FI118969B - Rekombinantit alfa-amylaasivariantit - Google Patents

Rekombinantit alfa-amylaasivariantit Download PDF

Info

Publication number
FI118969B
FI118969B FI953128A FI953128A FI118969B FI 118969 B FI118969 B FI 118969B FI 953128 A FI953128 A FI 953128A FI 953128 A FI953128 A FI 953128A FI 118969 B FI118969 B FI 118969B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
peroxidase
residue
amylase
acid
detergent
Prior art date
Application number
FI953128A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI953128A (fi
FI953128A0 (fi
Inventor
Torben Halkier
Grethe Rasmussen
Egon Nielsen
Original Assignee
Novozymes As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novozymes As filed Critical Novozymes As
Publication of FI953128A publication Critical patent/FI953128A/fi
Publication of FI953128A0 publication Critical patent/FI953128A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI118969B publication Critical patent/FI118969B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38627—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

118969
Rekombinantit alfa-amylaasivariantit - Rekombinanta alfa-amylasvarianter 5 Tämä keksintö liittyy α-amylaasivariantteihin, jotka on stabiloitu peroksidaasisysteemien aiheuttamaa inaktivoitumista vastaan. Siinä a-amylaasivariantista on deletoitu luonnossa ilmenevä tyrosiinitähde tai se on substituoitu eri aminohappotähteellä yhdessä tai useammassa kohdassa.
10
Keksintö liittyy myös menetelmään a-amylaasin stabiloimiseksi peroksidaasisysteemin aiheuttamaa inaktivoitumista vastaan samoin kuin pesuainekoostumuksiin, jotka sisältävät keksinnön mukaista a-amylaasivarianttia.
15
Peroksidaasit (EC 1.11.1.7) ovat entsyymejä, jotka katalysoivat substraatin (elektroni tai vetydonori) hapettumista vetyperoksidin avulla. Tunnetaan mikrobeista, kasveista sekä eläimistä peräisin olevia tällaisia entsyymejä, esim. Cop-20 rinus cinereus -peroksidaasi (vrt. esim. EP-patenttihakemus 179486). Ne ovat tyypillisesti hemoproteiineja, ts. ne sisältävät hemin prosteettisena ryhmänä.
·*;*· Peroksidaasin käyttö yhdessä vetyperoksidin tai vetyperoksi- t · .·. ϊ 25 diprekursorin kanssa on tuotu esiin esim. massan valkaisuun • · paperinvalmistuksessa, massanvalmistuksesta muodostuvien jä- • t ••S' tevesien käsittelyyn, parempaan pyykinpesuaineiden vai- • ' · kaisukykyyn sekä ligniinin modifiointiin esim. lastulevyjen • t · *”.* valmistuksessa.
• · « 30
Peroksidaasisysteemejä (joista käytetään myös nimitystä POD- • « : *·* systeemi) , jotka muodostuvat peroksidaasista tai peroksidaa- • · · *itt· si-aktiivisuutta osoittavasta yhdisteestä, vetyperoksidiläh- ,*, j teestä ja peroksidaasitehostimesta, käytetään estämään värjä- • · · 35 tyistä kankaista irtoavia väriaineita asettumasta muihin sa- • · . massa pesussa läsnä oleviin kankaisiin (ilmiö tunnetaan ylei- • i I *·· sesti väriaineiden siirtymisenä) . Tällaisia peroksi- ··· daasi systeemejä 2 118969 sisältäviä pesuainekoostumuksia ja pesunesteitä on kuvattu esim. patenttihakemuksissa WO 92/18687 ja WO 92/18683.
Eräs huomattava haitta tällaisten peroksidaasisyteemien käy-5 tössä pesuainekoostumuksissa on, että peroksidaasisysteemi voi vaikuttaa tällaisissa koostumuksissa läsnä oleviin entsyymeihin voimakkaasti ja siten vähentää pesuainekoostumuksen pesukykyä.
10 Yllättäen on nyt havaittu, että α-amylaasit voidaan stabiloida peroksidaasisysteemien aiheuttamaa inaktivoitumista vastaan deletoimalla tai substituoimalla yksi tai useampi luonnossa ilmenevä tyrosiinitähde erilaisella aminohappotähteellä.
15
Keksinnön kohteena on siis patenttivaatimuksen 1 mukainen a-amylaasivariantti, jossa yksi tai useampi luonnossa esiintyvä tyrosiinitähde on deletoitu tai substituoitu erilaisella aminohappotähteellä.
20
Keksinnön kohteena on myös patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä stabiloida α-amylaasivariantti peroksidaasisysteemien aiheuttamaa inaktivoitumista vastaan deletoimalla tai substi-:Y: tuoimalla yksi tai useampi luonnossa ilmenevä tyrosiinitähde 2 5 erilaisella aminohappotähteellä.
• * • · ··.·. Eräs keksinnön kohteista on pesuainekoostumus, joka sisältää • · j keksinnön mukaista a-amylaasivarianttia.
• « · «·· · «·» • « · i · t t * 30 Lisäksi keksinnön kohteena on pesuainelisäaine, joka käsittää keksinnön mukaista a-amylaasia.
·· • · • ♦· * ··· ·...· Tarkemmin sanoen keksinnön kohteena ovat uudenlaiset a- : amylaasivariantit, jotka on stabiloitu peroksidaasisysteemien • · 35 aiheuttamaa inaktivoitumista vastaan.
• · *» ϊ *·* Tämän keksinnön yhteydessä termi stabiloitu a-amy- ί,,,ί laasivariantti tarkoittaa a-amylaasia, jolla on parempi sta- 118969 3 biilisuus peroksidaasisysteemien aiheuttamaa inaktivoitumista vastaan kuin alkuperäisellä a-amylaasilla.
5 Aminohapot:
Aminohapoista käytetään seuraavia symboleita:
Alaniini Ala A
Systeiini Cys C
10 Asparagiinihappo Asp D
Glutamiinihappo Glu E
Fenylaniliini Phe F
Glysiini Gly G
Histidiini His H
15 Isoleusiini Ile I
Lysiini Lys K
Leusiini Leu L
Metioniini Met M
Asparagiini Asn N
20 Proliini Pro P
Glutamiini Gin Q
Arginiini Arg R
Seriini Ser S
Treoniini Thr T
• ·
·*·,· 25 Väliini Vai V
• · ....: Tryptofaani Trp w
S·.·. Tyrosiini Tyr Y
* « • · • · • » ·
"I.* Asp (D) tai Asn (N) Asx B
• · ·
30 Glu (E) tai Gin (Q) Glx Z
·· • ·
ί ** Satunnainen aminohappo: X
«»* s...: Deleetio tai poissaoleva aminohappo: * • · • · • *· • · 35 • « • Peroksidaasiaktiivisuus: ·· ί *’ Tämän keksinnön yhteydessä peroksidaasien aktiivisuus on il- ··· moitettu peroksidaasiyksikköinä (PODU) . Vetyperoksidin läs- 118969 4 näollessa peroksidaasit (EC 1.11.1.7) katalysoivat 2,2'-atsino-bis(3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonaatin (ABTS) de-hydrogenaation. Muodostuvaa vihreänsinistä väriä tutkitaan fotometrisesti 418 nmrssä. Yksi PODU on entsyymimäärä, joka 5 standardiolosuhteissa (ts. pH 7,0, vetyperoksidi substraattina, 0,1 M fosfaattipuskuri, inkubointilämpötila 30 °C, inku-bointiaika 3 minuuttia kineettisestä mitattuna) katalysoi konvertoitumisen 1 pmol vetyperoksidia/minuutti.
