FI112031B - New use of a biologically active product - Google Patents

Description

112031112031

Biologisesti aktiivisen tuotteen uusi käyttö Keksinnön alaFIELD OF THE INVENTION

Keksintö liittyy mineraalien hyväksi käytettävyyden tehostamiseen ja 5 luuston vahvistamiseen biologisesti aktiivisten peptidien ja niitä sisältävien tuotteiden avulla. Peptidit ja niitä sisältävät tuotteet ovat käyttökelpoisia mm. erilaisten luun mineraalien absorptioon liittyvien häiriöiden ja sairauksien ennaltaehkäisemiseksi ja hoitamiseksi. Tuote, jolla on korkea lyhytketjuisten peptidien pitoisuus ja korkea kalsiumpitoisuus, on todettu erityisen tehokkaaksi 10 keksinnön mukaiseen käyttöön.The invention relates to the enhancement of the utilization of minerals and the strengthening of bones by means of biologically active peptides and products containing them. Peptides and products containing them are useful e.g. for the prevention and treatment of various disorders and diseases associated with the absorption of bone mineral. A product having a high content of short chain peptides and a high content of calcium has been found to be particularly effective for use in accordance with the invention.

Keksinnön taustaBackground of the Invention

Ravinnon proteiinit ovat elimistölle välttämättömien aminohappojen ja typen lähde. Lisäksi ravinnon proteiinit sisältävät peptidejä, jotka saattavat 15 olla elimistön toimintojen merkittäviä säätelijöitä. Biologisesti aktiiviset peptidit voivat vaikuttaa mm. ravintoaineiden imeytymiseen (fosfopeptidit ja kasomor-fiinit), hormonien eritykseen (kasomorfiinit) sekä immuniteettiin (immunopepti-dit, kasokiniinit, kasomorfiinit). Ravinnosta maidon kaseiini on biologisesti aktiivisten peptidien merkittävin lähde (Schlimme E. & Meisel H. Bioactive pepti-20 des derived from milk proteins. Structural, physiological and analytical aspects.Nutritional proteins are a source of essential amino acids and nitrogen for the body. In addition, dietary proteins contain peptides that may be important regulators of body functions. Biologically active peptides may affect e.g. nutrient absorption (phosphopeptides and casomorphins), hormone secretion (casomorphins), and immunity (immunopeptides, casoquinins, casomorphins). In food, milk casein is the major source of biologically active peptides (Schlimme E. & Meisel H. Bioactive peptide-20 derived from milk proteins. Structural, Physiological and Analytical aspects.

,. Die Nahrung 1995; 39:1-20; Steijns J. Dietary proteins as the source of new • · '··' health promoting bio-active peptides with special attention to glutamine pep- :.i : tide. Food Tech Europe 1996; March/April: 80-84).,. Die Nahrung 1995; 39: 1-20; Steijns J. Dietary Proteins as a Source of New • · '··' Health Promoting Bio-Active Peptides with Special Attention to Glutamine pep-: .i: tide. Food Tech Europe 1996; March / April: 80-84).

j \ ; Fosfopeptidien on todettu vaikuttavan kivennäisaineiden imey- 25 tymiseen kehossa. Fosfopeptidit muodostuvat pääasiassa a- ja β-kaseiinista ; trypsiinin aiheuttaman proteolyysin kautta. Lee on tutkimusryhmineen havain- : nut, että dieetti, joka sisälsi kaseiinia 200 g/kg, lisäsi fosfopeptidien muodos tumista (Lee Y et ai. Phosphopeptides and soluble calcium in small intestine of :· rats given a casein diet. Br J Nutr 1980; 43:457-67). Kun kaseiinia annettiin ai- > > . 30 noana ravinnonlähteenä, ei fosfopeptidejä kuitenkaan muodostunut. Tutkijat I t päättelivät, että fosfopeptidien muodostuminen vaatii kaseiinin lisäksi myös I 1 i muita ravinnon lähteitä, kuten tärkkelystä tai rasvaa. Tämä saattaisi johtua sii-tä, että muut ravintoaineet lisäävät proteolyyttisten entsyymien aktiivisuutta : X ohutsuolessa.j \; Phosphopeptides have been found to affect the absorption of minerals in the body. Phosphopeptides consist mainly of α- and β-casein; through trypsin-induced proteolysis. Lee and his team have found that a diet containing 200 g / kg of casein increased the formation of phosphopeptides (Lee Y, et al., Phosphopeptides and soluble calcium in a small diet). Br J Nutr 1980; 43: 457-67). When casein was administered? However, no phosphopeptides were formed. The researchers concluded that the formation of phosphopeptides requires not only casein but also other sources of food such as starch or fat. This could be because other nutrients increase the activity of proteolytic enzymes: X in the small intestine.

‘11. 35 Eläinkokeiden perusteella maidon kaseiinista muodostuneet fosfo- “ peptidit lisäävät liukoisen kalsiumin määrää suolessa ja saattavat siten paran- 112031 2 taa kalsiumin imeytymistä (ks. mm. Lee Y et ai. Phosphopeptides and soluble calcium in small intestine of rats given a casein diet. Br J Nutr 1980; 43:457-67; Lee Y et al. Intestinal absorption of calcium in rats given diets containing casein or amino acid mixture: the role of casein phosphopeptides. Br J Nutr 5 1983; 49:67-76; Li Y et al. Indirect effect of casein phosphopeptides on cal cium absorption in rat ileum in vitro. Reprod Nutr Dev 1989; 29:227-233; Mykkänen HM, Wasserman RH. Enhanced absorption of calcium by casein phosphopeptides in rachitic and normal chicks. J Nutr 1980; 110:2142-2148; Tsu-chita H at al. The effect of casein phosphopeptides on calcium utilization in 10 young ovaryectomized rats. Z Ernahrungswiss 1993; 32:121-130; Yuan YV, Kitts DD. Calcium absorption and bone utilization in spontaneously hypertensive rats fed on native and heat-damaged casein and soya-protein. Br J Nutr 1994; 71:583-603), ja elimistön kalsiumtilaa (Tsuchita H et al. ibid.). Kaikki tulokset eivät tosin tue tätä väitettä (ks. esimerkiksi Brommage R et al. Influence 15 on casein phosphopeptides and lactulose on intestinal calcium absorpition in adult female rats. Lait 1991; 71:173-180).'11. 35 Animal experiments have shown that phospho-peptides formed from milk casein increase the amount of soluble calcium in the intestine and thus may improve calcium absorption (see, e.g., Lee Y et al., Phosphopeptides and soluble calcium in a case-by-case diet. Br. J Nutr 1980; 43: 457-67; Lee Y et al., Intestinal Absorption of Calcium in Rats Dietary Containing Casein or Amino Acid Mixture: The Role of Casein Phosphopeptides Br J Nutr 5 1983; 49: 67-76; Li Y et al. Indirect effect of casein phosphopeptides on calcium absorption in rat ileum in vitro Reprod Nutr Dev 1989; 29: 227-233; Mykkänen HM, Wasserman RH Enhanced absorption of calcium by casein phosphopeptides in rachitic and normal chicks J Nutr 1980; 110: 2142-2148; Tsu-Chita H at al., The effect of casein phosphopeptides on calcium utilization in 10 young ovaryectomized rats, Z Ernahrungswiss 1993; 32: 121-130; Yuan YV, Kitts DD, Calcium absorption and bone utilization in spontaneously hypertensive rats fed is a native and heat-damaged casein and soya-protein. Br J Nutr 1994; 71: 583-603), and calcium in the body (Tsuchita H et al. Ibid.). However, not all results support this assertion (see, for example, Brommage R et al. Influence 15 is a casein phosphopeptides and lactulose on intestinal calcium absorption in adult female rats. Lait 1991; 71: 173-180).

Ihmisillä fosfopeptidien vaikutusta kalsiumin imeytymiseen on selvitetty muutamassa tutkimuksessa. Hansenin ym. randomisoidussa cross-over-tutkimuksessa 22 terveelle aikuiselle annettiin riisi- tai kokojyväpohjaista las-20 tenruokaa, johon oli lisätty 0, 1 tai 2 grammaa fosfopeptidejä ja leimattua kalsiumia. Kalsiumin imeytyminen tutkittiin radioisotoopin retention avulla, ja sen '· ' todettiin lisääntyvän fosfopeptidien ansiosta noin 30 % riisipohjaista ruokaa ·’ saaneilla koehenkilöillä. Kokojyväpohjaista ruokaa saaneilla fosfopeptidit päin- : ' vastoin eivät lisänneet kalsiumin imeytymistä, mikä tutkijoiden mukaan saattoi : 25 johtua ruoan korkeasta fytaattipitoisuudesta (Hansen M et al. Casein phos- : phopeptides improve zinc and calcium absorption from rice-based but not from ; whole-grain infant cereal. J Pediatr Gastrolog Nutr 1997; 24:56-62). Heaney t ·» ym. antoivat 35 terveelle naiselle ravinnon mukana 250 g leimattua kalsiumia ;v, sekä 87,5 mg fosfopeptidejä tai plaseboa. Kalsiumin imeytyminen parani mer- 30 kittävästi niillä fosfopeptidejä saaneille naisilla, joilla kalsiumin imeytyminen oli ‘ ' muuten heikkoa. Naisilla, joilla kalsiumin imeytyminen oli runsasta, ja plaseboa * * · v : saaneilla henkilöillä fosfopeptidit eivät merkittävästi lisänneet kalsiumin imey- : ": tyrnistä (Heaney RP et al. Effect of caseinophosphopeptide on absorbability of ; I·, coingested calcium in normal postmenopausal women. J Bone Miner Metab 35 1994; 12.77-8I).In humans, the effect of phosphopeptides on calcium absorption has been investigated in a few studies. In a randomized crossover study by Hansen et al., 22 healthy adults were given rice or whole grain-based las-20 food supplemented with 0, 1 or 2 grams of phosphopeptides and labeled calcium. Calcium absorption was studied by radioisotope retention, and was found to increase due to phosphopeptides in subjects receiving about 30% rice-based food. Conversely, in whole-grain foods, phosphopeptides did not increase calcium absorption, which, according to the researchers, may be due to the high phytate content of the food (Hansen M et al. Casein's Phos: Phopeptides Improve Zinc and Calcium Absorption; grain infant cereal.J Pediatr Gastrolog Nutr 1997; 24: 56-62). Heaney et al. Gave 35 healthy women 250 g of labeled calcium, v, and 87.5 mg of phosphopeptides or placebo. There was a significant improvement in calcium absorption in women receiving phosphopeptides who were otherwise '' poorly absorbed. In women with high calcium uptake and in subjects receiving placebo * * · v, phosphopeptides did not significantly increase calcium absorption from the buckthorn (Heaney RP et al., Effect of caseinophosphopeptide on absorption; .J Bone Miner Metab 35 1994; 12.77-8I).

112031 3112031 3

Fosfopeptidien käytöstä saattaisi olla hyötyä esimerkiksi vauvoille, vanhuksille ja sairauksissa, joissa mineraalien, erityisesti kalsiumin imeytyminen on huonontunut tai tarve lisääntynyt. Fosfopeptidien lisääminen elintarvikkeisiin voisi olla turvallinen keino lisätä kalsiumin imeytymistä (Hansen M et ai.The use of phosphopeptides could be useful for example in infants, the elderly, and in diseases where absorption of minerals, especially calcium, is impaired or increased. Adding phosphopeptides to foods could be a safe way to increase calcium absorption (Hansen M et al.

5 1997, ibid.).5, 1997, ibid.).

