FI105690B - Process for the preparation of oxidized starch - Google Patents

Description

105690105690

Menetelmä hapetetun tärkkelyksen valmistamiseksiProcess for the preparation of oxidized starch

Esillä oleva keksintö koskee patenttivaatimuksen 1 johdannon mukaista menetelmää 5 hapetetun tärkkelyksen valmistamiseksi.The present invention relates to a process 5 for the preparation of oxidized starch according to the preamble of claim 1.

Tällaisen menetelmän mukaan tärkkelyspitoinen substraatti saatetaan kosketuksiin okso-ammonium-ionia tuottavan reagenssin kanssa hapetusaineen läsnäollessa. Reaktio suoritetaan sopivimmin nestemäisessä väliaineessa ja reaktiotuote erotetaan väliaineesta reaktion 10 jälkeen, pestään ja kuivatetaan.According to such a method, the starch-containing substrate is contacted with an oxo-ammonium ion-producing reagent in the presence of an oxidizing agent. The reaction is preferably carried out in a liquid medium and the reaction product is separated from the medium after the reaction, washed and dried.

Tärkkelys on luonnonpolymeeri, jonka johdannaisia käytetään paperi-ja kartonkiteollisuu-dessa täyteaineina, liimaukseen ja päällystykseen. Hapetettuja tärkkelysjohdannaisia kuten myös tärkkelyseettereitä ja kationoituja tärkkelyksiä käytetään pinta-liimaukseen paperin 15 lujuuden ja painatusominaisuuksien parantamiseen sekä päällystyksen sideaineina sitomaan pigmenttihiukkaset toisiinsa ja pohjapaperiin.Starch is a natural polymer whose derivatives are used in the paper and board industry as fillers, adhesives and coatings. Oxidized starch derivatives as well as starch ethers and cationic starches are used for surface sizing to improve the strength and printing properties of the paper 15 and as coating binders to bind the pigment particles to one another and the base paper.

• · v, ·' Tärkkelys hapetetaan teollisesti pääasiallisesti epäorgaanisten hapettimien, kuten natrium- • # * : V hypokloriitin avulla, jolloin tärkkelysdispersion viskositeetti alenee sopivalle tasolle ja osa ' 20 tärkkelyksen hydroksyyliryhmistä hapettuu karbonyyli- ja karboksyyli-ryhmiksi. Primääri- iThe starch is industrially oxidized mainly by inorganic oxidants such as sodium hypochlorite, whereby the viscosity of the starch dispersion is reduced to a suitable level, and some of the hydroxyl groups of the starch are oxidized to carbonyl and carboxyl groups. Primary i

« « I«« I

;; · · sistä hydroksyyliryhmistä saadaan hapettamalla uronihapporyhmiä. Karboksyyliryhmät • i — - — • f · p t t ( ............;; · · These hydroxyl groups are obtained by oxidation of uronic acid groups. Carboxyl groups • i - - - • f · p t t (............

*... lisäävät dispersion viskositeettistabiilisuutta. Hypokloriittihapetukselle on esitetty vaih- • · « • i i toehtoisina menetelminä vetyperoksidin, bromin, perjodaatin, otsonin ja hapen käyttöä, ;·, joista vetyperoksidihapetus on lupaavin vaihtoehto (1 - 2).* ... increase the viscosity stability of the dispersion. Alternative methods for hypochlorite oxidation have been proposed using hydrogen peroxide, bromine, periodate, ozone and oxygen, among which hydrogen peroxide oxidation is the most promising alternative (1-2).

• ·· ____ • _ ··· 25 .....• ·· ____ • _ ··· 25 .....

• · · · - ·------- - • ________ - . Perinteisiin hapetusmenetelmiin liittyy se ongelma, ettei hapetus ole tarpeeksi spesifinen • · .,..; primäärisille OH-ryhmille. Kemiallisissa hapetuksissa primääristen OH-ryhmien lisäksi • « •. hapettuvat aina myös sekundääriset OH-ryhmät jossain määrin. Sekundääristen OH-ryhmi- « « en hapettuminen johtaa polymeeriketjun katkeamiseen, depolymeroitumiseen. Tämän I f 30 vuoksi tärkkelyksen j a muiden luonnon polysakkaridien hapetukseen on jo kauan etsitty spesi-fisempiä menetelmiä.• · · · - · ------- - • ________ -. The problem with conventional oxidation methods is that oxidation is not specific enough • ·., ..; for primary OH groups. In chemical oxidation, in addition to primary OH groups • «•. secondary OH groups are always oxidized to some extent. Oxidation of secondary OH groups results in polymer chain breakdown, depolymerization. Because of this I f 30, more specific methods for the oxidation of starch and other natural polysaccharides have long been sought.

105690 2105690 2

Erittäin selektiivinen TEMPO-johdannainen edustaa kiinnostavaa hapetusvaihtoehtoa. TEMPO-radikaali voidaan kirjallisuuden mukaan hapettaa hypohaliittien, kuten hypokloriitin ja -bromiitin avulla. Hapetettu TEMPO hapettaa puolestaan erilaisia primäärisiä alkoholiryhmiä karboksyyleiksi.The highly selective TEMPO derivative represents an interesting oxidation alternative. According to the literature, the TEMPO radical can be oxidized by hypohalites such as hypochlorite and bromite. Oxidized TEMPO, in turn, oxidizes various primary alcohol groups to carboxyls.

