FI120495B - Tat-peräisiä kuljetuspolypeptidejä - Google Patents

Tat-peräisiä kuljetuspolypeptidejä Download PDF

Info

Publication number
FI120495B
FI120495B FI945248A FI945248A FI120495B FI 120495 B FI120495 B FI 120495B FI 945248 A FI945248 A FI 945248A FI 945248 A FI945248 A FI 945248A FI 120495 B FI120495 B FI 120495B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
seq
protein
tat
amino acids
fusion protein
Prior art date
Application number
FI945248A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI945248A0 (fi
FI945248A (fi
Inventor
R Blake Pepinsky
James G Barsoum
Stephen E Fawell
Original Assignee
Biogen Idec Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Idec Inc filed Critical Biogen Idec Inc
Publication of FI945248A0 publication Critical patent/FI945248A0/fi
Publication of FI945248A publication Critical patent/FI945248A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI120495B publication Critical patent/FI120495B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y111/00—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11)
    • C12Y111/01—Peroxidases (1.11.1)
    • C12Y111/01007—Peroxidase (1.11.1.7), i.e. horseradish-peroxidase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2123/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

Tafc-peräisiä kuljetuspolypepti.de ja Tämä keksintö on jatkohakemus samaan aikaan vireillä όlevälle hakemukselle, jonka sarjanumero on 07/934 375 5 ja joka on jätetty 21. elokuuta 1992.
Keksinnön tekninen ala Tämä keksintö koskee biologisesti aktiivisten las-timolekyylieh., kuten polypeptidien ja nukleiinihappojen, viemistä solujen sytoplasmaan ja tumiin in vitro. Tämän 10 keksinnön mukainen 1astimo1ekyy1ien solunsisäinen vieminen saadaan aikaan käyttämällä uusia kuljefcuspolypeptidejä, jotka käsittävät yhden tai useamman osan HIV:n tat~ proteiinista, ja jotka on kiinnitetty kovalenttisesti las-timo1ekyyleihin. Tämän keksinnön mukaisille kuljetuspoly-15 peptideille on tunnusmerkillistä se, että luonnossa ilmenevän tät-proteiinin tat:n emäksinen alue {aminohapot 49 -57) on läsnä, tat:n kysteiinipitoinen alue (aminohapot 22 -36) on poissa, ja cat:n eksoni 2 :n koadittama karboksiterminaalinen alue (aminohapot 73 - 86) on poissa. Tayanomai-20 sista tat-pröteiineista löytyvän kysteiinipitoisen alueen poissaolon ansiosta tämän keksinnön mukaiset kuljetuspoly-peptidit ratkaisevat väärän transaktivaation ja disulfi-diaggregaation ongelmat. Tämän keksinnön mukaisten kulje-tuspölypeptldien pienentynyt koko minimoi myös lastimole-25 kyy!in biologisen aktiivisuuden häiritsemisen.
Keksinnön tausta
Biologiset solut ovat yleensä läpäisemättömiä mak- 1 romolekyy1ien suhteen, mukaan lukien proteiinit ja nukleiinihapot . Jotkin pienet molekyylit menevät solujen sisään j 30 hyvin alhaisilla nopeuksilla. Se, että ei ole ollut keinoja j viedä makromolekyylejä soluihin in vivo, on ollut este sil- j le, että käytettäisiin terapeuttisesti, profylaktisesti ja j diagnostisesta mahdollisesti suurta määrää proteiineja ja j i | 2 nukleiinihappoja, joiden toimintapaikka on sölunsisäinen.
Niinpä useimmat terapeuttiset, profylaktiset ja diagnostiset ehdokkaat, jotka tähän saakka on tuotettu yhdistelmä-DNA-tetoiologiaa käyttämällä, ovat polypeptidejä, jotka toi-5 mivat solimulkodsessa ympäristössä tai kohdesolun pinnalla.
On kehitetty useita menetelmiä makromolekyylien viemiseksi soluihin in vitro. Luetteloon tällaisista menetelmistä kuuluvat: elektroporaatio, membr aan if uusio liposo-mien kanssa, suurinopeuksinen pommitus DNA-päällysteinillä 10 mikroammuksilla, irikubointi kälsiymfosfaatti-DNA-sakan kanssa, DSAE-dekstraani-välitteinen transfektio, infektio muokatuilla virusnukleiinihapoilla ja suora mikroinjektio yksittäisiin soluihin. Nämä in vitro “menetelmät vievät tyypillisesti nnkleiinihappomölekyylejä: vain osaan koko so-15 lupopulaatiosta, ja niillä on taipumus vahingoittaa suurta joukkoa soluja. Makromolekyylien kokeellinen vieminen soluihin in vivo on saatu aikaan raaputuslätaämisella {"scrape. loading") kalsiumfosfaattisakoilla ja 1 iposomeilla. Nämä tekniikat ovat kuitenkin osoittautuneet tähän mennessä | 20 rajoitusti käyttökelpoisiksi soluihin viemisessä in vivo.
Lisäksi jopa soluissa in vitro tällaisten menetelmien käyttökelpoisuus on äärimmäisen rajoittunut proteiinien viemisen kannalta.
Tarvitaan yleisiä menetelmiä biologisesti aktixvis-25 ten proteiinien viemiseksi ehjiin soluihin in vitro ja in vivo. {L. A. Stemson, "Obstacles to Polypeptide Delivery",
Ann. N. Y, Acad. Sei, 57, s. 19 - 21 {1987)). Lipopeptidin CP. Hoffmann ym ., "Stimulation of Human and Murine Adherent Cells by Bacterial Lipoprotein and Synthetic Lipppeptide 30 Analogues", Immunobiol,, 177, s. 158 - 170 (1988) ) tai emäksisen polymeerin, kuten polylysiinin tai polyargini-inin, kemiallinen lisäys (W-C. Chen ym., "Conjugation öf
Poly-L-Lysine Albumin and Horseradish Peroxidase: A Novel J
§ 3
Method of Enhancing the Cellular Uptake of Proteins”, Proc.
Natl, Acad. Sci. USA, 75, s. 1872 - 1876 (1978)) eivät ole osoittautuneet kovin luotettaviksi tai yleisesti käyttökel-poiksi (katso esimerkki 4 jäljempänä). Foolihappoa on 5 käytetty kuljetusosana (C. P. Leamon ja Low, Delivery of Macromolecules into Living Cells: A Method That Exploits
Folate Receptor Endocytosis”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, s. 5572 - 5576 (1991)) . Folaattikonjugaattien interna-lisaatiosta esitettiin todisteita, mutta ei sytoplasmaan 10 viemisestä. Kun otetaan huomioon kiertävän folaatin korkeat tasot in vivo, tämän järjestelmän hyödyl 1 isyyttä ei ole täysin osoitettu. Pseudomonas-eksotoksiinia on myös käytetty kuljetusosana (T, I. Prior ym. "Bamase Toxin: A New
Chimeric Toxin Composed of Pseudomonas Exotoxin A and 15 Barnase", Cell, 64, s. 1017 - 1023 (1991)). Tämän järjes telmän tehokkuus ja yleinen soveltuvuus ei kuitenkaan ole selvä julkaistun työn perusteella, ihmisen immuunikatoviruksen 1-tyypin ("HIV”) tat-proteiini on osoittanut potentiaalia lastiproteiinien so-20 luihin viemiseen (julkaistu PCT-hakemus WO 91/09 958). Kun kuitenkin otetaan huomioon täyspitkän tat-proteiinin kemialliset ominaisuudet, alalla ei ole esitetty yleisesti i käyttökelpoisia menetelmiä sen tehokkaaksi käyttämiseksi biologisesti aktiivisen lastin, viemisessä.
25 Tat on: HIV:n koodittama proteiini, joka transakti- voi tiettyjä HlV-geenejä ja on oleellinen viruksen repii-kaatiolle. HIV-l.;n täyspitkässä: tat-proteiinissa on 86 aminohappotähdettä . HIV:n tat-geenissä on kaksi eksonia, Tatin aminohappoja 1 - 72 koodit tää. eksoni 1, ja aminohappoja 30 73 - 86 koodittaa eksoni 2. Täyspitkälle tat-proteiini!le ominainen on emäksinen alue, joka käsittää kaksi lysiiniä ja kuusi arginiinia (aminohapot 49 - 57) , ja kysteiinxp.i-toinen alue, joka käsittää seitsemän kysteiinitähdettä § 4 (aminohapot 22 - 37). Viljelmässä kasvavat ihrnissolut ottavat sisäänsä puhdistettua tat-proteiinia ympäröivästä ela-tusaineesta (A. D. Frankel ja C. 0. Pabo, "Cellular Uptake: of the Tat Protein from Human Immunodeficiency Virus", 5 Cell, 55, s. 1189 - 1193 {1988)). Alalla ei ole esitetty sitä, vaaditaanko tat-pröteiinin kysteiinipitoista aluetta {joka saa aikaan aggregaatiota ja huonoliukoisuutta) tat-proteiinin ottamiseen solun sisään, PCT-patenttihakemus W0 91/09 958 ("'958-hakemus”)
10 paljastaa, että heterologinen proteiini, joka käsittää HIV:n tat-proteiinin aminohapot 1 - 67, jotka on fuusioitu geneettisesti papilloomaviruksen E2-transaktivaatiorepres-soripölypeptidiin, otetaan sisään soluihin. Lastipolypepti-din biologisen aktiivisuuden (E2-transaktivaation repres-15 s.io) säilymistä ei kuitenkaan tässä osoiteta. I
Tat-proteiinin käyttö, kuten '958-hakemuksessa osoitetaan, käsittää mahdollisesti käytännön vaikeuksia, kun sitä käytetään lastiproteiinien viemiseen soluun. Nämä käytännön vaikeudet käsittävät proteiinin aggregoituinisen 20 ja liukenemattomuuden, joihin liittyy tat-proteiinin kyste-iinipitoinen alue. Lisäksi ’9,58-hakemus ei tarjoa esimerkkejä tat-proteiinin kemiallisesta silloittamisesta lasti-proteiinien kanssa, mikä voi olla kriittisen tärkeää tilanteissa, joissa tat:n geneettinen fuusio lastiproteiiniin 25 häiritsee tat-proteiinin, lastiproteiinin tai molempien oikeaa laskostumista. Lisäksi sekä '95:8-hakemus että Frankel ja Pabo (edellä) esittävät tat-kuljetusproteiinien käyttöä j
yhdessä klorokiinin kanssa, joka on sytotoksinen. Niinpä on olemassa tarve yleensä sovellettavissa olevalle keinolle, I
3.0 jolla voitaisiin viedä turvallisesti ja tehokkaasti biolo- j i
gisesti aktiivisia lastimolekyylejä elävien solujen syto- I
i plasmaan ja tumiin. j i i i | * ä 5
Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö ratkaisee edellä esitetyt ongelmat tuomalla käytettäviksi tuotteita, joilla sytoplasmaan ja tumaan voidaan viedä tehokkaasti biologisesti aktiivisia 5 ei-tat~proteiineja, nukleiinihappoja ja muita molekyylejä, jotka eivät 1) sinänsä pysty menemään, sisään kohdesoluihin tai solujen tumiin, tai 2) eivät sinänsä pysty menemään sisään kohdesoluihin hyödyllisellä nopeudella. Kohdemolekyy-lien solunsisäinen antaminen saadaan aikaan käyttämällä uu-10 siä kuljetusproteiineja, jotka käsittävät yhden tai useamman osan HIV: n tat-prot ei .inistä ja jotka on kiinnitetty ko-valenttisesti lastimolekyyleihin. Erityisemmin tämä keksintö koskee uusia kuljetuspolypeptidejä, menetelmiä, joilla voidaan valmistaa näitä kuljetuspolypeptidejä, kuljetuspö-15 lypeptidi-lastikonjugaatteja, farmaseuttisia, profylaktisia ja diagnostisia koostumuksia, jotka käsittävät kuljetuspo-lypep ‘cidi-lasti kon j ugaatteja.
Tämän keksinnön kuljetuspolypeptideille on tunnusomaista tatin emäksisen, alueeen aminohapposekvenssin läsnä-2Ö olo (luonnossa esiintyvän tat-proteiinin aminohapot 49 -57), tatin kysteiinipitoisen alueen aminohapposekvenssin poissaolo (luonnossa esiintyvän tat-proteiinin aminohapot 22 - 36:) ja tat in eksoni 2 m koödittaman karboksiterminaa-iisen osan poissaolo (luonnossa ilmenevän tat-proteiinin 25 aminohapot 73 - 86)·., Tällaisten kuljetuspolypeptidien edullisia suoritusmuotoja ovat: tat37-72 (SEQ ID nro 2), tat37“ 58 (SEQ ID nro 3), tat38-58GGC (SEQ ID nro 4), tatCGG47-58 (SEQ ID nro 5) , tat47-58GGC (SEQ ID nro 6) , ja tati-Veys (SEQ ID nro 7). Ammattimiehet ymmärtävät,: että kun kulje-30 tuspolypeptidi fuusioidaan geneettisesti lastiosaan, täytyy lisätä aminoterminaalinen metioniini, mutta väliosan aminohappoja (esim. CvsGlyGly tai GlyGlyCys) ei tarvitse lisätä.
Sen ansiosta, että tavanomaisissa tat-prpteiineissa läsnä: ! 6 oleva kysteiinipitoinen alue on poissa, tämän keksinnön mukaiset kuljetuspolypeptidit ratkaisevat disulfIdiaggregaa-ti on ongelman, joka ypi johtaa lastin biologisen aktiivisuuden katoamiseen, kuljetuspolypeptidi-lastikonjugaatin 5 1 lukeneina ttomuuteen tai molempiin. Tämän keksinnön mukais ten kuljetuspolypäptidieu pienentynyt koko minimoi myös edullisella tavalla lastin biologisen aktiivisuuden häirintää. 'Pienentyneen kuljetuspolypeptidin koon etuna on lisäksi viemisen lisääntynyt teho niissä tämän keksinnön mukai-10 sissa suoritusmuodoissa, joihin kuuluu useampien kuljetus-polypeptIdien kiinnittäminen lastimolekyyliä kohden.
Tämän keksinnön mukaiset kuljetuspolypeptidit voidaan kiinnittää edullisesti lastimolekyyleihin kemiallisesti silloittamalla tai geneettisellä fuusiolla. Tämän kek-15 sinnon edullisten suoritusmuotojen mukaisesti kuljetuspoly- peptidi ja lastimolekyyli ovat kemiallisesti silloitettuja. Ainutkertainen terminaalinen kysteiinitähde on edullinen: keino kemialliseen silloitukseen,. Muiden tämän, keksinnön edullisten suoritusmuotojen mukaisesti kuljetusosan karbok-20 sipää fuusioidaan geneettisesti lastiosan aminopäähän. Erityisen edullinen tämän keksinnön mukainen suoritusmuoto on JB106, joka koostuu aminoterminaalisesta metioniinistä, jota seuraävat tat-tähteet 47-58, joita seuraavat HPV-16:n E2-tähteet 245-365.
25 Monissa tapauksissa tämän keksinnön mukaiset uudet kuijetuspolypeptidit välttävät edullisella tavalla kloro-kiiniin liittyvän sytotoksisuuden. Edellä mainittujen piirteiden ansiosta tämä keksintö avaa tien sellaiselle biologiselle tutkimukselle ja taudin hoidolle, joihin liittyvät 30 proteiinit, nukleiinihapot ja muut molekyylit, joiden vai-kutuspaxkat ovat sytoplasmassa tai tumassa,
S
j 7
Kuvoiden lyhyt kuvaus
Kuvio 1 kuvaa Hiy-l:n tat-proteiinin aminohapposekvenssiä (SEQ ID nro 1} .
Kuvio 2 esittää yhteenvetona tulokset solujen si-5 säänöttokokeista, joissa käytettiin kuljetuspolypeptidin ja Pseudomonas-eksotöksiinin ribosylaatiöalueen muodostamia konjugaatteja (varjostetut pylväät; konjugoimattomat, vino-viivoitetut pylväät, konjugoidut),
Kuvio 3 esittää yhteenvetona tulokset solujen si-10 säänottokokeista, joissa käytettiin kuljetuspolypeptidin ja ribonukleaasin muodostamia konjugaatteja (täytetyt neliöt, rlbonukleaasi-SMCC ilman kuljetusosaa, täytetyt ympyrät, t;at37-72-ribonukleaasi, täytetyt kolmiot, tat38-58GGC-ribö-nukleaasi, täytetyt vinoneliöt, tafcCGG38-58-ribonukleaasi, 15 avoimet neliöt, tatCGG47-58-ribönukleäasi).
Kuvio 4 esittää kaavamaisesti plasmidin pÄHE2 muodostamisen.
Kuvio 5 esittää kaavamaisesti plasmidin pET8cl23 muodostamisen.
20 Kuvio 6 esittää kaavamaisesti plasmidin pET8c12 3 CCSS muodos tamis en.
Kuvio 7 esittää yhteenvetona tulokset solujen si-säänottokokeista, joissa käytettiin kuljetuspolypeptidin ja E2-:repressorin muodostamia konjugaatteja (avoimet vinoneli-25 öt, E2.123 silloitettuna tat37-72:een ilman klprpkiiniä, täytetyt vinoneliöt, E2.123 silloitettuna tat37-72:een klo-rokiinin kanssa., avoimet ympyrät, E2.123CCSS silloitettuna tat37-72:een ilman klorokiiniä, suljetut ympyrät, E2.123CCSS silloitettuna tat37-72:een klorokiinin kanssa).
30 Kuvio 8 esittää kaavamaisesti plasmidin pTATÄcys muodostamisen.
Kuvio 9 esittää kaavamaisesti plasmidin pFTESQl muodos tami sen. } \ \ \ \ Λ j $ ! 3
Kavio 10 esittää kaavamaisesti plasmidin pTATÄöys-2 49 muodo s t am i s en.
Kuvio 11 esittää kaavamaisesti plasmidin pJBlÖS muodostamisen, .5' Kuvio 12 esittää proteiinin JB106 täydellisen; ami nohapposekvenssin .
Kuvio 13 esittää yhteenvetona E2-repressiomääritys-ten tulokset, joissa oli mukana JB106 (neliöt), TxHE2CCSS (vinoneliöt) ja HE2,123 (ympyrät). Määritykset suoritettiin 10 COS7-soluissa ilman klorökiiniä, kuten esimerkissä 14 kuvataan .
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Jotta tässä kuvattu keksintö voidaan ymmärtää täydellisemmin, esitetään seuraava yksityiskohtainen kuvaus.
15 Kuvauksessa käytetääh seuraavia termejä:
Aminohappo - Peptidin, polypeptidin tai proteiinin monomeerinen yksikkö. Kaksikymmentä proteiiniaminohappoa (L-Isomeerit) ovat: aianiini ("Ala'1 tai "A":), arginiini (n Arg" tai R") , asparagiini {"Asm" tai "N”), asparagiimi-20 happo ("Asp" tai "D"), kysteiini ("Cys" tai "C"), glutamii-ni ("Gin" tai "Q"), glutamiinihappo ("Glu" tai "E"), gly- siini ("Gly" tai "G"), histidiini ("His" tai "H"}, isoleus-iini ("Ile" tai "I"), leusiini {"Leu" tai "L"), lysiini ("Lys" tai "K"), metioniini ("Met" tai "M"), fenyylialanii-25 ni ("Phe" tai "F"), proliini ("Pro" tai "P"), setiini ("Ser" tai "S"), treonlini ("Thr" tai "T"), tryptofaani (” Trp" tai "W"j, tyros iini ("Tyr" tai ”Y"), ja väliini ("Vai" tai "V"). Termi aminohappo tässä käytettynä käsittää myös proteiiniaminohapppjen analogit ja proteiiniaminohap-30 pojen ja niiden analogien D-isomeerit.
Lasti ~ Molekyyli, joka ei ole tafc-proteiini tai sen fragmentti ja joka joko 1) ei itsessään kykene menemään sisään kohdesoluihin tai 2) ei itsessään kykene menemään j ] 9 sisään köhdesoluihin hyödyllisellä nopeudella. ("Lasti" tässä hakemuksessa käytettynä viittaa joko molekyyliin sinänsä > se on: ennen konjugointia, tai kuljetuspolypeptidi-lästikonjugäatin lastiosaan.) Esimerkkeihin "lastista" kuu-5 luvat:,; näihin rajoittumatta, pienet molekyylit ja makromolekyylit, kuten polypeptidit, nukleiinihapot ja polysakkaridit.
Kemiallinen silloittaminen - Kahden tai useamman ennalta muodostetun molekyylin kovalenttinen sitominen.
10 Lastikonjugaatti - Molekyyli, joka käsittää ainakin yhden kuljetuspolypeptidiosan ja ainakin yhden lastiosan ja joka on muodostettu joko geneettisen fuusion tai .kulj.et.iis-polypeptidin tai lastimolekyylin kemiallisen silloittämisen avulla.
15 Geneettinen fuusio - Kahden tai useamman proteiinin kolineaärinen, kovalenttinen sidos niiden polypeptidirunkojen välillä, proteiineja koodattavien peräkkäisten sekvenssien geneettisen ekspression välityksellä.
Makromolekyyli - Molekyyli, kuten peptidi, polypep-20 tidi, proteiini tai nukleiinihappo.
Polypepti di - Mikä tahansa polymeeri, joka koostuu oleellisesti mistä tahansa 20 proteiinlaminohaposta (edel- j lä) sen koosta riippumatta. Vaikka usein käytetään "prote- 1 iinia" viittaamaan suhteellisen suuriin polypeptideihin, ja ] 25 "peptidiä" käytetään usein viittaamaan pieniin polypepti- | deihin, näiden termien käyttö alalla limittyy ja vaihtelee. j
Termi "polypeptidl" tässä käytettynä viittaa peptideihin, | polypeptideihin ja proteiineihin, ellei toisin ilmaista.
Reportterigeeni - Geeni, jonka ekspressio riippuu 30 halutun solutason tapahtuman ilmenemisestä, ja jonka eks- ί pressio voidaan havaita mukavasti geneettisesti transformoidussa isäntäsolussa.
j i ;| :::3 10
Repor11eriplasmidi - Plasmidivektori, joka käsittää yhden tai useamman reportterigeenin.
Pieni molekyyli - Molekyyli, joka on muu kuin makromolekyyli .
5 Väliösa-aminohappo - Aminohappo (jolla on edulli sesti pieni sivuketju), joka sisällytetään kuljetusosan ja kemiallisessa silloituksessa käytetyn aminohappotähteen väliin (esimerkiksi molekyylitason taipuisuuden tarjoamiseksi ja steerisen estämisen välttämiseksi), 10 Kohdesolu - Solu, johon lasti viedään kuljetuspoly- peptidillä. '’Kohdesolu’' voi olla mikä tahansa solu, mukaan lukien ihmissolut, joko in vivo tai in vitro.
Kuljetusosa tai kuljetuspolypeptidi - Polypeptidi, joka kykenee viemään kövalenttisosti kiinnittyneen; lastin 15 kohdesoluun.
Tämän keksinnön mukainen fuusioproteiini on yleisesti sovellettavissa sellaisten pienten molekyylien ja makromolekyylien terapeuttiseen, profylaktiseen, tai dia- ! ί
gnostiseen viemiseen solun sisälle, kuten proteiinit, nuk- J
20 leiinihapot ja polysakkaridit, jotka eivät itsessään kykene menemään kohdesolujen sisään hyödyllisellä nopeudella. Pitäisi kuitenkin ymmärtää, että tämän keksinnön mukaiset vaihtoehtoiset suoritusmuodot eivät rajoitu kliinisiin sovellutuksiin. Tätä keksintöä voidaan soveltaa edullisesti 25 lääketieteellisessä ja biologisessa tutkimuksessa. Tämän keksinnön tutkimussovellutuksissa lasti voi olla lääkeaine tai reportterimolekyyli. Tämän keksinnön mukaisia kuljetus- | polypeptidejä voidaan käyttää tutkimuslaboratorioreagens- \
seinä joko yksinään tai osana, kuljetuspolypeptidin konju- I
30 gaatiotarvikesarjaa. |
Kohdesolut voivat olla in vivo soluja, se on: solu- | ja, jotka muodostavat elävien eläinten tai ihmisten elimiä j tai kudoksia, tai mikro-organismeja, joita löytyy elävistä .1 '1
S
li eläimistä tai ihmisistä. Kohdesolut voivat myös olla in vitro soluja, se on: viljeltyjä eläinsoluja, ihmissoluja tai mikro“organismeja.
Tämän keksinriön mukaisen fuusioproteiinin eri käyt-5 tötarkoituksissa käytettävien lääkeaineiden ja reportteri-molekyylien valitsemisessa on laaja liikkumavapaus. Tekijöihin, jotka on otettava huomioon reportteriinolekyylejä valittaessa, kuuluvat, näihin rajoittumatta, etsityn kokeellisen informaation tyyppi, myrkyt törnyys:, detektion mu-10 kavuus, detektion kvantitoitavuus, ja saatavuus. Ammattimies tuntee monia tällaisia reportterimolekyylejä.
Kuten ymmärretään jäljempänä esitettyjen esimerkkien perusteella, olemme käyttäneet sellaisia entsyymejä, joille on olemassa kolorimetrisiä määrityksiä, mallilastina 15 osoittaaksemme tämän keksinnön mukaisten kuljetuspolypepti-dien toimivuuden ja hyödylliset piirteet. Nämä entsyymilas-tit tarjoavat solun sisään ottamisen herkän, mukavan, visuaalisen detektion. Lisäksi koska visuaalinen tulos ilmenee vain jos lastin entsymaattinen aktiivisuus säilyy, nämä 20 entsyymit tarjoavat herkän ja luotettavan testin lastiosan biologisen aktiivisuuden säilymiselle tämän keksinnön mukaisissa kuljetuspolypeptidi-lastikonjugaateissa. Tämän keksinnön mukainen edullinen suoritusmuoto käsittää pipar-juuriperoksidaasin ("HRP") kuljetuspolypeptidi-lastikönju-25 gaatin lastiosana. Erityisen edullinen lästibsamalli tämän J
keksinnön suorittamista varten on β-galaktosidaasi. |
Lastiproteiinimalleja voidaan valita myös niiden | solunsisäisen vaikutuspaikan mukaan. Kuten esimerkeissä 6 | ja 7 jäljempänä kuvataan, olemme käyttäneet Pseudomonas-30 eksotoksiinista {"PE”) peräisin olevaa ADP-ribosylaatio-osaa ja haiman ribonukl eaasia vahvistaaksemme sen, että tämän keksinnön mukaiset kul jetuspolypept idit ovat vieneet sytoplasmaan oikein laskostuneita lastiproteiineja. j : ί i }
S
ä 12 Täyspitkiä Pseudomonas-eksotoksiini on itsessään kykenevä menemään sisään soluihin, missä se inaktivoi ribosome ja ADP-ribosylaatioreaktion välityksellä ja näin tappaa solut. Osa PseudomOnas-eksotoksiiniproteiinista, joka 5 tunnetaan ADP-ribosylaatio-osana, ei kykene menemään sisään soluihin, mutta siinä on jäljellä kyky inaktivoida ri-bosomit, jos se saatetaan yhteyteen niiden kanssa. Niinpä solukuolema, jonka kuljetuspolypeptidin ja PE-ADP-ribosy-laatio-osan muodostamat konjugaatit saavat aikaan, on testi 10 kuljetuspolypeptidin lastin viemiselle sytoplasmaan.
Olemme käyttäneet myös ribonukleaasia vahvistaaksemme sen, että tämän keksirmon mukaiset kuljefcuspolypepti-dit ovat vieneet sytoplasmaan oikein laskostuneen lastipro-teiinin. Proteiinisynteesi:, Ripusta riippuvainen, prosessi.
15 on hyvin herkkä ribönukleaasiile, joka digestoi RNA;ta. Ri-bonukleaasi ei itsessään kykene kuitenkaan menemään solujen sisään. Niinpä kuljetuspolypeptidin ja ribonukleaasin muodostaman konjugaatio aikaan saama proteiinisynteesin inhibit io on testi biologisesti aktiivisen ribonukleaasin vie-20 miselle solun sisään.
Tietenkin tietyn lastimolekyylin viemistä sytoplasmaan voi seurata saman lastimolekyylin vieminen edelleen tumaan. Tumaan vieminen käsittää välttämättä sen, että läpäistään jokin osa sytoplasmasta, 25 Papilloomaviruksen E2-repressoriproteiinit ovat esimerkkejä makromolekyylilääkkeistä, jotka voidaan viedä kohdesolujen tumiin tämän keksinnön mukaisilla kuljetuspo-lypeptideillä, Paplllöomaviruksen E2-proteiini, joka esiintyy normaalisti homodimeerinä, säätelee sekä papilloomavi-30 rusgenomin transkriptiota että replikaatiötai. E2-proteiinin karboksiterminaalinen osa sisältää DNA:hän sitoutumis- ja ] dimerisaatio-aktiivisuudet, Sellaisten DNA-sekyenssien ly- j hytkestoinen ekspressio transfektoiduissa nisäkässpluissa, ^ :13 jotka koodit tavat: erilaisia E2-analogeja tai E2:n karboksi-terminaalisiä fragmentteja:, inhiboi täyspifckän E2 “proteiinin aikaansaamaa transaktivaatiota (J. Barsoum ym., "Mechanism of Action of the Papillomavirus E2 Repressor: 5 Repression in the: Absence of DNA Binding",: J. Virol., 66, s. 3941 - 3945 {1992}}. E2-repress0rit, jotka on lisätty viljeltyjen nisäkässolujen kasvatuselatusaineeseen, eivät mene solujen sisään, ja niinpä ne eivät inhiboi E2;n transaktivaatiota näissä soluissa. Tämän keksinnön mukaisten 10 kuljetuspolypeptidien konjugointi E2-repressoreihin saa kuitenkin aikaan E2-repressorien translokaation kasva-tuselatusaineesta viljeltyihin; soluihin, missä ne ilmentävät biologista aktiivisuutta ja repressoivat reportterigee-nin E2-riippuvaista ekspressiota:;.
15 Nopeutta, jolla yksi- ja kaksijuosteiset nukleii nihapot menevät solujen sisään in vitro ja in vivo, voidaan tehostaa edullisesti käyttämällä tämän keksinnön mukaisia kul j etuspolypepticie jä. Kuten esimerkissä 11 (jäljempänä) osoitetaan, menetelmät polypeptidien silloittamiseksi kerni -20 allisesti nukleiinihappoihin ovat sinänsä tunnettuja. Tämän keksinnön edullisessa suoritusmuodossa lasti on yksijuos-teinen "antisense''-nukleiinihappo. "Antisense"-nukleiinihapot ovat hyödyllisiä inhiboimaan sellaisten sekvenssien so-lunsisäistä ekspressiota, joille ne ovat komplementaarisia.
25 Eräässä toisessa tämän keksinnön suoritusmuodossa lasti on kaksijuosteinen nukleiinihappo, joka käsittää sitoutumiskohdan, jonka nukleiinihappoon sitoutuva proteiini tunnistaa. Esimerkki tällaisesta nukleiinihappoon sitoutuvasta proteiinista on virusperäinen transaktivaatfcori.
30 Luonnossa ilmenevällä HIV-l;n tat-proteiinilla (ku vio 1) on alue {aminohapot 22 - 37), jossa 7 16:sta aminohaposta on kysteiini, Nämä kysteiinitähteet kykenevät muodostamaan disulfidisidöksia keskenään, toisten tat-proteii- :: | 14 nimolekyylien kysteiinipitoisella alueella olevien kyste-iinitähteiden kanssa, ja lastiproteiinissa tai konjugaatin lastiosassa olevien kysteiinitähteiden kanssa. Sellainen disulfidisidoksen muodostuminen voi saada aikaan lastin 5 biologisen aktiivisuuden katoamisen. Lisäksi vaikka ei olisikaan mahdollisuutta disulfidisidoksen muodostumiseen las-tiosan kanssa (esimerkiksi kun lastiproteiinissa ei ole kysteiinitähteitä), disulfidisidoksen muodostuminen kulje-tuspolypeptidien välillä johtaa kuljetuspolypeptidin, kul-10 jetuspolypeptidi-lastikonjugaatin tai molempien aggregoitu-miseen ja liukenemattomuuteen. Tat:n kysteiinipitoinen alue on potentiaalisesti vakavien ongelmien lähde käytettäessä luonnossa ilmenevää tat-proteiinia lastimolekyylien viemiseen soluun.
15 Kysteiinipitoista aluetta tarvitaan tat·:n dimeri- j soitumiseen in vitro, ja se vaaditaan HIV:n DNA-sekvenssien transaktivaatioon. Niinpä ta tm kysteiinipitoisen alueen poistamisella on se lisäetu, että tat:n luonnollinen aktiivisuus poistuu, se on: Hiv:n transkription ja replikaation 20 induktio. Alalla ei kuitenkaan esitetä tarvitaanko tat-pro- teiinin kysteiinipitoista aluetta solun sisään ottamiseen. j Tämä keksintö: käsittää suoritusmuotoja, joissa on \ ratkaistu tat:n kysteiinipitoiseen alueeseen liittyvät on- j geIinat, koska tämä alue ei ole: läsnä tässä kuvatuissa kul- | 25 jetuspolypeptiöeissä. Näissä suoritusmuodoissa kuljetuspo- lypeptidin tai kuljetuspolypeptidi-lastikonjugaatin otto solun sisään tapahtuu yhä. Yhdessä tämän keksinnön edullisten suoritusmuotojen ryhmässä aminohapposekvenssi, joka edeltää kysteiinipitoista aluetta, fuusioidaan suoraan sii-30 hen aminohapposekvenssiin, joka seuraa kysteiinipitoista aluetta. Sellaisille kuljetuspolypeptideille on annettu nimeksi tatÄcys ja niillä on yleinen kaava {tatl-21)-(tatlE- n), jossa n on karboksiterminaalisen tähteen numero, se on: 15 49 - 86. Edullisesti n on 58 - 72, Kuten jäljempänä olevista esimerkeistä käy ilmi, tat-proteiinin kysteiinipitoista aluetta edeltävää aminohapposekvenssiä ei tarvita ottoon solun sisään. Edullinen kuljetuspolypeptidi (tai kuljetus-5 osa) koostuu tat-proteiinin aminohapoista 37 - 72, ja sille on annettu nimeksi tat37-72 (SEQ ID nro 2). Tat^tähteen 37, kysteiinin, säilyttäminen kuljetuspolypeptidin aminopäässä on edullista, koska se on käyttökelpoinen kemiallisessa s ill oit tautisessa .
10 TatÄcys“polypept.Idien, tat37-72:n ja muiden tämän keksinnön suoritusmuotojen etuihin kuuluvat seuraavat.: aj tat-proteiinin luonnollinen aktiivisuus, se on: HIV-transkription induktio, eliminoituu, b) dimeerit ja muut kuljetuspolypeptidin korkeammat 15 multiineerit vältetään, c) tatAcys-geneettisten fuusioiden ekspressiotaso E^_ j cölissa voi parantua, d) joillakin kuljetuspolypeptidikonjugaateilla ilmenee lisääntynyttä liukoisuutta ja ylivertaista käsittelyn 20 helppoutta ja e) joillakin fuusioproteiineilla ilmenee: lisäänty- nyttä aktiivisuutta lästiosassa:, verrattuna fuusioihin, j jotka sisältävät kysteiinirikkaan osan. j
Monia kemiallisia silloitusmenetelmiä tunnetaan ja | 25 ne ovat mahdollisesti käyttökelpoisia, kun halutaan konju- | goidä tämän: keksinnön mukaisia kuljetuspolypeptidejä lasti-makromolekyyleihin, Monet tunnetut kemialliset silloitusme-netelmät ovat: epäspesifisiä, se on: ne eivät suuntaa liitoskohtaa mihinkään tiettyyn kohtaan kuljetuspolypeptidissä 30 tai lastimakromolekyylissä. Tuloksena tästä epäspesifisten silloitusaineideii käyttö voi hyökätä funktionaalisiin kohtiin tai tukkia steerisesti aktiivisia kohtia, mikä tekee konjugoiduista proteiineista biologisesti inaktiivisia.
| 16
Edullinen lähestyrniatapa, jolla liittämisen spesifisyyttä voidaan lisätä tätä keksintöä suoritettaessa, on suunnata kemiallinen liittäminen funktionaaliseen ryhmään, joka havaitaan vain kerran tai muutaman kerran yhdessä tai 5 molemmissa silloitettavista polypeptideistä. Esimerkiksi monissa proteiineissa kysteiini,: joka on ainoa tioli.ryhmän sisältävä proteiiniaminohappo, esiintyy vain joitakin kertoja, Samoin esimerkiksi jos polypeptidi ei sisällä lysii-nitähteitä, sulloitusreagenssi, joka on spesifinen primää-10 risille: amiineille, on selektiivinen kyseisen polypeptidin aminopäälle. Tämän lähestytti S tavan menestyksekäs hyödyntäminen liittämisspesifisyyden parantamiseksi vaatii sen, että polypeptideillä ön sopivan harvinaiset ja reaktiiviset aminohappotähteet sellaisilla molekyylin alueilla, joita 15 voidaan muuttaa ilman että molekyylin biologinen aktiivisuus katoaa,
Kuten jäljempänä olevissa esimerkeissä osoitetaan, kysteiinitähteet voidaan korvata, kun ne ilmenevät sellaisissa pölypeptidisekvenssin osissa, joissa niiden osallis-20 tuminen sillpitusreaktiöon todennäköisesti häiritsisi biologista aktiivisuutta. Kun kysteiinitähde korvataan, on tyypillisesti suotavaa minimoida tuloksena olevat muutokset polypeptidin laskostumisessa. Muutokset polypeptidin laskostumisessa minimoituvat,: kun korvike on kemiallisesti ja 25 steerisesti samanlainen kysteiinin kanssa. Häistä syistä seriini on edullinen kysteiinin korvike. Kuten jäljempänä olevissa esimerkeissä osoitetaan, kysteiinitähde voidaan | tuoda polypeptidin aminohapposekvenssiin silloitustarköi- | tukeissa. Kun tuodaan kysteiinitähde, tuominen amino- tai | 30 karboksipäähän tai sen lähelle on .edullista,. Sellaisia ami- j nohapposekvenssimuutoksia varten on saatavilla tavanomaisia 1 menetelmiä., tuotettiinpa haluttu polypeptidi kemiallisella j synteesillä tai yhdistelmä-DNA;n ekspressiolla. j ] ! 17
Sllloitusreagenssit voivat olla homobifunktionaalisia, se on: joilla on kaksi funktionaalista ryhmää, jotka käyvät läpi saman reaktion. Edullinen homobi funk tienaa linen silloitusreagenssi: on bismaleimidoheksaani ("ΒΜΗ®). BMH si-5 sältää kaksi funktionaalista maleimidiryhmää, jotka reagoivat spesifisesti sulfhydryylin sisältävien yhdisteiden kanssa hellävaraisissa olosuhteissa {pH 6,5 - 7,7). Nuo kaksi maleimidiryhmää on yhdistetty toisiinsa hiilivetyket-julla. Niinpä BMH on hyödyllinen sellaisten polypeptidien 10 irreversiibeliä silloittamista varten, jotka sisältävät kysteiinitähteitä.
Silloitusreagenssit voivat olla myös heterobifunk-t tonaalisia·, Heterdbifunktiohaalisilla silloitusaineilla on kaksi erilaista funktionaalista ryhmää, esimerkiksi amiini -15 reaktiivinen ryhmä ja tiolireaktiivinen ryhmä, jotka silloittavat kaksi proteiinia, joilla on vapaita amiineja ja I
vastaavasti tioleja. Esimerkkejä heterobifunktionaalisista silloitusaineista ovat sukkinimidyyli-4- (N-maleimidömetyyli )sykloheksaani-l-karboksylaatti {"SMCC"), m-maleimido-20 bentsoyyli-N-hydroksisukkinimidiesteri {"MBS"), ja sukkin- imidi-4-{p-maleimidofenyyli) butyraatti {"SMPB"), MBS:n pi-tempiketjuinen analogi. Näiden silloitusaineiden sukkinimi-dyyliryhmä reagoi primäärisen amiinin kanssa ja tiolireak- | tiivinen maleimidi muodostaa kovalenttisen sidoksen kyste- ]
25 iinitähteen tiolin kanssa. I
Silloitusfeagensseilla on usein huono liukoisuus J
veteen. Silloitusreagenssiin voidaan lisätä hydrofiilinen 1 osa, kuten sulfonaattiryhmä, sen vesiliukoisuuden paranta- j miseksi. Sulfö-MBS ja sulfo-SMCC ovat esimerkkejä silloi- j 30 tusreagensseista, joita on modifioitu vesiliukoisuutta silmällä pitäen.
18
Monet silloitusreagenssit saavat aikaan konjugaa-tin, joka on .oleellisesti katkeamaton solun olosuhteissa.
Jotkin silloitusreagenssit sisältävät kuitenkin kovalentti-sen sidoksen.,: kuten, di suit idin, joka voidaan katkaista so-5 lun olosuhteissa. Esimerkiksi ditiobis(sukkinimidyylipro-pionaatti) ("PSP"), Trautih reagenssi ja N-sukkinirnidyyli- 3-(2-pyriäYyliditio)propionaatti ("SFDP") ovat hyvin tunnettuja katkaistavissa olevia silloitusäineita. Katkaistavissa olevan silloitusreagenssih käyttö mahdollistaa sen, 10: että lastiösä erotetaan kuljetuspolypeptidistä kohdesoluun viemisen jälkeen.. Suora disulfidiliitos voi olla myös hyödyllinen.
Joillakin uusilla silloitusreagensseilla, kuten n-γ-maleimidobutyryylioksi-sukkinimidiesteri {"GMBS") ja sul-15 fo-GMBS, on vähentynyt immunogeenisyys. Joissakin tämän keksinnön mukaisissa suoritusmuodoissa tällainen vähentynyt immunogeenisyys voi olla edullinen. ;
Monia s i 11 o i tus r eac/enss e j a, mukaan lukien edellä käsitellyt, on kaupallisesti saatavilla. Yksityiskohtaiset 20 ohjeet niiden käyttöä varten ovat helposti saatavilla kaupallisilta toimittajilta. Yleinen lähdeteos proteiinien silloittamisesta ja korljugaattien valmistamisesta on S. S.
Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press (1991): .
25 Kemialliseen silloittamiseeri voi sisältyä väliosien käyttö. Väliosat tarjoavat molekyylin sisäistä joustoa tai ne säätävät molekyylinsisäisiä etäisyyksiä konjugoitujen | osien välillä ja näin ollen voivat auttaa biologisen aktii- j visuuden säilyttämisessä. Väliosa. voi olla polypeptidiosan 30 muodossa, joka käsittää väliosa-aminohappoja. väliryhmä voi vaihtoehtoisesti olla osa silloitusreagenssia, kuten "pit-käketjuisessa SPDF:ssä'' {Pierce Chem. Co., Rockford, IL, luettelonrO: 21651 H) , j ·:§ 19
Kuten seuraavissa esimerkeissä osoitetaan käyttämällä tässä tarjottua aminohappo- ja DNA-- sekvenss i - informaatiota, tämän keksinnön mukaiset kuljetuspolypeptidit voidaan syntetisoida kemiallisesti tai tuottaa yhdistelmä-5 DNA-menetelmillä. Menetelmät, joilla aminohapposekvenssil tään tunnettuja polypeptidejä voidaan tuottaa kemiallisella synteesillä tai yhdistelmä-DNA-menetelmillä, ovat hyvin tunnettuja, Automaattilaitteet polypeptidi- tai DNA-synteesiä varten ovat kaupallisesti saatavilla. Isäntäsolut, 10 kloonausvektorit, DNA-ekspressioköntrollisekvenssit ja oli- gönukleotidiiinkkerit ovat myös kaupallisesti saatavilla;.
Tässä esitettyihin edullisiin kuljetuspolypeptidien aminohappoa elevens s eihin voidaan helposti tehdä pieniä lisäyksiä, deleetipita tai substituutioita sinänsä tunnetulla; 15 tavalla. Pitäisi kuitenkin ymmärtää, että sellaiset variaatiot ovat tämän keksinnön suojapiirin sisällä.
Lisäksi tunnetaan tat-proteiineja muista viruksista, kuten HIV-2 (M. Guyader ym,, "Genome Organization i and Trans activation of the Human immunodeficiency Virus 20 Type 2", Nature, 326, s. 662 - 669 (1987)), hevosen tarttuva anemiavirus (R. Carroll ym., "Identification of Lenti-virus Tat Functional Domains Through Generation of Equine Infectious Anemia Virus/Human Immunodeficiency Virus Type 1 tat Gene Chimeras", J. Virol., 65, s. 3460 - 3467 (1991)), 25 ja apinan immuunipuutosvirus (L. Chakrabarti ym., "Sequence of Simian Immunodeficiency Virus from Macaque and Its Relationship to Other Human and Simian Retroviruses", Nature, j 328, s, 543 - 547 (1987); S. K. Arya ym., "New Human and j
Simian HIV-Related Retroviruses Possess Functional Transac- j 30 tivator (tat) Gene", Nature 328, s. 548 - 550 (1987)). Pi- \
täisi ymmärtää, että polypeptidit, jotka ovat peräisin I
näistä tat-proteiineista ja joiden piirteenä on tatin emäk- J
$ j j $ 20 sisen alueen läsnäolo ja tatin kysteiinipi toisen alueen poissaolo, kuuluvat tämän keksinnön suojapilariin.
