FI104898B - Process for the preparation of a therapeutically active metal complex compound - Google Patents

Description

, 104898, 104898

Menetelmä terapeuttisesti aktiivisen metallikompleksiyh-disteen valmistamiseksiA process for preparing a therapeutically active metal complex compound

Jakamalla erotettu hakemuksesta 906368 5 Keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti aktiivi sen metalli- kompleksiyhdisteen valmistamiseksi, jonka muodostaa kaavan (IA)The present invention relates to a process for the preparation of a therapeutically active metal complex compound represented by the formula (IA)

QQ

/"3 10 ,-ζ V \ / R2-// \\-CCH2)-c-N K-a >=/ ";/ "3 10, -ζ V \ / R2 - // \\ - CCH2) -c-N K-a> = /";

QQ

15 mukainen yhdiste, jossa kaavassa kukin Q on itsenäisesti vety tai (CHR5)pC02R, Q1 on vety tai C02R, kukin R on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, 20 sillä edellytyksellä, että ainakin kaksi substituenteista Q ja Q1 on muita kuin vetyjä ja että kun Q1 on vety niin R3 on muu kuin vety, kukin R5 on itsenäisesti vety tai C1.4-alkyyli, n on kokonaisluku nollasta viiteen, : 25 p on 1 tai 2, R2 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikar-batsido-, tiosemikarbatsido-, maleimido-, bromiasetamido-tai karboksyyliryhmä, R3 on C^-alkoksi, -0CH2C02H, hydroksi tai vety, 30 R4 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikar-*!' batsido-, tiosemikarbatsido-, maleimido-, bromiasetamido- tai karboksyyliryhmä, sillä edellytyksellä, että R2 ja R4 eivät molemmat voi olla vetyjä mutta toisen niistä on oltava vety, 2 104898 tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola kompleksoi-tuneena metalli-ionin kanssa, joka on La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y tai Se.A compound according to 15 wherein Q is independently hydrogen or (CHR 5) p CO 2 R, Q 1 is hydrogen or CO 2 R, each R is independently hydrogen or C 1 -C 4 alkyl, provided that at least two of Q and Q 1 are other than hydrogen and that when Q1 is hydrogen then R3 is other than hydrogen, each R5 is independently hydrogen or C1-4 alkyl, n is an integer from zero to 5, p is 1 or 2, R2 is hydrogen or nitro, amino, isothiocyanato , semicarbazido, thiosemicarbazido, maleimido, bromoacetamido or carboxyl groups, R 3 is C 1-4 alkoxy, -OCH 2 CO 2 H, hydroxy or hydrogen, R 4 is hydrogen or nitro, amino, isothiocyanato, semicarboxyl; a bazido, thiosemicarbazido, maleimido, bromoacetamido or carboxyl group, provided that R 2 and R 4 cannot both be hydrogen but one must be hydrogen, 2 104898 or a pharmaceutically acceptable salt thereof, complexed with a metal ion La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y or Se.

Funktionaalisia ryhmiä sisältävien kelaatinmuodos-5 tajien, tai bifunktionaalisten koordinoivien yhdisteiden, tiedetään kykenevän sitoutumaan kovalenttisesti vasta-aineeseen, joka on spesifinen syöpä- tai kasvainsolujen epi-tooppien tai antigeenien suhteen. Sellaisten vasta-aine-kelaatinmuodostajakonjugaattien radionuklidikompleksit 10 ovat käyttökelpoisia diagnostisissa ja/tai terapeuttisissa sovellutuksissa keinona kuljettaa radionuklidi syöpä- tai kasvainsoluun. Tutustukaa esimerkiksi artikkeleihin Meares et ai., Anal. Biochem. 142 (1984) 68 - 78 ja Krejcarek et ai., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 77 (1977) 581 -15 585.Functional group-containing chelating agents, or bifunctional coordinating compounds, are known to be capable of covalently binding to an antibody specific for epitopes or antigens of cancer or tumor cells. Radionuclide complexes 10 of such antibody-chelating agent conjugates are useful in diagnostic and / or therapeutic applications as a means of transporting the radionuclide to a cancer or tumor cell. See, for example, Meares et al., Anal. Biochem. 142: 68-78 (1984) and Krejcarek et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 77: 581-15155 (1977).

Kelaatteja muodostavia aminokarboksyylihappoja on tunnettu ja tutkittu monta vuotta. Tyypillisiä aminokarboksyylihappoja ovat nitriilietikkahappo (NTA), etyleeni-diamiinitetraetikkahappo (EDTA), hydroksietyylietyleenidi-20 amiinitrietikkahappo (HEDTA), dietyleenitriamiinipenta- etikkahappo (DTPA), trans-1,2-diaminosykloheksaanitetra-etikkahappo (CDTA) ja 1,4,7,10 -tetra-atsasyklododekaani-tetraetikkahappo (DOTA). Lukuisia aminokarboksyylihappo-pohjaisia bifunktionaalisia kelaatinmuodostajia on esitet-; ' ' 25 ty ja valmistettu. On esimerkiksi raportoitu DTPA:n sykli sestä dianhydridistä [Hnatowich et ai., Science 220 (1983) 613 - 615; US-patenttijulkaisu 4 479 930] ja DTPA:n kar-boksihiilihapposeka-anhydrideistä [Gansow, US-patenttijulkaisut 4 454 106 ja 4 472 509; Krejcarek et ai., Biochem. 30 and Biophys. Res. Comm. 77 (1977) 581 - 585]. Liitettäessä \* anhydridejä proteiineihin liittyminen tapahtuu amidisidok- sen muodostumisen kautta, jolloin jäljelle jää siis neljä dietyleenitriamiinirungon (DETA-rungon) alkuperäisistä viidestä karboksimetyyliryhmästä [Hnatowich et ai., Int. 35 J. Appi. Isot. 33 (1982) 327 - 332]. US-patenttijulkai- 3 104898 suissa 4 432 907 ja 4 352 751 on lisäksi esitetty bifunk-tionaalisia kelaatinmuodostajia, jotka soveltuvat metalli-ionien sitomiseen "orgaanisiin spesieksiin, kuten esimerkiksi orgaanisiin kohdemolekyyleihin tai vasta-aineisiin".Chelate-forming aminocarboxylic acids have been known and studied for many years. Typical aminocarboxylic acids include nitrile acetic acid (NTA), ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), hydroxyethylethylenedioxy-20-amine triacetic acid (HEDTA), diethylenetriamine pentacetic acid (DTPA), trans-1,2-diaminocarboxy-10 -tetra-azacyclododecane-tetraacetic acid (DOTA). Numerous aminocarboxylic acid-based bifunctional chelating agents are disclosed; '' 25 ty and made. For example, cyclic dianhydride of DTPA has been reported [Hnatowich et al., Science 220: 613-615 (1983); U.S. Patent 4,479,930] and DTPA Carboxylic Acid Mixed Anhydrides [Gansow, U.S. Patent Nos. 4,454,106 and 4,472,509; Krejcarek et al., Biochem. 30 and Biophys. Res. Comm. 77: 581-585 (1977)]. When the anhydrides are coupled to the proteins, attachment occurs via the formation of an amide bond, leaving four of the original five carboxymethyl groups of the diethylenetriamine backbone (DETA backbone) [Hnatowich et al., Int. 35 J. Appl. Large. 33: 327-332 (1982)]. U.S. Patent Nos. 3,104,898, 4,432,907 and 4,352,751, further disclose bifunctional chelating agents which are suitable for binding metal ions to "organic species, such as organic target molecules or antibodies".

5 Samoin kuin edellä liittäminen tapahtuu amidiryhmän kautta diaminotetraetikkahappojen dianhydridejä hyväksi käyttäen. Esimerkkejä anhydrideistä ovat EDTA:n, CDTA:n, propyleeni-diamiinitetraetikkahapon ja fenyleeni-1,2-diamiinitetra-etikkahapon dianhydridit. Tuoreessa US-patenttijulkaisussa 10 4 647 447 on esitetty useita kompleksisuoloja, jotka on muodostettu komplekseja muodostavan hapon anionista, erilaisissa diagnosointitekniikoissa käyttäviksi. Konjugaation mainitaan tapahtuvan kompleksin muodostavan hapon karboksyyliryhmän kautta, mikä johtaa sitoutumiseen amidi-15 sidoksen välityksellä.As above, the coupling is effected via the amide group utilizing the dianhydrides of diaminotetraacetic acids. Examples of anhydrides are dianhydrides of EDTA, CDTA, propylene diamine tetraacetic acid and phenylene 1,2-diamine tetraacetic acid. Recent U.S. Patent 10,464,447,437 discloses a plurality of complex salts formed from the anion of a complexing acid for use in various diagnostic techniques. Conjugation is mentioned to occur via the carboxyl group of the complex forming acid, which results in binding via an amide-15 bond.

Paik et ai. ovat julkaisussa J. of Radioanalytical Chemistry 57 (1980), nro 12, 553 - 564 tuoneet esiin p-nitrobentsyylibromidin käytön reaktiossa "suojatun" di-etyleenitriamiinin kanssa, so. bis (2-ftaiimidoetyyli) amii-20 nin kanssa, jota reaktiota seuraavat suojauksenpoistotoi- menpiteet ja karboksimetylointi kloorietikkahappoa käyttäen, jolloin saadaan N'-p-nitrobentsyylidietyleenitriamii-ni-Ν,Ν,Ν'',N'1-tetraetikkahappoa. Koska sitoutuminen tapahtuu typen kautta, saadaan tässäkin tapauksessa tetra-; 25 etikkahappojohdannainen. Julkaisussa käsitellään bifunk- tionaalisen kelaatinmuodostajan konjugoitumista ja kela-toitumista indiumin kanssa. Typpiatomiin tapahtuvaa substituutiota kuvaavat myös Eckelman et ai. julkaisussa J. of Pharm. Sei. 64 (1975), nro 4, 704 - 706, joka substituutio « 30 tapahtuu antamalla amiinien, kuten esimerkiksi "etyleeni-diamiinin tai dietyleenitriamiinin reagoida asianmukaisen alkyylibromidin kanssa ennen karboksimetylointia". Yhdisteitä on ehdotettu potentiaalisiksi radiofarmaseuttisessa kuvauksessa käytettäviksi aineiksi.Paik et al. in J. of Radioanalytical Chemistry 57 (1980), No. 12, 553-564 have disclosed the use of p-nitrobenzyl bromide in the reaction with "protected" diethylene triamine, i.e. bis (2-phthalimidoethyl) amine-20, followed by deprotection and carboxymethylation with chloroacetic acid to give N'-p-nitrobenzyldiethylenetriamine-Ν, Ν, Ν '', N'1-tetraacetic acid. Since the bonding is via nitrogen, tetra-; 25 acetic acid derivative. The disclosure relates to conjugation and chelation of a bifunctional chelator with indium. Substitution on the nitrogen atom is also described by Eckelman et al. in J. of Pharm. Sci. 64 (1975), No. 4, 704-706, which substitution occurs by reacting amines such as "ethylenediamine or diethylenetriamine with the appropriate alkyl bromide before carboxymethylation". Compounds have been proposed as potential agents for use in radiopharmaceutical imaging.

4 1048984, 104898

Myös eräs toinen aminokarboksyylihappofunktionaali-suuteen perustuva bifunktionaalisten kelaatinmuodostajien ryhmä on kirjallisuudessa hyvin dokumentoitu. Sundberg, Meares et ai. ovat julkaisussa J. of Med. Chem. 17 (1974), 5 nro 12, 1304 esittäneet EDTA:n bifunktionaalisia analogeja. Tyypillisiä esimerkkejä näistä yhdisteistä ovat 1-(p-aminofenyyli)etyleenidiamiinitetraetikkahappo ja 1-(p-bentseenidiatsonium)etyleenidiamiinitetraetikkahappo. Julkaisussa käsitellään liittymistä proteiineihin para-10 substituentin kautta ja radioaktiivisten metallien sitoutumista kelaatin muodostavaan ryhmään. Yhdisteitä on esitetty myös julkaisussa Biochemical and Biophysical Research Communications 75 (1977), nro 1, 149 sekä US-pa-tenttijulkaisuissa 3 994 966 ja 4 043 998. On tärkeätä 15 huomata, että aromaattisen ryhmän sitoutuminen EDTA-raken-teeseen tapahtuu etyleenidiamiinirungon hiiliatomin kautta. Optisesti aktiivisia bifunktionaalisia kelaatinmuodostaj ia, joiden perustana on EDTA, HEDTA tai DTPA, on esitetty US-patenttijulkaisussa 4 622 420. Näissä yhdisteissä 20 alkyleeniryhmä yhdistää aromaattisen ryhmän (joka sisältää proteiiniin liittymiseksi tarpeellisen funktionaalisen ryhmän) funktionaalisen kelaatinmuodostusryhmän sisältävän polyamiinin hiileen. Muita lähteitä, joissa sellaisia yhdisteitä käsitellään, ovat Brechbiel et ai., Inorg. Chem.Another group of bifunctional chelating agents based on the amino carboxylic acid functionality is well documented in the literature. Sundberg, Meares et al. in J. of Med. Chem. 17 (1974), 5, No. 12, 1304, discloses bifunctional analogs of EDTA. Typical examples of these compounds are 1- (p-aminophenyl) ethylenediaminetetraacetic acid and 1- (p-benzenediazonium) ethylenediaminetetraacetic acid. The publication discusses the attachment to proteins via the para-10 substituent and the binding of radioactive metals to the chelating group. The compounds are also disclosed in Biochemical and Biophysical Research Communications 75 (1977), No. 1, 149, and in U.S. Patent Nos. 3,994,966 and 4,043,998. It is important to note that the binding of an aromatic group to the EDTA structure occurs at the carbon atom of the ethylenediamine backbone. through. Optically active bifunctional chelating agents based on EDTA, HEDTA, or DTPA are disclosed in U.S. Patent No. 4,622,420. In these compounds, the 20 alkylene group combines an aromatic group (containing a functional group required for protein attachment) with a chelate-containing functional group. Other sources treating such compounds include Brechbiel et al., Inorg. Chem.

: 25 25 (1986) 2772 - 2781, US-patenttijulkaisu 4 647 447 ja kansainvälinen patenttijulkaisu WO 86/06384.: 25 25: 2772-2781 (1986), U.S. Patent 4,647,447 and International Patent Publication No. WO 86/06384.

Vielä vähemmän aikaa sitten on US-patenttijulkaisussa 4 678 667 ja julkaisussa Moi et ai., Inorg. Chem. 26 (1987) 3458 - 3463 tuotu esiin eräitä makrosyklisiä bi- 30 funktionaalisia kelaatinmuodostajia sekä niiden kuparike-'/ laattikonjugaattien käyttö diagnostisissa tai terapeutti sissa sovellutuksissa. Funktionaalisen aminokarboksyyli-happo-osan liittyminen bifunktionaalisen kelaatinmuodosta-jamolekyylin muuhun osaan tapahtuu syklisen polyamiinirun-35 gon rengashiiliatomin kautta. Yhdistävä ryhmä, joka on 5 1G4898 - toisesta päästään sitoutunut syklisen polyamiinin rengas-hiileen, on myös siten sitoutunut toisesta päästään funktionaaliseen ryhmään, joka kykenee reagoimaan proteiinin kanssa.More recently, U.S. Patent No. 4,678,667 and Moi et al., Inorg. Chem. 26, 3458-3463 (1987) disclose some macrocyclic bi-functional chelating agents and their use of copper sulfate / plate conjugates for diagnostic or therapeutic applications. The attachment of the functional aminocarboxylic acid moiety to the rest of the bifunctional chelating agent and molecule occurs via the ring carbon atom of the cyclic polyamine ring-35 gon. The linking group, which is 5 1G4898 - at one end bound to the ring carbon of a cyclic polyamine, is also bound at one end to a functional group capable of reacting with the protein.

5 Erään toisen, myös huomionarvoisen, bifunktionaa listen kelaatinmuodostajien ryhmän muodostavat yhdisteet, joissa molekyylin kelaatin muodostava osa, so. aminokar-boksyylihappo, on liittynyt typen kautta sellaisen molekyylin funktionaaliseen ryhmään, joka sisältää proteiinin 10 kanssa reaktiokykyisen osan. Esimerkiksi Mikola et ai. ovat esittäneet patenttihakemuksessaan (kansainvälinen julkaisunumero W0 84/03698, julkaistu 27. 9. 1984) bifunk-tionaalisen kelaatinmuodostajan, joka valmistetaan antamalla p-nitrobentsyylibromidin reagoida DETA:n kanssa, 15 jota reaktiota seuraa reaktio bromietikkahapon kanssa ami-nokarboksyylihapon aikaansaamiseksi. Nitroryhmä pelkistetään vastaavaksi amiiniryhmäksi ja muunnetaan sitten reaktiolla tiofosgeenin kanssa isotiosyanaattiryhmäksi. Nämä yhdisteet ovat bifunktionaalisia kelaatinmuodostajia, jot-20 ka kykenevät muodostamaan lantanidien kanssa kelaatteja, jotka voidaan konjugoida bio-orgaanisiin molekyyleihin diagnostisina aineina käyttöä varten. Koska molekyylin kytkentäosan sitoutuminen tapahtuu jonkin aminokarboksyy-lihapon typen kautta, menetetään yksi potentiaalinen kela-; 25 toituva aminokarboksyyliryhmä. Saadaan siis valmistetuksi DETA-pohjäinen bifunktionaalinen kelaatinmuodostaja, joka sisältää neljä (eikä viisi) happoryhmää. Tässä suhteessa tähän ryhmään kuuluva kelaatinmuodostaja on samanlainen kuin ne, joiden liittyminen proteiiniin tapahtuu amidiryh- t 30 män välityksellä, mistä on seurauksena kelaatin muodosta-T van karboksyyliryhmän menetys.Another group of noteworthy bifunctional chelating agents are compounds in which the chelating moiety of the molecule, i. aminocarboxylic acid, is attached via nitrogen to a functional group of a molecule containing a reactive moiety with protein 10. For example, Mikola et al. in their patent application (International Publication No. WO 84/03698, published 27.9.1984), a bifunctional chelating agent prepared by reacting p-nitrobenzyl bromide with DETA followed by reaction with bromoacetic acid to give the aminocarboxylic acid. The nitro group is reduced to the corresponding amine group and then converted by reaction with thiophosgene to the isothiocyanate group. These compounds are bifunctional chelating agents capable of forming chelates with lanthanides that can be conjugated to bio-organic molecules for use as diagnostic agents. Because the binding of the linker moiety of the molecule occurs via the nitrogen of one of the aminocarboxylic acids, one potential coil is lost; 25 nascent aminocarboxyl group. Thus, a DETA-based bifunctional chelator having four (rather than five) acid groups is prepared. In this regard, the chelating agent belonging to this group is similar to those which are attached to the protein via an amide group, resulting in the loss of the chelating carboxyl group.

Carney, Rogers ja Johnson esittivät hiljattain (3rd International Conference on Monoclonal Antibodies for Cancer, San Diego, Kalifornia, 4. - 6. 2. 1988) tiivistel-35 mät, joiden otsikot olivat "Absence of Intrinsically « 104898Carney, Rogers, and Johnson recently presented at the 3rd International Conference on Monoclonal Antibodies for Cancer, San Diego, California, June 4, 6, 1988, 35 abstracts entitled "Absence of Intrinsically« 104898

Higher Tissue Uptake from Indium-111 Labeled Antibodies: Co-administration of Indium-111 and Iodine-125 Labeled B72.3 in a Nude Mouse Model" ja "Influence of Chelator Denticity on the Biodistribution of Indium-ill Labeled 5 B72.3 Immunoconjugates in Nude Mice". Ne paljastavat bi- funktionaalisen EDTA- ja DTPA-kelaatinmuodostajan kanssa kompleksoituneen indium-111:n biologisen jakautumisen. Aromaattisen renkaan sitoutuminen EDTA- tai DTPA-osaan tapahtuu asetaattimetyleenin kautta. Eräässä hiljattaises-10 sa kokouksessa (Florida Conf. on Chem. in Biotechnology, 26. - 29. huhtikuuta 1988} myös D. K. Johnson et ai. esittivät EDTA:n ja DTPA:n bifunktionaalisia johdannaisia, joissa p-isotiosyanaattibentsyyliryhmä on sitoutunut jonkin karboksimetyyliryhmän metyleenihiileen. Aikaisemmin 15 Hunt et ai. ovat esittäneet US-patenttijulkaisuissa 4 088 747 ja 4 091 088 (1978) etyleenidiamiinidietikkahap-poon (EDDA) pohjautuvia kelaatinmuodostajia, joissa aromaattisen renkaan liittyminen EDDA-osaan tapahtuu alkylee-nin tai asetaattimetyleenin kautta. Yhdisteiden mainitaan 20 olevan käyttökelpoisia kelaatteina haiman ja sapen toimintaa tutkittaessa. Edullinen metalli on teknetium-99m. Myös indium-111 ja indium-113m mainitaan kuvaukseen soveltuvina radionuklideina.Higher Tissue Uptake from Indium-111 Labeled Antibodies: Co-Administration of Indium-111 and Iodine-125 Labeled B72.3 in a Nude Mouse Model and Influence of Chelator Denticity on the Biodistribution of Indium-Ill Labeled 5 B72.3 Immunoconjugates in Nude Mice ". They reveal the biodistribution of indium-111 complexed with the bi-functional EDTA and DTPA chelator. Binding of the aromatic ring to the EDTA or DTPA moiety occurs via acetate methylene. In a recent meeting (Florida Conf. on Chem. In Biotechnology, April 26-29, 1988} Bifunctional derivatives of EDTA and DTPA in which the p-isothiocyanate benzyl group is bound to a methylene carbon of a carboxymethyl group have also been disclosed by DK Johnson et al. U.S. Patent Nos. 4,088,747 and 4,091,088 (1978) to ethylene diamine acetic acid (EDDA) -chelated chelating agents with EDDA aromatic ring incorporation. is carried out via alkylene or acetate methylene. The compounds are mentioned as being useful as chelates in the study of pancreatic and biliary function. The preferred metal is technetium-99m. Indium-111 and indium-113m are also mentioned as suitable radionuclides for the description.

Olisi siis edullista saada aikaan kompleksi, joka 25 ei hajoa helposti, poistuu nopeasti koko elimistöstä haluttua kudosta lukuunottamatta ja konjugoituu vasta-aineen kanssa, niin että saavutetaan toivotut tulokset.Thus, it would be advantageous to provide a complex that is not readily degraded, rapidly eliminated throughout the body except the desired tissue, and conjugates with the antibody to achieve the desired results.

Oheisissa piirroksissa esitettyjä kuvia voidaan kuvata seuraavasti: 3 0 Kuvat 1 - 7 ja 15 - 21 esittävät tämän keksinnön !* mukaisesti saadusta metallikompleksiyhdisteestä valmistet tuna, 153Sm:a sisältävänä konjugaattina annetun 153Sm:n biologista jakautumista. Kyseisessä konjugaatissa käytettiin vasta-ainetta CC49-IgG. Biologinen jakautuminen määritet-35 tiin karvattomilla hiirillä, joilla oli LS 174-T -kasvain.The figures shown in the accompanying drawings can be illustrated as follows: Figures 1-7 and 15-21 show the biological distribution of 153Sm given as a 153Sm-containing conjugate prepared from the metal complex compound of this invention. The conjugate in question used the antibody CC49-IgG. Biodistribution was determined in nude mice bearing LS 174-T tumor.

104898104898

Kuvat 8 - 14 ja 22 - 28 esittävät tämän keksinnön mukaisesti saadusta metallikompleksiyhdisteestä valmistettuna, 153Sm:a sisältävänä konjugaattina annetun 153Sm:n biologista jakautumista. Kyseisessä konjugaatissa käytettiin 5 vasta-ainefragmenttina CC49-F(ab')2:ta. Biologinen jakautuminen määritettiin karvattomilla hiirillä, joilla oli LS 174-T -kasvain.Figures 8-14 and 22-28 show the biodistribution of 153Sm given as a 153Sm conjugate of the metal complex compound obtained according to the present invention. In this conjugate, CC49-F (ab ') 2 was used as 5 antibody fragments. Biodistribution was determined in nude mice bearing LS 174-T tumor.

Kuvat 29 - 34 esittävät 177Lu (PA-DOTMA) : ta tai 177Lu-(PA-DOTA) :ta sisältävänä konjugaattina annetun 177Lu:n bio-10 logista jakautumista. Konjugaatissa käytettiin vasta-aineena CC49-IgG:tä. Biologinen jakautuminen määritettiin balb/C-hiirillä, joilla oli LS 174-T -kasvain.Figures 29-34 show the bio-10 distribution of 177Lu given as a conjugate containing 177Lu (PA-DOTMA) or 177Lu (PA-DOTA). The conjugate used was CC49-IgG antibody. Biodistribution was determined in balb / C mice bearing LS 174-T tumor.

Yllättävää kyllä, tämän keksinnön mukaisesti saatavat kompleksit ovat suhteellisen stabiileja (ts. eivät ha-15 joa helposti) ja jotkut niistä poistuvat nopeasti koko kehosta ja eräistä kohteena olemattomista elimistä, kuten maksasta, munuaisesta ja luusta.Surprisingly, the complexes obtained in accordance with the present invention are relatively stable (i.e., not easily digestible) and some of them are rapidly eliminated throughout the body and in some non-target organs such as liver, kidney, and bone.

Keksintö liittyy uudenlaisten bifunktionaalisten kelaatinmuodostajien suunnittelun ja valmistuksen, jotka 20 kelatoivat aineet sisältävät kukin kelaatin muodostavan funktionaalisen ryhmän sekä kemiallisesti reaktiivisen ryhmän biomolekyyleihin tapahtuvaa kovalenttista sitoutumista varten. Tähän liittyvät myös menetelmät erilaisten bifunktionaalisten koordinoivien yhdisteiden (BFC) ja me-:’* 25 tallien kompleksien valmistamiseksi sekä konjugaattien valmistamiseksi, joissa kompleksi on liitetty vasta-aineisiin diagnostisiin ja/tai terapeuttisiin käyttötarkoituksiin soveltuvien, radionuklidilla (kuten esimerkiksi sama-rium-153:11a, lutetium-177:llä tai yttrium-90:llä) leimat-30 tujen vasta-aineiden ja/tai fragmenttien aikaansaamiseksi.The invention relates to the design and manufacture of novel bifunctional chelating agents, each containing a chelating functional group and a chemically reactive group for covalent binding to biomolecules. Related thereto are methods for the preparation of various bifunctional coordinating compounds (BFCs) and metal complexes, as well as conjugates containing the complex with antibodies for diagnostic and / or therapeutic uses, such as radionuclide 153: 11a, lutetium-177 or yttrium-90) to generate labeled antibodies and / or fragments.

Tässä keksinnössä uudet kaavan IA mukaiset, bifunk-tionaalisia kelaatteja muodostavat yhdisteet muodostavat komplekseja metalli-ionien kanssa, erityisesti sellaisten "radioaktiivisten" metalli-ionien kanssa, jotka ovat ke-35 mialtaan harvinaisten maametallien tyyppiä. Tällaisia har- β 104898 vinaisten maametallien ioneja ovat La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y ja Se ja edullisia niistä ovat Sm, Ho, Y ja Lu. Edullisia radioaktiivisia harvinaisten maametallien ioneja ovat 153Sm, 166Ho, 90Y, 149Pm, 5 159Gd, 140La, 177Lu, 175Yb, 47Sc ja 142Pr ja erityisen edullisia 153Sm, 166Ho, 90Y ja 142Pr. Muita radioaktiivisia metalli-ioneja, jotka saattavat olla kiinnostavia, ovat 47Sc, 99mTc, 186Re, 188Re. 97Ru, 10SRh, 109Pd, 197Pt, 67Cu, 198Au, 199Au, 67Ga, 68Ga, lxlIn, 113mIn, 115mIn, 117Sn ja 212Pb/212Bi. Siten muodoste-10 tut kompleksit voidaan liittää (kovalenttisella sidoksella) vasta-aineeseen tai sen fragmenttiin ja käyttää terapeuttisiin ja/tai diagnostisiin tarkoituksiin. Kompleksit ja/tai konjugaatit voidaan formuloida in vivo tai in vitro käyttöä varten. Formuloituja konjugaatteja käytetään edul-15 lisesti eläinten, erityisesti ihmisten, syövän hoidossa.In the present invention, the novel bifunctional chelating compounds of formula IA form complexes with metal ions, in particular with "radioactive" metal ions of the rare-earth type. Such rare earth metal ions are La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y and Se, and preferred are Sm, Ho, Y and Lu. Preferred radioactive ions of rare earths are 153Sm, 166Ho, 90Y, 149Pm, 5159Gd, 140La, 177Lu, 175Yb, 47Sc and 142Pr, and particularly preferred 153Sm, 166Ho, 90Y and 142Pr. Other radioactive metal ions that may be of interest are 47Sc, 99mTc, 186Re, 188Re. 97Ru, 10SRh, 109Pd, 197Pt, 67Cu, 198Au, 199Au, 67Ga, 68Ga, 1x1In, 113min, 115min, 117Sn and 212Pb / 212Bi. Thus, the complexes formed may be linked (covalently bonded) to the antibody or fragment thereof and used for therapeutic and / or diagnostic purposes. The complexes and / or conjugates may be formulated for in vivo or in vitro use. Formulated conjugates are preferably used in the treatment of cancers in animals, particularly humans.

Tämän keksinnön mukaisesti saatuja komplekseja, jotka sisältävät jotakin ei-radioaktiivista metallia, on myös mahdollista käyttää tautitilojen, kuten esimerkiksi syövän, diagnosointiin ja/tai hoitamiseen. Sellainen käyt-20 tö on tunnettua ei-radioaktiivisten metallien tapauksessa käytettäessä radiotaajuutta hypertermian indusointiin (JP-patenttijulkaisu Kokai Tokkyo Koho 61/158 931) ja fluoresenssi -immuuniohjatussa hoidossa (FIGS) [K. Pettersson et ai., Clinical Chemistry 29 (1983), nro 1, 60 - 64 ja C.The complexes obtained according to the present invention containing a non-radioactive metal can also be used for the diagnosis and / or treatment of disease states such as cancer. Such use is known for non-radioactive metals in the use of radio frequency for the induction of hyperthermia (JP Patent Specification Kokai Tokkyo Koho 61/158,931) and in fluorescence immuno-guided therapy (FIGS) [K. Pettersson et al., Clinical Chemistry 29 (1983), No. 1, 60-64 and C.

" " 25 Meares et ai., Acc. Chem. Res. 17 (1984) 202 - 209] ."" 25 Meares et al., Acc. Chem. Res. 17: 202-209 (1984)].

Ilmaisu "nisäkäs" tarkoittaa tässä käytettynä eläimiä, jotka ruokkivat poikasiaan maitorauhasten erittämällä maidolla, edullisesti tasalämpöisiä nisäkkäitä, vielä edullisemmin ihmisiä. "Vasta-aineella" tarkoitetaan mitä 30 tahansa polyklonaalista, monoklonaalista tai kimeeristä '/ vasta-ainetta tai heterovasta-ainetta, edullisesti mono klonaalista vasta-ainetta; "vasta-ainefragmentilla" tarkoitetaan Fab-fragmentteja ja (F (ab' )2-fragmentteja sekä mitä tahansa vasta-aineen osaa, joka on spesifinen halutun 35 epitoopin tai epitooppien suhteen. Käytettäessä ilmaisua 9 104898 "metallikelaatti-vasta-ainekonjugaatti" tai "konjugaatti" osalla "vasta-aine" tarkoitetaan kokonaisia vasta-aineita ja/tai vasta-ainefragmentteja niiden puolisynteettiset tai geeniteknisesti käsitellyt muunnokset mukaan luettuina.The term "mammal", as used herein, refers to animals that feed their offspring with milk secreted by the mammary glands, preferably even mammals, more preferably humans. By "antibody" is meant any polyclonal, monoclonal or chimeric / antibody or heterova antibody, preferably a monoclonal antibody; By "antibody fragment" is meant Fab fragments and (F (ab ') 2 fragments, as well as any portion of an antibody that is specific for the desired epitope or epitopes. As used herein, the term "metal chelate antibody conjugate" or " conjugate "moiety" refers to whole antibodies and / or antibody fragments, including their semi-synthetic or genetically engineered variants.

5 "Kompleksilla" tarkoitetaan tässä käytettynä kek sinnön mukaista, kaavan IA mukaista yhdistettä kompleksoi-tuneena metalli-ionin kanssa, joka on tyypiltään harvinainen maametalli, erityisesti radioaktiivisen harvinaisen maametallin ionin kanssa, jolloin ainakin yksi metalliato-10 mi on kelatoitunut tai kompleksoitunut; "radioaktiivisella metalli-ionikelaatti-vasta-ainekonjugaatilla" tai "radioaktiivisella metalli-ionikonjugaatilla" tarkoitetaan radioaktiivisen metalli-ionin konjugaattia, jossa metalli-ioni on sitoutunut kovalenttisesti vasta-aineeseen tai 15 vasta-ainefragmenttiin; "radioaktiivisella" tarkoitetaan sanan "metalli-ioni" yhteydessä käytettynä tyypiltään harvinaisia maametalleja olevien alkuaineiden yhtä tai useampaa sellaista isotooppia, joka emittoi hiukkasia ja/tai fotoneja, kuten esimerkiksi isotooppeja 153Sm, 166Ho, 90Y, 20 149Pm, 159Gd, 140La, 177Lu, 175Yb, 47Sc ja 142Pr; ilmaisuja "bi- funktionaalinen koordinoiva yhdiste", "bifunktionaalinen kelaatinmuodostaja" ja "funktionaalisia ryhmiä sisältävä kelaatinmuodostaja" käytetään toistensa vaihtoehtoina ja niillä tarkoitetaan yhdisteitä, jotka sisältävän kelaatin ' ' 25 muodostavan osan, joka kykenee muodostamaan metalli-ionin kanssa kelaatin, ja kelaatin muodostavaan osaan kovalenttisesti sitoutuneen kytkentäryhmän/väliryhmän, joka pystyy toimimaan vasta-aineeseen tai vasta-ainefragmenttiin tapahtuvan kovalenttisen sitoutumisen välineenä."Complex" as used herein means a compound of the formula IA of the invention complexed with a metal ion of a rare earth type, in particular with a radioactive rare earth ion, wherein at least one metal atom of 10 ml is chelated or complexed; "radioactive metal ion chelate antibody conjugate" or "radioactive metal ion conjugate" means a radioactive metal ion conjugate in which the metal ion is covalently bound to the antibody or antibody fragment; "radioactive" as used in the context of the term "metal ion" means one or more isotopes of elements of the rare earth type which emit particles and / or photons, such as 153Sm, 166Ho, 90Y, 20 149Pm, 159Gd, 140La, 177L, 177L. , 47Sc and 142Pr; the terms "bi-functional coordinating compound", "bifunctional chelating agent" and "functional group-containing chelating agent" are used interchangeably and refer to compounds containing a chelating moiety capable of forming a chelate with a metal ion, and a covalently bonded linker / spacer capable of acting as a vehicle for covalent binding to an antibody or antibody fragment.

30 "Farmaseuttisesti hyväksyttävä suola" tarkoittaa Γ* tässä käytettynä mitä tahansa kaavan IA mukaisen yhdisteen suolaa, joka on riittävän myrkytön, jotta se on käyttökelpoinen nisäkkäiden diagnosoinnissa ja hoidossa. Suoloja voidaan siis käyttää tämän keksinnön mukaisesti. Tyypilli-35 siä sellaisia suoloja, joita muodostetaan tavanomaisilla 104898 reaktioilla sekä orgaanisista että epäorgaanisista lähteistä, ovat esimerkiksi rikki-, suola-, fosfori-, etikka-, meripihka-, sitruuna-, maito-, maleiini-, fumaari-, palmitiini-, sappi-, pamoni-, lima-, glutamiini-, D-kamfe-5 ri-, glutaari-, glykoli-, ftaali-, viini-, muurahais-, lauriini-, steariini-, salisyyli-, metaanisulfoni-, bent-seenisulfoni-, sorbiini-, pikriini-, bentsoe- ja kaneliha-pon sekä muiden sopivien happojen suolat. Suoloihin kuuluvat myös sellaiset suolat, joita muodostetaan tavanomai-10 silla reaktioilla sekä orgaanisista että epäorgaanisista lähteistä, kuten esimerkiksi ammoniumioneista, alkalime-talli-ioneista, maa-alkalimetalli-ioneista ja muista samankaltaisista ioneista. Erityisen edullisia ovat kaavan IA mukaisten yhdisteiden kalium-, natrium- ja ammoniumsuo- 15 lat sekä niiden seokset."Pharmaceutically acceptable salt", as used herein, means any salt of a compound of formula IA that is sufficiently non-toxic to be useful in the diagnosis and treatment of mammals. Thus, salts may be used in accordance with the present invention. Typical salts such as those formed by conventional 104898 reactions from both organic and inorganic sources include, for example, sulfur, salt, phosphorus, vinegar, amber, lemon, milk, maleic, fumaric, palmitic, bile, pamoni, mucus, glutamine, D-camph-5 ri, glutar, glycol, phthalic, wine, ants, laurine, stearin, salicyl, methanesulfone, benzenesulfone salts of sorbic acid, sorbic acid, picric acid, benzoic acid and cinnamic acid and other suitable acids. Salts also include salts formed by conventional reactions from both organic and inorganic sources, such as ammonium ions, alkali metal ions, alkaline earth metal ions and the like. Particularly preferred are the potassium, sodium and ammonium salts of the compounds of formula IA and mixtures thereof.

Luonnollisesti voidaan käyttää kaava IA mukaisten yhdisteiden vapaata happomuotoa samoin kuin yhdisteiden protonoitua muotoa, jollainen syntyy esimerkiksi protonoi-taessa karboksylaatti ja/tai typpiatomit, ts. muodostetta-20 essa HCl-suola.Of course, the free acid form of the compounds of formula IA as well as the protonated form of the compounds, such as that resulting from the protonation of the carboxylate and / or nitrogen atoms, i.e. the HCl salt of the formation, can be used.

Edullisia kaavan IA mukaisia yhdisteitä ovat yhdisteet, joissa Q1 on vety A ja joita kuvaa seuraava kaava: ' 25 r~C « ^*"^7 "2-// Λ-(ch2)-c-N N-°Preferred compounds of formula IA are those compounds wherein Q1 is hydrogen A and are represented by the following formula: - (-) - (-) - (CH2) -C-NN-

(II) Q(II) Q

• · jossa kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R ja kukin R on itsenäisesti vety tai C1.4-alkyyli, il 104898 ' sillä edellytyksellä, että ainakin kaksi substituenteista Q on muita kuin vetyjä, m on kokonaisluku nollasta viiteen, R2 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatto- semikarbat-5 sido-, tiosemikarbatsido-, karboksyyli-, bromiasetamido- tai maleimidoryhmä, R3 on C^-alkoksi, -0CH2C02H, hydroksi tai vety, R4 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikar-batsido-, tiosemikarbatsido-, karboksyyli-, bromiasetami-10 do- tai maleimidoryhmä ja kukin R5 on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli sillä edellytyksellä, että R2 ja R4 eivät molemmat voi olla vetyjä mutta toisen niistä on oltava vety; ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.Wherein each Q is independently hydrogen or CHR 5 CO 2 R and each R is independently hydrogen or C 1-4 alkyl, provided that at least two of Q are non-hydrogen, m is an integer from zero to five, R 2 is hydrogen or nitro -, amino, isothiocyanato-semicarbat-5-bond, thiosemicarbazido, carboxyl, bromoacetamido or maleimido group, R 3 is C 1-4 alkoxy, -OCH 2 CO 2 H, hydroxy or hydrogen, R 4 is hydrogen or nitro, amino, isothiocyanato-, , semicarbazido, thiosemicarbazido, carboxyl, bromoacetamide-10-doo or maleimido, and each R 5 is independently hydrogen or C 1-4 alkyl, provided that R 2 and R 4 cannot both be hydrogen, but one of them must be hydrogen; and pharmaceutically acceptable salts thereof.

15 Kun R3 ja R4 ovat molemmat kaavassa II vetyjä, yh disteet vastaavat seuraavaa kaavaa:When R3 and R4 are both hydrogen in formula II, the compounds correspond to the following formula:

QQ

VV

R2——<CHz>—'c-^R-2 - <CH> - 'c ^

(III) Q(III) Q

25 jossa kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R ja kukin R on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, 30 sillä edellytyksellä, että ainakin kaksi substituenteista ” Q on muita kuin vetyjä, m on kokonaisluku nollasta viiteen, R2 on nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikarbatsido-, tiosemikarbatsido-, karboksyyli-, bromiasetamido- tai ma-35 leimidoryhmä ja 12 104898 kukin R5 on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli; tai ovat vastaavia farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja.Wherein each Q is independently hydrogen or CHR 5 CO 2 R and each R is independently hydrogen or C 1-6 alkyl, provided that at least two of the substituents' Q are other than hydrogen, m is an integer from zero to five, R 2 is nitro, amino, an isothiocyanato, a semicarbazido, a thiosemicarbazido, a carboxyl, a bromoacetamido, or a ma-35-imimido group, and 12 104898 each R 5 is independently hydrogen or C 1-6 alkyl; or are the corresponding pharmaceutically acceptable salts.

R2:n ollessa kaavassa II vety yhdisteet vastaavat kaavaa 5 3 'When R 2 in formula II, the hydrogen compounds are of formula 5 3 '

(/ -cch2)-c-H *>-Q(/ -cch2) -c-H *> - Q

\—/ " * / \ io — H\ - / "* / \ io - H

(IV) Q(IV) Q

jossa kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R ja 15 kukin R on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, sillä edellytyksellä, että ainakin kaksi substituenteista Q on muita kuin vetyjä, m on kokonaisluku nollasta viiteen, R3 on C-^-alkoksi, -0CH2C02H tai hydroksi, 20 R4 on nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikarbatsido-, tiosemikarbatsido-, karboksyyli-, bromiasetamido- tai ma-leimidoryhmä ja kukin R5 on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli; tai ovat vastaavia farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja. 25 Muita edullisia kaavan IA mukaisia yhdisteitä ovat yhdisteet, joissa ainakin yksi Q on vety ja jotka vastaavat kaavaawherein each Q is independently hydrogen or CHR 5 CO 2 R and each R is independently hydrogen or C 1-4 alkyl, provided that at least two of Q are non-hydrogen, m is an integer from zero to five, R 3 is C 1-6 alkoxy, -OCH 2 CO 2 H or hydroxy, R 4 is nitro, amino, isothiocyanato, semicarbazido, thiosemicarbazido, carboxyl, bromoacetamido or maleimido, and each R 5 is independently hydrogen or C 1-6 alkyl; or are the corresponding pharmaceutically acceptable salts. Other preferred compounds of formula IA are those wherein at least one Q is hydrogen and are of formula

QQ

r-S Q1 . .. r2-(/ y-(CH2)-c-n n-qr-S Q1. .. r2 - (/ y- (CH2) -c-n n-q

H*/ / HH * / / H

35 Q35 Q

(V) 13 104898 jossa kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R, Q1 on vety tai C02R ja kukin R on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, 5 sillä edellytyksellä, että ainakin kaksi substituenteista Q ja Q1 on muita kuin vetyjä ja yksi Q on vety, m on kokonaisluku nollasta viiteen, R2 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikar-batsido-, tiosemikarbatsido-, karboksyy1i-, maleimido- tai 10 bromiasetamidoryhmä, R3 on Cj^-alkoksi, -0CH2C02H, hydroksi tai vety, R4 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikar-batsido-, tiosemikarbatsido-, karboksyyli-, maleimido- tai bromiasetamidoryhmä ja 15 kukin R5 on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, sillä edellytyksellä, että R2 ja R4 eivät molemmat voi olla vetyjä mutta toisen niistä on oltava vety; ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.(V) 13 104898 wherein each Q is independently hydrogen or CHR 5 CO 2 R, Q 1 is hydrogen or CO 2 R and each R is independently hydrogen or C 1 -C 4 alkyl, provided that at least two of Q and Q 1 are other than hydrogen and one Q is hydrogen, m is an integer from zero to five, R 2 is hydrogen or nitro, amino, isothiocyanato, semicarbazido, thiosemicarbazido, carboxyl, maleimido or bromoacetamido, R 3 is C 1-6 alkoxy, -OCH 2 CO 2 H, hydroxy or hydrogen, R 4 is hydrogen or nitro, amino, isothiocyanato, semicarbazido, thiosemicarbazido, carboxyl, maleimido or bromoacetamido groups, and each R 5 is independently hydrogen or C 1-4 alkyl, provided that R 2 and R 4 both cannot be hydrogen but one must be hydrogen; and pharmaceutically acceptable salts thereof.

Muita edullisia kaavan IA mukaisia yhdisteitä ovat 20 yhdisteet, joissa Q1 on C02R ja jotka vastaavat kaavaa /> /-\ C°2R \ /Other preferred compounds of formula IA are those wherein Q 1 is CO 2 R and are of the formula?

: 25 r2-(/ V-<ch2>-c-9 N-Q: 25 r2 - {/ V- <ch2> -c-9 N-Q

QQ

(VI) jossa v»x/ * 30 kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R ja « * > kukin R on itsenäisesti vety tai Cj.^-alkyyli, sillä edellytyksellä, että ainakin yksi Q on muu kuin vety, m on kokonaisluku nollasta viiteen, 14 104898 R2 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikar-batsido-, tiosemikarbatsido-, karboksyyli-, maleimido- tai bromiasetamidoryhmä, R3 on C^-alkoksi, -0CH2C02H, hydroksi tai vety, 5 R4 on vety tai nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikar-batsido-, tiosemikarbatsido-, karboksyyli-, maleimido- tai bromiasetamidoryhmä ja kukin R5 on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, sillä edellytyksellä, että R2 ja R4 eivät molemmat voi olla 10 vetyjä mutta toisen niistä on oltava vety; ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.(VI) wherein v x x / 30 30 each Q is independently hydrogen or CHR 5 CO 2 R and *> each R is independently hydrogen or C 1 -C 4 alkyl, provided that at least one Q is other than hydrogen, m is an integer from zero to 5; , 14 104898 R 2 is hydrogen or nitro, amino, isothiocyanato, semicarbazido, thiosemicarbazido, carboxyl, maleimido or bromoacetamido, R 3 is C 1-4 alkoxy, -OCH 2 CO 2 H, hydroxy or hydrogen, R 4 is hydrogen or nitro, amino, isothiocyanato, semicarbazido, thiosemicarbazido, carboxyl, maleimido or bromoacetamido groups and each R 5 is independently hydrogen or C 1-4 alkyl, provided that R 2 and R 4 may not both be hydrogen but one of them must be hydrogen; and pharmaceutically acceptable salts thereof.

Eräitä edullisia kaavan VI mukaisia yhdisteitä ovat yhdisteet, joissa R3 ja R4 ovat molemmat vetyjä ja jotka vastaavat kaavaaSome preferred compounds of formula VI are compounds wherein R 3 and R 4 are both hydrogen and corresponding to formula

QQ

15 i rN— /15 i rN— /

K--r M— (CH2)-C-N N-QK - r M - (CH 2) -C-N N-Q

20 H20 H

QQ

(VII) jossa kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R ja : 25 kukin R on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, sillä edellytyksellä, että ainakin yksi Q on muu kuin vety, m on kokonaisluku nollasta viiteen, R2 on nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikarbatsido-, 30 tiosemikarbatsido-, karboksyyli-, bromiasetamido- tai male imidoryhmä ja kukin R5 on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli; ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.(VII) wherein each Q is independently hydrogen or CHR 5 CO 2 R and: each R is independently hydrogen or C 1-4 alkyl, provided that at least one Q is other than hydrogen, m is an integer from zero to five, R 2 is nitro, amino, , isothiocyanato, semicarbazido, thiosemicarbazido, carboxyl, bromoacetamido or maleimido and each R 5 is independently hydrogen or C 1-6 alkyl; and pharmaceutically acceptable salts thereof.

Muita edullisia kaavan VI mukaisia yhdisteitä ovat 35 yhdisteet, joissa R2 on vety ja jotka vastaavat kaavaa 104898 jossa q R3 _ ' .Other preferred compounds of formula VI are compounds wherein R 2 is hydrogen and corresponding to formula 104898 wherein q R 3 - '.

f, C02R r 7f, CO 2 R 7

5 ( y-(CH2)-c-N N-Q5 (y- (CH 2) -c-N N-Q

QQ

(VIII) 10 kukin Q on itsenäisesti vety tai CHR5C02R ja kukin R on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli, sillä edellytyksellä, että ainakin yksi Q on muu kuin vety, m on kokonaisluku nollasta viiteen, 15 R3 on C^-alkoksi, -0CH2C02H tai hydroksi, R4 on nitro-, amino-, isotiosyanaatto-, semikarbatsido-, tiosemikarbatsido-, karboksyyli-, maleimido- tai bromiase-tamidoryhmä ja kukin R5 on itsenäisesti vety tai C^-alkyyli; 20 ja vastaavat farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.(VIII) 10 each Q is independently hydrogen or CHR 5 CO 2 R and each R is independently hydrogen or C 1-4 alkyl, provided that at least one Q is other than hydrogen, m is an integer from zero to five, R 3 is C 1-4 alkoxy, - OCH 2 CO 2 H or hydroxy, R 4 is nitro, amino, isothiocyanato, semicarbazido, thiosemicarbazido, carboxyl, maleimido or bromoacetamido, and each R 5 is independently hydrogen or C 1-6 alkyl; And the pharmaceutically acceptable salts thereof.

Tässä kuvattuja bifunktionaalisia kelaatinmuodosta-jia (jotka vastaavat jotakin kaavoista IA - VIII) voidaan käyttää kelatoimaan tai kompleksoimaan tyypiltään harvinaisia maametalleja olevia metalli-ioneja, erityisesti ; 25 radioaktiivisia harvinaisia maametalli-ioneja, metalli- ionikelaattien (joita kutsutaan tässä myös "komplekseiksi") muodostamiseksi. Koska kompleksit sisältävän funktionaalisen osan (jota edustaa substituoitu fenyyli kaavassa IA) , ne voidaan kiinnittää funktionalisoituihin kantajiin, 30 kuten esimerkiksi funktionaalisia ryhmiä sisältäviin polymeerisiin kantajiin, tai edullisesti, kun kysymyksessä on kaavan IA mukainen kompleksi, jossa R2 ja R4 ovat pakosta muita kuin nitroryhmiä, se voidaan liittää proteiineihin tai vielä tarkemmin vasta-aineisiin tai vasta-ainefrag-35 mentteihin. Tässä kuvatut kompleksit (joita edustaa har- 16 104898 vinaisten maametalli-ionien kanssa, erityisesti radioaktiivisten harvinaisten maametalli-ionien kanssa, kompleksin muodostanut yhdiste, joka vastaa jotakin kaavoista IA - VIII) voidaan liittää kovalenttisesti vasta-aineeseen 5 tai vasta-ainefragmenttiin, ja niitä kutsutaan tässä "kon-jugaateiksi".The bifunctional chelating agent described herein (corresponding to any one of formulas IA to VIII) may be used to chelate or complex metal ions of the rare earth type, in particular; Radioactive rare earth ions to form metal ion chelates (also referred to herein as "complexes"). Since the functional moiety containing the complexes (represented by substituted phenyl in formula IA), they can be attached to functionalized supports, such as polymeric functional groups containing functional groups, or preferably in the case of a complex of formula IA wherein R 2 and R 4 are necessarily non-nitro groups, it can be linked to proteins or, more particularly, to antibodies or antibody fragments. The complexes described herein (represented by the rare earth metal ions, in particular the radioactive rare earth ions, the compound forming one of the formulas IA-VIII) may be covalently linked to antibody 5 or antibody fragment, and referred to herein as "conjugates".

Tässä kuvatuissa konjugaateissa käyttökelpoisia vasta-aineita tai vasta-ainefragmentteja voidaan valmistaa alalla tunnetuilla tekniikoilla. Erittäin spesifisiä mo-10 noklonaalisia vasta-aineita voidaan valmistaa hybridisaa-tiotekniikoilla, jotka ovat tällä alalla tunnettuja; tutustukaa esimerkiksi Kohlerin ja Milsteinin julkaisuihin [Nature 256 (1975) 495 - 497 ja Eur. J. Immunol. 6 (1976) 511 - 519] . Sellaisilla vasta-aineilla on tavallisesti 15 hyvin spesifinen reaktiokyky. Radioaktiivisissa metalli-ionikonjugaateissa voidaan käyttää minkä tahansa halutun antigeenin tai hapteenin vasta-aineita. Edullisesti radioaktiivisissa metalli-ionikonjugaateissa käytettävät vasta-aineet ovat monoklonaalisia vasta-aineita tai niiden frag-20 mentteja, joilla on suuri spesifisyys halutun epitoopin tai epitooppien suhteen. Tässä yhteydessä käytettävät vasta-aineet voivat olla esimerkiksi kasvainten, bakteerien, sienien, virusten, loisten, mykoplasmojen, erilaistumis-ja muiden solukalvoantigeenien, patogeenien pinta-antigee-: 25 nien, toksiinien, entsyymien, allergeenien, lääkkeiden ja minkä tahansa biologisesti aktiivisten molekyylien vasta-aineita. Eräitä esimerkkejä vasta-aineista tai vasta-aine-fragmenteista ovat C-ll, CC-46, CC-49, CC-49:n F(ab')2, CC-83, CC-83:n F(ab')2 ja B72.3. [Mitä vasta-aineisiin CC-49, 30 CC-83 ja B72.3 tulee, tutustukaa julkaisuun D. Colcher et ai., Cancer Res. 48 (15. elokuuta 1988) 4597 - 4603. Hyb-ridoomasolulinja B72.3 on talletettu kokoelmaan American Type Culture Collection (ATCC) numerolla HB 8108. Erilaiset CC-vasta-aineet on esitetty US-patenttihakemuksessa 7-35 073685, joka on jätetty 15. heinäkuuta 1987 ja on saata- 17 104898 vissa NTIS:n kautta. Muut hiiren monoklonaaliset vasta-aineet sitoutuvat kasvaimiin yhteydessä olevan antigeenin TAG-72:n epitooppeihin.] Täydellisempi luettelo antigeeneistä löytyy US-patenttijulkaisusta 4 193 983. Tässä ku-5 vatut radioaktiiviset metalli-ionikonjugaatit ovat erikoisen edullisia erilaisten syöpien diagnosointiin ja hoitoon .Antibodies or antibody fragments useful in the conjugates described herein can be prepared by techniques known in the art. Highly specific mon-10 monoclonal antibodies can be prepared by hybridization techniques known in the art; see, for example, Kohler and Milstein [Nature 256: 495-497 (1975) and Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976)]. Such antibodies usually have a very specific reactivity. Antibodies of any desired antigen or hapten may be used in the radioactive metal ion conjugates. Preferably, the antibodies used in the radioactive metal ion conjugates are monoclonal antibodies or fragments thereof having a high specificity for the desired epitope or epitopes. Antibodies used in this context may include, for example, antibodies against tumors, bacteria, fungi, viruses, parasites, mycoplasmas, differentiation and other cell membrane antigens, pathogen surface antigens, toxins, enzymes, allergens, drugs and any biologically active molecules. the enclosure. Some examples of antibodies or antibody fragments are C-11, CC-46, CC-49, F (ab ') 2 of CC-49, CC-83, F (ab') of CC-83. 2 and B72.3. [For antibodies to CC-49, CC-83 and B72.3, see D. Colcher et al., Cancer Res. 48 (August 15, 1988) 4597-4603. The Hybidomaoma cell line B72.3 is deposited in the American Type Culture Collection (ATCC) under the number HB 8108. Various CC antibodies are disclosed in U.S. Patent Application No. 7-35 073685. July 15, 1987 and is available through NTIS. Other murine monoclonal antibodies bind to epitopes on the TAG-72 antigen associated with tumors.] A more complete list of antigens can be found in U.S. Patent 4,193,983. The radioactive metal ion conjugates described herein are particularly advantageous for the diagnosis and treatment of various cancers.