5 TEMPO-radikaalin (2,2,6,6-tetrametyyli-piperidiini-l-oksyyli) on todettu hapettavan erittäin selektiivisesti hiilihydraattipolymeerien primäärisiä OH-ryhmiä. Varsinaisena hapettimena toimii oksoammonium-ioni (nitrosonium-ioni)Joka saadaan hapettamalla TEMPO:a ensin hypohaliittien, kuten hypokloriitin tai -bromiitin avulla. Oksoammonium-ioni hapettaa hiilihyd-10 raattien primäärisiä OH-ryhmiä karbonyyleiksi, j otka voidaan edelleen hapettaa karboksyyleik- si.The TEMPO radical (2,2,6,6-tetramethyl-piperidine-1-oxyl) has been found to selectively oxidize primary OH groups in carbohydrate polymers. The actual oxidant is the oxoammonium ion (nitrosonium ion), which is obtained by first oxidizing TEMPO with hypohalites such as hypochlorite or bromite. The oxoammonium ion oxidizes the primary OH groups of the carbohydrates to carbonyls which can be further oxidized to carboxyls.

TEMPO.a ja sen johdannaisia on käytetty aikaisemmin hapetettaessa alkoholien ja diolien primäärisiä hydroksyyliryhmiä aldehydeiksi sekä karboksyyleiksi samoin kuin hapetettaes-15 sa alifaattisia ja aromaattisia aldehydejä karboksyyleiksi. Tällöin mukana on ollut lisäkata-lyyttejä ja reaktio on tapahtunut alkaalisessa kaksifaasisysteemissä (3-5). TEMPO:a on käytetty myös erilaisten polysakkaridien, kuten tärkkelyksen hapettamiseen vesifaasissa (6- • · j ' ·' 9). Tällöin primäärihapettimina on ollut edellä mainittu hypokloriitti ja katalyyttinen määrä « » « : ·' natriumbromidia, joiden reagoidessa muodostuu vahvempi hapetin hypobromiitti.TEMPO and its derivatives have previously been used in the oxidation of primary hydroxyl groups of alcohols and diols to aldehydes and carboxyls, as well as in the oxidation of aliphatic and aromatic aldehydes to carboxyls. In this case, additional catalysts were present and the reaction occurred in an alkaline biphasic system (3-5). TEMPO has also been used to oxidize various polysaccharides, such as starch, in the aqueous phase (6-9 · 9). The primary oxidants have been the above-mentioned hypochlorite and a catalytic amount of sodium bromide, the reaction of which produces a stronger oxidant hypobromite.

« I«I

. 20 * 4 I I. 20 * 4 I I

|!" Menetelmän on todettu olevan erittäin selektiivinen ja tehokas. Välituotteena syntyy hydra- • · · .·:·. tottuneita aldehydeja vesiliuoksessa; aldehydit hapettuvat edelleen karboksyyleiksi (7-9).|! "The process has been found to be highly selective and effective. The intermediate produces hydrated, • · ·. ·: ·., Aldehydes in aqueous solution; the aldehydes are further oxidized to carboxyls (7-9).

• · · | *. < _ Tunnetun tekniikan epäkohtana on, että hypokloriitti on paitsi kallis myös ympäristölle 25 haitallinen. Tämä aiheuttaa ongelmia teollisuusmittakaavassa toimittaessa.• · · | *. The disadvantage of the prior art is that hypochlorite is not only expensive but also harmful to the environment. This causes problems on an industrial scale.

• · ....: Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on poistaa tunnettuun tekniikkaan liittyvät epäkoh- dat ja saada aikaan aivan uudenlainen menetelmä tärkkelyksen selektiiviseksi hapettami- . · · ·. seksi. Etenkin keksinnön tarkoituksena on saada aikaan uudenlainen ratkaisu tärkkelyspi- • · 30 toisen lähtöaineen hapettamiseksi oksoammonium-ionia tuottavan reaktantin kanssa, kuten TEMPO:n avulla, jolloin reaktantin regeneroivana hapettimena käytetään haliditonta hapetinta.It is an object of the present invention to overcome the drawbacks of the prior art and to provide a novel method for the selective oxidation of starch. · · ·. sex. In particular, it is an object of the present invention to provide a novel solution for oxidizing a starch silicon second precursor with an oxoammonium ion producing reactant, such as TEMPO, using a halide-free oxidant as a regenerating oxidant for the reactant.

3 1056903, 105690

Keksintö perustuu siihen ajatukseen, että TEMPO hapetetaan hapettavan entsyymin avulla. Sopivia hapettavia entsyymejä ovat fenoloksidaasit, etenkin lakkaasi ja peroksidaasit.The invention is based on the idea that TEMPO is oxidized by an oxidizing enzyme. Suitable oxidizing enzymes are phenol oxidases, especially laccase and peroxidases.

Täsmällisemmin sanottuna keksinnön mukaiselle ratkaisulle on pääasiallisesti tun-5 nusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.More specifically, the solution according to the invention is essentially characterized by what is stated in the characterizing part of claim 1.

