FI110060B

FI110060B - Menetelmä rokotekoostumuksen saamiseksi eläinten rokottamiseksi niiden suojaamiseksi BHV-1-virusta vastaan

Info

Publication number: FI110060B
Application number: FI935459A
Authority: FI
Inventors: Roger Kamiel Maes; Franciscus Antonius Rijsewijk; Oirschot Johannes Theodoru Van
Original assignee: Stichting Centr Diergeneeskund
Priority date: 1991-06-07
Filing date: 1993-12-07
Publication date: 2002-11-29
Also published as: EP0587805A1; US5789177A; RU2170254C2; WO1992021751A1; SK280862B6; JP4486055B2; DE69214146T3; EP0587805B2; KR100293761B1; AU2275092A; SK137593A3; GR3022138T3; FI935459A; ATE143412T1; HU219602B; JP2006296426A; US6403097B1; NL9100989A; CA2110519A1; DE69214146T2

Description

110060

Menetelmä rokotekoostumuksen saamiseksi eläinten rokottamiseksi niiden suojaamiseksi BHV-l-virusta vastaan 5 Keksinnön ala

Keksintö koskee patageenien aiheuttamiin sairauksiin liittyvää rokottamista, ja siinä käytetään sekä klassisia menetelmiä elävän, heikennetyn rokotteen tai inaktivoidun rokotteen valmistamiseksi että uusia, DNA-rekombinaatio-10 teknologiaan liittyviä menetelmiä.

Keksintö koskee erityisesti elävien heikennettyjen rokotteiden ja inaktivoitujen rokotteiden valmistamista eläinten, erityisesti nautaeläinten, suojaamiseksi naudan herpesvirus 1-tyyppiä (BHV-1) vastaan, jolloin nämä 15 rokotteet on suunniteltu sellaisiksi, että ne eivät ainoastaan ole turvallisia ja tehokkaita vaan myös tarjoavat mahdollisuuden erottaa rokotettujen eläinten joukosta tartunnan saaneet niistä, jotka eivät ole saaneet tartuntaa.

Keksinnön tausta 20 BHV-1, mukaan lukien naudan turvan limakalvojen ja henkitorven tulehdusta (rhinotracheitis) aiheuttava tarttuva virus (IBRV) ja märkivää emätintulehdusta (pustular vulvovaginitis) aiheuttava tarttuva virus (IPVV), on tärkeä tekijä nautaeläinten hengityselinten sairauksien ja 25 hedelmällisyyshäiriöiden kehittymisessä. Akuutin infektion jälkeen BHV-1 jää v usein kantajan elimistöön piilevässä muodossa. Piilevä virus voi aktivoitua uudelleen mm. rasituksen vaikutuksesta - mihin mahdollisesti liittyy tai ei liity kliinisiä oireita - ja lopulta poistua eritteenä. Tästä syystä tartunnan saaneita eläimiä on pidettävä mahdollisina elinikäisinä BHV-1 :n levittäjinä. BHV-l:ä 30 esiintyy kotoperäisesti noin 75 %:ssa hollantilaisia karjatiloja. Erityisesti vanhemmat karjat ovat serologisesti positiivisia.

’ Saatavilla on useita inaktivoituja ("kuolleita") rokotteita ja useita heikennettyjä ("eläviä") rokotteita BHV-1-infektiota vastaan. Inaktivoituja rokotteita 35 valmistetaan tappamalla BHV-1-virus esimerkiksi lämpökäsittelyn, \ säteilytyksen tai etanoli- tai formaliinikäsittelyn avulla. Näin aikaansaatu suoja on kuitenkin usein riittämätön. Heikennettyjä rokotteita valmistetaan suurella 2 110060 määrällä kulkuja homologisissa (naudan) tai heterologisissa, kuten sian tai koiran, soluissa, ja toisinaan viruksia käsitellään tällöin myös fysikaalisesti tai kemiallisesti. Tällä tavoin viruksen perimässä kehittyy tuntemattomia mutaatioita/häviämiä, jotka usein vähentävät viruksen tautia-5 aiheuttavia ominaisuuksia. Heikennetyt elävät rokotteet antavat paremman suojan kuin inaktivoidut rokotteet, mm. sen vuoksi, että ne tuovat enemmän virusantigeenejä kantajan immuunijärjestelmään. Elävien rokotteiden toinen tärkeä etu on se, että ne voidaan antaa nenänsisäisesti eli siihen kohtaan, jossa villit virustyypit ensiksi lisääntyvät tartunnan jälkeen. Kuitenkin elävissä 10 rokotteissa on parantamisen varaa. Jotkin elävät rokotteet ovat ilmeisesti säilyttäneet sikiökuolemia aiheuttavan ominaisuutensa, mikä havaitaan erityisesti lihakseen ruiskutetuissa rokotteissa. Todennäköisesti myös kaikki elävät rokotteet pysyvät piilevinä rokotetussa lehmässä. Lisäksi on olemassa mahdollisuus, että jos rokote eroaa ainoastaan vähän villistä virustyyppistä, 15 tapahtuu tautia aiheuttavien ominaisuuksien palautuminen.

Kuitenkin yksi vaikeimmista ongelmista on se, että BHV-1-rokotteet eivät voi estää villien virustyyppien aiheuttamaa tartuntaa. Tästä on seurauksena, että rokotettu karja voi myös levittää villiä BHV-1-virustyyppiä.

20 BHV-1-viruksen saamiseksi hallintaan on välttämätöntä saada aikaan tehokas ja turvallinen rokote, joka voidaan erottaa villistä virustyypistä, koska : käyttämällä tehokasta rokotetta voidaan vähentää BHV-1 :n kiertoa ... huomattavasti, ja testi, jolla voidaan erottaa rokote ja villi virustyyppi, : . 25 mahdollistaa tartunnan saaneiden eläinten löytämisen (ja sitten poistamisen) y V rokotetusta karjasta.

’·’ Aikaisemmin on kehitetty BHV-1-rokotteita, jotka vaikuttavat turvallisemmilta kuin perinteiset rokotteet ja jotka voidaan erottaa villistä 30 virustyypistä. On eristetty tymidiinikinaasi-häviämämutantti, joka aiheuttaa vähemmän sikiökuolemia, tulee harvemmin piileväksi eikä voi tulla uudelleen aktiiviseksi. Lisäksi DNA-rekombinaatiotekniikalla on rakennettu BHV-1-: " rokote, jossa on glykoproteiinin gill geenin kohdalla häviämä, jolloin tämä rokote voidaan erottaa villistä BHV-1-virustyypistä serologisin menetelmin.

35 Näitä rokotteita vastaan on kuitenkin tiettyjä näkökohtia. Toisaalta tymidiinikinaasigeeni liittyy viruksen kahdentumiseen, ja pienemmät kahdentumisominaisuudet voivat johtaa heikompaan suojaan. Toisaalta 3 110060 glykoproteiini gill on tärkeä suojaavien vasta-aineiden tuottamisessa, mikä tekee glll-häviämärokotteen teholtaan heikommaksi. Yksi käytännön ongelma on se, että rekombinoitujen rokotteiden nenänsisäinen anto, mikä antaa yleisesti parhaan suojan, on joissakin maissa kiellettyä. Näin ollen 5 tarvitaan rokotetta, joka on sekä turvallinen että tehokas ja joka voidaan myös erottaa villistä BHV-1-virustyypistä, jolloin on lisäksi toivottavaa, että ainakin yksi tällainen rokote on valmistettu viruksesta, joka on heikennetty perinteisellä menetelmällä, pikemmin kuin viruksesta, joka on valmistettu DNA-rekombinaatiotekniikalla.

10

Soluviljelmissä tapahtuneiden kulkujen kautta on saatu BHV-1-kanta, josta puuttuu glykoproteiinia gE vastaava geeni. Tutkimuksen ensimmäiset tulokset viittaavat siihen, että tämä geeni on hyvin hyödyllinen tehtäessä serologista erottelua BHV-1-viruksen villiin tyyppiin nähden ja että se liittyy 15 taudinaiheuttamisominaisuuksien ilmentämiseen. Tästä syystä sen poisjättäminen lisää turvallisuutta ja saattaa tehdä tymidiinikinaasi-häviämien käytön tarpeettomaksi. Glykoproteiini gE vaikuttaa vähemmän tärkeältä suojan indusoimisessa kuin glykoproteiini gill. Tavanomaisella menetelmällä heikennetty BHV-1-kanta, joka voidaan erottaa serologisesti viruksen villistä 20 tyypistä, on ainutlaatuinen. Tässä yhteydessä ensimmäistä kertaa kuvattu gE-geenin sijainti ja DNA-sekvenssi eivät ole olleet aiemmin tunnettuja, eivätkä myöskään tästä johdettavat oligonukleotidit, polypeptidit ja oligopeptidit. gE-:' geenin perusteella tehtävä serologinen erottelutesti on myös ainutlaatuinen.

; . * 25 Tämän ’’tavanomaisen” (’’tavanomainen” tarkoittaa tässä heikennetyn viruksen ;·"· tavanomaisen eristysmenetelmän käyttöä) gE-häviämämutantin tärkeä etu on se, että sitä on mahdollista antaa nenänsisäisesti niissä maissa, joissa tämä antotapa on rekombinoitujen rokotteiden osalta kielletty. Tämän tavanomaisen gE-häviämärokotteen lisäksi on kuitenkin valmistettu myös tarkoin 30 määriteltyjä rekombinoituja rokotteita ottaen huomioon eri turvallisuusnäkökohdat. Myös näissä rekombinoiduissa rokotteissa on gE-häviämä - ja niissä voi mahdollisesti olla häviämä myös tymidiinikinaasi-:geenin kohdalla - ja näitä voidaan myös käyttää heterologisten geenien ilmentymisen vektoreina. Kaikki nämä rekombinoidut rokotteet voidaan !.. 35 erottaa villistä virustyypistä samalla gE-spesifisellä testillä. Yhden T. standarditestin käyttö useiden eri rokotteiden sarjan yhteydessä voi olla suuri 4 110060 etu, kun BHV-1 -virusta vastaan kamppaillaan kansainvälisesti. Tällaista menetelmää ei ole aikaisemmin kuvattu BHV-1-rokotteiden alalla.

Karjan BHV-1-vasteen serologinen analyysi osoitti, että tärkeä osa anti-gE-5 vasta-aineista suuntautuu glykoproteiini gE:n ja toisen BHV-1-glykoproteiinin, nimittäin glykoproteiini gl:n, muodostamaa kompleksia vastaan. Serologiset testit, jotka voivat (myös) osoittaa tällaisten kompleksispesifisten vasta-aineiden olemassaolon, voivat siis olla herkempiä kuin testit, jotka tunnistavat ainoastaan anti-gE-vasta-aineet. Karja, joka on 10 rokotettu yhdellä ainoalla gE-häviämämutantilla, voi tuottaa anti-gl-vasta-aineita, jotka voivat sekaantua anti-gl/gE-vasta-aineiden tunnistamiseen. Näin ollen keksinnön piiriin kuuluu myös gl/gE-kaksoishäviämärokote.

Keksinnön yhteenveto 15 Tämä keksintö tarjoaa ensisijaisesti menetelmän rokotekoostumuksen saamiseksi eläinten, erityisesti nisäkkäiden, tarkemmin nautaeläinten rokottamiseksi niiden suojaamiseksi BHV-1-virusta vastaan, jolloin rokote-koostumus muodostetaan BHV-1 -mutantista ja sopivasta kantajasta tai apu-20 aineesta, jolloin mainitussa BHV-l-mutantissa on häviämä glykoproteiinin gE geenissä, joka gE on proteiini, jolla erityisessä BHV-1-kannassa on kuvan 3A : mukainen aminohapposekvenssi ja joka voidaan erottaa serologisesti villiä : : ‘ tyyppiä olevasta B HV -1: stä.

; .· 25 Keksinnön eräs edullinen suoritusmuoto käsittää menetelmän, jossa :·,· glykoproteiinin gE geenissä häviämä on aiheutettu heikentämismenetelmällä, '. ! kuten häviämämutantti Difivac-1, jota kuvataan jäljempänä.

Keksinnön muita edullisia suoritusmuotoja on menetelmä, jossa BHV-1 :n 30 häviämämutantissa häviämä glykoproteiinin gE geenissä on saatu aikaan DNA-rekombinaatiotekniikalla, kuten häviämämutantit 1B7 tai 1B8, joita kuvataan jäljempänä.

»» ,*:· Keksinnön yksi edullinen suoritusmuoto käsittää menetelmän, jossa BHV-1 :n , ‘.. 35 kaksoishäviämämutantissa on häviämä sekä glykoproteiinin gE geenissä että glykoproteiinin gl geenissä, kuten gl/gE-kaksoishäviämämutantti Difivac-IE, .,! - jota kuvataan jäljempänä.

5 110060

Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan valmistaan seuraavia rokotekoostumuksia: 5 Yksi mahdollisimman turvallinen suoritusmuoto on rokotekoostumus, joka käsittää BHV-l:n häviämämutantin, jossa on häviämä sekä glykoproteiinin gE geenissä että tymidiinikinaasigeenissä. Keksintö kattaa myös BHV-l:n häviämämutantin, jossa on häviämä glykoproteiinin gE geenissä, glykoproteiinin gl geenissä ja tymidiinikinaasigeenissä.

10

Rokotevalmiste eläinten, erityisesti nisäkkäiden, erityisesti nautaeläinten, rokottamiseksi niiden suojaamiseksi BHV-1 -virusta vastaan, joka valmiste käsittää edellä kuvatun BHV-1 :n häviämämutantin, ja sopivan lisäkantajan tai apuaineen. Mainittu valmiste voi olla elävä tai inaktivoitu rokotevalmiste.

15

Keksintö koskee myös menetelmää rokotekoostumuksen saamiseksi, jossa on BHV-1 :n mutantti, jossa on häviämä glykoproteiinin gE geenissä ja joka sisältää heterologisen geenin, joka on siirretty DNA-rekombinaatiotekniikan avulla. Tämä on edullisimmin BHV-1 :n mutantti, joka sisältää heterologisen 20 geenin, joka on siirretty DNA-rekombinaatiotekniikalla glykoproteiinin gE geenin paikalle, joka heterologinen geeni on gE:n geenin säätelysekvenssien ohjauksessa ja on mahdollisesti liitetty gE:n geenin siihen osaan, joka koodaa : : signaalipeptidiä. Tämä heterologinen geeni voi myös olla BHV-1 :n eri j promoottorin ohjauksessa tai heterologisen promoottorin ohjauksessa. Kun ; 25 BHV-1 -mutantissa on glykoproteiinin gE geenin häviämän lisäksi muitakin : v häviämiä, kuten tymidiinikinaasigeenihäviämä ja/tai glykoproteiinin gl geenin ' häviämä, mainittu heterologinen geeni voidaan myös liittää tämän/näiden ’ lisähäviämän/lisähäviämien kohtaan. Yhden vaihtoehdon muodostavat useat liitännäiset, joko yhdessä yhteen häviämäkohtaan tai sijoitettuina erikseen 30 useisiin häviämäkohtiin.

Siirretty heterologinen geeni koodaa edullisesti toisen taudinaiheuttajan immunogeenistä proteiinia tai peptidiä, tai sytokiinia, joka edistää .*:· immuunivastetta. Sopivia sytokiineja ovat esimerkiksi interleukiini 2, 35 interferoni-alfa ja interferoni-gamma.

i ·

> I

6 110060

Keksintö tarjoaa myös menetelmän (elävän tai inaktivoidun) rokoteval-misteen saamiseksi eläinten, erityisesti nisäkkäiden, erityisesti nautaeläinten, rokottamiseksi niiden suojaamiseksi (eri) taudinaiheuttajilta, joka valmiste käsittää BHV-l:n mutantin, jossa on heterologinen geeni, joka koodaa tämän 5 toisen taudinaiheuttajan immunogeenistä proteiinia tai peptidiä, sekä sopivan kantajan tai apuaineen. Suoja voi luonnollisesti koskea useampia kuin yhtä taudinaiheuttajaa, t.s. se voi olla monenarvoinen rokote, jossa mutantti sisältää useita heterologisia geenejä.