Edullisia tyypiltään harvinaisia maametalleja (lan-tanideja tai pseudolantanideja) olevien metallien komplek-10 seja, jotka ovat tämän keksinnön mukaisia, kuvaa kaava C [Ln (BFC) ] (IX) 15 jossa Ln on harvinaisen maametallin ioni, lantanidi-ioni, kuten esimerkiksi Ce3+, Pr3*, Nd3*, Pm3*, Sm3+, Eu3*, Gd3*, Tb3*, Dy3*, Ho3*, Er3*, Tm3*, Yb3* tai Lu3+, tai pseudolantanidi- ioni, kuten esimerkiksi Sc3+, Y3* tai La3+, ja erityisen edullisia metalli-ioneja ovat Y3*, Ho3+, Lu3* ja Sm3*, BFC 20 tarkoittaa kaavan IA mukaista bifunktionaalista kelaatin-muodostajaa ja C tarkoittaa farmaseuttisesti hyväksyttävää ionia tai ioniryhmää, jolla on riittävä varaus tekemään koko kompleksi sähköisesti neutraaliksi. Mikäli BFC sisältää vähintään 4 negatiivisesti varautunutta ryhmää, C on : 25 kationi tai ryhmä kationeja, kuten esimerkiksi H*, Li+, Na*, K\ Rb*, Cs\ Mg2*, Ca2*, Sr2*, Ba2*, NH4*, N(CH3)4*, N(C2H5)4*, N(C3H7)4*, N (C4H9) 4*, As (C6H5) 4*, [ (C6H5)3P=]2N* tai muu pro- tonoitu amiini. Jos BFC sisältää 3 negatiivisesti varautunutta ryhmää, C:tä ei tarvita. Mikäli BFC sisältää 2 % 30 negatiivisesti varautunutta ryhmää, C on anioni, kuten '1 esimerkiksi F', Cl', Br', I', C104', BF4', H2P04~, HC03', HC02", CH3S03·, H3C-C6H4-S03-, PF6·, CH3C02- tai N(C6H5)4'.Preferred complexes of rare-earth metals (lanthanides or pseudolanthanides) of the present invention are represented by Formula C [Ln (BFC)] (IX) wherein Ln is a rare-earth ion, such as Ce3 +, Pr3 *, Nd3 *, Pm3 *, Sm3 +, Eu3 *, Gd3 *, Tb3 *, Dy3 *, Ho3 *, Er3 *, Tm3 *, Yb3 * or Lu3 +, or a pseudolantanedione such as Sc3 +, Y3 * or La3 +, and particularly preferred metal ions are Y3 *, Ho3 +, Lu3 * and Sm3 *, BFC20 represents a bifunctional chelating agent of formula IA and C represents a pharmaceutically acceptable ion or ionic group having sufficient charge to render the entire complex electrically neutral. If the BFC contains at least 4 negatively charged groups, C is: a cation or a group of cations such as H *, Li +, Na *, K 1 R b *, C 5 \ Mg 2 *, Ca 2 *, Sr 2 *, Ba 2 *, NH 4 *, N (CH 3) 4 *, N (C 2 H 5) 4 *, N (C 3 H 7) 4 *, N (C 4 H 9) 4 *, As (C 6 H 5) 4 *, [(C 6 H 5) 3 P =] 2N * or other protonated amine . If the BFC contains 3 negatively charged groups, no C is required. If the BFC contains 2% of 30 negatively charged groups, C is an anion such as' 1 for example F ', Cl', Br ', I', C104 ', BF4', H2PO4, HC03 ', HCO2', CH3SO3, H3C-. C6H4-SO3-, PF6 ·, CH3CO2- or N (C6H5) 4 '.

Tämän keksinnön mukaisesti saatavia komplekseja voidaan käyttää formulaatioiden muodossa. Formulaatiot si-35 sältävät yhdistettä, jolla on kaava IA, yhdistettynä me- ie 104898 talli-ioniin ja mahdollisesti vasta-aineeseen sekä sopivaa fysiologisesti hyväksyttävää kantaja-, täyte- tai väliainetta. Formulaatio voi siis koostua fysiologisesti hyväksyttävästä kantaja-aineesta ja kompleksista (metalli-5 ioni + ligandi) tai konjugaatista (metalli-ioni + ligan-di + vasta-aine). Menetelmät sellaisten formulaatioiden valmistamiseksi ovat tunnettuja. Formulaatioita voidaan käyttää suspension, injektoitavaksi soveltuvan liuoksen tai muun sopivan formulaation muodossa. Voidaan käyttää 10 fysiologisesti hyväksyttäviä suspendointiaineita mahdollisesti yhdessä apuaineiden kanssa.The complexes obtained according to the present invention can be used in the form of formulations. The formulations si-35 contain a compound of formula IA combined with 104898 thallium ion and optionally an antibody and a suitable physiologically acceptable carrier, excipient or vehicle. Thus, the formulation may consist of a physiologically acceptable carrier and complex (metal ion + ligand) or conjugate (metal ion + ligand di + antibody). Methods for preparing such formulations are known. The formulations may be used in the form of a suspension, solution for injection or other suitable formulation. Physiologically acceptable suspending agents may be used, optionally in association with adjuvants.

Hoitoon käytetään "vaikuttava määrä" formulaatiota. Annos vaihtelee hoidettavan taudin mukaan. Vaikka kyseisiä formulaatioita voidaan käyttää in vitro suoritettavassa 15 diagnosoinnissa, myös in vivo diagnosointi on mahdollista niiden avulla. Lisäksi kyseisiä formulaatioita voidaan käyttää myös radioimmuuniohjatussa kirurgiassa (RIGS); muita metalleja, joita voitaisiin käyttää tähän tarkoitukseen, ovat kuitenkin myös 99mTc, 311In, 113mIn, 67Ga ja 68Ga.An "effective amount" of the formulation is used for treatment. The dose will vary depending on the disease being treated. Although these formulations can be used for in vitro diagnosis, they are also possible for in vivo diagnosis. In addition, these formulations may also be used in radioimmuno-guided surgery (RIGS); however, other metals that could be used for this purpose include 99mTc, 311In, 113mIn, 67Ga and 68Ga.

20 Muihin eräiden tämän keksinnön mukaisesti saatavien kompleksien käyttöihin kuuluvat magneettiseen resonanssiin perustuva kuvaus, esimerkiksi kaavan IA mukaisten yhdisteiden, erityisesti kaavan VI mukaisten yhdisteiden ja Gd3*:n kompleksien, kiinnittäminen polymeerisiin kantajiin 25 erilaisia tarkoituksia varten, esimerkiksi diagnostisina aineina käyttöä varten, ja lantanidimetalli- tai pseudolantanidimetalli-ionin poistaminen selektiivisellä uutolla.Other uses of some of the complexes obtainable in accordance with the present invention include magnetic resonance imaging, for example, attachment of compounds of formula IA, in particular compounds of formula VI and Gd3 *, to polymeric carriers for various purposes, such as use as diagnostic agents, and lanthanide or removal of the pseudolanthanide metal ion by selective extraction.

Tämän keksinnön avulla saadaan, komplekseja, joista 30 eräät ovat stabiilimpia ja/tai biologiselta jakautumisel-' taan parempia ja/tai poistuvat nopeammin elimistöstä kuin alalla jo tunnetut.The present invention provides complexes, some of which are more stable and / or have a better biodistribution and / or faster elimination from the body than are known in the art.

19 10489819 104898

Keksinnön mukaiselle menetelmälle terapeuttisesti aktiivisen metallikompleksiyhdisteen valmistamiseksi kaavan IA mukaisesti yhdisteestä tai sen suolasta ja metalli-ionista on tunnusomaista, että 5 (A) yhdiste, jolla on kaavaThe process of the invention for the preparation of a therapeutically active metal complex compound of formula IA from a compound or a salt thereof and a metal ion is characterized in that the compound of formula (A)

HB

/ (VA)/ (VA)

10 o2fc -(' -(CH2)-C-N M"H10 o2fc - ('- (CH 2) -C-N M "H

n Hn H

HB

15 j ossa Q1 on C02R, R on C^-alkyyli ja n on kokonaisluku nollasta viiteen, 20 satetaan reagoimaan a-halogeenikarboksyylihappoesterin kanssa, jolla on kaavaWherein Q 1 is CO 2 R, R is C 1 -C 4 alkyl and n is an integer from zero to 5, is reacted with an α-halo carboxylic acid ester of the formula

BrCH2C02RBrCH2C02R

• ’’ 25 jossa R on C^-alkyyli, orgaanisen liuottimen ja emäksen läsnäollessa 0 °C:n ja refluksointilämpötilan välillä olevassa lämpötilassa, kaavan IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa Q1 ja n ovat edellä määritellyt, 3 0 R3, R4 ja R5 ovat vetyjä, " R on C1.4-alkyyli ja R2 on nitro, tai (B) vaiheen (A) tuote saatetaan reagoimaan hydra-usaineen, kuten Pd/C:n ja vedyn, kanssa tavanomaisissa 20 104898 reaktio-olosuhteissa kaavan IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa Q1 ja n ovat edellä määritellyt, R3, R4 ja R5 ovat vetyjä, 5 R on C^-alkyyli ja R2 on amino, tai (C) vaiheen (B) tuote saatetaan reagoimaan de-es-teröintiaineen, kuten vahvan hapon, kanssa kaavan IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa 10 Q1 ja n ovat edellä määritellyt, R3, R4 ja R5 ovat vetyjä, R on vety ja R2 on amino, tai (D) edellä määritelty kaavan VA mukainen yhdiste 15 saatetaan reagoimaan optisesti aktiivisen a-bentseenisul- fonaatin kanssa, jolla on kaava R5Wherein R is C 1 -C 4 alkyl, in the presence of an organic solvent and a base at a temperature between 0 ° C and reflux, to provide a compound of formula IA wherein Q 1 and n are as defined above, R 3, R 4 and R 5 are hydrogen, "R is C 1-4 alkyl and R 2 is nitro, or (B) the product of step (A) is reacted with a hydrazine such as Pd / C and hydrogen under standard reaction conditions for a compound of formula IA wherein Q 1 and n are as defined above, R 3, R 4 and R 5 are hydrogen, R 5 is C 1-4 alkyl and R 2 is amino, or (C) reacting the product of step (B) with a de-esterifying agent such as a strong acid with a compound of formula IA wherein Q1 and n are as defined above, R3, R4 and R5 are hydrogen, R is hydrogen and R2 is amino, or (D) reacting a compound of formula VA as defined above with an optically active α- benzene sulfonate of formula R5

)COOR) COOR

20 020 0

_ I_ I

o — S= o ά . 25 ^ jossa R ja R5 ovat edellä määritellyt, kaavan IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa Q1, R5 ja n ovat edellä määritellyt, R3 ja R4 ovat vetyjä, 30 R on C1.4-alkyyli ja ·; R2 on nitro, tai (E) vaiheen (D) tuote saatetaan reagoimaan hydra-usaineen, kuten Pd/C:n ja vedyn, kanssa tavanomaisissa reaktio-olosuhteissa kaavan IA mukaisen yhdisteen saami-35 seksi, jossa 104898 Q1, R5 ja n ovat edellä määritellyt, R3 ja R4 ovat vetyjä, R on C^-alkyyli ja R2 on amino, tai 5 (F) vaiheen (E) tuote saatetaan reagoimaan de-es- teröintiaineen, kuten vahvan hapon, kanssa kaavan IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa Q1, R5 ja n ovat edellä määritellyt, R3, R4 ja R ovat vetyjä ja 10 R2 on amino, tai (G) yhdiste, jolla on kaava ” /ri " /' Λ-(CH2)-C-N N- h (IVA)o - S = o ά. Wherein R and R 5 are as defined above, to provide a compound of formula IA wherein Q 1, R 5 and n are as defined above, R 3 and R 4 are hydrogen, R is C 1-4 alkyl and ·; R2 is nitro, or the product of step (D) of (E) is reacted with a Hydra reagent such as Pd / C and hydrogen under standard reaction conditions to provide a compound of formula IA wherein 104898 Q1, R5 and n are as defined above, R 3 and R 4 are hydrogen, R is C 1 -C 4 alkyl and R 2 is amino, or the product of step (E) of step 5 (F) is reacted with a de-esterifying agent such as a strong acid to provide a compound of formula IA Q 1, R 5 and n are as defined above, R 3, R 4 and R are hydrogen and R 2 is amino, or (G) a compound of the formula "/ R 1" / '- (CH 2) -C N N -h (IVA)

11 H11 H

no2no2

HB

20 jossa R3' on C^-alkoksi, -0CH2C02H tai hydroksi ja n on kokonaisluku nollasta viiteen, satetaan reagoimaan α-halogeenikarboksyylihapon kanssa, .. 25 jolla on kaavaWherein R 3 'is C 1-4 alkoxy, -OCH 2 CO 2 H, or hydroxy and n is an integer from zero to five, is reacted with an α-halo carboxylic acid of the formula

BrCH2C02HBrCH2C02H

orgaanisen liuottimen ja emäksen läsnäollessa 0 °C:n ja 30 refluksointilämpötilan välillä olevassa lämpötilassa, kaa van IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa R3 on sama kuin edellä määritelty R3', n on edellä määritelty, Q1 ja R2 ovat vetyjä ja 35 R4 on nitro, tai 104898 (H) vaiheen (G) tuote saatetaan reagoimaan hydra-usaineen, kuten Pd/C:n ja vedyn, kanssa tavanomaisissa reaktio-olosuhteissa kaavan IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa 5 R3 on sama kuin edellä määritelty R3' , n on edellä määritelty, Q1, R, R2 ja R5 ovat vetyjä ja R4 on amino, tai (I) yhdiste, jolla on kaava 10in the presence of an organic solvent and a base at a temperature between 0 ° C and 30 ° C to give a compound of formula IA wherein R 3 is as defined above R 3 ', n is as defined above, Q 1 and R 2 are hydrogen and R 4 is nitro, or 104898 (H) the product of step (G) is reacted with a Hydra reagent such as Pd / C and hydrogen under standard reaction conditions to provide a compound of formula IA wherein R 3 is as defined above for R 3 ', n is as defined above. as defined, Q 1, R, R 2 and R 5 are hydrogen and R 4 is amino, or (I) a compound of formula 10

HB

/ OMe N ^ /-\ '1 \ / // v\-(CH2)-C-M N' H (VIHA) 15 \-/ n ' \/ OMe N ^ / - \ '1 \ / // v \ - (CH2) -C-M N' H (VIHA) 15 \ - / n '\

Λ-7 HΛ-7 H

no2 h jossa 2 0 Q1 on C02R, R on C1.4-alkyyli ja n on kokonaisluku nollasta viiteen, satetaan reagoimaan a-halogeenikarboksyylihappojohdannaisen kanssa, jolla on kaava .. 25no 2 h where 2 0 Q 1 is CO 2 R, R is C 1-4 alkyl and n is an integer from zero to five, is reacted with an α-halo carboxylic acid derivative of the formula.

BrCH2C02RBrCH2C02R

jossa R on edellä määritelty, orgaanisen liuottimen ja emäksen läsnäollessa 0 °C:n ja refluksointilämpötilan vä-30 Iillä olevassa lämpötilassa, kaavan IA mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa Q1, Q ja n ovat edellä määritellyt, R2 on vety ja R4 on nitro, tai 23 104898 (J) vaiheen (I) tuote saatetaan reagoimaan de-es-teröintiaineen, kuten vahvan hapon, kanssa ja sen jälkeen hydrausaineen, kuten Pd/C:n ja vedyn, kanssa tavanomaisissa reaktio-olosuhteissa kaavan IA mukaisen yhdisteen 5 saamiseksi, jossa Q1, Q ja n ovat edellä määritellyt, R, R2 ja R5 ovat vetyjä ja R4 on amino, tai (K) vaiheen (B) , (F) , (H) tai (J) tuote saatetaan 10 reagoimaan tiofosgeenin kanssa vastaavan yhdisteen saamiseksi, jossa R2 tai R4 on isotiosyanaatto; (L) mahdollisesti kaavan IA mukainen yhdiste saatetaan tunnetuilla menetelmillä reagoimaan sopivan reagens-sin kanssa yhdisteen kalium-, natrium-, litium-, am- 15 monium-, kalsium-, magnesium- tai vetykloridiadduktin saa miseksi farmaseuttisesti hyväksyttävänä suolana, ja (M) jollakin menetelmistä (A) - (L) valmistettu yhdiste saatetaan reagoimaan metalli-ionin kanssa, joka metalli-ioni on La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, 20 Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y tai Se.wherein R is as defined above, in the presence of an organic solvent and a base at a temperature of 0 ° C and reflux temperature, to provide a compound of formula IA wherein Q 1, Q and n are as defined above, R 2 is hydrogen and R 4 is nitro, or 104898 (J) The product of step (I) is reacted with a de-esterifying agent such as a strong acid and then with a hydrogenating agent such as Pd / C and hydrogen under conventional reaction conditions to provide a compound of formula IA wherein Q1, Q and n are as defined above, R, R2 and R5 are hydrogen and R4 is amino, or the product of step (B), (F), (H) or (J) of (K) is reacted with thiophosgene to give the corresponding compound wherein R 2 or R 4 is isothiocyanato; (L) optionally reacting, optionally, a compound of formula IA with a suitable reagent to provide a potassium, sodium, lithium, ammonium, calcium, magnesium or hydrochloride adduct of the compound as a pharmaceutically acceptable salt, and (M) reacting a compound prepared by any of methods (A) to (L) with a metal ion selected from La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, 20 Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y or Se.

Eräs järkevä ja yleinen tapa kaavan IA mukaisen 12 rengasatomia sisältävän, makrosyklisen, bifunktionaalisen kelaatinmuodostajan syntetisoimiseksi, on monofunktionali-soida vapaana emäksenä oleva makrosyklinen yhdiste (esim.One rational and common way to synthesize a macrocyclic, bifunctional chelating agent containing 12 ring atoms of formula IA is to monofunctionalize the free base macrocyclic compound (e.g.

.. 25 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani) liittämällä vain yhteen sen typpiatomeista sopiva elektrofiili (esim. jokin asianmukaisella tavalla substituoitu a-halogeenikarboksyylihap-poesteri). Tämän elektrofiilin täytyy sisältää sopiva kyt-kentäryhmä tai sopivalla tavalla suojattu kytkentäryhmä, 30 joka mahdollistaa bifunktionaalisen ligandin liittämisen proteiiniin, vasta-aineeseen tai vasta-ainefragmenttiin... 1,4,7,10-tetraazacyclododecane) by attaching only one of its nitrogen atoms to a suitable electrophile (e.g., an appropriately substituted α-halo carboxylic acid ester). This electrophile must contain a suitable linker group or a suitably protected linker group which enables the bifunctional ligand to be attached to the protein, antibody or antibody fragment.

On alalla tunnettua, että alkylointimenettelytavat mono-N-funktionaalisten makrosyklisten polyatsayhdisteiden valmistamiseksi saattavat johtaa vaikeasti erotettavien 35 tuotteiden seoksiin [T. Käden, Top. Curr. Chem. 121 (1984) 24 104898 157 - 175]. Tästä ongelmasta on päästy käyttämällä, niin kuin on raportoitu, suuria makrosyklisen yhdisteen ylimääriä (5 - 10 ekvivalenttia suhteessa elektrofiiliin), mikä edistää monoadditiotuotteen muodostumista [M. Studer 5 ja T. A. Käden, Helv. Chim. Acta 69 (1986) 2081 - 86; E. Kimura et ad. , J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1986, 1158 -59] .It is known in the art that alkylation procedures for the preparation of mono-N-functional macrocyclic polyaza compounds may lead to mixtures of difficult to separate products [T. Hand, Top. Curr. Chem. 121: 24104898157-175 (1984)]. This problem has been overcome by using, as reported, large excesses of the macrocyclic compound (5 to 10 equivalents relative to the electrophile), which promotes the formation of the monoaddition product [M. Studer 5 and T. A. Käden, Helv. Chim. Acta 69: 2081-86 (1986); E. Kimura et al. , J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1986, 1158-59].

Muut tiet mono-N-funktionaalisten makrosyklisten polyatsayhdisteiden valmistamiseksi sisältävät pitkähkön 10 suojaus-, funktionalisointi- ja suojauksenpoistosysteemin [P. S. Pallavicini et ai., J. Amer. Chem. Soc. 109 (1987) 5139 - 44; M. F. Tweedle et ai. , EP-hakemusjulkaisu 0 232 751]. Abbott Laboratories on julkaissut hiljaittain tiivistelmänä äskettäisestä kokouksesta raportin substitu-15 oitujen fenyylipalorypälehappojen ja amiinien välisestä pelkistysaminaatiosta [D. K. Johnson et ai., Florida Conf. on Chem. in Biotechnology, April 26-29 (1988), Palm Coast, FL] .Other pathways for the preparation of mono-N-functional macrocyclic polyaza compounds include an elongated protective, functionalization and deprotection system [P. S. Pallavicini et al., J. Amer. Chem. Soc. 109: 5139-44 (1987); M. F. Tweedle et al. , EP-A-0 232 751]. Abbott Laboratories has recently published a summary of a recent meeting report on the reductive amination of substituted 15-phenylphenolic acid and amines [D. K. Johnson et al., Florida Conf. is Chem. in Biotechnology, April 26-29, 1988, Palm Coast, FL].

Yleisiä valmistusteitä kaavan IA mukaisten kelaa-20 tinmuodostajien valmistamiseksi on esitetty jäljempänä synteesikaavioissa I - V, ja ne sisältävät sopivan elektrof iilin ja makrosyklisen polyatsayhdisteen reaktion sopivassa orgaanisessa liuottimessa eri reagointisuhteilla, lämpötiloissa ja pitoisuuksilla. Esimerkkejä sopivista .. 25 orgaanisista liuottimista ovat kaikki liukenemista edistä vät hiilivedyt, kuten esimerkiksi asetonitriili, isopropa-noli, metyleenikloridi, tolueeni, kloroformi, n-butanoli, hiilitetrakloridi, tetrahydrofuraani ja 5 % etanolia sisältävä kloroformi, joista edullisimpia ovat kloroformi, 30 metyleenikloridi, n-butanoli, 1,4-dioksaani ja asetonitriili. Makrosyklistä yhdistettä ja elektrofiiliä voidaan käyttää stökiometrisinä tai lähes stökiometrisinä määrinä ja vastaava mono-N-alkylointituote voidaan saada yhdessä vaiheessa. Lämpötila voi vaihdella reaktiossa noin 35 0 °C:sta suunnilleen seoksen kiehumislämpötilaan ja on 104898 edullisesti O - 25 °C. Aika, jossa reaktio menee loppuun, on noin 1-24 tuntia.General preparation routes for the preparation of chelating agents of formula IA are shown below in Synthetic Schemes I through V and include the reaction of a suitable electrophile with a macrocyclic polyaza compound in a suitable organic solvent at various reaction ratios, temperatures, and concentrations. Examples of suitable organic solvents include all hydrocarbons which promote solubility, such as acetonitrile, isopropanol, methylene chloride, toluene, chloroform, n-butanol, carbon tetrachloride, tetrahydrofuran and chloroform containing 5% ethanol, most preferably chloroform, n-butanol, 1,4-dioxane and acetonitrile. The macrocyclic compound and the electrophile can be used in stoichiometric or near stoichiometric amounts and the corresponding mono-N-alkylation product can be obtained in one step. The temperature in the reaction may range from about 35 ° C to about the reflux temperature of the mixture, and is 104898, preferably 0 to 25 ° C. The reaction time is about 1-24 hours.

Yleismenettely substituoitujen a-halogeenihappoes-tereiden valmistamiseksi on toivottava, jotta synteesikaa-5 viot II ja IV ovat yleisesti käyttökelpoisia. Eräs sopiva tapa on bromata tai kloorata in situ muodostettu happoha-logenidi [esim. D. N. Harpp et ai., J. Org. Chem. 4 0 (1975) 3420 - 27] . Tämä menettelytapa mahdollistaa jopa reaktiivisia bentsyyliryhmiä sisältävien alkaanihappojen 10 yksinomaisen alfa-halogenoinnin. Eräs yleismenetelmä substituoitujen happohalogenidien valmistamiseksi käsittää orgaanisen hapon reaktion tionyylikloridin tai sulfuryyli-kloridin kanssa [esim. E. Schwenk et ai., J. Amer. Chem. Soc. 70 (1944) 3626 - 27]. Molemmissa menetelmissä käyte-15 tään hyväksi vapaata karboksyylihappoa, joka on usein saatavissa kaupallisista lähteistä.A general procedure for the preparation of substituted α-haloic acid esters is desirable for the general use of Synthetic Cassettes II and IV. One suitable method is to brominate or chlorinate the acid halide formed in situ [e.g. D. N. Harpp et al., J. Org. Chem. 40 0: 3420-27 (1975)]. This procedure allows the exclusive alpha-halogenation of alkanoic acids even containing reactive benzyl groups. One general method for preparing substituted acid halides involves the reaction of an organic acid with thionyl chloride or sulfuryl chloride [e.g. Schwenk et al., J. Amer. Chem. Soc. 70, 3626-27 (1944)]. Both methods utilize free carboxylic acid, which is often available from commercial sources.

Makrosyklisiä polyatsayhdisteitä, kuten esimerkiksi 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani, voidaan valmistaa menetelmillä, joista on jo raportoitu [esim. T. J. Atkins et 20 ai., J. Amer. Chem. Soc. 96 (1974) 2268 - 70 ja T. J.Macrocyclic polyaza compounds such as, for example, 1,4,7,10-tetraazacyclododecane may be prepared by methods already reported [e.g. Atkins T. J. et al., 20, J. Amer. Chem. Soc. 96: 2268-70 (1974) and T.J.

Richman et ai., Org. Synthesis 58 (1978) 86 - 98].Richman et al., Org. Synthesis 58: 86-98 (1978).

Mono-N-funktionaalisen makrosyklisen yhdisteen kar-boksimetylointi voidaan toteuttaa Desreux'n menetelmällä käyttämällä bromietikkahappojohdannaisia ja sopivaa emästä .. 25 [J. F. Desreux, Inorg. Chem. 19 (1980) 1319 - 24].The carboxymethylation of the mono-N-functional macrocyclic compound can be accomplished by the Desreux method using bromoacetic acid derivatives and a suitable base .. 25 [J. F. Desreux, Inorg. Chem. 19: 1319-24 (1980)].

Kaikki tässä keksinnössä tarvittavat lähtöaineet ovat joko kaupallisista lähteistä saatavissa tai valmistettavissa tunnetuista kirjallisuuslähteistä löytyvien kuvausten perusteella.All of the starting materials required in this invention are either commercially available or can be prepared from descriptions in the known literature.

30 Seuraavassa kaaviossa I valmistetaan yhdisteitä, joilla on kaava IA, jossa Q1 on vety. Vaikka esitetyt ter- • · mit viittaavat vain yhteen yhdisteeseen, tällä menetelmällä voidaan valmistaa myös muita samankaltaisia kaavan IA piiriin kuuluvia yhdisteitä, joissa Q1 on vety ja n on 35 0-5.In the following Scheme I, compounds of formula IA wherein Q1 is hydrogen are prepared. Although the terms mentioned refer to only one compound, other similar compounds of formula IA in which Q 1 is hydrogen and n is 35 to 5 may also be prepared by this method.

26 1 0 4 8 9 826 1 0 4 8 9 8

Kaavio IScheme I

ΙΟΙ + Η"/ Ν'Η CHC1V 25°C Η Η-Η νο2 · ' / ' 10 / BrCH2C02CH3, / K2C03 CH3CN, / 25eC, 'l7 h o2n cooch3 15 00«, >—Ns/ΙΟΙ + Η "/ Ν'Η CHC1V 25 ° C Η-Η νο2 · '/' 10 / BrCH2C02CH3, / K2C03 CH3CN, / 25eC, 'l7 h o2n cooch3 15 00«,> —Ns /

Pd/c, H2, / ^ COOCH3 20 CH3OH, 25°C, / 2,5 h / h2h cooch3 :· 25 ΥλλΙ ^ väk. HC1 COOCH3 80eC, 2,5 h 7 N—' 1 /Pd / c, H2, / ^ COOCH3 20 CH3OH, 25 ° C, / 2.5 h / h2h cooch3: · 25 ΥλλΙ ^ conc. HCl COOCH3 80eC, 2.5 h 7 N— '1 /

VV

*^cooch3 / 30 * h7n cooh /_/»» 35 ^nHCl* ^ cooch3 / 30 * h7n cooh / _ / »» 35 ^ nHCl

XCOOHXCOOH

27 10489827 104898

Seuraavassa kaaviossa II valmistetaan yhdisteitä, joilla on kaava IA, jossa Q1 on vety. Vaikka esitetyt termit viittaavat vain yhteen yhdisteeseen, tällä menetelmällä voidaan valmistaa myös muita samankaltaisia kaavan IA 5 piiriin kuuluvia yhdisteitä, joissa Q1 on vety ja n on 0 - 5.In the following Scheme II, compounds of formula IA wherein Q1 is hydrogen are prepared. Although the terms given refer to only one compound, other similar compounds of formula IA 5 wherein Q 1 is hydrogen and n is 0 to 5 may also be prepared by this method.

28 10489828 104898

Kaavio IIScheme II

HB

N02 R 2 HNO 2 R 2 H

1) Pd/C, h2, ch3oh / 2) HCl(g), C2H5OH / 10 / H / joTUJ' 15 H2N h -nHCl1) Pd / C, h2, ch3oh / 2) HCl (g), C2H5OH / 10 / H / joTUJ15 H2N h -nHCl

BrCH2C02CH3, /BrCH2CO2CH3, /

K2C03r CH3CHK 2 CO 3 and CH 3 CH

20 ^cooch3 £0OCH320 ^ cooch3 £ 0OCH3

1°fV1 ° fV

25 H2N ^ / cooch3 Väk. / HC1 / 30 / j/0™ ’· / cooh j@X.. J' - h2n ^25 H2N ^ / cooch3 Väk. / HC1 / 30 / j / 0 ™ '· / cooh j @ X .. J' - h2n ^

35 COOH35 COOH

29 10489829 104898

Seuraavassa kaaviossa III valmistetaan yhdisteitä, joilla on kaava IA, jossa Q1 on C02R. Vaikka esitetyt termit viittaavat vain yhteen yhdisteeseen, tällä menetelmällä voidaan valmistaa myös muita samankaltaisia kaavan IA 5 piiriin kuuluvia yhdisteitä, joissa Q1 on C02R ja n on 0-5.In the following Scheme III, compounds of formula IA wherein Q 1 is CO 2 R are prepared. Although the terms given refer to only one compound, other similar compounds of formula IA wherein Q 1 is CO 2 R and n is 0 to 5 may be prepared by this method.

30 10489830 104898

Kaavio III Br _^~C00H COOCH-, 5 ύ -ä:.z: @Scheme III Br _ ^ ~ C00H COOCH-, 5 ύ-a: .z: @

I CH3OHI CH 3 OH

02n no202n no2

Br HBr H

'V—COOCH, .'V — COOCH,.

Ϋ' "CJ" ^Ϋ '"CJ" ^

HO, ' H3COOCHO, 'H3COOC

1 H ,1 H,

15 H15 H

BrCH2C02CH3, , K2C03f CH3CN, \ 25eC, 17 h \BrCH2CO2CH3,, K2CO3f CH3CN, \ 25eC, 17h \

YY

20 ON COOCH3 M/C, H2 Y/~n1 ^ _yCOOC£3 T H3C00<: :· 25 HpN _ .COOCH, { ΊΘΐ C00CH> H^COOC \20 ON COOCH3 M / C, H2 Y / ~ n1 ^ _yCOOC £ 3 T H3C00 <:: · 25 HpN _ .COOCH, {ΊΘΐ C00CH> H ^ COOC \

l h2^ ___ \ /C00Hl h2 ^ ___ \ / C00H

30 C00CH3 t ^ S00C 13HC1 k30 C00CH3 t ^ S00C 13HC1 k

COOHCOOH

104898104898

Seuraavassa kaaviossa IV valmistetaan yhdisteitä, joilla on kaava IA, jossa Q1 on C02R. Vaikka esitetyt termit viittaavat vain yhteen yhdisteeseen, tällä menetelmällä voidaan valmistaa myös muita samankaltaisia kaavan IA 5 piiriin kuuluvia yhdisteitä, joissa Q1 on C02R ja n on 0-5.In the following Scheme IV, compounds of formula IA wherein Q 1 is CO 2 R are prepared. Although the terms given refer to only one compound, other similar compounds of formula IA wherein Q 1 is CO 2 R and n is 0 to 5 may be prepared by this method.

Kaaviossa IV esitetty A':n sisältävä reagenssi voi olla mikä tahansa a-hapon aikaansaantiin soveltuva poistuva ryhmä, ts. A' on fenyyli tai CF3.The A 'containing reagent shown in Scheme IV may be any leaving group suitable for generating the? -Acid, i.e., A' is phenyl or CF 3.

10 Optisesti aktiivisen alkylointiaineen käyttö on minimoinut diastereomeerien muodostumisen ja tekee synteesistä yksinkertaisemman. Yhden ainoan diastereomeerin saaminen eristetyksi, mikä tuottaisi yhden helposti puhdistettavan lantanidikompleksin, olisi toivottavaa sekä ra-15 dioaktiivisen kelaatin muodostuksen kannalta.The use of an optically active alkylating agent has minimized the formation of diastereomers and simplifies the synthesis. It would be desirable to isolate a single diastereomer, which would produce one easily purified lanthanide complex, both for the formation of the radioactive chelate.

· • .· •.

1 · 32 1 0 4 8 9 81 · 32 1 0 4 8 9 8

Kaavio IVScheme IV

H Br ’ COOCH(CH3) 2 5 »'C' + if^l _,.H Br 'COOCH (CH 3) 2 5 »' C '+ if ^ l _,.

^ V %\l \QL^ V% \ l \ QL

H N02 V / N N"HH N02 V / N N "H

(H3C)jCHOOC(H3C) jCHOOC

10 „ __ H10 "__ H

K2c03, CH3CH(50-95%) ^ +K 2 CO 3, CH 3 CH (50-95%)

H,CH, C

3 , COOCH-53, COOCH-5

XX

„ r H"R H

15 h3C^, COOCH, O15 h3C ^, COOCH, O

o,1 _ V Io, 1 _ V I

2 V^v, H HlY _ 1 ] (H3C)2CHOOC C „ \ \ \C00CH3 20 H I.jL· />ch3 cooch32 V ^ v, H HlY _ 1] (H3C) 2CHOOC C „\ \ \ C00CH3 20 H I.jL · /> ch3 cooch3

Pd/C, H2 IPd / C, H2 I

:· 25 ch3oh I: · 25 ch3oh I

h3C<4 COOCH3 h3C<4 COOHh3C <4 COOCH3 h3C <4 COOH

Β21νΛν H ,V H2NV^N h 'VΒ21νΛν H, V H2NV ^ N h 'V

. ^>ΓΊ^· ^>fl> (B3C)2CHOOC 3 \ HOOC ) \. ^> ΓΊ ^ · ^> fl> (B3C) 2CHOOC 3 \ HOOC) \

.. COOCH3 COOH.. COOCH3 COOH

H IIlL H uLH IIlL H uL

/ ▼CH-j w väk. ECl » / ▼CH3/ ▼ CH-j w conc. ECl »/ ▼ CH3

COOCH-, COOHCOOCH-, COOH

35 J35 J

33 10489833 104898

Seuraavassa kaaviossa V valmistetaan yhdisteitä, joilla on kaava IA, jossa Q1 on C02R ja R2 on vety. Vaikka esitetyt termit viittaavat vain kahteen yhdisteeseen, tällä menetelmällä voidaan valmistaa myös muita samankaltai-5 siä kaavan IA piiriin kuuluvia yhdisteitä, joissa Q1 on C02R, n on 0 - 5, R3 on edellä esitetyn määritelmän mukainen ja R2:na sekä R4:nä tulevat kysymykseen vety ja amino-, nitro-, isotiosyanaatto-, semikarbatsido-, tiosemikarbat-sido-, maleimido-, bromiasetamido- ja karboksyyliryhmä. 1 · 3« 104898In the following Scheme V, compounds of formula IA wherein Q 1 is CO 2 R and R 2 is hydrogen are prepared. Although the terms given refer to only two compounds, other similar compounds of formula IA wherein Q 1 is CO 2 R, n is 0 to 5, R 3 is as defined above, and R 2 and R 4 are present may be prepared by this method hydrogen and an amino, nitro, isothiocyanato, semicarbazido, thiosemicarbatido, maleimido, bromoacetamido and carboxyl group. 1 · 3 «104898

Kaavio VScheme V

HB

|R H OR ' _ 1 [_ ΒΓ Xl| R H OR '_ 1 [_ ΒΓ Xl

(ÄY“ R * CH3' i^YU^'K w.H(ÄY "R * CH3 'i ^ YU ^' K w.H

+ H"^Ks^"H R * h' dioksaani kD>jJ+ H "^ Ks ^" H R * h 'dioxane kD> jJ

°2N h 02N° 2N hr 02N

r’b h» R * CH3, 10 / R’ = C0,CH, R1 « H, COOCH3 Rs H ν' 2 3 ν' BrCH2COOH BrCH2COOCH3r'b h »R * CH3, 10 / R '= C0, CH, R1« H, COOCH3 R5 H ν' 2 3 ν 'BrCH2COOH BrCH2COOCH3

ν' Tν 'T

CH2COOCH3CH2COOCH3

15 “jC0" ca3o I15 "jC0" ca3o I

f V~K~^ I t|02l-H3f V ~ K ~ ^ I t | 02l-H3

O) W¥”JO) W ¥ ”J

chocooh CH2C00CH3chocooh CH2C00CH3

0,N0, N

20 °2N 220 ° 2N 2

(1) HC1, 90-10D°C(1) HCl, 90-10 D ° C

(2) Pt02/H2(2) PtO 2 / H 2

Pt02/H2PT02 / H2

▼ T▼ T

• · 9 c• · 9 c

: CH2C00H: CH2C00H

CH2C00HCH2C00H

0H 1 CH3O I0H 1 CH 3 O I

i 1 /_X / N N-CH^COOH X \2 V 'i 1 / _X / N N-CH ^ COOH X \ 2 V '

f/Λγ / \ 2 xXx/-H N-CH-,COOHf / Λγ / \ 2 xXx / -H N-CH-, COOH

(QJ (DJ(QJ (DJ

30 T c^coob 'h2cooh30 T c ^ coob 'h2cooh

E2S HjKE2S HjK

35 10489835 104898

Elektrofiilinen osa (kaavassa IA substituoitu fe-nyyliryhmä) voidaan valmistaa alalla tunnetuin menetelmin. Sellaisia menetelmiä on esitetty julkaisussa Acc. Chem. Res. 17 (1984) 202 - 209. Eräs menetelmä, jolla voidaan 5 valmistaa kaavan IA mukaisia yhdisteitä, joissa elektro-fiili voisi olla isotiosyanaattoryhmä (läsnä oleva R2 tai R4 on isosyanaattoryhmä) käsittää aminokelaatin (R2 tai R4 on aminoryhmä) reaktion tiofosgeenin kanssa ja on esitetty M. J. Fazion et ai. US-patenttihakemuksessa 289 712, joka 10 on jätetty 23. joulukuuta 1988.The electrophilic moiety (the phenyl group substituted in Formula IA) may be prepared by methods known in the art. Such methods are disclosed in Acc. Chem. Res. 17, 202-209 (1984). One method for preparing compounds of formula IA wherein the electro-phenyl could be an isothiocyanate group (R2 or R4 present is an isocyanate group) comprises reaction of an aminocelate (R2 or R4 is an amino group) with thiophosgene and disclosed by MJ Fazion et al. U.S. Patent Application 289,712, filed December 23, 1988.

Radionuklideja voidaan tuottaa monin tavoin. Nukli-dia pommitetaan ydinreaktorissa neutroneilla, jolloin saadaan radionuklidi, esimerkiksi 15 Sm-152 + neutroni - Sm-153 + gammaRadionuclides can be produced in many ways. The nuclide is bombarded in the nuclear reactor with neutrons to give a radionuclide, for example 15 Sm-152 + neutron - Sm-153 + gamma

Toinen menetelmä saada aikaan radionuklideja on pommittaa nuklideja hiukkasilla lineaarikiihdyttimessä tai syklotronissa. Eräs tapa on vielä eristää radionuklidi 20 fissiotuotteiden seoksesta. Tässä keksinnössä käytettävä menetelmä radionuklidien aikaansaamiseksi ei ole keksinnön kannalta ratkaiseva.Another method of providing radionuclides is to bombard the nuclides with particles in a linear accelerator or cyclotron. Another way is to isolate radionuclide 20 from a mixture of fission products. The method of generating radionuclides used in the present invention is not critical to the invention.

Konjugaatteja voidaan valmistaa muodostamalla ensin keksinnön mukaisesti kompleksi ja liittämällä siihen ;·, 25 sitten vasta-aine tai vasta-ainefragmentti. Menetelmä kä sittää siis ligandin valmistamisen, sen ja metallin kompleksin muodostamisen ja vasta-aineen liittämisen sen jälkeen.Conjugates may be prepared by first complexing and coupling with the invention, then an antibody or antibody fragment. Thus, the method comprises preparing the ligand, forming a complex with the metal, and subsequently coupling the antibody.

Seuraavissa esimerkeissä käytetään seuraavia terme- 30 jä ja käytettiin seuraavia olosuhteita, ellei toisin ole .. erikseen mainittu.In the following examples, the following terms are used and the following conditions are used unless otherwise stated.

♦♦

Massaspektrit saatiin joko Finnigan TSQ -massaspektrometrillä (Q^S-malli) tai hyvän erotuskyvyn omaavalla VG ZAB-MS -massaspektrometrillä (pommitus nopeilla kse- 36 1 0 4 8 9 8 nonatomeilla käyttäen ditiotreitolin ja ditioerytritolin seosta suhteessa 3:1).Mass spectra were obtained either on a Finnigan TSQ mass spectrometer (Q 5 S model) or on a highly resolved VG ZAB-MS mass spectrometer (bombardment on fast x 10 1 8 4 9 9 8 atoms using a 3: 1 mixture of dithiothreitol and dithioerythritol).

1H- ja 13C-NMR-spektrit saatiin käyttämällä Varian VXR-300, Bruker APC 300, IBM/Bruker Nr-80 tai Jeol FX400 5 -spektrometriä. Kaikki spektrit saatiin 30 °C:ssa, ellei toisin ole mainittu. ^-NMR-spektrit ajettiin taajuudella 300 MHz, 80 MHz tai 400 MHz edellä lueteltuja laitteita vastaavasti ja 13C-NMR-spektrit taajuudella 75 MHz, 20 MHz tai 100 MHz edellä lueteltuja laitteita vastaavasti.1H and 13C NMR spectra were obtained using a Varian VXR-300, Bruker APC 300, IBM / Bruker Nr-80 or Jeol FX400 5 spectrometer. All spectra were obtained at 30 ° C unless otherwise noted. 1 H-NMR spectra were performed at 300 MHz, 80 MHz or 400 MHz for the devices listed above and 13 C-NMR spectra for the 75 MHz, 20 MHz or 100 MHz devices listed above.

10 NMR-arvot ovat delta-arvoja suhteessa TMSrään (tetrametyy-lisilaaniin) tai D20:n ollessa liuottimena suhteessa DSS:ään (2,2-dimetyyli-2-silapentaani-5-sulfonihapon nat-riumsuolaan).The NMR values are delta values relative to TMS (tetramethylsilane) or D 2 O as a solvent relative to DSS (2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonic acid sodium salt).

Infrapunaspektrit (IR-spektrit) rekisteröitiin 15 Nicolet 5SX FT/IR -laitteella.Infrared (IR) spectra were recorded on a 15 Nicolet 5SX FT / IR instrument.

Mitä kromatografisiin menettelytapoihin tulee, useimmat liuottimet olivat Fischer HPLC -laatua olevia aineita. Ammoniumasetaatti ostettiin Aldrichilta. Vesi puhdistettiin Barnstead NANOpure™ -vedensuodatusjärjestel-20 mää käyttäen. Orgaanisten yhdisteiden preparatiivinen kromatografinen käsittely toteutettiin joko normaalilla painovoimaan perustuvalla kromatografiällä tavanomaista tekniikkaa käyttäen tai flash-kromatografiällä, jota kuvaavat C. W. Still et ai., J. Org. Chem. 43 (1978) 2923 - 24.As far as chromatographic procedures are concerned, most solvents were Fischer HPLC grade. Ammonium acetate was purchased from Aldrich. The water was purified using a Barnstead NANOpure ™ water filtration system. The preparative chromatography of the organic compounds was carried out either by conventional gravity chromatography using conventional techniques or by flash chromatography as described by C. W. Still et al., J. Org. Chem. 43, 2923-24 (1978).

: ' ' 25 Käytettiin seuraavia liuotinseoksia:: '' 25 The following solvent mixtures were used:

Liuotinseos Aineosat 1 CHCI3SCH3OH: väk. NHjjOH til. suhde 30 2:2:iSolvent mixture Ingredients 1 CHCl3SCH3OH: conc. NH 3 OH OH m.p. ratio 30 2: 2: i

V : V : VA: A: A

• · 2 CHCli :CH-aOK: väk. ΝΗ],0Η til. suhde• · 2 CHCl3: CH-aOK: conc. ΝΗ], 0Η vol. ratio

12:11:1 J12: 11: 1 J

V : V : VA: A: A

37 104898 H CHCl-a sCH^OH: väk. NHhOH ti 1. suhde 4:2:1 037 104898 H CHCl-a sCH ^ OH: conc. NHhOH ti 1: 4: 2: 10 ratio

V: V * VA: V * V

5 CHClc:CH-aOH: väk. NHnOH til. suhde 5 3:2:1 0CHClc: CH-aOH: Conc. NHnOH vol. ratio 5 3: 2: 10

V:V: VA: A: A

6 CHClöiCHoÖH: väk. NHmOHtil.suhde 7:3:16 CHCl3 CHOOH: conc. 7: 3: 1 NH 3 OH / v / v

V: V: VA: A: A

γ Fysiologinen suolaliuos (0,85 % 10 NaCl:ä tislatussa vedessä): väk.NH4OH,γ Saline (0.85% 10 NaCl in distilled water): Conc.

til.suhde 4:1 V:Vv / v 4: 1 V: V

8 CHClo:CHoOH: väk. NKhOK til.suhde 4:4:1 08 CHCl3: CHoOH: conc. NKhOK Ratio 4: 4: 1 0

V: V: VA: A: A

1515

Ilmoitetut Rf-arvot on saatu näitä liuotinseoksia ja kaupan olevia, faasiltaan normaaleja silikageeli-TLC-levyjä (GHLF 250 mieron, Analtech Inc. tai Kieselgel 60F254, Merck) käyttäen. Preparatiivinen pylväskromatografiakäsit-20 tely tehtiin Merck grade 60 -silikageeliä (600 nm:n sili-kageeliä) käyttäen.The reported Rf values are obtained using these solvent mixtures and commercially available phase-silica gel TLC plates (GHLF 250 mieron, Analtech Inc. or Kieselgel 60F254, Merck). Preparative column chromatography was performed using Merck grade 60 silica gel (600 nm silica gel).

Kaikki prosenttiluvut perustuvat massaan, ellei toisin ole mainittu.All percentages are by weight unless otherwise stated.

Eräitä kiinteitä aineita kuivattiin pyöröhaih-: 25 dutinta (Buchi 461) tai vakuumiuunia käyttäen noin 55 - 60 °C:ssa muutaman tunnin ajan. Liuottimien poistoon käytettiin lisäksi automaattista Virtis-kylmäkuivauslaitetta (malli 10-010) tai Speed Vac™ -väkevöintilaitetta.Some solids were dried using a rotary evaporator (Buchi 461) or a vacuum oven at about 55-60 ° C for a few hours. Additionally, an automatic Virti freeze-dryer (model 10-010) or a Speed Vac ™ concentrator was used to remove solvents.

Samarium-153 ja lutetium-177 tuotettiin Missourin 30 yliopiston (Columbia, MO) tutkimusreaktorilla. Yttrium-90 *·; ostettiin Oak Ridge National Laboratoriesilta.Samarium-153 and lutetium-177 were produced in a research reactor at 30 University of Missouri (Columbia, MO). Yttrium-90 * ·; purchased from Oak Ridge National Laboratories.

1- (4 -isotiosyanaattobentsyyli)dietyleenitriamii-nipentaetikkahappo (SCN-Bz-DTPA) valmistettiin muunnelmalla menetelmästä, jonka ovat esittäneet M. W. Brechbiel 35 et ai., Inorg. Chem. 25 (1986) 2772 - 2781, ja 38 1 0 4 8 9 8 puhdistettiin yhden ainoan lajin saamiseksi anioninvaihto-HPLC:llä (Q-Sepharose™). Jotkut käytetyistä kemikaaleista hankittiin alla mainituista lähteistä: N-2-hydroksietyyli-piperatsiini-N'-2-etaanisulfonihappo (HEPES), vapaa happo 5 ja natriumsuola, ostettiin Behring Diagnosticsilta (La1- (4-Isothiocyanate-benzyl) -diethylenetriaminipenta-acetic acid (SCN-Bz-DTPA) was prepared by a modification of the method of M. W. Brechbiel 35 et al., Inorg. Chem. 25, 2772-2781 (1986), and 381040889 were purified to obtain a single species by anion exchange HPLC (Q-Sepharose ™). Some of the chemicals used were obtained from the following sources: N-2-hydroxyethyl-piperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES), free acid 5, and sodium salt, purchased from Behring Diagnostics (La.

Jolla, CA) ; natriumsitraatti (takuulaatu) oli peräisin Fisher Scientificilta; tiofosgeeni oli peräisin Aldrich Chemicalsilta; ammoniumasetaatti, natriumasetaatti, ety-leenidiamiinitetraetikkahappo (EDTA) ja fosfaattipuskuroi-10 tu fysiologinen suolaliuos (PBS) olivat peräisin SigmaJolla, CA); sodium citrate (guaranteed) was from Fisher Scientific; thiophosgene was from Aldrich Chemicals; ammonium acetate, sodium acetate, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), and phosphate buffered saline (PBS) were from Sigma

Diagnosticsilta.Diagnostics.

HPLC-kolonnit, joita käytettiin, olivat seuraavia: Käsin pakattu Q-Sepharose™ (Pharmacia), jonka koko oli joko 1,5 cm x 25 cm tai 2,5 cm x 25 cm; Zorbax™ BIO Series 15 GF-250 (DuPont Instruments; 9,4 mm x 25 cm); Vydac™ pro tein C-4 (Separations Groupin, Hesperia, CA, tavaramerkki; 4,6 mm x 25 cm); sekä Mono-Q™ ja Sp-Sephadex™ (Pharmacia Biotechnology Productsin tavaramerkki). Sep-Pak™ (Waters Associatesin tavaramerkki) C-18 -patruunat ostettiin 20 Waters Associatesilta (Milford, MA) , Sephadex™ G-25 -ker-takäyttökolonnit (2,2 ml) Isolab Inc:Itä (Akron, OH) ja Centricon™-30 (Amicon Divisionin, W. R. Grace & Co., Danvers, MA, tavaramerkki) -pienväkevöintilaitteet Amico-nilta.The HPLC columns used were: Hand-packed Q-Sepharose ™ (Pharmacia), either 1.5 cm x 25 cm or 2.5 cm x 25 cm; Zorbax ™ BIO Series 15 GF-250 (DuPont Instruments; 9.4mm x 25cm); Vydac ™ Protein C-4 (trademark of Separations Group, Hesperia, CA; 4.6mm x 25cm); and Mono-Q ™ and Sp-Sephadex ™ (trademark of Pharmacia Biotechnology Products). Sep-Pak ™ (trademark of Waters Associates) C-18 cartridges were purchased from 20 Waters Associates (Milford, MA), Sephadex ™ G-25 ker recycle columns (2.2 mL) from Isolab Inc. (Akron, OH) and Centricon ™ -30 (trademark of Amicon Division, WR Grace & Co., Danvers, MA) from Amico-n.

; 25 Analyyseissä ja näyte-erotuksissa käytettiin viittä HPLC-systeemiä:; Five HPLC systems were used for analysis and sample separation:

Systeemi I koostui LKB 2150 -pumpusta ja 4152 -säätölaitteesta, UV-detektorista (LKB 2238 UV Cord) Berthold LB 506 A HPLC -radioaktiivisuusseurantalaitteesta 30 (International Berthold Group) ja Gilson 201-202 -frakti-*·; onkeräyslaitteesta (Gilson International, Middleton, WI) .System I consisted of an LKB 2150 pump and 4152 control unit, a UV detector (LKB 2238 UV Cord), a Berthold LB 506 A HPLC radioactivity monitor 30 (International Berthold Group) and a Gilson 201-202 fraction *; from a catcher (Gilson International, Middleton, WI).

