western recognition of LGG wall fractions with SpaA and SpaC pilin-specific polyclonal antibodies x 30, respectively. The negative control was L. rhamnosus LC705 (LC705) grown in mTSB medium or MRS medium containing 0.6% bovine bile. g Fig. 6a shows the presence of SpaA-containing piles and SpaA monomers in § LGG, and Fig. 6b shows SpaC-containing piles and SpaC-mono-

Oo

^ meerien läsnäoloa LGG:ssä. Kaivo 1: rekombinantti SpaA/SpaC-piliiniproteiini; 35 kaivo 2: LGG, kasvatettu mTSB:ssä; kaivo 3: LGG, kasvatettu MRS:ssä, jossa 0,6 % häränsappea; kaivo 4: LC705, kasvatettu mTSB:ssä, kaivo 5: LC705, 10 kasvatettu MRS:ssä, jossa 0,6 % häränsappea. Käytetty vasta-aine on merkitty kummankin kuvan yläosaan. Kuviossa 6b paneeli A: kaivot 1 - 5 valotus 1 sekuntia; paneeli B: kaivot 2 - 5 valotus erikseen 60 sekuntia. Molekyylipaino-standardien asemat osoitetaan vasemmalla kilodaltoneina. HMW osoittaa suu-5 rimolekyylistä tikapuuta (high molecular weight ladder).^ the presence of merers in LGG. Lane 1: recombinant SpaA / SpaC pilin protein; Lane 35: LGG, grown in mTSB; lane 3: LGG grown in MRS with 0.6% bovine bile; lane 4: LC705, grown in mTSB, lane 5: LC705, 10 grown in MRS with 0.6% bovine bile. The antibody used is labeled at the top of each image. Figure 6b panel A: wells 1-5 exposure for 1 second; panel B: wells 2-5 exposure for 60 seconds separately. The positions of the molecular weight standards are indicated on the left in kilodaltons. HMW shows a high-molecular weight ladder of foot-5.

Kuviot 7a ja 7b esittävät nukleotidisekvenssejä, jotka koodaavat kuviossa 2 esitettyjä pilusoperoneita. Kuvio 7A esittää operonia, joka koodaa geenejä GG00441 - GG00444 (lihavoitu). Oletetut konservoituneet elementit -35-sekvenssi (alleviivattu), -10-sekvenssi (kaksoisalleviivattu), ribosomin 10 sitoutumiskohta (alleviivattu kursiivi) ja rho-terminaattori (alleviivattu katkoviivalla). Kuvio 7B esittää operonia, joka koodaa geenejä GG02369 - GG02372 (lihavoitu). Oletetut konservoituneet elementit -35-sekvenssi (alleviivattu), -10-sekvenssi (kaksoisalleviivattu), ribosomin sitoutumiskohta (alleviivattu kursiivi) ja rho-terminaattori (alleviivattu katkoviivalla).Figures 7a and 7b show nucleotide sequences encoding the pilus operons shown in Figure 2. Figure 7A shows an operon encoding genes GG00441 to GG00444 (bold). Presumed conserved elements -35 sequence (underlined), -10 sequence (double underlined), ribosome 10 binding site (underlined italic) and rho terminator (underlined dashed). Figure 7B shows an operon encoding genes GG02369 to GG02372 (bold). Presumed conserved elements -35 sequence (underlined), -10 sequence (double underlined), ribosome binding site (underlined italic) and rho terminator (underlined dashed).

15 Keksinnön yksityiskohtainen selostusDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Maitohappobakteereita on käytetty elintarviketeollisuudessa pitkän aikaa, ja nykyisin niitä käytetään erilaisissa ruokatuotteissa, kuten maitotuotteissa. Esimerkiksi laktobasilleilla ja bifidobakteereilla tunnetaan olevan probi-oottisia vaikutuksia, mutta tapaa, jolla probioottiset bakteerit vaikuttavat tervey-20 teen, ei täysin ymmärretä. Näin ollen probioottien lisätutkimukset ovat aiheellisia.Lactic acid bacteria have been used in the food industry for a long time and are now used in a variety of food products such as dairy products. For example, lactobacilli and bifidobacteria are known to have probiotic effects, but the way in which probiotic bacteria affect health is not fully understood. Therefore, further studies on probiotics are warranted.

Tämä keksintö perustuu siihen löydökseen, että myös grampositiivi-sissa bakteereissa on pilusrakenteita. Lisäksi keksintö perustuu siihen, että on löydetty uusia piluspeptidejä ja -rakenteita grampositiivisista bakteereista, eri-25 tyisesti laktobasilleista, erityisemmin Lactobacillus rhamnosus -bakteerista.The present invention is based on the discovery that Gram-positive bacteria also have slit structures. In addition, the invention is based on the discovery of novel pili peptides and structures in Gram-positive bacteria, especially lactobacilli, more particularly Lactobacillus rhamnosus.

^ Pilusrakenteen peptidit i § Yleensä grampositiivinen bakteeripilus lähtee ulospäin bakteerien i o ulkomembraanista, ja se on yleensä 1 - 4 μιτι pitkä ja 2 - 8 nm leveä ja esiintyy x vähäisinä määrinä. Pilusten katsotaan edistävän bakteerien tarttumista kohde-^ Peptide Structure Peptides i § Generally, a gram-positive bacterial plexus exits outwardly from the outer membrane of bacteria io, and is usually 1-4 μιτι long and 2-8 nm wide and occurs in small amounts x. Pilils are considered to promote bacterial adhesion to the target

CCCC

30 pinnoille. Ilmaus ’’pilusrakenne” todellakin viittaa tässä käytettynä pitkänomai- g seen karvaan tai karvamaiseen proteiinikuituun, joka käsittää useita proteiini- § alayksiköitä (edullisesti useamman kuin yhden alayksikön). Näiden proteiinien o o kokoonpano voi olla riippuvainen tietyistä proteiineista, toisin sanoen sortaa- seista. Ominaisuuksiltaan adhesiivinen proteiini sijaitsee tavallisesti pilusten 35 kärjessä. Myös muut heteromeerisen pilusrakenteen proteiinit voivat olla adhe- 11 siivisia. Tässä käytettynä ilmaus ’’osa pilusrakenteesta” viittaa mihin tahansa piluksen komponenttiin, edullisesti piluksen mihin tahansa proteiiniin tai mihin tahansa fragmenttiin tai mihin tahansa varianttiin. Keksinnön eräässä edullisessa suoritusmuodossa pilusrakenne sijaitsee mikro-organismin pinnalla tai 5 on siitä peräisin.30 surfaces. Indeed, the expression '' pilus structure '' as used herein refers to an elongated hairy or hairy protein fiber comprising a plurality of protein subunits (preferably more than one subunit). The composition of these proteins may be dependent on certain proteins, i.e. sorpts. The protein with adhesive properties is usually located at the tip of the pili 35. Other proteins of the heteromeric pili structure may also be adhesive. As used herein, the term "part of the pilus structure" refers to any component of the pilus, preferably to any protein or any fragment or variant of the pilus. In a preferred embodiment of the invention, the slit structure is located on or derived from the surface of the microorganism.

Tässä käytettynä ilmaus ’’peptidi” viittaa mihin tahansa peptidiin, kuten dipeptidiin, polypeptidiin, proteiiniin ja/tai piliiniproteiiniin.As used herein, the term "" peptide "refers to any peptide such as a dipeptide, a polypeptide, a protein and / or a pilin protein.

Piliinin tunnusmerkkeinä ovat suurempi (SpaA), avustava pienempi (SpaB) ja kärkiproteiini (SpaC) piliinialayksiköt.The pilin is characterized by the larger (SpaA), helper smaller (SpaB), and tip protein (SpaC) subunits.

10 Piliinispesifiset sortaasit toimivat siirtämällä SpaA:n SpaC:hen kas vavassa piluspolymeerirakenteessa (kuvio 1). Keksinnössä kuvattu peptidi, joka käsittää sekvenssin, jolla on ainakin 94 %:n sekvenssi-identtisyys sekvens-si-id-nro 1:n (GG00441) kanssa, tai sekvenssin, jolla on ainakin 83 %:n sekvenssi-identtisyys sekvenssi-id-nro 5:n (GG002369) kanssa, on piliinispesifi-15 nen sortaasi (kuvio 2),The pilin-specific sorpases function by transferring SpaA to SpaC in a growing bilayer polymer structure (Figure 1). A peptide described in the invention comprising a sequence having at least 94% sequence identity to SEQ ID NO: 1 (GG00441) or a sequence having at least 83% sequence identity to SEQ ID NO. 5 (GG002369), is a pilin-specific sorpase (Figure 2),

SpaA muodostaa todennäköisesti pilusrakenteen pääketjun. Eri pi-lusrakenteiden pituus riippuu pääketjussa olevan SpaA:n määrästä (kuvio 1). Keksinnössä kuvattu peptidi, joka käsittää sekvenssin, jolla on ainakin 94 %:n sekvenssi-identtisyys sekvenssi-id-nro 2:n (GG00442) kanssa, tai sekvenssin, 20 jolla on ainakin 94 %:n sekvenssi-identtisyys sekvenssi-id-nro 6:n (GG002370) kanssa, on suurempi piluksen varren proteiini, toisin sanoen suurempi pilii-nialayksikkö (kuvio 2). GG00442 ja GG02370 sisältävät sortaasin tunnistus-kohdan, ja näin ne ovat sortaasien substraatteja.SpaA is likely to form the backbone of the pilus structure. The length of the various mask structures depends on the amount of SpaA in the backbone (Figure 1). A peptide described in the invention comprising a sequence having at least 94% sequence identity to SEQ ID NO: 2 (GG00442) or a sequence having at least 94% sequence identity to SEQ ID NO: 2 6 (GG002370), has a higher pilin stem protein, i.e., a larger pilin subunit (Fig. 2). GG00442 and GG02370 contain a sortase recognition site, and thus are substrates for sortases.

SpaB:tä lisätään pilusrakenteeseen todennäköisesti piluksenmuo-25 dostuksen viimeisessä tilassa (terminaalivaiheessa), ja se muodostaa sidoksen piluksen ja soluseinämän välillä (kuvio 1). Keksinnössä kuvattu peptidi, jo-^ ka käsittää sekvenssin, jolla on ainakin 84 %:n sekvenssi-identtisyys sekvens- ^ si-id-nro 3:n (GG00443) kanssa, tai sekvenssin, jolla on ainakin 93 %:n sek- 00 9 venssi-identtisyys sekvenssi-id-nro:n 7 (GG002371) kanssa, on pienempi pi- ° 30 luksen varren proteiini (kuvio 2). GG00443 ja GG002371 sisältävät sortaasin tunnistuskohdan, ja näin ne ovat sortaasien substraatteja.SpaB is probably added to the pilus structure in the final state of the pilus (terminal) and forms a bond between the pilus and the cell wall (Fig. 1). A peptide described in the invention comprising a sequence having at least 84% sequence identity to SEQ ID NO: 3 (GG00443), or a sequence having at least 93% sequence identity to SEQ ID NO: 3 (GG00443). 9 sequence identity with SEQ ID NO: 7 (GG002371), is a smaller protein of the stem (Figure 2). GG00443 and GG002371 contain a sorption recognition site and are thus substrates for sorpases.

CLCL

SpaC sijaitsee todennäköisesti piluksen varren kärjessä ja on en-o simmäinen piliinialayksikkö, joka aloittaa piluksen polymeroinnin (kuvio 1).The SpaC is probably located at the tip of the pilus shaft and is the first o-pilin subunit to initiate pilon polymerization (Figure 1).

Oo

§ Keksinnön mukainen peptidi, joka käsittää sekvenssin, jolla on ainakin 91 %:n ° 35 sekvenssi-identtisyys sekvenssi-id-nro 4:n (GG00444) kanssa, tai keksinnössä kuvattu peptidi, joka käsittää sekvenssin, jolla on ainakin 93 %:n sekvenssi- 12 identtisyys sekvenssi-id-nro 8:n (GG002372) kanssa, on sitoutuva pilusproteiini (kuvio 2). Proteiini GG00444 sisältää von Willebrand -domeenin (vWF), ja GG00444 ja GG02372 sisältävät sortaasin tunnistuskohtia, ja näin ne ovat sor-taasien substraatteja.A peptide of the invention comprising a sequence having at least 91% sequence identity to SEQ ID NO: 4 (GG00444), or a peptide described in the invention comprising a sequence having at least 93% sequence identity. sequence identity to SEQ ID NO: 8 (GG002372) is a binding pilus protein (Figure 2). The GG00444 protein contains the von Willebrand domain (vWF), and the GG00444 and GG02372 contain sorption recognition sites and thus are substrates for sorghum.

5 Keksinnön erässä erityisessä suoritusmuodossa keksinnön mukai nen peptidi tai polypeptidi käsittää sekvenssin, jolla on ainakin 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.8, 99.9 tai 100 %:n identtisyys sekvenssi-id-nro 4:n aminohapposekvenssin tai sen fragmenttien tai varianttien kanssa. Kuvataan myös peptidi tai polypeptidi, joka käsittää sekvenssin, jolla on ainakin 60, 65, 70, 75, 80, 10 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.8, 99.9 tai 100 %:n identtisyys sekvenssi-id-nro 1:n, 2:n, 3:n, 5:n, 6:n, 7:n tai 8:n aminohapposekvenssin tai sen fragmenttien tai varianttien kanssa.In a particular embodiment of the invention, the peptide or polypeptide of the invention comprises a sequence having at least 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.8, 99.9 or 100% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or fragments thereof. or variants. Also described is a peptide or polypeptide comprising a sequence having at least 60, 65, 70, 75, 80, 10 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.8, 99.9 or 100% identity to SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7: n or 8 amino acid sequence or fragments or variants thereof.

Keksinnön erään erityisen suoritusmuodon mukaan peptidillä on 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.8, 99.9 tai 100 %:n identtisyys sekvenssi-id-nro 4:n 15 aminohapposekvenssin tai sen fragmenttien tai varianttien kanssa. Kuvataan myös peptidi tai polypeptidi, joka käsittää sekvenssin, jolla on ainakin 60, 65, 70, 75, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.8, 99.9 tai 100 %:n identtisyys sekvenssi-id-nro 1:n, 2:n, 3:n, 5:n, 6:n, 7:n tai 8:n minkä tahansa aminohapposekvenssin tai sen fragmenttien tai 20 varianttien kanssa.According to a particular embodiment of the invention, the peptide has 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.8, 99.9 or 100% identity to the 15 amino acid sequences of SEQ ID NO: 4 or fragments or variants thereof. Also described is a peptide or polypeptide comprising a sequence having at least 60, 65, 70, 75, 80, 81.82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 , 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.8, 99.9 or 100% identity to SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7 or any 8 amino acid sequences or fragments or variants thereof.

Keksinnön eräässä erityisessä suoritusmuodossa peptidillä on sekvenssi, joka on esitetty sekvenssissä sekvenssi-id-nro 4, tai sen fragmenteissa tai varianteissa. Kuvataan myös peptidi, jolla on sekvenssi, joka on esitetty missä tahansa sekvenssissä sekvenssi-id-nro 1, 2, 3, 5, 6, 7 tai 8 tai sen frag-25 menteissa tai varianteissa.In a particular embodiment of the invention, the peptide has the sequence set forth in SEQ ID NO: 4, or fragments or variants thereof. Also described is a peptide having the sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 5, 6, 7 or 8, or fragments or variants thereof.

Minkä tahansa sekvenssin tai sen fragmentin identtisyys verrattuna ^ tämän keksinnön sekvenssiin viittaa minkä tahansa sekvenssin identtisyyteen ^ verrattuna esillä olevan keksinnön koko sekvenssiin. Sekvenssi-identtisyys 00 o voidaan määrittää esimerkiksi käyttämällä BLAST (Basic Local Alignment ? 30 Search Tools) tai FASTA (FAST-AII) nimisiä ohjelmia. Hauissa valitaan tyypilli- g sesti asetusparametereiksi ’’aukkosakot” (’’gap penalties”) ja ’’matriisi” (’’matrix”) Q_ oletusarvot.The identity of any sequence or fragment thereof relative to the sequence of the present invention refers to the identity of any sequence relative to the entire sequence of the present invention. Sequence identity 00 o can be determined, for example, using programs called BLAST (Basic Local Alignment? 30 Search Tools) or FASTA (FAST-AII). Typically, the default parameters for searches are "default penalties" and "default matrix" Q_.

o Tässä käytettynä peptidin fragmentti tai variantti viittaa mihin tähän-As used herein, a fragment or variant of a peptide refers to

Oo

§ sa peptidin osaan tai varianttiin, jolla voi olla biologinen funktio. Variantti viittaa ° 35 peptidiin, jonka peptidisekvenssissä on pieniä muutoksia, esimerkiksi pieniä poistoja, mutaatioita tai lisäyksiä.A portion or variant of a peptide which may have a biological function. The variant refers to a? 35 peptide having minor changes in its peptide sequence, for example minor deletions, mutations or insertions.

1313

Keksinnössä peptidi, jolla on sekvenssi-id-nro 4, on osa pilusraken-netta. Keksinnön eräässä toisessa edullisessa suoritusmuodossa keksinnön pilusrakenne käsittää ainakin yhden keksinnön mukaisista peptideistä, edullisemmin ainakin kaksi tai ainakin kolme keksinnön mukaisista peptideistä. Li-5 säksi keksinnön eräässä edullisessa suoritusmuodossa pilusrakenne käsittää peptidit GG00442 (sekvenssi-id-nro 2), GG00443 (sekvenssi-id-nro 3) ja GG00444 (sekvenssi-id-nro 4) ja peptidit GG02370 (sekvenssi-id-nro 6), GG02371 (sekvenssi-id-nro 7) ja GG02372 (sekvenssi-id-nro 8).In the invention, the peptide having SEQ ID NO: 4 is part of the slit structure. In another preferred embodiment of the invention, the slit structure of the invention comprises at least one of the peptides of the invention, more preferably at least two or at least three of the peptides of the invention. In addition, in a preferred embodiment of the invention, the slot structure comprises peptides GG00442 (SEQ ID NO: 2), GG00443 (SEQ ID NO: 3) and GG00444 (SEQ ID NO: 4), and GG02370 (SEQ ID NO: 6) ), GG02371 (SEQ ID NO: 7), and GG02372 (SEQ ID NO: 8).

Grampositiiviset ja probioottiset bakteerit 10 Keksinnön peptidit tai pilusrakenteet voivat olla peräisin mistä ta hansa bakteereista, kuten grampositiivisista tai gramnegatiivisista bakteereista. Keksinnön eräässä edullisessa suoritusmuodossa peptidit tai pilusrakenteet ovat kuitenkin grampositiivisista bakteereista. Grampositiivisiin bakteereihin, jotka voivat käsittää keksinnön peptidit tai pilusrakenteet, kuuluu laktobasilleja, 15 laktokokkeja, bifidobakteereja, propionibakteereja, Leuconosfoc-bakteereja, streptokokkeja, korynebakteereja, aktinomykeettejä ja mykobakteereja, mutta ne eivät ole rajoittuneet näihin.Gram-positive and probiotic bacteria The peptides or slit structures of the invention may be derived from any bacterium, such as Gram-positive or Gram-negative bacteria. However, in a preferred embodiment of the invention, the peptides or slit structures are of Gram-positive bacteria. Gram-positive bacteria which may comprise the peptides or slit structures of the invention include lactobacilli, lactococci, bifidobacteria, propionic bacteria, Leuconosfoc bacteria, streptococci, corynebacteria, actinomycetes and mycobacteria.

