FI116198B - Polypeptidien immobilisointimenetelmä - Google Patents

Description

116198

Polypeptidien immobilisointimenetelmä

Esillä oleva keksintö koskee uutta menetelmää kiinnostavien polypeptidien immobili-soimiseksi ja immobilisoitua polypeptidiä. Keksintö saa erityisesti aikaan menetelmän 5 fuusiopolypeptidien tai -proteiinien immobilisoimiseksi pintoihin liittämällä mainitut polypeptidit tarttumispolypeptideihin tai proteiineihin, joilla on kyky sitoutua pintaan.

Proteiinin immobilisointi on tärkeää monille diagnostisille ja biosensorisovelluksille ja esimerkiksi immobilisoiduissa entsyymireaktoreissa. Adsorboituneen kerroksen laatuja 10 ominaisuudet ovat usein merkityksellisiä sovelluksen toimintakyvylle. Usein immobilisointi saadaan aikaan kemiallisella ristisitomisella glutaarialdehydillä (tai vastaavanlaisella reagenssilla), spontaanilla adsorptiolla (fysikaalisella adsorptiolla), tai jollain pinnalla oleviin reaktiivisiin ryhmiin kytkemällä (esimerkiksi amiinireaktiivisiin ryhmiin). Näiden menetelmien haittapuolena on usein se, että niitä on vaikea kontrolloida ja niihin saattaa 15 sisältyä immobilisoidun proteiinin aktiivisuuden häviäminen. Fysikaalisessa adsorptiossa aktiivisuuden häviäminen johtuu kohdeproteiinin denaturaatiosta ja käytettäessä ristisito-mista tai kytkentää se johtuu uusista kemiallisista sidoksista, jotka joko rajoittavat proteiinin luoksepäästävyyttä tai muuttavat kohdeproteiinin kemiallisia ominaisuuksia. Lisäksi .., nämä immobilisointimenetelmät eivät taijoa yleistapaa suunnata kohdeproteiinia millään • · ; 20 halutulla tavalla.

• · * ·

• I

• · * " [ I Proteiinin yksöiskerroksen muodostaminen on kuvattu käyttäen Langmuir-Blodgett - tekniikkaa, jossa molekyylit pakotetaan mekaanisesti yhteen puristamalla veden pinnalla • » . · · ·, erityistä laitteistoa käyttäen, ja siirretään sitten tukialustalle. Joillekin proteiineille voidaan • · 25 valmistaa kerroksia joko suoraan tällä tavalla tai esimerkiksi tekemällä ensin biotinyloitu : . *. lipidikerros, johon sitoutuu avidiinikerros ja johon vuorostaan voidaan sitoa biotinyloitu :" ; kohdeproteiini. Tähän tekniikkaan sisältyvä ongelma on se, että useimmat proteiinit eivät • · » t. ’. muodosta rajapinnassa kerroksia, jotka voidaan siirtää, ja että tarvitaan erityslaitteistoa.

* * t; 30 Nopean ja helpon immobilisointimenetelmän kehittäminen on kiinnostavaa. Immobilisoin- ' * ‘, timenetelmän edullisia ominaisuuksia olisivat esimerkiksi se, ettei erityislaitteisto ole

* > I I I

tarpeen, tai että ei ole tarvetta muodostaa yksöiskerroksia. Immobilisointimenetelmän hyvin tärkeä ominaisuus on se, että kiinnostuksen kohteena oleva proteiini ei denaturoidu.

2 116198

On myös eduksi, ettei menetelmässä ole mitään kemiallisia ristisitomisvaiheita, koska tämä voisi lisätä proteiinin denaturoitumisen todennäköisyyttä.

Edullisia ominaisuuksia olisivat myös, että kiinnostuksen kohteena oleva proteiini voidaan 5 suunnata halutulla tavalla kiinteään faasiin, että immobilisoitavan proteiinin tuottaminen on helppoa ja että proteiinin pintakerros on kestävä. Käytännön kannalta on myös arvokasta, että voidaan valmistaa kerroksia, joilla on määrätty kiinnostuksen kohteena olevan polypeptidin tiheys. Saattaa myös olla arvokasta, että immobilisoitu proteiini voidaan helposti poistaa kiinteästä faasista tietyissä olosuhteissa.

10

Tiedetään, että antigeeneinä entsyymisitoisissa immunosorbent-määrityksissä (ELISA) tai vastaavanlaisissa määrityksissä, joissa jokin polypeptidi sidotaan pintaan, käytettävät proteiinit voivat kadota tai saada muuttuneita antigeenin sitomisominaisuuksia tai muita ominaisuuksia, ja aiheuttaa näin ongelmia määrityksessä. Tämän välttämiseksi antigeeni 15 on biotinyloitava ja sitten sidottava pintaan, joka on aiemmin päällystetty avidiinilla tai streptavidiinilla ylimääräisessä vaiheessa.

: : Wessels (1997) on ehdottanut, että hydrofobiineja voidaan käyttää välikerroksena solujen, • * I proteiinien, kuten vasta-aineiden, ja pienten ligandien kiinnittämiseksi hydrofobisiin • g •. · ; 20 pintoihin. SC3-hydrofobiinin on osoitettu päällystävän hydrofobisen kultapinnan. Ehdo- tettiin, että pintaan sitoutuneen SC3-kalvon esillä olevalla hydrofiilisellä puolella voidaan ’·"" * mannoositähteitä hapettaa peijodihapolla häiritsemättä sitoutumista kultaan, kun taas *...: synnytettyj en aldehydiryhmien ehdotettiin kytkeytyvän proteiinin aminoryhmiin Schiff- pohjaisella reaktiolla. Tämän lähestymistavan haittana on, että muodostuu uusia kemial- » » » ·* 25 lisiä sidoksia, jotka voivat joko rajoittaa proteiinin luoksepäästävyyttä tai muuttaa kohde- ‘ ’ proteiinin kemiallisia ominaisuuksia.

f 11 « i ‘;' Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on poistaa tunnetun tekniikan ongelmat ja saada ‘* aikaan uusi menetelmä polypeptidien tai proteiinien immobilisointia varten, jossa menetel- • 30 mässä kiinnostuksen kohteena oleva polypeptidi tai proteiini säilyttää olennaisen määrän biologisesta funktiostaan tai aktiivisuudestaan.

3 116198 Tämän keksinnön kohteena on erityisesti menetelmä polypeptidien tai proteiinien immobilisoimiseksi, joka sisältää seuraavat vaiheet: - tarttumisproteiinia koodaavan nukleotidisekvenssin liittäminen kiinnostuksen kohteena olevaa polypeptidiä tai proteiinia koodaavaan nukleotidisekvenssiin, 5 - fuusiokonstruktin siirtäminen isäntään ja ilmentäminen siinä sopivissa olosuhteissa ja - fuusiopolypeptidin tai -proteiinin immobilisointi puhdistetusta preparaatista, kasvualustasta tai hajotetuista isäntäsoluista kiinteään pintaan.

10 Esillä olevan keksinnön mukaiselle menetelmälle proteiinien immobilisoimiseksi on pääasiassa tunnusomaista se, mitä määritellään patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.

Tämän keksinnön toisena kohteena on immobilisoitu polypeptidi tai proteiini, joka sisältää kiinteään pintaan immobilisoidun fuusiopolypeptidin tai -proteiinin. Fuusiopolypeptidi tai 15 -proteiini sisältää vähintään kaksi osaa: kiinnostuksen kohteena oleva polypeptidi ja tarttu-mispolypeptidi. Tarttumispolypeptidi on edullisesti hydrofobiini tai hydrofobiinin kaltainen proteiini. Fuusioproteiini immobilisoidaan kiinteään pintaan tarttumisproteiinin väli-. · ·. tyksellä. Fuusioproteiinin tarttumisosa kykenee spontaanisti immobilisoitumaan kiinteään : . ·. pintaan.

: . · . 20 •It I

....; Esillä olevan keksinnön mukaiselle immobilisoidulle polypeptidille on pääasiassa tunnus- • · .,.,: omaista se, mitä määritellään patenttivaatimuksen 22 tunnusmerkkiosassa.

Esillä olevan keksinnön avulla saadaan huomattavia etuja. Eräs tärkeä etu on, että immobi- • * · ’; 25 lisointimenetelmä estää kiinnostuksen kohteena olevan polypeptidin aktiivisuuden häviä- : ’": misen, kiinnostuksen kohteena oleva polypeptidi toisin sanoen säilyttää olennaisen määrän ,, ’,; biologista aktiivisuuttaan tai funktiotaan menetelmässä. Tavanomaisissa immobilisointi- > * . ’ · ·. menetelmissä biologinen aktiivisuus tai funktio usein häviää osittain tai kokonaan. 1 '. 30 Toinen tärkeä etu on, että adsorptio on spontaani. Menetelmässä ei tarvita mitään kemial lista ristisitomista tai kytkemistä reaktiivisiin ryhmiin.

4 116198

Tavanomaisissa immobilisointimenetelmissä polypeptidi.tai proteiini tulisi tavallisesti puhdistaa ennen immobilisointia. Tämän menetelmän mukaisesti immobilisointi voidaan tehdä käyttämällä puhdistamatonta proteiinipreparaattia, näin ollen kalliit ja monimutkaiset puhdistusjäijestelmät välttäen. On jopa mahdollista immobilisoida proteiineja suoraan 5 viljelyalustasta, jossa proteiini on tuotettu.