Jotta tässä kuvattu keksintö olisi mahdollista ymmärtää täydellisemmin, esitetään seuraavat esimerkit. Pi-5 taisi ymmärtää, että nämä esimerkit ovat pelkästään havain-nollistamistarkoituksia varten ja niiden ei ole tarkoitus rajoittaa· tätä keksintöä millään tavalla. Kaikkien näiden esimerkkien: yhteydessä kaikki molekyylikloonausreaktiot suoritettiin J. Sambrookin ym, teoksen mukaisesti, Moleeu-10 lar Cloning: A Laboratory Manual/ 2nd Editiot-; Cold Spring Harbor Laboratory (1989), paitsi missä toisin mainitaan.
Esimerkki 1
Kuljetuspolypeptidien tuotanto ja puhdistus
Yhdisfcelmä-DMA
15 Plasmidi p:Tat72 oli lähtökloomi tat-peräisten kul jetuspolypeptidien tuottamiseksi bakteereissa ja sellaisten geenien muodostamiseksi, jotka koodittavat kuljetuspolypep-jtidin ja lastiproteiinin fuusioita. Hankimme plasmidin pTat72 (kuvattu Frankelin ja Pabon artikkelissa edellä) 20 Alan Frankelilta (The Whitehead institute for Biomedical Research, Cambridge, MA) . Plasmidi pTat72 oli peräisin F. W. Studierin ym. pET~3a-ekspressiövektorista ("Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes", Methods Enzymol., 185, s . 60 - 90 (1990) ) sijoittamalla syn-25 teettinen geeni, joka kooditti HIV-l-n tat:n aminohappoja 1 - 72, Tatin koodittava alue käyttää E. colin kodoninkäyt-töä ja sitä kontrolloi bakteriofaagi T7 m polymeraasin promoottori, joka on indusoitavissa isopropyyli-beta-D-tiogalaktopyranosidilla ("IPTG"). Tat-prpteiini käsitti 5 % 30 E, colin kokonaisproteiinista IPTG-induktion jälkeen.
21
Tati-72:n puhdistus bakteereista
Suspensoimme E. colin, joka ekspressoi tat1-72-proteiinia, 10-kertaiseen tilavuuteen 25-millimolaarista Tris-HClrää (pH 7,5), joka oli 1 niM EDTÄ.-n suhteen. Hajotimme 5 solut "French press"-laitteessa: ja poistimme liukenemattomat roskat sentrifupoimalia 10 000 g:n kiihtyvyydessä 1 tunnin ajan, Latasimme supernatantin Q Sepharose Fast Plow -ioninvaihtopylvääseeri (Pharmacia LKB, Piscataway, MJ) (20 ml hartsia/60 ml lysaattia), Käsittelimme läpi tulleen 10 fraktion 0,5 M NaCljlla, mikä aiheutti tat-proteiinin saos-tumlsen, Keräsimme suolalla saostetun proteiinin sentrifu-goimalla 35 000 g m kiihtyvyydellä 50.2-roottorissa 1 tunnin ajan. Liuotimme pöhjaan ajetun sakan 6-molaariseeh gua-nidiini-HClrään ja kirkastimme liuoksen sentrifugoimälla 15 35 000 rpm:ssä, 50.2-roottorissa 1 tunnin ajan. Latasimme j kirkastetun näytteen A.5-agaroos igeelisuodatuspylvääseen, | joka oli tasapainotettu 6-molaarisella guanidiini-HCl:llä, 1 joka oli 50-millimolaarinen natriumfosfaatin suhteen (pH j 5,4) ja 10-millimolaarinen DTTln suhteen, ja eluoimme sit-20 ten näytteen samalla puskurilla. Latasimme tat-proteiinin j sisältävät geelisuodatusfraktiot C4-käänteisfa.asi-HPLC-pyl- | vääseen ja eluoimme gradientilla, jossa oli 0,l-%:isessa \
trifluorietikkahapossa asetonitriiliä 0 - 75 %. Tällä mene- I
telmällä tuotimme noin 20 mg tatl-72—proteiinia per litra j 25 E. coli -viljelmää (olettaen että soluja oli 6 g per lit- | ra), Tämä edusti noin 50-%:ista kokonaissaantoa, | SDS-PAGE-analyysissä tatl-72-polypeptidi liikkui ]
noin 10 kDa:n yksittäisenä juovana. Puhdistettu täti-72— I
polypeptidi oli aktiivinen sisäänotto/transaktivaatiomää- ΐ i 30 rityksessä. Lisäsimme polypeptidin sellaisten ihmisen hepa- ! | toomasolujen viljelmäelatusaineeseen, jotka sisälsivät tat- j re spons i ivi s en kudosplasminogeeniaktivaattori ("tPA") -re- | portterigeenin. Klorokiinin ollessa läsnä (0,1 mM) , pohdis- j $ $ 22 tettu täti”7;2-proteiini (100 ng/xnl) indusoi tPA:n ekspres-sion noin 150-kertaiseksi.
Kul j etuspolypepfcidien kemiallinen synteesi
Monien erilaisten kuljetuspolypeptidien kemiallista 5 synteesiä varten käytimme kemiallisesti saatavilla olevaa automatisoitua järjestelmää (Applied BiosystemS Model 430A -syntetisaattoria:) ja noudatimme järjestelmän valmistajan suosittelemia menetelmiä. Poistimme suojaryhmät HF-käsit-telylla ja eristimme synteettiset polypeptidit tavanomai-10 silla käänteisfaasi-HPLC-menetelmillä. Kaikkien synteettisten polypeptidien eheys varmistettiin massaSpektrometriana-lyysillä.
Esimerkki 2 p-galaktosidaasikonjugaatit 15 Kemiallinen silloitus SMCCillä β-galaktosidaasih asetylointia varten fkysteiini-sulfhydryyliryhraien suojaamiseksi) liuotimme 6,4 mg kaupallisesti saatavilla olevaa β-galaktosidaasia (Pierce Chem. |
Co,, luettelonro 32101G) 200 pl:aan 50-millimolaarista fos-20 faattipuskuria (pH 7,5). Lisäsimme 10 μΐ jodietikkahappoa, joka valmistettiin liuottamalla 30 mg jodietikkahappoa 4 mlraan 50-millimolaarista fosfaattipuskuria (pH 7,5), 200 plraan β-galaktosidaasiliuosta, (Seuraavissa kokeissa havaitsimme joäiasetamidin olevan edullinen korvike jodietik-25 kahapolle.) Annoimme reaktion edetä 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten erotimme asetyloiduh β-galaktosi-daasin reagoimattomasta jodietikkahaposta lataamalla reak-tioseoksen (Pharmacia) pieneen G— 25-geel:isuodatuspylvääseen \ (Pharmacia LKB, Piscataway, MJ) ja keräämällä välisijatila- j 30 vuuden. \
•I
Ennen asetylo idun β-galakt os idaas in ami ini ryhmien j SMCC-aktivaatidta konsentroimme 2 ml G-25-pylväästä kerät- j tyä entsyymiä 0,3 ml:ksi Centricon 10 -ultrasuodätusXait- j j | j $ | 23 teessä {Amicon, Danvers, MA). Lisäsimme konsentroituun ase-fcyloituun β-galaktosidaasiin 19 pg sulfo-SMCC:tä (Pierce Chem. Co., luettelonro 22322G), joka oli liuotettu 15 pl:aan dimetyylifOCTiamiäia ("DMF"). Annoimme reaktion edetä 30 mi-5 nuuttia huoneenlämpötilassa. Erotimme sitten β-galaktosi-daasi“SMCG:n DMF·. stä ja reagoimattomasta SMCC: stä viemällä sen pienen G-2 5-gee1isuodatuspylvään läpi.
ilotta saisimme silloitettua kul jetuspolypeptidit kemiallisesti β-galaktosidaasiin, sekoitimme β-galaktosi-10 daasi-SMCC-liuoksen 100 pg:aan kuljetuspolypeptidiä (tatl- 72, tat37-72, tat38-58GGC, tat37-58, tat47-58GGC tai tatCGG47-58), joka oli liuotettu 200 pl:aan 50-millimolaa-rista fosfaattipuskuria (pH 7,5). Annoimme reaktion edetä 60 minuuttia huoneenlämpötilassa. Eristimme sitten kulje-15 tuspolypept idi-β-galaktos idaasikonjugaatin lataamalla reak-
tioseoksen S-2ÖÖHR~geelisuodatuspylvääseen ja keräämällä välisijatilavuuden. I
Nain hankittu ktiIjetuspolypepti<lL-p~gaiakt#.siciaasi’-' j konjugaätti antoi positiivisia tuloksia, kun siitä määri-20 tehtiin. tat tavanomaisissa Western blot- ja ELISA-ana lyyseissä, jotka suoritettiin tat:ia vastaan suunnatuilla kanin polyklonaalisilla vasta-aineilla. Western blot- ja i ELISA-analyysistä yleisen esityksen voi löytää E. Harlowin j ja D. Lanen teoksesta Antibodies; A Laboratory Manual, Cold j
25 Spring Harbor Laboratory (1988). Geelisuodatusanalyysi Su- I
perose 6:11a (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) osoitti, että I
kuljetuspolYpeptidi^-galaktosidaasikonjugaäfcin molekyyli- j paino oli noin 540 000 daltonia. Kuljetuspoiypeptidi-β- j
galaktosidaasikonjugaatin spesifinen aktiivisuus oli 52 % I
30 β-galaktpsidaasilähtömateriaalin spesifisestä aktiivisuu- j
desta, kun se määritettiin ö-nitrofenyyli^-D-galaktopyra- I
i nosidilla ("ONPG") . ONPG-määritysmenetelmä kuvataan yksi- j | | $ ] x 24 tyiskohtaisesti Sambrookin ym. teoksessa (edellä) sivuilla 16,66 - 16,67* β-galaktosidaasikonjugaattien otto solujen sisään
Lisäsimime konjugaatit HeLa-solujen (ATCC nro CCL2) 5 elatusaineeseen lÖQ-mikromolaarisen klorokiinin ollessa läsnä tai poissa, Ihkuboimme soluja 4 - 18 tuntia 37 °C:n lämpötilassa/5,5 % C02. Kestävöimme solut fosfaattipusku-roidussa suolaliuoksessa ("PBS"}, joka oli 2-%:inen formaldehydin ja 0,2-%:inen glutaraldehydin suhteen., 5 minuutin 10 ajan 4 °C:n.lämpötilassa. Pesimme sitten solut kolme kertaa 2-millimolaarisella MgClsilla PBS:ssä ja värjäsimme ne X-Gal:11a 37 °C:n lämpötilassa. X-gal on väritön β-galaktosi-daasin substraatti. (5-bromi-4-kloro-3-indolyyli-B-galakto-sidi), joka tuottaa sinisen tuotteen, kun β-galaktosidaasi 15 katkaisee sen. Meidän X-gal-värjäysliuoksemme sisälsi 1 mg:n X-gal:ia (Bio.-Rad, Richmond, CÄ, luettelonumero 170- j 3455) per ml PBS;ää, joka oli 5-millimolaarinen kaliumfer- ! £i syanidin, 5-millimolaarinen kaliumferrosyanidin ja 2-mil-iimolaarinen MgCl2:n suhteen.
20 Tutkimme värjätyt solut mikroskoopilla jopa 400- kertaisillä suurennoksilla. Sellainen mikroskooppinen tutkiminen paljasti tuman värjäytymisen, samoin kuin sytoplasma, s en värjäytymisen.
Solut, joihin tat37-72-3~galaktosidaasikonjugaatti ]
25 tai tatl-72-p-galaktosidaasikonjugaatti lisättiin, värjäy- I
tyivät tummansinisiksi, β-galaktosidaasiaktiivisuutta voi- ] ti in havaita niinkin lyhyen kehitysajan kuin 15 minuutin \ jälkeen. Vertailun vuoksi pitäisi huomata, että ainakin 6 | tunnin pituinen värinkehitysaika vaaditaan normaalisti, kun 30 β-gäiaktosidaasiaktiivisuus viedään soluihin β-galaktosi- äaasigeenin transfektion avulla. Tuman värjäytyminen oli näkyvissä klorokiinin poissa ollessa, vaikkakin tuman vär- j jäytymisen intensiteetti oli hieman suurempi klorokiinillä j ] j 25 käsitellyissä soluissa. Kontrollisoluissa, jotka oli käsitelty konjugoitumattoinalla β-galaktosicäaasilla, ei ollut havaittavissa värjäytyrnistä.
Katkaistavissa oleva konjugointi suoralla äisulfi- 5 dilla
Kuliakin pi-galaktosiääasitetrameerilla on 12 kyste-iinitähdettä, joita voidaan käyttää suoraan disulfidisidok-seen kuljetuspolypeptidin kysteiinitähteeseen. Tat37-72 :n sulfhydryylin pelkistämiseksi ja sitten suojaamiseksi liuo-10 timme 1,8 mg (411 nanomoolia) tat37--72: ta 1 ml: aan 50-millimolaarista natriumfosfaattia (pH 8,0), joka oli 150-millimolaarinen NaCl:n, 2-millimolaarinen EDTA:n suhteen ja panimme liuoksen Reduce-Imm-pylvääseen (Pierce Chein. Co. ,
Rockford, IL) . 30 minuutin kuluttua huoneenlämmössä eluoim-15 me tat37-72:n pylväästä 1 ml:n erillä samaa puskuria, putkiin jotka sisälsivät 0,1 ml lO-millimolaarista 5,5Γ-άιΐ1ο- j bis(2-nitrobentsoehappoa) ("DTNB"). Jätimme pelkistyneen i tat37-72-polypeptidin DTNB:n luo 3 tunniksi. Poistimme sitten reagoimattoman DTNB:n tat37-72-TNB:stä geelisuodatuk-20 sella 9 ml:n Sephadex G 10 -pylväässä (Pharmacia LKB, Pis-cataway, NJ) . Liuotimme 5 mg (3,~galakfcosiäaasia 0,5 ml:aan puskuria ja poistimme siitä suolat 9 ml:n Sephadex G-25 | -pylväässä (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) , jolloin saimme j 3,8 mg β~galaktO:ε±daasia/ml puskuria. Sekoitimme 0,5 ml :ii \ 25 erät β-galaktosidaasiliuosta, josta suolat oli poistettu, f 0,25 tai 0:,:5 ml:aan tat37-72~TNB-valmistetta, ja. annoimme f suoran disulfidisilloitusreaktion jatkua huoneenlämpötilas- j
sa 30 minuutin ajan. Poistimme reagoimattoman tat37-72- I
TNB:n β-galaktosidaasikonjugaatista geelisuodatuksella 9 : 30 ml:n Sephacryl S-200 -pylväässä. Monitoroimme silloitusre- aktion laajuutta epäsuorasti mittaamalla abs o rbans siä 412 ] nm:n aallonpituudella, joka johtui vapautuneesta TNB*stä. j •Ä 26 Näin tuotetut suorat disulfidikonjugaatit otettiin soluihin {tuloksia ei esitetä).
Katkaistavissa oleva konjugointi SPDPsllä Käytimme heterofoifunktionaalista siHoitusreagens-5 siä ("SPDP"), joka sisältää katkaistavissa olevan disulfi-disidoksen, muodostamaan silloituksen seuraavien välille: 1) β-galaktosidaasin primääriset amiiniryhmät ja tatl~72:n kysteiinisulfhydryylit {metabolisesti leimattu 3sS:llä), tai 2) rodamiinileimatun p-galaktösidaasin primääriset 10 amiiniryhmat ja tat37-72:n aminoterminaalinen kysteiini-sulfhydryyli.
latl-72“konjugaatiota varten liuotimme 5 mg β-ga-laktosidaasia 0,5 ml:aan SO-millimolaärista natriumfosfaat-tia {pH 7,5), joka oli 150 mM NäCl :n ja 2 rtiM MgCl2:n suh-15 teen, ja poistimme suolat β-galaktosidaasista 9 ml:n Sepha-dex G-25-pylväässä {Pharmacia LKB, Piscataway, NJ). Käsittelimme β^αΙ^1θΞΐ:ά3Β5ΐη, josta suolat oli poistettu, 88-kertaisella molaarisella ylimäärällä: jodiasetamidia huo neenlämmössä 2 tunnin ajan vapaiden sulfhydryyliryhmien 20 tukkimiseksi. Sen jälkeen kun reagoimaton jodiasetamidi oli poistettu geelisuodatuksella, käsittelimme suojatun β-galaktosidaasin 10-kertaisella molaarisella ylimäärällä SPDP:ta huoneenlämpötilassa. 2 tunnin kuluttua vaihdoimme puskurin ultrasuodatuksella (Ultrafree 30, Millipqre, Bed-25 ford, MA) . Lisäsimme sitten 4“kertaisen molaarisen ylimää- \ rän leimattua tatl-72:ta ja annoimme silloitusreaktion ede~ tä yli yön huoneenlämpötilassa. Poistimme reagoimattoman | tatl-72:n geelisuodatuksella 9 mi :n Sephacryl S-2O0-pyl~ \ väässä. Leimatun tatl-72:n tunnettua spesifistä aktiivi- j
30 suutta käyttämällä laskimme:, että .yhtä β-galaktosidaasi- J
tetrameeriä kohti oli 1,1 silloitettua tatl-72~poiypepti- :j diä. ONPG-määritystä käyttämällä havaitsimme, että konju- j goitu β-galaktosidaasi oli säilyttänyt 100 % entsymaatti- j ! $ $ 27 sesta aktiivisuudestaan. Käyttämällä soluun inkorporoi tune en radioaktiivisuuden mittausta ja X-gal-värjäystä, osoitimme että konjugaatti oli otettu sisään viljeltyihin HeLa-soluihin, 5 Tat37-72-konjugaatiota varten menettelimme aikai- semmassa kappaleessa kuvatulla tavalla, paitsi että leimasimme β-galaktosidaasin rodamiinimaleimidilla (molaarinen suhde 5:1) huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan, ennen jo-diasetamidikäsittelyä {100:1 jodiasetamidin molaarinen yli-10 määrä). Silloitusreaktiossa käytimme SPDP-suhdetta 20:1 ja tat37-72~suhdetta 10:1. Arvioimme että konjugoidulla tuotteella olisi noin 5 rodamiinimolekyyliä (UV-absorbanssin perusteella) ja noin 2 tat37~72-osaa (geelitiltraation perusteella) per β-galaktosidaasitetrameeri. Tästä menette-15 lystä saadulla konjugaatilla oli säilynyt noin 35 % β- galaktosidaasin alkuperäisestä entsymaattisesta aktiivisuu- | desta. Osoitimme X-gal-värjäystä ja rodamiinifluoresenssia j käyttämällä, että SPPP-konjugaatti otettiin sisään viljel- j tyihin HeLa-soluihin. ! 20 Esimerkki 3 ! $
Eläintutkimukset β-galaktosidaasikonjugaateilla j
Konjugaatin puoliintumisajan määrittämistä ja bio- j logisen jakautumisen: analysointia varten injektoimme joko: | 200 |ig SMCC-p-galaktosidaasia (kontrolli) tai tatl-72-β-25 galafcfcosidaasia suonensisäisesti ("IV") Balb/c-hiirten f (Jackson Laboratories) häntälaskimoihin, joko klorokiinin ;j kanssa tai ilman. Keräsimme verinäytteitä tietyin välein 30 minuutin ajan. 30 minuutin kuluttua uhrasimme eläimet ja poistimme elimet ja kudokset fristokemiallista analyysiä 30 varten.
Mittasimme β-galaktosidaasin aktiivisuuden verinäytteissä GNPG-määrityksellä. QiiPG-määritysmenetelmä kuva- j taan yksityiskohtaisesti Sambrookin ym. teoksessa (edellä) j 28 sivuilla 16.66 - 16.67. β-galaktösIdaasi ja tatl-72-.-β- galaktosidaasi poistuivat nopeasti verenkierrosta. Arvioimme että niiden puoliintumisajat olivat 3-6 minuuttia. Nämä kokeelliset vertailut viittasivat siihen, että tafcl-72-5 kuljetuspolypeptidin kiinnittymisellä' on vähän tai ei lainkaan vaikutusta β-gslaktosidaasin poistumisnopeuteen verestä .
Jotta voisimme: havaita kuljetuspolypeptidi-p-galäk-tosidaasikonjugaattien oton solun sisään, valmistimme ohui-10 ta kudosjääleikkeitä uhratuista eläimistä {edellä}, suoritimme kestävöirmin esimerkissä 2 (edellä) kuvatulla tavalla ja alistimme ne tavanomaiseen X-gal-värj äysmenettelyyn.
Maksa, perna ja sydän värjäytyivät voimakkaasti. Keuhko ja luuranka li has: värjäytyivät vähemmän voimakkaasti. Aivoissa, 15 haimassa ja munuaisessa ei näkynyt havaittavissa olevaa värjäytymistä. Mikroskooppinen tutkimus suurella suurennoksella paljasti vahvaa värjäytymistä solussa ja joissakin tapauksissa tumassa, ilmeisesti endo te e1isolui s sa, jotka ympäröivät kudoksiin menevää verivarastoa.
2 0 Esimerkki 4
Soluihin sisään menon testauksia β-galaktosidaasin ja polyarginiinin sekä β-galaktosidaasin ja polylysiinin muodostamilla konjugaateilla
Verrataks.emme yksinkertaisten, emäksisistä aminöha- | 25 poista koostuvien polymeerien tehoa meidän tat-peräisten \ kuljetuspolypeptidiemme tehoon, konjugoimme kaupallisesti | saatavilla olevan polyarginiinin {Sigma Chem Co., St. Lo- | uis, MO, luettelonro P-4663) ja polylysiinin (Sigma, luet- j telonro P-2658) p-galaktosidaasiin esimerkissä 2 edellä ku- ! 30 vatulla tavalla. Lisäsimme konjugaatit HeLa-splujen elatus- aineeseen konsentraätiona 1 - 30 pg/ml, klorokiinin kanssa tai ilman. Sen jälkeen kun oli inkuboitu könjugaättien
S
i ! | 29 kanssa, kestävöimme ja värjäsimme solut ja tutkimme ne mikroskoopilla, kuten esimerkissä 2 edellä on kuvattu.
Po ly 1 y s iin i -* β - gaiakt o sidaa s ikon j ugaatti antoi matalat pintavärjäytymistasot eikä tUitan värjäytymistä. Polyar-5 giniini-p-galaktosidaasikonjugaatti antoi intensiivisen yleisen värjäytymisen, mutta tällöin näkyi vähemmän tuman värjäytymistä kuin tatl-72-0-galaktosidaasi- ja tat37-72-p-galaktosidaasikonjugaateillä, Jotta voisimme tehdä eron po-lyarginiini-p-galaktosidaasikonjugaatin solun pinnalle si~ 10 toutumisen ja varsinaisen internalisaation välillä, käsit telimme solut trypsiinillä, proteaasilla, ennen kestävöin-ti- ja värjäysmenettelyjä. Trypsiinikäsittely eliminoi suurimman osan polyarginiini-(3:~galaktoS:idaasilla värjättyjen solujen X-gal-värjäytymisestä, mikä viittasi siihen että 15 polyarginiini-O-galaktosidaasikonjugaatti oli sitoutunut solujen ulkopuolisiin rakenteisiin pikemminkin kuin todella internalisoitunut. Sitä vastoin solut, jotka oli altistettu i tatl~72- tai 37-72-B-galaktosidaasikonjugaateille, värjäytyivät trypsiinikäsittelystä huolimatta, mikä viittasi sii-20 hen että β-galaktosidaasilasti oli solujen sisällä ja näin suojassa trypsiinidlgestiolta. Köntrollisoluissa, jotka oli käsitelty konjugoimattomalla β-galaktosidaasilla, ei näky- \ nyt havaittavissa olevaa värjäytymistä. j 3 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ |
N
: $ :i 30
Esimerkki 5
Piparj uuriperoksIdaasikon jugaati t
Kemiallinen silloitus
Jotta saisinune tuotettua tatl-72-HRP- ja tat37-72-5 HRP-konjugaatit, käytimme kaupallisesti saatavilla olevaa HRP-liittimistarvikesarjaa (mäleimidilla aktivoitu Immuno-pure-HRP, Pierce Chem. Co., luettelonro 31498G). Tarvike-sarjan mukana tuleva HRP on muodossa, joka on selektiivisesti reaktiivinen vapaiden -SH-ryhmien suhteen. (Kysteii-10 ni on 20 proteiiniaminohaposta ainoa, jolla on vapaa -SH-ryhmä.) Kuljetuspolypeptidl-HRP-konjugaatiokokeessa, joka käsitti tatl-72:n, tuotimme tatl-72-alpitusmateriaalin E. colissa ja puhdistimme sen HPLC:llä kuten esimerkissä 1 edellä kerrotaan. Lyofilisoimme 200 yg puhdistettua tatl-15 72:ta (joka liuotettiin TFA/asetonitriiliin) ja liuotimme sen uudestaan 100 yltään IQQ-millimolaarista HEPES-puskuria (pH 7,5), joka oli 0,5-millimolaarinen EDTAtn suhteen. |
Lisäsimme 50 yl tatl-72- tai tat37-72-liuosta 50 yltään j
Immunopure HRPttä (750 yg entsyymiä) 25Ö-milliinolaarlsessa J
20 trietanoliamiinissa (pH 8,2). Annoimme reaktion jatkua 80 minuuttia huoneenlämpötilassa. Näissä olosuhteissa noin 70 % HRPtstä oli liittynyt kemiallisesti tatl-72-raolekyylei- j hin. Monitoroimme liittämisreaktion laajuutta SpS-PAGE- | analyysillä. | 25 HRP-konjugaattien otto solun sisään |
Lisäsimme konjugaatit HeLa-solujen elatusaineeseen f pitoisuutena 20 yg/ml, klorokiinin (100 yM) ollessa läsnä | tai poissa. Inkubpimme soluja 4 - 18 tuntia 37 °C:n lämpö- | tilassa, 5,5 % C02. Kehitimme HRP-värjäyksen käyttämällä 4- j 30 kloro-l-naftolia (Bio-Rad, Richmond, CA, luettelonro 170-6431) ja vetyperoksidia HRP:n substraattina, Seuraavlssa kokeissa korvasimme diaminobentsidiinln (Sigma Chem. Co.,
St. Louis, MO) 4-kloro-l-naftolilla.
Soluissa, joihin lisäsimme kuljetuspolypeptidi-HRP-35 konjugaatit, näkyi soluun liittynyttä HRP-aktiivisuutta.
| $ 31
Lyhyet konjugaatille altistamisen ajanjaksot saivat aikaan värjäytymiskuvioita, jotka vaikuttivat pistemäisiltä, mikä mahdollisesti heijastaa HRPitä endosyyttisissä vehikke-leissä. Pitempien inkubaatioiden jälkeen havaitsimme dif-5 fuusia tuman ja sytoplasman värjäytymistä. Kontrolliso- luissa, jotka oli käsitelty konjugoimattomalla HRPillä, ei näkynyt havaittavissa olevaa värjäytymistä.
Esimerkki 6 PE-ÄDP-ribösylaat io-osa-konjugaatit 10 Kloonasimme ja ekspressoimme E. colissa Pseudomo nas- ekso toksiinin ("PE") sekä täyspitkänä muotona että sen ADP-ribosyiaatio-osan muodossa. Tuotimme kuljetuspolypep-tidi-FE-konjugaatteja sekä geneettisellä fuusiolla että kemiallisella silloituksella.
15 Plasmidin muodostaminen
Plasmidin pTat70(ApaI) muodostamiseksi sijoitimme ainutkertaisen Apal-kohdan tat:n avoimeen lukukehykseen | digestöimalla pTat72:n BamHIillä ja EcoRIiliä, ja sijoi- | i timme kaksijuosteisen linkkerin, joka koostui seuraavista ! 20 synteettisistä oligonukleotideista: | GATGCCAGAC CCACCAGGTT TCTGTGTCGG GCCCTTAAG (SEQ ID j nro 8) ^ AATTCTTAAG GGCCCGAGÄG AGAAACCTGG TGGGTCTGG (SEQ ID nro 9) | 25 Linkkeri korvasi tatin G-pään, LysGlnStop, ÖlyPro- |
StopiHa. Linkkeri lisäsi myös ainutkertaisen Apal-kohdan, | joka oli sopiva tat-sekvenssin kehyksensijäistä fuusiota varten PE-ADPih ribosylaatiQ-osaa koodattavien sekvenssien kanssa, käyttämällä PE-sekyenssissä luonnöstaan Olevaa 30 Apal-kohtaa. Plasmidin pTat7ÖPE (SEQ ID nro 10) muodostamiseksi poistimme Apal-EooRI-fragmentin, joka koodittaa PE-ADP:n ribosylaatlo-osaa, plasmldista GD4(18l)-PE(392).
CD4(181)~PE(392)in muodostaminen on kuvattu G. Winklerin j ym. artikkelissa ("CD4-Pseudomonas Exotoxin Hybrid | 35 Proteins; Modulation of Potency and Therapeutic Window j 3
X
! 32
Through Structural Design and Characterization of Cell Internalization", AIDS Research and Human Retroviruses, 7, s. 393 - 401 (1991)). Sijoitimme Apal-EcoRI-fragmentin pTat70(Apai):een, joka oli digestoitu Apal:llä ja 5 EcoRIillä.
Plasmidin pTatSPE {SEQ ID nro 11) muodostamiseksi poistimme 214 emäsparin kokoisen Ndel-Apal-fragmentin pTat70PE:stä ja korvasimme sen kaksijuosteisella linkke-rillä, jossa on Ndel- ja Apal-kohesiiviset päät, ja joka 10 koodittaa tat-tähteitä 1 - 4 ja 67 - 70, ja joka koostuu seuraavista synteettisistä oligonukleotideista: TATGGAACCG GTCGTTTCTC TGTCGGGCC (SEQ ID nro .12) GGACAGAGAA ACGACCGGTT CCA (SEQ ID nro 13).
TÄT8 - PE: n. puhdi s tus 15 pTat8-PE~konstruktion puhdistus tuotti PE-ADP;n ribosylaatio-osa-polypeptidin, joka oli fuusioitu tat-pro-teiinin aminohappoihin 1 - 4 ja 67 - 70. pTat8-FE-ekspres- j siotuote ( "tat8-PE") toimi PE-ADP:n ribosylaatio-ösa-osana (ja konjugoimattomana kontrollina) jäljempänä kuvatuissa 20 kemiallisissa silloituskokeissa. 8:n tat-aminohapon kodo- nit olivat artefaktoja kloonausmenetelmästä, joka välit- | tiin mukavuussyistä. PE-ADP:n ribosylaatio-osaan fuusioi- \ dulla 8 aminohapolla ei ole kuljetusaktiivisuutta (kuvio
2). I
25 Tat8-PE:n puhdistusta varten suspensoimme 4,5 g j
ρΤΆΤ8-ΡΕ-transformoitua E. colia 20 ml:aan 5Ö-millimolaa- I
rista Tris-HCl:ää (pH 8,0), joka oli 2-miilimolaarinen EDTAiri suhteen. Hajotimme solut "French press” -laitteessa ja poistimme liukenemattoman roskan sentrifugoimalla 30 10 Ö0Q rpm:n nopeudella 1 tunnin ajan SA6ÖÖ-roottorissa.
Suurin osa tat8-PE:stä oli supernatantissa. Latasimme super na tantin 3 ml:n Q~Sepharose Fast Flow -ioninvaihtopyl-vääseen (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ). Näytteen latauk- j
sen jälkeen pesimme pylvään 50-millimolaarisella Tris- I
35 HClillä (pH 8,0), joka oli 2-milliinolaarinen EDTA:n suh- j 5
J
33 teen. Pylvään pesemisen jälkeen suoritimme vaiheittaisen gradienttieluution käyttämällä samaa puskuria, joka oli 100-, 200- ja 4ÖQ-millimolaar inert NaCl:n suhteen. Tat8-PE eluoitui 200-millimolaarisella Na€l:llä. Xoninvaihtokroma-5 tografian jälkeen puhdistimme edelleen tat8-PE:n geelisuo-datuksella Superdex 75 FPLC-pylväässä (Pharmacia LKB,
Piscataway, NJ). Tasapainotimme geelisuodatuspylvään 50-millimoläarisella HEPES-puskurilla (pH 7,5). Sitten la-tasimme näytteen ja suoritimme eluution tasapainotuspusku-10 rilla nopeudella 0,34 ml/min. Keräsimme 1,5 minuutin fraktioita ja varastoimme tatS-PE-fraktiot -70 °C:n lämpötilaan.
TÄT8-PE:n silloitus
Koska PE-ADP-ribosylaatio-osassa ei ole kysteiini-15 tähteitä, käytimme sulfo~SMCC:tä (Pierce Chem. Co., Rockford, IL, luettelonro 22322 G) kuljetuspolypeptidin ja s tat8-PE:n konjugointiin. Suoritimme konjugoinnin 2-vaihei- j sella reaktiomenetelmällä. Ensimmäisessä reaktiovaiheessa | käsittelimme tat8-PE:n (3 mg/ml)' 50-millimölaarisella | 20 HEPES-puskurilla (pH 7,5), joka ;öli 10-millimolaarinen j sulfo~SMCC:n suhteen, huoneenlämpötilassa 40 minuutin ajan. Sulfo-SMCC lisättiin reaktioon 100-millimolaarisena karitaliuoksena 1-molaarisessa HEPES-’puskurissa, pH 7,5). |
Erotimme tat8-PE~sulfo-SMCC:n reagoimattomasta sulfo- |
25 SMCC: stä geelisuodatuksella PoDG-pyiväässä (.Bio-Rad, I
Richmond, CA), joka oli tasapainotettu 25-millimolaarises- | sa HEPES-puskurissa (pH 6,0), joka oli 25-millimolaarinen j
NaCl:n suhteen. Toisessa reaktiovaiheessa annoimme tatfi-PE-suifo-SMCC:n (1,5 mg/ml, 100 nvM HEPES (pH 7,5), 1 mM
30 EDTA) reagoida puhdistetun tat37-72:n kanssa (lopullinen konsentraatio 600 μΜ) huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Sxlloitusreaktion lopettamiseksi lisäsimme kysteiiniä.
\
Analysoimme silloitusreaktiotuotteet Sps-PAGE;ssa, Noin 90 | % tat8-PE:stä silloittui tat37-72-kuljetuspolypeptidiin j 35 näissä oloissa. Noin puolella konjugoituneesta tuotteesta 1 i ! 5 3 34 oli yksi kuljetuspolypeptidiosa, ja puolella oli kaksi ku 1 j etuspolyp ep ti dips aa,
Soluton määritys PE-ADP;n. ribosylaatiolle Sen varmistamiseksi, että PE:n ribosylaatio-osassa 5 säilyi sen biologinen aktiivisuus (se on: tuhoava riboso-mien muokkaus) kuljetuspolypeptideihin konjugoimisen jälkeen, testasimme kulj et:uspolypeptidi-PE-ÄDP~ribosylaatio~ konjugaattien vaikutusta in vitro (se on: soluttomasti) translaatioon. Kutakin in vitro translaatiokoetta varten 10 teimme tuoreen translaatioseoksen ja pidimme sen jäillä.
In vitro translaätioseos sisälsi 200 μΐ kanin retikulo-syyttilysaattia (Promega, Madison, WI), jossa oli 2 μΐ 10-millimolaarista ZnCl2:ta (valinnainen), 4 μΐ 20:n prate- | iiniaminohapon muodostamaa seosta, josta puuttui metionii- j
15 ni, ja 20 μΐ 35S-metioniinia. Lisäsimme 9 pliaan translaa- I
tioseosta 1 - 1000 ng kulj etuspolypeptidi-PE-konjugaattia (edullisesti 1 μ1:η tilavuudessa) tai kontrollia, ja esi-inkuboimme seosta 60 minuuttia 30 °C:n lämpötilassa. Lisäsimme sitten 0,5 μΐ BMV-RNA:ta kuhunkin näytteeseen ja 20 inkuboimme vielä 60 minuuttia 30 °C:n lämpötilassa. Varastoimme näytteet -70 °G:n lämpötilaan sen jälkeen kun olim- |
me lisänneet 5 μΐ 50-prosenttista glyserolia per näyte. Anälysoimine in vitro translaatioreaktion tuotteet SDS- I
PAGE-menetelmin. Latasimme 2 μΐ kutakin translaatioreak- j
25 tioseosta (sekä sopivan määrän SDS-PAGE-näytepuskuria) I
$ kaistaa kohden SDS-geeleihin. Elektroforeesin jälkeen vi- | sualisoinune 35S:n sisältävät in vitro -translaatlotuotteet j fluorografiällä. |
Havaitsimme edeltävässä kappaleessa kuvattua inene-30 telmää käyttämällä, että PE-ADP:n ribosylaatio-osalla, J
joka on fuusioitu geneettisesti tatl-70-kuljetuspoiypepti- |
diin, ei ollut biologista aktiivisuutta, se on: se ei es- I
tänyt in vitro translaatiota. Sitä vastoin samaa menetel- j mää käyttämällä havaitsimme, että PE~ADP:n ribosylaatio- | 35 osa, joka on silloitettu kemiallisesti tat37-72-kuljetus- j 35 palypeptidiin, oli säilyttänyt täyden biologisen aktiivisuuden, se on: inhiboinut in vitro translaation yhtä hyvin kuin kontrollit, joissa oli konjugoimattomia PE-ABP:n ri~ bosylaatio-osia (kuvio 2).
5 Sytotoksisuusniääritys PE~äDP:n ribosylaatiolle
Toisessa testissä, jossa oli mukana tat37~72:n ja PE~ADP:n ribosylaatio-osan konjugaatti, lisäsimme sen viljellyille Hela-soluille klqroklinin (100 μΜ) ollessa läsnä tai poissa. Määritimme sitten sytotoksisuuden mittaamalla TO in vitro proteiinisynteesiä, jonka osoittaa trikloorietik-kahapolla ("TCA’’) säostettavissa oleva radioaktiivisuus soluekstrakteissa.
Suoritimme sytotoksisuusmäärityksen seuraavasti.
Hajotimme HeLa-splukerrokset, sentrifugoimme solut ja re-15 suspenäpimme ne elatusalneeseen tiheydellä 2,5 x lO4/ml·
Käytimme 0,5 ml suspensiota/kuoppa, kun käytimme 24-kuop- I
paisia levyjä, tai 0, 25 ml suspensiota/kuoppa, kun käytim- j me 48^kuoppaisia levyjä- Lisäsimme konjugaatteja tai kon- | jugoimattomia kontrolleja, jotka oli liuotettu 100 μΐ:aan \
20 PBS:ää, kuoppiin sen jälkeen kun solujen oli annettu aset- I
tua ainakin 4 tunnin ajan. InkUboimme soluja konjugaattien | tai kontrollien läsnäollessa 60 minuutin ajan 37 °C:n läm- | pötilassa, sitten lisäsimme 0,5 ml tuoretta elatusainetta 1 kullekin solulle ja inkuboimmme soluja vielä 5 ~ 24 tun- 1 25 tia. Tämän inkubaation jälkeen poistimme elatusaineen kus- | takin kuopasta ja pesimme solut kerran noin 0,5 mX:lla | j PBS:ää. Sitten lisäsimme 1 pCi 35S-metioniinia (Amersham) ! per 100 μΐ per kuoppa, in vivo soluleimauslaatu (SJ.1Ö15) j ja inkuboirame soluja 2 tunnin ajan. Kahden tunnin kuluttua 1 30 poistimme radioaktiivisen elatusaineen ja pesimme solut 3 kertaa kylmällä 5-prqsenttisella TCA:lla ja sitten kerran PBS:llä. Lisäsimme 100 μΐ 0,5-molaarista NaOH:ta kuhunkin kuoppaan ja annoimme solujen hajoamisen ja proteiinien liukenemisen tapahtua ainakin 45 minuutin ajan- Lisäsimme 35 sitten kuhunkin kuoppaan 50 μΐ l-molaarista HCl:ää ja 36 siirsimme kunkin kuopan koko sisällön tuikenesteeseen radioaktiivisuuden nestetuikemittausta varten.
Klorokiinin poissa ollessa oli olemassa selvä annosriippuvainen soluproteiinisynteesin inhibitio vasteena 5 käsittelylle kul jetuspolypeptidin ja PE~ADF:n ribosylaa-tio-osan konjugaatilla, mutta ei vasteena käsittelylle konjugoimattomalla PE-ADP:n ribosylaatio-osalla. Tulokset esitetään yhteenvetona kuviossa 2, Tat37-72:een konjugoi-tuna PE~ADP:n ribosylaatio-osa vaikutti olevan kuljetettu 10 3 - 10 kertaa tehokkaammin kuin tatl-72:een konjugoituna.
Konjugoimme myös kuljetuspolypeptidit tat3S-58GGC, tat37-58, tat47-58GGC ja tatCGG-47-58 PE-ADP:n ribosylaatio-osaan. Kaikki nämä konjugaatit saivat aikaan biologisesti ΐ aktiivisen PE-ADP:n ribösylaät±Q-osan oton solun sisään 15 (tuloksia ei esitetä).
Esimerkki 7
Ribonukleaasikonj ugaatit
Kemiallinen silloitus
Liuotimme 7,2 mg naudan haiman ribonukleaasi A:ta, 20 tyyppi 12A (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, luettelonro R550Q) 200 μΐ:aan PBS:ää (pH 7,5). Eibonukleaastliuakseen lisäsimme 1,4 mg sulfo-SMCC:tä (Pierce Chem. Co.,
Rockford, IL, luettelonro 22322H). Vortex-laitteella se- j koituksen jälkeen annoimme reaktion edetä huoneenlämpöti- \
25 lassa 1 tunnin ajan. Poistimme reagoimattoman SMCC;n ri- I
bonukleaasi-SMCC:stä Viemällä reaktiotuotteen 9 ml:n F6DG- j \
pylvään läpi (Bio-Rad, Richmond, CA) ja keräämällä 0,5 I
ml:n fraktioita. Tunnistimme välisijatilavuuden huippu- j fraktiot (jotka sisälsivät ribonukleaasi-SMCG-konjugaatin) j 30 monitoroimalla tIV-absorbanssia 280 nm:n aallonpituudella. j
Jaoimme yhdistetyt, ribonukleaasi-SMCC:n sisältävät frak- I
tiot 5 yhtäsuureen erään. Kuhunkin 4:ään ribonukleaasi- j SMCC-erään lisäsimme kemiallisesti syntetisoidun kuljetus- j polypeptidin, joka vastasi tat-tähteitä: 37-72 (,'37-72" ), j 35 38-58 sekä GGC karboksipäässä ("38-58GGC"), 37-58 ("CGG37- | | | 37 58" ), tai 47-58 sekä CGG aminopäässä ("06647-58”). Annoim-mekuljetuspolypeptidi-ribonukleaasikonjugaatioreaktioiden edetä 2 tunnin ajan huoneenlämmössä, ja sitten yli yön 4 °C:n lämpötilassa. Analysoimme reaktiotuotteet SDS-5 PAGE:ssa 10 - 20-prosenttisessa gradienttigeelissä. Sii lo! tus tehokkuus oli noin 60-prosenttinen kuljetuspolypep-tideille tat38-58GGC, tat37—58 ja tatCGG47-58 ja 40-pro-senttinen tat37-72:lie. Modifioiduista luokista 72 % sisälsi yhden ja 25 % sisälsi kaksi kuljetuspolypeptidisubs-10 tituutiota.
Tat37-72-ribonukleaasikonjugaattien otto solun sisään
Pidimme soluja yllä 37 °G:n lämpötilassa soiuvilje-lyinkubaattorissa Dulbeccon muokatussa Eäglen elatusai-15 neessa, jossa oli lisänä 10-prosenttinen fetaalivasikan seerumi ja penisilliini/streptomysiini. Solun sisäänoton määrityksiä varten jaoimme 105 solua 24-kuoppaiselle levylle ja viljelimme niitä yli yön. Pesimme solut Dulbeccon PBS:llä ja lisäsimme ribonukieaasikonjugaatin, joka oli 20 liuotettu 300 plraan. PBS:ää, joka oli 80 μΜ klorokiinin suhteen, konsentraatioina 0, 10, 20, 40 ja 80 pg/ml. Kun s oli inkuboitu 1,25 tuntia 37 °C:n lämpötilassa, lisäsimme 750 μΐ kasvatuselatusainetta ja inkuboinune solunäytteitä ] vielä yli yön. Yli yön inkuböinnin jälkeen pesimme solut j 25 kerran PBS:llä ja inkuboimme niitä 1 tunnin ajan Minimal |
Essential Medium -elatusaineessa ilman metioniinia (Flow j
Labs) (250 μΐ/kuoppa), joka sisälsi 35S~metiani±nia | (1 pCi/kuoppa). Kun oli inkuboitu 1 tunti radioaktiivisen j metioniinin kanssa, poistimme elatusaineen ja pesimme so- !
30 lut kolme kertaa 5-prosenttisella TCA:lla (1 ml/kuoppa/pe- I
j su). Sitten lisäsimme 250 μΐ 0,5-molaarista NaOH:ta per j kuoppa. Kun oli kulunut 1 tunti huoneenlämpötilassa, pipe- ] toimme 200 μΐ kunkin kuopan sisältöä tuikepulloon, li~ j säsirame 100 μΐ 1-raolaaristä HC1:ää ja 4 ml tuikenestettä. | 35 Sen jälkeen kun kunkin pullon sisältöä oli sekoitettu pe- | | 38 rusteellisesti, mittasirnme kussakin näytteessä oleman radioaktiivisuuden nestetuikelaskermalla.
Solun sisään ottoa koskevat tulokset esitetään yhteenvetona kuviossa 3. Kuljetuspolypeptidi tat38-58GGC 5 toimi yhtä hyvin tai hieman paremmin kuin tat37-72. Kulje-tuspolypeptidillä tatCGG47-58 oli vähentynyt aktiivisuus (tuloksia ei esitetä). Emme tiedä, oliko tällä polypepti-dillä vähentynyt sisäänmenoaktiivisuus vai oliko emäksisen alueen läheisyys ribonukleaasiin häirinnyt entsyymiaktii-10 visuutta.
Olemme käyttäneet kationinväihtokromaiografiaa (BioCAD-perfuusiokromatografiajärjestelmä, PerSeptive Blo-systems) sellaisten ribonukleaasikonjugaattien puhdistamiseen, joilla on yksi tai kaksi kuljetuspolypeptidiosaa.
15 Esimerkki 8
Proteiinikinaasi A:n inhibiittorikonjugaatit
Kemiallinen silloitus
Ostimme proteiinikinaasi A:n inhibiittori ("PKAI")
-peptidin (20 aminohappoa) Bachem California -yhtiöltä 20 (Torrence, CA). PKAIrn kemialliseksi silloittamiseksi kul-jetuspolypeptideihin käytimme joko sulfo-MBS:ää (konsen-traationa 10 mM) tai sulfo-SMPB:tä (konsentraationa 15 mM). Molemmat näistä silloitusaineista ovat heterobifunk-tionaalisia tioliryhmien ja primääristen amiiniryhmien I
25 suhteen. Koska PKAIista puuttuvat lysiini- ja kysteiini- | tähteet, sekä sulfo-MBS että sulfo-SMPB kohdistavat selek- j 5 tiivisesti silloituksen PKAI:n aminopäähän. Saatoimme | PKAI:n reagoimaan konsentraatiossa 2 mg/ml, niin että läs- | nä oli 5ö-millimolaarinen HEPES-puskuri (pH 7,5) joka oli 30 25-millimölaarinen NaCl:n suhteen, huoneenlämpötilassa 50 minuutin ajan kumman tahansa silloitusaineen kanssa. Sul-fo-MBS-reaktioseos sisälsi 10-millimolaarisen sulfo-MBS:n ja 20-prosenttisen DMF:n» Sulfo-SMPB-reaktioseos oli 15-millimolaarinen sulfo-SMPB:n suhteen ja 20-prosenttinen 35 dimetyylisulfoksidin suhteen ("DMSö"). Puhdistimme PKA:n 39 -ja slllpitusaineiden aduktit käänteisfaasi-HFLC:llä käyttäen G4-pylvästä. Eluoimme näytteet C4-pylväästä 20 - 75 -prosenttisella asetonitriiligradientilla, joka oli 0.,.1-prosenttinen trifluorietikkahapon suhteen. Poistimme aduk-5 teista asetonitriilin ja trifluorietikkahapon lyofilisoi-maila ja liuotimme ne uudelleen 25-millimolaariseen HEPES-puskuriin (pH 6,0), joka oli 25-mxllimolaarinen NaCl:n suhteen. Lisäsimme tat1-72:n tai tai37-72:n ja säädimme reaktioseoksen pH:n 7, 5:ksi lisääiaällä 1-mplaarista HEPES-10 puskuria (pH 7,5) niin että loppukönsentraatio oli 100 mM.
Annoimme sitten silloitusreaktion edetä huoneenlämpötilassa 60 minuutin ajan.
Säätelimme silloittumisen laajuutta muuttamalla kuljetuspolypeptidin ja PKAI: n suhdetta. Analysoimme s±l-15 loitusreaktion tuotteita SDS-PÄGE:ssa, Tat37-72:lla sil- j loitusreaktioissa muodostui yksittäinen uusi elektrofo- j reettinen juova. Tämä tulos oli yhdenmukainen sen kanssa j
että yksittäiseen PKAI-molekyyliin oli lisätty yksittäinen I
