FI110660B

FI110660B - Kaseiinihydrolysaatti ja menetelmä tämän kaseiinihydrolysaatin valmistamiseksi

Info

Publication number: FI110660B
Application number: FI942122A
Authority: FI
Inventors: Per Munk Nielsen
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 1991-11-08
Filing date: 1994-05-06
Publication date: 2003-03-14
Also published as: DK0610411T3; CA2123091C; DE69213755D1; EP0610411A1; AU2942392A; WO1993008702A1; US5486461A; KR100259127B1; FI942122A; JP3121014B2; NZ245031A; DE69213755T2; NO317313B1; FI942122A0; ATE142430T1; EP0610411B1; NO941701L; CA2123091A1; JPH07500733A; RU2086143C1

Description

1 110660

Kaseiinihydrolysaatti ja menetelmä tämän kaseiinihydrolysaa-tin valmistamiseksi 5 Keksintö käsittää kaseiinihydrolysaatin ja menetelmän tämän kaseiinihydrolysaatin valmistamiseksi.

Kaseiinihydrolysaatteja käytetään pääasiassa ainesosina vau-vanruuassa ja useat erilaiset kaseiinihydrolysaatit ja mene-10 telmät kaseiinihydrolysaattien valmistamiseksi ovat tunnet tuja. Ainakin neljällä kaseiinihydrolysaatteja ja niiden valmistusmenetelmiä koskevalla osatekijällä on tärkeä merkitys mahdollisimman hyvän lopputuloksen saavuttamiselle, ja nämä ovat 1) menetelmällä saavutettava suuri DH-arvo (hydro-15 lysoitumisaste), jonka vaikutuksesta tuotteen peptidit ovat lyhyehköjä ja sen allergeenisyys on vähäinen, 2) tuotteen pieni vapaiden aminohappojen pitoisuus, minkä vaikutuksesta osmolaalisuus on vähäinen, mikä on edullista käytettäessä tuotetta ruokavaliossa, 3) pieni kitkeryys ja 4) suuri saan-2 0 to.

Useita kaseiinihydrolysaatin valmistusmenetelmiä, joilla saadaan aikaan hyvät organoleptiset ominaisuudet, on mahdol-lista käyttää vain niin, että saanto jää pieneksi. Tämä ··· 25 merkitsee yleisemmin tarkasteltuna sitä, että optimaaliseen : tasapainoon pääseminen edellä mainittujen neljän osatekijän t · välillä on vaikeaa. Tämän keksinnön tarkoituksena onkin Y. saattaa käyttöön ominaisuuksiltaan optimaalinen kaseiini hydrolysaatti sekä tämän kaseiinihydrolysaatin valmistusme-30 netelmä, toisin sanoen kaseiinihydrolysaatti, jonka DH-arvo '· on suuri, vapaiden aminohappojen pitoisuus pieni, kitkeryys · « « vähäistä ja saanto suuri.

,···. Tämän keksinnön mukaisesti on tehty se hämmäs- 35 tyttävä löytö, että tietyllä erityisten entsyymien ja sellaisen hydrolyysin, jossa pH: ta ei säädetä '’* vakioarvoon (non-pH-stat), yhdistelmällä saadaan käyttöön 2 11C660 kaseiinihydrolysaatin valmistusmenetelmä, jossa vallitsee optimaalinen tasapaino DH:n, vapaiden aminohappojen, kitkeryyden ja saannon välillä.

5 Tämän keksinnön mukaisessa kaseiinihydrolysaatissa ei ole lainkaan hydrolysoitumatonta kaseiinia ja sille on ominaista, että kaseiinihydrolysaatti on täydellisesti liukoinen tai lähes täydellisesti liukoinen vesipitoiseen mediumiin, että sen pH-arvo on alueella 3,5 - 7,0, että sen organo-10 leptinen laatu on hyvä, että se sisältää peptidejä, joiden suhteelliset määrät vastaavat seuraavan luettelon mukaista suhteellisten moolimassojen jakautumaa (MW on suhteellisen moolimassan lyhenne)

Paino-% 15 MW > 5 000 0 -1 5 000 > MW > 1 500 15 - 35 1 500 > MW > 500 40 - 60 500 > MW 15 - 35 20 ja että vapaiden aminohappojen määrä on alle 10 % ja luku- :··| keskimääräinen suhteellinen moolimassa (Mn) on 400 - 650.

·;··· Proteiinihydrolysaateissa olevien peptidien MW-jakautuma .·. : määritetään seuraavasti.

* _; 2 5 ‘1!! 1. Periaate Näyte laimennetaan, suodatetaan ja ruiskutetaan geeli-kromatografisessa (GPC) toimintamuodossa käytettävään neste-kromatografiajärjestelmään. Tämä erotusmenetelmä perustuu 30 siihen, että siinä käytetään nesteen kulkeutumista sellai- silla huokoisilla partikkeleilla täytetyn pylvään läpi, : : : joissa olevien huokosten läpimitta on tarkkaan rajattu.

; V Suhteelliselta moolimassaltaan erisuuruisia peptidejä sisäl- tävän liuoksen kulkeutuessa pylvään läpi kykenevät pienet ’;’35 peptidit kulkeutumaan huokosiin, kun taas näitä suuremmat

i » I

3 110660 peptidit eivät kykene tähän. Liuoksessa olevat peptidit erottuvat siten molekyylin koon (ja suhteellisen moolimassan) mukaisesti, koska suuremmat peptidit eluoituvat pylväästä pienempiä peptidejä nopeammin. Pylväästä ulos 5 tulevaa nestettä tarkkaillaan jatkuvasti pylvään ulostulon kohdalla olevalla detektorilla. Kromatografiajärjestelmä kalibrioidaan peptideillä, joiden suhteellinen moolimassa on tunnettu.

10 2. Kromatografialaitteisto 2.1 HPLC-järjestelmä, jonka osat ovat

Korkeapainepumppu, Waters M 510, virtausnopeus 0,7 ml minuutissa

Injektori, Waters WISP M 710 15 Detektori, Waters M 440, varustettuna lisälaitteella, joka laajentaa aallonpituusalueen 214 nm:ään.