Systeemi II varustettiin automaattisella näytteen-ottolaitteella (WISP 710 B) , kahdella pumpulla (malli 510) ja automaattisella gradientinsäätölaitteella (Waters Asso-35 ciates), Perkin-Elmer LC-75 -spektrofotomeridetektorilla, 39 104898System II was equipped with an automatic sampler (WISP 710 B), two pumps (model 510) and an automatic gradient control (Waters Asso-35 ciates), a Perkin-Elmer LC-75 spectrophotometer detector, 39 104898

Beckman Model 170 -radioisotooppidetektorilla ja fraktion-keräyslaitteella (Pharmacian Frac-100).Beckman Model 170 radioisotope detector and fraction collector (Pharmacian Frac-100).

Systeemi III koostui kahdesta Waters M-6000A -pumpusta ja Waters 660 -liuotinohjelmointilaiteesta, Waters 5 Model 481 -detektorista, jossa aallonpituus on vaihdeltavissa, ja Waters Data Module -yksiköstä; preparatiivisesti käytettiin myös ISCO-fraktiokeräyslaitetta.System III consisted of two Waters M-6000A pumps and a Waters 660 solvent programming device, a Waters 5 Model 481 variable wavelength detector, and a Waters Data Module; a ISCO fraction collector was also used preparatively.

Systeemi IV oli Dionex BioLC™ -systeemi, joka oli varustettu UV-detektorilla, jossa aallonpituus oli vaih-10 deltavissa.System IV was a Dionex BioLC ™ system equipped with a UV detector with a wavelength range of 10 delta.

Systeemi V oli Waters Model 590 -pumppu yhdistettynä ISCO Model 2360 -gradientinohjelmointilaitteeseen ja Dionex-detektoriin, jossa aallonpituus on vaihdeltavissa.System V was a Waters Model 590 pump combined with an ISCO Model 2360 gradient programming device and a Dionex detector with variable wavelength.

Sentrifugointiin ja väkevöitiin käytettiin Sorvali 15 RT 6000B -laitetta (DuPontin jäähdytettävää sentrifugia). Haihtuvien liuottimien poistamiseen käytettiinm Speed Vac -haihdutinta (Savant Instruments Inc., Hicksville, N.Y.). Radioaktiivisuusmittaukset tehtiin Capintec™ Radioisotope Calibrator (Capintec Inc:n tavaramerkki) CRC-12 -laitteel-20 la, Beckman LS 9800 -nestetuikelaskurilla (beckman Instru ments, Inc., Irvine, CA) tai Canberra 35* -monikanava-ana-lysaattorilla, jossa jakopintana oli talliumissa uiva 7,6 cm natriumjodidikolokide.A Sorvali 15 RT 6000B (DuPont cooled centrifuge) was used for centrifugation and concentration. A Speed Vac evaporator (Savant Instruments Inc., Hicksville, N.Y.) was used to remove volatile solvents. Radioactivity measurements were made on a Capintec ™ Radioisotope Calibrator (trademark of Capintec Inc.) on a CRC-12 instrument, a Beckman LS 9800 liquid scintillation counter (Beckman Instruments, Inc., Irvine, CA) or a Canberra 35 * multi-channel analyzer, with a 7.6 cm sodium iodide colocide floating in thallium.

Kompleksin muodostusta koskevissa esimerkeissä ; 25 kompleksinmuodostumisprosentti määritettiin seuraavalla yleisellä vaihtomenetelmällä, silloin kun se on ilmoitettu.In the examples of complex formation; The percent complex formation was determined by the following general exchange method, where indicated.

10 ml:n muovikolonni täytettiin 1 - 2 ml:11a SP-Sephadex™ C-25 -hartsia, joka turvotettiin vedessä. 30 Ylimääräinen vesi poistettiin kolonnin yläpäähän kohdiste-'·; tulla paineella. Hartsin päälle lisättiin tutkittava liuos (15 μΐ), ja sen jälkeen käytettiin eluenttina 2 ml isotonisen suolaliuoksen ja väk. NH4OH:n seosta tilavuussuhteessa 4:1. Eluentti kerättiin laskentaputkiin. Sen jälkeen 35 käytettiin 2 ml lisää eluenttia. Sen jälkeen kun eluentti 40 104898 oli kerätty toiseen laskentaputkeen, hartsin yläosaan puhallettiin paineilmaa sen saamiseksi kuivaksi. Kuivattu hartsi siirrettiin kolmanteen laskentaputkeen. Aktiivisuus kussakin laskentaputkessa mitattiin Canberra-monikanava-5 analysaattoriin kytketyllä Nal-kolokidelaskurilla. Komp leksina esiintyvän metallin määrä on ilmoitettu sinä koko-naisaktiivisuuden osana (prosentteina), joka todettiin eluentista. Vapaassa kompleksoitumattomassa tilassa olevan metallin määrä on ilmoitettu sinä prosenttiosuutena koko-10 naismetallimäärästä, joka jää hartsiin.The 10 mL Plastic column was filled with 1-2 mL of SP-Sephadex ™ C-25 resin, which was swollen in water. Excess water was removed to the top of the column at the target point; come under pressure. The test solution (15 μΐ) was added to the resin, followed by the addition of 2 ml of isotonic saline and conc. NH4OH in a 4: 1 by volume ratio. The eluent was collected in counting tubes. Subsequently, 2 ml of additional eluent were used. After collecting the eluent 40 104898 in a second counting tube, compressed air was blown to the top of the resin to dry it. The dried resin was transferred to a third counting tube. Activity in each counting tube was measured with a Nal colloidal crystal counter connected to a Canberra Multichannel-5 Analyzer. The amount of metal present as a complex is expressed as the percentage (%) of total activity found in the eluent. The amount of metal in the free, uncomplexed state is expressed as the percentage of the total amount of metal that remains in the resin.

Kompleksoitumattoman metallin poisto ioninvaihdolla 10 ml:n muovikolonni täytettiin 0,5 ml :11a SP-Sephadex™ C-25 -hartsia, joka oli turvotettu vedessä. Ylimääräinen vesi poistettiin sentrifugoimalla kolonnia 15 4 minuuttia kierrosnopeudella 3000 min'1. Hartsin päälle laitettiin 200 - 500 μΐ kompleksiliuosta, ja putkea sentrifugoitiin jälleen 4 minuuttia kierrosnopeudella 3000 min"1. Kompleksoitumaton metalli jäi kolonniin ja kompleksoitunut eluoitui liuottimen mukana.Removal of uncomplexed metal by ion exchange A 10 mL plastic column was filled with 0.5 mL of SP-Sephadex ™ C-25 resin swollen in water. Excess water was removed by centrifugation of the column for 15 min at 3000 rpm. 200 to 500 μΐ of complex solution was applied to the resin and the tube was centrifuged again for 3 minutes at 3000 rpm. The uncomplexed metal remained on the column and the complexed eluted with the solvent.

20 Yttriumkompleksin valmistus20 Preparation of the Yttrium Complex

Kompleksit valmistettiin valmistamalla yttriumin 3 x 10'4 M vesiliuos [YC13 *6H20, 303,26 g/mol, tai Y(OAc)3, 12,1 % H20:ta]. Halutun radioaktiivisuustason saavuttamiseksi lisättiin radioaktiivista Y3+-liuosta (Oak Ridge : 25 National Laboratories). 990 ul:aan Y3+-liuosta lisättiin • ’ 10 μΐ ligandiliuosta (0,03 M), jolloin ligandin ja metallin moolisuhteeksi tuli 1:1. Ligandi-metallisuhteen 10:1 muodostamiseen käytettiin 10-kertainen määrä ligandiliuosta. pH säädettiin arvoon 7,4 mikrolitraluokkaa olevilla 30 määrillä HCl:a tai NaOH:a. Liuoksesta tutkittiin sitten *·; kompleksoituneen yttriumin määrä edellä esitettyä katio- « ninvaihtomenetelmää käyttäen.The complexes were prepared by preparing 3 * 10 * 4 M aqueous solution of yttrium [YCl 3 * 6H 2 O, 303.26 g / mol, or Y (OAc) 3, 12.1% H 2 O]. Radioactive Y3 + solution (Oak Ridge: 25 National Laboratories) was added to achieve the desired level of radioactivity. To 990 µL of Y3 + solution was added • '10 μ 10 ligand solution (0.03 M) to give a 1: 1 molar ratio of ligand to metal. A 10-fold amount of ligand solution was used to form a 10: 1 ligand metal ratio. The pH was adjusted to 7.4 microliters with 30 volumes of HCl or NaOH. The solution was then examined * ·; the amount of complexed yttrium using the cationic exchange method described above.

Samariumkompleksin valmistusManufacture of a samarium complex

Samariumkompleksit muodostettiin edellä yttrium-35 komplekseille esitetyllä tavalla, paitsi että 3 x 10~4 MSamarium complexes were formed as described above for the yttrium-35 complexes except that 3 x 10 ~ 4 M

104898 samariumliuos valmistettiin liuottamalla Sm203 (348,7 g/mol) 0,1 M HCl:oon. Radioaktiivinen Sm-153 saatiin Missourin yliopiston (Columbia, Missouri) tutkimus-reaktorista noin 3 x 10'4 M liuoksena 0,1 M HC1: ssa.104898 samarium solution was prepared by dissolving Sm 2 O 3 (348.7 g / mol) in 0.1 M HCl. Radioactive Sm-153 was obtained from a research reactor at the University of Missouri (Columbia, Missouri) in approximately 3 x 10 -4 M solution in 0.1 M HCl.

5 Eräät läpi koko tämän tekstin käytettävät termit määritellään seuraavasti.5 Some terms used throughout this text are defined as follows.

Sanasto: Väk. tarkoittaa väkevää; *OAc tarkoittaa asetaattiryhmää, 'OCOCH3; 10 TLC tarkoittaa ohutkerroskromatografiaa; DI H20 tarkoittaa deionisoitua NANOpure™-vettä; NANOpure™-vesi on puhdasta vettä, jota saadaan Barnstead NANOpure™-vedensuodatus j ärj estelmästä; ympäristön lämpötila tarkoittaa huoneen lämpötilaa 15 eli noin 20 - 25 °C:n lämpötilaa; yön yli tarkoittaa noin 9-18 tuntia; LC tarkoittaa nestekromatografiaa; NBS tarkoittaa N-bromisukkinimidiä; MES tarkoittaa 2-(N-morfolino)etaanisulfonihappoa; 2 0 HPLC tarkoittaa suuren erotuskyvyn nestekromatogra- f iaa; PBS tarkoittaa Sigmalta peräisin olevaa fosfaatti-puskuroitua fysiologista suolaliuosta, joka sisältää 120 mmol NaCl:a/l, 2,7 mmol KCl:a/l ja 10 mmol fosfaatti-; 25 puskuria (pH 7,4)/1.Vocabulary: Pop. means strong; * OAc means an acetate group, 'OCOCH3; TLC refers to thin layer chromatography; DI H20 denotes deionized NANOpure ™ water; NANOpure ™ Water is pure water obtained from the Barnstead NANOpure ™ Water Filtration System; ambient temperature means a room temperature of 15, i.e., about 20-25 ° C; overnight means about 9-18 hours; LC stands for liquid chromatography; NBS means N-bromosuccinimide; MES stands for 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid; 20 HPLC refers to high performance liquid chromatography; PBS means Sigma-derived phosphate-buffered saline containing 120 mmol NaCl / L, 2.7 mmol KCl / L, and 10 mmol phosphate; 25 buffers (pH 7.4) / L.

SP-Sephadex™ C-25 -hartsi on kationinvaihtohartsi, joka sisältää funktionaalisia sulfonihapporyhmiä ja jota myy Pharmacia, Inc.; min'1 = kierroksia minuutissa; 30 pD tarkoittaa pH:ta vedyn ollessa korvattu deute riumilla; DOTA = 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkahappo; HEPES = N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N'-2-etaani-35 sulfonihappo; 42 104898 BFC = bifunktionaalinen kelaatinmuodostaja;SP-Sephadex ™ C-25 Resin is a cation exchange resin containing sulfonic acid functional groups and sold by Pharmacia, Inc .; min'1 = revolutions per minute; 30 pD represents the pH when hydrogen is replaced by deuterium; DOTA = 1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid; HEPES = N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethane-35 sulfonic acid; 42 104898 BFC = bifunctional chelator;

Sykleeni = 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani; PA-DOTA = a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahappo; 5 PA-DOTMA = a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10- tetra-atsasyklododekaani-l-etikka-4,7,10-tris(metyylietik-ka) happo; BA-DOTA = a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahappo; 10 OMe-BA-DOTA = a - ( 5-amino-2-metoksifenyyli) - 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikka-happo; EA-D03A = 1-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10- tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahappo; 15 DTPA = dietyleenitriamiinipentaetikkahappo; SCN-Bz-DTPA = 1-(4-isotiosyanaattobentsyyli)diety-leenitriamiinipentaetikkahappo; EDTA = etyleenidiamiinitetraetikkahappo; kelaatinmuodostaja on ekvivalenttinen ligandin 20 kanssa; kompleksi on ekvivalenttinen kelaatin kanssa, konjugaatti tarkoittaa kovalenttisesti vasta-ainee-seen tai vasta-ainefragmenttiin sitoutunutta kelaatinmuo-dostajaa tai kompleksia; : 25 vasta-aineet tarkoittavat CC-49:ää, CC-83:a ja B72.3:a ja niiden fragmentteja, kuten esimerkiksi Fab:tä ja F(ab')2:ta. Muita mahdollisia vasta-aineita on esitetty edellä. Hybridoomasolulinja B72.3 on talletettu kokoelmaan American Type Culture Collection numerolla ATCC HB 8108, 30 ja muut nimetyt hiiren monoklonaaliset vasta-aineet sitoutuvat TAG-72:n, kasvaimiin yhteydessä olevaan antigeenin, epitooppeihin.Cyclene = 1,4,7,10-tetraazacyclododecane; PA-DOTA = α- [2- (4-Aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid; PA-DOTMA = α- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1-acetic acid-4,7,10-tris (methyl acetic acid); BA-DOTA = α- (4-aminophenyl) -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid; 10 OMe-BA-DOTA = α - (5-amino-2-methoxyphenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid; EA-D03A = 1- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid; DTPA = diethylenetriaminepentaacetic acid; SCN-Bz-DTPA = 1- (4-Isothiocyanate-benzyl) -diethylenetriaminepentaacetic acid; EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid; the chelating agent is equivalent to ligand 20; the complex is equivalent to a chelate, the conjugate being a chelating agent or complex covalently bound to an antibody or antibody fragment; : 25 antibodies refer to CC-49, CC-83 and B72.3 and fragments thereof such as Fab and F (ab ') 2. Other possible antibodies are shown above. The hybridoma cell line B72.3 is deposited in the American Type Culture Collection under the accession number ATCC HB 8108, 30 and other designated murine monoclonal antibodies bind to epitopes of TAG-72, a tumor associated antigen.

Keksintöä valaistaan yksityiskohtaisemmin seuraa-villa esimerkeillä.The invention is illustrated in more detail by the following examples.

35 43 104898 Lähtöaineiden valmistus35 43 104898 Manufacture of starting materials

Esimerkki AExample A

DL-2-bromi-4-(4-nitrofenyyli)butaanihapon metyyli-esterin valmistus 5 Liuokseen, joka sisälsi 5 ml hiilitetrakloridia ja 15 ml (0,2 mol) tionyylikloridia, lisättiin 10,46 g (0,05 mol) 4-(4-nitrofenyyli)butaanihappoa typpikaasukehän alla. Liuosta refluksoitiin 1 tunti, jolloin aluksi vapautui vetykloridikaasua ja rikkidioksidikaasua. Lämpimään 10 liuokseen lisättiin 11,0 g (0,06 mol) N-bromisukkinimidiä 25 ml:ssa hiilitetrakloridia ja katalysaattoriksi kolme pisaraa 48-%:ista vetybromidin vesiliuosta. Bromikaasua havaittiin vapautuvan. Tummanpunaista liuosta refluksoitiin 35 minuuttia. Liuos jäähdytettiin ja kaadettiin 15 100 ml taan metanolia samalla sekoittaen. TLC-analyysi (etyyliasetaatti-heksaaniseos tilavuussuhteessa 60:40) osoitti uuden tuotteen (R£ = 0,69, silikageelilevyt) syntyneen. Ylimääräinen liuotin poistettiin pyöröhaihdutta-malla, ja tummanpunainen öljy suodatettiin flash-kromato-20 grafiasilikageelikerroksen (2,5 cm x 12,7 cm) läpi käyttäen eluenttina metyleenikloridia. Haihdutettaessa liuotin saatiin kirkas öljy (saanto 15,43 g), joka oli otsikon mukaisen yhdisteen ja lähtöaineena käytetyn butaa-nihappojohdannaisen metyyliesterin seos suhteessa 85:15.Preparation of DL-2-Bromo-4- (4-nitrophenyl) butanoic acid methyl ester To a solution of 5 ml of carbon tetrachloride and 15 ml (0.2 mol) of thionyl chloride was added 10.46 g (0.05 mol) of 4 (4-nitrophenyl) butanoic acid under a nitrogen atmosphere. The solution was refluxed for 1 hour, initially releasing hydrogen chloride gas and sulfur dioxide gas. To the warm solution was added 11.0 g (0.06 mol) of N-bromosuccinimide in 25 ml of carbon tetrachloride and three drops of 48% aqueous hydrogen bromide as catalyst. Bromine gas was found to be released. The dark red solution was refluxed for 35 minutes. The solution was cooled and poured into 100 ml of methanol with stirring. TLC analysis (ethyl acetate-hexane 60:40 by volume) showed the formation of a new product (R f = 0.69, silica gel plates). Excess solvent was removed by rotary evaporation and the dark red oil was filtered through a plug of flash chromatography-20 graphite silica gel (2.5 cm x 12.7 cm) using methylene chloride as eluent. Evaporation of the solvent gave a clear oil (yield: 15.43 g) which was a 85:15 mixture of the title compound and methyl ester of the butanoic acid starting material.

.. 25 Otsikon mukaisen tuotteen karakterisoitiin seuraavien tie- tojen perusteella: ^-NMR (CDClj) : 8,16 (d) , 7,38 (d) , 4,20 (dd) , 3,79 (s), 2,88 (m), 2,38 (m): 13C-NMR (CDCIj, 75 MHz): 169,6, 147,5, 129,3, 123,7, 53,0, 30 44,4, 35,5, 33,0... The title product was characterized by the following data: 1 H-NMR (CDCl 3): 8.16 (d), 7.38 (d), 4.20 (dd), 3.79 (s), 2, 88 (m), 2.38 (m): 13 C NMR (CDCl 3, 75 MHz): 169.6, 147.5, 129.3, 123.7, 53.0, 30 44.4, 35.5 , 33.0.

Esimerkki BExample B

• · I• · I

a-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-l-etikkahapon 1-metyyliesterin valmistusPreparation of 1-methyl ester of α- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-1-acetic acid

Liuokseen, joka sisälsi 1,72 g (10,0 mmol) 35 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania 17 ml:ssa penteenillä 44 104898 stabiloitua kloroformia ja jota sekoitettiin, lisättiin 5 minuutin aikana 2,07 g (5,82 mmol) DL-2-bromi-4-(4-nit-rofenyyli) butaanihapon metyyliesteriä typpikaasukehän alla ja samalla sekoittaen. Reaktioseosta sekoitettiin noin 5 25 °C:ssa 48 tuntia. TLC (Analtechin silikageelilevyillä käyttäen liuotinseosta 2) osoitti otsikon mukaisen tuotteen (Rf = 0,73) muodostuneen. Keltainen kloroformiliuos laitettiin kooltaan 2,5 cm x 40 cm olevaan flash-kromato-grafiasilikageelipylvääseen (esieluoitu 5 % metanolia si-10 sältävällä kloroformilla), joka eluoitiin 250 ml :11a kloroformia, joka sisälsi 5 % metanolia ja sen jälkeen liuo-tinseoksella 2. Puhdasta otsikon mukaista tuotetta sisältävät jakeet yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 2,15 g (5,46 mmol, 94 %) otsikon mukaista tuotetta 15 vaaleankeltaisena lasimaisena aineena. Tämän lasimaisen aineen kloroformiliuoksen triturointi dietyylieetterin kanssa johti analyysipuhtaan valkean jauheen (sp = 156 -159 °C) saostumiseen, joka jauhe karakterisoitiin seuraa-vien tietojen perusteella: 20 1H-NMR (CDC13) : 8,14 (d) , 7,39 (d) , 3,71 (s), 3,39 (dd) , 2,5 - 3,0 (m), 2,08 (m), 2,01 (m) ; 13C-NMR (CDC13i 75 MHz): 172,7, 149,3, 146,4, 129,2, 123,6, 62,3, 51,2, 48,9, 47,2, 45,8, 45,4, 32,8,30,9.To a solution of 1.72 g (10.0 mmol) of 35 1,4,7,10-tetraazacyclododecane in 17 mL of pentene 44 104898-stabilized chloroform and stirred was added 2.07 g (5, 82 mmol) of DL-2-bromo-4- (4-nitrophenyl) butanoic acid methyl ester under nitrogen atmosphere with stirring. The reaction mixture was stirred at about 25 ° C for 48 hours. TLC (Analtech on silica gel plates using solvent mixture 2) showed the formation of the title product (Rf = 0.73). The yellow chloroform solution was applied to a 2.5 cm x 40 cm flash column of flash chromatography (silica gel eluted with 5% methanol containing si-10) eluted with 250 ml of 5% methanol in chloroform followed by solvent mixture 2. The fractions containing pure title product were combined and evaporated to give 2.15 g (5.46 mmol, 94%) of the title product as a pale yellow glass. Trituration of the chloroform solution of this vitreous material with diethyl ether resulted in the precipitation of an analytical white powder (m.p. 156-159 ° C) characterized by the following data: 1 H-NMR (CDCl 3): 8.14 (d), 7.39 ( d), 3.71 (s), 3.39 (dd), 2.5-3.0 (m), 2.08 (m), 2.01 (m); 13 C NMR (CDCl 3 75 MHz): 172.7, 149.3, 146.4, 129.2, 123.6, 62.3, 51.2, 48.9, 47.2, 45.8, 45 , 4, 32,8,30,9.

Esimerkki CExample C

25 2-bromi-2-(4-nitrofenyyli)etaanihapon metyylieste- rin valmistusPreparation of 2-Bromo-2- (4-nitrophenyl) -acetic acid methyl ester

Seosta, joka sisälsi p-nitrofenyylietikkahappoa (25,0 g, 0,14 mol) ja tionyylikloridia (15,1 ml, 0,21 mol) kuivassa bentseenissä (100 ml), sekoitettiin ja refluksoi-30 tiin N2-vaipan alla 3 tuntia. Sen jälkeen seos haihdutettiin kuiviin alipaineessa, Jäännös liuotettiin hiilitetra-kloridiin, ja liuosta sekoitettiin ja refluksoitiin typpi-vaipan alla. Palautusjäähdyttimen alla kiehuvaan seokseen lisättiin bromi (7,2 ml, 0,14 mol) pienissä erissä 3 vuo-35 rokauden aikana. Reaktioseoksen annettiin jäähtyä, ja hap- 45 104898 pokloridiin lisättiin hitaasti metanolia (50 ml). Tulokseksi saatu bromiesteri (27 g, 71 %) saatiin talteen keltaisena alennetussa paineessa 6 tuuman lasikierukkakolon-nin läpi tislaamalla (kp = 168 °C 1,1 mm:n paineessa).A mixture of p-nitrophenylacetic acid (25.0 g, 0.14 mol) and thionyl chloride (15.1 ml, 0.21 mol) in dry benzene (100 ml) was stirred and refluxed under N 2 for 3 hours. . The mixture was then evaporated to dryness under reduced pressure, the residue was dissolved in carbon tetrachloride, and the solution was stirred and refluxed under a nitrogen blanket. To the refluxing mixture was added bromine (7.2 mL, 0.14 mol) in small portions over 3 flow-35 rocks. The reaction mixture was allowed to cool, and methanol (50 mL) was slowly added to the oxygen chloride. The resulting bromo ester (27 g, 71%) was recovered as a yellow under reduced pressure through a 6 inch glass helical column by distillation (bp = 168 ° C at 1.1 mm pressure).

5 Otsikon mukaisen tuotteen rakenteen vahvistivat seuraavat spektritiedot: lH-NMR (CDClj) : 8,25 (d) , 7,81 (d) , 5,51 (s), 3,86 (s).The structure of the title product was confirmed by the following spectral data: 1 H NMR (CDCl 3): 8.25 (d), 7.81 (d), 5.51 (s), 3.86 (s).

Esimerkki DExample D

a- (4-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-10 ni-l-etikkahapon 1-metyyliesterin valmistus 529 mg:aan (2,068 mmol) 2-bromi-2-(4-nitrofenyyli)-etaanihapon metyyliesteriä (valmistettu esimerkin C mukaisella menetelmällä), joka oli liuotettu 20 ml:aan aseto-nitriiliä, lisättiin kerralla liuos, joka sisälsi 354 mg 15 (2,068 mmol) 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania 20 ml:ssa asetonitriiliä, joka sisälsi juuri ja juuri riittävästi metanolia täydellisen liukenemisen aikaansaamiseksi. Tulokseksi saatua vaaleanpunaista liuosta sekoitettiin 1,5 tuntia, jonka jälkeen se väkevöitiin alipaineessa 20 35 °C:ssa pieneen tilavuuteen. Tämä epäpuhdas monoesteri- tetra-amiini puhdistettiin silikageelikromatografiällä käyttäen eluent tina 20 % (m/V) NH4OAc:a sisältävää CH3OH:a. Näin triasetaattisuolana eristetty puhdistettu monoesteri-tetra-amiini muunnettiin sitten vapaaksi amiiniksi.Preparation of 1-methyl ester of α- (4-nitrophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-10-yl-1-acetic acid in 529 mg (2.068 mmol) of 2-bromo-2- (4-nitrophenyl) - acetic acid methyl ester (prepared according to the method of Example C) dissolved in 20 ml of acetonitrile was added in one portion a solution of 354 mg of 15 (2.068 mmol) of 1,4,7,10-tetraazacyclododecane in 20 ml of acetonitrile containing just enough methanol to achieve complete dissolution. The resulting pink solution was stirred for 1.5 hours, after which it was concentrated under reduced pressure at 35 ° C to a small volume. This crude monoester tetraamine was purified by silica gel chromatography using 20% (m / v) CH3OH in NH4OAc as the eluent. The purified monoester tetraamine isolated as the triacetate salt was then converted to the free amine.

;· 25 270 mgraan suolaa, joka oli liuotettu 3 mlraan vettä, li sättiin 0 °C:ssa K2C03:n vesiliuosta (10-painoprosenttista) niin, että liuoksen pH:ksi tuli 11. Emäksinen liuos uutettiin sitten 10 ml:lla kloroformia (viidesti), ja klorofor-mikerrokset yhdistettiin, kuivattiin natriumsulfaatilla ja 30 haihdutettiin, jolloin saatiin 160 mg (saanto 42 %) haluttua monoesteritetra-araiinia, joka karakterisoitiin NMR-spektrometrian ja FAB-massaspektrometrian (FAB = nopeilla atomeilla pommitus; [M + H]+ = 366) avulla sekä seuraavien tietojen perusteella: 46 1 0 4 8 9 8 Ή-NMR (CDC13) : 8,12 (d) , 7,44 (d) , 4,75 (s) , 3,76 (s) , 2,67 - 2,44 (m); 13C-NMR (CDCI3) : 171,5, 147,6, 144,0, 130,0, 124,0, 67,0, 49,8, 47,9, 46,9, 46,0.· 270 mg of a salt dissolved in 3 ml of water were added at 0 ° C to an aqueous solution of K2CO3 (10% w / w) to bring the pH of the solution to 11. The basic solution was then extracted with 10 ml of chloroform ( five times), and the chloroform layers were combined, dried over sodium sulfate, and evaporated to give 160 mg (42% yield) of the desired monoester tetra-araine, which was characterized by NMR and FAB mass spectrometry ([M + H]). + = 366) and based on the following data: 46 10808 δ NMR (CDCl3): 8.12 (d), 7.44 (d), 4.75 (s), 3.76 (s) ), 2.67-2.44 (m); 13 C NMR (CDCl 3): 171.5, 147.6, 144.0, 130.0, 124.0, 67.0, 49.8, 47.9, 46.9, 46.0.

5 Esimerkki E5 Example E

N- (2-metoksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaanin valmistusPreparation of N- (2-methoxy-5-nitrobenzyl) -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane

Kloroformiliuokseen (20 ml), joka sisälsi 2,9 g (16,8 mmol) 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania ja jota 10 sekoitettiin, lisättiin yhdessä eräss kloroformiliuos (20 ml), joka sisälsi 2,1 g (8,5 mmol) 2-metoksi-5-nitro-bentsyylibromidia. Sen jälkeen kun reaktioseosta oli sekoitettu huoneen lämpötilassa 3 tuntia, se suodatettiin ja suodos väkevöitiin (alipaineessa) , jolloin saatiin jään-15 nös, joka käsiteltiin kromatografisesti silikageeli, liuo-tinsseos 3). Monoalkyloitu tuote saatiin eristetyksi 79 %:n saannolla (sp = 154 - 156 °C) ja karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (CDCI3) : 162,47, 140,63, 127,92, 125,49, 124,53, 20 109,91, 55,88, 53,25, 50,90, 47,17, 45,45, 45,29.To a solution of chloroform (20 mL) containing 2.9 g (16.8 mmol) of 1,4,7,10-tetraazacyclododecane and stirred was added a solution of chloroform (20 mL) containing 2.1 g ( 8.5 mmol) of 2-methoxy-5-nitro-benzyl bromide. After stirring at room temperature for 3 hours, the reaction mixture was filtered and the filtrate was concentrated (under reduced pressure) to give an ice residue which was chromatographed on silica gel, solvent mixture 3). The monoalkylated product was isolated in 79% yield (mp = 154-156 ° C) and characterized by the following data: 13 C NMR (CDCl 3): 162.47, 140.63, 127.92, 125.49, 124.53 , 20 109.91, 55.88, 53.25, 50.90, 47.17, 45.45, 45.29.

Esimerkki FExample F

N-(2-hydroksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaanin valmistus 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaanin (2,3 g, 14 mmol) .. 25 1,4-dioksaaniliuokseen (20 ml) lisättiin yhdessä erässä ja tasaisesti sekoittaen 2-hydroksi-5-nitrobentsyylibromidin (1,2 g, 7 mmol) dioksaaniliuos (15 ml). Muutaman minuutin kuluttua lisättiin K2C03:a (1 g), ja sekoitusta jatkettiin 1 tunti huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen reaktioseos suo-30 datettiin ja suodos haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin keltaista puolikiinteätä ainetta, joka käsiteltiin kromatografisesti (pylväässä) silkageelillä käyttäen elu-enttina liuotinseosta 5. Haluttu monoalkyloitu tuote eristettiin viimeistä kolmasosasta kirkkaankeltaista eluent-35 tia, joka sisälsi myös reagoimatonta amiinia. Haihdutuksen 104898 jälkeen keltaista öljyä trituroitiin CHCl3:n (100 ml) kanssa, ja seos suodatettiin CHCl3-liukoisen amiinilähtöaineen poistamiseksi. Lopputuote eristettiin sitten puhtaana keltaisen kiinteän aineen muodossa (1,2 g, 55 %; sp = 142 -5 145 °C) ja karakterisoitiin tarkemmin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (D20) : 25,04. 25,28, 26,83, 31,80, 36,54, 101,88, 107,22, 110,92, 111,80, 115,26, 159,99.Preparation of N- (2-hydroxy-5-nitrobenzyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane 1,4,7,10-tetraazacyclododecane (2.3 g, 14 mmol). To a dioxane solution (20 ml) was added in one portion and under stirring a solution of 2-hydroxy-5-nitrobenzyl bromide (1.2 g, 7 mmol) in dioxane (15 ml). After a few minutes, K 2 CO 3 (1 g) was added and stirring was continued for 1 hour at room temperature. The reaction mixture was then filtered and the filtrate evaporated under reduced pressure to give a yellow semi-solid which was chromatographed (column) on silica gel using solvent mixture 5 as eluent. The desired monoalkylated product was isolated from the last third of a bright yellow eluent also. After evaporation, 104898, the yellow oil was triturated with CHCl3 (100 mL) and the mixture was filtered to remove the CHCl3-soluble amine starting material. The final product was then isolated in pure form as a yellow solid (1.2 g, 55%; mp = 142-515 ° C) and further characterized by 13 C NMR (D 2 O): 25.04. 25.28, 26.83, 31.80, 36.54, 101.88, 107.22, 110.92, 111.80, 115.26, 159.99.

Esimerkki 6 10 1-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaanin valmistusExample 6 Preparation of 1- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane

Liuokseen, joka sisälsi 3,50 g (20,3 mmol) 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania 50 ml:ssa penteenillä stabiloitua kloroformia ja jota sekoitettiin, lisättiin 15 pisaroittain 5 minuutin aikana 4,00 g (17,4 mmol) l-(2-bromietyyli)-4-nitrobentseeniä typpikaasukehän alla ja samalla voimakkaasti sekoittaen.To a solution of 3.50 g (20.3 mmol) of 1,4,7,10-tetraazacyclododecane in 50 ml of pentene-stabilized chloroform was stirred, 4.00 g (17.4 g) was added dropwise over 5 minutes. mmol) 1- (2-bromoethyl) -4-nitrobenzene under a nitrogen atmosphere while stirring vigorously.

Sekoitusta jatkettiin noin 18 tuntia huoneen lämpötilassa (noin 25 °C:ssa), jolloin liuoksesta saostui amii-20 nihydrobromidikiteitä. Koko reaktioseo siirrettiin flash-kromatografiapylvääseen (2,5 cm x 46 cm) , joka oli esielu-oitu 5 % metanolia sisältävällä kloroformilla; 200 ml tätä liuosta käytettiin eluenttina ja eluointia jatkettiin sen jälkeen liuotinseoksella 3. Halutusta tuotteesta erotet-:· 25 tiin 1,45 g (9,7 mmol) p-nitrostyreeniä (Rf = 0,98, liuo- tinseos 1) . Haluttu monofunktionaalinen otsikon mukainen yhdiste saatiin eristetyksi keltaisena öljynä (2,27 g, 7,06 mmol, 40,6 %), joka jähmettyi seisoessaan (Rf = 0,73, liuotinseos 1).Stirring was continued for about 18 hours at room temperature (about 25 ° C), whereupon amine-20 hydrobromide crystals precipitated out of solution. The entire reaction mixture was loaded onto a flash chromatography column (2.5 cm x 46 cm) eluted with 5% methanol in chloroform; 200 ml of this solution was used as eluent and then elution was continued with solvent mixture 3. 1.45 g (9.7 mmol) of p-nitrostyrene (Rf = 0.98, solvent mixture 1) were separated from the desired product. The desired monofunctional title compound was isolated as a yellow oil (2.27 g, 7.06 mmol, 40.6%) which solidified on standing (Rf = 0.73, solvent mixture 1).

30 Otsikon mukaisesta yhdisteestä otettu näyte kitey tettiin uudelleen CHCl3-sykloheksaaniseoksesta, ja sen ka-rakterisistiset tiedot olivat seuraavat: sp = 146,5 - 148,5 °C; "H-NMR (CDC13) : 8,135 (d, m), 7,395 (d, m), 2,91 (t) , 2,77 35 (t), 2,72 (t), 2,50 (t), 2,60 (s); 48 1 0 4 8 9 8 13C-NMR (CDC13; 75 MHz) : 148,5, 146,7, 129,6, 123,4, 55,5, 51,4, 46,9, 45,9, 45,1, 33,7.A sample of the title compound was recrystallized from CHCl3-cyclohexane and had the following characteristic characteristics: mp = 146.5-148.5 ° C; 1 H-NMR (CDCl 3): 8.135 (d, m), 7.395 (d, m), 2.91 (t), 2.77 35 (t), 2.72 (t), 2.50 (t) , 2.60 (s); 48 1 0 4 8 9 8 13 C NMR (CDCl 3; 75 MHz): 148.5, 146.7, 129.6, 123.4, 55.5, 51.4, 46 , 9, 45.9, 45.1, 33.7.

Esimerkki HExample H

1-(4-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklodode-5 kaanin valmistus 50 ml:aan kloroformia lisättiin lisättiin 3,5 g (20,3 mmol) 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania ja 1,7 g (7,87 mmol) p-nitrobentsyylibromidia, ja seosta sekoitettiin typen alla 25 °C:ssa 24 tuntia. Hydrobromidisuolan 10 kloroformiliete siirrettiin sitten flash-silikageelikroma- tografiapylvääseen (liuotinseos 3) , jonka koko oli 2,5 cm x 43 cm. Saatiin 2,13 g (6,93 mmol) otsikon mukaista tuotetta analyysipuhtaana, vaaleankeltaisena, kiinteänä aineena 88 %:n saannolla (Rf = 0,58, liuotinseos 3), sp = 15 128 - 129 °C, joka aine karakterisoitiin tarkemmin seuraa- vien tietojen perusteella: ^-NMR (CDClj) : 8,19 (d) , 7,49 (d) , 3,69 (s), 2,82 (t) , 2,70 (t), 2,59 (m); 13C-NMR (CDC13, 75 MHz): 147,2, 128,4, 123,8, 58,8, 51,7, 20 47,1, 46,3, 45,1.Preparation of 1- (4-nitrobenzyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododode-5 cane To 50 ml of chloroform was added 3.5 g (20.3 mmol) of 1,4,7,10-tetra- azacyclododecane and 1.7 g (7.87 mmol) of p-nitrobenzyl bromide and the mixture was stirred under nitrogen at 25 ° C for 24 hours. The chloroform slurry of the hydrobromide salt 10 was then loaded onto a flash silica gel chromatography column (solvent mixture 3) of 2.5 cm x 43 cm size. 2.13 g (6.93 mmol) of the title product are obtained in the form of an analytical, light yellow solid in 88% yield (Rf = 0.58, solvent mixture 3), m.p. 15 128-129 ° C. - based on 1 H NMR (CDCl 3): 8.19 (d), 7.49 (d), 3.69 (s), 2.82 (t), 2.70 (t), 2.59 (m); 13 C NMR (CDCl 3, 75 MHz): 147.2, 128.4, 123.8, 58.8, 51.7, 20, 47.1, 46.3, 45.1.

(Esimerkkiä I ei ole lainkaan, jotta vältetään sekaantuminen myöhempien biologisten esimerkkien numeroinnin kanssa .)(Example I is not at all to avoid confusion with subsequent biological example numbering.)

Esimerkki JExample J

.. 25 1-(4-aminobentsyyli)1,4,7,10-tetra-atsasyklodode- kaanin valmistus 10 ml:aan metanolia liuotettiin 690 mg (2,25 mmol) 1-(4-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania (valmistettu esimerkin H mukaisella menetelmällä). Liuok-30 seen lisättiin 350 mg katalysaattoria, joka sisälsi 10 % palladiumia hiilikantoaineella. Liuoksen läpi johdettiin ylimäärin vetyä 25 °C:n lämpötilassa. TLC osoitti 45 minuutin kuluttua otsikon mukaisen tuotteen syntyneen (Rf = 0,33, liuotinseos 3). Muodostunut otsikon mukainen tuote 35 puhdistettiin kromatografisesti flash-silikageelipylväässä 49 104898 (liuotinseos 3), jonka koko oli 2,5 cm x 41 cm, ja saatiin 480 mg (77 %) otsikon mukaista tuotetta vaaleankeltaisena kirkkaana öljynä.Preparation of 1- (4-aminobenzyl) 1,4,7,10-tetraazacyclododecane In 10 ml of methanol was dissolved 690 mg (2.25 mmol) of 1- (4-nitrobenzyl) -1,4, 7,10-Tetrazazacyclododecane (prepared by the method of Example H). 350 mg of catalyst containing 10% palladium on carbon were added to solution 30. Excess hydrogen was bubbled through the solution at 25 ° C. After 45 minutes, TLC showed the title product to be formed (Rf = 0.33, solvent mixture 3). The resulting title product 35 was purified by flash column chromatography on silica gel 49 104898 (solvent mixture 3), 2.5 cm x 41 cm, to give 480 mg (77%) of the title product as a pale yellow clear oil.

Vapaan emäksen muodossa oleva otsikon mukainen tuo-5 te (103 mg, 0,37 mmol) muunnettiin hydrokloridisuolaksi puhaltamalla vapaan emäksen etanoliliuosten läpi vedetöntä vetykloridia. Syntyneen otsikon mukaisen yhdisteen tetra-hydrokloridisuolan saanto oli kylmällä etanolilla pesun ja alipainekuivauksen jälkeen 147 mg (0,347 mmol), sp = 255 -10 260 °C (hajoaa), ja se karakterisoitiin tarkemmin seuraa- vien tietojen perusteella: XH-NMR (D20, pD = 1,9): 7,56 (d) , 7,47 (d) , 3,95 (s), 3,28 (t), 3,23 (t), 3,09 (t), 2,96 (t); 13C-NMR (D20, pD = 1,9, 75 MHz): 138,3, 134,2, 132,2, 126,0, 15 58,5, 50,3, 46,7, 44,6, 44,3.The title product in the form of the free base (103 mg, 0.37 mmol) was converted to the hydrochloride salt by blowing anhydrous hydrogen chloride through ethanol solutions of the free base. The yield of the resulting title compound, tetrahydrochloride salt, after washing with cold ethanol and vacuum drying, was 147 mg (0.347 mmol), m.p. 255-1060 ° C (dec.), And was further characterized by the following data: 1 H-NMR (D pD = 1.9): 7.56 (d), 7.47 (d), 3.95 (s), 3.28 (t), 3.23 (t), 3.09 (t), 2 , 96 (t); 13 C NMR (D 2 O, pD = 1.9, 75 MHz): 138.3, 134.2, 132.2, 126.0, 58.5, 50.3, 46.7, 44.6, 44 , 3.

Esimerkki KExample K

2-metoksi- 5-nitrobentsyylinitriilin valmistus Liuokseen, joka sisälsi natriumsyanidia (6 g, 121,9 mmol) vedessä (5,3 ml) jajonka lämpötila oli 70 °C, 20 lisättiin pienissä erissä ja samalla sekoittaen kuuma liuos, joka sisälsi 2-metoksi-5-nitrobentsyylibromidia (25 g, 101,6 mmol) etanolissa (15 ml). Reaktioseosta refluksoi-tiin sitten 1,5 tuntia, ja se jäähdytettiin ja suodatettiin. Suodatuskakku pestiin asetonitriilillä ja suodos ;· 25 haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin 2-metoksi-5- nitrobentsyylinitriiliä (19,5 g, 100 %) kellertävänruskeana kiinteänä aineena. Tuote karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (CDC13) : 161,4, 141,0, 125,7, 124,6, 119,8, 116,5, 30 110,2, 56,3, 18,8.Preparation of 2-methoxy-5-nitrobenzyl nitrile To a solution of sodium cyanide (6 g, 121.9 mmol) in water (5.3 mL) at 70 ° C was added in small portions while stirring, a hot solution containing 2 methoxy-5-nitrobenzyl bromide (25 g, 101.6 mmol) in ethanol (15 mL). The reaction mixture was then refluxed for 1.5 hours and cooled and filtered. The filter cake was washed with acetonitrile and the filtrate was evaporated under reduced pressure to give 2-methoxy-5-nitrobenzyl nitrile (19.5 g, 100%) as a tan solid. The product was characterized by the following data: 13 C NMR (CDCl 3): 161.4, 141.0, 125.7, 124.6, 119.8, 116.5, 30 110.2, 56.3, 18.8.

Esimerkki LExample L

• « 2-metoksi-5-nitrofenyylietikkahapon valmistus Lietettä, joka sisälsi 2-metoksi-5-nitrobentsyyli-nitriiliä (19,5 g) (valmistettu esimerkin K mukaisella 35 menettelytavalla) väk. HCl:ssa (20 ml) refluksoitiin 3 104898 tuntia. Jäähdytyksen jälkeen raakatuote saatiin talteen suodattamalla ja pestiin vedellä. Kiinteä aine sekoitettiin natriumhydroksidin kuumaan vesiliuokseen ja seos suodatettiin kuumana. Oranssi liuos jäähdytettiin ja tehtiin 5 happamaksi HClrlla. Sakka suodatettiin erilleen, pestiin vedellä ja kuivattiin, jolloin saatiin 2-metoksi-5-nitro-fenyylietikkahappoa valkeana kiinteänä aineena (15 g, 70 %) . Tuote karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella : 10 13C-NMR (CDCI3-CD3OD) : 172,8, 162,5, 140,7, 126,2, 124,7, 124,1, 109,7, 55,8, 35,0.Preparation of 2-methoxy-5-nitrophenylacetic acid A slurry containing 2-methoxy-5-nitrobenzyl nitrile (19.5 g) (prepared according to the procedure of Example K) was concentrated. HCl (20 mL) was refluxed for 3 104898 hours. After cooling, the crude product was recovered by filtration and washed with water. The solid was mixed with hot aqueous sodium hydroxide and the mixture filtered while hot. The orange solution was cooled and acidified with HCl. The precipitate was filtered off, washed with water and dried to give 2-methoxy-5-nitro-phenylacetic acid as a white solid (15 g, 70%). The product was characterized by the following data: ¹³C NMR (CDCl3-CD3OD): 172.8, 162.5, 140.7, 126.2, 124.7, 124.1, 109.7, 55.8, 35, 0.

Esimerkki HExample H

α-bromi- (2-metoksi-5-nitrofenyyli)etikkahapon me-tyyliesterin valmistus 15 Lietteeseen, joka sisälsi 2-metoksi-5-nitrofenyyli- etikkahappoa (2,266 g, 10,74 mmol) (valmistettu esimerkin L mukaisella menettelytavalla) kuivassa bentseenissä (50 ml), lisättiin tionyylikloridia (4,0 ml, 54,8 mmol). Pulloon asetettiin kuivausputki ja jäähdytin, ja seosta 20 refluksoitiin 2 tuntia. Tulokseksi saatu keltainen liuos väkevöitiin alipaineessa pieneen tilavuuteen ja sekoitettiin kuivaan hiilitetrakloridiin. Lisättiin bromia (0,6 ml, 11,6 mmol), ja liuosta refluksoitiin 2 vuorokautta ilmakehän kosteudelta suojattuna. Reaktioseos väkevöi-.. 25 tiin pieneen tilavuuteen, ja siihen lisättiin metanolia (50 ml). Sen jälkeen kun ylimääräinen metanoli oli haihdutettu alipaineessa, tulokseksi saatu öljy puhdistettiin kromatografisesti (silikageeli, metyleenikloridi-heksaani-seos suhteessa 4:1). Otsikon mukainen tuote (2,399 g, 30 74 %) saatiin keltaisena öljynä. Tuote karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 1H-NMR (CDC13) : 8,45 (dd) , 8,15 (dd) , 6,95 (d) , 5,75 (s), 3,99 (s), 3,78 (s).Preparation of α-Bromo (2-methoxy-5-nitrophenyl) acetic acid methyl ester In a slurry of 2-methoxy-5-nitrophenylacetic acid (2.266 g, 10.74 mmol) (prepared according to the procedure of Example L) in dry benzene (50 mL), thionyl chloride (4.0 mL, 54.8 mmol) was added. A drying tube and condenser were placed in the flask and the mixture was refluxed for 2 hours. The resulting yellow solution was concentrated under reduced pressure to a small volume and mixed with dry carbon tetrachloride. Bromine (0.6 mL, 11.6 mmol) was added and the solution refluxed for 2 days, protected from atmospheric moisture. The reaction mixture was concentrated to a small volume and methanol (50 mL) was added. After evaporation of excess methanol under reduced pressure, the resulting oil was purified by chromatography (silica gel, 4: 1 methylene chloride-hexane). The title product (2.399 g, 30 74%) was obtained as a yellow oil. The product was characterized by the following data: 1 H NMR (CDCl 3): 8.45 (dd), 8.15 (dd), 6.95 (d), 5.75 (s), 3.99 (s), 3, 78 (s).

104898104898

Esimerkki NExample N

a-(2-metoksi-5-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-l-etikkahapon metyyliesterin valmistusPreparation of α- (2-methoxy-5-nitrophenyl) -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-1-acetic acid methyl ester

Liuokseen, joka sisälsi 1,4,7,10-tetra-atsasyklodo-5 dekaania (2,72 g, 15,79 mmol) kloroformissa (50 ml) ja jota sekoitettiin, lisättiin liuos, joka sisälsi o-bromi-(2-metoksi-5-nitrofenyyli)etikkahappoa (2,399 g, 7,89 mmol) (valmistettu esimerkin M mukaisella menettelytavalla) kloroformissa (10 ml). Seosta sekoitettiin huo-10 neen lämpötilassa 2 tuntia. Samea seos väkevöitiin sitten pieneen tilavuuteen alipaineessa ja huoneen lämpötilassa. =aakatuote puhdistettiin kromatografisesti (silikageeli, liuotinseos 3) . Otsikon mukainen yhdiste saatiin talteen keltaisena kiinteänä aineena (2,60 g, 83 %) ja karakteri-15 soitiin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (CDCIj) : 170,7, 161,6, 139,9, 125,0, 124,5, 124,2, 110,2, 59,5, 55,5, 50,5, 48,0, 47,3, 45,6, 44,3, 43,5.To a solution of 1,4,7,10-tetraazacyclo-5-decane (2.72 g, 15.79 mmol) in chloroform (50 mL), which was stirred, was added a solution of o-bromo (2- methoxy-5-nitrophenyl) acetic acid (2.399 g, 7.89 mmol) (prepared by the procedure of Example M) in chloroform (10 mL). The mixture was stirred at room temperature for 2 hours. The cloudy mixture was then concentrated to a small volume under reduced pressure and at room temperature. = the crude product was purified by chromatography (silica gel, solvent mixture 3). The title compound was recovered as a yellow solid (2.60 g, 83%) and characterized by 13 C NMR (CDCl 3): 170.7, 161.6, 139.9, 125.0, 124 , 5, 124.2, 110.2, 59.5, 55.5, 50.5, 48.0, 47.3, 45.6, 44.3, 43.5.

Esimerkki 0 DL-2-bromi-4-(4-nitrofenyyli)butaanihapon isopro-20 pyyliesterin valmistusExample 0 Preparation of isopropyl 20-ester of DL-2-bromo-4- (4-nitrophenyl) butanoic acid

Liuokseen, joka sisälsi hiilitetrakloridia (10 ml) ja tionyylikloridia (30 ml, 0,4 mol), lisättiin typpikaa-sukehän alla 4-(4-nitrofenyyli)butaanihappoa (21,0 g, 0,10 mol) Harppin et ai. [J. Org. Chem. 40 (1975) 3420 -;· 25 27] menettelytapaa käyttäen. Liuosta refluksoitiin l tun- ti, jolloin aluksi vapautui nopeasti vetykloridia ja rikkidioksidia. Tässä vaiheessa lämpimään liuokseen lisättiin N-bromisukkinimidiä (22,0 g, 0,12 mol) hiilitetrakloridiin (50 ml) liuotettuna ja katalysaattoriksi 8 pisaraa 30 48-%:ista vetybromidin vesiliuosta, jolloin havaittiin vapautuvan bromia. Tummanpunaista liuosta refluksoitiin 35 minuuttia lisää. Liuos jäähdytettiin ja kaadettiin iso-propanoliin(400 ml) samalla sekoittaen. TLC-analyysi (me-tyleenikloridi, silikageelilevyt) paljasti uuden tuotteen 35 (Rf = 0,73). Ylimääräinen liuotin poistettiin, ja tummanpu- 52 104898 nainen öljy suodatettiin flash-kromatografiasilikageeli-kerroksen läpi (7,6 cm x 15 cm) käyttäen eluenttina mety-leenikloridia. Liuotin poistettiin alipaineessa, ja vaaleankeltainen öljy siirrettiin flash-kromatografiapylvääseen 5 (7,6 cm x 46 cm) ja elueoitiin metyleenikloridilla, jol loin saatiin 25,0 g (0,076 mol) otsikon mukaista bromies-terituotetta 75 %:n saannolla kirkkaana öljynä isopropano-lilla solvatoituneena, joka tuote sisälsi alle 5 % bromau-tumatonta esteriä ja joka karakterisoitiin seuraavien tie-10 tojen perusteella: 1H-NMR (CDC13) : 8,16 (d, 2 H), 7,38 (d, 2 H), 5,05 (sept., 1 H), 4,14 (dd, 1 H), 2,88 (m, 4 H), 2,39 (m, 4 H), 1,29 (d, 6 H) ; 13C-NMR (CDCI3) : 168,7, 147,7, 129,3, 123,8, 69,9, 45,1, 15 35,6, 33,0, 21,5, 21,2.To a solution of carbon tetrachloride (10 mL) and thionyl chloride (30 mL, 0.4 mol) was added 4- (4-nitrophenyl) butanoic acid (21.0 g, 0.10 mol) under H 2 O, under a nitrogen atmosphere. [J. Org. Chem. 40, 3420-7 (1975); 25 27]. The solution was refluxed for 1 hour at which time hydrogen chloride and sulfur dioxide were rapidly released. At this point, N-bromosuccinimide (22.0 g, 0.12 mol) dissolved in carbon tetrachloride (50 mL) was added to the warm solution and 8 drops of a 48% aqueous hydrogen bromide solution were observed to release bromine. The dark red solution was refluxed for an additional 35 minutes. The solution was cooled and poured into iso-propanol (400 mL) with stirring. TLC analysis (methylene chloride, silica gel plates) revealed a new product 35 (Rf = 0.73). Excess solvent was removed and the dark brown oil was filtered through a pad of flash chromatography silica gel (7.6 cm x 15 cm) using methylene chloride as eluent. The solvent was removed under reduced pressure and the light yellow oil was transferred to a flash chromatography column 5 (7.6 cm x 46 cm) and eluted with methylene chloride to give 25.0 g (0.076 mol) of the title bromoester product in 75% yield as a clear oil in isopropanol. solvated with a product containing less than 5% non-brominated ester and characterized by: 1 H-NMR (CDCl 3): 8.16 (d, 2H), 7.38 (d, 2H), 5.05 (Sept, 1H), 4.14 (dd, 1H), 2.88 (m, 4H), 2.39 (m, 4H), 1.29 (d, 6H) ; 13 C NMR (CDCl 3): 168.7, 147.7, 129.3, 123.8, 69.9, 45.1, 15 35.6, 33.0, 21.5, 21.2.