Biologisesti aktiivisten peptidien joukossa on myös verenpaineeseen vaikuttavia peptidejä. ACE eli angiotensiini l:ä muuttava entsyymi on avainentsyymi verenpaineen säätelyssä. Se muuttaa angiotensiini l:n angiotensiini ll:ksi, mikä supistaa voimakkaasti verisuonia. ACE-inhibiittorit voivat 10 estää tämän vaikutuksen ja siten toimia verenpainetta alentavina aineina. ACE-inhibiittoreina toimivia peptidejä esiintyy sekä maidon kaseiinissa että kalan ja maissin proteiineissa (Schlimme et ai. 1995, ibid.). Alan kirjallisuudessa verenpaineeseen vaikuttavina peptideinä on esitetty mm. Asp-Glu-Leu-GIn-Asp-Lys-lle-His-Pro-Phe-Ala-GIn-Thr-GIn-Ser-Leu-Val-Tyr-Pro-Phe-Gly-Pro-15 Ile-Pro-Asn-Ser ja Leu-Leu-Tyr-GIn-GIn-Pro-Val-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Pro-Phe-Pro-lle-lle-Val (Yamamoto N et ai. Antihypertensive effect of the peptides derived from casein by an extracellular proteinase from Lactobacillus helveticus CP790. J Dairy Sci 1994; 77:971-922), Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp (Maryama S et al. Angiotensin l-converting enzyme inhibitory activity of the C-terminal 20 hexapeptide of asi-casein. Agric Biol Chem 1987; 51:2557-61), ja Phe-Phe-Val-Ala-Pro (Maryama S et al. Agric Biol Chem 1985; 49:1405).Biologically active peptides also include peptides that affect blood pressure. ACE, or angiotensin I converting enzyme, is a key enzyme in the regulation of blood pressure. It converts angiotensin I to angiotensin II, which severely constricts blood vessels. ACE inhibitors may inhibit this effect and thus act as antihypertensive agents. Peptides acting as ACE inhibitors are present in both milk casein and fish and maize proteins (Schlimme et al. 1995, ibid.). In the literature, peptides affecting blood pressure have been disclosed e.g. Asp-Glu-Leu-Gln-Asp-Lys-lle-His-Pro-Phe-Ala-Gln-Thr-Gln-Ser-Leu-Val-Tyr-Pro-Phe-Gly-Pro-15 Ile-Pro-Asn -Ser and Leu-Leu-Tyr-Gln-Gln-Pro-Val-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Pro-Phe-Pro-lle-lle-Val (Yamamoto N et al. Antihypertensive effect of Peptides derived from casein by an extracellular proteinase from Lactobacillus helveticus CP790.J Dairy Sci 1994; 77: 971-922), Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp (Maryama S et al., Angiotensin I-Converting Enzyme Inhibitory Activity of the C). -terminal hexapeptide of as-casein. Agric Biol Chem 1987; 51: 2557-61), and Phe-Phe-Val-Ala-Pro (Maryama S et al. Agric Biol Chem 1985; 49: 1405).

• · *··;' Myös hapatettujen maitotuotteiden on raportoitu sisältävän peptide- :.i.; jä, joilla on verenpainetta alentava vaikutus. Peptidien on arveltu muodostuvan * · : \; maitotuotteisiin maitohappobakteerien ja erityisesti niiden solunulkoisten pro- 25 teinaasien aiheuttaman maitoproteiinien hydrolyysin tuloksena.• · * ··; ' Fermented milk products have also been reported to contain peptide: .i .; which have an antihypertensive effect. Peptides are thought to be formed * ·: \; milk products as a result of hydrolysis of milk proteins by lactic acid bacteria and in particular by their extracellular proteinases.

Yamamoto et al. kuvaavat julkaisussa J. Biochem. 114 (1993) 740 mikro-organismista Lactobacillus helveticus CP790 peräisin olevan pro- *»· teinaasin puhdistamista ja karakterisointia. Yamamoto et al. ovat myös rapor-toineet tutkimuksesta, jossa asi- ja β-kaseiinia hydrolysoitiin mainitulla pro- • · '..! 30 teinaasilla ja saadut peptidit tutkittiin ACE:ta inhiboivan vaikutuksensa suhteen *;· (J Dairy Sci 1994; ibid.). Tutkittuja peptidejä oli yhteensä 25, ja ne olivat mole- •»* _ v : kyylikooltaan ja vaikutukseltaan hyvin erilaisia. Tehokkaimmat olivat kolme β- : ‘ ’ ‘: kaseiinista saatua, 8, 18 ja vastaavasti 27 aminohappoa sisältävää peptidiä.Yamamoto et al. in J. Biochem. 114 (1993) Purification and characterization of protease from 740 microorganisms Lactobacillus helveticus CP790. Yamamoto et al. have also reported a study in which azo and β-casein were hydrolyzed with said pro-. 30 and the resulting peptides were examined for their ACE inhibitory activity * (J Dairy Sci 1994; ibid.). There were a total of 25 peptides studied, and they were very different in molecular size and effect. The most effective were the three β-: '' ': casein-containing peptides containing 8, 18 and 27 amino acids, respectively.

; Tutkimuksessa verrattiin myös Lactobacillus helveticus -kannalla CP790 ja sen \‘.Y 35 proteinaasi-aktiivisuuden suhteen vajavaisella variantilla CP791 fermentoidun maidon ACE-aktiivisuutta, jolloin edellinen todettiin tehokkaaksi spontaanisti 112031 4 korkeaa verenpainetta kehittävissä SHR-rotissa, mutta ei tavallisessa rotta-kannassa, kun taas jälkimmäiseltä puuttui täysin aktiivisuus.; The study also compared the ACE activity of fermented milk with Lactobacillus helveticus strain CP790 and its? 35 proteinase deficient variant, which was found to be effective spontaneously in 112031 4 high blood pressure SHR rats, but not in normal rat rats. the latter was completely absent.

Nakamura et ai. kuvaavat julkaisussa J Dairy Sei 1995; 78:777 -783 Lactobacillus helveticusta ja Saccharomyces cerevisiaeta sisältävän ha-5 patteen käyttöä kahden ACE-inhibiittorin valmistuksessa. Rasvaton maito fer-mentoitiin mainitulla hapatteella, minkä jälkeen ACE-inhibiittorit puhdistettiin kromatografisesti ja analysoitiin. Aktiiviset yhdisteet olivat molemmat tripepti-dejä, Val-Pro-Pro ja Ile-Pro-Pro.Nakamura et al. described in J Dairy Sci 1995; 78: 777-783 The use of ha-5 patch containing Lactobacillus helveticus and Saccharomyces cerevisiae in the preparation of two ACE inhibitors. The skimmed milk was fermented with the said fermenter, after which the ACE inhibitors were purified by chromatography and analyzed. The active compounds were both tripeptides, Val-Pro-Pro and Ile-Pro-Pro.

US-patentissa 5,449,661, Nakamura et ai., kuvataan tripep-10 tidisekvenssin Val-Pro-Pro sisältävän peptidin valmistusta ja käyttöä korkean verenpaineen alentamiseen. Peptidi valmistetaan fermentoimalla rasvatonta maitojauhetta Lactobacillus helveticus -kannalla JCM-1004, minkä jälkeen peptidi puhdistetaan kromatografisesti ja kylmäkuivataan.U.S. Patent No. 5,449,661 to Nakamura et al. Describes the preparation and use of a peptide containing the tripep-10 tide sequence Val-Pro-Pro for lowering hypertension. The peptide is prepared by fermentation of skimmed milk powder with Lactobacillus helveticus strain JCM-1004, after which the peptide is purified by chromatography and freeze-dried.

Kansainvälisessä patenttihakemuksessa W099/16862, Yamamoto 15 et ai., kuvataan Lactobacillus helveticus -kantaa CM4, FERM BP-6060, joka kykenee tuottamaan suuren määrän tripeptidiä Val-Pro-Pro ja/tai Ile-Pro-Pro ja jolla on korkea solunulkoinen proteaasiaktiivisuus. Julkaisussa kuvataan myös fermentoituja maitotuotteita, jotka sisältävät edellä mainittuja tripeptidejä ja bakteeria, sekä menetelmää näiden valmistamiseksi fermentoimalla tripepti-20 disekvenssit sisältäviä tuotteita mainitulla bakteerilla.International Patent Application WO99 / 16862 to Yamamoto 15 et al. Describes Lactobacillus helveticus strain CM4, FERM BP-6060, which is capable of producing a large amount of the tripeptide Val-Pro-Pro and / or Ile-Pro-Pro and has high extracellular protease activity. The publication also describes fermented milk products containing the aforementioned tripeptides and a bacterium and a process for their preparation by fermentation of products containing tripeptide 20 sequences with said bacterium.

ACE-inhibiittoreina toimivilla peptideillä on arvioitu mahdollisesti ··' olevan vaikutusta immuniteettiin sen perusteella, että bradykiniineillä, joiden : toimintaa ACE-inhibiittorit stimuloivat, on kyky lisätä makrofagien ja lymfosyyt- tien toimintaa (Migliore-Samour D et ai. Biologically active milk peptides impli-' 25 cated in immunomodulation. J Dairy Res 1989; 56:357-362). Näiden peptidien vaikutusta mineraalien imeytymiseen ei ole tutkittu eikä kuvattu alan kirjaili- * suudessa.Peptides acting as ACE inhibitors have been evaluated for possible ·· 'effect on immunity by virtue of the ability of bradykinins that: stimulate ACE inhibitors to increase macrophage and lymphocyte function (Migliore-Samour D et al. Biologically active milk Peptides impli. - '25 cated in immunomodulation. J Dairy Res 1989; 56: 357-362). The effect of these peptides on mineral absorption has not been studied or described in the literature.

Luun heikkoon mineraalitasoon liittyvät vammat ja taudit yleistyvät : v. koko ajan. Niitä esiintyy kaikissa ikäryhmissä. Ongelma on suurin vanhemmilla 30 ihmisillä, joilla yleinen metabolian heikentyminen, vähäinen liikunta ja niukka tärkeiden ravintoaineiden, vitamiinien ja mineraalien saanti, sekä erityisestiInjuries and diseases associated with low bone mineral levels are becoming more common: v. All the time. They occur in all age groups. The problem is most severe in the older 30 people with generalized metabolic decline, poor physical activity and low intake of important nutrients, vitamins and minerals, and especially

* · I* · I

· kalsiumin imeytymisen heikkeneminen voi aiheuttaa osteoporoosia. Väestön ikääntyessä pelätään, että luun mineraalitason heikentymiseen liittyvien tautien ja vammojen esiintyvyys tulee lisääntymään entisestään. Myös postmeno-35 pausaalisilla naisilla kalsiumin imeytyminen on heikentynyt. Muuttuneiden ravitsemus-, liikunta- ja muiden kulttuuritapojen myötä on myös pelättävissä, että 112031 5 ajan myötä ongelma pahenee ja siirtyy aina nuorempiin väestöryhmiin. Esimerkiksi laktoosi-intoleranteilla, vegaaneilla ja laihduttajilla kalsiumin saanti jää alle suositusrajojen. Toisen riskiryhmän muodostavat ne, joiden kalsiumin tarve on lisääntynyt, kuten nuoret tytöt sekä imettävät ja raskaana olevat naiset.· Impaired calcium absorption may lead to osteoporosis. As the population ages, it is feared that the incidence of diseases and injuries associated with bone mineral depletion will increase further. Postmeno-35 paused women also have reduced calcium absorption. With the change in nutrition, exercise and other cultural habits, it is also to be feared that over the course of 112031 5 the problem will worsen and always reach younger populations. For example, lactose intolerant, vegan and dieters are below the recommended intake of calcium. The second group at risk is those with increased calcium requirements, such as young girls and breastfeeding and pregnant women.