10 Keksintö koskee lisäksi menetelmää sellaisen koostumuksen saamiseksi, joka käsittää rekombinanttinukleiinihappoa, joka käsittää BHV-l:n glykoproteiinin gE geenin, osan tätä glykoproteiinin gE geeniä tai tästä glykoproteiinin gE geenistä johdetun nukleotidisekvenssin. Tämä koostumus voi sisältää kloonaus- tai ilmentämisvektorin, jossa on rekombinanttinukleiinihapon 15 liitännäinen, joka käsittää BHV-l:n glykoproteiinin gE geenin, osan tätä glykoproteiinin gE geeniä tai tästä glykoproteiinin gE geenistä johdetun nukleotidisekvenssin.

Keksintö käsittää myös menetelmän sellaisen koostumuksen saamiseksi, joka 20 käsittää BHV-l:n glykoproteiinin gE, osan tätä glykoproteiini gE:tä, tästä ' glykoproteiini gE:stä johdetun peptidin tai glykoproteiinien gE ja gl . kompleksin, sekä koostumuksen, joka käsittää vasta-ainetta, joka on spesifinen ; BHV-l:n glykoproteiineille gE, osalle tätä glykoproteiinia gE, tästä • glykoproteiini gE:stä saadulle peptidille tai glykoproteiinien gE ja gl < ‘ I » ; · 25 kompleksille. "Vasta-aine" merkitsee tässä yhteydessä sekä polyklonaalista > ’. vasta-ainevalmistetta että monoklonaalista vasta-ainetta, joka on useimmissa ’, ! sovelluksissa edullisempi. Termit "osa glykoproteiinia gE" ja "glykoproteiini gE:stä johdettu peptidi" merkitsevät tässä yhteydessä gE-spesifistä aminohapposekvenssiä, jonka pituus on yleensä ainakin noin 8 aminohappoa.

30

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 0

Keksintö koskee sarjaa BHV-l-rokotteita, sekä eläviä että inaktivoituja, joille !. ’ on yhteistä se, että niistä puuttuu glykoproteiinin gE geeni kokonaan tai 35 osaksi. Tämä sarja käsittää sekä luonnollisen gE-häviämämutantin että konstruoidut gE-häviämämutantit, joissa voi lisäksi olla tymidiinikinaasin j geenin ja/tai glykoproteiinin gl geenin häviämä, sekä konstruoidut gE- 7 110060 häviämämutantit, joita käytetään heterologisten geenien vektoreina.

Keksintö koskee myös BHV-l:n glykoproteiinin gE geeniä koodaavia nukleotidisekvenssejä, näistä sekvensseistä johdettuja oligonukleotideja, itse glykoproteiini gE:tä, näistä johdettuja peptidejä sekä (monoklonaalisia tai 5 polyklonaalisia) vasta-aineita, jotka kohdistuvat glykoproteiini gE:tä ja siitä johdettuja peptidejä vastaan. Keksintö koskee lisäksi BHV-l:n glykoproteiinien gE ja gl komplekseja sekä tällaisia komplekseja vastaan kohdistuvia vasta-aineita.

10 Näitä keksinnön mukaisia aineita voidaan käyttää seuraaviin tarkoituksiin: 1) karjan rokottamiseen BHV-l:n aiheuttamia tauteja vastaan siten, että voidaan erottaa toisistaan BHV-1 -tartunnan saaneet eläimet ja rokotetut eläimet, jolloin tavanomaista ja konstruoitua rokotevalmistetta voidaan käyttää rinta rinnan; 15 2) karjan rokottamiseen sekä BHV-1 :n aiheuttamia tauteja että muiden patogeenien aiheuttamia tauteja vastaan, joiden patogeenien suoja-antigeenien koodaussekvenssit voidaan sisällyttää BHV-1-häviämämutantteihin; 3) karjasta saadun veren, seerumin, maidon tai elimistön muun nesteen 20 testaamiseen, jolloin voidaan serologisesti tai nukleiinihappo- määritystekniikalla (esim. PCR) määrittää, ovatko eläimet saaneet BHV-l:n villin tyypin tartunnan tai onko ne rokotettu gE-häviämämutantilla.

BHV-1 :n glykoproteiinin gE geenin ia glykoproteiinin gl geenin koodaus-25 sekvenssistä johdettujen oligopeotidien, polvpeptidien ia glykoproteiinien synteesi

Esimerkeissä on kuvattu glykoproteiinin gE geenin (Fig. 3A) ja tämän geenin koodaavien eristettyjen DNA-jaksojen DNA-sekvenssianalyysin tulokset, 30 joiden avulla on standardinmukaisia molekyylibiologisia menetelmiä käyttäen mahdollista sekä valmistaa synteettisesti gE-proteiinin peptidejä (oligo- tai . . : polypeptidejä) että ilmentää gE-proteiinia kokonaisuudessaan tai suurelta osin prokaryoottista reittiä pitkin (bakteereissa) tai eukaryoottista reittiä pitkin • · (esimerkiksi hiirien tai rottien soluissa). Näitä reittejä käyttäen voidaan saada 35 gE-spesifmen antigeeni, jota voidaan käyttää esimerkiksi gE-spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden (Mab:t) tuottamiseen. Lisäksi gE-spesifistä antigeeniä (ja gE-spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita) voidaan käyttää 110060 8 serologisissa testeissä, joilla voidaan erottaa toisistaan BHV-l:n gE-häviämärokotteella rokotetut eläimet ja BHV-l:n villin virustyypin tartunnan saaneet eläimet.

5 Esimerkeissä kuvatun glykoproteiinin gl geenin osittaisen DNA- sekvenssianalyysin tulosten avulla ja tämän geenin koodaavien eristettyjen DNA-jaksojen avulla yhdessä glykoproteiini gE:tä ilmentävien eukaryoottisten solujan kanssa on mahdollista ilmentää gl/gE-kompleksia eukaryoottisissa soluissa (ks. Fig. 13 ja 14). Tätä glykoproteiinikompleksia voidaan käyttää 10 gl/gE-spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseen. gl/gE- kompleksia voidaan myös käyttää antigeeninä serologisissa testeissä, joilla voidaan erottaa toisistaan BHV-l:n yksinkertaisella gE-häviämämutantilla tai kaksinkertaisella gl/gE-häviämämutantilla rokotetut eläimet ja BHV-l:n villin virustyypin tartunnan saaneet eläimet.

15 gE-spesifiset peptidit

Tunnetun proteiinikoodaussekvenssin perusteella voidaan automaattisen syntetisoijan avulla valmistaa polypeptidejä, joissa on vähintään n. 40-50 20 aminohappoa. Kun BHV-l:n Lam-kannan glykoproteiinin gE proteiini-koodaussekvenssi on nyt purettu (Fig. 3A), voidaan synteettisesti valmistaa tämän BHV-l:n glykoproteiinin gE polypeptidejä. Tällaisilla polypeptideillä voidaan standardinmukaisilla menetelmillä immunisoida koe-eläimiä, kuten ’ ’ hiiriä tai kaneja, gE-spesifisten vasta-aineiden tuottamiseksi. Lisäksi tällaisia " 25 gE-spesifisiä peptidejä käyttäen voidaan edelleen määrittää ne kohdat (epitoopit), joissa anti-gE-vasta-aineet reagoivat gE-proteiinin kanssa, esimerkiksi PEPSCAN-menetelmän avulla (Geysen ym., 1984, Proc. Natl.

' Acad. Sei. USA 81, 3998-4002). gE-spesifisiä oligopeptidejä voidaan myös käyttää serologisissa testeissä anti-gE-vasta-aineiden osoittamiseksi.

30

Prokarvoottinen gE:n ilmentäminen gE-proteiinin valmistamiseksi synteettisesti bakteereissa (eli gE:n prokaryoottiseksi ilmentämiseksi) on ne DNA-jaksot, jotka koodaavat glyko-35 proteiini gE:tä tai sen osia, kloonattava prokaryoottisiin ilmentämisvektoreihin. Prokaryoottiset ilmentämisvektorit ovat pyöreitä ; DNA-molekyylejä, jotka voivat pysyä bakteerissa erillisinä kahdentuvina 110060 9 molekyyleinä (plasmideina). Nämä ilmentämisvektorit sisältävät yhden tai useampia merkitsingeenejä, jotka koodaavat antibioottien vastustuskykyä ja mahdollistavat näin ilmentämisvektorin sisältävien bakteerien valinnan.

Lisäksi ilmentämisvektorit käsittävät (usein ohjailtavan) promoottorialueen, 5 jonka taakse voidaan sitoa DNA-jaksot, joita sitten ilmennetään promoottorin vaikutuksesta. Useissa nykyisissä prokaryoottisissa ilmentämisvektoreissa haluttu proteiini ilmennetään fuusioituna ns. kantajaproteiiniin. Tätä tarkoitusta varten vektorissa sijaitsee promoottorin takana kantajaproteiinin koodaussekvenssi, ja haluttu DNA-jakso voidaan liittää suoraan tämän 10 viereen. Fuusioproteiinit ovat usein pysyvämpiä ja helpommin tunnistettavia ja/tai eristettäviä. Pysyvyysaste, jonka tietty fuusioproteiini voi saavuttaa tietyssä bakteerikannassa, vaihtelee fuusiosta ja kannasta toiseen. Yleensä kokeillaan eri yhdistelmiä.

15 Glvkoproteiinin gE geenin eukarvoottinen ilmentäminen

Vaikka proteiinien prokaryoottinen ilmentäminen usein tarjoaa joitakin etuja, proteiineista puuttuvat ne vaihtelumahdollisuudet, kuten glykosylaatio ja vastaavat, jotka esiintyvät eukaryoottisissa soluissa. Tästä syystä 20 eukaryoottisesti ilmennetty proteiini on usein sopivampi antigeeni. Proteiineja ilmennetään heterologisesti eukaryoottisissa soluissa, esimerkiksi rotan tai hiiren soluissa, käyttämällä eukaryoottisia ilmentämisvektoreita. Nämä vektorit ovat plasmideja, joita ei voida ainoastaan lisätä E. coli -soluissa vaan jotka myös elävät pysyvästi eukaryoottisissa soluissa. Prokaryoottisen ; ; 25 valintamerkitsimen lisäksi ne sisältävät myös eukaryoottisen valinta- ;;'/· merkitsimen. Analogisesti prokaryoottisten ilmentämisvektorien kanssa : ·' eukaryoottiset ilmentämisvektorit käsittävät promoottorialueen, jonka taakse ·’ halutut geenit voidaan liittää. Eukaryoottisissa vektoreissa olevat promoottorisekvenssit ovat kuitenkin spesifisiä eukaryoottisille soluille.

30 Lisäksi eukaryoottisissa vektoreissa fuusioitumista kantajaproteiineihin käytetään vain harvoin hyväksi. Nämä vektorit siirretään eukaryoottisiin : soluihin standardinmukaisella siirtomenetelmällä (F.L. Graham ja A.J. Van der Eb, 1973, Virology 52, 456-467). Eukaryoottisten plasmidivektorien *: · lisäksi on myös virusvektoreita, joissa heterologinen geeni siirretään viruksen 35 perimään (esim. retrovirukset, herpesvirukset ja lehmärokkovirus).

·...·' Eukaryoottiset solut voidaan sitten tartuttaa rekombinanttiviruksilla.

110060 ΙΟ

Yleisesti ei voida ennustaa, mitkä vektorit ja solutyypit sopivat parhaiten tietylle geenituotteelle. Useimmiten kokeillaan monia yhdistelmiä.

Sekä glykoproteiini gE:n että glykoproteiini gl:n eukaryoottinen ilmentäminen 5

Proteiinin saama lopullinen rakenne riippuu sen primääristä aminohapposekvenssistä, laskostuneisuudesta, käännöksen jälkeisistä muunnelmista ym. Yksi tärkeä proteiinin rakenteeseen vaikuttava tekijä on sen vuorovaikutus yhden tai useamman toisen proteiinin kanssa. Tutkimuksessa on havaittu, että 10 myös BHV-l:n glykoproteiini gE muodostaa kompleksin ainakin yhden toisen glykoproteiinin, nimittäin BHV-l:n glykoproteiinin gl kanssa. Ensimmäinen havainto tällaisesta kompleksista saatiin tuloksistamme mahdollisilla monoklonaalisilla anti-gE-vasta-aineilla Mab:t 1, 51, 67, 75 ja 78 (ks. taulukko 2). Nämä monoklonaaliset vasta-aineet eivät reagoineet Difivac-l:n tai Lam 15 gE':n kanssa, mutta ne eivät myöskään tunnistaneet glykoproteiini gE:tä ilmentäviä 3T3-soluja. Kuitenkin nämä monoklonaaliset vasta-aineet reagoivat gE:tä ilmentävien 3T3-solujen kanssa Difivac-1-infektion jälkeen, mikä osoittaa, että tarvitaan täydentäviä tekijöitä, jotta glykoproteiini gE saisi näiden monoklonaalisten vasta-aineiden täydellisen antigeenisen 20 vastaavuuden. Joissakin Mab 81 :llä tekemissämme radioimmunologisissa saostuskokeissa havaitsimme yhteissaostumista proteiinin kanssa, jonka ilmeinen molekyylipaino oli 63 kD.

:. Ottaen huomioon, että herpes simplex -viruksen glykoproteiini gE muodostaa ! 25 kompleksin vastaavan molekyylipainon omaavan proteiinin kanssa (HSVlrn glykoproteiini gl), päättelimme, että BHV-l:n glykoproteiini gE muodostaa ; kompleksin glykoproteiini gl:n BHV-1 -homologin kanssa. Tämän BHV-l:n *' gE/gl-kompleksin tutkimiseksi ja sopivan antigeenirakenteen omaavan gE- antigeenin tuottamiseksi ilmensimme kumpaakin glykoproteiinia yhdessä 30 eukaryoottisessa solussa. Tätä varten käytimme samoja menetelmiä, joita on kuvattu edellä pelkästään glykoproteiini gE:n eukaryoottisen ilmentämisen : v yhteydessä. Ainoa lisäedellytys on se, että käytetään ilmentämisvektoreita, ; “' joilla on erilaiset eukaryoottiset valintamerkitsimet.

110060 11

Serologiset testit

Serologiset menetelmät Difivac-l:llä rokotetun karjan ja BHV-l:n villin 5 virustyypin tartunnan saaneen karjan erottamiseksi toisistaan gE:n vastaisten vasta-aineiden perusteella perustuvat sopivimmin monoklonaalisten gE:tä vastaan kohdistuvien vasta-aineiden käyttöön.

Näitä voidaan käyttää seuraavasti: a) Van Oirschotin ym. kuvaaman periaatteen mukaan (Journal of 10 Virological Methods 22, 191-206, 1988). Tässä Aujeszkyn taudin aiheuttavan viruksen vastaisten gl-vasta-aineiden ELISA-määrityksessä vasta-aineet tunnistetaan sen estovaikutuksen perusteella, joka niillä on kahden kaksi eri epitooppia gl:ssä omaavan monoklonaalisen vasta-aineen reaktioon. Testi tehdään seuraavasti: Mikrotiitterilevyjä 15 päällystetään Mab l:llä, ne pidetään yli yön 37°C:ssa, minkä jälkeen ne varastoidaan, esim. 4°C:ssa tai -20°C:ssa. Tutkittavaa seerumia esi-inkuboidaan antigeenin kanssa erillisissä päällystämättömissä mikrotiitterilevyissä, esim. 2 h ajan 37°C:ssa. Mab l.llä päällystetyt levyt pestään, esim. 5 kertaa, minkä jälkeen piparjuuriperoksidaasiin (HRPO) 20 yhdistettyä Mab 2:ta lisätään näihin levyihin. Tämän jälkeen esi- inkuboidut seerumivasta-ainesekoitukset siirretään levyihin, joissa on molemmat Mab:t, minkä jälkeen inkuboidaan esim. lh ajan 37°C:ssa.