Esimerkki PExample P

a - [3- (4-nitrofenyyli)propyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-l-etikkahapon 1-metyyliesterin valmistusPreparation of 1 - methyl ester of α - [3- (4-nitrophenyl) propyl] -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-1-acetic acid

Liuokseen, joka sisälsi 3,137 g (18,2 mmol) 20 sykleenistä vapaata emästä 30 mlrssa penteenillä stabiloi tua kloroformia ja jota sekoitettiin, lisättiin 5 minuutin aikana 4,81 g (14,6 mmol) DL-2-bromi-4-(4-nitrofenyyli)bu-taanihapon isopropyyliesteriä typpikaasukehän alla ja samalla sekoittaen. Reaktioliuosta sekoitettiin 24 tuntia ;· 25 huoneen lämpötilassa. TLC-analyysi (liuotinseos 2) paljas- ti muuttumisen otsikon mukaiseksi monoalkyloitumistuot-teeksi (Rf = 0,78, detektointi ninhydriinin, jodin ja UV-valon avulla). Keltainen kloroformiliuos siirrettiin kooltaan 2,5 cm x 43 cm olevaan flash-kromatografiasilikagee-30 lipylvääseen, joka oli esieluoitu 5 % metanolia sisältävällä kloroformilla. Eluointi 300 ml :11a tätä liuotinseos-ta ja sen jälkeen liuotinseoksella 2 antoi tuotteeksi puhdasta otsikon mukaista yhdistettä sisältäviä jakeita, jotka yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 4,85 g 35 (5,46 mmol) vapaan emäksen muodossa olevaa otsikon mukais- 53 104898 ta tuotetta vaaleana öljynä (saanto 79 %), joka karakterisoitiin tarkemmin seuraavien tietojen perusteella: 1H-NMR (CDClj) : 8,15 (d, 2 H), 7,40 (d, 2 H), 5,07 (p, 1 H), 3,35 (dd, 1 H), 2,65 - 3,0 (m, 13 H), 2,5 - 2,64 (m, 5 4 H) , 2,14 (m, 1 H), 2,00 (m, 1 H), 1,28 (dd, 6 H) ; 13C-NMR (CDC13) : 171,6, 149,5, 146,5, 129,2, 123,6, 68,1, 62,7, 49,2, 47,5, 45,9, 45,7, 32,9, 31,0, 22,1, 22,0; IR (CDC13, cm'1) : 3231 (N-H) , 2978, 2933, 1721 (esterikar-bonyyli), 1601, 1512, 1458, 1345, 1107; 10 FAB-massaspektri (m/e): 422 ([M + H]*), 408, 392.To a solution of 3.137 g (18.2 mmol) of 20 cyclenic free base in 30 ml of pentene-stabilized chloroform was stirred, 4.81 g (14.6 mmol) of DL-2-bromo-4- (4 -nitrophenyl) butanoic acid isopropyl ester under a nitrogen atmosphere while stirring. The reaction solution was stirred for 24 hours; · 25 at room temperature. TLC analysis (solvent mixture 2) revealed conversion to the title monoalkylation product (Rf = 0.78, detection by ninhydrin, iodine and UV light). The yellow chloroform solution was transferred to a 2.5 cm x 43 cm flash column of silica gel 30 pre-eluted with 5% methanol in chloroform. Elution with 300 ml of this solvent mixture followed by solvent mixture 2 gave fractions containing pure title compound which were combined and evaporated to give 4.85 g of 35 (5.46 mmol) of the title compound as a free base. of the product as a light oil (79% yield), which was further characterized by 1 H NMR (CDCl 3): 8.15 (d, 2H), 7.40 (d, 2H), 5.07 (p, 1H), 3.35 (dd, 1H), 2.65-3.0 (m, 13H), 2.5-2.64 (m, 5H), 2.14 (m, 1 H), 2.00 (m, 1H), 1.28 (dd, 6H); 13 C NMR (CDCl 3): 171.6, 149.5, 146.5, 129.2, 123.6, 68.1, 62.7, 49.2, 47.5, 45.9, 45.7 , 32.9, 31.0, 22.1, 22.0; IR (CDCl 3, cm -1): 3231 (N-H), 2978, 2933, 1721 (ester carbonyl), 1601, 1512, 1458, 1345, 1107; FAB mass spectrum (m / e): 422 ([M + H] +), 408, 392.

Kaavan IA mukaisten yhdisteiden valmistusPreparation of Compounds of Formula IA

Esimerkki 1 a- (4-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon monometyylitrietyyliesterin 15 valmistus 46 ml:aan asetonitriiliä, joka sisälsi 4,6 g (33,3 mmol) vastajauhettua vedetöntä kaliumkarbonaat tia, liuotettiin 700 mg (1,91 mmol) a-(4-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l-etikkahapon 1-metyyli-20 esteriä (valmistettu esimerkin D mukaisella menettelytavalla) . Tähän suspensioon lisättiin kerralla 1,022 g (6,12 mmol) etyylibromiasetaattia. Sen jälkeen kun suspensiota oli sekoitettu huoneen lämpötilassa 4 tuntia, se suodatettiin alipaineessa, suodatuskakku pestiin 15 ml :11a .. 25 asetonitriiliä (kahdesti) ja suodos haihdutettiin alipai neessa 38 °C:ssa, jolloin saatiin puhdistamatonta otsikon mukaista tetraesteriä purppuranpunaisena kiinteänä aineena. Tetraesteri puhdistettiin sitten silikageelikromato-grafian avulla käyttäen eluenttina 5 % C2H5OH:a sisältävää 30 CHCl3:a ja sen jälkeen liuotinseosta 3, jolloin saatiin 620 mg (0,988 mmol, 52 %) haluttua tuotetta. Tämä tuote •« karakterisoitiin FAB-massaspektrometrian avulla ( [M + H]+ = 624) ja lisäksi seuraavien tietojen perusteella: 1H-NMR (CDC13) : 8,24 (d) , 7,45 (d) , 4,94 (s), 4,35 - 4,10 35 (m), 3,79 (s), 3,75 - 1,84 (m), 1,34 - 1,22 (m); 54 104898 13C-NMR (CDC13) : 174,3, 173,8, 173,6, 171,5, 147,6, 138,9, 131,5, 123,4, 64,8, 61,5, 61,4, 60,2, 55,4, 55,0, 53,1, 52,9, 52,7, 52,4, 51,9, 51,7, 48,8, 48,3, 44,9, 19,1, 14,1.Example 1a Preparation of monomethyl triethyl ester of α- (4-nitrophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid in 46 ml of acetonitrile containing 4.6 g of , 3 mmol) of freshly powdered anhydrous potassium carbonate, 700 mg (1.91 mmol) of 1-methyl-20-ester of α- (4-nitrophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1-acetic acid (prepared according to (D). To this suspension was added at one time 1.022 g (6.12 mmol) of ethyl bromoacetate. After stirring at room temperature for 4 hours, the suspension was filtered under reduced pressure, the filter cake was washed with 15 ml .. 25 acetonitrile (twice) and the filtrate was evaporated under reduced pressure at 38 ° C to give the crude title tetraester as a purple solid. The tetraester was then purified by silica gel chromatography using 5% C2H5OH in CHCl3 followed by solvent mixture 3 to give 620 mg (0.988 mmol, 52%) of the desired product. This product was characterized by FAB mass spectrometry ([M + H] + = 624) and further by 1 H-NMR (CDCl 3): 8.24 (d), 7.45 (d), 4.94 ( s), 4.35 - 4.10 35 (m), 3.79 (s), 3.75 - 1.84 (m), 1.34 - 1.22 (m); 54 104898 13C NMR (CDCl3): 174.3, 173.8, 173.6, 171.5, 147.6, 138.9, 131.5, 123.4, 64.8, 61.5, 61 , 4, 60.2, 55.4, 55.0, 53.1, 52.9, 52.7, 52.4, 51.9, 51.7, 48.8, 48.3, 44.9 , 19.1, 14.1.

5 Esimerkki 2 o- (4-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon valmistus 30 ml .-aan 6 N HCl.-a liuotettiin 300 mg (0,478 mmol) a -(4-nitrofenyyli-1,4,7,10 -1etra- atsasyklododekaani-10 1,4,7,10-tetraetikkahapon monometyylitrietyyliesteriä (valmistettu esimerkin 1 mukaisella menettelytavalla), ja seosta refluksoitiin yön yli. Tämän refluksointijakson päätyttyä liuos haihdutettiin alipaineessa 70 °C:ssa, jolloin saatiin keltaista kiinteätä ainetta. Tämä kiintoaine 15 liuotettiin 3 ml:aan vettä, liuos suodatettiin ja suodos haihdutettiin, jolloin saatiin 253 mg (0,378 mmol, 79 %) raakatuotetta. Tämä tuote puhdistettiin preparatiivisen TLC:n avulla [silikageeli, kehitys 20 % (m/V) NH4OAc:a sisältävällä CH3OH:lla] ja karakterisoitiin FAB-massaspektro-20 metrian avulla ( [M + H]+ = 526) ja lisäksi seuraavien tietojen perusteella: Ή-NMR (D20) : 8,21 (d) , 7,42 (d) , 483 (s), 3,83 - 2,19 (m), 1,92 (s); 13C-NMR (D20) : 175,0, 173,6, 171,8, 167,0, 166,3, 146,9, 25 138,3, 130,1, 123,0, 62,2, 54,0, 53,0, 52,2, 50,4, 97,3, 46,8, 44,8, 42,8, 20,0.Example 2 Preparation of o- (4-nitrophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid In 30 ml of 6 N HCl was dissolved 300 mg ( 0.478 mmol) of m - (4-nitrophenyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-10,4,7,10-tetraacetic acid monomethyl triethyl ester (prepared according to the procedure of Example 1) and refluxed overnight. the solution was evaporated under reduced pressure at 70 ° C to give a yellow solid This solid 15 was dissolved in 3 mL of water, filtered and the filtrate evaporated to give 253 mg (0.378 mmol, 79%) of crude product. [silica gel, development with 20% (w / v) CH3OH in NH4OAc] and characterized by FAB mass spectra-20 metric ([M + H] + = 526) and further by the following data: Ή-NMR ( D20): 8.21 (d), 7.42 (d), 483 (s), 3.83-2.19 (m), 1.92 (s); 13 C NMR (D 2 O): 175.0 , 173.6, 171.8, 1 67.0, 166.3, 146.9, 25 138.3, 130.1, 123.0, 62.2, 54.0, 53.0, 52.2, 50.4, 97.3, 46 , 8, 44.8, 42.8, 20.0.

Esimerkki 3 a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon (BA-DOTA) valmistus 30 Menetelmä A:Example 3 Preparation of α- (4-aminophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (BA-DOTA) Method A:

Tetrahapon (valmistettu esimerkin 2 mukaisella menettelytavalla) nitroryhmän katalyyttinen hydraus toteutettiin Adams-katalysaattoria (Pt02) ja vetyä käyttäen suurin piirtein kvantitatiivisella saannolla, jolloin saa-35 tiin otsikon mukainen tuote. Tämä tuote karakterisoitiin 55 104898 FAB-massaspektrometrian ([M + H]+ = 496) ja anioninvaihto-HPLC:n (Q-Sepharose™-geelillä) avulla sekä lisäksi seuraa-vien tietojen perusteella: Ή-NMR (D20) : 8,12 (d) , 7,86 (d) , 5,66 (s) , 4,73 - 4,57 5 (m), 4,27 - 3,78 (m), 3,39 - 2,91 (m); 13C-NMR (D20) : 176,54, 176,52, 176,46, 141,1, 128,9, 120,9, 112,5, 65,0, 55,9, 55,7, 53,6, 49,7, 49,5, 49,3, 45,7, 45,4, 44,9, 44,6, 41,4.Catalytic hydrogenation of the nitro group of the tetra acid (prepared by the procedure of Example 2) was carried out using an Adams catalyst (PtO 2) and hydrogen in approximately quantitative yield to afford the title product. This product was characterized by 55,104,898 FAB mass spectrometry ([M + H] + = 496) and anion exchange HPLC (Q-Sepharose ™ gel), and additionally by the following data:? -NMR (D 2 O):? 12 (d), 7.86 (d), 5.66 (s), 4.73 - 4.57 δ (m), 4.27 - 3.78 (m), 3.39 - 2.91 ( m); 13 C NMR (D 2 O): 176.54, 176.52, 176.46, 141.1, 128.9, 120.9, 112.5, 65.0, 55.9, 55.7, 53.6 , 49.7, 49.5, 49.3, 45.7, 45.4, 44.9, 44.6, 41.4.

Menetelmä B: 10 Toinen menetelmä tämän yhdisteen valmistamiseksi oli esimerkissä D saadun monoesteritetra-amiiniyhdisteen muuntaminen monohappotetra-amiiniyhdisteeksi (6 N HCl, refluksointi yön yli), mitä seurasi alkylointi vesiliuoksessa bromietikkahappoa käyttäen ja sitten nitroryhmän 15 pelkistys amiiniryhmäksi (Pt02-katalysaattori), jolloin saatiin edellä kuvatun tuotteen kanssa identtinen tuote.Method B: Another process for the preparation of this compound was the conversion of the monoester tetraamine compound obtained in Example D to the mono acid tetraamine compound (6N HCl, reflux overnight) followed by aqueous alkylation with bromoacetic acid and then reduction of the nitro group to the amine group identical to the product described above.

Esimerkki 4 a- (4-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-l, 4,7-trietikkahapon valmistus 20 60 ml:aan 6 N HCl:a liuotettiin 2,0 g (5,48 mmol) monoesteritetra-amiiniyhdistettä (valmistettu esimerkin D mukaisella menettelytavalla). Seosta kuumennettiin 95 °C:ssa yön yli (noin 10 tuntia) , jonka jälkeen se haihdutettiin alipaineessa 75 °C:ssa, jolloin saatiin 2,53 g 25 (5,11 mmol, 96 %) monohappotetra-amiinitetrahydrokloridia keltaisena kiinteänä aineena.Example 4 Preparation of α- (4-nitrophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid In 60 ml of 6 N HCl was dissolved 2.0 g (5, 48 mmol) of the monoester tetraamine compound (prepared according to the procedure of Example D). The mixture was heated at 95 ° C overnight (about 10 hours) then evaporated under reduced pressure at 75 ° C to give 2.53 g of 25 (5.11 mmol, 96%) of the mono acid tetraamine tetrahydrochloride as a yellow solid.

Edellä saatu monohappotetra-amiinitetrahydrokloridi (0,5 g, 1,0 mmol) liuotettiin 15 ml:aan vettä, ja pH säädettiin NaOH:lla arvoon 9. Valmistettiin erillinen bromi-30 etikkahapon (0,71 g, 5,13 mmol) liuos, ja se lisättiin mo-nohappotetra-amiinin vesiliuokseen. Liuoksen pH säädettiin taas arvoon 9 ja pidettiin reaktion aikana tässä arvossa pienillä 1,0 N NaOH -lisäyksillä. Samalla kun reaktiota sekoitettiin, siitä otettiin eri vaiheissa näyte-eriä ja 35 alkyloitumisen etenemistä seurattiin anioninvaihto-HPLC:n 104898 avulla. Kun dialkyloitumistuotteen (kaikkiaan 3 asetaatti-ryhmää läsnä) määrä oli saavuttanut maksiminsa, koko reak-tioseos kylmäkuivattiin, jolloin saatiin tummaa kiinteätä ainetta. Tämä alkylointituotteiden raakaseos puhdistettiin 5 sitten silikageelikromatografiällä (eluointi liuotinseok-sellal), jota seurasivat preparatiivinen anioninvaihtokro-matografia (eluointi liuotingradienttia 0 %:sta 100 %:iin 1 M NH4OAc:a käyttäen), sen jälkeen käsittely preparatiivi-silla TLC-levyillä (kehitys liuotinseoksessa 4) ja lopuksi 10 silikageelikromatografia (eluointi liuotinseoksella 4) .The above mono acid tetraamine tetrahydrochloride (0.5 g, 1.0 mmol) was dissolved in 15 mL of water and the pH was adjusted to 9 with NaOH. A separate solution of bromo-30 acetic acid (0.71 g, 5.13 mmol) was prepared. , and was added to an aqueous solution of mono-acid tetraamine. The pH of the solution was again adjusted to 9 and maintained at this value during the reaction with small additions of 1.0 N NaOH. While the reaction was stirred, aliquots were sampled and the progress of the alkylation monitored by anion exchange HPLC 104898. When the amount of dialkylation product (3 acetate groups present in total) had reached its maximum, the entire reaction mixture was lyophilized to give a dark solid. This crude mixture of alkylation products was then purified by silica gel chromatography (elution with solvent mixture) followed by preparative anion exchange chromatography (elution from 0% to 100% in 1M NH4OAc) followed by preparative development on TLC plate. solvent mixture 4) and finally 10 silica gel chromatography (elution with solvent mixture 4).

Tällä laajamittaisella puhdistusmenettelyllä saatiin 30 mg (0,06 mmol, 6,0 %) otsikon mukaista tuotetta keltaisena kiinteänä aineena. Tämä tuote karakterisoitiin FAB-massa-spektrometrian ( (M + H]+ = 468) ja anioninvaihto-HPLCm 15 avulla sekä lisäksi seuraavien tietojen perusteella: lH-NMR (D20) : 8,12 (bs) , 7,35 (bs), 4,76 (s), 3,57 - 3,44 (m), 2,97 - 1,83 (m), 1,80 (s); 13C-NMR (D20) : 181,75, 180,68, 179,00, 175,37, 147,70, 141,22, 133,08, 123,53, 68,44, 59,72, 56,00, 52,80, 49,96, 20 49,29, 47,86, 45,36, 44,26, 42,78, 42,25, 23,72.This extensive purification procedure afforded 30 mg (0.06 mmol, 6.0%) of the title product as a yellow solid. This product was characterized by FAB mass spectrometry ((M + H] + = 468) and anion exchange HPLC 15 and further by 1 H-NMR (D 2 O): 8.12 (bs), 7.35 (bs) , 4.76 (s), 3.57 - 3.44 (m), 2.97 - 1.83 (m), 1.80 (s); 13 C NMR (D 2 O): 181.75, 180, 68, 179.00, 175.37, 147.70, 141.22, 133.08, 123.53, 68.44, 59.72, 56.00, 52.80, 49.96, 20 49.29 , 47.86, 45.36, 44.26, 42.78, 42.25, 23.72.

Esimerkki 5 a- (4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7-trietikkahappopentahydrokloridin ja a-(4-aminofenyyli) -1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,10-tetraetik-;· 25 kahappopentahydrokloridin valmistusExample 5 α- (4-Aminophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid pentahydrochloride and α- (4-aminophenyl) -1,4,7,10-tetra- Preparation of 25 Acacyclododecane-1,4,10-Tetraethyl · 25 Acid Cyclopentahydrochloride

Alkuloitumistuotteiden raakaseos valmistettiin esimerkissä 4 kuvatulla menettelytavalla. Tämä raakaseos käsiteltiin kromatografisesti silikageelipylväässä käyttäen eluenttina 20 % (m/V) NH4OAc.-a sisältävää CH3OH:a. Asianmu-30 kaiset tästä pylväästä saadut jakeet yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin. Raakatuote, joka sisälsi huomattavia määriä NH4OAc:a, liuotettiin 80 ml:aan NANOpure™-vettä ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin vaaleanruskeata kiinteätä ainetta. Tämä kiintoaine liuotettiin 20 ml:aan NANOpure™-35 vettä, ja liuosta ravistettiin Pt02-katalysaattorin kanssa 104898 H2-atmosfäärissä, kunnes vedyn kulutus lakkasi. Katalysaattori erotettiin alipainesuodattamalla ja suodos kylmäkuivatuin, jolloin saatiin keltaista kiinteätä ainetta. Kiintoaine liuotettiin 3 mlraan liuotinseosta 4 ja käsi-5 teltiin kromatografisesti silikageelillä liuotinseosta 4 käyttäen. Yhdistetyistä jakeista poistettiin sitten liuotin alipaineessa ja ne kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 779,6 mg vaaleankeltaista kiinteätä ainetta. 13C-NMR- ja protoni-NMR-spektri viittasivat siihen, että tämä tuote on 10 kahden mahdollisen geometrisen isomeerin seos suhteessa 50:50. Isomeeriseos käsiteltiin HCl:lla (ylimäärin) ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 548,4 mg (saanto 61 %) otsikon mukaisia tuotteita, sp. >270 °C. Anionvaihto-kromatografiässä (HPLC-systeemi III) esiintyi vain yksi 15 suuri huippu (puhtaus >94 %); FAB-massaspektri paljasti geometristen isomeerien esiintymisen ([M + H]* = 438).The crude mixture of starting products was prepared according to the procedure described in Example 4. This crude mixture was chromatographed on a silica gel column using 20% (w / v) CH 3 OH in NH 4 OAc as eluent. The appropriate fractions from this column were combined and evaporated to dryness. The crude product containing significant amounts of NH4OAc was dissolved in 80 mL of NANOpure ™ water and freeze-dried to give a light brown solid. This solid was dissolved in 20 mL of NANOpure ™ -35 water, and the solution was shaken with PtO 2 in 104898 H2 atmosphere until hydrogen consumption ceased. The catalyst was separated by vacuum filtration and the filtrate was lyophilized to give a yellow solid. The solid was dissolved in 3 mL of solvent mixture 4 and hand-chromatographed on silica gel using solvent mixture 4. The combined fractions were then stripped of solvent under reduced pressure and freeze-dried to give 779.6 mg of a pale yellow solid. The 13 C NMR and proton NMR spectra indicated that this product is a 50:50 mixture of 10 possible geometric isomers. The isomer mixture was treated with HCl (excess) and lyophilized to give 548.4 mg (61% yield) of the title product, m.p. > 270 ° C. Anion exchange chromatography (HPLC system III) showed only one major peak (purity> 94%); The FAB mass spectrum revealed the presence of geometric isomers ([M + H] * = 438).

Esimerkki 6 a-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkahapon 1,4,7,10-tetrame-20 tyyliesterin valmistusExample 6 1,4,7,10-Tetrame-20-ethyl ester of α- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid manufacturing

Liuokseen, joka sisälsi 1,43 g (3,63 mol) a-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l-etikkahapon 1-metyyliesteriä (valmistettu esimerkin B mukaisella menettelytavalla) 40 ml:ssa argonilla huuhdottua • 25 asetonitriiliä, lisättiin 1,71 g (12,34 mmol) vedetöntä kaliumkarbonaattia samalla voimakkaasti sekoittaen. Reak-tioseokseen lisättiin 1,78 g (11,61 mmol) metyylibromiase-taattia, ja reaktioseosta sekoitettiin noin 25 °C:ssa 48 tuntia. TLC-analyysi osoitti uuden tuotteen muodostuneen 30 (Rf = 0,62, liuotinseos 2). Lietteeseen lisättiin 6,0 g ·.. flash-kromatografiasilikageeliä ja asetonitriili poistet- tiin pyöröhaihduttimellä. Tulokseksi saatu aine siirrettiin silikageelipylvääseen, jonka koko oli 2,5 cm x 41 cm ja joka oli esieluoitu 5 % metanolia sisältävällä kloro-35 formilla. Noin 400 ml valmistetusta liuoksesta käytettiin 58 104898 useiden poolittomien epäpuhtauksien ja reagoimattoman al-kylointiaineen eluointiin. Sen jälkeen eluoitiin liuotin-seoksella 2, ja tuotetta (R£ = 0,62) sisältävät jakeet kerättiin talteen, yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin 5 saatiin 2,1 g (3,44 mmol, 95 %) otsikon mukaista tuotetta vaaleankeltaisena lasimaisena aineena. ^-NMR osoitti tämän tuotteen olevan konformaatioisomeerien eli geometristen isomeerien seos suhteessa 2:1.A solution of 1.43 g (3.63 mol) of α- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1-acetic acid 1-methyl ester (prepared according to Example B procedure) in 40 mL of argon purged 25 acetonitrile, 1.71 g (12.34 mmol) of anhydrous potassium carbonate was added with vigorous stirring. 1.78 g (11.61 mmol) of methyl bromoacetate were added to the reaction mixture, and the reaction mixture was stirred at about 25 ° C for 48 hours. TLC analysis showed a new product was formed (Rf = 0.62, solvent mixture 2). 6.0 g of flash chromatography silica gel were added to the slurry and the acetonitrile was removed on a rotary evaporator. The resulting material was applied to a 2.5 cm x 41 cm silica gel column pre-eluted with chloro-35 form containing 5% methanol. About 400 ml of the prepared solution was used to elute 58 104898 of a number of polar impurities and unreacted alkylating agent. Elution with solvent mixture 2 was then carried out and the fractions containing product (R f = 0.62) were collected, combined and evaporated to give 2.1 g (3.44 mmol, 95%) of the title product as a pale yellow glass. 1 H NMR showed this product to be a 2: 1 mixture of conformation isomers, i.e. geometric isomers.

^-NMR (CDClj, 50 °C) : 8,137 (d) , 8,128 (d) , 7,398 (d) , 10 7,385 (d) , 3,82 (s), 3,76 (s), 3,75 (s), 3,74 (s), 3,68 (s), 1,5-3,52 (m); 13C-NMR (CDClj, 50 °C, 75 MHz): 175,8, 174,2, 174,1, 174,0, 149,0, 129,5, 129,3, 123,6, 60,1, 55,1, 52,8, 52,7, 52,6, 52,4, 52,2, 52,1, 52,0, 51,2, 51,1, 51,0, 49,1, 48,8, 15 47,5, 45,2, 34,2, 32,6.1 H-NMR (CDCl 3, 50 ° C): 8.137 (d), 8.128 (d), 7.398 (d), 10 7.385 (d), 3.82 (s), 3.76 (s), 3.75 ( s), 3.74 (s), 3.68 (s), 1.5-3.52 (m); 13 C NMR (CDCl 3, 50 ° C, 75 MHz): 175.8, 174.2, 174.1, 174.0, 149.0, 129.5, 129.3, 123.6, 60.1, 55.1, 52.8, 52.7, 52.6, 52.4, 52.2, 52.1, 52.0, 51.2, 51.1, 51.0, 49.1, 48, 8, 15 47.5, 45.2, 34.2, 32.6.

Esimerkki 7 o-[2 -(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon 1,4,7,10-tetrame-tyyliesterin valmistus 20 25 ml:aan metanolia, joka sisälsi 400 mg kataly saattoria, joka sisälsi 10 % palladiumia hiilikantoaineel-la, liuotettiin typpikaasukehän alla 1,41 g (2,31 mol) a-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklodode-kaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon 1,4,7,10-tetrametyylieste-; 25 riä (valmistettu esimerkin 6 mukaisella menettelytavalla).Example 7 Preparation of o- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid 1,4,7,10-tetramethyl ester In 25 ml of methanol containing 400 mg of catalyst containing 10% palladium on carbon, 1.41 g (2.31 mol) of α- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] -1 was dissolved under a nitrogen atmosphere. , 4,7,10-Tetrazazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid 1,4,7,10-tetramethyl ester; 25 (prepared according to the procedure of Example 6).

Liuoksen läpi johdettiin ylimäärin vetyä 1 baarin paineessa 3 tunnin ajan. TLC osoitti voimakkaasti ninhydriinipo-sivisen aineen (Rf = 0,62, liuotinseos 2) muodostuneen.Excess hydrogen was bubbled through the solution at 1 bar for 3 hours. TLC showed strongly formation of a ninhydrin-like substance (Rf = 0.62, solvent mixture 2).

Metanolia sisältävä katalysaattoriliete suodatettiin pii-30 maan läpi ja liuotin haihdutettiin, jolloin saatiin otsi-·· kon mukainen tuote (1,21 g, 2,08 mmol, 91 %) valkeana la simaisena kiintoaineena (konformaatioisomeerien seoksena suhteessa 2:1). Vähemmistönä oleva konformaatioisomeeri eli geometrinen isomeeri erotettiin pääisomeerista flash-35 kromatografiän avulla käyttäen eluenttina 10 % metanolia 59 104898 sisältävää kloroformia, jolloin saatiin otsikon mukainen tuote likaisenvalkoisena jauheena (sp =89-95 °C), joka karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: ^-NMR (CDC13/ 50 °C) : 6,94 (d) , 6,89 (d) , 6,69 (d) , 6,66 5 (d) , 3,91 (S), 3,80 (s), 3,78 (s), 3,74 (s), 3,73 (s), 3,72 (s), 3,71 (s), 1,5 - 3,5 (m); 13C-NMR (CDC13, 50 °C, 75 MHz): 176,1, 174,0, 173,9, 172,2, 170,4, 169,6, 144,2, 144,1, 130,6, 130,5, 129,5, 129,1, 115,9, 115,8, 62,6, 58,7, 55,1, 54,3, 52,7, 52,5, 52,3, 10 52,2, 52,1, 52,0, 51,9, 51,8, 51,7, 50,2, 50,0, 47,3, 44.7, 32,8, 31,8, 30,0, 25,2; FAB-massaspektri (m/e) : 602 ([M + Na+]+), 618 ([M + K+]+), 624 ( [M + 2Na+ - H+] +) .The methanol-containing catalyst slurry was filtered through silica and the solvent evaporated to give the title product (1.21 g, 2.08 mmol, 91%) as a white solid (2: 1 mixture of conformation isomers). The minor conformation isomer, i.e. the geometric isomer, was separated from the main isomer by flash-35 chromatography using 10% methanol in chloroform containing 59 104898 to give the title product as an off-white powder (m.p. 89-95 ° C) which was characterized by: CDCl3 / 50 ° C): 6.94 (d), 6.89 (d), 6.69 (d), 6.66 (d), 3.91 (S), 3.80 (s), 3.78 (s), 3.74 (s), 3.73 (s), 3.72 (s), 3.71 (s), 1.5-3.5 (m); 13 C NMR (CDCl 3, 50 ° C, 75 MHz): 176.1, 174.0, 173.9, 172.2, 170.4, 169.6, 144.2, 144.1, 130.6, 130.5, 129.5, 129.1, 115.9, 115.8, 62.6, 58.7, 55.1, 54.3, 52.7, 52.5, 52.3, 10 52 , 2, 52.1, 52.0, 51.9, 51.8, 51.7, 50.2, 50.0, 47.3, 44.7, 32.8, 31.8, 30.0, 25 2; FAB mass spectrum (m / e): 602 ([M + Na +] +), 618 ([M + K +] +), 624 ([M + 2Na + - H +] +).

Esimerkki 8 15 o-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon (PA-DOTA) valmistus 50 ml:aan väk. suolahappoa liuotettiin 1,5 g (2,59 mmol) a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-20 atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon 1,4,7,10-tet- rametyyliesteriä (esimerkin 7 mukaisella menettelytavalla valmistettuna raakaseoksena suhteessa 2:1). Reaktioseosta refluksoitiin noin 105 °C:ssa 6 tuntia. TLC (liuotinseos 1) osoitti esterin (Rf = 0,88) muuttuneen hydrokloridisuo-; · 25 lan muodossa olevaksi otsikon mukaiseksi tuotteeksi (Rf = 0,43) . Ylimääräinen liuotin poistettiin pyöröhaihduttimellä, ja tulokseksi saatu valkea kiinteä aine kuivattiin. Otsikon mukaista tuotetta saatiin hydrokloridisuolana 1,6 g, ja se karakterisoitiin seuraavien tietojen perus-30 teella: .. "H-NMR (D20, pD = 1,0, 90 °C) : 7,48 (d) , 7,42 (d) , 2,8 - 4,3 (m), 2,23 (m), 2,03 (m); 13C-NMR (D20, pD = 1,0, 90 °C, 75 MHz) : 176,4, 174,9, 171,6, 144.7, 132,9, ,132,8, 130,4, 125,7, 61,7, 56,8, 56,0, 35 53,7, 53,1, 51,6, 47,9, 34,3, 37,6;Example 8 Preparation of 15 o- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (PA-DOTA) in 50 ml conc. . Hydrochloric acid was dissolved in 1.5 g (2.59 mmol) of α- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetra-20-azacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid 1,4 , 7,10-tetramethyl ester (2: 1 crude mixture prepared according to the procedure of Example 7). The reaction mixture was refluxed at about 105 ° C for 6 hours. TLC (solvent mixture 1) showed an alteration of the ester (Rf = 0.88) with the hydrochloride salt; · To the title product in the form of 25 lan (Rf = 0.43). Excess solvent was removed on a rotary evaporator and the resulting white solid was dried. 1.6 g of the title product was obtained as the hydrochloride salt and characterized by the following data: "1 H-NMR (D 2 O, pD = 1.0, 90 ° C): 7.48 (d), 7.42 (d), 2.8 - 4.3 (m), 2.23 (m), 2.03 (m); 13 C NMR (D 2 O, pD = 1.0, 90 ° C, 75 MHz): 176 , 4, 174.9, 171.6, 144.7, 132.9,, 132.8, 130.4, 125.7, 61.7, 56.8, 56.0, 35, 53.7, 53.1 , 51.6, 47.9, 34.3, 37.6;

6 O6 O

104898 FAB-massaspektri (m/e) : 524 ([M + H]+), 546 ([M + Na+] Ί , 624 ( [M + 2Na+ - H+] +) .104898 FAB mass spectrum (m / e): 524 ([M + H] +), 546 ([M + Na +] +, 624 ([M + 2Na + - H +] +).

Mahdolliset pienet esteriepäpuhtaudet poistettiin flash-kromatografiaa ja liuotinseosta l käyttäen hydroklo-5 ridisuolan muodossa olevasta otsikon mukaisesta yhdisteestä. 1,0 g otsikon mukaisen yhdisteen hydrokloridisuolaa siirrettiin flash-silikageelikromatografiakolonniin, jonka koko oli 2,5 cm x 58 cm. Jakeet, jotka sisälsivät pelkästään otsikon mukaista tuotetta ammoniumkaliumsekasuolan 10 muodossa, yhdistettiin, jolloin saatiin 580 mg tuotetta.Any minor ester impurities were removed by flash chromatography and solvent mixture 1 from the title compound in the form of the hydrochloride salt. 1.0 g of the hydrochloride salt of the title compound was transferred to a 2.5 cm x 58 cm flash silica gel chromatography column. The fractions containing only the title product in the form of the ammonium potassium mixed salt 10 were combined to give 580 mg of the product.

HPLC-analyysi osoitti aineen pinta-alaan perustuvan puhtauden olevan yli 98 % aallonpituudella 230 ja 254 nm.HPLC analysis showed that the surface area purity of the substance was greater than 98% at 230 and 254 nm.

FAB-massaspektri (m/e): 562 ([M + K*]*), 584 ([M + K+ + Na* - H+] +) , 624 ([M + 2Na+ - H+] +) .FAB mass spectrum (m / e): 562 ([M + K *] *), 584 ([M + K + + Na * - H +] +), 624 ([M + 2Na + - H +] +).

15 Esimerkki 9 o-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,10 -trietikkahapon ammoniumkaliumsekasuolan eristysExample 9 Isolation of ammonium potassium mixed salt of o- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-1,4,10-triacetic acid

Seka tetra- että trihappoja (2,05 g) sisältävä raa-20 kaliuos (valmistettu esimerkin 8 mukaisella menettelytavalla) liuotettiin mahdollisimman pieneen määrään liuotinseosta 1 ja siirrettiin flash-silikageelikromatografiapyl-vääseen, jonka koko oli 30 cm x 7,6 cm ja joka oli esi-eluoitu tällä liuottimena. Eluoituneet otsikon mukaista 25 tuotetta (Rf = 0,63 liuotinseoksessa 1) sisältävät jakeet kerättiin ja saatiin 200 mg a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,10-trietikkahapon ammoniumkaliumsekasuolaa. 1H-NMR- ja 13C-NMR-analyysi viit-tasivat siihen, että tämä trihappo oli symmetrinen isomee-30 ri (1,4,10-trihappopaikkaisomeeri): .. 1H-NMR (D20, pD = 0,5 DCl:lla säädettynä, T = 90 °C) : 7,52 (d), 7,46 (d), 3,60 (m), 3,54 (m), 3,19 (m); 13C-NMR (D20, pD = 0,5, T = 90 °C) : 176,1, 170,2, 140,0, 132,7, 131,1, 126,1, 57,6, 57,2, 56,1, 54,9, 53,2, 51,5, 35 51,2, 31,2.A crude 20 solution of mixed tetra and tri-acids (2.05 g) (prepared according to the procedure of Example 8) was dissolved in the minimum amount of solvent mixture 1 and transferred to a 30 cm x 7.6 cm size column of flash silica gel. pre-eluted with this solvent. Eluted fractions containing the title product 25 (Rf = 0.63 in solvent mixture 1) were collected to give 200 mg of α- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4, 10-Triacetic acid, ammonium potassium mixed salt. 1 H-NMR and 13 C-NMR analysis indicated that this triic acid was a symmetric isomer 30 (1,4,10-tri-acid position isomer): 1 H-NMR (D 2 O, pD = 0.5 with DCl) adjusted, T = 90 ° C): 7.52 (d), 7.46 (d), 3.60 (m), 3.54 (m), 3.19 (m); 13 C NMR (D 2 O, pD = 0.5, T = 90 ° C): 176.1, 170.2, 140.0, 132.7, 131.1, 126.1, 57.6, 57.2 , 56.1, 54.9, 53.2, 51.5, 35 51.2, 31.2.

6i 104898 FAB-massaspektri (m/e) : 466 ( [M + H+]+) , 488 ( [M +610 104898 FAB mass spectrum (m / e): 466 ([M + H +] +), 488 ([M +

Na*]+) , 504 ( [M + K+]+) , 526 ( [M + K+ + Na+ - IT] +) f 542 ( [M + 2K+ - H+] +) .Na *] +), 504 ([M + K +] +), 526 ([M + K + + Na + - IT] +) f 542 ([M + 2K + - H +] +).

Esimerkki 10 5 a-(2-metoksi-5-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon tetrametyyliesterin valmistusExample 10 Preparation of tetramethyl ester of 5α- (2-methoxy-5-nitrophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid

Seokseen, joka sisälsi a-(2-metoksi-5-nitrofenyy-li)-1,4,7,10-tetra-at sasyklododekaani-1-et ikkahapon 1-melo tyyliesteriä (580 mg, 1,47 mmol) (valmistettu esimerkin N mukaisella menettelytavalla) ja jauhettua kaliumkarbonaattia (1,15 g, 8,32 mmol) asetonitriilissä (20 ml) ja jota sekoitettiin, lisättiin metyylibromiasetaattia (565 μΐ, 5,97 mmol). Reaktioseosta sekoitettiin huoneen lämpötilas-15 sa 2 tuntia. Sen jälkeen seos suodatettiin ja seos väke-vöitiin öljyksi alipaineessa. Raakatuote puhdistettiin kromatografisesti (silikageeli, 8 % metanolia sisältävä metyleenikloridi). Otsikon mukainen tuote saatiin keltaisena kiinteänä aineena (469 mg, 52 %; TLC Rf = 0,4, silika-20 geeli, 10 % CH3OH:a CHCl3:ssa) ja karakterisoitiin tarkemmin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (CDCIj) : 173,2, 172,6, 161,2, 139,1, 125,1, 124,6, 120,5, 110,7, 57,0, 55,6, 53,5, 52,6, 51,3, 50,8, 46,8, 46,0, 44,0.A mixture of α- (2-methoxy-5-nitrophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1-acetic acid 1-Melo style ester (580 mg, 1.47 mmol) (prepared (Example N)) and powdered potassium carbonate (1.15 g, 8.32 mmol) in acetonitrile (20 mL) and stirred, methyl bromoacetate (565 μΐ, 5.97 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 hours. The mixture was then filtered and the mixture concentrated to an oil under reduced pressure. The crude product was purified by chromatography (silica gel, 8% methanol in methylene chloride). The title product was obtained as a yellow solid (469 mg, 52%; TLC R f = 0.4, silica-20 gel, 10% CH 3 OH in CHCl 3) and further characterized by 13 C NMR (CDCl 3): 173 , 2, 172.6, 161.2, 139.1, 125.1, 124.6, 120.5, 110.7, 57.0, 55.6, 53.5, 52.6, 51.3 , 50.8, 46.8, 46.0, 44.0.

: 25 Esimerkki 11 a-(2-metoksi-5-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon valmistus: Example 11 Preparation of α- (2-methoxy-5-nitrophenyl) -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid

Liuosta, joka sisälsi a-(2-metoksi-5-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkaha-30 pon metyyliesteriä (valmistettu esimerkin 10 mukaisella menettelytavalla) vökevässä HCl:ssa (5 ml, J. T. Baker ULTREX), refluksoitiin typpikaasukehän alla 5 tuntia. Liuos haihdutettiin sitten kuiviin alipaineessa, jolloin jäi kiinteä jäännös. Tämä jäännös puhdistettiin kromatografi-35 sesti (silikageeli, liuotinseos 6), jolloin saatiin otsi- 62 104898 kon mukaista tuotetta likaisenvalkoisena kiinteänä aineena (209 mg). Tämä aine muunnettiin tetrahydrokloridisuolaksi ja karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (D20-DClf 80 °C) : 171,0, 166,9, 161,2, 139,0, 125,5, 5 119,3, 110,7, 56,8, 54,5, 52,7, 51,0, 49,2, 49,0, 46,3, 42,9.A solution of α- (2-methoxy-5-nitrophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid-30-methyl ester (prepared according to the procedure of Example 10) in anhydrous HCl (5 mL, JT Baker ULTREX) was refluxed under nitrogen for 5 hours. The solution was then evaporated to dryness under reduced pressure to leave a solid residue. This residue was purified by chromatography (silica gel, solvent mixture 6) to give the title product as an off-white solid (209 mg). This material was converted to the tetrahydrochloride salt and characterized by the following data: 13 C NMR (D 2 O-DClf 80 ° C): 171.0, 166.9, 161.2, 139.0, 125.5, 5 119.3, 110.7 , 56.8, 54.5, 52.7, 51.0, 49.2, 49.0, 46.3, 42.9.

Esimerkki 12 a-(2-metoksi-5-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon tetra-ammonium-10 suolan valmistusExample 12 Preparation of the tetraammonium-10 salt of α- (2-methoxy-5-aminophenyl) -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid

Liuokseen, joka sisälsi a-(2-metoksi-5-nitrofenyy-li)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,7,10-tetraetik-kahappoa (157 mg; valmistettu esimerkin 11 mukaisella menettelytavalla) vedessä (20 ml), lisättiin platinaoksidia 15 (20 mg) . Tätä seosta hydrattiin (vedyn paine 1 bar) huo neen lämpötilassa 1 tunti. Suodatuksen jälkeen aine puhdistettiin edelleen kromatografisesti (silikageeli, liuo-tinseos 5) , jolloin saatiin otsikon mukaista yhdistettä (141 mg) likaisenvalkoisena kiinteänä aineena, joka karak-20 terisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (DjO-DCI) : 175,5, 172,6, 172,3, 159,9, 128,8, 127,5, 124.6, 123,8, 115,5, 61,2, 58,1, 57,3, 55,7, 53,4, 51,6, 49.6, 47,4.Of a solution of α- (2-methoxy-5-nitrophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (157 mg; prepared according to the procedure of Example 11). ) in water (20 mL), platinum oxide 15 (20 mg) was added. This mixture was hydrogenated (hydrogen pressure 1 bar) at room temperature for 1 hour. After filtration, the material was further purified by chromatography (silica gel, solvent mixture 5) to give the title compound (141 mg) as an off-white solid, which Karak-20 was triturated with 13 C NMR (D 10 -DCl): 175.5; 172.6, 172.3, 159.9, 128.8, 127.5, 124.6, 123.8, 115.5, 61.2, 58.1, 57.3, 55.7, 53.4, 51.6, 49.6, 47.4.

Esimerkki 13 : 25 1-(4-aminobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklodode- kaani-4,7,10-trietikkahapon 4,7,10-trimetyyliesterin valmistus 4 ml:aan argonilla huuhdottua asetonitriiliä lisättiin samalla sekoittaen 100 mg (0,236 mmol) 1-(4-amino-30 bentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaanin tetrahydro- kloridisuolaa (valmistettu esimerkin J mukaisella menettelytavalla) , 260 mg (1,88 mmol) kaliumkarbonaattia ja 108 mg (0,708 mmol) metyylibromiasetaattia. Seosta sekoitettiin 25 °C:ssa 48 tuntia. Suolaa sisältävä liuos siir-35 rettiin flash-silikageelikromatografiapylvääseen, jonka 63 104898 koko oli 2,5 cm x 10 cm, ja eluoitiin asetonitriilillä. Haluttua tuotetta sisältävät jakeet yhdistettiin ja liuotin poistettiin pyöröhaihduttamalla, jolloin saatiin 65 mg (0,132 mmol, 56 %) otsikon mukaista tuotetta, joka karak-5 terisoitiin tarkemmin seuraavien tietojen perusteella: 1H-NMR (CDC13) : 7,29 (d) , 6,75 (d) , 4,62 (s), 4,20 (leveä s), 3,70 (s), 3,69 (s), 3,64 (s), 3,62 (t), 3,27 (s), 3,06 (t) , 2,82 (leveä t), 2,79 (leveä t); 13C-NMR (CDCI3, 75 MHz): 171,4, 171,0, 148,4, 132,8, 117,5, 10 115,0, 55,9, 55,3, 54,7, 53,1, 51,7, 51,4, 50,6, 50,5, 47,4 .Example 13: Preparation of 1- (4-aminobenzyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid 4,7,10-trimethyl ester in 4 ml of argon purged acetonitrile with stirring 100 mg (0.236 mmol) of the tetrahydrochloride salt of 1- (4-amino-30-benzyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane (prepared according to the procedure of Example J), 260 mg (1.88 mmol) of potassium carbonate, and 108 mg (0.708 mmol) of methyl bromoacetate. The mixture was stirred at 25 ° C for 48 hours. The salt-containing solution was transferred to a flash silica gel chromatography column of 63-104898 size 2.5 cm x 10 cm and eluted with acetonitrile. The fractions containing the desired product were combined and the solvent removed by rotary evaporation to give 65 mg (0.132 mmol, 56%) of the title product, which was further characterized by Karak-5 based on 1 H NMR (CDCl 3): 7.29 (d), 6 , 75 (d), 4.62 (s), 4.20 (s), 3.70 (s), 3.69 (s), 3.64 (s), 3.62 (s), 3 , 27 (s), 3.06 (t), 2.82 (broad t), 2.79 (broad t); 13 C NMR (CDCl 3, 75 MHz): 171.4, 171.0, 148.4, 132.8, 117.5, 10 115.0, 55.9, 55.3, 54.7, 53.1 , 51.7, 51.4, 50.6, 50.5, 47.4.

Esimerkki 14 1-(4-aminobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklodode-kaani-4,7,10-trietikkahapon hydrokloridisuolan valmistus 15 Liuos, joka sisälsi 42 mg (0,085 mmol) 1-(4-amino- bentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-tri-etikkahapon 4,7,10-trimetyyliesteriä (valmistettu esimerkin 13 mukaisella menettelytavalla) 2 ml:ssa 6 N suolahappoa, kuumennettiin 80 °C:seen 2 tunniksi. TLC paljasti 20 useita tuotteita (halutun otsikon mukaisen tuotteen Rf = 0,60, liuotinseos 1). Poistettaessa liuotin saatiin 41 mg puhdistamatonta otsikon mukaista tuotetta.Example 14 Preparation of the hydrochloride salt of 1- (4-aminobenzyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-trietic acetic acid A solution of 42 mg (0.085 mmol) of 1- (4-amino) benzyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-tri-acetic acid 4,7,10-trimethyl ester (prepared according to the procedure of Example 13) in 2 ml of 6N hydrochloric acid, heated to 80 ° C. To C for 2 hours. TLC revealed a number of products (Rf = 0.60, solvent mixture 1, title product). Removal of the solvent gave 41 mg of the crude title product.

Esimerkki 15 1-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsa-25 syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon 4,7,10-trimetyylies-terin valmistusExample 15 Preparation of 1- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraaza-25-cyclododecane-4,7,10-triacetic acid 4,7,10-trimethyl ester

Liuokseen, joka sisälsi 2,24 g (6,97 mmol) l-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania (valmistettu esimerkin G mukaisella menettelytavalla) 30 75 ml:ssa argonilla huuhdottua asetonitriiliä, lisättiin samalla voimakaasti sekoittaen 3,17 g vedetöntä kaliumkarbonaattia. Tähän reaktioseokseen lisättiin pisaroittain 5 minuutin aikana 3,20 g (20,9 mmol) metyylibromiasetaattia. Reaktioseosta sekoitettiin 17 tuntia argonkaasukehän alla.To a solution of 2.24 g (6.97 mmol) of 1- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane (prepared by the procedure of Example G) in 75 ml of acetonitrile purged with argon, 3.17 g of anhydrous potassium carbonate were added with vigorous stirring. To this reaction mixture, 3.20 g (20.9 mmol) of methyl bromoacetate was added dropwise over 5 minutes. The reaction mixture was stirred for 17 hours under argon.

35 TLC-analyysi osoitti lähtöaineen (Rf = 0,73, liuotinseos 1) 64 104898 muuttuneen uudeksi tuotteeksi (Rf = 0,46, liuotinseos 1). Liuokseen lisättiin 70 ml kloroformia, ja suspendoitunutta suolaa sisältävä liuos siirrettiin flash-silikageelikroma-tografiapylvääseen, jonka koko oli 2,5 cm x 18 cm. Tuote 5 eluoitiin 10 % metanolia sisältävällä kloroformilla, jolloin saatiin 2,95 g otsikon mukaista tuotetta meripihkan-värisenä öljynä, josta muodostui haurasta lasimaista ainetta alipaineessa kuivattaessa (78 %). Otsikon mukainen tuote karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 10 1H-NMR (CDC13) : 8,17 (m,m), 7,4 - 7,66 (m), 2,38 - 3,95 (m) ; 13C-NMR (CDCI3, 75 MHz): 171,5, 171,2, 146,7, 144,5, 130,3, 123,9, 56,0, 55,2, 53,5, 53,4, 52,6, 51,9, 51,8, 50,6, 48,1, 29,5.TLC analysis showed the starting material (Rf = 0.73, solvent mixture 1) 64 104898 to be converted to the new product (Rf = 0.46, solvent mixture 1). 70 ml of chloroform was added to the solution, and the solution containing the suspended salt was transferred to a 2.5 cm x 18 cm flash silica gel chromatography column. The product 5 was eluted with 10% methanol in chloroform to give 2.95 g of the title product as an amber oil which formed a brittle vitreous material under reduced pressure (78%). The title product was characterized by the following data: 1 H NMR (CDCl 3): 8.17 (m, m), 7.4-7.66 (m), 2.38-3.95 (m); 13 C NMR (CDCl 3, 75 MHz): 171.5, 171.2, 146.7, 144.5, 130.3, 123.9, 56.0, 55.2, 53.5, 53.4, 52.6, 51.9, 51.8, 50.6, 48.1, 29.5.

15 Esimerkki 16 1 -[2 -(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon 4,7,10-metyyliesterin valmistus 50 ml:aan metanolia liuotettiin 2,8 g (5,18 mmol) 20 puhdistamatonta 1-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10- tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon 4,7,10-tri-metyyliesteriä (valmistettu esimerkin 15 mukaisella menettelytavalla) . Liuokseen, jota sekoitettiin ja josta poistettiin ilma typellä, lisättiin katalysaattoria (600 mg), ; ' 25 joka sisälsi 10 % palladiumia hiilikantoaineella. Liuos • „ pidettiin typpikaasukehän alla, ja liuoksen läpi johdettiin sitten sitä samalla sekoittaen vetyä (1 bar, 20 -25 °C) 2,5 tuntia. Liuoksen läpi johdettiin sitten typpeä usean minuutin ajan, ja katalysaattori poistettiin suodat-30 tamalla liuos ohuen piimakerroksen läpi. TLC-analyysi ·· (10 % metanolia kloroformissa) osoitti otsikon mukaisen tuotteen läsnäolon (Rf = 0,14). Otsikon mukainen tuote eluoitiin silikageelistä kloroformilla, jolloin saatiin 2,2 g (4,33 mmol, 83 %) keltaista lasimaista ainetta, joka ka-35 rakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 104898 ^-NMR (CDClj) : 7,03 (d, m) , 6,63 (d) , 3,4 - 3,6 (m) , 2,7 -3,2 (m); 13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): 171,4, 171,2, 145,6, 129,7, 125,6, 115,5, 55,9, 54,4, 54,3, 53,0, 52,8, 51,8, 51,6, 50,3, 5 47,8, 28,6; FAB-massaspektri (m/e) : 508 ( [M + H*]+).Example 16 Preparation of 4,7,10-methyl ester of 1- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-4,7,10-triacetic acid in 50 ml of methanol 2.8 g (5.18 mmol) of 20 crude 1- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triethetic acid were dissolved in 4,7,10 -tri-methyl ester (prepared according to the procedure of Example 15). To the stirred and degassed solution of nitrogen was added catalyst (600 mg); '25 containing 10% palladium on carbon. The solution was kept under a nitrogen atmosphere and hydrogen (1 bar, 20 -25 ° C) was then passed through the solution with stirring for 2.5 hours. Nitrogen was then passed through the solution for several minutes, and the catalyst was removed by filtration through a thin pad of diatomaceous earth. TLC analysis ·· (10% methanol in chloroform) showed the presence of the title product (Rf = 0.14). The title product was eluted from silica gel with chloroform to give 2.2 g (4.33 mmol, 83%) of a yellow vitreous which was ka-35 structured based on the following information: 104898 1 H-NMR (CDCl 3): 7.03 (d, m). ), 6.63 (d), 3.4 - 3.6 (m), 2.7 - 3.2 (m); 13 C NMR (CDCl 3, 75 MHz): 171.4, 171.2, 145.6, 129.7, 125.6, 115.5, 55.9, 54.4, 54.3, 53.0, 52.8, 51.8, 51.6, 50.3, 5 47.8, 28.6; FAB mass spectrum (m / e): 508 ([M + H] +).