Keksinnön eräässä edullisessa suoritusmuodossa peptidi tai pilusrakenne on peräisin probioottisista bakteereista, kuten probioottisista laktoba-20 silleistä, laktokokeista, bifidobakteereista, enterokokeista, propionibakteereista, Leuconostoc-bakteereista, streptokokeista tai hiivasta. Probiootit ovat eläviä mikro-organismeja, edullisesti ei-patogeenisiä mikrobeja, jotka annosteltuna riittävissä määrin ihmiselle tai eläimelle edistävät isännän hyvinvointia (Fuller, R. 1989, J. Appi. Microbiol. 66: 365 - 378). Probiootit saavat aikaan edullisen 25 terveysvaikutuksen isäntään, kun niitä nautitaan ruoka-aineena tai ruuan lisäni ravinteena riittävässä määrin, o ^ Probioottien ihmisiin tai eläimiin kohdistuviin terveysväitteisiin kuulu- o vat monien vaivojen estäminen ja hoito. Probioottien terveyttä edistäviin vaikuin tuksiin kuuluvat esimerkiksi suolen mikrobiston tasapainottaminen ja ylläpitä- x 30 minen, immuunijärjestelmän stimulointi ja antikarsinogeeninen aktiviteetti. Pro-bioottien hyödylliset vaikutukset ihmisen suolistoon perustuvat useisiin toisis-g taan riippumattomiin tekijöihin, joita saavat aikaan bakteerisolut, niiden solura- g> kenteet ja aineenvaihduntatuotteet, o 1 oIn a preferred embodiment of the invention, the peptide or slit structure is derived from probiotic bacteria, such as probiotic lactobacilli, lactococci, bifidobacteria, enterococci, propionic bacteria, Leuconostoc bacteria, streptococcus or yeast. Probiotics are living microorganisms, preferably non-pathogenic microbes, which, when administered to a human or animal in sufficient amounts, contribute to the welfare of the host (Fuller, R. 1989, J. Appl. Microbiol. 66: 365-378). Probiotics provide a beneficial effect on the host when consumed in sufficient amounts as a food or nutritional supplement, and the health claims made by the probiotics to humans or animals include the prevention and treatment of many ailments. The probiotic health promoting vaikuin purposes such as intestinal microflora balancing and maintaining x 30 in, the immune system stimulation and anticarcinogenic activity. The beneficial effects of the pro-biotics on the human intestine are based on a number of mutually independent factors produced by bacterial cells, their cellular structures and metabolites, o 1 o

(M(M

1414

Bakteeriin voidaan viitata probioottina, jos se täyttää olennaisesti seuraavat vaatimukset (Lee, Y-K ja Salminen, S. 1995, Trend Food Sei Tech-nol, 6: 241 - 245): se pysyy elinkykyisenä ruuansulatuskanavassa vallitsevissa vaativissa olosuhteissa (mahan alhainen pH, ruuansulatusjärjestelmän hapot 5 jne.), kiinnittyy suolen seinämiin, kolonisoi maha-suolikanavan, metaboloi suolessa, on teknologisesti sovellettavissa (kestää prosessointia), osoittaa kliinisesti testattuja ja raportoituja terveysvaikutuksia ja on turvallista nautittavaksi.A bacterium can be referred to as a probiotic if it substantially meets the following requirements (Lee, UN, and Salminen, S. 1995, Trend Food Sci Tech-nol, 6: 241-245): It remains viable under the digestive tract conditions (low gastric pH, digestive system acids 5, etc.) is attached to the walls of the intestine, colonize the gastrointestinal tract, is metabolized by the intestine, is technologically applicable (resistant to processing), and shows a clinically tested and reported health effects and is safe for human consumption.

Maha-suolikanavan eri osien mikrobipitoisuudessa on valtavia eroja, ja noin 95 % kaikista suolistobakteereista esiintyy paksusuolessa. On arvioitu, 10 että paksusuolessa menestyy yli 400 bakteerilajia transienttien mikrobien lisäksi. Dominoivat lajit ovat seuraavia: Bacteroides, Bifidobacterium, Copro-coccus, Peptostreptococcus, Eubacterium ja Ruminococcus. Lajien Lactobacillus, Streptococcus, Fusobacterium, Veillonella, Propionibacterium ja Entero-bacteriaceae lukumäärä on hiukan vähäisempi. Jotkut lajeista edustavat hyö-15 dyllisiä mikrobeja, kun taas toiset voivat olla jopa vahingollisia (Tannock, G. W.1998, Int. Dairy J. 8: 527 - 533). Muutokset suolen mikrobiston koostumuksessa tai sen määrän äkillinen väheneminen (vaikean ripulin, antibioottihoidon jne. vuoksi) lisää potentiaalisesti patogeenisten lajien infektiivisyyttä, millä voi olla vakavia seurauksia (allergioiden puhkeaminen, suolistosairaudet, syöpä). 20 Keksinnön eräässä edullisessa suoritusmuodossa peptidi tai pilus- rakenne sitoutuu maha-suolikanavaan, edullisimmin maha-suolikanavan epiteeliin. Keksinnön eräässä toisessa edullisessa suoritusmuodossa peptidi tai pilusrakenne sitoutuu limaan. Lima on liukasta eritystuotetta, sitkeää kolloidia, joka on peräisin limaa erittävistä soluista. Lima suojaa epiteelisoluja esimerkik-25 si maha-suolikanavassa. Antiseptisten entsyymien ja immunoglobuliinien lisäksi lima sisältää myös musiineja ja epäorgaanisia suoloja. Tässä käytettynä ^ maha-suolikanava viittaa kanavaan, joka johtaa suusta peräaukkoon ja joka o ™ osallistuu ruuan sulattamiseen. Maha-suolikanava käsittää suun, ruokatorven, o mahalaukun, pohjukaissuolen, tyhjäsuolen, sykkyräsuolen, ohutsuolen, paksu ni 30 suolen, umpisuolen, peräsuolen ja peräaukon.There are huge differences in the microbial content of the different parts of the gastrointestinal tract, and about 95% of all intestinal bacteria occur in the colon. It has been estimated 10 that more than 400 bacterial species thrive in addition to transient microbes in the colon. The dominant species are Bacteroides, Bifidobacterium, Copro-coccus, Peptostreptococcus, Eubacterium and Ruminococcus. The number of Lactobacillus, Streptococcus, Fusobacterium, Veillonella, Propionibacterium and Enterobacteriaceae species is slightly lower. Some species represent useful microbes, while others may even be harmful (Tannock, G. W.1998, Int. Dairy J. 8: 527-533). Changes in the composition of the intestinal microbiota, or the amount of the sudden decline (severe diarrhea, antibiotic therapy, etc. because of.) Increase the infectivity of potentially pathogenic species, which may have serious consequences (outbreak of allergies, intestinal diseases, cancer). In a preferred embodiment of the invention, the peptide or blister structure binds to the gastrointestinal tract, most preferably to the gastrointestinal epithelium. In another preferred embodiment of the invention, the peptide or slit structure binds to the mucus. Mucus is a slippery secretion product, a tough colloid derived from mucus secreting cells. The mucus protects epithelial cells in the exemplary gastrointestinal tract. In addition to antiseptic enzymes and immunoglobulins, mucus also contains music and inorganic salts. As used herein, the ^ gastrointestinal tract refers to the channel that leads from the mouth to the anus and which o ™ participates in the digestion of food. Gastrointestinal tract comprises the mouth, esophagus, stomach No, duodenum, jejunum, ileum, small intestine, large intestine ni 30, cecum, rectum and anus.

£ Parhaiten dokumentoituihin probiootteihin kuuluvat L. rhamnosus GG, L. johnsonii LA1, L. casei Shirota ja Bifidobacterium lactis Bb12. Lisäksi g alan kirjallisuudessa on kuvattu joitakin muita probiootteja. Keksinnön eräässäThe most well-documented probiotics include L. rhamnosus GG, L. johnsonii LA1, L. casei Shirota and Bifidobacterium lactis Bb12. In addition, some other probiotics have been described in the literature. In one aspect of the invention

Oo

g edullisessa suoritusmuodossa peptidi tai pilusrakenne on peräisin Lactobacil- c3 35 lus rhamnosus -kannasta, edullisimmin Lactobacillus rhamnosus GG (LGG, LGG®) -kannasta, joka on ei-patogeeninen, alun perin USA:sta lähtöisin oleva 15 (US 4839281 A) grampositiivinen isolaatti. LGG-kanta on eristetty ihmisen ulosteesta, ja se pystyy kasvamaan hyvin pH:ssa 3 ja selviytyy jopa alhaisemmissa pH-arvoissa sekä korkeissa sappihappopitoisuuksissa. Kanta osoittaa erinomaista adheesiota sekä limaan että epiteelisoluihin, ja se kolonisoi ma-5 hasuolikanavan. Maitohapon tuotto glukoosista on hyvä: kun kantaa kasvatetaan MRS-liemessä, se tuottaa 1,5-2 % maitohappoa. Kanta ei fermentoi laktoosia eikä näin tuota maitohappoa laktoosista. Kanta fermentoi seuraavia hiilihydraatteja: D-arabinoosi, riboosi, galaktoosi, D-glukoosi, D-fruktoosi, D-man-noosi, rhamnoosi, dulsitoli, inositoli, mannitoli, sorbitoli, N-asetyyliglukosamiini, 10 amygdaliini, arbutiini, eskuliini, salisiini, sellobioosi, maltoosi, sakkaroosi, treha-loosi, meletsitoosi, gentibioosi, D-tagatoosi, L-fukoosi ja glukonaatti. Kanta kasvaa hyvin 15-45 °C:ssa, ja optimilämpötila on 30 - 37 °C. LGG on talletettu talletusviranomaiselle American Type Culture Collection saantinumerolla ATCC 53103.g, in a preferred embodiment, the peptide or slit structure is derived from a Lactobacillus c3 35 lus rhamnosus strain, most preferably a Lactobacillus rhamnosus GG (LGG, LGG®) strain that is a non-pathogenic, originally US-derived (US 4,839,281 A) gram-positive isolate. The LGG strain is isolated from human stool and is able to grow well at pH 3 and survive even at lower pH values and high bile acid levels. The strain exhibits excellent adhesion to both mucus and epithelial cells and colonizes the gastrointestinal tract. The yield of lactic acid from glucose is good: when grown in MRS broth, it produces 1.5-2% lactic acid. The strain does not ferment lactose and thus produces lactic acid from lactose. The strain fermentes the following carbohydrates: D-arabinose, ribose, galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, rhamnose, dulsitol, inositol, mannitol, sorbitol, N-acetylglucosamine, 10 amygdalin, salutine, esulin, cellobiose, maltose, sucrose, trehalose, melezitose, gentibiosis, D-tagatose, L-fucose and gluconate. The strain grows well at 15-45 ° C and the optimum temperature is 30-37 ° C. The LGG is deposited with the Depository Authority under the American Type Culture Collection under accession number ATCC 53103.

15 Pilusgeenit15 Slide genes

Geenit, jotka koodaavat pilusrakenteen piliiniproteiineja, ovat kluste-roituneet samoihin lokuksiin LGG-genomissa. Bioinformatiikan menetelmillä LGG-genomista löydettiin kaikkiaan kaksi eri geeniklusteria, jotka koodaavat piluspeptidejä (kuvio 2).The genes encoding pilin structure pilin proteins have been clustered at the same loci in the LGG genome. Bioinformatics methods revealed a total of two different gene clusters encoding slit peptides in the LGG genome (Fig. 2).

20 Keksinnön mukaisella polynukleotidilla on sekvenssi-id-nro:n 12 sekvenssi tai sen degeneroitunut muoto tai fragmentti, tai se koodaa keksinnön peptidiä tai sen fragmenttia. Kuvataan myös polynukleotidit, joilla on sekvens-si-id-nro:n 9 - 11 ja 13 - 16 mukaiset sekvenssit. Polynukleotidi, jolla on jonkin sekvenssi-id-nro:ssa 9-16 esiintyvän sekvenssin degeneroitunut muoto, tar-25 koittaa, että se sisältää yhden tai useamman eri nukleotidin mutta koodaa yhä ^ samaa aminohappoa. ’’Polynukleotidi” on tässä käytettynä nukleotidien sek-The polynucleotide of the invention has the sequence of SEQ ID NO: 12 or a degenerate form or fragment thereof, or encodes a peptide or fragment thereof. Polynucleotides having the sequences of SEQ ID NOs: 9-11 and 13-16 are also described. A polynucleotide having a degenerate form of one of the sequences shown in SEQ ID NO: 9-16 means that it contains one or more different nucleotides but still encodes the same amino acid. "" Polynucleotide "as used herein is a sequence of nucleotides.

Oo

venssi, kuten DNA- tai RNA-sekvenssi, ja se voi olla yksi- tai kaksinauhainen o polynukleiinihappo. Termi ’’polynukleotidi” käsittää genomisen DNA:n, cDNA:n ° ja mRNA:n. Polynukleotidi voi olla myös eristetty DNA.a sequence, such as a DNA or RNA sequence, and may be a single or double stranded polynucleic acid. The term '' polynucleotide 'encompasses genomic DNA, cDNA and mRNA. The polynucleotide may also be isolated DNA.

x 30 Keksinnön eräässä toisessa edullisessa suoritusmuodossa geeni- klusteri käsittää keksinnön ainakin yhden polynukleotidin. Kuvataan myös gee-g niklusteri, joka käsittää ainakin kaksi, ainakin kolme tai ainakin neljä polynukle- g otidia. Edullisimmin geeniklusteri käsittää polynukleotidit, jotka esiintyvät sek- ° venssi-ID-nro:issa 9 - 12 tai sekvenssi-id-nro:issa 13 - 16. Tässä käytettynä 35 ’’geeniklusteri” viittaa ainakin kahden geenin ryhmään, jotka koodaavat pepti-dejä/proteiineja, joita tarvitaan yhteistä funktiota (yhteistoimintaa) varten, tässä 16 esim. pilusrakennetta varten. Saman klusterin geenit ryhmittyvät yhdessä yleensä samaan geneettiseen lokukseen.In another preferred embodiment of the invention, the gene cluster comprises at least one polynucleotide of the invention. Also described is a gee-g nickel cluster comprising at least two, at least three, or at least four polynucleotides. Most preferably, the gene cluster comprises polynucleotides appearing in SEQ ID NO: 9-12 or SEQ ID NO: 13-16. As used herein, the 35 '' gene cluster 'refers to a group of at least two genes encoding peptides. / proteins required for a common function (interaction), here 16 e.g. The genes of the same cluster are usually grouped together in the same genetic locus.

Keksinnön erään erityisen suoritusmuodon mukaan polynukleotidilla on ainakin 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 5 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,8, 99,9 tai 100 %:n identtisyys minkä tahansa sekvenssi-id-nro:n 12 tai sen fragmenttien kanssa.According to a particular embodiment of the invention, the polynucleotide has at least 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 5 88, 89, 90 , 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.8, 99.9 or 100% identity to any one of SEQ ID NO: 12 or fragments thereof .

Keksinnön eräässä toisessa erityisessä suoritusmuodossa polynuk-leotidillä on sekvenssi, joka esiintyy sekvenssissä sekvenssi-ID-nro 12.In another particular embodiment of the invention, the polynucleotide has the sequence that is found in SEQ ID NO: 12.

Tuotteita ja farmaseuttisia koostumuksia 10 Keksinnön eräässä edullisessa suoritusmuodossa tuote käsittää keksinnön ainakin yhden peptidin tai pilusrakenteen. Tuote voi myös käsittää ainakin kaksi tai ainakin kolme keksinnön peptidiä. Eräässä edullisessa suoritusmuodossa tuote käsittää keksinnön peptidin ainakin yhden fragmentin. Keksinnön tuotteet voidaan valita ryhmästä, joka muodostuu elintarvikkeista, eläin-15 ten rehusta, ravintotuotteista, lisäravinteista, elintarvikkeiden ainesosista, terveysvaikutteisista ruokatuotteista, lääketuotteista tai kosmetiikasta rajoittumatta näihin. Keksinnön eräässä edullisessa suoritusmuodossa tuote on elintarvike tai rehutuote. Keksinnön eräässä toisessa suoritusmuodossa tuote on funktionaalinen elintarvike, toisin sanoen elintarvike, jolla on mitä tahansa terveyttä 20 edistäviä ja/tai sairautta estäviä tai hoitavia ominaisuuksia. Edullisesti keksinnön elintarvike valitaan ryhmästä, joka muodostuu meijerituotteista, leipomotuotteista, suklaasta ja makeisista, sokeri- ja purukumituotteista, viljatuotteista, välipalatuotteista, marja- ja hedelmäpohjaisista tuotteista sekä juomista/vir-vokkeista. Meijerituotteisiin kuuluvat maito, piimä, jogurtit ja muut käymismaito-25 tuotteet, kuten juustot ja levitteet, maitojauheet, lastenruoka, vauvanruoka, 12 - 36 -kuukautisten lasten ruoka, vauvojen äidinmaidonkorvike, mehut ja keitot, o ™ mutta ne eivät ole rajoittuneet näihin. Keksinnön peptidien ja pilusrakenteiden o lisäksi tuote voi sisältää myös muita hapatteita, probiootteja jne.Products and Pharmaceutical Compositions In a preferred embodiment of the invention, the product comprises at least one peptide or slit structure of the invention. The product may also comprise at least two or at least three peptides of the invention. In a preferred embodiment, the product comprises at least one fragment of a peptide of the invention. The products of the invention may be selected from, but are not limited to, food, animal feed, nutritional products, nutritional supplements, food ingredients, health food products, pharmaceuticals, or cosmetics. In a preferred embodiment of the invention, the product is a food or feed product. In another embodiment of the invention, the product is a functional foodstuff, that is, a foodstuff having any health promoting and / or disease preventive or curative properties. Preferably, the food of the invention is selected from the group consisting of dairy products, bakery products, chocolate and confectionery, sugar and chewing gum products, cereal products, snack products, berry and fruit based products and beverages / snacks. Dairy products include, but are not limited to, dairy, milk, yoghurts and other fermented milk products such as cheeses and spreads, milk powders, baby food, baby food, infant formula, infant formula, juices and soups. In addition to the peptides and slit structures of the invention, the product may also contain other acids, probiotics, etc.

° Keksinnön eräässä edullisessa suoritusmuodossa tuote on farma- x 30 seuttinen koostumus. Keksinnön eräässä edullisessa suoritusmuodossa farmaseuttinen koostumus käsittää keksinnön ainakin yhden peptidin tai pilusra-g kenteen, ja eräässä toisessa suoritusmuodossa keksinnön ainakin kaksi tai ai- g nakin kolme peptidiä. Farmaseuttisia koostumuksia voidaan käyttää esimerkik- ° si muodoltaan kiinteänä, puolijähmeänä tai nestemäisenä, esimerkiksi tabletti-, 35 pilleri-, kapseli-, liuos-, emulsio- tai suspensiomuotoisina. Edullisesti koostumus on tarkoitettu oraalisesti annettavaksi tai enteraalisesti sovellettavaksi.In one preferred embodiment of the invention, the product is a pharmaceutical x 30 seutic composition. In a preferred embodiment of the invention, the pharmaceutical composition comprises at least one peptide or pilus g of the invention, and in another embodiment at least two or at least three peptides of the invention. The pharmaceutical compositions may be used, for example, in solid, semi-solid or liquid form, for example, in the form of tablets, pills, capsules, solutions, emulsions or suspensions. Preferably, the composition is for oral or enteral administration.

1717

Keksinnön ainakin yhden peptidin tai pilusrakenteen lisäksi farmaseuttinen koostumus voi käsittää prebiootteja, farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan (hyväksyttäviä kantajia) (esim. vesi, glukoosi tai laktoosi), adjuvantin (adjuvantteja), täyteaineen (-aineita), aputäyteaineen (-aineita), antiseptisen 5 aineen (antiseptisia aineita), stabilointi-, sakeutus- tai väriaineen (-aineita), hajusteen (hajusteita), sidosaineen (-aineita), täyttöaineen (-aineita), voiteluaineen (-aineita), suspendoimisaineen (-aineita), makeutusaineen (-aineita), aromiaineen (-aineita), hyytelöimisaineen (-aineita), antioksidantin (-oksidant-teja), säilöntäaineen (-aineita), puskuriaineen (-aineita), pH:n säätöaineen (-ai-10 neita), kostutusaineen (-aineita) tai normaalisti vastaavissa tuotteissa esiintyviä komponentteja.In addition to the at least one peptide or slit structure of the invention, the pharmaceutical composition may comprise prebiotics, a pharmaceutically acceptable carrier (s) (e.g., water, glucose or lactose), adjuvant (s), excipient (s), excipient (s). (antiseptics), stabilizer, thickener or coloring agent (s), perfume (s), binder (s), filler (s), lubricant (s), suspending agent (s), sweetener (s) ), flavoring agent (s), gelling agent (s), antioxidant (s), preservative (s), buffer (s), pH adjusting agent (s), wetting agent (s) ) or components normally found in similar products.