2.2 GPC-pylväs, 3 x TSK G 2000 SWXL, 7,8 mm x 300 mm, peräkkäin yhdistettynä, jota käytetään ympäristön lämpötilassa.

20 2.3 Integrointi/tulostenkäsittely, Waters 820 MAXIMA SIM -kromatografinen tietojenkäsittelyjärjestelmä, joka on . . varustettu 810/820 GPC -yksiköllä.

'· *:25 3. Reagenssit * · 3.1 Fosfaattipuskuri NaH2P04 -2 H20 3.2 Ammoniumkloridi NH4C1

3.3 Trifluorietikkahappo (TFA) , CF3COOH

3.4 Asetonitriili, CH3CN

30 3.5 Liikkuva faasi: 0,05-molaarinen fosfaattipuskuri/0,5- molaarinen ammoniumkloridiliuos, joka sisältää 0,1 % TFA:ta ja 25 % asetonitriiliä.

’/.! 4. Kuvaus ’.35 4.1 Kalibrointi | Kromatografiajärjestelmä kalibroidaan ruiskuttamalla järjes- : : telmään useita peptidistandardeja, joiden suhteelliset * » > 4 110660 moolimassat ovat tunnettuja. Kunkin standardin suhteellinen moolimassa merkitään puolilogaritmiseen kuvaajaan kohtaan, joka vastaa sitä havaittua liikkuvan faasin tilavuutta, joka tarvittiin peptidin eluoimiseen pylväästä. Havainto-5 pisteisiin parhaiten sopiva kolmannen kertaluokan polynomi määritetään pienimmän neliösumman menetelmällä. Tämä käyrä on kalibrointikäyrä.

4.2 Analyysi 10 Näyte laimennetaan/1luotetaan liikkuvaan faasiin siten, että sen konsentraatioksi saadaan noin 5 mg/ml. Liuos suodatetaan 22 μτη suodattimen läpi ja sitä injektoidaan 20 μΐ kromato-grafialaitteeseen. Detektorivastetta eluutiotilavuuden suhteen seurataan piirturilla. Piirturin käyrä - kromato-15 grammi - esittää näytteen todellisen MW-jakautuman. Jotta kromatogrammista voitaisiin laskea kertynyt massajakautuma ja keskimääräinen suhteellinen moolimassa, se jaetaan pieniin segmentteihin aikaa (ja eluutiotilavuutta) esittävällä akselilla ja kutakin segmenttiä kuvaa sen eluutiotilavuus ja 20 sen ala kromatogrammista tällä aikavälillä.

5. Laskutoimitukset . Tulokset on esitetty paino- ja lukukeskimääräisinä suhteel- 1 I lisinä moolimassoina.

f · t '· ‘25 .1· : fr = Σι ‘ Mw, j) pj- = _ ** ^ SiAi ' n Σ±(Ά± /K,,) * 1 1 • ti1

Mw: Painokeskimääräinen suhteellinen moolimassa Mn: Lukukeskimääräinen suhteellinen moolimassa

t t I

· Ä£: Kutakin segmenttiä vastaava kromatogrammin ala, joka on määritetty kertyneenä detektorivasteena kunkin ajanjakson aikana.

5 110660 5 M^ i; Kutakin segmenttiä vastaava suhteellinen moolimassa.

Arvo lasketaan kalibrointikäyrän avulla käyttäen keskimääräistä eluutiotilavuutta ajanjakson aikana.

Tämän keksinnön mukaisen kaseiinihydrolysaatin edulliselle 10 sovellutusmuodolle on tunnusomaista, että kaseiinihydroly- saatti on valmistettu renniinillä saostetusta kaseiinista ja että se sisältää peptidejä, joiden suhteelliset määrät vastaavat seuraavaa MW-jakautumaa (MW on suhteellista moolimassaa vastaava lyhenne):

Paino-% MW > 5 000 0 - 0,2 MW > 3 000 < 5 5 000 > MW > 1 500 15 - 35 1 500 > MW > 500 40 - 60 ·. : 500 > MW 15-35 15 ;·<· ja vapaiden aminohappojen määrä on alle 10 % ja että luku- : keskimääräinen suhteellinen moolimassa (Mn) on 400 - 650.

Tämän keksinnön mukaisen kaseiinihydrolysaatin tässä sovel-lutusmuodossa hydrolysaatin suhteellinen moolimassa on 20 erilainen, koska se sisältää suhteellisen pienen määrän pitkiä peptidejä. Suhteelliselta moolimassaltaan suurien » » · ’· peptidien puuttuminen vähentää antigeenisyyttä. Tämä tulos * · · ...” on hyvin tärkeä ajatellen renniinikaseiinista peräisin ··· olevan hydrolysaatin käyttöä ainesosana äidinmaidon- 25 vastikkeissa, joiden antigeenisyyden halutaan olevan vähäi nen. Tämä parantaa myös sulavuutta, mikä johdosta tuotteilla on pienempi taipumus aiheuttaa koliikkia. Tämä kek-' · sintö käsittää siten myös vauvanruokaformulaation tai äidin- maidonvastikkeen, joka sisältää tämän sovellutusmuodon tämän keksinnön mukaisesta kaseiinihydrolysaatista.

Tämän keksinnön mukaisen kaseiinihydrolysaatin edulliselle 5 sovellutusmuodolle on tunnusomaista, että kaseiini- hydrolysaatti liukenee täydellisesti vesipitoiseen mediumiin, jonka pH-arvo on pH-alueella 3,5 - 7,0. Koska kaseiinihydrolysaatti liukenee täydellisesti, se soveltuu erittäin hyvin ruokavaliossa käytettävän ravinnon aines-10 osaksi. Tämä keksintö käsittää lisäksi myös ruokavalio- formulaation, joka liukenee täydellisesti, jonka pysyvyys esitetyissä matalissa pH-arvoissa on hyvä ja jossa tämän keksinnön mukaisen kaseiinihydrolysaatin tätä sovellutus-muotoa käytetään proteiinilähteenä. Tällainen täysin liukoi-15 nen ruokavaliotormulaatio, joka perustuu tämän keksinnön mukaisen kaseiinihydrolysaatin tähän sovellutusmuotoon, estää varsinkin tavallisissa letkuruokintatuotteissa ongelman muodostavan hyytymisen mahassa.