Esillä olevalla keksinnöllä saavutetaan huomattavia etuja. Niinpä ratkaisulla saadaan aikaan varsin selektiivinen hapetus, jolloin hapetettuun tärkkelykseen saadaan syntymään sopivassa suhteessa sekä karboksyyli- että karbonyyliryhmiä. Käyttämällä fenoloksidaasia 10 regeneroivana hapettimena päästään edelleen eroon ympäristön kannalta ongelmalliseksi katsotuista halidi-pitoisista aineista. Lopullisena elektroniakseptorina toimii happi, jolloin samalla vältetään hankalien sivutuotteiden muodostuminen reaktiojäijestelmään, mikä helpottaa tuotteen erotusta ja puhdistusta. Niin ikään käytettessä hapettavaa entsyymiä, kuten fenoloksidaasia, regeneroivana hapettimena voidaan käyttää mietoja reaktio-olosuh-15 teitä, kuten neutraalia tai lähes neutraalia pH:ta ja alhaista lämpötilaa.The present invention achieves significant advantages. Thus, the solution provides quite selective oxidation, whereby both the carboxyl and carbonyl groups are formed in an appropriate ratio in the oxidized starch. By using phenoloxidase 10 as a regenerating oxidant, halide-containing substances that are considered environmentally problematic are still eliminated. Oxygen acts as the final electron acceptor while avoiding the formation of troublesome byproducts in the reaction system, which facilitates product separation and purification. Also when using an oxidizing enzyme such as phenol oxidase, mild reaction conditions such as neutral or near neutral pH and low temperature may be used as the regenerating oxidant.

Keksintöä ryhdytään seuraavassa lähemmin tarkastelemaan yksityiskohtaisen selityksen ja 4 « 1.'.' muutaman sovellutusesimerkin avulla. Selityksessä on viitattu oheiseen piirustukseen,In the following, the invention will be examined in more detail in the detailed description and 4 "1. '." with a few application examples. The description refers to the accompanying drawing,

M IM I

• t I• t I

: ·' jossa on kaaviomaisesti esitetty TEMPO:n reaktiot hapetusjärjestelmässä. Kuviossa IA on 20 esitetty TEMPO:n hapettuminen kemiallisten hapettimien vaikutuksesta ja kuviossa IB on: · 'Which schematically shows the reactions of TEMPO in the oxidation system. Figure 1A shows the oxidation of TEMPO by chemical oxidants and Figure 1B shows

IIIIII

!' annettu vastaava esitys keksinnön mukaisesta ratkaisusta, jossa hapetus saadaan aikaan < -----= * · · entsyymillä.! ' a corresponding disclosure of a solution according to the invention wherein the oxidation is achieved by an <----- = * · · enzyme.

« · · .........«· · .........

• - — — - -• - - - - -

Kuten kuviosta IA ja IB käy ilmi, stabiili nitroksyyliradikaali (kohta 1) hapettuu okso-• * * ------------ .As shown in Figures IA and IB, the stable nitroxyl radical (position 1) is oxidized by oxo • * * ------------.

25 ammoniumioniksi (kohta 2), joka hapettaa alkoholiryhmän (RCH2OH) esim. aldehydiksi • _________“ - (RCHO), jolloin oksoammoniumioni samalla pelkistyy hydroksyyliamiiniksi (kohta 3).25 to ammonium ion (step 2), which oxidizes the alcohol group (RCH2OH) to, for example, aldehyde • _________ “- (RCHO), thereby reducing the oxoammonium ion to hydroxylamine (step 3).

• · ________ .• · ________.

• f• f

Regeneroituvana hapetusaineena käytetään kuvion 1A mukaisesti hypokloriittia ja kuvios- [ ·'t sa 1B happea. Ensimmäisessä tapauksessa reaktioon tuodaan myös katalyyttinen määrä ·The regenerating oxidant used in Figure 1A is hypochlorite and patterned oxygen. In the first case, a catalytic amount is also introduced into the reaction ·

• « I• «I

30 bromidia, joka hapettuu hypobromiitiksi, joka on voimakkaampi hapetin kuin hypokloriitti.30 bromides which oxidize to hypobromite, which is a stronger oxidant than hypochlorite.

105690 4105690 4

Peroksidaaseja käytettäessä hapen tilalla voidaan käyttää vetyperoksidia elektroniaksepto-rina.When peroxidases are used, hydrogen peroxide can be used as an electron acceptor in place of oxygen.

Kuten edellä mainittiin, keksinnössä käytetään hapettavia (oksidatiivisia) entsyymejä.As mentioned above, the invention uses oxidizing (oxidative) enzymes.

5 Edullisia ovat fenolisten ryhmien hapettumista katalysoivat hapettavat entsyymit. Nämä entsyymit ovat oksidoreduktaaseja, kuten oksidaasit ja peroksidaasit. “Oksidaasit” ovat entsyymejä, jotka katalysoivat hapetusreaktiota käyttämällä molekulaarista happea substraattinaan, kun taas “peroksidaasit” ovat entsyymejä, jotka katalysoivat hapetusreaktioita käyttämällä vetyperoksidia substraattinaan. Fenoloksidaasit (EC 1.10.3.2 bentseenidioli:-10 happi oksidoreduktaasi) katalysoivat o- ja p-substituoitujen fenolisten hydroksyyliryhmien ja amino/amiiniryhmien hapettumista monomeerisissa ja polymeerisissä aromaattisissa yhdisteissä.Oxidizing enzymes catalyzing the oxidation of phenolic groups are preferred. These enzymes are oxidoreductases such as oxidases and peroxidases. "Oxidases" are enzymes that catalyze an oxidation reaction using molecular oxygen as its substrate, while "peroxidases" are enzymes that catalyze an oxidation reaction using hydrogen peroxide as its substrate. Phenoloxidases (EC 1.10.3.2 Benzene diol: -10 oxygen oxidoreductase) catalyze the oxidation of o- and p-substituted phenolic hydroxyl groups and amino / amine groups in monomeric and polymeric aromatic compounds.