10 Lipaasiaktiivisuus:
Lipaasien entsymaattinen aktiivisuus on ilmoitettu lipaasiyk-sikköinä (Lipase Unit, LU) . LU on ent-syymimäärä, joka standardiolosuhteissa, ts. 30,0 °C, pH 7,0, tributyriinisubst- raatti, vapauttaa 1 μπιοί titrattavaa voihappoa minuutissa.
15 οί-amylaasiaktiivisuus: a-amylaasiaktiivisuus mitataan absorptiona/ml 620 nm:ssä Pha-debas -tablettien avulla (Phadebasv® Amylase Test, Pharmacia Diagnostics, SW). Koe suoritetaan 60°C:ssa.
20
Peroksidaasisysteemit: Tämän keksinnön yhteydessä peroksidaasisysteemillä tarkoitetaan systeemiä, joka muodostuu peroksidaasista tai peroksi- • · I » « daasiaktuvisuutta osoittavasta yhdisteestä, vetyperoksidi- :*·,· 25 lähteestä ja peroksidaasitehostimesta. Tällaisia peroksi- • * ·.»·! daasisysteemejä on käyetty värien siirtymisen estämiseen ja jV, niitä ovat kuvanneet esim. patenttihakmeukset WO 92/18687 ja WO 92/18683 .
• · · • ti · **· • · · • t ♦ * 30 Tällaisissa peroksidaasisysteemeissä peroksidaasi tai perok- sidaasiaktiivisuutta osoittava yhdiste voi olla mikä tahansa • · ! ** peroksidaasi, joka kuuluu entsyymiluokkaan EC 1.11.1.7. tai • · · *φ..* mikä tahansa sellaisesta johdettu fragmentti, joka osoittaa peroksidaasiaktiivisuutta, tai synteettinen tai puolisynteet- • « 35 tinen johdannainen (esim porfyriinirengassysteemi tai mikro- peroksidaasi, vrt. esim. US-4077768, EP-537381 ja WO 91/05858 ϊ *’ ja WO 92/16634). Tällaiset peroksidaasit voivat olla peräi- *·· '...· sin mikrobeista, kasveista tai eläimistä.
118969 5
Peroksidaasi voi olla sellainen, jota tuotetaan kasveissa (esim. piparjuuri- tai soijaperoksidaasi) tai mikro-organismeissa kuten sienissä tai bakteereissa. Joitain suositeltavia sieniä ovat kannat, jotka kuuluvat alajaksoon Deuteromy-5 cotina, luokka Hyphomycetes, esim. Fusarium, Humicola, Trico-derma, Myrothecium, Verticillum, Arthromyces, Caldariomyces, Ulocladium, Embellisia, Cladosporium ja Dreschlera, erityisesti Fusarium oxysporum (DSM 2672), Humicola insolens, Trichoderma resii, Myrothecium verrucana (IFO 6113), Verti-10 cillum alboatrum, Verticillum dahlie, Arthromyces ramosus (FERM P-7754) , Caldariomyces fumago, Ulocladium chartarum, Ebellisia allior ja Dreschlera ha1odes.
Muita suositeltavia sieniä ovat muun muassa kannat, jotka 15 kuuluvat alajaksoon Basidiomycotina, luokka Basidiomycetes, esim. Coprinus, Phanerochaete, Coriolus tai Trametes, erityisesti Coprinus cinereus f. microsporus (IFO 8371), Coprinus macrorhizus, Phanerochaete chrysosporium (esim. NA-12) ja Trametes (aiempi nimitys Polysporus), esim. T. versicolor 20 (esim. pr4 28-A).
Edelleen muita suositeltavia sieniä ovat kannat, jotka kuuluvat alajaksoon Zygomycotina, luokka Mycoraceae, esim. Rhizo-·*;*; pus tai Mucor, erityisesti Mucor hiemalis.
.·. .* 25 • ·· • 9
Actinomycetales luokan kannat ovat eräitä suositeltavia bak- • · ;.t*t teereita, esim. Streptomyces spheroides (ATCC 23965), Strep- « · I tomyces thermoviolaceus (IFO 12382) sekä Streptoverticillum • · t **!,· verticillium ssp. verticillium.
• * * 30
Muita suositeltavia bakteereja ovat muun muassa Bacillus pu- • ; *·· milus (ATCC 12905), Bacillus stearothermophilus, Rhodobacter • · · ί,.,ί sphaeroides, Rhodomonas palustri, Streptococcus lactis, Pseu- X · domonas purrocinia (ATCC 15958) sekä Pseudomonas fluorescens X/. 35 (NRRL B-ll) .
« * • · ; *·· Edelleen suositeltavia bakteereja ovat Myxococcus-kantoihin :1: kuuluvat, esim M. virescens.
··· 118969 6
Muita mahdollisia käyttökelpoisia erityisperoksidaasilähteitä on lueteltu teoksessa Saunders, B C, op. cit., pp. 41-43.
Peroksidaasit voivat lisäksi olla sellaisia, jotka saadaan 5 tuotettua menetelmällä, jossa viljellään isäntäsolua, joka on transformoitu rekombinantti-DNA-vektorilla, jossa on tätä pe-roksidaasia koodaava DNA-sekvenssi samoin kuin DNA-sekvenssi, joka koodaa funktioita, jotka mahdollistavat peroksidaasia koodaavan DNA-sekvenssin ekspression viljelyväliaineessa olo-10 suhteissa, joissa peroksidaasin ekspressio on mahdollinen, ja kokoamalla sitten peroksidaasi viljelmästä talteen.
Erityisesti tämä rekombinantisti tuotettu peroksidaasi saisi olla peroksidaasi, joka on johdettu Coprinus sp. -lajeista, 15 tarkemmin sanoen Coprinus macrorhizuksesta tai cinereuksesta tavalla, jonka on esittänyt WO 92/16634.
Tämän keksinnön yhteydessä peroksidaasiaktiivisuutta osoittaviksi yhdisteiksi katsotaan peroksidaasiaktiiviset fragmen-20 tit, jotka on johdettu sytokromeista, hemoglobiinista tai pe-roksidaasientsyymeistä sekä näiden synteettiset tai puolisynteettiset johdannaiset, esim. rautaporfiinit, rautaporfy-riinit sekä rautaftalosyaniini ja niiden johdannaiset.
• · * · « • · · • · .*.J 25 Peroksidaasisysteemeissä tehostin voi olla hapettava sub- • · straatti, esim. metalli-ioneja tai fenoliyhdisteitä kuten 7- •V. hydroksikoumariini (7HCm), vanilliini (VAN) ja p- ♦ · j ^ hydroksibentseenisulfonaatti (pHBS), joita ovat kuvanneet *".* esim. WO 92/18683, WO 92/18687 ja Kato M, and Shimizu S, *·* * 30 Plant Cell Physiol. 26 (7):1291-1301, 1985 (vrt. erityisesti taulukko 1), sekä Saunders, B C et ai, Peroxidase :141 ff, : *·* Lontoo 1964, taikka 2,2 '-atsino-bis-(3- *·· :.,,J etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonaatti) (ABTS) , jota on kuvat- .·. j tu hakijan samanaikaisessa patenttihakemuksessa DK-9201441.
• ·· • « • · ·* • · 1 • ♦ • · ··· 7 118969
Lipaasit:
Lipaasi voidaan saada Humicola-kannasta, esim. H. lanuginosa, H. brevispora, H. brevis var. thermoidea tai H. insolens. Humicola-peräisiä lipaaseja kuvaavat esim. US-4810414, EP-5 305216 ja WO 89/01969, jotka on oheistettu.
Lipaasi voidaan myös saada Pseudomonas-kannasta, esim. Ps. cepacia, Ps. fragi, Ps. stutzeri tai Ps. fluorescens. Pseu-domonas-peräisiä lipaaseja kuvaa esim. WO 89/04361, joka on 10 oheistettu.
Lipaasi voidaan myös saada Fusarium-kannasta, esim. F. oxy-sporum. Fusarium-peräisiä lipaaseja kuvaavat esimerkiksi ep-130064 ja EP-359678, jotka on oheistettu.
15