5 Myös muut mineraalit vaikuttavat monipuolisesti ihmisen hyvinvoin tiin. Magnesium esimerkiksi välittää lihas- ja hermoärsytyksiä ja toimii luuston ja hampaiden rakennusaiheena. Magnesiumilla on myös todettu immuunivastetta vahvistava vaikutus. Magnesiumin puutostilat ovat harvinaisia, mutta nestehukka saattaa johtaa magnesiumkatoon. Kaliumin tehtäviin kuuluu neste-10 tasapainon säätelyjä lihasten supistus. Kaliumin puutteesta saattaa aiheutua lihasheikkoutta. Tärkeää magnesiumin ja kaliumin saanti on tautitiloissa, joissa esiintyy nestetasapainon häiriöitä tai nestehukkaa, sekä urheilijoilla liikuntasuorituksen jälkeen palautumiseen.5 Other minerals also have a profound effect on human well-being. Magnesium, for example, transmits muscle and nerve stimuli and serves as a bone and tooth building topic. Magnesium has also been shown to enhance the immune response. Magnesium deficiency states are rare, but dehydration can lead to magnesium loss. Potassium functions include fluid-10 balance regulation, muscle contraction. Potassium deficiency can cause muscle weakness. An important intake of magnesium and potassium is in conditions where there is fluid imbalance or dehydration, and for athletes to recover from exercise.

Mineraalien antaminen epäorgaanisia suoloja käsittävien valmistei-15 den muodossa ei ole kovin tehokasta, esimerkiksi epäorgaanisesta kalsiumista ainoastaan noin 40 % absorboituu suolistossa. Lisäksi kehon mineraali-tasapaino on herkkä ja saattaa muuttua hyvinkin jyrkästi, josta syystä tietyn mineraalin antaminen sellaisenaan ei aina ole hyvä vaihtoehto. Esimerkiksi ylenmääräinen kalsiumin lisääminen saattaa huonontaa muiden kivennäisai-20 neiden, kuten esimerkiksi raudan, imeytymistä. Siten on tärkeätä, että samalla kun nostetaan sen mineraalin pitoisuutta, jonka esiintyvyys tai absorboitumi-'···' nen on todettu liian heikoksi tai jonka tarve on lisääntynyt, muiden mineraalien väliset hyvät suhteet voidaan pitää ennallaan tai parantaa. Kivennäisaineiden ; .·’ imeytymiseen vaikuttavien peptidien antaminen sellaisenaan lääkeaineina tai 25 terveysvaikutteisina aineina on tällöin varteen otettava keino.Administration of minerals in the form of preparations containing inorganic salts is not very effective, for example only about 40% of inorganic calcium is absorbed in the gut. In addition, the body's mineral balance is sensitive and may change very sharply, which is why giving a certain mineral as such is not always a good option. For example, excess calcium intake may impair the absorption of other minerals such as iron. Thus, it is important that while increasing the concentration of a mineral that is found to be too low in incidence or absorption, or in need, the good relationship between other minerals can be maintained or improved. Minerals; The administration of peptides that affect absorption as such as drugs or as active ingredients is a worthwhile exercise.

Lääkehoidon vaihtoehdoksi tai sen lisäksi voidaan myös hyödyntää muita tapoja luuston vahvistamiseksi sekä ennaltaehkäisevänä toimenpiteenä että (re)mineralisaation aikaansaamiseksi. Hyvä tapa on esimerkiksi liikunnan :v. lisääminen. Eräs uusimpia keinoja on terveysvaikutteisten ravintoaineiden 30 käyttäminen osana normaalia ruokavaliota, mikä onkin kuluttajien keskuudes- ’: * * sa tervetullut vaihtoehto. Biologisesti aktiivisten aineiden lisääminen elintarvik- * · * v : keisiin on todettu turvalliseksi keinoksi, ja niinpä mm. kolesteroliin ja veren- : ‘ ‘ ‘: paineeseen alentavasti vaikuttavia tuotteita on jo markkinoilla.As an alternative to, or in addition to, drug therapy, there are other ways to strengthen the bone, both as a preventive measure and to achieve (re) mineralization. A good way is to exercise, for example: v. propagation. One of the newest ways is to use nutrients 30 as part of a normal diet, which is a welcome option for consumers. The addition of biologically active substances to foodstuffs has been found to be a safe means. products that lower cholesterol and blood: '' ': pressure are already on the market.

: Mineraalien hyväksikäytettävyyden tehostamiseen, osteoporoosin 35 ennaltaehkäisyyn, lievittämiseen ja parantamiseen, mineraalien imeytymisen ·’ parantamiseen, ja luun metabolian tukemiseen tarvitaan siis uusia keinoja.: Thus, new ways are needed to enhance the utilization of minerals, to prevent, alleviate, and improve osteoporosis, to improve mineral absorption, and to support bone metabolism.

112031 6112031 6

Sellaiset terveysvaikutteiset tuotteet, joilla on mineraalien imeytymistä ja luun muodostusta tehostava vaikutus, olisivat erittäin tervetullut lisä kaupan valikoimiin. Tärkeää on, että tuotteet eivät sisällä epämieluisia tai jopa haitallisia ainesosia, että niitä on helppo valmistaa teollisessa mittakaavassa, ja että ne 5 ovat kuluttajille miellyttäviä ja tutunomaisia ja siten helppo käyttää esimerkiksi osana normaalia ruokavaliota.Healthy products that have a mineral-enhancing effect and a bone-building effect would be a very welcome addition to the retail range. What is important is that the products do not contain any unpleasant or even harmful ingredients, that they are easy to manufacture on an industrial scale, and that they are pleasant and familiar to consumers and thus easy to use, for example, as part of a normal diet.

Keksinnön lyhyt kuvausBrief Description of the Invention

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on siten tarjota käytettäväksi 10 tuote, jolla on mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehostava vaikutus ja joka siten pystyy ennaltaehkäisemään, lievittämään tai parantamaan mineraalien hy-väksikäytettävyyteen liittyviä häiriöitä, sairastiloja ja vammoja. Erityisen tärkeä on tuotteen vaikutus kalsiumin imeytymiseen, osteoklastien muodostumisen vähenemiseen, osteoblastien ja siten vahvan luuston kehittymiseen ja osteo-15 poroosin ja sen esiasteiden ennaltaehkäisyyn ja lievittämiseen.It is therefore an object of the present invention to provide a product having a mineral utilization enhancement effect and thus capable of preventing, ameliorating or ameliorating disorders, conditions and injuries associated with mineral availability. Of particular importance is the effect of the product on calcium absorption, reduction of osteoclast formation, development of osteoblasts and thus strong bone, and prevention and alleviation of osteo-15 porosis and its precursors.

Keksinnön mukaisesti käytettävällä tuotteella on korkea mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehostavien peptidien pitoisuus. Edullisessa sovel-lusmuodossa tuotteella on lisäksi optimoitu suolapitoisuus, mikä tarkoittaa sitä, että yksiarvoisten kationien määrä on pieni ja hyödyllisten kaksiarvoisten ka-20 tionien määrä on suuri verrattuna vastaavantyyppiseen tunnettuun tuotteeseen.The product used according to the invention has a high content of peptides that enhance mineral utilization. In a preferred embodiment, the product further has an optimized salt content, which means that the amount of monovalent cations is low and the amount of useful divalent cations is high compared to a known product of the same type.

’··;* Erityisen edullisessa sovellusmuodossa tarjotaan käytettäväksi tuo- tetta, jonka mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehostavien peptidien pitoisuus * · · : ',** on korkea ja jonka kalsiumpitoisuus on korkea.* In a particularly preferred embodiment, a product is provided which has a high mineral content of peptide enhancers * · ·: ', ** and high calcium content.

: , , : 25 Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on edelleen tarjota tuote käyt- töön joko sellaisenaan mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehostavana aineena • · tai nautittavaksi tarkoitettujen terveysvaikutteisten elintarvikkeiden tai lääkeaineiden valmistuksessa.It is a further object of the present invention to provide a product as such, either as a mineral mineral enhancer or in the manufacture of functional foods or pharmaceuticals for human consumption.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on lisäksi tarjota menetelmä • » [..! 30 mineraalien hyväksikäytettävyyden tehostamiseksi ja/tai luuston vahvis- tamiseksi antamalla yksilölle, joka on tällaisen hoidon tarpeessa, mineraalien v ·' hyväksikäytettävyyttä tehostavia peptidejä tai niitä sisältävää tuotetta sellainen ‘ ’ ’: määrä, joka on riittävä halutun vaikutuksen aikaansaamiseksi.It is a further object of the present invention to provide a method • »[..! 30 to enhance the mineral utilization and / or strengthen the bone by providing the individual in need of such treatment with an amount of '' mineral minerals enhancing peptides or a product containing them, in an amount sufficient to achieve the desired effect.

; Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on myös tarjota menetelmä 35 osteoporoosin ennaltaehkäisemiseen, lievittämiseen tai parantamiseen antamalla yksilölle, joka on tällaisen hoidon tarpeessa, mineraalien hyväksikäytet- 112031 7 tävyyttä tehostavia peptidejä tai niitä sisältävää tuotetta sellainen määrä, joka on riittävä halutun vaikutuksen aikaansaamiseksi.; It is also an object of the present invention to provide a method of preventing, alleviating or ameliorating osteoporosis by administering to a subject in need of such treatment an amount of a mineral utilizing peptide or product containing it sufficient to achieve the desired effect.

Edelleen esillä olevan keksinnön tarkoituksena on tarjota menetelmä kalsiumin hyväksikäytettävyyden tehostamiseksi antamalla yksilölle tuotet-5 ta, jolla on korkea kaseiinipohjaisten pienimolekyylisten peptidien pitoisuus ja korkea kalsiumpitoisuus, ja joka on valmistettu fermentoimalla kaseiinipitoista lähtöainetta Lactobacillus helveticus -kannalla LBK-16H, DSM 13137, valinnaisesti poistamalla osittain tai kokonaan kaseiini ja/tai muita maidon proteiineja ja/tai laktoosi, riittävä määrä halutun vaikutuksen aikaansaamiseksi.It is a further object of the present invention to provide a method for enhancing the utilization of calcium by administering to a subject a product having high casein-based small molecule peptides and high calcium content prepared by fermenting the casein-containing starting material with Lactobacillus helveticus strain LBK-13H, or whole casein and / or other milk proteins and / or lactose, in an amount sufficient to produce the desired effect.

10 Edullisessa suoritusmuodossa fermentoidulle tuotteelle lisäksi suori tetaan nanosuodatuskäsittely.In a preferred embodiment, the fermented product is further subjected to nanofiltration treatment.

Kuvien lyhyt selostusBrief description of the pictures

Kuvassa 1 esitetään keksinnön mukaisesti käytettävän tuotteen ja 15 erilaisten vertailunäytteiden vaikutus rotan luuntiheyteen.Figure 1 shows the effect of the product used in accordance with the invention and various reference samples on rat bone density.