Lisäksi menetelmä tuottaa pinnan, jossa on funktionaalisten polypeptidien suuri tiheys, mikäli tavoitteena on esimerkiksi pinnan kapasiteetin suurentaminen. Jos halutaan kerros, jossa on kiinnostuksen kohteena olevan polypeptidin spesifinen pintatiheys, tarjoaa esillä 10 oleva keksintö helpon tavan tuottaa kerroksia, joissa on haluttu spesifinen pintatiheys.

Eräs etu on myös se, että tämän keksinnön mukainen menetelmä saa aikaan mahdollisuuden vaikuttaa kiinnostuksen kohteena olevan polypeptidin orientaatioon. Voi esimerkiksi olla edullista, että kiinnostuksen kohteena oleva polypeptidi suuntautuu ulospäin 15 pinnasta.

Nämä ja muut päämäärät yhdessä niiden tuottamien etujen kanssa tunnettuihin immobi-t ·. a lisointimenetelmiin tai —prosesseihin verrattuna, saadaan aikaan esillä olevalla keksinnöllä, i · ; .·, kuten jäljempänä kuvataan ja patenttivaatimuksissa esitetään.

:”·! 20 ·> * t • · · · ,...: Kuvio 1. Pylväsdiagrammi, joka esittää EGIc-HFBI:n tarttumisen silanisoituun ja käsittele- ....: mättömään lasipintaan EGIc-kontrolliin verrattuna. Tarttuminen mitataan fuusioproteiinin . ' · ·. sitoutuneena entsyymiaktiivisuutena, ja osoittaa, että nimenomaan fuusio HFBI:n kanssa ♦ · · saa proteiinin immobilisoitumaan hydrofobiselle pinnalle.

:*·*: 25 '... · Kuvio 2.

i » · « » ’ ' A) EGI-HFBI-fuusioproteiinin sitoutumisen isotermi silanisoituun lasiin, fuusioproteiinin ‘ ·; · * sitoutuneena entsymaattisena aktiivisuutena mitattuna. Ensimmäisen kertaluvun Langmuir- :, *',1 isotermi sovitetaan tuloksiin, mikä antaa maksimaaliseksi sitoutumisaktiivisuudeksi 2,8 •. ’ *: 30 pmol/m2 (67 pmol/s) ja dissosiaatiovakioksi 0,44 μΜ (21,8 pg/ml).

5 116198 B) Vastaavat isotermit, jotka osoittavat EGI-HFBI:n sitoutumisen Tefloniin ja polystyreeniin, silanisoituun lasiin verrattuna. Kontrolli osoittaa, että EGIc ei sitoudu polystyreeniin biologisesti aktiivisessa muodossaan.

5 Kuvio 3. EGIc-HFBI:n sitoutumisen ja desorption kinetiikka silanisoituun lasiin.

A) Adsoiptionopeus ilman HFBI:a ja vapaan HFBI:n kymmenkertaisen molaarisen ylimäärän kanssa. Fuusioproteiini tulee kilpailluksi ulos sitoutumisesta stökiömetrisessä suhteessa.

B) EGIc-HFBI:n desorptio silanisoidusta lasipinnasta ylimäärällä puskuria pesemällä.

10

Kuvio 4. EGIc:n, EGIc-HFBIIm ja EGIc-HFBI:n sitoutumisen sensogrammit alkyloituun kultapintaan SPS:lla mitattuna. EGIc-kontrolli ei osoita mitään sitoutumista pintaan, EGIc-HFBII adsorboituu injektion aikana mutta desorboituu pesuvaiheen aikana, kun taas EGIc-HFBI adsorboituu injektion aikana ja osoittaa hidasta desorboitumista pesun aikana.

15 ;' ‘ *: Kuvio 5. Natiivin HFBI:n ja HFBII.n sitoutumisen sensogrammit alkyloituun kultapintaan • :'; SPR:lla niitattuna. Vapaat hydrofobiinit eivät osoita sitoutumisen eroja, jotka havaittiin : : : hydrofobiinien ollessa fuusioproteiinien osina.

* « « » · t · ,·.··, 20 Kuvio 6.

A) Taajuussiirtymät ajan funktiona EGIc:n, EGIc-HFBII:n ja EGIc-HFBI:n sitoutumisen »at l ' : aikana silanisoituun kvartsipintaan kvartsimikrovaa’assa resonanssitaajuudella 1S MHz.

Mittaukset tehtiin staattisissa olosuhteissa. KuvassaB) esitetäänenergiandissipaatioarvon *: · · muutosta Af:n funktiona. Tulokset osoittavat, että etenkin HFBI-fuusio muodostaa tiheän :***: 25 ja jäykän kerroksen.

• I I t I > 6 116198

Esillä olevan keksinnön tarkoituksia varten termi “immobilisoida” tarkoittaa sitä, että polypeptidillä on halutuissa olosuhteissa kasvanut pitoisuus jossain pinnassa. Kiinnostuksen kohteena olevan polypeptidin pitoisuus on erityisesti vähintään 10 kertaa, edullisesti vähintään 100 kertaa, edullisemmin vähintään 1000 kertaa korkeampi pinnassa kuin 5 nesteessä jollakin etäisyydellä pinnasta. Riippuu kuitenkin sovelluksesta, milloin riittävä immobilisaatio tai adsorptio pintaan on tapahtunut. Vaikka immobilisaatio tai adsorptio ei olisikaan kovin vahva, voi se olla riittävä tietylle sovellukselle.

Termi ’’adsorptio” merkitsee tässä tapahtumaa, jossa atomi tai molekyyli tulee kiinnitty-10 neeksi kiinteään pintaan.

Termi “desorptio” merkitsee tässä ’’adsorptiolle” vastakkaista tapahtumaa.

“Fuusiopolypeptidi tai -proteiini” tarkoittaa polypeptidiä, joka sisältää vähintään kaksi 15 polypeptidiosaa, jotka on liitetty yhteen rekombinantti-DNA-tekniikoilla.

“Tarttumispolypeptidi” tarkoittaa tässä polypeptidiä, joka toimii fuusiopolypeptidikon-struktiossa kuten hydrofobiinit tai hydrofobiinin kaltaiset molekyylit. Tarttumispolypep-. *" tidi kykenee immobilisoitumaan kiinteään pintaan.

"V 20 • · ,",: Fuusiokonstruktissa käytetään tarttumispolypeptidiä tai sen funktionaalista osaa. Tarttu- ...,: mispolypeptidin funktionaalinen osa tarkoittaa sellaista tarttumispolypeptidin osaa, joka on t · . * · ·, fuusiokonstruktissa kykenevä immobilisoitumaan kiinteään pintaan.

* · · : v. 25 Fuusiokonstrukti sisältää edullisesti myös linkkerin kiinnostuksen kohteena olevan : "; polypeptidin ja tarttumispolypeptidin välillä.

, ·. Termi “hydrofobiini” tarkoittaa tässä polypeptidiä, jonka ominaisuudet tai sekvenssi • » muistuttavat kuvattuja peptidejä HFBI, HFBII, SRHI tai SC3.

Y\ 3o

Termillä “HFBI:n kaltainen”, “HFBII:n kaltainen”, “SRHI:n kaltainen”, tai “SC3:n kaltainen” tarkoitetaan tässä polypeptidiä, jolla on kuvatut ominaisuudet.

7 116198

Esillä olevan keksinnön tarkoitetaan kattavan myös polypeptidit HFBI, HFBII, SRHI ja SC3 tai polypeptidit, joilla on kuvatut ominaisuudet ja jotka käsittävät aminohapposekvenssejä, jotka ovat aminohapposekvenssitasolla vähintään 40-prosenttisesti, edullisesti 5 vähintään 50-prosenttisesti, edullisemmin vähintään 60-prosenttisesti, vieläkin edullisemmin vähintään 70-prosenttisesti homologisia mainittujen polypeptidien kanssa. Vieläkin edullisemmin katetaan polypeptidit, jotka käsittävät aminohapposekvenssejä, jotka ovat aminohapposekvenssitasolla vähintään 80-prosenttisesti, edullisimmin vähintään 90-prosenttisesti homologisia mainittujen polypeptidien kanssa.

10

Termillä “polypeptidi” tarkoitetaan tässä peptidisidoksin toisiinsa liittyneen kahden tai useamman aminohapon sekvenssiä. Määritelmän mukaan kaikki proteiinit ovat polypepti-dejä. Termiä polypeptidi käytetään tässä tarkoittamaan peptidejä ja/tai polypeptidejä ja/tai proteiineja.

15 “Kiinnostuksen kohteena oleva polypeptidi” tai “ennalta valittu polypeptidi” tarkoittaa mitä tahansa polypeptidiä, jolla on edullinen ominaisuus tai joka voi sitoa mitä tahansa yhtä tai useampaa kiinnostavaa molekyyliä. Polypeptidi valitaan, niihin rajoittumatta, .V ryhmästä, joka sisältää: jonkin antigeenin, jonkin vasta-aineen, jonkin entsyymin, jonkin !’V 20 rakenneproteiinin, j onkin tarttumisproteiinin tai j onkin säätelyproteiinin.

,,.,; “Kiinteä pinta” tarkoittaa tässä pintaa tai matriisia, johon hydrofobiini, hydrofobiinin • · . * · ·, kaltainen tai hydrofobiinin muunnos voi sitoutua. Kiinteä pinta on edullisesti hydrofobinen pinta. Kiinteä pinta voidaan valita ryhmästä, joka käsittää: jonkin silanisoidun pinnan, : v. 25 jonkin hiilivedyllä päällystetyn pinnan, jonkin polymeerin, kuten polyeteeni, polypropy- ;. leeni, polystyreeni, tai Teflon.