tat37-72-molekyyl±. Tatl-72:n tapauksessa silloitusreak- ] 20 ttoissa muodostui kuusi uutta tuotetta. Tämä tulos on yh~ j täpitävä sen kanssa, että monia PKAI-molekyylejä lisättiin j yhtä tatl-72-polypeptidiä kohti, mikä johtuu tatl-72:ssa f olevista monista kysteiinitähteistä. Kun lisäsimme PKAI:n silloitusreaktioon suurena molaarisena ylimääränä, saimme 25 aikaan vain konjugaatteja, jotka sisälsivät 5 tai 6 PKAI- \ osaa taitl-72: ta kohden. 1 PKAI-aktiivisuuden fosforylaatiomääritys in vitro Jotta saisimme testattua sulfö-MBS:llä silloitettujen kpnjugaattierx biologisen. PKAI-aktiivisuuden sailymi-30 sen, käytimme in vitro -fosforylaatiomääritystä. Tässä määrityksessä histoni V toimi substraättina proteiiniki-naasi A:n fosforylaatiossa PKAI:n ollessa läsnä tai poissa j (PKAI-konjugaattia silmällä pitäen). Sitten käytimme SDS- | PAGEa monitoroidaksemme PKAI-riippuvaisia eroja fosfory- | 35 laatioasteessa. Kussakin reaktiossa inkuhoimme 5:tä yksik- j \ j 40 köä proteiinikinaasi A:n katalyyttistä alayksikköä (Sigma) ja vaihtelevia määriä PKAI:ta tai PKAI-konjugaattia 37 °C;n lämpötilassa 30 minuutin ajan. Määritysreaktioseos oli 24-raillimolaärihen natriumasetaatin suhteen (pH 6,0) 5 ja 25-millimolaarinen MgCl2:n suhteen, 100-milIimolaarinen DTT:n suhteen, ja sisälsi 50 pCi [γ-3ΐΡ] ATP: tä ja 2 pg his-töni V:tä, 40 μΐ:n kokonaisreaktiotilavuudessa. Tätä määritystä käyttämällä havaitsiinme, että tatl-72: een tai tat37-72:een konjugoitu PKAI inhiboi fosforylaatiota yhtä 10 hyvin kuin konj ugoirnaton PKAI (tuloksia ei esitetä).
Solumääritys 1 PKAI:n ja kuljetuspolypeptidi-PKAI-konjugaattien j solun sisäänoton testaamiseksi käytimme viljeltyjä soluja, f jotka sisälsivät kloramfenikoliasetyylitrarisferaasi 15 ("CAT") -reportterigeenin cAMP-responsiivisen ekspressio- kontrolllsekvenssin alaisuudessa. Niinpä kvantitoimme pro-telinikihaasi A:n aktiivisuutta epäsuorasti mittaamalla CAT-aktiivisuutta. Tämän määrityksen ovat kuvanneet yksi- ;
tyiskohtaisesti J. R, Grove ym. ("Probind cAMP-Related I
20 Gene Expression with a Recombinant Protein Kinase Inhibi- j
tor", Molecular Aspects of Cellular Regulation. Vol. 6. I
toim. P, Cohen ja J. G. Folkes, Elsevier Scientific, \
Amsterdam, s. 173 - 195 (1991)). j Tätä määritystä käyttämällä emme havainneet PKAI:n j 25 tai minkään kuljetuspolypeptidi-PKAI-konjugaatin aktiivisuutta. Tätä tulos antoi meille kuvan, että PKAI-osa voisi hajota nopeasti mentyään solun sisään.
PKAI:n silloitus tat37-72-{3-galaktosidaasiin Olimme havainneet aikaisemmin tat37-72^~galaktosi-30 daasin solun sisään menon olevan klorokiinistä riippumatonta (esimerkki 2 edellä). Niinpä silloitimme PKAI:n tat37-72-p-galaktösidaasiin, jotta PKAI olisi mahdollisesti suojattu nopealta hajoamiselta, Käsittelimme β-galaktosidaasin 20-millimolaarisella 35 DTT:llä (pelkistävä aine) huoneenlämpötilassa 30 minuutin $ 41 ajan ja poistimme sitten DTT:n geelisuodatuksella G50-pyl-väässä MES-puskurissa (pH 5). Annoimme pelkistyneen β-ga-laktosidaasin reagoida SMPB-aktivoidun PKAI:n kanssa (edellä) pH:ssa 6,5 60 minuutin ajan. Jäljellä olevien 5 vapaiden sulfhydryyliryhmien suojaamiseksi lisäsimme N-etyylimaieimidia tai jodiasetamidia. SDS-PAGE-analyysi osoitti, että ainakin 95 % β-galaktosidaasista oli konju-goitunut. Noin 90 % konjugoidusta beta-galaktosidaasituotteesta sisälsi yhden PKAI-osan per alayksikkö, ja noin 10 10 % sisälsi 2 PKAI~osaa. Käsittelimme ΡΚΑΙ-β-galaktosi- daasikonjugaatin 10-kertaisella sulfo-SMCC:n molaarisella ylimäärällä. Saatoimme sitten ΡΚΑΙ-β-galaktosidaasi-SMCC:n reagoimaan tatl-72:n kanssa. SDS-PAGE-analyysin mukaan ΡΚΑΙ-β-galaktosidaasin ja tatl-72:n suhde vaikutti olevan 15 1:0,5, Olemme tuottaneet noin 100 pg lopputuotetta. Saos— tumisongelmien vuoksi lopputuotteen konsentraatio liuoksessa on rajattu 100 pg/ml:ksi.
Esimerkki 9 E2 ^repress or ikonj ugaa t i t 20 Kuljetuspolypeptidi-E2-repressorikonjugaattien so lun sisään oton ja E2-repressoriaktiivisuuden testaamiseksi tränsfektoimme samanaikaisesti E2-riippuvaisen report- \ teriplasmidin ja E2~ekspressioplasmiäin SV40~transformoi- | tuneeseeh "African green monkey" -munuaissoluihin ΐ 25 ("C0S7"). Sitten altistimme transfektoidut solut kuljetus- | polypeptidi-E2~repressörikonjugaateille (tehty geneettisellä fuusiolla tai kemiallisella silloituksella) tai soveliaille kontrolleille. Repressiomääritys, joka kuvataan jäljempänä, oli oleellisesti sama kuin Barsoumin ym.
30 (edellä).
Repressiomäärityssolut
Hankimme C0S7-solut American fype Culture Collection -talletuslaitoksesta, Rockville, MD (ATCC nro CRL 1651). Kasvatimme C0S7-soluja Pulbeceon modifioidussa 35 Eaglen elatusaineessa (Gibco, Grand Island, NY), jossa oli ] | 42 10 % fetaalivasikan seerumia (JRH Biosciences, Lenexa, KS) ja joka oli 4-millimolaarxnen glutamiinin suhteen { "kasva-tuselatusaine"). Solujen inkubaatio-olosuhteet olivat 5,5 % C02, 37 °C.
5 Repressioraääritysplasmidit
Meidän E2-riippuvainen I'eportteriplasmidimme pXB322hGH sisälsi ihraisen kasvuhormoni-reportterigeenin, joka oli lyhennetyn, SV40:n varhaisen promoottorin alainen, joka sisälsi 3 E2“Sitomiskohtaa ylävirrassa. Muodos-1Ö timme hGH-reportteriplasmidin pXB322gGHf kuten Barsoum yra.
ovat kuvanneet (edellä).
Täyspitkän HPV-E2-geenin ekspressiota varten muo- ; dostimme plasmidin pAGE2 (kuvio 4). Plasmidi pAHE2 sisäl- ; tää E2~geenin HPV-kannasta 16, joka on liitetty toimivasti 15 adenoviruksen myöhäiseen pääpromoottoriin, jota vahvistaa promoottorista ylävirtaan Sijaitseva SV40-tehostaja.
Eristimme HPV-E2-geenin plasmidista pHPV16 (täyspitkä HPVlfi-genomi, joka on kloonattu pBR322:eenj, jonka M.
Durst ym. ovat kuvanneet artikkelissa "A Papillomavirus 20 DNA from Cervical Carcinoma and Its Prevalence in Cancer |
Biopsy Samples from Different Geographic Regions”, Proc. I
Natl. Acad. Scsi. USA·. 80, s. 3812 - 3815 (1983) Tthllll- 1
Asel-fragmenttina. HPV~genomissa Tthllll katkaisee nukleo- | tidin 2711 ja Ase! katkaisee nukleotidin 3929 kohdalta. j 25 Teimme Tthllll-Aser-fragmentista tasapäisen DNA-polymeraa- j si 1 Klenow -reaktiolla ja ligoimme BamHI-linkkerit (New j j
England Biolabs, luettelonro 1021). Sijoitimme tämän link- j kerin sisältävän fragmentin BamHl-katkaistuun pBG331-plas-midiin saadaksemme aikaan plaämidin pAHE2.
30 Plasmidi pBG331 qn sama kuin pBG312 (R. L. Gate ym., "Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance and Expression of the Human j
Gene in Animal Cells”, Cellf 45, s. 685 - 698 (1986) ), | paitsi että siitä puuttuu BamHI-köhta SV40-polyadenylaa- | 35 tiosignaalista alavirtaan, mikä tekee BamHl-kohdan pro- 43 moottorin ja SV40-intronin välillä ainutkertaiseksi. Poistimme epäsuotavan BamHI-kohdan pBG3I2:n osittaisella BamHI-digestiolla, linearisoidun plasmidin geelipuhdistuk-sella, tasapäiden muodostamisella DNA-polymeraasi I Klenow 5 -käsittelyllä, ligaatiolla itsen kanssa ja seulomalla pläsmideja, joissa olisi haluttu BamHI-kohdan deleetio.
E2-repressoriproteiinien tuotanto bakteereissa Yksi meidän E2-repressoriproteiineistamme, E2.123, koostui HFV E2:n karboksiterminaalisista 121 aminohaposta, 10 jossa aminopäähän oli lisätty MetVal. Käytimme myös varianttia E2.123, jolle annettiin nimeksi E2.123CCSS.
E2.123:ssa on kysteiinitähteet HVP16 E2:n aminohappokoh-dissa 251, 281, 300 ja 309. E2,123CCSS:ssä kysteiinitähteet kohdissa 300 ja 309 vaihdettiin seriiniksi ja ly-15 siinitähde kohdassa 299 vaihdettiin arginiiniksi. Poistimme kysteiinitähteet kohdissa 300 ja 309, niin että kyste-liniriippuväinen kemiallinen silloitus voisi tapahtua E2-repressorin aminoterminaalisessa osassa, mutta ei E2:n minimaalisessa DNA:hän sitoutuvassa/dimerisaatio-osassa, 20 Ajattelimme, että minimaalisessa DNA:hän sitoutuvassa osassa silloitukset todennäköisesti häiritsisivät repres-sorin biologista aktiivisuutta.
Plasmidin pET8c~123:n muodostamista varten (kuvio j 5, SEQ ID nro 14) tuotimme välttämättömän DNA-fragmentin j
25 standardinomaisella polymeraasiketjureaktio ("PCR“) -tek- I
nilkoilla, joissa plasmidi pHPV16 oli templaatti. (PCR- j tekniikoista voi löytää yleisen esityksen Sambröokin ym. \ \ teoksen kappaleesta 14, edellä. Automatisoitu PCR-laite ja j
kemikaalit ovat kaupallisesti saatavilla.) EA52:n, PCR- I
30 oligonukleotidialukkeen 374 emäsparin E2-123-fragmentin ] 5'-päätä varten, nukleotidisekvenssi esitetään sekvenssi- ] listassa nimellä SEQ ID nro 15. EA54:n, PCR-oligonukleotx- | dialukkeen, jota käytettiin E2-123-fragmentin 3r-päätä varten, nukleotidisekvenssi esitetään sekvenssiluettelossa 35 nimellä SEQ ID nro 16, Digestoimme PCR-tuotteet NcoI::llä.
44 ja BamHI:llö ja kloonasimme syntyneen fragmentin Ncol/BamHI-digestoitiiun pETSc-ekspressioplasmiäiin (Studion ym,, edellä), jolloin saatiin aikaan plasmidi pRTSc-123.
5 Käyttämällä samaa menetelmää, jossa oli eri 5'-pään oligonukleotidi-PCR-aluke, hankimme 260 emäsparin fragmentin {nE2-85"), joka sisälsi metiöniinikodonin ja alaniini-kodonin, jota seurasivat välittömästi kodonit HPV16-E2:n 83;lie karbaksiterminaaliselle aminohapolle. EA57:n, 5' -.10 pään PCR-alukkeen E2-85:n tuottamiseksi,, nukleotidisek- venssi esitetään sekvenssiluettelossa nimellä SEQ ID nro 1
34. J
Plasmidin pET8c~l23CGSS:n muodostamiseksi (kuvio 6, SEQ ID nro 17), E2,123CCSS;n bakteerissa tuottoa varten,
15 syntetisoimme 882 emäsparin Pstl-Eagl-DNA-fragmentin PCR-tekniikoilla, PCR-templaatti oli pET8c-l23. Yksi PCR-aluk-keista, jolle oli annettu nimeksi 374.140, kooditti kaikkia kolmea aminohapppmuutosta: CGACACTGCA GTATACAATG
TAGAATGCTT TTTAAATCTA TATCTTAAÄG ÄTCTTAAAG (SEQ ID nro j 20 18). Toisella PCR-alukkeella, 374.18, oli seuraava sek- i venssi: GCGTCGGGCG CCATGCCGGC GATAAT (SEQ ID nro 19). Di- | gestoimme PCR-reaktiotuotteet Pstl;llä ja Eagl:llä ja \ eristimme 882 emäsparin fragmentin standardimenetelmillä. |
Lopullinen vaihe oli pET8Q“123GGSS:n tuottaminen kolmen j 25 kappaleen ligaatiossa, jossa pET8e-123:sta peräisin oleva j 3424 bp:n EcoRI-EagI-fragmentti liitettiin 882 emäsparin j PCR-fragmenttiin ja 674 emäsparin PstI-EcoRI-pET8c-123- j fragmenttiin, kuten kuviossa 6 esitetään. Varmistimme | konstruktion DNA-sekvenssianalyysillä. E2.123:n ja j 30 E2.123CCSS-proteiinien tuottamista varten ekspressöimme j plasmidit pET8c-123 ja pET8c-I23CCSS E. no11 -kannassa | BL2KDE3JpLysS, kuten Studier ym. ovat kuvanneet (edellä). E2-repressoriproteiinien puhdistus Sulatimme 3,6 grammaa pakastettuja, pET8c-123~ 35 transformoituja E. coll -soluja ja suspensoinane ne 35 45 ml:aan 25~millimqlaärisia Tris-HCl:ää (pH 7,5), joka oli 0,5-millimoläarinen EDTA:n, 2, 5-millimolaarinen DTT:n suhteen ja sisälsi prateaasi-iiihxbiittoreita (1 mM PMSF, 3 mM bentsamidiini, 50 pg/ml pepstatiini A, 10 pg/ml aprotinii-5 ni). Hajotimme solut viemällä ne kahdesti "French press" -laitteen läpi paineella 10 000 psi (68 880 kPa). Sentri-fugoimme lysaattia 12 000 rpm:n nopeudella SA600-rootto-rissa 1 tunnin ajan. E2.123-proteiini oli supernatantissa.
Lisäsimme supernatanttiin MES-puskuria (pH 6) 25 mM:ksi, 10 MES-puskuria (pH 5) 10 mM:ks± ja NaCl:a 125 mM;ksi. Panimme sitten supernatantin 2 ml: n S Sepharose Fast Flow -pylvääseen nopeudella 6 ml/h, Lataamisen jälkeen pesimme pylvään 50-millimolaarisella Tris-HGl:llä (pH 7,5), joka Oli 1-millimolaarinen DTT:n suhteen. Sitten suoritimme vai-15 heittaisen gradienttieluution (2 ml/vaihe), jossa oli \ 200-, 300-, 400-, 500-, 700- ja lOÖÖ-millimolaarinen MaCl j 5 0-mi11imö1aari ses sa Tris-HG1:ssä ( pH 7,5), j o ikä olivat \ 1-millimolaarisia DTT:n suhteen. E2.123-repressoriproteii-ni eluoitui 500- ja 700-millimolaarisissa NaCl-20 fraktioissa. SDS-PAGE-analyysi osoitti, että E2,123-rep- | ressorin puhtaus oli yli 95-prosenttinen.
Sulatimme 3,0 grammaa pakastettua, pET8e-123GCSS-transformoitua E. colia ja suspensoimme solut 30 ml:aan samaa puskuria, jota käytettiin pET8c^l23-transförmQiduil- J
25 le soluille (edellä). Hajotus, liukenemattoman soluroskan ja MES-puskurin ja NaCl:n lisäys oli myös samanlainen kuin ί E2-123:n puhdistuksen tapauksessa kuvattiin, E2.123CCSS:h j puhdistusmenetelmä erosi MES-puskurin ja NäCl;n lisäyksen j jälkeen, koska E2.123CCSS:n tapauksessa tässä menetelmän j 30 valheessa muodostui sakka. Poistimme sakan sentrifugoimai- j la, ja havaitsimme että se ja supernatantti sisälsivät j molemmat oleellista E2-repressoriäktiivisuutta. Niinpä j alistimme molemmat puhdistusvaiheisiin. Panimme superna- | tantin 2 ml:n S Sepharose Fast Flow -pylvääseen (Pharmacia j 35 LKB, Piscataway, NJ) nopeudella 6 ml/h. Lataamisen jälkeen | $ j 46
pesimme pylvään 50-millimolaarisella Tris-HCl:llä (pH
7,5), joka oli 1-millimolaarinen DTT:n suhteen* Pylvään pesun jälkeen suoritimme vaiheittaisen gradienttieluution (2 ml/vaihe) käyttämällä puskuria, joka oli 300-, 400-, 5 500-, 700- ja lOQG-millimolaarinen NaCl:n suhteen ja 50- millimolaarinen Tris-HCl:h suhteen (pH 7,5) sekä 1-milli-molaarinen DTT;n suhteen. E2.123GCSS~proteiini eluoitui 700-millimplaarisella NaClrllä, SPS-PAGE-ähälyysi osoitti, että sen puhtaus oli yli 95 %. Liuotimme E2.123CCSS-sakan 10 7,5 ml:aan puskuria, joka oli 25-millimolaarinen Tris- HCl: n {pH 7,5), 125-millimolaarinen NaClrn, l-millimolaa-rinen DTT:n ja 0,5-millimolaarinen EDTA:n suhteen. La-tasimme liuotetun materiaalin 2 ml:n S Sepharose Fast Flow -pylvääseen ja pesimme pylvään kuten on kuvattu E2.123:n f 15 ja ei-sakkäutuneen E2.123CCSS:n tapauksessa. Suoritimme vaiheittaisen gradienttieluution (2 ml/vaihe) käyttämällä 300-, 500-, 700- ja 1000-millimolaarista NaCliää. E2-repressor! eluoitui 500 - 700-millimolaarisen NaCltn fraktioissa. SDS-PAGE-analyysi osoitti, että sen puhtaus oli 20 yli 98 %. Heti E2.123- ja E2.123CCSS-proteiinien puhdistuksen jälkeen lisäsimme glyserolia, niin että sen loppu-konsentraatio oli 15 % (y/v) ja varastoimme pikapakästet-tuja (nestetyppi) eriä -70 °C:n lämpötilaan. Kv ant i t o imme j puhdistetut E2-repressoriproteiirtit UV-absorfaanssilla 280 \ 25 nm:n aallonpituudella käyttämällä ekstinktiokerrointa 1,8 pitoisuudessa 1 mg/ml.
Kemiallinen, silloitus
Suoritimme kuljetuspölypeptiäin, joka koostui tat-aminohapoista 37 - 72, kemiallisen synteesin esimerkissä 1 30 kuvatulia tavalla. Liuotimme polypeptidin (5 mg/ml) 10-millimöläariseen MES-puskuriin (pH 5,0), joka oli 50-mil-limolaarinen NaCl:n, 0,5-millimolaarinen BDTA:n suhteen | (ekstinktiokerroin 0,2 pitoisuudessa 1 ml/ml). Kuljetuspa- j lypeptidiliuokseen lisäsimme bismaleimidoheksaanin ("BMH") | 35 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, luettelonro 22319G) \ 47 kantaliuosta (6,25 mg/ml DMF) niin, että loppukonsentraatto oli 1,25 mg/ml, ja HEPES-puskurin kantaliuosta (1 M, pH 7,5) niin että loppukonsentraatio oli 100 mM. Annoimme BMH: n reagoida proteiinin kanssa 30 minuutin ajan huoneen-5 lämpötilassa. Sitten erotimme proteiini-BMH:n reagoimattomasta BMHista geelisuodatuksella G-lO-pylväässä, joka oli tasapainotettu puskurilla, joka oli 10-millimolaarinen MES:n (pH 5), 50-milllmolaarinen NaCl:n ja 0,5-millimolaa-rinen EDTA:n suhteen. Varastoimme kuljetuspolypeptidi-BMH-10 konjugaatin erät -70 °C:n lämpötilaan.
Kuljetuspolypeptidi-BMH-konjugaatinsilloittamisek-si E2-repressoriin poistimme E2-repressoriproteiinin sen säilytyspuskurista. Laimensimme E2-repressariproteiinin kolmella tilavuudella 25-millimolaarista MESriä (pH 6,0'.), 15 joka oli 0,5-miiiimolaarinen EDTA:n suhteen, ja latasimme j sen eränä S Sepharose Fast Flow -hartsiin (Pharmacia LKB, 1
Fiscataway, NJ), 5 mg proteiinia per ml hartsia. Sen jälkeen kun proteiinilla ladattu hartsiliete oli kaadettu pylvääseen, pesimme pylvään 25-millimölaarisella MES:llä 20 (pH 6,0), joka oli 0,S-raillimolaarinen EDTA:n ja 250-mil-limolaarinen NaCl:n suhteen. Sitten eluoimme sitoutuneen E2-represspriproteiinin pitoisuuteen 1 mg/ml 25-miilimo-laarisella MESrllä (pH 6,0), joka oli ö,5-ffiiilimolaarinen EDTA tn suhteen. Kokeiluluontoisista silloitustutkimuksis-25 ta, jotka oli suoritettu kullakin E2-repressoriproteiini- i erällä ja BMH-aktivoidulla kuljetuspolypeptidillä, määri- | timme että E2-repressoriproteiinin (1 mg) käsittely 0,6 j mg :11a BMH-aktivoitua kuljetuspolypeptidiä tuottaa halutun j inkorporaation, 1 kuljetusmolekyyli per E2-r©pressorihomo-30 dimeeri. Tyypillisesti sekoitimme 2 ml E2-repressoria (1 mg/ml) 300 μΐ:aan tat37-72-BMH:ta (4 mg/ml) ja 200 μΐ:aan l~molaarista HEPES:iä (pH 7,5). Annoimme silloitusreaktion edetä 30 minuuttia huoneenlämmössä. Lopetimme silloitus- j reaktion lisäämällä 2-merkaptoetanölia niin, että loppu- j 35 konsentraatio oli 14 mM. Määritimme silloittumisen määrän \ 48 SDS-PAGE-analyysissä. Varastoimme tat37-72-E2~repressori-konjugaatin eriä -70 eC:n lämpötilaan. Käytimme identtisiä menetelmiä tat37-72-kuljetuspolypeptidin silloittamiseksi kemiallisesti HPVE2 123 -repressöriproteiiniin ja HPVE2 5 CCS5 -repressöriproteiiniin.
E2-repressarikonjugaattien otto solun sisään Meidän E2-repressorimäärityksiämme varten käytimme C0S7-soluihin transfektoitujen plasmidien lyhytaikaista ekspressiota. Meidän E2-repressiomääritysmenetelmämnie oli 10 samanlainen kuin Barsoumin ym. artikkelissaan kuvaama (edellä). Transfektoimme 4 x 1Ö6 COSV-Solua (noin 50-pro-senttisen konfluentti keräysaikana) elektroporaatiolla kahdessa eri transfektiossa ("EP1" ja "EP2"). Transfek-tiossa EP1 käytimme 20 pg pXB322hGH:ta (reportteriplasmi-15 di) sekä 380 pg sonikoitua taimenen sperman kantaja-DNA;ta (Pharmacia 1<KB, Piscataway, NJ). Transfektiossa EP2 käy- j timme 20 pg pXB322hGH:ta sekä 30 pg pAHE2:ta (E2-transak- ! tivaattori) ja 350 pg taimenen sperman kantaja-DNA:ta. |
Suoritimme elektroporaatiot Bio-Rad Gene Pulser -laitteel- ! 20 la, 270 volttia, 960 pFD, noin 11 millisekunnin pulssi- j ajalla. Elektroporaatioideh jälkeen jaoimme solut 6-kuop- \ palevyille, 2 x 10s solua per kuoppa. Viisi tuntia elektro- j poraatioiden jälkeen imimme pois kasvatuselatusaineen, huuhtelimme solut kasvatuselatusaineella ja lisäsimme | 25 1,5 ml tuoretta kasvatuseiatusainetta kuhunkin kuoppaan. j Tässä vaiheessa lisäsimme klorokiinia ("CQ") niin että | loppukonsentraatio oli 80 pM (tai kontrolleihin tyhjä liuos). Sitten lisäsimme silloitetun tat37-72-E2.123:n (”TxHE2”) tai silloitetun tat37-72-E2.123CCSS:n ] 30 ("TxHE2CCSS"), Näiden kuljetuspolypeptidi-lastikonjugaat- |
tien lopullinen konsentraatio oli 6, 20 tai 60 pg/ml solu-kasvatuseiatusainetta (taulukko I). M
! | | 49
Taulukko I
Näytteiden nimeäminen
Kuoppa CO (pH) Proteiini (pg/ml) EP1.1 0 0 „ EP1.2 80 0
O
EP2.1 0 0 EP2.2 0 6 TxHE2 EP2v:3. 0 20 TXHE2 EP2»4 0 60 TxHE2
EP2* S 0 6 TxHE2 CCSS
EP2·6 0 20 TXHE2CCSS
10 EP2.7 o 60 TXHE2CCSS
EP2.8 80 0 EP2.9 80 6 TXHE2 ΕΡ2·10 80 20 TXHE2 EP2.il 80 60 TxHE2
EP2 »12 80 6 TXHE2CCSS
EP2.13 80 20 TXHE2CCSS
ig EP2.14 80 60 TxHE2CCSS
18 tunnin inkuboinnin jälkeen poistimme elatusai- j neen, huuhtelimme solut tuoreella elatusaineella ja lisä- \ simme 1,5 ml tuoretta elatusainetta, joka sisälsi samat f 20 klorökiinin ja kuljetuspolypeptidi- las tikon jugaatt ien kon- j sentraatiot kuin edeltävä 18-tuntinen inkubaatio. Tämä | elatusäineen vaihto tehtiin mahdollisen hGH:n poistamiseksi, joka on mahdollisesti ollut läsnä ennen kuin represso- ri meni sisään soluihin. 24 tuntia elatusaineen vaihdon j λ 25 jälkeen keräsimme solut ja suoritimme solulaskennat viabi- | liteetin tarkistamiseksi. Sitten määritimme hGH:n laimen- j tamattomista kasvuelatusainenäytteistä Seldonin menetelmän mukaisesti, joka on kuvattu teoksessa Protocols in Mölecu- j lar Biology, Green Publishing Associates, New York, s.
30 9,7.1 - 9.7.2 (1987), käyttämällä Allegro Human Growth I
Hormone -tarvikesarjaa lyhytkestoista geeniekspressiojär- | jestelmää varten (Nichols Institute, San Juan Capistrano, | CA). Vähensimme määrityksen taustan (se on: määritysköffipo- | nentit, joihin oli lisätty muokkaamatonta elatusainetta) 1 35 hGH:n cpm:stä kaikkien näytteiden tapauksessa. Suoritimme \ \ | s | 50 erilliset repressioläskut prosenttiosuuksina kullekin pro-teiinikäsittelylle sen mukaan oliko klorokiiniä läsnä C"(+)CQ") vai poissa ("(-)CQ") proteiinin sisäänottotes-tissä. Laskimme repression prosenttiosuuden seuraavan kaa-5 van mukaisesti: (ACT ~ BKG) - (REP ~ BKG)
Repressio = -—--—--x 100
ACT - BKG
10 jossa: 1 BKG = hGH:n cpm pelkän reportterin transfektioissa 5 (esim: EP1.1 (-)CQ:lle ja EP1.2 (+}CQ:lle); ACT = hGH:n cpm reportterin ja transaktivaattorin 15 transfektiossa, mutta missä ei lisätty repressorikonju-gaattia (esim: EP2.1 (-)CQ:lle ja EP2.8 (+)CQ:lie); REP = hGH:n cpm reportterin ja transaktivaattorin transfektiossa, missä lisättiin repressorikonjugaatti (esim: EP2.2 - 2.7 (-)CQ:lle ja EP2.9 - 2.14 (+)eQ:lle.
20 Tulokset edustavasta E2-repressiomäärityksestä esi- * tetään taulukossa II. Taulukko I nimeää taulukossa II esi- | tetyt eri näytteet. Kuvio 7 kuvaa graafisesti taulukossa ΐ
Il esitetyt tulokset. j l 5 . 1 j ] ! j 51
Taulukko II E2-repressimääriiys cpm - mää- hGH:n rityksen Repressio- 5 Näyte cpm tausta cpm - PKG prosentti EP1.1 3958 3808 - ~ EP1.2 5401 5251 EP2.1 15 161 15 011 11,203 EP2.2 12 821 12 671 8863 20,9 10 EP2.3 10 268 10 118 6310 43;7 EP2.4 8496 8346 4538 59,5 EP2.5 11 934 11 784 7976 28,8 EP2.6 9240 9090 5282 52,9 EP2.7 7926 7776 3968 64,6 j EP2.8 15 120 14 970 9719 ib | EP2.9 12 729 12 579 7328 24,6 EP2.10 9590 9440 4189 56.9 \ EP2.il 8440 8290 3039 68,7 EP2.12 11 845 11 695 6444 33,7 EP2.13 8175 8025 2774 71,5 20 EP2.14 6697 6547 1296 86; 7 ]
Kuljetuspolypeptidi tat37~72, joka oli silloitettu | joko E2-repressoriin (E2.123 tai E2.123CCSS) johti E2- | riippuvaisen geeniekspression annosriippuvaiseen inhibi-25 tioon viljellyissä nisäkässoluissa (taulukko II; kuvio 7).
Olemme toistaneet tämän kokeen neljä kertaa samaniaisi11a tuloksilla. Vaikutus oli E2-spesifinen sikäli että tat37- j 72-konjugaateilla ei ollut vaikutusta pXB332hGH:n E2-in- 1 duktioon (tuloksia ei esitetä). Tat37-72xHE2-konjugaateil- ] 30 la ei myös ollut vaikutusta Sellaisen reportterin hGH-eks- j pressiotasoon, jossa hGH-geenin ekspressiota ohjasi kons- ] titutiivinen promoottori, jossa ei ollut vastetta E2:n suhteen. E2~repressori, jossa oli CCSS-mutaatio, repressoi suuremmassa määrin kuin represser!, jossa oli villityyppi" 35 nen aminohapposekvenssi. Tämä oli odotusten mukaista, kos- 52 ka kuljetuspolypeptidin silloitus kumpaan tahansa viimeisestä kahdesta kysteiinistä villityyppisessä repressorissa todennäköisesti vähentäisi tai eliminoisi repressorin aktiivisuutta. Klörokiiniä ei vaadittu repressioaktiivisuu-5 teen. Klorokiini kuitenkin todella tehosti repressiota kaikissa testeissä. Nämä tulokset esitetään yhteenvetona taulukossa IX ja kuviossa 7.
Esimerkki 10 TATACYS-konj ugaatit 10 T&TAcys:n muodostaminen
Sellaisen kuljetuspolypeptidin tuotantoa varten bakteerissa, joka sisältäisi tat-aminohapot 1 - 21, jotka piisi fuusioitu suoraan tat-aminohappoihin 38 - 72, muodostimme ekspressioplasmidin pTATAcys (kuvio 8; SEQ ID nro 15 .2:0·), Plasmidin pTATAcys muodostamiseksi käytimme tavanomaisia PCR-tekniikoita, joissa piasmidi pTAT72 oli PCR- I
tempiaattina. Yksi PCR:ään käytetyistä oligonukleptidi- j al.ukkei.sta oli 374.18 (SEQ ID nro 19), joka kattaa Eagl-kohdan tatin koodittavasta sekvenssistä ylävirtaan. (Käy-20 timme myös aligonukleotidia 374.18 plasmidin pET8c-123CCSS muodostamiseen. Katso esimerkki 9.) Toinen oligonukleoti-dialuke PCR:Ile, 374.28, kattaa Eagl-kohdan tatin koodit-tavan sekvenssin sisällä, ja sillä on deleetio tat-DNA- \ sekvenssissä, joka koodittaa aminohappoja 22 - 37, } 25 374.28:n nukleotiäisekvenssi on: TTTACGGCCG TAAGAGATAC j CTAGGGGTTT GGTGATGAAC GCGGT (SEQ ID nro 21). Digestoimme | PCR-tuotteet Eaglillä ja eristimme tuloksena olevan 762 j emäsparin fragmentin. Sijoitimme tämän Eagl-fragmentin | 4057 emäsparin vektoriin, joka tuotettiin katkaisemalla j 30 pTAT72 Eaglillä. Varmistimme konstruktion DNA-sekvenssi- j
analyysillä ja ekspressoimme tatAcys-polypeptidin Stud- I
ierin ym. menetelmällä (edellä). SDS-PAGE-analyysi osoitti, että tatAcys-poiypeptidillä on oikea koko.
TatAcys-protelinin puhdistusta varten sulatimme 4, 5 | 35 grammaa pTATAcys-transformoituja E. eoli -soluja, resusp- j $
J
53 endoimme solut 35 ml:aan 2Q-millimoIaarista MES:iä (pH 6,2), Joka oli 0,5-millimalaarinen EDTÄ;n suhteen. Hajotimme solut viemällä ne kahdesti "French press"-laitteen läpi 10 000 psi:n (68 000 kPa) paineessa. Poistimme liu-5 kenemattoman roskan sentrifugoimalla 10 000 rpm:n nopeudella SA60Q-roottorissa 1 tunnin ajan. Panimme super-natantin 5 ml;n S Sepharose Fast Flow -pylvääseen nopeudella 15 ml/tunti. Pesimme pylvään 50-millimolaarisella Tris-HCl:llä (pH 7,5), joka oli 0,3-millimolaarinen DTT:n 10 suhteen. Sitten suoritimme vaiheittaisen gradienttieluu- tion (2 ml/yaihe) samalla puskurilla, joka oli 300-, 400-, 'f 500-, 700- ja 950-milliraolaarinen NaGlin suhteen. TatAcys-proteiini eluoitui 950-millimolaarisessa NaCl-fraktiossa.
Konjugoimme tatAcys-kuljetuspolypeptidin rodamiini-15 isotiosyanaattiin ja testasimme sen määrittämällä suoraan otto solun sisään. Tulokset olivat positiivisia (samanlaisia kuin tulokset vastaavissa kokeissa täti-72.·; 11a).
Geneettinen TATAcys-249-fuusio
TatAcys-kuljetuspolypeptidin, joka olisi fuusioitu I
20 geneettisesti natiivin E2-repressoriproteiinin arainopäähän (se on: BPV-1 E2:n 249 karboksiterminaaliseen aminohappoon), bakteeriekspressiota varten muodostimme plasmidin pTATAcys-249 seuraavasti. Muodostimme plasmidin pFTESQl j (kuvio 9) plasmideista pTAT72 (Frankel ja Laho, edellä) ja j 25 pXB314 (Barsoum ym. edellä). Plasmidista pXB314 eristimme j
Ncol-Spel-DNA-fragmentin, joka koodittaa 249 aminohapon j \ BPV-1 E2-repressoria. (Ncol katkaisee nukleotidista 296 ja 1
Spel katkaisee pXB314:n nukleotidista 1118.) Teimme tämän j fragmentin päät tasaisiksi DNA polymeraasi I Klenow -kä- j 30 sittelylla ja lisäsimme kaupallisesti saatavilla olevan j
Bglll-linkkerin (New England Biolabs, iuettelonro 1090). |
Sijoitimme tämän linkkerin sisältävän fragmentin BamHI-katkaistuun (täydellinen digestio) pTÄT72“plasmidiin!. pTAT72:ssa on BamHI-katkaisukohta tat:ia koodattavan alu-35 een sisällä, lähellä sen 3'-päätä, ja toinen BamHI-kat- 54 kaisukohta Hieman alavirtaan tat-geenistä. Bglll-linkkeri liitti tattia ja E2:ta koodlttavat sekvenssit samaan lukukehykseen, jolloin ne koodittivat fuusiota, jossa oli tat-proteiinin 62 ensimmäistä aminohappoa, joita seurasi se-5 riinitähde ja BPV-1 E2-proteiinin 249 viimeistä aminohappoa. Annoimme tälle bakteeriekspressioplasmidille nimeksi pFTESOl (kuvio 9). Plasraidin pTAT^cys-249 muodostamiseksi (kuvio 10; SEQ ID nro 22) sijoitimme 762 emäsparin Eagl-fragmentin plasmidista pTAToys, joka sisältää osan tattia, 10 joka sisältää kysteiinideleetion, plasmidin pFTE501 4812 emäsparin EagI-fragmenttiin.
TatAcys~249:n puhdistus j
Sulatimme 5 g S. colia. joka ekspressoi tatAcys-249ttä ja suspendoimme solut 40 ml:aan puskuria, joka oli 15 25-millimolaarinen Tris-HCltn (pH 7,5), 25-millimolaarinem NaCltn, 0,5-millimolaarinen EDTAtn, 5-millimolaarinen DTTtn suhteen ja joka sisälsi proteaasin inhibiittoreita (1,25 mM PMSF, 3 mM bentsamiidinl, 50 pg/ml pepstatiini A, 50 pg/ml aprotiniini, 4 pg/ml E64). Hajotimme solut vie-20 raällä ne kahdesti " French’1-painekammion läpi 10 000 psitn \
(68 000 kPa) paineessa. Poistimme liukenemattoman roskan I
lysaatista sentrifugoimalla 12 000 rpmtn nopeudella SA6Ö0- j roottorilla 1 tunnin ajan. Puhdistimme tatAcys-249tn liu- j koisesta fraktiosta. Supernatantti ladattiin 2 ml tn S \ 25 Sepharose Fast Flow -pylvääseen (Pharmacia LKB, Piscata- | way, NJ) virtausnopeudella 6 ml/h. Pylväs pestiin pusku- j rilla, joka oli 25-millimolaarinen Tris-HCltn (pH 7,5), j 25-millimolaarinen NaCltn, 0,5-millimolaarinen EDTAtn ja | i-millimolaarinen DTTtn suhteen, ja käsiteltiin peräkkäi-30 sillä suolavaiheilla samassa puskurissa, joka oli 100-, 200-, 3Ö0-, 400-, 500-, 600- ja SÖQ-millimolaarinen NaCltn suhteen. Otimme talteen tatAcys-249:n 600 - 800 mM suola-fraktioista·· Yhdistimme huippufraktiot, teimme sen 15- j prosenttiseksi glyserolin suhteen ja varastoimme erät ] 35 -70 °C:n lämpötilaan. | $ j 55
Immuno fluoresenssimääri tys
Jotta saisimme analysoitua tatAcys-E2-repressori-fuusioproteiinin oton solun sisään, käytimme epäsuoria immunofluoresenssitekniikoita. Jaoimme HeLa-soluj a "cover 5 slip" -lasien päälle 6-kuoppaisissa kudosvi1jelylevyissä, niin että ne olivat SD-prosenttisen konfluentteja, Yli yön inkuboinnin jälkeen lisäsimme tathcys-E2-repressor!fuusio-proteiinin (loppukonsentraatio 1 pg/ml) ja klorokiinin (loppukonsentraatio 0,l-millimolaarinen). Kuuden tunnin 10 kuluttua poistimme fuusioproteiinin/klorokiinin sisältävän kasvatuselatusaineen ja pesimme solut kahdesti PBS:llä.
Kestävöimme pestyt solut 3,5-prosenttisella formaldehydillä huoneenlämmössä. Permeabilisoimme kestävöidyt solut PBSillä, joka oli 0,2-prosenttinen Triton-X-100:n, 2-pro-15 senttinen naudan seerumialbumiinin ( "BSA" ) suhteen ja 1-millimolaarinen MgCl2:n ja 0 , l-millimolaarinen GaClz: n suhteen {"PBS+") 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa.
Permeabilxsoitujen solujen suojaamiseksi käsittelimme ne PBS:llä, joka oli 2-prosenttinen BSA:n suhteen, 1 tunnin 20 ajan 4 °C:n lämpötilassa.
Inkubpimme "cover slip" -laseja 20 piillä primääri-vasta-aine-liuosta kussakin kuopassa, 1:100-laimennoksena PBS+issa, joka pii 2-prosenttinen BSA:n suhteen, 1 tunnin ajan 4 °C:n lämpötilassa. Primäärinen vasta-aine oli joko I
25 kanin polyklonaalinen vasta-aine BPV-1 EZ-repressarille \ (saatu aikaan injektoimalla puhdistetut E2:n karboksiter- i minaaliset 85 aminohappoa) tai kanin polyklonaalinen vas- -\ ta-aihe tat:ia vastaan (saatu aikaan injektoimalla tatin ) puhdistetut amlnoterminaaliset 72 aminohappoa). Lisäsimme j 30 sekundäärisen vasta-aineen 1:100-laimennoksena PBS+:ssa, | joka pii Ö,2-prosenttinen Tween~20:n ja 2-prosenttinen BSA:n suhteen, 30 minuutiksi 4 °C:n lämpötilassa.
Sekundäärinen vasta-aine oli rodamiinikonjugoitu, kanin IgG:tä vastaan konjugoitu vuohen vasta-aine (Cappel, 35 nro 2212-0081). Sen jälkeen kun soluja oli inkuboitu se- j 56 kundäärisen vasta-aineen kanssa, pesimme solut PBS+:11a, joka oli 0r2-prosenttinen Tween 20;n ja 2-prosen11inen BSA:n suhteen, ja sijoitimme "cover slip”-lasit liuoksen päälle, joka oli 90-prosenttinen glyserolin, 25-millimo-5 laarinen natriumfosfaatin (pH 7,2) ja 15Q-millImolaarinen NaClin suhteen, Tutkimme solut flupresenssimIkroskoopilla> jossa oli rodamiinisuodatin.
TatAcys-fuusioiden otto soluun
Havaitsimme, että tatAcys-E2-repressorifuusiopro-10 teiinia otettiin merkittävästi solun sisään, kun käytimme joko tat-vasta-ainetta tai E2-vasta-ainetta. Kontrollisö-luissa, jotka oli altistettu konjugolmattomalle tat-prö-teiinille, havaitsimme solunsisäistä fluoresenssia kun | käytlme tat-vasta-ainetta, mutta ei E2-vasta-ainetta. j 15 Kontrollisoluissa, jotka oli altistettu seokselle, jossa oli konjugoimaton E2-repressori ja tat-proteiini tai tatAcys, havaitsimme fluoresenssia kun käytimme tat-vasta-ainetta, mutta ei E2-vasta-ainetta. Tämä vahvisti, että tat välittää E2-repressorin sisäänottoa vain silloin, kun 20 tämä on liitetty tat-proteiiniin. Kuten konjugoimattomalla tat-proteiinlllakin, havaitsimme tatAcys-E2-repressorifuu-sioproteiinia kaikkialla soluissa, mutta se oli konsent- j roitunut solunsisäisiin vehikkeleihin. Nämä tulokset 1 osoittavat, että tat-peräinen polypeptidi, josta täysin j 25 puuttuvat kysteiinltähteet, voi viedä heterologisen pro- j teiinin (se on: kuljetuspolypeptidin ja lastiproteiinin j geneettisen fuusion) eläinsoluihin. j
Samanlaisessa menetelmässä kuin edellä kuvattiin, ]
tuotimme tatAcys:n geneettisen fuusion HPV E2:n 123 C-ter-30 minaaliseen aminohappoon. Kasvatuselatusainpeseen lisättynä tämä fuusiopolypeptidi osoittautui repressolvan E2- I
riippuvaista geeniekspressiota CGS7-soluissa (tuloksia ei ] näytetä). ] : $ | 57
Esimerkki 11 "Antisense"-oligodeoksinukleotidikonjugaatit
Syntetisoimme DNA-fosforitionaattianalogeja (pituudeltaan 4 - 18 nukleotidia}, jotka kukin sisälsivät 5'-5 päässä vapaan aminoryhmän, käyttämällä automatisoitua DNA/RNA-syntetisaattoria (Applied Biosystems model 394), Amiiniryhmä inkorporoitiin oligonukleotideihin käyttämällä kaupallisesti modifioituja nukleotideja ("aminolink 2",
Applied Biosystems). Öligonukleotidit vastasivat "sense”-1Ö ja "antisense"-juosteita ihmisen kasvuhormoni-RNA:n ja CAT-lähetti-RNA:n alueilta.
Kutakin sillöitusreaktiota varten liuotimme 200 pg oligonukleotidia 100 μΐ:aan 25-milliraolaarista natriumfos-faattipuskuria (pH 7,0). Sitten lisäsimme 10 pl sulfo-15 SMCGrn 5Ö-raillimolaarista kantaliuosta ja annoimme reaktion edetä huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Poistimme reagoimattoman sul£o-SMCC:n geeiisuodattamalla reak-tioseoksen P6DG-pylväässä (Bio-Rad) 25-millimolaarisessa HEPES-puskurlssa (pH 6,0). Kuivasimme oligonukleotidi-sul-20 fo-SMCe-aäuktin alipaineessa. Oligonukleotidien saalis tässä menetelmässä oli välillä 58 — 95 %. Kuljetuspolypep-tidin kanssa tapahtuvaa reaktiota varten liuotimme kunkin j
aligonukleotidi-sulfo-SMCC-aduktin 50 μΐ:aan 0,5-millimo- I
laarista EDTA:ta, siirsimme liuoksen koeputkeen, joka si- j 25 säls.i 50 pg lyofilisoitua kuljetuspolypeptidiä, ja annoim- | me reaktion edetä huoneenlämpötilassa 2 tunnin ajan. Ana- 1 lysoimme reaktiotuotteet SDS-PAGE:ssa. j
Esimerkki 12 I
i
Vasta-aine-konjugaatit ä 30 Anti-ttibuliinikonjugaattx 1 j
Hankimme tubuliinia vastaan suunnattua, hiiren kau- | pallista monoklonaalista IgGl:tä (Amersham) ja puhdistimme | sen askitesnesteestä käyttämällä proteiini A: ta tavanömai- | sin menetelmin. Leimasimme puhdistetun vasta-aineen roda- j 35 milni-isotiosyanaatilla käyttämällä 1,2 moolia rodamiinia j | 58 per mooli vasta-ainetta. Kun altistimme kestävöidyt, per-meabiiisöidut HeLa-solut leimatulle vasta-aineelle, tutkiminen mikroskoopilla paljasti kirkkaasti värjäytyneitä mikrotubuleita. Vaikka rddamiinileimaus oli riittävä, te-5 hostirame vasta-aineen signaalia hiiren immunoglobuliinia vastaan suunnatulla, FITC-leimatulla vasta-aineella.
Menetelmässä, joka oli oleellisesti esimerkissä 2 kuvatun kaltainen (edellä), annoimme vasta-aineen (250 pg) reagoida sulfo-SMCC:n kanssa (10:1 molaarinen ylimäärä).
10 Sitten lisäsimme 48 pg (3iiS-leimattua) tatl-72:ta, Tatl-71:n ja vasta-aineen molaarinen suhde oli 2,7:1. Radioaktiivisuuden inkqrpöraatxon perusteella täti:72 oli silloittanut vasta-aiheeseen suhteessa 0,6:1.
Tatl-72:n ja vasta-aineen muodostaman konjugaatin 15 sisäänmenon analysoimiseksi lisäsimme konjugaatin elatus-aineeseen (10 pg/ml), joka huuhtoi "coverslip"-laseilla kasvatettuja soluja. Havaitsimme solussa pistemäisen fluo-resenssikuvion. Pistemäinen kuvio viittasi konjugaatin sijaintiin vehikkeleissä, ja siitä ei näin ollen voitu 20 tehdä sytoplasmaan joutumista koskevia johtopäätöksiä. j .jotta saisisimme osoitettua konjugoidun vasta-ai- f neen immunologisen reaktiivisuuden, testasimme sen kykyä ä sitoa tubuliinia» Liitimme puhdistetun tuhuliinin syano-geenibromidilla aktivoituun Sepharose 4B:hen (Sigma Chem. ! 25 Co., St. Louis, MO). Panimme radioaktiivisen konjugaatin j sisältävät näytteet tubuliinipylvääseen (ja Sepharose 4B j -kontrollipylvääseen) ja mittasimme sitoutuneen konjugaa- j tin määrän. Affiniteettimatrlisiin sitoutui enemmän radio- j
aktiivisuutta kuin kontrollipylvääseen, mikä viittasi tu- I
30 buliinia sitovaan aktiivisuuteen. | \
Tubuliinia vastaan suunnattu konjugaatti 2 ]
Erillisessä silloituskokeessa hankimme tubuliinia 1 vastaan suunnatun rotan monoklonaalisen lgG2ä-vasta-aineen j (Serotea) ja puhdistimme sen askitesnesteestä tavanomaisin 35 menetelmin käyttämällä proteiini G:tä. Eluoimme vasta-ai- 59 neen Caps-puskurilla (pH 10), Puhdistettu vasta-aine oli positiivinen tubuliininsitoutumisraäärityksessä. Annoimme tatl-72;n reagoida rodamiini-isotiosyanaatin kanssa molaa-risessa suhteessa 1:1. Reaktiotuotteen A55O/A20Q~suhde oli 5 0,63, mikä viittasi siihen että noin 0,75 moolia väriä oli substituoitanut per mooli täti-72: ta·. Kun reagoimaton väri erotettiin täti -72 -rodamiinista G-2 5-geeli suodatukse11a (PharmaGia LKB, Piscataway, NJ), havaitsimme että vain 52 pg 150 pg:sta tatl-72:ta käytettiin reaktiossa.