Keksinnön tuote tai farmaseuttinen koostumus käsittää sellaisen määrän peptidiä tai pilusrakennetta, joka on riittävä tuottamaan halutun vaikutuksen. Tuotteiden tai farmaseuttisten koostumusten muut ainesosat sekä 15 muut spesifiset komponentit saadaan joko kaupallisesti tai valmistetaan alalla tunnettujen tavanomaisten tekniikoiden avulla.The product or pharmaceutical composition of the invention comprises an amount of peptide or slit structure sufficient to produce the desired effect. Other ingredients in the products or pharmaceutical compositions as well as other specific components are either commercially available or are prepared by conventional techniques known in the art.

Tuotteet tai farmaseuttiset koostumukset voidaan valmistaa millä tahansa alalla tunnettujen tavanomaisten prosessien avulla. Peptidin tai pilusrakenteen muodostaminen tuotteeseen tarkoittaa, että peptidi tai pilusrakenne 20 voidaan esimerkiksi lisätä mihin tahansa tuotteeseen tai sekoittaa minkä tahansa aineiden kanssa. Peptidi tai pilusrakenne voidaan muodostaa tuotteeseen esimerkiksi ilmentämällä sitä sopivissa olosuhteissa. Peptidi tai pilusrakenne voidaan lisätä tai sekoittaa valmistuksen yhteydessä tai sen jälkeen, lopputuotteen viimeistelyn aikana. Keksinnön eräässä edullisessa suoritus-25 muodossa keksinnön peptidi tai pilusrakenne lisätään tuotteeseen.The products or pharmaceutical compositions may be prepared by any conventional process known in the art. Forming a peptide or slit structure on a product means that the peptide or slit structure 20 may, for example, be added to any product or mixed with any agents. The peptide or slit structure may be incorporated into the product, for example, by expression under appropriate conditions. The peptide or slit structure may be added or mixed during or after manufacture, during the final product finishing. In a preferred embodiment of the invention, the peptide or slit structure of the invention is added to the product.

T- Valmistusmenetelmät ^ Keksinnön peptidi tai pilusrakenne voidaan valmistaa esimerkiksi o synteettisillä menetelmillä, esimerkiksi peptidisynteesillä tai rekombinantti- o tuotolla, geneettisesti modifioidulla organismilla. Keksinnön eräässä eduliises- x 30 sa suoritusmuodossa peptidi tai pilusrakenne on rekombinantti. Tässä käytet-tynä ’’rekombinantti” geneettinen materiaali viittaa materiaaliin, joka on tyypilli-g sesti yhden tai useamman geneettisen materiaalin yhdistelmä, esimerkiksi al- g kuperältään erilaisia DNA-nauhoja, ja se on valmistettu yhdistämällä tai lisää- ° mällä sekvenssit. Rekombinantti valmistus mahdollistaa tiettyjen ja/tai erityis- 35 ten ominaisuuksien aikaansaamisen geeniin tai geenituotteeseen tai esimerkiksi geenin ilmentymiseen (esim. yli- tai ali-ilmentyminen). Keksinnön polynuk- 18 leotidi voidaan esimerkiksi asettaa minkä tahansa endogeenisten tai ekso-geenisten säätelijöiden, kuten promoottorien, säädeltäväksi. Rekombinantti proteiini johdetaan rekombinantti-DNA:sta.Methods of Preparation The peptide or slit structure of the invention may be prepared, for example, by o synthetic methods, for example, peptide synthesis or by recombinant production, by a genetically modified organism. In a preferred embodiment of the invention, the peptide or slit structure is recombinant. As used herein, '' recombinant '' genetic material refers to material that is typically a combination of one or more genetic materials, for example, genes of different origins and is made by combining or inserting sequences. Recombinant production allows the acquisition of certain and / or specific properties of a gene or gene product or, for example, gene expression (eg, over- or under-expression). For example, the polynucleotide of the invention may be placed under the control of any endogenous or exogenous regulators, such as promoters. The recombinant protein is derived from recombinant DNA.

Ainakin yksi kiinnostuksen kohteena oleva polynukleotidi voidaan 5 eristää solusta tai valmistaa synteettisesti. Tämä nukleotidi voidaan transformoida isäntäsoluun. Sopiva isäntäsolu keksinnön minkä tahansa peptidin valmistamiseksi voi olla mikä tahansa eukaryoottinen solu tai mikro-organismi, edullisesti bakteereita, edullisimmin maitohappobakteereita, kuten laktobasille-ja, laktokokkeja, bifidobakteereita, enterokokkeja, leuconostoc-bakteereja ja 10 streptokokkeja tai propionibakteereita tai hiivaa.At least one polynucleotide of interest may be isolated from a cell or prepared synthetically. This nucleotide can be transformed into a host cell. A suitable host cell for the preparation of any peptide of the invention may be any eukaryotic cell or microorganism, preferably bacteria, most preferably lactic acid bacteria such as lactobacilli, lactococci, bifidobacteria, enterococci, Leuconostoc, or propionic bacteria.

Tässä käytettynä ’’transformaatio" viittaa siihen, että solua muutetaan geneettisesti vieraalla geneettisellä materiaalilla, edullisesti DNA:lla, mistä seuraa tämän geneettisen materiaalin ilmentyminen. Vieras geneettinen materiaali voidaan tuoda sellaisenaan tai sisällytettynä mihin tahansa muuhun ge-15 neettiseen materiaaliin, kuten vektoreihin, plasmideihin jne. Isäntäsolun trans-formoimiseen keksinnön polynukleotidilla voidaan käyttää mitä tahansa geeniteknologian menetelmää tai mitä tahansa molekyylikloonausmenetelmiä. On olemassa useita menetelmiä vieraan materiaalin tuomiseksi eukaryoottiseen soluun. Sellaisia materiaaleja kuin polymeerit (esim. DEAE-dekstraani tai poly-20 etyleeni-imiini), liposomit ja nanopartikkelit (esim. kulta) on käytetty transfor-moinnin kantajina. Geneettinen materiaali voidaan tuoda soluihin myös käyttämällä esimerkiksi viruksia tai vektoreita kantajina. Muita menetelmiä vieraan materiaalin tuomiseksi soluun ovat, näihin rajoittumatta, nukleofektio, elektro-poraatio, konjugaatio, transfektio, sonoporaatio, lämpöshokki ja magnetofektio. 25 Eri transfektioreagenttien, kuten kalsiumfosfaatin tai lipofektamiinin, käyttö on alalla hyvin tunnettua. Edullinen menetelmä vieraan materiaalin tuomiseksi ^ bakteerisoluihin on elektroporaatio.As used herein, "transformation" refers to the alteration of a cell with a genetically foreign genetic material, preferably DNA, resulting in the expression of that genetic material. The foreign genetic material may be introduced as such or incorporated into any other genetic material, such as vectors, plasmids. etc. Any method of genetic engineering or any method of molecular cloning can be used to transform a host cell with the polynucleotide of the invention. There are several methods for introducing foreign material into a eukaryotic cell Materials such as polymers (e.g. DEAE-dextran or poly-20-ethyleneim) nanoparticles (e.g., gold) have been used as carriers for transformation. Genetic material can also be introduced into cells using, for example, viruses or vectors as carriers. Other methods of introducing foreign material into the cell are including, but not limited to, nucleofection, electroporation, conjugation, transfection, sonoporation, heat shock, and magnetofection. The use of various transfection agents, such as calcium phosphate or lipofectamine, is well known in the art. A preferred method of introducing foreign material into bacterial cells is electroporation.

^ Keksinnön peptidi tai pilusrakenne voidaan valmistaa myös niin, että 00 9 solut ilmentävät peptidejä tai pilusrakenteita luonnollisesti.The peptide or slit structure of the invention may also be prepared such that the peptides or slit structures are naturally expressed by the cells.

° 30 Sen jälkeen kun luonnollinen solu tai transformoitu isäntäsolu on £ valmistanut keksinnön peptidin sopivissa olosuhteissa, peptidi voidaan esimer-After the natural or transformed host cell has prepared the peptide of the invention under suitable conditions, the peptide may be

CLCL

kiksi puhdistaa solusta, tai peptidin erittynyt muoto voidaan ottaa talteen esi-o merkiksi kasvualustoista. Peptidin puhdistamiseksi solu voidaan rikkoa esimer-Therefore, the purified form of the peptide can be recovered, for example, from culture media. To purify the peptide, the cell may be disrupted, e.g.

Oo

§ kiksi sonikaatiolla, säteilytyksellä, lämmityksellä, lyysillä, mekaanisella sekoit- ° 35 tamisella (jauhaminen), entsymaattisilla menetelmillä, "solupommilla” tai kemi allisilla aineilla (hypotoninen isku, detergentit, liuottimet) tai näiden seoksilla.Sonication, irradiation, heating, lysis, mechanical agitation (grinding), enzymatic methods, "cell bombs" or chemical agents (hypotonic shock, detergents, solvents) or mixtures thereof.

1919

Peptidi tai pilusrakenne on saatavissa kasvavista tai metabolisesti aktiivisista, toisin sanoen elävistä ja/tai lyofilisoiduista, tai elinkelvottomista, esimerkiksi kuumalla tapetuista, säteilytetyistä tai hajotetuista organismeista. Peptidi tai pilusrakenne on saatavissa kuolleesta solusta tai elävästä solusta.The peptide or slit structure is obtainable from growing or metabolically active, i.e., living and / or lyophilized, or non-viable, for example, hot-killed, irradiated, or degraded organisms. The peptide or slit structure is obtainable from a dead cell or a living cell.

5 Peptidi tai pilusrakenne voidaan valmistaa yhdessä solussa ja sitten tuodaan esille samassa solussa, tai peptidi tai pilusrakenne voidaan valmistaa jossakin toisessa solussa kuin siinä, missä se tuodaan esille.The peptide or slit structure may be prepared in one cell and then expressed in the same cell, or the peptide or slit structure may be prepared in another cell than the one in which it is expressed.

Mitä tahansa menetelmiä, kuten immunisaatiota, voidaan käyttää vasta-aineiden valmistamiseksi keksinnön peptidejä vastaan. Peptidien mitä 10 tahansa epitooppeja tai funktionaalisia domeeneja vastaan voidaan muodostaa vasta-aineita, ja ne voivat olla joko monoklonaalisia tai polyklonaalisia. Keksinnön eräässä edullisessa suoritusmuodossa vasta-aineet ovat polyklonaalisia (kuvio 3). Tässä käytettynä ’’peptidin funktionaalinen domeeni” viittaa peptidin mihin tahansa osaan, jolla on biologinen funktio.Any methods, such as immunization, can be used to make antibodies against the peptides of the invention. Antibodies can be raised against any of the peptide epitopes or functional domains and can be either monoclonal or polyclonal. In a preferred embodiment of the invention, the antibodies are polyclonal (Figure 3). As used herein, the "" peptide functional domain "refers to any portion of a peptide having a biological function.

15 Hoidot15 Treatments

Bakteerit, suuri joukko yksisoluisia mikro-organismeja, aiheuttavat erilaisia tauteja eukaryooteissa, esimerkiksi ihmisissä, eläimissä ja kasveissa. Kuitenkin vasta viime vuosina on pilusten läsnäolo tärkeiden patogeenien pinnalla herättänyt kiinnostusta tutkijoissa. Koska maha-suolikanava ja sen mik-20 robisto vaikuttavat kohteiden hyvinvointiin, bakteereiden pilusten hyödyllisyys mahdollistaa uusia hoitoja. Keksinnön peptidejä, pilusrakenteita tai polynukle-otideja voidaan käyttää menetelmässä sellaisten sairauksien hoitamiseksi tai estämiseksi, jotka aiheutuvat mikro-organismeista, kuten bakteereista tai viruksista, tai jotka aiheutuvat muusta syystä, kuten epätasapainoisesta ravitse-25 muksesta, stressaavasta elämäntyylistä tai geneettisestä alttiudesta. Tauteihin tai vaivoihin, joita voidaan estää tai hoitaa keksinnön peptideillä, pilusrakenteil-^ la, polynukleotideilla tai farmaseuttisilla tuotteilla, kuuluu näihin rajoittumatta i o ripuli, esimerkiksi turistiripuli, kohonnut verenpaine, verisuonitaudit, allergia, o atooppiset taudit, virtsatieinfektiot, hengitystieinfektiot, karies, ärtyvän suolen x 30 oireyhtymä, tulehduksellinen suolistosairaus sekä vähäisemmän suolivaivan parantaminen ja henkilön kokonaishyvinvoinnin lisääminen/edistäminen. Kek-g sinnön koostumus on myös hyödyllinen gastrointestinaalisten häiriöiden ja tau- g tien estämisessä ja hoidossa sekä yleisen terveyden edistämisessä. Häiriöt tai ° taudit on edullisesti valittu ryhmästä, joka muodostuu limakalvon tulehdukses- 35 ta, suolen läpäisevyyshäiriöistä, IBD:stä, IBS:stä ja muista gastrointestinaali- 20 sista häiriöistä. Keksinnön eräässä erityisessä suoritusmuodossa peptidejä ja pilusrakenteita käytetään rokotteina (immunologinen vaste).Bacteria, a large number of single-celled microorganisms, cause various diseases in eukaryotes, for example humans, animals and plants. However, only in recent years has the presence of pili on important pathogens attracted interest from researchers. Because the gastrointestinal tract and its mik-20 robisto affect the well-being of the subjects, the utility of bacterial pili enables new treatments. The peptides, slit structures, or polynucleotides of the invention may be used in a method of treating or preventing diseases caused by microorganisms such as bacteria or viruses, or other causes such as unbalanced nutrition, a stressful lifestyle or genetic susceptibility. Diseases or ailments that can be prevented or treated with the peptides, slit structures, polynucleotides, or pharmaceutical products of the invention include, but are not limited to, diarrhea, for example, tourist diarrhea, hypertension, vascular diseases, allergies, o atopic diseases, urinary tract infections, x 30 syndrome, inflammatory bowel disease and improvement of lower intestinal distress and increase / promotion of overall well-being of the individual. The composition of Kek-g is also useful in the prevention and treatment of gastrointestinal disorders and diseases, and in the promotion of general health. Disorders or diseases ° is preferably selected from the group consisting of the mucosa of tulehdukses- 35, läpäisevyyshäiriöistä intestine, IBD, IBS and other gastrointestinal disorders Sista 20. In a particular embodiment of the invention, the peptides and slit structures are used as vaccines (immunological response).

Patogeenisten bakteerien adheesion vähentäminen tai estämisen kohteen maha-suolikanavaan johtaa patogeenien aiheuttamien oireiden estä-5 miseen tai helpottumiseen. Patogeeni syrjäytetään epiteeleistä tai maha-suoli-kanavan pinnalta kilpailun avulla keksinnön peptidillä tai pilusrakenteella. Edullisiin korvattaviin patogeeneihin kuuluu näihin rajoittumatta Escherichia coli, salmonella, basillit, bakteroidekset, listeriat, stafylokokit, enterokokit, klostridit ja streptokokit. Tässä käytettynä ’’patogeeniset bakteerit” viittaa mihin tahansa 10 bakteereihin, jotka aiheuttavat mitä tahansa tautia tai mitä tahansa haitallista vaikutusta. Tässä käytettynä ’’adheesio" viittaa ainakin kahden molekyylin tai rakenteen kiinnittymistä toisiinsa kemiallisilla tai fysikaalisilla sidoksilla/voimilla tai ilman niitä. Tunnetaan erityyppistä adheesiota, kuten mekaaninen adheesio, kemiallinen adheesio, dispersiivinen adheesio, elektrostaattinen adheesio 15 ja diffuusioadheesio. Adheesio voi olla palautuva tai palautumaton tapahtuma, mutta biokemiallisessa järjestelmässä adheesio on yleensä palautuva.Reducing or blocking the adhesion of pathogenic bacteria to the gastrointestinal tract of a subject results in the prevention or amelioration of symptoms caused by pathogens. The pathogen is displaced from the epithelium or from the surface of the gastrointestinal tract by competition with the peptide or slit structure of the invention. Preferred replacement pathogens include, but are not limited to, Escherichia coli, Salmonella, bacilli, bacteroids, listeria, staphylococci, enterococci, clostridia and streptococci. As used herein, "" pathogenic bacteria "refers to any bacterium that causes any disease or any deleterious effect. As used herein, "" adhesion "refers to the bonding of at least two molecules or structures to one another with or without chemical or physical bonding / forces. Different types of adhesion are known, such as mechanical adhesion, chemical adhesion, dispersive adhesion, electrostatic adhesion or diffusion adhesion. event, but in a biochemical system, adhesion is usually reversible.

Enterococcus faecalis ja Enterococcus faecium ovat suolistobakteereja, jotka ovat uusia nosokomiaalisia patogeenejä, mukaan lukien vankomy-siiniresistantit enterokokit (VRE), jotka ovat hyvin resistantteja tärkeälle kliini-20 selle antibioottivankomysiinille (de Regt M. J. et ai. 2008, J Antimicrob Che-mother. 62 (6): 1401 - 1406). Viime aikoina on kuvattu, että E. faecium -iso-laatit sisältävät pinnalla sijaitsevia piluksia ja, yllättävää kyllä, suurin osa (71 %) E. faeciumin sairaalasta saaduista kannoista sekä huomattava osuus (43 %) ei-sairaala-kannoista sisältää pilusgeenejä (Hendricks A. P. et ai. 2008, 25 Microbiology 154: 3212 - 3223). Eräässä kaksoissokko-ja plasebosäädellyssä tutkimuksessa on kuvattu, että Lactobacillus rhamnosus GG:n nauttiminen ^ poisti tehokkaasti enterokokit VRE-positiivisten potilaiden infektiosta (Manley ^ K. J. et ai. 2007 Med J Aust. 186 (9): 454 - 457). Molekulaarinen osoitus piluk- o siä sisältävän Lactobacillus rhamnosus GG:n ja VRE:n keskinäiselle kilpailulle ? 30 on peräisin sitoutumistutkimuksista, jotka osoittivat, että Lactobacillus rham- ^ nosus -bakteeri sitoutuu 20 - 130 kertaa paremmin ihmisen gastrointestinaali-Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium are intestinal bacteria that are novel nosocomial pathogens, including vancomycin resistant enterococci (VRE), which are highly resistant to the important clinical antibiotic vancomycin (de Regt MJ et al. 2008, J Antimicrob Che. (6): 1401-1406). Recently, it has been reported that E. faecium iso-isolates contain surface pili and, surprisingly, the majority (71%) of E. faecium hospital strains and a significant proportion (43%) of non-hospital strains contain pilus genes (Hendricks AP et al. 2008, 25 Microbiology 154: 3212-3223). In a double-blind and placebo-controlled study, ingestion of Lactobacillus rhamnosus GG was reported to effectively eliminate enterococci from infection in VRE-positive patients (Manley, K.K. et al. 2007 Med J Aust. 186 (9): 454-457). Molecular demonstration of competition between patches of Lactobacillus rhamnosus GG and VRE? 30 is derived from binding studies which showed that Lactobacillus rhamnoseus binds 20 to 130 times better in the human gastrointestinal tract.