20 Tämän keksinnön mukaiselle kaseiinihydrolysaatin valmistusmenetelmälle on myös tunnusomaista, että 1) kaseiini tai kaseinaatti, jossa on ainakin 85 % proteii- ·.’·· neja kuiva-aineena laskettuna, suspendoidaan/1 luotetaan vesipitoiseen mediumiin liuokseksi, jonka proteiinipitoisuus ·; ·:25 on korkeintaan noin 20 % ja edullisesti korkeintaan 10 %, 2) että vaiheesta 1) peräisin oleva suspensio/liuos hydro- .:. lysoidaan yksivaiheisessa reaktiossa proteolyyttisesti DH-arvoon 15 - 35 %, ja edullisesti arvoon 22 - 28 % kolmella ryhmällä proteaaseja, jotka ovat 30 1) Bacilluksesta peräisin oleva yksi tai useampi neutraali endoproteaasi, jonka konsentraatio on ainakin 0,005 Anson-yksikköä 100 grammassa proteiinia, 2) Bacilluksesta peräisin oleva yksi tai useampi alkalinen : endoproteaasi, jonka konsentraatio on ainakin 0,005 Anson- : .‘35 yksikköä 100 grammassa proteiinia, ja ,···, 3) Aspergilluksesta peräisin oleva yksi tai useampi ekso- proteaasi, jonka konsentraatio vastaa arvoa, joka on ainakin 7 110660 1 000 peptidaasiyksikköä 100 grammassa proteiinia lämpötilassa, joka on alueella 45 - 60°C, menetelmällä, jossa pH:ta ei säädetä vakioarvoon, 3) että hydrolyysi lopetetaan inaktivoimalla entsyymit ja 5 4) että vaiheesta 3 peräisin oleva effluentti muunnetaan kuivaan muotoon.

Julkaisussa US 3 761 353 on kuvattu proteiinihydrolysaatti, jonka ollessa kyseessä raakamateriaalina voidaan käyttää 10 maitoproteiinia. Tämän proteiinihydrolysaatin valmistuksessa saatava saanto on pienempi kuin tämän keksinnön mukaisella menetelmällä. Tässä tekniikan tason mukaisessa menetelmässä ei myöskään käytetä samaa proteolyyttisten entsyymien yhdistelmää kuin tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä.

15

Julkaisussa EP 3 84 303 on kuvattu menetelmää sellaisen proteiinihydrolysaatin valmistamiseksi, joka voi olla kaseiini-hydrolysaatti. Vaikkakin tämän kaseiinihydrolysaatin kitkeryys on pieni, on esitetty, että DH:n arvo on suuruusluokkaa 20 4,4 %, kun taas tämän keksinnön mukaisen menetelmän ollessa kyseessä DH on 15 - 35 %. Myös pH säilytetään hydrolyysin aikana vakiona, mikä käy ilmi sivun 6 riviltä 35, kun taas ,’·· tämän keksinnön mukainen hydrolyysi suoritetaan reaktiona, !/·· jossa pH: ta ei säädetä vakioarvoon.

:*·: 25

Julkaisussa EP 223 560 on kuvattu peräkkäiseen hydrolyysiin perustuva menetelmä sellaisen proteiinihydrolysaatin valmis-tautiseksi, joka voi olla kaseiinihydrolysaatti. Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävä hydrolyysi on . 30 yksivaiheinen reaktio, eikä tässä tekniikan tason mukaisessa • · lii menetelmässä myöskään ole kuvattu sitä nimenomaista proteolyyttisten entsyymien yhdistelmää, jota käytetään tämän ·:* keksinnön mukaisessa menetelmässä. 1

Julkaisussa US 4 600 588 on kuvattu maitoproteiini- ·’·’ hydrolysaatti, joka valmistetaan toisella proteolyyttisten entsyymien yhdistelmällä kuin tämän keksinnön mukaisessa a 110660 menetelmässä käytetty proteolyyttisten entsyymien yhdistelmä. Tätä tekniikan tason mukaista maitoproteiinihydro-lysaattia käytetään myös emulgaattorina, kun taas tämän keksinnön mukaista kaseiinihydrolysaattia käytetään elin-5 tarvikelisäaineena.

On selvää, että termiin "Bacilluksesta peräisin oleva neutraali endoproteaasi" kuuluu mikä tahansa Bacilluksen tuottama neutraali endoproteaasi sekä proteaasit, jotka ovat 10 samanlaisia kuin tähän entsyymiryhmään kuuluvat entsyymit ja jotka on tuotettu kloonaamalla muissa isännissä. Tätä tulkintaa on myös käytettävä silloin, kun kyseessä ovat saman-tyyppiset termit, esimerkiksi termi "Aspergilluksesta peräisin oleva eksoproteaasi".

15

Tyypillinen esimerkki Bacilluksesta peräisin olevasta neutraalista endoproteaasista on Novo Nordisk A/S -yhtiön tuottama Neutrase®, tyypillisiä esimerkkejä Bacilluksesta peräisin olevista aikalisistä endoproteaaseista ovat Novo Nordisk 20 A/S -yhtiön tuottamat Alcalase®, Esperase® ja Savinase®, ja tyypillinen esimerkki Aspergilluksesta peräisin olevasta eksoproteaasista on Novo Nordisk A/S -yhtiön tuottama Novo-U zym® 515 .

':··:25 Näiden kolmen entsyymin konsentraatioille ei ole esitetty mitään ylärajaa, mutta on selvää, että ylärajat muodostuvat • j. sen perusteella, että ei ole haluttua käyttää sellaista .·;·. entsyymimäärää, joka heikentää tuotteen organoleptisiä ominaisuuksia tai jolla menetelmästä tulee taloudellisesti 30 epäedullinen.