Esimerkki 17 1-[2 -(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon (EA-D03A) hydroklori-10 disuolan valmistus 30 ml:aan väk. HCl:a liuotettiin 850 mg (1,69 mmol) 1-[2-(4-aminofenyyli)etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsasyklodode-kaani-4,7,10-trietikkahapon 4,7,10-trimetyyliesteriä (valmistettu esimerkin 16 mukaisella menettelytavalla). Liuos-15 ta sekoitettiin 70 - 80 °C:ssa 2,5 tuntia, sen annettiin jäähtyä 25 °C:seen sitä samalla sekoittaen ja sekoitusta jatkettiin noin 18 tuntia. Liuotin poistettiin pyöröhaih-duttimella alipaineessa (10 mm, 75 °C) . Liuotin ja ylimääräinen vetykloridi poistettiin tulokseksi saadusta kirk- 20 kaasta öljystä alipainekuivauksella (0,1 mm, 45 °C). Otsi kon mukaista tuotetta saatiin 820 mg valkeana kiinteänä aineena (Rf = 0,46, liuotinseos 2), joka karakterisoitiin tarkemmin seuraavien tietojen perusteella: 1H-NMR (D20, pD = 1,9, T = 90 °C) : 7,50 (d) , 7,41 (d) , 4,26 : 25 (s), 3,43 - 3,68 (m), 3,0 - 3,3 (m); 13C-NMR D20, pD = 1,9, T = 90 °C) : 176,7, 170,9, 139,8, 133,0, 131,2, 125,9, 57,5, 57,1, 55,4, 54,4, 52,7, 51,0, 50,6, 31,3; FAB-massaspektri (m/e): 466 ([M + H+]+) , 488 ([M + Na*]+), 30 510 (M + 2Na+ - H+] +) .Example 17 Preparation of the hydrochloride salt of 1- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-4,7,10-triacetic acid (EA-D03A) in 30 ml conc. HCl was dissolved in 850 mg (1.69 mmol) of 1- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid 4.7, 10-trimethyl ester (prepared according to the procedure of Example 16). Solution-15 was stirred at 70-80 ° C for 2.5 hours, allowed to cool to 25 ° C with stirring, and stirring was continued for about 18 hours. The solvent was removed by rotary evaporator under reduced pressure (10 mm, 75 ° C). The solvent and excess hydrogen chloride were removed from the resulting clear oil by vacuum drying (0.1 mm, 45 ° C). The title product was obtained as 820 mg as a white solid (Rf = 0.46, solvent mixture 2), which was further characterized by 1 H-NMR (D 2 O, pD = 1.9, T = 90 ° C): 7.50 (d), 7.41 (d), 4.26: 25 (s), 3.43 - 3.68 (m), 3.0 - 3.3 (m); 13 C NMR D 2 O, pD = 1.9, T = 90 ° C): 176.7, 170.9, 139.8, 133.0, 131.2, 125.9, 57.5, 57.1, 55.4, 54.4, 52.7, 51.0, 50.6, 31.3; FAB mass spectrum (m / e): 466 ([M + H +] +), 488 ([M + Na *] +), 30510 (M + 2Na + - H +] +).

HPLC-analyysi osoitti pinta-alaan perustuvan puhtauden olevan yli 92 % (254 nm) 10 cm Partisil-5 OD53 RAC II -käänteisfaasikolonnia. Eluenttina oli 10 % asetonit-riiliä sisältävä 0,05 M kaliumfosfaattiliuos, pH 7,0.HPLC analysis showed area purity above 92% (254 nm) on a 10 cm Partisil-5 OD53 RAC II reverse phase column. The eluent was 0.05 M potassium phosphate solution, pH 7.0 containing 10% acetonitrile.

35 66 10489835 66 104898

Esimerkki 18 1- [2-(4-isotiosyanaattifenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon (SCN-EA-D03A) valmistus 5 1-[2 -(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon hydrokloridisuola (valmistettu esimerkin 17 mukaisella menettelytavalla; 106 mg, 0,21 mmol) liuotettiin 2 ml:aan vettä typpikaasu-kehän alla ja samalla sekoittaen. Lisättiin hitaasti nat-10 riumvetykarbonaattia (105,6 mg, 1,26 mmol) hiilidioksidin kehittymisestä aiheutuvan vaahtoamisen estämiseksi (tuloksena pH-arvo 8,0). Lisättiin tiofosgeenia (16,8 μΐ, 0,22 mmol), ja 1 tunnin voimakkaan sekoituksen jälkeen TLC-analyysi (20 % vettä asetonitriilissä) osoitti lähtö-15 aineen (Rf = 0,12) muuttuneen otsikon mukaiseksi tuotteeksi (Rf = 0,26). Liuotin poistettiin raakatuotteesta pyöröhaih-duttamalla, jolloin saatiin 130 mg otsikon mukaista tuotetta, joka sisälsi natriumkloridia. Tämän aineen infra-puna-analyysi (KBr-tabletti) vahvisti isotiosyanaattiryh-20 män läsnäolon (SCN = 2150 cm'1) .Example 18 Preparation of 1- [2- (4-Isothiocyanate-Phenyl) -ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid (SCN-EA-D03A) 5 1- [2- (4) -aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid hydrochloride salt (prepared according to the procedure of Example 17; 106 mg, 0.21 mmol) was dissolved in 2 ml of water under nitrogen gas and stirring. Sodium hydrogen carbonate (105.6 mg, 1.26 mmol) was slowly added to prevent foaming due to the evolution of carbon dioxide (resulting in a pH of 8.0). Thiophosgene (16.8 μΐ, 0.22 mmol) was added, and after 1 hour vigorous stirring, TLC analysis (20% water in acetonitrile) showed the starting material (Rf = 0.12) to be converted to the title product (Rf = 0, 26). The solvent was removed from the crude product by rotary evaporation to give 130 mg of the title product containing sodium chloride. Infrared analysis of this material (KBr tablet) confirmed the presence of the isothiocyanate group (SCN = 2150 cm -1).

Esimerkki 19 1-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon trietyyliesterin valmistus ; 25 5 ml:aan asetonitriililiuosta, joka sisälsi 395 mg (1,12 mmol) 1-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaania (valmistettu esimerkin G mukaisella menettelytavalla) 1,5 g (11 mmol) K2C03:a ja jota sekoitettiin, lisättiin yhdessä erässä 496 μΐ (4,5 mmol) etyyli-30 bromiasetaattia. Sen jälkeen kun seosta oli kuumennettu 68 °C:ssa N2-kaasukehän alla 1 tunti, tulokseksi saatu suspensio suodatettiin. Suodatuskakku pestiin CH3CN:llä (2 x 10 ml). Sen jälkeen suodos haihdutettiin, jolloin saatiin raakatuote viskoosina öljynä, jota trituroitiin dietyyli-35 eetterin (30 ml) kanssa ja joka haihdutettiin, jolloin 67 104898 saatiin 650 mg (saanto 100 %) 1-[2-(4-nitrofenyyli)etyy li] -1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani4,7,10-trietikkahapon trietyyliesteriä, joka karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 5 ^-NMR (CDC13) : 8,2 (d) , 7,6 (d) , 4,3 (q) , 2,6 - 3,8 (m), 1,55 (t); FAB-massaspektri: [M + H]+ = 588.Example 19 Preparation of 1- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-4,7,10-triacetic acid triethyl ester; 25 ml of a solution of acetonitrile containing 395 mg (1.12 mmol) of 1- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane (prepared according to the procedure of Example G) 1, 5 g (11 mmol) of K 2 CO 3 and stirred were added in one portion 496 μΐ (4.5 mmol) of ethyl 30 bromoacetate. After heating the mixture at 68 ° C under N 2 for 1 hour, the resulting suspension was filtered. The filter cake was washed with CH 3 CN (2 x 10 mL). The filtrate was then evaporated to give the crude product as a viscous oil which was triturated with diethyl 35 ether (30 mL) and evaporated to give 650 mg (100% yield) of 1- [2- (4-nitrophenyl) ethyl]. -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid triethyl ester which was characterized by the following data: 5 H-NMR (CDCl 3): 8.2 (d), 7.6 (d), 4, 3 (q), 2.6 - 3.8 (m), 1.55 (t); FAB Mass Spectrum: [M + H] + = 588.

Esimerkki 20 1-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsalo syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon valmistusExample 20 Preparation of 1- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazalo-cyclododecane-4,7,10-triacetic acid

Suspensioon, joka sisälsi 200 mg (0,35 mmol) 1-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani- 4,7,10-trietikkahapon trietyyliesteriä (valmistettu esimerkin 19 mukaisella menettelytavalla) 15 ml:ssa vettä, 15 lisättiin 59 μΐ NaOH:a (50-painoprosenttista, 3 ekv.). Seosta sekoitettiin 80 °C:ssa 6 tuntia. Syntynyt homogeeninen oranssi liuos jäähdytettiin sitten huoneen lämpötilaan ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin oranssia kiinteätä ainetta, joka puhdistettiin HPLCrn (Q-Sepharose™, 20 HPLC-systeemi III) avulla käyttämällä lineaarista 60 minuutin liuotingradienttia, jonka muodosti 0 - 10-%:inen HOAc:n vesiliuos, jolloin saatiin (50 %) hydrolysoitu tuote 1-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsasyklo-dodekaani-4,7,10-trietikkahappo, joka karakterisoitiin • 25 seuraavien tietojen perusteella: "H-NMR (D20) : 8,22 (d), 7,55 (d), 3,60 - 3,90 (m), 3,10 -3,40 (m).To a suspension of 200 mg (0.35 mmol) of 1- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid triethyl ester (prepared according to Example 19). procedure) in 15 mL of water, 59 μΐ NaOH (50 wt%, 3 equiv) was added. The mixture was stirred at 80 ° C for 6 hours. The resulting homogeneous orange solution was then cooled to room temperature and freeze-dried to give an orange solid which was purified by HPLC (Q-Sepharose ™, HPLC System III) using a linear 60 minute solvent gradient of 0 to 10% HOAc: aqueous solution to give (50%) the hydrolyzed product 1- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclo-dodecane-4,7,10-trietic acetic acid, which was characterized by: based on the following data: 1 H-NMR (D 2 O): 8.22 (d), 7.55 (d), 3.60 - 3.90 (m), 3.10 - 3.40 (m).

Esimerkki 21 1-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-30 syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon (EA-D03A) valmistusExample 21 Preparation of 1- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraaza-30-cyclododecane-4,7,10-triacetic acid (EA-D03A)

Parrin hydrauslaitteeseen laitettiin 50 ml vesiliuosta, joka sisälsi 214 mg (0,43 mmol) 1-[2-(4-nitrofenyyl-i)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trie-tikkahappoa (valmistettu esimerkin 20 mukaisella menette-35 lytavalla) ja 40 mg 10 % Pd/C -katalysaattoria. Suspensio- 68 104898 ta ravistettiin, kunnes vedyn kulutus lakkasi. Suodatuksen jälkeen vesiliuos kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 197 mg (98 %) 1-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-4,7,10-trietikkahappoa kellertävänruskeana 5 kiinteänä aineena, joka karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 1H-NMR (D20) : 7,35 (d) , 7,20 (d) , 3,10 - 3,70 (m); 13C-NMR (D20) : 173,85, 172,50, 137,90, 131,90, 130,22, 121,55, 56,25, 55,14, 54,42, 50,12, 49,65, 49,31, 31,00.50 ml of an aqueous solution of 214 mg (0.43 mmol) of 1- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10- trietic acetic acid (prepared by the procedure 35 of Example 20) and 40 mg of 10% Pd / C catalyst. The suspension was shaken until hydrogen consumption ceased. After filtration, the aqueous solution was lyophilized to give 197 mg (98%) of 1- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid as a tan solid. as a substance which was characterized by the following data: 1 H-NMR (D 2 O): 7.35 (d), 7.20 (d), 3.10-3.70 (m); 13 C NMR (D 2 O): 173.85, 172.50, 137.90, 131.90, 130.22, 121.55, 56.25, 55.14, 54.42, 50.12, 49.65 , 49.31, 31.00.

10 Esimerkki 22 1- (2-metoksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon 4,7,10-trimetyylies-terin valmistusExample 22 Preparation of 1- (2-methoxy-5-nitrobenzyl) -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-4,7,10-triacetic acid 4,7,10-trimethyl ester

Asetonitriililiuokseen (20 ml), joka sisälsi 1,0 g 15 (3 mmol) 1-(2-metoksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra- atsasyklododekaania (valmistettu esimerkin E mukaisella menettelytavalla), lisättiin yhdessä erässä 1,6 g (11 mmol) metyylibromiasetaattia. Tunnin kuluttua lisättiin kaliumkarbonaattia (0,3 g), ja sekoitusta jatkettiin 20 huoneen lämpötilassa 12 tuntia. Sen jälkeen reaktioseos suodatettiin ja suodos väkevöitiin (alipaineessa). Jäännös käsiteltiin kromatografisesti pylväässä (silikageeli, CH3CN-CH3OH-seos tilavuussuhteessa 9:1), jolloin saatiin haihdutuksen jälkeen triesteriä valkeana kiinteänä aineena - 25 68 %:n saannolla, ja se karakterisoitiin seuraavien tieto- jen perusteella: 1H-NMR (CDC13) : 8,19 (d) , 8,14 (s), 7,18 (d) , 2,58 - 3,99 (m) ; nC-NMR (CDC13) : 173,53, 172,83, 164,59, 142,28, 128,51, 30 127,69, 126,49, 112,30, 57,25, 56,90, 55,03, 54,21, 53,06, 52,09, 52,00, 51,54, 50,68, 50,30, 49,85, 49,63, 49,31, 49,00, 48,68, 48,37, 48,05, 47,70, 47,39.To a solution of acetonitrile (20 mL) containing 1.0 g of 15 (3 mmol) of 1- (2-methoxy-5-nitrobenzyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane (prepared according to the procedure of Example E) was added together batch 1.6 g (11 mmol) of methyl bromoacetate. After 1 hour, potassium carbonate (0.3 g) was added and stirring was continued at room temperature for 12 hours. The reaction mixture was then filtered and the filtrate concentrated (under reduced pressure). The residue was subjected to column chromatography (silica gel, CH 3 CN-CH 3 OH 9: 1 by volume) to give the triester as a white solid after evaporation in a 68% yield and characterized by 1 H-NMR (CDCl 3): 8.19 (d), 8.14 (s), 7.18 (d), 2.58 - 3.99 (m); 1 H NMR (CDCl 3): 173.53, 172.83, 164.59, 142.28, 128.51, 30 127.69, 126.49, 112.30, 57.25, 56.90, 55, 03, 54.21, 53.06, 52.09, 52.00, 51.54, 50.68, 50.30, 49.85, 49.63, 49.31, 49.00, 48.68, 48.37, 48.05, 47.70, 47.39.

Esimerkki 23 1- (2-metoksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-35 syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon valmistus 69 104898 6 M suolahappoon tehtyä liuosta (3 ml), joka sisälsi 0,25 g (0,45 mmol) 1-(2-metoksi-5-nitrobentsyyli)- 1.4.7.10- tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon 4.7.10- trimetyyliesteriä (valmistettu esimerkin 22 mukai-5 sella menettelytavalla) , sekoitettiin ja kuumennettiin 100 °C:ssa 24 tuntia. Huoneen lämpötilaan jäähdytyksen jälkeen lisättiin 5 ml vettä ja vesiliuos kylmäkuivattiin, jolloin saatiin kellertävänruskeaa kiinteätä ainetta. Pyl-väskromatografiakäsittelyn (silikageeli, liuotinseos 5) 10 trihappo eristettiin likaisenvalkoisena kiinteänä aineena (sp = 228 - 230 °C, hajoaa) 60 %:n saannolla ja karakterisoitiin tarkemmin seuraavien tietojen perusteella: XH-NMR (D20) : 8,18 (s), 8,09 (s), 7,12 (d) , 3,87 (s), 2,10 - 3,60 (m); 15 13C-NMR (D20) : 180,45, 179,80, 163,66, 140,22, 128,60, 126,24, 122,66, 111,50, 59,91, 59,06, 56,44, 52,75, 50,92, 48,84.Example 23 Preparation of 1- (2-methoxy-5-nitrobenzyl) -1,4,7,10-tetraaza-35-cyclododecane-4,7,10-triacetic acid 69 104898 in 6 M hydrochloric acid solution (3 ml) which containing 0.25 g (0.45 mmol) of 1- (2-methoxy-5-nitrobenzyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid 4.7.10-trimethyl ester (prepared according to Example 22). procedure), stirred and heated at 100 ° C for 24 hours. After cooling to room temperature, 5 mL of water was added and the aqueous solution was lyophilized to give a tan solid. Tri-acid from Pyl HPLC (silica gel, solvent mixture 5) was isolated as an off-white solid (m.p. 228-230 ° C, dec.) In 60% yield and further characterized by the following data: 1 H-NMR (D 2 O): 8.18 (s) ), 8.09 (s), 7.12 (d), 3.87 (s), 2.10 - 3.60 (m); 13 C-NMR (D 2 O): 180.45, 179.80, 163.66, 140.22, 128.60, 126.24, 122.66, 111.50, 59.91, 59.06, 56, 44, 52.75, 50.92, 48.84.

Esimerkki 24 1- (2-metoksi-5-aminobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-20 syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon valmistusExample 24 Preparation of 1- (2-methoxy-5-aminobenzyl) -1,4,7,10-tetraaza-20-cyclododecane-4,7,10-triacetic acid

Typellä huuhdottuun vesiliuokseen (50 ml), joka sisälsi 50 mg Pt02:a, lisättiin 50 mg 1-(2-metoksi-5-nitro-bentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-tri-etikkahappoa (valmistettu esimerkin 23 mukaisella menette-; ' 25 lytavalla). Sen jälkeen kun liuosta oli hydrattu Parrin pommissa 1 tunti, se suodatettiin ja vesisuodos kylmäkuivattiin, jolloin saatiin aniliinijohdannainen kellertävänruskeana kiinteänä aineena (saanto 95 %), sp. >240 °C (hajoaa) , ja se karakterisoitiin tarkemmin seuraavien tieto-30 jen perusteella: ^H-NMR (D20) : 7,54 (leveä s) , 7,21 (d) , 7,09 (d) , 7,05 (s), 6,88 (s), 3,84 (s), 3,78 (s), 2,85 - 3,56 (m) ; 13C-NMR (D20) : 180,59, 179,77, 153,38, 124,16, 124,03, 122,82, 120,18, 113,68, 112,43, 59,06, 57,02, 55,96, 35 53,67, 50,52, 50,08, 49,70, 49,04, 48,32.To a nitrogen-purged aqueous solution (50 mL) containing 50 mg of PtO 2 was added 50 mg of 1- (2-methoxy-5-nitrobenzyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10 -tri-acetic acid (prepared by the procedure of Example 23). After being hydrogenated in a Parr bomb for 1 hour, the solution was filtered and the aqueous filtrate freeze-dried to give the aniline derivative as a tan solid (95% yield), m.p. > 240 ° C (dec), and further characterized by the following data: 1 H-NMR (D 2 O): 7.54 (broad s), 7.21 (d), 7.09 (d), 7 , 05 (s), 6.88 (s), 3.84 (s), 3.78 (s), 2.85 - 3.56 (m); 13 C NMR (D 2 O): 180.59, 179.77, 153.38, 124.16, 124.03, 122.82, 120.18, 113.68, 112.43, 59.06, 57.02 , 55.96, 35 53.67, 50.52, 50.08, 49.70, 49.04, 48.32.

70 10489870 104898

Esimerkki 25 1-(2-hydroksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon valmistusExample 25 Preparation of 1- (2-hydroxy-5-nitrobenzyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid

Vesiliuokseen (1 ml) , joka sisälsi 1-(2-hydroksi-5-5 nitrobentsyyli)-1,4,7,10 -1etra - atsasyklododekaania (200 mg, 0,62 mmol; valmistettu esimerkin F mukaisella menettelytavalla), lisättiin bromietikkahappoa (309 mg, 2,2 mmol) ja NaOH:a (2,5 ml, noin 1 M) sekoittaen liuosta samalla huoneen lämpötilassa. Reaktion etenemistä seurat-10 tiin LC:n avulla (anionivaihto, Q-Sepharose™) , ja pH pidettiin suunnilleen arvossa 8 lisäämällä tarpeen mukaan NaOH:a. 12 tunnin kuluttua liuos kylmäkuivattiin ja kiinteä jäännös käsiteltiin kromatografisesti (pylväs) silika-geelillä käyttäen eluointiin liuotinseosta 5. Keltainen 15 pääjae väkevöitiin, liuotettiin veteen ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin haluttua tuotetta kirkkaankeltaisena jauheena (150 mg, 49 %), sp = 230 - 235 °C (hajoaa) , ja se karakterisoitiin tarkemmin seuraavien tietojen perusteella : 20 13C-NMR (D20) : 166,41, 165,60, 160,00, 119,91, 116,02, 113,85, 111,71, 104,59, 45,20, 44,50, 43,96, 36,43.To an aqueous solution (1 mL) of 1- (2-hydroxy-5-5 nitrobenzyl) -1,4,7,10 -1-tetraazacyclododecane (200 mg, 0.62 mmol; prepared according to the procedure of Example F) was added bromoacetic acid. (309 mg, 2.2 mmol) and NaOH (2.5 mL, about 1 M) while stirring the solution at room temperature. The progress of the reaction was monitored by LC (anion exchange, Q-Sepharose ™), and the pH was maintained at approximately 8 by the addition of NaOH as needed. After 12 hours, the solution was lyophilized and the solid residue was chromatographed (column) on silica gel eluting with solvent mixture 5. The yellow major fraction was concentrated, dissolved in water and freeze-dried to give the desired product as a bright yellow powder (150 mg, 49%); ° C (decomposes) and was further characterized by the following data: 13 C NMR (D 2 O): 166.41, 165.60, 160.00, 119.91, 116.02, 113.85, 111.71, 104.59, 45.20, 44.50, 43.96, 36.43.

Esimerkki 26 1- (2-hydroksi- 5 -aminobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon valmistus : 25 Argonilla huuhdottuun vesiliuokseen (25 ml) , joka sisälsi N-(2-hydroksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahappoa (200 mg, 0,4 mmol; valmistettu esimerkin 25 mukaisella menettelytavalla), lisättiin Pt02: a (130 mg) ja johdettiin sen jäl-30 keen H2:ä (Parrin hydrauslaite). Sen jälkeen kun keltainen väri oli hävinnyt kokonaan, liuos huuhdottiin argonilla ja suodatettiin. Sen jälkeen vesiliuos kylmäkuivattiin, jolloin saatiin haluttu tuote kellertävänruskeana kiinteänä aineena (146 mg, 78 %).Example 26 Preparation of 1- (2-hydroxy-5-aminobenzyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid: In an aqueous solution (25 ml) purged with argon, containing N- (2) -hydroxy-5-nitrobenzyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid (200 mg, 0.4 mmol; prepared by the procedure of Example 25), PtO 2 (130 mg) was added ) and subsequently passed with H2 (Parr hydrogenation device). After the yellow color had completely disappeared, the solution was purged with argon and filtered. The aqueous solution was then freeze-dried to give the desired product as a tan solid (146 mg, 78%).

35 71 10489835 71 104898

Esimerkki 27 α-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1-(R,S)-etikka-4,7,10-tris(R-metyylietikka) hapon 2-isopropyyli-4,7,10-trimetyyliesterin (PN-DOTMA-5 trimetyyli-isopropyyliesterin) valmistusExample 27 α- [2- (4-Nitrophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-1- (R, S) -acetic acid-4,7,10-tris (R-methyl-ethyl) ) Preparation of 2-isopropyl-4,7,10-trimethyl ester of acid (PN-DOTMA-5 trimethyl isopropyl ester)

Liuokseen, joka sisälsi 1,00 g (2,37 mmol) a-[3-(4-nitrofenyyli)propyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1-etikkahapon 1-metyyliesteriä (valmistettu esimerkin P mukaisella menettelytavalla) 35 mlrssa kuivaa asetonitrii-10 liä, lisättiin 1,15 g (8,32 mmol) vedetöntä kaliumkarbonaattia samalla voimakkaasti typen alla sekoittaen. Lisättiin optisesti aktiivista maitohapon metyyliesterin bent-seenisulfonaattia (1,79 g, 7,36 mmol, S:R = 98,2), ja seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 60 tuntia. TLC-15 analyysi osoitti uusien tuotteiden muodostuneen (otsikon mukaisten tetraestereiden Rf = 0,71, liuotinsysteemi 2, ja triestereiden Rf = 0,89). Tulokseksi saatu liuos, joka sisälsi suspendoituneita karbonaattisuoloja, kaadettiin 40 ml:aan kloroformia ja saostuneet epäorgaaniset suolat 20 suodatettiin pois. Tästä suodoksesta poistettiin liuotin, ja puhdistamaton oranssi öljy käsiteltiin kahdesti kroma-tografisesti flash-silikageelipylväässä, jonka koko oli 2,5 cm x 41 cm, käyttäen eluenttina liuotinseosta 2, jolloin saatiin otsikon mukaista tuotetta erottamattomien ; 25 tetraesteridiastereomeerien seoksena (1,00 g, 1,47 mmol, saanto 62 %), joka ei sisältänyt alialkyloituneita tuotteita .A solution of 1.00 g (2.37 mmol) of α- [3- (4-nitrophenyl) propyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1-acetic acid 1-methyl ester (prepared according to Example P) procedure) in 35 mL of dry acetonitrile-10, 1.15 g (8.32 mmol) of anhydrous potassium carbonate was added while stirring vigorously under nitrogen. Optically active benzene sulfonate of the lactic acid methyl ester (1.79 g, 7.36 mmol, S: R = 98.2) was added and the mixture was stirred at room temperature for 60 hours. Analysis by TLC-15 showed the formation of new products (Rf = 0.71 for the title tetraesters, solvent system 2, and Rf = 0.89 for the triesters). The resulting solution containing the suspended carbonate salts was poured into 40 ml of chloroform and the precipitated inorganic salts were filtered off. Solvent was removed from this filtrate and the crude orange oil was chromatographed twice on a 2.5 cm x 41 cm flash silica gel column using solvent mixture 2 as the eluent to afford the title product as a whole; 25 (1.00 g, 1.47 mmol, 62% yield) which did not contain the alkylated products.

Tämän aineen ^-NMR-analyysi osoitti sen sisältävän noin 0,5 ekvivalenttia reagoimatonta bentseenisulfonaatti-30 johdannaista. Tämän aineen NMR-spektrit eivät sulautuneet ·· yhteen 6 0 °C:ssa kloroformissa: Ή-NMR (CDC13, 60 °C) : 7,9 - 8,1 (m, 2 H), 7,2 - 7,4 (m, 2 H), 5,06 (m, 1 H), 3,4 - 4,0 (m, 9 H), 1,7 - 3,4 (m, 20 H), 1,0-1,7 (m, 15 H); 72 104898 IR (CDClj, cm'1) : 2980, 2840, 1725, 1710 (esterikarbonyyli) , 1590, 1510, 1440 , 1340; FAB-massaspektri (m/e) : 702 ( [M + Na+]+) , 687.1 H NMR analysis of this material showed it to contain about 0.5 equivalents of unreacted benzenesulfonate-30 derivative. The NMR spectra of this material did not merge ··· at 6 ° C in chloroform: Ή NMR (CDCl 3, 60 ° C): 7.9 - 8.1 (m, 2H), 7.2 - 7.4 (m, 2H), 5.06 (m, 1H), 3.4-4.0 (m, 9H), 1.7-3.4 (m, 20H), 1.0-1. , 7 (m, 15H); 72 104898 IR (CDCl 3, cm -1): 2980, 2840, 1725, 1710 (estercarbonyl), 1590, 1510, 1440, 1340; FAB mass spectrum (m / e): 702 ([M + Na +] +), 687.

Esimerkki 28 5 a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-1-(R,S)-etikka-4,7,10-tris(R-metyylietik-ka) hapon 2-isopropyyli-4,7,10-trimetyyliesterin (PA-DOTMA-trimetyyli-isopropyyliesterin) valmistus a-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-10 syklododekaani-1-(R,S)-etikka-4,7,10-tris(R-metyylietik ka) hapon 2-isopropyyli-4,7,10-trimetyyliesteri (950 mg, 1,40 mmol, korjaamatta) (valmistettu esimerkin 27 mukaisella menettelytavalla), joka sisälsi reagoimatonta a-[3-(4-nitrofenyyli)propyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-15 ni-l-etikkahapon 1-metyyliesteriä, liuotettiin 10 ml:aan metanolin 30-%:ista vesiliuosta, joka sisälsi 1,00 g 10 % Pd/C -katalysaattoria typpikaasukehän alla. Liuoksen läpi johdettiin ylimäärin vetyä 7 tunnin ajan. Tässä vaiheessa TLC-tutkimus osoitti voimakkaasti ninhydriinipositiivisen 20 aineen muodostuneen (Rf = 0,62, liuotinseos 2, lähtöaineen Rf = 0,71). Metanolia sisältävä katalysaattoriliete suodatettiin piimään läpi, ja haihdutettaessa liuotin saatiin 800 mg puhdistamatonta otsikon mukaista tuotetta kirkkaana öljynä, joka sisälsi bentseenisulfonaattiesterin samanai-' 2 5 kaisen hydrogenolyysin seurauksena muodostunutta bentsee- nisulfonihappoa (Rf = 0,09, liuotinseos 2). Epäpuhdas öljy käsiteltiin kromatografisesti flash-silikageelipylväässä, jonka koko oli 2,5 cm x 20 cm, käyttäen eluenttina 10 % metanolia sisältävää kloroformia, joka eluoi huokostilaan 30 vaaleankeltaisen vyöhykkeen. Sen jälkeen käytettiin liuo-tinseosta 2 otsikon mukaisen tuotteen (480 mg) eluointiin 52 %:n saannolla erottamattomien diastereomeerien ja geometristen isomeerien seoksena. 1H-NMR-spektrin aromaattisella alueella havaittiin kolme eri AB-kvartettia: 73 104898 lH-NMR (CDCI3, 30 °C) : 6,63 - 8,0 (kvartetit, 4 H) , 5,07 (tn, 1 H, isopropyylin metiini-H) , 3,53 - 3,9 (m, 13 H, neljä singlettiä kohdissa 3,85, 3,73, 3,69 ja 3,56), 3,46 (m, 1 H), 3,25 (leveä t, 3 H) , 2 - 3,1 (m, 14 H) , 1,0 - 5 2,0 (m, 15 H) ; 13C-NMR (CDCI3, 30 °C) : 177,3, 177, 176,4, 176,2, 175,9, 174,3, 172,9, 170,6, 145,3, 144,9, 130,8, 129,7, 129,3, 129,1, 128,8, 128,4, 127,5, 126,3, 115,2, 115,1, 114,9, 69,0, 68,4, 67,3, 61,6, 57,8, 57,4, 56,7, 56,5, 56,4, 10 52,9, 52,7, 52,1, 50,8, 50,7, 50,6, 47,3, 47,1, 47,0, 46.9, 46,5, 46,3, 44,8, 44,5, 44,3, 34,1, 32,9, 32,5, 32,2, 31,8, 24,8, 22,2, 22,1, 22,0, 21,8, 21,6, 15,8, 14.9, 7,7, 7,5, 7,4, 7,1; IR (CDC13, cm'1) : 2960, 2840, 1720, 1510, 1450, 1375; 15 FAB-massaspektri (m/e) : 672 ([M + Na*]+), 686.Example 28 5α- [2- (4-Aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-1- (R, S) -acetic acid-4,7,10-tris (R- Preparation of methyl acetic acid 2-isopropyl-4,7,10-trimethyl ester (PA-DOTMA-trimethyl isopropyl ester) α- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraaza -10-cyclododecane-1- (R, S) -acetic acid-4,7,10-tris (R-methylacetic) acid 2-isopropyl-4,7,10-trimethyl ester (950 mg, 1.40 mmol, uncorrected) (prepared by the procedure of Example 27) containing unreacted 1-methyl ester of α- [3- (4-nitrophenyl) propyl] -1,4,7,10-tetraazacacyclododecane-15-n-1-acetic acid was dissolved in 10 ml: 30% aqueous methanol containing 1.00 g of 10% Pd / C catalyst under a nitrogen atmosphere. Excess hydrogen was bubbled through the solution for 7 hours. At this point, TLC showed strongly formation of ninhydrin positive (Rf = 0.62, solvent mixture 2, starting material Rf = 0.71). The methanol-containing catalyst slurry was filtered through diatomaceous earth and evaporated to give 800 mg of the crude title product as a clear oil containing benzenesulfonic acid (Rf = 0.09) as a result of similar hydrogenolysis of the benzenesulfonate ester (Rf = 0.09). The crude oil was chromatographed on a 2.5 cm x 20 cm flash silica gel column using 10% methanol in chloroform as eluent to elute a 30-yellow pale yellow band in the pore space. Solvent mixture 2 was then used to elute the title product (480 mg) in 52% yield as a mixture of non-separated diastereomers and geometric isomers. In the aromatic region of the 1 H-NMR spectrum, three different AB quartets were observed: 73 104898 1 H-NMR (CDCl 3, 30 ° C): 6.63-8.0 (quartets, 4 H), 5.07 (tn, 1H, isopropyl methine-H), 3.53 - 3.9 (m, 13H, four singlets at 3.85, 3.73, 3.69 and 3.56), 3.46 (m, 1H), 3 , 25 (broad t, 3H), 2 to 3.1 (m, 14H), 1.0 to 2.0 (m, 15H); 13 C NMR (CDCl 3, 30 ° C): 177.3, 177, 176.4, 176.2, 175.9, 174.3, 172.9, 170.6, 145.3, 144.9, 130 , 8, 129.7, 129.3, 129.1, 128.8, 128.4, 127.5, 126.3, 115.2, 115.1, 114.9, 69.0, 68.4 , 67.3, 61.6, 57.8, 57.4, 56.7, 56.5, 56.4, 10, 52.9, 52.7, 52.1, 50.8, 50.7, 50.6, 47.3, 47.1, 47.0, 46.9, 46.5, 46.3, 44.8, 44.5, 44.3, 34.1, 32.9, 32.5, 32.2, 31.8, 24.8, 22.2, 22.1, 22.0, 21.8, 21.6, 15.8, 14.9, 7.7, 7.5, 7.4, 7.1; IR (CDCl 3, cm -1): 2960, 2840, 1720, 1510, 1450, 1375; FAB mass spectrum (m / e): 672 ([M + Na *] +), 686.

Esimerkki 29 a-(2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1-(R,S)-etikka-4,7,10-tris(R-metyylietikka) hapon (PADOTMA) valmistus 20 a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-1-(R,S)-etikka-4,7,10-tris(R-metyylietik-ka) hapon 2-isopropyyli-4,7,10-trimetyyliesterin diastereo-meerien seos (400 mg, 0,59 mmol; valmistettu esimerkin 28 mukaisella menettelytavalla) liuotettiin 50 ml:aan väkevää y ' 25 (6 N) suolahappoa, ja liuosta refluksoitiin 30 tuntia.Example 29 α- (2- (4-Aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-1- (R, S) -acetic acid-4,7,10-tris (R-methylacetic acid) ) acid (PADOTMA) Preparation of 20α- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1- (R, S) -acetic acid-4,7,10- A mixture of diastereomers of 2-isopropyl-4,7,10-trimethyl ester of tris (R-methylacetic acid) (400 mg, 0.59 mmol; prepared according to the procedure of Example 28) was dissolved in 50 ml of concentrated N) hydrochloric acid, and the solution was refluxed for 30 hours.

TLC-analyysi (liuotinseos 1) osoitti esterin (Rf = 0,98, liuotinseos 1) muuttuneen kahdeksi uudeksi täpläksi (nopeammin liikkuvan diastereomeerin Rf = 0,6 ja hitaammin liikkuvan Rf = 0,54, liuotinseos 1, molemmat täplät UV-, 30 ninhydriini- ja jodipositiivisia). Ylimääräinen liuotin .. poistettiin pyöröhaihduttimellä, ja kuivauksen jälkeen saatiin otsikon mukaisen tuotteen puhdistamattomien dia-stereomeerien seos (403 mg) hydrokloridisuolana. Otsikon mukaisen tuotteen kahden diastereomeerin preparatiivinen 35 erotus tehtiin siirtämällä 290 mg (0,51 mmol) raakasuolaa 74 104898 flash-silikageelikromatografiapylvääseen, jonka koko oli 1 cm x 13 cm ja joka eluoitiin liuotinseoksella 8. Suuremman Rf-arvon omaava diastereomeeri (119 mg, 0,21 mmol) saatiin puhtaammassa muodossa kuin diastereomeeri (90 mg, 5 0,16 mmol), jonka Rf-arvo oli pienempi, koska suuremmanTLC analysis (solvent mixture 1) showed that the ester (Rf = 0.98, solvent mixture 1) was transformed into two new spots (faster moving diastereomer Rf = 0.6 and slower moving Rf = 0.54, solvent mixture 1, both spots UV, ninhydrin and iodine positive). Excess solvent was removed on a rotary evaporator, and after drying, a mixture of crude diastereomers of the title product (403 mg) as the hydrochloride salt was obtained. Preparative separation of the two diastereomers of the title product was accomplished by transferring 290 mg (0.51 mmol) of the crude salt onto a 74 104898 flash silica gel chromatography column, 1 cm x 13 cm, eluting with solvent 8. Higher Rf diastereomer (119 mg, 0 , 21 mmol) was obtained in a purer form than the diastereomer (90 mg, δ 0.16 mmol) with a lower R

Rf-arvon omaava diastereomeeri eluoitui pylväästä ensin. Sen diastereomeerin XH-NMR-spektri, jolla oli suurempi Rf: ^H-NMR (DjO, 90 °C, pD = 7,5): 7,12 (d, 2 H), 6,80 (d, 2 H), 3,66 (m, 1 H), 3,57 (leveä t, 3 H), 2 - 3,4 (m, 19 10 H), 1,89 (m, 1 H), 1,37 (m, 1 H), 1,15 (d, 3 H), 1,10 (d, 3 H), 1,06 (d, 3 H); 13C-NMR (D20, 90C, pD = 7,5): 184,4, 184,2, 184,0, 183,3, 135,9, 132,6, 131,7, 119,1, 78,2, 69,0, 61,7, 61,5, 61,1, 57,4, 54,1, 49,7, 49,6, 48,2, 47,7, 47,2, 34,8, 33,8, 9,6, 15 9,1, 9,0; FAB-massaspektri (m/e): 566 ([M + H"] ") , 588 ((M + Na+]+), 604 ([M + K+]+), 626 ( [M + K* + Na+ - H*] +) , 642 ([M + 2K+ -H*n.The Rf-diastereomer first eluted from the column. 1 H NMR spectrum of diastereomer with higher R f: 1 H NMR (D 20, 90 ° C, pD = 7.5): 7.12 (d, 2H), 6.80 (d, 2H) , 3.66 (m, 1H), 3.57 (broad t, 3H), 2-3.4 (m, 19-10H), 1.89 (m, 1H), 1.37 (m , 1H), 1.15 (d, 3H), 1.10 (d, 3H), 1.06 (d, 3H); 13 C NMR (D 2 O, 90 C, pD = 7.5): 184.4, 184.2, 184.0, 183.3, 135.9, 132.6, 131.7, 119.1, 78.2 , 69.0, 61.7, 61.5, 61.1, 57.4, 54.1, 49.7, 49.6, 48.2, 47.7, 47.2, 34.8, 33 , 8, 9.6, 15 9.1, 9.0; FAB Mass Spectrum (m / e): 566 ([M + H +] +), 588 ((M + Na +] +), 604 ([M + K +] +), 626 ([M + K * + Na + -). H *] +), 642 ([M + 2K + -H * n.

Lopputuotteiden, kompleksien, valmistus 20 Metalli-ligandikompleksit valmistettiin erilaisin, alla esitetyin menetelmin. Menetelmät käsittivät metallin ja ligandin sekoittamisen vesiliuoksessa ja pH:n säätämisen haluttuun arvoon. Kompleksien muodostus toteutettiin liuoksissa, jotka sisälsivät suoloja ja/tai puskureita : 25 sekä vettä. Joskus kuumennettujen liuosten havaittiin an- tavan parempia saantoa kuin muodostettaessa kompleksi ympäristön lämpötilassa. Myös BFC:n valmistuksessa käytetyn tuotteeneristys- ja -puhdistusmenettelyn on osoitettu vaikuttavan kompleksin muodostukseen.Preparation of the final products, complexes Metal ligand complexes were prepared by various methods as described below. The methods involved mixing the metal and ligand in an aqueous solution and adjusting the pH to the desired value. The complexing was carried out in solutions containing salts and / or buffers: 25 and water. At times, heated solutions were found to give better yields than complexing at ambient temperature. The product isolation and purification procedure used in the manufacture of BFC has also been shown to influence complex formation.

30 Esimerkki 30 a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon ammoniumsuolan samarium (III) -kompleksin [Sm(BA-DOTA)] valmistusExample 30 Preparation of the samarium (III) complex [Sm (BA-DOTA)] of the ammonium salt of α- (4-aminophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid [Sm (BA-DOTA)]

Pieni erä (53 mg, 0,094 mmol) a-(4-aminofenyyli)-35 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-1etraet ikkahap- 75 104898 poa (valmistettu esimerkin 3 mukaisella menettelytavalla) liuotettiin 100 μ1:ΆΆΏ. vettä ja käsiteltiin 3 ml :11a 0,043 M Sm (OAc) 3-liuosta (48,8 mg, 0,128 mmol) pHrssa 6-7. Tätä liuosta kuumennettiin 100 °C:ssa ja määritet-5 tiin kompleksinmuodostumisaste anioninvaihto-HPLC:llä. Kun kompleksin muodostuminen oli täydellistä anionivaihtokro-matografian mukaan (HPLC-systeemi III), liuos jäähdytettiin huoneen lämpötilaan (noin 25 °C) ja kylmäkuivattiin. Samariumkompleksi puhdistettiin silikageelikromatografiän 10 avulla (eluenttina liuotinseos 1). Tämä menettelytapa antoi tulokseksi otsikon mukaista tuotetta 82 %:n saannolla. Tämä kompleksi karakterisoitiin TLC:n, FAB-massaspektro-metrian ja anioninvaihto-HPLC:n avulla sekä lisäksi seu-raavien tietojen perusteella: 15 1H-NMR (Da0) : 8,94, 7,81, 7,21, 6,97, 6,80, 5,63, 5,01, 4,58, 4,01, 3,56, 1,78, 1,53, 1,24, 1,10, 0,77, -2,80, -2,95, -3,21, -3,91; 13C-NMR (Da0) : 190,3, 184,9, 181,4, 146,8, 134,3, 122,7, 116,4, 80,8, 72,6, 64,2, 57,2, 55,8, 54,7, 53,4, 51,5, 20 49,7, 45,5, 43,5, 23,6.A small portion (53 mg, 0.094 mmol) of α- (4-aminophenyl) -35 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid 75 104898 poa (prepared according to the procedure of Example 3) ) was dissolved in 100 μl. water and treated with 3 mL of 0.043 M Sm (OAc) 3 solution (48.8 mg, 0.128 mmol) at pH 6-7. This solution was heated at 100 ° C and the degree of complexation was determined by anion exchange HPLC. When the complex formation was complete according to anion exchange chromatography (HPLC system III), the solution was cooled to room temperature (about 25 ° C) and lyophilized. The samarium complex was purified by silica gel chromatography (solvent mixture 1 as eluent). This procedure yielded the title product in 82% yield. This complex was characterized by TLC, FAB mass spectrometry and anion exchange HPLC and further by the following data: 1 H-NMR (Da 0): 8.94, 7.81, 7.21, 6.97 , 6.80, 5.63, 5.01, 4.58, 4.01, 3.56, 1.78, 1.53, 1.24, 1.10, 0.77, -2.80, -2.95, -3.21, -3.91; 13 C NMR (D 6): 190.3, 184.9, 181.4, 146.8, 134.3, 122.7, 116.4, 80.8, 72.6, 64.2, 57.2 , 55.8, 54.7, 53.4, 51.5, 20 49.7, 45.5, 43.5, 23.6.

FAB-massaspektri: [M + H+]+ = 645 (Sm-isotooppimalli). Esimerkki 31 a- (4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium(III)kompleksin val-; 25 mistusFAB mass spectrum: [M + H +] + = 645 (Sm isotope model). Example 31 The samarium (III) complex of α- (4-aminophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid; 25 mists

Valmistettiin liuos, joka sisälsi 150 μΐ Sm-153:a (3 x 10'4 mol/1 0,1 N HCl:ssa) ja 600 μΐ SmCl3:a (3 x 10'4 mol/1 0,1 N HCl:ssa), lisäämällä Sm-153-liuos SmCl3-liuokseen. Sitten lisättiin 5,0 μΐ 2,0 M NaOAc:a ja 30 sen jälkeen 45 μΐ 50 mM ligandin (valmistettu esimerkin 3 mukaisella menettelytavalla) HEPES-puskuriliuosta. Liuokseen pH säädettiin 275 μ1:1ΐ3 0,5 M HEPES:ää arvoon 7. Tämä liuos jaettiin kahteen 500 μ1:η suuruiseen osaan, ja toista osaa kuumennettiin 1 tunti 100 °C:ssa.A solution of 150 μΐ Sm-153 (3 x 10'4 mol / l in 0.1 N HCl) and 600 μΐ SmCl3 (3 x 10'4 mol / l in 0.1 N HCl) was prepared: ) by adding the Sm-153 solution to the SmCl3 solution. Then 5.0 μΐ of 2.0 M NaOAc was added followed by 45 μΐ of 50 mM ligand (prepared according to the procedure of Example 3) in HEPES buffer solution. The pH of the solution was adjusted to 275 μ1: 1ΐ3 0.5 M HEPES to 7. This solution was divided into two portions of 500 μ1: η and the other was heated for 1 hour at 100 ° C.

76 10485876 104858

Liuokset laskettiin SP-Sephadex™-kationinvaihto-hartsin läpi. Kompleksoituneen metallin prosenttiosuus määritettiin aikaisemmin kuvattua menettelytapaa käyttäen. Tulokset osoittavat, että 99,6 % metallista oli kompleksi-5 na kuumennetun näytteen tapauksessa ja 96,6 % kuumentamattoman näytteen tapauksessa.The solutions were passed through a SP-Sephadex ™ cation exchange resin. The percentage of complexed metal was determined using the procedure described previously. The results show that 99.6% of the metal was complex 5 in the case of the heated sample and 96.6% in the case of the unheated sample.

Kelaattien pH-stabiilisuusPH stability of chelates

Metalli-ligandikompleksien stabiilisuus mitattiin asettamalla ne alttiiksi erilaisille pH-arvoille ja analy-10 soimalla kompleksi liuoksesta. Matalassa pH:ssa ligandin protonoituminen voi aiheuttaa metallin vapautumisen. Korkeassa pH:ssa metallihydroksidit kilpailevat kelaatin muodostumisen kanssa. Niinpä inerttejä kelaatteja etsittäessä toivottu inertti kelaatti säilyy siis kelaattina sekä kor-15 keassa että matalassa pH:ssa.The stability of the metal-ligand complexes was measured by exposing them to various pH values and analyzing the complex from solution. At low pH, protonation of the ligand can cause metal release. At high pH, metal hydroxides compete with chelation. Thus, when searching for inert chelates, the desired inert chelate is thus retained as a chelate at both high and low pH.

Eräiden keksinnön mukaisesti saatavien kelaattien inerttiysprofiilit muodostettiin seuraavissa esimerkeissä kuvattuja menetelmiä käyttäen. Joissakin tapauksissa kela-toitumaton metalli poistettiin laskemalla liuos kationin-20 vaihtohartsin läpi. Kompleksiliuosten pH: n säätämiseen noin arvosta 1 suunnilleen arvoon 14 käytettiin laimeita natriumhydroksidi- ja suolahappoliuoksia. Kompleksina säilyneen metallin prosenttiosuus määritettiin sitten aikaisemmin kuvatuin menetelmin.The inertia profiles of some of the chelates obtainable according to the invention were formed using the methods described in the following examples. In some cases, the non-chelated metal was removed by passing the solution through a cation-20 exchange resin. Dilute sodium hydroxide and hydrochloric acid solutions were used to adjust the pH of the complex solutions from about 1 to about 14. The percentage of metal retained in the complex was then determined by the methods previously described.

: 25 Samalla tavalla valmistettiin useita bifunktionaa- lisiä kelaattikonjugaatteja, ja ne asetettiin alttiiksi pH:lie 2,8, 4,0 ja 6,0. Liuoksessa säilyneen konjugaatin määrä määritettiin HPLC:llä säteilynmittausdetektoria käyttäen. Tulokset on esitetty biologisessa osassa esimer-30 kissä XX.: 25 In a similar manner, several bifunctional chelate conjugates were prepared and exposed to pH 2.8, 4.0 and 6.0. The amount of conjugate remaining in solution was determined by HPLC using a radiation measuring detector. The results are shown in the biological section in Example 30 cat XX.

·· Esimerkki 32 a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium (III)kompleksin pH-stabiilisuus 104898 77·· Example 32 pH-stability of the samarium (III) complex of α- (4-aminophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid 104898 77

Esimerkistä 30 peräisin olevat kuumennettu ja kuumentamaton näyte jaettiin kumpikin kahteen yhtä suureen osaan, joiden koko oli 250 μΐ. Toisen 250 μ1:η erän pH säädettiin HClrlla seuraavassa taulukossa esitettyihin 5 arvoihin. Toisen 250 μ1:η erän pH säädettiin mikrolitra-luokkaa olevilla määrillä NaOH:ta haluttuihin arvoihin. Kun haluttu pH saavutettiin, otettiin 25 μ1:η näyte ja siitä määritettiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuvatulla tavalla. Tulokset olivat seulo raavat:The heated and unheated sample from Example 30 was each divided into two equal portions of 250 μΐ. The pH of the second batch of 250 μ1: η was adjusted with HCl to the values shown in the following table. The pH of the second batch of 250 μ1: η was adjusted to the desired values with microliter volumes of NaOH. When the desired pH was reached, a 25 μ1: η sample was taken and the percentage of the complexed metal determined as described previously. The results were a screening drab:

Kompleksina % pH .Ruumen- Kuumen nettu tamaton 15 _______- Ί . 98,9 92,7 3__99 T 6 93f 3 5__99 T 6 92,9 7 99,6 95.7 20 9__99f 9 95 T 8 n__99,6 95,7 13__99,6 9H,5 . 25 Nämä tulokset osoittavat tämän näytteen stabiili- suuden, kuumennettiin sitä sitten tai ei, testaus-pH:sta riippumatta.Complex% pH .Body- Heated uncommon 15 _______- Ί. 98.9 92.7 3__99 T 6 93f 3 5__99 T 6 92.9 7 99.6 95.7 20 9__99f 9 95 T 8 n__99.6 95.7 13__99.6 9H, 5. These results show the stability of this sample, whether heated or not, regardless of the test pH.

Esimerkki 33 a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-30 ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon yttrium(III)kompleksin val mistus 10 pl:aan liuosta, joka sisälsi 1,4 mg a-(4-amino-fenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l, 4,7,10-tetra-etikkahappoa/100 μΐ (valmistettu esimerkin 3 mukaisella 35 menettelytavalla), lisättiin 100 μΐ Y(OAc)3:a (0,003 M), 7β 104898 johon oli lisätty Y-90.-ää. Tähän liuokseen lisättin 500 μΐ vettä ja sen jälkeen 125 μΐ NaOAcra (0,5 M). Liuokseen lisättiin vettä (265 μΐ) sen kokonaistilavuuden saamiseksi 1 ml:ksi. Tämä liuos jaettiin kahteen yhtä suureen osaan.Example 33 Preparation of a Yttrium (III) Complex of α- (4-Aminophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-30 nα-1,4,7,10-tetraacetic acid in 10 µl of a solution containing 1 , 4 mg of α- (4-amino-phenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid / 100 μΐ (prepared by the procedure of Example 3), μΐ Y (OAc) 3 (0.003 M), 7β 104898 supplemented with Y-90. To this solution was added 500 μΐ of water followed by 125 μΐ of NaOAc (0.5 M). Water (265 μΐ) was added to the solution to bring the total volume to 1 ml. This solution was divided into two equal portions.

5 Toinen osa kuumennettiin 100 °C:seen 1 tunniksi. Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden määrittämiseksi aikaisemmin kuvattua kationinvaihtomenettelyä käyttäen. Tulokset osoittivat, että 84 % metallista oli kompleksina kuumen-10 netun näytteen tapauksessa ja 4 % kuumentamattoman näytteen tapauksessa.The second portion was heated to 100 ° C for 1 hour. Both heated and unheated sample were examined to determine the percentage of metal in the complex using the cation exchange procedure described above. The results showed that 84% of the metal was complex in the case of the hot sample and 4% in the case of the unheated sample.

Esimerkki 34 a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon lutetium(III)kompleksin val-15 mistus a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahappoliuos (valmistettu esimerkin 3 mukaisella menettelytavalla) liuotettiin tislattuun veteen niin, että liuoksen väkevyydeksi tuli 1,63 mg/ml.Example 34 Preparation of the α- (4-aminophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid lutetium (III) complex α- (4-aminophenyl) - A solution of 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (prepared according to the procedure of Example 3) was dissolved in distilled water to a concentration of 1.63 mg / ml.

20 Lutetiumkloridiliuos valmistettiin liuottamalla lutetiumkloridi 0,1 N HCl:oon niin, että tuloksena oli liuos, jonka väkevyys oli 3,9 mg/ml (0,01 M). Merkkiaineena käytettiin lutetium-177:ää (0,3 mM).A solution of lutetium chloride was prepared by dissolving lutetium chloride in 0.1 N HCl to give a solution of 3.9 mg / ml (0.01 M). Lutetium-177 (0.3 mM) was used as a marker.

30 μΐ 0,01 M lutetiumliuosta lisättiin 2 μΐ-.aan Lu-: 25 177-liuosta. Lisättiin asianmukainen määrä edellä saatua ligandia ja kokonaistilavuuden kasvattamiseksi 1,0 ml:ksi HEPES-puskuria (0,1 M, pH 7,6). Syntyneet liuokset olivat 0,3 mM ligandin ja lutetiumin suhteen. Liuos kuumennettiin sitten 100 °C:seen 1 tunniksi, ja kompleksina olevan Lu:n 30 prosenttiosuudeksi määritettiin aikaisemmin kuvatulla ka-·· tioninvaihtomenetelmällä 86 %.30 μΐ of 0.01 M lutetium solution was added to 2 μΐ of Lu: 25 177 solution. An appropriate amount of the above ligand was added and added to 1.0 mL of HEPES buffer (0.1 M, pH 7.6) to increase the total volume. The resulting solutions were 0.3 mM for ligand and lutetium. The solution was then heated to 100 ° C for 1 hour, and the percent Lu of the complex was determined to be 86% by the previously described cation exchange method.

Esimerkki 35 o-(4-isotiosyanaattofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium(III)-35 kompleksin valmistus 104898 79 Näyte-erä, 7 mg (10,8 μπιοί) , a- (4-aminofenyyli) - 1.4.7.10- tetra-atsasyklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkaha-pon samarium(III)kompleksia (valmistettu esimerkin 30 mukaisella menettelytavalla) liuotettiin 400 μΐ-.aan vettä.Example 35 Preparation of Samarium (III) -35 Compound o- (4-Isothiocyanatophenyl) -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid 104898 79 Sample lot, 7 mg ( 10.8 μπιοί), α- (4-aminophenyl) -14.7.10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid samarium (III) complex (prepared according to the procedure of Example 30) was dissolved in 400 μΐ. water.