CLCL

seen limaan kuin vakomysiiniresistantti E. faecium (Pultz NJ. et ai. 2006 Curr g Microbiol. 52 (3): 221 - 224). Yllättävästi tämän keksinnön sitoutumisanalyysis- o g sä puhdistetut His-Tag -merkityt LGG-proteiinit SpaA, SpaB ja SpaC estävät 35 patogeenejä, esimerkiksi vankomysiiniresistenttiä E. faeciumia, sitoutumasta limaan.mucus other than vacomycin resistant E. faecium (Pultz NJ. et al. 2006 Curr g Microbiol. 52 (3): 221-224). Surprisingly, in the binding assay of this invention, the purified His-Tag-labeled LGG proteins SpaA, SpaB and SpaC inhibit the binding of pathogens, for example vancomycin-resistant E. faecium, to mucus.

2121

Patogeenisten bakteerien adheesion vähentäminen tai estäminen kohteen maha-suolikanavaan, epiteeliin tai limaan voi käsittää seuraavat vaiheet: i) tuotetaan keksinnön ainakin yksi peptidi tai sen fragmentti tai pilusra-kenne; ii) tuodaan esille peptidi ja/tai pilusrakenne solun tai liman pinnalle.The reduction or inhibition of adhesion of pathogenic bacteria to a subject's gastrointestinal tract, epithelium or mucus may comprise the following steps: i) producing at least one peptide of the invention, or fragment or slit structure thereof; ii) exposing the peptide and / or slit structure on the surface of the cell or mucus.

5 Sen lisäksi että esillä oleva keksintö vähentää haitallisten tai pato geenisten bakteerien tarttumista, se tarjoaa myös mahdollisuuden edistää edullisten solujen tai muiden aineiden, kuten entsyymi(e)n, rekombinanttisolu-jen, mikrokapselien, nanokapselien tai lääkke(id)en, adheesiota mahasuoli-kanavaan. Bakteerisolun adheesion edistäminen limaan tai maha-suolikana-10 vaan tai keksinnön peptidin tai pilusrakenteen käyttö bakteerisolun adheesion edistämiseksi gastrointestinaaliseen limaan liittyy uusien peptidien tai pilusra-kenteiden yllättävään kykyyn tarttua maha-suolikanavaan in vivo, ex vivo tai in vitro. Piluspeptidi tai -rakenne toimii työkaluna solun tai minkä tahansa muun aineen, kuten lääkkeiden, entsyymi(e)n, mikro-organismi(e)n, rekombinant-15 tisolujen, mikrokapselin tai nanokapselin, sitomiseksi maha-suolikanavaan.In addition to reducing infectivity of harmful or pathogenic bacteria, the present invention also provides the ability to promote gastrointestinal adhesion of beneficial cells or other substances such as enzyme (s), recombinant cells, microcapsules, nanocapsules, or drug (s). channel. Promotion of bacterial cell adhesion to the mucosa or gastrointestinal tract, or the use of a peptide or slit structure of the invention to promote bacterial cell adhesion to the gastrointestinal mucus is associated with the surprising ability of novel peptides or ciliary structures to adhere to the gastrointestinal tract in vivo, ex vivo or in vitro. The slit peptide or construct serves as a tool for binding the cell or any other substance, such as drugs, enzyme (s), microorganism (s), recombinant thymus cells, microcapsule or nanocapsule, to the gastrointestinal tract.

Kohteen immuunivasteen modifioiminen ja peptidien tai pilusrakenteen käyttö immuunivasteen modifioimiseksi perustuvat yllättävään havaintoon, että keksinnön peptidit tai pilusrakenne aiheuttavat muutoksia immuunivasteeseen. Immuunivaste viittaa antigeenin aiheuttamaan vasteeseen 20 kehossa, ex vivo- tai in vitro tai toisen modulaattorin aiheuttamaan vasteeseen. Tätä vastetta voivat välittää lymfosyytit ja/tai spesifiset vasta-aineet tunnistamalla antigeenejä. Immuunivasteen yksi tavoite on tuhota antigeeni, joka on tavallisesti vierasta alkuperää, tai neutralisoida se. Tässä käytettynä ’’modifioiminen” viittaa mihin tahansa immuunivasteen muuttamiseen, kuten lisäämi-25 seen tai vähentämiseen. Immuunivasteen muutoksia voidaan seurata millä tahansa sopivalla lääketieteellisellä, fysiologisella tai biologisella testillä, joihin ^ kuuluvat näihin rajoittumatta testit, jotka perustuvat signalointireittien aktivaati- ^ on havaitsemiseen sekä markkerigeenien transkriptio- tai translaatiotason tai 00 o proteiinien määrän, esimerkiksi vasta-aineiden ja reseptorien määrän, havait- ° 30 semiseen. Tällä hetkellä ei ole yhtä markkeria solun tai organismin immuuniin vasteen määrittämiseen. Edullisiin markkereihin kuitenkin kuuluu näihin rajoit-Modification of the immune response of a subject and the use of peptides or pilos to modify the immune response are based on the surprising discovery that the peptides or pilos of the invention cause alterations in the immune response. An immune response refers to an antigen-induced response in the body, ex vivo or in vitro, or to another modulator. This response can be mediated by lymphocytes and / or specific antibodies by recognizing antigens. One of the aims of the immune response is to destroy or neutralize an antigen, usually of foreign origin. As used herein, "" modifying "refers to any alteration of the immune response, such as augmentation or reduction. Changes in the immune response may be monitored by any suitable medical, physiological or biological assay, including, but not limited to, assays based on the detection of signaling pathway activation, and the transcriptional or translational level of marker genes or the number of proteins, e.g. - ° 30 to go. There is currently no single marker for determining the immune response of a cell or organism. Preferred markers, however, include these limitations.

CLCL

tumatta tuumorinekroositekijä alfa (TNF-α), interleukiini 12 (IL-12), IL-10, IL-1 o β ja interferoni alfa (IFN-α). Muita mahdollisia markkereita ovat IL-1 a, IL-6, IL- § 18, IFN-γ, IL-4, TGF-β, IL-I Raja IL-18BP. Keksinnön eräässä edullisessa suo- ° 35 ritusmuodossa markkeri(t) valitaan ryhmästä, joka muodostuu TNF-a:sta, Th1- sytokiineistä, IL-10:stä ja IL-12:sta.tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interleukin 12 (IL-12), IL-10, IL-10 β and interferon alpha (IFN-α). Other possible markers include IL-1α, IL-6, IL-18, IFN-γ, IL-4, TGF-β, IL-1 and IL-18BP. In a preferred embodiment of the invention, the marker (s) is selected from the group consisting of TNF-α, Th1 cytokines, IL-10 and IL-12.

2222

Immuunivasteen muutoksia voidaan tarkistaa in vitro-, ex vivo- tai in vivo -testeissä mistä tahansa biologisesta näytteestä tai kohteesta. Probioottis-ten kantojen ominaisuuksia voidaan tutkia soluviljelmissä (in vitro), joissa käytetään esimerkiksi perifeerisiä yksitumaisia verisoluja (PBMC), ihmisen mo-5 nosyyttejä, makrofageja ja dendriittisoluja. Ex vivo -kokeiden esimerkkeihin kuuluvat neutrofiilien ja monosyyttien fagosytoosin määritys, oksidatiivinen purkaus, toisin sanoen neutrofiilien ja monosyyttien superoksidin muodostus, NK soluaktiivisuus, lymfosyyttien proliferaatio ja sytokiinien tuottaminen perifeerisillä yksitumaisilla verisoluilla, monosyyteillä tai lymfosyyteillä. In vivo -ko-10 keisiin kuuluu näihin rajoittumatta rokotusvasteen määritys (esim. rokotekoh-taiset vasta-aineet tai rokotekohtaiset vasta-ainetta muodostavat solut), viivästynyt yliherkkyys ja vaste heikennetyille patogeeneille.Changes in immune response can be checked by in vitro, ex vivo or in vivo assays from any biological sample or target. The properties of probiotic strains can be studied in cell cultures (in vitro) using, for example, peripheral mononuclear blood cells (PBMCs), human monocytes, macrophages and dendritic cells. Examples of ex vivo experiments include assaying phagocytosis of neutrophils and monocytes, oxidative bursting, i.e., superoxide formation of neutrophils and monocytes, NK cell activity, lymphocyte proliferation, and production of cytokines by peripheral mononuclear cells, monocytes or lymphocytes. In vivo assays include, but are not limited to, determination of the vaccination response (e.g., vaccine-specific antibodies or vaccine-specific antibody-forming cells), delayed hypersensitivity, and response to attenuated pathogens.

Vaihtoehtona probioottisille vaikutuksille keksinnön peptidit tai pilus-rakenteet voivat aiheuttaa muita vaikutuksia soluun tai kohteeseen. Nämä 15 muut vaikutukset voivat myös esiintyä yksin tai yhdessä probioottisten vaikutusten kanssa. Probioottinen vaikutus voi olla muun immunomodulaattorin (muiden immunomodulaattoreiden)'ja peptidien tai pilusrakenteiden yhdistelmä.As an alternative to probiotic effects, the peptides or pilus structures of the invention may cause other effects on the cell or target. These other effects may also occur alone or in combination with probiotic effects. The probiotic effect may be a combination of another immunomodulator (s) and peptides or slit structures.

Hoitojen tai estojen kohde voi olla mikä tahansa eukaryoottinen or-20 ganismi, edullisesti ihminen tai eläin, erityisesti lemmikkieläimet ja tuotantoeläimet. Eläin voidaan valita ryhmästä, joka muodostuu tuotantoeläimistä ja lemmikkieläimistä, kuten lehmistä, hevosista, sioista, vuohista, lampaista, siipikarjasta, koirista, kissoista, kaneista, matelijoista ja käärmeistä.The treatments or inhibitions may be any eukaryotic organism, preferably human or animal, in particular pets and farm animals. The animal may be selected from the group consisting of farm animals and pets such as cows, horses, pigs, goats, sheep, poultry, dogs, cats, rabbits, reptiles and snakes.

Seulontamenetelmät 25 Keksinnön mitä tahansa polynukleotidia tai sen mitä tahansa frag- menttia voidaan käyttää pilusrakenteeltaan samankaltaisten bakteerikantojen o seulomiseen. Menetelmässä bakteerikantojen seulomiseksi ainakin yksi poly- i 0 nukleotidi tai sen fragmentit, jotka koodaavat piluspeptidejä tai sen fragmentte- ° ja, voidaan määrittää esimerkiksi PCR-pohjaisilla menetelmillä, kuten tavan- 1 30 omaisella PCR:llä ja sekvensoinnilla tai minisekvensoinnilla; hybridisaatiome- netelmillä, kuten Southern- tai Northern-hybridisaatiolla; millä tahansa bioin-g formatiikan menetelmillä, joissa käytetään erilaisia ohjelmia ja parametrejä; ja g millä tahansa vasta-ainepohjaisilla menetelmillä käyttämällä vasta-aineita kek- ^ sinnön peptidejä vastaan, flow-sytometrialla, immunopresipitaatiolla, co-immu- 35 nopresipitaatiolla, immunohistokemialla, immunofluoresenssilla, ELISA- ja ELISPOT-tekniikoilla. Näin ollen keksinnön eräässä edullisessa suoritus muo- 23 dossa seulotaan PCR:llä uusia bakteerikantoja, joilla on pilusrakenteet, käyttäen alukkeita, jotka on suunniteltu LGG-pilusgeeneille. Keksinnön eräässä toisessa edullisessa suoritusmuodossa seulotaan uusia bakteerikantoja, joissa on pilusrakenteet, Southern-hybridisaatiolla käyttäen keksinnön LGG geenien 5 monistustuotteita koettimina.Screening Methods Any polynucleotide of the invention, or any fragment thereof, may be used to screen bacterial strains of similar pilus structure. In a method for screening bacterial strains, at least one poly nucleotide or fragments thereof that encode the slit peptides or fragments thereof can be determined, for example, by PCR-based methods such as conventional PCR and sequencing or mini-sequencing; hybridization methods such as Southern or Northern hybridization; any method of bioin-g formatting using various programs and parameters; and g by any antibody-based methods using antibodies against the peptides of the invention, flow cytometry, immunoprecipitation, co-immunoprecipitation, immunohistochemistry, immunofluorescence, ELISA and ELISPOT techniques. Thus, in a preferred embodiment of the invention, new bacterial strains having the pilos constructs are screened by PCR using primers designed for the LGG pilus genes. In another preferred embodiment of the invention, novel bacterial strains having slit structures are screened by Southern hybridization using the amplification products of the LGG genes of the invention as probes.

Menetelmissä keksinnön polynukleotidin kanssa homologisten sekvenssien tai fragmenttien seulomiseksi ovat tiukat hybridisaatio-olosuhteet edullisia alukkeille tai koettimille. Tässä käytettynä ’’homologinen sekvenssi” tai ’’sekvenssi, jolla on suuri identtisyys” viittaa sekvenssiin, joka voi olla identtinen 10 mutta jonka ei tarvitse olla identtinen toisen sekvenssin kanssa. Sekvenssit ovat kuitenkin samankaltaisia, ja niillä on suuri identtisyysprosentti.In methods for screening sequences or fragments homologous to a polynucleotide of the invention, stringent hybridization conditions are preferred for primers or probes. As used herein, "" homologous sequence "or" high sequence identity "refers to a sequence that may be identical to 10 but need not be identical to another sequence. However, the sequences are similar and have a high percentage of identity.

Keksinnön eräässä toisessa edullisessa suoritusmuodossa uudet bakteerikannat ja metapopulaatiot, joilla on pilusrakenteet, seulotaan laskennallisilla menetelmillä olemassa olevista tai juuri luoduista sekvenssiluetteloista 15 tai tietokannoista.In another preferred embodiment of the invention, novel bacterial strains and metapopulations having slit structures are screened by computational methods from existing or newly created sequence lists 15 or databases.

Seulottava näyte voidaan ottaa mistä tahansa organismista tai mistä tahansa aineesta, ja se voi olla esimerkiksi bakteeriviljely, kudosnäyte, verinäyte (seerumi- tai plasmanäyte), ruoka-ainenäyte tai ympäristönäyte. Keksinnön eräässä edullisessa suoritusmuodossa seulottava bakteerikanta on potentiaa-20 linen probioottinen bakteerikanta.The sample to be screened may be taken from any organism or any substance and may be, for example, bacterial culture, tissue sample, blood sample (serum or plasma sample), food sample or environmental sample. In a preferred embodiment of the invention, the bacterial strain to be screened is a potential probiotic bacterial strain.

Esillä olevassa keksinnössä seulonta voidaan suorittaa in vivo, in vitro, in silico tai ex vivo -olosuhteissa.In the present invention, screening may be performed under in vivo, in vitro, in silico or ex vivo conditions.

Esillä olevaa keksintöä havainnollistetaan seuraavilla esimerkeillä, joita ei ole tarkoitettu millään tavoin rajoittaviksi.The present invention is illustrated by the following examples, which are not intended to be limiting in any way.

25 Esimerkki 1. LGG-rekombinanttipiliiniproteiinien kloonaus, tuottaminen ja puhdistus w SpaA:n (GG00442), SpaB:n (GG00443), SpaC:n (GG00444), § SpaD:n (GG02370), SpaE:n (GG02371) ja SpaF:n (GG02372) koodaavat sek- ^ venssit lukuun ottamatta aluetta, joka koodaa N-terminaalista signaalipeptidiä x 30 ja C-terminaalista soluseinämään lajittelusignaalia (CWSS), PCR-monistettiin LGG:n genomisesta DNA:sta käyttäen reunustavia 5’- ja 3’-pään oligonukleoti-g dikoettimia, joista toinen sisälsi EcoRI-kohdan (Sacl-kohta GG02372:lle) ja toi- g nen Xhol-kohdan (ks. taulukko 1). Monistetut PCR-fragmentit pilkottiin EcoRI- c3 (tai GG02372:n ollessa kyseessä Sacl-) ja Xhol-restriktioendonukleaaseilla, 35 liitettiin sitten vastaaviin kohtiin T7-säädellyssä ilmentymisvektorissa pET28b+ ja tuloksena olevat rekombinanttiplasmidit (pKTH5319 GG00442:lle, 24 PKTH5320 GG00443:lle, pKTH5321 GG00444:lle, pKTH5324 GG02370:lle, pKTH5379 GG02371:lle ja pKTH5341 GG02372:lle) monistettiin E. coli - kannassa BL21 (DE3) pLysS solunsisäisten C- terminaalisten heksahistidiinimer-kittyjen proteiinien ilmentämiseksi. Kaikki käytetyt standardimenetelmät DNA-5 käsittelyissä olivat vakiintuneita. Proteiinintuotantoa varten kasvatettiin E. coli -bakteeria 37 °C:ssa mid-log-faasiin Luria-Bertani -alustassa, johon oli lisätty 50 μ9/ιηΙ kanamysiiniä, indusoitiin proteiinin ilmentymistä kolme tuntia 1 mM IPTG:llä, kerättiin solut sentrifugoinnilla ja suspendoitiin solupelletti uudelleen lyysipuskuriin [50 mM NaH2P04 (pH 8,0), 300 mM NaCI, 10 mM imidatsoli]. 10 Solut rikottiin sonikaatiolla, puhdistettiin sentrifugoinnilla, ja soluttomat lysaatit suodatettiin 0,45 μηι:η suodattimen läpi. Heksahistidiinimerkityt piliiniproteiinit puhdistettiin sitten Ni2+-kelatointiaffiniteettikromatografialla. Lyhyesti ilmaisten, soluttomat lysaatit vietiin kukin Ni-NTA-agaroosipylvääseen (Qiagen), pestiin pesupuskurilla [50 mM NaH2P04(pH 8,0), 300 mM NaCI, 20 mM imidatsoli], ja 15 proteiinit eluoitiin pylväästä eluointipuskurilla [50 mM NaH2P04 (pH 8,0), 300 mM NaCI, 250 mM imidatsoli]. Pylväsfraktiot, jotka sisälsivät puhdistettuja proteiineja, yhdistettiin, puskuri vaihdettiin 10 mM:iin Tris-HCI:a (pH 8,0) SpaA-(GG00442), SpaC- (GG00444), SpaD- (GG02370), SpaE- (GG02371) ja SpaF-proteiineille (GG02372) ja 50 mM:iin natriumasetaattia (pH 5,1) SpaB-20 proteiinille (GG00443) käyttäen BioRad EconoPac 10 DG -suolanpoisto-pylvästä ja väkevöitiin käyttäen 30 kDa Microsep -suodatinta (Pall Life Sciences). Rekombinanttipiliiniproteiinien puhtautta seurattiin SDS-PAGEIIa, ja proteiinipitoisuuksia arvioitiin A28o-mittauksilla.Example 1. Cloning, Production and Purification of LGG Recombinant Pilin Proteins w SpaA (GG00442), SpaB (GG00443), SpaC (GG00444), § SpaD (GG02370), SpaE (GG02371) and SpaF (GG02372) coding sequences, except for the region encoding the N-terminal signal peptide x30 and the C-terminal cell wall sorting signal (CWSS), were PCR amplified from LGG genomic DNA using the flanking 5 'and 3' end oligonucleotide-g dicotes, one containing the EcoRI site (SacI site for GG02372) and the other XhoI site (see Table 1). The amplified PCR fragments were digested with EcoRI-c3 (or, in the case of GG02372, SacI) and XhoI restriction endonucleases, then ligated into the respective sites in the T7-regulated expression vector pET28b + and the resulting recombinant plasmids (pKTH5319 Gle GG00444, pKTH5324 GG02370, pKTH5379 GG02371 and pKTH5341 GG02372) were amplified in E. coli strain BL21 (DE3) pLysS for intracellular C-terminal hexahistidine-labeled proteins. All standard methods used in DNA-5 treatments were well established. For protein production, E. coli was grown at 37 ° C in a mid-log phase in Luria-Bertani medium supplemented with 50 μ9 / ιηΙ kanamycin, induced protein expression for 3 hours with 1 mM IPTG, harvested by centrifugation and suspended in cell pellet. again in lysis buffer [50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0), 300 mM NaCl, 10 mM imidazole]. Cells were disrupted by sonication, purified by centrifugation, and cell-free lysates were filtered through a 0.45 μηι: η filter. The hexahistidine-labeled pilin proteins were then purified by Ni 2+ -chelating affinity chromatography. Briefly, cell-free lysates were each loaded on a Ni-NTA agarose column (Qiagen), washed with wash buffer [50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0), 300 mM NaCl, 20 mM imidazole], and the proteins eluted from the column with 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0), 300 mM NaCl, 250 mM imidazole]. The column fractions containing the purified proteins were pooled, the buffer exchanged with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) SpaA- (GG00442), SpaC- (GG00444), SpaD- (GG02370), SpaE- (GG02371) and For SpaF proteins (GG02372) and 50 mM sodium acetate (pH 5.1) for SpaB-20 protein (GG00443) using a BioRad EconoPac 10 DG desalting column and concentrated using a 30 kDa Microsep filter (Pall Life Sciences). The purity of the recombinant pilin proteins was monitored by SDS-PAGE, and protein levels were evaluated by A 280 measurements.