Tämän keksinnön mukaisen menetelmän ollessa kyseessä voidaan ··· organoleptisten ominaisuuksien parantamiseksi suorittaa ’ hiilikäsittely. Tämä hiilikäsittely voidaan suorittaa eril- : .‘35 lisenä vaiheena tai jonkin olemassa olevan vaiheen yhteydes- .···. sä. Mikäli menetelmässä käytetään ultrasuodatusta, voidaan • · hiili lisätä missä tahansa valitussa vaiheessa ennen ultra- 9 110660 suodatusta, ja käytetty hiili erottuu automaattisesti reaktioseoksesta ultrasuodatusvaiheessa, koska haluttu tuote on permeaatti. Mikäli ei suoriteta ultrasuodatusta, on hiilikäsittely tehtävä erillisenä vaiheena.

5

Entsyymit (vaihe 3) voidaan inaktivoida alentamalla pH-arvoa, joka alennetaan edullisesti suunnilleen arvoon 4,5, minkä johdosta lopputuote soveltuu suoraan lisäaineeksi virkistysjuomaan, esimerkiksi appelsiinimehuun, ja/tai 10 entsyymit voidaan inaktivoida kohottamalla lämpötilaa.

Mikäli entsyymit inaktivoidaan pH-arvoa alentamalla, on organoleptisten ominaisuuksien parantamiseksi suoritettava hiilikäsittely havaittu tarpeettomaksi.

15 Tämän keksinnön mukaisen menetelmän edulliselle sovellutus-muodolle on tunnusomaista, että vaiheen 2 kolme proteaasiryhmää ovat 1) Bacillus subtiliksen yksi tai useampi neutraali endo-proteaasi, 20 2) Bacillus licheniformiksen yksi tai useampi alkalinen endoproteaasi ja 3) Aspergillus oryzaen yksi tai useampi eksoproteaasi.

: On havaittu, että tämän sovellutusmuodon mukaisesti tuotetun • :--:25 kaseiinihydrolysaatin organoleptiset ominaisuudet ovat erinomaiset.

Tämän keksinnön mukaisen menetelmän edulliselle sovellutus-muodolle on tunnusomaista, että vaiheesta 2) peräkin oleva 30 seos erotetaan ultrasuodatus/mikrosuodatuslaitteessa ennen vaiheessa 3) olevan hydrolyysin lopettamista tai vaiheessa 3) olevan hydrolyysin lopettamisen jälkeen, ja permeaatti muodostaa kaseiinihydrolysaatin. Näin menetellen saadaan ‘ valmistettua täydellisesti liukenevaa kaseiini- : .-35 hydrolysaattia. Koska ultrasuodatusmembraanit, joiden .···. päästöraja on alle 5 000, ovat hyvin harvinaisia ja koska ’·'· ainoastaan 1 % kaseiinihydrolysaatista ylittää MW-arvon 110660 10 5000, ei tässä sovellutusmuodossa käytetyn ultrasuodatus-membraanin päästörajalla ole periaatteessa mitään merkitystä. Tätä arvoa suuremmat päästörajan arvot ovat kuitenkin suuremman virtauksen johdosta edullisia.

5 Tämän keksinnön mukaisen menetelmän edulliselle sovellutus-muodolle on tunnusomaista, että hydrolyysivaihe 2) jää alle 6 tunnin pituiseksi. Tässä sovellutusmuodossa ei ole tarpeellista esikäsitellä raakamateriaalia mikrobiologisen 10 pysyvyyden aikaansaamiseksi.

Tämän keksinnön mukaisen menetelmän edulliselle sovellutus-muodolle on ominaista, että entsyymit inaktivoidaan käsittelemällä niitä elintarvikelaatuluokkaa olevalla hapolla, 15 edullisesti suolahapolla tai sitruunahapolla. Tämä sovellu- tusmuoto on yksinkertainen eikä siinä tarvitse käyttää puhdistustarkoituksiin soveltuvaa hiiltä ja sillä voidaan myös tuottaa tuote, jonka pH-arvo veteen liuotettuna on mikä tahansa välillä 3,5 - 7,0 oleva arvo.

20 Tämän keksinnön mukaisen menetelmän edulliselle sovellus-muodolle on ominaista, että entsyymit inaktivoidaan lämpö-·.’·: käsittelyllä ja että vaiheesta 3 peräisin oleva effluentti käsitellään aktiivihiilellä, joka myöhemmässä vaiheessa *: * * :25 erotetaan, kun taas vaiheena 4 muutetaan vaiheesta 3 saatu f·.· effluentti, joka ei enää sisällä aktiivihiiltä, kuivaan olomuotoon. Tämä kaseiinihydrolysaatti soveltuu erityisen hyvin ainesosaksi vauvanruokaan.

30 Tämän keksinnön mukaisen menetelmän edulliselle sovellutus- muodolle on ominaista, että vaiheessa 4 käytetään hyper-suodatuksen ja/tai haihdutuksen sisältävää yhdistelmää, minkä jälkeen tuote sumutuskuivataan. Hypersuodatus on ·.· halvin keino tuotteen konsentroimiseksi arvoon 20 - 30 "B ja : .*35 sillä voidaan myös poistaa haitallisia suoloja. Sumutus-,···, kuivatuksesta saadaan helposti käsiteltävä lopputuote.

,, 110660 Tämän keksinnön mukaiselle edulliselle sovellutusmuodolle on ominaista, että lähtömateriaalina käytetään hapolla saostet-tua kaseiinia, ja että tämä liuotetaan emäksellä. Tässä sovellutusmuodossa käytetään halvinta käytettävissä olevaa 5 raakamateriaalia.

Tämän keksinnön mukaiselle edulliselle sovellutusmuodolle on ominaista, että saostettu kaseiini liuotetaan Ca(OH)2:n avulla. Tästä sovellutusmuodosta saadaan kaseiini-10 hydrolysaattilopputuote, jonka organoleptiset ominaisuudet ovat erinomaiset.