Spesifisinä esimerkkeinä oksidaaseista voidaan mainita: lakkaasit (EC 1.10.3.2), kateko-15 lioksidaasit (EC 1.10.3.1), tyrosinaasit (EC 1.14.18.1) ja bilirubiinioksidaasit (EC 1.3.3.5). Erityisen edullisesti keksinnössä käytetään fenoloksidaaseja, etenkin lakkaaseja. Lak-kaaseja voidaan tuottaa valkolahottajasienillä, etenkin Trametes (aikaisemmin Coriolus-) ' ' ' versicolor tai hirsuta tai villosa -kannoilla. Muita tunnettuja lakkaasia tuottavia mikro- ' organismeja ovat seuraavien sienien eri kannat: Agaricus, Armillaria, Aspergillus, 20 Botrytis, Fusarium, Lentinus, Monocillium, Neurospora, Phlebia, Polyporus, Podospora, Pycnoporus ja Schizophyllum.Specific examples of oxidases include: laccases (EC 1.10.3.2), catechol-15 oxidases (EC 1.10.3.1), tyrosinases (EC 1.14.18.1) and bilirubin oxidases (EC 1.3.3.5). Particularly preferred are phenoloxidases, especially laccases. Lak-vases can be produced by white-fungus fungi, especially Trametes (formerly Coriolus) '' 'versicolor or hirsuta or villosa strains. Other known laccase producing microorganisms include various strains of the following fungi: Agaricus, Armillaria, Aspergillus, Botrytis, Fusarium, Lentinus, Monocillium, Neurospora, Phlebia, Polyporus, Podospora, Pycnoporus and Schizophyllum.

* « • · · • · « • · ·* «• · · • ·« • · ·

Keksintö ei kuitenkaan rajoitu näihin entsyymien lähteisiin eikä johonkin tiettyyn eris- :’.f> tysmenetelmään, vaan entsyymit voidaan saada muillakin keinoin.However, the invention is not limited to these sources of enzymes or to any particular method of isolation, but the enzymes may be obtained by other means.

* * * _ - • · * 95 • I «* * * _ - • · * 95 • I «

Niinpä on mahdollista tuottaa oksidatiiviset entsyymit mikro-organismeilla, jotka on • · mutatoitu ja geneettisesti rakennettu tuottamaan haluttua entsyymiä, tai niitä tuotetaan |_ muilla isäntäkannoilla, joihin entsyymiä koodaavat geenit on siirretty.Thus, it is possible to produce oxidative enzymes with microorganisms that have been mutated and genetically engineered to produce the desired enzyme, or are produced by other host strains into which the genes encoding the enzyme have been introduced.

••

IMIIMI

IM • * • · • · · 30 Hapetettava tärkkelys voi olla mikä tahansa luonnon tärkkelys, jonka amyloosi/amylo-pektiini-suhde voi olla 1:0...0:1. Esimerkkeinä tyypillisistä tärkkelyslähteistä mainitta- 5 105690 koon mukula- ja viljakasvit, kuten peruna, vehnä, ohra, kaura, herne, maissi, riisi, sago ja tapioka.The oxidizing starch may be any natural starch having an amylose to amylopectin ratio of from 1: 0 to 0: 1. Examples of typical starch sources include tubers and cereals, such as potatoes, wheat, barley, oats, peas, corn, rice, sago, and tapioca.

Lakkaasin määrä tärkkelyksen hapetuksessa voi olla noin 1 ...1000 nkat/g tärkkelystä.The amount of laccase in the oxidation of starch can be from about 1 to 1000 nkat / g of starch.

5 Tärkkelyksen pitoisuus voi vaihdella laajalla välillä, se voi esim. olla 5...35 % (v/w).The starch content can vary over a wide range, for example from 5 to 35% (v / w).

Hapetus tehdään nestefaasissa, koska TEMPO on veteen liukeneva sopivimmin vedessä, lämpötila-alueella 10...70 °C, mieluimmin 20...40 °C sekä pH-alueella 4...9. TEMPO:n määrä on 0,01 - 50 paino-%, edullisesti noin 0,1-20 paino-%, tärkkelyksen määrästä.The oxidation is carried out in the liquid phase since TEMPO is preferably water soluble in water, at a temperature in the range of 10 to 70 ° C, preferably in the range of 20 to 40 ° C and in a pH range of 4 to 9. The amount of TEMPO is 0.01 to 50% by weight, preferably about 0.1 to 20% by weight, based on the amount of starch.