Lipaasi voidaan myös saada Rhizomucor-kannasta, esim. Rhizo-mucor miehei, tai Candida-kannasta, esim. C. antarctica tai C. cylindracea (käytetän myös nimitystä c. rugosa), tai Chro-mobacterium-kanta, esim. C. viscosum.
20
Eräs lipaasivariantti on Humicola lanuginosa -lipaasi, jonka aminohapposekvenssi on EP-305216:ssa julkaistun mukainen (julkaisussa aminohapposekvenssi on esitetty kuviossa 5) ja • · *.V joka sekvenssi on muutettu yhdessä tai useammassa seuraavista V·: 25 asemista: 16, 21, 53, 138, 164, 171, 194, 213, 220, 261.
• · ·***: Amylaasit: • · : Edullisessa toteutusmuodossa keksinnön mukainen a-amylaasi- i · « «** * variantti saadaan Bacillus- tai Aspergillus-kaimasta.
• i * 30 .. Spesifisemmässä toteutusmuodossa a-amylaasivariantti saadaan • · *..* B. licheniformis -kannasta. B. licheniformis 584 a-amylaasin • · *"·* aminohapposekvenssi (Stephens et ai) on ilmestynyt teoksissa : J. Bacteriol. 158:369-372, 1984, ja J. Bacteriol. 166:635- • · ·:··: 35 643, 1986, FR-2665178 ja EP-410498. Tyrosiiniasemat ovat siis: 10, 14, 31, 46, 59, 62, 77, 98, 150, 158, 175, 193, * · 195, 198, 203, 219, 262, 273, 290, 302, 348, 358, 367, 394, : 396, 402, 439, 480.
118969 8
Eräässä toisessa spesifisessä toteutusmuodossa a-amylaasiva-riantti saadaan B. amyloliquefaciens -kannasta. B. amyloli-quefaciens α-amylaasin aminohapposekvenssi on julkaistu {Takkinen et ai) teoksessa J. Biol. Chem. 258:1007-1013, 1983.
5
Kolmannessa spesifisessä toteutusmuodossa a-amylaasivariantti saadaan B. stearothermophilus-kannasta. B. stearothermophi-lus α-amylaasin aminohapposekvenssi on esitetty teoksessa J. Bacteriol. 166:635-643, 1986.
10
Neljännessä spesifisessä toteutusmuodossa a-amylaasivariantti saadaan A. niger -kannasta. A. niger α-amylaasin aminohappo-sekvenssi on esitetty patenttihakemuksessa DK-5126/87.
15 Vielä muutamissa spesifisissä toteutusmuodoissa keksinnön mukaiset α-amylaasivariantit ovat kimeerisiä a-amylaaseja. Ki-meerisiä α-amylaaseja on esitetty esim. patenttijulkaisussa EP-252666.
20
Menetelmiä lipaasien ja a-amylaasien stahiloimiseksi: Tämän keksinnön kohteena on menetelmä stabiloida a-amylaaseja peroksidaasisysteemien aiheuttamaa inaktivoitumista vastaan :.V deletoimalla tai substituoimalla yksi tai useampi luonnossa • · :.**i 25 ilmenevä tyrosiinitähde erilaisella aminohappotähteellä.
• » Γ**: Rekombinantisti tuotetut lipaasit ja a-amylaasit: • · • Aiemmin on kehitetty lukuisia prosesseja polypeptidien tai ·»· · proteiinien tuottamiseksi yhdistelmä-DNA-tekniikoin. Taval-30 lisimmin käytettäviä lajeja ovat E. coli, Bacillus subtilis, ··, Saccharomyces cervisiae sekä erilaiset Apergillus-kannat, • · * esim. A. oryzae ja A. niger. Erityisesti Aspergillukset ovat puoleensavetäviä isäntäorganismiehdokkaita yhdistelmä-DNA- • » !.*·: vektoreiksi, koska ne on karakterisoitu hyvin ja ne ovat laa- *:··: 35 jalti käytössä olevia mikro-organismeja kaupallisten entsyy- ·.* mien valmistuksessa. Aspergillus oryzaen kohdalla on kehi- • · *... telty menetelmiä organismin transformoimiseksi ja useiden eri * * "· entsyymien tuottamiseksi, muiden muassa Humicola lanuginosa 118969 9 ja Rhizomucor miehei -lipaasien (katso esim. patenttihakemukset EP-238023 ja 305216 sekä WO 89/01969, jotka on oheistettu) .
5 Polypeptidien biosynteettinen ekspressio:
Kun transformoidaan organismi polypeptidin tai proteiinin tuot-tamiseksi organismiin viedään DNA-sekvenssi. Tämä sekvenssi sisältää kiinnostuksen kohteena olevan geenin koodaus-alueen sivuillaan transkriptio/translaatioaloitussignaalit ja 10 transkriptio/translaatiolopetussignaalit. Koodausalue sisältää kolmen emäsparin yksiköitä, kodoneja, jotka transkriboitavan geenin translaatiossa translatoituvat aminohappoihin, jotka taas kootaan muodostamaan kiinnostuksen kohteena oleva polypeptidi.
15
Mutaatioiden tekeminen polypeptideihin:
Muuttamalla yhtä tai useampaa spesifistä koodausalueen kodo-nia ja transformoimalla isäntäorganismi näillä uusilla koo-20 dausalueilla saadaan tuotettua uusia polypeptidejä, jotka eroavat alkuperäisestä polypeptidistä yhden tai useamman aminohapon osalta. Tällaiset muutokset voidaan tehdä tunnetulla nk. suunnatun in vitro -mutageneesin avulla. Tällaisista me- · · *.*.* netelmistä on paljon julkaisuja. Erästä varhaisimmista mene- • · V·: 25 telmistä kuvaavat Zoller & Smith, DNA 3:479-488, 1983, siinä *·**· käytetään yksisäikeistä M13-bakteriofagia. Erästä suositel- tavaa menetelmää, jossa käytetään PCR-reaktiota (Polymerase • :*; Chain Reaction) , kuvaavat Nelson & Long, Analytical Bioche- ··· · mistry 180:147-151, 1989. Siinä käytetään 3-vaihegenerointia 30 halutun mutaation sisältävälle PCR-fragmentille käyttämällä ;·. kemiallisesti syntetoitua DNA-oligonukelotidiä yhtenä PCR- • · *... reaktoiden alukkeista. PCR-generoidusta fragmentista voidaan • · • · "* eristää mutaation sisältävä DNA-fragmentti suorittamalla • · !,*·· pilkkominen restriktioentsyymin avulla ja uudelleeninsertoin- ·:**: 35 ti ekspressioplasmidiin. Kolmas mutageneesimenetelmä käyttää hyväkseen DNA:n koodausalueilla sijaitsevia restriktiokohtia.
• ·· *... Hajottamalla DNA restriktioentsyymeillä kohdista, jotka si- • · *** vuavat mutageneesikohdetta, syntetoimalla halutun mutaation 1 W69 10 sisältävä uusi fragmentti synteettisesti ja kloonaamalla tämä uusi fragmentti restriktiokohtien väliin saadaan koottua mu-tanttikoodausalue.
5 Kaikki nämä menetelmät sopivat yleensä käytettäväksi proteiinien säätelyksi (protein engineering) kutsutulla tutkimusalueella, jolla käsitellään polypeptidien kehittämistä sisältämään uusia tai muunneltuja ominaisuuksia.
10 Transformointi ja ekspressio voidaan toteuttaa tunnetun tekniikan mukaisesti, esim. tavalla, jota on kuvannut EP-305216, joka on oheistettu.
Tämän keksinnön mukaista stabiloitua α-amylaasia tuottamaan 15 pystyviä mikro-organismeja voidaan viljellä tavallisin fer-mentointimenetelmin ravinnevällaineessa, joka sisältää assimiloituvaa hiiltä ja typpeä yhdessä muiden olennaisten ravinteiden kanssa väliaineiden ollessa alalla tunnettujen periaatteiden mukaisia. Myös stabiloidun α-amylaasin puhdista-20 minen ja talteenotto voidaan suorittaa sinänsä tunnetuin menetelmin.
