FI119176B - Lääkeyhdistelmä, joka on käyttökelpoinen eksogeenien transfektioon ja ilmentämiseen in vivo - Google Patents
Lääkeyhdistelmä, joka on käyttökelpoinen eksogeenien transfektioon ja ilmentämiseen in vivo Download PDFInfo
- Publication number
- FI119176B FI119176B FI973323A FI973323A FI119176B FI 119176 B FI119176 B FI 119176B FI 973323 A FI973323 A FI 973323A FI 973323 A FI973323 A FI 973323A FI 119176 B FI119176 B FI 119176B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- adenovirus
- combination according
- gene
- pharmaceutical combination
- recombinant dna
- Prior art date
Links
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 238000001890 transfection Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 40
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 title claims description 10
- 230000003721 exogen phase Effects 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 146
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims abstract description 124
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 31
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 claims abstract description 19
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 30
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 24
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 18
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 18
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 16
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 16
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 13
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 claims description 10
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 claims description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 8
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 claims description 6
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 claims description 5
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 claims description 5
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 claims description 5
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 claims description 5
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 claims description 4
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 claims description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 4
- QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N Tacrolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1\C=C(/C)[C@@H]1[C@H](C)[C@@H](O)CC(=O)[C@H](CC=C)/C=C(C)/C[C@H](C)C[C@H](OC)[C@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)O[C@@]2(O)C(=O)C(=O)N2CCCC[C@H]2C(=O)O1 QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N 0.000 claims description 4
- LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N azathioprine Chemical compound CN1C=NC([N+]([O-])=O)=C1SC1=NC=NC2=C1NC=N2 LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960002170 azathioprine Drugs 0.000 claims description 4
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 3
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 claims description 3
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 claims description 3
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 claims description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 3
- 108700022375 Human herpesvirus 1 VP23 Proteins 0.000 claims description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 claims 2
- 241000283903 Ovis aries Species 0.000 claims 1
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 80
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 41
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 35
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 33
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 11
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 11
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 6
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 6
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 6
- 102100038909 Caveolin-2 Human genes 0.000 description 5
- 101000740981 Homo sapiens Caveolin-2 Proteins 0.000 description 5
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 5
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 4
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 4
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 4
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 4
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 101150067954 B15R gene Proteins 0.000 description 3
- 102100035888 Caveolin-1 Human genes 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 3
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 3
- 101000715467 Homo sapiens Caveolin-1 Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 101150039910 UL18 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 101150067964 BcRF1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000701157 Canine mastadenovirus A Species 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 108090000368 Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 101150044134 US28 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 230000035990 intercellular signaling Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 102000005162 pleiotrophin Human genes 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 101150072531 10 gene Proteins 0.000 description 1
- PXKSAXUKRMRORY-ZWKOTPCHSA-N 2-(3,4-dichlorophenyl)-n-[(1s,2r)-2-(2,5-dihydropyrrol-1-yl)cyclohexyl]-n-methylacetamide Chemical compound N1([C@@H]2CCCC[C@@H]2N(C)C(=O)CC=2C=C(Cl)C(Cl)=CC=2)CC=CC1 PXKSAXUKRMRORY-ZWKOTPCHSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 1
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 1
- 101150039990 B13R gene Proteins 0.000 description 1
- 101150023320 B16R gene Proteins 0.000 description 1
- 101150006352 B18R gene Proteins 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100232885 Cowpox virus (strain Brighton Red) CPXV209 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012605 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Human genes 0.000 description 1
- 108010079245 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000004038 Glia Maturation Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000495 Glia Maturation Factor Proteins 0.000 description 1
- 206010048748 Graft loss Diseases 0.000 description 1
- 101710155188 Hexon-interlacing protein Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101000764622 Homo sapiens Transmembrane and immunoglobulin domain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101900102284 Human herpesvirus 1 ICP47 protein Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000049772 Interleukin-16 Human genes 0.000 description 1
- 101800003050 Interleukin-16 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100037792 Interleukin-6 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 108700005092 MHC Class II Genes Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 241000701168 Murine adenovirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101100007739 Neosartorya fumigata (strain ATCC MYA-4609 / Af293 / CBS 101355 / FGSC A1100) crmA gene Proteins 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 101100091964 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cyt-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 1
- 241000188845 Porcine adenovirus Species 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101100379247 Salmo trutta apoa1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100032889 Sortilin Human genes 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 102100026224 Transmembrane and immunoglobulin domain-containing protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100028748 Transportin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 101100004091 Vaccinia virus (strain Copenhagen) B15R gene Proteins 0.000 description 1
- 101100316831 Vaccinia virus (strain Copenhagen) B18R gene Proteins 0.000 description 1
- 101100340726 Vaccinia virus (strain Western Reserve) VACWR197 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100004099 Vaccinia virus (strain Western Reserve) VACWR200 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 241000701792 avian adenovirus Species 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000004106 carminic acid Substances 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 101150067246 crmA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007108 local immune response Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000006884 silylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 α-1ΑΤ Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
! 119176 Lääkeyhdistelmä, joka on käyttökelpoinen eksogeenlen transfaktioon ja ilmentämiseen in vivo
Esillä oleva keksintö koskee geeniterapian aluetta 5 ja etenkin adenoviruksen käyttöä terapeuttisesti kiinnostavan geenin ilmentämiseksi. Keksintö koskee tarkemmin ottaen geneettistä alkuperää olevien patologioiden uutta hoitomuotoa, joka perustuu kahden eri tyyppisen terapeuttisen aineen yhdistettyyn käyttöön.
10 Geeniterapiassa korjataan vajaus tai epänormaalius (mutaatio, poikkeava ilmentyminen jne.) viemällä sairastuneeseen soluun tai elimeen geneettistä tietoa. Tämä tieto voidaan viedä joko in vitro tai ex vivo elimestä uutettuun soluun, minkä jälkeen modifioitu solu palaute-15 taan organismiin, tai suoraan in vivo sopivaan kudokseen. Tässä jälkimmäisessä tapauksessa on olemassa erilaisia fysikaalisia transfektointitekniikoita, joista mainittakoon virusten käyttö vektoreina. Tässä suhteessa on testattu erilaisia viruksia niiden kyvyn suhteen tartuttaa 20 tiettyjä solupopulaatioita. Erityisesti mainittakoon ret-rovirukset (RSV, HMS, MMS jne.), HSV-virus, adenoliittei- ·*·*: set virukset ja adenovirukset.
• * .'.J Näistä viruksista adenoviruksi 11a on tiettyjä kiin- • · nostavia ominaisuuksia silmällä pitäen käyttöä geenitera- • · ··.·, 25 piassa. Niiden isäntävalikoima on suhteellisen laaja, ne • · j. * kykenevät tartuttamaan lepotilassa olevia soluja eivätkä • · · ne integroidu tartutetun solun genomiin. Adenovirukset • · * *·* * ovat lineaarisia kaksisäikeisiä DNA-viruksia, joiden koko on noin 36 ke. Niiden genomi käsittää etenkin toistuvan • · :.V 30 käänteisen sekvenssin (ITR) päässään, kapsidaatiosekvens- * · · :.,.ί sin, varhaisgeenit ja myöhäisgeenit (vrt. kuvio 1). Pää- : asialliset varhaisgeenit ovat geenit El (Elä ja Elb) , E2, • · · E3 ja E4. Pääasialliset myöhäisgeenit ovat geenit LI - L5.
• ·
Ottaen huomioon adenovirusten edellä mainitut omi- • · · : *.· 35 naisuudet niitä on jo käytetty geenien siirtämiseksi in • · Φ * · • · · • · o 2 119176 vivo. Tässä tarkoituksessa on valmistettu erilaisia ade-novirusperäisiä vektoreita, jotka sisältävät erilaisia geenejä (β-gal, OTC, α-1ΑΤ, sytokiinit jne.). Kussakin näistä rakenteista adenovirusta on modifioitu sen tekemä-5 seksi kykenemättömäksi replikoitumaan tartutetussa solussa. Täten alan teknisen tason puitteissa kuvatut rakenteet ovat adenoviruksia, joista on deletoitu alueet El (Elä ja/tai Elb) ja mahdollisesti E3, joille on insertoi-tu heterologinen DNA-sekvenssi [Levrero et, ai. . Gene 101 10 (1991) 195; Gosh-Choudhury et ai., Gene 50 (1986) 161] .
Kuitenkin kuten kaikille tunnetuille viruksille, villiadenoviruksen [Routes £t ai.. J. Virol. 65 (1991) 1450] tai replikaation suhteen defektiivisen yhdistelmä-DNA-adenoviruksen [Yang et ai.. PNAS (1994) 4407] antami-15 nen indusoi merkittävän immuunivasteen.
Immuunijärjestelmän ensisijainen päämäärä on yksilön integriteetin tai "itsen" integriteetin säilyttäminen. Tästä seuraa tartuttavien aineiden eliminointi kuten myös siirrännäisten ja kasvainten hylkiminen kuitenkaan 20 ilman, että organismin nämä tehokkaast puolustusmekanismit kääntyisivät organismia itseään vastaan ja synnyttää- ·*·': sivät autoimmuunisairauksia. Tämä ei-vastetila "itsen" • * : antigeeneille vieraiden antigeenien tullessa eliminoi- • · ♦·,·. duiksi määritellään fysiologisen toleranssin tilaksi.
• * .»I 25 Vieraiden aineiden poistamiseksi immuunijärjestelmän ke- • · * hittää kahden tyyppisiä mekanismeja. Ensimmäinen on B- • · 'M" lymfosyyttien spesifisten vasta-aineiden tuotanto; puhu- • « · *·’ * taan humoraalisesta immuniteetista. Nämä vasta-aineet si tovat antigeenin ja joko inaktivoivat sen tai poistavat • · \V 30 sen organismista. Toinen puolustusmekanismi liittyy solu- * * · ί.,,ϊ immuniteettiin ja hyödyntää T-lymfosyyttej ä, ja näistä : 1*. sytotoksisia T-lymfosyyttejä, jotka käsittävät spesifisen i * t reseptorin kyseessä olevalle antigeenille. Jotta T-resep- * · *;* tori tunnistaisi antigeenin, tämän on ilmennyttävä yhdis- ·· · • V 35 tyneenä proteiineihin, joita koodittavat luokan I tai • · • ♦ · • ·* ♦ * 3 119176 luokan II pääasiallisen histokompabiliteettikompleksin eli CMH:n geenit.
Tästä seurauksena tämä tartutettuja soluja vastaan kehittyvä immuunivaste muodostaa tärkeän esteen virusvek-5 torien käytölle geeniterapiassa, koska (i) indusoidessaan tartutettujen solujen tuhoa se rajoittaa terapeuttisen geenin ilmentymisen kestoa ja siten terapeuttista vaikutusta, (ii) se indusoi rinnakkaisesti merkittävän tuleh-dusvasteen ja (iii) siitä seuraa tartutettujen solujen 10 nopea eliminointi toistuvien ruiskeiden jälkeen. Tulee huomata, että tämän immuunivasteen laajuus tartutettuja soluja vastaan vaihtelee ruiskeen kohteena olevan elimen luonteen ja käytetyn ruiskutusmuodon funktiona. Näin β-galaktosidaasin, jonka koodittaa immuunikompetenttien 15 hiirten lihakseen annettu yhdistelmä-DNA-adenovirus, ilmentyminen on laskenut minimitasolle 40 päivän kuluttua ruiskeesta [Kass-Eisler et ai. . PNAS 90 (1993) 11498] .
Samoin adenoviruksilla maksaan transfektoitujen geenien ilmentyminen laskee merkittävästi ruisketta seuraavina 10 20 päivänä [Yang, Y., et ai.. Immunity 1 (1994) 433 - 442] ja hemofiilisten koirien maksasoluihin adenoviruksella siir-·1.1. retyn tekijä-IX:n ilmentyminen on kadonnut 100 päivän ku- .1. : luttua ruiskeesta [Kay et ai. . PNAS 91 (1994) 2353] .
Silmällä pitäen adenovirusperäisten vektorien hyö- • · 25 dyntämistä geeniterapiassa vaikuttaa siten välttämättö- • · t. 1 mältä kontrolloida niitä tai niiden tartuttamia soluja ♦ · vastaan kehittyvää immuunivastetta.