10 Käytännössä reaktio suoritetaan siten, että valittu määrä TEMPOa (stabiilin nitroksyyli-radikaalin muodossa) liuotetaan veteen, johon suspendoidaan tärkkelystä. Suspension kuiva-ainepitoisuudeksi asetetaan yleensä noin 0,1 - 20 paino-%. Veteen voidaan lisätä puskuria reaktioväliaineen pH:n asettamiseksi haluttuun, lakkaasikäsittelyn kannalta sopivaan arvoon (yli 4). Lakkaasin lisäyksen jälkeen reaktioseokseen tuodaan happea joko 15 kaasuna tai ilmana samalla, kun seosta sekoitetaan. Hapentuonti kestää hapetettavan aineksen määrän mukaan yleensä noin 10 min - 24 tuntia. Reaktion jälkeen hapetettu tärkkelys erotetaan suodattamalla nesteestä, pestään ja kuivatetaan.In practice, the reaction is carried out by dissolving a selected amount of TEMPO (in the form of a stable nitroxyl radical) in water in which the starch is suspended. The dry solids content of the suspension is generally set at about 0.1 to 20% by weight. Buffer may be added to the water to adjust the pH of the reaction medium to the desired value (more than 4) for the laccase treatment. After the addition of the laccase, oxygen is introduced into the reaction mixture either as gas or air while the mixture is stirred. Depending on the amount of material to be oxidized, the oxygen import usually takes about 10 minutes to 24 hours. After the reaction, the oxidized starch is filtered off from the liquid, washed and dried.

I f « · · n i I | I _______ _______ ' . · Peroksidaaseja käytettäessä TEMPO hapetetaan vetyperoksidilla, kuten edellä todettiin.I f «· · n i I | I _______ _______ '. · When using peroxidases, TEMPO is oxidized with hydrogen peroxide as stated above.

• mi . _ . ..• what. _. ..

' ' 20 I I | ;; ·; Keksinnön mukaisen hapetuksen seurauksena saadaan tärkkelys, jonka primäärisistä OH- » »i '.,, ryhmistä osa on muuttunut karbonyyli- ja karboksyyliryhmiksi. Tyypillisesti esillä olevan • · · • ♦ · menetelmän mukaan hapetetussa tärkkelyksessä karbonyyli/karboksyyliryhmien suhde on :·. 1...5. Tärkkelyksen moolimassa alenee mahdollisesti hapetuksen seurauksena, mutta on · · • . .... . ..'' 20 I I | ;; ·; Oxidation according to the invention results in a starch having part of the primary OH- »1 'groups converted to carbonyl and carboxyl groups. Typically, in the present process, the ratio of carbonyl / carboxyl groups in oxidized starch is:. 1 ... 5. The molecular weight of starch is possibly reduced by oxidation but is · · •. ..... ..

25 yleensä vielä yli 300.000 g/mol, esim. ainakin 400.000 g/mol.25, usually at least more than 300,000 g / mol, e.g. at least 400,000 g / mol.

• ___________ _ *····· ..........• ___________ _ * ····· ..........

• · .,.,; Hapetettua tärkkelystä voidaan sellaisenaan käyttää mm. paperinvalmistuksen lisäaineena, » 9 paperikoneen märässä päässä tai päällystysaineena. Koska karbonyyliryhmien ansiosta c c e '!!! tärkkelyksestä saadaan reaktiivinen (karbonyyliryhmien ansiosta), tuotetta voidaan myös• ·.,.,; The oxidized starch can be used as such e.g. as a papermaking additive, »9 at the wet end of a papermaking machine or as a coating agent. Because thanks to the carbonyl groups c c e '!!! starch is reactive (thanks to carbonyl groups), the product can also be

f If I

30 jatkohapettaa, ja karbonyyliryhmiä voidaan edelleen modifioida.30 further oxidation, and the carbonyl groups can be further modified.

Seuraavat ei-rajoittavat esimerkit valaisevat keksintöä.The following non-limiting examples illustrate the invention.

105690 6105690 6

Esimerkki 1 (vertailuesimerkki)Example 1 (Comparative Example)

Kemiallinen hapetus 5 TEMPO:n katalysoima hapetus tehtiin seuraavasti: TEMPO 0.3 g liuotettiin 3000 ml vettä, suspendoitiin liuokseen 30 g tärkkelystä, lisättiin 12 g NaBr. Reaktioseosta termostoitiin 0 °C:seen. Valmistettiin toinen liuos Jossa oli 345 ml 8 %:sta hypokloriittia; pH säädettiin 3 M suolahapolla arvoon 10,8 ja liuos termostoi-10 tiin 0 °C:seen. Liuos lisättiin kerralla tärkkelystä sisältävään liuokseen ja inkuboitiin 2 h. Inkuboinnin aikana tarkistettiin liuoksen pH ja säädettiin tarpeen mukaan takaisin arvoon 10-11 käyttämällä 0.5 MNaOH:a. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 60 ml 96 %:sta etanolia ja säätämällä tämän jälkeen suspension pH 7:ksi. Tärkkelys erotettiin ja pestiin 1000 ml vettä ja kuivattiin huoneenlämmössä.Chemical Oxidation 5 TEMPO-catalyzed oxidation was done as follows: TEMPO 0.3 g was dissolved in 3000 ml water, suspended in a solution of 30 g starch, 12 g NaBr was added. The reaction mixture was thermostated to 0 ° C. A second solution was prepared containing 345 ml of 8% hypochlorite; The pH was adjusted to 10.8 with 3M hydrochloric acid and the solution was thermostated to 0 ° C. The solution was added at once to the starch-containing solution and incubated for 2 h. During the incubation, the pH of the solution was checked and adjusted to 10-11 as necessary using 0.5 MNaOH. The reaction was quenched by the addition of 60 mL of 96% ethanol and then adjusted to pH 7 of the suspension. The starch was separated and washed with 1000 ml of water and dried at room temperature.