, , Nukleotidisekvenssit, ekspressiovektorit ja mikro-organismit: • · · **·* Tämä keksintö liittyy myös keksinnön mukaista stabiloitua a- · • * * « « *. *: 25 amylaasia koodaaviin DNA-nukleotidisekvensseihm. Stabiloitua α-amylaasia voidaan ekspressoida ja tuottaa kun a-amylaasia »· * J V koodaava DNA-nukleotidisekvenssi insertoidaan sopivassa vek- : torissa sopivaan isäntäorganismiin. Isäntäorganismin ei tar- vitse olla identtinen organismin kanssa, josta lähtögeeni on 30 peräisin. Mutatoitujen geenien, vektoreiden ja mutanttien :*. samoin kuin transformoitujen organismien kokoaminen voidaan • ** tehdä millä tahansa sopivalla tunnetun tekniikan mukaisella 9 · ”* yhdistelmä-DNA-tekniikalla.
• · t · » • ·· 9 9 ·:**: 35 Keksintö liittyy myös stabiloitua α-amylaasia koodaavan DNA- ··. nukleotidisekvenssin sisältäviin ekspressiovektoreihin ja • ·· isäntäorganismeihin.
• · • *· 118969 11
Pesuainekoostumus: Tämän keksinnön mukaan α-amylaasivariantti voi tyypillisesti olla pesuainekoostumuksen komponentti. Se voidaan lisätä sellaisenaan pölyämättömän granulaatin muodossa, stabiloidun 5 nesteen muodossa tai suojatun entsyymin muodossa. Pölyämättömiä granulaatteja voidaan valmistaa esimerkiksi tavalla, jonka ovat esittäneet US-4106991 ja US-4661452 (molemmat Novo Industri A/S -yhtiölle) ja valinnaisesti ne voivat olla alalla tunnettuun tapaan päällystettyjä. Esimerkkeinä vaha-10 maisista päällystemateriaaleista voidaan mainita poly (etyleenioksidi)tuotteet, (polyetyleeniglykoli, PEG) joiden keskimääräinen molekyylipaino on 1000-20000, etoksyloidut no-nyylifenolit, joissa on 16 - 50 etyleenioksidiyksikköä, etoksyloidut rasva-alkoholit, joissa alkoholi sisältää 12-20 15 hiiliatomia ja joissa on 15-80 etyleenioksidiyksikköä, rasva-alkoholit, rasvahapot sekä rasvahappojen mono-, di- ja tri-glyseridit. Esimerkkejä kalvon muodostavista pinnoitemäteri-aaleista, jotka sopiva käytettäväksi leijukerrostekniikoissa antaa GB-1483591. Nestemäiset entsyymivalmisteet voidaan 20 sta-biloida esimerkiksi lisäämällä polyolia kuten propyleeni-glykolia, sokeria tai sokerialkoholia, maitohappoa tai boori-happoa yleisesti käytössä olevin menetelmin. Alalla tunne- . , taan muitakin entsyymistabilisaattoreita. Suojatut entsyymit • · · *·*·| voidaan valmistaa esimerkiksi tavalla, jonka on esittänyt EP- 25 238216.
• · «· « • Keksinnön mukainen pesuainekoostumus voi olla missä tahansa : sopivassa muodossa, esim., jauheen, granulaatin, massan tai ·* · :***: nesteen muodossa. Nestemäinen pesuaine voi olla vesipitoi- * 30 nen, tyypillisesti enimmillään 70 % vettä ja 0-30% orgaanista ··. liuotinta sisältävä.
• ·· ··· • · • · T Pesuainekoostumus sisältää yhtä tai useampaa pinta-aktiivista • · ·.**: ainetta, joka voi olla anioninen, ioniton, kationinen tai 35 zwitterioninen. Tavallisesti pesuaine sisältää 0-50% anionista pinta-aktiivista ainetta kuten lineaarista alkyyli- • *· *...t bentseenisulfonaattia (LAS) , alfaolefiinisulfonaattia (AOS) , • · *** alkyylisulfaattia (rasva-alkoholisulfaattia) (AS), alkoho- 12 118969 lietoksisulfaattia (AEOS tai AES), sekundaarisia alkaanisul-fonaatteja (SAS), alfa-sulforasvahappometyyliestereitä, al-kyyli- tai alkenyyli-meripihkahappoa tai saippuaa. Se voi sisältää myös 0-40 % ionitonta pinta-aktiivista ainetta kuten 5 alkoholietoksylaattia (AEO tai AE) , karboksyloituja alkho-lietoksylaatteja, nonyylifenoli-etoksylaattia, alkyylipoly-glykosidia, alkyylidimetyyli-amiinioksidia, etoksyloitua ras-vahappomonoetanolamidia, rasvahappomonoetanolamidia, alkyyli-(N-metyyli)-glukoosiamidia tai poly- 10 hydroksialkyylirasvahappoamidia (esim. kuten kuvaa WO 92/06154).
Lisäksi pesuainekoostumus voi sisältää yhtä tai useampaa muuta entsyymiä kuten kutinaasia, proteaasia, sellulaasia, pe-15 roksidaasia tai oksidaasia.
Pesuaine voi sisältää 1-65 % pesuainetehoainetta tai muuta kompleksoivaa ainetta kuten zeoliittia, difosfaattia, trifos-faattia, fosfonaattia, sitraattia, nitrilotrietikkahappoa 20 (NTA), etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA), dietyleenit-riamiinipentaetikkahappoa (dtpa), alkyyli- tai alkenyylimeri-pihkahappoa, liukoisia silikaatteja tai pinnoitettuja silikaatteja (esim. SKS-6 Hoechst). Pesuaine voi myös olla teho- • * !.V aineeton, ts. olennaisesti vailla pesuainetehoainetta).
25 ♦ · *:**: Pesuaine voi sisältää yhtä tai useampaa polymeeriä. Esimerk- ·*·*· keinä voidaan mainita karboksimetyyliselluloosa (CMC) , poly- • « : (vinyylipyrrolidoni) (PVP), polyetyleeniglykoli (PEG), poly- • · * * (vxnyylialkoholi) (PVA) , polykarboksylaatit kuten polyakry- • · · 30 laatit, maleiini/akryylihappokopolymeerit ja lauryylimetakry- ,, laatti/akryylihappokopolymeerit.
• # Φ ·* • · · • * *···* Pesuaine voi sisältää valkaisusysteemin, jossa voi olla H,0,- 4 ί £ ·*·.· lähde kuten perboraatti tai perkarbonaatti, joka voi olla yh- i · 35 distetty perhappoa muodostavaan valkaisuaktivaattoriin kuten ,t* tetra-asetyylietyleenidiamiiniin (TAED) tai nonanoyylioksi- • · bentseenisulfonaattiin (NOBS) . Vaihtoehtoisesti valkaisusys- • · • * ··· 118969 13 teemi voi sisältää peroksihappoja, esim. amidi-, imidi- tai sulfoni-tyyppisiä.
Keksinnön mukaisen pesuainekoostumuksen entsyymit voidaan 5 sta-biloida tavallisilla stabilointiaineilla, joita ovat esimerkiksi polyoli kuten propyleeniglykoli tai glyseroli, sokeri tai sokerialkoholi, maitohappo, boorihappo tai boorihappo-johdannainen, esim. aromaattinen boraattiesteri, ja koostumus voidaan formuloida tavalla, jota kuvaavat esim. W0 92/19709 10 ja W0 92/19708.
Pesuaine voi sisältää myös muita tavallisia pesuaineiden aineosia, esim. kankaanhoitoaineita, joita ovat esimerkiksi savet, vaahdonvahvistimet, saippuavaahtosuppressorit, kor-15 roosionestoaineet, likaa irrottavat aineet, lian kiinnittymistä estävät aineet, väriaineet, bakterisidit, optiset kirkasteet ja hajusteet.
pH (mitattuna vesipitoisesta pesuaineliuoksesta käyttöpitoi-20 suudella) on tavallisesti neutraali tai alkalinen, esim. 7- 11.