• ♦ · *♦1 1 Edeltävästä ilmenee, että immuunijärjestelmän ak tivoituminen edellyttää ennalta, että immuunijärjestelmä • ♦ V." 30 tunnistaa organismille vieraita elementtejä (ei-itse tai :)2: modifioitu itse)kuten adenovirusperäisiä vektoreita, jot- l ]·, ka normaaleissa oloissa tulisi tuhota. Viime vuosina on • 1 1 *11.1 kehitetty immunologisen intervention strategioita, joiden "2 päämääränä on luoda "salliva" immuuniympäristö, eli indu- • · · • · • · · • · · • · 2 • · i 119176 soida toleranssin tila, edellä määriteltyihin vieraisiin antigeeneihin nähden.
Juuri tähän puuttuu esillä oleva keksintö. Keksinnön päämääränä on estää adenovirusten nopea eliminaatio 5 tartutetuista soluista ja siten siis pidentää niiden käsittämän terapeuttisen geenin ilmentymisaikaa in vivo.
Vast'ikään hakijat ovat osoittaneet, että tiettyjä geenejä tartutetuissa soluissa ko-ilmentämällä kyetään indusoimaan immuunisuojavaikutus ja siten kadottaa vekto-10 rit ja/tai tartutetut solut immuunijärjestelmältä. On etenkin kehitetty adenoviruksia, joissa terapeuttisesti kiinnostavan geenin ilmentyminen on kytketty immuunisuo-jageenin ilmentymiseen (FR-julkaisu 94 12 346). Kyseessä voi etenkin olla geeni, jonka tuote vaikuttaa pääasialli-15 sen histokompabiliteettikompleksin (MHC) aktiivisuuteen tai sytokiinien aktiivisuuteen, jolloin on mahdollista vähentää huomattavasti immuunireaktioita tai jopa tukahduttaa täysin kaikki immuunireaktiot vektoria tai tartutettuja soluja vastaan. Ne inhiboivat ainakin osittain 20 MHC-proteiinien ilmentymisen tai antigeenipresentaation, mistä edullisena seurauksena immuunireaktio vektoria tai tartutettuja soluja vastaan vähenee huomattavasti ja te- • · .·. : rapeuttisen vaikutuksen kesto siten pitenee.
• ♦·
Odottamattomasti hakijat ovat osoittaneet, että on • · I. I 25 mahdollista pidentää merkittävästi tällaisen vektorin te- « « « ·, ** rapeuttisen kestoa yhdistämällä siihen immunosuppressori.
♦ · • ** Kyseessä olevan vektorin eliminaatio ja/tai tartutettujen ··· *.* * solujen tuhoaminen immuunijärjestelmän toimesta hidastuu selvästi enemmän, kuin mitä voitaisiin odottaa mainitun • · '•/‘S 30 vektorin ja immunosuppressorin immuunisuojavaikutus ten :***: yksinkertaisesti limittyessä. Edullisesti esillä olevan ··· . \ keksinnön kohteena oleva lääkeyhdistelmä indusoi immuuni- * · järjestelmän "pseudo-inertia"-ilmiön, joka on suotuinen « · '*;·* terapeuttisen geenin pitkäaikaiselle ilmentymiselle.
· * t * * • · • • · • * · • · · • · 5 119176
Keksinnön tarkoituksessa immunosuppressorilla tarkoitetaan mitä tahansa yhdistettä, joka kykenee inhiboimaan osittain tai kokonaan vähintään yhden immuunisig-nallointireitin. Yleensä ottaen immunosuppressoreja käy-5 tetään tavanomaisesti kudos/elinsiirroissa tarkoituksena estää siirteen hyijintä, sekä tiettyjen autoimmuunisairauksien hoidossa. Tavanomaisesti käytettyjä tuotteita ovat joko kemialliset immunosuppressorit kuten kortiko-steroidit, atsatiopriini, syklosporiini, FK506 tai biolo-10 giset immunosuppressorit kuten polyklonaaliset tai monoklonaaliset vasta-aineet. Immunosuppressorien ensimmäisen luokan jäsenet ja niistä erityisesti syklosporiini ja FK506 inhiboivat merkittävällä tavalla sytokiinien kuten interleukiini-2:n tuotantoa, joiden rooli lymfosyyttien 15 differentiaatiossa ja lisääntymisessä on oleellinen. Valitettavasti ollakseen tehokkaita tämän tyyppisiä immuu-nisuppressoreita on annettava jatkuvasti, jolloin enemmän tai vähemmän pitkäaikaisessa käytössä törmätään niiden myrkyllisyyden aiheuttamaan ongelmaan. Täten atsatiopriini 20 mahdollisesti tuhoaa luuydintä ja syklosporiini on myrkyllistä munuaisille ja voi lisäksi johtaa liian kor- ·*·*; keaan verenpaineeseen tai neurologisiin häiriöihin.
• « : Mitä tulee erityisemmin vasta-aineisiin, kyseessä • ·· i · t ovat vasta-aineet, jotka kohdistuvat vastaan immuunijär- • * j. ! 25 jestelmän imusoluja. Immunosuppressorina käytetty ensim- * · *. * mäinen vasta-aine on anti-CD3, joka kohdistuu vastaan T- • · *te” lymfosyyttejä. Sen kohteena on yksi CD3-molekyylin poly- • · · *·* ’ peptidiketjuista, joka muodostaa reseptorin T-soluanti- geenille. Seuraa vasta-aineen tunnistamien T CD3+ -solujen ♦ · V.: 30 funktion inaktivoituminen. Meitä tässä kiinnostavassa ongelmassa tämän tyypin immunosuppressorin antaminen yh- • ]·, dessä terapeuttisen geenin sisältävän yhdistelmä-DNA-ade- • ♦ · Ύ..‘ noviruksen kanssa salpaisi isännän immuunireaktion virus- • · *** vektoria ja/tai sen tartutettujen solujen pinnalla ilmen- ·· ♦ • *.ί 35 tyviä tuotteita vastaan. Saman periaatteen mukaan voidaan • · • · » • ·♦ • · 6 119176 hyödyntää vasta-aineita anti~CD4, -CD2, -CD8, -CD28, -B7, -ICAM-1 ja -LFA-1.
Hakija on nyt kehittänyt uuden hoitomuodon, joka on erityisen tehokas immuunijärjestelmäreaktion hidasta-5 miseksi merkittävällä tavalla tai jopa inhiboimiseksi myrkyllisyysongelmia tuottamatta.
Tarkemmin ottaen esillä oleva keksintö on seurausta erityisen merkittävän synergistisen vaikutuksen osoittamisesta, joka liittyy yhdistelmä-DNA-adenoviruksen ja 10 vähintään yhden immunosuppressorin yhdistettyyn käyttöön, jossa terapeuttisesti kiinnostavan geenin ilmentyminen on kytketty immunosuojageenin ilmentymiseen edellä kuvatun mukaisesti.
Esillä olevan keksinnön ensimmäinen kohde on siis 15 vähintään yhden immunosuppressorin ja vähintään yhden yhdistelmä-DNA-adenoviruksen lääkeyhdistelmä, jossa yh-distelmä-DNA-adenovirusgenomi käsittää ensimmäisen yhdis-telmä-DNA:n, joka sisältää terapeuttisen geenin, ja toisen yhdistelmä-DNA:n, joka sisältää immunosuojageenin, 20 ajallisesti toisiaan seuraavaan, ajoittaiseen ja/tai sa manaikaiseen käyttöön, jolloin mainittu lääkeyhdistelmä on I’·’· käyttökelpoinen eksogeenien transfektioon in vivo ja/tai • · .·. ; ex vivo.
* ·· • · :v. Kuten edellä mainittiin, keksintö pohjaa etenkin • · 25 synergistisen vaikutuksen osoittamiseen immunosuppressorin • · * aktiivisuuden ja terapeuttisen geenin ilmentymisen päällä * · ilmennetyn immunosuojageenin vaikutuksen välillä.
• · *·* * Tämä yhdistetty käyttö mahdollistaa ajallisesti selvästi pidentyneen terapeuttisen vaikutuksen ja siinä • · V,: 30 tarvitaan edullisesti merkittävästi piennettyjä annoksia etenkin immunosuppressoria.
• *m·' Kuten jäljempänä esitetään, esillä olevan keksin- • · · "I.* nön mukaisen yhdistetyn hoidon kahta aineosaa voidaan • · "* käyttää ajallisesti toisiaan seuraten, ajoittain ja/tai
·· I
• *t! 35 samanaikaisesti. Edullisesti immunosuppressoria ruisku- • 4 4 4 4 * 4 · « · 7 119176 tetaan ennen adenovirusruisketta ja sen jälkeen. Esillä olevan keksinnön tämän suoritusmuodon mukaan immunosup-pressoria voidaan antaa ajallisesti jaetusti ja edullisemmin säännöllisesti toistaen. Tässä erityistapauksessa ky-5 seiset kaksi aineosaa valmistellaan erikseen. Samanaikaisessa annossa ne voidaan sekoittaa juuri ennen niiden antamista yhdessä tai päinvastoin ne voidaan antaa samanaikaisesti mutta erikseen. Erityisesti näiden kahden aineen antotiet voivat poiketa toisistaan.
10 Esillä olevan keksinnön mukaan immunosuppressorina voidaan käyttää mitä tahansa yhdistettä, joka kykenee inhiboimaan osittain tai kokonaisuudessaan vähintään yhden immuunisignallointireitin. Se voidaan valita etenkin syklosporiinista, FK506:sta, atsatiopriinista, kortikos-15 teroideista ja mistä tahansa mono- tai polyklonaalisista vasta-aineista. Edullisesti kyseessä ovat vasta-aineet, jotka kykenevät inaktivoimaan immuunimolekyylit tai aiheuttamaan näitä molekyylejä kantavien immuunisolujen tuhon. Vasta-aineena voidaan käyttää etenkin vasta-aineita 20 anti-CD4, ~CD3, -CD2, -CD8, -CD28, -B7, -ICAM-1 ja -LFA-1. Kyseessä voivat olla samoin hybridimolekyylit kuten ·*·*. CTLA4lg, joka on fuusioproteiini CTLA-4-molekyylin (CD28:n i · ,*.: homologi) ja immunoglobuliinin välillä. Tämän molekyylin ··,·. B7-molekyyliin liittyvä GlFc-kohta osoittautuu kykeneväksi • · I. I 25 inhiboimaan solujen aktivaation [D.J. Lenschow, Science * 257 (1992) 789] . Selvää on, että esillä olevan keksinnön • · 1 " suojapiiri ei millään muotoa rajoitu edellä mainittuihin • » * *·' * immuunisuppressoreihin. Näitä immuunisuppressoreita voi daan käyttää eristetysssä muodossa tai yhdistelmänä.
» · !,*,! 30 Mitä tulee esillä olevan keksinnön mukaan käytetyn i]]*: adenoviruksen genomissa esiintyviin yhdistelmä-DNA-sek- . [·' vensseihin, kyseessä ovat DNA-fragmentit, jotka sisältävät • · * kyseisen geenin (terapeuttinen tai immuunisuojaava) ja • e ***** mahdollisesti sen ilmentymisen mahdollistavat signaalit ja · ϊ 35 jotka rakennetaan in vitro ja insertoidaan sitten adenovi- • · • · · • ·· * » 119176 δ rusgenomiin. Esillä olevan keksinnön piirissä käytetyt yhdistelmä-DNA:t voivat edustaa komplementaarisia DNA-sek-venssejä (cDNA), genomi-DNA-sekvenssejä (gDNA) tai hybri-dirakenteita, jotka esimerkiksi koostuvat cDNA:sta, johon 5 insertoidaan yksi tai useampi introni. Kyseessä voivat samoin olla synteettiset tai puolisynteettiset sekvenssit. Nämä DNA:t voivat olla ihmis-, eläin-, kasvi-, bakteeri-, virus- jne. alkuperää. Erityisen edullisesti käytetään cDNA- tai gDNA-sekvenssejä.
10 Esillä olevan keksinnön mukaisten vektorien raken tamiseksi käyttökelpoisena terapeuttisena geeninä voidaan mainita mikä tahansa geeni, joka koodittaa tuotetta, jolla on terapeuttinen vaikutus. Näin kooditettu tuote voi olla proteiini, peptidi, RNA jne.
15 Kun kyseessä on proteiinituote, se voi olla homolo ginen kohdesoluun nähden (eli tuote, joka normaalisti ilmentyy kohdesolussa silloin, kun tämä on terve). Tässä tapauksessa proteiini ilmentämällä on mahdollista esimerkiksi lievittää riittämätöntä ilmentymistä solussa tai 20 modifikaation johdosta inaktiivisen tai heikosti aktiivisen proteiinin ilmentymistä tai edelleen ilmentää mainit- "·*: tua proteiinia hyvin runsaasti. Terapeuttinen geeni voi « · ϊ myös koodittaa soluproteiinimutanttia, jonka stabiilisuus • · ··.·. on parempi, aktiivisuus modifioitu jne. Proteiinituote voi • · I25 samoin olla heterologinen kohdesoluun nähden. Tässä ta-• · *, * pauksessa ilmennetty proteiini voi esimerkiksi täydentää • f •<t]* tai tuoda solusta puuttuvan aktiivisuuden, jolloin solun • · · *·’ * on mahdollista taistella patologiaa vastaan tai stimuloida immuunivaste.