Tämän keksinnön mukaisen menetelmän edulliselle sovellutus-muodolle on ominaista, että siinä käytetään lähtö-15 materiaalina renniinillä saostettua kaseiinia ja että tämä liuotetaan natriumfosfaatilla tai natriumkarbonaatilla. Tässä sovellutusmuodossa hydrolysaatin suhteellinen moolimassa on erilainen, koska se sisältää suhteellisen pienen määrän pitkiä peptidejä. Tämä tulos on hyvin tärkeä ajatel-20 Ien renniinikaseiinista peräisin olevan hydrolysaatin käyttämistä ainesosana äidinmaidonvastikkeissa, joiden anti- geenisyyden halutaan olevan pieni. On havaittu, että loppu-*· "· tuotteen suhteellisen moolimassan jakautuma on seuraava.

Paino-% ;\25 MW > 5 000 0 - 0,2 ..il' MW > 3 000 < 5 5 000 > MW > 1 500 15 - 35 1 500 > MW > 500 40 - 60 500 > MW 15 - 35 ..;: ‘3 0 ja vapaiden aminohappojen määrä on alle 10 % ja luku-: ,·. keskimääräinen suhteellinen moolimassa (Mn) on 400 - 650.

Tämän keksinnön mukaiselle edulliselle sovellutusmuodolle on :.:.35 tunnusomaista, että renniinillä saostettu kaseiini liuote- i2 110660 taan natriumfosfaatilla tai natriumkarbonaatilla. Tässä sovellutusmuodossa saadaan hydrolyysi tapahtumaan nopeasti ja sillä saadaan suuri saanto. Tätä keksintöä kuvataan käyttäen seuraavia esimerkkejä.

5

Esimerkki 1

Hydrolyysin raakamateriaali oli MD-Foods Denmark -yhtiöstä saatua Ca-kaseinaattia (Miprodan 40), joka sisälsi noin 87 % proteiinia. Tämä kaseinaatti suspendoitiin deionisoituun 10 veteen 8-prosenttiseen proteiinikonsentraatioon 50 °C:ssa.

Tämän tuloksena saatiin seuraavat pH-, osmolaalisuus- ja Brix-arvot: pH = 6,96, osmolaalisuus = 24 mOsm/kg ja ”Brix =7,20. Seokseen lisätyt entsyymit olivat: -Neutrase® 0.5L, jonka määrä oli 2 % proteiinista 15 -Alcalase® 2.4L, jonka määrä oli 0,5 % proteiinista -Novozym® 515, jonka määrä oli 0,8 % proteiinista.

Hydrolyysi suoritettiin 6 tunnin aikana 50 °C:ssa seuraten pH- osmolaalisuus- ja Brix-arvoja. Hydrolyysin päättyessä pH 20 oli 5,91, osmolaalisuus 222 mOsm/kg, Brix 12,00 °B ja DH

26,2 %. Hydrolyysi lopetettiin kuumentamalla seosta 3 minuuttia 85°C:ssa.

Hydrolyysiseos erotettiin käyttäen PCI-ultrasuodatus-....:25 laitteistoa, johon oli asetettu FPlOO-membraanit (päästö- _·. ; rajan MW = 100 000) . UF:n jälkeen saatu saanto oli > 93 % raakamateriaalin proteiinimäärän perusteella ilmoitettuna.

i i < *;;; Lopputuote konsentroitiin PCI-nanosuodatuslaitteen avulla, johon oli asettu AFC30-membraanit. Kokonaissaanto tämän 30 valmistusvaiheen jälkeen oli 90,7 %. Konsentraatti sumutus- kuivattiin.

·.· Saatu tuote oli täysin liukoinen jauhe, joka sisälsi 91 % kuiva-ainetta ja jonka suhteellisten moolimassojen jakauma .'.55 oli kuvion 1 mukainen. Keskimääräinen Mn = 516. Vapaat aminohapot = 7 %. Tuote oli täysin liukoinen pH-alueella 13 110660 3,5 - 7,0. Tuotteen 5-prosenttisen liuoksen pH-arvo oli 6,45.

Esimerkki 2 5 Hydrolyysiin käytetty raakamateriaali oli MD-Foods Denmark -yhtiöstä saatua Ca-kaseinaattia (Miprodan 40), joka sisälsi noin 87 % proteiinia. Kaseinaatti suspendoitiin 8-prosentti-seen proteiinikonsentraatioon deionisoituun veteen, jonka lämpötila oli 50 °C. Tuotteesta otettiin pH-, osmolaalisuus-10 ja Brix-lukemat: pH = 6,96, osmolaalisuus = 24 mOsm/kg ja °Brix = 7,20. Seokseen lisätyt entsyymit olivat: - Neutrase® 0.5L, jonka määrä oli 2,0 % proteiinista - Alcalase® 2.4L, jonka määrä oli 0,5 % proteiinista - Novozym® 515, jonka määrä oli 0,8 % proteiinista 15

Seosta hydrolysoitiin 6 tuntia 50 °C:ssa seuraten sen pH:ta, osmolaalisuutta ja Brix-arvoa. Hydrolyysin päätyttyä pH oli 5,91, osmolaalisuus 222 mOsm/kg, Brix-arvo li 12,00 °B ja DH

26,2 %. Hydrolyysi lopetettiin 3 minuutin pituisella lämpö-20 käsittelyllä 85 °C:ssa. Seokseen lisättiin aktiivihiiltä (Picatif 120 EW) käyttäen annoksena 4 % °B:stä.

• *

Hydrolyysi seos erotettiin PCI-ultrasuodatuslaitteistolla, : *.· joka oli varustettu FPlOO-membraaneilla (päästörajan MW oli *: * * *2 5 100 000) UF:n jälkeen saatu saanto oli >93 % raaka- ;'.J materiaalissa olleen proteiinin perusteella ilmoitettuna.

Tuote konsentroitiin PCI-nanosuodatuslaitteistolla, joka oli varustettu ACF30-membraaneilla. Kokonaissaanto tämän valmistusvaiheen jälkeen oli 90,7 %. Konsentraatti sumutus-30 kuivattiin.