,. Erityisiä tämän keksinnön suojapiirin kuuluvia pesuainekoos- • « · *♦*·* tumusmuotoja ovat: • · · \ *: 25 ***** 1) Pesuainekoostumus, joka on formuloitu granulaatiksi, jon- #i * ; V ka irtotiheys on vähintään 600 g/1 ja jonka aineosia ovat: • · • t · • · · • V» * ·*·*· - lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti 30 (laskettuna happona) 7-12 % ♦ ♦♦ • · • · *1* - alkoholietoksisulfaatti • · \*·· (esim. C12_18 alkoholi, 1-2 EO) tai "**· 35 alkyylisulfaatti (esim. C16_18) 1-4 :·*. % • ·· « *·· • ♦ *** - alkoholietoksylaatti 118969 14 (esim. Cl4_l5 alkoholi, 7 EO) 5-9 % - natriumkarbonaatti (Na2C03) 14-20 5 % - liukoinen silikaatti (Na20,2Si02) 2-6 % 10 - zeoliitti (NaAlSiOJ 15 - 22 % - natriumsulfaatti (Na2S04) 0-6 % 15 - natriumsitraatti/sitruunahappo (C6H5Na307/C8H807) 0-15 % 20 - natriumperboraatti (NaB03.H20) 11 - 18 % , - TAED 2-6 • · · • · · o.
• · % • · • · < *. **. 25 * ***** - karboksimetyyliselluloosa 0-2 «Φ *
• · · CL
• · • * * • · · • * * ··· * :*·*· - polymeerit (esim. maleiini/akryyli- 30 happokopolymeeri, PVP, PEG) 0-3 :·. % • ·» «·« • · • * "* - entsyymit 0-5 • · ·. ·: % ·:··: 35 ;·] - vähäisemmät aineosat (esim. saippua-
• M
\..t vaahtosuppressorit, hajusteet, optiset « · M* 118969 15 kirkasteet, fotovalkaisimet) 0-5 % 5 2) Pesuainekoostumus, joka on formuloitu granulaatiksi, jonka irtotiheys on vähintään 600 g/1 ja jonka aineosia ovat: - lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti (laskettuna happona) 6-11 10 % - alkoholietoksisulfaatti (esim. C12_18 alkoholi, 1-2 EO) tai alkyylisulfaatti (esim. C16_18) 1-3 15 % - alkoholietoksylaatti (esim. C14_15 alkoholi, 7 EO) 5-9 % 20 - natriumkarbonaatti (Na2C03) 15-21 % • « *·** - liukoinen silikaatti (Na,0,2Si0,) 1-4 • · £ £ 25 % * Γ*/. - zeoliitti (NaAlSiOj 24 - :34 % ··» · • »· « · • · * 3 0 - natriumsulfaatti (Na2S04) 4-10 % • ·· ··· • · • · "* - natriumsitraatti/sitruunhappo 0-15 • « • · β Q, ·. ·: % ·:··: 35 (C6H5Na307/C8H807) ·*
• I
- karboksimetyyliselluloosa 0-2 • · • · ··* % 16 118969 - polymeerit (esim. maleiini/akryyli- happokopolymeeri, PVP, PEG) 1-6 % 5 - entsyymit 0-5 % - vähäisemmät aineosat (esim. saippua- 10 vaahtosuppressorit, hajusteet) 0-5 % 3) Pesuainekoostumus, joka on formuloitu granulaatiksi, jon- 15 ka irtotiheys on vähintään 600 g/1 ja jonka aineosia ovat: - lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti (laskettuna happona) 5-9 % 20 - alkoholietoksylaatti (esim. C12_15 alkoholi, 7 EO) 7 - 14 % * * f * · • · · • · • * !,*·· 25 - saippua rasvahappona (esim. C16_22) 1-3 *:*·: % ·· » « · · • · » · | - natriumkarbonaatti (Na2C03) 10-17 ··· · ··· % t · · 30 .. - liukoinen silikaatti (Na,0,2Si0,) 3-9 • · A d.
• ·· % * · • · • · · :**.! - zeoliitti (NaAlSiO.) 23 - • · 4 ·:··: 35 33 % *♦ • · *,.* - natriumsulfaatti (Na2S04) 0-4 • « % 118969 17 - natriumperboraatti (NaB03.H20) 8-16 % 5 - TAED 2-8 % - fosfonaatti (esim. EDTMPA) 0-1 % 10 - karboksimetyyliselluloosa 0-2 % - polymeerit (esim. maleiini/akryyli- 15 happokopolymeeri, PVP, PEG) 1-3 % - entsyymit 0-5 % 20 - vähäisemmät aineosat (esim. saippua-vaahtosuppressorit, hajusteet, optiset kirkasteet) 0-5 • t • * · • · · Q, • · $ V·! 25 • · i'*|: 4) Pesuainekoostumus, joka on formuloitu granulaatiksi, jonka • ·*; irtotiheys on vähintään 600 g/1 ja jonka aineosia ovat: • M *
Ml » · · • * · 30 - lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti (laskettuna happona) 8-12 • ·· *... % • i • · *·· * * ·/·· - alkoholietoksylaatti *:*·; 35 (esim. C12_15 alkoholi, 7 EO) 10 - 25 ..* % • ·
• M
«·· • · • « ··· 18 118969 - natriumkarbonaatti (Na2C03) 14 - 22 % - liukoinen silikaatti (Na20,2Si02) 1-5 5 % - zeoliitti (NaAlSiOJ 25 - 35 % 10 - natriumsulfaatti (Na2S04) 0-10 % - karboksimetyyliselluloosa 0-2 % 15 - polymeerit (esim. maleiini/akryyli- happokopolymeeri, pvp, PEG) 1-3 % 20 - entsyymit 0-5 % - vähäisemmät aineosat (esim. saippua- * 1 · *.1.1 vaahtosuppressorit, hajusteet) 0-5 25 % «»·1· • · ;1·1: 5) Vesiperustainen nestemäinen pesuainekoostumus, jonka aine- • » * ·1; osia ovat: ··1 · • · · • · · * · · 30 - lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti (laskettuna happona) 15 - 21 • ·φ % • · • · • · · Φ » !/·· - alkoholietoksylaatti •Ϊ2: 35 (esim. C12_1S alkoholi, 7 EO tai ci2-i5 alkoholi, 5 EO 12 - 18 • «· % · 2 * ·
• M
118969 19 - saippua rasvahappona (esim. öljyhappo) 3-13 % - alkenyylimeripihkahappo (C12_14) 0-13 5 % - aminoetanoli 8-18 % 10 - sitruunahappo 2- 8 % - fosfonaatti 0-3 % 15 - polymeerit (esim. pvp. PEG) 0-3 % - boraatti (B407) 0-2 20 % - etanoli 0-3 % • · · • · · • · • · *. " 25 - propyleeniglykoli 8-14 ·:··: % » · ♦ · · • · • · : :*: - entsyymit 0-5 ·*« · ··· <v * · · • * · 30 j·. - vähäisemmät aineosat (esim. dispergointi- * «« \..t aineet, saippuvaahtosuppressorit, • · "* hajusteet, optiset kirkasteet) 0-5 • · • · · o_ ·. ·: % ·:··: 35 ··] 6) Vesiperustainen strukturoitu nestemäinen pesuainekoostu- • ·· mus, jonka aineosia ovat: • · «>» 118969 20 - lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti (laskettuna happona) 15 - 21 % 5 - alkoholietoksylaatti (esim. C12_1S alkoholi, 7 EO tai C12_15 alkoholi, 5 EO 3 - 9 % - saippua rasvahappona (esim. öljyhappo) 3-10 10 % - zeoliitti (NaAlSiOJ 14 - 22 % 15 - natriumsitraatti 9-18 % - boraatti (B407) 0 -2 % 20 - karboksimetyyliselluloosa 0-2 % • · *.*.· - polymeerit (esim. PVP. PEG) 0-3 V*j 25 % » • ••M • « ·***: - ankkurointipolymeerit, * · • ;*j esim. lauryylimetakrylaatti/akryylihappo- ··· · kopolymeeri, moolisuhde 25:1, MW 3800) 0-3 • · · 30 % ·· • · - glyseroli 0-5 * * *...* % • · • « I m · · • · ·:*·: 35 - entsyymit 0-5 % • · • φ ··· • · 1 - vähäisemmät aineosat (esim. dispergointi- „ 118969 21 aineet, saippuavaahtosuppressorit, hajusteet, optiset kirkasteet) 0-5 % 5 7) Pesuainekoostumus, joka on formuloitu granulaatiksi, jonka irtotiheys on vähintään 600 g/1 ja jonka aineosia ovat: - rasvahappoalkoholisulfaatti 5-10 10 % - etoksyloitu rasvahappomonoetanolamidi 3-9 % 15 - saippua rasvahappona 0-3 % - natriumkarbonaatti (Na2C03) 5-10 % 20 - liukoinen silikaatti (Na20,2Si02) 1-4 % - zeoliitti (NaAlSiO.) 20 - * · 1 V.: 25 40 % • · • · 1 • · 1 • · “2ϊ - natriumsulfaatti (Na2S04) 2-8 *· 1 Ω : 1 : % • · • · • · · » · · ·1« · 30 - natriumperboraatti (NaBQ,.H.O) 12 - 18 « · · i £.