5 Lisättiin ylimäärin (50 μΐ) tiofosgeenia ja sen jälkeen 400 μΐ CHCl3:a, ja kaksifaasista reaktioseosta sekoitettiin voimakkaasti 30 minuuttia. Tämän jälkeen vesikerros uutettiin 500 μ1:1ΐ3 CHCl3:a (neljästi) ja kylmäkuivattiin sitten, jolloin saatiin haluttua otsikon mukaista tuotetta 10 kvantitatiivisella saannolla.An excess (50 μΐ) of thiophosgene was added followed by 400 μΐ of CHCl 3, and the biphasic reaction mixture was vigorously stirred for 30 minutes. The aqueous layer was then extracted with 500 μ1: 1-3 CHCl3 (Four times) and then lyophilized to give the desired title product in 10 quantitative yields.

UV-spektrissä tällä yhdisteellä esiintyi absorptio-huippu aallonpituuksilla 272 nm ja 282 nm. TLC (silikagee-li, kehitys CH3CN-H20-seoksella tilavuussuhteessa 75:25) antoi Rf-arvoksi 0,38. Lähtöaineen R£-arvo on 0,19. 15 IR-spektrissä esiintyi SCN-venytyshuippu aaltoluvulla 2100 cm'1; FAB-massaspektri: [M + H] * = 687.In the UV spectrum, this compound exhibited an absorption peak at 272 nm and 282 nm. TLC (silica gel, developing with 75:25 by volume CH3CN-H2O) gave an Rf value of 0.38. The R £ value of the starting material is 0.19. The IR spectrum exhibited a SCN peak at 2100 cm -1; FAB Mass Spectrum: [M + H] * = 687.

Esimerkki 36 a- (4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon ammoniumsuolan yttrium(III)-20 kompleksin valmistus Näyte-erä, 90 mg (160 mmol), a-(4-aminofenyyli)- 1.4.7.10- tetra-atsasyklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkahap-poa (valmistettu esimerkin 3 mukaisella menettelytavalla) liuotettiin 1 ml:aan vettä. Tähän liuokseen lisättiin 3 ml : 25 vettä, joka sisälsi 51 mg (192 mmol) Y(OAc)3:a. Reaktio- seosta (pH =6-7) kuumennettiin sitten 100 °C:ssa 2 tuntia. Tulokseksi saatu liuos laskettiin sitten lasivillan läpi ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 126 mg keltaista kiinteätä ainetta. Tämä kiintoaine käsiteltiin kromatogra-30 fisesti silikageelillä (liuotinseos 1) , jolloin saatiin ;· 71 mg (76 %) haluttua kompleksituotetta. Anioninvaih- toanalyysi osoitti viipymäajan samaksi kuin vastaavalla Sm-kompleksilla. Otsikon mukainen tuote karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 80 104898 13C-NMR (D20) : 180,8, 180,5, 179,9, 146,1, 133,4, 122,0, 116,1, 74,9, 66,3, 56,3, 55,8, 55,4, 55,1, 54,8, 52,2, 46,0, 44,0, 23,6; ^-NMR (D20) ; 6,90 (d) , 6,70 (d) , 4,40 (s) , 3,45 - 3,06 5 (m), 2,71 - 2,10 (m), 1,75 (s) ; FAB-massaspektri: [M + H+] = 582.Example 36 Preparation of the yttrium (III) -20 complex of the ammonium salt of α- (4-aminophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid Sample lot, 90 mg (160 mmol), α- (4-aminophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (prepared according to the procedure of Example 3) was dissolved in 1 ml of water. To this solution was added 3 ml: 25 water containing 51 mg (192 mmol) of Y (OAc) 3. The reaction mixture (pH = 6-7) was then heated at 100 ° C for 2 hours. The resulting solution was then passed through glass wool and freeze-dried to give 126 mg of a yellow solid. This solid was chromatographed on silica gel (solvent mixture 1) to give; 71 mg (76%) of the desired complex product. Anion exchange analysis showed a dwell time similar to that of the corresponding Sm complex. The title product was characterized by the following data: 80 104898 13 C NMR (D 2 O): 180.8, 180.5, 179.9, 146.1, 133.4, 122.0, 116.1, 74.9, 66 , 3, 56.3, 55.8, 55.4, 55.1, 54.8, 52.2, 46.0, 44.0, 23.6; 1 H-NMR (D 2 O); 6.90 (d), 6.70 (d), 4.40 (s), 3.45 - 3.06 δ (m), 2.71 - 2.10 (m), 1.75 (s) ; FAB Mass Spectrum: [M + H +] = 582.

Esimerkki 37 a-(4-isotiosyanaattofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon natriumsuolan 10 yttrium (III) kompleksin valmistus Näyte-erä o-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon yttrium(III)kompleksia (valmistettu esimerkin 36 mukaisella menettelytavalla; 10 mg, 17 μΐ) liuotettiin 400 μΐ-.aan. vettä. Tähän 15 liuokseen lisättiin 64 μΐ (ylimäärin) tiofosgeenia ja 400 μΐ CHCl3:a, ja tulokseksi saatua reaktioseosta sekoitettiin voimakkaasti 40 minuuttia. Tänä aikana tehtiin useita pieniä kiinteän NaHC03:n lisäyksiä pH:n pitämiseksi suunnilleen arvossa 8. Reaktion päätyttyä vesikerros ero-20 tettiin ja uutettiin 1 ml :11a CHCl3:a (neljästi) ja kylmä-kuivattiin. Otsikon mukainen tuote karakterisoitiin TLC:n ja UV-spektroskopian avulla.Example 37 Preparation of Compound 10- Yttrium (III) Sodium Salt of α- (4-Isothiocyanatophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-Sample Lot o- (4-Aminophenyl) ) -1,4,7,10-Tetra-aza-cyclododecane-1,4,7,10-tetra-acetic acid yttrium (III) complex (prepared according to the procedure of Example 36; 10 mg, 17 μΐ) was dissolved in 400 μΐ. of water. To this 15 solution was added 64 μΐ (excess) thiophosgene and 400 μΐ CHCl 3 and the resulting reaction mixture was vigorously stirred for 40 minutes. During this time, several small additions of solid NaHCO 3 were made to maintain the pH at approximately 8. After completion of the reaction, the aqueous layer was separated and extracted with 1 mL of CHCl 3 (Fourth) and freeze-dried. The title product was characterized by TLC and UV spectroscopy.

Esimerkki 38 a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-: 25 syklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkahapon yttrium(III)komp- leksin ammoniumsuolan, NH4 [Y(PA-DOTA)] :n, valmistusExample 38 Ammonium salt of α- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraaza-aza: cyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid yttrium (III) complex, NH 4 Preparation of [Y (PA-DOTA)]

Ligandi, a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahappo (valmistettu esimerkin 8 mukaisella menettelytavalla), muun-30 nettiin protonoidun muodon ja ammoniumsuolan sekoituk-·. seksi kromatografisesti voimakasta kationinvaihtohartsia ' (SP-Sephadex™ C-25, Pharmacia) käyttäen. Pylväs oli proto- noidussa muodossa ja huuhdottiin tislatulla vedellä. Li-gandin väkevä vesiliuos laitettiin pylvääseen, jonka jäl-35 keen pylväs huuhdottiin tislatulla vedellä. Ligandi eluoi- 104898 o 1 tiin pylväästä 0,5 M NH4OH:lla. Eluentti poistettiin haihduttamalla liuos kuiviin.Ligand, α- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (prepared according to the procedure of Example 8), converted to the protonated form and ammonium salt blend. sex chromatography using a strong cation exchange resin (SP-Sephadex ™ C-25, Pharmacia). The column was in protonated form and rinsed with distilled water. Li-gand concentrated aqueous solution was applied to the column, after which the column was rinsed with distilled water. The ligand was eluted from 104898 µl of the column with 0.5 M NH4OH. The eluent was removed by evaporation of the solution to dryness.

Liuos, joka sisälsi Y(OAc) 3 *4H20: ta (0,0728 g, 0,215 mmol) 5 ml:ssa tislattua vettä, lisättiin lämpimään 5 liuokseen, joka sisälsi protonoidussa ja ammoniumsuolan muodossa olevaa sekaligandia (0,120 g, 0,215 mmol) 5 ml:ssa vettä. Liuos kuumennettiin palautusjäähdyttimen alla kiehuvaksi, ja sen pH säädettiin 0,1 M NH40H:lla suunnilleen arvoon 7,0. Tunnin refluksoinnin jälkeen liuos 10 jäähdytettiin ja haihdutettiin kuiviin. Ylimääräinen NH4OAc poistettiin kuumentemalla valkeata kiinteätä ainetta öljy-hauteessa noin 105 °C:ssa alipaineessa. Otsikon mukaisen tuotteen (joka sisälsi noin 1 ekvivalentin ammoniumase-taattia) saanto oli 0,142 g (94 %) , ja se karakterisoitiin 15 seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (D20, 88 °C, 75 MHz): 23,8, 27,6, 35,4, 49,6, 55,0, 56,2, 56,9, 57,1, 65,7, 68,0, 121,7, 132,6, 138,8, 180,7, 181.4, 182,0, 183,1 FAB-massaspektri (m/e): 610 (positiivinen ioni, [M" + 20 2H+]+) , 608 (negatiivinen ioni, M').A solution of Y (OAc) 3 * 4H 2 O (0.0728 g, 0.215 mmol) in 5 mL of distilled water was added to a warm solution of a mixed ligand in protonated and ammonium salt (0.120 g, 0.215 mmol). ml of water. The solution was heated to reflux and adjusted to pH 7.0 with 0.1 M NH 4 OH. After one hour at reflux, the solution 10 was cooled and evaporated to dryness. Excess NH4OAc was removed by heating the white solid in an oil bath at about 105 ° C under reduced pressure. The yield of the title product (containing about 1 equivalent of ammonium acetate) was 0.142 g (94%) and was characterized by 13 C NMR (D 2 O, 88 ° C, 75 MHz): 23.8, 27, 6, 35.4, 49.6, 55.0, 56.2, 56.9, 57.1, 65.7, 68.0, 121.7, 132.6, 138.8, 180.7, 181.4, 182.0, 183.1 FAB mass spectrum (m / e): 610 (positive ion, [M '+ 20 2H +] +), 608 (negative ion, M').

Esimerkki 39 a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium(III) -kompleksin ammoniumsuolan, NH4 [Sm(PA-DOTA)] :n, valmistus • ·* 25 Toistettaessa esimerkin 38 mukainen menettely käyt- tämällä Y(OAc) 3 *4H20:n tilalla Sm(OAc) 3 *3H20: ta (0,082 g, 0,215 mmol) saatiin valmistetuksi otsikon mukainen tuote (joka sisälsi noin 1 ekvivalentin ammoniumasetaattia) 0,155 g:n (94 %) saannolla, ja se karakterisoitiin seuraa-30 vien tietojen perusteella: 13C-NMR (D20, 88 °C, 75 MHz): 23,5, 27,2, 35,6, 50,5, 54,5, 4 56,0, 57,2, 57,9, 69,5, 71,5, 122,3, 133,0, 139,7, 181,2, 188.4, 189,3, 190,9; 104898 82 FAB-massaspektri (m/e) : 673 (positiivinen ioni, [M' + 21Γ]+, Sm-isotooppimalli), 671 (negatiivinen ioni, M', Sm-isotooppimalli).Example 39 Ammonium salt of the samarium (III) complex of α- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid, NH 4 [Sm Preparation of PA-DOTA)], · · * 25 By repeating the procedure of Example 38 using Sm (OAc) 3 * 3H 2 O (0.082 g, 0.215 mmol) in place of Y (OAc) 3 * 4H 2 O, the title compound was prepared. (containing about 1 equivalent of ammonium acetate) in a yield of 0.155 g (94%) and characterized by the following data: 13 C NMR (D 2 O, 88 ° C, 75 MHz): 23.5, 27, 2, 35.6, 50.5, 54.5, 4 56.0, 57.2, 57.9, 69.5, 71.5, 122.3, 133.0, 139.7, 181.2 , 188.4, 189.3, 190.9; 104898 82 FAB mass spectrum (m / e): 673 (positive ion, [M '+ 21Γ] +, Sm isotope model), 671 (negative ion, M', Sm isotope model).

Esimerkki 40 5 a-[2-(4-isotiosyanaattofenyyli)-etyyli]-1,4,7,10- tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium (III) kompleksin ammoniumsuolan, NH4 [Sm(SCN-PA-DOTA)] :n, valmistusExample 40 Ammonium salt of 5α- [2- (4-isothiocyanato-phenyl) -ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid complex, NH 4 [Sm (SCN) -PA-DOTA)]

Liuokset, jotka sisälsivät Sm(OAc) 3-3H20: ta 10 (27,9 mg, 381,56 g/mol, 73,1 μπιοί) 10 ml:ssa tislattua vettä ja 42 mg (632,97 g/mol, 66,4 μπιοί) PA-DOTA:n ammo-nium-kaliumsekasuolaa (valmistettu esimerkin 8 mukaisella menettelytavalla) 10 ml:ssa tislattua vettä, sekoitettiin ja niitä kuumennetiin höyryhauteella. 30 minuutin kuluttua 15 reaktio Sm(PA-DOTA):n muodostamiseksi oli mennyt loppuun HPLC:llä esimerkissä 41 kuvattua menetelmää käyttäen määritettynä. Liuoksen annettiin reagoida toisen liuoksen kanssa, joka sisälsi 45,4 mg CSCl2:a (114,98 g/mol, 395 μπιοί) 20 ml:ssa kloroformia, ravistemalla niitä ero-20 tussuppilossa. Reaktio meni loppuun noin 1 minuutissa HPLC:llä määritettynä ja sillä perusteella, että positiivista reaktiota ei ilmennyt ninhydriinitestissä (0,2 % etanolissa), kun vesiliuoksesta suoritettiin täpläanalyysi silikageeli-TLC-levyllä [lähtökelaatti, Sm(PA-DOTA), oli :· 25 testissä positiivinen]. Kloroformikerros poistettiin ja vesikerros pestiin kahdella 20 ml:n erällä kloroformia. Vesikerros haihdutettiin kuiviin lisäämällä siihen 100 ml asetonitriiliä ja tekemällä haihdutus ympäristön lämpötilassa typpivirran alla, jolloin saatiin 56 mg otsikon mu-30 kaista tuotetta.Solutions containing Sm (OAc) 3-3H2O 10 (27.9 mg, 381.56 g / mol, 73.1 μπιοί) in 10 ml of distilled water and 42 mg (632.97 g / mol, 66 , 4 μπιοί) PA-DOTA Ammonium Potassium Mixed salt (prepared by the procedure of Example 8) in 10 ml of distilled water, stirred and heated on a steam bath. After 30 minutes, the reaction to form Sm (PA-DOTA) was complete by HPLC as determined by the procedure described in Example 41. The solution was reacted with another solution containing 45.4 mg CSCl2 (114.98 g / mol, 395 μπιοί) in 20 ml of chloroform by shaking them in a separatory funnel. The reaction was completed in about 1 minute as determined by HPLC and based on the absence of a positive reaction in the ninhydrin assay (0.2% in ethanol) when spot-analyzed on an silica gel TLC plate [starting chelate, Sm (PA-DOTA), was: · 25 in test positive]. The chloroform layer was removed and the aqueous layer was washed with two 20 mL portions of chloroform. The aqueous layer was evaporated to dryness by adding 100 ml of acetonitrile and evaporating at ambient temperature under a stream of nitrogen to give 56 mg of the title product.

FAB-massaspektri (m/e): 715 (positiivinen ioni, [M' +2ΙΓ]*, Sm-isotooppimalli), 713 (negatiivinen ioni, M', Sm-isotooppimalli).FAB mass spectrum (m / e): 715 (positive ion, [M '+ 2 +] *, Sm isotope model), 713 (negative ion, M', Sm isotope model).

104898 83104898 83

Esimerkki 41 Y3t:n ja PA-DOTA:n välisen kelaatin muodostumisno-peuden HPLC-analyysi PA-DOTA:n ja Y3+:n välisen kelaatin muodostumisen 5 nopeutta tutkittiin PA-DOTA:n valmistuksessa käytetyn tuotteeneristys- ja -puhdistusmenettelyn funktiona. Kelaa-tinmuodostumisastetta seurattiin HPLC:llä 100 mm:n Alltech Econosphere™ C18 -kolonnia käyttäen. Käytetty gradientti oli: A) 0,05 M NaOAc-puskuri, pH 6,0, ja CH3CN suhteessa 10 95:5, B) 0,05 M NaOAc-puskuri, pH 6,0, ja CH3CN suhteessa 30:70, A vaihtui B:ksi 15 minuutissa. Sekä PA-DOTA:n hyd-rokloridisuolan (viipymäaika = 1,31 min) että PA-DOTA:n ammonium-kaliumsekasuolan (viipymäaika = 4,55 min), jotka molemmat oli valmistettu esimerkin 8 mukaisella menettely-15 tavalla, liuos valmistettiin väkevyydeltään 1,6 mM:ksi 0,5 M NaOAc-puskuriin, pH 6,0. Yhden millilitran (1,6 μπιοί) kumpaakin liuosta annettiin reagoida 0,2 ml:n (8 μπιοί) kanssa Y (OAc) 3 *4H20-liuosta (40 mol/1 0,5 M NaOAc-puskurissa, pH 6,0). Kelaatin muodostuminen määritettiin 20 retentioajalla 3,96 min esiintyvän piikin perusteella (varmistettu esimerkistä 38 peräisin olevaan näytteeseen vertaamalla). Tulokset kelaatin muodostumisesta olivat seuraavat: 25 I PA-DOTA-suola I Komplek-|Aika (min)/- sinä (%) lämpötila_.Example 41 HPLC Analysis of Chelation Rate between Y3t and PA-DOTA The rate of chelation between PA-DOTA and Y3 + was investigated as a function of the product isolation and purification procedure used to prepare PA-DOTA. The degree of chelation formation was monitored by HPLC using a 100 mm Alltech Econosphere ™ C18 column. The gradient used was: A) 0.05 M NaOAc buffer, pH 6.0, and CH 3 CN in a ratio of 95: 5, B) 0.05 M NaOAc buffer, pH 6.0, and CH 3 CN in 30:70, A changed to B in 15 minutes. A solution of both PA-DOTA hydrochloride salt (residence time = 1.31 min) and PA-DOTA ammonium potassium mixed salt (residence time = 4.55 min), both prepared according to the procedure of Example 8, was prepared at a concentration of 1.6 mM in 0.5 M NaOAc buffer, pH 6.0. One milliliter (1.6 μπιοί) of each solution was reacted with 0.2 mL (8 μπιοί) of Y (OAc) 3 * 4H 2 O solution (40 mol / L in 0.5 M NaOAc buffer, pH 6.0). . Chelate formation was determined based on the peak at 20 retention time of 3.96 min (confirmed by comparison with the sample from Example 38). The results of chelation were as follows: 25 I PA-DOTA salt I Complex Time (min) / - You (%) temperature_.

>90 juoneen lämpöt.> 90 line temperature.

PA-DOTA:n ammonium- <10 15/huoneen lämpötPA-DOTA ammonium <10 15 / room temperature

kaliumsekasuola >85 10/ 90°Cpotassium mixed salt> 85 10/90 ° C

30 ;· BFC:n puhdistuksessa käytetty menetelmä vaikuttaa selvästi kelaatin muodostumisen nopeuteen.· The method used to purify the BFC clearly affects the rate of chelation.

Esimerkki 42 a-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-35 syklododekaani-1-(R,S)-etikka-4,7,10-tris(metyylietikka)- 104898 84 hapon samarium(III)kompleksin ammoniumsuolan, NH„[Sm(PA-DOTMA)]:n, valmistusExample 42 α- [2- (4-Aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraaza-35-cyclododecane-1- (R, S) -acetic acid-4,7,10-tris (methylacetic acid) - 104898 Preparation of the ammonium salt of the samarium (III) acid complex, NH [[Sm (PA-DOTMA)].

Sm (OAc) 3 *3H20-liuos (13,2 mg 2 ml: ssa tislattua vettä) lisättiin a- [2- (4-aminofenyyli) etyyli] -1,4,7,10-tetra-5 atsasyklododekaani-1-(R,S)-etikka-4,7,10-tris(metyylietik-ka)hapon (valmistettu esimerkin 29 mukaisella menettelytavalla; diastereomeeri, jonka Rf-arvo on suurempi) liuokseen (30 mg 2 ml:ssa tislattua vettä). Liuosta, jonka pH oli 6,5, kuumennettiin höyryhauteella ja reaktiota seurattiin 10 HPLC:n avulla. 30 minuutin kuumennuksen jälkeen liuos haihdutettiin kuiviin pyöröhaihduttimellä ja kuivattiin vakuumiuunissa.A solution of Sm (OAc) 3 * 3H 2 O (13.2 mg in 2 mL of distilled water) was added α- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetra-5-azacyclododecane-1-one. Of a solution of (R, S) -acetic acid-4,7,10-tris (methyl acetic acid) (prepared according to the procedure of Example 29; higher diastereomer Rf) in a solution (30 mg in 2 ml of distilled water). The pH 6.5 solution was heated on a steam bath and the reaction monitored by 10 HPLC. After heating for 30 minutes, the solution was evaporated to dryness on a rotary evaporator and dried in a vacuum oven.

FAB-massaspektri (m/e) : 715 (positiivinen ioni, [M" + 2H*]*, Sm-isotooppimalli) , 737 (positiivinen ioni, [M + H+ + Na*]*, 15 Sm-isotooppimalli), 713 (negatiivinen ioni, M', Sm-isotooppimalli) .FAB mass spectrum (m / e): 715 (positive ion, [M + 2 H *] *, Sm isotope model), 737 (positive ion, [M + H + + Na *] *, 15 Sm isotope model), 713 (negative ion, M ', Sm isotope model).

Seuraavissa esimerkeissä kompleksien liuokset laskettiin ioninvaihtopylvään läpi mahdollisen ylimääräisen vapaan metallin poistamiseksi liuoksesta. Labiilit systee-20 mit palaisivat tasapainotilaan ja liuoksessa olisi samanlainen määrä vapaata metallia. Inertit systeemit eivät palaisi tasapainotilaan eikä kelatoitumattoman metallin määrän pitäisi pienentyä. Niinpä, vaikka kompleksia voikin muodostua pienellä saannolla, puhdistus laskemalla se : 25 ioninvaihtohartsin voisi tuottaa tulokseksi sopivan sta biilin kompleksin, joka ei sisällä kompleksoitumatonta metallia.In the following examples, solutions of the complexes were passed through an ion exchange column to remove any excess free metal from the solution. Labile systems-20 would return to equilibrium and have a similar amount of free metal in the solution. Inert systems would not return to equilibrium and the amount of non-chelated metal should not decrease. Thus, although the complex may be formed in low yield, purification by calculation: The ion exchange resin could yield a suitable stable complex which does not contain uncomplexed metal.

Esimerkki 43 a-(2-metoksi-5-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-3 0 syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium (III)- kompleksin valmistusExample 43 Preparation of the samarium (III) complex of α- (2-methoxy-5-aminophenyl) -1,4,7,10-tetraaza-30-cyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid

Valmistettiin a-(2-metoksi-5-aminofenyyli)- 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon (valmistettu esimerkin 12 mukaisella menettelytavalla) 35 3 x 10'2 M liuos liuottamalla 5,8 mg sitä 325 μΐ-.aan NANO- 104898 85 pure™-vettä. 10 /xl: n erä tätä liuosta lisättiin 990 /xl:aan 3 x 10~4 M SmCl3:a (0,1 N HClrssa), johon oli lisätty Sm-153:a. Liuoksen pH säädettiin sitten NaOHrlla arvoon 7,0. Tämä liuos jaettiin kahteen 500 ml:n osaan, joista toista 5 kuumennettiin 1 tunti 100 °C:ssa. Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden määrittämiseksi aikaisemmin kuvattua ka-tioninvaihtomenettelyä käyttäen. Liuos laskettiin sitten SP-Sephadex™-hartsin läpi. Taas määritettiin kompleksoitu-10 minen puhtaista näytteistä. Tulokset on esitetty seuraa-vassa taulukossa:A solution of α- (2-methoxy-5-aminophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (prepared according to the procedure of Example 12) was prepared by dissolving 35 x 10'2 M. 5.8 mg of it to 325 μΐ of NANO-104898 85 pure ™ water. A 10 µl aliquot of this solution was added to 990 µl of 3 x 10 -4 M SmCl 3 (in 0.1 N HCl) supplemented with Sm-153. The pH of the solution was then adjusted to 7.0 with NaOH. This solution was divided into two 500 ml portions, one of which was heated for 1 hour at 100 ° C. Both the heated and the unheated sample were examined to determine the percentage of metal in the complex using the cation exchange procedure described above. The solution was then passed through a SP-Sephadex ™ resin. Again, complexation was determined from pure samples. The results are shown in the following table:

Kuumennettu Kuumentamaton 15 Puhdistettu Puhdistama- Puhdistettu Puhdistama- ton tonHeated Unheated 15 Purified Purified- Purified Uncleaned ton

Komplek- 96 95 97 89 sinä (%)Complete 96 95 97 89 you (%)

Esimerkki 44 20 a-(2-metoksi-5-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium(III)-kompleksin pH-stabiilisuusExample 44 pH-Stability of 20? - (2-Methoxy-5-aminophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-Tetraacetic Acid Samarium (III)

Esimerkistä 43 peräisin olevat kuumennettu ja kuumentamaton näyte jaettiin kumpikin kahteen yhtä suureen :* 25 osaan, joiden koko oli 250 /xl. Toisen erän pH säädettiin HCl:lla ja toisen NaOH:lla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annettiin seistä 10 minuuttia ja siitä määritettiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuva-30 tulla kationinvaihtomenetelmällä. Tulokset on esitetty .. seuraavassa taulukossa: 86 1 0 4 8 9 8The heated and unheated sample from Example 43 was each divided into two equal portions: * 25 portions of 250 µl. The pH of the second batch was adjusted with HCl and the second with NaOH to the values shown in the following table. Once the desired pH was reached, the sample was allowed to stand for 10 minutes and the percentage of complex metal previously determined by the cation exchange method was determined. The results are shown in the following table: 86 1 0 4 8 9 8

Kompleksina (%) pH Ruumen- tKuumen- nettu tamaton 5 2 95 94 3 97 95 5__98 97 7__96 97 10 9__98 96 11__97 98 13 Ϊ55 99As a complex (%) pH RummyHeated madam 5 2 95 94 3 97 95 5__98 97 7__96 97 10 9__98 96 11__97 98 13 Ϊ55 99

Esimerkki 45 15 a-( 2-metoksi-5-nitrofenyyli )-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium(III)-kompleksin valmistusExample 45 Preparation of 15α- (2-methoxy-5-nitrophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid samarium (III) complex

Valmistettiin a-(2-metoksi-5-nitrofenyyli)- 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkaha-20 pon (valmistettu esimerkin 11 mukaisella menettelytavalla) 3 x 10'2 M liuos liuottamalla 7,9 mg sitä 464 pl:aan NANO-pure™-vettä. 10 μ1:η erä tätä liuosta lisättiin 950 plraan 3 x 10"4 M SmCl3:a (0,1 N HClissa), johon oli lisätty Sm-153:a. Liuoksen pH säädettiin sitten NaOH:lla arvoon ;· 25 7,0. Tämä liuos jaettiin kahteen 500 ml:n osaan, joista toista kuumennettiin 1 tunti 100 eC:ssa. Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden määrittämiseksi aikaisemmin kuvattua kationinvaihtomenettelyä käyttäen. Liuokset lasket-30 tiin SP-Sephadex™-hartsin läpi. Sen jälkeen määritettiin kompleksoituminen puhtaista näytteistä edellä kuvattua yleismenettelyä käyttäen. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa: 87 104898Α- (2-Methoxy-5-nitrophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid-20-p (prepared according to the procedure of Example 11) was prepared 3 x 10'2 M solution by dissolving 7.9 mg of it in 464 µl of NANO-pure ™ water. A 10 μl aliquot of this solution was added to 950 µl of 3 x 10 4 M SmCl 3 (in 0.1 N HCl) supplemented with Sm-153. The pH of the solution was then adjusted to pH 7.0 with NaOH; This solution was divided into two 500 ml portions, one of which was heated for 1 hour at 100. The sample, both heated and unheated, was assayed to determine the percentage of metal in the complex using the cation exchange procedure described above, and the solutions were run through an SP-Sephadex ™ resin. Complexation of the pure samples was then determined using the general procedure described above, and the results are shown in the following table: 87 104898

Kuumennettu Kuumentamaton 5 Puhdistettu Puhdistama- Puhdistettu Puhdistama- ton ton KömpTe^“ 100 72 100 46Heated Unheated 5 Purified Purified- Purified Uncleaned ton KömpTe ^ “100 72 100 46

Esimerkki 46 10 a-( 2-metoksi-5-nitrofenyyli )-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium(III)- kompleksin pH-stabiilisuusExample 46 pH-stability of the 10? - (2-methoxy-5-nitrophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid samarium (III) complex

Esimerkistä 45 peräisin olevat kuumennettu ja kuumentamaton, puhdistettu näyte jaettiin kumpikin kahteen 15 yhtä suureen osaan. Toisen erän pH säädettiin laimealla HCl:lla ja toisen NaOH:lla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annettiin seistä 10 minuuttia ja siitä määritettiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuva- 20 tulla kationinvaihtomenetelmällä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa:The heated and unheated, purified sample from Example 45 was each divided into two equal portions. The pH of the second batch was adjusted with dilute HCl and the second with NaOH to the values shown in the following table. When the desired pH was reached, the sample was allowed to stand for 10 minutes and the percentage of complexing metal was determined by the previously described cation exchange method. The results are shown in the following table:

Puhdistettu 25 u —..... .Refined 25 u ———.

• ph Ruumen- Kuumen nettu tamaton """ 2 99 ~99 Ϊ 100 100 30 5 Töö röö 7 100 100 9 100 ToÖ n loo Toö 35 13 Töö Töö e, 104898• ph Room- Heated Infinite "" "2 99 ~ 99 Ϊ 100 100 30 5 Job Job 7 100 100 9 100 Job Job To Job 35 13 Job Job, 104898

Esimerkki 47 α- (4-nitrofenyyli )-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7-trietikkahapon samarium(III )kompleksin valmistus a- (4-nitrofenyyli )-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-5 ni-1,4,7-trietikkahapon (valmistettu esimerkin 4 mukaisel la menettelytavalla) 0,0219 M liuos (100 μΐ, 2,195 mmol) saatettiin kosketuksiin 0,043 M Sm(OAc)3-liuoksen (25 μΐ, 1,075 mmol) kanssa. Reaktioseokselle tehtiin anioninvaih-to-HPLC-käsittely (Q-Sepharose™-kolonni, 1 cm x 25 cm, 10 virtausnopeus 2 ml/min, eluointi 0 - 1 M NH4OAc-gradientil-la 30 minuutin aikana). Tunnin kuluttua kompleksia (viipy-mäaika - 11,1 min) oli muodostunut 77 %:n (pinta-ala-%) saannolla ja se oli täysin erillään ligandihuipusta (vii-pymäaika - 15,5 min). Lisäosoitus otsikon mukaisen komp-15 leksin muodostumisesta saatiin silikageeli-TLC:llä (liuo-tinseos 4), jossa ligandin Rf-arvo oli 0,59 ja kompleksin Rf-arvo 0,00.Example 47 Preparation of the samarium (III) complex of α- (4-nitrophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid α- (4-nitrophenyl) -1,4,7 A solution of 0.0219 M (100 μΐ, 2.195 mmol) of 10-Tetrazazacyclododecane-5-1, 1,4,7-triacetic acid (prepared by the procedure of Example 4) was contacted with 0.043 M Sm (OAc) 3 (25 mL). μΐ, 1.075 mmol). The reaction mixture was subjected to anion exchange-to-HPLC treatment (Q-Sepharose ™ column, 1 cm x 25 cm, 10 flow rate 2 mL / min, elution with 0-1 M NH 4 OAc gradient over 30 min). After 1 hour, the complex (dwell time - 11.1 min) was formed in 77% (area%) yield and was completely separated from the ligand peak (dwell time - 15.5 min). Further evidence of the formation of the title comp-15 complex was obtained by silica gel TLC (solvent mixture 4), with ligand Rf 0.59 and complex Rf 0.00.

Esimerkki 48 a-(4-aminofenyyli )-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-20 ni-1,4,7-trietikkahapon samarium(III)kompleksin ja a-(4- aminofenyyli )-l,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,10-trietikkahapon samarium(III)kompleksin valmistusExample 48 α- (4-Aminophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-20 nino-1,4,7-triacetic acid Samarium (III) Complex and α- (4-Aminophenyl) -1,4 Preparation of Samarium (III) Complex of 7,10-Tetrazazacyclododecane-1,4,10-Trietic Acid

Isomeerien (valmistettu esimerkin 5 mukaisella menettelytavalla) 0,022 M liuos (100 μΐ, 2,2 pmol) saatet-25 tiin kosketuksiin 0,043 M Sm(OAc)3-liuoksen (6,4 μΐ, 0,275 mmol) kanssa. Reaktioseokselle tehtiin anioninvaih-to-HPLC-käsittely (Q-Sepharose™-kolonni, 1 cm x 25 cm, virtausnopeus 2 ml/min, eluointi 0 - 0,25 M NH4OAc-gradien-tilla 30 minuutin aikana). 40 minuutin kuluttua kompleksia 30 (viipymäaika = 9,0 min) oli muodostunut 66 %:n (pinta-ala-%) saannolla ja se oli täysin erillään ligandihuipusta • · (viipymäaika = 18,5 min).A 0.022 M solution (100 μΐ, 2.2 pmol) of the isomers (prepared according to the procedure of Example 5) was contacted with a 0.043 M Sm (OAc) 3 solution (6.4 μΐ, 0.275 mmol). The reaction mixture was subjected to anion exchange-to-HPLC treatment (Q-Sepharose ™ column, 1 cm x 25 cm, flow rate 2 ml / min, elution with 0-0.25 M NH 4 OAc gradient over 30 min). After 40 minutes, the complex 30 (residence time = 9.0 min) was formed in 66% (area%) yield and was completely separated from the ligand peak • · (residence time = 18.5 min).

β9 104898β9 104898

Esimerkki 49 α-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l, 4, 7-trietikkahapon samarium- 153-kompleksin ja a-(4-aminofenyyli)-l,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l, 4,10-5 trietikkahapon samarium-153-kompleksin valmistusExample 49 Samarium-153 complex of α- (4-aminophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid and α- (4-aminophenyl) -1,4,7,10 Preparation of the samarium-153 complex of tetraaza-azacyclododecane-1,4,10-5 trietic acetic acid

Valmistettiin a-(4-aminofenyyli)-l,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l, 4, 7-trietikkahappopentahydrokloridin ja a-(4-aminofenyyli)-l,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani- 1,4,10-trietikkahappopentahydrokloridin (valmistettu esi-10 merkin 5 mukaisella menettelytavalla) 3 x 10~2 M liuos liuottamalla 4,2 mg niitä 300 pl:aan NANOpure™-vettä. 10 μ1:η erä tätä liuosta lisättiin 15 pl:aan 2 x 10~5 M SmCl3:a (0,1 N HClrssa), johon oli lisätty Sm-153:a. Liuoksen tilavuudeksi muodostettiin 1 ml lisäämällä siihen vet-15 tä. pH säädettiin sitten Na0H:lla arvoon 7,0. Tämä liuos jaettiin kahteen 500 ml:n osaan, joista toista kuumennettiin 1 tunti 100 eC:ssa.Α- (4-aminophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,7-triacetic acid pentahydrochloride and α- (4-aminophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1-one were prepared. 3 x 10 ~ 2 M solution of 4,10-triacetic acid pentahydrochloride (prepared by the procedure of Example 10) by dissolving 4.2 mg in 300 µl of NANOpure ™ water. A 10 µl aliquot of this solution was added to 15 µl of 2 x 10 ~ 5 M SmCl3 (in 0.1 N HCl) supplemented with Sm-153. The solution was made up to 1 ml by addition of hydrogen. The pH was then adjusted to 7.0 with NaOH. This solution was divided into two 500 ml portions, one of which was heated at 100 ° C for 1 hour.

Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden määrit-20 tämiseksi aikaisemmin kuvattua kationinvaihtomenettelyä käyttäen. Tulokset osoittivat, että 89 % metallista oli kompleksina kuumennetun näytteen tapauksessa ja 96 % kuumentamattoman näytteen tapauksessa.Both heated and unheated sample were assayed to determine the percentage of metal in the complex using the previously described cation exchange procedure. The results showed that 89% of the metal was complex in the case of the heated sample and 96% in the case of the unheated sample.

Esimerkki 50 .'. 25 a- (4-aminofenyyli )-l, 4,7,10-tetra-atsasyklododekaa ni-l, 4,7-trietikkahapon samarium(III)kompleksin ja a-(4-aminofenyyli )-l,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,10-trietikkahapon samarium(III)kompleksin pH-stabiilisuusExample 50. '. 25 α- (4-aminophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid samarium (III) complex and α- (4-aminophenyl) -1,4,7,10 pH stability of the tetra-azacyclododecane-1,4,10-triacetic acid samarium (III) complex

Esimerkistä 49 peräisin oleva kuumennettu ja kuu-30 mentamaton näyte jaettiin kumpikin kahteen yhtä suureen osaan. Toisen erän pH säädettiin HCl:lla ja toisen NaOH:lla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annettiin seistä 10 minuuttia ja siitä määritettiin kompleksina olevan metal- 90 1 0 4 8 9 8The heated and unheated sample from Example 49 was each divided into two equal portions. The pH of the second batch was adjusted with HCl and the second with NaOH to the values shown in the following table. Once the desired pH was reached, the sample was allowed to stand for 10 minutes and assayed for complexed metal.

Iin prosenttiosuus aikaisemmin kuvatulla kationinvaihtome-netelmällä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa:Percentage of Iin by the cation exchange method described above. The results are shown in the following table:

Kompleksina (%) ^ pH Ruumen-.'.Kuumen nettu tamaton 1 86 83 3 99 99 10 5 99 99 7 89 96 9 99 98 Γ5 96 89 15 13 97 97As a complex (%) ^ pH of the body -. 'Heated unharmed 1 86 83 3 99 99 10 5 99 99 7 89 96 9 99 98 Γ 5 96 89 15 13 97 97

Esimerkki 51 a- (4-nitrof enyyli )-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7-trietikkahapon samarium(III)kompleksin valmistus 20 Seoksen, joka sisälsi 13 μΐ α-(4-nitrofenyyli)- 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,7-trietikkahapon (valmistettu esimerkin 4 mukaisella menettelytavalla) 2 x 10'2 M liuosta, 15 μΐ 0,02 M SmCl3:a (0,1 N HClrssa) ja 2 μΐ Sm-153:a, tilavuudeksi muodostettiin 1 ml NANOpure™-vettä j. 25 lisäämällä. pH säädettiin sitten NaOHrlla arvoon 7,0. Tämä liuos jaettiin kahteen 500 ml:n osaan, joista toista kuumennettiin 1 tunti 100 °C:ssa. Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden määrittämiseksi aikaisemmin kuvattua ka-30 tioninvaihtomenettelyä käyttäen. Tulokset osoittivat, että • « .. 74 % metallista oli kompleksina kuumennetun näytteen ta pauksessa ja 24 % kuumentamattoman näytteen tapauksessa.Example 51 Preparation of Samarium (III) Complex of α- (4-Nitrophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid 20 A mixture of 13 μΐ α- (4- nitrophenyl) - 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid (prepared according to the procedure of Example 4) 2 x 10'2 M solution, 15 μΐ 0.02 M SmCl3 (0.1 N in HCl) and 2 μΐ of Sm-153, a volume of 1 ml of NANOpure ™ water was made up. 25 adding. The pH was then adjusted to 7.0 with NaOH. This solution was divided into two 500 ml portions, one of which was heated at 100 ° C for 1 hour. Both the heated and the unheated sample were examined to determine the percentage of metal in the complex using the cation exchange procedure described above. The results showed that? 74% of the metal was in the case of the heated sample and 24% in the case of the unheated sample.

91 10489891 104898

Esimerkki 52 0- (4-nitrofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7-trietikkahapon samar ium (111) kompleksin pH-stabiilisuus 5 Esimerkin 51 mukainen kuumennettu näyte jaettiin kumpikin kahteen yhtä suureen osaan. Toisen erän pH säädettiin HCl:lla ja toisen NaOH:lla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annettiin seistä 10 minuuttia ja siitä määritet- 10 tiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuvatulla kationinvaihtomenetelmällä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa: oH Kompleksina (%) 15 1 *67 2 70 5 70 ~ 5 72 20 7 7¾ 9 76 TO 76 12 "75 ... 25 I ’3 I T6Example 52 The pH stability of the Samarium (111) complex of 0- (4-nitrophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid The heated sample of Example 51 was each divided into two for the most part. The pH of the second batch was adjusted with HCl and the second with NaOH to the values shown in the following table. Once the desired pH was reached, the sample was allowed to stand for 10 minutes and the percentage of complexing metal was determined by the cation exchange method described above. The results are shown in the following table: oH Complex (%) 15 1 * 67 2 70 5 70 ~ 5 72 20 7 7¾ 9 76 TO 76 12 "75 ... 25 I '3 I T6

Esimerkki 53 1- [2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4 ,7,10-trietikkahapon lutetium(III)komplek- 30 sin valmistusExample 53 Preparation of 1- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-4,7,10-triacetic acid lutetium (III) complex

Valmistettiin EA-D03a:n (valmistettu esimerkin 17 * · < mukaisella menettelytavalla) liuos liuottamalla kiinteä aine veteen. Loppupitoisuus oli 0,01 mmol/ml.A solution of EA-D03a (prepared by the procedure of Example 17 *) was prepared by dissolving the solid in water. The final concentration was 0.01 mmol / ml.

Lutetiumkloridiliuos valmistettiin liuottamalla 35 lutetiumkloridi 0,1 N HClroon. Tulokseksi saatu lutetium- 92 1 0 4 8 9 8 kloridipitoisuus oli 3,9 mg/ml (0,01 mmol Lu:a/ml). Merkkiaineena käytettiin lutetium-177:ää.A lutetium chloride solution was prepared by dissolving 35 lutetium chloride in 0.1 N HCl. The resulting lutetium chloride concentration was 3.9 mg / ml (0.01 mmol Lu / ml). Lutetium-177 was used as a marker.

30 μΐ 0,01 M Lu-liuosta lisättiin 2 μΐ-.aan Lu-177-liuosta. Lisättiin 30 μΐ ligandia ja kokonaistilavuuden 5 kasvattamiseksi 1,0 ml:ksi HEPES-puskuria (0,1 M, pH 7,6). Syntyneet liuokset olivat 0,3 mM ligandin ja lutetiumin suhteen.30 μΐ of 0.01 M Lu solution was added to 2 μΐ of Lu-177 solution. 30 μΐ of ligand was added and to increase the total volume to 1.0 ml of HEPES buffer (0.1 M, pH 7.6). The resulting solutions were 0.3 mM for ligand and lutetium.

Kompleksina olevan Lu:n prosenttiosuudeksi määritettiin aikaisemmin kuvatulla kationinvaihtomenetelmällä 10 98 %.The percentage of complex Lu was determined by the cation exchange method described above at 98%.

Esimerkki 54 1-[2 -(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon yttrium(III)kompleksin, Y(EA-D03A):n, valmistus 15 Ligandi, 1-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10- tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahappo (valmistettu esimerkin 17 mukaisella menettelytavalla), muunnettiin protonoidun muodon ja ammoniumsuolan sekoitukseksi kroma-tografisesti voimakasta kationinvaihtohartsia (SP-Sepha-20 dex™ C-25, Pharmacia) käyttäen. Pylväs oli protonoidussa muodossa ja huuhdottiin tislatulla vedellä. Ligandin väkevä vesiliuos laitettiin pylvääseen, jonka jälkeen pylväs huuhdottiin tislatulla vedellä. Ligandi eluoitiin pylväästä 0,5 M NH40H:lla. Eluaatti poistettiin haihduttamalla .. 25 liuos kuiviin pyöröhaihduttime11a ja kuivattiin vakuumiuu- nissa.Example 54 1- [2- (4-Aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-4,7,10-triacetic acid Yttrium (III) Complex, Y (EA-D03A) Preparation 15 Ligand, 1- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid (prepared according to the procedure of Example 17), was converted to the protonated form and the ammonium salt by chromatography using a strong cation exchange resin (SP-Sepha-20 dex ™ C-25, Pharmacia). The column was in protonated form and rinsed with distilled water. The concentrated aqueous ligand solution was applied to the column, after which the column was rinsed with distilled water. The ligand was eluted from the column with 0.5 M NH 4 OH. The eluate was removed by evaporation. The solution was dried on a rotary evaporator and dried in a vacuum oven.

Liuos, joka sisälsi Y (OAc) 3 *4H20: ta (0,203 g, 338,101 g/mol, 0,600 mmol) 10 ml:ssa tislattua vettä, lisättiin lämpimään liuokseen, joka sisälsi protonoidussa ja 30 ammoniumsuolan muodossa olevaa sekaligandia (0,300 g, 499,615 g/mol, 0,600 mmol) 10 ml:ssa tislattua vettä. Liuos kuumennettiin palautusjäähdyttimen alla kiehuvaksi, ja sen pH säädettiin 0,1 M NH4OH:lla suunnilleen arvoon 7,0. 15 minuutin refluksoinnin jälkeen liuos jäähdytettiin ja 35 haihdutettiin kuiviin pyöröhaihduttimellä. Ylimääräinen 93 104898 ammoniumasetaatti poistettiin kuumentemalla valkeata kiinteätä ainetta öljyhauteessa noin 105 °C:ssa alipaineessa. Otsikon mukaisen tuotteen (joka sisälsi noin 1 ekvivalentin ammoniumasetaattia) saanto oli 373 mg (99 %) , ja se 5 karakterisoitiin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (D20, 88 °C, 75 MHz) : 24,4, 28,4, 51,2, 56,5, 57,2 (2 C) , 57,7, 67,2, 67,6, 120,5, 132,3, 135,2, 182,1, 182,5, 183,0; FAB-massaspektri (m/e) : 552 (positiivinen ioni, [M + H+] *) , 10 610 (negatiivinen ioni, [M + OAc']') .A solution of Y (OAc) 3 * 4H 2 O (0.203 g, 338.101 g / mol, 0.600 mmol) in 10 mL of distilled water was added to a warm solution of mixed protonated and 30 ammonium salt (0.300 g, 499.615). g / mol, 0.600 mmol) in 10 mL of distilled water. The solution was heated to reflux and adjusted to pH 7.0 with 0.1 M NH 4 OH. After refluxing for 15 minutes, the solution was cooled and evaporated to dryness on a rotary evaporator. Excess 93 104898 ammonium acetate was removed by heating the white solid in an oil bath at about 105 ° C under reduced pressure. The yield of the title product (containing about 1 equivalent of ammonium acetate) was 373 mg (99%) and was characterized by 13 C NMR (D 2 O, 88 ° C, 75 MHz): 24.4, 28.4, 51.2, 56.5, 57.2 (2C), 57.7, 67.2, 67.6, 120.5, 132.3, 135.2, 182.1, 182.5, 183, 0; FAB mass spectrum (m / e): 552 (positive ion, [M + H +] *), 10610 (negative ion, [M + OAc ']').

Esimerkki 55 1-[2-(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium(III)kompleksin, Sm(EA-D03A):n, valmistus 15 Toistettaessa esimerkin 54 mukainen menettely käyt tämällä Y(OAc) 3 *4H20:n tilalla Sm(OAc) 3-3H20: ta (0,229 g, 381,531 g/mmol, 0,600 mmol) saatiin valmistetuksi otsikon mukainen tuote (joka sisälsi noin 1 ekvivalentin ammoniumasetaattia) 408 mg:n (99 %) saannolla, ja se karakterisoi-20 tiin seuraavien tietojen perusteella: 13C-NMR (D20, 88 °C, 75 MHz): 23,8, 27,0, 51,4, 57,5, 58,1 (3 C) , 68,7, 73,4, 120,3, 132,2, 134,7, 185,0, 186,8, 192,1; FAB-massaspektri (m/e): 615 (positiivinen ioni, [M + H+]+, 25 Sm-isotooppimalli), 673 (negatiivinen ioni, [M + OAc"]~,Example 55 1- [2- (4-Aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-4,7,10-triacetic acid samarium (III) complex, Sm (EA-D03A) Preparation 15 By repeating the procedure of Example 54, using Y (OAc) 3 * 4H 2 O instead of Sm (OAc) 3 - 3H 2 O (0.229 g, 381.531 g / mmol, 0.600 mmol), the title product (containing ca. 1 equivalent of ammonium acetate) in 408 mg (99%) yield and characterized by the following data: 13 C NMR (D 2 O, 88 ° C, 75 MHz): 23.8, 27.0, 51.4, 57.5, 58.1 (3C), 68.7, 73.4, 120.3, 132.2, 134.7, 185.0, 186.8, 192.1; FAB mass spectrum (m / e): 615 (positive ion, [M + H +] +, 25 Sm isotope model), 673 (negative ion, [M + OAc "] ~,

Sm-isotooppimalli).Sm-isotooppimalli).

Esimerkki 56 1-[2 -(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium(III)kömpiek-30 sin valmistus **' 10 μΐ liuosta, joka sisälsi 1,48 mg 1-(4-nitrofe nyyli) -1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikka-happoa/100 μΐ (0,03 M; valmistettu esimerkin 20 mukaisella menettelytavalla), lisättiin 15 /xl:aan0,02 M SmCl3-liuosta 35 (0,1 N HClsssa), johon oli lisätty Sm-153:a. Liuoksen ti- 94 104898 lavuudeksi muodostettiin 1 ml lisäämällä siihen NANOpure™-vettä. Tämä liuos jaettiin kahteen 500 ml:n osaan, joista toista kuumennettiin 1 tunti 100 °C:ssa. Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan 5 metallin prosenttiosuuden määrittämiseksi edellä kuvattua kationinvaihtomenettelyä käyttäen. Tulokset osoittivat, että 81 % metallista oli kompleksina kuumennetun näytteen tapauksessa ja 43 % kuumentamattoman näytteen tapauksessa.EXAMPLE 56 Preparation of 1- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-4,7,10-triacetic acid samarium (III) carbamate ** '10 μΐ of a solution of 1.48 mg of 1- (4-nitrophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid / 100 μΐ (0.03 M; prepared in Example 20). ) was added to 15 µl of a 0.02 M SmCl3 solution 35 (in 0.1 N HCl) supplemented with Sm-153. The solution was made up to 1 ml by adding NANOpure ™ water. This solution was divided into two 500 ml portions, one of which was heated at 100 ° C for 1 hour. Both heated and unheated sample were assayed to determine the percentage of the complexed metal using the cation exchange procedure described above. The results showed that 81% of the metal was complex in the case of the heated sample and 43% in the case of the unheated sample.

Esimerkki 57 10 1-[2-(4-nitrofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium(III)kompleksin pH-stabiilisuusExample 57 10 pH-stability of 1- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid samarium (III) complex

Esimerkin 56 mukainen kuumennettu näyte jaettiin kumpikin kahteen yhtä suureen osaan. Toisen erän pH sää-15 dettiin HCl:lla ja toisen NaOH:lla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annettiin seistä 10 minuuttia ja siitä määritettiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuvatulla kationinvaihtomenetelmällä. Tulokset on esi-20 tetty seuraavassa taulukossa: pH Kompleksina __L*l—_ 1 20 .. 25-- : ' 2 37 4 49 5 58 7 81 30 9 62 ·· 10 64 12 64 il 54 35 95 104898The heated sample of Example 56 was each divided into two equal portions. The pH of the second batch was adjusted with HCl and the second with NaOH to the values shown in the following table. Once the desired pH was reached, the sample was allowed to stand for 10 minutes and the percentage of complexing metal was determined by the cation exchange method described above. The results are shown in the following table: pH As a complex __L * l - _ 1 20 .. 25--: '2 37 4 49 5 58 7 81 30 9 62 ·· 10 64 12 64 il 54 35 95 104898

Esimerkki 58 1-[2-(4-aminofenyyli)etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium(III)kompleksin valmistus 5 3 μΐ liuosta, joka sisälsi 4,65 mg 1-(4-aminofenyy li) -1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahap-poa/100 ml (valmistettu esimerkin 20 mukaisella menettelytavalla) , lisättiin 15 μ1ι&3.η 0,02 M SmCl3-liuosta (0,1 N HClrssa), johon oli aikaisemmin lisätty Sm-153:a. Liuoksen 10 tilavuudeksi muodostettiin 1 ml lisäämällä siihen NANOpure™-vettä. Tämä liuos jaettiin kahteen yhtä suureen osaan, joista toista kuumennettiin 1 tunti 100 °C:ssa. Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden määrittämiseksi 15 aikaisemmin kuvattua kationinvaihtomenettelyä käyttäen. Tulokset osoittivat, että 96 % metallista oli kompleksina kuumennetun näytteen tapauksessa ja 93 % kuumentamattoman näytteen tapauksessa.Example 58 Preparation of Samarium (III) Compound 1- [2- (4-Aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-4,7,10-triacetic acid 5 3 μΐ of a solution containing 4 , 65 mg of 1- (4-aminophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid / 100 ml (prepared according to the procedure of Example 20), 15 µl of & 3.η 0 02 M SmCl3 solution (0.1 N in HCl) previously Sm-153 added. The volume of solution 10 was made up to 1 ml by addition of NANOpure ™ water. This solution was divided into two equal portions, one of which was heated for 1 hour at 100 ° C. Both heated and unheated samples were assayed to determine the percentage of metal in the complex using the cation exchange procedure previously described. The results showed that 96% of the metal was complex in the case of the heated sample and 93% in the case of the unheated sample.