Levyt pestään, ja kuhunkin kuoppaan lisätään substraattia. Levyjä pidetään noin 2 h ajan huoneenlämmössä, kunnes ne luetaan 25 spektrofotometrisesti. Kussakin levyssä on neljä negatiivista kontrolliseerumia ja neljä positiivisen seerumin sarjalaimennosta. Positiiviseksi katsotaan seerumi, jonka optinen tiheys (OD-arvo) on : vähemmän kuin 50 % samalla levyllä tutkitun neljän negatiivisen kontrolliseerumin keskimääräisestä OD-arvosta.

30 b) Epäsuoran kaksoisvasta-aine-sandwich (Indirect Double Antibody Sandwich, IDAS) periaatteen mukaan. Tällöin mikrotiitterilevyt päällystetään gE-proteiinia vastaan suunnatulla monoklonaalisella vasta-.· aineella tai polyklonaalisella seerumilla. gE-antigeenivalmisteella . inkubointi saa aikaa gE:n sitoutumisen päällysteeseen. Tutkittavassa v 35 naudan seerumissa erityisesti gE:tä vastaan suunnatut vasta-aineet sitoutuvat tämän jälkeen gE:hen. Anti-naudan immunoglobuliinin konjugaatit tunnistavat nämä sitoutuneet vasta-aineet. Tämän 110060 12 konjugaatin vasta-aineet sitoutuvat kovalenttisesti peroksi- daasientsyymiin. Lopuksi sitoutunut konjugaatti saadaan näkyviin lisäämällä kromogeenistä substraattia. Tämän reaktion spesifisyys tarkistetaan tekemällä samat toimenpiteet gE-negatiivisella 5 kontrollivalmisteella gE-antigeenivalmisteen asemesta. Kussakin mikro- tiitterilevyssä on sekä positiivista että negatiivista kontrolliseerumia.

Testi on pätevä, jos positiivisella seerumilla saadaan positiivinen tulos tietyllä laimennoksella. Seerumi on positiivinen, jos sen optinen tiheys on 0,2 yksikköä korkeampi kuin standardinmukaisen negatiivisen 10 kontrolliseerumin optinen tiheys.

c) Kohdassa 2) kuvatun IDAS-periaatteen mukaisesti, mutta käyttämällä tutkittavan seerumin inkuboinnin jälkeen anti-gE-monoklonaalista vasta-ainetta ja piparjuuriperoksidaasia anti-naudan immunoglobuliinin konjugaatin asemesta. Anti-gE-monoklonaalisen vasta-aineen asemesta 15 voidaan käyttää anti-gE-peptidiseerumia tai anti-gE polyklonaalista seerumia. Levyt pestään, ja kuhunkin kuoppaan lisätään kromogeenistä substraattia. Levyjä pidetään esim. 2 h ajan huoneenlämmössä, kunnes ne luetaan spektrofotometrisesti. Kussakin levyssä on neljä negatiivista kontrolliseerumia ja neljä positiivisen seerumin sarjalaimennosta.

20 Positiiviseksi katsotaan seerumi, jonka optinen tiheys (OD-arvo) on vähemmän kuin 50 % samalla levyllä tutkitun neljän negatiivisen kontrolliseerumin keskimääräisestä OD-arvosta.

d) ELISA-estoperiaatteen mukaan, jolloin mikrotiitterilevy päällystetään yön aikana virusantigeenillä, joka voi olla puhdistettu tai puhdistamaton.

25 Näillä levyillä tutkittavaa seerumia inkuboidaan esimerkiksi yhden tunnin ajan tai kauemmin 37°C:ssa. Pesun jälkeen levyille lisätään anti-; gE monoklonaalista vasta-ainetta, minkä jälkeen inkuboidaan

esimerkiksi 1 h ajan 37°C:ssa. Anti gE monoklonaalisen vasta-aineen asemesta voidaan käyttää anti-gE peptidiseerumia tai anti-gE

30 polyklonaalista seerumia. Levyt pestään, ja kuhunkin kuoppaan lisätään kromogeenistä substraattia. Levyjä pidetään esim. 2 h ajan huoneenlämmössä, kunnes ne luetaan spektrofotometrisesti. Kussakin levyssä on neljä negatiivista kontrolliseerumia ja neljä positiivisen seerumin sarjalaimennosta. Positiiviseksi katsotaan seerumi, jonka 35 optinen tiheys (OD-arvo) on vähemmän kuin 50 % samalla levyllä tutkitun neljän negatiivisen kontrolliseerumin keskimääräisestä OD-!: arvosta.

110060 13

Kaikissa em. järjestelyissä voidaan käyttää tavanomaisesti kasvatettua gE:n sisältävää virusantigeeniä, mutta myös prokaryoottien tai eukaryoottien kautta ilmennettyä gE-antigeeniä. Vaihtoehtoisesti voitaisiin em. diagnostisissa 5 testeissä käyttää tavanomaisen antigeenin asemesta BHV-l:n gE-sekvenssiin perustuvia oligopeptidejä. Lisäksi tällaisia oligopeptidejä voitaisiin käyttää ns. ’’lehmänpuoleisten” testien kehittämisessä periaatteen mukaisesti, joka on kuvattu Kempin ym. artikkelissa, Science 241, 1352-1354, 1988. Tällainen testi perustuisi siis siihen, että tartunnan saaneissa eläimissä olevaa gE:tä 10 vastaan toimivat vasta-aineet sitovat oligopeptidin antigeenisekvenssin.

Tällaista testiä varten oligopeptidi täytyisi kytkeä monoklonaaliseen vasta-aineeseen, joka suuntautuu naudan punasoluja vastaan.

Nukleiinihappoanalvvsi polymeraasiketjureaktiota käyttäen 15

Polymeraasiketjureaktiossa voidaan käyttää esimerkiksi oligonukleotideja (koettimia ja alukkeita) rokotettujen ja tartunnan saaneiden eläinten erottamiseksi toisistaan. Polymeraasiketjureaktio (PCR) on menetelmä, jolla taudinaiheuttajan nukleiinihapot voidaan moninkertaistaa miljardeja kertoja 20 lyhyessä ajassa (De polymerase kettingreactie, P.H. Hilderink, J.A. Wagenaar, J.W.B van der Giessen ja B.A.M. van der Zeijst, 1990, Tijdschrift voor Diergeneeskunde deel 115, 1111-1117). gE-oligonukleotidit voidaan valita siten, että gE-positiivisessa perimässä muodostuu eri tuote kuin gE-negatiivisessa perimässä. Tässä on se etu, että myös gE-häviämärokotteella 25 rokotettu eläin antaa PCR-testissä positiivisen signaalin. Tämä menetelmä riippuu kuitenkin testattavasta eläimestä saadussa näytteessä, esimerkiksi veressä, olevien virusnukleiinihappojen esiintymisestä.

Akuutin BHV-1-infektion jälkeen on suuri mahdollisuus, että veressä voidaan 30 osoittaa olevan BHV-1-spesifisiä nukleiinihappoja, mutta vielä ei ole osoitettu, voiko BHV-1-nukleiinihappoja esiintyä veressä myös piilevän vaiheen aikana.

BHV-1 :n käyttö vektorina 35 Heterologisten geenien ilmentämiseksi BHV-1 :n genomissa on välttämätöntä, että käytettävissä on täsmällistä tietoa alueesta, johon heterologinen geeni * liitetään. Olennaisissa sekvensseissä ei saisi esiintyä mitään häiriöitä, ja 110060 14 käytettävissä on oltava sääteleviä sekvenssejä heterologisen geenin ilmentämiseksi. Glykoproteiinin gE geeni on periaatteessa sopiva kohta heterologisten geenien ilmentämiseksi. gE-geeni ei ole oleellinen, eikä gE-geenin korvaamiselle heterologisella geenillä siis ole mitään estettä. Näin ollen 5 heterologinen geeni voidaan sijoittaa siten, että se tulee gE-geenin säätelevien sekvenssien vaikutuspiiriin. Ei kuitenkaan ole välttämätöntä käyttää gE-geenin sääteleviä sekvenssejä. Heterologisten geenien ilmentämistä voidaan vaihtoehtoisesti kontrolloida eri geenien muilla, esim. vahvemmilla säätelevillä sekvensseillä. On myös mahdollista sitoa heterologinen geeni gE-10 geenin (vienti) signaalipeptidiin, jolloin voidaan vaikuttaa heterologisen geenin tuotteen erittymiseen. On selvää, että gE-geenin ja gE-proteiinin tarkka tuntemus mahdollistaa BHV-l:n käyttämisen vektorina erittäin säädellysti.

Kehitetyt vektorit voidaan lisäksi erottaa serologisesti villistä tyypistä. Heterologisia geenejä ilmentäviä BHV-l-mutantteja voidaan muodostaa 15 samaan tapaan kuin gE-häviämämutantteja, joita esitetään esimerkeissä.

Häviämäjaksot on tällöin kuitenkin korvattava häviämäkohdassa jaksolla, jossa on heterologinen geeni.

Esimerkkejä 20 1. Luonnollisen gE-häviämämutantin eristäminen ja tunnistaminen .' a) Luonnollisen mutantin eristäminen ^ 25 Perimän DNA:ta eristettiin useista tavanomaisesti heikennetyistä rokotteista standardinmukaisilla menetelmillä ja analysoitiin käyttäen restriktioentsyymejä. Erityisesti etsittiin perimän poikkeamia, jotka voisivat soveltua erotukseen B HV -1 :n villistä virustyypistä.

30 Huomiota kiinnitettiin erityisesti BHV-l:n perimän Us-alueeseen, koska tällä alueella - analogisesti herpes simplex -viruksen kanssa - on todennäköisesti ; ’ ·. epäolennaisia glykoproteiinejä koodaavia geenejä [Identification of a herpes simplex virus 1 glykoprotein gene within a gene cluster dispensable for growth in cell culture, R. Longnecker, S. Chatterjee, R.J. Whitley ja B.

’; 1, 35 Roizman (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. 84,4303-4307].

» > < » » 15 110060 BHV-1-rokoteannoksesta, joka on saatu Zagrebin yliopistosta Jugoslaviasta (Lugovic ym, Veterinarski Archiv 55, 241-245, 1985), useilla kuluilla naudan sikiön munasoluissa ja naudan sikiön henkitorven soluissa (Ebtr), on löydetty poikkeava Us-alue normaalin Us-alueen lisäksi. Tämä 5 rokote muodosti myös sekä suuria että pieniä plakkeja Ebtr-soluissa. Tästä sekapopulaatiosta eristettiin poikkeavan Us-alueen omaava virus käyttämällä kolmea rajoittavaa laimennusvaihetta, jolloin kullakin kertaa valittiin pienet plakit. Tällä menetelmällä eristettyä virusta tutkittiin edelleen, ja sille annettiin nimitys Difivac-1. Se tallennettiin 27.5.1992 Institut Pasteuriin, Pariisi, 10 Ranska, tallennusnumerolla 1-1213.

b) gE-geenin häviämän tunnistaminen Difivac-1 :ssä Tätä Us-alueella olevaa poikkeamaa tutkittiin edelleen eristämällä Difivac-1 :n 15 perimän DNA:ta standardinmukaisilla menetelmillä ja käyttämällä Southern blot —analyysiä (Fig. IA). Tämän blotin hybridisointi 32P-leimatulla villin tyypin Hindlll K-jaksolla vahvisti, että tämä keskellä Us-aluetta sijaitseva osa on Difivac-1 :ssä noin 1,0 kb lyhyempi. Lisäksi tällä analyysillä voitiin arvioida puuttuvan osan sijaintikohta (Fig. IB). Tätä häviämää analysoitiin 20 edelleen eristämällä BHV-1 :n villin tyypin Lam-kannan Us-alue ja kloonaamalla se prokaryoottisiin vektoreihin. Tätä tarkoitusta varten Lam-kannan perimässä olevaa DNA:ta (Fig. 2A) eristettiin ja kloonattiin standardinmukaisilla menetelmillä vektoreihin pUC18, pACYC ja pBR322 (Fig. 2B). Häviämän oletetun sijaintikohdan ympäristöstä koottiin fyysinen ; 25 kartta (Fig. 2C). Tämän fyysisen kartan perusteella muodostettiin tämän alueen nukleotidisekvenssien määritykseen soveltuvia alaklooneja vektoreihin pKUN19 ja pUCl 8 (Fig. 2D). Näitä alaklooneja käyttäen määritettiin Sangerin menetelmän avulla koko alueen (ks. Fig. 2C) molempien säikeiden nukleotidisekvenssi. Tämä nukleotidisekvenssi (SEQ ID NO:l) analysoitiin 30 PC/Gene-ohjelman avulla. Transkriptiosta kävi ilmi, että nukleotidit (nt) 168-1893 koodaavat 574 aminohapon avointa lukukehystä (Fig. 3A). Jatkoanalyysi osoitti, että tällä aminohapposekvenssillä on membraanin läpäisevän glykoproteiinin ominaisuudet, kuten kuvassa 3B on osoitettu. Ensimmäiset 26 ’ * aminohappoa (aa) voidaan tunnistaa tyypilliseksi eukaryoottiseksi 35 vientisignaaliksi, ja aminohappojen 423 ja 450 välinen alue voidaan tunnistaa membraanin läpäiseväksi alueeksi. Lisäksi tässä sekvenssissä esiintyy kolme potentiaalista N-sidoksista glykosylaatiokohtaa. Tässä ennusteen mukaisessa

I I

110060 i 16 aminohapposekvenssissä on selviä yhtäläisyyksiä herpes simplex -viruksen (HSV) glykoproteiini gE geenin kanssa; ks. Fig. 4A ja 4B. Nämä ja muut yhtäläisyydet ovat perustana päätelmälle, että löydetty geeni on BHV-l:n gE-homologi. Tästä syystä geeniä kutsutaan gE.ksi. p318-jakso eristettiin, jotta 5 voitiin määrittää, missä määrin tämä BHV-l:n gE-geeni puuttuu Difivac-l:stä. p318-jakso alkaa Alul-kohdasta 55 nukleotidia ennen oletettua BHV-l:n gE:n avointa lukukehystä ja päättyy 133 nukleotidia sen jälkeen. Difivac-l:n perimän DNA:ta analysoitiin tällä p318-jaksolla käyttäen Southern blot -hybridisointia. Tässä tuli esille, että Difivac-1 ei sisällä p318:n tunnistamia 10 sekvenssejä (Fig. 5). Tämä koe vahvisti sen, että Difivac-1 sisältää häviämän, ja osoittaa selvästi, että tämä häviämä ulottuu koko gE-geenin alueelle.

Häviämäalueen koon ja sijaintikohdan määrittämiseksi Difivac-1 :n Us-alueen kattavia perimän sekvenssejä kloonattiin prokaryoottisiin vektoreihin (ks. Fig.

15 11C). 14,5 kb:n pituinen EcoRI-jakso kloonattiin pACYC-vektoriin, jolle annettiin nimitys p775. 7,4 kb:n pituinen Hindlll-jakso kloonattiin erikseen pUC 18-vektoriin, jolle annettiin nimitys p728. Kloonista p728 eristettiin kaksi alakloonia; 1,4 kb:n pituinen Pstl-jakso kloonissa p737 ja 350 kb:n pituinen AluI-Pstl-jakso kloonissa p754. Näiden kloonien restriktioentsyymianalyysi ja 20 Southern blot -analyysi (tietoja ei esitetty) osoitti, että Difivac-1 :n gE-häviämän pituus on 2,7 kb, ja se alkaa 5’-päästä gE-geenistä ja päättyy Us-alueen rajalle. Nämä 2,7 kb on korvattu 1 kb:n segmentin kahdentumalla, joka : on sijoitettu gE-geeniä vastapäätä olevalle Us-alueelle (ks. Fig. 1 IB). Näiden analyysien tulosten vahvistamiseksi ja täsmällisen rekombinaation 25 määrittämiseksi määritettiin kloonin p754 liitännäisen suurimman osan : nukleotidisekvenssi ja sitä verrattiin villin tyypin sekvensseihin (ks. Fig. 12).

lv. Tämä analyysi osoitti, että rekombinaatiokohta sijaitsee 77 bp ennen gE- geenin aloituskloonia.