Saatu tuote oli täydellisesti liukeneva jauhe, joka sisälsi kuiva-aineesta 91 % proteiinia ja jonka suhteellisten mooli- » * » massojen jakautuma oli kuvion 2 mukainen. Keskimääräinen Mn • * : /35 = 564. Vapaat aminohapot = 7 %. Tämän tuotteen makua kuvat- /·· tiin miedommaksi kuin esimerkistä 1 saadun tuotteen maku.

» » I

* I

» « 14 110660

Tuote on täysin liukoinen pH-alueella 3,5 - 7,0. Tuotteen 5- prosenttisessa liuoksessa oleva pH oli 6,38.

Esimerkki 3 5 Hydrolyysiin käytetty raakamateriaali oli MD-Foods Denmark -yhtiöstä saatua renniinikaseinaattia (Miprodan 26) , joka sisälsi noin 87 % proteiinia. Kaseiini suspendoitiin de-ionisoituun veteen 8-prosenttiseen proteiinikonsentraatioon 75 °C:ssa. Seokseen lisättiin kaseiinin solubilisoimiseksi 10 2 % dinatriumdifosfaattia ja 1 % mononatriumdifosfaattia proteiinin määrän perusteella ilmoitettuna. Materiaali solubilisoitui täydellisesti 60 minuutissa. Seos jäähdytettiin 50 °C:een. Tuotteesta otettiin pH-, osmolaalisuus- ja Brix-lukemat: pH = 6,95, osmolaalisuus = 40 mOsm/kg ja 15 °Brix = 11,4. Seokseen lisätyt entsyymit olivat: - Neutrase® 0.5L, jonka määrä oli 2,0 % proteiinista - Alcalase® 2.4L, jonka määrä oli 0,5 % proteiinista - Novozym® 515, jonka määrä oli 0,5 % proteiinista 20 Seosta hydrolysoitiin 6 tuntia 50 °C:ssa seuraten sen pH:ta, osmolaalisuutta ja Brix-arvoa. Hydrolyysin päätyttyä pH oli 6,15, osmolaalisuus oli 211 mOsm/kg ja Brix-arvo oli :.‘*i 12,00 °B. Hydrolyysi lopetettiin 3 minuutin pituisella lämpökäsittelyllä 85 °C:ssa.

•: * * Ϊ2 5 ;\f Hydrolyysiseos erotettiin PCI-ultrasuodatuslaitteistolla, joka oli varustettu FPlOO-membraaneilla (päästörajan MW oli 100 000). UF:n jälkeen saatu saanto oli >80 % raaka- • * materiaalissa olleen proteiinin perusteella ilmoitettuna. 30 Tuote konsentroitiin PCI-nanosuodatuslaitteistolla, joka oli varustettu ACF30-membraaneilla. Kokonaissaanto tämän valmistusvaiheen jälkeen oli 77,5 %. Konsentraattiin lisät-tiin aktiivihiiltä (Picatif 120EW) käyttäen annoksena 4 % °B:stä, jonka jälkeen tämä suodatettiin tasosuodattimel-: .'35 la ja sumutuskuivattiin.

15

Saatu tuote oli täydellisesti liukeneva jauhe, jclkl^^^iQsi kuiva-aineesta 91,3 % proteiinia ja jonka suhteellisten moolimassojen jakautuma oli kuvion 3 mukainen. Keskimääräinen Mn = 496. Vapaat aminohapot = 5 %. Tämän tuotteen 5 makua kuvattiin vähän aromikkaammaksi kuin esimerkistä 1 saadun tuotteen maku. Tuote on täysin liukoinen pH-alueella 3,5 - 7,0. Tuotteen 5-prosenttisessa liuoksessa oleva pH oli 6,50.

10 Esimerkki 4

Hydrolyysiin käytetty raakamateriaali oli MD-Foods Denmark -yhtiöstä saatua Na-kaseinaattia (Miprodan 30) , joka sisälsi noin 87 % proteiinia. Kaseinaatti suspendoitiin deionisoi-tuun veteen 8-prosenttiseen proteiinikonsentraatioon 15 50 °C:Ssa. Seokseen lisätyt entsyymit olivat: - Neutrase® 0.5L, jonka määrä oli 2,0 % proteiinista - Alcalase® 2.4L, jonka määrä oli 0,5 % proteiinista - Novozym® 515, jonka määrä oli 0,8 % proteiinista 20 Seosta hydrolysoitiin 6 tuntia 50 °C:ssa. Suoritettiin rinnakkainen hydrolyysikoe samoissa olosuhteissa. Ainoa ero oli se, että tässä käytettiin Ca-kaseinaaattia (Miprodan * · 40) . Seoksen maun arviointi hydrolyysin, lämpökäsittelyn ja suodatuksen jälkeen osoitti, että Ca-kaseinaatista valmis-.,..25 tettu hydrolysaatti oli aromiprof iililtaan merkittävästi ,\ . heikompi kuin Na-kaseinaatista valmistettu hydrolysaatti.

t t I I

'!'! Tuote liukeni täydellisesti pH-alueella 3,5 - 7,0.

i » 30 Esimerkki 5

Jotta solubilisoinnin vaikutusta hydrolyysin tehokkuuteen olisi kyetty tutkimaan, verrattiin hydrolysoitumisnopeuksia * renniinikaseiinia raakamateriaalina käyttäen.

:T Hydrolyysiin käytetty raakamateriaali oli MD-Foods Denmark . ’*$5 -yhtiöstä saatua renniinikaseiinia (Miprodan 26) , joka sisälsi noin 87 % proteiinia. Kaseiini suspendoitiin deioni-soituun veteen 8-prosenttiseen proteiinikonsentraatioon 16 110660 75 °C:ssa. Seokseen lisättiin kaseiinin solubilisoimiseksi 2 % dinatriumdifosfaattia ja 1 % mononatriumdifosfaattia proteiinin määrän perusteella ilmoitettuna. Materiaali solubilisoitui täydellisesti 60 minuutissa. Seos jäähdytet-5 tiin 50 °C:een.