Kuvassa 2 esitetään keksinnön mukaisesti käytettävän tuotteen ja erilaisten vertailunäytteiden vaikutus rotan luunmineraalipitoisuuteen.Figure 2 shows the effect of the product used according to the invention and various reference samples on the bone mineral content of the rat.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 20 Esillä olevan keksinnön mukaisesti on havaittu, että nämä tavoitteet voidaan saavuttaa käyttämällä mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehostavia peptidejä tai niitä sisältävää tuotetta. Mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehostavina peptideinä pidetään ennen kaikkea di- - tetrapeptideja ja näiden seok-siä. Näitä peptidejä voidaan edullisesti valmistaa kaseiinista tai kaseiinipitoi-25 sesta lähtöaineesta fermentoimalla. Erityisen edullisesti käytetään menetel-; .: mää, jossa biologisesti aktiivisia peptidejä sisältävä tuote muodostetaan fer- mentoimalla, minkä jälkeen se konsentroidaan ja koostumus viimeistellään nanosuodattamalla. Edulliseksi mainittu menetelmä antaa erinomaiset mah- : ·, ·. dollisuudet käyttää erityyppisiä lähtöaineita ja muokata lopputuotteen koostu- » · ‘ · · *, 30 musta halutun tyyppiseksi, kuten seuraavassa yksityiskohtaisesti kuvataan.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION In accordance with the present invention, it has been found that these objectives can be achieved by the use of peptides or a product containing mineral enhancers. Above all, peptides and their mixtures are considered as peptides enhancing mineral utilization. Preferably, these peptides can be prepared from casein or casein-containing starting material by fermentation. Particularly preferred is a method; .: the amount by which the product containing the biologically active peptides is formed by fermentation, followed by concentration and finalization of the composition by nanofiltration. The preferred method gives excellent capacities: ·, ·. The ability to use different types of starting materials and customize the final product composition, · black, to the desired type, as described in detail below.

Keksintö koskee kaseiinipohjaisten pienimolekyylisten peptidien lle-: Pro-Pro ja/tai Val-Pro-Pro käyttöä valmistettaessa mineraalien hyväksikäytet- ,,,: tävyyttä tehostavaa tuotetta.The invention relates to the use of casein-based small molecule peptides Ile-: Pro-Pro and / or Val-Pro-Pro in the preparation of a mineral recovery product.

> * · 112031 8> * · 112031 8

Keksintö koskee edelleen sellaisen tuotteen käyttöä, jolla on korkea kaseiinipohjaisten pienimolekyylisten peptidien Ile-Pro-Pro ja/tai Val-Pro-Pro pitoisuus, valmistettaessa mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehostavaa tuotetta.The invention further relates to the use of a product having a high content of casein-based small molecule peptides Ile-Pro-Pro and / or Val-Pro-Pro in the preparation of a mineral-enhancing product.

5 Edullisesti kaseiinipohjaiset pienimolekyyliset peptidit käsittävät di- - tetrapeptidejä ja näiden seoksia. Erityisen edullisesti sekä IPP:n että VPP:n ja kalsiumin pitoisuudet ovat korkeat.Preferably, the casein-based small molecule peptides comprise di- tetrapeptides and mixtures thereof. Particularly preferably, both IPP and VPP and calcium are high.

Keksintö koskee edelleen sellaisen tuotteen käyttöä, jolla on korkea kaseiinipohjaisten pienimolekyylisten peptidien pitoisuus ja korkea kalsium-10 pitoisuus, ja joka on valmistettu fermentoimalla kaseiinipitoista lähtöainetta maitohappobakteerilla ja mahdollisesti nanosuodattamalla saatu peptidejä sisältävä fermentoitu tuote, valmistettaessa mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehostavaa lopputuotetta.The invention further relates to the use of a product having a high content of casein-based small molecule peptides and a high content of calcium 10 produced by fermentation of a casein-containing starting material with a lactic acid bacterium and optionally by nanofiltration of a fermented product containing peptides.

Edullisena sovellusmuotona keksintö koskee hapatetun koostu-15 muksen, joka sisältää kaseiinipohjaisia pienimolekyylisiä peptidejä Ile-Pro-Pro ja/tai Val-Pro-Pro, mineraaleja ja elävää maitohappobakteeria, käyttöä valmistettaessa mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehostavaa tuotetta.In a preferred embodiment, the invention relates to the use of an acidified composition containing casein-based small molecule peptides Ile-Pro-Pro and / or Val-Pro-Pro, minerals and a living lactic acid bacterium in the preparation of a mineral availability enhancer.

Kuvataan myös menetelmää mineraalien hyväksikäytettävyyden tehostamiseksi ja/tai luuston vahvistamiseksi antamalla yksilölle mineraalien hy-20 väksikäytettävyyttä tehostavia peptidejä tai niitä sisältävää tuotetta sellainen määrä, joka on riittävä halutun vaikutuksen aikaansaamiseksi.Also described is a method for enhancing mineral utilization and / or bone enhancement by administering to an individual an amount of mineral minerals enhancing peptides or a product containing them sufficient to produce the desired effect.

;* Yksilö on ensisijaisesti ihminen. Keksinnön mukaisesti käytettävien * » ·' tuotteiden myönteisistä vaikutuksista hyötyvät luonnollisesti myös eläimet, eri- : . tyisesti lemmikkieläimet ja tuotantoeläimet. Näistä voidaan esimerkkeinä mai- ,,,; 25 nita koirat, kissat, kaniinit, hevoset, lehmät, siat, vuohet, lampaat ja siipikarja.; * The individual is primarily human. Of course, the positive effects of the products used in accordance with the invention also benefit animals, in particular:. especially pets and farm animals. Examples of these are maize ;,; 25 nita dogs, cats, rabbits, horses, cows, pigs, goats, sheep and poultry.

Mineraalien hyväksikäytettävyyden tehostamisella tarkoitetaan tä-män julkaisun puitteissa monipuolista vaikuttamista, joka käsittää erityisesti mineraalien imeytymistä ja vaikutusta luusoluihin.In the context of this publication, enhancement of the utilization of minerals means multifaceted action, which includes in particular the absorption of minerals and the action on bone cells.

Biologisesti aktiivisia peptidejä käytettäväksi mineraalien hyväk-,’·>·, 30 sikäytettävyyden tehostamiseen esillä olevan keksinnön mukaisesti voidaan *” siis muodostaa fermentoinnilla. Fermentoinnissa lähtöaineena voidaan käyttääThus, biologically active peptides for use in enhancing the good usability of minerals according to the present invention may thus be generated by fermentation. The starting material for fermentation can be used

* I I* I I

v : mitä tahansa tuotetta, joka sisältää haluttujen biologisesti aktiivisten peptidien sekvenssejä osana omaa peptidi- tai proteiinisekvenssiään. Edullisesti käyte-: tään maidon proteiinia, erityisesti kaseiinia, sellaisenaan tai erilaisten valmis- '·>[ 35 teiden muodossa. Lähtöaineeksi soveltuvat edullisesti myös erilaiset kaseiinia sisältävät maitotuotteet, kuten rasvaton tai rasvapitoisuudeltaan vaihteleva 112031 9 maito sellaisenaan tai vastaavan maitojauheen muodossa ja hapatetut maitotuotteet, kuten piimä, kirnupiimä, jogurtti, viili, tuorejuustot, jne.v: Any product containing sequences of desired biologically active peptides as part of its own peptide or protein sequence. Preferably, the milk protein, especially casein, is used as such or in the form of various preparations. Preferably, various casein-containing dairy products such as skimmed or non-fat 112031 9 milk as such or in the form of milk powder and acidified dairy products such as butter, buttermilk, yoghurt, filet, cream cheese, etc. are also suitable as starting materials.

Fermentointi voidaan suorittaa millä tahansa maitohappobakteerilla, joka kykenee tuottamaan mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehostavia pieni-5 molekyylisiä peptidejä lähtöaineesta. Sopivia maitohappobakteereja voi löytyä mm. sukuihin Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus ja Bifidobacterium kuuluvista lajeista. Maitohappobakteereista proteolyyttisin on Lactobacillus helveticus, ja tätä pidetään siten erityisen sopivana tähän tarkoitukseen. Edullinen Lactobacillus helveticus -kanta on L helveticus LBK-16H, 10 DSM 13137, joka on yksityiskohtaisesti kuvattu patenttijulkaisussa WO 01/32836. Maitohappobakteereja voidaan käyttää puhdasviljelminä tai sekavil-jelminä, erikseen tai tavanomaisesti käytettyjen ja kaupallisesti saatavien ha-patteiden kanssa. Maitohappobakteereja voidaan myös käyttää yhdessä muiden mikro-organismien kanssa. Mikrobiyhdistelmien osalta valitaan tarkoituk-15 senmukaisesti sellaisia yhdistelmiä, joilla saadaan lopputuotteeseen paras mahdollinen maku ja joilla kontaminaatioriski väistyy.The fermentation can be carried out with any lactic acid bacterium capable of producing small-molecule peptides from the starting material that enhance mineral utilization. Suitable lactic acid bacteria can be found e.g. Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus and Bifidobacterium. The most lactolactic bacterial proteolytic is Lactobacillus helveticus and is therefore considered particularly suitable for this purpose. A preferred Lactobacillus helveticus strain is L helveticus LBK-16H, 10 DSM 13137, which is described in detail in WO 01/32836. Lactic acid bacteria can be used as pure cultures or mixed cultures, alone or with conventional and commercially available inhibitors. Lactic acid bacteria can also be used in combination with other microorganisms. In the case of microbial combinations, combinations which provide the best flavor to the final product and which eliminate the risk of contamination are appropriately selected.

Fermentointiolosuhteet valitaan fermentoinnissa käytettävän kannan vaatimusten mukaisesti siten, että muodostuu halutun vaikutuksen aikaansaamiseksi riittävä määrä biologisesti aktiivisia peptidejä. Sopivien olo-20 suhteiden, kuten esimerkiksi lämpötilan, pH:n ja ilmastuksen valinta kuuluvat alan ammattimiesten tietotaitoihin. Lämpötila voi olla esimerkiksi 30 - 45 °C.The fermentation conditions are selected according to the requirements of the strain used in the fermentation so that a sufficient amount of biologically active peptides is formed to produce the desired effect. The selection of suitable conditions such as temperature, pH and aeration is within the skill of those skilled in the art. The temperature may be, for example, 30 to 45 ° C.

Fermentoinnin annetaan jatkua, kunnes haluttu määrä biologisesti aktiivisia peptidejä on muodostunut. Aikaa tähän kuluu normaalisti noin 20 - 30 h, edullisesti 22 - 24 h.The fermentation is allowed to continue until the desired amount of biologically active peptides is formed. This usually takes about 20 to 30 hours, preferably 22 to 24 hours.

: 25 Fermentoinnissa muodostuu erilaisten peptidien seos. Kun fermen- tointi kestää riittävän kauan, saadaan pääasiassa suhteellisen pieniä di- ja tri- • · . * *. peptidejä, kuten esimerkiksi Val-Pro-Pro (VPP) ja Ile-Pro-Pro (IPP).: 25 A mixture of different peptides is formed during fermentation. When fermentation lasts long enough, relatively small di- and tri- • · are obtained. * *. peptides such as Val-Pro-Pro (VPP) and Ile-Pro-Pro (IPP).

* a* a

Fermentoinnin jälkeen solususpensio kerätään talteen. Sitä voidaan ... käyttää sellaisenaan tai peptidit voidaan erottaa ja puhdistaa siitä tavanomai- 30 siä menetelmiä käyttäen. Solususpensiota voidaan myös konsentroida, esi- * · '*·* merkiksi haihduttamalla tai kuivaamalla osittain tai kokonaan, kuten levittämäl- lä se levylle, kuivaamalla ja lopuksi jauhamalla hyvin säilyvän kuivan jauheen saamiseksi.After fermentation, the cell suspension is collected. It can ... be used as such or peptides can be isolated and purified using conventional techniques. The cell suspension can also be concentrated, for example, by evaporation or partial or total evaporation, such as spreading onto a plate, drying and finally grinding to obtain a well-preserved dry powder.

« ·«·

Solususpension jatkokäsittely nanosuodattamalla on osoittautunut 35 hyväksi keinoksi, joka mahdollistaa mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehosta- • t 1 · 10 112031 vien peptidien ja halutun kivennäisainekoostumuksen muodostamisen samaan lopputuotteeseen.Further treatment of the cell suspension by nanofiltration has proven to be a good means of making the minerals more potent to form 1 · 10 112031 peptides and the desired mineral composition in the same end product.