Esimerkki 2. LGG:n rekombinanttipiliiniproteiinispesifisten polyklonaa-25 listen vasta-aineiden muodostaminenExample 2. Generation of LGG Recombinant Pilin Protein Specific Polyclonal Antibodies

ΪΙ SpaA (GG00442)-, SpaB (GG00443)-, SpaC (GG00444)-, SpaDΪΙ SpaA (GG00442) -, SpaB (GG00443) -, SpaC (GG00444) -, SpaD

^ (GG02370)-, SpaE (GG02371)-ja SpaF (GG02372)-piliiniproteiineille spesifisiä o kanin polyklonaalisia vasta-aineita valmistettiin immunisaatiomenettelyllä, jon- 2 ka ovat kuvanneet Johnston B. A. et ai. (1991, Laboratory of Animal Science x 30 41: 15 - 21). Lyhyesti ilmaistuna, annettiin aluksi ihonalainen (SC) injektio (1 ml) 1:1-sekoituksena 400 μ9 puhdistettua rekombinanttista piliiniproteiinia g Freudin täydellisessä adjuvantissa, mitä seurasi kolme sarjaa tehosteinjektioita g (SC) 1:1-sekoituksena 200 μ9 proteiinia Freudin epätäydellisessä adjuvantissa ^ kolmen viikon välein. Lopullinen verenkeräys tehtiin kaksi viikkoa viimeisen te- 35 hosteinjektion jälkeen. Antiseerumien valmistus verestä suoritettiin käyttäen standardimenettelyjä.Polyclonal antibodies specific for the ^ (GG02370), SpaE (GG02371) and SpaF (GG02372) pilin proteins were prepared by the immunization procedure described by Johnston B. A. et al. (1991, Laboratory of Animal Science x 30 41: 15-21). Briefly, a subcutaneous (SC) injection (1 ml) of 400 μ9 purified recombinant pilin protein in g Freud's complete adjuvant was initially administered, followed by three sets of booster injections in g (SC) 1: 1 in Freud's incomplete adjuvant. every three weeks. Final blood collection was done two weeks after the last booster injection. Preparation of antisera from blood was performed using standard procedures.

+-1 o > 03 .c O = O 03 < '17 o o o 5 E-π O E-< ^ _ E-ι H E-ι ξ £ ft H 1¾ O ; = m »5 f5 *3 Eh >+ -1 o> 03 .c O = O 03 <'17 o o o 5 E-π O E- <^ _ E-ι H E-ι ξ £ ft H 1¾ O; = m »5 f5 * 3 Eh>

S V p£ EH o OS V p £ EH o O

C rt! rt rt! rt -= 3 O rt rt rt d dC rt! rt rt! rt - = 3 O rt rt rt d d

3 rt! O O U rt! O C3 rt! O O U rt! O C

« Eh O d d rt rt O«Eh O d d rt rt O

_ rt d d d Eh Eh m 5 rt Eh O O rt d m S d u o q rt d to o, rt ,< rt ,< rt O oi «douudC-* -¾ d EH EH EH d O 3 ±EhU(_>UOCJ"c5 JSOUUUOH^ cortodortcj-g reortrtdooo > CJ O O O U O φ * EH EH O U EH rt! "3 *ut_)rtrtEHUO;5 2 d Eh d Eh rt O c fS d d Eh rt d rt o — rt Eh d d d En C35 <ooououo =_ rt ddd Eh Eh m 5 rt Eh OO rt dm S duoq rt d to o, rt, <rt, <rt O oi «douudC- * -¾ d EH EH EH d O 3 ± EhU {_> UOCJ« c5 JSOUUUOH ^ cortodortcj-g reortrtdooo> CJ OOOUO φ * EH EH OU EH rt! "3 * ut_) rtrtEHUO; 5 2 d Eh d Eh rt O c fS dd Eh rt d rt o - rt Eh ddd En C35 <ooououo =

SUrtUCJEHO OSUrtUCJEHO O

s rt rt d eh rt o c o h o rt d rt o ro ω o i i ι o i ro 2 rt - - - o - £ O LO LT) LO d LO 5 = O d 3s rt rt d eh rt o c o h o rt d rt o ro ω o i i ι o i ro 2 rt - - - o - £ O LO LT) LO d LO 5 = O d 3

“ d O COD O CO

g, EH O cg, EH O c

in = 1 'Sin = 1 'S

CN O d ir> Jo M 'ro d j*;CN O d and> Jo M 'ro d j *;

Eh O ^ u eh eh ro rt rt a d to d O O d f£ rt m d U rt! rt d > rt rt rt u rt d _Eh O ^ u eh eh ro rt rt a d to d O O d f £ rt m d U rt! rt d> rt rt rt u rt d _

EH O EH EH O O OEH O EH EH O O O

rt o rt o eh o -crt o rt o eh o -c

_dddrtrtoX_dddrtrtoX

,ΞΕηΟΕηΟΟΟ m :(C rt Eh d O EH EH =*., ΞΕηΟΕηΟΟΟ m: {C rt Eh d O EH EH = *.

o. rt d rt rt υ d c C d Eh d rt EH O '.m tUdOUOEHO'o Q> rt rt d rt rt En ro βί EH rt EH d rt U oo. rt d rt rt υ d c C d Eh d rt EH O '.m tUdOUOEHO'o Q> rt rt d rt rt En ro βί EH rt EH d rt U o

°UOrtOÖO O° OVERHEAT O

*« EHEHrtEHrtrt-S* «EHEHrtEHrtrt-S

S Eh EH O EH U O ω irtrtEHrtEHdTj -r- — rtrtdrtEnrtro «OOEHddOcn -n rt rt eh rt d d SH ~dOdddd.!5, ^ oEHrtrtrtEnEH — I SdUOEHEHEHO; oo SdrtEndrtrtoS Eh EH O EH U O ω irtrtEHrtEHdTj -r- - rtrtdrtEnrtro «OOEHddOcn -n rt rt eh rt d d SH ~ dOdddd.! 5, ^ oEHrtrtrtEnEH - I SdUOEHEHEHO; oo SdrtEndrtrto

O iddEHOdrtOO iddEHOdrtO

' 2drtdOrtrtLU'2drtdOrtrtLU

r-, £ u o rt o o o - _ OEnddrtdd — ,5> | I I I | I to x ΟΐΓ)ίηΐ-ηιηΐΓ)ΐη5 cc -9? O. -* 3 er-, £ u o rt o o o - _ OEnddrtdd -, 5> | I I I | I to x ΟΐΓ) ίηΐ-ηιηΐΓ) ΐη5 cc -9? O. - * 3 e

H- OH-O

O CM CO θ' O T— CM* Si SH ti- Ht 'J fn- n. frt ω SH T- 'ϊ Ht Hf co co co .°O CM CO θ 'O T— CM * Si SH ti- Ht' J fn- n. Frt ω SH T- 'ϊ Ht Hf co co. °.

2 O O O CM CM CM -H2 O O O CM CM CM -H

O o O O O O O O — o 000000-1= CM X O O O O O O ω — Έ<ωοαιυιΓ?:: i rororororororoi CC Φ Q. Ω. Q. Q. Q. Q. ra h- Ococococococo'* 26O o O O O O O O - o 000000-1 = CM X O O O O O O O ω - Έ <ωοαιυιΓ? :: i rororororororoi CC Φ Q. Ω. Q. Q. Q. Q. ra h- Ococococococo '* 26

Esimerkki 3. Proteiineja koodaavien sekvenssien ennustaminen bioin-formatiikan menetelmilläExample 3. Prediction of protein coding sequences by bioinformation methods

Proteiinia koodaavien sekvenssien ennustaminen suoritettiin käyttämällä Glimmer3:a (Delcher A. L. et ai. 2007, Bioinformatics. 23: 673 - 679) ja 5 analysoimalla valmis LGG:n genomisekvenssi. Glimmer3:a sovellettiin käyttämällä iteraatiomalliskriptiä (g3-iterated.csh) seuraavin oletusparametreihin tehdyin muunnelmin: minimigeenipituus (150 bp) ja maksimipäällekkäisyys (50 bp). Alkuennusteiden aloituskohdat korjattiin käyttäen BLASTia (Altschul S. F. et ai. 1997, Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389 - 3402) ja etsimällä oletettuja ri-10 bosomaalisia sitoutumiskohtia. Glimmer3-ennusteet GG00441:lle, GG00442:lle, GG00443:lle, GG00444:lle, GG02369:lle, GG02370:lle ja GG02371:lle hyväksyttiin sellaisinaan, kun taas GG02372:n ennustetta korjattiin alkamaan 21 bp:tä enemmän alavirtaan manuaalisesti. Rho-riippuvaiset lopetuskohdat ennustettiin käyttäen TransTermHP:tä (Kingsford C. L. et ai. 15 2007, Genome Biol. 8: R22), joka osoitti, että GG00441, GG00442, GG00443 ja GG00444; GG02369, GG02370, GG02371 ja GG02372 transkriptoidaan yhtenä transkriptinä, ja näin ne muodostavat omat operonit.Prediction of protein coding sequences was performed using Glimmer3 (Delcher A.L. et al. 2007, Bioinformatics. 23: 673-679) and 5 analyzing the finished LGG genome sequence. Glimmer3 was applied using an iteration template script (g3-iterated.csh) with modifications to the following default parameters: minimum gene length (150 bp) and maximum overlap (50 bp). Initial prediction start sites were corrected using BLAST (Altschul S.F. et al. 1997, Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402) and searching for putative ri-10 bosomal binding sites. Glimmer3 predictions for GG00441, GG00442, GG00443, GG00444, GG02369, GG02370 and GG02371 were accepted as such, while the GG02372 prediction was corrected to start at 21 bp man. Rho-dependent termination sites were predicted using TransTermHP (Kingsford C.L. et al. 15 2007, Genome Biol. 8: R22), which showed that GG00441, GG00442, GG00443 and GG00444; GG02369, GG02370, GG02371 and GG02372 are transcribed as a single transcript and thus form their own operons.

Sekvenssikuvauksia saatiin muuntamalla ennustetut proteiineja koodaavat sekvenssit proteiinisekvensseiksi ja suorittamalla homologiahaku 20 julkiseen sekvenssitietokantaan vertaamalla (Wheeler D. L. et ai. 2008, Nucleic Acids Res. 36: D13 - 21). Sekvenssikuvaukset hyväksyttiin vain niistä sekvensseistä, joissa kyselyn ja kohteen välisen sekvenssin paikallinen rinnastus oli >= 35 %:n aminohappoidenttisyys ja joka kattoi >= 80 % kohteen sekvenssistä. Perustuen tähän hakuun GG00441 ja GG02369 kuvattiin sortaasient-25 syymeiksi, GG00444 von Willebrand -tekijädomeinin sisältäväksi proteiiniksi, ^ GG02370 ja GG02371 konservoineeksi hypoteettisiksi proteiineiksi ja ™ GG02372 ulkomembraaniproteiiniksi. GG00442:lle ja GG00443:lle ei saatu § sekvenssikuvauksia.Sequence mapping was obtained by converting the predicted protein coding sequences into protein sequences and performing a homology search on 20 public sequence databases by comparison (Wheeler D.L. et al. 2008, Nucleic Acids Res. 36: D13-21). Sequence descriptions were accepted only for those sequences where the local alignment of the query to the target was> = 35% amino acid identity and covered> = 80% of the target sequence. Based on this search, GG00441 and GG02369 were described as sorption-enzymes, GG00444 von Willebrand factor domain-containing protein, GG02370 and GG02371 as conserved hypothetical proteins and ™ GG02372 as outer membrane protein. No sequence descriptions were obtained for GG00442 and GG00443.

o Lisää sekvenssikuvauksia ja informaatiota sekvensseistä saatiin x 30 integroimalla InterPro-ja COG-analyysien tietoja (Mulder N. J, et ai. 2007, Nu- cleic Acids Res. 35: D224 - D228; Tatusov R. L. et ai. 2000, Nucleic Acids g Res. 28: 33 - 36) ja tekemällä spesifisiä domeenianalyysejä. Spesifisiä do- § meenianalyysejä tehtiin käyttämällä Hmmer-paketin Hmmsearch-työkalua ja o o käyttämällä sortaaseihin liittyviä domeenimalleja, joita saadaan PFAM:n ja 35 TIGRFAM:n julkisista tietokannoista (Finn R. D. et ai. 2008, Nucleic Acids Res. 36: D281 - 288; Haft D.H. et ai. 2003, Nucleic Acids Res. 31: 371 - 373). Sor- 27 taasitunnistuskohtien etsimiseen käytettiin malleja TIGR01167, TIGR03063, TIGR03065, TIGR03068 ja PF00746 ja sortaasien hakemiseen malleja TIGR01076, TIGR03064, PF04203 ja PF07170. PFAM-mallien sekä fs- että Ismaileja etsittiin sekä TIGR-mallien täyspituisia malleja. Molempia hakutyyppe-5 jä, sekvenssi- ja domeenihakua, käytettiin. Osumia, jotka olivat suurempia kuin tietokannan antama luotettavuusraja-arvo, pidettiin merkittävinä. Tapauksissa, joissa sekvenssimalli oli merkittävä, hyväksyttiin jokainen domeeniosuma. Nämä haut osoittivat, että GG00441 ja GG02369 ovat sortaasientsyymejä ja että GG00442, GG00443, GG02370 ja GG02372 sisältävät sortaasintunnistuskoh-10 dan ja ovat näin niiden todennäköisiä substraatteja. Etsittiin myös sortaasitun-nistuskohtia käyttäen varsinaisia ilmentymishakuja (malleilla LPXTG ja LVNTG (Ton-That H et ai. 2004, Mol Microbiol. 53: 251 - 261), joissa X tarkoittaa mitä tahansa aminohappoa), jolloin saatiin seuraavat täsmäykset: GG00442 ja GG00443, GG00444, GG02370, GG02371 ja GG02372. E-laatikkoja etsittiin 15 käyttäen YXXXETXXPX(G/N)X:ää varsinaisena ilmentymisenä, joka johdettiin alkuperäisestä YXLXETXAPXGY-mallista (Ton-That H et ai. 2004, Mol Microbiol. 53: 251 - 261). E-laatikkohaku tuotti osumat GG00442:sta, GG00443:sta, GG00444:stä, GG02370:sta ja GG02372:sta, mikä vahvisti, että nämä sekvenssit olivat todennäköisesti sortaasisubstraatteja. Mahdollisten eristyssig-20 naalien olemassaolo testattiin käyttäen SignalP3-työkalua käyttäen sekä piilotettua Markovin mallia ja neuraaliverkkomenetelmiä. Kaikissa tapauksissa molemmat menetelmät ennustivat, että GG00441:n, GG00442:n GG00443:n, GG02370:n GG02371:n ja GG02372:n peptidisekvenssit sisälsivät eritystä varten sopivan signaalin.o More sequence mapping and sequence information was obtained by x 30 integrating data from InterPro and COG analyzes (Mulder N.J. et al. 2007, Nucleic Acids Res. 35: D224-D228; Tatusov RL et al. 2000, Nucleic Acids g. Res. 28: 33-36) and by performing specific domain analyzes. Specific domain analyzes were performed using the Hmmsearch tool of the Hmmer package and using the sorption-related domain models obtained from the public databases of PFAM and 35 TIGRFAM (Finn RD et al. 2008, Nucleic Acids Res. 36: D281-288; Haft DH et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31: 371-373). The TIGR01167, TIGR03063, TIGR03065, TIGR03068, and PF00746 templates were used to search for sor 27 re-recognition sites, and the TIGR01076, TIGR03064, PF04203, and PF07170 templates were used to search for sorta. Both fs and Ismails of the PFAM models were searched for as well as full length models of the TIGR models. Both search type-5, sequence and domain search, were used. Hits greater than the confidence limit given by the database were considered significant. In cases where the sequence model was significant, each domain hit was accepted. These searches indicated that GG00441 and GG02369 are sorpase enzymes and that GG00442, GG00443, GG02370 and GG02372 contain a sorption recognition site and are thus likely substrates. Sorterase recognition sites were also searched using actual expression searches (LPXTG and LVNTG (Ton-That H et al. 2004, Mol Microbiol. 53: 251-261), where X represents any amino acid), yielding the following alignments: GG00442 and GG00443, GG00444, GG02370, GG02371 and GG02372. E-boxes were searched using YXXXETXXPX (G / N) X as the actual expression derived from the original YXLXETXAPXGY model (Ton-That H et al. 2004, Mol Microbiol. 53: 251-261). The e-box search yielded hits on GG00442, GG00443, GG00444, GG02370, and GG02372, confirming that these sequences were likely to be sorption substrates. Potential isolation signals were tested using the SignalP3 tool, using a hidden Markov model and neural network methods. In all cases, both methods predicted that the peptide sequences of GG00441, GG00442, GG00443, GG02370, GG02371 and GG02372 contained a suitable signal for secretion.

25 Esimerkki 4. Julkisten tietokantojen bioinformatiiviset seulonnat25 Example 4. Bioinformative Screening of Public Databases

Esillä olevan keksinnön mukaisia peptidisekvenssejä, niiden frag-The peptide sequences of the present invention, fragments thereof

Oo

cv mentteja, niiden variantteja, polynukleotidisekvenssejä, niiden fragmentteja tai o niiden variantteja voidaan käyttää suorittamaan laskennallisia hakuja julkisiin ja 5 yksityisiin sekvenssikokoelmiin ja näin ollen havaitsemaan bakteerikantoja, jot- x 30 ka käsittävät samankaltaisia peptidisekvenssejä, polynukleotidisekvenssejä tai pilusrakenteita. Eräs bioinformaattisten seulontamenetelmien edullinen käyttö g on tarkoitettu valitsemaan bakteeriyhteisöjä, joissa rikastuvat peptidisekvens- g sit, polynukleotidisekvenssit tai pilusrakenteet. Bioinformaattiset haut tarjoavat ^ vakuuttavan menetelmän sellaisten kantojen havaitsemiseksi, joista on sek- 35 venssejä, jotka ovat julkisissa sekvenssikokoelmissa mutta joita asiantuntija ei ole koskaan kuvannut tai karakterisoinut.cv enzymes, variants thereof, polynucleotide sequences, fragments thereof, or variants thereof may be used to perform computational searches on public and private sequence collections, and thus detect bacterial strains comprising similar peptide sequences, polynucleotide sequences, or pilus constructs. One preferred use of bioinformatic screening methods g is for selecting bacterial communities that enrich for peptide sequences, polynucleotide sequences or slit structures. Bioinformatic searches provide a convincing method for detecting strains that have sequences that are in public sequence collections but have never been described or characterized by an expert.