• · *,V 30 Esillä olevan keksinnön mielessä terapeuttisina ··· proteiinituotteina voidaan mainita erityisemmin entsyymit, • ]·, veri johdannaiset, hormonit, interleukiinit, interferonit, • · · TNF jne. (FR 92 03 120), kasvutekijät, hermovälittäjäai- • · neet tai niiden prekursorit tai synteesientsyymit, trofi-!*·]= 35 set tekijät: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, t ·
• « I
· · • t 9 119176 NT5, HARP/pleiotrofiini jne.; apolipoproteiinit: ApoAI,
ApoAIV, ApoE jne. (FR 93 05 125), dystrofiini tai minidys-trofiini (FR 91 11 947), mukoviskosidoosiin liittyvä CFTR-proteiini, kasvaimia suppressoivat geenit: p53, Rb, RaplA, 5 DOC, k-rev jne. (FR 93 04 745), koagulaatioon liittyviä tekijöitä koodittavat geenit: tekijät VII, Vili, ix, DNA:n korjaamiseen osallistuvat geenit jne.
Kuten edellä mainittiin, terapeuttinen geeni voi samoin olla antisense-geeni tai -sekvenssi, joka kohdeso-10 lussa ilmentämällä on mahdollista kontrolloida geenien ilmentymistä tai solu-mRNA-sekvenssien transkriptiota. Voidaan esimerkiksi suorittaa tällaisten sekvenssien transkriptio kohdesolussa solu-mRNA-sekvensseihin nähden komplementaarisiksi RNA-sekvensseiksi ja salvata siten 15 niiden translaatio proteiiniksi tekniikan mukaan, jota kuvataan EP-patenttijulkaisussa 140 308. Antisense-sek- venssit käsittävät myös ribotsyymejä koodittavat sekvenssit, jotka kykenevät selektiivisesti tuhoamaan kohde-RNA-sekvenssejä (EP 321 201).
20 Terapeuttiset geenit voivat olla ihmis-, eläin-, kasvi-, bakteeri-, virus- jne. alkuperää. Ne voidaan saada ·1·’. millä tahansa alan ammattilaiselle tutulla tekniikalla, ja • i : etenkin seulomalla pankkeja, kemiallisesti syntetisoimalla • · jv. tai edelleen sekamenetelmillä mukaan lukien pankkeja • · I. 1 25 seulomalla saatujen sekvenssien kemiallinen tai : · : *. 1 entsymaattinen modifiointi.
• ·
Esillä olevan keksinnön piirissä käytetty immuno- • · ♦ "·1 1 suojageeni voi olla eri tyyppiä. Kuten edellä on selitet ty, kyseessä on geeni, jonka tuote vaikuttaa pääasiallisen · *.V 30 histokompatibiliteettikompleksin (MHC) aktiivisuuteen tai sytokiinien aktiivisuuteen. Kyseessä on edullisesti geeni, • ]·, jonka tuote inhiboi ainakin osittain MHC-proteiinien • · · ilmentymisen tai antigeenipresentaation. Edullisina • 1 *;· esimerkkeinä voidaan mainita tietyt adenoviruksen E3- ♦ · « ♦ · · • · • · · • · · • ·· • · 119176 ίο alueelle sisältävät geenit, herpes-viruksen ICP47-geeni tai sytomegaloviruksen ULl8-geeni.
Adenovirusgenomin E3-alue sisältää eri lukualueita, joista erilaisen silraukoitumisen tuloksena syntyy 5 erilaisia proteiineja. Näistä Gpl9k-proteiini (tai E3-19k) on glykosyloitu, membraanin lävistävä proteiini, joka sijaitsee endoplastisen retikulumin (RE) membraanissa. Tämä proteiini käsittää ontelodomeenin, joka yhdistää MHC-I-molekyylit ja C-terminaalisen sytoplasmapään, joka kykenee 10 sitomaan mikroputkia (eli pieniä putkimaisia rakenteita), ja joka vaikuttaa ankkuroimalla gpl9k-proteiinin RE-memb-raaniin. Gpl9k kykenee täten estämään MHC-I-molekyylien ilmentymisen solujen pinnalla vuorovaikutuksen ja sekves-troinnin RE:n tasolla välityksellä. Kuitenkin virusrepli-15 kaation puuttuessa adenovirukset ilmentävät gpl9k-proteii-nin heikosti. Sitä paitsi gpl9k;n ilmentyminen on myös ehdollistettu silmukoitumisen toteutumiseen. Viemällä keksinnön mukaisiin vektoreihin yhdistelmä-DNA, joka sisältää sekvenssin (edullisesti cDNA-), joka koodittaa gpl9k:ta, 20 on mahdollista kontrolloida mainitun proteiinin ilmentymistä ja optimoida se. Erityisesti käyttämällä konstitu- ♦*·*. tiivisia promoottoreita ja suppressoimalla muut lukualueet * · : on mahdollista lisätä voimakkaasti tämän proteiinin ilmen- ··.·. tyrnistä ja vapautua virusreplikaatiosta ja indusoivien ••l' 25 aineiden läsnäolosta riippuvuudesta. Näin voidaan erityi- • · *„ * sen edullisesti vähentää huomattavasti tartutettujen solu- • · jen lyysiä CTL:illä ja siten lisätä ja ajallisesti piden- • · · ’·* * tää terapeuttisen geenin tuotantoa in vivo.
Adenovirusgenomin E3-alueen koodittamilla muilla i · V.: 30 proteiineilla kuten proteiinit 10,4k ja 145,k on tiettyjä • I· ί.,,ί kiinnostavia ominaisuuksia silmällä pitäen niiden sisäl- : ]*, lyttämistä keksinnön mukaisiin vektoreihin.
• · ·
Herpes simplex -viruksen ICP47-geeni muodostaa • * T toisen immunosuojageenin, joka on esillä olevan keksin- ·· · • *,ί 35 nön mielessä erityisen kiinnostava. Herpes simplex -vi- • · » · · • ·· • * 11 119176 ruksella tartutetut solut osoittavat resistenssiä CTL:illä indusoitua lyysiä vastaan. On osoitettu, että tämäm resistenssin voisi tuottaa ICP47-geeni, joka kykenee vähentämään MHOI-molekyylien ilmentymistä solujen pinnalla. 5 ICP47-geenin sisältyessä keksinnön mukaiseen yhdistelmä-DNA :hän keksinnön mukaisten yhdistelmä-DNA-virusten on samoin mahdollista välttää immuunijärjestelmä.
Sytomega1oviruksen UL18-geeni muodostaa toisen edullisen esimerkin keksinnön mukaisesta immunosuojagee-10 nistä. ULl8-geenituote kykenee sitomaan S2-mikroglobulii-nin [Browne et ai., Nature 347 (1990) 770]. £2-mikroglo- buliini on yksi MHC-I-molekyylien ketjuista. Sisällyttämällä UL18-geeni keksinnön mukaiseen yhdistelmä-DNA:hän on siten mahdollista vähentää keksinnön mukaisilla viruksilla 15 tartutetuissa soluissa funktionaalisten E2-mikroglobulii-nimolekyylien lukumäärää ja siten vähentää näiden solujen kykyä tuottaa täydellisiä ja funktionaalisia MHC-l-mole-kyylejä. Tämän tyyppisellä rakenteella on siten mahdollista suojata tartutettuja soluja CTL-lyysiltä.
20 Kuten edellä on mainittu, esillä olevan keksinnön piirissä käytetty immunosuojageeni on toisessa edullisessa ·*·*· suoritusmuodossa geeni, jonka tuote inhiboi sytokiinien • * ;*.J aktiivisuuden tai signallointireitit. Sytokiinit • · muodostavat luokan erittyviä proteiineja, jotka toimivat • · 25 immuunijärjestelmän signallointimolekyyleinä. Ne voivat • · !. * vetää puoleensa immuniteettisoluja, aktivoida ne, indu- soida ne lisääntymään ja jopa vaikuttaa suoraan tartunnan • · t *·* * saaneisiin soluihin näiden tappamiseksi.
Geeneistä, joiden tuote vaikuttaa sytokiinien ak- • · V,* 30 tiivisuuteen tai signallointireitteihin, voidaan mainita
Ml geenit, jotka puuttuvat sytokiinien synteesiin, tai joiden j )·, tuote kykenee sekvestroimaan sytokiinit, vastustamaan • · · niiden aktiivisuutta tai häiritsemään solujen välisiä *" signallointireittejä. Edullisina esimerkkeinä voidaan ·· m • V 35 mainita erityisesti Epstein-Barr-viruksen BCRFl-geeni, • · • · · • ·« « · 12 119176 lehmänrokkoviruksen crmA- ja crtnB-geenit, lehmänrokkovi-ruksen B15R- ja B18R-geenit, sytomegaloviruksen US28-gee-ni, adenovirusgeenit E3-14,7, E3-10,4 ja E3-14,5.
Lehmänrokkoviruksen B15R-geeni koodittaa liukoista 5 proteiinia, joka kykenee sitomaan interleukiini-lfi:n (in-terleukiini-1:n eritetty muoto), ja siten estämään tämän sytokiinin sitoutumisen sen solureseptoreihin. Interleu-kiini-1 on itse asiassa yksi ensimmäisistä sytokiineista, jota tuotetaan vasteena antigeenihyökkäykseen, ja se 10 esittää hyvin tärkeätä osaa immuunijärjestelmän signal-loinnissa tartunnan alussa. Mahdollisuus sisällyttää B15R-geeni keksinnön mukaiseen vektoriin tekee edullisesti mahdolliseksi IL-lfi:n aktiivisuuden, etenkin immuunisolujen aktivaation suhteen, vähentämisen, ja siten keksinnön mu-15 kaisilla viruksilla tartutettujen solujen paikallisen suojaamisen merkittävää immuunivastetta vastaan. Voidaan käyttää myös B15R-geeniin nähden homologisia geenejä, kuten lehmänrokkovirusgeeni.
Samalla tavalla lehmänrokkoviruksen B18R-geeni 20 koodittaa interleukiini-6-reseptoriin nähden homologista proteiinia. Tämä geeni, tai sen mikä tahansa funktionaa- ·*·'· linen homologi, on myös käyttökelpoinen keksinnön mukai- • · : sissa vektoreissa interleukiini-6 :n sitoutumisen sen so- • ·· • · lureseptoriin inhiboimiseksi ja siten immuunivasteen pai- • · ·· i 25 kalliseksi vähentämiseksi.
« · · • · I. * Edelleen samalla tavalla lehmänrokkoviruksen crmB- ♦ *>ti geeniä voidaan edullisesti käyttää. Tämä geeni koodittaa • · * *·* * itse asiassa eritettyä proteiinia, joka kykenee sitoutu maan TNF:ään ja kilpailemaan TNF-reseptorien solujen pin- • · \V 30 nalla kanssa. Tämä geeni keksinnön mukaisissa viruksissa • · · tekee siten mahdolliseksi laskea paikallisesti aktiivi- : sen, tartutettuja soluja tuhoavan TNF:n pitoisuutta. Voi- • · · daan samoin käyttää muita geenejä, jotka koodittavat pro- • · teiineja, jotka kykenevät sitoutumaan TNF:ään ja inhiboi- ·· · • V 35 maan ainakin osittain sen sitoutumisen reseptoreihinsa.
• » « · · • ·* • · 13 119176
Lehmänrokkoviruksen crmA-geeni koodittaa puolestaan proteiinia, jolla on serpiinityypin proteaaseja inhiboivaa aktiivisuutta ja joka kykenee inhiboimaan inter-leukiini-16:n synteesin. Tätä geeniä voidaan siten käyt-5 tää interleukiini-1:n pitoisuuden paikalliseksi vähentämiseksi ja siten immuuni- ja tulehdusvasteen kehittymisen vähentämiseksi.
Epstein-Barr-viruksen BCRF1-geeni koodittaa inter-leukiini-10-analogia. Tämän geenin tuote on sytokiini, 10 joka kykenee vähentämään immuunivastetta ja muuttamaan sen spesifisyyttä indusoidessaan samalla B-lymfosyyttien lisääntymistä.