30 c) Difivac-1 :n turvallisuuden ja tehokkuuden arviointi

Difivac-1 ;tä testattiin 7 viikon ikäisissä BHV-l-seronegatiivisissä vasikoissa, joilla ei esiintynyt mitään taudinaiheuttajia. Kahdeksan vasikkaa rokotettiin : | nenänsisäisesti 2 ml:lla 105 TCID50:a, josta 1 ml ruiskutettiin kumpaankin v 35 sieraimeen. Kahdeksan 7 viikon ikäistä BHV-seronegatiivista vasikkaa, joilla ei esiintynyt taudinaiheuttajia ja jotka pidettiin erillisessä eristysyksikössä, saivat nenänsisäisesti 2 ml elatusainetta ja toimivat rokottamattomina 110060 17 verrokkeina. Viiden viikon kuluttua rokotuksesta rokotetuille ja verrokkeina toimiville vasikoille annettiin sieraimen sisäisesti BHV-l:n hyvin voimakasta Iowa-kantaa 107 TCID50. Kuusi viikkoa tämän altistamisen jälkeen kaikille vasikoille annettiin lihaksen sisäisesti deksametasonia 5 päivän ajan 5 otaksutun piilevän viruksen uudelleenaktivoimiseksi. Samalla tarkkailtiin kliinisiä oireita, peräsuolen lämpötilaa ja ruhon kasvua. Virus eristettiin sierainvanutupoista, ja seerumista määritettiin neutraloivien vasta-aineiden tiitterit.

10 Rokotuksen jälkeen vasikoiden käyttäytyminen, ruokahalu, peräsuolen lämpötila ja kasvu pysyi normaalina, mutta rokotetuilla vasikoilla esiintyi jonkin verran seerumin erittymistä nenästä ja jonkin verran syljen liikaeritystä.

Nenän limakalvojen haavaumia ei havaittu. Difivac-l:ä erittyi rokotuksen jälkeen sierainvanutuppoihin (Fig. 17). Kaikissa rokotetuissa vasikoissa 15 kehittyi neutraloivia BHV-l-vasta-aineita.

Altistamisen jälkeen kaikissa rokottamattomissa verrokkivasikoissa ilmeni haluttomuutta, ruokahaluttomuutta, silmän ja nenän eritteiden vuotamista, alaleuan ikenien punoitusta, vakavia nenän limakalvojen haavaumia 14 päivän 20 kuluessa altistamisesta ja kasvun pysähtyminen 4 päivän kuluessa.

Rokotetuissa vasikoissa oli pieniä, nopeasti paranevia nenän limakalvojen haavaumia eikä lainkaan kasvun pysähtymistä. Päivittäiset kliiniset arvot, peräsuolen lämpötila ja kasvun kehittyminen altistamisen jälkeen on esitetty kuvissa 18, 19 ja 20. Altistamisen jälkeen kaikki vasikat erittivät virusta ; · 25 nenästä, mutta viruksen erittymisen määrä ja kesto oli huomattavasti pienempi ; rokotetuilla vasikoilla (Fig. 21). Rokotetuissa vasikoissa kehittyi . ·. ·. sekundäärinen vasta-ainevaste, ja kaikissa rokottamattomissa vasikoissa syntyi ’ ·. ·. vasta-aineita altistamisen jälkeen.

30 Uudelleenaktivoinnin jälkeen altistava virus eristettiin yhdestä rokotetusta ja viidestä rokottamattomasta vasikasta. Difivac-l:tä ei voitu aktivoida uudelleen.

Edellä esitetyt tulokset osoittavat, että Difivac-1 ei aiheuttanut juuri mitään ;· 35 taudin oireita nuorilla vasikoilla eikä sitä voitu uudelleenaktivoida. Difivac-1 ··, vähensi huomattavasti taudin vakavuutta ja viruksen erittymisen määrää : ‘. altistamisen j älkeen.

110060 18

Lopuksi voidaan todeta, että Difivac-1 on turvallinen ja tehokas rokote annettavaksi karjalle BHV-1-infektioita vastaan.

5 2. BHV-1 :n rekombinoitujen gE-häviämämutanttien valmistaminen

Toisistaan erotettavien BHV-1-rokotteiden aikaansaamiseksi, jotka ovat molekyylirakenteeltaan paremmin määriteltyjä kuin Difivac-1 ja sisältävät haluttaessa gE-geenin häviämän lisäksi esimerkiksi tymidiinikinaasigeenin 10 häviämän, konstruoitiin rekombinoituja gE-häviämämutantteja Difivac-1 :n lisäksi. gE-häviämäjakso voitiin konstruoida lähtemällä glykoproteiinin gE geenin määritetystä sijaintikohdasta ja käyttämällä kloonattuja gE-geeniä rajaavia DNA-jaksoja. Käyttäen standardinmukaista menetelmää (F.L.

Graham ja A.J. Van der Eb, 1973, Virology 52, 456-467) tämä häviämäjakso 15 voitiin rekombinoida BHV-1-kannan villin tyypin perimään, jolloin tuloksena saatiin gE-häviämämutantti.

a) gE-häviämäjakson konstruoiminen 20 gE-häviämäjakson konstruoimiseksi pyrittiin saamaan osa, josta toisaalta puuttuu koko gE-sekvenssi ja joka toisaalta sisältää riittävän rajasekvenssin, joka mahdollistaa villin tyypin perimän kanssa tapahtuvan rekombinoitumisen. 5’-puolella (alkupäässä) valittiin 1,2 kb:n pituinen Pstl-AsuII-jakso, joka päättyy 18 nukleotidia ennen gE-geenin aloituskoodonia. 3’-pään (loppupään) 25 jaksoa varten valittiin 1,2 kb:n pituinen EcoNI-Dral-jakso, joka alkaa 2 nukleotidia ennen gE-geenin lopetuskoodonia (Fig. 6).

gE-häviämäjakson konstruoimiseksi BHV-1 :n Lam-kannan 8,4-kb:n pituisesta, gE-geenin 5’-puolella sijaitsevasta Hindlll K-jaksosta saatu 1,4 30 kb:n pituinen Pstl-Smal-jakso alakloonattiin pUC18-plasmidin Smal- ja Pstl-kohtiin. Tälle kloonille annettiin nimitys p515. gE:n 3’-puolella sijaitseva 4,1 kb:n pituisesta Hindlll-EcoRI-kloonista saatu EcoNI-Smal-jasko kloonattiin • . p515:n ainoaan AsuII-kohtaan. Näin ollen gE-häviämäjakson konstruktio saatiin valmiiksi, ja näin konstruoidulle kloonilla annettiin nimitys p519.

; . 35 Vaikka periaatteessa p519:n koko Pstl-Smal-liitännäistä on mahdollista ' : käyttää gE-häviämäjaksona, tämä ei ole suositeltavaa. Itse asiassa Pstl-Smal jatkuu noin 100-150 emäsparin (bp) verran Us-aluetta rajaavaan i 19 110060 toisintosekvenssiin. Tämä 100-150 bp:n kappale voisi rekombinoitua Us-alueen toisen puolen toisintosekvenssin kanssa, jossa ei ole gE-geeniä, ja voisi tällöin tuottaa vääränlaisia rekombinaatiotuotteita. Tästä syystä rekombinaatiokokeiluun valittiin Pstl-Dral-jakso, niin että lOObp toisinnosta 5 poistuu.

b) gE-häviämäjakson rekombinaatio BHV-1 :n villin tyypin perimän kanssa

Konstruoidun gE-häviämäjakson ja BHV-l:n villin tyypin perimän 10 rekombinaation aikaansaamiseksi mikrogrammamääriä molempia DNA-molekyylejä siirretään yhdessä naudan sikiön henkitorven (Ebtr) soluihin F.L.

Grahamin ja A.J. Van der Ebin standardinmukaisen menetelmän mukaan (1973, Virology 52, 456-467). Solujen rekombinaatiomekanismien vaikutuksesta rekombinoituu pieni määrä (2-4 %) soluihin liittyneitä DNA-15 molekyylejä. Rekombinoitujen häviämämutanttien valitsemiseksi siirron jälkeen muodostunut virussekoitus hajotetaan uuteen Ebtr-soluviljelmään. Useimmissa tapauksissa näin kehittyvät erilliset viruspopulaatiot (plakit) ovat peräisin yhdestä viruksesta. BHV-l:n Lam-kannan gE-häviämämutanttien eristämiseksi eristettiin 230 tällaista plakkia ja tutkittiin standardinmukaisilla 20 immunologisilla menetelmillä BHV-1-spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden (Mab:t) kanssa, jotka eivät reagoi Difivac-1 :llä infektoitujen solujen kanssa. Nämä monoklonaaliset vasta-aineet suuntautuvat glykoproteiini gE:tä vastaan. Mainituista 230 plakista viisi ei reagoinut näiden monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa. Näiden 5 plakin DNA:ta tutkittiin tarkemmin.

25 c) BHV-l:n Lam-kannan konstruoitujen gE-häviämämutanttien DNA- ‘. analyysi

Yllämainituista 5 gE-häviämämutanttiehdokkaasta kolmen (1B7, 1B8, 2H10) 30 DNA-valmisteita tutkittiin edelleen käyttäen standardinmukaista Southern blot -analyysimenetelmää (Sambrook ym. 1989). Nämä DNA-valmisteet pilkottiin kahteen kertaan PstLllä ja DraLllä, minkä jälkeen tehtiin geelisähköforeesi ja Southern blot -hybridisaatio käyttäen koettimena 2,3 kb:n pituista Pstl-Dral-häviämäjaksoa. Tulokset osoittivat, että viruspopulaatioiden 1B7 ja 1B8 35 perimän gE-geeni on poistettu täsmälleen halutulla tavalla; ks. Fig. 7A ja 7B. Populaatiossa 2H10 on poikkeava Pstl-Dral-jakso. gE-spesifisellä koettimella tehdyt Southern blot -hybridisaatiot osoittivat, että missään näistä kolmesta 110060 20 DNA-valmisteesta ei ole gE- sekvenssejä (tuloksia ei ole esitetty).

BHV-l:n viruspopulaatiot 1B7 ja 1B8 ovat aiottuja rekombinoituja gE-häviämämutantteja. BHV-l:n viruspopulaation 1B7 rokotusominaisuuksia on testattu.

5 d) Tymidiinikinaasi/gE-kaksoishäviämämutanttien konstruoiminen

Koska BHV-l:n rekombinoidut häviämämutantit, joissa on häviämä ainoastaan yhdessä geenissä, eivät ehkä ole riittävästi taudinaiheut-10 tamiskyvyltään heikennettyjä, häviämät tehtiin myös BHV-1 :n Lam- ja Harbe-rink-kantojen tymidiinikinaasi (TK) -geeniin. Nämä mutantit konstruoitiin samalla menetelmällä, jota käytettiin edellä mainittujen gE-häviämämutanttien yhteydessä (tuloksia ei ole esitetty). Näitä TK-häviämämutantteja on käytetty TK/gE-kaksoishäviämämutanttien konstruoimiseksi.

15 e) Glykoproteiini gl/glykoproteiini gE-kaksoishäviämämutanttien konstruoiminen

Koska yhdellä gE-häviämämutantilla rokotettu karja saattaa tuottaa anti-gl-20 vasta-aineita, jotka voivat häiritä anti-gl/gE-vasta-aineiden tunnistamista (tätä käsitellään jäljempänä), keksimme myös rokotteen, jossa on gl/gE-kaksois-häviämä. Tällainen gl/gE-kaksoishäviämämutantti voidaan konstruoida käyt-; täen samoja menetelmiä, joita on käytetty gE-yksittäishäviämämutantin konstruoimisessa. 1,8 kb:n pituisen Pstl-jakson alkupään - joka kattaa gE-25 geenin 5’-pään - osittainen nukleotidisekvenssianalyysi paljasti avoimen luku-kehyksen, jolla on merkittävää homologiaa muissa herpesviruksissa tavattujen gl-homologien kanssa (ks. Fig. 13 ja 14). gl/gE-häviämäjakso voidaan konstruoida käyttäen 350 bp:n pituista Smal-Pstl-jaksoa, joka käsittää gl-geenin oletetun 5’-pään ja EcoNI-Smal-jakson, joka sijaitsee jäljempänä gE-geenissä.

30 Tämä jakso voidaan rekombinoida villin tyypin perimän kanssa, jolloin saadaan BHV-l:n gl/gE-häviämämutantti (ks. Fig. 16). Ne 80-90 aminohappoa, jotka - teoriassa - voidaan vielä muodostaa, eivät kykene tuomaan : ’ ·. esiin vasta-aineita, jotka voivat häiritä anti-gl/gE-vasta-aineiden havaitsemista.

gl-geenin sekvenssin jatkotutkimukset mahdollistavat sellaisen gl-häviämän 35 konstruoimisen, joka kattaa täydellisen gl-koodausalueen. Tälle gl/gE-kaksoishäviämämutantille annettiin nimitys Difivac-IE.

21 110060 O Lam gE' ja Lam gE',TK' -mutanttien turvallisuuden ja tehokkuuden arviointi BHV-l:n mutanttikantojen Lam gE' ja Lam gE , TK' rokotusominaisuuksia 5 testattiin 7 viikon ikäisissä BHV-l-seronegatiivisissa vasikoissa, joilla ei esiintynyt spesifisiä taudinaiheuttajia. Kutakin mutanttikantaa ruiskutettiin 6 vasikalle nenänsisäisesti. Kullekin vasikalle annettiin kokonaisannos, jossa oli 105 TCID50 2 ml:ssa elatusainetta ja josta 1 ml ruiskutettiin kumpaankin sieraimeen. Verrokkeina toimiville rokottamattomille 6 vasikalle ruiskutettiin 10 nenänsisäisesti elatusainetta, jossa ei ollut virusta. Viiden viikon kuluttua rokottamisesta kaikki vasikat, rokotetut ja rokottamattomat, altistettiin antamalla nenänsisäisesti 107 TCID50 BHV-l:n hyvin voimakasta Iowa-kantaa. Rokottamisen jälkeen ja altistamisen jälkeen seurattiin kliinisiä oireita, peräsuolen lämpötilaa ja ruhon painoa. Sieraimista otettiin vanutupponäytteet, 15 joiden avulla määritettiin viruksen nenästä erittymisen kesto vuorokausina.

Rokottamisen jälkeen vasikoiden käyttäytyminen, ruokahalu, peräsuolen lämpötila ja kasvu pysyi normaalina. Seerumin erittymistä nenästä ja pieniä nenän limakalvon haavaumia havaittiin kaikissa rokotetuissa vasikoissa.

20 Virusta voitiin eristää rokotettujen vasikoiden nenistä noin 7 päivän ajan (Taulukko 1).

Altistamisen jälkeen kaikissa rokottamattomissa verrokkivasikoissa ilmeni haluttomuutta, ruokahaluttomuutta, silmän ja nenän eritteiden vuotamista, 25 alaleuan ikenien punoitusta, vakavia nenän limakalvon haavaumia ja kasvun heikkenemistä. Kaikissa Lam gE', TK':11a rokotetuissa vasikoissa ilmeni jonkin verran nenän eritteiden vuotamista ja vähäisiä nenän limakalvon ; haavaumia. Kaikissa Lam gE':llä rokotetuissa vasikoissa ei esiintynyt nenän eritteiden vuotamista tai nenän limakalvon haavaumia. Haluttomuutta, 30 ruokahaluttomuutta tai muita taudin kliinisiä oireita ei rokotetuilla vasikoilla esiintynyt. Peräsuolen lämpötila, kasvu ja kliiniset arvot altistamisen jälkeen on esitetty kuvissa 22, 23 ja 24. Rokottamattomat vasikat erittivät virusta nenän kautta 2 kertaa kauemmin kuin rokotetut vasikat (Taulukko 1).

35 Edellä esitetyt tulokset osoittavat, että BHV-l:n mutanttikannat Lam gE' ja Lam gE,TK' aiheuttivat nuorissa vasikoissa tuskin mitään kliinisiä taudin 110060 22 oireita. Kummatkin mutanttikannat estivät sairastumisen altistamisen jälkeen ja vähensivät virukset nenästä erittymisen kestoa 50 %:lla.