2828

Bioinformaattiset haut suoritetaan käyttämällä algoritmeja, kuten BLASTia (Altschul S. F. et ai. 1997, Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389 - 3402) tai FASTAa (Pearson WR, 1990, Methods Enzymol 183: 63 - 98) (edullisesti käytetään oletusparametrejä). BLAST-ja FASTA-algoritmeja käytetään valittu-5 jen sekvenssien vertaamiseen muiden sekvenssien ryhmään ja tilastollisesti merkittävien osumien raportoimiseen. Peptidisekvenssejä, polynukleotidisek-venssejä tai pilusrakenteita etsitään esimerkiksi seuraavista julkisista sekvens-sikokoelmista, jotka tarjoaa National Center for Biotechnology Information (NCBI): ei-redundantit proteiinisekvenssit, ympäristönäytteet, kokogenomin 10 osittaissekvenssit ja genomitutkimuksen sekvenssit; tai edullisesti yksityisestä sekvenssikokoelmasta, joka saadaan aikaan esimerkiksi käyttämällä high through put -sekvensointimenetelmiä.Bioinformatic searches are performed using algorithms such as BLAST (Altschul SF et al. 1997, Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402) or FASTA (Pearson WR, 1990, Methods Enzymol 183: 63-98) (default parameters are used). . BLAST and FASTA algorithms are used to compare selected sequences to a group of other sequences and to report statistically significant hits. Peptide sequences, polynucleotide sequences, or slit structures are searched, for example, in the following public sequence collections provided by the National Center for Biotechnology Information (NCBI): non-redundant protein sequences, environmental samples, whole genome 10 sequences, and genomic research sequences; or preferably from a private sequence collection obtained, for example, using high through put sequencing methods.

Sekvenssi-id-nro:iden 1 - 8 peptidirakenteita tai niiden fragmentteja käytetään seulomaan peptidien huomattavia täsmäyksiä suorittamalla tavan-15 omainen Blast-haku NCBI:n ei-redundanttien proteiinisekvenssien kokoelmassa. Kun löydetään merkittävä peptiditäsmäys, tätä kiinnostuksen kohteena olevaa peptidiä koodaava bakteeri luokitellaan putatiiviseksi probioottikannaksi tai putatiiviseksi patogeeniksi, jota vastaan peptidi tehoaa.Peptide constructs of SEQ ID NOs: 1-8, or fragments thereof, are used to screen for significant peptide alignments by performing a standard Blast search of the NCBI non-redundant protein sequence library. When a significant peptide match is found, the bacterium encoding this peptide of interest is classified as a putative probiotic strain or putative pathogen against which the peptide is active.

Esimerkki 5. Atomivoimamikroskopia, joka osoittaa LGG-piluksia 20 LGG-kantaa kasvatettiin MRS (LabM) -agarmaljalla 37 °C:ssa 20 tunnin ajan anaerobisesti. Bakteerisolut laimennettiin steriilin veteen, kiinnitettiin Mica-levyyn, ja ne ilmakuivattiin. Nanoscope lila Multimode AFM (atomi-voimamikroskooppi, Digital Instruments, Santa Barbara) -mikroskoopilla ja J-skannerilla saatiin bakteereista sekä topografisia että faasikontrastikuvia (kuvio 25 4).Example 5. Atomic force microscopy showing LGG piles 20 LGG strains were grown on an MRS (LabM) agar plate at 37 ° C for 20 hours anaerobically. The bacterial cells were diluted in sterile water, fixed on a Mica plate and air-dried. Nanoscope purple Multimode AFM (Atomic Power Microscope, Digital Instruments, Santa Barbara) microscope and J scanner provided both topographic and phase contrast images of the bacteria (Fig. 25 4).

5 Esimerkki 6. Rekombinanttien LGG-proteiinien sitoutuminen ihmisen oo suolistolimaan määritettynä ei-kvantitatiiviselta ELISA-analyysilla o Rekombinanttien heksahistidiinimerkittyjen SpaA-, SpaB-, SpaC-, x SpaD-, SpaF-piliiniproteiinien sitoutuminen ihmisen suoliston limaan määritet-Example 6: Binding of recombinant LGG proteins to human oo intestinal mucosa as determined by non-quantitative ELISA analysis o Binding of recombinant hexahistidine labeled SpaA, SpaB, SpaC, x SpaD, SpaF pilin proteins to human intestinal mucosa

CECE

30 tiin in vitro. Liman lähteenä käytettiin ihmisen resektoitua suolistokudosta. Ih- g misen resektoidun suolistokudoksen käytön hyväksyi Turun yliopiston ja Turun § yliopistollisen keskussairaalan (molemmat Turussa, Suomessa) yhteinen eetti- o o nen toimikunta, ja potilailta saatiin tietoihin perustuva kirjallinen suostumus.30 in vitro. The source of mucus was resected human intestinal tissue. The use of resected human intestinal tissue was approved by the joint ethical committee of the University of Turku and the Turku § University Central Hospital (both in Turku, Finland), and informed informed written consent was obtained.

Lima eristettiin kudoksen terveestä osasta, joka saatiin paksusuolen leikkaus-35 ta, esimerkiksi kolorektaalisen syövän vuoksi, läpikäyviltä potilailta. Suolistoku- 29 doksen prosessointi ja liman eristäminen tehtiin aikaisemmin kuvatulla tavalla (Vesterlund S. et ai. 2005; Res Microbiol. 156 (2): 238 - 244; J Microbiol Methods 60 (2): 225 - 233). Lima immobilisoitiin passiivisesti polystyreenimikrotiit-terilevylle (Maxisorp, Nunc, Tanska) inkuboimalla sitä yli yön 4 °C:ssa. Kaivot 5 pestiin kolme kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS; pH 7,2) ja Nokattiin 0,5-prosenttisella naudan seerumialbumiinilla (Sigma A7030) PBS:ssä 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. Blokkausliuos poistettiin, ja lisättiin 0,5 tai 0,05 nmol heksahistidiinimerkittyjä piliiniproteiineja BSA-PBS:ssä, mitä seurasi 1 tunnin inkubointi 37 °C:ssa. Inkuboinnin ja pesujen jälkeen sitoutuneet proteii-10 nit havaittiin entsyymisidosimmunoadsorbenttianalyysillä. Piliiniproteiinit havaittiin hiiren Tetra-His -vasta-aineella (Qiagen, 34670) ja vuohen antihiiri-lgG Fab -spesifisellä alkalisella fosfataasikonjugaatilla (Sigma, A1293), jota käytettiin sekundaarisena vasta-aineena. Primaarille ja vastaavasti sekundaariselle vasta-aineelle käytettiin laimennuksia 1:2000 ja 1:5000 (v/v). Substraatti 4-15 nitrofenyylifosfaattidinatriumsuolaa (pNPP, Sigma, A7030) dietanoliamiini-MgCI-puskurissa (Reagena, 170057, Suomi) lisättiin pitoisuutena 2 mg/ml, ja värin kehittymistä mitattiin 1 tunnin jälkeen 405 nnrssa. Tulokset ovat keskiarvoja ± standardipoikkeama kolmesta rinnakkaisesta mittauksesta (kuviot 5a - b).Mucus isolated from a healthy section of tissue obtained from surgery of the colon-35 of, for example, colorectal cancer, therefore, patients undergoing. Intestinal tissue processing and mucus isolation were performed as previously described (Vesterlund S. et al. 2005; Res Microbiol. 156 (2): 238-244; J Microbiol Methods 60 (2): 225-233). The mucus was passively immobilized on a polystyrene microtiter plate (Maxisorp, Nunc, Denmark) by incubating overnight at 4 ° C. Wells were washed three times with phosphate buffered saline (PBS; pH 7.2) and knocked in 0.5% bovine serum albumin (Sigma A7030) in PBS for 1 hour at room temperature. The blocking solution was removed and 0.5 or 0.05 nmol of hexahistidine-labeled pilin proteins in BSA-PBS was added, followed by incubation for 1 hour at 37 ° C. After incubation and washing, bound protein 10 was detected by enzyme-linked immunoadsorption assay. Pilin proteins were detected with mouse Tetra-His antibody (Qiagen, 34670) and goat anti-mouse IgG Fab specific alkaline phosphatase conjugate (Sigma, A1293) used as a secondary antibody. Dilutions of 1: 2000 and 1: 5000 (v / v) were used for primary and secondary antibody, respectively. Substrate 4-15 nitrophenyl phosphate disodium salt (pNPP, Sigma, A7030) in diethanolamine-MgCl buffer (Reagena, 170057, Finland) was added at a concentration of 2 mg / ml and color development was measured after 1 hour at 405 nm. Results are means ± standard deviation of three replicate measurements (Figures 5a - b).

20 Esimerkki 7. Solunseinämiin liittyneiden pilusproteiinien eristäminen ja western blotExample 7. Isolation and Western Blot of Pilot Proteins Associated with Cell Walls

Tuoreita 10 tunnin LGG-ja LC705-solujen (negatiivinen kontrolli) viljelyksiä ympättiin (1 %) mTSB-alustaan (15 g/l TSB-alustaa, BD Biosciences), jota oli rikastettu 20 g/l baktopeptonilla (Difco), tai MRS-alustaan, johon oli li-25 sätty 0,6 % häränsappea (Sigma) ja viljeltiin 37 °C:ssa. Kasvua seurattiin mit- taamalla optinen tiheys (OD600), ja stationäärivaiheessa olevia soluja kerättiin o ™ sentrifugoinnilla.Fresh 10-hour cultures of LGG and LC705 cells (negative control) were seeded (1%) in mTSB medium (15 g / L TSB medium, BD Biosciences) enriched with 20 g / L Bactopeptone (Difco) or MRS. medium supplemented with 0.6% bovine bile (Sigma) li-25 and cultured at 37 ° C. Growth was monitored by measuring optical density (OD600), and cells in the stationary phase were harvested by o ™ centrifugation.

o Bakteeriseinämien fraktiointi tehtiin olennaisesti kuten on kuvattu i ° muualla (Ävall-Jääskeläinen S. et ai. 2003, Appi Environ Microbiol 69: 2230 - χ 30 2236). Lyhyesti ilmaistuna, bakteerit (108cfu) pestiin kerran PBS:llä ja homo genoitiin sekoittamalla kolme kertaa kahden minuutin ajan lasihelmien kanssa g solumyllyssä (Buhler Vibrogen-ZellmOhle). Bakteerihomogenaatit suspendoitiin g uudelleen 500 ^:aan PBS:ää ja sentrifugoitiin viisi minuuttia voimakkuudel- ° lal 000 g. Supernatantti sentrifugoitiin 16 000 g voimakkuudella 30 minuutin 35 ajan +4 °C:ssa soluseinämien kokoamiseksi. Tuloksena olevat pelletit suspendoitiin uudelleen 50 μΙ^θη 50 mM Tris-CI:ää (pH 8,0), jota täydennettiin 30 5 mM:lla MgCl2:a, 5 mM:lla CaCl2:ta, 10 mg/ml:lla lysotsyymiä ja 42 U/ml:Ila mutanolysiiniä. Uudelleen suspendoituja soluseinämäpellettejä inkuboitiin 3 tuntia 37 °C:ssa soluseinämään liittyneiden polypeptidien vapauttamiseksi.Fractionation of bacterial walls was performed essentially as described elsewhere (Ävall-Jääskeläinen S. et al. 2003, Appl. Environ Microbiol 69: 2230 - χ 30 2236). Briefly, bacteria (10 8 cfu) were washed once with PBS and homogenized by mixing three times for two minutes with glass beads in a g cell mill (Buhler Vibrogen-ZellmOhle). The bacterial homogenates were resuspended in g in 500 µl PBS and centrifuged for five minutes at 000 g. The supernatant was centrifuged at 16,000 g for 30 minutes at +4 ° C to assemble the cell walls. The resulting pellets were resuspended in 50 μΙ ^ θη 50 mM Tris-Cl (pH 8.0) supplemented with 5 mM MgCl 2, 5 mM CaCl 2, 10 mg / ml lysozyme and 42 U / ml mutanolysin. The resuspended cell wall pellets were incubated for 3 hours at 37 ° C to release the polypeptides attached to the cell wall.

Entsymaattisesti käsitellyt soluseinämäfraktiot ajettiin 4 - 15-pro-5 senttisessa gradienttigeelissä (Bio-Rad) ja siirrettiin Immobilon-P PVDF -mem-braanille (Millipore). Membraanilla tehtiin Western-analyysi ECL AdvanceTM Western Blotting Detection Kit -reagensseilla (Amersham) valmistajan ohjeiden mukaan. SpaA- SpaB- ja SpaC-piliiniproteiinispesifisiä polyklonaalisia primaa-rivasta-aineita laimennettiin 1:25 000, ja Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)- HRP-10 Conjugate -sekundaarivasta-ainetta (Bio-Rad) laimennettiin 1:100 000.Enzymatically treated cell wall fractions were run on a 4-15% -5% gradient gel (Bio-Rad) and transferred to Immobilon-P PVDF membrane (Millipore). The membrane was subjected to Western analysis with ECL Advance ™ Western Blotting Detection Kit (Amersham) according to the manufacturer's instructions. SpaA-SpaB and SpaC pilin-specific polyclonal primary antibodies were diluted 1:25,000, and Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) - HRP-10 Conjugate secondary antibody (Bio-Rad) was diluted 1: 100,000. .

Grampositiivisissa bakteereissa olevat pilukset muodostuvat pilii-nialayksiköistä, jotka ovat kovalenttisesti sitoutuneet toisiinsa. Monomeeriset piliinialayksiköt lisätään kasvaviin piluksiin yksi kerrallaan sortaasien toiminnan avulla, ja tämän seurauksena tiettynä ajankohtana kukin yksittäinen solu kan-15 taa eripituisia piluksia pinnallaan (Scott J. R. ja Zahner D. 2006, Mol Microbiol 62:320 - 330). Näin ollen klassinen tapa osoittaa pilusten olemassaolo on kohdistaa mutanolysiini-/lysotsyymikäsiteltyihin soluseinämäfraktioihin Western-analyysi: jos piluksia on läsnä, havaitaan suurimolekyylinen tikapuu (HMW), ja monissa tapauksissa havaitaan myös piliinimonomeerejä (Scott J. R. ja Zahner 20 D. 2006, Mol Microbiol 62: 320 - 330). SpaA:ta ja SpaC:tä sisältävien pilusten läsnäolo LGG:ssä ilmenee selvästi kuvioista 6a ja 6b, koska sekä monomeeriset SpaA- ja SpaC-piliinialayksiköt että HMW:t voidaan tunnistaa LGG-soluseinämäekstrakteista käyttäen SpaA- ja SpaC-spesifisiä vasta-aineita, kun taas LC705-soluista ei löydy SpaA- ja SpaC-osia. Altistusaika, joka tarvittiin 25 kemiluminesenssi- signaalin rekisteröimiseksi SpaC-blotista, oli 60 sekuntia, kun taas 1 sekunnin altistusaika oli riittävä SpaA:lle, mikä implikoi, että SpaA:ta ^ oli läsnä suurempina määrinä piluksessa kuin SpaC:tä. Tämä ero suhteellisis- ™ sa määrissä saattaa osoittaa, että SpaA on varren muodostava piliinialayksik- 00 9 kö, kun taas SpaC voisi toimia piluksen kärkiadhesiinina. On myös huomatta- ° 30 va, että piluksia esiintyy LGG-soluissa, joita kasvatetaan sapelia täydennetys- sä väliaineessa, mikä osoittaa, että piluksia saattaisi ilmentyä ihmisen maha-The pili in gram-positive bacteria consist of pilin subunits which are covalently bound to each other. The monomeric pilin subunits are added to the growing piles one by one by the action of the sorbs, and as a result, at a given time, each individual cell carries piles of different lengths on its surface (Scott J.R. and Zahner D. 2006, Mol Microbiol 62: 320-330). Thus, a classic way of demonstrating the existence of pili is to target mutanolysin / lysozyme-treated cell wall fractions by Western analysis: if pili is present, a high molecular weight ladder (HMW) is detected, and in many cases pilin monomers are also detected (Scott JR and Zahner 20 D. 2006, Mol Microbi 320-330). The presence of SpaA and SpaC-containing piles in LGG is clearly evident from Figures 6a and 6b, since both monomeric SpaA and SpaC pilin subunits and HMWs can be identified in LGG cell wall extracts using SpaA and SpaC specific antibodies when whereas LC705 cells do not contain SpaA and SpaC moieties. The exposure time required to record 25 chemiluminescence signals from the SpaC blot was 60 seconds, while the 1 second exposure time was sufficient for SpaA, implying that SpaA was present in greater amounts in the well than SpaC. This difference in relative amounts may indicate that SpaA is the pilin subunit forming the stem, whereas SpaC could serve as the apex of the pilus. It is also noticeable that piles are present in LGG cells grown in sapwood-supplemented medium, indicating that the piles could be expressed in the human stomach.

CLCL

suolikanavasssa.suolikanavasssa.

COC/O

o oo o

CDCD

o o cv 31o o cv 31

Esimerkki 8. Uusien probioottisten pilusrakenteisten kantojen seulominen PCR:lläExample 8. Screening of New Probiotic Pilot Structure Strains by PCR

Laktobasilleja kasvatetaan anearobisesti MRS-liemessä +37 °C:ssa 10 tunnin ajan. Genominen DNA eristetään seuraavasti. 1 ml vil-5 jelmää sentrifugoidaan 14 000 g:ssa 2 minuutin ajan. Kootut solut suspendoi-daan uudelleen 480 μΙ^η 50 mM EDTA:ta, 100 μΙ^βη 50 mg/ml lysotsyymiä (Amresco, Solon, OH, USA), ja lisätään 20 μΙ^ 50 U/μΙ mutanolysiiniä (Sigma), ja seosta inkuboidaan 37 °C:ssa 1 tunnin ajan. Seosta sentrifugoidaan 2 minuutin ajan 14 000 g:ssa, supernatantti heitetään pois, ja bakteeripelletti ero-10 tetaan Wizard® Genomic DNA Purification Kit -reagenssien (Promega) avulla valmistajan ohjeiden mukaan. Puhdistettu DNA suspendoidaan 200 μΐιβθη Tris-EDTA (TE) -puskuria. Noin 200 ng genomista DNA:ta käytetään templaat-tina PCR-reaktiossa. PCR suoritetaan käyttäen Dynazyme-polymeraasia (Finnzymes, Espoo, Suomi) ja oligunukleotidialukkeita, jotka perustuvat sek-15 vensseihin GG00442, GG00443, GG00444 ja GG02370-, GG02371-, GG02372-geeneistä. PCR-reaktio suoritetaan PCT-200-laitteella (MJ Research, Waltham, MA, USA), ja se sisältää 10 mM Tris-HCL:ää, 1,5 mM MgCl2:ta, 50 mM KCI:a ja 0,1 % Triton-X 100:a (pH 8,8). Alukkeita käytetään 1 μΜ:η ja deoksinukleotideja 200 μΜ:η pitoisuuksina. Alkudenaturointi tapah-20 tuu 94 °C:ssa 2 minuutin ajan. Ensimmäinen sykli on 1 min kukin 95 °C:ssa, 65 °C:ssa ja 72 °C:ssa, seuraavat viisi sykliä ovat 1 min kukin 95 °C:ssa, 60 °C:ssa ja 72 °C:ssa, ja viimeiset 25 sykliä ovat 1 min 95 °C:ssa, 55 °C:ssa ja 72 °C:ssa. Syklien lopettamiseksi reaktioseosta pidetään 72 °C:ssa 5 minuutin ajan ja 4 °C:ssa 15 minuutin ajan. Monistetut DNA-nauhat erotetaan 0,7-25 prosenttisessa agaroosigeelissä geelielektrofereesilla.Lactobacilli are grown anearobically in MRS broth at +37 ° C for 10 hours. Genomic DNA is isolated as follows. 1 ml of the culture medium is centrifuged at 14,000 g for 2 minutes. The harvested cells are resuspended in 480 μΙ ^ η 50 mM EDTA, 100 μΙ ^ η 50 mg / ml lysozyme (Amresco, Solon, OH, USA), and 20 μΙ ^ 50 U / μΙ mutanolysin (Sigma) is added, and the mixture is incubated at 37 ° C for 1 hour. The mixture is centrifuged for 2 minutes at 14,000 g, the supernatant discarded, and the bacterial pellet separated by Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega) according to the manufacturer's instructions. The purified DNA is suspended in 200 μΐιβθη Tris-EDTA (TE) buffer. Approximately 200 ng of genomic DNA is used as a template in the PCR reaction. PCR is performed using Dynazyme polymerase (Finnzymes, Espoo, Finland) and oligunucleotide primers based on the sequences GG00442, GG00443, GG00444 and GG02370, GG02371, GG02372. The PCR reaction is performed on a PCT-200 (MJ Research, Waltham, MA, USA) and contains 10 mM Tris-HCL, 1.5 mM MgCl 2, 50 mM KCl and 0.1% Triton. -X 100 (pH 8.8). Primers are used at 1 μΜ and deoxynucleotides at 200 μΜ. The initial denaturation occurs at 94 ° C for 2 minutes. The first cycle is 1 min each at 95 ° C, 65 ° C and 72 ° C, the next five cycles are 1 min each at 95 ° C, 60 ° C and 72 ° C, and the last 25 cycles are 1 min at 95 ° C, 55 ° C and 72 ° C. To terminate the cycles, the reaction mixture is maintained at 72 ° C for 5 minutes and at 4 ° C for 15 minutes. The amplified DNA bands are separated on a 0.7-25% agarose gel by gel electrophoresis.