Seosta hydrolysoitiin 4 tuntia seuraamalla sen osmolaali-suutta. Rinnakkainen hydrolyysi suoritettiin samoissa olosuhteissa mutta ilman fosfaattia. Hydrolysoitumisnopeus oli 10 merkittävästi pienempi, mikä käy ilmi kuviosta 4. Tämä korreloi myös saannon kohoamiseen, kun renniinikaseiini solubilisoidaan fosfaatilla ennen hydrolysointia.

Esimerkki 6 15 Hydrolyysiin käytetty raakamateriaali oli MD-Foods Denmark -yhtiöstä saatua Ca-kaseinaattia (Miprodan 40), joka sisälsi noin 87 % proteiinia. Kaseinaatti suspendoitiin deionisoi-tuun veteen 8-prosenttiseen proteiinikonsentraatioon 50 °C:ssa. Tuotteesta otettiin pH-, osmolaalisuus- ja Brix-20 lukemat: pH = 6,86, osmolaalisuus = 25 mOsm/kg ja °Brix = 8,40. Seokseen lisätyt entsyymit olivat: - Neutrase® 0.5L, jonka määrä oli 2,0 % proteiinista • » '·/.· - Alcalase® 2.4L, jonka määrä oli 0,5 % proteiinista - Novozym® 515, jonka määrä oli 0,8 % proteiinista •;..25 .*, Seosta hydrolysoitiin 6 tuntia 50 °C:Ssa seuraten sen pH:ta, osmolaalisuutta ja Brix-arvoa. Hydrolyysin päätyttyä pH oli t

5,92, osmolaalisuus 212 mOsm/kg, Brix-arvo 11,40 °B ja DH

* · » * 26,1 %. Hydrolyysi lopetettiin laskemalla pH arvoon 4,5 SOSO prosenttisella HCl:llä, jonka jälkeen suoritettiin 3 minuu tin pituinen lämpökäsittely 75 °C:ssa.

i

Hydrolyysiseos erotettiin PCI-ultrasuodatuslaitteistolla, : : joka oli varustettu FPlOO-membraaneilla (päästörajan MW = ; ’-35 100 000). UF:n jälkeen saatu saanto oli >84,7 % raaka- » * |i!.’ materiaalissa olleen proteiinin perusteella ilmoitettuna.

» Tämä tulos saatiin diafiltraatiota optimoimatta.

» » i i » I * * * I i i 17 110660

Tuote konsentroitiin PCI-nanosuodatuslaitteistolla, joka oli varustettu ACF30-membraaneilla. Kokonaissaanto tämän valmistusvaiheen jälkeen oli 79,7 %. Konsentraatti sumutus-kuivattiin. Saatu tuote oli täydellisesti liukeneva jauhe, 5 joka sisälsi kuiva-aineesta 90 % proteiinia ja jonka suh teellisten moolimassojen jakautuma oli kuvion 5 mukainen. Keskimääräinen Mn = 500. Vapaat aminohapot = 7 %. Tuotteen 5-prosenttisessa liuoksessa oleva pH oli 4,67.

10 Esimerkki 7

Hydrolyysiin käytetty raakamateriaali oli MD-Foods Denmark -yhtiöstä saatua Ca-kaseinaattia (Miprodan 40) , joka sisälsi noin 87 % proteiinia. Kaseinaatti suspendoitiin deionisoi-tuun veteen 8-prosenttiseen proteiinikonsentraatioon 15 50 °C:ssa. Seoksen pH -, osmolaalisuus- ja Brix-lukemat olivat: pH = 6,86, osmolaalisuus = 25 mOsm/kg ja °Brix = 8,40. Seokseen lisätyt entsyymit olivat: - Neutrase® 0.5L, jonka määrä oli 2,0 % proteiinista - Alcalase® 2.4L, jonka määrä oli 0,5 % proteiinista 20 - Novozym® 515, jonka määrä oli 0,8 % proteiinista

Seosta hydrolysoitiin 6 tuntia 50 °C:ssa seuraten sen pH:ta, osmolaalisuutta ja Brix-arvoa. Hydrolyysin päätyttyä pH oli ;·.· 5,92, osmolaalisuus 212 mOsm/kg, Brix-arvo 11,40 °B ja DH

.·. :25 26,1 %. Hydrolyysi lopetettiin alentamalla pH arvoon 4,5 30- prosenttisella HClrllä, jonka jälkeen suoritettiin 3 minuu-. . tin pituinen lämpökäsittely 75 °C:ssa.

·;;; Hydrolyysiseos erotettiin PCI-ultrasuodatuslaitteistolla, '·' ‘30 joka oli varustettu FPlOO-membraaneilla (päästörajan MW-arvo 100 000). UF:n jälkeen saatu saanto oli >84,7 % raaka-materiaalissa olleen proteiinin perusteella ilmoitettuna. Tämä tulos saavutettiin diafiltraatiota optimoimatta.

;";35 Tuote konsentroitiin ACF30-membraaneilla varustetulla PCI- . nanosuodatuslaitteistolla. Kokonaissaanto tämän valmistus- · vaiheen jälkeen oli 79,7 %. Konsentraattiin lisättiin 18 110660 aktiivihiiltä (Picatif 120 EW) käyttäen annoksena 4 % °B:stä, jonka jälkeen tämä suodatettiin tasosuodattimel-la ja sumutuskuivattiin. Saatu tuote oli täydellisesti liukeneva jauhe, joka sisälsi kuiva-aineesta 89,6 % proteii-5 nia ja jonka suhteellisten moolimassojen jakautuma oli kuvion 6 mukainen. Keskimääräinen Mn = 541. Vapaat aminohapot =7 %. Tuotteen 5-prosenttisessa liuoksessa oleva pH oli 4,64. Maun arviointi (kolmiotesti) ei osoittanut merkittävää eroa tämän tuotteen ja edellisestä esimerkistä, jossa 10 ei ollut suoritettu aktiivihiilikäsittelyä, peräisin olevan tuotteen välillä.