Sytomega1oviruksen US28-geeni koodittaa makrofa-gien la (MIP-la) tulehdusproteiinin reseptoriin nähden 15 homologista proteiinia. Tämä proteiini kykenee siten vaikuttamaan MIP-reseptorien kilpailijana, ja siten inhiboimaan paikallisesti sen aktiivisuuden.
Adenovirusgeenien E3-14,7, E3-10,4 ja E3-14,5 tuote kykenee salpaamaan tiettyjen sytokiinien välittämän 20 solujen välisen signaalin siirron. Kun sytokiinit sitoutuvat reseptoriinsa tartutetun solun pinnalla, signaali •Vj välittyy ytimeen solukuoleman indusoimiseksi tai proteii- • · : nisynteesin pysäyttämiseksi. Näin on asianlaita erityi- ·*,·[ sesti kasvainkuoliotekijän (TNF) kohdalla. Sisällyttämäl- • · 25 lä geenit E3-14,7, E3-10,4 ja/tai E3-14,5 keksinnön mu- • « I, * kaiseen yhdistelmä-DNA:han silmällä pitäen niiden konsti- • i *tt7 tutiivista tai säädeltyä ilmentymistä on mahdollista sai- • · · '·* vata TNF:n indusoima solujen välinen signallointi, ja si ten suojata keksinnön mukaisten yhdistelmä-DNA-virusten • i V,* 30 tartuttamat solut tämän sytokiinin toksisilta vaikutuk- ··· silta.
: !*, Paikallinen ja tilapäinen inhibitio voi olla eri- • · · "I.* tyisen edullinen. Tämä voidaan saada etenkin valitsemalla ♦ ♦ *Γ erityiset ilmentämissignaalit (esimerkiksi sytokiiniriip- ·· · * V 35 puvaiset promoottorit) kuten jäljempänä esitetään.
• · • · · • ·· • · 14 119176
Huomattakoon, että muitakin homologisia geenejä, joilla on samankaltaisia funktionaalisia ominaisuuksia, voidaan käyttää keksinnön mukaisten vektorien rakentamiseksi. Nämä eri geenit voidaan saada millä tahansa alan 5 ammattilaiselle tuttulla tekniikalla, ja etenkin seulomalla pankkeja, kemiallisesti syntetisoimalla tai edelleen sekamenetelmillä mukaan lukien pankkeja seulomalla saatujen sekvenssien kemiallinen tai entsymaattinen modifiointi. Lisäksi näitä eri geenejä voidaan käyttää yksilö nään tai yhtenä tai useampana yhdistelmänä.
Kyseessä olevien geenien insertointi keksinnön mukaisien yhdistelmä-DNA-sekvenssien muodossa tarjoaa paremman joustavuuden adenovirusten rakentamisessa ja mahdollistaa mainittujen geenien ilmentymisen paremman kontrol-15 Iin.
Täten esillä olevan keksinnön mukaisiin adenovirus-vektoreihin sisällytetyt yhdistelmä-DNA-sekvenssit (ja siten ktseiset kyseiset kaksi kiinnostavaa geeniä) voidaan järjestellä eri tavoin.
20 Ne voidaan ensiksikin insertoida adenovirusgenomin samaan kohtaan tai valikoituihin eri kohtiin. Erityisesti ·'·*. yhdistelmä-DNA-sekvenssit voidaan insertoida ainakin osit- j*. : tain adenovirusgenomin alueille El, E3 ja/tai E4 korvaa- ··.·, maan virussekvenssejä tai niiden lisäksi.
• · I. I 25 Edullisesti yhdistelmä-DNA-sekvenssit insertoidaan • ♦ *, * ainakin osittain adenovirusgenomin alueille El, E3 tai E4.
♦ · • ** Kun ne insertoidaan kahteen eri kohtaan, keksinnön piiris- • · · V * sä käytetään edullisesti alueita El ja E3 tai El ja E4.
Esimerkit osoittavat itse asiassa, että tämä järjestely * · V.: 30 mahdollistaa kyseisten kahden geenin kohonneen ilmentymi- t** : sen ilman näiden kahden välisiä häiriöitä. Edullisesti ··· • yhdistelmä-DNA-sekvenssit insertoidaan korvaamaan virus- • · · sekvenssejä.
**"* Nämä yhdistelmä-DNA:t voivat sitten käsittää kukin «· · • 35 transkriptiopromoottorin, jolloin nämä ovat identtisiä tai • « • · » • ·· • · 15 119176 erilaisia. Tällä konfiguraatiolla on mahdollista saada korkeampia ilmentymistasoja ja se tarjoaa geenien ilmentymisen paremman kontrollin. Tässä tapauksessa kyseiset kaksi geeniä voidaan insertoida samoin suuntautuneina tai 5 vastakkaisesti suuntautuneina.
Ne voivat myös muodostaa yksittäisen transkriptio-yksikön. Tässä konfiguraatiossa kyseiset kaksi yhdistelmä-DNA:ta ovat peräkkäin ja sijoitettu siten, että kyseiset kaksi geeniä ovat yksittäisen promoottorin kontrollissa, 10 ja synnyttävät yksittäisen esilähetti-RNA:n. Tämä asettelu on edullinen, koska sen yhteydessä on mahdollista käyttää yhtä ainoata transkriptiopromoottoria.
Lopuksi käytettäessä keksinnön mukaisia yhdistelmä -DNA- sekvenssejä on mahdollista käyttää luonteeltaan 15 erilaisia transkriptiopromoottoreita, ja etenkin voimakkaita tai heikkoja, säädeltyjä tai konstitutiivisia, ku-dosspesifisiä tai kaikkialla esiintyviä jne. promottorei-ta.
Ilmentämissignaalien ja yhdistelmä-DNA-sekvenssien 20 vastaavan aseman valinta on erityisen tärkeä terapeuttisen geenin kohonneen ilmentymisen ja merkittävän immuuni- ·1·1. suojavaikutuksen saamiseksi.
·
Esillä olevan keksinnön erityisen edullisessa suo- ♦ · ··.·. ritusmuodossa käytetään defektivistä adenovirusta, joka • · 25 käsittää ensimmäisen yhdistelmä-DNA:n, joka sisältää te- • 1 * rapeuttisen geenin, ja toisen yhdistelmä-DNA:n, joka si- sältää immunosuojageenin, ja jossa kyseiset kaksi yhdis- • · · *·'1 telmä-DNA:ta on insertoitu El-alueelle.
Esillä olevan keksinnön erityisen edullisessa suo- • · V.: 30 ritusmuodossa käytetään defektivistä adenovirusta, joka käsittää ensimmäisen yhdistelmä-DNA:n, joka sisältää te- * 1·# rapeuttisen geenin insertoituna El-alueelle, ja toisen * · · "1.1 yhdistelmä-DNA:n, joka sisältää immunosuojageenin inser- * · ·"1 toituna E3-alueelle.
·· · • · 1 • · • · · • · · • ·· « · 16 119176
Kuten edellä on mainittu, esillä olevan keksinnön mukaiset adenovirukset ovat defektiivisiä, eli ne ovat kykenemättömiä replikoitumaan itsenäisesti kohdesolussa. Yleensä esillä olevan keksinnön mukaisten defektiivisten 5 adenovirusten genomi on siten vailla vähintään mainitun viruksen replikataiolle tartutetussa solussa välttämättömiä sekvenssejä. Nämä alueet on voitu joko eliminoida (kokonaisuudessaan tai osittain) tai niistä on voitu tehdä ei-funktionaalisia tai ne on voitu substituoida muilla 10 sekvensseillä ja etenkin terapeuttisillä geeneillä. Keksinnön mukaisten adenovirusten defektiivinen luonne on tärkeä tekijä, koska se takaa, etteivät keksinnön mukaiset vektorit leviä annon jälkeen.
Edullisessa suoritusmuodossa keksinnön mukaiset 15 adenovirukset käsittävät ITR-sekvenssit ja kapsidaation mahdollistavan sekvenssin ja niistä on El-geeni kokonaisuudessaan tai osittain deletoitu.
Toistuvat käänteiset sekvenssit (ITR) muodostavat adenovirusten replikaatioalkukohdan. Ne sijaitsevat vi- 20 rusgenomin 3'- ja 5'-päissä (vrt. kuvio 1), joista ne voidaan eristää helposti alan ammattilaiselle tutuilla IV. molekyylibiologian tavanomaisilla tekniikoilla. Ihmisade- • · .·. : novirusten (erityisesti serotyyppien Ad2 ja Ad5) ITR-sek- ··,/ venssien nukleotidisekvenssiä kuvataan kirjallisuudessa • · 2 5 kuten myös koira-adenovirusten (etenkin CAV1 ja CAV2) .
• 1 2 h 1 Mitä tulee esimerkiksi Ad5-adenovirukseen, vasemmanpuo- • · • [’ leinen ITR-sekvenssi vastaa aluetta, joka käsittää geno- V 2 min nukleotidit 1 - 103.
Kapsidaatiosekvenssi (jota kutsutaan myös Psi-sek- • 1 ϊ.ϊ.ϊ 30 venssiksi) on välttämätön virus-DNA:n kapsidaatiolle. Tä- :3: män alueen on siten oltava läsnä keksinnön mukaisten de- • · · \# fektiivisten yhdistelmä-DNA-adenovirusten valmistuksen • · · *".1 mahdollistamiseksi. Kapsidaatiosekvenssi sijaitsee adeno- • 1 ’1“1 virusten genomissa vasemmanpuoleisen (5') ITR:n ja El- | 35 geenin välissä (vrt. kuvio 1). Se voidaan eristää tai * · 2 • ♦ · 3 • ♦♦ • · 17 119176 syntetisoida keinotekoisesti molekyylibiologian tavanomaisilla tekniikoilla. Ihmisadenovirusten (erityisesti sero-tyypit Ad2 ja Ad5) kapsidaatiosekvenssin nukleotidisek-venssiä kuvataan kirjallisuudessa kuten myös koira-adeno-5 virusten (etenkin CAV1 ja CAV2). Mitä tulee esimerkiksi Ad5-adenovirukseen, kapsidaatiosekvenssi vastaa aluetta, joka käsittää genomin nukleotidit 194 - 358.
Edullisemmin keksinnön mukaiset adenovirukset käsittävät ITR-sekvenssit ja kapsidaation mahdollistavan 10 sekvenssin ja niistä on geenit El ja E4 kokonaisuudessaan tai osittain deletoitu.
Erityisen edullisessa suoritusmuodossa keksinnön mukaisten adenovirusten genomista on deletoitu kokonaisuudessaan tai osittain geenit El, E3 ja E4 ja vielä 15 edullisemmin kokonaisuudessaan tai osittain geenit El, E3, L5 ja E4.
Keksinnön mukaiset adenovirukset voidaan valmistaa eri alkuperää olevista adenoviruksista. On itse asiassa olemassa eri adenovirusserotyyppejä, jotka rakenteeltaan 20 ja ominaisuuksiltaan vaihtelevat jonkin verran, mutta joiden geneettinen organisaatio on verrattavissa. Täten eisllä olevassa hakemuksessa kuvatut neuvot voi alan am- • · • · .*, : mattilainen helposti toistaa minkä tahansa tyypin adeno- ··,·. virukselle.
* · j.I 25 Erityisemmin keksinnön mukaiset adenovirukset voi- • * *, * vat olla ihmis-, eläin- tai seka-alkuperää (ihminen ja • · • '* eläin) .
• · · • · · *·* * Mitä tulee ihmisalkuperää oleviin adenoviruksiin, käytetään edullisesti niitä, jotka luokitellaan ryhmään C.
• · V.: 30 Edullisemmin eri ihmisadenovirusserotyypeistä esillä ole- * · van keksinnön piirissä käytetään edullisesti tyypin 2 tai : ]·, 5 adenoviruksia (Ad2 tai Ad5) .
• · *".* Kuten edellä mainittiin, keksinnön mukaiset adeno- • · • · "* virukset voivat samoin olla eläinalkuperää, tai ne voivat • · · • 35 käsittää eläin alkuperää olevista adenoviruksista saatuja Φ · • · · • ·· • t 18 119176 sekvenssejä. Hakija on itse asiassa osoittanut, että eläinalkuperää olevat adenovirukset kykenevät tartuttamaan ihmissoluja hyvin tehokkaasti, ja että ne eivät kykene lisääntymään ihmissoluissa, joissa niitä on testattu 5 (vrt. FR-hakemusjulkaisu 93 05 954) . Hakija on myös osoittanut, että ihmisalkuperää olevat adenovirukset eivät mitenkään täydennä trans eläinalkuperää olevia adenoviruk-sia, mikä eliminoi täysin vaaran DNA-yhdistymisestä ja lisääntymisestä in vivo. joka ihmisadenoviruksen läsnä 10 ollessa voisi johtaa tarttuvan partikkelin muodostumiseen. Eläinalkuperää olevien adenovirusten tai adenovirusaluei-den käyttäminen on siten erityisen edullista, koska virusten käyttöön vektoreina geeniterapiassa luontaisesti liittyvät vaarat ovat vielä pienempiä.