1515

Esimerkki 2 Tärkkelyksen lakkaasi-TEMPO-hapetus • · $ ί .' Natiivia perunatärkkelystä hapetettiin käyttämällä TEMPO:a välittäjäaineena ja lakkaasi- I I I I « 20 entsyymiä hapettajana.Example 2 Starch Laccase TEMPO Oxidation • · $ ί. ' The native potato starch was oxidized using TEMPO as the mediator and the laccase I 20 I as the oxidant.

• t ·• t ·

Entsyymi: Trametes hirsuta D 443 -sieni lakkaasi, kasvuliuoskonsentraatti. AktiivisuusEnzyme: Trametes hirsuta D 443 fungal lacquer, growth solution concentrate. activity

• « I• «I

• · · määritettiin käyttämällä ABTS-substraattia (10).· · · Was determined using ABTS substrate (10).

* · • · • «« 25 35 g natiivista perunatärkkelyksestä tehtiin 5 %:n suspensio 0,1 M NaAc puskuriin, jonka m . pH-arvo oli 5,0. TEMPO (3,5 g) liuotettiiin puskuriin, lisättiin tärkkelys ja suspendoitiin • · ....: tämä nestefaasiin, minkä jälkeen lisättiin lakkaasi (annos 200 nkat/g tärkkelystä). Reaktiota * · ', hapetettiin happivirtauksella 3 h huoneenlämmössä ja sekoitettiin samanaikaisesti mag- 'neettisekoittajalla. Tärkkelys poistettiin suodattamalla ja pestiin 1000 ml vettä. Pesun 30 jälkeen tärkkelys kuivattiin huoneenlämmössä.* 35% native potato starch was suspended in a 5% suspension in 0.1 M NaAc buffer m. The pH was 5.0. TEMPO (3.5 g) was dissolved in buffer, starch added and suspended in the liquid phase followed by the addition of laccase (dose 200 nkat / g starch). The reaction was oxidized with a flow of oxygen for 3 h at room temperature and stirred simultaneously with a magnetic stirrer. The starch was removed by filtration and washed with 1000 ml of water. After washing 30, the starch was dried at room temperature.

7 1056907 105690

Esimerkki 3Example 3

Hapetettujen tärkkelysten ominaisuudetProperties of oxidized starches

Karboksyyli- ja karbonyyliryhmiä muodostui tärkkelykseen sekä kemiallisella hapetuksella 5 että lakkaasi-TEMPO-hapetuksella (määritys ref. 11 :n mukaan). Tulokset on ilmoitettu alla esitettävässä taulukossa:Carboxyl and carbonyl groups were formed on the starch by both chemical oxidation 5 and laccase TEMPO oxidation (assay ref. 11). The results are shown in the table below:

I II I

' I »'I »

' « I'«I

I (I (

' « I'«I

I t .· * I ----------- I l .......— • < i f < ( c * «« * · « • · e - - —.....I t. · * I ----------- I l .......— • <i f <{c * «« * · «• · e - - ———.

• · · -------t-~ r-· • « • · • ·· • · ·• · · ------- t- ~ r- · • «• · • · · · · ·

• f O• f O

· · " • - ----------— - • ......· · "• - ----------— - .......

f M««| • · a • Ml| ----------- - ( , i · <~ i : i ft f t < ( ( 105690 8f M «« | • · a • Ml | ----------- - {, i · <~ i: i ft f t <{{105690 8

Taulukko. Hapetettujen tärkkelysten ominaisuudet Tärkkelys COOH/100 glukoosi CHO/100 glukoosi -yksikköä -yksikköä natiivi perunatärkkelys 0,47-0,52 0 '.ν.^νΜ^^ΛνΛκ^ν.νΜν.ν^Μ'ι'.ν,ν.ν/.νΛνΛ'Μν.νι’ΛνΛ'Μ'.ν.ν.ν.νΛν.'.ν.'ΛίΗΜΒ^Μ^ΗΜΜΗΒΗΜΗΙ^ΗΗΜΙΙΙ^^^ΜΜβΗΒΗΒΜΙ^ΗΗΜηΜΜ^^^ΒΗΗ 5 kemiallinen TEMPO hapetus 1,07-10,3_2,86-11,0_Table. Properties of oxidized starches Starch COOH / 100 glucose CHO / 100 glucose units native potato starch 0.47-0.52 0 '.ν. ^ ΝΜ ^^ ΛνΛκ ^ ν.νΜν.ν ^ Μ'ι'.ν, ν .ν / .νΛνΛ'Μν.νι'ΛνΛ'Μ'.ν.ν.ν.νΛν. '. ν.'ΛίΗΜΒ ^ Μ ^ ΗΜΜΗΒΗΜΗΙ ^ ΗΗΜΙΙΙ ^^^ ΜΜβΗΒΗΒΜΙ ^ ΗΗΜηΜΜ ^^^ ΒΗΗ 5 TEMPO Chemical Oxidation 1 , 07-10,3_2,86-11,0_

Lakkaasi-TEMPO hapetus_ 1,02_2,99_Lacquer-TEMPO oxidation_ 1,02_2,99_

Hapetetun (sekä kemiallisesti että lakkaasi-TEMPOlla hapetetun) tärkkelyksen molekyyli-10 painot olivat hieman alhaisemmat kuin natiivin perunatärkkelyksen.The molecular weight of the oxidized starch (both chemically and by oxidation by laccase TEMPO) was slightly lower than that of native potato starch.