.. _ Tämän keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti fuusiopolypeptidi voidaan desorboida pinnasta kontrolloidulla tavalla. Tämä tehdään edullisesti ylimäärällä puskuria ja/tai ; · ’ 30 oktyyliglukosididetergenttiä, kuten SDS, Tween 20, C12-18 EO5 tai oktyyliglukosidi.

t » 8 116198

Termi ”biologinen funktio” tai "biologinen aktiivisuus” tarkoittaa tässä mitä tahansa ominaisuutta, joka on riippuvainen polypeptidin kovalenttisesta rakenteesta tai konfirmaatiosta. Biologinen aktiivisuus voi tarkoittaa esimerkiksi entsymaattista aktiivisuutta, katalyyttistä aktiivisuutta, antigeenisiä ominaisuuksia tai säätelytoimintoja.

5

Ilmaisulla "olennaisesti säilyttää biologisen funktion tai aktiivisuuden" tarkoitetaan tässä sitä, että kyseessä oleva polypeptidi tai proteiini säilyttää vähintään SO %, edullisesti vähintään 60 %, edullisemmin vähintään 70 % biologisesta funktiostaan tai aktiivisuudestaan. Vieläkin edullisemmin kyseessä oleva polypeptidi tai proteiini säilyttää vähintään 10 80 % ja edullisimmin vähintään 90 % biologisesta funktiostaan tai aktiivisuudestaan.

Tämän keksinnön edullisimmassa suoritusmuodossa kyseessä oleva polypeptidi tai proteiini säilyttää jopa 99 % tai enemmän biologisesta funktiostaan tai aktiivisuudestaan.

"Bioaktiivisella pinnalla" tarkoitetaan pintaa, jolla on kiinteälle pinnalle sitoutuneen 15 polypeptidin aikaansaama biologinen funktio.

Tämän keksinnön mukaisesti on mahdollista tuottaa polypeptidikerroksia, joilla on spesifinen pintatiheys. Tämä voidaan saada aikaan immobilisoimalla spesifinen määrä . * ’! fuusiopolypeptidiä, j oka sisältää kiinnostuksen kohteena olevan polypeptidin yhdessä j' V 20 spesifisen määrän kanssa vapaita tarttumispolypeptidejä.

.,..: Tämän keksinnön mukaisesti on myös mahdollista tuottaa polypeptidikerroksia, joissa on « t , · · *. kahden tai useamman ennalta valitun polypeptidin haluttu yhdistelmä. Tämä saadaan aikaan immobilisoimalla fuusiopolypeptidejä, jotka sisältävät erilaisia ennalta valittuja • v; 25 polypeptidej ä, samaan kiinteään pintaan.

,, t',; Fuusiopolypeptidi voidaan tuottaa sieni- tai hiivaisännässä, valittuna ryhmästä, joka . · * käsittää Trichoderma spp., Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp., Penicillium .'. spp., Humicola spp., Tolypocladium spp., Kluyveromyces spp., Pichia spp., Hansenula .‘ '. 30 spp., Candida spp., Yarrowia spp., Schizosaccharomyces spp., Saccharomyces spp. ja

Schizophyllum spp. Fuusiopolypeptidi tuotetaan edullisesti Trichoderma-isäanäs&L· 9 116198

Immobilisointimenetelmä voidaan toteuttaa 5-40 °C:n lämpötilassa, edullisesti se toteutetaan 20 °C - 35 °C:ssa. Immobilisointimenetelmä voidaan toteuttaa pH:ssa 3-7, edullisesti se toteutetaan pH:ssa 4-6. Immobilisointimenetelmä voidaan toteuttaa 0,1 - 2 M:n ionivahvuudessa, edullisesti se toteutetaan 0,5 -1 M:n ionivahvuudessa.

5 "Hydrofobiinit" ovat ryhmä proteiineja, joita on tähän mennessä löydetty ainoastaan rihmasienissä, joissa ne näyttävät olevan kaikkialla läsnä olevia. Ne ovat erittyviä proteiineja, joita joissakin tapauksissa löytyy kasvatusalustassa monomeereinä, ja siirtymässä pintoihin, joissa ne itsestään kerääntyvät muodostaen ohuita pintakerroksia, 10 mutta niitä löytyy myös sienirihmoihin sitoutuneena. Hydrofobiineille on myös tunnusomaista niiden korkea pinta-aktiivisuus. Schizophyllum communesta olevan hydro-fobiini SC3:n muodostama kerros on karakterisoitu perusteellisesti, ja sillä on pinnan hydrofobisuuden muuttamisen ominaisuus siten, että se muuttaa hydrofiilisen pinnan hydrofobiseksi ja hydrofobisen pinnan hydrofiiliseksi (Wostem, de Vries et ai. 1993) 15 (Martin, Cannon, et ai., 2000). SC3-kerros saadaan helposti näkyviin elektronimikroskopialla ja sille on tunnusomaista tiukasti pakkautunut sauvarakenne, ja sitä kutsutaan siksi usein sauvakerrokseksi (Wessels 1997). SC3-kerros on hyvin stabiili, ja vain hyvin kovat kemikaalit kuten puhdas trifluorietikkahappo tai muurahaishappo voivat liuottaa sen.

.' ’; Esimerkiksi kuumentaminen natriumdodekyylisulfaatin (SDS) liuoksessa ei vaikuta " Y 20 kerrokseen (de Vries, Fekkes et ai. 1993). On myös osoitettu, että suuria konformaation ’ Ύ muutoksia voi liittyä rakentumiseen ja adsorptioon (de Vocht, Scholtmeijer et ai. 1998).

‘ Hydropaattisuuskäyrien vertailu muodostaa perusteen hydrofobiinien jakamisen kahteen luokkaan, I ja II. Näillä kahdella luokalla on useita yhteisiä yleisominaisuuksia, mutta ne * * # : · ’ 25 näyttävät eroavan merkittävästi eräiden aspektien, kuten niiden rakenteiden liukoisuuden ’ *; · * osalta. Vaikka luokan I rakenteet ovat erittäin liukenemattomia, näyttävät luokan II hydro- ‘ * fobiinirakenteet ja adsorboituneet pintakerrokset joskus dissosioituvan helpommin, esimer- * .. * kiksi 60-prosenttisella etanolilla, SDS:lla, tai käyttämällä painetta. Luokan II hydrofobii- : V: neille ei tähän mennessä ole raportoitu sauvatyyppisiä pintarakenteita, ja luokan II hydro- Y ·; 30 fobiinit näyttävät monin tavoin olevan käyttäytymiseltään vähemmän äärimmäisiä (Wosten ja de Vocht, 2000). Vaikka ero luokkien välillä voidaan tehdä primäärirakenteen vertailulla, ei mitään selitystä ominaisuuksien eroille voida tehdä aminohappotasolla.

116198 ΙΟ

Hydrofobiineissa huomattavin piirre on kahdeksan Cys-tähteen rakenne, jotka muodostavat ainoan konservoidun primäärirakenteen hydrofobiiniperheissä, mutta on kuvattu myös hydrofobiineja, joissa tämä rakenne ei ole ollut konservoitu (Lora, de la Cruz et ai. 1994). Hydrofobiinit voivat myös erota modulaarisen koostumuksen osalta siten, että ne sisältävät 5 erilaisia määriä toistuvia hydrofobiiniyksiköitä (De Vries, Moore et ai. 1999). Muutoin hydrofobiineissa on huomattavaa primäärirakenteen vaihtelua. HFBI ja HFBII ovat kaksi luokan II hydrofobiinia Trichoderma reesei -sienestä, ja ovat melko samanlaiset 66 %:n sekvenssi-identiteetillä. Julkaistut tulokset luokan I ja II hydrofobiineista osoittavat, että luokkien välillä on funktionaalinen jako, joka näyttää pääasiassa käsittävän niiden aggre-10 gaattien rakenteen ja liukoisuuden. Systemaattisia tutkimuksia luokan II hydrofobiinien pintasitoutumisesta ei ole aiemmin raportoitu, mutta luokan I hydrofobiinin SC3 adsorptiota on karakterisoitu paljon yksityiskohtaisemmin. SC3:n tapauksessa sauvakerrosten muodostuminen näyttää olevan sitoutumisen olennainen komponentti. Hydrofobiineja on kuvattu esimerkiksi seuraavissa artikkeleissa; (Wessels 1997); ja (Wessels 1996). Γ.

15 reesein HFBI:n geenin eristäminen on kuvattu julkaisussa (Nakari-Setala, Aro et ai. 1996) ja HFBII:n julkaisussa (Nakari-Setala, Aro et ai. 1997). T. harzianumin srA/-geenin eristäminen on kuvattu julkaisussa (Munoz, Nakari-Setala et ai. 1997). Hydrofobiineja voidaan lisäksi tunnistaa ja kloonata kuten kuvataan kansainvälisessä patenttihakemuk-; · · ·* sessa PCT/FI00/00249 (WO 00/58342).

: !·! 20 •: · * i Kansainvälinen patenttihakemus PCT/FI00/00249 (WO Ö0/58342) kuvaa useiden hydro- " ”fobiinifuusioproteiinien rakenteen ja tuottamisen. Niiden j oukossa on Trichoderma reesein •.,,: HFBI liitettynä hydrolyyttiseen entsyymiin EGI (endoglukanaasi I) Tätä konstruktia on käytetty suurten määrien mainittua fuusioproteiinia tuottamiseksi ja puhdistamiseksi * · · : '.· 25 kahden faasin vesiuuttomenetelmallä.