δδ

(M(M

COC/O

cp ocp o

XX

cccc

CLCL

COC/O

o 0 01 o oo 0 01 o o

(M(M

cc

COC/O

ro 4-» c 3 3 U) c 0) o V) ro ^ o 0 0 o rt hro 4- »c 3 3 U) c 0) o V) ro ^ o 0 0 o rt h

en rf! 0 H rt Hen rf! 0 H rt H

«S c o h c <ϋ o«S c o h c <ϋ o

0) O H 0 O O O0) O H 0 O O O

(ö O H H O rf) H(ö O H H O rf) H

> rf) rt! H O O O> rf) rt! H O O O

ω O d, H 0 rt rf!ω O d, H 0 rt rf!

S O O H rf) rf) OS O O H rf) rf) O

3 rf) rf) CJ 0 H H3 rf) rf) CJ 0 H H

— O fl) O O H rf) ro 0 o h o a) o- O fl) O O H rf) ro 0 o h o a) o

Ή 0 O O H rf) HΉ 0 O O H rf) H

~ H 0 0 H 0 H~ H 0 0 H 0 H

O E—* E—* E—i E—i E—i E—Oh E— * E— * E —i E —i E —i E—

S rf) 0 O 0 0 HS rf) 0 O 0 0 H

73 Eh H H 0 O rf) Ϊ 0 H C rf) U 0 2 En H 0 0 0 0 £ O 0 0 rf) 0 0 O Eh 0 0 rt) 0 073 Eh H H 0 O rf) Ϊ 0 H C rf) U 0 2 En H 0 0 0 0 £ O 0 0 rf) 0 0 O Eh 0 0 rf) 0 0

O [ I I I I IO [I I I I I

CN = _CN = _

CO O LO LO LO LO LO LOCO O LO LO LO LO LO LO LO

c =5 U 0 0 rt) O 0 g- 0 rf) 0 0 rf) 0 C 0 0 0 Eh 0 0 ® rf) EH 0 rf) 0 rf) jö 0 0 rf) rf) rf) 0 φ 0 rf) 0 0 rf! 0c = 5 U 0 0 rt) O 0 g- 0 r f) 0 0 r f) 0 C 0 0 0 Eh 0 0 ® r f) E H 0 r f) 0 r f) j o 0 0 r f) r f) r f) 0 φ 0 r f ) 0 0 rf! 0

0 En rf) 0 0 H0 En rf) 0 0 H

S Eh H 0 rf) 0 0S Eh H 0 rf) 0 0

f rf) 0 rf) Eh rt) EHf rf) 0 rf) Eh rt) EH

— rf) 0 rf) Eh rt) rf)- rf) 0 rf) Eh rt) rf)

T- « 0 CJ O 0 0 OT- «0 CJ O 0 0 O

T- ^ Eh Eh 0 Eh 0 0 O ~ Eh 0 0 0 0 rf) (M Q00EH000 , Φ 0 0H000T- ^ Eh Eh 0 Eh 0 0 O ~ Eh 0 0 0 0 rf) (M Q00EH000, Φ 0 0H000

03 73 0 0 rt O rf) O03 73 0 0 rt O rf) O

O 0 0 rt rt 0 OO 0 0 rt rt 0 O

V 2 Eh 0 rf 0 0 rt) t-, 2 0 0 0 0 rf) 0 — 0^000^0 ^ ra i i i i i iV 2 Eh 0 rf 0 0 rt) t-, 2 0 0 0 0 rf) 0 - 0 ^ 000 ^ 0 ^ ra i i i i i i i

O LO LO LO LO LO LOO LO LO LO LO LO LO LO

CLCL

co cm ^ o ~ £Tco cm ^ o ~ £ T

o n- n- n- 0 0 o t Ί- t n n oo n- n- n- 0 0 o t Ί- t n n o

O) CM O O O CM CM CNO) CM O O O CM CM CN

o _ o o o O O Oo _ o o o O O O O

o 9 o O o O o CDo 9 o O o O o CD

«m 2 5 c ccqOOujll 3 9? ro ro ro ro ro ro ro o 0.0.0.0.0.0.«M 2 5 c ccqOOujll 3 9? ro ro ro ro ro ro ro o 0.0.0.0.0.0.

I- O co co co co co co 33I- O co co co co co 33 co

Taulukossa 2 esitetään esimerkki alukkeista pilusten geenien monistusta varten, mutta alukkeet eivät ole rajoittuneet näihin. Monistettujen PCR-tuotteiden, jotka käyttävät L. rhamnosus GG DNA:ta templaattina ja taulukon 2 alukkeita, koot ovat 780 bp, 612 bp ja 801 bp SpaA:lle, ,SpaB:lle ja SpaC:lle, 5 vastaavasti sekä SpaD:lle, SpaE:lle ja SpaF:lle 688 bp, 705 bp ja 799 bp.Table 2 provides an example of primers for amplification of pilus genes but is not limited to these. Amplified PCR products using L. rhamnosus GG DNA as template and the primers in Table 2 have sizes of 780 bp, 612 bp and 801 bp for SpaA,, SpaB and SpaC, 5 and SpaD, respectively. 688 bp, 705 bp and 799 bp for SpaE and SpaF.

Esimerkki 9. Uusien pilusgeenillisten probioottien seulonta Southern-hybridisaatiollaExample 9. Screening of new pilus genetic probiotics by Southern hybridization

Uusia probioottisia kantoja, joilla on pilusrakenteet, seulotaan Sout-hern-hybridisaatiolla käyttäen esimerkin 8 LGG-monistustuotteita koettimina. 10 Hybridisaatio-olosuhteet voidaan säätää tiukoiksi, mikä mahdollistaa koettimen hybridisoinnin vain identtisille sekvensseille, tai löyhemmiksi, mikä mahdollistaa jonkin verran sekvenssipoikkeavuutta. SpaA:n, B:n, C:n, D:n, E:n ja F:n PCR-monistustuotteet puhdistetaan alhaisen sulamispisteen NuSieve-agaroo-sissa (FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA) ja leimataan DIG-leimalla 15 (Roche Diagnostics). Bakteerikantojen kokonais-DNA pilkotaan EcoRhllä, ja tuloksena saatavat fragmentit erotetaan 0,7-prosenttisessa agaroosigeelissä. Agaroosissa olevat DNA-fragmentit blotataan nailonmembraaniin ja hybridisoi-daan DIG-järjestelmän standardimenettelyn mukaan. Tiukka hybridisaatio suoritetaan 68 °C:ssa, pesut ovat kaksi kertaa 2 x SSC - 0,1 % SDS huoneen- 20 lämmössä ja kaksi kertaa 0,1 x SSC - 0,1 % SDS 15 minuutin ajan 68 °C:ssa.Novel probiotic strains with slit structures are screened by Sout-hern hybridization using the LGG amplification products of Example 8 as probes. The hybridization conditions can be adjusted to be stringent, allowing the probe to hybridize only to identical sequences, or to be lighter, allowing some sequence mismatch. The PCR amplification products of SpaA, B, C, D, E, and F are purified on low melting point NuSieve agarose (FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA) and labeled with DIG. (Roche Diagnostics). Total bacterial strains DNA is digested with Eco RI and the resulting fragments are separated on a 0.7% agarose gel. DNA fragments in agarose are blotted onto a nylon membrane and hybridized according to the standard procedure of the DIG system. Tight hybridization is performed at 68 ° C, washing twice with 2 x SSC - 0.1% SDS at room temperature and twice with 0.1 x SSC - 0.1% SDS for 15 minutes at 68 ° C.

Löyhempi hybridisaatio suoritetaan 60 °C:ssa, ja kaksi viimeistä pesua ovat 0,5 x SSC - 0,1 % SDS 50 °C:ssa 15 minuutin ajan. Hybridisaatio havaitaan alkaliseen fosfataasiin konjugoidun vasta-aineen ja NBT/BCIP-värireaktion avulla (DIG-järjestelmä, Roche).Looser hybridization is performed at 60 ° C and the last two washes are 0.5 x SSC - 0.1% SDS at 50 ° C for 15 minutes. Hybridization is detected by antibody conjugated to alkaline phosphatase and NBT / BCIP color reaction (DIG system, Roche).

-r- 25 Esimerkki 10. Immunomodulaatio puhdistetuilla LGG-pilusproteiineilla c3 Ihmisen makrofageja eristetään terveiden vapaaehtoisten verestä i § (buffy coat -fraktio), kuten on aikaisemmin dokumentoitu (Miettinen M. et ai.EXAMPLE 10. Immunomodulation with Purified LGG Pilot Proteins c3 Human macrophages are isolated from the blood of healthy volunteers as described previously (Buffett coat fraction) (Miettinen M. et al.

o 2000, J Immunol 164: 3733 - 3740; Miettinen M. et ai. 2008, J Leuk Biol 84: x 1092 - 1100). Olennaisesti tämä tehdään käyttämällä 4 terveestä verenluovut- 30 tajasta (jotka hankkii Suomen Punaisen Ristin Veripalvelu, Helsinki Fl) peräisin g olevia äskettäin luovutettuja, paljon leukosyyttejä sisältäviä buffy coat -ker- § roksia ja eristämällä perifeerisiä mononukleaarisia verisoluja (PBMC) Ficoll-o 2000, J Immunol 164: 3733-3740; Miettinen M. et al. 2008, J Leuk Biol 84: x 1092 - 1100). Essentially, this is done using recently donated high-leukocyte-rich buffy coat layers from 4 healthy blood donors (purchased by the Finnish Red Cross Blood Service, Helsinki Fl) and isolating peripheral mononuclear blood cells (PBMCs) with Ficoll's.

Oo

° Paque-gradienttisentrifugoinnilla (Amersham Pharmacia Biotech, Upsala SE).° by Paque gradient centrifugation (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala SE).

Monosyytit puhdistetaan PBMC:stä adheroimalla ne kuusikaivoisiin muovile-35 vyihin (Falcon Becton Dickinson, Franklin Lakes NJ, US) ja viljelemällä niitä 7 34 päivää makrofagi-seerumivapaassa alustassa (Gibco Invitrogen, Grand Island NY, USA), jossa on 10 ng/ml ihmisen rekombinanttia (rh) GM-CSF:ää (Leuco-max, Schering-Plough, Innishannon, IRL), makrofagien aikaansaamiseksi. Makrofageja inkuboidaan pitoisuudessa noin 4 miljoonaa solua kaivoa kohti 6-5 kaivoisessa mikrotiitterilevyssä ja stimuloidaan vastaavalla määrällä eläviä bakteereja (LGG ja Streptococcus pyogenes T1M1) tai suunnilleen 3, 100, 3 000 tai 10 000 jne. fmoUla puhdistettuja His-Tag -merkittyjä LGG-proteiineja SpaA ja SpaC. 6 tunnin ja 24 tunnin inkubaation jälkeen määritetään im-muunimarkkerien määrien muutos tai signalointireittien aktivaatio tai reseptorin 10 ilmentyminen, kuten on kuvattu aikaisemmin (Miettinen M. et ai. 1996, Infec immunol 64: 5403 - 5405; Miettinen M. et ai. 2000, J Immunol 164: 3733 -3740; Miettinen M. et ai. 2008, J Leuk Biol 84: 1092 - 1100).Monocytes are purified from PBMC by adhering to 6-well plastic 35-wells (Falcon Becton Dickinson, Franklin Lakes NJ, US) and culturing for 7 34 days in 10 ng / ml macrophage serum-free medium (Gibco Invitrogen, Grand Island NY, USA). recombinant human (rh) GM-CSF (Leuco-max, Schering-Plow, Innishannon, IRL) to induce macrophages. Macrophages are incubated at a concentration of about 4 million cells per well in 6-5 well microtiter plates and stimulated with an equivalent amount of live bacteria (LGG and Streptococcus pyogenes T1M1) or approximately 3, 100, 3,000 or 10,000 etc. fmoU-purified His-Tag-tagged LGGs SpaA and SpaC. After 6 hours and 24 hours incubation, changes in the levels of immune markers or activation of signaling pathways or expression of the receptor 10 are assayed as described previously (Miettinen M. et al. 1996, Infec Immunol 64: 5403-5405; Miettinen M. et al. 2000, J Immunol 164: 3733-3740; Miettinen M. et al. 2008, J Leuk Biol 84: 1092-1100.

Tyypillisesti probioottisen LGG:n ja patogeenisen S. pyogenes T1M1:n solut osoittavat immunomodulatorista aktiivisuutta ja indusoivat spesi-15 fisen Th1:n kaltaisen vasteen PBMC:issä tai makrofageissa (Miettinen M. et ai. 2000, J Immunol 164: 3733 - 3740; Veckman V. et ai. 2003, J Leuk Biol 74: 395 - 402). Yllättävästi, puhdistetut LGG-pilusproteiinit indusoivat myös vasteen makrofageissa ja osoittavat näin funktionaalisuutensa immunomodulaati-ossa. Lisäksi nämä kokeet osoittavat, että LGG-pilusproteiinit signaloivat ihmi-20 sen isäntäsoluille.Typically, cells of probiotic LGG and pathogenic S. pyogenes T1M1 show immunomodulatory activity and induce a specific Th1-like response in PBMCs or macrophages (Miettinen M. et al. 2000, J Immunol 164: 3733-3740; Veckman V. et al. 2003, J Leuk Biol 74: 395-402). Surprisingly, purified LGG pilus proteins also induce a response in macrophages, thus demonstrating their functionality in the immunomodulation section. In addition, these experiments demonstrate that LGG pilin proteins signal human-20 to its host cells.

Esimerkki 11. Kilpailuanalyysi LGG-pilusproteiineillaExample 11. Competition Analysis with LGG Pilot Proteins

Suolistokudoksen käsittelyjä liman eristäminen tehtiin esimerkissä 6 kuvatulla tavalla.Intestinal tissue treatments for mucus isolation were performed as described in Example 6.

Kilpailuanalyysi suoritetaan Vesterlund S:n et ai. mukaan, 2006 25 (Microbiology 152 (6): 1819 - 1826). Lima (Sigma) 0,5 mg/ml:n konsentraatios- ^ sa immobilisoidaan passiivisesti polystyreenimikrotiitterilevylle (Maxisorp, ^ Nunc, Tanska) yli yön kestävällä inkubaatiolla 4 °C:ssa. Kaivot pestään kolme 00 o kertaa fosfaatti-puskuroidulla suolaliuoksella (PBS; pH 7,2) ja blokataan 0,5- ° prosenttisella (w/v) naudan seerumialbumiinilla (Sigma A7030) PBS:ssä 1 tun- £ 30 nin ajan huoneenlämmössä. Blokkausliuos poistetaan ja 5,0 tai 0,05 nmol his-The competition analysis is performed by Vesterlund S et al. , 2006 25 (Microbiology 152 (6): 1819-1826). Mucus (Sigma) at 0.5 mg / ml is passively immobilized on a polystyrene microtiter plate (Maxisorp, Nunc, Denmark) by overnight incubation at 4 ° C. The wells are washed three times with phosphate buffered saline (PBS; pH 7.2) and blocked with 0.5% (w / v) bovine serum albumin (Sigma A7030) in PBS for 1 hour at room temperature. The blocking solution is removed and 5.0 or 0.05 nmol of

CLCL

tidiinimerkittyä piliiniproteiinia tai pilusrakennetta BSA-PBS:ssä lisätään, mitä o seuraa 1 tunnin inkubaatio 37 °C:ssa. Sitoutumattomat pilusproteiinit tai pilus- o § rakenteet pestään pois edellä kuvatulla tavalla. Patogeenisiä bakteerisoluja ° lisätään kaivoihin 100 μΙ, kussakin kokeessa käytetään neljää rinnakkaista kai- 35 voa. Bakteerien annetaan tarttua 1 tunnin ajan 37 °C:ssa, ja kaivot pestään kolme kertaa 250 μΙ:Ιΐ3 PBS:ää tarttumattomien bakteerien poistamiseksi. Li- 35 maan sitoutuneet bakteerit vapautetaan, ja genominen DNA erotetaan Wizard Genomic -välineiden (Promega) avulla. Näytteessä olevien bakteerien määrä määritetään kvantitaviisella PCR:llä käyttäen lajispesifisiä alukkeita ja SYBR Green havaitsemismenetelmää. Bakteerien adheesiosuhde (%) lasketaan ver-5 taamalla tarttuneiden bakteerien määrää lisättyjen bakteerien määrään. LGG pilusproteiinit ja pilusrakenteet estävät patogeenisen bakteerin adheesion limaan.thidine-labeled pilin protein or slit structure in BSA-PBS is added, followed by 1 hour incubation at 37 ° C. Unbound pilus proteins or pilus structures are washed away as described above. Pathogenic bacterial cells are added to the wells at 100 μΙ, four replicate wells are used in each experiment. The bacteria are allowed to adhere for 1 hour at 37 ° C and the wells are washed three times with 250 μΙΙ3 PBS to remove non-adherent bacteria. Bacteria bound to the glue are released and the genomic DNA is separated by Wizard Genomic (Promega). The number of bacteria in the sample is determined by quantitative PCR using species-specific primers and the SYBR Green detection method. The bacterial adhesion ratio (%) is calculated by comparing the number of infected bacteria with the number of bacteria added. LGG pilus proteins and pili structures prevent adhesion of the pathogenic bacterium to the mucus.