BHV-l:n mutanttikannat Lam gE' ja Lam gE,TK ovat turvallisia ja 5 tehokkaita käyttää karjan rokottamiseen BHV-1-infektioita vastaan.

3. gE:n prokaryoottinen ilmentäminen BHV-1 :n glykoproteiini gE-geenin prokaryoottista ilmentämistä varten on 10 tähän asti käytetty pGEX-ilmentämisvektoreita (D.B. Smith ja K.S. Johnson,

Gene 67 (1988) 31-40). pGEX-vektorit koodaavat Schistosoma japonicumista saatavaa kantajaproteiinia glutationi S-transferaasi (GST), joka on tac-promoottorin vaikutuksen alainen, joka voidaan indusoida ilmentämään iso-propyylitiogalaktosidin (IPTG) avulla. Esimerkkinä GST-gE-fuusio-15 proteiinista on rakennetuote pGEX-2T600s3 (Fig. 8A). Tässä rakenteessa GST-geenin taakse sidottiin standardinmukaisia molekyylibiologisia menetelmiä käyttäen (Sambrook ym. 1989) 600bp:n pituinen Smal-jakso, joka koodaa gE-proteiinin 200 aminohapon N-pään aluetta. Tämä rakenne suunniteltiin kolminkertaiseksi liittämällä kullakin kerralla GSTrhen 600bp:n 20 pituinen jakso eri lukukehystä. Kaikki kolme rakennetta istutettiin Escherichia coli:n DH5a-kantaan, ne indusoitiin IPTG.llä ja muodostuneet proteiinit siirrettiin nitroselluloosaan sen jälkeen, kun Western blotting -menetelmällä oli tehty polyakrylamidigeelisähköforeesi. Anti-GST-vasta-aineiden avulla tehty immunologinen havainnointi osoitti, että ainoastaan sopivan gE-25 proteiinin aluetta koodaavan lukukehyksen (nro 3) avulla saadaan aikaan selvän fuusioproteiinin ilmentäminen, joka proteiini on ennustettua kokoa 27k (GST) + 20k (gE) = 47k. Kolme eristämäämme monoklonaalista vasta-ainetta, jotka eivät reagoi Difivac-l:n kanssa, tunnistavat 47 kD GST-gE-fuusioproteiinin Western blot-analyysissa; ks. Fig. 8B.

30 4. Glykoproteiinin gE geenin eukaryoottinen ilmentymä

Glykoproteiinin gE geenin eukaryoottiseksi ilmentämiseksi on tähän mennessä valittu mm. vektori pEVHis. Tässä pEVHis-vektorissa on eukaryoottisena 35 merkitsimenä HisD-geeni, joka koodaa histidinolidehydrogenaasia [EC 1.1.1.23] (C. Hartmann ja R. Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85,

·[· 8047-8051), joka saa solut elämään histidinolin tappavassa 2,5mM

110060 23 konsentraatiossa. Lisäksi vektori käsittää ihmisen sytomegaloviruksen (HCMV) välittömän varhaisgeenin promoottorialueen, jonka takana ovat ainoat restriktioentsyymikohdat. pEVHis/gE-ilmentämisvektorin konstruoimiseksi käytettiin jaksoa, joka käsittää glykoproteiinin gE geenin koko 5 koodausalueen. Se alkaa Alul-kohdasta 55bp ennen gE:n oletettua avointa lukukehystä ja päättyy 133 bp sen takana. Tämä alue kloonattiin pEVHis-vektorin HCMV-promoottorin taakse, jolloin muodostui rakenne pEVHis/gE (Fig. 9). pEVHis/gE vahvistettiin E. coli DH5a-soluissa ja puhdistettiin cesiumkloridigradientin avulla (Sambrook ym. 1989). Tämä puhdistettu DNA 10 siirrettiin Balb/C-3T3-soluihin Grahamin ja Van der Ebin menetelmän mukaisesti. Muunnetut solut valittiin histidinolin avulla, minkä jälkeen voitiin eristää kaksikymmentä histidinolille resistenttiä pesäkettä. Nämä pesäkkeet tutkittiin Mab 81 :n avulla käyttäen immunoperoksidaasiyksikerrosanalyysia (IPMA). Neljässä pesäkkeessä havaittiin gE-proteiini ilmentymä. Näistä 15 neljästä pesäkkeestä käytettiin 3T3 gE-kloonia 9 korkean gE-ilmentymän omaavan alakloonin eristämiseen. Tällä menetelmällä eristettyä kloonia (nimitys 3T3gE 9.5) käytettiin mahdollisten monoklonaalisten anti-gE-vasta-aineiden tunnusmerkkien löytämiseen.

20 5. Sekä BHV-l:n glykoproteiinin gE että BHV-l:n glykoproteiinin gl eukaryoottinen ilmentymä samassa solussa BHV-l:n glykoproteiinin gl ilmentämiseksi samassa solussa kuin BHV-l:n glykoproteiini gE määriteltiin aluksi BHV-l:n gl-geenin oletettava sijainti-25 kohta. Koska herpes simplex -viruksen glykoproteiini gl-geeni sijaitsee aivan ennen glykoproteiini gE-geeniä, pääteltiin, että BHV-l:n gl-geeni voisi sijaita vastaavalla kohdalla. Tämän testaamiseksi sekvenssistä määriteltiin 283 nukleotidin alue, joka sijaitsee n. 1 kb BHV-l:n gE-geenin alkua ennen.

Tämän alueen käsitteellinen käännös osoitti, että toinen lukukehys koodaa 94 30 aminohapon sekvenssiä, joka on homologinen herpes simplex -viruksen glykoproteiinin gl kanssa (Fig. 13 ja 14). Koska homologinen segmentti on noin 80 aminohappoa aloituskoodonista, BHV-l:n gl-geenin avoimen lukukehyksen oletettu alkukohta arvioidaan olevaksi noin 250 nukleotidia ennen sekventoitua aluetta. Tästä pääteltiin, että 1,7 kb:n pituinen Smal-jakso, j ·' 35 joka alkaa 400 nukleotidia ennen sekventoitua aluetta ja päättyy gE-geenin ... sisäpuolella, sisältäisi BHV-l:n geenin gl-geenin koko koodausalueen. Tämä 1,7 kb:n pituinen Smal-osa on kloonattu eukaryoottiseen vektoriin MSV-neo l i i • ; > · 110060 24 (ks. Fig. 15). Tämä vektori sisältää vahvan hiiren ja rotan sarkoomaviruspromoottorin ja valitsingeeni neon, joka koodaa resistanssia antibioottista G-418-sulfaattia Geniticin vastaan. Tuloksena syntynyt rakenne MSVneoGI on vahvistettu E. coli DH5a-soluissa ja siirretty 3T3gE 9.5 5 -soluihin käyttäen Grahamin ja Van der Ebin menetelmää. Siirretyt solut valittiin käyttämällä 400 pg Geneticiniä/ml elatusainetta, ja resistentit pesäkkeet eristettiin ja testattiin monoklonaalisten anti-gE-vasta-aineiden kanssa, jotka eivät reagoineet 3T3gE 9.5 -solujen kanssa. Tämän perusteella valittiin 3T3gE/gI R20-klooni, joka reagoi esim. Mab 66:n kanssa samoin kuin 10 BHV-l:n villi tyyppi.

6. Monoklonaalisen anti-gE-vasta-aine-ehdokkaiden karakterisointi BHV-l:n villiä tyyppiä vastaan tuotettiin monoklonaalisia vasta-aineita, joista 15 tehtiin valinta, jos ne eivät reagoineet Difivac-l:llä altistettujen naudan sikiön henkitorven (Ebtr) solujen kanssa. Näistä monoklonaalisista vasta-aineista tutkittiin niiden reaktiivisuus a) Lam gE' -häviämämutantin kanssa; b) edellä kuvatun prokaryoottisen ilmentymätuotteen kanssa Western blot - 20 analyysissa; c) edellä kuvattujen gE:tä ilmentävien Balb/c-3T3-solujen kanssa; d) kohdassa c) mainittujen ja Difivac-l:llä infektoitujen solujen kanssa, ja e) gE/gl-kompleksia ilmentävien Balb/c-3T3-solujen kanssa.

25 Kohdissa a, c, d ja e mainituissa reaktiivisuustesteissä käytettiin immuno-: : peroksidaasiyksikerrosanalyysia (IPMA). Taulukossa 2 esitetyistä tuloksista käy ilmi, että on tuotettu monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on kohdistettu gE:tä vastaan (nrot 2, 3, 4, 52, 66, 68, 72 ja 81), ja monoklonaalisia vasta-aineita (nrot 1, 51, 53, 67, 75 ja 78), jotka voidaan kohdistaa gE/gl-30 kompleksin vastaavia antigeenialueita vastaan. Eri monoklonaalisten vasta-aineiden tunnistamien antigeenialueiden kartoittamiseksi suoritettu kilpailu-. , IPMA tutkimus osoitti, että glykoproteiini gE:ssä on ainakin 4 antigeenialuetta ; ’· ja että yhden alueen muodostaa todennäköisesti gE/gl-kompleksi (Taulukko 2).

:T 35 110060 25

Anti-gE-vasta-aineiden tunnistaminen BHV-1-tartunnan saaneessa karjassa

Sen tutkimiseksi, onko tartunnan saaneen karjan seerumissa gE:n vastaisia 5 vasta-aineita, tehtiin epäsuora esto-IPMA-tutkimus 16 monoklonaalisella gE-vasta-aine-ehdokkaalla ja seuraavilla 8 valitulla seerumilla: 2 seerumia Difivac-l:llä rokotetuista ja virulentilla Iowa-kannalla altistetuista naudoista, joiden seerumit otettiin 14 päivää altistamisen jälkeen; 10-2 seerumia BHV-1 :n alatyypin 1 viruksella kokeellisesti altistetuista naudoista, joiden seerumit otettiin 20 kuukautta altistamisen jälkeen.

Toinen naudoista sai tartunnan kosketusaltistuksesta; 2 seerumia BHV-1 :n alatyypin 2b viruksella altistetuista naudoista, joiden seerumit otettiin 20 kuukautta altistamisen jälkeen. Toinen 15 naudoista sai tartunnan kosketusaltistuksesta; 1 seerumi vasikasta, jolla ei esiintynyt spesifisiä taudinaiheuttajia ja joka rokotettiin ts-mutanttirokotteella, altistettiin 3 viikkoa myöhemmin BHV-1 :n alatyypin 2b virukselle ja jonka seerumia otettiin 7 viikon kuluttua altistamisesta; 20 - 1 seerumi gnotobioottisissa olosuhteissa kasvatetusta vasikasta, joka rokotettiin ts-mutanttirokotteella, altistettiin 3 viikkoa myöhemmin BHV-1 :n alatyypin 2b virukselle ja jonka seerumia otettiin 7 viikon kuluttua altistamisesta.

· 25 Taulukosta 2 käy ilmi, että kaikki nämä seerumit sisälsivät vasta-aineita gE:n .'. antigeenialueita III ja IV vastaan ja antigeenialuetta I vastaan, joka sijaitsee todennäköisesti gE/gl-kompleksissa. Voidaan päätellä, että gE on ilmeisesti ‘ sopiva serologinen merkitsin BHV-1-tartunnan saaneiden ja rokotettujen nautaeläinten erottamiseksi.

30 7. BHV-1 :n nukleiinihappojen tunnistaminen PCR-määrityksen avulla käyttäen BHV-1 :n gE-spesifisiä alukkeita BHV-1 :n gE-geenin määrätystä nukleotidisekvenssistä lähtien valittiin PCR-·;*’ 35 määritykseen sopiva alukepari käyttäen Lowen ym. kehittämää alukevalintaohjelmaa (T. Lowe, J. Sharefkin, S. Qi Yang ja C.W. Dieffenbach, :-. 1990, Nucleic Acids Res. 18, 1757-1761). Näille alukkeille annettiin j 26 110060 nimitykset P3 ja P4, ja ne on esitetty kuvassa 10. Alukkeet sijaitsevat 159 nt:n etäisyydellä toisistaan ja johtavat 200 nukleotidin muodostaman jakson vahvistamiseen. Alukkeita P3 ja P4 ja eristettyä BHV-l:n DNA:ta käyttäen olosuhteet optimoitiin PCR-määritystä varten. Tämä edellytti erityisesti 5 MgCl2-konsentraation, glyserolipitoisuuden ja kierto-olosuhteiden vaihtelumahdollisuutta. P3:n ja P4:n käyttöä varten BHV-l:n DNA:n vahvistamiseksi löydetty optimaalinen puskuri on 10 mM Tris, pH 8,0, 50 mM KC1, 0,01% gelatiinia, 2,6mM MgCl2 ja 20% glyserolia. Löydetyt optimaaliset kierto-olosuhteet (Perkin Elber Cetus DNA Thermal Cycler) ovat 1.-5. kierroille: 1 10 min 98°C, 30 s 55°C ja 45 s 72°C ja 6.-35. kierroille: 30 s 96°C, 30 s 55°C ja 45 s 72°C. PCR-vahvistamisen jälkeen saatu 200 nukleotidin DNA-jaksolle tehtiin 2 % agaroosigeelillä sähköforeesi, blotattiin nitroselluloosalla ja tämän jälkeen sille suoritettiin Southern blot -analyysi. Southern blot -analyysissä käytetty 1P dCTP -leimattu koetin on 137 bp:n pituinen TaqI-jakso, joka 15 sijaitsee alukkeiden sidoskohtien välissä (Fig.10). Hybridisoitujen suodattimien autoradiografian jälkeen havaittiin 200bp:n pituinen nauha. Tällä menetelmällä ainoastaan 10 BHV-l:n perimän (noin 1,5 x 10'15 μg DNA:ta) vahvistus vielä synnyttää selvästi havaittavan signaalin (tulosta ei esitetty).

Vastaavasti kehitettiin PCR-menetelmä, jossa käytettiin alukkeita, jotka 20 perustuvat BHV-l:n glykoproteiinin gill koodaussekvenssiin (D.R.

Fitzpatrick, L.A. Babiuk ja T. Zamb, 1989, Virology 173, 46-57). Jotta voitaisiin erotta BHV-l:n villin tyypin DNA ja gE-häviämämutanttirokote toisistaan, DNA-näytteille tehtiin sekä gE-spesifinen PCR-analyysi että glll- : . spesifinen PCR-analyysi. Tässä testissä Difivac-l:n DNA-valmiste havaittiin ’:' 25 glll-positiiviseksi ja gE-negatiiviseksi.

Koska BHV-1 DNA:n havaitseminen naudan siemennesteessä on yksi tärkeä ; · BHV-1-spesifisen PCR-menetelmän käyttömuoto, BHV-1 :llä infektoituneelle naudan siemennesteelle pyrittiin tekemään gE-spesifinen PCR-analyysi.

30 Siemenenesteen tuntemattomilla komponenteilla on kuitenkin voimakkaasti polymeraasiketjureaktiota estävä vaikutus. Tämän vuoksi kehitettiin . . menetelmä BHV-1 DNA:n eristämiseksi naudan siemennesteestä. DNA

;, ’ eristetään naudan siemennesteestä inkuboimalla 30 μΐ siemennestettä 1 *; · mg/ml:lla proteinaasi K:ta (pK) kokonaistilavuudessa 300 μΐ 0,15M NaCl, 0,5 35 % Na-Sarkosyliä ja 40 mM DTT:tä, 60 °C:ssa. 1 tunnin kuluttua näytteen ' ‘ · annetaan jäähtyä huoneenlämpötilaan, jolloin lisätään 300 μΐ 6M Nal:tä ja inkuboidaan 5 min ajan. Tästä seoksesta DNA eristetään standardinmukaisella 110060 27 kloroformi/isoamyylietanoli-uutolla ja saostetaan 1 tilavuusyksiköllä isopropanolia. Seos pestään 2,5 moolilla NH4Ac/70 % etanolia ja sus-pendoidaan uudelleen 10 millimooliin Tris:iä, jonka pH-arvo on 7,4, ja jossa on ImM EDTA.ta, 0,5 % Tween 80:tä ja 0,1 mg/ml proteinaasi K:ta, ja inku-5 bointi suoritetaan toisen kerran 1 tunnin ajan 60°C:ssa. Tälle DNA-valmis-teelle voidaan tehdä suoraan polymeraasiketjureaktio (PCR).