Esimerkki 59 . 20 1-[2 -(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium(III)kompleksin pH-stabiilisuusExample 59. PH stability of 1- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid samarium (III) complex

Esimerkin 58 mukaiset kuumennettu ja kuumentamaton näyte jaettiin kumpikin kahteen yhtä suureen osaan. Toisen .. 25 erän pH säädettiin HClrlla ja toisen NaOH:lla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annettiin seistä 10 minuuttia ja siitä määritettiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuvatulla kationinvaihtomenetelmällä. Tulokset 30 on esitetty seuraavassa taulukossa: * ·« «· « 96 104898The heated and unheated sample of Example 58 was each divided into two equal portions. The pH of the second batch was adjusted with HCl and the second with NaOH to the values shown in the following table. Once the desired pH was reached, the sample was allowed to stand for 10 minutes and the percentage of complexing metal was determined by the cation exchange method described above. The results 30 are shown in the following table: * · «« · «96 104898

Kompleksina (%) pH --Complex (%) pH -

Kuumenettu Kuumentamaton 5 1 ~~ MM 13 3 50 _M2 5 ‘ 73__55 7__96__93 10 9 9B 98Heated Unheated 5 1 ~ MM 13 3 50 _M2 5 '73__55 7__96__93 10 9 9B 98

Ti 89 90 13 28 _37_Tue 89 90 13 28 _37_

Esimerkki 60 15 1-(2-hydroksi-5-nitrobentsyyli)-l,4,7,10-tetra- atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium(lii)-kompleksin valmistusExample 60 Preparation of Samarium (li) complex of 1- (2-hydroxy-5-nitrobenzyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid

Valmistettiin l-(2-metoksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon 20 (valmistettu esimerkin 25 mukaisella menettelytavalla) 3 x 10'2 M liuos liuottamalla 3,9 mg sitä 260 yl:aan NANOpure™-vettä. 10 pl:n erä tätä liuosta lisättiin 15 pl:aan 2 x 10'2 M SmCl3-vesiliuosta, johon oli lisätty 10 μΐ 3 x 10"* M Sm-153:a (0,1 N HCltssa). Liuoksen tilavuus muodostettiin 25 1 ml:ksi lisäämällä siihen 965 μΐ tislattua vettä. pH sää dettiin sitten Na0H:lla arvoon 7,0. Tämä liuos jaettiin kahteen 500 ml:n osaan, joista toista kuumennettiin 1 tunti 100 °C:ssa. Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden 30 määrittämiseksi aikaisemmin kuvattua kationinvaihtomenet- • · .. telyä käyttäen. Tulokset osoittivat, että 71 % metallista oli kompleksina kuumennetun näytteen tapauksessa ja 74 % kuumentamattoman näytteen tapauksessa.A 3 x 10'2 M solution of 1- (2-methoxy-5-nitrobenzyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid 20 (prepared by the procedure of Example 25) was prepared by dissolving 3, 9 mg of it in 260 ul of NANOpure ™ water. A 10 µl aliquot of this solution was added to 15 µl of 2 x 10'2 M aqueous SmCl3 supplemented with 10 µ 10 3 x 10 µM Sm-153 (in 0.1 N HCl). To 1 ml by addition of 965 μΐ distilled water, the pH was then adjusted to 7.0 with NaOH. This solution was divided into two 500 ml portions, one of which was heated at 100 ° C for 1 hour. to determine the percentage of metal in the complex 30 using the cation exchange procedure described previously .. The results showed that 71% of the metal was complex in the case of the heated sample and 74% in the case of the unheated sample.

97 1 0 4 8 9 897 1 0 4 8 9 8

Esimerkki 61 1-(2-hydroksi-5-nitrobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium(III )-kompleksin pH-stabiilisuus 5 Esimerkin 60 mukaiset kuumennettu ja kuumentamaton näyte jaettiin kumpikin kahteen 250 μ1:η osaan. Toisen erän pH säädettiin HCl:lla ja toisen NaOH:lla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annettiin seistä 10 minuuttia ja siitä 10 määritettiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuvatulla kationinvaihtomenetelmällä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa:Example 61 pH-stability of samarium (III) complex of 1- (2-hydroxy-5-nitrobenzyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid 5 Heat and unheated sample according to Example 60 were each divided into two 250 μ1: η portions. The pH of the second batch was adjusted with HCl and the second with NaOH to the values shown in the following table. Once the desired pH was reached, the sample was allowed to stand for 10 minutes and 10% of the complexed metal was determined by the previously described cation exchange method. The results are shown in the following table:

Kompleksina (%) 15 nH --Complex (%) 15 nH -

Pn Kuumen-.Kuumen nettu tamaton 1 65 51 ~~ 3 *98 93 ~ 20 5 “ 99 99 7 100 100 9 TOO 99 ΤΪ T5Ö 96 25 13 100 ' 98Pn Hot-.Heat Frozen 1 65 51 ~~ 3 * 98 93 ~ 20 5 "99 99 7 100 100 9 TOO 99 ΤΪ T5Ö 96 25 13 100 '98

Esimerkki 62 1 — (2-hydroksi-5-aminobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium(III)-30 kompleksin valmistus * Valmistettiin 1-(2-hydroksi-5-aminobentsyyli)- 1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon (valmistettu esimerkin 26 mukaisella menettelytavalla) 3 x 10‘2 M liuos liuottamalla 3,2 mg sitä 100 pl:aan NANOpure™-35 vettä. 10 μ1:η erä tätä liuosta lisättiin 15 pl:aan 2 x 98 104898 ΙΟ'2 M SmCl3-vesiliuosta, johon oli lisätty Sm-153:a. Liuoksen tilavuus muodostettiin 1 ml:ksi lisäämällä siihen 950 μΐ tislattua vettä ja 20 μΐ 0,1 N NaOH:a. Tämä liuos jaettiin kahteen 500 ml:n osaan, joista toista kuumennet-5 tiin 1 tunti 100 eC:ssa. Sekä kuumennettu että kuumentamaton näyte tutkittiin kompleksina olevan metallin prosenttiosuuden määrittämiseksi aikaisemmin kuvattua kationin-vaihtomenettelyä käyttäen. Kun alle 95 % metallista oli kompleksoituneena, liuos laskettiin SP-Sephadex™-hartsin 10 läpi. Kompleksina olevan metallin prosenttiosuus määritettiin uudelleen. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa:Example 62 Preparation of 1- (2-hydroxy-5-aminobenzyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid samarium (III) -30 Complex 1- (2-Hydroxy- 5-aminobenzyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid (prepared by the procedure of Example 26) 3 x 10'2 M solution by dissolving 3.2 mg in 100 µl of NANOpure ™ -35 water. A 10 µl aliquot of this solution was added to 15 µl of 2 x 98 104898 ΙΟ2 M aqueous SmCl3 supplemented with Sm-153. The volume of the solution was made up to 1 ml by the addition of 950 μΐ of distilled water and 20 μΐ of 0.1 N NaOH. This solution was divided into two 500 ml portions, one of which was heated for 1 hour at 100 ° C. Both the heated and unheated sample were examined to determine the percentage of metal in the complex using the cation exchange procedure described above. When less than 95% of the metal was complexed, the solution was passed through SP-Sephadex ™ resin 10. The percentage of complex metal was re-determined. The results are shown in the following table:

Kuumennettu Kuumentamaton 15 -—----γ—-:-Heated Unheated 15 -—---- γ —-: -

Puhdis- Puhdis- Puhdis- Puhdistettu tamaton tettu tamatonPure Pure Pure Purified Tummy Tummy Tummy

Komplek- 99 68 99 21 sinä (%) 20Complete 99 68 99 21 you (%) 20

Esimerkki 63 1— (2-hydroksi-5-aminobentsyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium(III)-kompleksin pH-stabiilisuus V 25 Esimerkistä 62 peräisin olevat kuumennettu ja kuu mentamaton, puhdistettu näyte jaettiin kumpikin kahteen 250 μ1:η osaan. Toisen 250 μ1:η erän pH säädettiin HCl:lla ja toisen NaOH:lla seuraavassa taulukossa esitettyihin arvoihin. Kun haluttu pH oli saavutettu, näytteen annet-30 tiin seistä 10 minuuttia ja siitä määritettiin kompleksina .* olevan metallin prosenttiosuus aikaisemmin kuvatulla ka- tioninvaihtomenetelmällä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa: 99 104898Example 63 pH stability of the samarium (III) complex of 1- (2-hydroxy-5-aminobenzyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid the unheated, purified sample was each divided into two 250 μl portions. The pH of one batch of 250 μ1: η was adjusted with HCl and the other with NaOH to the values shown in the following table. Once the desired pH was reached, the sample was allowed to stand for 10 minutes and the percentage of metal present as a complex determined by the cation exchange method described above. The results are shown in the following table: 99 104898

Kompleksina (%) pH ,Kuumen- Kuumen nettu tamaton 1 60 56 2 74 76 3 84 87 5 97 98 10 7 ~ 99 99 9 99 98 11 99 99 13 9999 15 Käyttömenetelmät - biologiaComplex (%) pH, Heated Heated 1 60 56 2 74 76 3 84 87 5 97 98 10 7 ~ 99 99 9 99 98 11 99 99 13 9999 15 Methods of Use - Biology

Bifunktionaaliset kelaatinmuodostajat, jotka sisältävät samassa molekyylissä metallin kanssa kelaatin muodostavan ryhmän, kuten esimerkiksi DTPA:n, ja reaktiivisen 5 kytkentäryhmän (aryyliamiinin), tiedetään voitavan liittää kovalenttisesti erilaisiin kohteeseen ohjaaviin biomole-kyyleihin, jotka ovat spesifisiä syöpä- tai kasvainsolujen epitooppien tai antigeenien suhteen. Sellaisten konjugaat-tien sisältämät radionuklidikompleksit ovat käyttökelpoi-10 siä diagnostisissa ja/tai terapeuttisissa sovellutuksissa keinona kuljettaa radionuklidi kasvain- tai syöpäsoluun. [Lähdeviite: Meares et ai., Anal. Biochem. 142 (1984) 68 -78; tutustukaa myös pohdintaan Mearesin ja Goodwinin julkaisussa J. Protein Chem. 3 (1984), nro 2, sivuilla 215 -15 216; tuoreempia kirjallisuuslähteitä ovat US-patenttijul kaisu 4 678 677 (Meares), joka on julkaistu 7. heinäkuuta 1987, US-patenttijulkaisu 4 652 519 (Warshawsky et ai.), joka on julkaistu 24. maaliskuuta 1987, ja Brechbiel et ai., Inorg. Chem. 25 (1986) 2772 - 2781.] On ajateltavis-20 sa, että tuotteita, joissa käytetään radioaktiivisia tai loo 104898 luminesoivia metalleja, voidaan käyttää myös in vitro tehtävissä imuunimäärityksissä.Bifunctional chelating agents containing a chelating moiety in the same molecule as a metal, such as DTPA, and a reactive linking group (arylamine) are known to be covalently linked to various target-targeting biomolecules that are specific for cancer or tumor cells. The radionuclide complexes contained in such conjugates are useful for diagnostic and / or therapeutic applications as a means of transporting the radionuclide to a tumor or cancer cell. [Reference: Meares et al., Anal. Biochem. 142: 68-78 (1984); see also the discussion in Meares and Goodwin, J. Protein Chem. 3 (1984), No. 2, pp. 215-15156; more recent literature include U.S. Patent 4,678,677 (Meares), issued July 7, 1987, U.S. Patent 4,652,519 (Warshawsky et al.), issued March 24, 1987, and Brechbiel et al., Inorg . Chem. 25, 2772-2781 (1986). It is contemplated that products using radioactive or loo 104898 luminescent metals may also be used in in vitro immunoassays.

Taustatietojabackground information

Leimattujen vasta-aineiden käyttökelpoisuus riippuu 5 monista seikoista, esimerkiksi (1) vasta-aineen spesifisyydestä, (2) kompleksin inerttiydestä tai stabiilisuudes-ta käyttöolosuhteissa (so. stabiilisuudesta seerumissa) ja (3) vasta-aineen integriteetistä, ts. siitä, että leimaus-prosessi ei vaikuta haitallisesti vasta-aineen spesifisyy-10 teen tai immuunireaktiivisuuteen.The usefulness of labeled antibodies will depend on many factors, for example (1) antibody specificity, (2) complex inertness or stability under conditions of use (i.e., stability in serum), and (3) antibody integrity, i.e., labeling process does not adversely affect antibody specificity or immune reactivity.

Kompleksin stabiilisuus tai inerttiys on äärimmäisen tärkeätä, jotta radionuklidi-vasta-ainekonjugaatti on tehokas diagnostisena ja/tai terapeuttisena aineena. Kineettinen labiilisuus voi johtaa epästabiilisuuteen esi-15 merkiksi seerumissa ja radionuklidin eroamiseen kompleksista. Siten sen diagnostinen ja terapeuttinen tehokkuus alenee. Lisäksi mahdollisuus normaalille kudokselle aiheutuvaan yleiseen säteilyvaurioon kasvaa. [Cole et ai., J. Nucl. Med. 28 (1987) 83 - 90.] 20 Radionuklidin liittäminen vasta-aineeseenThe stability or inertness of the complex is extremely important for the radionuclide-antibody conjugate to be effective as a diagnostic and / or therapeutic agent. Kinetic lability can lead to instability in pre-15 serum and release of the radionuclide from the complex. Thus, its diagnostic and therapeutic efficacy is reduced. In addition, the potential for general radiation damage to normal tissue increases. [Cole et al., J. Nucl. Med. 28: 83-90 (1987).] 20 Addition of a radionuclide to an antibody

Radionuklidin liittäminen vasta-aineeseen voidaan toteuttaa konjugoimalla vasta-aine etukäteen muodostettuun (ympäristön tai korotettu lämpötila) metalli-BFC-kompleksiin. [Meares et. ai., Acc. Chem. Res. 17 (1984) 25 202 - 209.] Annetaan esimerkkejä:The incorporation of the radionuclide into the antibody can be accomplished by conjugating the antibody to a preformed (ambient or elevated temperature) metal BFC complex. [Meares et. al., Acc. Chem. Res. 17, 25, 202-209 (1984).] Examples are given:

Esimerkki ZA (vertailuesimerkki) 1-(4-isotiosyanaattobentsyyli)dietyleenitriamiini-pentaetikkahapon samarium-153-kompleksin konjugointi IgGthen ja CC-49:n F(ab')2:een; [153Sm (SCN-Bz-DTPA) ]-IgG ja 30 [153Sm (SCN-Bz-DTPA) ] -F (ab ' ) 2-fragmentti : 1-(4-isotiosyanaattobentsyyli)dietyleenitriamiini- pentaetikkahapon samarium-153-kompleksi [153Sm(SCN-Bz-DTPA) ] valmistettiin sekoittamalla 150 ^l:aan liuosta, joka sisälsi 153Sm: a 0,1 N HC1: ssa, 9 μΐ 1-(4-isotiosyanaattobent-35 syyli)dietyleenitriamiinipentaetikkahappoa, johon oli li- 101 104898 sätty HEPES-puskuria (0,5 M, pH 8,9, noin 30 μΐ) sen pH:n säätämiseksi suunnilleen arvoon 6. Konjugaation toteuttamiseksi 153Sm-kompleksiin sekoitettiin 22,5 x 10'9 mol IgG:tä tai CC-49:n F(ab')2:ta (proteiinin pitoisuus noin 5 1 x 10"4 mol/1 50 mmol:ssa HEPES:ää, pH 8,5) , ja pH säädet tiin natriumkarbonaattiliuosta (1,0 M, 12 - 15 μΐ) lisäämällä arvoon 8,9. Konjugointi tehtiin huoneen lämpötilassa (noin 25 °C) sen kestoajan ollessa noin 3 tuntia. 153Sm-kompleksilla leimattu IgG tai F(ab')2 eristettiin ja karak-10 terisoitiin esimerkissä XII kuvatulla tavalla.Example ZA (Comparative Example) Conjugation of 1- (4-isothiocyanate-benzyl) -diethylenetriamine-pentaacetic acid samarium-153 complex to IgG and F (ab ') 2 of CC-49; [153Sm (SCN-Bz-DTPA)] -IgG and 30 [153Sm (SCN-Bz-DTPA)] -F (ab ') 2 fragment: 1- (4-Isothiocyanate-benzyl) -diethylenetriaminepentaacetic acid samarium-153 complex [ 153Sm (SCN-Bz-DTPA)] was prepared by mixing with 150 µl of a solution of 153Sm in 0.1 N HCl, 9 μΐ of 1- (4-isothiocyanate-benz-35-yl) -diethylenetriaminepentaacetic acid. 104898 adjusted HEPES buffer (0.5 M, pH 8.9, about 30 μΐ) to adjust its pH to approximately 6. To effect conjugation, 153.5mg of IgG or CC-49 was mixed with the 153Sm complex. of F (ab ') 2 (protein concentration about 5 1 x 10 4 4 mol / L in 50 mmol HEPES, pH 8.5) and the pH was adjusted with sodium carbonate solution (1.0 M, 12- 15 μΐ) to 8.9 Conjugation was carried out at room temperature (about 25 ° C) for about 3 hours, IgG or F (ab ') 2 labeled with 153Sm complex was isolated and Karak-10 was sterilized as described in Example XII.

Biologiaa koskeva kokeellinen osaExperimental part on biology

Esimerkit I ja II sekä vertailuesimerkit A - D:Examples I and II and Comparative Examples A to D:

Bifunktionaalisten kelaattien tutkiminen in vivoIn vivo study of bifunctional chelates

Eräiden harvinaisten maametallien kelaattien sta-15 biilisuutta on testattu An vivo eläimillä. Esimerkiksi Rosoff et ai. ovat raportoineet julkaisussa International Journal of Applied Radiation and Isotopes 14 (1963) 129 -135 radioaktiivisten harvinaisten maametallien kelaattien jakautumisesta hiirissä tiettyjen aminokarboksyylihappojen 20 tapauksessa. Havaittiin, että in vivo "kelaatinmuodostajan ja elimistön aineosien (epäorgaanisten ja orgaanisten) välinen kilpailu harvinaisen maametallin ioneista määrää sen kerrostumisen ja erittymisen". Tämän keksinnön mukaisten harvinaisten maametallien vahvojen kelaattien arvel-: 25 laan hajoavan hyvin vähäisessä määrin ja erittyvän, kun sen sijaan alalla tunnetut heikot ja kestävuudeltään keskinkertaiset kelaatit hajoavat helpommin ja kerrostuvat siten elimiin, kuten esimerkiksi maksaan. Maksan radionuk-lidipitoisuus ei kuitenkaan aina aiheudu heikon kompleksin 30 muodostumisesta vaan on joissakin tapauksissa seurausta ·; metallikelaatin affiniteetista maksaan. Kelaatteja on itse asiassa valmistettu ja käytetty maksan toiminnan tutkimiseen (Alan R. fritzberg, Radiopharmaceuticals: Progress and Clinical Perspectives, osa 1, 1986; US-patenttijulkai-35 sut 4 088 747 ja 4 091 088) .The stability of some rare-earth metal chelates has been tested in An vivo animals. For example, Rosoff et al. have reported in International Journal of Applied Radiation and Isotopes 14, 129-135 (1963) the distribution of radioactive rare earth chelates in mice to certain aminocarboxylic acids. It was found that in vivo "competition between the chelating agent and constituents (inorganic and organic) of the rare earth ions determines its deposition and secretion". The strong earth chelates of the rare earth metals of this invention are expected to be degraded to a very small extent and excreted, whereas the weak and medium-strength chelates known in the art are more readily degraded and thus deposited in organs such as the liver. However, liver radionuclide content is not always due to the formation of a weak complex, but is in some cases the result of ·; the affinity of the metal chelate for the liver. In fact, chelates have been prepared and used to study liver function (Alan R. Fritzberg, Radiopharmaceuticals: Progress and Clinical Perspectives, Vol. 1, 1986; U.S. Patent Nos. 4,088,747 and 4,091,088).

102 104898102 104898

Esimerkin 3 mukaisen yhdisteen yttrium- ja samari-umkelaattien, jotka ovat esimerkkejä harvinaisten maame-tallien vahvoista kelaateista, biologinen jakautuminen määritettiin ja prosenttiosuutta annoksesta käytettiin in 5 vivo -tutkimusmenettelynä kelaattien stabiilisuuden arvi-oimisesti kvalitatiivisesti. NTA:n ja EDTA:n kelaatit ovat mukana vertailun vuoksi. Myös samariumia injektoitiin vertailuaineeksi kelatoimattomassa muodossa samariumkloridi-na.The biodistribution of the yttrium and samarium chelates of the compound of Example 3, which are examples of strong chelates of rare earth metals, was determined and a percentage of the dose was used as a qualitative evaluation of chelate stability in an in vivo assay. NTA and EDTA chelates are included for comparison purposes. Samarium was also injected as a reference substance in unchelated form as samarium chloride.

10 Sprague-Dawley-rotat, jotka painoivat 150 - 200 g, hankittiin Charles River Laboratoriesilta. Nämä eläimet sijoiitettiin häkkeihin, ja niille annettiin vettä ja ruokaa rajoittamattomasti. Eläimiä totutettiin oolosuhteisiin vähintään 5 vuorokauden ajan ennen käyttöä. Ennen komplek-15 sin injektointia eläimet sijoitettiin lämpölampun alle (15 - 30 minuutiksi) häntälaskimon laajentamiseksi. Sen jälkeen eläin laitettiin rajoittavaan häkkiin, häntä puhdistettiin alkoholilla pyyhkäisemällä ja eläimelle annettiin ruiske (50 - 200 μΐ) häntälaskimoon. Injektoinnin 20 jälkeen eläin sijoitettiin toiseen häkkiin 2 tunniksi, jonka jälkeen se lopetettiin katkaisemalla siltä kaula. Eläin leikeltiin sitten, osat huuhdottiin deionisoidulla vedellä, läpsäytettiin kuiviksi ja punnittiin laskentapul-loon, jonka oma paino oli määritetty. Valmistettiin vähin-: 25 tään 3 vertailunäytettä samasta aineesta, jota injektoi tiin, ja niistä suoritettiin laskenta eläinkudosten kanssa. Prosenttiosuus annoksesta on pulssien lukumäärä elimessä jaettuna pulssien lukumäärällä vertailunäytteessä kerrottuna 100:11a (ks. seuraava taulukko).10 Sprague-Dawley rats weighing 150-200 g were purchased from Charles River Laboratories. These animals were housed in cages and given unlimited water and food. Animals were acclimatized to the conditions for at least 5 days prior to use. Prior to the injection of complex 15, the animals were placed under a heat lamp (15-30 minutes) to dilate the tail vein. The animal was then placed in a confining cage, wiped with alcohol, and injected (50-200 μΐ) into the tail vein. After injection 20, the animal was placed in a second cage for 2 hours, after which it was sacrificed by neck dissection. The animal was then dissected, rinsed with deionized water, flushed dry and weighed into a weighing flask. At least 3 control samples of the same substance were injected and counted with animal tissues. The percentage of dose is the number of pulses in the organ divided by the number of pulses in the control sample multiplied by 100 (see table below).

30 « · 103 10489830 «· 103 104898

TaulukkoTable

Tiedot biologisesta jakautumisesta “ ’ : jMaksaan pää- 5 Esimerkki Ligandi esi- Metalli tyhyt osa(%h nro merkistä* injektoidus ta annoksesta Ϊ 3 Ϊ 0.17 II 3 Sm 0.29Biodistribution Data '': jThe liver 5 Example Ligand pre- Metal blank (% h no sign * of injected dose Ϊ 3 Ϊ 0.17 II 3 Sm 0.29

10 (A) ~ EDTA Sm__S.H10 (A) ~ EDTA Sm__S.H

(B) EDTA Sm (cl NTA Sm 8.6 (D) SmC1.3 Sm 39 15 *Kompleksien valmistuksessa käytettiin ligandi-metallisuh-detta 1:1 esimerkeissä I ja II, 5:1 esimerkeissä A ja noin 300:1 esimerkeissä 5 ja C.(B) EDTA Sm (cl NTA Sm 8.6 (D) SmC1.3 Sm 39 15) The ligand-metal ratio of 1: 1 in Examples I and II, 5: 1 in Examples A and about 300: 1 in Examples 5 and C was used to prepare the complexes. .

Esimerkit III ja EExamples III and E

Valmistettiin edellä kuvatuin menetelmin yttriumin 20 (johon oli lisätty pieni määrä 90Y:a) 1:1-kompleksit esimerkin 3 mukaisen ligandin kanssa, joka on BA-DOTA, ja EDTA:n (vertailuesimerkki E) kanssa. Muutama 100 pl:n erä siirrettiin sitten eri sentrifugiputkeen. Y(III):a lisättiin ylimäärin, niin että tilavuuden kokonaismuutos saa-. 25 tiin minimoiduksi, ja aika rekisteröitiin. Puolen tunnin kuluttua metallin lisäyksestä määritettiin kompleksin määrä prosentteina edellä kuvatulla kationinvaihtomenetelmäl-lä ja sitä verrattiin alkuperäiseen kompleksin määrään. Kompleksin määrä prosentteina lisätun metallin funktiona 30 antaa viitteen ligandi-metallikompleksin labiilisuudesta. .. Tulokset on esitetty taulukossa.By the methods described above, 1: 1 complexes of Yttrium 20 (to which a small amount of 90Y was added) were prepared with the ligand of Example 3, BA-DOTA, and EDTA (Comparative Example E). A few aliquots of 100 µl were then transferred to a separate centrifuge tube. Y (III) was added in excess so that the total volume change was obtained. 25 was minimized and time was recorded. After half an hour, the amount of addition of the metal complex as a percentage as described above kationinvaihtomenetelmäl-la and compared to the original amount of complex. The percentage of complex as a function of added metal provides an indication of the lability of the ligand-metal complex. .. The results are shown in the table.

104 104898104 104898

TaulukkoTable

Metallin ja li- Kompleksina (%) 5 gandin mooli- __Metal and Li- As a Complex (%) 5 gand mole __

SUhde 3A-D0TA EDTARatio 3A-D0TA EDTA

Ϊ 80 98 10 — 86 10 100 — 78 250 88 H8 500 80 16Ϊ 80 98 10 - 86 10 100 - 78 250 88 H8 500 80 16

Esimerkki IVExample IV

15 1- [2-(4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,10- tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium-153-kompleksin, [153Sm (SCN-EA-D03A) ] -kompleksin, valmistus1- [2- (4-Isothiocyanatophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid samarium-153 complex, [153Sm (SCN-EA-D03A)] - preparation of the complex

100 μl:aan. liuosta, joka sisälsi 153Sm:a 0,1 NTo 100 μl. solution containing 153Sm 0.1 N

HCl:ssa, lisättiin 5 μΐ SCN-EA-D03A:ta (5 mmol/1 50 mM 20 HEPES:ssä, pH 8,2). Tätä seosta sekoitettiin pyörresekoit-timessa ja siihen lisättiin vähitellen HEPES-puskuria (0,5 M, pH 8,9; yhteensä noin 25 μΐ) pH:n säätämiseksi suunnilleen arvoon 7. Kelaatin muodostumisen etenemistä seurattiin HPLC:llä GF-250 -kolonnia käyttäen (HPLC-sys-: 25 teemi I) . Saavutettiin noin 50 %:n saanto.In HCl, 5 μΐ SCN-EA-D03A (5 mmol / l in 50 mM 20 HEPES, pH 8.2) was added. This mixture was stirred in a vortex mixer and HEPES buffer (0.5 M, pH 8.9; total about 25 μΐ) was gradually added to adjust the pH to approximately 7. Chelation progress was monitored by HPLC using a GF-250 column. (HPLC sys-: Theme I). A yield of about 50% was obtained.

Esimerkki VExample V

tt-[2-(4-aminofenyyli)etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-tt- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid samarium-153-

kompleksin, [153Sm (PA-DOTA) ] -kompleksin, valmistus 30 150 μl:aa^n liuosta, joka sisälsi 153Sm:a 0,1 NPreparation of Complex, [153Sm (PA-DOTA)] Complex, 30 150 μl of a solution containing 153Sm in 0.1 N

HCl:ssa (noin 4,6 mCi), lisättiin 1 μΐ natriumasetaattia (2,0 M) ja 9 μΐ a-[2 -(4-aminofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,19-tetraetikkahapon ammo-nium-kaliumsekasuolaa (5 mmol 50 mmol:ssa HEPES:ää, pH 35 8,5, valmistettu esimerkin 9 mukaisella menettelytavalla).In HCl (about 4.6 mCi), 1 μΐ sodium acetate (2.0 M) and 9 μΐ α- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1 were added. Ammonium potassium mixed salt of 4,7,19-tetraacetic acid (5 mmol in 50 mmol HEPES, pH 35 8.5, prepared according to the procedure of Example 9).

105 1 0 4 8 9 8105 1 0 4 8 9 8

Seosta sekoitettiin mekaanisesti ja se titrattiin vähitellen HEPES-puskurilla (0,5 M, pH 8,9, lisäys noin 31 /il) pH-arvoon 7. Tätä seosta kuumennettiin sitten 98 °C:ssa hiukkahauteessa 1 tunti. Kuumennuksen päätyttyä 5 μΐ seok-5 sesta käytettiin analyysiin Mono-Q™-kolonnissa HPLC-sys-teemillä II käyttäen eluoinnissa gradienttiliuotinsystee-miä (0 - 15 minuuttia, 0 %:sta 100 %:iin B:tä; jossa systeemissä A = vesi ja B = 1,0 M ammoniumasetaatti, joka sisälsi 0,1 mmol EDTA:a). Saavutettiin 85 - 95 %:n saanto-10 ja 153Sm:iin perustuen. Näin valmistettu o- [2- (4-aminofenyy-li)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksi karakterisoitiin vertaamalla sen kromatografiakäyttäytymista Mono-Q™- ja GF-250-kolonnissa identtisen ei-radioaktiivisen näytteen 15 käyttäytymiseen.The mixture was mechanically stirred and titrated gradually with HEPES buffer (0.5 M, pH 8.9, about 31 µl) to pH 7. This mixture was then heated at 98 ° C in a particle bath for 1 hour. At the end of heating, 5 μΐ of Mixture-5 was used for analysis on a Mono-Q ™ column using HPLC system II, eluting with a gradient solvent system (0-15 minutes, 0% to 100% B; where A = water) and B = 1.0 M ammonium acetate containing 0.1 mmol EDTA). 85-95% yield based on 10 and 153Sm was achieved. The samarium-153 complex of o- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid thus prepared was characterized by comparing its chromatographic behavior with Mono-Q. ™ and GF-250 column for identical non-radioactive sample 15 behavior.

Lisäosoitusta radioaktiivisen kompleksin läsnäolosta hankittiin muuntamalla se isotiosyanaattojohdannaisek-seen ja konjugoimalla se sitten vasta-aineeseen. Kompleksi on myös valmistettu ilman kuumennusta (ympäristön lämpöti-20 lassa) 6-18 tuntia inkuboimalla, jolloin tuloksena oli 70 - 80 %:n saanto.Further evidence of the presence of the radioactive complex was obtained by converting it to an isothiocyanate derivative and then conjugating it to the antibody. The complex is also prepared without heating (at ambient temperature) for 6-18 hours incubation, resulting in a 70-80% yield.

Esimerkki VIExample VI

a - [2-(4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon sama-: 25 rium-153-kompleksin, [153Sm(SCN-PA-DOTA) ]-kompleksin, valmis tusα- [2- (4-Isothiocyanato-phenyl) -ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid identical to 253-153 complex, [153Sm (SCN-PA -DOTA)] complex

Esimerkissä V saatuun reaktioseokseen lisättiin 2 μΐ HEPES-puskuria (0,5 M, pH 8,9), 2 μΐ tiofosgeenia ja 0,2 ml kloroformia. Seosta sekoitettiin voimakkaasti me-30 kaanisesti 2 tai 3 kertaa muutama sekunti kerrallaan. Klo- *; roformikerros heitettiin pois ja vesikerros, joka sisälsi pääasiallisesti haluttua tuotetta, säästettiin ja puhdistettiin tarkemmin. a-[2-(4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkaha-35 pon samarium-153-kompleksin saanto oli HPLC:llä GF-250- 106 104898 kolonnissa HPLC-systeemiä I käyttäen tehdyn 153Sm-aktiivi-suusmittauksen perusteella 85 - 90 %. Vesikerros johdettiin sen puhdistamiseksi SEP-Pak™ C-18 -patruunan läpi ja eluoitiin asetonitriili-vesiseoksella, joka sisälsi 90 % 5 asetonitriiliä. Ensimmäiset 300 μΐ eluaattia heitettiin pois, ja seuraavissa 900 μΐ:ssa ulos tullut SCN-johdannainen karakterisoitiin HPLC:llä GF-250-kolonnissa. 153Sm-aktiivisuuden talteensaanti oli parempi kuin 90 %. Pääosa liuottimesta haihdutettiin sitten 1,5 - 2 tunnin 10 aikana, ja jäännös käytettiin vasta-aineeseen konjugointiin .To the reaction mixture obtained in Example V, 2 μΐ HEPES buffer (0.5 M, pH 8.9), 2 μΐ thiophosgene and 0.2 ml chloroform were added. The mixture was vigorously stirred me-30 2 or 3 times for a few seconds at a time. Cl *; the roform layer was discarded and the aqueous layer containing mainly the desired product was saved and further purified. The yield of the samarium-153 complex of α- [2- (4-isothiocyanatophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid-35-one was by HPLC GF-250 - 106 to 104898 columns based on 153Sm activity measurement using HPLC system I 85-90%. The aqueous layer was passed through a SEP-Pak ™ C-18 cartridge for purification and eluted with an acetonitrile-water mixture containing 90% 5 acetonitrile. The first 300 μΐ of eluate was discarded, and the subsequent 900 μ ulos of the SCN derivative was characterized by HPLC on a GF-250 column. Recovery of 153Sm activity was better than 90%. Most of the solvent was then evaporated over 1.5 to 2 hours and the residue used for conjugation to the antibody.

Esimerkki VIIExample VII

a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaa-ni-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksin, 15 [153Sm (BA-DOTA) ]-kompleksin, valmistusPreparation of α- (4-aminophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid samarium-153 complex, 15 [153Sm (BA-DOTA)] complex

200 ^l:aan liuosta, joka sisälsi 153Sm:a 0,1 N200 µl of a solution containing 153 Sm 0.1 N

HCl:ssa, lisättiin 1 μΐ natriumasetaattia (2,0 M) ja 12 μΐ a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,19-tetraetikkahappoa (5 mmol 50 mmol:ssa HEPES:ä, 20 pH 8,5; valmistettu esimerkin 3 mukaisella menetelmällä). Seosta sekoitettiin mekaanisesti ja se titrattiin vähitellen HEPES-puskurilla (0,5 M, pH 8,9, lisäys noin 38 μΐ) pH-arvoon 7. Tätä seosta kuumennettiin sitten 98 °C:ssa hiukkahauteessa 1 tunti. Kuumennuksen päätyttyä 5 μΐ seok-: 25 sesta käytettiin analyysiin Mono-Q™-kolonnissa (HPLC-sys- teemillä II, eluointi gradienttiliuotinsysteemillä: 0-15 minuuttia, 0 %:sta 100 %:iin B:tä; jossa systeemissä A = vesi ja B = 1,0 M ammoniumasetaatti, joka sisälsi 0,1 mmol EDTA:a) . Yleensä saavutettiin 85 - 95 %:n saantoja 153Sm:iin 30 perustuen. Kompleksi on valmistettu myös inkuboimalla ·; seosta huoneen lämpötilassa 12 - 18 tuntia, mikä johti otsikon mukaisen tuotteen saantoon 80 - 90 %. Näin valmistettu a-(4-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklodode-kaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksi 35 karakterisoitiin vertaamalla sen kromatografiakäyttäyty- 104898 mistä Mono-Q™-kolonnissa autenttisen näytteen käyttäytymiseen, muuntamalla se isotiosyanaattojohdannaisekseen ja konjugoimalla se sitten vasta-aineeseen.In HCl, 1 μΐ of sodium acetate (2.0 M) and 12 μΐ of α- (4-aminophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,19-tetraacetic acid (5 mmol) were added. in mmol HEPES, pH 8.5 (prepared by the method of Example 3). The mixture was mechanically stirred and titrated gradually with HEPES buffer (0.5 M, pH 8.9, approximately 38 μΐ) to pH 7. This mixture was then heated at 98 ° C in a particle bath for 1 hour. After heating, 5 μΐ of the mixture was used for analysis on a Mono-Q ™ column (HPLC system II, gradient solvent elution: 0-15 minutes, 0% to 100% B, where A = water) and B = 1.0 M ammonium acetate containing 0.1 mmol EDTA). Generally, 85-95% yields based on 153Sm were achieved. The complex is also prepared by incubation ·; mixture at room temperature for 12-18 hours resulting in 80-90% yield of the title product. The samarium-153 complex of α- (4-aminophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid 35 thus prepared was characterized by comparing its chromatographic behavior from Mono-Q ™. column to convert the authentic sample to its isothiocyanate derivative and then conjugate it to the antibody.

Esimerkki VIIIExample VIII

5 a-(4-isotiosyanaattofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksin, [153Sm(SCN-BA-DOTA) ] -kompleksin, valmistus5α- (4-Isothiocyanate-phenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid samarium-153 complex, [153Sm (SCN-BA-DOTA)] complex , manufacture

Esimerkissä VII saatuiin reaktioseokseen lisättiin 2 μΐ HEPES-puskuria (0,5 M, pH 8,9), 2 μΐ tiofosgeenia ja 10 0,2 ml kloroformia. Seosta sekoitettiin voimakkaasti me kaanisesti 2 tai 3 kertaa muutama sekunti kerrallaan. Klorof ormikerros heitettiin pois ja vesikerros, joka sisälsi pääasiallisesti haluttua tuotetta, säästettiin ja puhdistettiin tarkemmin, a-(4-isotiosyanaattofenyyli)-1,4,7,10-15 tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon sama rium- 153 -kompleksin saanto oli HPLC:llä GF-250-kolonnissa HPLC-systeemiä I käyttäen tehdyn, 153Sm-aktiivisuuteen perustuvan analyysin mukaan yli 90 %. Vesikerros johdettiin sen puhdistamiseksi SEP-Pak™ C-18 -patruunan läpi ja elu-20 oitiin asetonitriili-vesiseoksella, joka sisälsi 90 % ase-tonitriiliä. Ensimmäiset 0,3 ml eluaattia heitettiin pois, ja haluttu tuote tuli ulos seuraavissa 1,2 ml:ssa saannon ollessa 86 - 93 %. Pääosa liuottimesta haihdutettiin sitten noin 2 tunnin aikana, ja jäännös käytettiin vasta-ai-; · 25 neeseen konjugointiin.To the reaction mixture obtained in Example VII was added 2 μΐ HEPES buffer (0.5 M, pH 8.9), 2 μΐ thiophosgene and 10 0.2 ml chloroform. The mixture was vigorously stirred mechanically 2 or 3 times for a few seconds at a time. The chloroform layer was discarded and the aqueous layer containing mainly the desired product was spared and further purified, the same as α- (4-isothiocyanatophenyl) -1,4,7,10-15 tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid The yield of the 153 complex was greater than 90% by HPLC on a GF-250 column using HPLC system I based on 153Sm activity. The aqueous layer was passed through a SEP-Pak ™ C-18 cartridge for purification and eluted with an acetonitrile-water mixture containing 90% acetonitrile. The first 0.3 mL of eluate was discarded, and the desired product came out in the next 1.2 mL in a 86-93% yield. Most of the solvent was then evaporated for about 2 hours and the residue was used in an · 25 conjugations.

Esimerkki IXExample IX

1- [2- (4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium-153-kompleksin konjugointi vasta-aineeseen; [153Sm(SCN-EA-30 D03A)]-IgG-konjugaatti ·;· Käytetty vasta-aine oli CC-49, hiiren monoklonaali- nen IgG, joka sitoutuu TAG-72:n, kasvaimiin yhteydessä olevan antigeenin, epitooppiin. Konjugaation toteuttamiseksi 187 μΐ :aan vasta-aineliuosta (1,20 x 10'4 mol/1 50 mM 35 HEPES :ssä, pH 8,5) sekoitettiin 4,5 x 10*8 mol 153Sm(SCN-EA- 109 1 0 4 8 9 8 D03A):ta, joka oli valmistettu esimerkissä IV kuvatulla tavalla, ja seokseen lisättiin sen jälkeen natriumkarbo-naattiliuosta (1,0 M) sen pH:n nostamiseksi arvoon 8,9. Reaktion annettiin jatkua 2 tuntia huoneen lämpötilassa.Conjugating the samarium-153 complex of 1- [2- (4-isothiocyanatophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid to the antibody; [153Sm (SCN-EA-30 D03A)] - IgG Conjugate ·; · The antibody used was the epitope of CC-49, a murine monoclonal IgG that binds TAG-72, a tumor-associated antigen. To effect conjugation, 187 μΐ antibody solution (1.20 x 10'4 mol / l in 50 mM 35 HEPES, pH 8.5) was mixed with 4.5 x 10 x 8 mol 153Sm (SCN-EA-10910). 4,8 9,8 D03A) prepared as described in Example IV and then sodium carbonate solution (1.0 M) was added to the mixture to raise its pH to 8.9. The reaction was allowed to proceed for 2 hours at room temperature.

5 Sen päätyttyä 153Sm:lla leimattu IgG eristettiin keskipako-geelisuodatuksella Sephadex GF-25 (2,2 ml) -kertakäyttöko-lonneissa ja puhdistettiin edelleen HPLC:llä GF-250-kolon-nissa käyttäen eluenttina sitraattipuskuria (0,25 M, pH 7,4). Leimattua IgG:tä sisältävät jakeet yhdistettiin ja 10 väkevöitiin ja tehtiin vaihto (3 x) PBSrään Centricon™-väkevöintilaitteita käyttäen. Näin valmistetun 1S3Sm:llä leimatun IgG:n ominaisaktiivisuus oli noin 0,16 μCi/μg proteiinia. [153Sm(SCN-EA-D03A) ] -IgG-valmisteen integriteetti varmistettiin HPLC:llä [S. I. Sivakoff, BioChrom 1 15 (1986) , nro 1, 42 - 48] ja tavanomaisin biokemiallisin menettelytavoin, esimerkiksi natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja autoradiografi-alla sekä radioimmunologisella kiinteäfaasimäärityksellä (RIA) . [Ks. David Colcher et ai., Cancer Res. 43 (1983) 20 736 - 742.]Upon completion, 153Sm-labeled IgG was isolated by centrifugal gel filtration in Sephadex GF-25 (2.2 mL) disposable columns and further purified by HPLC on a GF-250 column using citrate buffer (0.25 M, pH 7 as eluent). , 4). The fractions containing labeled IgG were combined and concentrated and exchanged (3x) with PBS using Centricon ™ concentrators. The 1S3Sm-labeled IgG so prepared had a specific activity of about 0.16 μCi / μg protein. The integrity of [153Sm (SCN-EA-D03A)] -IgG was confirmed by HPLC [S. I. Sivakoff, BioChrom 1 15 (1986), No. 1, 42-48] and by conventional biochemical procedures, for example, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis and autoradiography, and radioimmuno-solid phase assay (RIA). [See. David Colcher et al., Cancer Res. 43: 20736-742 (1983).]

Esimerkki XExample X.

1- [2- (4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-4,7,10-trietikkahapon samarium-153-kompleksin konjugointi CC-49:n F (ab') 2-fragmenttiin; 25 [153Sm (SCN-EA-D03A) ] - CC-49-F (ab ' ) 2-fragmenttiConjugation of the samarium-153 complex of 1- [2- (4-isothiocyanato-phenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid to F (ab ') 2- of CC-49 fragment; 25 [153Sm (SCN-EA-D03A)] - CC-49-F (ab ') 2 fragment

CC-49 : n F (ab') 2-f ragmenttiin, joka oli valmistettu entsymaattisesti hajottamalla Lamoyin ja Nisonoffin esittämällä menettelytavalla [E. Lamoyi ja A. Nisonoff, J. Immunol. Methods 56 (1983) 235 - 243] (225 μΐ 1 x 10‘4 MTo the F (ab ') 2-fragment of CC-49 prepared by enzymatic digestion according to the procedure described by Lamoyin and Nisonoff [E. Lamoyi and A. Nisonoff, J. Immunol. Methods 56: 235-243 (1983) (225 μΐ 1 × 10′4 M)

30 liuosta, jossa liuottimena oli 50 mM HEPES, pH 8,5) sekoitettiin 2,9 x 10'8 mol esimerkissä IV kuvatulla tavalla valmistettua 1S3Sm(SCN-EA-D03A) :ta. Lisättiin natriumkarbonaattia (1,0 M, noin 5 μΐ) pH:n säätämiseksi arvoon 8,9, ja reaktiota jatkettiin noin 2,5 tuntia. Sen päätyttyä 109 104898 153Sm:lla leimattu fragmentti eristettiin ja karakterisoitiin esimerkissä IX kuvatulla tavalla.30 solutions of 50 mM HEPES, pH 8.5) were mixed with 2.9 x 10 -8 mol of 1S3Sm (SCN-EA-D03A) prepared as described in Example IV. Sodium carbonate (1.0 M, about 5 μΐ) was added to adjust the pH to 8.9, and the reaction was continued for about 2.5 hours. Upon completion, 109-104898 153Sm-labeled fragment was isolated and characterized as described in Example IX.

Esimerkki XI (A ja B) [153Sm(EA-D03A) ] -IgG:n ja [153Sm(EA-D03A) ] -F (ab' )2:n 5 paikallistaminen in vivo t153Sm(EA-D03A) ] :11a leimatun CC-49:n IgG:n (esimerkistä IX) ja F(ab')2:n (esimerkistä X) käyttökelpoisuutta havainnollistettiin leimattujen materiaalien kerääntymisellä kateenkorvattomien hiirien ihmisestä peräisin olevan 10 kasvainsiirrännäiseen. Kateenkorvattorniin naarashiiriin (Nu/Nu, CDl-tausta) inokuloitiin subkutaanisesti (s.c.) (0,1 ml/lähde) ihmisen paksusuolensyöpäsolulinjaa, LS-174 T (noin 1 x 106 solua/eläin) . Noin 2 viikon kuluttua inokulaatiosta kuhun eläimeen ruiskutettiin häntälaskimon 15 kautta noin 2 μ(Γϊ (15 - 30 μg) 153Sm:lla leimattua vasta-ainetta PBS:ssä. Hiiret lopetettiin erilaisin aikavälein. Verettömäksi tekemisen jälkeen kasvain ja tietyt kudokset leikattiin irti ja punnittiin, ja niiden radioaktiivisuus mitattiin gamma-laskurilla. Määritettiin 153Sm:n aiheuttama 2 0 pulssimäärä minuutissa (min"1) kussakin kudoksessa, ja se on ilmoitettu yksikkönä min'Vgramma kudosta injektoitua annosta kohden kerrottuna 100:11a (prosenttia injektoidusta annoksesta/gramma). Tulokset on esitetty kuvissa 1-14 ja taulukoissa IA ja IB. 153Sm(SCN-Bz-DTPA) :11a leimattu IgG j'" 25 ja CC-49:n F(ab')2 (esimerkistä ZA) otettiin mukaan tutki- mukseen vertailun vuoksi. Tulokset on esitetty taulukoissa IC ja ID.Example XI In vivo localization of [153Sm (EA-D03A)] -IgG and [153Sm (EA-D03A)] -F (ab ') 2 with t153Sm (EA-D03A)] the utility of labeled CC-49 IgG (from Example IX) and F (ab ') 2 (from Example X) was demonstrated by the accumulation of labeled materials in human tumorous graft of nude mice. Female thymus mice (Nu / Nu, CD1 background) were inoculated subcutaneously (s.c.) (0.1 ml / source) in a human colon cancer cell line, LS-174T (about 1 x 10 6 cells / animal). Approximately 2 weeks after inoculation, each animal was injected via tail vein 15 with approximately 2 μ (Γϊ (15-30 μg)) of 153Sm-labeled antibody in PBS. Mice were sacrificed at various intervals. After bleeding, tumor and certain tissues were excised and and their radioactivity was measured with a gamma counter. The number of pulses per minute (min "1) caused by 153Sm in each tissue was determined and expressed as min'Vgram of tissue per injection dose multiplied by 100 (% of injected dose / gram). are shown in Figures 1-14 and Tables IA and IB. IgG j '25 labeled with 153Sm (SCN-Bz-DTPA) and F (ab') 2 of CC-49 (from Example ZA) were included in the study. The results are shown in Tables IC and ID.

Esimerkki XIIExample XII

a - [2- (4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-30 tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon sama- ·· rium-153-kompleksin konjugointi vasta-aineeseen; [153Sm(SCN- PA-DOTA)]-IgG-konjugaatti Käytetty vasta-aine oli CC-49, hiiren monoklonaali-nen IgG, joka sitoutuu TAG-72:n, kasvaimiin yhteydessä 35 olevan antigeenin, epitooppiin. Konjugaation toteuttami- 110 104898 seksi 178 μΐ:aan vasta-aineliuosta (1,26 x 10'4 mol/1 50 mM HEPES: ssä, pH 8,5) sekoitettiin 3,4 x 10~8 mol a-[2-(4-iso-tiosyanaattofenyyli)etyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklodode-kaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksia 5 (valmistettu esimerkissä VI kuvatulla tavalla), ja seokseen lisättiin sen jälkeen natriumkarbonaattiliuosta (1,0 M, noin 17 μΐ) sen pH:n nostamiseksi arvoon 8,9. Reaktion annettiin jatkua 2 tuntia huoneen lämpötilassa. Sen päätyttyä 153Sm:lla leimattu IgG eristettiin keskipako-10 geelisuodatuksella Sephadex™ GF-25 (2,2 ml) -kertakäyttö-kolonneissa ja puhdistettiin edelleen HPLC:llä GF-250-kolonnissa käyttäen eluenttina sitraattipuskuria (0,25 M, pH 7,4). Leimattua IgG:tä sisältävät jakeet yhdistettiin ja väkevöitiin ja tehtiin vaihto (3 x) PBS:ään Centricon™-15 väkevöintilaitteita käyttäen. Näin valmistetun 153Sm:llä leimatun IgG:n ominaisaktiivisuus oli noin 0,16 μCi/μg proteiinia. a-[2-(4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli] -1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksi-IgG-valmisteen homogeenisuus ja 20 integriteetti varmistettiin HPLC:llä ja tavanomaisin biokemiallisin menettelytavoin kuten esimerkissä IX.conjugation of α- [2- (4-isothiocyanatophenyl) ethyl] -1,4,7,10-30 tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid complex to the antibody; [153Sm (SCN-PA-DOTA)] - IgG Conjugate The antibody used was the epitope of CC-49, a murine monoclonal IgG that binds to TAG-72, an antigen associated with tumors. To perform conjugation, 110 104898 sex of 178 μΐ antibody solution (1.26 x 10 4 mol / l in 50 mM HEPES, pH 8.5) was mixed with 3.4 x 10 ~ 8 mol a- [2- ( 4-Isothiocyanate-phenyl) -ethyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid samarium-153 complex 5 (prepared as described in Example VI) and added to the mixture. sodium carbonate solution (1.0 M, about 17 μΐ) to raise its pH to 8.9. The reaction was allowed to proceed for 2 hours at room temperature. Upon completion, 153Sm-labeled IgG was isolated by centrifugal gel filtration on Sephadex ™ GF-25 (2.2 mL) disposable columns and further purified by HPLC on a GF-250 column using citrate buffer (0.25 M, pH 7, eluent) as the eluent. 4). Fractions containing labeled IgG were pooled and concentrated and exchanged (3x) with PBS using Centricon ™ -15 concentrators. The 153Sm-labeled IgG so prepared had a specific activity of about 0.16 μCi / μg protein. The homogeneity and integrity of the samarium-153 complex IgG preparation of α- [2- (4-isothiocyanatophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid was confirmed by HPLC: and standard biochemical procedures as in Example IX.

Esimerkki XIIIExample XIII

a- [2-(4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l, 4 ,7,10-tetraetikkahapon sama-' 25 rium-153-kompleksin konjugointi CC-49:n F (ab' ) 2-fragmenttiin; [153Sm (SCN-PA-DOTA) ] - CC-49-F (ab') 2-f ragmentti CC-49:n F (ab') 2-fragmenttiin [joka oli valmistettu entsymaattisesti hajottamalla menettelytavalla, jonka ovat esittäneet E. Lamoyi et ai., J. Immunol. Methods 56 (1983) 30 235 - 243] (225 μΐ 1 x ΙΟ'4 M liuosta, jossa liuottimena .. oli 50 mmol HEPES:ää, pH 8,5) sekoitettiin 2,9 x 10"8 mol esimerkissä VI kuvatulla tavalla valmistettua a-[2-(4-iso-tiosyanaattifenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-l, 4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksia. 35 Lisättiin natriumkarbonaattia (1,0 M, noin 9 μΐ) pH:n sää- 104898 tämiseksi suunnilleen arvoon 8,9, ja reaktiota jatkettiin noin 2,5 tuntia. 153Sm:lla leimattu fragmentti eristettiin ja karakterisoitiin esimerkissä IX kuvatulla tavalla. Omi-naisaktiivisuus oli noin 0,4 μα/μ%.Conjugation of α- [2- (4-Isothiocyanate-Phenyl) -ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid Compound 153 of CC-49 (ab ') 2 fragment; [153Sm (SCN-PA-DOTA)] - CC-49-F (ab ') 2 -f fragment to F-ab' 2 'fragment of CC-49 [prepared by the enzymatic degradation procedure of E. Lamoyi et al., J. Immunol. Methods 56, 30 235-243 (1983) (225 μΐ 1x ΙΟ 4 M solution containing 50 mmol HEPES, pH 8.5) was mixed with 2.9 x 10 "8 mol as described in Example VI. Prepared α- [2- (4-iso-thiocyanate-phenyl) -ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid samarium-153. Compound sodium carbonate (1.0) was added. M, about 9 μΐ) to adjust the pH to 104898 to approximately 8.9, and the reaction was continued for about 2.5 hours The 153Sm-labeled fragment was isolated and characterized as described in Example IX. / μ%.

5 Esimerkki XIV (A ja B) «- [2- (4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon sama-rium-153-kompleksilla leimatun IgG:n tai F(ab')2:n muodostaman konjugaatin, [153Sm(SCN-PA-DOTA) ]-IgG:n ja [153Sm(SCN-10 PA-DOTA)]-F(ab1)2:n, paikallistaminen in vivo a- [2- (4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium- 153 -kompleksilla leimatun CC-49:n IgG:n tai F(ab')2:n (esimerkeistä XII ja XIII) käyttökelpoisuutta havainnol-15 listettiin leimattujen materiaalien kerääntymisellä ka-teenkorvattomien hiirien ihmisestä peräisin olevaan kas-vainsiirrännäiseen. Biologinen jakautuminen määritettiin esimerkissä XI kuvatulla menetelmällä. Tulokset on esitetty kuvissa 1-7 IgG:n tapauksessa ja kuvissa 8-14 20 F(ab')2:n tapauksessa; ks. myös taulukot IIA ja IIB.Example XIV (A and B) N - [2- (4-Isothiocyanatophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid labeled with the samium-153 complex IgG or F (ab ') 2 conjugate, [153Sm (SCN-PA-DOTA)] -IgG and [153Sm (SCN-10 PA-DOTA)] -F (ab1) 2, localization in vivo of IgG of CC-49 labeled with α- [2- (4-isothiocyanatophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid samarium-153 complex: The utility of n or F (ab ') 2 (from Examples XII and XIII) was demonstrated by the accumulation of labeled material in human tumorous graft of nude mice. The biodistribution was determined by the method described in Example XI. The results are shown in Figures 1-7 for IgG and Figures 8-14 for F (ab ') 2; see. See also Tables IIA and IIB.