δδ

(M(M

i 00 o oi 00 o o

XX

enI do not

CLCL

00 o o σ> o o00 o o σ> o o

(M(M

Claims (37)

3636 1. Peptidi, tunnettu siitä, että se käsittää sekvenssin, jolla on ainakin 91 %:n sekvenssi-identtisyys sekvenssin SEQ ID NO:4 (GG00444) 5 kanssa ja joka on osa pilusrakennetta.A peptide, characterized in that it comprises a sequence having at least 91% sequence identity to SEQ ID NO: 4 (GG00444) 5, which is part of a slit structure. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi, tunnettu siitä, että se käsittää sekvenssin, jolla on ainakin 95 %:n sekvenssi-identtisyys sekvenssin SEQ ID NO:4 (GG00444) kanssa.A peptide according to claim 1, characterized in that it comprises a sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 4 (GG00444). 3. Pilusrakenne, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuk- 10 sen 1 tai 2 mukaisen ainakin yhden peptidin.Slit structure, characterized in that it comprises at least one peptide according to claim 1 or 2. 4. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen peptidi tai pilusrakenne, tunnettu siitä, että se on rekombinantti.A peptide or slit structure according to any one of the preceding claims, characterized in that it is recombinant. 5. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen peptidi tai pilusrakenne, tunnettu siitä, että se on peräisin bakteereista.Peptide or slit structure according to one of the preceding claims, characterized in that it is derived from bacteria. 6. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen peptidi tai pi lusrakenne, tun nettu siitä, että se on peräisin Lactobacillus rhamnosuk-sesta.The peptide or lobe structure according to any one of the preceding claims, characterized in that it is derived from Lactobacillus rhamnosus. 7. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen peptidi tai pilusrakenne, tunnettu siitä, että se on peräisin Lactobacillus rhamnosusPeptide or slit structure according to one of the preceding claims, characterized in that it is derived from Lactobacillus rhamnosus 8. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen peptidi tai pilusrakenne, tunnettu siitä, että se sitoutuu maha-suolikanavaan.A peptide or slit structure according to any one of the preceding claims, characterized in that it binds to the gastrointestinal tract. 9. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen peptidi tai pilusrakenne, tunnettu siitä, että se sitoutuu limaan.A peptide or slit structure according to any one of the preceding claims, characterized in that it binds to mucus. 10. Tuote, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaati- ^ muksen 1-9 mukaisen ainakin yhden peptidin tai pilusrakenteen. oA product characterized in that it comprises at least one peptide or slit structure according to any one of claims 1-9. o 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen tuote, tunnettu siitä, että o se on elintarvike tai rehutuote.Product according to claim 10, characterized in that it is a food or feed product. ° 12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen tuote, tunnettu siitä, että x 30 se on elintarvike ja valitaan ryhmästä, joka muodostuu meijerituotteista, leipo motuotteista, suklaasta ja makeisista, sokeri- ja purukumituotteista, viljatuot-g teista, välipalatuotteista, marja- ja hedelmäpohjaisista tuotteista sekä juomiset ta/virvokkeista. oProduct according to Claim 11, characterized in that x 30 is a foodstuff selected from the group consisting of dairy products, bakery products, chocolate and confectionery, sugar and chewing gum products, cereal products, snack products, berry and fruit based products and drinking ta / refreshments. o ° 13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen tuote, tunnettu siitä, että 35 se valitaan ryhmästä, joka muodostuu maidosta, piimästä, jogurteista, juustoista ja levitteistä, maitojauheista, lastenruuasta, vauvanruuasta, 12-36-kuu- 37 kautisten lasten ruuasta, vauvojen äidinmaidonkorvikkeesta, mehuista ja keitoista.Product according to Claim 12, characterized in that it is selected from the group consisting of milk, milk, yoghurts, cheeses and spreads, milk powders, baby food, baby food, infant formulas, infant formulas, juices and soups. 14. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksen 1 - 9 mukaisen ainakin yhden peptidin tai pilusra- 5 kenteen.Pharmaceutical composition, characterized in that it comprises at least one peptide or a pilus structure according to any one of claims 1 to 9. 15. Tuote, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksen 1 - 9 mukaisen ainakin yhden peptidin tai pilusrakenteen, käytettäväksi lääkkeenä.A product characterized in that it comprises at least one peptide or slit structure according to any one of claims 1 to 9 for use as a medicament. 16. Tuote, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaati-10 muksen 1 - 9 mukaisen ainakin yhden peptidin tai pilusrakenteen, ripulin, kohonneen verenpaineen, verisuonitautien, allergioiden, syövän, atooppisten tautien, virustautien, infektiotautien, virtsatieinfektioiden, hengitystieinfektioiden, karieksen, ärtyvän suolen oireyhtymän, tulehduksellisen suolistosairauden, limakalvon tulehduksen, suolen läpäisevyyshäiriöiden, liikalihavuuden, metabo- 15 lisen oireyhtymän, oksidatiivisen stressin tai vatsakipujen estämiseen tai hoitamiseen.A product characterized in that it comprises at least one peptide or slit structure, diarrhea, hypertension, vascular diseases, allergies, cancer, atopic diseases, viral diseases, infectious diseases, urinary tract infections, respiratory tract infections, caries, bowel syndrome, inflammatory bowel disease, mucosal inflammation, intestinal läpäisevyyshäiriöiden, obesity, metabolic syndrome, 15 Lisen, oxidative stress or abdominal pain prevention or treatment. 17. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 9 mukaisen ainakin yhden peptidin tai pilusrakenteen käyttö valmistettaessa lääkettä ripulin, kohonneen verenpaineen, verisuonitautien, allergioiden, syövän, atooppisten tautien, virus- 20 tautien, infektiotautien, virtsatieinfektioiden, hengitystieinfektioiden, karieksen, ärtyvän suolen oireyhtymän, tulehduksellisen suolistosairauden, limakalvon tulehduksen, suolen läpäisevyyshäiriöiden, liikalihavuuden, metabolisen oireyhtymän, oksidatiivisen stressin tai vatsakipujen hoitamiseen tai estämiseen.17 in any one of claims 1 - use of at least one peptide or pilusrakenteen to 9 in the manufacture of a medicament for diarrhea, high blood pressure, cardiovascular diseases, allergies, cancer, atopic diseases, viral, 20 diseases, infectious diseases, urinary tract infections, respiratory tract infections, dental caries, irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease, mucosal inflammation, intestinal läpäisevyyshäiriöiden, obesity, metabolic syndrome, oxidative stress, or abdominal pain to treat or prevent. 18. Polynukleotidi, tunnettu siitä, että se käsittää sekvenssin 25 SEQ ID NO: 12 tai sen degeneroituneen muodon ja koodaa jonkin patenttivaatimuksen 2-9 mukaista peptidiä.A polynucleotide, characterized in that it comprises SEQ ID NO: 12 or a degenerate form thereof and encodes a peptide according to any one of claims 2 to 9. ^ 19. Vektori, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen ^ 18 mukaisen polynukleotidin. 00A vector, characterized in that it comprises a polynucleotide according to claim 18. 00 20. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuk- ? 30 sen 18 mukaisen polynukleotidin tai jonkin patenttivaatimuksen 2 - 9 mukaisen £ peptidin. Q_20. A host cell, characterized in that it comprises the 30 polynucleotide according to any one of claims 18 to 8 or a peptide according to any one of claims 2 to 9. Q_ 20 GG (LGG) -kannasta.20 GG (LGG) strain. 21. Geeniklusteri, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaati- o muksen 18 mukaisen ainakin yhden polynukleotidin. O21. A gene cluster comprising at least one polynucleotide according to claim 18. o § 22. Vasta-aine, tunnettu siitä, että se on jonkin patenttivaati- O cm 35 muksen 1 - 9 mukaista peptidiä vastaan tai niiden funktionaalisia domeeneja vastaan. 38Antibody characterized in that it is directed against a peptide according to any one of claims 1-9 or their functional domains. 38 23. Menetelmä sellaisten bakteerikantojen seulomiseksi, jotka käsittävät ainakin yhden sekvenssin SEQ ID NO: 12 mukaisen polynukleotidin, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää: i) tarjotaan käyttöön DNA tai RNA bakteerikannoista; 5 ii) hybridisoidaan alukkeet tai koettimet, jotka ovat spesifisiä sek venssin SEQ ID NO: 12 mukaiselle polynukleotidille tai sen fragmentille, vaiheen i) DNA:n tai RNA:n kanssa, ja valinnaisesti monistetaan polynukleotidi tai sen fragmentti; ja iii) havaitaan ainakin yksi polynukleotidi tai sen fragmentti, joka on 10 homologinen sekvenssin SEQ ID NO: 12 mukaisen polynukleotidin kanssa.A method for screening bacterial strains comprising at least one polynucleotide of SEQ ID NO: 12, characterized in that the method comprises: i) providing DNA or RNA from bacterial strains; Ii) hybridizing primers or probes specific for the polynucleotide or fragment thereof of SEQ ID NO: 12 with the DNA or RNA of step i) and optionally amplifying the polynucleotide or fragment thereof; and iii) detecting at least one polynucleotide or fragment thereof that is homologous to the polynucleotide of SEQ ID NO: 12. 24. Ainakin yhden sekvenssin SEQ ID NO: 12 mukaisen polynukleotidin tai patenttivaatimuksen 22 mukaisen ainakin yhden vasta-aineen käyttö bakteerikantojen seulomiseen.Use of at least one polynucleotide of SEQ ID NO: 12 or at least one antibody of claim 22 for screening bacterial strains. 25. Menetelmä sellaisten bakteerikantojen seulomiseksi, jotka käsit-15 tävät jonkin patenttivaatimuksen 1 -9 mukaisen ainakin yhden peptidin tai pi- lusrakenteen, käyttämällä patenttivaatimuksen 22 mukaista ainakin yhtä vasta-ainetta, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää: i) tarjotaan käyttöön proteiineja bakteerikannoista; ja ii) havaitaan ainakin yksi polypeptidi, pilusrakenne tai niiden frag-20 mentti käyttämällä vasta-ainetta/vasta-aineita.A method for screening bacterial strains comprising at least one peptide or lysis structure according to any one of claims 1 to 9 using at least one antibody according to claim 22, characterized in that the method comprises: i) providing proteins from bacterial strains; and ii) detecting at least one polypeptide, slit structure or fragment thereof using the antibody (s). 26. Patenttivaatimuksen 23 tai 25 mukainen menetelmä tai patenttivaatimuksen 24 mukainen käyttö, tunnetut siitä, että bakteerikannat ovat probioottisia.Method according to claim 23 or 25 or use according to claim 24, characterized in that the bacterial strains are probiotic. 27. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen ainakin yksi peptidi 25 ja/tai pilusrakenne patogeenisten bakteerien adheesion vähentämiseksi tai estämiseksi kohteen maha-suolikanavaan, epiteeliin tai limaan.At least one peptide 25 and / or slit structure according to any one of claims 1 to 9 for reducing or preventing adhesion of pathogenic bacteria to the gastrointestinal tract, epithelium or mucus of a subject. ^ 28. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 9 mukainen ainakin yksi peptidi ™ tai pilusrakenne bakteerisolun tai minkä tahansa muun aineen adheesion edis- 00 o tämiseksi limaan tai epiteeliin. ° 30At least one peptide ™ or slit structure according to any one of claims 1 to 9 for promoting adhesion of a bacterial cell or any other substance to the mucosa or epithelium. ° 30 29. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen ainakin yksi peptidi £ tai pilusrakenne kohteen immuunivasteen modifioimiseksi. CLAt least one peptide E1 or slit structure according to any one of claims 1 to 9 for modifying the immune response of a subject. CL 30. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksen 10-13 mukaisen tuot- o teen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vaiheen, jos- o § sa muodostetaan jonkin patenttivaatimuksen 1 - 9 mukainen ainakin yksi pep- ° 35 tidi tai pilusrakenne tuotteeseen. 39A process for the production of a product according to any one of claims 10 to 13, characterized in that the process comprises the step of forming at least one pep 35 or slit structure according to any one of claims 1 to 9 in a product. 39 31. Patenttivaatimuksen 30 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää jonkin patenttivaatimuksen 1 - 9 mukaisen ainakin yhden peptidin tai pilusrakenteen lisäämisen tuotteeseen.A method according to claim 30, characterized in that the method comprises adding at least one peptide or slit structure according to any one of claims 1 to 9 to the product. 32. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksen 1 - 9 mukaisen ainakin 5 yhden peptidin tai pilusrakenteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: i) tarjotaan käyttöön patenttivaatimuksen 18 mukainen ainakin yksi polynukleotidi; ii) transformoidaan isäntäsolu polynukleotid(e)illa; 10 iii) viljellään vaiheen ii) isäntäsolua peptidi(e)n tai pilusrakenteen valmistamiseksi; ja iv) valinnaisesti otetaan talteen peptidi(t) tai pilusrakenne.A process for the preparation of at least one peptide or slit structure according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the process comprises the following steps: i) providing at least one polynucleotide according to claim 18; ii) transforming the host cell with polynucleotide (s); Iii) culturing the host cell of step ii) to prepare the peptide (s) or slit structure; and iv) optionally recovering the peptide (s) or slit structure. 33. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukaisen ainakin yhden peptidin tai pilusrakenteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että me- 15 netelmä käsittää seuraavat vaiheet: i) rikotaan jonkin patenttivaatimuksen 1 - 9 mukaista ainakin yhtä peptidiä tai pilusrakennetta valmistava tai käsittävä solu; ja ii) valinnaisesti otetaan talteen peptidi(t) tai pilusrakenne.33. A method of producing at least one peptide or slit structure according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the method comprises: i) disrupting a cell producing or comprising at least one peptide or slit structure according to any one of claims 1 to 9; and ii) optionally recovering the peptide (s) or slit structure. 34. Patenttivaatimuksen 33 mukainen menetelmä, tunnettu sii- 20 tä, että solu on kuollut solu tai elävä solu.34. The method of claim 33, wherein the cell is a dead cell or a living cell. 35. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksen 2-9 mukaisen ainakin yhden peptidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet; i) tarjotaan käyttöön aminohappoja; ja 25 ii) valmistetaan ainakin yksi mainittu peptidi syntetisoimalla vaiheen i) aminohapoista ainakin yksi peptidi.A process for preparing at least one peptide according to any one of claims 2 to 9, characterized in that the process comprises the following steps; (i) providing amino acids; and ii) preparing at least one of said peptides by synthesizing at least one peptide from the amino acids of step i). ^ 36. Menetelmä potentiaalisten probioottisten bakteerikantojen ha- ^ vaitsemiseksi käyttämällä bioinformatiikan lähestymistapoja, tunnettu siitä, 00 9 että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: ° 30 i) tarjotaan käyttöön patenttivaatimuksen 1 mukaisen ainakin yhden it peptidin tai patenttivaatimuksen 18 mukaisen polynukleotidin sekvenssi; Q_ ii) verrataan vaiheen i) sekvenssiä sekvenssikokoelmien sekvens- o seihin; ja o iii) havaitaan sekvenssejä, joissa esiintyy merkittäviä osumia vai- o 35 heen i) peptidi(e)n tai polynukleotidi(e)n kanssa samanlaisia peptidisekvensse-jä, polynukleotidisekvenssejä tai pilusrakenteita. 4036. A method for detecting potential probiotic bacterial strains using bioinformatics approaches, characterized in that the method comprises the steps of: (i) providing a sequence of at least one IT peptide according to claim 1 or a polynucleotide according to claim 18; Q_ ii) comparing the sequence of step i) with the sequences of the sequence collections; and o iii) detecting sequences showing significant hits in peptide sequences, polynucleotide sequences, or slit structures identical to peptide (s) or polynucleotide (s) of Figure 35. 40 37. Menetelmä sellaisten patogeenikantojen havaitsemiseksi, joita vastaan patenttivaatimusten 1 - 9 mukaiset peptidit tai pilusrakenteet vaikuttavat, käyttämällä bioinformatiikan lähestymistapoja, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää: 5 i) tarjotaan käyttöön patenttivaatimuksen 1 mukaisen ainakin yhden peptidin tai patenttivaatimuksen 18 mukaisen polynukleotidin sekvenssi; ii) verrataan vaiheen i) sekvenssiä sekvenssikokoelmien sekvens- seihin; ja iii) havaitaan sekvenssejä, joissa esiintyy merkittäviä osumia vai-10 heen i) peptidi(e)n tai polynukleotidi(e)n kanssa samanlaisia peptidisekvensse- jä, polynukleotidisekvenssejä tai pilusrakenteita. δ cv ob o o x cc 0- 00 o o CD O O CV 4137. A method for detecting pathogen strains that are targeted by the peptides or slit structures of claims 1 to 9 using bioinformatics approaches, characterized in that the method comprises: i) providing a sequence of at least one peptide of claim 1 or a polynucleotide of claim 18; ii) comparing the sequence of step i) with that of the sequence collections; and iii) detecting sequences that exhibit significant hits with peptide sequences, polynucleotide sequences, or slot structures similar to the peptide (s) or polynucleotide (s) of step i). δ cv ob o o x cc 0- 00 o o CD O O CV 41
FI20090031A 2009-02-02 2009-02-02 New peptides and processes for their preparation FI122200B (en)

Priority Applications (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20090031A FI122200B (en) 2009-02-02 2009-02-02 New peptides and processes for their preparation
JP2011546898A JP5792073B2 (en) 2009-02-02 2010-02-02 Lactobacillus rhamnosus pili polypeptide and method for producing the same
PCT/FI2010/050059 WO2010086512A2 (en) 2009-02-02 2010-02-02 Novel peptides and methods for producing them
DK10703916.6T DK2391641T3 (en) 2009-02-02 2010-02-02 Lactobacillus rhamnosus pili og pilus polypeptider
KR1020117020625A KR101782170B1 (en) 2009-02-02 2010-02-02 Lactobacillus Rhamnosus Pilus Polypeptides and Methods for Producing Them
AU2010209584A AU2010209584C1 (en) 2009-02-02 2010-02-02 Lactobacillus rhamnosus pilus polypeptides and methods for producing them
RU2011136454/10A RU2583579C2 (en) 2009-02-02 2010-02-02 Novel peptides and methods for production thereof
EP10703916.6A EP2391641B1 (en) 2009-02-02 2010-02-02 Lactobacillus rhamnosus pili and pilus polypeptides
CA2750576A CA2750576C (en) 2009-02-02 2010-02-02 Novel pilus polypeptides
CN201080006238.5A CN102317311B (en) 2009-02-02 2010-02-02 Novel peptides and methods for producing them
ZA2011/05579A ZA201105579B (en) 2009-02-02 2011-07-28 Lactobacillus rhamnosus pilus polypeptides and methods for producing them
IL214375A IL214375A0 (en) 2009-02-02 2011-08-01 Novel peptides and methods for producing them

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20090031 2009-02-02
FI20090031A FI122200B (en) 2009-02-02 2009-02-02 New peptides and processes for their preparation

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI20090031A0 FI20090031A0 (en) 2009-02-02
FI20090031A FI20090031A (en) 2010-08-03
FI122200B true FI122200B (en) 2011-10-14

Family

ID=40404559

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20090031A FI122200B (en) 2009-02-02 2009-02-02 New peptides and processes for their preparation

Country Status (1)

Country Link
FI (1) FI122200B (en)

Also Published As

Publication number Publication date
FI20090031A0 (en) 2009-02-02
FI20090031A (en) 2010-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2583579C2 (en) Novel peptides and methods for production thereof
Lee et al. The quest for probiotic effector molecules—unraveling strain specificity at the molecular level
Corthésy et al. Cross-talk between probiotic bacteria and the host immune system1
Caselli et al. Actual concept of" probiotics": is it more functional to science or business?
AU2020218748B2 (en) A genetically modified lactobacillus and uses thereof
Savijoki et al. Comparative proteome cataloging of Lactobacillus rhamnosus strains GG and Lc705
KR20170121291A (en) Engineered bacteria to treat diseases that benefit from reduced intestinal inflammation and / or enhanced intestinal mucosal barriers
KR20130086155A (en) Cellular constituents from bacteroides, compositions thereof, and therapeutic methods employing bacteroides or cellular constituents thereof
EA017558B1 (en) Strain of e. mundtii st4sa capable to produce antimicrobial peptide st4sa, process for production of peptide st4sa and use of strain of e. mundtii st4sa and peptide
Chaffanel et al. Surface proteins involved in the adhesion of Streptococcus salivarius to human intestinal epithelial cells
MX2007012755A (en) Methods and compositions to modulate adhesion and stress tolerance in bacteria.
Górska et al. Identification of Lactobacillus proteins with different recognition patterns between immune rabbit sera and nonimmune mice or human sera
WO2019149941A1 (en) Postbiotic-based composition for the modulation of immune system activation and protection of mucosal barriers
US8445426B2 (en) Peptides and methods for producing them
JP2021534089A (en) Composition containing bacterial strain
FI122200B (en) New peptides and processes for their preparation
US10287326B2 (en) Anti-inflammatory properties of a surface protein of propionibacterium freudenreichii
US20210322492A1 (en) Probiotic strains and uses thereof
JP2000505642A (en) Novel adhesion factors of non-pathogenic microorganisms and their application for screening microorganisms for specific symbiotic properties; novel pharmaceutical compositions and food additives containing such microorganisms and adhesion factors
KR20180074609A (en) Novel Salmonella specific bacteriophage SC1 and antibacterial composition comprising the same
Wen Identification and functional characterisation of a novel surface protein complex of Lactobacillus rhamnosus: a thesis presented in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in Microbiology and Genetics at Massey University, Manawatu Campus, New Zealand
Buck Functional analysis of adhesion factors and signaling mechanisms in Lactobacillus acidophilus NCFM

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 122200

Country of ref document: FI

PC Transfer of assignment of patent

Owner name: CHR. HANSEN A/S

MM Patent lapsed