Tietyissä tapauksissa voi olla tarkoituksenmukaista altistaa fermen-toitu tuote esikäsittelyyn, esimerkiksi poistaa siitä kaseiini tai kaikki maidon 5 proteiinit, ennen nanosuodatusta. Esikäsittelyyn soveltuvat menetelmät ovat alalla tunnettuja ja käsittävät mm. erilaisia saostus- ja suodatusmenetelmiä. Eräs käyttökelpoinen menetelmä käsittää fermentoidun tuotteen pH:n säätämisen alueelle, jossa kaseiini saostuu, esimerkiksi arvoon noin 4,6 noin 37 °C:n lämpötilassa, minkä jälkeen saostunut kaseiini erotetaan esimerkiksi rah-10 kaseparaattorilla, kaseiininerotusseulalla, dekantterilla, laskeuttamalla tai muulla sopivalla menetelmällä. Toinen menetelmä käsittää hapatetun tuotteen ultrasuodatuksen pH:ssa 3 - 3,5, jolloin kaikki proteiinit pidättyvät kalvolle ja permeaattina saadaan lähes proteiinitonta heraa. Yhteissaostusta, jolla saadaan lähes proteiinitonta, peptidit sisältävää heraa, voidaan aikaansaada esi-15 merkiksi CaCI2-lisäyksellä, lämpökäsittelyllä tai happolisäyksellä. Tarvittaessa mahdollinen kaseiinipöly poistetaan sentrifugikäsittelyllä. Muitakin aineita, kuten laktoosia, voidaan poistaa ennen nanosuodatusta esimerkiksi entsymaattisesti hydrolysoimalla tai fermentoimalla.In some cases, it may be appropriate to subject the fermented product to pretreatment, for example, to remove casein or all milk proteins prior to nanofiltration. Methods suitable for pretreatment are known in the art and include e.g. various precipitation and filtration methods. One useful method involves adjusting the pH of the fermented product to the area where the casein is precipitated, for example to about 4.6 at a temperature of about 37 ° C, followed by separation of the precipitated casein using, for example, tracer, casein separator, decanter, settling or other suitable method. . Another method involves ultrafiltration of the acidified product at a pH of from 3 to 3.5, whereby all proteins are retained on the membrane, and as a permeate almost whey-free whey is obtained. Co-precipitation to obtain a nearly protein-free, peptide-containing whey can be effected, for example, by addition of CaCl 2, heat treatment or acid addition. If necessary, any casein dust is removed by centrifugation. Other substances, such as lactose, may be removed prior to nanofiltration, for example, by enzymatic hydrolysis or fermentation.

Fermentointituote, joka mahdollisesti on esikäsitelty tarkoi-20 tuksenmukaisella tavalla, kuten edellä kuvatun mukaisesti saatu hera, altiste- ... taan sitten haluttaessa nanosuodatuskäsittelyyn. Nanosuodatuskalvona voi- • · daan käyttää tavanomaista NF-kalvoa, kuten esimerkiksi Nanomax-50 (Millipo- :..v re) tai Desal 5 (Desal Inc. USA), ja olosuhteet valitaan kalvonvaimistajien vaa- »1 1 ί V timusten ja ohjeiden mukaisesti. Nanosuodatuskalvotyypin ja prosessiolosuh- 25 teiden valinnalla voidaan vaikuttaa merkittävästi saatavan tuotteen koostu-: mukseen, etenkin suola- ja sokerikoostumukseen.The fermentation product, optionally pretreated in an appropriate manner, such as whey obtained as described above, is then subjected, if desired, to a nanofiltration treatment. A conventional NF film such as Nanomax-50 (Millipo-: v re) or Desal 5 (Desal Inc. USA) can be used as the nanofiltration membrane, and conditions are selected according to the specifications and guidelines of the film makers. in accordance with. The choice of the nanofiltration membrane type and the process conditions can significantly influence the composition of the product obtained, particularly the salt and sugar composition.

Nanosuodatuskäsittely suoritetaan haluttuun kuiva-ainepitoisuuteen i« · tai tilavuuskonsentrointisuhteeseen, mikä yleensä on mahdollisimman korkea. Kuiva-ainepitoisuus on suuruusluokkaa noin 20 - 40 % ja tilavuus- * » 30 konsentrointisuhde noin 5 - 20. (Hera)tiiviste voidaan laimentaa vedellä, jolloin suoloja ja maitohappoa voidaan poistaa tiivisteestä enemmän nanosuodatuk-v ·1 sessa. Tämä on yksinkertainen ja tehokas keino säätää suolojen määrää tiivis- : ' ’: teessä halutulle tasolle.The nanofiltration treatment is carried out at the desired solids content i «· or volume concentration ratio, which is generally as high as possible. The solids content is in the order of about 20-40% and the volume concentration ratio is about 5-20. The (Hera) concentrate can be diluted with water, which allows more salts and lactic acid to be removed from the concentrate in a nanofiltration. This is a simple and effective means of adjusting the amount of salts in the compact to the desired level.

; Fermentoinnissa muodostuneet, mineraalien hyväksikäytettävyyttä 35 tehostavat pienikokoiset peptidit, kuten noin 350 D:n kokoiset tripeptidit IPP ja * · ·’ VPP, pidättyvät täysin nanosuodatuskalvon avulla. Nanosuodatusmenetelmä 11 112031 tarjoa mahdollisuuden laktoosin poistamiseen myös kokonaan; laktoosi voidaan pilkkoa entsymaattisesti ennen nanosuodatusvaihetta, jolloin monosak-karidit poistuvat suurelta osin. Nanosuodatuksessa myös maitohappo, pienet typpiyhdisteet, kuten urea, ja yhdenarvoiset suolat läpäisevät kalvon. Na-5 nosuodatuksen avulla tuotteen peptidipitoisuus siten kasvaa. Konsentroinnin myötä myös sen kaksiarvoisten ionien, erityisesti haluttujen kalsium- ja magnesium-ionien pitoisuus kasvaa, kun taas yksiarvoisten ionien, kuten natrium-, kalium- ja kloridi-ionien suhteellinen osuus laskee. Varsinkin natrium-ioneilla tiedetään olevan merkittävä vaikutus kehon nestetasapainoon, ja näiden hai-10 tallisten ionien määrän lasku voidaan siten pitää hyvin merkittävänä etuna. Tiettyjen kaksiarvoisten ionien, erityisesti kalsium-ionien, tiedetään vaikuttavan mm. luun mineralisoitumisen tehostumiseen, ja näiden korkea pitoisuus pidetään siten hyvin suotavana.; Small-size peptides formed during fermentation, such as about 350 D-size tripeptides IPP and * · · 'VPP, are completely retained by the nanofiltration membrane. The nanofiltration process 11 112031 also offers the ability to completely eliminate lactose; lactose can be enzymatically cleaved before the nanofiltration step, whereby the monosaccharides are largely removed. In nanofiltration, lactic acid, small nitrogen compounds such as urea, and monovalent salts also permeate the membrane. Na-5 filtration thus increases the peptide content of the product. Concentration also increases the concentration of its divalent ions, especially the desired calcium and magnesium ions, whereas the proportion of monovalent ions such as sodium, potassium and chloride ions decreases. Sodium ions in particular are known to have a significant effect on the body's fluid balance, and thus a reduction in the amount of these harmful ions can be considered a very significant advantage. Certain divalent ions, particularly calcium ions, are known to act, e.g. bone mineralization, and their high concentration is thus highly desirable.

Tiettyjen valittujen mineraalien pitoisuutta tuotteessa voidaan myös 15 nostaa lisäämällä siihen haluttua mineraalia esimerkiksi sopivan suolan muodossa. Tällaisina mineraaleina mainittakoon erityisesti kalsium ja magnesium.The content of certain selected minerals in the product may also be increased by adding the desired mineral, for example in the form of a suitable salt. Such minerals include, in particular, calcium and magnesium.

Edellä kuvatun kaksivaiheisen, fermentointiin ja nanosuodatukseen perustuvan menetelmän fermentointivaiheessa muodostettuun esivalmis-teeseen sisältyvien ainesosien käyttäytyminen nanosuodatusvaiheessa on esi-20 tetty taulukossa 1. Kyseessä on esimerkinomaisesti esitetty koostumus, joka on muodostettu fermentoimalla rasvatonta maitoa Lactobacillus helveticus -kannalla. Kuten edellä esitetystä kuvauksesta käy selkeästi ilmi, myös muita y;\: tuotteita voidaan käyttää lähtöaineina. Lisäksi fermentointiolosuhteet, valinnai- : nen nanosuodatuskäsittely ja mahdolliset muut esi- ja lisäkäsittelyt vaikuttavat 25 lopputulokseen, joten lopputuotteiden koostumus (ja nanosuodatustulokset) .'. : luonnollisesti vaihtelevat ja voivat poiketa tässä annetuista. 1 * < » · · · > · 12 112031The behavior of the constituents of the pre-product formed during the fermentation step of the two-stage fermentation and nanofiltration process described above is shown in Table 1. This is an exemplary composition formed by fermentation of skimmed milk with Lactobacillus helveticus. As is clear from the description above, other y; \: products may be used as starting materials. In addition, the fermentation conditions, the optional nanofiltration treatment and any other pre- and further treatments will affect the final result, so the composition of the final products (and the nanofiltration results). '. : of course, vary and may differ from those given here. 1 * <»· · ·> · 12 112031

Taulukko 1table 1

Biologisesti aktiivisia peptidejä sisältävän heran aineosien käyttäytyminen na-nosuodatuksessa.Behavior of whey constituents containing biologically active peptides in nano-filtration.

5 Kalvo: Nanomax 50, olosuhteet: 40 °C, 30 bar, til.kons.-suhde K=9, pH 4.6.Film: Nanomax 50, conditions: 40 ° C, 30 bar, v / v K = 9, pH 4.6.

__Molekyylipaino D Retentio (%) IPP 361,4 100 VPP 347,4 100 maitohappo 90,1 24__Molecular Weight D Retention (%) IPP 361.4 100 VPP 347.4 100 Lactic Acid 90.1 24

Ca 40,1 68Ca 40.1 68

Mg 24,3 72 K 39,1 11Mg 24.3 72 K 39.1 11

Na 23 10Well 23 10

Cl 35,5 9 P04 95 47Cl 35.5 9 P04 95 47

Urea 60,1 ~10 laktoosi__342,3__63_ * I » 10 Tämän julkaisun esimerkissä 2 kuvatulla tavalla valmistettu tuote on todettu soveltuvan erinomaisesti keksinnön mukaiseen tarkoitukseen. Tuot-teen kokonaiskoostumus on suoritetuissa vertailukokeissa todettu optimaali-seksi. Tuotteen fysiologisiin aktiivisuuksiin vaikuttavat monet osatekijät, kuten tuotteen pitkälle suoritettu proteolyysi, jolla saadaan erilaisten aktiivisten pepti-15 dien kirjo, tuotteen erinomainen mineraalipitoisuus, tuotteen sisältämät elävät mikrobisolut sekä tuotteen happamuus. Kaikki näihin ominaisuuksiin voidaan :*.·. vaikuttaa ja niitä voidaan maksimoida valmistusmenetelmän eri parametrejä muuttamalla kulloinkin tarkoituksenmukaisella tavalla. Proteolyysiolosuhteet, T kuten entsyymiaktiivisuus ja reaktioaika, vaikuttavat saatavien peptidien laa- * 1 * v 20 tuun ja määrään. Myös nanosuodatuksella voidaan vaikuttaa näihin, ja erityi- sesti nostaa tuotteen peptidipitoisuutta merkittävästi. Lisäksi voidaan helposti ; . ·, säätää suolojen pitoisuudet ja niiden väliset suhteet halutulle tasolle. ErityisestiUrea 60.1 ~ 10 Lactose__342.3__63_ * 10 The product prepared as described in Example 2 of this publication has been found to be excellent for the purpose of the invention. The overall composition of the product has been found to be optimal in the comparative tests performed. The physiological activities of a product are affected by many factors, such as advanced proteolysis of the product to obtain a spectrum of various active peptides, excellent mineral content of the product, live microbial cells contained in the product, and acidity of the product. All of these features can be:. influence and can be maximized by modifying the various parameters of the manufacturing process as appropriate. Proteolysis conditions such as T enzyme activity and reaction time affect the quality and amount of peptides obtained. These can also be affected by nanofiltration and, in particular, significantly increase the peptide content of the product. In addition, one can easily; . ·, Adjusts the salt concentrations and their ratios to the desired level. Specially

* t I* t I

' -. ‘ voidaan nostaa haluttujen kaksiarvoisten ionien pitoisuutta ja vähentää yksiar- 13 112031 yksiarvoisten ionien pitoisuutta. Myös happamuutta ja mikrobisolujen määrää ja laatua on helppo maksimoida alan ammattimiehen tuntemin tavoin.'-. The concentration of the desired divalent ions can be increased and the concentration of the monovalent ions can be decreased. Also, acidity and the number and quality of microbial cells are easily maximized, as known to one skilled in the art.