» »

* I

» · ... Esillä olevaa keksintöä valaistaan esimerkein kahden sienihydrofobiiniproteiinin, HFBI ja HFBII T. reeseista ja hydrofobiinin SC3 Schizophyllum communesta tarttumisominai-;' *" suuksien tutkimuksilla näiden ollessa partnereina fuusioproteiineissa. Kolme rekombi- ‘ ’ 30 nanttifuusioproteiinikonstruktia tehtiin, joissa T. reeseista olevan endoglukanaasi EGI:n (EGIc) katalyyttinen domeeni liitettiin joko HFBI:een tai HFBII:een tai SC3:een. Karakterisointi tehtiin vertaamalla kahden fuusioproteiinin ominaisuuksia ja kontrollina 11 116198 eristettyä entsyymidomeenia EGIc. Päätulos oli, että HFBI:a voidaan käyttää menestyksellisesti immobilisoimaan fuusioproteiineja hydrofobisiin pintoihin hyvällä pysyvyydellä, ja fuusiopartnerin aktiivisuus säilyttäen, kuten esimerkeissä 3,4, 5,6 ja 7 esitetään. HFBII-fuusioproteiini sitoutuu eri tavalla kuin HFBI, kuten esimerkeissä 4 ja 5 osoitetaan. Hydro-5 fobisten pintojen tyypit olivat Teflon, polystyreeni ja alkyloitu tai silanisoitu lasi tai kulta. Eristettyjen hydrofobiinien adsorption tutkimukset hydrofobisilla pinnoilla pintaplasmoni-resonanssilla (SPR) tehtiin vertailuna esimerkissä 4 ja yhteisadsorptiokokeissa esimerkissä 5.

10 Sitoutuneen fuusioproteiinin desorptiota tutkittiin kahdentyyppisissä kokeissa, entsyymi-aktiivisuus-ja SPR-kokeissa (esimerkki 3 ja 4). Desorptio sitoutuneella entsyymiaktiivisuudella tutkittuna on hidasta HFBI-fuusiolle ja HFBII-fuusion tapauksessa se on aluksi nopeampaa. Vaikka HFBII-fuusion alku off-nopeus on nopea, pysyy jäljelle jäävä määrä hyvin stabiilisti sitoutuneena. Vastaavassa SPR-kokeessa EGIc-HFBI:lla on pieni aluksi 15 tapahtuva nopea desorptio, mitä seinää hyvin hidas vaihe.

... Adsorboitunut HFBI-fuusioproteiinikerros on mitä todennäköisimmin yksöiskerros, joka

peittää pinnan täydellisesti. Tämän osoittaa se tosiasia, että esimerkin 3 kuviossa 2A

• · * · '' · ’ esitetyssä isotermissä j a myöskin SPR-kokeissa saavutettu selkeästi määritetty kyllästys-< · · ,,, · 20 taso on kyllästyneen adsorption tason muotoinen. Maksimaalisen sitoutumisen taso vastasi ,,.,; arvoa 14 mg/m2, mikä on tiheälle yksöiskerrokselle odotettavalla välillä. Kvaitsimikro- . · “. vaakakokeissa (QCM) (esimerkki 6) AD-arvo on alhainen, mikä osoittaa kerroksen olevan ohut ja suhteellisen jäykkä.

* » » 1 2 3 4 5 6

Eräs etu, jonka fuusioproteiinilähestymistapa tarjoaaimmobilisoinnissa, kuvataanesimer- *·>»*« 2 kissä 7 ja esimerkissä 3 (kuvio 2B). Fuusioproteiinin sitoutumisen osoitetaan pitävän 3 * * 4 * ; · ’ kiinnostuksen kohteena olevan polypeptidin funktionaalisesti aktiivisena, kun taas vapaan 5 ::: polypeptidin spontaanisti sitoutuneen fraktion aktiivisuus katoaa. Esimerkeissä kaikki •, ‘ · · sitoutuvasta kontrolliproteiinista EGIc denaturoituu ja tulee näin ollen epäfunktionaa- 6 liseksi. Tämä osoittaa, että fuusioproteiinin sitoutumisen aikana molekyyli sitoutuu 12 116198 sellaisella tavalla, että katalyyttinen fuusiopartneri osoittaa ulospäin eikä denaturoidu pinnalla, kuten tapahtuisi fysikaalisen adsorption aikana.

On myös yllättävää, että molemmat fuusioproteiinit ja eristetyt hydrofobiinit ovat vesiliu-5 koisia ainakin 10 mg/ml :aan saakka, vaikka niiden hydrofobiset vuorovaikutukset näyttä vät olevan niin tärkeitä sitoutumiselle. Proteiinin liukoisena pitämiseksi ei näin ollen tarvita pinta-aktiivisia aineita tai muita lisäaineita.

Fuusioproteiini voidaan immobilisoida suoraan kasvualustasta tai hajotetuista isäntäso-10 luista kiinteään pintaan. Immobilisoitava fuusioproteiini voi myös olla puhdasta. Puhdistaminen voidaan esimerkiksi tehokkaasti suorittaa kahden faasin vesierotuksilla, kuten kuvataan kansainvälisessä patenttihakemuksessa PCT/FI00/00249 (WO 00/58342).

Menetelmä saa aikaan helpon tavan tuottaa immobilisoitua proteiinia immobilisoidun 15 fuusioproteiinin halutulla pintatiheydellä sekoittamalla fuusioproteiinia ja vapaata hydro-fobiinia eri suhteissa kuten esimerkissä 5 esitetään. Tätä ominaisuutta voidaan myös : ': käyttää tuottamaan pintoja kiinnostavien sekapolypeptidien kanssa, mikä on joskus eduksi : : : kun vaaditaan moniarvoisuutta esimerkiksi vasta-aineen ja antigeenin vuorovaikutuksissa.

• * · ‘: *': 20 Keksintöä voidaan käyttää esimerkiksi diagnostisissa välineissä kuten liuskoissa tai ‘ mikrotiitterilevyissä, joihin kiinnostuksen kohteena oleva polypeptidi on immobilisoitu.

•... · Edellä mainitut edut, kuten immobilisoinnin helppous, ovat näissä sovelluksissa eduksi.

Joissain tapauksissa, mikäli kiinnostuksen kohteena oleva polypeptidi on pieni, sen .* . ‘ valmistaminen rekombinantti-DNA-tekniikalla on vaikeaa ja hydrofobiinifuusiopartneri • » '···' 25 voi toimiapolypeptidinkantajana.

. « » · :Biosensoripinnat myös edustavat tapauksia, joissa edellä mainitut ominaisuudet kuten i': homogeenisuus, paksuus ja spontaani adsorptio ovat eduksi. 1

Bioaktiivisten pintojen luominen biologisesti aktiivisia polypeptidejä immobilisoimalla sallii muiden polypeptidien vuorovaikutusten tutkimisen immobilisoitujen polypeptidien 13 116198 kanssa, ja sillä voi siksi olla sovelluksia suurtehoseulonnassa, kiinteän faasin uutossa tai kromatografisessa puhdistamisessa. Immobilisoinnilla voi myös olla etuja fuusioproteiinin itsensä puhdistamisessa.

5 Esimerkit

Esimerkki 1. Fuusio proteiinien rakentaminen EGIT. reeseista, kuten monet sellulolyyttiset entsyymit, on modulaarinen proteiini. Se koostuu katalyyttisestä domeenista N-terminuksessa (368 aminohappoa) ja selluloosaa 10 sitovasta domeenista C-terminuksessa (36 aminohappoa). Nämä kaksi domeenia ovat glykosyloidun linkkerin liittämät (33 aminohappoa). Tässä tutkimuksessa käytettävä EGIc-proteiini on EGI:n lyhennetty muoto, josta puuttuu C-terminaalinen selluloosaa sitova domeeni ja suurin osa liittävästä linkkeristä. Se koostuu EGI:n 371 ensimmäisestä aminohaposta. EGIc-HFBI sisältää koko linkkerin, mutta asemaan 403, josta selluloosaa 15 sitova domeeni alkaa, liitettiin 75 aminohapon HFBI (Nakari-Setala, Aro et ai. 1996) selluloosaa sitovan domeenin sijaan. Analogisesti EGIc-HFBII:ssa on 71 aminohapon HFBII (Nakari-Setala, Aro et ai. 1997) liitettynä selluloosaa sitovan domeenin sijaan.

* · • * I I t • ·

t « I

• · · I | I « ·,: j Rekombinantti-DNA-konstruktiot ’ 20 EGIc:n kloonaus kuvataan julkaisussa (Srisodsuk, Lehtiö et ai. 1997),jaEGIc-HFBI:nja » * * i t

,,. EGIc-SC3 :n kloonaus kuvataan julkaisussa Penttilä et ai. (PCT/FI00/00249, WO

• · • · *'' 00/58342). EGIc-HFBII:a tuottavan kannan tekemiseksi käytimme templaattina vektoria .. . EGIc-HFBI:lle (pMQl 13), jossa geenikasetti on vahvan cbhl-promoottorin alaisena.

i » ’..EGIc-HFBII rakennettiin korvaamalla A/W-sekvenssi pMQl 13:ssa A/fc2-sekvenssillä.