15 Esillä olevan keksinnön piirissä käyttökelpoiset eläinalkuperää olevat adenovirukset voivat olla lähtöisin koirasta, naudasta, hiirestä [esimerkki: Mavl, Beard et ai. , Virology 75 (1990) 81] , lampaasta, siasta, linnusta ja edelleen apinasta (esimerkki: SAV). Tarkemmin ottaen 20 lintuadenoviruksista voidaan mainita serotyypit 1 - 10, jotka ovat saatavana talletuslaitoksesta ATCC, kuten esi-Γ.1. merkiksi kannat Phelps (ATCC VR-432) , Fontes (ATCC VR-
280), P7-A (ATCC VR-827) , IBH-2A (ATCC VR-828) , J2-A (ATCC
• · · ·./' VR-829) , T8-A (ATCC VR-830) , K-ll (ATCC VR-921) tai edel- · \ 25 leen kannat, joiden viiten on ATCC VR-831 - 835. Nauta- • · » • · * adenoviruksista voidaan käyttää tunnettuja eri serotyyppe- * · • 2 jä, ja etenkin niitä, jotka voidaan saada talletuslaitok- V : sesta ATCC (tyypit 1-8) viitteillä ATCC VR-313, 314, 639 - 642, 768 ja 769. Voidaan mainita myös hiiriadenovi-:V: 30 rukset FL (ATCC VR-550) ja E20308 (ATCC VR-528), lammas- adenovirustyyppi 5 (ATCC VR-1343) tai tyyppi 6 (ATCC VR- • 1340); sika-adenovirus 5359, tai apina-adenovirukset kuten • · · *",1 etenkin adenovirukset, joiden ATCC-viitteet ovat numerot • · *·"1 VR-591-594, 941-943, 195-203 jne.
·· · • · · • · « · · • · · • ♦♦ 2 • · 19 119176
Edullisesti eläinalkuperää olevista eri adenovi-ruksista keksinnön piirissä käytetään adenoviruksia tai adenovirusalueita, jotka ovat peräisin koirasta, ja etenkin adenovirusten CAV2 kaikkia kantoja [esimerkiksi kanta 5 Manhattan tai A26/61 (ATCC VR-800)]. Koira-adenovirukset ovat olleet lukuisten rakennetutkimusten kohteena. Täten adenovirusten CAV1 ja CAV2 täydelliset restriktiokartat on esitetty alan teknisen tason puitteissa [Spibey et ai. . J. Gen. Virol. 70 (1989) 165], ja geenit Elä, E3 sekä ITRIO sekvenssit on kloonattu ja sekventoitu [katso etenkin Spibey et ai.. Virus Res. 14 (1989) 241; Linne, Virus Res. 23 (1992) 119, W0 91/11 525].
Keksinnön mukaiset defektiiviset yhdistelmä-DNA-adenovirukset voidaan valmistaa eri tavoin.
15 Ensimmäisessä menetelmässä in vitro valmistettu defektiivisen yhdistelmä-DNA-viruksen DNA transfektoidaan (joko ligatoimalla tai plasmidina) transformoitumiskel-poiseen solulinjaan, eli solulinjaan, joka käsittää en trans kaikki defektiivisen viruksen täydentämiseksi vält-20 tämättömät funktiot. Nämä funktiot integroidaan edullisesti solun genomiin, jolloin voidaan välttää DNA-yhdis- jV. tymisvaarat, ja tuottaa solulinjalle kasvanut stabiili- • · ,** ; suus.
• i* .·,/ Toisen lähestymistavan mukaan kotransfektoidaan • · !. ‘ 25 sopivaan solulinjaan in vitro valmistettu defektiivisen ** yhdistelmä-DNA-viruksen DNA (joko ligatoimalla tai plas- • " midina) ja apuviruksen DNA. Tämän menetelmän mukaan ei ole *.* * tarpeen käyttää transformoitumiskelpoista solulinjaa, joka kykenee täydentämään yhdistelmä-DNA-adenoviruksen kaikki • · 30 defektiiviset funktiot. Osan näistä funktioista täydentää itse asiassa apuvirus. Tämän apuviruksen on sinänsä oltava . defektiivinen, ja solulinja käsittää en trans sen täyden- • · · tämiselle tarpeelliset funktiot. Tämän toisen lähestymis- • · **;*’ tavan piirissä etenkin käyttökelpoisista solulinj öistä I * : 35 voidaan mainita etenkin ihmisen alkion munuaissolulinja • · • Φ m • ·· • · 20 119176 293, KB-solut, HeLa-solut, MDCK, GHK jne. (vrt. esimerkit) .
Sitten lisääntyneet vektorit otetaan talteen, puhdistetaan ja niitä monistetaan molekyylibiologian tavan-5 omaisilla tekniikoilla.
Suoritusmuunnoksen mukaan on mahdollista valmistaa in vitro joko ligatoimalla tai plasmidin muodossa defek-tiivisen yhdistelmä-DNA-viruksen DNA, joka käsittää sopivat deleetiot ja kyseiset kaksi yhdistelmä-DNA:ta. Kuten 10 edellä on mainittu, keksinnön mukaisista vektoreista on edullisesti deletoitu kokonaisuudessaan tai osittain tietyt virusgeenit, etenkin geenit El, E3, E4 ja/tai L5. Tämä deleetio voi vastata minkä tahansa tyypin suppressio-ta, joka vaikuttaa kyseessä olevaan geeniin. Kyseessä voi 15 olla etenkin mainitun geenin kooditusalueen suppressio kokonaisuudessaan tai osittain, ja/tai mainitun geenin transkriptiopromoottorialueen suppressio kokonaisuudessaan tai osittain. Suppressointi suoritetaan yleensä de-fektiivisen yhdistelmä-DNA-viruksen DNA:11a, esimerkiksi 20 pilkkomalla sopivilla restriktioentsyymeillä, minkä jäl keen ligatoidaan molekyylibiologian tekniikoiden mukaan kuten esimerkeissä havainnollistetaan. Yhdistelmä-DNA- Φ · • · : sekvenssit voidaan sitten insertoida tähän DNA:hän ent-
• M
··,·! syymeillä pilkkomisen jälkeen ligatoimalla valituille • · U ' 25 alueille ja valittuun suuntaukseen.
i t « * Näin saadusta DNA:sta, joka käsittää siis sopivat • · • ** deleetiot ja kyseiset kaksi yhdistelmä-DNA-sekvenssiä, on • · · *·1 ’ mahdollista muodostaa suoraan defektiivinen yhdistelmä- DNA-adenovirus, joka käsittää mainitut deleetiot ja yh- • · V,1 30 distelmä-DNA:t. Tämä ensimmäinen muunnos sopii erityises- ti yhdistelmä-DNA-adenovirusten valmistamiseksi, joissa . 1· geenit on sijoitettu yhdeksi yksittäiseksi transkriptio- • « · yksiköksi tai erillisten promoottorien kontrolliin mutta • ♦ '1“1 insertoituina samaan kohtaan genomissa.
** 9 • # ♦ 9 · • · · • · ♦ * 1♦ • · 21 119176
On samoin mahdollista valmistaa yhdistelmä-DNA-vi-rus kahdessa vaiheessa, jolloin on mahdollista liittää kaksi yhdistelmä-DNA:ta mukaan peräkkäin. Täten ensimmäisen, sopivat deleetiot (tai osan mainituista deleetioista) 5 sekä yhden yhdistelmä-DNA-sekvensseistä käsittävän yhdistelmä-DNA-viruksen DNA rakennetaan ligatoimalla tai plasmidin muotoon. Tällä DNA:11a muodostetaan sitten ensimmäinen yhdistelmä-DNA-virus, joka käsittää mainitut deleetiot ja yhden yhdistelmä-DNA:n. Tämän ensimmäisen 10 viruksen DNA eristetään sitten ja kotransfektoidaan toisen plasmidin tai toisen, 2. yhdistelmä-DNA:n, sopivat deleetiot (osa joka ei esiinny ensimmäisessä viruksessa) ja homologisen DNA-yhdistymisen mahdollistavan alueen käsittävän defektiivisen yhdistelmä-DNA-viruksen DNA:n 15 kanssa. Tässä toisessa vaiheessa muodostuu siten defek-tiivinen yhdistelmä-DNA-virus, joka käsittää kyseiset kaksi yhdistelmä-DNA:ta. Tämä valmistusmuunnos on erityisen sopiva yhdistelmä-DNA-virusten valmistamiseksi, jotka käsittävät kaksi yhdistelmä-DNA-sekvenssiä insertoituina 20 adenovirusgenomin kahdelle eri alueelle.
Keksinnön mukaiset kaksi ainetta, nimittäin immu- ;1·1. nosuppressori ja yhdistelmä-DNA-adenovirus, voidaan koos- • · taa silmällä pitäen antoa paikallisesti, oraalisesti, ··,·[ ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta, nenänsisäisesti, las- • ! 25 kimonsisäisesti, lihaksensisäisesti, ihonalaisesti, sil- • 1 · • * mänsisäisesti, ihon kautta jne.
• · *4>|1 Edullisesti vastaava yksi tai useampi farmaseutti- • « t V 1 nen koostumus sisältää ruiskeena annettavaan koostumukseen farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantoaineita. Kyseeseen • · S.V 30 voivat tulla erityisesti suolaliuokset (mono-, di- natriumfosfaatti, natrium-, kalium-, kalsium- tai magne- . \t siumkloridi jne. tai tällaisten suolojen seokset), jotka • · · *".1 ovat steriilejä, isotoonisia, tai kuivat koostumukset, i · ·;2 etenkin kylmäkuivatut, joista lisäämällä tapauksesta * «
• I
• · « « · · • ·· 2 • · 22 119176 riippuen steriloitua vettä tai fysiologista seerumia on mahdollista rekonstituoida ruiskeena annettavia liuoksia.
Ruiskeeseen käytetyt immunosuppressorin ja adeno-viruksen annokset voidaan sovittaa eri parametrien funk-5 tiona, ja etenkin käytetyn antomuodon, kyseessä olevan patologian, ilmennettävän geenin tai edelleen hoidon halutun keston funktiona.
Yleensä ottaen keksinnön mukaiset yhdistelmä-DNA-adenovirukset koostetaan annoksiksi ja annetaan annoksina, 10 jotka ovat 104 - 1014 pmy/ml, ja edullisesti 106 - 1010 pmy/ml. Ilmaisu pmy ("plakin muodostava yksikkö") vastaa kyseessä olevan liuoksen tartutuskykyä, ja se määäritetään tartuttamalla sopiva soluviljelmä ja mittaamalla yleensä 5 päivän kuluttua tartutettujen solujen plakkien lukumäärä.
15 Tekniikat virusliuoksen pmy-tiitterin määrittämiseksi on kirjallisuudessa perusteellisesti dokumentoitu. Mitä tulee erityisesti immuunisuppressoreihin, niiden annokset ja ruiskutusmuodot vaihtelevat niiden luonteen mukaan. Näiden kahden parametrin säätäminen kuuluu alan ammattilaisen 20 ammattitietouteen.
Keksinnön mukaista lääkeyhdistelmää voidaan käyt-tää lukuisten patologioiden hoitamiseksi tai estämiseksi.
• · .·. : Adenovirukseensa insertoidun terapeuttisen geenin mukaan • · · sitä voidaan käyttää etenkin geneettisten sairauksien « I. * 25 (dystrofia, mukoviskosidoosi jne.), hermoston rappeutu- • · · I, *' missairauksien (Alzheimer, Parkinson, ALS jne.), liika- • * • ** kasvusairauksien (syövät, uudelleenahtautuminen jne.), *.* : koagulaatiohäiriöihin tai dyslipoproteinimioihin liitty vien patologioiden, virustartuntoihin (hepatiitti, aids • · ί,ϊ,ϊ 30 jne.) liittyvien patologioiden jne. hoitamiseksi tai es- tämiseksi.
• ft* .*. Esillä oleva keksintö koskee samoin kaikkia terä- * · · f · · peuttisia hoitomenetelmiä, joissa käytetään patentoita- • · ’*“* vaksi vaadittua lääkeyhdistelmää.