Edellä kuvattuja tuotteita voidaan käyttää sellaisinaan halutun vaikutuksen aikaansaamiseksi. Tuotteita voidaan myös kuivata ja käyttää jau-5 heen tai lyofilisoidun valmisteen muodossa. Tuotteita voidaan myös edullisesti käyttää terveysvaikutteisten elintarvikkeiden tai muiden tuotteiden valmistuksessa.The products described above can be used as such to achieve the desired effect. The products may also be dried and used in the form of a powder or lyophilized preparation. The products may also be advantageously used in the manufacture of health-promoting foods or other products.

Käsitteellä elintarvike on tässä julkaisussa laaja merkitys kattaen kaikki nautittavaksi tarkoitetut tuotteet, jotka voivat olla kiinteässä, hyytelöidys-10 sä tai nestemäisessä muodossa, ja kattaen sekä valmiit tuotteet että tuotteet, joihin biologisesi aktiiviset peptidit tai niitä sisältävä tuote lisätään nauttimisen yhteydessä, lisäaineeksi tai osaksi tuotetta. Elintarvikkeet voivat olla esimerkiksi meijeriteollisuuden, lihanjalostusteollisuuden, einesteollisuuden, juoma-teollisuuden, leipomoteollisuuden ja makeisteollisuuden tuotteita. Tyypillisiä 15 ovat maitotuotteet, kuten jogurtti, viili, rahka, piimä, kirnupiimä, muut hapan-maitojuomat, tuorejuustot ja kypsytetyt juustot, välipalasnackien täytteet, jne. Toisen tärkeän ryhmän muodostavat juomat, kuten herajuomat, hedelmä-juomat, ja oluet.The term food has a broad meaning in this publication, encompassing all products intended for ingestion, which may be in solid, gelatinized or liquid form, and includes both finished products and products to which biologically active peptides or a product containing them are added as an additive or as part of a product. . Foodstuffs may be, for example, products of the dairy industry, the meat processing industry, the food industry, the beverage industry, the bakery industry and the confectionery industry. Typical are dairy products such as yogurt, frankfurters, quark, buttermilk, buttermilk, other sour milk drinks, cream cheese and matured cheeses, snack toppings, etc. Another important group is beverages such as whey drinks, fruit drinks, and beers.

Keksinnön mukaisesti biologisesti aktiivisia peptidejä tai niitä sisäl-20 tävää tuotetta käytetään riittävä määrä halutun, kivennäisaineiden imeytymistä tehostavan vaikutuksen aikaansaamiseksi. Käytettäessä edellä kuvatulla kaksivaiheisella menetelmällä saatua tuotetta käyttömäärä riippuu merkittävästi \i.: heran konsentrointiasteesta, ja on esimerkiksi 0,1 - 30 %, edullisesti noin 5 - tl · * 15 % lopputuotteen painosta laskettuna.According to the invention, the biologically active peptides or the product containing them are used in an amount sufficient to achieve the desired effect of enhancing the absorption of minerals. When using the product obtained by the two-step process described above, the application rate is significantly dependent on the degree of concentration of the whey, and is, for example, from 0.1 to 30%, preferably from about 5 to about 15% by weight of the final product.

: ’ ; 25 Biologisesti aktiivisia peptidejä tai niitä sisältävää tuotetta voidaan lisätä elintarvikkeeseen sen valmistusprosessin aikana tai jo valmistettuun elintarvikkeeseen. Kyseiset elintarvikkeet sisältävät siis mineraalien hyväksi- I i t käytettävyyttä tehostavia peptidejä tai niitä sisältävää tuotetta muiden vastaa-vanlaisiin elintarvikkeisiin sisältyvien ainesosien lisäksi, ja vastaavat maultaan t · 30 ja käyttötavoiltaan täysin näitä tavanomaisia tuotteita.: '; The biologically active peptides or the product containing them may be added to the food during the manufacturing process or to the food already prepared. The foodstuffs in question thus contain, in addition to other ingredients contained in similar foodstuffs, peptides or a product containing them which enhance the usefulness of the minerals, and which are identical in taste to those of conventional products.

Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavien esimerkkien , ί ’: avulla. Nämä esimerkit annetaan vain keksinnön valaisemiseksi eikä niitä pidä katsoa sen suojapiiriä mitenkään rajoittaviksi. Viite-esimerkeissä ja kuvissa . X-:llä merkitty tuote on valmistettu esimerkkien 2 ja 5 mukaisesti.The invention will be described in more detail by means of the following examples, ί '. These examples are provided for purposes of illustration only and are not to be construed as limiting the scope thereof. Refer to Reference Examples and Figures. The product marked with X- is prepared according to Examples 2 and 5.

» I » » 35 Μ 112031 14»I» »35 Μ 112031 14

Viite-esimerkki 1Reference Example 1

Eri tuotteiden proteolyysiaste ja kivennäisainepitoisuusDegree of proteolysis and mineral content of different products

Eri hapanmaitovalmisteiden proteolyysiasteen määrittämiseksi selvitettiin niiden proteiinipitoisuus (proteiini), kokonaistyppipitoisuus (kokN), ei-5 proteiinityppipitoisuus (NPN; mm. urea, aminohapot, pienet peptidit jne.), tikattujen vapaiden aminohappojen määrä (titr.vap.ah.) sekä pH. Proteolyysiasteen voi karkeasti määritellä laskemalla ei-proteiinitypen suhde kokonaistyp-peen (NPN / kokN); titrattujen vapaiden aminohappojen määrä mmol/g proteiinia saadaan laskemalla titr.ah/prot.To determine the degree of proteolysis of various sour milk products, their protein content (protein), total nitrogen content (kokN), non-5 protein nitrogen (NPN; urea, amino acids, small peptides, etc.), quartered free amino acids (titr.free) were determined. The degree of proteolysis can be roughly determined by calculating the ratio of non-protein nitrogen to total nitrogen (NPN / kokN); the amount of titrated free amino acids in mmol / g protein is obtained by counting the titr.ah / prot.

10 Tulokset on esitetty taulukossa 2. Niistä ilmenee selvästi Evolus- juoman suurempi proteolyysiaste, ja siten suurempi lyhytkejuisten peptidien määrä, kaupalliseen japanilaiseen Calpis sour milk -tuotteeseen, Calpis Food Industry Co Ltd, verrattuna.The results are shown in Table 2. They clearly show a higher degree of proteolysis of the Evolus beverage, and thus a higher amount of short-chain peptides, compared to the commercial Japanese product Calpis sour milk, Calpis Food Industry Co Ltd.

* » ·* »·

* > I*> I

« * t 1 1«* T 1 1

* I* I

* -* -

XX

is 112031 Q- cn r-_ σι cd m- o- co o ro ro’ ro" ro ro' O' o o o·’ -4~t ’+3 +-* 2 03 Q. — * v o F- co co_ eo o oo en oo o· M·" ro' ro" cm" cm" cm" cm"is 112031 Q- cn r-_ σι cd m- o- co o ro ro 'ro "ro ro' O 'ooo ·' -4 ~ t '+3 + - * 2 03 Q. - * vo F- co co_. eo o oo en oo o · M · "ro 'ro" cm "cm" cm "cm"

~ ^ CO~ ^ CO

~ ti~ ti

_______________ <U_______________ <U

--------- ------------- ----

COC/O

-e CT ro ω | n 5 ? ? ? “ S | S S -5 S E 2 _______________ Q.-e CT ro ω | n 5? ? ? “S | S S -5 S E 2 _______________ Q.

CC

z ϋ £ .0 , , '«L ®. ^ o CO O CO ~ ^ äv CM CO CO ° OT- ° K ro 1 s Z Ji _______________ rö z -*: Z -55 oocnCDh-ooco o- cm co cd -*: Q. 03 S S (o. q ffl o en id d m- ^ 2 £ o' o" 0 cd" o" o" o" o" o" o' 2 Q_z ϋ £ .0,, '«L ®. ^ o CO O CO ~ ^ äv CM CO CO ° OT- ° K ro 1 s Z Ji _______________ rö z - *: Z -55 oocnCDh-ooco o- cm co cd - *: Q. 03 SS {o. q ffl o en id d m- ^ 2 £ o 'o "0 cd" o "o" o "o" o "o' 2 Q_

_______________ Z_______________ Z

:ro" ro 4=! o ω o.: ro "ro 4 =! o ω o.

^ cm o cm o o o ro M- ro en ~ 2" ,· M- M· CD LO LO CO ID ID ID ID > “2^ cm o cm o o o ro M- ro en ~ 2 ", · M- M · CD LO LO CO ID ID ID>" 2

O o" o" o" o" o" o" o" o' o' Ö" OO o "o" o "o" o "o" o "o 'o' Ö" O

: -* -o C: - * -o C

, Q. E, Q. E

: · : roro --------------- ro . , > .t;: ·: Roro --------------- ro. ,> .t;

*,,, * e CO* ,,, * e CO

• · ~ 00 in cm en en o co m- 00 cd tn S" jy co cd ro v- V- en co M- co r» ~ > • * O cm" cm" co" co" ro" T-" co" ro" ro" ro" _ “ Sf S--------------- S-| (0 Q-.-t; ... CO :(0 +-• · ~ 00 in cm en en o co m- 00 cd tn S "jy co cd ro v- V- en co M- co r» ~> • * O cm "cm" co "co" ro "T-" co "ro" ro "ro" _ "Sf S --------------- S- | (0 Q -.- t; ... CO: (0 + -

IV g, ISIV g, IS

> o.® o C ^ t . © ^. ro o 2 ·.. ti ro ro S£ • * * P e — «o SB. j= . tt ^ JS C :CT3 , , — S Ό .2, .¾ .s 2, "55 (0 e **» Φ E.C000 .2, p r- • M Ό ^ ^ ο. a o. P c *- e e iS* * . _ *— ro ro *o *u <O ;= o C Φ O ^ : : I o 2 E E E E E Q § =o ro =j -g1 ··* .* o ° § 'a 'cl 'q o E e ^ e ro 3 >>> o.® o C ^ t. © ^. ro o 2 · .. ti ro ro S £ • * * P e - «o SB. j =. tt ^ JS C: CT3,, - S Ό .2, .¾ .s 2, "55 {0 e **» Φ E.C000 .2, p r- • M Ό ^ ^ ο. a o. P c. * - ee iS * *. _ * - ro ro * o * u <O; = o C Φ O ^:: I o 2 EEEEEQ § = o ro = j -g1 ·· *. * o ° § 'a' cl 'qo E e ^ e ro 3 >>