Piirustusten kuvaus 10 Kuva 1:BHV-1-kantojen Difivac-1 ia Iowa Southern blot -analyysi A. Piirustuksessa on esitetty Difivac-1 :n ja Iowan perimän DNA:n Southern blot -autoradiodiagrammi. Väyliin 1 ja 3 lisättiin Difivac-1 :n DNA:ta HindIII:n ja Pstl:n restriktioentsyymipilkonnan jälkeen, vastaavassa 15 järjestyksessä. Väyliin 2 ja 4 lisättiin Iowan DNA:ta HindIII:n ja Pstl:n restriktiopilkonnan jälkeen vastaavasti. Osion koko on esitetty kiloemäksinä (kb).

Viruksen DNA eristettiin sentrifugoimalla viruksella infektoituja Ebtr-soluja 20 elatusaineessa (70 ml / n. 450 cm :n rullauspullo) noin 2h ajan 25 % (paino-%) sakkaroosityynyn läpi, 10 mM Trisiä, jonka pH oli 7,4, 150mM natriumkloridia ja 1 millimoolissa EDTAita 20 krpm:n nopeudella Beckman L5-65 ultrasentrifugointilaitteen SW27-roottorissa. Näin saadusta viruspallosta eristettiin DNA standardinmukaisilla menetelmillä (J. Sambrook, E.F. Fritsch : 25 ja T. Maniatis, 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2. painos, toim.

: Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Tälle DNA:lie tehtiin ,: restriktioentsyymipilkonnat Boehringer-Mannheimin entsyymeillä saman ::: valmistajan SuRE/cut-puskureissa. 1 2 3 4 5 6

Vaakasuorassa elektroforeesissa 0,7-prosenttisessa agaroosigeelissä tehdyn 2 eristyksen ja nitroselluloosasuodattimelle (Schleicher & Schuell, Inc.) tehdyn 3 : blottauksen jälkeen suodatin esihybridisoitiin 6 h ajan 42°C:n lämpötilassa 4 liuoksessa, jossa oli 50 % formamidia, 3x SSC (lx SSC = 0,15 M NaCl ja 5 0,015 M Na-sitraattia, pH 7,4), 50 μΐ denaturoitua lohen sperman DNA:ta 6 (Sigma)/ml ja 0,02 % naudan seerumin albumiinia, 0,02 % polyvinyylipyrrolidonia ja 0,02 % ficollia ja 0,1 % Na-dodekyylisulfaattia (SDS). Tämän jälkeen suoritettiin hybridisaatio lisäämällä samaan liuokseen 28 110060 j2P dCTP (Amersham) -leimattua HindlH K-jaksoa (Hindlll K-jakson valinta perustuu artikkeliin: Cloning and cleavage site mapping of DNA from bovine herpesvirus 1 (Cooper strain), John F. Mayfield, Peter J. Good, Holly J.

VanOort, Alphonso R. Campbell ja David A. Reed, Journal of Virology 5 (1983) 259-264). 12-14 h hybridisaation jälkeen suodatin pestiin 2 h ajan 0,1- prosenttisessa SDS:ssä ja 0,1 x SSc:ssä 60°C:n lämpötilassa. Hindlll K-jakso kloonattiin pUC18-vektoriin standardinmukaisten kloonausmenetelmien mukaan (J. Sambrook, E.F. Fritsch ja T. Maniatis, 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).

10 pUC/8,4 HindHIK-kloonin Hindlll-pilkonnan jälkeen pUC18-vektori erotettiin uudelleen 8,4 kb Hindlll K-jaksosta elektroforeesilla, jossa käytettiin 0,7-prosenttista ’’Low Melting Point Agarose” -geeliä (BRL, Life Technologies, Inc.), ja vektori eristettiin agaroosista standardinmukaisilla fenoliuuttamis- ja etanolisaostamismenetelmillä. Eristetty Hindlll K-jakso 15 merkittiin Boehringer-Mannheim Random Primed DNA -leimausvälineistön 1004.760 avulla. Hybridisoiduille suodattimille tehtiin autoradiografia valottamalla 36 h ajan Kodak XAR -filmiä -70 °C:ssa ja käyttämällä heijastavaa ruutua.

20 B. Iowa-kannan 8,4 kb:n pituisen Hindlll K-jakson ja Difivac-l:n 7,4 kb:n pituisen Hindlll K-jakson fyysiset kartat. Ottaen huomioon, että 6 kb:n .. pituiset Pstl-jaksot kulkeutuvat yhdessä ja että Difivac-l:n 1,8 kb:n pituinen > · .' . Pstl-jakso on poissa, häviämä on todennäköisesti kuvan vinoviivoitetulla alueella.

: 25 : i Kuva 2:BHV-l:n villin tyypin jaksojen alakloonaus Difivac-l:stä puuttuvan • *. alueen ympärillä

Kuvassa A on esitetty BHV-l:n genomin osat: Unique Long (UL) -alue, 30 Unique Short (Us) -alue ja kaksi toisintoa (Ir ja Tr). Tämä kartta perustuu Cooper-kannasta julkaistuun analyysiin (John F. Mayfield, Peter J. Good, ,·, · Holly J. VanOort, Alphonso R. Campbell ja David A. Reed, Journal of !.. Virology (1983) 259-264).

* » * · * 35 Kuvassa B on esitetty Us -alueen jaksoja, jotka on kloonattu prokaryoottisiin vektoreihin: 15,2 kb:n pituinen EcoRI-jakso pACYC.ssa, 8,4 kb:n pituinen ’; ‘ HindlH-jakso pUC18:ssa ja 2,7 kb:n ja 4,1 kb:n pituinen EcoRI-HindHI-jakso

! » I

110060 29 pBR322:ssa. Viruksen DNA-jaksojen eristäminen tehtiin menetelmillä, jotka on mainittu kuvan IA yhteydessä. Näiden jaksojen kloonaus eri vektoreille tehtiin standardinmukaisilla menetelmillä (J. Sambrook, E.F.

Fritsch ja T. Maniatis, 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., 5 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).

Kuvassa C on esitetty fyysinen kartta alueesta, johon Difivac-l:n oletettu häviämä on paikannettu.

10 Kuvassa D on esitetty joitakin em. alueen alaklooneja, joita on käytetty jatkoanalyyseissä. Kaksi Pstl-jaksoa kloonattiin pKUN 19-vektoriin ja muut osat pUC18-vektoriin.

Kuva 3 15 A: BHV-l:n Lam-kannan Us-alueen 2027 nukleotidin muodostama nukleotidisekvenssi oletetun kohdan ympärillä, joka on hävinnyt Difivac-l:stä. kuten kuvassa 2C on esitetty [äärimmäisenä vasemmalla olevasta Alul-tunnistuskohdasta äärimmäisenä oikealla olevaan HincII-tunnistuskohtaan].

20 Kuvassa 2D esitettyjen alakloonien siirrännäisten nukleotidisekvenssit määritettiin analysoimalla kahta säiettä käyttämällä Sangerin ym.

. dideoksisekvenssimenetelmää (F. Sanger, S. Nicklen ja A.R. Coulson, 1977,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467). Tätä tarkoitusta varten käytettiin : Pharmacian T7-sekvenssivälineistöä valmistajan esittämällä tavalla.

25 Radioaktiivista leimausta varten käytettiin [j5S] dATP:tä (Amersham). GC-: : pitoisten alueiden ja yhteenpuristettujen keinotekoisten rakenteiden ' sekvenssianalyysi toistettiin Pharmacia-välineistön 7-deatsa-dGTP-variantilla.

Nukleotidisekvenssin alapuolella on kolmikirjaimisen koodin muodossa esitetty 575 aminohappotähteen avoimen lukukehyksen aminohapposekvenssi, 30 joka löydettiin nukleotidisekvenssin käsitteellisen käännöksen jälkeen. Tämä transkriptio perustuu vallitsevaan koodiin ja määritettiin käyttäen PC/geeni-. ( . tietokoneohjelmaa (PC/gene versio 1.03, marraskuu 1987). Tämä 575 aminohapon avoin lukukehys alkaa methioniinilla nukleotidin 168 kohdalla ja : , päättyy lopetuskoodoniin nukleotidin 1893 kohdalla.

T 35 575 aminohapon avoimen lukukehyksen rakenneanalyysi suoritettiin myös V PC/geeni-tietokoneohjelman avulla. Ensimmäiset 26 aminohappoa 110060 30 muodostavat eukaryoottisen vientisignaalin, joka on kuvassa mer kitty ’’signaalipeptidinä”. Tuloksella 6,2 tämän signaalisekvenssin ennustetaan katkeavan aminohappojen 26 ja 27 välistä. 575 aminohapon sekvenssissä on kolme mahdollista N-sidoksista glykosylaatiokohtaa (NXT/S), joita on 5 merkitty aminohappotähteiden alle merkityllä viivalla. Raon ja Argosin menetelmän mukaan aminohappojen 423 ja 450 välissä on membraanin läpäisevä alue, jota on merkitty kuvassa ’’membraanin läpäisevänä kierukkana”. Restriktioentsyymien AsuII, Smal, Hindlll ja EcoNI tunnistussekvenssit (kohdat) on alleviivattu. Tämän polypeptidin laskettu 10 molekyylipaino on 61212.

B: Edellä mainittujen 575 aminohapon avoimen lukukehyksen rakenteellisten tunnusmerkkien esitys kaaviona 15 Kuva 4:BHV-l:n gE-geenin aminohapposekvenssin ia herpes simplex -viruksen (HSV) gE-geenin ia muiden gE-homologisten geenien Γpseudorabies virus (PRV) gl ia varicella-zoster (VZV) gpll aminohapposekvenssin vertailu Tämän vertailun sekvenssit on otettu seuraavista julkaisuista: 20 HSV: Sequence determination and genetic content of the short unique region • in the genome of herpes simplex virus type 1. D.J. McGeoch, A.

Dolan, S. Donald ja F.J. Rixon (1985), Journal Mol. Biol. 181, 1-13.

: VZV: DNA sequence of the Us component of the varicella-zoster virus genome. A.J. Davidson (1983), EMBO Journal 2, 2203-2209.

• 25 PRV: Use of Agtll to isolate genes for two pseudorabies virus glycoproteins with homology to herpes simplex virus and varicella-zoster virus glycoproteins. E.A. Petrovskis, J.G. Timmins ja L.E. Post (1986) Journal of Virology 60,185-193.

Näitä sekvenssejä verrattiin käyttämällä sekvenssianalyysiohjelmaa Multalin 30 (F.Corpet, 1988, Nucl. Acids Res. 16, 10881-10890).

.,, Kuvassa A on esitetty diagrammi, jossa kaikki neljä aminohapposekvenssiä on esitetty kaaviollisesti. Tässä esitetyt membraanin läpäisevät osat (TM) on esitetty allekkain. Ennustettujen vientisignaalisekvenssien (SP) ja · · 35 mahdollisten N-sidoksisten glykosylaatiokohtien (I) lisäksi on esitetty kaksi säilytettyä aluetta, joissa kysteiinitähteiden suhteellinen asema pysyy usein . · muuttumattomana (C C C).

110060 31

Kuvassa B on esitetty neljän gE-version keskellä sijaitsevan kysteiinipitoisen alueen Multalin-vertailu. Tähdellä on merkitty identtisiä aminohappoja ja kaksoispisteellä analogisia aminohappoja.

I 5 ! Kuva 5:Difivac-l:n ia Iowa-kannan Southern blot -analyysistä saatujen valokuvien perusteella tehty piirustus

Kuva A: Difivac-l:n ja Iowa-kannan perimien restriktioentsyymipilkonnat 10 BstLllä (1, 2), EcoRLllä (3, 4) ja HindllElla (5, 6), eristetty 0,7-prosenttisella agaroosigeelillä, blotattu nitroselluloosalla ja hybridisoitu BHV-l:n Lam-kannan P-leimatun Hindlll K-jakson kanssa käyttäen menetelmiä, jotka on esitetty kuvan IA yhteydessä.

15 KuvaB: Em. geelin nitroselluloosablottaus, joka on hybridisoitu BHV-l:n gE-spesifisellä p318-koettimella. Tämä näyte käsittää koko AluI-HincII-alueen, joka on esitetty kuvassa 2C.

Kuva 6:BHV-l:n gE-häviämäjakson konstruoiminen 20

Kuvassa A on esitetty gE-geenin ja käytettyjen kloonien sijaintikohta. BHV-1-perimän komponentit ovat: Unique Long (UL) -osa. Unique Short (Us) -osa ja kaksi toisintoa (Ir ja Tr). gE-geenin 5’-puolella sijaitseva alue saatiin seuraavasti: BHV-l:n Lam-kannan 8,4 kb:n pituisen Hindlll K-jakson 1,4 ; 25 kb:n pituinen Pstl-Smal-jakso alakloonattiin plasmidin pUC18 Smal- ja Pstl- . kohtiin. Tälle kloonille annettiin nimitys p515, ja se on esitetty kuvassa B. 4,1 kb.n pituisesta HindlH-EcoRI-kloonista saatu, gE.n 3’-puolella sijaitseva EcoNI-Smal-osa kloonattiin p515:n ainoaan AsuII-kohtaan. Jotta EcoNI-tähteen sitominen AsuII-tähteeseen olisi mahdollista, klooni p515 pilkottiin 30 AsuII:n kanssa ja käsiteltiin tämän jälkeen Klenowin entsyymillä (Boehringer-• ' · Mannheim) ja dCTP:llä, jolloin AsuII-tähteeseen saatiin yksi sytosiinitähde ... standardinmukaisilla menetelmillä (Sambrook ym. 1989). Tätä lisäsytosiinia :·;· on merkitty tähdellä kuvassa D. Tämän jälkeen p515 pilkottiin myös Smal- ,··. entsyymillä, minkä jälkeen EcoNI-jakso voitiin sitoa tähän vektoriin. Näin : · 35 konstruoidulle kloonille annettiin nimitys p519.

110060 32

Kuva 7 A: DNA-valmisteiden 1B7, 1B8 ia 2H10 Southern blot -analyysista saadun valokuvan perusteella tehty piirustus. DNA:n eristys, 5 restriktioentsyymipilkonnat, blottaus ja hybridisaatio tehtiin menetelmillä, jotka on esitetty kuvan IA selostuksen yhteydessä. Kun DNA-valmisteille 1B7, 1B8 ja 2H10 oli tehty kaksinkertainen Pstl-Dral-pilkonta, jaksot erotettiin 0,7-prosenttiseen agaroosigeeliin ja tämän jälkeen blotattiin nitroselluloosasuodattimella. Tämä suodatin hybridisoitiin koettimena 10 käytetyllä 32P dCTP -leimatulla 2,3 kb:n pituisella Pstl-Dral-häviämäjaksolla.

Väylillä 1-3 näytteet 1B7, 1B8 ja 2H10 erotettiin vastaavassa järjestyksessä.

Väylällä 4 käytettiin Lam-kannasta saatua villin tyypin BHV-l-DNA:ta ja väylällä 5 2,3 kb:n pituista häviämäjaksoa.

15 B: BHV-l:n Lam-kannan 15.2 kb:n pituisen EcoRI-osan fyysinen kartta.

Kartassa on esitetty PstI-, Dral- ja Hindlll-tunnistuskohtien sijainti ja kohdassa 7A mainitun hybridisaationäytteen sijainti.

Kuva 8:BHV-l:n gE-geenin prokaryoottinen ilmentyminen 2° BHV-l:n gE:n prokaryoottisen ilmentymisen aikaansaamiseksi gE-geenin 600 bp:n pituinen Smal-jakso fuusioitiin kolmena lukukehyksenä Schistosoma japonicumin glutationi-S-transferaasigeenin koodausalueelle vektorissa pGEX-2T (D.B. Smith ja K.S. Johnson, Gene 67 (1998) 31-40).