10 Säästimme erän tatl-72-rodamiinista käytettäväksi (kontrollina;)- soluunottokokeissa, ja lisäsimme loput 0,4 mg:aan vasta-ainetta, joka oli reagoinut SMCC:n kanssa (20:1). Reaktioseos sisälsi tatl-72:vasta-aine-suhteen noin 1:1, pikemminkin kuin odotettu 5:1. (Seuraavassa ko~ 15 keessa 5:l-suhde osoittautui olevan epätyydyttävä, ja sai aikaan sakan). Annoimme silloitusreaktion edetä yli yön 4 °C:n lämpötilassa. Sitten lisäsimme mölaarisen ylimäärän kysteiiniä jäljellä olevien maleiraidiryhmien suojaamiseksi ja näin silloitusreaktion pysäyttämiseksi. Sentrifugaimme 20 reaktioseokset poistaaksemme mahdollisen läsnä olevan sakan .
Suoritimme elektroforeesin käyttäen 4 - 20-pro- \ senttistä polyakryyliamidigradienttigeeliä analysoidaksem- | me supernatantin pelkistävissä ja ei-pelkistävissä olosuh- \ 25 teissä. Analysoimme myös sakat tällä menetelmällä. Vasta-aineella tat-1-72 (ilman rodamiinia) tehdyistä konjugaa-tiokokeista peräisin olevissa supernatanteissa havaitsimme hyvin vähän materiaalia 4 - 2Ö-prosentt±sessa geelissä. Supernatanteissa, jotka olivat peräisin vasta-aine-tat-1-30 72-rodamiinin konjugaatiokokeista, havaitsimme kuitenkin suhteellisen raskaita juovia vasta-aineen yläpuolella pelkistyneen näytteen tapauksessa. Vasta-aine vaikutti olevan konjugoitunut tat-1-72:een noin 1:1 suhteessa.
Soluunottokokeissa, jotka suoritettiin konjugaatil-35 la 2 (menetelmä kuten edellä kuvattiin konjugaatille 1), :.|j 60 saimme tuloksia, jotka olivat samanlaisia kuin jotka saatiin konjugaatllle 1, Kun konjugaatti visualisoitiin ro-damiinifluoresenssi11a tai toiseen vasta-aineeseen assosioituneella fluoresiinilla, havaitsimme konjugaatin vehik-5 keleissä.
Esimerkki 13
Muita tat-E2~konjugaatteja
Kemiallisesti silloitetut tat-E2-konjugaatit
Silloitimme kuljetuspolypeptidin tat37-72 E2:n neliö jään eri repressorimuotoon. Näissä kokeissa käytetyt E2- repressorin neljä osaa olivat BPV-1:n 103 karboksitermi-naalista tähdettä (se on: 308 - 410) ("E2.1Q3"), BPV-l:h 249 karboksiterminaalistä tähdettä (se on: 162 - 410) ("£2.249"), HPV-16:n 121 karboksiterroinaa!1sta tähdettä 15 (se on: 245 - 365) ("HE2"), ja HPV-16:n 121 karboksiterminaalista tähdettä, jossa kysteiinitähteet kohdissa 3ÖÖ ja 309 vaihdettiin seriiniksi, ja lysiinitähde kohdassa 299 vaihdettiin arginiiniksi ("HE2CGSS"). HE2:n ja HE2CCSS:n rekomhinanttituotanto ja puhdistus, jota seurasi HE2:n ja )
20 HE2CCSS:n kemiallinen silloitus tat37~72reen, jolloin muodostui TxHE2 ja vastaavasti TxHE2CCSS, kuvataan esimerkissä 9 (edellä). E2.l03:n ja E2.249:n kemialliseksi silloit- I
s
tamiseksi tat37-72:een (jolloin saatiin aikaan konjugaa- I
tit, joille annettiin nimeksi TxE2.103 ja TxE2.249), käy- I
25 tinune samaa menetelmää, jota käytettiin tekemään TxHE2 ja \
TkHE2Cess (esimerkki 9 edellä). 1
Ekspressoimme proteiinin E2.103 E. colissa plasmidista pET-E2.103. Hankimme pET-E2.103:n PCR-kloo- j
nausmenetelmällä, joka oli analoginen sen kanssa, jota I
30 käytettiin pET8c-123:n tuottamiseksi, joka on kuvattu esi- J
merkissä 9 (edellä) ja kuviossa 5. Kuten pET8c-123:n muo- \ dostamisessakin, ligoimme PCR:Ilä tuotetun Ncol-BamHI—E2- j fragmentin Ncol-BamHI-katkaistuun pET8c:hen. Meidän PCR- | templaattinune E2-fragmentille oli plasmidi pC0-E2 (Hawley-35 Nelson ym., EMBQ J. . voi. 7, s. 525 - 31 (1988), US-pa- 61 tentti nro 5 219 99Ö). Oligonukleotidialukkeet, jolta käytettiin E2-fragmentin tuottamiseksi pCO-E2:sta, olivat EA21 (SEQ ID nro 36) ja EA22 (SEQ ID nro 37). Aluke EÄ21 toi Nool-kohdan^ joka lisäsi metioniinikoäonin, jota seu-5 rasi alaniinikodoni, joka oli 5'-suunnassa sellaisen alueen vieressä, joka kooditti BPV-1 Elin 101:tä karboksiter-minaalista tähdettä.
Ekspressoimme proteiinin E2.249 E. colissa plasmi-dista pET8c-249. Muodostimme pET8c-249:n sijoittamalla 10 1362 entäsparin Neal-BamHI-fragmentin plasmidista pXB314 (kuvio 9) Ncol“BamHI-katkaistuun pET8c:hen (kuvio 5).
Geneettiset TATAcys-BPV E2-fuusiot TATAcys-249m lisäksi testasimme useita muita TATAcys-BPV-1 E2 -repressorifuusioita. Plasmidi pTATAcys-15 105 kooditti tat-tähteitä 1 - 21 ja 38 - 67, joita seura si vat BPV-1:n karboksiterminaaliset 105 tähdettä. Plasmidi pTATÄcys-löl kooditti tat-tähteitä 1 - 21 ja 38 - 62, joita seurasivat BPV-1:n 161 karboksiierminaalisia tähdettä.
Muodostimme plasmidit pTATAcys-105 ja pTATAcys-161 väli-20 tuoteplasmideista pFTEl03 ja vastaavasti pFTE403. s
Tuotimme pFTE103:n ja pPTE4Ö3:n (samoin kuin | pFTE5Öl:n) ligöimalla eri insertit BamHI-katkaistuun (täy- j dellinen digestio) vektoriin pTAT72» f
Jotta saisimme insertiofragmeniin PFTE103:lle, j 25 eristimme 929 emäsparin Plel-BamHI-fragmentin pXB314:stä j ja ligoimme sen kaksijuosteiseen linkkeriin, joka koostui j synteettisestä oligonukleotidista FTE.3 (SEQ ID nro 23) ja j synteettisestä oligonukleotidista FTE.4 (SEQ ID nro 24) .
Llnkkerl kooditti tat-tähteitä 61 - 67 ja siinä oli yksi-30 juosteisena yli tuleva BamHI-osa 5'-päässä ja yksijuostei-sena yli tuleva Plel-osa 31-päässä, ligoimme linkkerin sisältävän fragmentin pXB33l4:stä BamHI-katkaistuun | pTAT72:eenf jolloin saatiin pFTEl03. Jotta saisimme inser- | tiofragmentin pFTE403:een, digestoimme pXB314in Ncol:llä ] 35 ja Spel:llä, teimme tasapäät Klenow-käsittelyllä ja li- j | 62 goimme Bgl II-Hakkerin, joka koostui GAAGATCTTC:stä (New England Biolabs, Beverly, MA, luettelonro 1090) (SEQ ID nro 35), joka oli muodostanut dupleksin itsensä kanssa. Puhdistimme tuloksena olevan 822: n emäsparin fragmentin 5 elektroforeesilla ja sitten ligoimme sen BamHl-digestoi-tuun pTAT72-vektorIin, jolloin saimme PFTE4Ö3:n.
Jotta saisimme deletoitua tat-tähteet 22 - 37, jolloin saatiin plasmidi pTATAcys-105 pFTE103:sta ja pTATAcys-161 pFTE403:sta, käytimme samaa menetelmää (ku-10 Vattu edellä), jota käytettiin hankkimaan plasmidi pTATAcys-249 pFTE501:stä.
Geneettiset TÄTAcys-HPV E2-fuusiot
Muodostimme plasmidit pTATAcys-HE2.85 ja pTATAcys-HE2.121, koodittaaksemme fuusioproteiinin, joka koostuisi 15 tatAcys-kuljetusosasta (tat-tähteet 1 - 21, 38 - 72), jota f seuraisi HPV-16:n 85 tai vastaavasti 121 karboksiterminaa- ! ί lista tähdettä. j
Meidän iähtäplasmidimme pTATAcys-HE?*85:n ja pTAT Acys-HE2,121 :n muodostamisessa olivat pT:E5P80:-8.5 ja vastaa-20 vasti pET8c-123 (molemmat kuvattu edellä). Digestoimme ; pET8c-85:n ja pET8c-123:n Bglil;lla ja Ncoliliä, ja eristimme ison fragmentin molemmissa tapauksissa (4769 emäspä-ria pET8c-85:stä tai 4880 emäspariä pET8c-l23:sta) käytet- | täväksi vektorina. Molemmissa Vektoreissa E2:ta kooditta- j 25 vat alueet alkavat Ncol-kohdasta. Sijoitimme molempiin j vektoreihin 220 emäsparin Bgill-Aatll-fragmentin plasmi- | dista pTATAcys, ja synteettisen fragmentin. Bglll-Aatll- ! fragmentin 5'-pää on ylävirtaan T7-promoottorista ja koo- | dittaa tatAcvs:n ensimmäistä 40 tähdettä (se on: tähteet | 30 1 - 21, 38 - 56). Synteettinen fragmentti, joka koostui hybridisoituneista oligonukleotideista 374.67 (SEQ ID nro 25) ja 374,68 (SEQ ID nro 26), kooditti tat-tähteitä 57 -72, jossa oli yksijuosteisena yli tuleva Aatll-osa 5'-päässä ja yksijuosteisena yli tuleva Ncol-osa 3-päässä. j 63
Sarja geneettisiä JB-fuusioita
Plasmidi pJB106 koodittaa fuusioproteiinia (kuvio 12) (SEQ ID nro 38), jossa aminoterminaalista metioniini-tähdettä seuraavat tat-tähteet 47 - 58 ja sitten HPV-16:n 5 E2-tähteet 245 - 365. Jotta saisimme aikaan pJBl06:n, suo ritimme kolmivaiheisen ligaation, joka kuvataan kaavamaisesti kuviossa 11. Saimme aikaan 4602 emäsparin vektori-fragmentin digestoimalla plasmidin pETSc Ncol:llä ja BamHI: llä. Yksi insertti oli 359 emäsparin MspI-BamHX-10 fragmentti pET8c-123:sta, joka kooditti HPV-16 E2-tähteitä 248 - 365. Toinen insertti oli synteettinen fragmentti, joka koostui hybridisortuneesta oligonukleotidiparista 374.185 (SEQ ID nro 27) ja 374.186 (SEQ ID nro 28). Synteettinen fragmentti kooditti aminoterminaalista metiqnii-15 nia ja tat-tähteitä 47 - 58, sekä HPV16~tähteitä 245 - 247 (se on: ProAspThrj. Synteettisellä fragmentilla oli yksi-juosteisena yli tuleva Ncol-osa 5'-päässä ja yksijuostei-sena yli tuleva Mspl-osa 3'-päässä.
Hankimme plasmidit pJB117 (SEQ ID nro 59), pJBIlS 20 (SEQ ID nro 60), pJB119 (SEQ ID nro 61), pJBl20 (SEQ ID
nro 62) ja pJB122 (SEQ ID nro 63) PCR-deleetiokloonauksel- ; la, samanlaisella tavalla kuin käytettiin pTÄT^oys:n ta- j pauksessa (kuvattu edellä ja kuviossa 8). Muodostimme \ plasmidit pJB117 ja pJBIlS deletoimalla pTATAcys~HE2.121:n \ 25 segmenttejä. Muodostimme plasmidit pJB119 ja pJB120 dele- | toimalla pTATAcys-161:n segmenttejä. Kaikissa neljässä j kloonauksessa käytimme PCR-aluketta 374.122 (SEQ ID nro \ 29) kattaaksemme HindiII-kohdan, joka sijaitsee alavirtaan | tat-E2:n koodattavasta alueesta. Kussakin tapauksessa toi-30 nen aluke ulottui Ndel-kohtaan tatAcys:n koodittavän sekvenssin alussa ja poisti kodonit tähteille tatAcysm alussa (se on: tähteet 2 - 21 ja 38 - 46 pJBll7:lle ja pJB119:lie, ja tähteet 2 - 21 pJBllBrlle ja pJB120:lle).
Tähteiden 2 - 21 deletointia varten käytimme aluketta 35 379*11 (SEQ ID nro 30). Tähteiden 2 - 21 ja 38 - 46 dele- 64 tointia varten käytimme aluketta 379,12 (SEQ ID nro 31). FCR-reaktion jälkeen digestoimme FCR-tuotteet Ndel:llä ja Hindi.II:11a. Sitten kloonasimme tuloksena olevat restrik-tiofragmentit vektoriin pTATAcys-HE2.121, joka oli diges-5 toitu aikaisemmin Ndel:llä ja Hindlll:llä, jolloin saimme 4057 emäsparin reseptorifragmentin. Näin muodostimme eks-pressioplasmideja, jotka kopdittivat fuusioproteiineja, jotka koostuivat aminohappotähteistä seuraavasti: 138117 = Tat47-72-HPVl6 E2 245 - 365, 10 JB118 = Tat38-72-HPVI6 E2 245 - 365, 1B119 = Tat47-62-BPV1 E2 250 - 410 ja 1B120 = Tat 38-62-BPVI E2 250 - 410.
Muodostimme PJBl22:n, joka koodittaa tat-tähteitä 38 - 58, jota seuraa HPV16:n E2-tähteet 245 - 365 (se on: 15 E2:n karboksiterminaaliset 121 aminohappoa), deletoimalla pJB118-kodoneista tat-tähteet 59 ~ 72. Suoritimme tämän deleetion PCRillä käyttämällä alukkeita 374.13 (SEQ XD nro 32), joka kattaa AatII-kohdan tat:n köodittavan alueen sisällä, ja alukkeella 374.14 (SEQ ID nro 33), joka kattaa 20 AatII-kohdan, joka sijaitsee hieman alavirtaan Tat-E2-gee- | nin ainutkertaisesta HindiII-kohdasta, Digestoimme PCR- ? tuotteen AätII;Ila ja eristimme tuloksena olevan restrik- ) tiofragmentin. Lopullisessa pJBl22-muodostusvaiheessa si- \ joitimme eristetyn Aatll-fragmentin AatH-digestoituun j 25 pJBllS-vektoriin. |
Pitäisi panna merkille, että meidän kaikissa vii- j dessä edellä kuvatussa plB-konstruktiossamme tat:n koodit-tavaa sekvenssiä edelsi metioniinikodoni translaation initiaatiota varten.
30 Tat-E2-fuusioproteiinien puhdistus Käytimme kaikissa tapauksissa E. colia ekspressoi- | daksemme geneettiset tat-E2-fuusiomme. Meidän yleinen menetelmämme tat-E2-proteiinin puhdistamiseen käsitti seu-raavat alkuvaiheet: solujen ajamisen sakaksi, niiden re-35 suspendoinnin 8-10 tilavuuteen lyysipuskuria (25-milli- \ 65 molaarinen Tris (pH 7,5), 25-millimolaarinen NaCl, 1-tnil-limolaarinen DTT, 0,5-millimolaarinen EDTA), joka sisälsi proteaasin inhibiittoreita - yleensä 1 mM PMSF:n, 4 pg/ml E64:ää, 50 pg/ml aprotiniinia, 50 pg/ml peps tätiini A: ta, 5 ja 3 mM bentsamidiinin), solujen hajotuksen "French press" -laitteessa (2 kertaa 12 000 psi (82 656 kPa)), ja lysaat-tien sentrifugoinnin 10 000 - 12 000 g:n kiihtyvyydessä 1 tunnin ajan (paitsi FTE-proteiinitj, 4 °C:n lämpötilassa. Lisävaiheet, joita käytettiin tiettyjen tat-E2-fuus±opro-10 teilnien puhdistukseen, kuvataan jäljempänä.
£2,103 ja E2.249 - Lysaatin sentrifugoinnin jälkeen latasimme supernatantin Fast S Sepharose -pylvääseen ja eluöimine £2,103- tai E2.249-proteiinin 1-molaarisella NaClillä. Sitten puhdistimme lisäksi E2.103:n tai E2.249:n 15 kromatografiässä P60-geelisuodatuspylväässä, joka oli ta- |
Sapainotettu lÖO-millimalaarisella HEPES-puskurilla (pH j 7,5), joka oli 0,1-millimolaarinen EDTA:n ja l-millimolaa-rinen BTT:n suhteen.
FTE1Q3 - Sen jälkeen kun lysaattia oli sentrifugöi-20 tu 10 000 g:n kiihtyvyydessä 10 minuutin ajan 4 °C:n lämpötilassa, otimme talteen FTElOS-proteiinin (joka sakkau-tui) resuspendoimalla Sakan 6-molaarisella urealla ja li- f säämällä kiinteää guanidiini-HCI:ää niin että loppukon- j sentraatio oli 7~molaarinen. Suspension sentrifugoinnin | 25 jälkeen puhdistimme FTElQ3-proteiinin supernatantista kromatograf iällä A.5M-geel±suodatuspylväässä 6-molaarisella guanidiinilla, joka oli 50-millimolaarinen natriumfosfaa-tin (pH 5,4) ja IG-millimOlaarinen DTT:n suhteen. Keräsimme FTE103;n sisältävät fraktiot geelisuodatuspylväästä sen 30 perusteella, että Coamassie-värjättyihin SDS-polyakryy-liamidielektroforeesigeeleihin ilmestyi juova, jonka näennäinen moiekyylipaiho oli 19 fcDa.
FTE403 - Meidän puhdistusmenetelmämme FTE403:lle oli oleellisesti sama kuin FTE103:lie, paitsi että FTE403 5 s
S
: I
66 liikkui geelisuodatuspylväässä 25 kDa:n näennäisen mole-kyylipainon mukaisesti.
FTE501 - Sen jälkeen kun lysaattia oli sentrifugoi-tu 10 000 g:n kiihtyvyydessä 30 minuutin ajan, resuspen-5 soimme sakan 6-moiaärisessa ureassa, lisäsimme kiinteää guanidiini-HCl:ää niin että loppukonsentraatio oli 6 M, ja DTT:tä 10-millimolaariseksi konsentraatioksi. 30 minuutin jälkeen 37 °C:n lämpötilassa, kirkastimme liuoksen sentri-fugoimalla 10 000 g:n lämpötilassa 30 minuutin ajan. Sit-10 ten latasimme näytteen A. 5-agaroosigeelisuodatuspylvääseen
6-molaarisessa guanidiini-HCl: ssä, joka oli 50-millimolaa-rinen natriumfosfaatin {pH 5,4) ja lö-millimolaarinen DTT:n suhteen, ja keräsimme FTESÖlin sisältävät fraktiot I
geelisuodatuspylväästä, sen perusteella, että Coomassle-15 värjättyihin SDS-polyakryyliamidielektroforeesigeeleihin ilmestyi juova, jonka näennäinen molekyylipaino oli 40 kDa. Latasimme geelisuodatuksella puhdistetun FTE5Ö1 :n Cie-käänteisfaasi-HPLC-pylvääseen ja eluoimme gradientilla, jossa oli 0-75 % asetönitriili 0,1-prosenttisessa tri- i 20 fluorietikkahapossa. Keräsimme FTE5Ö1 ^proteiinin yksittä!- | senä piikkinä, jonka näennäinen molekyylipaino oli 40 kDa. |
TatAcys-lOS - Lysaatin sentrifugoinnin jälkeen la- | tasimme supernatantin Q-Sepharose-pylvääseen, joka Oli | tasapainotettu 25-millimolaarisella Tris:llä (pH 7,5), \ 25 joka oli 0,5-millimolaarinen EDTAin suhteen. Latasimme Q- |
Sepharose-pylväästä läpi tulleen nesteen S-Sepharose-pyl- | vääseen, joka oli tasapainotettu 25-millimolaarisella | MES:llä (pH 6,0), sen jälkeen kun Q-Sepharose-pylväästä | läpi tullut nesteen pH oli säädetty noin 6,Öiksi lisäämäl- | 30 lä MES:iä (pH 6,0.) niin että loppukonsentraatio oli 30 mM. ]
Otimme talteen tatAcys-lOS-proteiinin s-Sephärose-pylvääs- | tä käyttämällä peräkkäisiä NaGl-konsentrpintivaiheita 25- | millimolaarisessa MESissä (pH 6,0). TatAcys-105 eiuoitui j pH 6,0 -puskurissa 800 - 1 000 mM NaCl:lla. | ! | 67
TatAcys-l6l - Lysaatin sentrifugoinnin jälkeen la-tasimme supernatantin S-Sepharose-pylvääseen, joka oli tasapainotettu 25~millimolaariseIla Tris:11a (pH 7,5), joka oli 0,5-millimolaarinen EDTA:n suhteen. Otimme tal-5 teen tatAcys-161:n S-Sepharöse-pylväästä käyttämällä vaiheittaista NaGl-gradienttia 25-millimolaarisessa Tris: ssa (pH 7,5). TatAcys-lol eluoitui pH 7,5 -puskurissa 500 -700-millimolaafiseIla NaCl;lla.
TatAcys-249 - Lysaatin sentrifugoinnin jälkeen la-10 tasimme supernatantin Q-Sepharöse-pylvääseen, joka oli tasapainotettu 25-millimolaarisella Tris:llä (pH 7,5), joka oli 0,5-millimolaarinen EDTA:n suhteen. Otimme talteen tatAcys-249:n S-Sepharose-pylväästä käyttämällä vaiheittaista NaCl-gradlenttia 25-miilimolaarisessä Tris:ssa 15 (pH 7,5). Tathcys-249 eluoitui vaiheittaisessa NaCl-gra-dientissa osassa, joka oli 600 - 800-miIilmolaarinen NaCl:n suhteen,
Tat^cys-HE2.85 ja TatAcys.He2.121 - Lysaatin sentrifugoinnin jälkeen latasimme supernatantin Q-Sepharose-20 pylvääseen. Latasimme läpi tulleen nesteen S-Sepharose- 5 pylvääseen. Otimme talteen tatAcys-HE2.85;n tai tatAcys- j HE2.121:n käyttämällä vaiheittaista NaCl-gradienttia. Mo- i lemmat proteiinit eluoituivat 1-molaarisella NaCl:lla, \ HPV E2 ja HPV E2CCSS - Katso esimerkki 9 (edellä). j i 25 JBl.06 - Lysaatin sentrifugoinnin ja supernatantin \
keräämisen jälkeen llisäsimme NaCl:a niin että loppukon- I
sentraatio oli 300 mM. Latasimme supernatantin, johon oli j lisätty NaClra, S-Sepharose-pylvääseen joka oli tasapai- i j notettu 25 mM HEPES-puskurilla (pH 7,5). Käsittelimme pyi- j 30 vään peräkkäisillä suolakonsentraatiovaiheilla puskurissa, i joka oli 25-miliimolaaririen HEPES:n (pH 7,5), 1,5-millimö- j laarinen EDTA:n ja 1-millimolaarinen DTT:n suhteen. Elu-oimme JB106-proteiinin S-Sepharpse-pylväästä 1-molaarisella NaCl:lla.
68 JB117 - Lysaatin sentrifugoinnin ja supernatantin keräämisen jälkeen lisäsimme NaCl:a niin että loppukonsen-traatio oli 300 mM. Koska JB117 pakkautui 300-millimolaa-risessa NaCl:ssa, laimensimme JB117-supernatantin 100-mil-5 limolaariseen NaCl:iin ja latasimme proteiinin eränä S-Sepharose-pyl vääseen. Eluoimme JB117:n S-Sepharose-pyi-väästä 1-inolaarisella NaCl :11a, joka oli 2 5-mi Himo laari-nen Tris:n (pH 7,5) ja 0,3-millimolaarinen DTT:n suhteen.
JB118 - Lysaatin sentrifugoinnin ja supernatantin 10 keräämisen jälkeen lisäsimme. NaCl:a niin että loppukon-sentraatiö oli 300 mM. Latasimme supernatantin, johon oli lisätty NaCl:a, S-Sepharose-pylvääseen, joka oli tasapainotettu 25 mM HEPES-puskurilla (pH 7,5). Eluoimme JB118-proteiinin S-Sepharose-pylväästä 1-roolaarisella NaCl:11a, 15 joka oli 25-millimolaarinen Tris:n (pH 7,5) ja 0,3-milli-molaarinen DTT:n suhteen.
.«JB119, JB120, JB121 ja JB122 - Lysaatin sentrifugoinnin ja supernatantin keräämisen jälkeen lisäsimme JB119:n ja JB121:n tapauksessa NaCl:a niin että sen kon-20 sentraatiö oli 150 mM, ja JB120:n ja JB122:n tapauksessa s niin että sen konsentraatio oli 2QQ mM. Latasimme supernatantin, johon oli lisätty NaCl:a, S-Sepharose-pylvääseen, ΐ joka oli tasapainotettu 25 mM HEPES-puskuri11a (pH 7,5). f
Eluoimme proteiinit JB119, JB12Ö, JB121, ja JB122 S-Sepha- \ 25 rqse-pylväästä 1-molaarisella NaCl:11a, joka oli 25-millimolaarinen Trisrn (pH 7,5) ja 0,3-mlllimplaarinen DTT:n suhteen.
Esimerkki 14 E2-repressiomääritykset - muut konjugaatit 30 Testasimme tat-E2-£uusioproteiinimjne silmällä pi täen papilloomaviruksen täyspitkän E2-proteiinin aikaansaamaa transkription aktivaatiota ("repressiota"). Mitta- j simme E2~repression lyhytkestoisella kotransfektiömääri- j tyksellä C0S7-soluissa. Tässä määrityksessä käytetyt C0S7- | 35 solut pidettiin viljelmässä vain lyhyitä ajanjaksoja. Su- | 69 latimme C0S7-solut pasaasissa 13 ja käytimme niitä vain pasaasiin 25 asti. Pitkät kasvatusajat johtivat alhaisiin E2:n transkription aktivaatiotasoihin ja alentuneeseen repressioon ja toistettavuuteen. Meidän repressiomäärityk-5 semrne ja repressloaktiivisuuden laskentamenetelmämme kuvataan esimerkissä 9 {edellä). Konjugaattien TxE2.103, TXE22.249, FTE103, FTE202, FTE403 ja FTE501 tapauksessa korvasimme HFV-16 E2“transaktivaattorin yhtä suurella määrällä BPV-l:n E2-transaktivaattoria. Vastaavasti, sen si-10 jaan että olisi transfektoitu HPV-16 E2 -ekspressioplasmi-dxlla pAHE2, transfektoimme BPV-1 E2 -ekspressioplasmidil-la pXÖ323, joka kuvataan täysin US-patentissa 5 219 990.
Geneettinen fuusloproteiini JB106 on ollut jatkuvasti meidän tehokkain tat-E2-repressorikonjugaattinime.
15 Tulokset JB106:ta ja TxHE2CCSS:ää vertaavasta repres-siomäärityksestä esitetään taulukossa III. Kuvio 13 kuvaa graafisesti taulukossa III esitettyjä tuloksia.
JB106:n lisäksi useat muut tat-E2-repressorikonju-gaatit ovat saaneet aikaan merkittävää repressiota. Kuten 20 taulukossa IV esitetään, TxHE2:lla, TxHE2CCSS:llä, J8117:llä, JB118:11a, JB119:llä, JB120:lla ja JB122:lla havaittiin repressiotasoja ++-alueella.
i * j * ] $ j | i j
Taulukko III
70
Lisätty Rinnakkais- cpm- proteiini cpm- parien taustan Repressio- {pg/ml) tausta* keskiarvo keskiarvo prosentti 5 0 3 872 0 3 694 3783 0 17 896 0 18 891 18 393 14 610 1 JB106 16 384 10 1 »133106 17 249 16 816 13 033 10,8 3 »TB1Q6 11 456 j 3 »JB106 10 550 11 003 7 220 50.6 10 JB106 6 170 10 JB106 7 006 6 588 2.805 81,0 30 JB106 4 733 30 JB106 4 504 4 618 835 94,3 15 1 TXHE2CCSS 17 478 1 TXHE2CCSS 18 047 17 762 13 979 4,3 3 TxHE2CCSS 14 687 3 TXHE2CCSS 15643 15165 11382 22,1 10 XXHE2CCSS 12 914 10 TXHE2GCSS 12 669 12 791 9 008 38,3 30 TXHE2CCSS 7 956 20 30 TXHE2CCSS 8 558 8 257 4 474 69,4 1 HE2.123 18 290 |
1 HE2.123 18 744 18 517 14 734 0 I
3 HE2.123 17 666 \ 3 HE2.123 18 976 18 321 14 538 1.3 10 HE2.123 18 413 i
10 HE2.123 17 862 18 137 14 354 2,6 I
30 HE2.123 18 255 i 30 HE2.123 18 680 18 467 14 684 0,3 ! * Tausta = 158 cpm j Ϊ j 30 Taulukossa IV esitetään yhteenvetona meidän tat-E2- j : repressiomääritystuloksemme. Vaikka testasimmekin kaikki tat~E2-repressorifconjugaattimme samanlaisissa määrityksissä, kaikkia konj ugaattej a ei testattu yhtaikaa samassa määrityksessä. Olemme vastaavasti Ilmaisseet repressioak-35 tiivisuuden tason semlkvantitatiivisesti seuraavasti; +++, .¾ j 71 ++, +, +/- tai jossa +++ on vahva repressio ja - tarkoittaa ettei repressiota ole havaittavissa. Kuvio 13 esittää havainnollisesti repressioaktilvisuutta luokitta-levän järjestelmän, jota käytetään taulukossa IV. JB.106 on 5 esimerkki aktiivisuustasosta +++. TxHE2CCSS on esimerkki aktiivisuustasosta ++. Negatiivinen kontrolli, HE2.123, on esimerkki aktiivisuustasosta -. Aktiivisuustaso + on välimuoto TxHE2CCSS:llä ja HE2.123:11a havaitusta aktiivisuu-desta. Niillä kahdella konjugaatilla, joiden aktiivisuus 10 esitetään +/-:na, oli heikko (mutta havaittavissa oleva) aktiivisuus joissakin määrityksissä eikä havaittavissa olevaa aktiivisuutta muissa määrityksissä.
• j j ! i ! : | 5 | 72
Taulukko IV
Repressio-
Proteiini Tat-tähteitä E2-tähteitä taso c TxE2.103 37-72 BPV-1 308-410 + 5 TXE2.249 37-72 BPV-1 162-410 TXHE2 37-72 HPV-16 245-365 ++ TXHE2CCSS 37-72 HPV-16 245-365 ++ 10 FTE103 1-67 BPV-1 306-410 FTE208 1-62 BPV-1 311-410 FTE403 1-62 BPV-1 250-410 - j FTE501 1-62 BPV-1 162-410 15
TatAcys- 1-21.38-67 BPV-1 306-410 105
TatAcys- 1—2.1,38—62 BPV-1 250-410 +/- 161
TatAcys- 1-21,38-62 BPV-1 162-410 +/- 249
TatAcys- 1-21,38-72 HPV-16 281-365 + \ HE2.85 |
TatAcys- 1-21,38-72 HPV-16 245-365 + i
HE2.121 I
25 ) JB106 47-58 HPV-16 245-365 +++ 1 \ JB117 47-72 HPV-16 245-365 ++ |
JB118 38-72 HPV-16 245-365 ++ J
30 JB119 47-62 BPV-1 250-410 ++ ' j j JB120 38-62 BPV-1 250-410 ++ | JJ3122 38-58 HPV-16 245-365 ++ | ! i i 73 FTE103:lta, FTE403:lta, FTE208:lta ja FTE5Ql:ltä, niiltä neljältä konjugaatilta, joilla oli tat:n aminoter-minaalineo alue (se on: tähteet 1-21) ja kysteiinipitoinen alue (se on: tähteet 22 - 37), puuttui repressio koko-5 naan. Koska olemme osoittaneet epäsuoralla immunofluore-senssilla, että FTE501 menee sisään soluihin, pidämme todennäköisenä että E2-repressoriaktiivisuus on menetetty FTE-sarjassa johtuen liitoksesta tat-kuljetuspolypepti-diin. Meidän tuloksemme osoittavat, että kysteiinipitoisen 10 alueen puuttuminen tat-osasta lisäsi yleisesti E2-repres- SOriaktiivisuutta. Lisäksi kysteiinipitoisen alueen pois- f saolö tat-E2-konjugaateissa vaikutti lisäävän proteiinin-tuotantotasoja E. colissar ja lisäävän proteiinin liukoisuutta, ilman että menetettiin kuljetusta kohdesoluihin.
15 Tat:n aminoterminaalisen alueen deleetio lisäsi myös E2-repressorin aktiivisuutta. Fuusiöproteiini JB106, jossa oli vain tat-tähteet 47 ~ 58, oli tehokkain meidän tat-E2-repressörlkanjugaateistamme. Tatin kysteiinipitoisen alueen poissaolo ei kuitenkaan aina johda E2-repressoriak- Ϊ 20 tiivisuuden säilymiseen konjugaatissa. Esimerkiksi kemia!- 1 linen konjugaatti TxE2.249 oli liukenematon ja myrkyllinen \ soluille. Hiinpä jopa kysteiinittömän tatin osan liittämi- \ < nen voi saada aikaan toimimattoman E2-repressörikqnjugaa- j
tin. I
25 Esimerkki 15 |
Katkaistavissa olevat E2-konjugaatit j
Tat-osien kemiallinen konjugointi E2-proteiiniin sai aikaan ainakin 20-kertaisen vähentymisen E2-proteiinin sitoutumisessa E2-sitoutumiskohtiin DNA:ssa (tuloksia ei 30 esitetä). Niinpä teimme kokeita arvioidaksemme katkaistavissa olevan silloituksen tat-kuljetusosan ja E2-represso-riosan välillä. Testasimme erilaisia menetelmiä, joilla voidaan tehdä katkaistavissa oleva silloitus.
Yhdessä koesarjassa aktivoimme HFV E2-€CSS-proteii-35 nin kysteiinisulfhydryyliryhmät aläritiolilla lÖO-miliimo- 1 ] ] ) 74 laarisessa HEPES-puskurissa (pH 7,5), joka oli 500-milli-molaarinen NaCl:n suhteen. Eristimme aktivoidun E2~repres~ sorin geelisupdatuskromatografiällä ja käsittelimme sen tat37~72;11a. Saimme aikaan alhaisen siilo!tustehon, mikä 5 johtui nopeasta E2-CC$S-dimeerin muodostumisesta aldritio-likäsittelyllä. Tämän ongelman välttämiseksi panimme E2-CCSS:n 8-molaariseen ureaan huoneenlämpötilassa ja käsittelimme sen aldritiolilla 23 °C:n lämpötilassa 60 minuutin ajan denaturoivissa olosuhteissa. Sitten laskastinune uu-10 destaan E2CCSS-aldtitioli-aduktin, edistimme sen gee- lisuodatuskromatografilla ja annoimme sen sitten reagoida 1 tat37-72:n kanssa. Tällä menetelmällä saatiin aikaan erin- ; omainen silloitus. Silloitimme myös E2CSSS:n ja E2CCSC:n tat37-72:een käyttämällä ureamenetelmän muunnelmaa, jossa 15 käytimme S-Sepharose-kromatografiaa geelisuodatuksen si jasta eristääksemme E2-aldritioli-adukteja. Tämä muunnos lisäsi aduktien saantoa ja sai aikaan reaktiossa käytetyssä E2-lähtömateriaalissa noin 9Ö-prosenttisen silloittumi-sen.
20 Katkaistavissa olevilla tat-E2-konjugaateilla oli aktiivisuutta repressiomäärityksessä, Katkaistavissa olevien konjugaattien repressioaktiivisuus oli kuitenkin hie- f man alhaisempi kuin samanlaisilla konjugaateilla, jotka |
oli silloitettu irreversiibelisti, Katkaistavissa olevien I
25 konjugaattien hieman alhaisempi aktiivisuus voi heijastaa j proteiinin puoliintumisaikaa solussa» Tat on suhteellisen ;| stabiili soluissa. E2-proteiineilla on yleensä lyhyet puo- | liintumisajat solussa. Niinpä irreversiibeli silloittaminen tat-osan ja E2-osan välillä voi stabiloida E2-osaa.
30 Esimerkki 16
Herpes Simplex-viruksen repressorikonjugaatti Herpes Simplex -virus ("HSV") koodittaa transkription äktivaattoria VP16, joka indusoi hyvin varhaisten HSV-geenien ekspression. Friedman ym. ovat tuottaneet 35 HSV:n VP16-repressorin deletoimalla VP16:n karboksitermi- 75 naalisen transaktivaatia--osan ( "Expression of a Truncated Viral Trans-Activator Selectively Impedes Lytic Infection by Its Cognate Virus", Nature, 335, s. 452 - 454 (1988)). olemme tuottaneet HSV-2:n VP15-repressorin samanlaisella 5 tavalla.
jotta saisimme testattua kuljetuspolypeptidi-VPl 6-repressorikonjugaattien soluun oton ja VPl6-repressor!aktiivisuuden, transfektoimme samanaikaisesti VPlö-riippu-vaisen reportteriplasmidin ja Vplö-repressoriplasmidin 10 C0S7“Soluihin. Sitten altistimme transfektöidut solut kul-jetuspolypeptidi-VPl6-repressorikonjugaatille tai soveliaalle kontrollille. Jäljempänä kuvattu repressiomääritys Oli analoginen edellä esimerkissä 9 kuvatun E2~repres-siomääritvksen kanssa.
15 VFlö-repressiomääritysplasniidit
Meidän reportterikonstruktiomme VPl6~repressIoraää-ritystä varten oli plasmidi pl75kCAT, joka oli hankittu G.
Hayward!Itä (katso P. 0'Hare ja G. S. Hayward, “Expression of Recombinant Genes Containing Herpes Simplex Virus 20 Delayed-Early and Immediate-Early Regulatory Regions and \
Trans Activation by Herpes Virus Infection", J. Virol., 52, s. 522 - 531 (1984)). Plasmidi pl75kCAT sisältää HSV- j l:n IE175-promoottorin, joka ohjaa CAT-reportterigeeniä. ΐ
Meidän HSV-2-transaktivaattorikonstruktiomme VP16- j 25 repressiomääritystä varten oli plasmidi pXB324, joka si- | sälsi villityyppisen HSV-2 VPl6-geeenin kanan β-aktiini- j \ promoottorin ohjauksessa. Muodostimme pXB324:n sijoitta- ) maila pXBlOO:aan (P. Han ym., "Transactivation of Heterologous Promoters by HIV-1 Tat", Nuc. Acids. Res. .
30 19, s. 7225 - 7229 (1991)), XhoI-fcohdan ja BamHI-kphdan väliin, 280 emäsparin fragmentin joka sisälsi kanan β-ak- j tiinipromoottorin, ja pCA5-plasmidista peräisin olevan j 2318 emäsparin BamHI-EcoRI-fragmentin (0'Hare ja Hayward, ] edellä), joka koodittaa kokonaista villityyppistä HSV-2:n ] 35 VP16-proteiinia. |
J
i
; I
76
Tat-VPl6-repressori£misioproteiini Tuotimme bakteereissa fuusioprateiinih tat-VP16R.GF (SEQ ID nro 58), joka koostui HIV:n tat-proteiinin aminohapoista 47 - 58, jota seuräsivat HSV:n VP16-proteiinin 5 aminohapot 43 - 412. Tat-VPl6-repressorifuusioproteiinin bakteerituotantoa varten muodostimme plasmidin pET/tat~ VP16R.GF kolmivaiheisessa ligaatiössa. Ensimmäinen fragmentti oli vektori pET-3d (kuvattu edellä vaihtoehtoisella nimellä "pET-Sc"), joka oli digestoitu NcoI:llä ja 10 Bglll :1.1a (noin 4600 emäsparia). Toinen fragmentti koostui synteettisistä oligonukleotideista 374.219 (SEQ ID nro 39) ja 374,220 (SEQ ID nro 40), jotka oli liitetty yhteen kaksi juosteisen DNA-molekyylin muodostamiseksi. Synteettisen fragmentin 5'-päässä oli yksijuosteisena yli tuleva Ncol-15 osa, joka sisälsi translaation aloituskodonin ATG. Aloi-tuskodonin jälkeen olivat kodonit tat-1ähtei1le 47 - 58,
Heti tat-kodonien jälkeen lukukehyksessä olivat kodonit VPl6:n tähteille 43 - 47. Synteettisen fragmentin 3'-pää oli tasapää kolmanteen fragmenttiin ligaatiota varten, 20 joka oli 1134 emäsparin Pvu11-Bgl11™ fragmentti pXB324R4:sta, joka sisälsi HSV-2 VP16:n kodonit 48 - 412.
Johdimme pXB324R4:n pXB324:stä (kuvattu edellä). Plasmidi 1 PXB324R2 oli välituote pXB324R4:n muodostamisessa, j
Muodostimme pXB324R2:n sijoittamalla pXBlQ0:aan 25 1342 emäsparin BamHI-Aatll-fragmentin, joka oli peräisin j
pXB324;stä ja kooditta HSV-2 VP16:n 419 N-terminaalista I
aminohappoa. Jotta saisimme aikaan lukukehyksen sisällä j olevan lopetuskodonin, käytimme 73 emäsparin Aatll-ScoRI- | fragmenttia, joka oli peräisin pSV2-CAT:sta (C,M> Gorman 30 ym., Molecular and Cellular Biology, 2, s. 1044 - 1051 (1982)). Niinpä pXB324R2 kooditta HSV-2:n VPl6:n 419 ensimmäistä aminohappoa ja lisäksi seitsemää ei-VP6-amino-happoa ennen lopetuskodonia. pXB324R4:n muodostamiseksi \ suoritimme kolmen palan ligaation, joka käsitti 5145 emäs- 1 35 parin MluI~EcoRI~fragmentin pXB324R2:sta ja kaksi insert- | | 77 tifragmenttia. Yksi insertti oli 115 emäsparin MluI-NspI-fragmentti pXB324R2:sta, joka kooditti VP16:n 198 ensimmäistä aminohappoa. Toinen insertti fragment ti oli kaksi-juosteinen synteettinen DNA-molekyyli, joka koostui syn-5 teettisista oligonukleotideista 374.32 (SEQ ID nro 41) ja 374.33 (SEQ ID nro 42). Yhteen hybridisoituina nämä oli-gonukleotidit muodostivat 5'-päähän yksijuOSteisen Nspl-pään ja 31-päähän yksijuosteisen EcoRI-pään. Tämä synteettinen fragmentti kooditti VP16:n tähteitä 399-412, jota 10 seurasi lOpetuskodoni. Niinpä plasmidi pXB324R2 erosi pXB324R2:sta sikäli että siitä puuttuivat kodonit VP16:n aminohapoille 413 - 419 ja seitsemän ylimääräistä aminohappoa ennen lopetuskodonia,
Tat~VPl6R.GF“£uusioproteiinin puhdistus 15 Ekspressoimme tat-VP16R.GF;ää varten tehdyn geneet tisen konstruktiomme E. colissa. Keräsimme transformoidun E. Colin sentrifugaatiolla, resuspendoimme solut 8-10 tilavuudessa hajatuspuskuria (25 mM Tri s: (pH 7,5), 25 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 4 pg/ml E64:ää, 50 20 pg/ml aprotiniinia, 50 pg/ml pepstatiini A: ta, ja 3 mM | bentsamidiini), hajotimme solut "French press”-laitteessa (2 kertaa, 12 000 psi:n paine (82 656 kPa), ja sentrifu- \ goimme iysaatin 10 000 - 20 000 g;n kiihtyvyydessä 1 tun- \
nin ajan 4 °C:n lämpötilassa. Lysaatin sentrifugoinnin I
25 jälkeen latasiinme supernatantin Fast Q-Sepharose-pylvää- | seen, joka oli tasapainotettu 25-mill±molaarisella i
Trisrllä (pH 7,5), joka oli 0,5-millintolaarinen EDTA: n suhteen. Latasimme Q-Sepharose;sta läpi tulleen nesteen Fäst S-Sepharose-pylvääseen, joka oli tasapainotettu 25- j 30 millimolaarisella MES:llä (pH 6,0), joka oli 0,1-millimo- j laarinen EDTA;n ja 2-millimöXaarinen DTT:n suhteen. Kerä- j simme tat-VP16-fuusioproteiinin S-Sepharose-pylväästä pe- | räkkäisillä NaCl-könsentrointivaiheilla 25-miilimolaari~ | sessa MES:ssä (pH 6,0), joka oli 0,1-millimolaarinen 35 EDTA:n ja 2-millimolaarinen DTT:n suhteen. Tat-VBTö-fuu- || 78 sioproteiini e luo itu i 600 - 1000-milllinolaarisisaa NäCl-fraktioissa.
VP16:n repressiomääritys
Jaoimme HeLa-soluja 24"kuoppaisille viljelmälevyil-5 le, 10s solua/kuoppä. Seuraavana päivänä transfektoimme solut käyttämällä DEAS-dekstraanimenetelmää, kuten B. R.
Cullen on kuvannut artikkelissa "Use of Eukaryotic Expression Technology in the Functional Analysis of Cloned Genes", Meth Enzymol.r vol. 152, s. 684 (1987). Seostimme 10 DNA:n transfektioita varten ja liuotimme sen uudelleen konSentraatioon noin 100 pg/ml liuoksessa, joka oli 100-millimolaarinen NaClrn ja 10-millimplaar±nen Tris:n suhteen (pH 7,5). Kutakin transfektiata varten DNA-DEAE-seos koostui seuraavista: 200 ng pl75kCAT (+/- 1 ng pXB324) tai 15 200 ng pSV-CAT (kontrolli), 1 mg/ml DEAE-dekstraania ja PBS:ää, lopputilavuus 100 μΐ. Altistimme solut tälle seokselle 15 - 20 minuutin ajan 37 °C:n lämpötilassa, niin että viljelylevyjä heilutettiin ajoittain. Sitten lisäsimme kuhunkin kuoppaan 1 ml tuoretta DC-elatusainetta (DMEM 20 + 10-prosenttinen seerumi), joka oli 80-mikromolaarinen Ϊ klorokiinin suhteen. Sen jälkeen kun soluja oli inkuboitu \ 37 °C:n lämpötilassa 2,5 tuntia, imimme elatusaineen kus- \ takin kuopasta ja korvasimme sen tuoreella DC:ilä, joka j
oli 10-prosenttinen DMSO:n suhteen. Kun oli kulunut 2,5 I
\ 25 tuntia huoneenlämpötilassa, imimme pois DMSO:n sisältävän | elatusaineen ja korvasimme sen tuoreella DC:llä, joka si- | sälsi 0, 10 tai 50 pg^ml puhdasta tat-VP16.GF:ää. Seuraa- j vana päivänä korvasimme kussakin kuopassa elatusaineen tuoreella elatusaineella, jolla oli sama koostumus. 24 30 tuntia myöhemmin hajotimme HeLa-solut puskurilla, joka oli 0,65-prosenttinen NP~40:n (detergentti), lO-ntillimolaari-nen Tris:n (pH 8,0), 1-millimolaarinen EDTA:n jaiSO-mil-limolaarinen NaCl:n suhteen. Mxttasimme proteiinikonsent-raation kussakin ekstraktissa normalisoidaksemme näytteet 35 kussakin määrityksessä.
| s § 79
Kun tah-VP1.6>.GF:n konsentraatio oli 50 pg/ml, toksisuus soluille häiritsi määritystä* Kun konsentraatio oli 10 pg/ml, tat~VPl6.G£-fuusloproteiini sai aikaan lähes täydellisen repression VP16-riippuvaisessa CAT-ekspres-5 siossa, niin että havaittavaa solukuolemaa ei ollut ja kontrolleissa oli noin 30-prosenttinen ei-VP16~riippuvai-sen CAT-ekspression repressio, Niinpä havaitsimme VP16-riippuvatsen transaktivaätion spesifisen repression sen lisäksi että vähemmässä määrin esiintyi epäspesifistä rep-10 resslota.
Esimerkki 17
Kulj etuspolypeptidi-DNA-konj ugaatit
ÖNA:han sitoutuvan transkriptiofaktorin aikaansaama I
transkription aktivaatio voidaan estää tuomalla soluihin \ 15 DNA, jossa on sitoutumiskohta kyseiselle transkriptiofak- torille. Tuotu DNA sitoo transkriptiofaktorin ja siitä tulee kyvytön sitoutumaan promoottorikohtaan, jossa se normaalisti toimii. Tätä strategiaa on käytetty inhiboimaan NF-KB:n aikaansaama transkription aktivoituminen 20 (Bielinska ym., "Regulation of Gene Expression with ]
Double-Stranded Phosphorothipate Oligonucleotides”, Scien- ΐ
ee, vol. 250, s. 997 - 1000 (1990)). Bielinska ym, havait- I
sivat annosriippuväisen inhibition, kun soluviljelyelatus- j aineeseen pantiin kaksijuosteista DNA:ta. Konjugoimme kul- \ 25 jetuspolypeptidi tat37-72:n kaksijuosteiseen DNA-molekyy- j liin, jotta saisimme määritetyksi tehostaisiko sellainen | konjugaatio inhibitiota lisäämällä DNA:n ottoa solun sisään.
Ostimme neljä halutulla tavalla syntetisoitua SOSO meeristä fosforitioaattioligonukleotidia, joille oli annettu nimiksi NF1, NF2, NF3 ja NF4, ja joilla oli vastaavasti nukleotidi sekvenssit SEQ ID nro 43, SEQ ID nro 44, j SEQ ID nro 45 ja SEQ ID nro 46. NF1 ja NF2 muodostavat ] dupleksin, joka vastaa villityyppistä NF-KB:n sitoutumis- j 3 80 kohtaa. NF3 Ja NF4 muodostavat dupleksin, joka vastaa mu-tatoitunutta NF-KB:n sitoutumiskohtaa.