·· · • · · • · • * • · • · « • ·· • · 23 119176
Esillä olevaa keksintöä kuvataan täydellisemmin seuraavien esimerkkien avulla, jotka on katsottava havainnollistaviksi eikä rajoittaviksi.
Kuvio 1 adenoviruksen Ad5 geneettinen organisaa-5 tio. Ad5:n täydellinen sekvenssi on saatavana annettujen arvojen nojalla ja tekee alan ammattilaiselle mahdolliseksi valikoida tai luoda mikä tahansa restriktiokohta ja siten eristää mikä tahansa genomin alue.
Kuvio 2 adenoviruksen CAV2, kanta Manhattan, rest-10 riktiokartta (Spibey et ai.. supra).
Kuvio 3 vektorin pAD5-gpl9k-figal rakentaminen.
Kuvio 4 adenoviruksen Ad-gpl9k-i3gal, delta-El,delta- E3 rakentaminen.
Molekyylibiologian yleiset tekniikat 15 Molekyylibiologiassa tavanomaisesti käytetyt mene telmät kuten plasmidi-DNA:n preparatiiviset uutot, plas-midi-DNA:n sentrifugointi seesiumkloridigradienttia käyttäen, elektroforeesi agaroosi- tai akryyliamidigeeleissä, DNA-fragmenttien puhdistaminen elektroeluutiolla, proteii-20 nien uuttaminen fenolilla tai fenoli-kloroformi11a, DNA:n saostaminen suolaympäristössä etanolilla tai isopropano- •V. lilla, transformointi Escherichia coliin jne. ovat alan • · ammattilaiselle tuttuja ja niitä kuvataan runsaasti kir-
«,·* jallisuudessa [Maniatis, T., et ai.. "Molecular Cloning, A
• * J 25 Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold *, * Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel, F.M., et al. (toim.), • ♦ *7 "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & V : Sons, New York, 1987].
Tyypin pBR322, pUC plasmidit ja sarjan M13 fagit • · :.V 3° ovat kaupallista alkuperää (Bethesda Research Laborat- ories) .
• · + . *. Ligatointeja varten DNA-fragmentit voidaan erottaa Φ · *",* niiden koon perusteella agaroosi- tai akryyliamidigeeleis- Φ f "·* sä, uuttaa fenolilla tai fenoli/kloroformi-seoksella, ·♦ φ I \i 35 saostaa etanolilla ja sitten inkuboida T4-fagin DNA-li- Φ · Φ # φ • ·· • * 24 119176 gaasin (Biolabs) läsnä ollessa toimittajan suositusten mukaan.
Esiintyöntyvät 5'-päät voidaan täyttää käyttäen E. colin DNA-polymeraasi-I:n Klenow-fragmenttia (Biolabs) 5 toimittajan spesifikaatioiden mukaan. Esiintyöntyvät 3'-päät tuhotaan T4-fagin DNA-polymeraasin (Biolabs) läsnä ollessa käyttäen entsyymiä valmistajan suositusten mukaan. Esiintyöntyvät 5'-päät tuhotaan käsittelemällä rajoitetusti Sl-nukleaasilla.
10 Kohdennettu mutagenisointi in vitro synteettisillä oligodeoksinukleotideillä voidaan suorittaa menetelmän mukaan, jonka ovat kehittäneet Taylor et ai. fNucl. Acids Res. 13 (1985) 8749 - 8764], käyttäen Amershamin markkinoimaa pakkausta.
15 DNA-fragmenttien entsymaattinen monistaminen PCRtksi [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki, R.K., et äL·.# science 230 (1985) 1350 - 1354; Mullis, K.B., ja
Faloona, F.A., Meth. Enzvm. 155 (1987) 335 - 350] kutsutulla tekniikalla voidaan suorittaa käyttäen DNA Thermal 20 Cycler -laitetta (Perkin Elmer Cetus) valmistajan spesifikaatioiden mukaan.
I1.·. Nukleotidisekvenssit voidaan todentaa Sangerin et • ♦
.·, · ai. kehittämällä menetelmällä rProc. Natl. Acad. Sei. USA
• Il ••t»1 74. (1977) 5463 - 5467] käyttäen Amershamin markkinoimaa • · I. I 2 5 pakkausta.
• · · • Φ J, 1 Käytetyt solulinjat t · • 2 Seuraavissa esimerkeissä käytettiin tai voidaan • · · V 1 käyttää seuraavia solulinjoja:
Ihmisen alkion munuaissolulinja 293 [Graham et ai. .
30 J. Gen. Virol. 36 (1977) 59] . Tämä solulinja sisältää j|2j etenkin genomiinsa integroituna ihmisen adenoviruksen Ad5 . genomin vasemmanpuoleisen osan (12 %).
• 9 · *".1 Ihmissolulinja KB: Tämä solulinja on peräisin ihmi- • e "· sen orvaskesisyövästä ja saatavana talletuslaitoksesta *· · e · · e · e · • ♦ · • ♦· 2 • ♦ 25 119176 ATCC (viite CCL17) mukaan lukien sen viljelyn mahdollistavat olosuhteet.
Ihmissolulinja HeLa: Tämä solulinja on peräisin ihmisen epiteelisyövästä ja saatavana talletuslaitoksesta 5 ATCC (viite CCL2) mukaan lukien sen viljelyn mahdollistavat olosuhteet.
Koirasolulinja MDCK: MDCK-solujen viljelyolosuhteita ovat kuvanneet etenkin Macatney et ai., Science 44 (1988) 9.
10 Solulinja gmDBP6 [Brough et ai. . Virology 190 (1992) 624]. Tämä solulinja koostuu HeLa-soluista, jotka käsittävät adenovirusgeenin E2 MMTV:n LTR:n kontrollissa. Esimerkkejä Esimerkki 1 15 Defektiivisten yhdistelmä-DNA-adenovirusten raken taminen, jotka käsittävät terapeuttisen geenin (E^_ colin LacZ-geeni) RSV:n LTR-promoottorin kontrollissa sekä gpl9k~geenxn RSV:n LTR-promoottorin kontrollissa, jotka molemmat geenit on insertoitu alueelle El 20 Nämä adenovirukset rakennetaan homologisella DNA- yhdistymisella plasmidin, joka käsittää adenoviruksen Ad5 ·’·1 2· vasemmanpuoleisen osan, kyseisten kahden yhdistelmä-DNA:n • · : ja adenovirus-Ad5-alueen (joka vastaa proteiinia IX) ja • · eri deleetiot käsittävän defektiivisen adenoviruksen DNA:n !· · 25 välillä.
• · « • · *. 1 1. Vektorin pAD5-gpl9k-figal rakentaminen (kuvio 3) • 1 1.1. Plasmidin pGEM-gpl9k rakentaminen • ta V 1 Plasmidi pAD5-gpl9k-Sgal sisältää adenovirusprote- iinia gpl9k koodittavan cDNA-sekvenssin. Tämä plasmidi • · *,V 30 rakennettiin seuraavasti. Villi-Ad5-adenoviruksen genomin M· •tt>1 Xbai - fragmentti, joka sisältää E3-alueen, eristettiin ja |·, kloonattiin plasmidin pGEM (Promega) vastaavaan kohtaan, • a · *!!/ jolloin saatiin plasmidi pGEM-E3. gpl9k:ta koodittavan • a sekvenssin sisältävä HinfI-fragmentti (villi-Ad5-adenovi- 2 · • 1#ί 35 rusnukleotidit 28 628 - 29 634) eristettiin sitten plas- • a • ta • M « · 26 119176 midista pGEM-E3. Tämän fragmentin päät tasattiin sitten käyttämällä EL. colin DNA-polymeraasi-I:n Klenow-fragmenttia (vrt. molekyylibiologian yleiset tekniikat), minkä jälkeen saatu fragmentti kloonattiin plasmidin pGEMzf+ 5 (Promega) SmaI-kohtaan.
Saatu plasmidi nimetiin pGEM-gpl9k:ksi (kuvio 3).
1.2. Vektorin pAD5-gpl9k-£gal rakentaminen Tässä esimerkissä kuvataan plasmidin rakentamista, joka sisältää omat promoottorinsa käsittävät kaksi yhdis-10 telmä-DNA:ta, adenovirusgenomin vasemmanpuoleisen osan ja ylimääräisen osan (proteiini pIX), joka mahdollistaa homologisen DNA-yhdistymisen. Tämä vektori rakennettiin plasmidista pAd.RSVfiGal seuraavasti.
Plasmidi pAd.RSVSGal sisältää 5' -» 3' -suunnassa: 15 PvuII-fragmentin, joka vastaa adenoviruksen Ad5 vasenta päätä ja käsittää: ITR-sekvenssin, replikaatioal-kukohdan, kapsidaatiosignaalit ja ElA-monistajan; β-galaktosidaasia koodittavan geenin RSV- (Rous-sarkoomavirus) promoottorin kontrollissa; 20 toisen fragmentin adenovirus-Ad5-genomista, joka mahdollistaa homologisen DNA-yhdistymisen plasmidin pAd.RSVSGal ja adenoviruksen dl324 välillä. Plasmidia * * : pAd.RSVSGal kuvaavat Stratford-Perricaudet et ai. f J.
• ·· •I ·* Clin. Invest. 90 (1992) 6261 .
• · * - - \ r j • » ,,I 25 Plasmidi pAd.RSVSGal leikattiin ensiksi entsyy- • * i *. * meillä EagI ja Clal. Tällöin muodostuu ensimmäinen frag- • · J *’ mentti, joka käsittää etenkin Ad5-adenoviruksen vasemman-
·*« J
• * * V * puoleisen osan ja RSV:n LTR-promoottorin. Rinnan plasmidi pAd.RSVfiGal leikattiin myös entsyymeillä EagI ja Xbal.
• · ί.ί,ϊ 30 Tällöin muodostuu toista tyyppiä edustava fragmentti, jo- ka käsittää etenkin RSV:n LTR-promoottorin, LacZ-geenin ja • j. Ad5-adenovirusgenomista fragmentin, joka mahdollistaa ho- • * · mologisen DNA-yhdistymisen. Sitten Clal-EagI- ja EagI- » · *;·* Xbal-fragment it ligatoitiin plasmidin pGEM-gpl9k (esi- • t t • *1 35 merkki 1.1) Xbal-Clal-fragmentin läsnä ollessa, joka kä- • · • · · • *· • · 27 119176 sittää gpl9k:ta koodittavan sekvenssin (vrt. kuvio 3). Näin saatu vektori, joka nimetiin pAD%-gpl9k~figal:iksi, sisältää siis
PvuII-fragmentin, joka vastaa adenoviruksen Ad5 5 vasenta päätä ja käsittää: ITR-sekvenssin, replikaatioal-kukohdan, kapsidaatiosignaalit ja ElA-monistajan; gpl9k-,ta koodittavan sekvenssin RSV:n (Rous-sar-koomavirus) promoottorin kontrollissa; β-galaktosidaasia koodittavan geenin RSV- (Rous-10 sarkoomavirus) promoottorin kontrollissa; ja toisen fragmentin adenovirus-Ad5-genomista, joka mahdollistaa homologisen DNA-yhdistymisen.
2. Yhdistelmä-DNA-adenovirusten rakentaminen 2.1. Yhdistelmä-DNA-adenoviruksen rakentaminen, 15 josta on deletoitu alue El, ja joka käsittää kyseiset kaksi yhdistelmä-DNA!ta insertoituina samoin suuntautuneina alueelle El
Vektorista pAD5-gpl9k-i3gal tehtiin lineaarinen ja se kotransfektoitiin El-geenin suhteen defektiivisen ade- 20 novirusvektorin kanssa apusoluihin (solulinja 293), jotka tuovat en trans adenoviruksen El-alueiden (E1A ja E1B) iV. koodittamat funktiot.
• · • · .·. : Täsmällisemmin adenovirus Ad-gpl9k-15gal,delta-El
• M
•It·* saatiin homologisella DNA-yhdistymisellä in vivo adenovi- e · I. m, 25 ruksen Ad-RSVISgal (vrt. Stratford-Perricaudet et ai. . sup- • e e _ *# * ra) ja vektorin pAD%-gpl9k-6gal välillä seuraavan proto- • s kollan mukaan: plasmidi pAD%-gpl9k-Sgal, josta oli tehty V* lineaarinen XmnI-.llä, ja adenovirus Ad-RSVJägal, josta oli tehty lineaarinen entsyymillä Clal, kotransfektoitiin so- • s ·.!.! 30 lulinjaan 293 kalsiumfosfaatin läsnä ollessa homologisen i"]: DNA-yhdistymisen mahdollistamiseksi. Näin muodostetut yh- . distelmä-DNA-adenovirukset valikoitiin sitten plakkipuh- • · ♦ '!*.* distuksella. Eristämisen jälkeen yhdistelmä-DNA-adenovi- • · **J·’ ruksen DNA:ta monistettiin solulinjassa 293, mikä johtaa ·· i • *βί 35 viljelmäsupernatanttiin, joka sisältää ei puhdistettua • · t f · • ·· 28 119176 defektiivistä yhdistelmä-DNA-adenovirusta, jonka tiitteri on noin 1010 pmy/ml.