25 Rekombinaatiomolekyylit, joissa on Smal-jakson oikea (syn) orientaatio, tunnistettiin rajoitusentsyymianalyysillä käyttäen standardinmukaisia menetelmiä. Tämän fuusiorakenteen omaaville E. coli DH5a-klooneille annettiin nimitykset pGEX-2T600sl, pGEX-2T600s2 ja pGEX-2T600s3.

30 A: Yhden pGEX-2T600-rakenteen diagrammi. GST-gE-fuusiotuotetta :· ' koodaavan alueen NH2-puolella sijaitsee isopropyylitiogalaktosidin (IPTG) indusoima tac-promoottorialue.

B. pGEX-2T600s:llä_transformoitujen_DH5a-soluien 35 kokonaisproteiinivalmisteiden Western blot -analyysistä saatujen valokuvien perusteella tehty piirustus. Yön yli viljeltyjä pGEX-2T600sl, pGEX-2T600s2 :.··· ja pGEX-2T600s3 -rakenteilla siirrettyjä DH5a-soluviljelmiä jatkettiin 1/10 110060 33

Luria-Bertani (LB) -väliaineessa, jossa oli 50 μg/ml ampisilliiniä, ja lh kasvun jälkeen niitä indusoitiin IPTG:llä 5 h ajan. Näitä indusoituja viljelmiä sentrifugoitiin 5 min nopeudella 6000 x g ja lisättiin 1 x kerrosseokseen (2 % SDS, 10 % glyserolia, 5 % merkaptoetanolia ja 0,01 % bromofenolisinistä) 5 [1,5 ml viljelmää 500 μΐ-.ssa kerrosseosta] ja kuumennettiin 95°C:ssa 5 min ajan. Tämän jälkeen 50 μΐ väylää kohti erotettiin pystysuoralla 12,5-prosenttisella polyakryyliamidigeelillä standardinmukaisilla menetelmillä ja sitten blotattiin puolikuivalla menetelmällä nitroselluloosasuodattimeen käyttäen LKB-multiphor II Nova Blot -järjestelmää valmistajan määrittämissä 10 olosuhteissa.

Väylillä M käytettiin esivärjättyä merkitsinproteiinia (BRL Life Technologies,

Inc. 236k, 112k, 71k, 44k, 28k, 18k ja 15k) ja väylillä 1, 2 ja 3 vastaavasti kolmella kehyksellä pGEX-2T600s 1, pGEX-2T600s2 ja pGEX-2T600s3 15 siirrettyjen DH5a-solujen kokonaisproteiinivalmisteita.

Kentässä A voidaan nähdä anti-GST-seerumilla tehdyn Western blot -analyysin tulos. Tätä analyysia varten suodatinta inkuboitiin standardinmukaisilla menetelmillä (E. Harlow ja D. Lane, 1986, Antibodies: a 20 laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) estopuskurissa (PBS + 2 % maitojauhetta ja 0,05 % Tween 20:ta) ja tämän jälkeen polyklonaalisessa kaniinin anti-GSP-seerumissa. Suodatin pestiin ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasilla (HRPO) konjugoidun vuohi-anti-kaniini -immunoglobuliiniseerumin kanssa. Tämän jälkeen sitoutuneet vuohen vasta-25 aineet tunnistettiin immunokemiallisesti kromogeenillä (diaminobentsidiini, kloronaftoli ja H2O2). GST-fuusiotuotteella, joka on merkitty nuolella, on n.

47 k arvioitu koko vain ruudussa 3.

Kentässä B voidaan nähdä gE-proteiinin tunnistavalla monoklonaalisella 30 vasta-aineella Mab 4 tehdyn Western blot -analyysin tulos. Tätä analyysia varten kentän A mukainen duplo-suodatin estettiin, inkuboitiin monoklonaalisella vasta-aineella, pestiin ja inkuboitiin HRPO-konjugoidulla . ' kaniini-anti-hiiri -seerumilla. Tämän jälkeen sitoutuneet kaniinin vasta-aineet tunnistettiin immunokemiallisesti kromogeenillä. Väylällä 3 (rakenne 3) ': ·. 35 näkyvä nauha on kooltaan 47 k, ja se on merkitty nuolella.

110060 34

Kuva 9:pEVHisgE:n konstruoiminen BHV-l:n gE-geenin eukarvoottista ilmentymistä varten gE-geenin eukaryoottista ilmentymistä varten kloonattiin koko gE:n 5 koodausalue oikeassa suunnassa ilmentämisvektorin pEVHis HCMV-promoottorialueen taakse käyttäen standardinmukaisia menetelmiä (Sambrook ym. 1989). Tätä tarkoitusta varten 394 bp:n pituinen Alul-osa, joka alkaa 55 bp ennen gE:n avointa lukukehystä, kloonattiin pUC18:aan, ja sille annettiin nimitys p201. Kun p201 oli HincII-pilkottu, 1740 bp:n pituinen HincII-jakso, 10 joka käsittää suuremman osan gE-geeniä, kloonattiin p201:een. Tästä syntyi tuloksena plasmidi p318, joka pUC18:n monisidoksessa käsittää koko gE-geenin koodausalueen 55 bp ennen gE:n aloituskoodonia olevasta Alul-kohdasta HincII-kohtaan, joka sijaitsee 133 bp gE:n lopetuskoodonin takana.

Vektorin monisidoksessa olevia restriktioentsyymikohtia käyttäen tämä jakso 15 leikattiin p318:sta entsyymeillä BamHI ja SphI. Ensin p318 pilkottiin SphElla ja tämän jälkeen SphI-kohta täytettiin käyttäen Klenowin polymeraasia ja dNTP.itä. BamHI-pilkonnan jälkeen 1,9 kb:n pituinen siirrännäinen erotettiin pUC18-vektorista alhaisen sulamispisteen omaavassa agaroosissa (Low Melting Point Agarose) ja sidottiin pEVHis-vektorissa, joka oli pilkottu 20 BamHI:lla ja EcoRVrlla kanssa tätä tarkoitusta varten. Näin muodostetulle plasmidille annettiin nimitys pEVHis/gE.

Kuva 10: gE-spesifisten alukkeiden ia koettimien sijainti PCR-menetelmässä BHV-l:n DNA:n tunnistamiseksi 25

Kuvassa on esitetty BHV-l:n glykoproteiinin gE geenin nukleiinihapposekvenssi nukleotidistä 1272 nukleotidiin 2027 [sekvenssi on otettu kuvassa 3 esitetystä]. gE-spesifistä PCR-menetelmää varten käytetyille alukkeille annettiin nimitykset P3 ja P4. Alukkeiden P3 ja P4 on alleviivattu.

30 P3:n nukleotidisekvenssi on 5’-ACG-TGG-TGG-TGC-CAG-TTA-GC-3’ (SEQ ID NO:2). P4:n nukleotidisekvenssi on (edellä määritellyn alukkeen sidossekvenssin komplementti) 5’-ACC-AAA-CTT-TGA-ACC-CAG-AGC-. G-3’ (SEQ ID NO: 3). Koetin, jota käytettiin Southern blot -hybridisaatiossa PCR-vahvistetun DNA:n tunnistamiseksi, on 137 bp:n pituinen TaqI-jakso, ’ 1'. 35 joka sijaitsee alukkeiden sidoskohtien välissä, jolloin tämän jakson päät on esitetty. Jotta voidaan tehdä vertailuja kuvaan 3 nähden, on myös esitetty , · HindlH- ja EcoNI-kohdat.

110060 35

Kuva 11: Difivac-1 :n gE-häviämän kartoitus

Kentässä A on esitetty fyysinen kartta BHV-l:n villin tyypin Lam-kannan 5 EcoRI-jaksosta, jonka pituus on 15,5 kb. Kentässä B on esitetty fyysinen kartta Difivac-l:n EcoRI-jaksosta, jonka pituus on 14,5 kb. Kummatkin EcoRI-osat kattavat vastaavien virusten perimien ainoat lyhyet alueet (Unique short regions) kokonaan. gE-geenin asema ja gl-geenin oletettu asema on osoitettu avoimin laatikoin. Kartat A ja B on sijoitettu siten, että kummassakin 10 kartassa 6 kb:n pituiset Pstl-jaksot ovat kohdakkain. Kummassakin kartassa sisäiset toisintosekvenssit ja lopussa olevat toisintosekvenssit on osoitettu vinoviivoitetuin laatikoin. Toisintojen alapuolella olevat nuolet osoittavat näiden sekvenssien suuntaa.

15 Kentässä A on esitetty se osa Us-aluetta, joka puuttuu Difivac-1-kannasta.

Kentässä C on esitetty gE-häviämän kartoittamiseksi ja B:ssä esitetyn fyysisen kartan aikaansaamiseksi käytettyjen kloonattujen Difivac-1-jaksojen sijainti.

Kloonien p728, p737 ja p754 liitännäisten alapuolella olevat nuolet osoittavat 20 alueita, joiden sekvenssi on kartoitettu rekombinaatiokohdan määrittämiseksi.

Lyhenteitä: A = AluI, E = EcoRI, P = PstI, H = Hindlll, r = rekombinaatiokohta, IR = sisäinen toisinto, TR = lopetustoisinto 25

Kuva 12: Difivac-1 :n Us-alueen täsmällisen rekombinaatiokohdan määrittäminen

Difivac-1-kannasta löydetyn gE-häviämän täsmällisten rajojen 30 määrittämiseksi on kartoitettu kloonin p754 sekvenssi sekä kloonien p728 ja '· * p737 päiden sekvenssi. Näiden kloonien liitännäiset on esitetty kuvassa 11.

:,. Käytetyt sekvenssien kartoitusmenetelmät on selostettu kuvan 3 selityksissä.

Kentässä A on esitetty AluI-Pstl-jakson pääosan sekvenssistä. Tämä sekvenssi · · 35 alkaa gE-geenin promoottorialueelta. Oletettu TATA-laatikko on alleviivattu.

.: Rekombinaatiokohdassa r tämä promoottorialue fuusioituu sekvenssiin, joka ,*·; on löydetty myös Us-alueen vastakkaisesta kohdasta, nimeltään 110060 36 käänteistoisinto. Täsmällinen rekombinaatiokohta on määritetty vertailemalla gE-promoottorialueelta löydettyä toisintoa Us-alueen vastakkaisesta kohdasta löydetyn toisinnon kopioon. Kohtaa, jossa nämä sekvenssit poikkeavat, on kentässä B(I) merkitty r:llä. Samantapainen vertailu 5 on tehty Difivac-l:stä löydetyn gE-promoottorisekvenssin ja villin tyypin Lam-kannasta löydetyn gE-promoottorin kesken. Kohtaa, jossa nämä sekvenssit poikkeavat, on kentässä B(II) merkitty samoin r:llä. Löydetyt rekombinaatiokohdat ovat samat.

10 Kuva 13:BHV-l:n gl-geenin osittainen sekvenssianalyysi Käyttämällä BHV-1 :n Lam-kannan 1,8 kb:n pituista Pstl-kloonia, joka ulottuu BHV-l:n sekä gl- että gE-geeniin (ks. Fig. 11), määritettiin 284 nukleotidin sekvenssi BHV-1 :n gl:n koodausalueella. Käytetyt sekvenssi-15 kartoitusmenetelmät on selostettu kuvan 3 selitysten yhteydessä. Sekvenssin käännös perustuu yleispätevään koodiin, ja se on tehty PC/gene-tietokoneohjelmalla versio 1,03 (marraskuu 1987). Toisen lukukehyksen koodaama aminohapposekvenssi on esitetty yksikirjaimisina koodeina nukleotidisekvenssin alapuolella. Tämä aminohapposekvenssi on homologinen 20 muiden herpesviruksen gl-homologien koodausalueen kanssa (ks. Fig. 14).

Kuva 14: Oletetun BHV-1 :n gl-geenin osittaisen aminohapposekvenssin aminohappovertailu herpes simplex -viruksen (HSV1) gl-geenin.

pseudorabiesviruksen (PRV) gp63-geenin ia varicella-zoster-viruksen (VZV) 25 gpIV-geenin koodausalueen vastaavien osien kanssa PRV-sekvenssi alkaa koodausalueensa aminohapon 82 kohdalla, HSV1-sekvenssi aminohapon 80 kohdalla, ja VZV-sekvenssi aminohapon 76 kohdalla. Käytetyt sekvenssit on julkaistu raporteissa, jotka on mainittu kuvan 30 4 selitysten yhteydessä. Vertailu tehtiin käyttämällä Multalin- tietokoneohjelmaa. Tähdillä on merkitty identtisiä aminohappoja ja kaksoispisteillä analogisia aminohappoja.

37 110060

Kuva 15:MSVneoGI-plasmidin konstruoiminen BHV-l:n gl-geenin euka-rvoottista ilmentämistä varten 5 BHV-l:n gl-geenin osittaisen sekvenssin aminohappovertailun perusteella on arvioitu BHV-l:n gl-geenin oletettu sijaintikohta. Tämän arvioinnin perusteella pääteltiin, että 1,7 kb:n pituinen Smal-jakso sisältää BHV-l:n gE-geenin täydellisen koodausalueen. Tämän 1,7 kb:n pituisen Smal-jakson sijainti on merkitty kentässä A. Tämän 1,7 kb:n pituisen Smal-jakson tylppiin 10 päihin on standardinmukaisia menetelmiä käyttäen liitetty BamHI-sitojat. Näin saatu tuote pilkottiin BamHLlla ja liitettiin eukaryoottiseen ilmentämisvektoriin MSV-neo. MSV-neo-vektorissa on ainoa BamHI-kohta MSV-LTR:n takana, jolla on vahva promoottorivaikutus. Tämä vektori on kuvattu julkaisussa Rijsewijk ym, 1987 EMBO J. 6, 127-131.

15

Kuva 16: BHV-l:n gl/gE-kaksoishäviämäjakson konstruoiminen

Glykoproteiinin gE geenin asema ja glykoproteiinin gl geenin oletettu asema BHV-l:n Us-alueella on esitetty diagrammissa A. Vinoviivoitetut lohkot 20 osoittavat Us-aluetta rajaavia toisintoja. Kentässä B on esitetty fyysinen kartta eräistä oleellisista restriktioentsyymikohdista kummankin geenin sijainnin suhteen. gl/gE-häviämäjakson konstruoimiseksi klooni pl,7-SmaI/o, joka sisältää gl-geeniä ympäröivän 1,7 kb:n pituisen Smal-jakson, pilkotaan PstLlla. Jäljellä olevan 350 bp:n pituisen Smal-Pstl-liitännäisen Pstl-kohdan 25 pää tylpistetään käyttäen standardinmukaisia molekyylibiologisia menetelmiä.

Myös EcoNISmal-jakson (ks. Fig. 6B), joka on eristetty kuvan 6A yhteydessä kuvatusta 4,1 kb:n pituisesta Hindlll-EcoRI-jaksosta, pää tylpistetään ja liitetään muunnettuun Pstl-kohtaan. Tämä on esitetty diagrammeissa C ja D.

Näin saadusta kloonista ρΔΙΕ voidaan Smal-Dral-jakso eristää BHV-l:n villin 30 tyypin DNA:n kanssa rekombinoimiseksi.

r »

Lyhenteitä: E = EcoRI, H = Hindlll, S = Smal, P = PstI, ENI = EcoNI, D = I ’ · ‘ Dral, kb = kiloemäs, Us = unique short j ► 110060 38

Kuva 17: Viruksen nenästä erittymisen keskiarvo vasikoilla rokotuksen jälkeen 5 · = Difivac-1:11a rokotettu o = rokottamaton verrokki

Kuva 18: Vasikoiden päivittäisen kliinisen arvon keskiarvo BHV-l:n virulentilla kannalla altistamisen jälkeen, merkinnät kuten kuvassa 17.

10

Kuva 19: Vasikoiden peräsuolen lämpötilan keskiarvo BHV-l:n virulentilla kannalla altistamisen jälkeen, merkinnät kuten kuvassa 17.