Liuotimme NFl:n ja NF3:n veteen noin 4 mg/ml:n kon-sentraatioon. Sitten panimme 800 pg NF1:tä ja NF3:a erik-5 seen 400 μΐ:aan puskuria, joka oli 50-millimolaarinen tri-etanolianiiinin (pH 8,2), 50-millimolaarinen NaCl:n ja 10-millimolaarinen Trautin reagenssin suhteen. Annoimme reaktion edetä 50 minuuttia huoneenlämpötilassa. Pysäytimme reaktion geelisuodatuksella P6DG-pylväässä (BioRad, 10 Richmond, CA), joka oli tasapainotettu 50-millimolaarisel-la HEpES-puskurilla (pH 6,0), joka oli 50-millimolaarinen NaCl:n suhteen, jotta saisimme poistettua ylimääräisen Trautin reagenssin. Monitoroimme 260 nm:n absorbanssia tunni s taaksemme oligonukleotidin sisältävät fraktiot. Mei- \ 15 dän oligonukleotidisaantomme oli noin 75 %. Sitten hybridi soimme Trautilla muokatun NFl:n NF2:n kanssa (lappukon-, sentraatio 0,55 mg/ml) ja hybridisoimme Trautilla muokatun NF3;n NF4:n kanssa (loppukonsentraatio 0,50 mg/ml). Lopuksi annoimme 0,4 mg:n kutakin Trautilla muokattua DNA:ta 20 reagoida 0,6 mg:n kanssa tat-37-BMH:ta (valmistettu esimerkissä 9 edellä kuvatulla tavalla), lOQ-millimolaarises- s
sa BEFES-puskurissa (1 ml, pH 7,5), 60 minuutin ajan huo- I
neenlämpötilassa. Monitoroimme silloitusreaktion etenemis- \ tä polyakryyliamidigeelielektroforeesiila, jota seurasi j 25 geelin värjäys etidiumbromidilla. Yleensä havaitsimme, että noin 50 % DNA:sta modifioituu näissä olosuhteissa.
Nämä kaksijuosteiset DNA-molekyylit testattiin oleellisesti Bielinskan ym. (edellä) menetelmien mukaisesti, tat-sidoksella tai ilman, silmällä: pitäen NF-KB: n 30 transkription aktivaatiota. Tat-liitos tehosti merkittä- j västi nf-kB:n aikaansaamaa transaktivaatiota. ] Tässä kuvatuilla menetelmillä valmistetuista rekom- | binantti-DNA-sekvensseistä on esimerkkinä viljelmä, joka j on talletettu American Type Culture Collection -talletus- j 35 laitokseen, Rockville, Maryland. Escherichia coli -viljel- | | i j 81 mä, jolle on annettu niineksi pJB106, talletettiin 28. heinäkuuta 1993 ja sille annettiin ATCC-talletusnumero 69368.
Vaikka Olemme kuvanneet lukuisia tämän keksinnön suoritusmuotoja, on ilmeistä että meidän peruskonstruk-5 tioitamme voidaan muuttaa siten, että tarjotaan muita suoritusmuotoja, jotka käyttävät hyväksi tämän keksinnön mukaisia menetelmiä ja tuotteita. Niinpä ymmärretään, että tämän keksinnön suojapiirin määrittävät liitteenä Olevat patenttivaatimukset pikemminkin kuin spesifiset suoritus-10 muodot, jotka on esitetty esimerkinomaisesti.
! | 82
SekvenssiIista: (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: BXOGEN, INC, BARSOUM, James G. (US only) FAWELL, Stephan E. (US only) PEPINSKY, R. B. (US only) (ii) TITLE OF INVENTION: TAT-DERIVED TRANSPORT POLYPEPTIDES , (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 63 (lv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: FISH £ NEAVE , . ' .
(B) STREET: 1251 Avenue of the Americas (C) CITY: New York (D) STATE: New York
(E) COUNTRY: USA
(F) ZIP: 10020 (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1,0, Version #1.25 (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: (B) FILING DATE: (C) CLASSIFICATION: (vii) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 07/934,375 (3) FILING DATE: 21-AUG-1992 (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Haley Jr., James F.
(B) REGISTRATION NUMBER: 27,794
(C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: B170CIP
<ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: (212) 596-9000 (B) TELEFAX; (212) S96-9Q90 (C) TELEX: 14-8367 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:l: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH; B6 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein 83
(vi) ORIGINAL SOURCES
(A) ORGANISM; human Immunodeficiency virus (B) STRAIN; type 1 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO;X;
Met Giu Pro Val Asp Pro Arg Leu Giu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser 1 5 10 15
Gin Pro Lys Tiir Ala Cys Thr Ann Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe 20 25 30
His Cys Gin Val Cys Phe lie Thr Lys Ala Leu Gly lie ser Tyr Gly 35 40 45
Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin Gly Ser Gin Thr 50 55 60
His Gin Val Ser Leu Ser LyB Gin Pro Thr ser Gin Ser Arg Gly Asp 65 70 75 80
Pro Thr Gly Pro Lys Giu 85 {2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: (1} SEQUENCE CHARACTERISTICS; (A) LENGTH; 3:6 amino acids (3} TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (li) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:
Cys Phe lie Thr Lys Ala Leu Gly lie Ser Tyr Gly Arg Lye Lys Arg
1 5 10 IS
Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin Gly Ser Gin Thr His Gin Val Ser 20 25 30
Leu Ser Lys Gin 35 \ (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: 04 <i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTHS 22 amino acids (B) TYPE: amino acid (p) TOPOLOGY: linear (iij MOLECULE TYPE*, peptide (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3s
Cys Phe lie Thr Lya Ala Leu Gly He Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg 1 5 10 15
Arg Gin Arg Arg Arg Pro 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4; (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS; (A) LENGTH: 24 amino acids (B) TYPE: amino acid (0) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4:
Phe lie Thr Lye Ala Leu Gly He Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg
I S 10 IS
Gin Arg Arg Arg Pro Gly Gly Cys 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5: (1) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: IS amino acids (B) TYPE:.amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5:
Cys Gly Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro 1 5 10 1 = (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6: 85 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 15 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY; linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (.Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6:
Tyr Giv Arg Lys Lys Arg Arg Gift Arg Arg Arg Pro Giy Gly Cys 1 5 10 15 (2) INFORMATION FOR SEQ 10 NO:7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 56 amino acids (B) TYPE:: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE; peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION:; SEQ ID NO: T:
Met Gift Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser
1 5 10 IS
Gin Pro Lys Thr Ala Phe 11« Thr Lys Ala Leu Gly lie Ser Tyr Gly 20 25 30
Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin Gly Ser Gin Thr 35 40 45
His Gin Val Ser Leu Ser Lys Gin 50 55 (2) INFORMATION FOR SEQ IB NOiB: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 39 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8; 86 GATCCCAGAC CCACCAGGTT TCTCTGTCGG GCCCTTÄAG 39 {2} INFORMATION FOR SEQ ID NO:9i (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 39 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (0} TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO;9: AATTCTTAAG GGCCCGACAG AGAAACCTGG TGGGTCTGG 39 (2} INFORMATION FOR SEQ ID NO:10: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 5098 base pairs (B) TYPE; nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double ¢0} TOPOLOGY: circular (ii) MOLECULE TYPE; DNA {genomic} (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO;ID:
TTGAÄGÄCGA AAGGGCCTCG TGÄTACGCCT ATTTTTATAG GTTAATGTCA TGATAATAAT SO
GGTTXCTTAG ACGTCAGGTg: GCACTTTTCG GGGAAATGTG CGCGGAACCC CTATTTGTTT 120:
ATTTTTCTAA ATACATTCAA ATATGTATCG GCTCATGAGA CAATAACCCT GATAAATGCT ISO
TCAATAATAT TGAAAAAGGA AGÄGTATPAG TATTCÄACAT TTCCGTGTCG CCCTTATTCC 240 CTTTTTTGCG GCATTTTGCG TTCCTGTTTT TGCTCACCCA GAAÄCGCTGG TGÄÄAGTÄAK 300 AGATGCTGAA GATCAGTTGG GTGCACGAGT GGGTTACATC GAACTCGATC TCAACAGCGG 360 TAAGATCCTT GÄGAGTTTTC GCCCCGAAGA ACGTTTTCCA ATGATGAGCA CTTTTAAAGT 420 TCTGCTATGT GGCGCGGTAT TATCCCGTGT TGACGCCGGG CAAGAGCAAC TCGGTCGCCG 480 CATACACTAT TCTCAGAATG ACTTGGTTGA GTACTCACCA GTCACAGAAA AGCATCTTAC 540 GGATGGCKTG ACAGTAAGAG AATTATGCAG: TGCTGCCATA AOCATGAGTG ATAACACTGC 600 GGCCAACTTA CTTCTGACAA CGÄTCGGAGG ACCGAAGGAG CTAACCÖCTT TTTTGCACÄA 660 CATGGGGGAT CATGTAACTC GCCTTGATCG TTGGGMCCG GAGCTGM.TG ÄAGCCATACC 720 87 AAACCACGAG CGTGACACCA CGATGCCTGC AGCAAXGGCA ACAACGTTGC GCAAACIAXT 780 AACXGGCGAA CTACTTACTC TAGCTTCCCG GCAACAÄTTA ATAGACTGGA TGGAGGCGGA B40 TAAAGTXGCA GGACCACTTC TGCGCTCGGC CCTTCCGGCT GGCTGGTTTA TTGCTGATAA 900
ATCTGGAGCC GGXGAGCGTG GGTCTCGCGG TATCATXCCA GCACXGGGGC CÄGÄTGGTAA 9SO
GCCCTCCCGT ATCGTAGTTA TCTACACGAC GGGGAGTCÄG GCAACTATGG ATGAACGAAA 1020 TAGACAGATC GCXGAGAXAG GTGCCTCACT GATTAAGCAT TGGTAACTGT CACACCAAGT 1080 TXACTCATAX ATACTTTAGA XTGATTTAAA ÄCTXCATTTT TAATTTAAAA GGATCTAGGT " 1140 GAAGATCCXT TTTGAT&AXC TC&XGACCAA AATCCCXXAA CGTGAGTTXX CGTXCCACTG 1200 AGCGTCAGAC CCCGTAGAAA AGATCAAAGG ATCTTCTTGA GATCCTTXTT TTCTGCCCGX 12£0 ÄAXCTGCXGC TTGCAAACAA AAAAAdCACC GCXACCÄGCG GTGGTTTGTT TGCCGGÄTCA 1320 AGAGCTACCA ACTCTTTXTC CGAAGGTAAC TGGCTTCAGC AGAGCGCAGA TACCAAATAC 1380 TGTCCTTCTA GXGTÄGGGGT AGXTAGGCCA CCACXTCAAG AACTCTGXAG CACCGCCTAC 1440 ATACCTCGCT CTGCXAAXCC TGXTACCAGT GGCXGCTGCC AGXGGCGATA AGXCGXGXCT 1500 XACCGGGTXG GACXCAAGAC GATAGTTACC GGAXÄAGGCG CAGCGGTGGG GCXGAACGGG 1560 GGGTXCGXGC ACACAGCCCA GCXXGGAGCG AÄCGACCXAC ACCGAACXGA GAXACCTACA 1620 GCGXGAGCAX TGAGAAAGCG CCACGCTTCC CGAAGGGAGA AAGGCGGACA GGIAXCCGGX '.16.80 AAGCGGCAGG GTCGGAACAG GAGAGCGCAC GAGGGAGCTX CCAGGGGGAA ACGCCTGGTA 1740 XCXTXAXAGX CCTGTCGGGT TTCGCCACCX CXGAOTXGAG CGTCGATXXT XGTGAXGCXC 1800 GTCAGGGGGG CSGAGCCTAX GGÄAAAACGC CAGCAACGCG GCCXXTXXAO GGIXCCXGGC I860 CTTTIGCXGG CCXTXTGCXC ÄCAXGXXCXT XCCTGCGXXA TCCCCXGATT CTGTGGAXAA 1920 CCGXATXACC GCCTXXGAGT GAGCXGAXAC CGCXCGCCGC AGCCGAACGÄ CCGAGCGCAG 1980 CGAGXCAGTG AGCGAGGAAG CGGAAGAGCG CCXGAXGCGG IAXTXXCTCC XXACGCAXCT 2040 GTGCGGXATf TCACACCGCA TAXATGGXGC ACTCXCAGXA CAAXCTGCTC TGATGCCGCA 2100 XAGXXAAGCe AGIAXACACT CCGCXAXCGC IACGXGACTG GGTCAIGGCX GCGCCCCGAC 2150 ACGCGCCAAC ACCCGCTGAC GCGeGGTGAC GGGCTXGTCT GCXCCCGCCA XCCGCTTACA 2220 GÄCAAGCXGX GACCGTCTCC GGGAGGXGCA XGXGTCAGAG GXXXXCACCG XCAXCACCGA 2280 AACGCGCGAG GCÄGSXGCGG IAAAGCXCAT CAGCGTGGTC GTGAAGCGAX ICACAGATGT 2340 CTGCCTGIXC ATCCGCGTCC AGCXCGXXGA GXXXCXCCAG AAGCGTXAAT GXCXGGCXXC 2400 88 TGAXAAAGCG GGCCATGTTA AGGGCGGTTT TTTCCTGTTT GGTCACTTGA TGCCTCCGTG 2460 TAAGGGGGAA TTTCTGTTCA TGGGGGTAAT GATACCGATG AAÄCGAGAGA GGATGCTCAC 2520 GATACGGGTT ACTGATGATG AACÄTGCCCG GTTACTGGAA CGTTGTGAGG GTAAACAACT 2580 GGCGGXATGG ATGCGGGGGG ÄCCAGAGAAA AATCACTCAG GGTCAATGCC AGCGCTTCGT 2640 TAATACAGAT GXAGGXGTXC CACAGGGTAG CCAGCÄGCAT CCTGCGATGC AGATCCGGAA 2700 CATAATGGTG CAGGGCGCXG ACTTCCGCGT TTCCAGACTT TACGAAACAC GGAAACCGAA 2760 GACCÄTXCAX GTTGTTGCTC AGGTCCCAGA CGTTTTGCAG CAGCAGTCGC TTCACGTTCG 2820 CTCG03TATC GGTGATXCAT TCTGCTAACC AGTAAGGCAA CCCCGCCAGC CXAGCCGGGT -2880 CCXCÄÄCGAC AGGÄGCÄCGA TCATGCGCAC CCGTGGCCAG GÄCCCAACGC TGCCCGAGAX 2940 GCGCCGCGTG CGGCTGCTGG AGATGGCGGA CGCGATGGAT ATGTTCTGCC AAGGGTTGGT 3000 TTGCGCATTC ACAGXXCXCC GCAAGAATTG ÄTTGOCXCCA ATTCXTGGAG TGGXGÄATCG 3060 GXXAGCGAGG TGCCGCCGGC XTCCAXXCÄG GTCGAGGTGG CCCGGCTCCA TGCACCGCGA 3120 CGCAACSCGG GGAGGCAGAC AAGGTATAGG GCGGCGCCTA CAÄTCCATGC GAACCCGTTC 3180 CAXGTGCTCG CCGAGGCGGC AXAAATCGCC GTGACGATCA GCGGTCCAGT GATCGAAGTT 3240 AGGCTGGXAA GAGCCGCGAG CGATCCTTGA AGCTGTCCCT GATGGTCGTC ATCTACCTGC 3300 CTGGACAGCA TGGCCTGCAA CGCGGGCATC CCGATGCCGC CGGAAGCGAG AAGAATCATA 3360 ATGGGGAAGG CCATCCAGCC TCGCGTCGCG AACGCCAGCA AGACGTAGCC CAGCGCGTCG 3420 GCCGCGATGC CGGCGATAAT GGCCTGCTTC TCGCCGAAAC GTTTGGTGGC GGGACCAGTG 3480 ÄCGÄAGGCTT CAGCGAGGGC GTGCAAGATT CCGAATACCG CAAGCGACAG GCCGAXCAXC 3540 GTCGCGCXCC AGCGAAAGCG GTCCXCGCCG AAAATGACCC AGAGCGCXGC CGGGACCXGT 3600 CCXACGÄGTT GCAXGATAAA GAAGACAGTC AXAAGTGCGG CGACGATAGT CATGCCCCGC 3660 GCCCACCGGA A6GAGGXGAC TGGGTTGAAG GCXCTCAÄGG GCAXCGGXCG ACGCTCTCCC 3720 TXAXGCGACT CGTGGATTAG GAAGCAGCCC AGTAGTAGGT XGAGGGGGTT GAGCACCGCC 3780 GCCGCAAGGA AXGGTGCAXG CAAGGAGÄTG GCGCCCAACA GTCCCCCGGC CACGGGGCCT 3840 GCCACCATAC CCACGCCGAA ACÄAGCGCTC ATGAGCCCGA ÄGTGGCGAGC CCGATCTTCC 3900 CCATCGGXGA TGTCGGCGAX ATAGGCGGCA GCAACCGCAC CTGTGGCGCC GGIGAIGGCG 3960 GCGACGKTGC GTCCGGCGTA GAGGAXCGAG ATCTCGATCC CGCGAAATTA ATACGACTCA 4020 CTATAGGGAG ÄCCACAACGG XXtCGCXCXA GAAATAAXTT TGTTTAACTT TAAGAACGAG 4080 $ : 89 ATATACATAT GGAACCGGTC GÄCCCGCGTC TGGAACCAT6 GAAACACCCC GGGTCCCAGC 4140 CGAAAACCGC GTGCACCAAC TGCTACTGCA AAAAATGCTG CTTCCACTGC CAGGTTTGCT 4200 TCATCACCAA AGCCCTAGGT ATCTCTTACG GCCGTAÄAAA ACGTCGTCAG CGACGTCGTC 4260 CGCCGCAGGG ÄTCCCAGÄCC CACCAGGTTT CTCTGTCGGG CCCGGCGGAC AGCGGCGÄCG 4320 CCCTGCTGGA GCGCAACTAT CCCACTGGCG CGGAGTTCCT CGGCGACGGC GGCGACGTGA 438.0 GCTTCAGCAC CCGCGGCACG CAGAACTGGA CGGTGGAGCG GCTGCTCCAG GCGCACCGCC 4440 AACTGGAGGK GCGCGGCTAT GTGTTCGTCG GCTACCACGG CACCTTCCTC GAAGCGGCGC 4500 AAAGCATCGT CTTCGGCGGG GTGCGCGCGC GCAGCCAGGA CCTCGACGCG ATCTGGCGCG 4560 GTXTCTATAT CGCCGGCGAT CCGGCGCTGG CCTACGGCTA CGCCCAGGAC CAGGAACCCG 4620 ACGCACGCGG GCGGATCCGC AACGGTGCCC TGCTGCGGGT CTATGTGCCG CGCTCGAGCC 4680 TGCCGGGCTT CTACCGCACC AGCCTGACCC TGGCCGCGCC GGAGGCGGCG GGCGAGGTCG 4740 AACGGCTGAT CGGCCÄTCCG CTGCCGCTGC GCCTGGACGC CAXCACCGGC CCCGäGGAGG 4800 AAGGCGGGCG CCTGGAGACC ATTCTCGGCT GGCCGCTGGC CGAGGGCACC GTGGTGATTC 4860 CCTCGGCGAT CCCCACCGAC CCGCGCAACG TCGGCGGCGA CCTCGACGCG TCCAGCATCC 4920 CCGACAAGGA ÄCAGGCGATC AGCGCCCTGC CGGACTACGC CAGCCAGCCC GGCAAACCGC 4980 CGCGCGKGGA CCTGÄAGTAA CTGCCGCGAC CGGCCGGCTC CCTTCGCAGG AGGCGGCCTT " 5040 CTCGGGGCCT GGCCATACAT CAGGTTTTCC TGATGCCÄGC CCÄÄTCGAAT ÄTGAATTC 5098 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO;11: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 4910 base pairs (BJ TYPE:: nucleic acid (C) STRANDEDNESS; double (B)· TOPOLOGY: circular (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic); (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: ESQ ID NO:lit TTGAAGACGA AAGGGCCTCG TGATACGCCT ATTTTTATAG GTTAATGTCA TGATAATÄAT 60 GGTTTCTTAG ACGTCAGGTG GCACTTTTCG GGGAÄÄTGTG CGCGGAACCC CTATTTGTTT 120 ATTTTTCTAA ATACATTCAA:ATATGTATCC GCTCATGAGA CAATAACCCT GÄTAAATGCT 180 TCÄÄTAATAT TGAAÄAAGGA AGAGTATGAC TATTCAACAT TTCCGTGTCG CCCTTATTCC 240 90 CTTTTTTGCG GCATTTTGCC TTCCTGTTTT TGCTCACCCA GÄAACGCTGG TGAAAGTAAA 300 AGATGCTGAA GAXCAGTXGG GTGCACGAGT GGGTTACATC GAACTGGATC TCAACÄGCGG 360 TAAGATCCTT GAGAGTTTTC GCCCCGAAGÄ ACGTTTTCCA ATGATGAGCA CTTTTAAAGT 420 TCXGCTÄTGT GGCGCGGTAX TATCCCGTGT TGACGGCGGG CAAGAGCAAC TCGGXCGCCG 480 CATACACTAT TCTCAGAATG ACXTGGTXGA GXACTDACCA GTCACAGAAA ACCATCTTAC 540 GGATGGCAXG ACAGTAAGAG AÄXTAXGDAG TGCX6CCATA ACCATGAGTG ATAACACXGC 600 GGCCAÄCXTA CXXCTGACAA CGAXCGGAGG ACCGAAGGAG CTAACCGCXX TTXTGCACAA 660 CATGGGCGAT CATGTAACXC GCCTTGATCG TXGGGAACCG GAGCXGAAXG AAGCCAXÄCC 720 AAACGÄCGAG CGTGACACCA CGÄXGCCTGC AGCAATGGCA ACAACGTTGC GCAAACTATT 780 AACTGGCGAA CTAGXTACTC TAGCTXCCCG GCAKGAATTA ATAGACTGGA TGGAGGCGGA 840 TAAAGXTGCA GGACCACXTC XGCGCXCGGC CCTTCCGGCT GGCTGGTTTA TTGCXGATAA 900 ATCXGGAGCC GGTGAGCGXG GGTCTCGCGG TATCATTGCA GCACTGGGGC CAGATGGTAA 960 GCCCXCCCGT ATCGTAGTTA TCTACACGAC GGGGAGTCAG GCAACTATGG ATGAACGAAA 1020 TAGACAGÄTC GCTGAGATAG GTGCCTCACT GATTAAGCAX TGGXAACTGT CAGACCAAGT 1080 TXACTDATAT ATACTXTAGA TTGÄTTTAAA ACTTCAXTTT TAAXTTAAAA GGATCTAGGT 1140 GAÄGAXCCtT TTTGAXAATC TCATGÄCCÄÄ AÄTCCCTTAA CGTGAGTTTT CGTTCCACTG *1200 AGCÖXCAGÄC CCCGTAGAAA AGATCAAAGG ATCXTCTXGA GATCCXXTXT TXCTGCGGGT 1260 ÄATCTGCTGC TTGCAAACAA AAAAÄCCAGC GCTACCAGCG GTGGTTTGTT TGCCGGATCA 1320 AGAGCTACCA ACTCTTTTTC CGAAGGXAAC TGGCXXCÄGC AGAGCGCAGA TACCAAATAC 1380 XGTCCTTCTA GTGTAGCCGT AGTTAGGCCA CCACTTCAAG AACXCTGTAG CACCGCCXAC 1440 ATACCXCGCT CTGCXAATCC TGTTACCAGT GGCTGeXGCC AGTGGCGATA AGTCGTGXCT 1500
TACCGGGTTG GACTCAAGAC GATAGTXACC GGATAAGGCG CAGCGGTCGG GCTGAACGGG 156Q
GGGTTCGTGC ACACAGCCCA GCTTGGäGCG AACGACCTAC ACCGAACTGA GATACCTACA 1620 GCGXGAGCAT TGAGAAAGCG CCACGCTXCC CGAAGGGACA ÄAGGCGGÄCA GGXATCCGGT 1680 AAGCGGCAGG GTCGGAÄCAG GAGAGCGCAC GAGGGAGCTT CCAGGGGGAA ACGCCXGGTA 1740 TCTTXATÄGX CCTGTCGGGT XXCGCCACCT CTGACTTGAG CGTCGArrXT TGXGATGCTC 1800 GTCAGGGGGG CGGAGCCTAT GGÄAAAACGC CAGCÄACGCG GCCTTXTTAC GGTTCCTGGC 1860
CmTGCTGG CCTTTTGCTC ACATGTTCTT TCCTGCGTXA TCCGCTGATT CXGTGGATAA 1920 1 | 31 CCGTAXTACC GCCTTTGAGX GÄGCTGATAC CGCTCGCCGC AGCCGAACGA CCGAGCGCAG 19B0 CGAGTCAGTG ÄGCGAGGAAG CGGAAGAGCG CCTGÄ.TGCGG TAXXTTCTCC TTACGCATCT 2040 GTGCGGTATT TCÄCACCGCA TATATGGTGC ACTCTCAGTA CAATCTGCTC TGÄTGCCGCÄ 2100 XACTXAÄGCC AGTATACACT CCGCTATCGC TACGXGACXG GGTCATGGCT GCGCCCCGAC 2160 ACCCGCCAAC ÄCCCGCXGAC GCGCCCTGÄC GGGCXXGXCT GCTCCCGGCA XCCGCTXAGA 2220 GACAAGCTGT GACCGTCTCC GGGAGCTGCA TGTGXCAGAG GXXXXCACCG XCAXCACCGA 22S0 AACGCGCGAG GCAGCTGCGG TAAAGCTCÄT CAGCGXGGTC GTGÄAGCGAX TCACAGATGT 2340 CTGCCTGTXC AXCCGCGXCC AGCTCGTXGA GTTTCTCCÄG AAGCGTXAAX GTCTGGCTTC 2400 IGAXÄAAGCG GGCCAXGTXA AGGGCGGXXX TXXCCXGXXX GGXCÄCXTGA TGGCXCCGXG 2460 TAÄGGGGGAA XIXCIGXXCA TGGGGGXAÄX GATÄCCGAXG AAACGAGAGA GGAXGCXCAC 2520 GAXÄCGGGTX ÄCXGATGATG AACAXGCCCG GTXACXGGÄA CGXXGTGAGG GXAAACÄAÖX 2580 GGCGGTAXGG ATGCGGCGGG ACCAGAGÄAA AAXCACTCAG GGXCAÄTGCC AGCGCXTCGX 2640 TAATACAGAT GIAGGXGXXC cacagggxag CCAGCAGCAT CCXGCGAXGC AGAICCGGAA 2700 CAXAAXGGTG CAGGGCGCTG ACXXCCGCGT XTCCAGACTT XACGäAACAC GGAAACCGAA 2760 GACCAXXCAT GXTGXTGCXC AGGTGGCAGA CGTTTTGCAG CAGGAGTCGC XXCACGXTCG 282.0 CTCGCGXATC GGXGÄTXCAT TCXGCXAACC: AGTAAGGCAK CCCCGGGAGC CXAGCCGGGT ' 2880 CCXCAACGAC AEGAGCACGA TCAXGCGCÄC CCGXGGGCAG GACCCAACGC TGCCCGAGAT 2940 GCGCCGCGXG CGGCXGCXGG ftGATGGCGGA CGCGÄXGGAT: AXGXTCXGCG AÄGGGXXGGX 3000 TXGCGCAXXC ACAGTXCXCG GC&AGÄATTG ATTGCCXCCA ATXCXTGGAG XGGXGAATCC 3060 GTTAGCGÄGG IGCCGCCGGC XXCCAXXCAG GTCGAGGTGG CCCGGCTCCA TGCACCGCGA 3120 CGCAACGCGG GGAGGCAGAC AAGGXAXAGG GCGGCGCCTA CAAXCCATGC CAACCCGXTC 31B0 GAXGXGCXCG CCGAGGCGGC AIAAÄTCGCC GTGACGAXCA GCGGTCCAGT GAXCGAAGXX 324,0 aggctggxaa gagccgcgag CGATCCTXGA AGCTGTCCCT GÄTGGXCGXG ATCTACCTGC 3300 CXGGACAGCA TGGCCTGCAA CGCGGGCAXC CCGAXGCCGC CGGAAGGGAG AAGAATCATA 3360 ATGGGGAAGG CCATCCAGCC TCGCGTCGCG AACGCCAGCA AGACGTAGCC CAGCGCGTCG 3420 GCCGCCATGC CGGCGATAAX GGCCTGCXXC TCGGCGAAAC GTTTGGXGGG, GGGACCAGTG 348:0 ACGAAGGCXX1 GAGCGAGGGC GTGCAftGATT CCGAATACCG CAAGCGKCAG GCCGAXCATC 3540 GXCGCGCTCC ÄGCGAAAGCG GTCCTCGCCG AAAATGACCC AGÄGGGCTGG CGGCÄCGXGT 3600 \ ! j | 92 CCTACGAGTT GCATGATAAA GAAGACAGTC ATAAGTGCGG CGAGGATAGT CATGCCCCGC 3660 GCCGACCGGA AGGAGCTGAC TGGGTTGAAG GCTCTCÄAGG GCATCGGTCG ACGCTCTCCC 3720 TTATGCGACT CCTGCATTAG GAAGCAGCCC AGTAGTAGGT TGAGGCCGTT GAGCACCGCC 3780 GCCGCAAGGA ATGGTGCATG CAAGGAGATG GCGCCCAACA GTCCCCCGGC CACGGGGcCX 3840 GCCACCATAC CCACGCCGAA ACAAGCGCTC ATGAGCCCGA ÄGTGGCGAGC CCGATCTTCC 3900 CCATCGGTGA TGTCGGCGÄT ATAGGCGCCA GCAACCGCAC CTGTGGCGCC GGTGÄTGCCG 3960 GCCACGATGC GTCCGGCGTA GAGGATCGAG ATCTCGATCC CGCGAAATTA ATACGACTCA 4020 CTÄTAGGGÄG: ÄCCACAACGG TTTCCCTCTA GAAATAATTT TGTTTAACTT·TAAGAAGGAG 4080 ATATATATGG ÄACCGG1CGT TTCTCTGTCG GGCCCGGCGG ÄCAGCGGCGA CGCCCiGCTG 4140 GÄGCGCAACT ATCCCACTGG CGCGGAGTTC CTCGGCGACG GCGGCGACGT CAGCTTCAGC 4200 ACCCGCGGCA CGCAG&ACTG GACGGTGGAG CGGCTGCTCC AGGCGCACCG CCAACTGGAG 4260 GAGCGCGGCT ATGTGTTCGT CGGCTACCAC GGCACCTTCC TCGAAGCGGC GCAAAGCATC 4320 GTCTTCGGCG GGGTGCGCGC GCGCAGCCAG GACCTCGACG CGATCTGGCG CGGTTTCTAT 4380 ÄTCGCCGGCG ATCCGGCGCT CGCCTACGGC TACGCCCAGG ACCÄGGAACC CGACGCÄCGC 4440 GGCCGGATCC GCAACGGTGC CCTGCTGCGG GTCTATGTGC CGCGCTCGAG CCTGCCGGGC 4500 TTCTACCGCA CCAGCCTGAC CCTGGCCGCG CCGGAGGCGG CGGGCGAGGT CGAACGGCTG * 4560 ATCGGCCÄTC CGCTGCCGCT GCGCCTGGAC GCCATCACCG GCCCCGAGGA GGAAGGCGGG 4620 CGCCTGGAGA CCATTCTCGG CTGGCCGCTG GCCGAGCGCA CCGTGGTGÄT TCCCTCGGCG 4680 ATCCCCACCG ACCCGCGCAA CGTCGGCGGC GACCTCGACC CGTCCAGCAT CCCCGACAAG 4740 GAACAGGCGÄ TCAGCGCCCT GCCGGACTAC GCCAGCCAGC CCGGCAAACC GCCOCGCGAG 4800 GACCTGAAGT AACTGCCGCG ACCGGCCGGC TCCCTTCGCA GGAGCCGGCC TTCTCGGGGC 4860 CTGGCCATAC ATCAGGTTTT CCTGATGCCA GCCCAATCGA ATATGAÄTTC 4910 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12: {i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 29 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANOEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) § 93 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12: TATGGAÄCCG GTCGTTTCTC TGTCGGGCC 29 (2} INFORMATION FOR SEQ ID NO:13: fi) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 23 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear <ii) MOLECULE TYPE: DNA {genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:13: CGACAGAGAA ACGACCGGTT CCA - 23 (,2} INFORMATION FOR SEQ ID NO: 14: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH; 4977 base pairs (fi) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double (D) topology: circular (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:14: TTCTTGÄAGA CGAAAGGGCC TCGTGATACG CCTATTTTTA TAGGTTAATG TCATGATAAT 60 AATGGTTTCT TAGACGTCAG GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG 120 TTTATTTTTC TAAATACATT CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAKC CCTGATAAAT X80 GCTTCAATAA TATTGAAAAA GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT 240 TCCCTTTtTT GCGGCATTTT GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT 3Ö0 AÄAAGÄTGCT GAAGATCAGT TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG 360 CGGTAAGATC CTTSAGÄGTT TTCGCCCCGA AGÄACGTTTT CCAÄTGATGA GC&CTTTTAA 420 AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG TATTATCCCG TGTTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTOG 480 CCGCATACAC TATTCTCAGA ÄTGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AÄÄAGCATCT 540 TÄCGGATGGC ATGACAGTAA GÄGAATTÄTG CAGTGCTGGC ATAACCATGA GTGATAACAC 600 TGCGGCCAAC TTACTTCTGA CÄÄCGATCGG ÄGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA 660 § 94 C&AcATGGGG GATCKTGTAA CTCGCCTTGA TCGTXGGGAÄ CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT 720 ÄCCAAACGÄC GAGCGTGACA CCACGATGCG TGCAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT 780 ATTAACXGGC GAACTACTTA CTCTAGCTTC CCGGGAACAA TTAATAGACT GjGATOG&GGC B'4.0 GGATARRGXT GCAGGACGÄG XXCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT XTATTGCTGA 900 TAAATCTGGA GCCGGTGAGC GTGGGTCTCG CGGTATCATX GCAGCACXGG GGCCAGAXGG 960 TAAGCCCTCC CGTATCGTAG TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACXA TGGATGAACG 1020 AAATAGACAG ÄTCGCTGAGA TAGGTGGCTC ACTGATTAAG CATTGCTAAC TGTCAGACCA ’ 1080 AGXXTACTCA TAXAXACTTT AGATXGATTX AAAACTTCAT TTXTAAXTTA AAAGGATCTA 1140 GGXGAAGATC CTTXTTGATA ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTGCA 1200 CTGAGCGTCA GACCCCGTAG AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGÄGATCCTT TTTTTCTGOS 1260 CGTAATCTGC XGCXXGCAAA CAÄAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA 1320 TCAAGAGCXA CCAACTCTTT TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA 1380 XACTGXCCTT CTAGTGTAGC CGTAGTTAGG CCAGCACXXC AAGAACTCTG XAGCACCGCC 1440 TACATACCTC GCTCTGCXAA TCCTGTXACC AGXGGCXGCX OCCAGXGGCG AXÄAGTCGXG 1500 TCXTACCGGG TTGGACTCAA GÄCGATAGTT ACCGGAXAAG GCGCAGCGGT CGGGCXGAAC 1560 GGGGGGTTCG TGCACACAGC CCAGCTXGGA GCGAACGACC TACACCGAAC XGAGAXACCX 1620 ACAGCGXGAG CÄTXGAGAAA GCGCCACGGT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTAXCC 1680 GGXÄÄGCGGC ÄGGGXGGGAA CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTXCCAGGGG GAAACGCCTG 1740 GTATCTTTAT ÄGXCCXGTCG GGTTTCGCCA CCXCXGACTT GAGCGTCGAT XtTTGTGATG 1800 CXCGTCAGGG GGGCGGAGGG TAXGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCXXTX XACGGTTGCX 1860 GGCCXXTXGC TGGCCTTTTG CXCACAXGXX CTXXCCTGCG XXAXCCCCXG AXTGXGTGSA 1920 XÄACCGXÄTX ACCGCCrXTG AGTGAGCTGA XACCGCTCGC CGCAGCCGÄA CGACCGAGCG 1980 CAGCGAGXCA GXGAGCGAGG AAGCGGAAGA GCGCCXGATG eGGIAXXTXC XCCTTACGCA 2040 TCTGTGCGGX ATTTCACACC GCAXATATGG TGCACTCTCA GXACAATCXG CICTGATGGC 2100 GCATAGTXAA GCCÄGXAIAC ACXCCGCXAT CGCTACGXGA CTGGGTCATG GCXGCGCCCC 2160 GACACCCGCC AACACCCGCX GACGCGCCCT GAGGGCCXXG XCTGCXCCCG GGÄXCCGCXX 2220 ACAGACAAGC: XGTGACCGTC XCCGGGAGCT GCATGTGTCA GAGGTXTXCA CCGXCATCAC 2280 CGAAACGCGC GÄGGCAGCTG CGGTAAAGCX CATCASCSTG GXCGXGAAGC GAXXCACAGA 2:340 : j 95 TGTCTG'CCTG TTCATCCGCG TCCAGCXCGI XGAGXXXCXC CAGAAGCGTT AAXGTCTGGC 2400 XTCTGÄTAAA GCGGGCCATG TTAAGGGGGG: TttTTTCCXG TTTGGTCACT TGATGCCTCC 2450 GTGTAAGGGG GftAXTTCTGX TCATGGGGGT AATGAXACCG ATGAAnCGAG AGAGGATGCT 2520 CACGATACGG GTTACTGATG ATGAACATGC CCGGTTACTG GAACGTTGTG AGGGTÄASCA 25B0 RCTGGCGGTA TGGÄTGCGGC GGGACCAGAG AAAAATCACT CAGGGTCAAX GCCAGCGCTT 2640 CGTTAATÄCA GATGTAGGTG TTOCACAGGG TAGCCAGCAG CAXCCTGCGÄ TGCAGATCGG 2700 GAACATAATG GTGCÄGGGCG CTGACTTCCG CGTTXCCAGA CTTTÄCGAAA CACGGÄÄÄCC 2760 GAÄGÄCCÄXT CATGTTGXXG CTCAGGTCGC AGACGXXTTG CAGCAGCAGT CGCTTCACGT 2820 TCGCTCGCGT ÄTCGGTGAXX CA7TCTGCTA ACCAGTAAGG CAACCCCGGC AGCCTAGCCG 2880 GGXCCTCAAC GACAGGAGCA CGATCATGCG CACCCGXGGC CAGGACCCAA CGCTGCCCGA 2940 GATGCGCCGC GTGCGGCTGC TGGAGATGGC GGACGCGATG GAXAXGTTCT GCCAAGGGTT 3000 GGTTXGCGCA TTCACAGTTC XCCGCAAGAA TTGATTGGCT CCAAXTCTTG GAGTGGTGAA 3060 TCCGTTAGCG AGGTGCCGCC GGCTXCCÄTT CAGGTCGAGG TGGCCCGGCT CCÄXGCACCG 3120 CGÄCGCAäCG CGGGGAGGCA GACRAGGTAT AGGGCGGGGG CTACAATCCR XGCCAACCCG 3180 TTCCATGTGC TCGCCGAGGC GGCATAAATC GCCGTGACGA XCAGCGGXCC AGTGAXCGAA 3240 GXXAGGCTGG TAAGAGCCGC GAGCGATCCT TGAAGCTGTC CCTGATGGTC GTCATCXACC '3300 TGCCTGGACA GCATGGCCXG CAACGCGGGC ATCCCGATGC CGCCGGAAGC GAGAAGAATC 3360 ÄTAATGGGGA AGGCCATCCA GCCTCGCGTC GCGAÄGGCCA GCAAGACGTÄ GCCCAGCGCG 3420 TCGGCCGCCA TGCCGGCGAX AATGGCCTGC TTCTCGCCGA AACGXXXGGT GGCGGGACCA 3480 GXGACGAAGG CTTGAQCGAG GGCGTGCAAG AXXCCGAÄTA CCGCAAGCGA CAGGCCGATC 3540 AXCGXCGCGC TCCAGCGAAA GCGGTCCTCG CCGAAAATGA CCCAGAGCGC TGCGGGCACC 3600 TGTCCTACGA GTTGCATGAT AAAGAAGACA GTCATAAGTG CGGCGÄCGAT AGTCATGCCC 3660 CGCGCCCACC GGAAGGAGCT GACTGGGXIG AAGGCXCXCA AGGGCATCGG TCGACGCTCT 3720 CCCXXAXGCG ACTCCTGCAT TAGGAAGCAG CCCAGXAGTA GGXXGAGGCC GTTGAGCACC 3780 GCCGCCGCAA GGAATGGTGC ATGCAAGGAG AXGGCGCCCA ACAGTCCCCC GGCCACGGGG 3840 CCTGCCACCA TÄCCCACGCC GAAACAAGCG CXCAXGAGCC CGAAGTGGCG AGCCCGATCT 3900 TCCGCATGGG TGAXGXCGGC GATAXAGGCG CCAGCAACCG CACCXGTGGC GCGGGTGATG 3960 CCGGCCACGA TGGGTCCGGC GXAGAGGATC GAGAXCTCGA TCCCGCGAAA XTAATACGAC 4020 96 TCACTATAGG GAGACCACAA CGGTTTCCCT CTAGAAATAA TTTTGTTTAA CTTTAAGAAG 4080 GAGATATAGC ATGGTACCAG ACACCGGAAA CCCCTGCCAC ACCACTAAGT TGTTGCACAG 4140 AGACTCAGTG GACAGTGCTC CAATCCTCAC TGCATITAÄC AGCTCACACA AAGGACGGAT 4200 TAACTGTAAT AGTAÄCACTA CACCCATAGT ACATTTAAAÄ GGTGÄTGCTÄ ATACTTTAAA 4250 ATGTTTAAGA TATAGATTTA AÄAAGCATTG TACATTGTAT ACTGCAGTGT CGTCTACATG 4320 GCATTGGACA GGAGÄTAATG TAAAACATAA AAGTGCAATT GTTACACTTA CATATGATAG 4380 TGAATGGCAA CGTGACCAAT TTTTGTCTCA AGTTAAAATA GCAAAAACTA TXACAGTGTC 4440 TACTGGATTT ATGTCTATAT GAGGATCCGG CTGCTAACAA AGCCGGAAAG GAAGCTGAGT 4500 TGGCTGCTGC CACCGCTGAG CAATAACTAG CATAACCCCT TGGGGCCTCT AAACGGGTCT 4560 TGAGGGGTTT TTTGCTGAAA GGAGGAACTA TATCCGGATA TCCÄCÄGGAC GGGTGTGGTC 4620 GCCATGATCG CGTAGTCGAT AGTGGCTCCA AGTAGCGAAG CGAGCAGGAC TGGGCGGCGG 4680 CCAÄAGCGGT CGGACAGTGC TCCGAGBACG GGTGCGCATA GAAATTGCAT CAACGCATAT 4740 AGCGCTKGCA GCAGGCCATA GTGACTGGCG ATGCTGTCGG AATGGACGAT ATCGCGCAÄG 4800 AGGCCCGGCA GTACCGGCAT AACCAAGCCT ATGCCTACAG CATCCAGGGT GACGGTGCCG 4860 AGGATGÄCGA TGAGCGCÄTT GTTAGATTTC ATACACGGTG CCTGACTGCG TTAGCAATTT 4920 AACTGTGATA AACTACCGCA TTAAAGCTTA TCGATGATAA GCTGTCAAAC ATGAGAA '4977 (2) INFORMATION FOR SEQ ID MO:IS: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS; (A) LENGTH: 27 base pairs (8) TYPE; nucleic acid (C) STEANDEDNESS: single (D) TOPOLOGI: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:15: CTCCCATGGT ÄCCAGACACC GGAAACC 27 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:16: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 27 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STPANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 97 (11) MOLECULE TYPE: DNA {genomic} (xl) SEQUENCE DESCRIPTION; SEQ ID NO:16: CGGGGATCCT CATATAGACA TAAATCC 27 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:17: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: {A} LENGTH: 4977 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C} STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: circular (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION:: SEQ ID NO:17:
TTCTTGAAGA CGÄÄAGGGCC TCGTGATACG CCTATTTTTA TAGGTTAATG TCATGATAAT: SO
ÄATGGTTTCT TAGACGTCAG GTGGCACTTT TCGGGGÄAÄT GTGCGCGGAÄ CCCCTATTTG 120
TTTATTTTTC TAAATACATT CAAATATGTA TCCGCTCATG AGÄCAATAAC CCTGÄTÄÄÄT ISO
GCTTCAATAA TATTGAAAAA GGAAGAGTAT GÄGTATTCAÄ CATTTCCGTG TCGCCCTTÄT 240 TCCCTTTTTT GCGGCATTTT GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT ' 300 ÄAAAGKTGCT GAAGATCAGT TGGGTGCACG AGTGGGTTÄC ATCGAACTGG ATCTCAACAG 360 CGGTAAGATC CTTGAGAGTT TTCGCCCCGÄ RGAACGTTIT CCAATGATGA GCACTTTTAA 420 AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG TATTATCCCG TGTTGACGCC GGGCAKGAGC AACTCGGTCG 480 CCGCATACAC TATTCTCAGA ATGACTTGGX TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT S40 TACGGATGGC ATGACAGTAA GAGAATTÄTG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATÄftCAC 600 TGCGGCCAAC TTACTTCTGA CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA 660 CAACATGGGG GATCÄXGTAA CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGÄ ATGAAGCCAT 720 ACCAAACGAC GAGCGTGACA CCACGATGCC TGCAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT 730 ATTAACTGGC GAACTACTTA CICTAGCTTC CCGGCAACAA TTÄATAGACT GGATGGAGGC B40 GGATAAAGTT GCAGGACCAC TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGGTGGT TTATTGCTGA 900 TAAATCTOGA GCCGGTGÄGC GTGGGTCTCG GGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG 960 TAAGCCCTCC CGTATCGTAG TTATCTACAC GACGGGGAGT CÄGGCAACTA TGGATGAACG 1020 98 AAATAGACAG AXCGCTGAGÄ 7AGGTGCCXC ACXGAXTAAG CATTGGTAAe TCTCAGACCA 1080 AGXXTACTCA TATATACXXX AGÄTTGAXTT AAÄACTTCAT XTTTAAXTTA AAAGGATCTA 1140 GGTGAAGAXC CTTXXXGAXA ATCTCATGAC CAAAATCCCX TAACGTGAGT TTTCGTTCCA 1200 CXGRGCGXCA GACCCCGTAG AAAAGATGAA AGGATCTTCT XGAGATCCXT XXXXTCTGGG 1260 CGXAAICXGC TGCTTGCAAA CAAAAAAACC ACCGCXACCA GCGGXCGTXX GTXXGCCGGA 1320 TGAAGAGCTA CCAACTCTTI XXCCGAAGGT AAGXGGCXXC AGCAGAGCGC AGATACCAAA 1380 TACXGTCGXX CTAGXGXAGC CGXAGTTAGG CCACCACXXC AAGAACTCTG XAGCACCGCC ' 1440 TACATACCTC GCTCTGCTAA TCCTGXXACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGXG 1500 TCTTACCGGG XXGGACXCAA GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC 1560 GGGGGGTTCG XGCACACAGC CCAGGTTGGA GCGAACGAGC TACACCGAAC TGAGATACCT 1620 ACAGCGTGÄG GATXGAGAAA GCGCCAGGOX TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTAXCC 1680 GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA CAGGAGAGCG CACGäGGGAG CTXCCAGGGG GAAACGCCTG 1740 GTATCXTTAT A5TCCTGTCG GGTTTCGCCA CCXCTGACTX GAGCGTCGAX TTTXGTGATG 1800 CTCGTCAGGG gggcggagcc taxggaaaaa CGCCAGCAAC GCGGCCTXXX XAGGGXTCCT 1860 GGCCTTXTGC XGGCCXTXTG CXCACATGXT CTTTCCXGCG TTAXCCCCXG AXTCXGTGGA 1920 XAÄCCGTATT ACCGGCTTXG AGXGAGCXGA TACCGCXCGC GGCAGGGGAA CGACCGAGCG 1980 CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG AAGCGGAAGA GCGCCTGATG CGGTÄXXXTC TCCXTACGCA 2040 TCTGTGGGGT ATTTCACACC GCATATATGG TGCACTCTCA GTACAATCTG CTCTGÄXGCC 2100 GCATAGXTAA GCCAGTAXÄC ACXCCGCTAT CGCXACGXGA CTGGGTCÄXG GCTGGGCGCC 2160 GACACCCGCC AACAGCCGGX GACGOGCCCT GACGGGCXXG TCTGCTCCCG GCAXGCGCXX 2220 ACAGAGAAGC XGTGACCGXC TCCGGGAGCT GCAXGXGXCA GAGGXTTXCA CCGXCATCAC 2280 CGAAACGCGC GAGGCAGCTG CGGTAAAGCT CÄTCAGCGTG GTCGTGAÄGC GATTCACAGA 2340
:S
TGTCTGCCTG XTCATCCGCG TCCAGCTCGT TGÄGTTTCTC CÄGAAGCGXT AATGTCXGGC 2400 · j XXCXGATAAA GCGGGCGATG TTAAGGGCGG TTTTTXCCXG TXTGGXCACT TGATGGCXCC 2400 | GTGTAAGGGG GAÄXTTCXGX TCATGGGGGT AAXGRXACCG AXGAAACGAG AGAGGAXGCT 2520 | % CACGATACGG GTTACTGAXG ATGAKCAXGC CCGGXTACTG GAACGXTGTG AGGGTAAACA 2580 ] ::j ACXGGCGGIA XGGAXGCGGC GGGACCAGAG AAAAAXCACX CAGGGXCAAT GCGAGCGCXT 2640 j j CGTTAATÄCA GÄTGTÄGGXG TTCCÄCÄGGG TÄGGCÄGCAG CÄTCCXGCGA XGCAGAXCCG 2700 j j 99 GAACAXAATG GTGCAGGGCO CTGACTTCCG CGTTTCCAGA CXTXACGAAA CACGGAAACC 2760 GAAGACCATX CATGTIGTTG CXCAGGTCGC AGACGTTTTG CAGCAGCAGX CGCTTCACGT 2820 TCGCTCGCGT AXCGGTGATT GATTCTGCTA &CC&GTAAGG GAACCCCGCC AGCCTAGCCG 2880 GC-TCCTCAAC GACAGGAGCA CGATCATGCG CACGCGTGGC CAGGÄGCCAA CGCTGCCCGA 2940 GATGCGCCGC GTGCGGCTGC TGGAGATGGC GGACGCGATG GATATGTTCT GCCAAGGGTX 3QQÖ GGTTTGCGCA TTCÄCAGTTC TCCGCAAGAA TTGATTGGCT CGAATTCTTG GAGTGGTGAA 3060 TCCGTXAGCG AGGTGCCGCC GGCTTCGATT CAGGTCGAGG TGGCCCGGCT CCATGCACCG 3120 CGÄCGCAÄCG CGGGGAGGCA GACÄAGGTAT AGGGCGGCGC CTACAATCCA TGCCAACCCG 3180 XXCCATGTGC TCGCCGAGSG GGCATAAATC GCCG7GACGA TCAGCGGTCC AGTGATCGAA 3240 GTTAGGCTGG TAAGAGCCGC GAGCGATCCT TGAAGCTGTC CCXGAIGGXC GTCATCTACC '3300 7GCCTGGACA GCATGGCCTG CfiACGCGGGC ATCCCGATGC CGCCGGAAGC GAGAKGAATC 3360 ATAATGGGGA AGGCCATCCA GCCTCGCGTC GCGAACGCCA GCAASACGXA GCCCAGCGCG 3420 TCGGCCGCCA TGCCGGCGAT AATGGCCTGC TTCTCGCCGA AACGTTTGGT GGCGGGACCA 3480 GTGACGAAGG CXTGAGCGAG GGCGTGCAAG ATTCCGAATA CCGCAAGCGA CAGGCCGATC 3540 ATCGXCGCGC TCCAGCGAAA GCGGTCCTCG CCGAAAATGA CCCAGAGGGG TGCCGGCACC 3600 TGXCCTACGA GTTGCATGAT AAAGAAGACA CTCÄTÄÄGTG CGGCGACGAT AGTCATGCCC ' 3660: CGCGCCCACC GGAÄGGAGCT GACTGGGTTG AAGGCTCTCA AGGGCATCGG TCGACGCTCT 3720 CCCTTATGCG ACTCCTGCAX TAGGAAGCAG CCCAGTAGTA GGXTGAGGCC GTTGAGCACC 3780 GGCGCCGCAA GGAATGGTGC AXGCAAGGAG &XGGCGCCCA ACAGTCCCCC GGCCACGGGG 3840 CCTGCCACCA TACCCACGCC GAAACAAGCG CTCATGAGCC CGAAGTGGCG AGCCCGATCT 3900 TCCCCATCGG TGATGTCGGC GÄTÄTAGGCG CCAGCAACCG CACCTGTGGC GCCGGTGATG 3960 CCGGCCACGA TGCGTCCGGC GTAGAGGATC GAGAXCTCGA TCCCGCGAAA TTAATACGAC 4020 TCACTATAGG GAGÄCCACAA CGGTXTCCCT CTAGAAATAA TTTTGXTTAA CTXTAAGAAG 4080 GÄGAIAIACC ATGGXACCAG ACACCGGAAA CCCGTGCCAC ACCACXAAGT TGTTGCAGAG 4140 AGÄCTCAGTG GACAGTGCTC CAATCCTCAC TGCATTTAAC AGCTCACACA AAGGACGGAX 4200 XAACTGTAÄT AGTAACACTA CACCCAXAGT ACATXTAAAK GGTGATGCXA ATACTTTAAG 4260 ATCTTTAAGA XATAGAXXTA AAAAGGATTC TACATXGXAT ÄCTGCAGXGT CGTCTACATG 4320 GCATTOGACA GGACATAATG TAAAACAXAA ÄAGXGCAATT GTTACACITA CAXAXGATAG 4380 100 TGAATGGCAÄ CGTGACCAAT TTXTGTCTCA AGTTAAAATA CCAAAAACTA TTACAGTGTC 4440 TACTGGATTT ATGTCTATAT GAGGATCCGG CTGCTAACAA AGCCCGAAÄG GAAGCTGAGT 4500 TGGCTGCTGC CACCGCTGAG CÄATAÄCTAg CÄTAÄCCCCT TGGGGCCTCT AAACGGGTCT 4560 TGAGGGGTTT TTTGCTGAAA GGÄGGAACTÄ TATCCGGATA TCCACAGGAC GGGTGTGGTC 4620 GCCATGATCG CGTAGTCGAT ÄGTGGCTCCA ÄGTÄGCGAAG CGAGCAGGAC TGGGCGGGGG 4680 CCAAAGCGGT CGGACAGTGC TCCGAGAACG GGTGCGCATA GÄAÄTXGCÄT CAACGCATAT 4740 AGCGCTAGCA GCACGCCATA GTGÄCTGGCG ÄTGCTGTCGG AATGGACGAT ATCCCGCAAG 4800 ÄGGCCCGGCA GTACCGGCAT ÄACCAAGCCT ATGCCTACAG CATCCAGGGT GACGGTGCGG 4860 ÄGGATGACGA TGAGCGGATT GTTAGATTTC ATACACGGTG CCTGACTGCG TTAGCAATTT 4920 ÄACTGTGÄTÄ AÄCTAGCGCA TTäAAGCTTÄ TCGÄTGATAA GCTGTCAAAC ATGAGAA 4977 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO-.18: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 59 base pairs {B} TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (0) TOPOLOGY! linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:IB: CGACACTGCA GTATACAATG TÄGAATGCTT TTTAAATCTA TATCTTAAAG ATCTTAÄAG 59 (2} INFORMATION FOR SEQ ID NO:19: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 26 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION; SEQ ID Ν0:Ϊ9ί GCGTCGGCCG CCATGCCGGC GÄTAAT 26 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:20: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICSf i 1Ö1 (A) LENGTH: 4019 base pairs (8) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: circular <ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:20: TTCTTGÄAGÄ CGAAAGGGCC TCGTGATACG CCTATTTTTA TAGGTTAATG TCATGATAAT 60 AATGGXTTCT TAGACGTCAG GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG 120
TTTATTTTTe TAAÄTACATT CÄAATÄTGTA TCCGCTCATG AGÄCAATAAC CCTGATAAAT ISO
CCTTCAATAA TATTGAAAAA GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT 240 TCCCTTTTTT GCGGCATTTT GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT 300 AAAAGATGCT GAAGÄTCÄGT TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG 360 CGGTAAGATC CTTGAGAGTT TTCGCCCCGA ÄGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA 420 ÄGTTCTGCTA TGTGGCGCGG TATTATCCCG TGTTGACGCC GGGCAACAGC ÄÄCTCGGTCG 400 CCGCATACAC TATTCXCAGA ATGACTTGGT TGÄGTÄCTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT 540 TACGGATGGC ATGACAGTAA GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACC&TGA GTGATAACAC 600