1 3 £ f f S S S .8 ! ΐ f S1 3 £ f f S S S .8! ΐ f S

2—0 OOOOO— w en «J. m "rnO^^ n e. 3 > > > > > ro ro U m ro .¾ -o LLI * h UI h ui 111 UI UJ UI O e O < 2 ϊέ 3 * Ϊ 112031 162-0 OOOOO— w en «J. m "rnO ^^ n e. 3>>>>> ro ro U m ro .¾ -o LLI * h UI h ui 111 UI UJ UI O e O <2 ϊέ 3 * Ϊ 112031 16

Eri hapanmaitovalmisteiden kivennäisainepitoisuuden määrittämiseksi selvitettiin niiden natrium-, kalsium-, magnesium- ja kaliumpitoisuudet. Seerumin korkea natriumpitoisuus on todettu haitalliseksi monessa suhteessa, mm. elektrolyyttitasapainon, korkean verenpaineen ja sydän- ja verisuonitau-5 tien osalta, joten sen vähentäminen ravinnosta on edullista. Muiden mineraalien osalta tilanne on päinvastainen ja pitoisuuden nostaminen on siis edullista. Mittauksen on suoritettu Ympäristölaboratoriossa (Ympäristökeskus, Helsinki). Tulokset on esitetty taulukossa 3. Evolus-tuotteen mineraalisisäitö on optimaalinen keksinnön tarkoitusta varten.The sodium, calcium, magnesium and potassium levels of the various sour milk preparations were determined in order to determine their mineral content. High levels of serum sodium have been found to be harmful in many respects, e.g. electrolyte balance, hypertension, and cardiovascular disease, so reducing it from the diet is advantageous. For other minerals, the opposite is the case, and raising the concentration is therefore advantageous. The measurement was carried out in the Environmental Laboratory (Environmental Center, Helsinki). The results are shown in Table 3. The mineral content of the Evolus product is optimal for the purpose of the invention.

1010

Taulukko 3Table 3

Eri tuotteiden mineraalipitoisuusMineral content of different products

Rasvaton Evolus Lisäys/ Japanilainen piimä vähennys Calpis ____Evoluksessa__ __mg/100 g__mg/100g__%__Mg/100gEvolus Fat Free Addition / Japanese Dairy Reduction Calpis ____Evolus__ __mg / 100g__mg / 100g __% __ Mg / 100g

Natrium__56__32__- 43__66_Sodium__56__32 __- 43__66_

Kalsium__120__200__+ 67__66_Calcium__120__200 __ + 67__66_

Kalium__190__310__+ 63__94_Potassium__190__310 __ + 63__94_

Magnesium__14__17__+ 21__6,6 15 Viite-esimerkki 2Magnesium__14__17 __ + 21__6.6 15 Reference Example 2

Eri tuotteiden vaikutus luustoonEffect of different products on bone

! > I! > I

• Tutkimuksessa selvitettiin veden, maidon, piimän sekä kahden IPP- » · :: ja VPP-peptidejä sisältävän juoman, kaupallisen japanilaisen Calpis sour milk - tuotteen, Calpis Food Industry Company Ltd, sekä esimerkin 2 tuotteen X 20 (Evolus, Valio Oy), vaikutus luustoon.• The study investigated water, milk, milk and two IPP-containing and VPP-containing beverages, the commercial Japanese Calpis sour milk product, Calpis Food Industry Company Ltd, and the product of Example 2, X 20 (Evolus, Valio Oy), effect on bone.

Tutkimuksissa käytettiin 6-viikkoisia SH-rottia, joille juotettiin yhtä koejuomista ad libitum 14 viikon ajan. Tutkimuksen jälkeen rottien luut irrotet-tiin ja luuntiheydet (BMD, bone mineral density) ja luunmineraalipitoisuudet ' (BMC, bone mineral content) määritettiin Dexalla (dual energy X-ray absorp- 25 tiometry). Dexa on matalaenergiseen röntgensäteilyyn perustuva tekniikka, jol-: la mitataan yleisesti luuntiheyttä.. Tulokset laskettiin Fisher LSD-menetelmällä ; (Sahai H and Ageel M. 2000. The analysis of variance: Fixed, random and mixed models, Birkhäuser, Boston). Kalsiumin ja energian saanti eroaa eri „ 112031 ryhmissä kokeen aikana, ja tästä syystä tulokset on vakioitu näiden muuttujien suhteen. Tulokset on esitetty taulukossa 4 sekä kuvioissa 1 ja 2. Kuviosta 1 ilmenee, että Evolus-juomaa saaneiden rottien luuntiheys on suurempi kuin muilla ryhmillä. Kuviosta 2 ilmenee Evolus-juoman selkeä tehostava vaikutus 5 luunmineraalipitoisuuteen. Luun-mineraalipitoisuudessa on tilastollisesti merkittävä ero Evolus-juomaa ja vettä nauttineiden rottien, sekä myös Evolus-juomaa ja Calpis-juomaa nauttineiden rottien välillä. Tuloksista ilmenee siten selkeäasti, että Evolus-tuotteella on optimaalin koostumus keksinnön mukaiseen tarkoitukseen.The studies used 6-week-old SH rats fed one of the test drinks ad libitum for 14 weeks. After examination, the bones of the rats were detached and bone mineral density (BMD) and bone mineral content (BMC) were determined by Dexa (dual energy X-ray absorption thiometry). Dexa is a low energy X-ray technique that generally measures bone density. The results were calculated using the Fisher LSD method; (Sahai H and Ageel M. 2000. Analysis of variance: Fixed, random and mixed models, Birkhäuser, Boston). Calcium and energy intake differed across the 112031 groups over the course of the experiment, and as a result, results are standardized for these variables. The results are shown in Table 4 and Figures 1 and 2. Figure 1 shows that rats receiving Evolus had a higher bone density than the other groups. Figure 2 shows the clear potentiating effect of Evolus beverage 5 on bone mineral content. There is a statistically significant difference in bone mineral content between rats given Evolus and water and rats receiving Evolus and Calpis. The results thus clearly indicate that the Evolus product has the optimum composition for the purpose of the invention.

10 Fl-hakemusjulkaisussa 992360 kuvataan vastaavan Evolus- tuotteen valmistusta ja aktiivisuutta verenpainetta alentavana aineena. Kuten julkaisussa kuvataan on ensimmäiset tutkimukset tehty rotilla, minkä jälkeen ne toistettiin ihmisillä. Verenpaineen osalta saatiin molemmissa tutkimuksissa vastaavat selkeät tulokset. Näin ollen ei ole mitään syytä uskoa, ettei nyt me- 15 neillään olevissa jatkotutkimuksissa koskien kivennäisaineiden imeytymistä ihmisillä saataisi samankaltaisia tuloksia kuin edellä kuvatuissa eläinkokeissa.10 Fl application 992360 describes the preparation and activity of the corresponding Evolus product as an antihypertensive agent. As described in the publication, the first studies were performed in rats and subsequently replicated in humans. Concerning blood pressure, both studies gave similar clear results. Therefore, there is no reason to believe that the results of the current ongoing studies on the absorption of minerals in humans would not produce results similar to those described above in animal experiments.

Taulukko 4Table 4

Eri tuotteiden vaikutus luustoon 20 _______ .., Maito Piimä vs Calpis vs Evolus vs Evolus vs Piimä vs * · " ‘ ’__vs vesi__vesi__vesi__vesi__Calpis__maito BMP__0J6__0JB0__0j92__0J1__0J1__0,96 ί BMC 0,74 0,47 0,87 0,008 0,008 0,69 • · · * < · • ·Effect of different products on bone 20 _______ .., Milk Milk vs Calpis vs Evolus vs Evolus vs Milk vs * · "'' __vs water__water__water__water__Calpis__ milk BMP__0J6__0JB0__0j92__0J1__0J1__0,96 0,87 0,47 0,47 0,47 0,47 0,47 0,47 0,47 <· • ·

Esimerkki 1Example 1

Keksinnön mukaisesti käytettävän tuotteen valmistaminen 25 Lactobacillus helveticus -kanta LBK 16-H kasvatettiin MRS- /··, liemessä 37 °C:ssa 24 h ja siirrostettiin rekonstituoituun maitoon (10 %) ympin muodostamiseksi. Kahden kasvatuskerran jälkeen ymppi (15%) siirrostettiin v : fermentorialustaan, joka muodostui 9 - 10-prosenttisesta rasvattomasta maito- jauhemaidosta ja joka oli steriloitu 110 °C:ssa 10 min. Fermentointi suoritettiin 30 37 °C:ssa 22 - 24 h, koko ajan voimakkaasti sekoittaen. Tuote voidaan käyttää sellaisenaan, kuivatussa ja/tai jauhetussa muodossa, tai halutut peptidit voidaan eristää siitä käyttäen sinänsä tunnettuja menetelmiä.Preparation of the product to be used according to the invention Lactobacillus helveticus strain LBK 16-H was grown in MRS / ··, broth at 37 ° C for 24 h and inoculated into reconstituted milk (10%) to form an inoculum. After two cultures, the inoculum (15%) was inoculated into a v: fermentation medium consisting of 9-10% skimmed milk powder and sterilized at 110 ° C for 10 min. Fermentation was carried out at 37 ° C for 22-24 hours with vigorous stirring. The product may be used as such, in dried and / or powdered form, or the desired peptides may be isolated therefrom using methods known per se.

is 112031is 112031

Esimerkki 2Example 2

Keksinnön mukaisesti käytettävän tuotteen valmistaminenPreparation of a product for use according to the invention

Esimerkin 1 mukaisesti saatu hapatettu tuote altistettiin nano-suodatuskäsittelyyn seuraavasti.The acidified product obtained according to Example 1 was subjected to nano-filtration treatment as follows.

5 Hapatetun piimän pH nostettiin arvoon noin 4,6 KOH:lla ja kaseiini poistettiin vinoseulalla. Jäännöskaseiinipöly poistettiin kirkastussentrifugoi-malla. Heraan lisättiin GLL Conc. -laktaasia (Biocon Ltd., Japani) ja annettiin hydrolysoitua 5 °C:ssa 24 h laktoosin hajottamiseksi monosakkarideiksi. Näin esikäsitelty hera nanosuodatettiin Nanomax-50 -kalvon (Millipore) läpi.The pH of the fermented milk was raised to about 4.6 KOH and the casein was removed with a bias screen. Residual casein dust was removed by clarification centrifugation. Whey was added to GLL Conc. lactase (Biocon Ltd., Japan) and allowed to hydrolyze at 5 ° C for 24 h to decompose lactose into monosaccharides. The whey thus prepared was nanofiltered through a Nanomax-50 membrane (Millipore).

10 Suodatus tehtiin 40 °C:ssa 30 bar paineessa. Heraa suodatettiin kunnes tilavuuskonsentrointisuhde oli 9. Saadun tiivisteen ja siitä muodostetun kuivatun jauheen koostumukset esitetään taulukossa 5.Filtration was carried out at 40 ° C and 30 bar. The whey was filtered until the volume concentration ratio was 9. The compositions of the concentrate obtained and the dried powder formed therefrom are shown in Table 5.