Kuva 20: Vasikoiden kasvun keskiarvo BHV-l:n virulentilla kannalla 15 altistamisen jälkeen, merkinnät kuten kuvassa 17.

Kuva 21: Viruksen nenästäerittvmisen keskiarvo vasikoilla BHV-t:n virulentilla kannalla altistamisen jälkeen, merkinnät kuten kuvassa 17.

20 Kuva 22: Vasikoiden peräsuolen lämpötilan keskiarvo BHV-1 :n virulentilla kannalla altistamisen jälkeen • = Lam gE:llä rokotettu o = Lam gE7TK':lla rokotettu 25 x = rokottamaton verrokki i . V Kuva 23: Vasikoiden kasvun keskiarvo BHV-1 :n virulentilla kannalla \ ; altistamisen jälkeen, merkinnät kuten kuvassa 22 30 Kuva 24: Vasikoiden päivittäisen kliinisen arvon keskiarvo BHV-1 :n virulentilla kannalla altistamisen jälkeen, merkinnät kuten kuvassa 22.

110060 39

Taulukko 1: Viruksen nenästäerittvminen vasikoilla Lam gE':lIä ia Lam gE7TK :llä rokottamisen ia BHV-l:n virulentilla kannalla altistamisen jälkeen näissä rokotetuissa vasikoissa ia verrokkivasikoissa

Viruksen nenästäerittymisen keskimääräinen kesto päivinä

Ryhmä Rokotuksen jälkeen Altistamisen jälkeen verrokki 0 10,33 ±1,51

Lam gE' 7,00±0,89 4,83±1,17

LamgETTK' 7,17±1,33 5,17±0,98

Taulukko 2: Monoklonaalisten qE-vasta-aineiden fMab) tunnusmerkit

Mab gE-Mab-ehdokkaiden reaktiivisuus seuraavien kanssa:

Difi- Lam Prok. 3T3 gE 3T3 gE 3t3 Ag Ab vac-l gE" Difi- gE/gl ryhmä karja 3T3/ vac-l

EBTR

1- -nd- + ? I + 2- -- + + + I - 3- -+ + + + ? - 4 — — + + + + ? — 42 nd - ? V? ± 51 - nd ? + III + 52--+ + + + ?- * : 53 - nd + + III + 59 - - nd - + III + 66 - nd + + + III + 67 - - nd + + III + 68---+ + +IV + 72--- + + + V ± 75 --nd - + ? I + i 78 - - nd - + ? nd - 81 - - - + + + II? + : Kaikissa 8 testatussa seerumissa estoprosentti oli > 50 % epäsuorassa IPMA-blocking -testissä.

± : Seerumien estoprosentti oli ± 50 %.

- : Seerumien estoprosentti oli < 50 %.

110060 40 SEKVENSSILISTAUS SEQ ID NO:1 PITUUS: 2027 nukleotidia, 575 aminohappoa 5 TYYPPI: nukleotidi ja aminohappo SÄIKEISYYS: yksinkertainen AGGGCGGAGC GTTGAGCGGC CCGACCGCCG CCGGGTTGTT AAAXGGGTCT CGCGCGGCTC €0 10 |-> deleted in Oifivacl GTGGTTCCAC ACCGCCGGAG AACCAGCGCfi AGCTTCGCTG CGTGTGTCCC GCGAGCTGCG 120

AsuII

15 TTCCGGGGAA CGGCGCACGC GAGAGGGTTC GAAAAGGGCA TTTGGCA 167 ATG CAA CCC ACC GCG CCG CCC CGG CGG CGG TTG CTG CCG CTG CTG CTG 215

Het Gin Pro Thr Ala Pro Pro Arg Arg Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu 20 1 5 10 15 ——.......———— ---------- SIGNAL PEPTIDE —————— CCG CAG TTA TTG CTT TTC GGG CTG ATG GCC GAG GCC AAG CCC GCG ACC 263 25 Pro Gin Leu Leu Leu Phe Gly Leu Met Ala Glu Ala Lys Pro Ala Thr 20 25 30

SmaX

30 GAA ACCL£CG_££C TCG GCT TCG GTC GAC ACG GTC TTC ACG GCG CGC GCT 311

Glu Thr Pro Gly Ser Ala Ser Vai Asp Thr Vai Phe Thr Ala Arg Ala 35 40 45 35 GGC GCG CCC GTC TTT CTC CCA GGG CCC GCG GCG CGC CCG GAC GTG CGC 359

Gly Ala Pro Vai Phe Leu Pro Gly Pro Ala Ala Arg Pro Asp Vai Arg 50 55 60 40 GCC G TT CGC GGC TGG AGC GTC CTC GCG GGC GCC TGC TCG CCG CCC GTG 407

Ala Vai Arg Gly Trp Ser Vai Leu Ala Gly Ala Cys Ser Pro Pro Vai 65 70 75 · 80 45 CCG GAG CCC GTC TGC CTC GAC GAC CGC GAG TGC TTC ACC GAC GTG GCC 455

Pro Glu Pro Vai Cys Leu Asp Asp Arg Glu Cys Phe Thr Asp Vai Ala 85 90 95 50 CTG GAC GCG GCC TGC CTG CGA ACC GCC CGC GTG GCC CCG CTG GCC ATC 503 • - Leu Asp Ala Ala Cys Leu Arg Thr Ala Arg Vai Ala Pro Leu Ala Ile 100 105 110 |55 GCG GAG CTC GCC GAG CGG CCC GAC TCA ACG GGC GAC AAA GAG TTT GTT 551

Ala Glu Leu Ala Glu Arg Pro Asp Ser Thr Gly Asp Lys Glu Phe Vai 115 120 125 110060 41

PvuII

CTC GCC GAC CCG CAC GTC TCG GCG CAG CTG GGT CGC AAC GCG ACC GGG 599

Leu Ala Asp Pro His Val Ser Ala Gin Leu Gly Arg Aan A3 a Thr Gly 130 135 140 5 GTG CTG ATC GCG GCC GCA GCC GAG GAG GAC GGC GGC GTG TAC TTC CTG 647

Val Leu lie Ala Ala Ala Ala Glu Glu Asp Gly Gly Val Tyr Phe Leu 145 150 155 160 10 TAC GAC CGG CTC ATC GGC GAC GCC GGC GAC GAG GAG ACG CAG TTG GCG 695

Tyr Asp Arg Leu lie Gly Asp Ala Gly Asp Glu Glu Thr Gin Leu Ala 165 170 175 15 CTG ACG CTG CAG GTC GCG ACG GCC GGC GCG CAG GGC GCC GCG CGG GAC 743

Leu Thr Leu Gin Val Ala Thr Ala Gly Ala Gin Gly Ala Ala Arg Asp 180 185 190 20 GAG GAG AGG GAA CCA GCG ACC GGG CCC ACC CCC GGC CCG CCG CCC CAC 791

Glu Glu Arg Glu Pro Ala Thr Gly Pro Thr Pro Gly Pro Pro Pro His 195 200 205 25 CGC ACG ACG ACA CGC GCG CCC CCG CGG CGG CAC GGC GCG CGC TTC CGC 839

Arg Thr Thr Thr Arg Ala Pro Pro Arg Arg His Gly Ala Arg Phe Arg 210 215 220 30 Smal GTG CTG CCG TAC CAC TCC CAC GTA TAC ACC CCG GGC GAT TCC TTT CTG 887

Val Leu Pro Tyr His Ser His Val Tyr Thr Pro Gly Asp Ser Phe Leu 225 230 235 240 35 CTA TCG GTG CGT CTG CAG TCT GAG TTT TTC GAC GAG GCT CCC TTC TCG 935

Leu Ser Val Arg Leu Gin Ser Glu Phe Phe Asp Glu Ala Pro Phe Ser 245 250 255 40 GCC AGC ATC GAC TGG TAC TTC CTG CGG ACG GCC GGC GAC TGC GCG CTC 983

Ala Ser lie Asp Trp Tyr Phe Leu Arg Thr Ala Gly Asp Cys Ala Leu 260 265 270 45 ATC CGC ATA TAC GAG ACG TGC ATC TTC CAC CCC GAG GCA CCG GCC TGC 1031 lie Arg lie Tyr Glu Thr Cys lie Phe His Pro Glu Ala Pro Ala Cys 275 280 285 50 CTG CAC CCC GCC GAC GCG CAG TGC AGC TTC GCG TCG CCG TAC CGC TCC 1079

Leu His Pro Ala Asp Ala Gin Cys Ser Phe Ala Ser Pro Tyr Arg Ser ; 290 295 300 v 55 GAG ACC GTG TAC AGC CGG CTG TAC GAG CAG TGC CGC CCG GAC CCT GCC 1127

Glu Thr Val Tyr Ser Arg Leu Tyr Glu Gin Cys Arg Pro Asp Pro Ala V 305 310 315 320 42 110060 GGT CGC TGG CCG CAC GAG TGC GAG GGC GCC GCG TAC GCG GCG CCC GTT 1175

Gly Arg Trp Pro His Glu Cys Glu Gly Ala Ala Tyr Ala Ala Pro Val 325 330 335 5 GCG CAC CTG CGT CCC GCC AAT AAC AGC GTA GAC CTG GTC TTT GAC GAC 1223

Ala His Leu Arg Pro Ala Aan Asn Ser Val Asp Leu Val Phe Asp Asp 340 345 350 10 GCG CCG GCT GCG GCC TCC GGG CTT TAC GTC TTT GTG CTG CAG TAC AAC 1271

Ala Pro Ala Ala Ala Ser Gly Leu Tyr Val Phe Val Leu Gin Tyr Asn 355 360 365 15

HindXIX

GGC CAC GTG GAA GCT TGG GAC TAC AGC CTA GTC GTT ACT TCG GAC CGT 1319

Gly His Val Glu Ala Trp Asp Tyr Ser Leu Val Val Thr Ser Asp Arg 370 375 380 20 TTG GTG CGC GCG GTC ACC GAC CAC ACG CGC CCC GAG GCC GCA GCC GCC 1367

Leu Val Arg Ala Val Thr Asp His Thr Arg Pro Glu Ala Ala Ala Ala 385 390 395 400 25 GAC GCT CCC GAG CCA GGC CCA CCG CTC ACC AGC GAG CCG GCG GGC GCG 1415

Asp Ala Pro Glu Pro Gly Pro Pro Leu Thr Ser Glu Pro Ala Gly Ala 405 410 415 30 CCC ACC GGG CCC GCG CCC TGG CTT GTG GTG CTG GTG GGC GCG CTT GGA 1463

Pro Thr Gly Pro Ala Pro Trp Leu Val Val Leu Val Gly Ala Leu Gly 420 425 430 35 ----------—— ---TRANSMEMBRANE HELIX -------- CTC GCG GGA CTG GTG GGC ATC GCA GCC CTC GCC GTT CGG GTG TGC GCG 1511

Leu Ala Gly Leu Val Gly Ixe Ala Ala Leu Ala Vai Äi.<j Val Cys Ala 40 435 440 445 CGC CGC GCA AGC CAG AAG CGC ACC TAC GAC ATC CTC AAC CCC TTC GGG 1559 . V 45 Arg Arg Ala Ser Gin Lys Arg Thr Tyr Asp lie Leu Asn Pro Phe Gly 450 455 460 CCC GTA TAC ACC AGC TTG CCG ACC AAC GAG CCG CTC GAC GTG GTG GTG 1607 50 Pro Val Tyr Thr Ser Leu Pro Thr Asn Glu Pro Leu Asp Val Val Val 465 470 475 480 CCA GTT AGC GAC GAC GAA TTT TCC CTC GAC GAA GAC TCT TTT GCG GAT 1555 55 Pro Val Ser Asp Asp Glu Phe Ser Leu Asp Glu Asp Ser Phe Ala Asp • 485 490 495

I I

110060 43 GAC GAC AGO GAC GAT GAC GGG CCC GOT AGC AAC CCC CCT GCG GAT GCC 1703

Asp Asp Ser Asp Asp Asp Gly Pro Ala Ser Asn Pro Pro Ala Asp Ala 500 505 510 5 TAC GAC CTC GCC GGC GCC CCA GAG CCA ACT AGC GGG TTT GCG CGA GCC 17S1

Tyr Asp Leu Ala Gly Ala Pro Glu Pro Thr Ser Gly Phe Ala Arg Ala 515 520 S25 10 CCC GCC AAC GGC ACG CGC TCG AGT CGC TCT GGG TTC AAA GTT TGG TTT 1799

Pro Ala Asn Glv Thr Arg Ser Ser Arg Ser Gly Phe Lys Val Trp Phe 530 535 540 15 AGG GAC CCG CTT GAA GAC GAT GCC GCG CCA GCG CGG ACC CCG GCC GCA 1847

Arg Asp Pro Leu Glu Asp Asp Ala Ala Pro Ala Arg Thr Pro Ala Ala S45 550 555 560 20 EeoNl CCA GAT TAC ACC GTG GTA GCA GCG CGA CTC AAG TCC ATC CTC CGC TAG 1895

Pro Asp Tyr Thr Val Val Ala Ala Arg Leu Lys Ser lie Leu Arg 1 565 570 575 25 QCGCCCCCCC CCCCCCGCGC GCTGTGCCGT CTGACGGAAA GCACCCGCGT GTAGGGCTGC 1955 ATATAAATGG AGCGCTCACA CAAAGCCTCG TGCGGCTGCT TCGAAGGCAT GGAGAGTCCA 2015 CGCAGCGTCG TC 2027 30 SEQ ID NO:2 PITUUS: 20 nukleotidia TYYPPI: nukleotidi SÄIKEISYYS: yksinkertainen 35 ACGTGGTGGT GCCAGTTAGC 20 SEQ ID NO:3 PITUUS: 22 nukleotidia TYYPPI: nukleotidi 40 SÄIKEISYYS: yksinkertainen ACCAAACTTT GAACCCAGAG CG ‘22 • » » » » t «

Claims

110060

1. Menetelmä rokotekoostumuksen saamiseksi eläinten, erityisesti nisäkkäiden, tarkemmin nautaeläinten rokottamiseksi niiden suojaamiseksi

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jolloin mainittu häviämä gE-geenissä on aiheutettu heikennysmenetelmällä pikemminkin kuin konstruoitu DNA-rekombinaatiomenetelmillä.

3. Patenttivaatimukseni mukainen menetelmä, jolloin saatu mutantti on Difivac-1 (Institut Pasteur France, tallennusnumero 1-1213).

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jolloin mainittu häviämä on konstruoitu DNA-rekombinaatiomenetelmillä. 20

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jolloin mutantissa on mainitun glykoproteiinin gE geenin häviämän lisäksi häviämä glykoproteiinin gl geenissä.

5 BHV-1-virusta vastaan, jolloin rokotekoostumus muodostetaan BHV-1 - mutantista ja sopivasta kantajasta tai apuaineesta, jolloin mainitussa BHV-1 -mutantissa on häviämä glykoproteiinin gE geenissä, joka gE on proteiini, jolla erityisessä BHV-l-kannassa on kuvan 3A mukainen aminohapposekvenssi ja joka voidaan erottaa serologisesti villiä tyyppiä olevasta BHV-1 :stä. 10

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jolloin mainittu mutantti valitaan prosessissa, jossa erotetaan BHV-1-virukset, joissa on koskematon gE geeni, ja BHV-1-virukset, joissa on häviämä gE geenissä, jolloin mainittu prosessi käsittää vaiheen, jossa tutkitaan, reagoiko viruksen aminohappo gErlle spesifisten koettimien tai alukkeiden kanssa, jotka on saatu 30 glykoproteiinia gE koodaavista nukleotidisekvensseistä.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jolloin mainittu mutantti valitaan prosessissa, jossa erotetaan BHV-1-virukset, jotka ilmentävät glykoproteiinia gE, ja BHV-1-virukset, joissa on häviämä glykoproteiinin gE 35 geenissä, jolloin mainittu prosessi käsittää vaiheen, jossa tutkitaan, reagoiko virus gE:lle spesifisten vasta-aineiden kanssa, jotka on muodostettu gE:tä tai gE:n aminohapposekvenssistä saatuja peptidejä vastaan. I * * 110000