Viruspartikkeleita puhdistetaan yleensä sentrifu-goimalla seesiumkloridigradienttia käyttäen tunnettujen 5 tekniikoiden mukaan [katso etenkin Graham et ai.. virology 52 (1973) 456]. Adenovirus Ad-gpl9k-6gal,delta-El voidaan säilyttää -80 °C*. ssa 20-%:isessa glyserolissa.
2.2. Yhdistelmä-DNA-adenoviruksen rakentaminen/ josta on deletoitu alueet El ja E3 ja joka käsittää ky-10 seiset kaksi yhdistelmä-DNA:ta insertoituina samoin suuntautuneina alueelle El (kuvio 4)
Vektorista pAD%-gpl9k-Sgal tehtiin lineaarinen ja se kotransfektoitiin geenien El ja E3 suhteen defektiivi-sen adenovirusvektorin kanssa apusoluihin (solulinja 293), 15 joka tuo en trans adenovirusalueiden El (E1A ja E1B) koo-dittamat funktiot.
Täsmällisemmin adenovirus Ad-gpl9k-Sgal,delta-El,-delta-E3 saatiin homologisella DNA-yhdistymisellä in vivo adenovirusmutantin Ad-dll324 [Thimmappaya et ai.. Cell 31 20 (1982) 543] ja vektorin pAD%-gpl9k-figal välillä seuraavan protokollan mukaan: plasmidi pAD%-gpl9k-figal ja adenovi-·*·*: rus Ad-dll324, josta oli tehty lineaarinen entsyymillä φ · .'.J Clal, kotransfektoitiin solulinjaan 293 kalsiumfosfaatin • * !V, läsnä ollessa homologisen DNA-yhdistymisen mahdollistami- • · 25 seksi. Näin muodostetut yhdistelmä-DNA-adenovirukset va- • · !. * likoitiin sitten plakkipuhdistuksella. Eristämisen jäi- * ·· *,,, keen yhdistelmä-DNA-adenoviruksen DNA:ta monistettiin so- * · · *·* lulinjassa 293, mikä johtaa viljelmäsupernatanttiin, joka sisältää ei puhdistettua defektiivistä yhdistelmä-DNA- • * \V 30 adenovirusta, jonka tiitteri on noin 1010 pmy/ml.
·#
Viruspartikkeleita puhdistetaan yleensä sentrifu- : .·. goimalla seesiumkloridigradienttia käyttäen tunnettujen **· · ,···, tekniikoiden mukaan [katso etenkin Graham et ai. . Virology • · 52 (1973) 456]. Yhdistelmä-DNA-adenoviruksen genomi toden- !*·*· — ! ,* 35 nettiin sitten Southern blot -analyysillä. Adenovirus Ad- • * • · · • ·· • · 29 119176 gpl9k-£gal,delta-El,delta-E3 voidaan säilyttää -80 °C:ssa 20-%:isessa glyserolissa.
Esimerkki 2
Keksinnön mukaisen lääkeyhdistelmän immuunisuoja-5 aktiivisuuden osoittaminen 60 täysikasvuista naaraspuolista DBA/2-hiirtä jaettiin sattumanvaraisesti kuuteen 10 hiiren ryhmään, minkä jälkeen ryhmiä käsiteltiin vastaavasti seuraavien ruiskutusprotokollien mukaan: 10 Ryhmä la: Tähän ryhmään annettiin silmänsisäisenä ruiskeena 10 yg anti-CD3-vastaista monoklonaalista vasta-ainetta päivinä -2, -1, 1, 2, 3, 4 ja 5 antaen päivänä 0 laski-monsisäisenä ruiskeena 4xl09 pmy Ad-RSV-£gal-virusta (vrt. 15 Stratford-Perrricaudet et ai,. supra)-Ryhmä Ib: Tämä ryhmä sai saman käsittelyn kuin ryhmä la käyttäen viruksena 4xl09 pmy virusta Ad-gpl9k-figal (kuvio 4) .
2 0 Ryhmä 2a: Tälle ryhmälle annetaan vatsaontelon sisäisenä ruiskeena 250 yg monoklonaalista anti-CD4-vasta-ainetta • · : päivinä -2, -1, 1, 4, 7 antaen päivänä 0 laskimonsisäisenä • ·· ··,·] ruiskeena 4xl09 pmy Ad-RSV£gal-virusta.
!. :1 25 Ryhmä 2b: • « · j.2 Tälle ryhmälle annetaan sama käsittely kuin ryh- • 9 • " mälle 2a käyttäen viruksena 4xl09 pmy Ad~gpl9k-Sgal-vi- *.1 : rusta.
Ryhmä 3a: • 9 30 Tälle ryhmälle annetaan laskimonsisäisenä ruiskee- :3: na 4xl09 pmy Ad-Bgal:ia antamatta samanaikaisesti immu- *· . ^ nosuppressoria.
:;i.: Ryhmä 3b: • » • · • · · ·1 1 • · 9 Φ · • · · 9 9 9 2 9 99 3 9 9 30 119176 Tälle ryhmälle annetaan laskimonsisäisenä ruiskeena 4xl09 pmy Ad-gpl9k-J5gal: ia antamatta samanaikaisesti immunosuppressoria.
Eri ajankohtina kaksi eläintä kustakin ryhmästä 5 uhrattiin ja poistettiin maksa ja perna.
2.1. Pääasiallisten lymfosyyttialapopulaatioiden (CD3+, CD4+ ja CD8+) jakauman analyysi immuuni fluoresenssilla pernasoluista, jotka on otettu päivänä 15 ruiskeen jälkeen 10 Valmistettiin eristettyjen solujen suspensio läh tien poistetuista pernoista. Solunäyte analysoitiin im-muunifluoresenssilla käyttäen kullekin lymfosyyttialapo-pulaatiolle spesifisiä vasta-aineita. Fluoresoivat solut luettiin sytofluorometrillä (FACS Schan-Becton Dickinson). 15 Seuraavassa taulukossa I esitetään tulokset.
Taulukko I
Ryhmä 3a Ryhmä 3b Ryhmä la Ryhmä 2a Ad-figal Ad-figal- anti-CD3/ anti-CD4/ 20 gpl9k Ad-figal Ad-figal
Solujen %-osuus, jotka ilmentävät figal:in solupin- nallaan rv. CD3 20,0 17,5 20,6 21 5,4 6,1 12 10,3 !·.1: CD4 13,4 12,6 15,3 16,8 4,4 5,1 2,7 4,1 e se 25 CD8 5,5 5,5 6,1 6 2,02 2,3 7,9 6,6 • e • e • e e e · 1
Huomataan CD3+-, CD4+- ja CD8+-solujen nettovähen- e · tyminen anti-CD3:lla käsitellyissä eläimissä ja CD4+-so-V’ lujen selektiivinen vähennys anti-CD4tllä käsitellyissä 30 eläimissä.
♦ · S.!.: 2.2. 32 päivän kuluttua ruiskeesta otettujen per- ·”1: nasolujen sytotoksisen kapasiteetin analyysi, kun perna- j 2a soluja on stimuloitu in vitro figalsin ilmentäviin kudos- *".1 yhteensopiviin kohteisiin nähden • · *·;·1 35 Toista näytettä käsiteltyjen eläinten pernoista • eristettyjä pernasoluja viljeltiin in vitro 4 päivän ajan 2 • · • · e • «e • · 31 119176 β-galaktosidaasin pinnallaan ilmentävien P815-solujen läsnä ollessa. Viljelyn päätyttyä arvioitiin pernasolujen sytotoksinen aktiivisuus verrattuna Cr51-leimattuihin P815-Sgal-kohteisiin. Sytotoksinen aktiivisuus ilmaistuna syto-5 lyysi-%:na määritettiin tavanomaiseen tapaan käyttäen vaikuttaja- ja kohdesolujen erilaisia suhteita. Tulokset esitetään seuraavssa taulukossa II.
Taulukko II
10 Ryhmä 2b 3A
Käsittely Anti-CD4/ AD-Sgal
Ad-figal-gpl9k
Suhde
Vaikuttajät/kohteet Sytolyysi-% 15 80/1 4 2 13 14 40/1 2 1 13 9 20/1 11 59 10/1 0 0 2 5 5/1 01 12 20
Pernasolut, jotka on otettu eläimistä, jotka ovat saaneet anti-CD4-käsittelyn, eli ryhmä 2b, osoittavat sy-..t. totoksisen kapasiteettinsa hyvin selvää neutraloitumista.
e · 2.3. B-galaktosidaasiaktiivisuuden ilmentäminen « 1 · (1 / 25 maksassa 15 ja 32 päivän kuluttua • · 1 S ·1 Maksat paloiteltiin ja värjättiin X-gal:illa β-ga- • · · ! .1 laktosidaasiaktiivisuuden ja eosiinin toteamiseksi leik- s s • 1·· kauksen histologian osoittamiseksi. Tulokset esitetään • · · i.J i seuraavassa taulukossa III.
• ♦ « » · * 1 ♦ • ♦ • •e • · • 1 * · • · · * ♦ ♦ ··· · • · · * · • e • 1 » ·· · • · · e · • · ♦ • · ♦ • ·· • · 32 119176
Taulukko III
Sgaltin ilmentävien solujen lukumäärä 15 päivää 32 päivää 5 Ryhmä 2a: (anti-CD4/Ad-Sgal) 1 1
Ryhmä 2b: (anti-CD4/Adgpl9k-£gal) 250 50
Ryhmä 3a: (Ad-Sgal) 3 0
Ryhmä 3b: (Adgpl9k-figal) 25 0 10 Edeltävistä tuloksista ilmenee, että ruiskuttamal la anti-CD4-vasta~ainetta yhdessä Adgpl9k-£gal-ruiskeen kanssa indusoidaan kyseessä olevan geenin selvästi pitkäaikaisempi ilmentyminen. Täten 30 päivän kuluttua ruiskeista havaitaan ryhmän 2b kohdalla merkittävä £-galakto-15 sidaasiaktiivisuus. Tämä pidennys, joka voidaan tulkita seuraukseksi keksinnön mukaan indusoidusta toleranssi-ilmiöstä, on selvästi parempi kuin se, joka voitaisiin saada yksinkertaisesti limittämällä anti-CD4:n ja vastaavasti yhdistelmä-DNA-adenoviruksen Adgpl9k-Egal immunosuppres-20 sorivaikutukset.
*· « • · · • ♦ • · • · • · · • ··
V I
• e · • « · • · • 9 ·· · • · · • · • · ·· 9 9 9 99 9 999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 999 9 9 9 9 999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 999 9 99 9 9 9 9 9 999 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9
Claims (25)
1. Lääkeyhdistelmä vähintään yhdestä immunosuppres-sorista ja vähintään yhdestä yhdistelmä-DNA-adenoviruk- 5 sesta, jonka genomi käsittää ensimmäisen yhdistelmä-DNA:n, joka sisältää terapeuttisen geenin, ja toisen yhdistelmä-DNA:n, joka sisältää immunosuojageenin, ajallisesti toisiaan seuraavaan, jaksottaiseen ja/tai samanaikaiseen käyttöön, joka lääkeyhdistelmä on käyttökelpoinen eksogeenien 10 transfektointeihin in vivo ja/tai ex vivo.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen lääkeyhdistelmä, tunnettu siitä, että immunosuppressori valitaan edullisesti syklosporiinista, FK506:sta, atsatiopriinista, korti-kosteroideista ja mono- tai polyklonaalisista vasta- 15 aineista.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen lääkeyhdistelmä, tunnettu siitä, että kyseessä on vasta-aine, joka kykenee inaktivoimaan immuunimolekyylejä tai aiheuttamaan näitä molekyylejä kantavien immuunisolujen tuhon.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen lääkeyhdistelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine valitaan seuraavista: Γν anti-CD4, -CD2 -CD3, -CD8, -CD28, -B7, -ICAM-1, -LFA-1 ja CTLA4ig.
5. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen · ·1·1; 25 lääkeyhdistelmä, tunnettu siitä, että terapeuttinen • · :\ geeni koodittaa terapeuttista proteiinia. • ·
6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen lää- • · · keyhdistelmä, tunnettu siitä, että terapeuttinen geeni . , koodittaa terapeuttista RNA:ta. • « i *·1·1 30
7. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen • · *···' lääkeyhdistelmä, tunnettu siitä, että immunosuojageeni • on geeni, jonka tuote vaikuttaa pääasiallisen histokompati- ··· · .2·. biliteettikompleksin (MHC) aktiivisuuteen tai sytokiinien • · « ##\ aktiivisuuteen. • · · • · • · · • · ♦ • ·♦ 2 ♦ · 119176
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen lääkeyhdistelmä, tunnettu siitä, että immunosuojageeni on geeni, jonka tuote inhiboi ainakin osittain MHC-proteiinien ilmentymisen tai antigeenipresentaation.
9. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen lääkeyhdistelmä, tunnettu siitä, että immunosuojageeni valitaan seuraavista: adenoviruksen gpl9k-geeni, herpes viruksen ICP47-geeni tai sytomegaloviruksen UL18-geeni.
10 E4.
10. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen 10 lääkeyhdistelmä, tunnettu siitä, että adenovirusgenomin mainitut kaksi yhdistelmä-DNA:ta muodostavat yhden yksittäisen transkriptioyksikön.
11. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen lääkeyhdistelmä, tunnettu siitä, että mainitut kaksi 15 yhdistelmä-DNA:ta käsittävät kumpikin transkriptiopromoot- torin, jotka ovat identtiset tai erilaiset.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen lääkeyhdistelmä, tunnettu siitä, että mainitut kaksi yhdistelmä-DNA:ta insertoidaan samoin suuntautuneina.
13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen lääkeyhdistel mä, tunnettu siitä, että mainitut kaksi yhdistelmä- ·· · : *.* DNA: ta insertoidaan vastakkaisesti suuntautuneina. * Λ V*:
14. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen : lääkeyhdistelmä, tunnettu siitä, että mainitut kaksi ·***: 25 yhdistelmä-DNA: ta insertoidaan adenovirusgenomissa samaan • « i\ kohtaan, edullisesti alueille El, E3 tai E4.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen lääkeyhdistel- • · · mä, tunnettu siitä, että mainitut kaksi yhdistelmä- .. DNA:ta insertoidaan alueelle El. • · · • « · *.* 30
16. Jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukainen lää- • · *···* keyhdistelmä, tunnettu siitä, että mainitut kaksi yh- : distelmä-DNA: ta insertoidaan adenovirusgenomissa eri koh- tiin. ·♦· ·♦ · • ♦ · • » • · • * • · ♦ • ♦· • · 119176
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen lääkeyhdistelmä, tunnettu siitä, että yksi yhdistelmä-DNA-sekvens-seistä insertoidaan alueelle El ja toinen alueelle E3 tai E4.
18. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen lääkeyhdistelmä, tunnettu siitä, että adenovirus on de-fektiivinen yhdistelmä-DNA-adenovirus, joka käsittää ITR-sekvenssit, kapsidaation mahdollistavan sekvenssin ja josta on deletoitu kokonaisuudessaan tai osittain geenit El ja
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen lääkeyhdistelmä, tunnettu siitä, että kyseessä on adenovirus, joka käsittää ITR-sekvenssit, kapsidaation mahdollistavan sekvenssin ja josta on deletoitu kokonaisuudessaan tai osit- 15 tain geenit El, E3 ja E4.
20. Jonkin patenttivaatimuksen 1-19 mukainen lääkeyhdistelmä, tunnettu siitä, että kyseessä on adenovirus, jonka genomista on deletoitu kokonaisuudessaan tai osittain geenit El, E3, L5 ja E4.
21. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen lääkeyhdistelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmä-DNA- ί ·1 adenovirus on ihmis-, eläin- tai seka-alkuperää. * · V1j
22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen lääkeyhdistel- *· » • mä, tunnettu siitä, että ihmisalkuperää olevat yhdis- :11; 25 telmä-DNA-adenovirukset valitaan ryhmään C luokitelluista, • · edullisesti tyypin 2 tai 5 yhdi s te lmä- DNA- adenovi r uks i s t a (Ad2 tai Ad5) . • · ·
23. Patenttivaatimuksen 21 mukainen lääkeyhdistel- #1>1i mä, tunnettu siitä, että eläinalkuperää olevat yhdis- • 1 30 telmä-DNA-adenovirukset valitaan adenoviruksista, jotka • · ***** ovat peräisin koirasta, naudasta, hiirestä, lampaasta, : siasta, linnusta ja apinasta. ··1 • · • · • · · ♦ ♦ · · • 1 · • » · • · · • ·» ft · 119176
24. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen lääkeyhdistelmä, tunnettu siitä, että immunosuppressori on käytettävissä ennen adenovirusruisketta ja sen jälkeen.
25. Jonkin patenttivaatimuksen 1-23 mukainen lää-5 keyhdistelmä, tunnettu siitä, että immunosuppressori ja yhdistelmä-DNA-adenovirus on käytettävissä samanaikaisesti. ·· · • · · • « φ · v · · • 1» • · ·· 1 • « · • » • · I· · • 1 · • · • · f1 t m • · · • 1 · » · · * 9 · • 4 · · t » I • 1 «»1 » · • · ··· • ♦ • · · • · · «M · t · · • I • · • · 1 «· « • · · • • · · • · « f# • Φ 119176
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9501662 | 1995-02-14 | ||
| FR9501662A FR2730411B1 (fr) | 1995-02-14 | 1995-02-14 | Association medicamenteuse utile pour la transfection et l'expression in vivo d'exogenes |
| FR9600218 | 1996-02-12 | ||
| PCT/FR1996/000218 WO1996025177A1 (fr) | 1995-02-14 | 1996-02-12 | Association medicamenteuse utile pour la transfection et l'expression in vivo d'exogenes |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI973323A FI973323A (fi) | 1997-08-13 |
| FI973323A0 FI973323A0 (fi) | 1997-08-13 |
| FI119176B true FI119176B (fi) | 2008-08-29 |
Family
ID=9476106
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI973323A FI119176B (fi) | 1995-02-14 | 1997-08-13 | Lääkeyhdistelmä, joka on käyttökelpoinen eksogeenien transfektioon ja ilmentämiseen in vivo |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20030004091A1 (fi) |
| EP (1) | EP0809516B1 (fi) |
| JP (1) | JPH11500430A (fi) |
| KR (1) | KR100402540B1 (fi) |
| AT (1) | ATE204481T1 (fi) |
| AU (1) | AU717218B2 (fi) |
| BR (1) | BR9607310A (fi) |
| CA (1) | CA2211039C (fi) |
| CZ (1) | CZ258197A3 (fi) |
| DE (1) | DE69614668T2 (fi) |
| DK (1) | DK0809516T3 (fi) |
| ES (1) | ES2163612T3 (fi) |
| FI (1) | FI119176B (fi) |
| FR (1) | FR2730411B1 (fi) |
| GR (1) | GR3036438T3 (fi) |
| HU (1) | HU222991B1 (fi) |
| IL (1) | IL117116A0 (fi) |
| MX (1) | MX9706017A (fi) |
| NO (1) | NO320072B1 (fi) |
| PT (1) | PT809516E (fi) |
| SK (1) | SK282235B6 (fi) |
| WO (1) | WO1996025177A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA961161B (fi) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6451571B1 (en) | 1994-05-02 | 2002-09-17 | University Of Washington | Thymidine kinase mutants |
| EP0942747A1 (en) * | 1996-08-26 | 1999-09-22 | Chiron Corporation | Postinfection human immunodeficiency virus (hiv) vaccination therapy |
| EP1025242A1 (en) | 1997-10-30 | 2000-08-09 | Cornell Research Foundation, Inc. | A method of inhibiting an immune response to a recombinant vector |
| CA2358385C (en) | 1998-12-31 | 2013-08-06 | Chiron Corporation | Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof |
| WO2000074688A1 (en) * | 1999-06-08 | 2000-12-14 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Methods for preventing formation of inhibitory antibodies in the setting of gene therapy |
| FR2799472B1 (fr) * | 1999-10-07 | 2004-07-16 | Aventis Pharma Sa | Preparation d'adenovirus recombinants et de banques adenovirales |
| IL152450A0 (en) | 2000-05-12 | 2003-05-29 | Genzyme Corp | COMPOUNDS HAVING TNF-alpha SIGNAL MODULATING ACTIVITY |
| WO2003004620A2 (en) | 2001-07-05 | 2003-01-16 | Chiron, Corporation | Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof |
| US7569217B2 (en) * | 2001-09-24 | 2009-08-04 | University Of Saskatchewan | Porcine adenovirus E1 and E4 regions |
| US20030124132A1 (en) * | 2001-09-27 | 2003-07-03 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Combined compositions for tumor vasculature coaguligand treatment |
| US7687530B2 (en) * | 2002-11-21 | 2010-03-30 | Genzyme Corporation | Inhibition of chronic tissue transplant rejection |
| US7217718B2 (en) * | 2002-11-21 | 2007-05-15 | Genzyme Corporation | Induction of immune tolerance |
| CA2554978A1 (en) * | 2004-02-04 | 2005-08-25 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Anti-cd3 and antigen-specific immunotherapy to treat autoimmunity |
| WO2008013918A2 (en) * | 2006-07-26 | 2008-01-31 | Myelin Repair Foundation, Inc. | Cell cycle regulation and differentiation |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994016065A1 (en) * | 1992-12-31 | 1994-07-21 | Exemplar Corporation | Producing cells for transplantation to reduce host rejection and resulting cells |
| AU5965294A (en) * | 1993-01-08 | 1994-08-15 | Exemplar Corporation | An (in vitro)/(in vivo) method for identifying anti-neoplastic drugs |
| FR2705686B1 (fr) * | 1993-05-28 | 1995-08-18 | Transgene Sa | Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes. |
| US5872154A (en) * | 1995-02-24 | 1999-02-16 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method of reducing an immune response to a recombinant adenovirus |
-
1995
- 1995-02-14 FR FR9501662A patent/FR2730411B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-02-12 MX MX9706017A patent/MX9706017A/es unknown
- 1996-02-12 EP EP96903080A patent/EP0809516B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-12 US US08/894,246 patent/US20030004091A1/en not_active Abandoned
- 1996-02-12 AU AU47238/96A patent/AU717218B2/en not_active Ceased
- 1996-02-12 CZ CZ972581A patent/CZ258197A3/cs unknown
- 1996-02-12 BR BR9607310A patent/BR9607310A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-02-12 WO PCT/FR1996/000218 patent/WO1996025177A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1996-02-12 DE DE69614668T patent/DE69614668T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-12 CA CA2211039A patent/CA2211039C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-12 PT PT96903080T patent/PT809516E/pt unknown
- 1996-02-12 ES ES96903080T patent/ES2163612T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-12 SK SK1108-97A patent/SK282235B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1996-02-12 KR KR1019970705594A patent/KR100402540B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-02-12 AT AT96903080T patent/ATE204481T1/de active
- 1996-02-12 JP JP8524707A patent/JPH11500430A/ja not_active Ceased
- 1996-02-12 IL IL11711696A patent/IL117116A0/xx unknown
- 1996-02-12 DK DK96903080T patent/DK0809516T3/da active
- 1996-02-12 HU HU9800635A patent/HU222991B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-02-13 ZA ZA961161A patent/ZA961161B/xx unknown
-
1997
- 1997-08-13 FI FI973323A patent/FI119176B/fi not_active IP Right Cessation
- 1997-08-13 NO NO19973724A patent/NO320072B1/no not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-08-23 GR GR20010400947T patent/GR3036438T3/el unknown
-
2004
- 2004-04-14 US US10/823,682 patent/US20040265276A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1749098B1 (en) | Chimeric adenoviruses for use in cancer treatment | |
| KR100356615B1 (ko) | 결함아데노바이러스벡터및유전자치료에서그의사용 | |
| CN106471125B (zh) | 包括白蛋白结合部分的腺病毒 | |
| JP3816952B2 (ja) | 治療遺伝子と免疫保護遺伝子とを含む欠陥アデノウイルス | |
| FI119176B (fi) | Lääkeyhdistelmä, joka on käyttökelpoinen eksogeenien transfektioon ja ilmentämiseen in vivo | |
| CZ302895A3 (en) | The use of recombinant adenovirus of animal origin for preparing a pharmaceutical preparation | |
| FR2707664A1 (fr) | Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique. | |
| FR2729674A1 (fr) | Cellules pour la production d'adenovirus recombinants |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 119176 Country of ref document: FI |
|
| MM | Patent lapsed |