Taulukko 5 15Table 5 15

Valmistetun tiivisteen ja kuivatun jauheen koostumusComposition of prepared concentrate and dried powder

Koostumus Tiiviste Kuivattu jauheComposition Concentrate Dried powder

Kuiva-aine (%) 30,0 94,5Dry matter (%) 30.0 94.5

Tuhka (%) 3,69 13,3Ash (%) 3.69 13.3

Na (mg/kg) 130 470 .V;: K (mg/kg) 1600 5600 : Ca (mg/kg) 10000 36000Na (mg / kg) 130,470 .V ;: K (mg / kg) 1600 5600: Ca (mg / kg) 10000 36000

Mg (mg/kg) 1700 6300 \'·| Cl (mg/kg) 550 2000 P (mg/kg) 6700 24500 IPP (mg/L) 510 2500 ;v: VPP (mg/L) 540 2700 * * * ,Poistettu kaseiini neutraloitiin kaseinaatiksi ja kuivattiin.Mg (mg / kg) 1700 6300 \ '· | Cl (mg / kg) 550 2000 P (mg / kg) 6700 24500 IPP (mg / L) 510 2500; v: VPP (mg / L) 540 2700 * * *, The removed casein was neutralized to caseinate and dried.

20 Esimerkki 3 t * *20 Example 3 t * *

Keksinnön mukaisesti käytettävän tuotteen valmistaminen • Esimerkissä 1 kuvattu fermentointi toistettiin käyttämällä rasvat- > » I · toman maidon sijasta (a) rasvaista maitoa ja (b) kirnumaitoa.Preparation of the product to be used according to the invention • The fermentation described in Example 1 was repeated using (a) skimmed milk and (b) buttermilk instead of fat-free milk.

19 11203119 112031

Esimerkin 3(b) mukaisen tuotteen pH nostettiin arvoon noin 4,5 ja kaseiini poistettiin rahkaseparaattorilla. Heraan lisättiin laktaasia ja pöly poistettiin baktofuugilla. Hera nanosuodatettiin sitten NF-kalvon (Desal-5, Desal Inc.) läpi, haihdutettiin ja kuivattiin. Saatu nanosuodatustiiviste oli koostumuk-5 seitaan erittäin samankaltainen taulukossa 5 esitetyn kanssa.The pH of the product of Example 3 (b) was raised to about 4.5 and the casein was removed by a sludge separator. Lactase was added to the whey and the dust was removed with a bacterial fugue. The whey was then nanofiltered through an NF membrane (Desal-5, Desal Inc.), evaporated and dried. The resulting nanofiltration concentrate on the composition was very similar to that shown in Table 5.

Poistetussa kaseiinissa on mukana paljon heraa, joka sisältää yhtä paljon biologisesti aktiivisia peptidejä kuin fermentoitu piimä. Kaseiini käytettiin sellaisenaan rahkassa, johon tällä tavalla saatiin myös biologisesti aktiivisia peptidejä.The removed casein contains a lot of whey, which contains as much biologically active peptides as fermented milk. Casein was used as such in the curd, which also obtained biologically active peptides in this manner.

10 Esimerkki 4Example 4

Keksinnön mukaisesti käytettävän tuotteen valmistaminenPreparation of a product for use according to the invention

Lactobacillus helveticus -kanta LBK 16-H kasvatettiin MRS-liemessä 37 °C:ssa 24h ympin muodostamiseksi, kuten esimerkissä 1 on kuvattu. Ymppi siirrostettiin fermentorialustaan, joka koostui happosaostetun ka- 15 seiinin (2,8 %) ja glukoosin (2,5 %) vesiliuoksesta. Kaseiini liuotettiin nostamalla pH 10% KOH:lla 6,7:ään. Kasvatus tehtiin 37 °C:ssa 24 h ajan. Tuotteeseen saatiin tuotettua vastaavat määrät biologisesti aktiivisia peptidejä VPP ja IPP kuin maitoa fermentoitaessa, mutta peptidien erottaminen kaseiiniliuoksesta oli helpompaa kuin maidosta.Lactobacillus helveticus strain LBK 16-H was grown in MRS broth at 37 ° C for 24h to form an inoculum as described in Example 1. The inoculum was inoculated into a fermentation medium consisting of an aqueous solution of acid precipitated casein (2.8%) and glucose (2.5%). The casein was dissolved by raising the pH to 6.7 with 10% KOH. The growth was carried out at 37 ° C for 24 h. Similar amounts of biologically active peptides VPP and IPP were obtained in the product as in milk fermentation, but the separation of peptides from the casein solution was easier than from milk.

20 Fermentointiliuoksen pH nostettiin 4,6:een KOH:lla lämpötilan olles sa 37 °C, jolloin kaseiini saostui. Kaseiini erotettiin rahkaseparaattorilla ja saa-'. tava hera otettiin talteen. Hera sisältää peptidejä, maitohappoa ja suoloja, mut- • ta ei lainkaan laktoosia. Heran nanosuodatuksella voidaan poistaa suuri osa Γ heran maitohaposta ja yhdenarvoisista suoloista sekä jäännösglukoosista.The pH of the fermentation solution was raised to 4.6 with KOH at 37 ° C, whereupon casein precipitated. The casein was separated by a curd separator and obtained. this whey was recovered. Whey contains peptides, lactic acid and salts, but no lactose. Nanofiltration of whey can remove much of Γ whey from lactic acid and monovalent salts and residual glucose.

25 Nanosuodatusretentaatti voidaan haihduttaa tiivisteeksi tai kuivata jauheeksi, . · . ; jolloin saadaan hyvin konsentroitu ja pitkään säilyvä biologisesti aktiivisia pep- . · ·, tidejä sisältävä valmiste.The nanofiltration retentate can be evaporated to a concentrate or dried to a powder,. ·. ; thus providing a highly concentrated and long-lasting bioactive pep. · ·, Preparation containing tides.

* »* »

Esimerkki 5 ,, . Hapanmaitotuotteen valmistus : 30 Kivennäisaineiden imeytymistä tehostavia peptidejä sisältävä piimä ' · · ‘ valmistettiin lisäämällä 3,5 % esimerkin 1 mukaisesti saatua peptiditiivistettä kaupallisesti saatavaan piimään. Saadun tuotteen koostumus on esitetty tau-lukossa 6, jossa vertailun vuoksi myös esitetään kaupallisesti saatavan ha-, , panmaitotuotteen, AB-piimän, Valio Oy, koostumus.Example 5 ,,. Preparation of the Sour Milk Product: The milk '· ·' containing mineral absorption enhancing peptides was prepared by adding 3.5% of the peptide concentrate obtained according to Example 1 to commercially available milk. The composition of the resultant product is shown in Table 6, which also compares the composition of a commercially available whey, bran milk product, AB milk, Valio Oy, for comparison.

’ 35 20 112031'35 20 112031

Taulukko 6Table 6

Evolus-tuotteen ja kaupallisen hapanmaitotuotteen koostumus __AB-piimä__Evolus-tuoteComposition of Evolus Product and Commercial Sour Milk Product __AB Milk__Evolus Product

Kuiva-aine (%) 9,0 9,8Dry matter (%) 9.0 9.8

Na (mg/kg) 390 380 K (mg/kg) 1700 1700Na (mg / kg) 390 380 K (mg / kg) 1700 1700

Ca (mg/kg) 1200 1510Ca (mg / kg) 1200 1510

Mg (mg/kg) 114 170Mg (mg / kg) 114,170

Cl (mg/kg) 1000 980 VPP (mg/l) 0 19 IPP (mg/l)_ 0_ 18_ 5Cl (mg / kg) 1000 980 VPP (mg / l) 0 19 IPP (mg / l) _ 0_ 18_ 5

Claims (9)

1. Användning av de kaseinbaserade smamolekylära peptiderna lle-Pro-Pro och/eller Val-Pro-Pro vid framställning av en produkt som effektiverar 5 tillgodogörandet av mineraler.Use of the casein-based smamolecular peptides Ile-Pro-Pro and / or Val-Pro-Pro in the preparation of a product that enhances the mineral supply. 2. Användning enligt patentkrav 1,kännetecknad avatt man använder en produkt som uppvisar en hög hait av de kaseinbaserade smämo-lekylära peptiderna Ile-Pro-Pro och/eller Val-Pro-Pro vid framställning av en produkt som effektiverar tillgodogörandet av mineraler.Use according to claim 1, characterized in that one uses a product which exhibits a high content of the casein-based small-molecule peptides Ile-Pro-Pro and / or Val-Pro-Pro in the preparation of a product which enhances the utilization of minerals. 3. Användning enligt patentkrav 2 av en sadan produkt, som uppvi sar en hög hait av kaseinbaserade smamolekylära peptider och en hög kalci-umhalt och som är framställd genom fermentering av ett kaseinhaltigt ut-gangsämne med en mjölksyrabakterie, vid framställning av en slutprodukt som effektiverar tillgodogörandet av mineraler.Use according to claim 2 of such a product, which exhibits a high content of casein-based smamolecular peptides and a high calcium content, which is prepared by fermentation of a casein-containing starting material with a lactic acid bacterium, in the preparation of a final product which enhances efficacy. the utilization of minerals. 4. Användning enligt patentkrav 3 av en sadan produkt, som uppvi sar en hög hait av kaseinbaserade smamolekylära peptider och en hög kalci-umhalt och som är framställd genom fermentering av ett kaseinhaltigt ut-gängsämne med Lactobacillus he/vef/'cus-stammen LBK-16H, DSM 13137 val-bart genom att helt eller delvis avlägsna kasein och/eller andra mjölkproteiner 20 och/eller laktos och genom att nanofiltrera den erhallna fermenterade produk-ten som innehäller peptider, vid framställning av en produkt som effektiverar ·',, ·* tillgodogörandet av mineraler.Use according to claim 3 of such a product, which exhibits a high content of casein-based smamolecular peptides and a high calcium content, which is prepared by fermentation of a casein-containing precursor with the Lactobacillus he / web / cus strain LBK. -16H, DSM 13137 optionally by removing all or part of casein and / or other milk proteins and / or lactose and by nanofiltering the obtained fermented product containing peptides, in the preparation of a product which enhances efficacy. · * The supply of minerals. ; ' : 5. Användning av en sur komposition som innehäller de kaseinba- serade smamolekylära peptiderna Ile-Pro-Pro och/eller Val-Pro-Pro, mineraler 25 och levande mjölksyrabakterier vid framställning av en produkt som effektive-rar tillgodogörandet av mineraler.; The use of an acidic composition containing the casein-based smamolecular peptides Ile-Pro-Pro and / or Val-Pro-Pro, minerals and live lactic acid bacteria in the preparation of a product that makes the mineral more effective. 6. Användning av en produkt enligt nägot av patentkraven 1-5, ( kännetecknad av att de kaseinbaserade smamolekylära peptiderna om- *,,; fattar en blandning av kortkedjiga peptider.Use of a product according to any one of claims 1-5, characterized in that the casein-based smamolecular peptides comprise a mixture of short chain peptides. 7. Användning av en produkt enligt patentkrav 6, kännetecknad v : av att peptiderna är di- - tetrapeptider.Use of a product according to claim 6, characterized in that the peptides are di-tetrapeptides. 8. Användning enligt patentkrav 7, kännetecknad av att man . använder en produkt med hög Ile-Pro-Pro- och/eller Val-Pro-Pro-halt och hög kalciumhalt. ‘ 35Use according to claim 7, characterized in that one. uses a product with high Ile-Pro-Pro and / or Val-Pro-Pro content and high calcium content. '35 9. Användning enligt nagot av patentkraven 1-5, kännetecknad av att man därigenom effektiverar tillgodogörandet av kalcium.Use according to any one of claims 1-5, characterized in that the utilization of calcium is thereby effected.