Claims

1. Bacillus subtiliksen yksi tai useampi neutraali endopro-teaasi,

1. Kaseiinihydrolysaatti, joka ei sisällä yhtään hydroly-soitumatonta kaseiinia, tunnettu siitä, että kaseiini- 5 hydrolysaatti on täysin liukoinen tai miltei täysin liukoi nen vesipitoiseen mediumiin, jonka pH-arvo on pH-alueella 3,5 - 7,0, sen organoleptinen laatu on hyvä, se sisältää peptidejä, joiden suhteelliset määrät vastaavat MW-jakautumaa (MW on suhteellista moolimassaa tarkoittava lyhenne), 10 joka on: Paino-% MW > 5 000 0-1 5 000 > MW > 1 500 15 - 35 1 500 > MW > 500 40 - 60 500 > MW 15-35 ja vapaiden aminohappojen määrä on alle 10 %, ja lukukeski-määräinen suhteellinen moolimassa (Mn) on 400 - 650. ’ 15

2. Bacillus licheniformiksen yksi tai useampi alkalinen en-doproteaasi ja 5 3) Aspergillus oryzaen yksi tai useampi eksoproteaasi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kaseiinihydrolysaatti, tunnettu siitä, että kaseiinihydrolysaatti on valmistettu ,·. : renniinillä saostetusta kaseiinista ja se sisältää peptide- jä, joiden suhteelliset määrät vastaavat MW-jakautumaa (MW 20 on suhteellista moolimassaa tarkoittava lyhenne), joka on: • · Paino-% MW > 5 000 0 - 0,2 ..'.i* MW > 3 000 < 5 ·;·' 5 000 > MW > 1 500 15 - 35 ν·| 1 500 > MW > 500 40 - 60 » · 500 > MW 15-35 20 110660 ja vapaiden aminohappojen määrä on alle 10 %, ja lukukeski-määräinen suhteellinen moolimassa (Mn) on 400 - 650.

3. Aspergilluksesta peräisin oleva yksi tai useampi eksoproteaasi, jonka konsentraatio vastaa arvoa, joka on ainakin 1 000 peptidaasiyksikköä 100 grammassa proteiinia, 30 lämpötilassa, joka on alueella 45 - 60 °C, menetelmäl lä, jossa pH:ta ei säädetä vakioarvoon, !/.: 3) että hydrolyysi lopetetaan inaktivoimalla entsyymit ja : " 4) että vaiheesta 3 peräisin oleva effluentti muunnetaan • * I i.' kuivaan muotoon. 35

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kaseiinihydrolysaatti, 5 tunnettu siitä, että kaseiinihydrolysaatti on täysin liukoi nen täydellisesti vesipitoiseen mediumiin, jonka pH-arvo on pH-alueella 3,5 - 7,0.

4. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaisen ka- 10 seiinihydrolysaatin valmistamiseksi, tunnettu siitä, 1. että kaseiini tai kaseinaatti, jossa on ainakin 85 % proteiinia kuiva-aineena laskettuna, suspendoidaan/liuotetaan vesipitoiseen mediumiin liuokseksi, jonka proteiinipitoisuus on korkeintaan noin 20 % ja edullisesti korkeintaan 10 %, 15 2) että vaiheesta 1 peräisin oleva suspensio/liuos hydro lysoidaan yksivaiheisessa reaktiossa proteolyyttisesti DH-arvoon 15 - 35 %, ja edullisesti arvoon 22 - 2 8 %, seuraa-vaan kolmeen ryhmään kuuluvien proteaasien avulla, jotka ovat: 20 1) Bacilluksesta peräisin oleva yksi tai useampi neut raali endoproteaasi, jonka konsentraatio on ainakin 0,005 Anson-yksikköä 100 grammassa proteiinia, j 2) Bacilluksesta peräisin oleva yksi tai usempi alkali- . nen endoproteaasi, jonka konsentraatio on ainakin ; 25 0,005 Anson-yksikköä 100 grammassa proteiinia, ja

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu : : siitä, vaiheessa 2 olevat kolme proteaasi-ryhmää ovat: 21 110660

6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheesta 2) peräisin oleva seos erotetaan ultrasuodatus/mikrosuodatuslaitteessa ennen vaiheessa 3) 10 olevan hydrolyysin lopettamista tai vaiheessa 3) olevan hyd- rolyysin lopettamisen jälkeen, ja permeaatti muodostaa kase-iinihydrolysaatin.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 4-6 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että hydrolyysivaiheen 2) kesto on alle 6 tuntia.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 4-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymit inaktivoidaan käsittelemällä 20 niitä elintarvikelaatuluokkaa olevalla hapolla, edullisesti suolahapolla tai sitruunahapolla.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 4-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymit inaktivoidaan lämpökäsitte- 25 lyllä ja että vaiheesta 3) peräisin oleva effluentti käsi tellään aktiivihiilellä, joka erotetaan myöhemmässä vaihees-; sa, minkä jälkeen vaiheena 4) muunnetaan vaiheesta 3) peräi sin oleva effluentti, jossa ei ole aktiivihiiltä, muunnetaan kuivaan tilaan. 30

10. Jonkin patenttivaatimuksen 4-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaihe 4 suoritetaan hypersuodatuksen ja/tai haihdutuksen yhdistelmällä, jonka jälkeen suoritetaan sumutuskuivaus. 35

' ‘ 11. Jonkin patenttivaatimuksen 4-10 mukainen menetelmä pa- tenttivaatimuksen 1 tai 3 mukaisen kaseiinihydrolysaatin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että lähtömateriaalina käy- 22 110660 tetään hapolla saostettua kaseiinia ja että se liuotetaan emäksen avulla.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu 5 siitä, että hapolla saostettu kaseiini liuotetaan Ca(OH)2:ta käyttäen.

13. Jonkin patenttivaatimuksen 4-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtömateriaalina käytetään renniinillä 10 saostettua kaseiinia ja että lähtömateriaali liuotetaan nat- riumfosfaatilla tai natriumkarbonaatilla.