25 hfb2:ta koodaava alue monistettiin ensin Ala-16:sta STOP-kodoniin PCR:lla käyttäen alukenaria 5' CGG AGG AGC TCG ACG ACT TCG AGC AGC CCG AGC TGC ACG : * ‘ CAG GCT GTC TGC CCT AC C GG (sense) ja 5' TCA TTG GAT CCT TAG AAG GTG

v.: CCG ATG GC (antisense) ja vektoria phfb2 templaattina (Nakari-Setala, Aro et ai. 1997).

* * : Alleviivattu sekvenssi sense-alukkeessa koodaa aminohappoja 413-425 EGI:ssa. PCR- 30 fragmentti hajotettiin SacLlla ja BamHI:lla, ja ligoitiin pMQ 113:iin, joka oli samalla tavalla tavalla hajotettu. Tuloksena oleva sieni-ilmentämisvektori pTNS32 sisälsi EGIc- 14 116198 HFBII-kasetin cbh 1 -promoottorin säätelykontrollin alaisena ja lopetussekvenssit. Ennen sienitransformaatiota pTNS32 hajotettiin EcoRLlla ja Sphl:lla ilmentämiskasetin vapauttamiseksi.

5 T. reesei -kanta QM9414 transformoitiin julkaisun (Penttilä, Nevalainen et ai. 1987) mukaisesti käyttäen 10 pg hajotettua pTNS32:a yhdessä 4 pg:n kanssa pAR021 :a, joka on olennaisesti sama kuin pRMLeX30 (Mach, Schindler et ai. 1994) ja antaa resistenssin hygromysiinille. Transformantit vedettiin viivoiksi kolme kertaa selektiiviselle alustalle, siirrostettiin sitten perunadekstroosiagarille itiöintiä varten. Itiösuspensiot maljattiin 10 selektiiviselle alustalle yksittäisten itiöpesäkkeiden saamiseksi jatkoanalyysiä varten.

Hygromysiinipositiiviset transformantit seulottiin EGIc-HFBII -fuusioproteiinin tuoton osalta analysoimalla viljelyalustanäytteitä mikrotiitterilevykasvatuksista selluloosalla HFBIIrlle spesifisillä vasta-aineilla.

IS Esimerkki 2. Proteiinin tuottaminen ja puhdistaminen.

EGIc tuotettiin ja puhdistettiin ioninvaihtokromatografialla kuten julkaisussa (Srisodsuk, ... Lehtiö et ai. 1997). EGIc-HFBII (kanta X77A) kasvatettiin ravistelupulloissa minimaali- • * • | alustassa (Penttilä, Nevalainen et ai. 1987), joka oli täydennetty 3 %:lla Solka-höytäle- * < · j ‘ V selluloosaa (James River Corporation, USA) and 1,5 %:lla kompleksista viljapohjaista * * * . . \ 20 typenlähdettä 7 päivän ajan. Se puhdistettiin viljelyalustasta tekemällä ensin suolanpoisto ...,: Bio-Rad P6 (Bio-Rad, USA) -pylväällä 10 mM asetaattipuskurilla, pH 5,0. Fraktio, josta . · · *, suolat oli poistettu, ladattiin sitten Resource Q -pylvääseen (Amersham Pharmacia, i · • · ·

Ruotsi) ja eluoitiin 10 mM asetaatin, pH 5,0 lineaarisella gradientilla, joka sisälsi 0,2 M j \. NaCl. Viimeisenä vaiheena EGIc-HFBII -piikkifraktio ladattiin sitten Phenyl Sepha- : : 25 rose’en (Amersham Pharmacia, Ruotsi), kun oli ensin lisätty (NH^SCVa siten, että loppu- ‘ . pitoisuudeksi tuli 0,5 M. Eluutio oli 10 mM asetaatilla, pH 5,0. Puhdistamista seurasi SDS- , - · , PAGE:n ajaminen ja western blotting käyttäen polyklonaalisia vasta-aineita, jotka oli I t . *. synnytetty EGI:a, HFBI:a ja HFBII:a vastaan.

» · I

* *

i » t « * I

1 » 15 116198 EGIc-HFBI:n viljely bioreaktorissa tehtiin kannalla VTT D-99702 40 g/l:n laktoosia kanssa minimaalialustassa 4 päivää LF7-fermentorissa (Chemap, Sveitsi). EGIc-HFBI puhdistettiin samalla tavalla kuin EGIc-HFBII, paitsi että aluksi tehtiin kahden faasin pinta-aktiivisen aineen uutto ja Phenyl Sepharose -vaihe jätettiin tekemättä.

5

Adsorptiokokeita varten puskurit vaihdettiin 10-DG -pylväillä (Bio-Rad). Proteiinipitoisuudet määritettiin adsorptiolla 280 nm:n kohdalla käyttäen ekstinktiovakiota 61180 EGIc-HFBI:LLE, 60020 EGIc:lle ja EGIc-HFBII:lle.

10 Esimerkki 3. Fuusion sitoutuminen kiinnostuksen kohteena olevan polypeptidln entsymaattisella aktiivisuudella analysoituna.

EGIc-HFBI:n ja kontrollin EGIc sitoutuminen erilaisiin pintoihin testattiin aluksi upottamalla sauva 0,5 mkaan fuusioproteiinin liuosta koeputkessa. Standardiolosuhteina adsorptiolle käytettiin 50 mM asetaattipuskuria pH:ssa 5,0. NaCl:n tai (NFLOaSO^n 15 lisäämistä käytettiin ionivahvuuden vaikutuksen testaamiseksi. pH:n vaikutuksen testaamiseksi käytettiin glysiiniä, pH 3,0, tai Hepesrta, pH 7,0. Sauvat oli tehty joko lasista tai ; “': Teflonista ja niiden läpimitta oli 2 mm pyöristetyin päin ja pituus noin 3 cm. Käyttäen : : samaa tilavuutta koeputkissa sauvojen paljas pinta pidettiin vakiona. Lasisauvoja käytetään | j | joko sellaisenaan tai silanisoituna trimetylikloorisilaanilla (T4252, Sigma) tai dimetyyli- ’:20 kloorisilaanilla (D3879). Teflon-sauvat saatiin Cowie Technologies’lta (UK). Tiettyinä ': ‘ : ajankohtina sauvat nostettiin pois liuoksesta ja pantiin 5 mkaan 50 mM asetaattipuskuria, • · * •... · pH 5,0,2 minuutiksi varovaisella ravistelulla. Sitten pesu toistettiin.

: ’' ’; Entsyymiaktiivisuuden mittauksissa käytimme hyväksi EGI:n aktiivisuutta liukoista ,, ’, j 25 fluorogeenistä substraattia 4-metyyliumbelliferyyli-P-D-sellobiosidi (MUG2) (M6018, . · , Sigma) kohtaan proteiinin määrittämiseksi. Kumpikaan hydrofobiini ei osoita mitään entsymaattista aktiivisuutta tähän tai mihinkään muuhun tunnettuun substraattiin. Sitoutu- * » · I ‘. neen entsyymin määrä mitattiin upottamalla sauva 0,5 mkaan 0,5 mM 4-MUG2:a 5 minuu tiksi. Reaktio lopetettiin nostamalla sauva pois ja 0,5 ml 1 M NaCOj. Aktiivisuuden mitta-30 ukset nestemäisissä näytteissä suoritettiin samalla tavalla. Vapautunut metyyliumbelli-feroni määritettiin fluoresenssilla 96-kuoppaisessa lukijassa käyttäen eksitaatiosuodinta 16 116198 (355 nm) ja emissiosuodinta (430 nm) (Multiscan, Labsystems, Suomi). Standardikäyrien tekemiseksi aktiivisuusmittauksia varten käytettiin puhdasta reaktiotuote 4-metyyliumbel-liferonia (M 1381, Sigma). Assosiaationopeus laskettiin sovittamalla yksifaasinen eksponentiaalinen assosiaatiokäyrä tuloksiin, käyttäen Prism-ohjelmistoa (Graph Pad, USA) 5

Kuviossa 1 esitetyt tulokset osoittavat, että HFBI-fuusion ja hydrofobisen pinnan yhdistelmä johtaa merkittävään sitoutumiseen, kun taas muut yhdistelmät osoittivat paljon vähäisempää sitoutumista.

10 Adsorptiokapasiteetin osoittamiseksi määritettiin sitoutumisisotermi (kuvio 2A). Isotermi mallinnettiin ensimmäisen kertaluvun Langmuir-jhtälöllä. Maksimiadsorptio saavutetaan noin 70 pmol/s:n kohdalla. Kvantitointia varten määritimme spesifisen aktiivisuuden EGI:lle 3,48 nmol s'1 mg'!:ksi (22 °C). Tästä voidaan arvioida, että noin 14 mg m'2 proteiinia immobilisoitui silanisoiduille lasisauvoille. Isotermituloksista voitiin arvioida, että 15 EGIc-HFBI / silanisoitu pinta -kompleksin dissosiaatiovakio (Kd) oli 0,44 μΜ (21,8 pg/ml, Bmax = 2,8 pmol/m2).