TGCGGCCAAC TTACTTCTGÄ CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCÄ * 66Q
CAACATGGGG GATCATGTAÄ CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT 720 AGGAAACGAC GAGCGTGACÄ CCACGATGCC TGCÄGCAAXG GCAACAACGT TGCGCÄÄACT 700 ATXAACTGGC GAACTACTTA CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGÄTGGAGGC 040 GGATAAAGTT GCAGGACCAC TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA 900 TAAATCTGGA GCCGGTGAGC GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG 960 TAÄGCCCTCC CGTATCGTAG TTATCTACAC GACGGGGÄGT CAGGCAACTA TGGATGAACG 1020 AAATAGACAG ATCGCTGAGA TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA 1080 AGTTTACTCA TATATACTXT AGATTGATTT AAAACTTCAT TT'ITAATTTA AAAGGATCTA 1140.
GGTGAAGATC CTTTTTGATA ATCTCÄTGÄC CAAAATCCCT TAACGTGÄGT TTTCGTTCCA 1200 CTGAGCGTCA GACCCCGTAG AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTcTGCG 1260 CGT&ATCTGC TGGTTGCAAA CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA 1320 TCAAGAGCTA CCAACTCTTT TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA 1380 102 TACTGTCCTT CTAGTCJTAGC CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC 1440 TACAXACCTC GCTCTGCTAA TCCTGTTACC KGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG 1500 TCTTACCGGG TTGGACTCAA GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGC&GCGGT CGGGCTGAÄC 1560 GGGGGGXTCG TGCAGACAGC CCAGCTTGGA GCGÄACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT 1620 ACAGCGTGAG CATTGAGAAA GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGÄÄÄGGCGG ACAGGTATCC 1680 GGTAAGCGGC AGGGTGGGAA CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG 1240 GTATCTTTAT AGTCCTGTCG GGTTTCGCCA CCXCXGACXX GAGCGTCGAT TTTTGTGATG ' 1B00 CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT 1860 GGCCXXXXGC XGGCCTXXXG CTCACATGTX CXTXCCXGCG XTAXCCCCXG AXTCXGXGGA 1920 TAACCGIATT ACCGCCTTTG AGXGAGGTGA TÄCCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG 1980 CAGCGAGXCA GIGAGCGAGG AAGCGGÄAGA GCGCCXGATG CGGXAXXTTC TCCXTACGCA 2040 XCTGIGCGGX AXXXCACACC GCAXATATGG TGCACTCTCA GTACAAXCTG CTCTGATGCC 2100 GCATAGXXAA GCCAGTATAC ACTCCGCTAX CGCTAGGXGA CXGGGTGATG GCTGCGCCCC 2160 GACACCCGCC AACACCCGCT GACGCGCCCX GACGGGCTXG XGXGGXCCCG GCAXCCGCTT 2220 ACAGACAAGC XGIGÄCCGXC TCCGGGAGCX GCAXGTGTCÄ GÄGGTXXXGÄ CCGTCAICAC 2280 CGAAACGCGC GAGGCAGCTG CGGTAAAGCX CAXCAGCGTG GTCGTGAAGC GATTCACAGA '2340 TGTCTGCCTG TTCATCCGCG TGCÄGCTCGT XGAGXTXGXC CAGAAGCGXX AATGXCXGGC 2400 XXCTGAXAAA GCGGGCCATG XXAAGGGCGG TXTXTTCCTG XXXGGXCACX XGATGCCXGC 2460 GXGTÄAGGGG GAAXXXCTGT TCATGGGGGT AAXGATACCG AXGAAÄCGAG AGAGGAXGCX 2620 CACGATACGG GTTAGTGAXG AXGAACAXGC CCGGXXACXG GAACGXXGXG AGGGXAAäCA 2580 ACXGGCGGTA XGGAXGGGGC GGGACCAGAG AAAAAXCAGT GAGGGXCAAI GCCAGCGCTX 2640 CGXTAATACA GAXGXAGGXG TTCCAGAGGG TAGCCAGCAG CAXCCXGCGA XGCAGÄXGCG 2700 j GAACAXAAXG GXGCAGGGCG CXGACTTCCG CGXXXCCAGA CTTTACGAAA CACGGAAACC 2760 r \ GAAGACCÄTX CAXGTTGXXG CTCAGGTCGC AGACGTXXTG CAGCAGCAGT CGCTXCACGT 2820 |
I
XCGCTCGCGT ÄXCGGIGÄTT CATXCTGCTA ACCAGiAAGG CAACCCCGCC AGCGTAGGCG 2880 j j GGTGCXCAAC GACAGGAGCA CGATCATGCG CACCCGXGGC GAGGAGCCAA CGCTGCCCGA 2940 | GATGCGCCGG GXGCGGCTGC: TGGAGAXGGC GGACGCGAXG GAIATGTXCX GCCAAGGGXT 3000 i GGTTTGCGCA XTCACÄGTTC TCCGCAAGAA XXGAXTGGCT CCAATTCXTG GAGXGGTGAA 3060 1 j i 108 TCCGTTAGCG AGGXGCCGCC GGCTTCCATT CAGGTCGAGG TGGCCCGGCT CCATGCACCG 3120 CGACGCAÄCG CGGGGAGGCft GACAAGGTAT AGGGCGGCGC CTACAATCCA TGCCAACCCG 3180 ' TTCCATSTGC TCGCCGAGGC GGCATAAATC GCGGTGACGA TCAGCGGTCC AG TGAT CG AA 3240 GTTAGGCTGG TAAGAGCCGC GAGCGATCCT TGAAGCTGTC GCTGATGGTC GTCATGTACC 3300 TGCCTGCACÄ GCATGGCCTG CAAGÖCGGGC ATCCCGATGC CGCCGGAAGC GAGAAGAATC 3360 ATAATGGGGA AGGCCATCCA GCCTCGCGTC GCGAACGCCA GCÄAGACGTA GCCCAGCGCG 3420 TCGGCCGCCA TGCCGGCGAT AATGGCCTGC TTCTCGCCGA AACGTTTGGT GGCGGGACCA 3480 GTGAGGAAGG CTTGAGCGAG GGCGTGGRAG ATTCCGAATA CCGCAAGCGA CAGGCCGATC 3540 ATCGTCGCGC TCCAGCGAAA GCGGTCCTCG CCGAÄÄATGA CCCAGAGCGC TGCCGGCACC 3600 TGTCCTACGA GTTGCATGAT AAAGAAGACA GTCATAAGTG CGGCGACGAT ÄGTCATGCCC 3660 CGCGCCCACC GGAAGGAGCT GACTGGGTTG AAGGCTCTCA AGGGCÄTCGG TCGACGCTCT 3720 CCCTTATGCG ACTCCTGCAT TAGGAAGCAG CCCAGTAGTA GGTTGAGGCC GTTGAGCACC 3780 GCCGCCGCAA GGAATGGTGC ATGCAAGGAG ATGGCGCCCA ACAGTCCCCC GGCCACGGGG 3840 CCTGCCACCA TACCCAGGCC GAAAGAAGCG CTCATGAGCC CGAAGTGGCG AGCCCGATCT 3900 XCCCCATCGG TGATGTCGGC GATATAGGCG CCAGCAACCG CACCTGTGGG GCCGGTGATG 3960 CCGGCCACGA TGCGTCCGGC GTAGAGGATC GAGATCTCGA TCCCGCGÄAA TTAATACGAC ’ 4020 TCACTATAGG GAGACCACAA CGGXTTCCGT CTAGAAÄTAA TTTTGTXTAA CTTTAAGAAG 4080 GAGATATACA T&TGGÄACCG GTCGACCCGC GTCTGGAf.CC ATGGAAACAG CCCGGGTCCC 4240 AGCCGAAAAC CGCGTTCATC ACCAAAGCCC TAGGTATCTC TTACGGCCGT AAÄÄAACGTC 4200 GTCAGCGACG TCGTCGGCCG CAGGGATCGC AGACCCACCA GGTTTCTCTG TCTAAACÄGT 4260 GATCAGCATT GGCTAGCATG ACTGGTGGAC AGCAAATGGG TCGCGGATCC GGCTGCTAAC 4320 AAAGCeCGAA AGGAAGCTGA GTTGGCTGCT GCCACCGCTG AGCAATAACT AGCATAACCC 4380 CTTGGGGCCT CTAAACGGGT CTTGAGGGGT TTTTTGCTGA AAGGAGGAAC TATATCCGGA 4440 TÄTCCACSGG ÄCGGGTGTGG TCGCCATGAT CGCGTAGTCG ATAGTGGCTC CAAGTÄGCGA 4500 AGCGAGCAGG ACTGGGCGGC GGCCAAAGCG GTCGGÄCAGT GCTCCGAGAA QGGGTGCGCA 4560 TAGAAATTGC ATCAAGGCAT ATAGCGCTAG CAGCACGCCA TAGTGACTGG CGATGCTGTC 4620 GGAATGGACG ATATCCCGCA AGAGGCCCGG CAGTACCGGC ATAACCAAGC CTÄTGCCTÄC 4680 AGCATCCAGG GTGACGGTGG CGAGGATGAC GATGAGCGCA TTGTTAGATT TCATACACGG 4740 :] 104 TGCCTGACTG CGYTAGCAAT TTAACTGTGA TAAACTACCG CATTAAAGCT TATCGATGAT 4800 AAGCTGTCAA AGATGAGAA - 4819 (2) INFORMATION FOR SEQ 10 NO;21: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICSt (A) LENGTH: 4S base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single <:D) TOPOLOGY; linear <li) MOLECOLS TYPE; DNA (genomic)
IxL) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID: NO: 21 r TTTACGGCCG TAAGAGATAC CTAGGGCTTT GGTGATGAAC GCGGT 45 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:22: (1} SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 5574 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STHANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: circular (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:22: TTCTTGAAGA CGAAAGGGCC TCGTGATACG CCTÄTTTTTA TAGGTTAATG TCATGATAAT 60 AATGGTTTCT TÄGACGTCAG GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG 120 TTTATTTTTC TAÄÄTACATT CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT 180 GCTTG&ÄTÄÄ TATTGAAAAA GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT 240 TCeCTTTTTT GCGGCATTTT GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT 300 AÄAAGÄTGCT GAAGATCAGT TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG 360 : CGGTAAGATC CTTGÄGAGTT TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCAGTTTTAA 420' AGTTCTGCTÄ TGTGGCGCGG TÄTTATCCCG TGTTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG 480 CCGCATACAC TATTCTCAGA ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AÄAAGCATCT 540 TACGGATGGC ATGACAGTAA GAGAATTATG CACTGCTG.CC ATAACCATGA GTGÄTAACAC 600 TGCGGCCÄÄC TTACTTCTGA CAACGATCGG AGGÄCCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA 6:50 105 CAACATGGGG GAXCATGTAA CTCGCCTTGA XCGXTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT 720 ACCAAACGAC GAGCGTGACA CCACGAXGCC TGCAGCAATG GCAACÄAGGT XGCGCAAACX 780 ATXAACTGGC GAACTACTTA CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC 840 GGÄTAAAGTX GCAGGACCAC TXCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCXGGCTGGT TTATTGCXGA 900 xaaatctgga GCCGGTGAGC GTGGGTCTCG CGGTATCATX GCÄGCACTGG GGCCAGATGG 360 TAAGCCCTCC CGTATCGTAG XXAXCXACÄC GACGGSGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG 1020 ÄAAXAGÄGAG ATCGCTGAGA TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCÄ 1080 AGTXXACXCÄ XATATACXXT AGAXTGRTXT AAAACTTCAT TXTXAATTTA AAAGGAXCTA 1140 5GXGÄAGAXC CTXTTTGATA ÄTCTCÄTGAC CAAAÄTCCCT TAACGXGAGT TTXCGXTCCA 1200 CTGAGCGTCA GACCCCGXAG AAAAGATCAA AGGAXCXXCT TGAGAXCCTT XTTTTCTGCG 1260 CGTAATCTGC XGCXTGCAAA CAAAAAÄACC ACCGCXÄGCÄ GCGGTGGTTX GXTXGCCGGA 1320 TCAAGAGCXA CCAACTCTXX TXCCGAAGGX AACTGGCXXC AGCAGAGCGC AGATACCAAA 1380 TACTGXCCXX CXACXGXAGC CGTAGTXAGG CCAGCACTXC AÄGAÄCTCXG TAGCACCGCC 1440 1 XACATACCTC GCTCTGCTAA TCCXGTXACC AGTGGCTGCT GCCÄGTGGCG ATAAGTCGTG 1500 XCXTACCGGG TTGGACXCAA GACGAXACXX ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAG 1560 GGGGGGXXCG XGCACACAGC CCAGeXTGGA GCGAACGACC TACÄCCGÄAC TGAGATACCT 1620 ACAGCGTGAG CAXTGAGAAA GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC 1680 GGXAAGCGGC ÄGGGTCGGAÄ CAGGAGÄGCG CACGACGGAG CTTCCAGGGG GAAAGGCCTG 1740 GTATCXTXÄT AGTGCXGXCG GGXTXCGCCA CCXCXGACXT GAGCGTCGAX XXXXGTGATG 1800 CXCGXCAGGG GGGGGGÄGCC TAXGGAÄAAK CGCCAGCAAC GCGGCCTTXT XACGGTXCCX 1360 GGCGXTXIGG XGGCCTXXXG CXCACATGTT CXIXCCXGCG XTATCCCCTG AXXCXGXGGA 1920 1 XAACCGTATT ACCGCGXTTG AGXGAGCTGA XACCGGXCGG CGCAGCGGAA CGACCGAGCG .1980 ] \
CÄGCGAGXCA GTGAGCGAGG AAGCSGAAGA GCGCCXGAXG CGGTAXXXXC TCCTXACGCÄ 2040 I
TGXGTGCGGX ATTXCACACC GCATATATGG TGCACXCXCA GTACAATCTG CXCXGATGCC 2100 j GCATAGTTAA GCCAGTAXAC ÄCXCCGGTAX CGCXACGTGA CTGGGTCATG GCTGCGCCCC 2160 1 GACACCCGCC AACACCCGCT GACGCGCCGT GACGGGCXTG TCTGCXCCCG GCAXCCGCXX 2220 ] ACAGACAAGC TGIGACCGXC TCCGGGAGCT GCATGXGTCA GAGGTTTTCA CCGTCATCAC 2280 CGAAÄCGCGC GAGGCAGCTG CGGTAAAGOX GAXCAGGGXG GTCGXGAAGC GATXCÄCAGA 2340 106 TGXCTGCCTG TTCATCCGCG TCCAGCTCGX TGAGTTTCTC CAGAAGCGTT AATGTCTGGC 2400 TTCXGATAAA GCGGGCCATG TTAAGGGCGG XXTTTTCCTG TXTGGXCACX TGATGCCTCC 2460 GTGTAAGGGG GÄATTTCTGT TCAXGGGGGT AATGAXACCG ÄTGAAACGAG AGAGGATGCT 2520 CACG&XACGG GTXACTGATG ATGÄÄCÄTGC CCGGTTACTG GAACGTTGXG AGGGTAAACA 2550 ACTGGCGGTA TGGAXGCGGC GGGACCAGAG ÄÄAAATCACT CAGGGTCAAT GCCAGCGCTT 2640 CGTTAÄTACA GATGTAGGTG TTCGÄCAGGG TAGCCAGCAG CATCCTGCGA TGCAGATCCG 2700 GAACATAAXG GXGCAGGGCG CTGÄCTTCCG CGTTTCCÄGA CXTTACGAAA CACGGAAÄCC 2760 GAAGACCÄTX CATGTTGTTG CTCAGGTCCC AGACGXTTXG CAGCAGCAGT CGCTTCACGT 2820 TCGCTCGCGT: ATCGGTGATT CATTCTGCTA ACCAGXÄAGG CÄÄCCCCGCC AGCCTAGCCG 2880 GGTCCTCAAC GACftCGAGCA CGATCAXGCG CACCCGTGGC CAGGACCCAA CGCTGCCCGA 2940 GATGCGCCGC GTGCGGCTGC TGGAGATGGC GGACGCGATG GAXATGTXCT GCCAAGGGTT 3000 GGTTTGCGCA XTCACAGXTC TCCGCAAGAA TXGATTGGCX CCAATXCXTG GAGXGGTGAA 3060 TCCGTTAGCS AGGTGCCGCC GGCTXCCATT "AGGTCGAGG TGGCCCGGCT CCAXGCAGCG 3120 CGACGCAACG CGGGGAGGCA GACAAGGtAT AGGGCGGCGC CTACAATCCA TGCCAACCCG 3180 TTCCATGTGC TCGCCGAGGC GGCATAAATC GGCGXGACGA TCAGCGGTCC AGXGATCGAA 3240 GTTAGGCIGG TAAGAGCCGC GAGCGATCCX XGÄAGCTGXC CCTGATGGXC GTCATCXACC 3300 TGCCTGGACA GCAXGGCCTG CAACGCGGGC ATCCCGATGC CGCCGGAAGC GAGAAGAAXC 3360 ATAATGGGGA AGGCCATCCA GCCXCGCGTC GCGAACGCCA GCAAGACGTA GCCCAGCGCG 3420 TCGGCCGCCA TGCCGGCGAT AATGGCCXGC TTCTCGCCGA ÄÄCGTTTGGT GGCGGGACCA 3480 GTGACGAAGG CXXGAGCGAG GGCGTGCAAG ATTCCGAAXA CCGCAAGCGA CÄGGCCGATC 3540 ATCGXCGCGC TCCAGCGAAA GCGGTCCXCG CCGAAAATGA CCCAGAGCGC TGCCGGCACC 3600 IGTCCTACGA GTTGCATGAT AAAGAAGÄGA GTCATAAGTG CGGCGACGAX ÄGXCATGCCC 3660 CGCGCCCACC GGAAGGAGGX GACXGGGXXG AAGGCXCXCÄ AGGGCÄTCGG TCGACGCTCX 3720 CCCTTATGCG ACXCCTGCAT TAGGÄÄGCÄG CCCAGTAGTA GGTTGAGGCC GTTGAGCACC 3780 GCCGCCGCAA GGAATGGXGC ATGCAAGGAG AXGGCGCCCA ACAGTCCGCC GGCCACGGGG 3840 CCTGCCAGCA TACCCACGCC GAAACAAGGG CXCATGAGCC CGAAGTGGCG AGCCCGATCX 3900 TCCCCATCGG XGATGTCGGC GATÄTAGGCG CCAGCAACCG CACCTGTGGC GCCGGXGATG 3960 CCGGCCACSA TGCGTCCGGC GTAGAGGATC GAGATCTCGA TCCCGCGAAA TTAATACGAC 4020 107 TCACTATAGG GAGACCACAA CGGTTTCCCT CTAGAAATAA TTTTGTTTAA CTTTAAGAAG 4080 GAGATATACA TATGGAACCG GTCGACGCGG GTCTGGAftCC ÄTGGAAACAC CCCGGGTCCC 4140 AGCCGAAAAC CGCGTTCATC ACGAAAGCCC TAGGTATCTC TTACCGCCGT AAAAAACGTC 4200 GTCAGCGACG TCGTCCGCCG CAGGGATCTT CGATGGCCGG TGCTGGACGC ATTTACTATT 4250 CTCGCTTTGG TGACGAGGCA GCCAGATTTA GXACAACAGG GCATTACTCT GIAAGAGAXC 4320 AGGACAGAGT GTATGCTGGT GTCTCATCCA GGXCXXCXGÄ TTTTAGAGAT CGCCCAGACG 4380 GAGTCTGGGT CGCATCCGAA GGACCXGAAG GAGACCCTGC AGGAAÄAGAA GCCGAGCCÄG 4440 CCCAGCCTGT CTCXXCTXTG CTCGGCTCCC CCGCCXGCGG TCCCATCAGA GCAGGCCTCG 4500 GTTGGGTACG GGACGGTCCT CGCXCGCACC CCXACAATTX XCCIGCÄGGC TCGGGGGGCT 4560 CTATTCTCCG CTCTTCCTCC ACCCCGGTGC AGGGCACGGT ACCGGTGGAC TTGGCäTCäA 4620 GGCAGGÄÄGÄ AGAGGAGCAG XCGCCCGACX CCACAGAGGA AGAACCAGTG ACTCTCCCAÄ 4680 GGCGCACCAC CÄATGATGGA TTCCACCTGT TAAAGGCAGG AGGGTCATGC TXTGCTCXAA 4740 TTTCAGGAAC TGCTRACCÄG GTAAAGTGCT AXCGCTTTCG GGTGAAÄAAG äACGATAGAC 4800 ATCGCTACGA GAACTGCACC ACCÄCCTGGT TCÄCAGTTGC TGACAACGGX GCTGAAAGAC 4860 AAGGACAAGC ACAAAXACTG ATCACCTTTG GATCGCCAAG TCAAAGGCAA GACTTTCTGA 492:0 AACATGTACC ACXACCTCCX GGAATGAACA TTTCCGGCTT TACAGCCAGC TTGGÄCTTCT 435(0 GAXCACTGCC ATTGCCTTTT CITCAXCXGA CXGGTGTAGT äXGGCAAATC TATGGXXXCT 5040
ATXGTTCTTG GGACTAGGAA GATCCGGCTG CXAACAAAGC CCGAAAGGAA GCTGAGTTGG SIDO
CXGCTGeCAC CGCTGAGCAA TAACTAGCAT AACCCCXTGG GGCCTCTÄAA CGGGTGTXGÄ S166 GGGGTTTTTT GCXGAAAGGA GGAACTATAT CCGGÄTATCC ACAGGACGGG TGTGGTCGGC 5220 AXGATCOGGT: AGTCGATAGT GGCTCCAAGT AGCGAAGCGA GCAGGACTGG GCGGCGGCCA 5280 AAGCGGTCGG ACAGXGCTCC GAGAACGGGT GCGCATAGAA AXTGCATCAA CGCATATAGG 5340 GCTAGCAGCA CGCCAXAGTG ACXGGeGATG CXGTCGGÄAX GGÄCGAXÄXC CCGCAAGAGG 5400 CCCGGCAGTA CCGGCATAAC CAAGCCXAXG CCXACAGeAT CCÄGGGTGAC GGTGCCGAGG 5460 ATGACGATGA GCGCATTGTT AGÄTTTCATA CAGGGTGCCT GACXGCGTTA GCAAXXXAAC 5520 TGXGAXÄAAC TACCGCATTA AAGCTXATCG ÄXGATÄAGGT GTCAAACATG AGAA 5574 {2) INFORMATION FDR SEQ ID NO:23; (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: | 108 (A) LENGTH: 20 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (Li) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(ill) HYPOTHETICAL: NO
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:23: GATCCCAGAC CCAGCAGGTT 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:24: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTHS 17 base pairs (B) TYPE: nucleic acid ¢0) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (Ki) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:24: GAACCTGGTG GGTCTGG 17 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:25: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: SO base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) \ (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NOS'25: \
CGTCCGCCGC AGGGATCGCA GACCCACCAG GTTTCTCTGT CTAAACAGGC SO ‘ I
\ (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:26; j (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: j (A) LENGTH: 5Ö base pairs \ (B) TYPE: nucleic acid j (C) STRANDEDNESS·: single \ (D) TOPOLOGY: linear 1 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) j (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:26: 109
CATGGCCTGT TTAGACAGAG ÄAACCTGOTG GGTCTGCGAT CCCTGCGGCG GACGACGT 5S
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:27: (I) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 48 base pairs {B} TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGI: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:27: CATGTACGGC CGTAAAAAAC GTCGTCAGCG ACGTCGTCCG CCGGACAC 48 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:28: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 46 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRARDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NQ-.28: CGGTGTCCGG CGGACGACGT CGCTGACGAC GTTTTTTACG GCCGTA 46 {2) INFORMATION FOR SEQ ID NO;29: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 26 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS; single (D) TOPOLOGY: linear {iiJ MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:29: ATCATCGATA AGCTTTAATG CGGTAG 26 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:30: ] $ 110 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A:) LENGTH: 52 base palps (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (DJ TOPOLOGY: linear (iij MOLECULE TYPE: UNA {genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 30: ACTTTAAGAA GGAGATATAC ATATGTTCAT CACCRAAGCC CTAGGTATCT CT 52 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:31: ίi) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 51 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear ίii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:31: ' j ACTTTAAGAA GGAGATATAC ATATGTACGG CCGTAAAAAA CGTCGTCAGC G 51 j (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:32; (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: S2 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:32: ÄACGTCGTCA GCGACGTCGT CCGCCGGACA CCGGAAACCC CTGCCACACC AG 52 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:33: j (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: | (A) LENGTH: 30 base pairs 1 (B) TYPE: nucleic acid j (C) STRANDEDNESS: single j (D) TOPOLOGY: linear j {ii} HOLBCULE TYPE: DUK (genomic) |
Ill (xi) SEQUENCE DESCRIPTIONS SEQ ID NO:33: CGÄÄÄÄGTGC CÄCCTGÄCGT CTAAGAAACC 30 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:34: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: {A) LENGTH; 26 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (II) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:34: CTCCCATGGC TAGCAACACT ACACCC 26 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:35: (x) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 10 base pairs I
(B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:35: GAAGATCTTC 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:36: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 27 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single j (D) TOPOLOGY: linear |
(ii) MOLECULE TYPE; DNA (genomic) I
) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:36: ] ] CAGAGGAAGC CATGGTGACT CTCCCAA 27 j (2j INFORMATION FOR SEQ ID NO;37: 1
J
s 112 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 2? base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE; DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION; SEQ ID NO:37; AAOGCAATGG ATCCGATCAG AAGTCCA 27 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3S; (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 134 amino acids (B) : TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3B:
Met Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg pro Pro Asp Thr 1 5 10 15
Gly Asn Pro Cys His Thr Thr Lys Leu Leu His Arg Asp Ser Val Asp 20 25 30
Ser Ala Pro lie Leu Thr Ala Phe Asn Ser Ser His Lys Gly Arg lie 35 40 45
Asn Cys Asn ser Asn Thr Thr Pro lie val His Leu Lys Gly Asp Ala 50 55 60
Asn Thr Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg Phe Lys Lys His Cys Thr Leu 65 70 75 80
Tyr Thr Ala Val Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Gly His Asn Val Lys 85 90 95
His Lys Set Ala lie Val Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Glu Trp Gin Arg 100 105 110 113
Asp Gift Phe Leu Ser Gin Val Lys He Pro Lys Thr Ile Thr Val ;,er 115 120 12S
Thr Gly Phe Ket See He 130 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:39: (i) SEQUENCE CHARACTERlSTiCS: (A) LENGTH: 55 base pairs (8) ΤΥΡΕ: nucleic acid {¢) STRANDEDNESS: single (0) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:39: CÄTGTACGGC CGTAAAÄAAC GTCGTCAGCG ACGTCGTCCG CTGAGTCAGG CCCAG 55 (2) INFORMATION FOR SEQ ID 80:40: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 51 base pairs {0.). TYPE: nucleic acid (C) STRANBEDNESS: single (0) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:40: CTGGGCCTGA CTCÄGCGGAC GACGTCGCTG ACGACGTTTT TTACGGCCGT A 51 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO·;·41: (i) SEQUENCE: CHARACTERISTICS: (A) LENGTH; 46 base .pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS; single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:41: TCCTTCCTGT CCGCTGGTCA GCGCCCGCGC CGCCTGTCCA CCTÄÄG 46 -¾ (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO;42: 114 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS; (A) LENGTH: 54 base pairs (B) TYPE; nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY; linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ XD NO:42:-AATTCTTAGG TGGACAGGCG GCGCGGGCOC TGACCAGCGG ACAGGAAGGA CATG 54 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO;43: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 39 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: ONÄ (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:43: GGGGACTTTC CGCTGGGGAC TTTCCACGGG GGACTTTCC „ 39 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:44: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS; (A) LENGTH: 39 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID MO:44: GGAAAGTCCC CCGTGGAAAG TCCCCAGCGG AAAGTCCCC 39 .¾ (2) INFORMATION FOE SEQ IQ NOs 45: j (1) SEQUENCE CHARACTERISTICS: \ (A) LENGTH: 39 base pairs j {B) TYPE: nucleic acid \ (C) STRANDEDNESS: single ] (D) TOPOLOGY; linear 1 j 115 (ii) MOLECULE TYPE: DNA {genomic} (xi) SEQUENCE DESCRIPTION; SEQ ID NO:45s gtctactttc cgctgtctac tttccacggt ctactttcc 39 {2} INFORMATION FOR SEQ ID NO:46: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH; 39 base pairs (Bj TYPE: nucleic acid {C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY; linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA {genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:46: GGAAAGTAGA CCGTGGAAAG TAGACAGCGG AAAGTAGAC 39 {2} INFORMATION FOR SEQ ID NO:47: ίIJ SEQUENCE CHARACTERISTICS : (A) LENGTH; 12 amino acids (8) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear {ii) MOLECULE TYPE; peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:47:
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro 15 10 {2} INFORMATION FOR SEQ ID NO:48: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH; 26 amino acids (8) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS; single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi.) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 48: 116
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin Gly Ser 1 S 10 IS
Gin Thr His Gin Vai Ser Leu Ser Lys Gin 20 25 (2) INFORMATION FOR SEQ 10 NO:49: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 35 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (0) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ IB NO:49:
Phe lie Thr Lys Ala Led Gly lie Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg 1 5 10 15
Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin Gly Ser Gin Thr His Gin val ser Leu j 20 25 30 !
Ser Lys Gin 35 (2:) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 50: :(1} SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH; 21 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear {ii) MOLECOLB' TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ; ID NO:50: |
Phe lie Thr Lys Ala Leu Gly lie Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg :j 1 5 10 15
Gin Arg Arg Arg Pro | 2 0 j (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 51: :| 117 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 121 aiftino acids {BJ TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS; single (0) TOPOLOGI: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein :(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: SI:
Pro Asp Thr Sly Asn Pro Cys His Thr Thr Lys Leu Leu His Arg Asp 1 5 10 is ser Val Asp Ser Ala Pro lie Leu Thr Ala Phe Asn Ser Ser Hie Lyc 20_ 25 30
Gly Arg lie Asn Cys Asn Ser Asn Thr Thr Pro lie Val His Leu Lys 35 40 45
Gly Asp Ala Asn Thr Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg Phe Lys Lys His 50 55 60
Cys Thr Leu Tyr Thr Ala Val Ser Ser Thr Trp His. Trp Thr Gly Hia
65 70 75 SO
Asn Val Lys His Lys Ser Ala lie; Val Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Glu 85 90 95
Trp Gin Arg Asp Gin Phe Leu Ser Gin Val Lys lie Pro Lys Thr lie 100 105 1X0
Thr Val Ser Thr Gly Phe Met Ser lie 115 120 {2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:S2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTHS IS amino acids {0} TYPE: ainino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO;52: 118
Gly Arg Lys Lys Arg Arg: Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin Gly set 1 5 10 15 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO;S3s (1) SEQUENCE CHARACTERISTICSi (A) LENGTH; 25 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS; single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide {xi| SEQUENCE DESCRIPTIONS SEQ ID NO*53:
Phe lie Thr Lys Ala Leu Gly ..He Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg
1 5 10 IS
Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin Gly Sex 20 25 (.2} INFORMATION FOR SEQ ID NO: 54; (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 85 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (Ki) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO;54:
Cys Asn Ser Asn Thr Thr Pro Ile Val His Leu Lys Gly Asp Ala Asn 1 5 10 15
Thr Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg Phe Lya Lys His Cys Thr Leu Tyr.
20 25 30
Thr Ala Val Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Gly His Asn Val Lys His 35 40 45
Lys Ser Ala lie Val Thr Leu Thr Tyr Asp Ser G.lu Trp: Gin Arg Asp 50 55 50 :] • ] 119
Gin Phe Xsu Set Gin Vai Lys Ile Pro Lys Thr Ile Thr Vai Ser Thr 65 70 V 75 80
Gly Pile Met Ser Ile es (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO!55: (i) SEQUENCE CHARACTER!STICS: (A) LENGTH.: 121 amino acids (B) TYPE: amino acid .(C) STRANDEDNESS! single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE: TYPE: protein (XX) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:55:
Fto Asp Thr Gly Asn Pro Cys His Thr Thr Lys Leu Leu His Arg Asp 1 5 10 15
Sar Val Asp Ser Ala Pro lie Leu Thr Ala Phe Asn ser Ser His Lys 20 25 30
Gly Arg lie Asn Cys Asn Ser Asn Thr Thr Pro lie Val His Leu Lys 35 A 0 4 5
Gly Asp Ala Asn Thr Leu Lys Ser Leu Arg Tyr Arg Phe Lys Lys His 50 55 60
Ser Thr Leu Tyr Thr Ala Val Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Gly His 65 70 75 80:
Asn Val Lys His Lys Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Glu 85 90, 95
Trp Gin Arg Asp Gin Phe Leu Ser Gin Val Lys lie Pro Lys Thr lie 100 105 110
Thr Val Ser Thr Gly Phe Met Set lie 115 120 ¢2) INFORMATION FOR SEQ: ID NO; 5,6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS; (A) LENGTH: 161 amino acids: 120 ί,Β) TYPE: amino acid: (C) STRANDEDNESS: single (DJ TOPOLOGI: linear {Ii> MOLECULE ΤΪΡΕ: protein {xi} SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:56:
Lea G ly Trp Vai Arg Asp Gly Pro Rrg Ser His Pro Tyr Asu Phe Pro
1 5 10 IS
Ala Gly Ser Gly Gly Ser Ile Leu Arg Ser Ser Ser Thr Pro Vai Gin 20 25 30
Gly Thr Vai pro Vai Asp Leu Ala Ser Arg Gin Glu Glu Glu Glu Gin 35 40 45
Ser Pro Asp Ser Thr Glu Glu Glu Pro Vai Thr Leu Pro Arg Arg Thr 50 55 60
Thr Asn Asp Gly Phe His Leu Leu Lye Ala Gly Gly Ser Cys Phe Ala SS 70 75 80
Leu Ile Ser Gly Thr Ala Asn Gin Vai Lye Cys Tyr Arg Phe Arg Vai S5 90 95
Lye Lys Asn His Arg His Arg Tyr Glu Asn Cys Thr Thr Thr Trp Phe 100 105 110
Thr Vai Ala Asp Asn Gly Ala Glu Arg Gin Gly Gin Ala Gin Ile Leu 115 120 125
Ile Thr Phe Gly Ser Pro Ser Gin Arg Gin Asp: phe Leu Lys: His Vai 130 135 140
Pro Leu Pro Pro Gly Met Asn Ile Ser Gly Phe Thr Ala Ser Leu Asp 145 ISO 155 160 r
Phe (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:57: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 121 {A) LENGTH: 249 amino acids (B) TYPE: amino acid {C) STRAKDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE' TYPE! protein (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION; 5EQ ID NO!57: , Met Ala Gly Ala Gly Arg lie Tyr Tyr Ser Arg Phe Gly Asp Glu Ala 1 5 10 15
Ala Arg Phe Ser Thr Thr Gly Hie Tyr ser Val Arg Asp Gin Asp Arg 20 25 30
Val Tyr Ala Gly Val Ser Ser Thr Ser Ser Asp Phe Arg Asp Arg Pro 35 40 45
Asp Gly Val Trp Val Ala Ser Glu Gly Pro Glu Gly Asp Pro Ala Gly 50 55 SO
Lys Glu Ala Glu Pro Ala Gin Pro Val Ser Ser Lett Leu Gly Ser Pro
65 70 75 SO
Ala Cys Gly Pro He Arg Ala Gly Leu Gly Trp Val Arg Asp Gly Pro 85 SO 95
Arg Ser His Pro Tyr Asn Phe Pro Ala Gly Ser Gly Gly Ser lie Leu loo 105 no
Arg Ser Ser Ser Thr Pro Val Gin Gly Thr Val Pro Val Asp Leu Ala 115 120 125
Ser Arg Gin Glu Glu Glu Glu Gin Ser Pro Asp Ser Thr Glu Glu Glu 130 135 140
Pro Val Thr Leu Pro Arg Arg Thr or Asn Asp Gly Phe His Leu Leu 145 ISO 155 160
Lys Ala Gly Gly Ser cys Phe Ala Leu lie Ser Gly Thr Ala Asn Gin 165 170 ' 175 j 122
Vai Lys Cys Tyr Arg Phe Arg Val Lye Lys Asn Hia Arg His Arg Tyr 180 185 190
Glu Abb Cys Thr Thr Thr Trp Phe Thr Val Ala Asp Asn Gly Ala Glu 195 200 205
Arg Gin Gly Gin Ala Gin He Leu He Thr Phe Gly Ser Pro Ser Gin 210 215 220
Arg Gin Asp Phe Leu Lye His Val Pro Leu Pro Pro Gly Met Asn He 225 230 235 240
Ser Gly Phe Thr Ala Ser Leu Asp Phe 245 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NOiSB: (1) SEQUENCE CHARACTERISTICS!: (A) LENGTH! 385 amino acids (IB.) TYPE: amino acid (C) STRANDEONESS! single i| (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE! protein j ! (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:58: j
Met Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Leu Ser Gin j
1: 5 10 15 I
Ala Gin Leu Met Pro Ser Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Ala Leu 20 25 30
Phe Asn Arg Leu Leu Asp Asp Leu Gly Phe Ser Ala Gly Prtf Ala Leu j 35 40 45 '1
Cys Thr Met Leu Asp Thr Trp Asn Glu Asp Leu Pha Ser Gly Phe Pro 50 55 60
Thr Asn Ala Asp Met Tyr Arg Glu Cys Lye Phe Leu Ser Thr Leu Pro 65 70 75 80
Ser Asp Val He Asp Trp Gly Asp Ala His Val Pro Glu Arg Ser Pro j 85 90: 95 j j 5! 123
Ile Asp Ile Arg Ala Bis Gly Asp Vai Ala Phe pro Thr Leu Pro Ala 100 105 110
Thr Arg Asp Glu Leu Pro ser Tyr Tyr Glu Ala Met Ala Gin Phe Phe 115 120 125
Arg Gly Glu Leo Arg Ala Arg Glu Glu Ser Tyr Arg Thr Vai Leu Ala 130 135 140
Aan Phe Cys Ser Ala Leu Tyr Arg Tyr Leu Arg Ala Ser Vai Arg Gin 145 ISO 155 160
Leu His Arg Gin Ala His Met Arg Gly Arg Aan Arg Asp Leu Arg Glu 165 170 175
Ket Leu Arg Thr Thr Ile Ala Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Thr Ala Arg ISO 185 190
Leu Ala Arg Vai Leu Phe Leu His Leu Tyr Leu Phe Leu Ser Arg Glu 195 200 205__ lie Leu Trp'Ala Ala Tyr Ala Glu Gin Met Met Arg Pro Asp Leu Phe 210 215 220
Asp: Gly leu Cys Cys Asp Leu Glu ser Trp Arg Gin Leu Ala cys Leu 225 230 235 240
Phe Gin Pro Leu Het Phe lie Aan Gly Ser Leu Thr Vai Arg Gly Vai 245 250 255
Pro Vai Glu Ala Arg Arg Leu Arg Glu Leu Αβπ His Ile Arg Glu His 260 265 270 j
Leu Aan Leu Pro Leu Vai Arg Ser Ala Ala Ala Glu Glu Pro Gly Ala 275 280 285 j ; i
Pro Leu Thr Thr Pro Pro Vai Leu Gin Gly Ään Gin Ala Arg ser Ser | 290 295 300 j
Gly Tyr Phe Het Leu Leu Ile Arg Ala Lys Leu Asp Ser Tyr Ser Ser 1 305 310 315 320 j •j j 124
Vai Älä Thr Ser Glu Gly Glu Ser Vai Het Arg Glu Hls Ala Tyr Ser 325 330 335
Arg Gly Arg Thr Ärg Asn Ab n Tyr Gly ser Thr l ie Glu Gly Lea Leu ' .
340 345 350
Asp Leu Pro Asp Asp Asp Asp Ala Pro Ala Glu Ala Gly Leu Vai Ala 355 350 355
Pro Arg Met Ser Phe Leu Ser Ala Gly Gin Arg Pro Arg Arg Leu Ser 370 375 380
Thr 365 (2). INFOEHATION FOR SEQ ID NO: 59: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 148 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGI: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein - :(xi) SEQUENCE: DESCRIPTION: SEQ ID NO: 59:
Met Tyr Gly Arg Lys Lya Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin Gly 1 5 ID 15
Ser Gin Thr His Gin Val Ser Leu Ser Lys Gin Pro Asp Thr Gly Asn 20 25 30
Pro Cys His Thr Thr Lye Leu Leu His Arg Asp Ser Val Asp Ser Ala 35 40 45 . §
Pro lie Leu Thr Ala phe Asn Ser Ser His Lys Gly Arg Ile Asn Cys |
50 55 60 I
Asn Ser Asn Thr Thr Pro lie Val His Leu Lys Gly Asp Ala Asn Thr j 65 70 75 80 :! j 5 \ j \
A
125
Leu Lye. Cys Leu Arg Tyr Arg Phe Lye Lys Hie Cys Thr Leu: Tyr Thr 85 90 95
Ala Val Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Gly His Aan Vai Lye His Lys 100 105 110
Ser Ala lie Val Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Glu Trp Gin Arg Asp Gin 115 120 125
Phe Leu Ser Gin Val Lys lie Pro Lys Thr He Thr Val Ser Thr Gly 130 135 140
Phe Het Sar lie 145 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:60! {I) SEQUENCE CHARACTERISTICS* (A) LENGTH: 1ST amino acids (.8) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNBSSs single (D) TOPOLOGY: linear (ti) MOLECULE TYPE* protein f (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:60:
Met Phe lie Thr Lys Ala Leu Gly He Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg 1 5 10 15
Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin Gly Ser Gin Thr His Gin Val Ser 20 25 30
Leu Ser Lys Gin Pro Asp Thr Gly Asn Pro Cys His Thr Thr Lye Leu
35 40 45 I
Leu His Arg Asp Ser Val Asp Ser Ala Pro lie Leu Thr Ala Phe Aen ] SO 55 SO j j
Ser Ser His Lys Gly Arg He Asn Cys Asn Ser Asn Thr Thr Pro lie 65 70 75 80
Val His Leu Lys Gly Asp Ala Asn Thr Leu Lys Cye Leu Arg Tyr Arg j
85 90 95 I
' I
J
j i j ä 5 i 126
Pha Lye Lye His Cya Thr Leu Tyr Thr Ala Val Ser Ser Thr Trp His 100 105 no
Trp Thr Gly His Asn Val Lys Hia Lya Ser Ala lie Val Thr Leu Thr US 120 125
Tyr Asp Ser Glu Trp Gin Arg Asp Gin Phe Leu Ser Gin Val Lya lie 130 135 140
Pro Lye Thr lie Thr Val Ser Thr Gly Phe Met Ser He 145 ISO 155 {2} INFORMATION FOR SEQ ID NO:61; (I) SEQUENCE CHARACTERISTICS: {A} LENGTH: 177 amino acids (Bj TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (jci) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NQ:61:
Met Gly Arg Lya Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin Gly Ser 1 5 10 15
Leu Gly Trp Val Arg Asp Gly Pro Arg ser His Pro Tyr Asn Phe Pro 20 25 30
Ala Gly Ser Gly Gly Ser lie Leu Arg Ser Ser Ser Thr Pro Val Gin 35 40 45
Gly Thr Val Pro Val Asp Leu Ala Ser Arg Gin Glu Glu Glu Glu Gin 50 55 60
Ser Pro Asp: Ser Thr Glu Glu Glu Pro Val Thr Leu Pro Arg Arg Thr 1
65 70 75 80 I
Thr Asn Asp Gly Phe Hia Leu Leu Lys Ala Gly Gly Ser Cys Phe Ala 85 90 95 127 teu Ile ser Gly Thr Ala Aan Gin Val lye Cys Tyr Arg Phe Arg Val 100 10S 110
Lye Lye Asn Hia Arg His Arg Tyr Glu Asn eye Thr Thr Thr Trp Phe 115 120 125
Thr Vai Ala Asp Aan Gly Ala Giu Arg Gin Gly Gin Ala Gin lie leu 130 135 140
lie Thr Phe Gly Ser Pro Ser Gin Arg Gin Asp phe leu Lys His val 145 ISO IS5 ISO
Pro leu Pro Pro Gly Met Asn He ser Gly Phe Thr Ala Ser Leu Asp _165 170 175
Phe · ; (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO;62i j C i> SEQUENCE CHARACTERISTICS; j fA) LENGTHi 187 amino acids (B) TYPE: amino acid ! (C) STRANDEDNESS: single | fD) TOPOLOGY: linear ' j
(ii) MOLECULE TYPE: protein * I
(Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:62: |
Met Phe He Thr Lya Ala Leu Gly He Ser Tyr Gly Arg Lys Lya Arg J
1 5 10 15 j
Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin Gly Ser Leu Gly Trp Val Arg Asp j 20 25 30
Gly Pro Arg Ser His Pro Tyr Aan Phe Pro Ala Gly Ser Gly Gly Ser 35 40 45 j j j
He Leu Arg Ser Ser Ser Thr Pro Val Glh Gly Thr Val Pro Val Asp j 50 55 60 j
Leu Ala Ser Arg Gin Glu Glu Glu: Glu, Gin Ser Pro Asp: ser Thr Glu 65 70 75 SO
128
Glu Glu Pro Val Thr Leu Pro Arg Arg Thr Thr Aan Asp Gly phe His 85 90 95
Leu Leu Lye Ala Gly Gly Ser cys Phe Ala Leu lie Ser Gly Thr Ala 100 105 110
Asn Gin Val Lye Cys Tyr Arg Phe Arg Val Lye Lye Asn His Arg Bis 115 120 125
Arg Tyr Glu Asn Cys Thr Thr Thr Trp Phe Thr Val Ala Asp Asn Gly 130 135 140
Ala Glu AKg Gin Gly Gin Ala Gin lie Leu lie Thr Phe Gly Ser Pro 14:5 150 155 150
Ser Gin Arg Gin Asp Phe Leu Lys Bie Val Pro Leu Pro Pro Gly Hat j 165 170 175 | $ Ϊ i
Asn lie Ser Gly Phe Thr Ala Ser Leu Asp Phe j 180 185 ) (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:63 ? | (i) SEQUENCE CHARACTERISTICSi (A) LENGTHS 143 amino acids | (B) TYPE: amino acid 1 (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear ^ (ii) MOLECOLE TYPE: protein <xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO;63:
Met Phe lie Thr Lys Ala Leu Gly lie Ser Tyr Gly Arg Lye Lys Arg 1 5 10 15
Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Asp Thr Gly Asn Pro Cys His Thr Thr
20 25 30 I
t } )
Lys Leu Leu His Arg Asp Ser val Asp Ser Ala Pro lie Leu Thr Ala j 35 40 45 j \ ? 129
Ph e Asti ser Ser Hie Lys Gly Arg Ile ASn cys Aan Ser Aan Thr Thor 50 55 60
Pro Ile Vai His Lcu Lye Gly Asp Ala Aan Thr Len Lys Cys Len Arg 65 70 75 80
Tyr Arg Phe Lys Lya His Cys Thr Leu Tyr Thr Ala Vai Ser Ser Thr 85 90 95
Trp His Trp Thr Gly Hi» Aan Vai Lys His Ly s Sat Ala Ile Vai Thr 100 105 HO
Leu Thr Tyr Asp ser Glu Trp Gin Arg Asp Gin Phe Len ser Gin Vai 115 120 125
Lys Ile Pro Lye Thr Ile Thr Vai Ser Thr Gly Phe Met Ser Ile 130 135 140 | 5 $ $ i