Hapetettujen tärkkelysten geeliytymisominaisuudet mitattiin Bohlin VOR reometrilla (oskillointimenetelmä). Näytteitä jäähdytettiin 90 °C:sta 20 °C:seen nopeudella 1 °C/min. Mittaukset tehtiin 15 % tärkkelysliuoksista. Lakkaasi-TEMPO ja kaupallinen hapetettu 15 tärkkelys (hypokloriitti-hapetettu) eivät geeliytyneet mittausolosuhteissa.The gelling properties of the oxidized starches were measured on a Bohl VOR rheometer (oscillation method). Samples were cooled from 90 ° C to 20 ° C at a rate of 1 ° C / min. Measurements were made of 15% starch solutions. Laccase-TEMPO and commercial oxidized starch (hypochlorite-oxidized) did not gel on the assay conditions.

Esimerkki 4 r ( < f * ! « ' ’ «Example 4 r (<f *! «''«

« I«I

' f' Tärkkelystä hapetettiin eri lakkaasi- ja TEMPO-annoksilla. Hapetettujen tärkkelysten « < t 20 ominaisuudet (molekyylipainojakauma, geelitymisominaisuudet ja rakenne) mitattiin ; # esimerkin 3 mukaisesti. Havaittiin, että vaihtelemalla TEMPO-ja lakkaasiannosta, voidaan • «· . ·: ·, tärkkelyksen modifiointiastetta muuttaa ja siten myös geeliytymis- ja molekyylipaino- • · · * ominaisuudet muuttuvat.'f' The starch was oxidized with different doses of laccase and TEMPO. The properties (molecular weight distribution, gelling properties and structure) of oxidized starches were measured; # as in Example 3. It was found that by varying the dose of TEMPO and lacquer, it is possible to • «·. ·: ·, The degree of modification of the starch changes and thus the gelation and molecular weight properties.

• · • · * · · V · · • · « • · · » • · « « · · · * · · • f • · 9 105690• · • · * · V · · • • • • • • • • 9 105690

Kirjallisuus 1. Forssell, P., Hamunen, A., Autio, K., Suortti, T. & Poutanen,K. Starch 47, 371-377 (1995).References 1. Forssell, P., Hamunen, A., Autio, K., Suortti, T. & Poutanen, K. Starch 47, 371-377 (1995).

5 2. Parovuori,P., Hamunen,A., Forssell, P., Autio,K. & Poutanen, K. Starch 47,19-23 (1995).5 2. Parovuori, P., Hamunen, A., Forssell, P., Autio, K. & Poutanen, K. Starch 47, 19-23 (1995).

3. Anelli, P.L., Biffi, C., Montanari, F. & Quid,S. J.Org. Chem. 52,2559 (1987) 10 4. Anelli, P.L., Banfi, S., Montanari, F. & Quid,S. J.Org. Chem.,54,2970(1989) 5. Kabalka, G.W., Chatla, N., Wadgaonkar, P.P. & Deshpande, S.M. Synth. Comm., 20.1617(1990).3. Anelli, P.L., Biffi, C., Montanari, F. & Quid, S. J.Org. Chem. 52, 2559 (1987) 10 4. Anelli, P.L., Banfi, S., Montanari, F. & Quid, S. J.Org. Chem., 54, 2970 (1989) 5. Kabalka, G.W., Chatla, N., Wadgaonkar, P.P. & Deshpande, S.M. Synth. Comm., 20.1617 (1990).

15 6. deNooy, A.E.J., Besemer, A.C. & van Bekkum, H. RecI.Trav.Chim. Pays-Bas 113, 165-166(1994).15 6. deNooy, A.E.J., Besemer, A.C. & van Bekkum, H. RecI.Trav.Chim. Pays-Bas 113, 165-166 (1994).

• | 7. de Nooy, A.E.J., Besemer, A.C. & van Bekkum, H. Carbohydrate Res. 269, 89-98• | 7. de Nooy, A.E.J., Besemer, A.C. & van Bekkum, H. Carbohydrate Res. 269, 89-98

* I* I

:··; 20 (1995). ;;: ··; 20 (1995). ;;

* * I* * I

r I « I < • *·· 8. Besemer, A.C & de Nooy, A.EJ. PCT WO 95/07303.r I «I <• * ·· 8. Besemer, A.C & de Nooy, A.EJ. PCT WO 95/07303.

• · t • · · • · · 9. Chang, P.S. & Robyt, J.F. J. Carboh. Chem., 15, 819-830 (1996).• · t • · · • · · 9. Chang, P.S. & Robyt, J.F. J. Carboh. Chem., 1996, 15, 819-830.

·· ----:-:-.-=:-.-: • · : ** 25 .....·· ----: -: -.- =: -.-: • ·: ** 25 .....

• · · • · · ...-.• · · • · · ...-.