;’ Osittaiset isotermit fuusioproteiinin sitoutumiselle Tefloniin ja polystyreeniin silanisoituun *" ; lasiin verrattuna esitetään kuviossa 2B. Kuten kuviossa esitetään, ei EGIc-kontrollin sitou- tilli , 20 tuminen polystyreeniin osoita lainkaan sitoutunutta EGI:a entsymaattisen aktiivisuuden • · perusteella.

t i t

Riippuvuutta lämpötilasta testattiin määrittämällä osittaiset sitoutumisisotermit 5,22,35 ' · · °C:ssa ja vertaamalla affiniteettia isotermien alkukulmakertoimien perusteella. Mitään 25 merkittävää lämpötilan vaikutusta ei havaittu. Ionivahvuuden muuttamisen vaikutuksia ;: määritettiin lisäämällä NaCl:a tai (NH^SO^ta. Korkea suolapitoisuus (1 M) johti affini- :';': teetin lievään kasvuun (10-15 %). Kokeet, joissa käytettiin puskureita pHrssa 3,5, ja 7 : ·.: osoittivat suurempaa vaikutusta, sitoutumisen ollessa 25 % parempi pH:ssa 5 kuin pH:ssa 3 • » ja 40 % parempi pH:ssa 5 kuin pH:ssa 7.

17 116198

Silanisoituun lasiin sitoutumisen ja siitä tapahtuvan desorption kinetiikka esitetään kuvioissa 3A ja 3B. Sitoutuminen on hyvin hidastaja vaatii yli viisi tuntia saavuttaakseen tasaisen arvon.

5 Desorptiotesteissä sauvoja, joita oli inkuboitu EGIc-HFBI:n kanssa pestiin ja inkuboitiin sitten eri aikoja suuressa ylimäärässä puskuria (50 mM asetaatti, pH 5). Lievä desorptio tai inaktivoituminen voidaan havaita 24 tunnin kuluessa. Desorptiota tutkittiin myös lisäämällä 0,5 % SDS:aa tai Tween 20:a pesupuskureihin. Käyttämällä SDS:aa aktiivisuus katosi välittömästi, ja käyttämällä Tween 20:a sitoutunut aktiivisuus aleni 50 %:iin 1-2 io tunnissa.

Esimerkki 4. Sitoutumisanalyysi pintaplasmoniresonanssilla

Sitoutumisen tutkimiseen pintaplasmoniresonanssilla käytettiin Biacore-biosensoria (Biacore, Ruotsi). Ennakkoon valmistettuja HPA-sensoripintoja käytettiin, joissa on 15 oktadekaanitiolin kerros sitoutuneena alla olevaan kultapintaan. 50 mM asetaattipuskuria, pH 5,0 käytettiin ajopuskurina nopeudella 5 μΐ/min. Virtauskyvetit pestiin 1-prosenttisella : * ‘ ’: oktyyliglukosidilla ja pestiin perusteellisesti ennen näytteen syöttämistä. Näytetilavuus oli j (f: tyypillisesti 30 μΐ, ja proteiinin desorptio testattiin oktyyliglukosidilla, SDS :11a ja ionit- ·. * f tornilla pinta-aktiivisilla aineilla Tween 20 ja C12-18EO5, käyttäen laimennoksia 10,5 and 1 20 g/1 ja injektiotilavuuksia 5-25 μΐ. Kuviossa 4 esitetään esimerkki kahden fuusion ja ’: ’ ‘: kontrollin adsorptiokäyttäytymisestä alkeenitiolilla päällystetyllä kultapinnalla. Tässä :esimerkissä EGIc-kontrolli injektoitiin ensin ja sitten EGIc-HFBII -fuusio ja lopuksi EGIc-HFBI -fuusio. EGIc:lla on merkityksetön adsorptio eikä osoita mitään vastesignaalia tällä : · * vahvistusskaalalla. EGIc-HFBII osoittaa nopean sitoutumisen näytteen injektoinnin aikana, ‘ ·; * ’ 25 ja nopean desorption pesuvaiheen aikana, kun taas HFBI-fuusio osoittaa jossain määrin ‘: ‘' ·’ hitaamman sitoutumisen ja hyvin hitaan desorption. Muissa kokeissa injektiojäijestystä ja :: injektioiden määriä muutettiin. Kun HFBI-fuusio injektoitiin tuoreelle pinnalle, oli sitou- : *; ‘: tuneen proteiinin taso suurempi samalla määrällä kuin HFBII-fuusio sitoutui kuviossa 4 I » : ’ ·. i olevassa esimerkissä sitoutunut, and vastaavasti HFBII-fuusio ei sitoutunut, jos HFBI-

» I

30 fuusio injektoitiin ensin. Testasimme desorptiota pinta-aktiivisilla aineilla SDS, Tween 20, C12-18EO5 ja oktyyliglukosidi pinnan regeneroimiseksi, ja havaitsimme, että 5 μ1:η SDS- 18 116198 injektio pitoisuudessa 1 g/1 kykenee poistamaan sitoutuneen proteiinin. Muut pinta-ak-tiiviset aineet eivät merkittävästi alentaneet sitoutuneen proteiinin määrää, vaikka pinta-aktiivisen aineen injektoiminen johti usein epästabiiliin signaaliin. Regeneraation jälkeen seuraavan proteiinisaijan sitoutuminen oli samanlainen kuin edellisten, mutta riittävän 5 erilainen ollakseen sallimatta käyrän sovittamisen ja sitoutumisparametrien laskemisen. Tämän mahdollinen syy on, että regenerointi oli vaurioittanut pintaa.

SPR:ssa nähdään puskuri- tai bulkkivaikutukseksi kutsuttu ilmiö, kun näyteliuoksella on erilainen taitekerroin kuin ajopuskurilla. Tämä tarkoittaa sitä, että havaitaan RU-signaali 10 vaikka mitään sitoutumista ei tapahdu (Hashimoto 2000). Tässä työssä EGIc-kontrol-liproteiinin bulkkivaikutus oli merkityksetön verrattuna kahden fuusioproteiinin tuottamaan signaaliin. Voidaan siksi tehdä se johtopäätös, että HFBII-fuusiosignaali johtuu todellisesta vuorovaikutuksesta eikä bulkkivaikutuksesta, mutta jossa sekä off- että on-nopeudet ovat nopeita.

15 EGIc-HFBI -näyte osoittaa hitaampaa on-rate -sitoutumista ja paljon hitaampaa desorp- :***;. tionopeuttakuin EGIc-HFBII -näyte. Sitoutunut HFBI-fuusio ei desorboitunutpiden- * * * • :': nettyjen, yli yön kestäneiden puskuripesujen aikana enempää kuin 5 %. On huomion- : : ’; arvoista, että HFBII-fuusio saavuttaa hyvin stabiilin joskin alhaisen sitoutuneen proteiinin *: * *: 20 tason nopean alkudesorptiovaiheen jälkeen. Neljän myöhemmän injektion jälkeen RU-taso ’: *': oli noin 4500 EGIc-HFBI:lle ja noin 900 EGIc-HFBII:lle. Taso ei kohonnut tästä myöhem- : pien injektioiden aikana edes proteiinipitoisuuksissa, jotka olivat yli 250 pg/ml. Koska vaste SPRissa on suhteessa sitoutuneeseen massaan, on mahdollista arvioida sitoutuneen • '. proteiinin määrä suhteella, jonka mukaan 1000 RU vastaa 1 mg/m2.

25 « »li»·

Lisätestejä eristettyjä hydrofobiineja käyttäen esitetään kuviossa 5. Saadut käyrät eivät olle • » * · ’ täysin tasaisia ja antoivat ajoittain epästabiilin vastesignaalin. Tästä huolimatta voidaan havaita, että molemmat proteiinit yhdistyvät hydrofobisen pintaan, mutta HFBII:n sitou- ♦ i * ' ‘ tuminen oli lievästi heikompaa.

30 19 116198

Esimerkki 5. Adsorboituneen kerroksen liganditiheys

Usein on tärkeää, että adsorboituneen kerroksen liganditiheys voidaan optimoida tiettyyn kattavuuteen. Osoitamme, että lisäämällä samanaikaisesti vapaata HFBI:a ja fuusiopro-teiini EGI-HFBI:a, nämä kaksi proteiinia adsorboituvat stökiömetrisessä suhteessa. Koe 5 suoritettiin käyttämällä HFBIia ja fuusioproteiinia suhteessa lilja suhteessa 1:9 putkessa ja hydrofobista Teflon- tai silanisoutua lasisauvaa upotettuna liuokseen 6 tunniksi. Inku-boinnin jälkeen sauvat pestiin perusteellisesti ja hydrolyyttinen aktiivisuus määritettiin MUG2:lla kuten esimerkissä 3 kuvataan. Sitoutunut aktiivisuus oli 50 % kontrollista, kun proteiinit olivat läsnä suhteessa 1:1 ja 10 % suhteella 1:9. Vertailuna naudan seerumial-10 bumiinin yhtä suuren pitoisuuden lisääminen ei estänyt HFBI-fuusion sitoutumista silani- soituun lasiin. HFBI:n tai HFBII:n lisääminen kompetitiokokeissa johti fuusioproteiinia joutumiseen kilpailluksi ulos stökiömetrisessä suhteessa, kuten kuviossa 3A esitetään.

Esimerkki 6. Sitoutuminen analysoituna kvartsimikrovaa'alla 15 Käytetty kvartsikidemikrovaaka (QCM) oli mallia QAFC 301 Q-Sense'ltä (Ruotsi), joka mahdollistaa sekä taajuuden että dissipaatiotekijän mittaamisen (Hook, Rodahl et ai. 1998). . · · ·. Kvartsikiteiden resonanssi taajuus oli 5 MHz ja ne oli esipäällystetty Siialla (QSX 303).