Claims (26)

130
1. Fuusioproteiini, joka koostuu karboksiterminaa-lisesta lastipsasta ja amino t errninaal i s es ta kul jetusOsasta,: 5 tunnettu siitä, että a} kulj et us osas s a on: i) läsnä BlV:n tat-proteiinin aminohapot 49 - 57, li) poissa HiV:n tat-proteiinin aminohapot 2:2 - 36 ja iii) poissa HIV:n tat-proteiinin aminohapot 73 - 86, 10 ja b) lastiosassa säilyy biologinen aktiivisuus: sen jälkeen, kun se on viety kul jetusqsasta. riippuvaisella tavalla solun sisään.
2. Fusionsprotein enligt patentkrav 1, k ä n n e -tecknat av att lastdelen är en terapeutisk molekyl, pro-fyiaktisk molekyl eller diagnostisk molekyl.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen fuusioproteiini, 15 tunnettu siitä, että lastinsa on joko terapeuttinen mo lekyyli, profylaktinen molekyyli tai diagnostinen molekyy li.
3. Fusionsprotein enligt patentkrav 1 eller 2, 20. i n n e t e ok n a t av att lastdelen bestar av en human papillomavirus E2-repressor sora bibehäller sin biologiska ak-tivitet efter transporten tili mälcellen och transportdelen är:: a) HIV tat-proteinets aminosyror 47 - 58 (SEQ ID nr 25 47) , b) HIV tat-proteinets aminosyror 47 - 72 (SEQ id nr 48) , i c) HIV tat-proteinets aminosyror 38 - 72 (SEQ ID nr 4,9) eller 3. d) HIV tat-proteinets aminosyror 38 - 58 (SEQ ID nr 50) .
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen fuusioproteiini, tunnettu siitä, että lastiosa koostuu ihmisen 20 papilloomaviruksen ES-repreäsorista, joka säilyttää biolo gisen aktiivisuutensa sen jälkeen, kun se on viety koh-desoluun, ja kuljetusosa on joko: a) HIV:n. tat-proteiinin aminohapot 47 - 58 {sekvenssi tunnusnumero 47}, 25 b) HIVm tat-proteiinin aminohapot 47 - 72 (sekvens- | si tunnusnumero 48), c) HIV:n tat-proteiinin aminohapot 38 - 72 (sekvenssi tunnusnumero 49} tai d) HIV:n tat-proteiinin aminohapot 38 - 58 {sekvens- 30 si tunnusnumero 50).
4. Fusionsprotein enligt patentkrav 3, känne-tecknat av att transportdelen föregäs av en amino terminal metionin. 136
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen fuusioproteiini, tunnettu siitä, että kuljetusosaa edeltää amino: termi -naalinen. metioniini. OI S. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1 - 4 mukainen f uus i opr o t e i in i, tunnettu siitä, että lastiosa koostuu ihmisen papi11oomaviruksen E2-proteiinin aminohapoista 245 -365 (sekvenssi tunnusnumerosi). 5 6, Patenttivaatimuksen 1 mukainen fuusioproteiini, tunnettu siitä, että se on fuusioproteiini CTB106 (sekvenssi tunnusnumero 38} .
5, Fusionsprotein enligt vilket som heis t av pa-tentkraven 1-4, kannetecknat av att lastdelen bestar av human papillomavirus E2-protelnets aminosyror 245 - 365 (SEQ ID nr 51}.
6. Fusionsprotein enligt patentkrav 1, kanne tecknat av att det är fusionsprotein JB106 (SEQ ID nr 38) ,
7. Fusionsprotein enligt patentkrav 1-., kanne tecknat av att det är fusionsprotein JB117 (SEQ ID nr 10 59) .
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen fuusioproteiini, tunnettu siitä, että se on fuusioproteiini JB117 (sek- 10 venssi tunnusnumero 59 ) .
8. Fusionsprotein enligt patentkrav 1.,. kanne tecknat av att det är fusionsprotein jBllS (SEQ ID nr 60) ,
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen fuusioproteiini, tunnettu siitä, että se on fuusioproteiini JB118 (sekvenssi tunnusnumero 60).
9. Fusionsprotein enligt patentkrav 1, kanne- 15 teckna t av att det är fusionsprotein JB122 (SEQ ID nr 63) ,
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen fuusioproteiini, 15 tunnettu siitä, että se on fuusioproteiini JB122 (sekvenssi tunnusnumero 63).
10. Fusionsprotein enligt patentkrav 1, kannetecknat av att lastdelen bestär av en nöt papillomavirus E2-repres5or som bibehäller sin biologiska aktivitet efter 20 transporten till en malcell och transportdelen är: a) KIV tat-proteinets aminosyror 47 - 62 (SEQ ID nr 52. eller b) HIV tat-proteinets aminosyror 38 - 62 (SEQ ID nr 53) . 2 5
11. Fusionsprotein enligt patentkrav 10, känne- tecknat av att transportdelen föregäs ay en aminotermi-nal metionin .
10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen fuusioproteiini, tunnettu siitä, että lastiosa koostuu naudan papilloo-maviruksen E2-repressorista, joka säilyttää biologisen ak-20 ti ivi suhteensa kohdesoiuun viemisen jälkeen, ja kuljetusosa on joko: a) HIV:n tat-proteiinin aminohapot 47 - 62 (sekvenssi tunnusnumero 52) tai b) HIV*n tat-proteiinin aminohapot 38 - 62 (sekvens- 25 si tunnusnumero 53), 11. : Patenttivaatimuksen 10 mukainen fuusioproteiini, tunnettu siitä, että kuljetusosaä edeltää amino terminaalinen metioniini.
12. Fusionsprotein enligt vilket som heist av pa- tentkraven 1, 2 , 10 eller 11, k ä nn e t eg Jen a t av att ; 30 lastdelen är en E2-repressor bestaende av not papillomavirus E2-proteinets aminosyror 250 - 410 (SEQ ID nr 56).
12. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1, 2, 10 tai 30 11 mukainen fuusioproteiini, tunnettu siitä, että las tiosa on E2-repressori, joka koostuu naudan papilloomavi-ruksen E2-proteiinin aminohapoista 250 - 410 (sekvenssi tunnusnumero 56).
13. Fusionsprotein enligt patentkrav 12, kannetecknat av att det är J3119 (SEQ ID nr 61).
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen fuusioproteii-35 hi, tunnettu siitä, että se oh JB119 (sekvenssi tunnusnumero 61). 132
14. Fusionsprotein enligt patentkrav 12, kanne- 3. teckna t av att det är JB120 (SEQ ID nr 62) . 137
14. Patenttivaatimuksen. 12 mukainen fuusioproteii-ni, tunnettu siitä, että se on 013120 (sekvenssi tunnusnumero: 62) .
15. Fusionsprotein enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknat av att lastdelen bestär av HSV VP16-prate inets aminosyror 43 - 412 och transportdelen bestär av HIV tat-proteinets aminosyror 47 - 58.
15. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen Etmsiopro-5 teiini, tunnettu siitä, että lastiosa koostuu HSV:n VEI6-proteiinin aminohapoista 43 - 412 ja kuljetusOSa koostuu HIV:n tat-proteiinin aminohapoista 47 - 58.
16. Fusionsprotein enligt pa ten tkrav 15, känne tecknat av att transportdelen föregas av en amino terminal metionin.
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen fuasioproteii-ni, tunnettu siitä, että kulje tus osaa edeltää aminoter- 1.0 minaalihen metioniini. 17 .. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-16 mukaisen fuusioproteiinin käyttö lastin viemiseen solun sisään ei-terapeuttisessa tarkoituksessa. 18,. Kovalan tt is es ti liitetty kemia Uinen konjugaat-15 ti, joka koostuu kuljetuspolypeptidiosasta ja lastiosasta, tunnettu siitä, että a) konjugaatin kuljetuspolypeptidiosassa: on: i) läsnä HIV:n tat-proteiinin aminohapot 49 - 57, ii) poissa HIV:n tat-proteiinin aminohapot 22 - 36 ja 20 lii) poissa HIV:n tat-proteiinin aminohapot 73 - 86, ja b) konjugaatin lastiosassä säilyy biologinen aktiivisuus sen jälkeen, kun se on viety solun sisään, kuljetus-osasta riippuvaisella tavalla.
17. Användning av ett fusionsprotein enligt vilket som heist av kraven 1 - 14, för intracellulär tillförsel av 10 last 1 icke-teräpeutiskf ähdamäl.
18. Kovalent bundet kerniskt konjugat bestaende av en transport polypeptiddel och en lastdel, kännetecknat: av att a] kpnjugatets transportpolypeptiddel karakterise- 15 ras av: i) förekomsten av HIV tat-proteinets aminosyror 49 -57, ii) avsaknaderi av HIV tat-proteinets aminosyror 22 - 36 och i 20 lii) avsaknaden av HIV tat-proteinets aminosyror 73 - 86, och b) lastdelen bibehäller en väsentlig biologisk ak-tivitet efter att den har förts in i cellen pä ett sätt, som är beroende av transportdelen.
19. Kovalent bundet kemisk konjugat enligt patent- krav 18, kännetecknat av att transportpolypeptiddel en bestär av HIV tat-proteinets aminosyror 37 - 72 (SEQ ID nr 2) .
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen kovalenttisesti liitetty kemiallinen konjugaatti, tunnettu siitä, että kuljetuspolypeptidiosa koostuu HIV:n tat-proteiinin aminohapoista 37 - 72 (sekvenssi tunnusnumero 2).
20. Kovalent bundet kemiskt konjugat enligt patent-30 krav 19, kännetecknat av att lastdelen är; a) human papillomavirus E2-proteinets aminosyror 245 - 365 (SEQ ID nr 51) eller bj human papillomavirus S2-proteinets aminosyror 245 - 365, väri aminosyroma 300 och 309 har ändrats tili 35 cystein (SEQ ID nr 55). | 138
20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen kovalenttisesti 30 liitetty kemiallinen konjugaatti, tunnettu siitä, että lastiosa on: a) ihmisen papilloomaviruksen E2-proteiinin aminohapot 245 - 365 (sekvenssi tunnusnumero 51) tai b) ihmisen papilloomaviruksen E2.-proteiinin amino-35 hapot 245 - 365, jossa aminohapot 300 ja 3 09 on muutettu kysteiiniksi (sekvenssi tunnusnumero 55}. 133
21. Kovalent bundet kemiskt konjugafc enligt patent-krav 20, kanne tecknat av att lastdelen är en dubbel-strängad DNA-molekyl, som är: a) oligonukleotiden NF1 (SEQ ID nr 43) kopplad till 5 oligonukleotiden NF2 (SEQ ID nr 44) eller b) en oligonukleotiden NF3 (SEQ ID nr 45) kopplad till oligonukleotiden NF4 (SEQ ID nr 46).
21. Patenttivaatimuksen: 20 mukainen kovalenttisesti liitetty kemiallinen konjugaatti, tunnettu siitä, että lastiosa on kaksijuosteinen DNA, joka on: a) oligonukleotidi MFl (sekvenssi tunnusnumero 43) , 5 joka on Hybridisoitu oligonukleotidiin NF2 (SEQ ID nro 44) tai b) oligonukleotidi MF3 (sekvenssi tunnusnumero 45), joka on hybridisoitu oligonukleotidiin HF4 (sekvenssi tunnusnumero 46) . 10 22, Minkä takansa: patenttivaatimuksen 18 - 21 mu kaisen kovalenttisesti liitetyn kemiallisen konjugaatin käyttö lastin viemiseen solun sisään ei-terapeuttisessa tarkoituksessa..
22. Användning av ett kovalent bundet kemis3c konju-gat enligt vilket som heist av patentkraven är 18 - 21 för 10 intracellular tillförsel av last i icke-terapeutiskt ända-mal,
23. DNA-molekyl, kännetecknad av att den be-stär av en nukleotidsekvens som kodar ett fusionsprotein enligt patentkrav 1 som är: 15 a) JB106 (SEQ ID nr 38), b) JB117 (SEQ ID nr 59), c) JB118 (SEQ ID nr 60), d) JB119 (SEQ ID nr 61) , e) JB120 (SEQ ID nr 62), 20 £) JB122 (SEQ ID nr 63) eller g) tat-VPl6R.GF (SEQ ID nr 58).
23. DMA-mölekyyli, joka käsittää nukleotidisekvens- 15. in, joka koodittaa patenttivaatimuksen 1 mukaista fuusio- proteiinia, joka on: a) 1B1Ö6 (sekvenssi tunnusnumero 38), b) JB117 (sekvenssi tunnusnumero 59) , g) JB118 (sekvenssi tunnusnumero 60), 20 d) JB119 (sekvenssi tunnusnumero 61), e) JB120 (sekvenssi tunnusnumero 62}, f) JB122 (sekvenssi tunnusnumero 63) tai g) tat-VP16R,GF (sekvenssi tunnusnumero 58) .
24. DNA-molekyl enligt patentkrav 23, känne-teeknad av att nukleotidsekvensen, som kodar fusionspro-teiriet, är funktionellt bunden till expressionskontrollsek- 25 venser.
24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen DNA-molekyyli, 25 tunnettu siitä, että fuusioproteiinia koodittava nukleo tidi sekvenssi on toimivalla tavalla liitetty ekspression kontrollisekvensseihin. I
25. Encellig värd, kännetecknad av att den är transformeräd med en DNA-molekyl enligt patentkrav 23 eller 24.
25. Yksisoluinen isäntä, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 23 tai 24 mukaisel- 30 la DNA-molekyylillä.
26. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen fuusio-proteiinin tuottamiseksi, joka on: a) JBIG6 (SEQ ID nro 38) , bj JB117 (SEQ ID nro 59) , 35 c) JB118 (SEQ ID nro 60), d) JB119 (SEQ ID nro 61) , 134 e) JB120 {SEQ ID nro 62}, f) JB122 (SEQ ID nro 63} tai g) HIV:n tat-proteiinin aminohapot 47 - 58, joita seuraa HSVln VPl6-proteiinin aminohapot 43 - 412, 5 tunnettu siitä, että a) viljellään patenttivaatimuksen 23 tai 24 mukaisella DNA-molekyylillä transformoitua yksisoluista isäntää ja b} kerätään fuusioproteiini mainitusta viljelmästä. 135 1... Fusionsprotein, sora bestir av en karboxiteivnina 1 lastdel och en aminoterminal transportdel, känneteck- 5. a t av att a) transportdelen karakteriseras av: i) fdrekomsten av HIV ta t -pr o te ine t s arainosvror 49 - 57, ii) avsaknaden av HIV tat-proteinets aminosyror 22 ~ 10 36 och iii) avsaknaden av HIV tat-proteinets aminosyror 73 - 86, och b) lastdelen bihehaller en vasentlig biologisk ak-tivitet. efter att den har forts in 1 cellen pä ett säti, 15 sora är beroende av transportdelen.
26. Forfarande för framställning av ett fusionspro- 30 tein enligt patentkrav 1, som är: a) JB106 (SEQ ID nr 38), b) JB117 (SEQ ID nr 59), c) JB118 (SEQ ID nr 60), d) JB119 (SEQ ID nr 61) , 35 e) JB120 (SEQ ID nr 62), f) JB122 (SEQ ID nr 63) eller 139 g) aminosyxör 47 - 58 av HIV tat-protein följd av aminosyror 43 - 412 av HSV VPl6-protein, kännetecknat av att a) man odlar en encellig värd transfomerad med en 5 DNA-molekyl enligt patentkrav 23 eller 24 och b) tillvarafcar fusiönsproteinet fran nämnda odling.
FI945248A 1992-08-21 1994-11-08 Tat-peräisiä kuljetuspolypeptidejä FI120495B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US93437592A 1992-08-21 1992-08-21
US93437592 1992-08-21
PCT/US1993/007833 WO1994004686A1 (en) 1992-08-21 1993-08-19 Tat-derived transport polypeptides
US9307833 1993-08-19