*. * 10. Niku-Paavola, M.-L., E. Karhunen, P. Salola, and V. Raunio. Biochem. J. 254, 877-884 (1988).*. * 10. Niku-Paavola, M.-L., E. Karhunen, P. Salola, and V. Raunio. Biochem. J. 254, 877-884 (1988).

11. Smith, R. J. in Starch: Chemistry and Technology, Eds.R.L. Whistler & E.F. Paschall,11. Smith, R.J. in Starch: Chemistry and Technology, Eds.R.L. Whistler & E.F. Paschall,

Voi II, Academic Press, Inc., New York 1967, pp.620-625.Vol II, Academic Press, Inc., New York 1967, pp.620-625.

# · · u • « • · • · ·# · · U • «• · • · ·

KK

Claims (11)

105690105690 1. Menetelmä hapetetun tärkkelyksen valmistamiseksi Jonka menetelmän mukaan tärkkelyspitoinen lähtöaine saatetaan kosketuksiin okso-ammonium-ionia tuottavan 5 reaktantin kanssa tätä reaktanttia hapettavan hapetusaineen läsnäollessa, tunnettu siitä, että hapetusaineena käytetään oksidatiivista entsyymiä.A process for preparing an oxidized starch which comprises contacting a starch-containing starting material with an oxo-ammonium ion-producing reactant in the presence of an oxidizing oxidizing agent, characterized in that an oxidizing enzyme is used as the oxidizing agent. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että oksidatiivisena entsyyminä käytetään fenoloksidaasia.Process according to Claim 1, characterized in that phenol oxidase is used as the oxidative enzyme. 3. Patenttivaatimuksen I tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktio suoritetaan nestemäisessä väliaineessa ja reaktiotuote erotetaan väliaineesta reaktion jälkeen ja saatetaan jatkokäsittelyyn sen puhdistamiseksi.Process according to Claim I or 2, characterized in that the reaction is carried out in a liquid medium and the reaction product is separated from the medium after the reaction and subjected to further treatment to purify it. 4. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että oksoammonium-ionia tuottavana reaktanttina käytetään 2,2,6,6-tetrametyylipiperidiini-l-oksyyliä (TEMPO:a) ja tämän kanssa reagoivana hapettimena lakkaasia.Process according to any one of claims 1 to 3, characterized in that 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl (TEMPO) is used as the oxoammonium-producing reactant and the laccase as the reactant with it. 5. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 20 fenoloksidaasina käytetään Trametes-, Agaricus-, Armillaria-, Aspergillus-, Botrytis-, Fusarium-, Lentinus-, Monocillium-, Neurospora-, Phlebia-, Polyporus-, Podospora-, Pycnoporus- tai Schizophyllum-suvun lakkaasia. M · a · * a a a · aProcess according to any one of claims 1 to 4, characterized in that Trametes, Agaricus, Armillaria, Aspergillus, Botrytis, Fusarium, Lentinus, Monocillium, Neurospora, Phlebia, Polyporus, are used as phenol oxidase. Laccase from Podospora, Pycnoporus or Schizophyllum. M · a · * a a a · a • · · · · • 6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että a a a ”·' 25 oksoammonium-ionia tuottavana reaktanttina käytetään 2,2,6,6-tetrametyylipiperidiini-l- a · a aa "... oksyyliä (TEMPO:a) ja tämän kanssa reagoivan regeneroivana hapettimena peroksidaasia. a a a a a a aA process according to any one of claims 1 to 3, characterized in that 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-a-aa is used as the reactant producing oxoammonium ion. oxyl (TEMPO) and peroxidase as the regenerating oxidant reacting with it. ,«- , 7. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että <11 . · *', tärkkelystä hapetetaan aldehydi- ja karboksyyliryhmien muodostamiseksi erityisesti • a a . '.t 30 primääriseen OH-ryhmään. • a · a a a · • a f • · • a • aa .The process according to any one of claims 1 to 6, characterized in that <11. · * ', The starch is oxidized to form aldehyde and carboxyl groups, in particular • a a. 30 to the primary OH group. • a · a a a · • a f • · • a • aa. 8. Tärkkelyksen modifiointi entsymaattisesti hapetetulla TEMPO:11a. a ♦ · a · I I > a * ala 7056908. Modification of starch by enzymatically oxidized TEMPO. a ♦ · a · I I> a * ala 705690 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen modifiointi, tunnettu siitä, että TEMPO on hapetettu lakkaasin avulla.Modification according to claim 8, characterized in that the TEMPO is oxidized by a laccase. 10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen modifiointi, tunnettu siitä, että TEMPO on 5 hapetettu peroksidaasin avulla.Modification according to claim 8, characterized in that the TEMPO is oxidized by peroxidase. 11. Sellaisten modifioitujen tärkkelysten käyttö paperinvalmistuksen lisäaineena, paperikoneen märässä päässä tai päällystysaineena, jotka on käsitelty entsymaattisesti hapetetulla TEMPOdla. • • · · « « ....... • 1 • · __ --- M» _____ • Mf - - • « « · • · · ----------- • · • · · I « · — · 1C • 4 · 10569011. Use of modified starches as a papermaking additive, at the wet end of a papermaking machine, or as a coating agent treated with enzymatically oxidized TEMPO. • • · · «« ....... • 1 • · __ --- M »_____ • Mf - - •« «· • - ----------- • · • · · I «· - · 1C • 4 · 105690