% • · • 1 - TAED 2-7 • · ·...1 % 35 • · ;2: - polymeerit (esim. malei ini/akryyli- happokopolymeeri, PEG) 1-5 • · · % 2 • · • · · 118969 22 - entsyymit 0-5 % 5 - vähäisemmät aineosat (esim. optiset kirkasteet, saippuavaahtosuppressorit, hajusteet) 0-5 % 10 8) Pesuainekoostumus, joka on formuloitu granulaatiksi, jonka aineosia ovat: - lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti 15 (laskettuna happona) 8-14 % - etoksyloitu rasvahappomonoetanolamidi 5-11 % 20 - saippua rasvahappona 0-3 % . - natriumkarbonaatti (Na2C03) 4-10 25 % • « ·· • · * 1 - liukoinen silikaatti (Na20,2Si02) 1-4 . · · : V % • · s · · • · ·
··· I
: : : 30 - zeoliitti (NaAlSiO.) 30 - • e 50 % Φ1 • ♦ • ·· .···. - natriumsulfaatti (Na,SOJ 3-11 • 1 · • % • · • · · ·. 1: 35 ***** - natriumsitraatti (CsH5Na,03) 5-12 :2. % • ·· « 1 · * · • · 2 • · · 118969 23 - polymeerit (esim. PVP, maleiini/akryyli- happokopolymeeri, PEG) 1-5 % 5 - entsyymit 0-5 % - vähäisemmät aineosat (esim. saippuavaahto- suppressorit, hajusteet) 0-5 10 % 9) Pesuainekoostumus, joka on formuloitu granulaatiksi, jonka aineosia ovat: 15 - lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti (laskettuna happona) 6-12 % 20 - ioniton pinta-aktiivinen aine 1-4 % - saippua rasvahappona 2-6 % 25 • · * *j - natriumkarbonaatti (Na2C03) 14 - 22 **·« * * % i# · • · • * • · • · ·,* : - zeoliitti (NaAlSiOj 18 - 3 0 32 % !*·.. - natriumsulfaatti (Na2S04) 5-20 » · • · * * • *· " 35 - natriumsitraatti (C6H6Na307) 3 -8 % • · • * * · · · · · • * • · · 118969 24 - natriumperboraatti (NaB03.H20) 4-9 % - valkaisuaktivaattori (esim. NOBS tai TAED) 1-5 5 % - karboksimetyyliselluloosa 0-2 % 10 - polymeerit (esim. polykarboksylaatti tai PEG) 1-5 % - entsyymit 0-5 15 % - vähäisemmät aineosat (esim. optiset kirkasteet, hajusteet) 0-5 % 20 10) Vesiperustäinen nestemäinen pesuainekoostumus, jonka aineosia ovat: • · ; · · *·*·* 25 - lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti • · (laskettuna happona) 15 - 23 ·:··: % ·· · • · • · • ' · • - alkoholietoksisulfaatti ·>· · 30 (esim. C12_15 alkoholi, 2-3 EO) 8-15 % ·· • ** \..t - alkoholietoksylaatti *“ (esim. C12_15 alkoholi, 7 EO tai V·'· 35 C12.15 alkoholi, 5 EO) 3-9 *J**· % ·· • · • ·· ··· « · • · ··· 118969 25 - saippua rasvahappona (esim. lauriinihappo) 0-3 % - aminoetanoli 1-5 5 % - natriumsitraatti 5-10 % 10 - hydrotrooppi (esim. natriumtolueeni- sulfonaatti) 2-6 % - boraatti (B407) 0 -2 15 % - karboksimetyyliselluloosa 0-1 % 20 - etanoli 1-3 % - propyleeniglykoli 2-5 % • · · • * 25 ·. - entsyymit 0-5 ***** % *· · · · • · * · ; - vähäisemmät aineosat (esim. polymeerit, ·· · .*·*: 30 dispergointiaineet, hajusteet, optiset kirkasteet) 0-5 *.·. % * ·· ··· • · • · ··· • · V‘j 35 11) Vesiperustäinen nestemäinen pesuainekoostumus, jonka ai- *!'*i neosia ovat: • ·
* M
- lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti • · • · ··· 26 (laskettuna happona) 20 - 32 % - alkoholietoksylaatti 5 (esim. C12_15 alkoholi, 7 EO tai C12.15 alkoholi, 5 EO) 6-12 % - aminoetanoli 2-6 10 % - sitruunahappo 8-14 % 15 - boraatti (B407) 1 -3 % - polymeerit (esim. maleiini/akryyli-happokopolymeeri, ankkurointipolymeerit, 20 esim. lauryylimetakrylaatti/akryylihappo- kopolymeeri ja CMC) 0-3 % , . - glyseroli 3-8 • ® • · · : 25 % • · · • ** • · * 1 2 3 - entsyymit 0-5 *· · • · · „ : .· % • · * · · • · · **· · 3 0 - Vähäisemmät aineosat (esim. hydrotroopit, * dispergointiaineet, hajusteet, :1. optiset kirkasteet) 0-5 .**·. % • 1 ··· · * · · *. ·: 35 12) Pesuainekoostumus, joka on formuloitu granulaatiksi, 2 Ϊ1. jonka irtotiheys on vähintään 600 g/1 ja jonka aineosia ovat: 3 • · * 1 ··· 27 116949 - anioninen pinta-aktiivinen aine (lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti, alkyylisulfaatti1 alfaolefiinisulfonaatti, aifa-sulforasvahappometyylies teri t, aikaani-5 sulfonaatit, saippua) 25 - 40 % - ioniton pinta-aktiivinen aine (esim. alkoholietoksylaatti) 1-10 10 % - natriumkarbonaatti (Na2C03) 8-25 % 15 - liukoinen silikaatti (Na20,2Si02) 5-15 % - natriumsulfaatti (Na2S04) 0-5 % 20 - zeoliitti (NaAlSiOJ 15 - 28 % .. - natriumperboraatti (NaB03.4H20) 4-9 :·:·! 25 % • · • · 2 • · "3 - valkaisuaktivaattori (esim. NOBS tai TAED) 0-5 *· ·
• · · CL
: .· % • · • · · • · · ··· · :1·1: 30 - entsyymit 0-5 % ·· * · ·· ’···. - vähäisemmät aineosat (esim. hajusteet, • · "1 optiset kirkasteet) 0-3 • · ·. 1ϊ 35 % • · ·· f · * ·« ·« • 1 2 • 1 3 28 118969 13) Kohdissa 1) - 12) kuvatun kaltaiset pesuaineformuloinnit, joissa lineaarisen alkyylibentseenisulfonaatin osuus (tai osa siitä) korvataan alkyylisulfaatilla (Cl2-C18) .
5 14) Kohdissa 1) - 13) kuvatun kaltaiset pesuaineformuloin nit, jotka sisältävät stabiloitua tai kapseloitua perhappoa joko lisäkomponenttina tai korvaamassa jo spesifioituja val-kaisysteemejä.
10 15) Kohdissa 3), 7), 9) ja 12) kuvatun kaltaiset pesu- ainekoostumukset, joissa perboraatin osuus korvataan perkar-bonaatilla.
16) Pesuainekoostumus, joka on formuloitu vedettömäksi nes-15 temäiseksi pesuaineeksi, joka sisältää nestemäistä ionitonta pinta-aktiivista ainetta, esim. lineaarista alkoksyloitua primaarialkoholia, tehoainesysteemin (esim. fosfaatti), entsyymiä ja alkalia. Pesuaine voi sisältää myös anionista pinta-aktiivista ainetta ja/tai valkaisusysteemin.
20
Keksinnön mukaisia a-amylaasivariantteja voidaan käyttää tavallisesti pesuaineissa käytettävinä pitoisuuksina. Tällä hetkellä keksinnön mukaisessa pesuainekoostumuksessa sopiva lisättävä α-amylaasivarianttimäärä voi olla 0,001 - 100 mg a- • · · *·*·' 25 amylaasivarianttia kohti pesunestelitra.
• · • · * • M * * * · «· » I I · • · • * • · • « * • · t »«· · • · · • · · • · « • · • · • ·· ··· • * • · ··· • · ♦ · · • ·· • · • · ·· • · • ·· 1 • · • ♦ ···