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI945248A0 FI945248A0 (fi) 1994-11-08
FI945248A FI945248A (fi) 1995-01-05
FI120495B true FI120495B (fi) 2009-11-13

Family

ID=25465458

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI945248A FI120495B (fi) 1992-08-21 1994-11-08 Tat-peräisiä kuljetuspolypeptidejä

Country Status (14)

Country Link
EP (3) EP0656950B1 (fi)
JP (2) JP2702285B2 (fi)
KR (1) KR0153027B1 (fi)
AT (1) ATE173016T1 (fi)
AU (1) AU667244B2 (fi)
CA (1) CA2135642C (fi)
DE (2) DE69321962T2 (fi)
DK (1) DK0656950T3 (fi)
ES (1) ES2123062T3 (fi)
FI (1) FI120495B (fi)
HK (1) HK1012678A1 (fi)
NO (1) NO316761B1 (fi)
NZ (1) NZ255831A (fi)
WO (1) WO1994004686A1 (fi)

Families Citing this family (114)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5219990A (en) * 1991-01-28 1993-06-15 Biogen, Inc. Papillomavirus e2 trans-activation repressors
US5861161A (en) 1994-09-07 1999-01-19 Universite De Montreal Chimeric proteins comprising a Vpr/Vpx virion incorporation domain for targeting into HIV-1 or HIV-2 virions
US5955593A (en) * 1996-09-09 1999-09-21 Washington University BH3 interacting domain death agonist
EP0972025A1 (en) 1997-01-21 2000-01-19 Human Genome Sciences, Inc. I-flice, a novel inhibitor of tumor necrosis factor receptor-1 and cd-95 induced apoptosis
CA2291074C (en) 1997-05-21 2008-04-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Composition and method for enhancing transport across biological membranes
CA2291483C (en) 1997-06-06 2012-09-18 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
GB9720585D0 (en) * 1997-09-26 1997-11-26 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US6589503B1 (en) 1998-06-20 2003-07-08 Washington University Membrane-permeant peptide complexes for medical imaging, diagnostics, and pharmaceutical therapy
US7306784B2 (en) 1998-06-20 2007-12-11 Washington University Membrane-permeant peptide complexes for medical imaging, diagnostics, and pharmaceutical therapy
US8038984B2 (en) 1998-06-20 2011-10-18 Washington University Membrane-permeant peptide complexes for treatment of sepsis
US6348185B1 (en) 1998-06-20 2002-02-19 Washington University School Of Medicine Membrane-permeant peptide complexes for medical imaging, diagnostics, and pharmaceutical therapy
WO2000038733A1 (en) * 1998-12-24 2000-07-06 Ucb S.A. Peptidic product, process and composition
DE19916224C1 (de) * 1999-04-10 2000-06-21 November Ag Molekulare Medizin Synthetisches biologisch aktives Molekül
US6730293B1 (en) 1999-08-24 2004-05-04 Cellgate, Inc. Compositions and methods for treating inflammatory diseases of the skin
EP1210121A2 (en) 1999-08-24 2002-06-05 Cellgate Inc. Enhancing drug delivery across and into epithelial tissues using oligo arginine moieties
US6669951B2 (en) 1999-08-24 2003-12-30 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into epithelial tissues
US7229961B2 (en) 1999-08-24 2007-06-12 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into ocular tissues
US6881825B1 (en) 1999-09-01 2005-04-19 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Identication of peptides that facilitate uptake and cytoplasmic and/or nuclear transport of proteins, DNA and virues
US6610820B1 (en) * 1999-10-12 2003-08-26 University Of Lausanne Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
US8183339B1 (en) 1999-10-12 2012-05-22 Xigen S.A. Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
US20040082509A1 (en) 1999-10-12 2004-04-29 Christophe Bonny Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
US20030108539A1 (en) * 2000-02-14 2003-06-12 Christophe Bonny Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
CA2396149A1 (en) * 2000-01-07 2001-07-12 Artemis Pharmaceuticals Gmbh Transduction of recombinases for inducible gene targeting
AU8466501A (en) 2000-07-21 2002-02-05 Essentia Biosystems Inc Multi-component biological transport systems
KR100379577B1 (ko) * 2000-07-26 2003-04-08 최수영 세포침투성 티에이티 - 인간 글루탐산 탈수소효소 융합단백질, 이 융합단백질을 코딩하는 재조합폴리뉴클레오타이드, 이 융합단백질의 발현벡터 및 이융합단백질을 세포 내로 도입하는 방법
KR100379578B1 (ko) * 2000-07-26 2003-04-08 최수영 세포침투성 티에이티-씨3 트랜스페라제 융합단백질, 이융합단백질의 발현벡터 및 티에이티-씨3 트랜스페라제를이용한 로 단백질의 생리적 기능 분석방법
WO2002020565A2 (en) 2000-09-08 2002-03-14 Universität Zürich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
US20050059031A1 (en) 2000-10-06 2005-03-17 Quantum Dot Corporation Method for enhancing transport of semiconductor nanocrystals across biological membranes
ATE437647T1 (de) 2001-02-16 2009-08-15 Cellgate Inc Transporter mit beabstandeten arginin-teilchen
CA2449802C (en) 2001-06-05 2012-02-07 Pola Chemical Industries Inc. Polypeptide for unstabilizing a protein in a cell under aerobic conditions and dna encoding the same
KR100495138B1 (ko) * 2001-07-31 2005-06-14 학교법인 한림대학교 식물세포 투과 도메인-화물분자 복합체
EP1427856B1 (en) 2001-09-18 2011-05-11 Carnegie Institution Of Washington Fusion proteins useful for detecting analytes
WO2003035892A2 (en) * 2001-10-19 2003-05-01 The Scripps Research Institute Novel methods for introducing molecules into cells and vectors and compositions for use in such methods
CA2471762C (en) 2002-01-09 2010-08-17 University Of Lausanne Cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway
US7026166B2 (en) 2002-01-22 2006-04-11 Chiron Corporation Fluorogenic dyes
WO2003086470A2 (en) * 2002-04-17 2003-10-23 Deutsches Krebsforschungszentrum Smac-peptides as therapeutics against cancer and autoimmune diseases
EP1354953A1 (en) * 2002-04-17 2003-10-22 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Smac-peptides as therapeutics against cancer and autoimmune diseases
CA2482598C (en) 2002-04-22 2012-09-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Peptide inhibitors of protein kinase c
KR100472939B1 (ko) * 2002-05-24 2005-03-18 학교법인 한림대학교 세포침투성 티에이티-피리독살 카이네이즈 융합단백질 및그 용도
WO2004009665A2 (en) 2002-07-19 2004-01-29 The Regents Of The University Of California Dendrimers as molecular translocators
KR100472938B1 (ko) * 2002-10-31 2005-03-11 학교법인 한림대학교 세포침투 효율을 향상시킨 수송도메인-목표단백질-수송도메인 융합단백질 및 그 용도
US7704756B2 (en) 2003-01-21 2010-04-27 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Fluorogenic dyes
DK2351844T3 (da) 2003-04-29 2014-09-22 Sarepta Therapeutics Inc Præparater til forøgelse af transport- og antisense-effektivitet af nukleinsyreanalog i celler
WO2005035562A1 (ja) * 2003-10-07 2005-04-21 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. 新規な細胞増殖促進剤
ES2324538T3 (es) 2003-12-05 2009-08-10 Multimmune Gmbh Anticuerpos anti-hsp terapeuticos y de diagnostico.
US9211248B2 (en) 2004-03-03 2015-12-15 Revance Therapeutics, Inc. Compositions and methods for topical application and transdermal delivery of botulinum toxins
SG150570A1 (en) 2004-03-03 2009-03-30 Revance Therapeutics Inc Compositions and methods for topical diagnostic and therapeutic transport
US20050288246A1 (en) 2004-05-24 2005-12-29 Iversen Patrick L Peptide conjugated, inosine-substituted antisense oligomer compound and method
JP4474264B2 (ja) * 2004-08-20 2010-06-02 生寶生物科技股▲ふん▼有限公司 子宮頸癌抑制の融合蛋白
EP1793847A2 (en) 2004-09-21 2007-06-13 NascaCell IP GmbH Use of microproteins as tryptase inhibitors
JP4596391B2 (ja) 2005-02-10 2010-12-08 国立大学法人大阪大学 細胞透過性ペプチド
DK1988167T3 (da) * 2005-02-17 2020-07-13 Univ Sorbonne Intracellulære inhiberende peptider
CN102499981B (zh) 2005-03-03 2016-08-03 雷文斯治疗公司 用于局部施用和经皮肤递送肉毒杆菌毒素的组合物和方法
ZA200707351B (en) 2005-03-03 2010-02-24 Revance Therapeutics Inc Compositions and methods for topical application and transdermal delivery of an oligopeptide
EP1861417B1 (en) 2005-03-10 2013-05-15 BioNTech AG Dimeric or multimeric microproteins
KR100699279B1 (ko) 2005-04-28 2007-03-23 학교법인 포항공과대학교 당 또는 당 유사체를 골격으로 하는 분자 수송체 및 그의제조방법
US7973084B2 (en) 2005-04-28 2011-07-05 Postech Academy-Industrial Foundation Molecular transporters based on alditol or inositol and processes for the preparation thereof
US8067571B2 (en) 2005-07-13 2011-11-29 Avi Biopharma, Inc. Antibacterial antisense oligonucleotide and method
US8080517B2 (en) 2005-09-12 2011-12-20 Xigen Sa Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
WO2007031098A1 (en) 2005-09-12 2007-03-22 Xigen S.A. Cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway
US8883507B2 (en) 2005-10-18 2014-11-11 The Regents Of The University Of Colorado Conditionally immortalized long-term hematopoietic stem cells and methods of making and using such cells
US7517959B2 (en) 2005-11-11 2009-04-14 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research SOCS3 proteins
SG177954A1 (en) 2007-01-05 2012-02-28 Univ Zuerich Method of providing disease-specific binding molecules and targets
PT2457928T (pt) 2007-03-13 2017-08-17 Univ Zuerich Anticorpo monoclonal humano específico de tumores
AU2008224950B2 (en) 2007-03-13 2013-10-03 National Jewish Medical And Research Center Methods for generation of antibodies
US20110038865A1 (en) 2007-06-26 2011-02-17 University Of Miami Antibody- endostatin fusion protein and its variants
US20100016215A1 (en) 2007-06-29 2010-01-21 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating myotonic dystrophy
CA2694046C (en) 2007-07-26 2023-09-12 Revance Therapeutics, Inc. Cationic peptides and compositions thereof
WO2009033743A1 (en) 2007-09-13 2009-03-19 University Of Zurich Prorektorat Forschung Monoclonal amyloid beta (abeta)-specific antibody and uses thereof
US7935816B2 (en) 2007-10-25 2011-05-03 Gene Tools, Llc Molecular transporter compositions comprising dendrimeric oligoguanidine with a triazine core that facilitate delivery into cells in vivo
KR101585046B1 (ko) 2008-02-28 2016-01-13 도레이 카부시키가이샤 경비 투여용 의약 조성물
KR101803099B1 (ko) 2008-05-16 2017-11-30 타이가 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 항체 및 그 제조 방법
WO2009143865A1 (en) 2008-05-30 2009-12-03 Xigen S.A. Use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases
WO2009143864A1 (en) 2008-05-30 2009-12-03 Xigen S.A. Use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of chronic or non-chronic inflammatory digestive diseases
ES2525411T3 (es) 2008-07-21 2014-12-22 Taiga Biotechnologies, Inc. Células anucleadas diferenciadas y método para preparar las mismas
CA2735710A1 (en) 2008-08-04 2010-02-11 Glen N. Barber Sting (stimulator of interferon genes), a regulator of innate immune responses
JP5812861B2 (ja) 2008-08-28 2015-11-17 タイガ バイオテクノロジーズ，インク． Ｍｙｃの修飾物質、該ｍｙｃの修飾物質を使用する方法、およびｍｙｃを調節する薬剤を同定する方法
WO2010072228A1 (en) * 2008-12-22 2010-07-01 Xigen S.A. Novel transporter constructs and transporter cargo conjugate molecules
BRPI1008230B1 (pt) 2009-05-20 2019-05-28 Toray Industries, Inc. Peptídeo de penetração celular e composição farmacêutica
US20130079382A1 (en) 2009-10-12 2013-03-28 Larry J. Smith Methods and Compositions for Modulating Gene Expression Using Oligonucleotide Based Drugs Administered in vivo or in vitro
WO2011160653A1 (en) 2010-06-21 2011-12-29 Xigen S.A. Novel jnk inhibitor molecules
CN105457016B (zh) 2010-09-22 2022-06-24 科罗拉多大学董事会 Smad7的治疗应用
US9150618B2 (en) 2010-10-14 2015-10-06 Xigen Inflammation Ltd. Use of cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway for the treatment of chronic or non-chronic inflammatory eye diseases
PT2663580T (pt) 2011-01-10 2017-03-10 Univ Zuerich Terapêutica de associação incluindo anticorpos de ligação a antigénios associados a tumores
EP2704749A1 (en) 2011-05-05 2014-03-12 Sarepta Therapeutics, Inc. Peptide oligonucleotide conjugates
US9161948B2 (en) 2011-05-05 2015-10-20 Sarepta Therapeutics, Inc. Peptide oligonucleotide conjugates
WO2012163769A1 (en) 2011-06-03 2012-12-06 Ct Atlantic Ltd. Magea3 binding antibodies
WO2012163771A1 (en) 2011-06-03 2012-12-06 Ct Atlantic Ltd. Magea3 binding antibodies
DE202011103324U1 (de) 2011-07-12 2012-01-02 Nekonal S.A.R.L. Therapeutische anti-TIRC7 Antikörper für die Verwendung in Immun und anderen Krankheiten
WO2013091670A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 Xigen S.A. Novel jnk inhibitor molecules for treatment of various diseases
US20150030602A1 (en) 2011-12-23 2015-01-29 Phenoquest Ag Antibodies for the treatment and diagnosis of affective and anxiety disorders
CA2861793C (en) 2011-12-28 2023-08-01 Immunoqure Ag Method of providing monoclonal auto-antibodies with desired specificity
EP3868387A1 (en) 2012-07-20 2021-08-25 Taiga Biotechnologies, Inc. Enhanced reconstitution and autoreconstitution of the hematopoietic compartment
WO2014138670A1 (en) 2013-03-08 2014-09-12 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Ptd-smad7 therapeutics
US9365825B2 (en) 2013-03-11 2016-06-14 Taiga Biotechnologies, Inc. Expansion of adult stem cells in vitro
US10272115B2 (en) 2013-03-11 2019-04-30 Taiga Biotechnologies, Inc. Production and use of red blood cells
AU2014249045A1 (en) 2013-03-11 2015-10-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Delivery of CARD protein as therapy for occular inflammation
WO2015197097A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 Xigen Inflammation Ltd. New use for jnk inhibitor molecules for treatment of various diseases
US10624948B2 (en) 2013-06-26 2020-04-21 Xigen Inflammation Ltd. Use of cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway for the treatment of various diseases
WO2014206427A1 (en) 2013-06-26 2014-12-31 Xigen Inflammation Ltd. New use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases
US10112995B2 (en) 2013-07-03 2018-10-30 Immunoqure Ag Human anti-IFN-α antibodies
AU2015229381B2 (en) 2014-03-11 2019-11-07 University Of Florida Research Foundation, Inc. Use of AAV-expressed M013 protein as an anti-inflammatory therapeutic
JP6468722B2 (ja) * 2014-04-30 2019-02-13 日本信号株式会社 物体検出装置
CA2987877A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 Medigene Immunotherapies Gmbh T-cell receptor specific antibodies
WO2016193299A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 Medigene Immunotherapies Gmbh T cell receptor library
AU2016273214B2 (en) 2015-06-01 2018-10-18 Medigene Immunotherapies Gmbh Method for generating antibodies against T cell receptor
EP3302489A4 (en) 2015-06-04 2019-02-06 Sarepta Therapeutics, Inc. METHOD AND COMPOUNDS FOR THE TREATMENT OF DISEASES AND SUFFERING IN CONNECTION WITH LYMPHOCYTES
JP6864364B2 (ja) 2015-06-11 2021-04-28 学校法人慶應義塾 融合タンパク質又は複合タンパク質、細胞内送達用担体、部分ペプチド、細胞膜透過促進剤、ｄｎａ、及びベクター
DK3394247T3 (da) 2015-12-23 2021-04-12 Medigene Immunotherapies Gmbh Ny generering af antigen-specifikke tcr'er
WO2018102678A1 (en) 2016-12-02 2018-06-07 Taiga Biotechnologies, Inc. Nanoparticle formulations
KR102552428B1 (ko) 2016-12-19 2023-07-06 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 근육 이상증에 대한 엑손 스킵핑 올리고머 결합체
US10149898B2 (en) 2017-08-03 2018-12-11 Taiga Biotechnologies, Inc. Methods and compositions for the treatment of melanoma
JP7489319B2 (ja) 2018-09-26 2024-05-23 株式会社カネカ 細胞膜透過性ペプチド
JPWO2022154079A1 (fi) * 2021-01-18 2022-07-21

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU658818B2 (en) * 1989-12-21 1995-05-04 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Method of delivering molecules into eukaryotic cells using tat protein conjugate
US5219990A (en) 1991-01-28 1993-06-15 Biogen, Inc. Papillomavirus e2 trans-activation repressors

Also Published As

Publication number Publication date
EP0903408A3 (en) 2005-11-02
NO944273L (no) 1995-02-17
EP0656950B1 (en) 1998-11-04
DE69321962T2 (de) 1999-07-01
FI945248A0 (fi) 1994-11-08
FI945248A (fi) 1995-01-05
NO944273D0 (no) 1994-11-09
EP0903408A2 (en) 1999-03-24
EP2000536A3 (en) 2010-06-30
DK0656950T3 (da) 1999-07-19
DE656950T1 (de) 1996-03-14
AU5083293A (en) 1994-03-15
NZ255831A (en) 1997-04-24
DE69321962D1 (de) 1998-12-10
KR0153027B1 (en) 1998-10-15
JPH1033186A (ja) 1998-02-10
WO1994004686A1 (en) 1994-03-03
CA2135642A1 (en) 1994-03-03
ES2123062T3 (es) 1999-01-01
EP0656950A1 (en) 1995-06-14
NO316761B1 (no) 2004-05-03
ATE173016T1 (de) 1998-11-15
EP2000536A2 (en) 2008-12-10
AU667244B2 (en) 1996-03-14
JP2869396B2 (ja) 1999-03-10
CA2135642C (en) 1999-12-14
JP2702285B2 (ja) 1998-01-21
JPH07503617A (ja) 1995-04-20
HK1012678A1 (en) 1999-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI120495B (fi) Tat-peräisiä kuljetuspolypeptidejä
US6316003B1 (en) Tat-derived transport polypeptides
US11859247B2 (en) Enzyme-pore constructs
AU688746B2 (en) Synthetic polynucleotides
US5804604A (en) Tat-derived transport polypeptides and fusion proteins
US5747641A (en) Tat-derived transport polypeptide conjugates
CN101133163B (zh) 修饰的2，4-二氧四氢蝶啶合酶的分离的嵌合蛋白
CN107580503B (zh) 用于治疗细菌感染的杀菌剂与亲溶酶体碱化剂的组合
US5159062A (en) Signal peptide for the secretion of peptides in escherichia coli
AU636537B2 (en) Improvement of the yield when disulfide-bonded proteins are secreted
WO1993018141A1 (en) Thrombin receptor antagonists
Alexander et al. Proteolytic processing of avian sarcoma and leukosis viruses pol-endo recombinant proteins reveals another pol gene domain
CN109609538A (zh) 一种预防h7n9病毒感染的口服疫苗及其制备方法
CN112912112A (zh) 肝特异性核酸调节元件以及其方法及用途
CN111788215B (zh) 抗体和生理活性物质的缀合方法
CA2139517A1 (en) Immunological conjugates of ompc and hiv-specific selected principal neutralization epitopes
JP2974348B2 (ja) ヘモフイルス インフルエンザｂ型の膜タンパク及びペプチド
KR100217809B1 (ko) 재조합 bcg 백신
CN109957560B (zh) 一种具有蛋白酶活性的多肽及其应用
CN112921007A (zh) 用于预防猫感染新冠病毒的重组腺相关病毒及其构建方法和应用
CN107937429B (zh) CRIPSR/Cas9***中重组sgRNA骨架载体的构建方法
HODGE et al. Oligomerization of the HIV type 2 Nef protein: mutational analysis of the heptad leucine repeat motif and cysteine residues
CN114539425B (zh) 一种提高线性多肽生物表达的方法
KR20230146330A (ko) NamH 단백질 발현용 재조합 벡터 및 이를 이용한 NamH 단백질의 생산 방법
Kolli et al. A synthetic dengue virus antigen elicits enhanced antibody titers when linked to, but not mixed with, Mycobacterium tuberculosis HSP70 domain II

Legal Events

Date Code Title Description
HC Name/ company changed in application

Owner name: ALLIBERT EQUIPEMENT

FD Application lapsed
PC Transfer of assignment of patent

Owner name: BIOGEN IDEC MA INC.

Free format text: BIOGEN IDEC MA INC.

FG Patent granted

Ref document number: 120495

Country of ref document: FI

MA Patent expired