. ·. Kiteet silanisoitiin trimetyylikloorisilaanilla inkuboimalla reagenssia yhdessä sensori- : pinnan kanssa eksikaattorissa, ja pestiin perusteellisesti vedellä. Proteiini (EGIc, EGIc- ·;·.· 20 . HFBI, ja EGIc-HFBII) laimennettiin 50 mM asetaattipuskurilla, pH 5,0, pitoisuuteen 0,25- *: · · 0,5 mg/ml. Kun stabiili pohjaviiva oli saatu aikaan, näyte injektoitiin mittauskammioon : ’kuten julkaisussa (Hook, Rodahl et ai. 1998) kuvataan, 30 °C:n lämpötilassa. Af ja AD tallennettiin 5 ja 15 MHzrssa 2 Hz:n näytteenkeruunopeudella.

» * f : . 25 Kvartsimikrovaaka (QCM) antaa kahdentyyppistä informaatiota. Muutos taajuudessa, Af, on suoraan verrannollinen adsorboituneeseen massaan, ja dissipaation muutos, AD, antaa informaatiota signaalin vaimenemisnopeudesta, joka on riippuvainen adsorboituneen ; ‘, kerroksen rakenteesta. Adsorboitunut massa voidaan laskea resonanssitaajuuden muutok sesta Sauerbreyn suhteella: 30 Am= -CAf/n 20 116198 jossa Am on adsorboitunut massa, n on yliäänen luku (n=l 5 MHz:n mittauksille ja 3 15 MHz:n mittauksille), ja C on massaherkkyysvakio (17.7 ng cm'2 Hz'1) (Sauerbrey 1959; Hook, Rodahl et ai. 1998). Kuvio 6 esittää kahden fuusioproteiinin ja kontrollin adsorptio-käyrät silanisoituun kvartsipintaan. EGIc-HFBI antaa maksimaalisen Af:n 240 Hz, joka 5 vastaa 14 mg/m2:n adsorboitua massaa. Tässä mittauksessa vapaa pitoisuus 0,25 mg/ml oli kyllästävä, tarkistettuna titrauksella korkeammilla pitoisuuksilla. Koska QCM:ssa on näytekyvetti, jossa näyte on staattinen eikä virtaava, näemme HFBII-fuusiolle tilanteen, joka vastaa injektiovaihetta SPR:ssa. Tulokset osoittavat, että tasapainotilanteessa HFBII-fuusio sitoutuu hydrofobiseen pintaan.

10 AD:n esittäminen graafisesti Af:n funktiona antaa informaatiota kerroksen jäykkyydestä adsorboituneen proteiinimäärän funktiona. Pieni AD (hidas vaimentuminen) osoittaa jäykkää adsorboitunutta kerrosta ja suuri AD osoittaa adsorboitunutta kerrosta, joka tehokkaasti adsorboi värähtelyenergian adsorption aikana. Kuviosta 6B havaitsemme, että 15 EGIc-kerros liittyy hyvin löyhästi pintaan, ja antaa hyvin jyrkän käyrän, jossa on suuri D:n muutos f:n muuttuessa hyvin vähän. EGIc-HFBI -sitoutuminen osoittaa hyvin suuren ... muutoksen Afissa ja vastaavasti pienen muutoksen AD:ssä, mikä osoittaa, että muodostuu . tiheä ja jäykkä kerros (Hook, Rodahl et ai. 1998; Hook, Rodahl et ai. 1998; Hook, Rodahl • V et ai. 1998). HFBII-fuusio osoittaa edellisten välillä olevaa käyttäytymistä. Käyrältä • · * ., ’, 20 voimme myös havaita, että EGIc-HFBI:n adsorptio on kaksifaasinen, pienellä D:n ,,.,; alkumuutoksella, joka sitten tulee jyrkemmäksi lähempänä kyllästymistä. Nämä tiedot . · · ·. osoittavat, että sitoutumisen myöhemmän vaiheen aikana kerroksen paksuus kasvaa I · kyllästystä lähestyttäessä proteiinin pakkautuessa tiukemmin. Tavalliset dissipaatioarvot : V. globulaarisille proteiineille ovat noin 1 x 1 O'6 f:n muutokselle 20-40 adsorboituessaan » t ; ; 25 jäykkänä kerroksena (Hook, Rodahl et ai. 1998; Hook, Rodahl et ai. 1998; Hook, Rodahl et « t · _ _ ’ . ai. 1998). Kiijallisuudessa on raportoitu korkeampia arvoja esimerkiksi antigeeniker- • · , · · ·, rokseen sitoutuneiden immunoglobuliinien tapauksessa, koska tämän tyyppinen sitou- * · tuminen jättää pitkän Fc-osan riippumaan liuokseen.

I * » 21 116198

Esimerkki 7. Fuusioproteiinin sitoutuminen puhdistamattomasta supernatantista

Teflonsauvoja upotettiin kuten esimerkissä 3 kuvattiin viljelyalustaan, jossa EGIc-HFBI-ja EGIc-SC3 -proteiinia oli tuotettu esimerkissä 2 kuvatulla tavalla. Kontrollina käytettiin viljelyalustaa isäntäkannasta, joka ei tuottanut mitään fuusioproteiinia. Entsymaattiset 5 määritykset osoittivat, että 5 minuutin reaktioajan jälkeen kontrolliviljelyalustassa inku- boidut sauvat eivät kyenneet hydrolysoimaan lainkaan MUG2-substraattia, kun taas EGIc-SC3:ssa inkuboidut sauvat hydrolysoivat 0,15 μΜ MUG2:a ja EGIc-HFBI:ssa inkuboidut sauvat hydrolysoivat 1,5 μΜ MUG2:a. Alempi aktiivisuuden määrä EGIc-SC3:ssa johtuu todennäköisesti siitä, että T.reesei tuottaa pienemmän määrän tätä proteiinia verrattuna 10 EGIc-HFBI:een.

Esimerkki 8. Fuusioproteiinin sitoutuminen polystyreenilateksiin

Entsyymiä EGIc tai fuusioproteiinia EGIc-HFBI (100 pg/ml) inkuboitiin lateksihelmien (Sigma LB-30) suspensiossa 3 tuntia. Sitten suspensio sentrifugoithn 10 000 g:ssä 15 15 minuuttia siten, että lateksi pelletoitui, ja supematantti poistettiin. Lateksipelletti sus- pendoitiin sitten uudelleen alkuperäiseen tilavuuteen puskuria. Proteiinin adsorptiota seurattiin supematanttiin jäävän MUG2-aktiivisuuden avulla (mitattuna kuten esimerkissä :... 1 3), ja aktiivisuus lateksihelmillä mitattiin uudelleensuspendoidusta lateksipelletistä. Latek- • · .: : siffaktio EGIc-proteiinille ei osoittanut mitään entsymaattista aktiivisuutta, kun taas EGIc- * 1 ·’ ' : 20 HFBI -fuusioproteiinin kanssa inkuboitu lateksifraktio osoitti aktiivisuutta, joka vastasi 80 • mi %:a inkubaatiossa läsnä olevasta alkuaktiivisuudesta. Toistokokeissa lateksihelmiin sitoutuneen EGIc-HFBI:n aktiivisuus ei osoittanut mitään aktiivisuuden alenemista neljän • · ' · · 1 ‘ päivän inkuboinnin aikana huoneenlämpötilassa. Kaikissa tapauksissa EGIc:n inkubointi t, i lateksin kanssa aiheutti proteiinin merkittävän inaktivoitumisen. Koe osoittaa, että EGIc I 1 ’.,; 25 menetti aktiivisuutta lateksihelmien kanssa inkuboinnin aikana mahdollisesti denatu-

* I

» I

';' roitumisesta johtuen, mutta EGIc-HFBI ei näin tehnyt vaan immobilisoitui sen sijaan 112» ‘ 1 funktionaalisesti.

* 1 * 1 1 1 » 2 I 1 » 22 116198

Viitteet de Vocht, M. L., K. Scholtmeijer, et ai. (1998). “Structural characterization of the hydrophobin SC3, as a monomer and after self-assembly at hydrophobic/hydrophilic interfaces." Biophvs. J. 74(4): 2059-68.

5 de Vries, O., M. P. Fekkes, et al. (1993). “Insoluble hydrophobin complexes in the walls of Schizophyllum communae and other filamentous fungi." Arch. Microbiol. 159: 330-335.

De Vries, O. M., S. Moore, et al. (1999). “Identification and characterization of a tri-partite hydrophobin from Claviceps fusiformis. A novel type of class II hydrophobin." Eur J Biochem 262(21: 377-85.

10 Hashimoto, S. (2000). Principles of BIACORE. Real time analysis of biomolecular interactions. K. Nagata and H. Handa. Tokyo, Springer Verlag: 23-32.

Hook, F., M. Rodahl, et al. (1998). “Energy dissipation kinetics for protein and antibody-antigen adsorption under shear oscillation on a quarz crystal microbalance." Langmuir 14: 729-734.

15 Hook, F., M. Rodahl, et al. (1998). “QCM-measurements of ferritin monolayers on methyl- thiolated gold; depenence of energy dissipation and saturation coverage on salt j *;' concentration." J Colloid Interface Sci 208: 263-267.

• » · • « I · : . . Hook, F., M. Rodahl, et al. (1998). “Structural changes in hemoglobin during adsorption to

t 1 I

solid surfaces: effects of pH, ionic strength, and ligand binding." Proc Natl Acad Sei U S A .,..: 20 95(21):12271-6.

:..,: Lora, J. M., J. de la Cruz, et al. (1994). “A putative catabolite-repressed cell wall protein from the mycoparasitic fungus Trichoderma harzianum." Mol Gen Genet 242(4): 461-6.