Claims (5)

29 1 1 8969
1. Bacillus licheniformisin α-amylaasivariantti, jolla on parantunut stabiilisuus inaktivoitumista vastaan, jonka aihe- 5 uttaa peroksidaasisysteemi, jossa on peroksidaasi tai perok-sidaasiaktiivisuutta osoittava yhdiste, vetyperoksidilähde ja peroksidaasitehostin, kun verrataan lähtöentsyymiin, tunnettu siitä, että yksi tai useampi luonnossa ilmenevä tyrosiinitähde on substituoitu fenyylialaniinitähteellä, leu- 10 siinitähteellä, isoleusiinitähteellä, valiinitähteellä, se-riinitähteellä tai histidiinitähteellä yhdessä tai useammassa seuraavista asemista: 10, 14, 31, 46, 56, 59, 62, 77, 98, 150, 158, 175, 193, 195, 198, 203, 219, 262, 273, 290, 302, 348, 358, 367, 394, 396, 402, 439, 480. 15
2. Menetelmä Bacillus licheniformisin α-amylaasivariantin stabiloimiseksi inaktivoitumista vastaan, jonka aiheuttaa peroksidaasisysteemi, jossa on peroksidaasi tai peroksidaasiaktiivisuutta osoittava yhdiste, vetyperoksidilähde ja peroksi- 20 daasitehostin, kun verrataan lähtöentsyymiin, tunnettu siitä, että yksi tai useampi luonnossa ilmenevä tyrosiinitähde sub-stituoidaan fenyylialaniinitähteellä, leusiinitähteellä, iso-leusiinitähteellä, valiinitähteellä, seriinitähteellä tai ., histidiinitähteellä yhdessä tai useammassa seuraavista ase- ?;8·| 25 mistä: 10, 14, 31, 46, 56, 59, 62, 77, 98, 150, 158, 175, V·: 193, 195, 198, 203, 219, 262, 273, 290, 302, 348, 358, 367, 394, 396, 402, 439, 480.
·· · • · · • · • · : **: 3. Pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että sisältää surfak- • •e · f »1·1· 30 tanttia ja patenttivaatimuksen 1 mukaista a- amylaasivarianttia. ♦ · • · i 1# 4···,
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen pesuainekoostumus, tunnet- 9 · *t1 tu siitä, että se lisäksi sisältää yhtä tai useampaa muuta • e ·,**: 35 entsyymiä, erityisesti proteaaseja, sellulaaseja, oksidaaseja *ί**ϊ ja/tai peroksidaaseja, joita yleisesti käytetään pesu- j·. aineissa. e m· 9 99 * m 9 m 999 118969
5. Pesuainelisäaine, tunnettu siitä, että siinä on patenttivaatimuksen 1 mukaista a-amylaasivarianttia pölyämättömänä granulaattina, stabiloituna nesteenä, lietteenä tai suojattuna entsyyminä. 5
FI953128A 1992-12-23 1995-06-22 Rekombinantit alfa-amylaasivariantit FI118969B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK154292 1992-12-23
DK921542A DK154292D0 (da) 1992-12-23 1992-12-23 Nyt enzym
PCT/DK1993/000441 WO1994014951A1 (en) 1992-12-23 1993-12-22 Recombinant lipase and alpha-amylase variants
DK9300441 1993-12-22