I r I

* I ·

Mach, R. L., M. Schindler, et al. (1994). “Transformation of Trichoderma reesei based on t · • · ' i ‘ hygromycin B resistance using homologous expression signals." Curr Genet 25(6): 567-70.

*

Mill , · · ·, 25 Martin, G. G., G. C. Cannon, et al. (2000). “Sc3p hydrophobin organization in aqueous * · it» media and assembly onto surfaces as mediated be the associated polysaccharide « * · ; *. schizophyllan." Biomacromolecules 1:49-60.

Munoz, G., T. Nakari-Setala, et al. (1997). “Hydrophobin gene srhl, expressed during sporulation of the biocontrol agent Trichoderma harzianum." Curr Genet 32(3): 225-30.

23 116198

Nakari-Setala, T., N. Aro, et ai. (1997). “Differential expression of the vegetative and spore-bound hydrophobins of Trichoderma reesei—cloning and characterization of the hfb2 gene.“ Eur, J. Biochem, 248(2): 415-23.

Nakari-Setala, T., N. Aro, et ai. (1996). “Genetic and biochemical characterization of the 5 Trichoderma reesei hydrophobin HFBI.“ Eur. J. Biochem. 235(1-2): 248-55.

Penttilä, M., H. Nevalainen, et ai. (1987). “A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei.“ Gene 61(2): 155-64.

Sauerbrey (1959). “ Verwendung von Schwingquarzen zur Wargung dunner Schichten zur Mikrowagung." Z. Phvsik 155: 206-222.

10 Srisodsuk, M., J. Lehtiö, et al. (1997). “Trichoderma reesei cellobiohydrolase I with an endoglucanase cellulose- binding domain: action on bacterial microcrystalline cellulose." J Biotechnol 57(1-3): 49-57.

Wessels, J. G. (1997). “Hydrophobins: proteins that change the nature of the fungal surface.” Adv. Microb. Phvsiol. 38: 1-45.

15 Wessels, J. G. H. (1996). “Fungal hydrophobins: proteins that function at an interface." Trends Plant Sci. 1(1): 9-15.

’" Wosten, H. A. and M. L. de Vocht (2000). “Hydrophobins, the fungal coat unravelled.4* « * ♦ » V Biochim Biophvs Acta 1469(2): 79-86.

* Ϊ I

* « · · *: * Wosten, H. A. B., O. M. H. de Vries, et al. (1993). “Interfacial self-assembly of a fungal ·:·: 20 hydrophobin into a hydrophobic rodlet layer." Plant cell 5: 1567-1574.

• · • » * » *

I « I

* * «lift ( t ( * t J · *

Claims (24)

116198

1. Menetelmä polypeptidin immobilisoimiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: 5. liitetään tarttumispolypeptidiä koodaava nukleotidisekvenssi, joka polypeptidi on luokan Π hydrofobiini,.ennalta valittua polypeptidiä koodaavaan nukleotidisek-venssiin fuusiokonstruktin muodostamiseksi; - ilmennetään fuusiokonstrukti isännässä sopivissa olosuhteissa; - immobilisoidaan fuusiopolypeptidi suoraan kasvualustasta tai puhdistetusta tai 10 osittain puhdistetusta kasvualustasta tai hajotetuista isäntäsoluista tai puhdista- mattomasta, puhdistetusta tai osittain puhdistetusta proteiiniliuoksesta kiinteään pintaan tarttumispolypeptidin välityksellä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ennalta valitulla 15 polypeptidillä on immobilisoidussa muodossa vähintään 50 % biologisesta funktiosta tai aktiivisuudesta, joka sillä on vapaassa muodossaan.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tarttumispoly- : ‘ : peptidi on hydrofobiiniyksiköiden moninkertainen rakenne tai sellainen hydrofobiinin osa, • ;'; 20 joka kykenee immobilisoitumaan kiinteään pintaan. ':··.· 4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ’:": tarttumispolypeptidi on Trichoderman hydrofobiini. • · • · • · I

5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että :.: ! hydrofobiini on Trichoderma reesein HFBI tai HFBI:n kaltainen polypeptidi tai HFBII tai "... * HFBILn kaltainen polypeptidi, tai I harzianumin SRHI tai SRHLn kaltainen polypeptidi •; * tai polypeptidi, joka käsittää aminohapposekvenssin, joka on aminohapposekvenssitasolla i(: vähintään 40-prosenttisesti homologinen mainittujen polypeptidien aminohapposekvens- •;: 30 sien kanssa. 116198

6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiinteä pinta valitaan ryhmästä, joka käsittää: silanisoitu pinnan, hiilivedyllä päällystetyn pinnan, polymeerin, kuten polyeteenin, polypropyleenin, polystyreenin, tai Teflonin.

7. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fuusiopolypeptidin immobilisoituminen kiinteään pintaan on spontaania.

8. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fuusiopolypeptidi voidaan desorboida pinnasta kontrolloidulla tavalla. 10

9. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fuusiopolypeptidi immobilisoidaan yhdessä spesifisen määrän kanssa vapaita tarttu-mispolypeptidejä.

10. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ennalta valittu polypeptidi voidaan suunnata halutulla tavalla.

11. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että . · · ·. ennalta valittu polypeptidi suuntautuu poispäin pinnasta. 20 • · · • · » · : .12. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ....: kaksi tai useampia ennalta valittuja polypeptidejä immobilisoidaan fuusiokonstrukteina •; · · j samaan kiinteään pintaan.

13. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että : fuusiopolypeptidi tuotetaan sieni- tai hiivaisännässä, valittuna ryhmästä, joka käsittää •... ‘ Trichoderma spp., Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp., Penicillium spp., .:. Humicola spp., Tolypocladium spp., Kluyveromyces spp., Pichia spp., Hansenula spp., * * 1 * Candida spp., Yarrowia spp., Schizosaccharomyces spp., Saccharomyces spp. ja [ ; 30 Schizophyllum spp. • · 1 • 4 Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sieni-isäntä on Trichoderma spp. 116198

15. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immobilisointi toteutetaan 5-40 °C:n lämpötilassa, edullisesti 20 °C - 35 °C:ssa.

16. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immobilisointi toteutetaan pH:ssa 3-7, edullisesti pH:ssa 4-6.

17. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immobilisointi toteutetaan ionivahvuudessa 0,1 - 2 M, edullisesti 0,5 - 1 M. 10

18. Immobilisoitavissa oleva polypeptidi, tunnettu siitä, että kyseinen polypeptidi on fuusiopolypeptidi, joka käsittää ennalta valittuun polypeptidiin liitetyn tarttumispoly-peptidin, jolloin tarttumispolypeptidi on luokan II hydrofobiini, ja mainittu fuusiopolypeptidi immobilisoidaan kiinteään pintaan tarttumispolypeptidin välityksellä. 15

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että ennalta valitulla polypeptidillä on immobilisoidussa muodossa vähintään 50 % biologisesta funktiosta tai aktiivisuudesta, joka sillä on vapaassa muodossaan. ; ; *: 20 20. Patenttivaatimuksen 18 tai 19 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että I :': tarttumispolypeptidi on hydrofobiini, hydrofobiiniyksiköiden moninkertainen rakenne tai I t * I •: · *: sellainen hydrofobiinin osa, joka kykenee immobilisoitumaan kiinteään pintaan. IM··

21. Jonkin patenttivaatimuksen 18-20 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että 25 tarttumispolypeptidi on Trichoderman hydrofobiini. • » • · » » * * · • · · ·... · 22. Jonkin patenttivaatimuksen 18-21 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että j ‘ ·.. hydrofobiini on Trichoderma reesein HFBI tai HFBI:n kaltainen polypeptidi tai HFBII tai • : * ”: HFBII:n kaltainen polypeptidi, tai T. harzianumin SRHI tai SRHI:n kaltainen polypeptidi . ·: ·, 30 tai polypeptidi, joka käsittää aminohapposekvenssin, joka on aminohapposekvenssitasolla »ta ,,..: vähintään 40-prosenttisesti homologinen mainittujen polypeptidien aminohapposekvens sien kanssa. 116198

23. Jonkin patenttivaatimuksen 18-22 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että ennalta valittu polypeptidi suuntautuu halutulla tavalla.

24. Jonkin patenttivaatimuksen 18-23 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että 5 ennalta valittu polypeptidi suuntautuu poispäin pinnasta.

25. Polypeptidikerros, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksen 18 -24 mukaisen immobilisoidun fuusiopolypeptidin.

26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen polypeptidikerros, tunnettu siitä, että se käsittää erilaisten kiinnostuksen kohteena olevien polypeptidien seoksen.

27. Patenttivaatimuksen 25 tai 26 mukainen polypeptidikerros, tunnettu siitä, että se käsittää spesifisen määrän fuusiopolypeptidejä immobilisoituna yhdessä spesifisen määrän 15 kanssa vapaita tarttumispolypeptidejä.

28. Jonkin patenttivaatimuksen 18- 24 mukaisen immobilisoidun fuusiopolypeptidin tai jonkin patenttivaatimuksen 25 - 27 mukaisen polypeptidikerroksen käyttö sovelluksessa, , 1. joka valitaan ryhmästä, joka käsittää: käyttö diagnostisissa välineissä, käyttö biosensori- * · : .20 pinnoilla, käyttö biologisesti aktiivisten pintojen luomisessa, käyttö tehoseulonnassa, ja/tai « < · t : . ’. käyttö materiaalien päällystyksessä. • 1 » t I • · • • · » • · 1 1 • · » ( · IM»» * » · 1 » » » 116198