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI953128A FI953128A (fi) 1995-06-22
FI953128A0 FI953128A0 (fi) 1995-06-22
FI118969B true FI118969B (fi) 2008-05-30

Family

ID=8105895

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI953128A FI118969B (fi) 1992-12-23 1995-06-22 Rekombinantit alfa-amylaasivariantit

Country Status (10)

Country Link
US (1) US5731280A (fi)
EP (1) EP0675949B1 (fi)
JP (1) JPH08504586A (fi)
KR (1) KR100296853B1 (fi)
AT (1) ATE280220T1 (fi)
BR (1) BR9307718A (fi)
DE (1) DE69333672T2 (fi)
DK (1) DK154292D0 (fi)
FI (1) FI118969B (fi)
WO (1) WO1994014951A1 (fi)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0700427B2 (en) † 1993-05-26 2005-08-10 Unilever Plc Detergent compositions
US5830837A (en) * 1994-11-22 1998-11-03 Novo Nordisk A/S Amylase variants
BR9407767A (pt) * 1993-10-08 1997-03-18 Novo Nordisk As Variante de enzima &-amilase uso da mesma construção de DNA vetor de express o recombinante célula processos para produzir uma &-amilase hibrida e para preparar uma variante de uma &-amilase aditivo detergente e composições detergentes
TW255887B (en) * 1994-05-25 1995-09-01 Lilly Co Eli Synthesis of benzoquinolinones
GB2296011B (en) * 1994-12-13 1999-06-16 Solvay Novel fusarium isolate and lipases, cutinases and enzyme compositions derived therefrom
US6936289B2 (en) 1995-06-07 2005-08-30 Danisco A/S Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products
EP0756000A1 (en) * 1995-07-24 1997-01-29 The Procter & Gamble Company Detergent compositions comprising specific amylase and linear alkyl benzene sulfonate surfactant
US5741767A (en) * 1995-11-16 1998-04-21 Lever Brothers Company, Division Of Conopco, Inc. Peracid based dishwashing detergent composition
US6077818A (en) * 1996-02-20 2000-06-20 The Procter & Gamble Company Cellulase activity control by a terminator
ES2432519T3 (es) 1996-04-30 2013-12-04 Novozymes A/S Mutantes de alfa-amilasa
MX9800749A (es) * 1996-06-19 1998-04-30 Procter & Gamble Composiciones detergentes que comprenden una amilasa especifica y una proteasa.
US6140475A (en) * 1997-04-11 2000-10-31 Altus Biologics Inc. Controlled dissolution crosslinked protein crystals
ES2188190T5 (es) 1998-07-21 2007-11-16 Danisco A/S Producto alimentario.
US6887986B1 (en) * 1998-11-16 2005-05-03 Novozymes A/S α-amylase variants
US6080687A (en) * 1999-03-18 2000-06-27 Zydex Industries Method of dyeing anionic materials with pigment colors having a net cationic charge using a padding process
WO2001021499A1 (en) 1999-09-22 2001-03-29 The Procter & Gamble Company A hand-held liquid container
US7005288B1 (en) 1999-11-10 2006-02-28 Novozymes A/S Fungamyl-like alpha-amylase variants
JP2003513666A (ja) * 1999-11-10 2003-04-15 ノボザイムス アクティーゼルスカブ フンガミル様アルファ−アミラーゼ変異体
US20010046493A1 (en) * 2000-02-24 2001-11-29 Alex Margolin Lipase-containing composition and methods of use thereof
BR0112778A (pt) * 2000-07-28 2003-07-01 Henkel Kommanditgellschaft Auf Enzima amilolìtica de bacillus sp. a 7-7 (dsm 12368) bem como detergente e agente de limpeza com esta enzima amilolìtica
US20020115846A1 (en) * 2001-01-24 2002-08-22 Xuanchuan (Sean) Yu Novel human lipase and polynucleotides encoding the same
CA2444960C (en) 2001-05-18 2011-08-09 Danisco A/S Method of improving dough and bread quality
US7153820B2 (en) 2001-08-13 2006-12-26 Ecolab Inc. Solid detergent composition and method for solidifying a detergent composition
US9453251B2 (en) * 2002-10-08 2016-09-27 Pfenex Inc. Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens
US7955814B2 (en) 2003-01-17 2011-06-07 Danisco A/S Method
MXPA05007654A (es) 2003-01-17 2005-09-30 Danisco Metodo.
US20050196766A1 (en) 2003-12-24 2005-09-08 Soe Jorn B. Proteins
US7142464B2 (en) * 2003-04-29 2006-11-28 Saifun Semiconductors Ltd. Apparatus and methods for multi-level sensing in a memory array
US7718408B2 (en) 2003-12-24 2010-05-18 Danisco A/S Method
GB0716126D0 (en) 2007-08-17 2007-09-26 Danisco Process
US7906307B2 (en) 2003-12-24 2011-03-15 Danisco A/S Variant lipid acyltransferases and methods of making
ES2707786T3 (es) 2004-01-16 2019-04-05 Pfenex Inc Expresión de proteínas de mamífero en Pseudomonas fluorescens
GB0405637D0 (en) 2004-03-12 2004-04-21 Danisco Protein
ES2539006T3 (es) 2004-07-16 2015-06-25 Dupont Nutrition Biosciences Aps Enzima lipolítica, usos de la misma en la industria alimentaria
EP2412816B1 (en) 2004-07-26 2014-12-03 Pfenex Inc. Process for improved protein expression by strain engineering
UA91521C2 (ru) * 2004-10-14 2010-08-10 Элтус Фармасьютикалз Инк. Композиции, содержащие липазу, протеазу и амилазу, предназначенные для лечения недостаточности поджелудочной железы
EP1700907A1 (en) 2005-03-11 2006-09-13 Unilever N.V. Liquid bleaching composition
EP1700904A1 (en) 2005-03-11 2006-09-13 Unilever N.V. Liquid detergent composition
US20100196344A1 (en) * 2005-10-14 2010-08-05 Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating pancreatic insufficiency
PL2405007T3 (pl) 2007-01-25 2014-04-30 Dupont Nutrition Biosci Aps Wytwarzanie acylotransferazy lipidowej z przekształconych komórek gospodarza Bacillus licheniformis
US8093200B2 (en) 2007-02-15 2012-01-10 Ecolab Usa Inc. Fast dissolving solid detergent
US9580719B2 (en) 2007-04-27 2017-02-28 Pfenex, Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
MX2009011523A (es) 2007-04-27 2009-11-09 Dow Global Technologies Inc Metodo para clasificar rapidamente huespedes microbianos para identificar ciertas cepas con rendimiento y/o calidad mejorados en la expresion de proteinas heterologas.
ES2439958T3 (es) 2007-10-18 2014-01-27 Ecolab Inc. Composiciones de limpieza sólidas, céreas y comprimidas, y métodos de hacerlas
US8853269B2 (en) * 2010-02-04 2014-10-07 Copperhead Chemical Company Inc. Composition and method for treating infections and promoting intestinal health
AU2012260576B2 (en) 2011-05-20 2015-07-09 Ecolab Usa Inc. Acid formulations for use in a system for warewashing
EP2902471A1 (en) 2011-05-20 2015-08-05 Ecolab USA Inc. Non-phosphate detergents and non-phosphoric acids in an alternating alkali/acid system for warewashing
AU2012351758B2 (en) 2011-12-13 2016-03-17 Ecolab Usa Inc. Concentrated warewashing compositions and methods
CA2874061A1 (en) 2012-06-08 2014-01-09 Danisco Us Inc. Variant alpha amylases with enhanced activity on starch polymers
US9745543B2 (en) 2012-09-10 2017-08-29 Ecolab Usa Inc. Stable liquid manual dishwashing compositions containing enzymes
CN110777132B (zh) 2013-03-11 2024-03-22 丹尼斯科美国公司 α-淀粉酶组合变体
US11891588B2 (en) 2019-07-31 2024-02-06 Ecolab Usa Inc. Personal protective equipment free delimer compositions o

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61104784A (ja) * 1984-10-26 1986-05-23 Suntory Ltd ペルオキシダ−ゼの製造法
US5030240A (en) * 1986-06-09 1991-07-09 The Clorox Company Enzymatic peracid bleaching system
ES2058119T3 (es) * 1986-08-29 1994-11-01 Novo Nordisk As Aditivo detergente enzimatico.
US5108457A (en) * 1986-11-19 1992-04-28 The Clorox Company Enzymatic peracid bleaching system with modified enzyme
ES2076939T3 (es) * 1987-08-28 1995-11-16 Novo Nordisk As Lipasa recombinante de humicola y procedimiento para la produccion de lipasas recombinantes de humicola.
DK212388D0 (da) * 1988-04-15 1988-04-15 Novo Industri As Detergent additiv
CA2030554C (en) * 1989-06-29 2001-08-28 Wilhelmus J. Quax Mutant microbial .alpha.-amylases with increased thermal, acid, and/or alkaline stability
GB8915658D0 (en) * 1989-07-07 1989-08-23 Unilever Plc Enzymes,their production and use
PE14291A1 (es) * 1989-10-13 1991-04-27 Novo Nordisk As Procedimiento para inhibir la transferencia de tintes
GB9027836D0 (en) * 1990-12-21 1991-02-13 Unilever Plc Enzymes and enzymatic detergent compositions
WO1992018683A1 (en) * 1991-04-12 1992-10-29 Novo Nordisk A/S Process for bleaching of dyed textiles
EP0580707B1 (en) * 1991-04-12 1997-07-16 Novo Nordisk A/S Removal of excess dye from new textiles
JPH07504807A (ja) * 1991-11-26 1995-06-01 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ プロテアーゼ安定性タンパク質

Also Published As

Publication number Publication date
DK154292D0 (da) 1992-12-23
US5731280A (en) 1998-03-24
EP0675949A1 (en) 1995-10-11
WO1994014951A1 (en) 1994-07-07
EP0675949B1 (en) 2004-10-20
KR960700339A (ko) 1996-01-19
DE69333672D1 (de) 2004-11-25
FI953128A (fi) 1995-06-22
KR100296853B1 (ko) 2001-11-26
ATE280220T1 (de) 2004-11-15
JPH08504586A (ja) 1996-05-21
BR9307718A (pt) 1999-09-08
FI953128A0 (fi) 1995-06-22
DE69333672T2 (de) 2006-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI118969B (fi) Rekombinantit alfa-amylaasivariantit
US6087315A (en) Protease variants
EP0781328B1 (en) Enhancers such as acetosyringone
AU617811B2 (en) A detergent additive for bleaching fabric
US5855621A (en) Dye transfer inhibition
US5445755A (en) Detergent compositions containing a peroxidase/accelerator system without linear alkylbenzenesulfonate
WO1996013578A1 (en) Enzymatic detergent composition
WO1994012619A1 (en) Enhancement of enzyme reactions
EP0214761A2 (en) An enzymatic detergent additive, a detergent, and a washing method
MXPA97002041A (en) Intensifiers such as acetosiring
US5801035A (en) L-amino acid oxidase
WO1995033040A1 (en) Dye transfer inhibition system containing a peroxidase/accelerator system
US6110884A (en) Protease variants
US5948661A (en) Myxococcus peroxidase
EP0763094A1 (en) Dye-transfer inhibitory preparation, and detergent composition comprising such a preparation

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 118969

Country of ref document: FI

MA Patent expired