153Sm(SCN-Bz-DTPA) :11a leimattu IgG ja CC-49:n F(ab')2 (valmistettu esimerkissä ZA) otettiin mukaan tutkimukseen vertailun vuoksi. [Ks. taulukot IC ja ID.] Esimerkki XV153Sm (SCN-Bz-DTPA) -labeled IgG and CC-49 F (ab ') 2 (prepared in Example ZA) were included in the study for comparison. [See. Tables IC and ID.] Example XV

: 25 a-(4-isotiosyanaattofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa- syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksin konjugointi vasta-aineeseen; [153Sm (SCN-BA-DOTA)]-IgG-konjugaatti CC-49:n kokonaiseen IgG:hen (174 μΐ 1,2 x 10'4 mol/1 30 0,25 M HEPES:ssä, pH 8,7) sekoitettiin 2,0 x 10'8 mol a-(4- Γ* isotiosyanaattifenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsasyklododekaani- 1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksia (2,8 mCi), joka oli valmistettu esimerkin VIII mukaisesti, ja seokseen lisättiin sen jälkeen natriumkarbonaattiliuos-35 ta (1,0 M, noin 2 μΐ) sen pH:n pitämiseksi suunnilleen 112 104898 arvossa 8,7. Reaktion annettiin jatkua 2,5 tuntia huoneen lämpötilassa. Sen päätyttyä 153Sm:lla leimattu IgG eristettiin keskipakogeelisuodatuksella Sephadex™ GF-25 (2,2 ml) -kertakäyttökolonneissa ja puhdistettiin edelleen HPLC:llä 5 GF-250-kolonnissa käyttäen eluenttina sitraattipuskuria (0,25 M, pH 7,4). Leimattua IgGrtä sisältävät jakeet yhdistettiin ja väkevöitiin ja tehtiin vaihto (kolmesti) PBS:ään Centricon™-väkevöintilaitteita käyttäen. ls3Sm:llä leimatun IgG-valmisteen homogeenisuus ja integriteetti 10 varmistettiin HPLCrllä ja tavanomaisin biokemiallisin menettelytavoin, kuten esimerkissä IX on esitetty.: Conjugation of 25 α- (4-isothiocyanatophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid samarium-153 complex to antibody; [153Sm (SCN-BA-DOTA)] - IgG Conjugate to Total IgG of CC-49 (174 μΐ 1.2 x 10'4 mol / L in 0.25 M HEPES, pH 8.7) 2.0 x 10'8 mol of α- (4- Γ * isothiocyanate-phenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid samarium-153 complex (2.8 mCi ) prepared according to Example VIII and then sodium carbonate solution (35 M, 1.0 M, about 2 μΐ) was then added to the mixture to maintain its pH at about 112 104898 at 8.7. The reaction was allowed to proceed for 2.5 hours at room temperature. Upon completion, 153Sm-labeled IgG was isolated by centrifugal filtration on Sephadex ™ GF-25 (2.2 mL) disposable columns and further purified by HPLC on a 5 GF-250 column using citrate buffer (0.25 M, pH 7.4) as eluent. Fractions containing labeled IgG were pooled and concentrated and exchanged (three times) with PBS using Centricon ™ concentrators. The homogeneity and integrity of the IgG preparation labeled with ls3Sm were confirmed by HPLC and standard biochemical procedures as set forth in Example IX.

Esimerkki XVIExample XVI

a - (4 - isotiosyanaattofenyyli)-1,4,7,10 -tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153- 15 kompleksin konjugointi CC-49:n F (ab1) 2-fragmenttiin; [153Sm (SCN-BA-DOTA) ] - CC-49-F (ab' ) 2-fragmentti CC-49:n F (ab ' ) 2-f ragmenttiin (84 μΐ 2,4 x 10'4 M liuosta, jossa liuottimena oli 0,25 M HEPES-puskuri, pH 8,7), joka oli valmistettu entsymaattisesti hajottamal-20 la menettelytavalla, jonka ovat esittäneet E. Lamoyi et ai., sekoitettiin 2,1 x 10~B mol a-(4-isotiosyanaattofenyy-li)-1,4,7,10 -tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153-kompleksia (valmistettu esimerkin VIII mukaisella menettelytavalla). Lisättiin natriumkarbo-; · ' 25 naattia (1,0 M, noin 2 μΐ) pH:n säätämiseksi suunnilleen arvoon 8,7, ja reaktiota jatkettiin noin 2 tuntia. Sen päätyttyä 153Sm:lla leimattu fragmentti eristettiin ja karakterisoitiin esimerkissä IX kuvatulla tavalla.Conjugation of the α- (4-isothiocyanate-phenyl) -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid samarium-153-15 complex to the F (ab1) 2 fragment of CC-49 ; [153Sm (SCN-BA-DOTA)] - CC-49-F (ab ') 2 fragment to CC-49 F (ab') 2 -f fragment (84 μΐ 2.4 x 10'4 M solution, with 0.25 M HEPES buffer, pH 8.7) prepared by enzymatic digestion according to the procedure of E. Lamoyi et al., mixed with 2.1 x 10 ~ B mol a- (4 -isothiocyanatophenyl) -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid samarium-153 complex (prepared according to the procedure of Example VIII). Sodium carbo- was added; 25 N (1.0 M, about 2 μΐ) to adjust the pH to approximately 8.7, and the reaction was continued for approximately 2 hours. Upon completion, the 153Sm-labeled fragment was isolated and characterized as described in Example IX.

Esimerkki XVII (A ja B) 30 a-(4-isotiosyanaattofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa- ;· syklododekaani-l,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153- kompleksilla leimatun IgG:n (esimerkki XV) ja F(ab')2:n (esimerkki XVI) , [153Sm (BA-DOTA) ]-IgG:n ja [153Sm (BA-DOTA) ] - F(ab')2:n, paikallistaminen in vivo 113 104898Example XVII (A and B) IgG of 30α- (4-Isothiocyanato-phenyl) -1,4,7,10-tetraaza-aza-cyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid labeled with samarium-153 (Example XV) and F (ab ') 2 (Example XVI), [153Sm (BA-DOTA)] -IgG and [153Sm (BA-DOTA)] -F (ab') 2 in vivo 113 104898

In vivo -tutkimukset tehtiin esimerkissä XI kuvatulla tavalla, ja tulokset on esitetty kuvissa 1 - 14 ja taulukoissa IIIA ja IIIB.In vivo studies were performed as described in Example XI and the results are shown in Figures 1-14 and Tables IIIA and IIIB.

Esimerkki XVIII (A ja B) 5 a-[2-(4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,10- tetra-atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon 177Lu-kompleksilla leimatun IgG:n ja F(ab')2:n, [177Lu (PA-DOTA) ] -Example XVIII (A and B) 5α- [2- (4-Isothiocyanatophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid 177Lu complex-labeled IgG and F (ab ') 2, [177Lu (PA-DOTA)] -

IgG:n ja [177Lu (PA-DOTA) ] -F (ab1 ) 2 :n, paikallistaminen in vivo 10 Otsikon mukaiset yhdisteet valmistettiin ja in vivo -tutkimukset tehtiin esimerkeissä V, VI, XI, XII ja XIII kuvatulla tavalla, ja tulokset on esitetty taulukoissa IVA ja IVB.In vivo localization of IgG and [177Lu (PA-DOTA)] -F (ab1) 2 The title compounds were prepared and in vivo assays were performed as described in Examples V, VI, XI, XII and XIII, and the results are shown in Tables IVA and IVB.

Esimerkki XIX (A ja B) 15 a- [2-(4-isotiosyanaattofenyyli)etyyli]-1,4,7,10- tetra- atsasyklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon yttrium-90-kompleksilla leimatun IgG:n ja F(ab')2:n, [90Y- (PA-DOTA) ]-IgG:n ja [90Y(PA-DOTA) ] -F (ab*) 2 :n, paikallistaminen in vivo 20 Otsikon mukaiset yhdisteet valmistettiin ja in vivo -tutkimukset tehtiin esimerkissä XI kuvatulla tavalla, paitsi että kudokset hajotettiin ja niille suoritettiin nestetuikelaskenta, ja tulokset on esitetty taulukoissa VA ja VB.Example XIX (A and B) IgG Labeled with 15α- [2- (4-Isothiocyanato-phenyl) -ethyl] -1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid Yttrium-90 Complex: in vivo localization of n and F (ab ') 2, [90Y- (PA-DOTA)] -IgG and [90Y (PA-DOTA)] -F (ab *) 2 were prepared and in vivo studies were performed as described in Example XI except that the tissues were disrupted and subjected to liquid scintillation counting, and the results are shown in Tables VA and VB.

: 25 Esimerkki XX: 25 Example XX

[153Sm (BFC) ] -CC-49-IgG:n ja [177Lu (BFC) ] -CC-49-IgG:n pH-stabiilisuus in vitro [153Sm(BFC) ] -CC-49-IgG:n tai [177Lu (BFC) ]-CC-49-IgG: n annettin seistä 0,2 M NaOAc-puskurissa pHrssa 6,0, 4,0 ja 30 2,8 huoneen lämpötilassa proteiinipitoisuuden ollessa noin Γ 5 x 10~6 mol/1 ja kompleksin ja vasta-aineen suhteen olles sa noin 0,5. Näytteitä otettiin tietyin aikavälein, ja ne analysoitiin HPLC:llä (GF-250 -kolonni) 153Sm- tai 177Lu-ak-tiivisuuden häviämisen proteiinista määrittämiseksi. Tut- 35 kimus kesti yleensä 5 vuorokautta tai siihen saakka, että 104898 90 % radioisotoopeista oli dissosioitunut. Tulokset on ilmoitettu radioisotooppihäviön alkunopeutena vuorokaudessa. Tulokset osoittivat 153Sm (PA-DOTA) : n, 177Lu (PA-DOTA) : n, 153Sm (BA-DOTA) :n, 153Sm (PA-DOTMA) :n ja 153Sm (MeO-BA-DOTA) :n 5 erinomaisen stabiilisuuden happamalla pH-alueella vertai-lukompleksiin 153Sm (Bz-DTPA) nähden. Tulokset on esitetty alla olevassa taulukossa.In vitro pH stability of [153Sm (BFC)] -CC-49-IgG and [177Lu (BFC)] -CC-49-IgG or [153Sm (BFC)] -CC-49-IgG or [ 177Lu (BFC)] -CC-49-IgG was allowed to stand in 0.2 M NaOAc buffer at pH 6.0, 4.0 and 2.8 at room temperature with a protein concentration of about Γ5x10 106 mol / l and with the complex and the antibody being about 0.5. Samples were taken at specific time intervals and analyzed by HPLC (GF-250 column) to determine the loss of 153Sm or 177Lu activity from the protein. The study generally lasted 5 days or until 104898 90% of the radioisotopes were dissociated. The results are expressed as the initial daily rate of radioisotopic loss. The results showed 5 excellent values for 153Sm (PA-DOTA), 177Lu (PA-DOTA), 153Sm (BA-DOTA), 153Sm (PA-DOTMA) and 153Sm (MeO-BA-DOTA). stability in the acidic pH range with reference complex 153Sm (Bz-DTPA). The results are shown in the table below.

Tämä kompleksien suurempi stabiilisuus in vitro korreloi myös hyvin 153Sm:n ja 177Lu:n nopeamman elimistöstä 10 ja ei-kohdekudoksista (esim. munuaisesta, maksasta) poistumisen kanssa; ks. kuvat 1-34.This greater stability of the complexes in vitro also correlates well with the faster elimination of 153Sm and 177Lu from the body 10 and non-target tissues (e.g., kidney, liver); see. Figures 1-34.

Isotooppihäviö (%)/vuorokausi SPC Isotooppi pHIsotope loss (%) / day SPC Isotope pH

15 6,0 V 2?815 6.0 V 2? 8

Bz-DTPA 'IDJSm <2 35 35 PA-DOTA '^Sm <2 <2 <2 BA-DOTA 1^Sm <2 <2 <2 PA-DOTA ^'<Lu <2 <2 <2 20 j -- " —---------------Bz-DTPA 'IDJSm <2 35 35 PA-DOTA' ^ Sm <2 <2 <2 BA-DOTA 1 ^ Sm <2 <2 <2 PA-DOTA ^ '<Lu <2 <2 <2 20 j - "—---------------

MeOBA-DOTA 1:?JSm <2 <2 <2 EA-D03A ^Sm <2 90 95 PA-DOTMA 153sm <2 <2 - ; 25 Esimerkki XXI (A ja B) a-(2-metoksi-5-aminofenyyli)-1,4,7,10-tetra-atsa-syklododekaani-1,4,7,10-tetraetikkahapon samarium-153 -kompleksilla leimatun IgG:n ja F(ab')2:n, [153Sm (MeO-BA- DOTA) ]-IgG:n ja [153Sm (MeO-BA-DOTA) ]-F (ab1 ) 2:n, paikallista- 30 minen in vivo ;* Otsikon mukaiset yhdisteet valmistettiin esimer keissä V, VI, XII ja XIII esitetyin menettelytavoin, ja in vivo -tutkimukset tehtiin esimerkin XI mukaisin menettelytavoin. Tulokset on esitetty taulukoissa VIA ja VIB.MeOBA-DOTA 1:? JSm <2 <2 <2 EA-D03A ^ Sm <2 90 95 PA-DOTMA 153sm <2 <2 -; Example XXI IgG Labeled with Samarium-153 Complex of α- (2-Methoxy-5-aminophenyl) -1,4,7,10-tetraaza-cyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid and F (ab ') 2, [153Sm (MeO-BA-DOTA)] -IgG and [153Sm (MeO-BA-DOTA)] -F (ab1) 2, in vivo; * The title compounds were prepared according to the procedures set forth in Examples V, VI, XII and XIII, and in vivo studies were performed according to the procedures of Example XI. The results are shown in Tables VIA and VIB.

35 115 10489835 115 104898

Esimerkki XXIIExample XXII

100 μΐ-.aan 153Sm-liuosta (väkevyys 0,3 x 10'3 M 0,01 N HCl:ssa; 5 mCi) lisättiin 6 μΐ PA-DOTMA:ta (esimerkin 29 mukaisella menetelmällä valmistettua diastereomee-5 ria, jolla on korkea Rf-arvo; 5 mmol/1 Milli-Q™-vedessä) , 20 μΐ MES-puskuria (1,0 M, pH 6) ja 1 μΐ HEPES-puskuria (0,5 M, pH 8,7). Tämä liuos sekoitettiin pyörresekoitti-mella, ja sen loppu-pH oli noin 6. Sen jälkeen kun seosta oli kuumennettu 90 °C:ssa 30 minuuttia, siitä analysoitiin 10 HPLC:llä GF-250-kolonnissa kompleksoitumisaste, ja yleensä saavutettiin vähintään 90 %:n saanto. 153Sm-DOTMA karakterisoitiin vertaamalla sitä ei-radioaktiiviseen Sm-komplek-siin, joka oli valmistettu ja karakterisoitu erikseen esimerkissä 42 kuvatulla tavalla.To 100 μΐ of 153Sm (0.3 x 1033 M in 0.01 N HCl; 5 mCi) was added 6 μΐ of PA-DOTMA (diastereomer 5 prepared by the method of Example 29 having high Rf; 5 mmol / L in Milli-Q ™ water), 20 μΐ MES buffer (1.0 M, pH 6) and 1 μΐ HEPES buffer (0.5 M, pH 8.7). This solution was stirred on a vortex mixer and had a final pH of about 6. After heating at 90 ° C for 30 minutes, it was analyzed by 10 HPLC on a GF-250 column for degree of complexation, and generally achieved at least 90%: n yield. 153Sm-DOTMA was characterized by comparison with a non-radioactive Sm complex prepared and characterized separately as described in Example 42.

15 Esimerkki XXIIIExample XXIII

153Sm(SCN-PA-DOTMA) :n valmistusPreparation of 153Sm (SCN-PA-DOTMA)

Esimerkissä XXI valmistettuun 153Sm(PA-DOTMA)-kompleksiin, jota oli jäähdytetty huoneen lämpötilassa 20 minuuttia, lisättiin 10 μΐ l-%:ista tiofosgeeniliuosta, jos-20 sa väliaineena oli asetonitriili-vesiseos, joka sisälsi 90 % asetonitriiliä. Seosta sekoitettiin voimakkaasti pyörresekoittimessa, ja sen annettiin seistä huoneen lämpötilassa 5-20 minuuttia. HPLC-analyysiseurannan mukaan reaktio tapahtui välittömästi. Aktivoitu 153Sm-kompleksi • ' 25 uutettiin sen puhdistamiseksi kolmesti kloroformilla (200 μΐ/kerta), ja vesikerros johdettiin PRP-patruunan läpi (PRP-patruuna = Mini-clean™-patruuna, joka oli hankittu Alltech Associatesilta, Deerfield, IL) , joka oli esikäsitelty 5 ml :11a metanolia ja 5 ml :11a MES-puskuria 30 (20 mM, pH 5,8) . Pesun jälkeen, joka tehtiin 5 ml :11a MES- T puskuria ja 5 ml :11a Milli-Q™-vettä, se uutettiin 900 μ1:1ΐ3 90-%:ista asetonitriiliä heittäen ensimmäiset 100 μΐ pois, jolloin saatiin talteen noin 90 % 153Sm-aktii-visuudesta. Seos haihdutettiin kuiviin alennetussa pai-35 neessa alle 40 °C:n lämpötilassa, ja jäännös sisälsi suu- 116 104898 rimmaksi osaksi otsikon mukaista yhdistettä, joka käytettiin vasta-aineeseen konjugointiin.To the 153Sm (PA-DOTMA) complex prepared in Example XXI, cooled at room temperature for 20 minutes, was added 10 μΐ of a 1% thiophosgene solution if the medium was an acetonitrile / water mixture containing 90% acetonitrile. The mixture was vigorously stirred in a vortex mixer and allowed to stand at room temperature for 5-20 minutes. According to HPLC analytical monitoring, the reaction occurred immediately. The activated 153Sm complex • '25 was extracted three times with chloroform (200 μΐ / time) and the aqueous layer passed through a PRP cartridge (PRP cartridge = Mini-clean ™ cartridge purchased from Alltech Associates, Deerfield, IL) was pretreated with 5 mL of methanol and 5 mL of MES buffer 30 (20 mM, pH 5.8). After washing with 5 ml of MES-T buffer and 5 ml of Milli-Q ™ water, it was extracted with 900 μ1: 1-3% 90% acetonitrile, discarding the first 100 μΐ, yielding about 90% 153Sm -aktii-isotype. The mixture was evaporated to dryness under reduced pressure at a temperature below 40 ° C and the residue contained most of the title compound which was used for conjugation of the antibody.

Esimerkki XXIV (A ja B) 153Sm(SCN-PA-DOTMA) :n konjugointi IgG:hen ja F (ab1 )2-5 CC-49:äänExample XXIV (A and B) Conjugation of 153Sm (SCN-PA-DOTMA) to IgG and F (ab1) 2-5 to CC-49

Yleensä vasta-aine väkevöitiin ja tehtiin vaihto karbonaattipuskuriin (pH 9,1 tai 9,5, 50 mM) Centricon™- väkevöintilaitteessa (moolimassaltaan 30 kilodaltonia pienemmät poistettiin), jolloin tuloksena oli vähintään pro-10 teiinipitoisuus 1,5 x 10'4 mol/1. Konjugaation toteuttamiseksi 153Sm(PA-DOTMA) :n isotiosyanaattijohdannaiseen (valmistettu esimerkissä XXIII) lisättiin sellainen pieni määrä karbonaattipuskuria, joka oli tarpeen lopullisen proteiinipitoisuuden alentamiseksi 1,5 x 10'4 mooliin/1, ja sen 15 jälkeen ekvivalenttinen määrä väkevöityä vasta-ainetta suhteessa BFC-153Sm-kompleksiin. Seos sekoitettiin pyörre-sekoittimessa, ja sen annettiin reagoida huoneen lämpötilassa 1 tunti tai siihen saakka, että 40 - 50 % 153Sm:sta oli sitoutunut vasta-aineeseen GF-250-kolonnissa tehdyn 20 HPLC-analyysin mukaan. Leimattu vasta-aine eristettiin kahdella peräkkäisellä keskipakogeelisuodatuksella Sepha-dex™ G-25 -kolonneja (2,2 ml) käyttäen. Leimatun vasta-aineen homogeenisuus, integriteetti ja immuunireaktiivi-suus määritettiin HPLC-analyysillä ja tavanomaisin bioke-25 miallisin menettelytavoin, joita on kuvattu edellä.Generally, the antibody was concentrated and exchanged with carbonate buffer (pH 9.1 or 9.5, 50 mM) in a Centricon ™ concentrator (smaller than 30 kilodaltons), resulting in at least a pro-10 protein concentration of 1.5 x 10 -4 mol. / 1. To effect conjugation to the 153Sm (PA-DOTMA) isothiocyanate derivative (prepared in Example XXIII), a small amount of carbonate buffer was required to reduce the final protein concentration to 1.5 x 10 -4 moles / L, followed by an equivalent amount of concentrated antibody relative to BFC-153 Sm-complex. The mixture was stirred in a vortex mixer and allowed to react at room temperature for 1 hour or until 40-50% of the 153Sm was bound to the antibody, according to HPLC analysis on a GF-250 column. The labeled antibody was isolated by two successive centrifugal filtration using Sepha-dex ™ G-25 columns (2.2 mL). The homogeneity, integrity and immunoreactivity of the labeled antibody were determined by HPLC analysis and standard biochemical procedures described above.

Esimerkki XXV (A ja B) 153Sm(PA-DOTMA) :11a leimatun IgG:n ja F (ab') 2-CC-4 9 :n biologista jakautumista koskevat tutkimuksetExample XXV (A and B) Biodistribution Studies on 153Sm (PA-DOTMA) Labeled IgG and F (ab ') 2-CC-4 9

Tutkimukset tehtiin esimerkissä XI kuvatulla taval-30 la. Tulokset on esitetty taulukoissa VIIA ja VIIB. Ks. kuvat 15 - 28.Studies were performed as described in Example XI. The results are shown in Tables VIIA and VIIB. See. pictures 15 - 28.

Esimerkki XXVIExample XXVI

177Lu (PA-DOTMA)-kompleksin valmistus 30 μ1:33η 177Lu-liuosta (6 x 10'3 mol/1 1,1 N 35 HCl:ssa, 4 mCi) lisättiin 36 μΐ PA-DOTMA:n (valmistettu 117 104898 esimerkin 29 mukaisella menettelytavalla) 5 mM Milli-Q™-vedessä. Liuosta sekoitettiin pyörresekoittimessa, ja lisättiin 115 μΐ MES-puskuria (1,0 M, pH 6,0) liuoksen pH:n säätämiseksi suunnilleen arvoon 5,5 - 6. Tätä liuosta kuu-5 mennettiin 90 °C:ssa 30 minuuttia yli 90-%:isen kelatoitu-misen saavuttamiseksi. Seos johdettiin PRP-patruunan läpi, joka oli esikäsitelty 5 ml :11a metanolia ja 5 ml :11a MES-puskuria (20 mM, pH 5,8). Se pestiin 5 ml:lla Milli-Q™-vedellä. 1000 ui:aan 90-%:ista asetonitriiliä uutetuksi 10 saatu kompleksi vastasi noin 78 % lähtö-177Lu-aktiivisuudes-ta (ensimmäiset 100 μΐ uutetta heitettiin pois).Preparation of 177Lu (PA-DOTMA) Complex 30 µl: 33η 177Lu solution (6 x 10 103 mol / l in 1.1 N 35 HCl, 4 mCi) was added to 36 µΐ of PA-DOTMA (prepared according to Example 117104898). 29) in 5 mM Milli-Q ™ water. The solution was stirred in a vortex mixer, and 115 μΐ MES buffer (1.0 M, pH 6.0) was added to adjust the pH of the solution to approximately 5.5 to 6. This solution was passed at 90 ° C for 30 minutes over 90 - to achieve a% chelation. The mixture was passed through a PRP cartridge pretreated with 5 mL of methanol and 5 mL of MES buffer (20 mM, pH 5.8). It was washed with 5 ml Milli-Q ™ water. The complex obtained with 1000 µl of 90% acetonitrile extracted corresponded to about 78% of the initial 177Lu activity (the first 100 µΐ of the extract was discarded).

Esimerkki XXVII 177Lu(SCN-PA-DOTMA) :n valmistus 90-%:isessa asetonitriilissä olevaan 177Lu(PA-15 DOTMA)-kompleksiin, joka saatiin esimerkissä XXVI, lisättiin 6 μΐ liuosta, joka sisälsi 10 % tiofosgeenia ja 90 % asetonitriiliä. Tätä liuosta sekoitettiin pyörresekoittimessa, ja 20 minuutin kuluttua siitä analysoitiin isotio-syanaattijohdannaisen muodostuminen HPLC:llä. Reaktio on 20 yleensä kvantitatiivinen. Liuottimen ja ylimääräisen tio-fosgeenin poisto toteutettiin 1-2 tunnin alipainehaihdu-tuksella alle 40 °C:n lämpötilassa. Jäännös käytettiin vasta-aineeseen konjugointiin.Example XXVII Preparation of 177Lu (SCN-PA-DOTMA) in 90% Acetonitrile 177Lu (PA-15 DOTMA) Complex obtained in Example XXVI was added 6 μΐ of a solution containing 10% thiophosgene and 90% acetonitrile. This solution was stirred in a vortex mixer and after 20 minutes it was analyzed for isothiocyanate derivative formation by HPLC. The reaction is usually quantitative. Removal of the solvent and excess thio-phosgene was effected by evaporation under vacuum for 1-2 hours at a temperature below 40 ° C. The residue was used for conjugation of the antibody.

Esimerkki XXVIIIExample XXVIII

25 177Lu (PA-DOTMA) :n konjugointi IgG-CC-49 : äänConjugation of 177Lu (PA-DOTMA) to IgG-CC-49

Karbonaattipuskurissa (50 mM, pH 9,1) olevaan vasta-aineeseen IgG-CC-49:ään sekoitettiin ekvivalenttinen moolimäärä massa puskurissa olevaa isotiosyanaattijohdannaista (valmistettu esimerkin XXVII:n mukaisella menette-30 lytavalla). Reaktiota jatkettiin 70 minuuttia vasta-aine-pitoisuuden ollessa 1,5 x 10'4 M, ja leimattu vasta-aine eristettiin ja karakterisoitiin esimerkissä IX kuvatulla menettelytavalla.An IgG-CC-49 antibody in carbonate buffer (50 mM, pH 9.1) was mixed with an equivalent molar mass of the isothiocyanate derivative in the buffer (prepared by the procedure of Example XXVII). The reaction was continued for 70 minutes at an antibody concentration of 1.5 x 10 4 M, and the labeled antibody was isolated and characterized according to the procedure described in Example IX.

118 104898118 104898

Esimerkki XXIXExample XXIX

177Lu (PA-DOTMA) :11a ja 177Lu (PA-DOTA) : 11a leimatun IgG-CC-49:n biologista jakautumista pitkällä aikavälillä koskevat tutkimukset 5 Pitkäaikainen eläinkoe tehtiin 177Lu:lla leimatulla vasta-aineella käyttäen hyväksi sen pitkää puoliintumisai-kaa (161 tuntia). Koe tehtiin Balb/c-hiirillä kolmen viikon aikana esimerkissä XI esitetyä ohjelmaa noudattaen. Tulokset on esitetty taulukossa VIHA. Ks. kuvat 29 - 34.Studies on the long-term biodistribution of 177Lu (PA-DOTMA) and 177Lu (PA-DOTA) -labelled IgG-CC-49 A long-term animal study was performed with 177Lu-labeled antibody utilizing its long half-life ( 161 hours). The experiment was performed on Balb / c mice for three weeks following the protocol set forth in Example XI. The results are shown in Table VIHA. See. pictures 29 - 34.

10 Kuvissa, joissa seuraavien taulukoiden tulokset on esitetty graafisesti, on käytetty seuraavia symboleja:10 In the figures, where the results of the following tables are graphically represented, the following symbols are used:

Konjugaatit ΙΤ^Ζ |K“Vat 'Β1?1’ boli lukko 'esim.Conjugates ΙΤ ^ Ζ | K “Vat 'Β1? 1' boli lock 'e.g.

15 i1;^Sn(EA-D03A)]-IgG-CC-iJ9 Δ IA 1-7 IX15 i1; ^ Sn (EA-D03A)] - IgG-CC-iJ9 Δ IA 1-7 IX

(1:>->SRj(EA-D03A))-F(ab· 2)-CC-49 Δ 13 8-1») X(1:> -> SRj (EA-D03A)) - F (ab · 2) -CC-49 Δ 13 8-1 ») X

[]?;Sm(Ez-DTPA)]-IgG-CC-49 Ö IC W ZA[?]; Sm (Ez-DTPA)] - IgG-CC-49? IC W ZA

['^SmiBz-DTPA^-FUb^-CC^ O ID 8-14 ZA['^ SmiBz-DTPA ^ -FUb ^ -CC ^ O ID 8-14 ZA

ί ] H^Sm( PA-DOTA) ]-IgG-CC-49 □ IIA 1-7 XIIί] H ^ Sm (PA-DOTA)] -IgG-CC-49 □ IIA 1-7 XII

[1:j-'Sm(PA-DOTA))-F(ab'2)-CC-49 □ 113 6-14 XIII[1: j-'Sm (PA-DOTA)) - F (ab'2) -CC-49 □ 113 6-14 XIII

20 l '^Sm(BA-DOTA)]-I6G-CC-4 9 ΣΙΙΑ W XV20 l '^ Sm (BA-DOTA)] - I6G-CC-4 9 ΣΙΙΑ W XV

i1;>3Sm(BA-DOTA)]-F(ab,2)-CC-49 “ JIIB 8-14 XVIi1;> 3Sm (BA-DOTA)] - F (ab, 2) -CC-49 "JIIB 8-14 XVI

f) ·?^3πΐ( PA-DOTMA)] —! gG — CC — 4? V VI IA 15-21 XXIVf) ·? ^ 3πΐ (PA-DOTMA)] -! gG - CC - 4? V VI IA 15-21 XXIV

[154Sm(PA-DOTMA)]-r (ab'2)-CC-49 V VIIB 22-28 XXV[154Sm (PA-DOTMA)] - r (ab'2) -CC-49V VIIB 22-28 XXV

[ 1'?'7Lu(PA-D0TMA)]-IgG-CC-4O · VIIIA 29-34 XXIX[1 '?' 7Lu (PA-D0TMA)] - IgG-CC-4O · VIIIA 29-34 XXIX

[rn Lu(PA-DOTA )]-IgG-CC-4 9 V "viIIA 29-34 XXIX[rn Lu (PA-DOTA)] - IgG-CC-4 9V "viIIA 29-34 XXIX

: 25: 25

Oheisissa kuvissa esitetyt tiedot ovat seuraavat: •.The information shown in the figures below is as follows:.

119 104898119 104898

Kuva Elin Otsikko 1 Veri 153Sm-BFC:n biol.jakau? c 2 Maksa - " - 3 | Perna__- " - _ ~ Munuainen - " -_ 5 Kasvain τ " - 6 Reisi - " - 7 Retentio „ in koko ..eli- “ “ .Image Body Title 1 Blood 153Sm-BFC biodistribution? c 2 Liver - "- 3 | Spleen __-" - _ ~ Kidney - "-_ 5 Tumor τ" - 6 Thigh - "- 7 Retention" in size ..eli- "".

1U _ mistossa__ 8 Veri - " - ** 9 Maksa - " - 10 Munuainen - - " -_ n Perna__- " -_ ^ 12 Kasvain - " - 13 Reisi «·. glilnSi?- "-3I : “ _. mistÖssä__ 15 Veri - " - Ιό Maksa - " -_' 20 “7 Perna - " - 18 Munuainen - " - 19 Kasvain - " - 20 Reisi - " - 21 £S£§niK- - ” - _mistössä___ 25 22 Veri — " — ! 23 Maksa - " - 2-i Perna - " - 25 Munuainen.,’ - " - • · 30 *CC49-IgG karvattomissa hiirissä, joilla on LS174-T-kas-vain **CC49-F(ab')2 karvattomissa hiirissä, joilla on LS174-T-kasvain 35 ***CC49-IgG balb/c-hiirissä 120 1048981U _ misto__ 8 Blood - "- ** 9 Liver -" - 10 Kidney - - "-_ n Spleen __-" -_ ^ 12 Tumor - "- 13 Trip« ·. GlilnSi? - "-3I:“ _. in what__ 15 Blood - "- Ιό Liver -" -_ '20 "7 Spleen -" - 18 Kidney - "- 19 Tumor -" - 20 Thigh - "- 21 £ S £ §niK- -" - _ In the Blood ___ 25 22 Blood - "-! 23 Liver -" - 2-Spleen - "- 25 Kidney., '-" - • · 30 * CC49-IgG in nude mice bearing LS174-T-Cas ** CC49-F (ab' ) In 2 nude mice with LS174-T tumor in 35 *** CC49-IgG balb / c mice 120 104898

Kuva Elin Otsikko 5 26 Kasvain 153Sm-BFC:n bioL.jakaut.Image Body Title 5 26 Tumor 153Lm BFC bioL.

27 Reisi - " - 28 Retentio „ koko eli- -mistä s s ä_____27 Thigh - "- 28 Retention" From the Whole Body "_____

29 Veri l'^u-BFC n bioL jaka^£A29 Veri l '^ u-BFC n BioL jacka ^ £ A

30 Maksa - " - 10 31 j^na . - " - 32 Munuainen ' - " - 33 Reisi - " - K teli?- - - - _{[riistossa·___ 15 *CC49-IgG karvattomissa hiirissä, joilla on LS174-T-kas-vain **CC49-F(ab')2 karvattomissa hiirissä, joilla on LS174-T-kasvain 20 ***CC49-IgG balb/c-hiirissä 1 · 121 104898 5 θ' ο Ν Οΐ n ϊ »o ^ t» in t\j m 'rt ·^ ·~ ^ v n ^ , J3 1- ο — o m ο ο 1 Μ 1 id ω Μ Λ > ta 0 ~Τ3 —30 Liver - "- 10 31 j ^ n. -" - 32 Kidney '- "- 33 Thigh -" - K bogie? - - - - _ {[deprived · ___ 15 * CC49-IgG in nude mice with LS174- T-Cas-only ** CC49-F (ab ') 2 in Nude Mice with LS174-T Tumor 20 *** CC49-IgG in Balb / c Mice 1 · 121 104898 5 θ' ο Ν Οΐ n ϊ » o ^ t »in t \ jm 'rt · ^ · ~ ^ vn ^, J3 1- ο - om ο ο 1 Μ 1 id ω Μ Λ> ta 0 ~ Τ3 -

° ™ > Ο Ν [\| ο Γ· n W° ™> Ο Ν [\ | ο Γ · n W

- ^ «(-ΛΟιΝΟΙΜΙΓι 2 Τ] in t— -=r m σ' ·=τ ο Ί m σ' n) Ο w -° 5oCMCM\OOOr- Λ 5 OvOSt-t-Mr- |rt w ^ κ ^ c jj ο ο ο σ> o o ” H 1 & (1) “ Λ > £ co -σ-------- rH -j. p1 f\icoc\j^r·— coo 2 oa in ό f— o r— m- ^ «(-ΛΟιΝΟΙΜΙΓι 2 Τ] in t— - = rm σ '· = τ ο Ί m σ' n) Ο w - ° 5oCMCM \ OOOr- Λ 5 OvOSt-t-Mr- | rt w ^ κ ^ c jj ο ο ο σ> oo ”H 1 & (1)“ Λ> £ co -σ -------- rH -j. p1 f \ icoc \ j ^ r · - coo 2 oa in ό f— o r— m

SS

3 Tj «-vo^rromcMo S « ^ ^3 Tj «-vo ^ rromcMo S« ^^

o <Uo <U

P tn « λ; ^ 2; 5 ^OvOiomcjcvjax M £Γ μ .H 7 in λ ιλ -- in o £ ui m +J cm o O 0 cm 0 0P tn «λ; ^ 2; 5 ^ OvOiomcjcvjax M £ Γ μ .H 7 in λ ιλ - in o £ ui m + J cm o O 0 cm 0 0

X ad M h MX ad M h M

SC O c w 3 σ> C -15 —π-------- (¾ 'r id K _ ph I f\j r in co o — cr> cn 0 0 «1 ”f\iinoo»-inc\j cj -p .3 11 -~ 1- ·- ·- - ' 1 to Π t- in sr c- c\j 0 us m «- cv»SC O cw 3 σ> C -15 —π -------- {¾ 'r id K _ ph I f \ jr in co o - cr> cn 0 0 «1” f \ iinoo »-inc \ j cj -p .3 11 - ~ 1- · - · - - '1 to Π t- in sr c- c \ j 0 us m «- cv»

o» 10 So »10 S

1 O--Ξ________ v —g : Μ ή vo co cr> co m o\ • rija> ·η m (M in vo ·— 01 O - Ξ ________ v —g: Μ ή vo co cr> co m o \ • rija> · η m {M in vo · - 0

fO "Π id as KfO «Π id as K

0 c f cm — 0 0 — 1 00 c f cm - 0 0 - 1 0

Q ·Η HQ · Η H

1 0) rij — > ω t»p - — C — Λ —--------- mew ^ r as in h- o» s· vo WGW 2 0 cr. — m ·— % % Z M Z! ^ ^ - 1 0 kj +J O CO ^ * 0)1 0) rij -> ω t »p - - C - Λ —--------- mew ^ r as in h- o» s · vo WGW 2 0 cr. - m · -%% Z M Z! ^^ - 1 0 kj + J O CO ^ * 0)

KK

G G <— 0) 0) 0 a G g g~G G <- 0) 0) 0 a G g g ~

•H ·Η -H H• H · Η -H H

(H id id id id -H <d id W -hcoc £ > co > co >-l Λί ^ C CO -HUIO ~ 0) id 0) 9 id ui idie n > S Λ sg 1 « 1 g c __1—L—L—J 1 122 104898(H id id id id -H <d id W -hcoc £> co> co> -l Λί ^ C CO -HUIO ~ 0) id 0) 9 id ui idie n> S Λ sg 1 «1 gc __1 — L —L — J 1 122 104898

3 ·— (M ro t- ο O' N3 · - {M ro t- ο O 'N

|H O Ui -T ΙΛ ~ OJ CM| H O Ui -T ΙΛ ~ OJ CM

Ή ·- ·— ·— *— ^ *— t_Ή · - · - · - * - ^ * - t_

2 o o — o <- O O2 o o - o <- O O

0) A > i o "Ό 3 cm > in — co m m cr\ .=r S '“IjO’-OvOincrvsr0) A> i o "Ό 3 cm> in - co m m cr \. = R S '" IjO'-OvOincrvsr

Jl Tjoaoinc— in.=ro 'H· ·— ro tn C ΦJl Tjoaoinc— in. = Ro 'H · · - ro tn C Φ

a) Ma) M

e --------- ’il ,2 en cr\ vo in — q .2] o ω σ in in f- -- 0 _2 ooocv^-oo •H u Λ a) * Λ > C —ET —------ g t: ,> oo'-NO'-aj en h cm o co <- a· oj fT| *0 ·- ♦* r- f- m "fj o co 3· s ^ ro o -« Tn 0 ^ 3 __5*________ Ό - pq-H cm r- a »- <0 tn ho j-a-rocMcot— cmcm o ^ ~ JS o^-Nno^o- ·η " *· 3 C & C - « H -H \ w Λ p 3 (0 ““O— ------ 5¾ t! r-j > CMOVIOOJ — tn=r E-<C m 2 m o σ> m o ~ m 2 S jl — co^r^roiMo 10 w UP 0) UP « (0 --g— —--------e --------- 'il, 2 en cr \ vo in - q .2] o ω σ in in f- - 0 _2 ooocv ^ -oo • H u Λ a) * Λ> C - ET —------ gt:,> oo'-NO'-aj en h cm o co <- a · oj fT | * 0 · - ♦ * r- f- m «fj o co 3 · s ^ ro o -« Tn 0 ^ 3 __5 * ________ Ό - pq-H cm r- a »- <0 tn ho ja-rocMcot— cmcm o ^ ~ JS o ^ -Nno ^ o- · η "* · 3 C&C -« H -H \ w Λ p 3 (0 "" O— ------ 5¾ t! rj> CMOVIOOJ - tn = r E- <C m 2 mo σ> mo ~ m 2 S jl - co ^ r ^ roiMo 10 w UP 0) UP «(0 --g——--------

rt» ΜΛ T o m in Ort »ΜΛ T o m in O

; . -£CT\vOCMOC~-OC\J; . - £ CT \ vOCMOC OC ~ \ J

(ö 3 "H OO '-•in·— 00 - « a> fn H ·> 1 O ^ ^ £ λ —g-------- < φ ^ Γ νΟΓο — oinain(ö 3 "H OO '- • in · - 00 -« a> fn H ·> 1 O ^ ^ £ λ —g -------- <φ ^ Γ νΟΓο - oinain

m ·γί J ro-cnouvf-Nm · γί J ro-cnouvf-N

Ο Ρ .η - - - - - - · -Ο Ρ .η - - - - - - · -

Q ·Η y m?-in-t\l(\JOQ · Η y m? -In-t \ l {\ JO

I W ~ ^ <1 —>· 0) .. W rt» v; ^ C — -— g 0) ------- ω e mI W ~ ^ <1 -> · 0) .. W rt »v; ^ C - -— g 0) ------- ω e m

n -H 3 acmes o) ai Gn -H 3 acmes o) ai G

H 3 W _ CC f=— ^ ^ O 5 -H -H H _ j m m <d m -h ien ^ m ·Ηΐοα3>ιη>« ., w ^^HCW-HUIK " Φ ra φ 3 <0 a; ran: _H 3 W _ CC f = - ^ ^ O 5 -H -HH _ jmm <dm -heni ^ m · Ηΐοα3> ιη> «., W ^^ HCW-HUIK" Φ ra φ 3 <0 a; ran: _

> S 0< S « « «!E> S 0 <S «« «! E

_f ' |-> —___.j-,. I ., |. - i_ 123 104898 S <x> in ro — o o •-J t— zr us m co m_f '| -> —___. j-,. I., |. - i_ 123 104898 S <x> in ro - o o • -J t— zr us m co m

Ή C K «S KΉ C K «S K

2 --0000 pj ' M ro2 - 0000 pj 'M ro

<U V<U V

Xi > roXi> ro

o ”TJo ”TJ

tM ·> a· ro 00 VO n in — U es =r e— t— ro c\jtM ·> a · ro 00 VO n in - U es = r e— t— ro c \ j

I Id «.t-kK*·!, QI Id «.t-kK * ·!, Q

1 rjininroro — n ^ Γ» « vfl1 rjininroro - n ^ Γ »« vfl

£ W£ W

3 φ O3 φ O

rt ui t— * -------—--- .JH, P. o t— — — o in Η Ό O 00 Ό ro t«- 0) ^CM’-OOCOOpj rt M ro Ί rt si > in o -n-------- 0 5- r — 00 tM — CO t~-rt ui t— * -------—--- .JH, P. ot— - - o in Η Ό O 00 Ό ro t «- 0) ^ CM'-OOCOOpj rt M ro Ί rt si> in o -n -------- 0 5- r - 00 tM - CO t ~ -

H y 30 VO C- CO ΓΟ OH y 30 VO C- CO ΓΟ O

Λ .2 «- — ·-»-*- ·- vrj * c\j in = ro vo — £ 2 w *" " g ® r- w « r- fo ^ 1/1 i: in in so co ro co ^ 12 3Γ o ro 00 o m u rt U No-0‘90 e Ό M in O Ή —. W vΛ .2 «- - · -» - * - · - vrj * c \ j in = ro vo - £ 2 w * "" g ® r- w «r- fo ^ 1/1 i: in in so co ro co ^ 12 3Γ o ro 00 omu rt U No-0'90 e Ό M in O Ή -. W v

Λί O &> r< > COΛί O &> r <> CO

.* -P — ^ —σ-------- « o ^ &£::££££ 3 , 4JrH J300000000 rt C tn II .2 ,> r- * .Τ' vo. * -P - ^ —σ -------- «o ^ & £ :: ££££ 3, 4JrH J300000000 rt C tn II .2,> r- * .Τ 'vo

E-,.h a) e 2 Oiosrrocv- 'XE -,. H a) e 2 Oiosrrocv- 'X

tn —1 n — * f ;rt -V e) o ® g_________Ξ_ ' σ> e ^ iö ·“! f- in - a- co w ; 1 -H o ro o O — — QJ (Q •O*'.·*·»·»*.·.tn —1 n - * f; rt -V e) o ® g _________ Ξ_ 'σ> e ^ iö ·'! f- in - a- co w; 1 -H o ro o O - - QJ {Q • O * '. · * · »·» *. ·.

0 -M Τ' ro — — — roo _ • 1 w ” rl OS rt0 -M Τ 'ro - - - Roo _ • 1 w ”rl OS rt

Cn Ό ^ H -P Jd -n— __J______ ^ 10 Γ t- 3- ON ΛΙ o « — -f· «j o t— vi> in o ro ^Thincn(v ΐ s -s 1 ~ - 1 rt inCn Ό ^ H -P Jd -n— __J______ ^ 10 Γ t- 3- ON ΛΙ o «- -f ·« j o t— vi> in o ro ^ Thincn {v ΐ s -s 1 ~ - 1 rt in.

N —. *< CON -. * <CO

m <#> — ------ — rt —m <#> - ------ - rt -

β rt C Iβ rt C I

. tn e w d) 0>-trt • · n -h s CC' —Min in £ S C H -H -*-> <u tn rHpin -h id id id id -h e ΰ. tn e w d) 0> -trt • · n -h s CC '—Min in £ S C H -H - * -> <u tn rHpin -h id id id id -h e ΰ

^ +j O «n -h tn C S > tn ajo-P^ + j O «n -h tn C S> tn ajo-P

H n Ai M e tn -H -ΡΛίιη o» nj a) S id <u (UOri > 2 a. S «oi dime 124 104898 3 (\j (M a- in o o ar — mH n Ai M e tn -H -ΡΛίιη o »nj a) S id <u (UOri> 2 a. S« oi dime 124 104898 3 {\ j {M a- in o o ar - m

J ^ K K KJ ^ K K K

5 O-Oun-O CQ5 O-Oun-O CQ

I U =r 3 ' <D vI U = r 3 '<D v

+J iC > <M+ J iC> <M

3 Ο "TJ3 Ο „TJ

[0 rg > p· o a r- a in ·* *— W 10 oo c\j «- in co *0 R] ^ K k ».[0 rg> p · o a r- a in · * * - W 10 oo c \ j «- in co * 0 R] ^ K k».

-HoinmovOCNJil? - no U1 C in *~-HoinmovOCNJil? - no U1 C in * ~

<D φ O<D φ O

5 *-------Z.5 * ------- Z.

n ^bot-tMinoo ^ jj Ο Ό vO CO CO “n ^ bot-tMinoo ^ jj Ο Ό vO CO CO '

Λ _i fc. 4. K v KΛ _i fc. 4. K v K

•H 20000'rj°o Λ M ar „ rt v 3 .C > ·=Γ• H 20000'rj ° o Λ M ar «rt v 3 .C> · = Γ

MMM M ^ M M M. mm—MMMM M ^ M M M. mm — M

g CÖ u to 5- > ^ a- in w in to ro h r\j ·— »£> a- in — ing CÖ u to 5-> ^ a- in w in to ro h r \ j · - »£> a- in - in.

r—i -rj o vo on *- uo c\j rJr — i -rj o vo on * - uo c \ j rJ

« vO «— C tn *' n <U C3«VO« - C tn * 'n <U C3

O * LOO * LO

Ή ^ " ~ ** ”**" 0 j 3 a in Λ o o ti - a - - c- - oj Q « -— 2 {j o oj m o — c —-n |j{ fv O -H C « M (ö w X3 ^ Ό MM -P ~U-------- 3C m oj f; mm(M f-o t- 3 <* tn rt ^ ^ h T o 32 ~ ^ gV~ ~ u c « ra u c <u oj 1 rt fc«S t— o* --3-------- Γ' jj '“J ^J· 00 t- en co —Ή ^ "~ **” ** "0 j 3 a in Λ oo ti - a - - c- - oj Q« -— 2 {his oj mo - c —- n | j {fv O -HC «M ( ö w X3 ^ Ό MM -P ~ U -------- 3C m oj f; mm {M fo t- 3 <* tn rt ^ ^ h T o 32 ~ ^ gV ~ ~ uc «ra uc < u oj 1 rt fc «S t— o * --3 -------- Γ 'jj' 'J ^ J · 00 t- en co -

0 Tn '7 X o Oi o o (M0 Tn '7 X o Oi o o {M

: * £ 5 - o-o^- _ ΐ o £ * Ϊ5 S ä -Tr-_______Ξ.: * £ 5 - o-o ^ - _ ΐ o £ * Ϊ5 S ä -Tr -_______ Ξ.

< ai ir. K<a ir and. K

O, m 10 r on to- o — Ln co E-ι C £ O o un f- en ar Q -H -H w ·- .u.O, m 10 r on to- o - Ln co E-ι C £ O o un f- en ar Q -H -H w · - .u.

1 w m t~ a o uo oj ‘ ’ n — « - - - °i.1 w m t ~ a o uo oj '' n - «- - - ° i.

« *» <U«*» <U

e ** co .. to C m ---- • ro <U O _e ** co .. to C m ---- • ro <U O _

* in C O , C I* in C O, C I

rH -H tn Ϊ _ OHirt <j g o cc >-m tn ^ c w 3 -h -h -PO) tnrH -H tn Ϊ _ OHirt <j g o cc> -m tn ^ c w 3 -h -h -PO) tn

h rt rt m rt <n C «Dh rt rt m rt <n C «D

H h tn e 3 > tn tuo-p W MVMCW H-P^tn o) rt 0) „ e rt o> cdo-hH h tn e 3> tn ato-p W MVMCW H-P ^ tn o) rt 0) „e rt o> cdo-h

> S Λ S « OS PiMB> S Λ S «OS PiMB

125 104898 3 m no in c— σ' σ\ m f-t (VI Ο O' ΙΛ Μ νΟ - •Η I ™ -=Τ ·“ — Ο ΓΠ Ο Ο 3 £ m -Ρ η 3 Λ « (0 * r-J —Q--------125 104898 3 m no in c— σ 'σ \ m ft {VI Ο O' ΙΛ Μ νΟ - • Η I ™ - = Τ · “- Ο ΓΠ Ο Ο 3 £ m -Ρ η 3 Λ« {0 * rJ -Q --------

(0 ‘j t> 7 ιΟ " O O - O(0 'j t> 7 ιΟ "O O - O

h n - m (\j m 3· (Mh n - m {\ j m 3 · {M

Ifl c «-tf-JTJTmco'-o Ϊ M t- c n •H fl>Ifl c «-tf-JTJTmco'-o Ϊ M t- c n • H fl>

Cn « O -----------Cn «O -----------

Tl 3 CO CM C\J CT> CO C— m o tn m m in ro <— Λ Ji*-ooo*-oo e H ™ ·· fl) tn -e —p-------- ro ϋ in σ» p* cocnt— •s'O'O'io rH ^ y (\i in m ? in vo -- 5 v - e "J m in q- m n >- o O ^ T“ K.Tl 3 CO CM C \ J CT> CO C— mo tn mm in ro <- Λ Ji * -ooo * -oo e H ™ ·· fl) tn -e —p -------- ro ϋ in σ »p * cocnt— • s'O'O'io rH ^ y {\ i in m? in vo - 5 v - e« J m in q- mn> - o O ^ T «K.

-Ö « -H — <» 0 O'_________ < -3 - m h Λί o *- o in m cm o m o <o Π — cm tn co ro cm 'Π -P e ^ ► i. r- o C w* jj CM o O O CO o o * -h φ r-Ö «-H - <» 0 O '_________ <-3 - mh Λί o * - o in m cm omo <o Π - cm tn co ro cm' Π -P e ^ ► i. R- o C w * jj CM o OO CO oo * -h φ r

v> (Λ Hv> (Λ H

3 «rt Ä ® Ή C o II ^ 3 .. CC10 —n-----—-— (0 ON G ^ ™ > 3 N in ιΟ - ΓΜ 5· ίη 7 « «»-O'O’-coom Λ m * «_-·*-«*·»- y ^ 2 λ in in m n n o 1 to to *" ~3 «rt Ä ® Ή C o II ^ 3 .. CC10 —n -----—-— (0 ON G ^ ™> 3 N in ιΟ - ΓΜ 5 · ίη 7« «» -O'O'- coom Λ m * «_- · * -« * · »- y ^ 2 λ in in mnno 1 to to *" ~

U3 <UU3 <U

en T3 « H -H--g—------- . J U <-* ON^rovoO’— ctven T3 «H -H - g —-------. J U <- * ON ^ rovoO'— ctv

• ·_? x -Hco«— co o — CM• · _? x -Hco «- co o - CM

ί Ä S ™ - - o" cvv O cTί Ä S ™ - - o «cvv O cT

§ -S Λ « l in ^ <C -» - —rr— —— — — — —_ rininco — »-erNp- E JjNOCMONOmoro en e to i ί ·* n. λ -e v» ηΦ3 Γ; -=r co o — — cm o m e 3 Tn cm — Il .. <rl Ή W Ϊ ^ e O $ ; e « G G—· O) tue e G G £—§ -S Λ «l in ^ <C -» - —rr— —— - - - —_ rininco - »-erNp- E JjNOCMONOmoro en e to i ί · * n. Λ -e v» ηΦ3 Γ; - = r co o - - cm o m e 3 Tn cm - Il .. <rl Ή W Ϊ ^ e O $; e «G G— · O) support e G G £ -

5 rl -H H5 µl -H

j <0 3 tJ <fl H rö <t)j <0 3 tJ <fl H rö <t)

Ti HtOG3>co>cfl W P * M 3 M H totoTi HtOG3> co> cfl W P * M 3 M H toto

<D HJ <D 3 (0 oi (ÖrtJ<D HJ <D 3 {0 oi {ÖrtJ

> s i< 3 « x pe 126 104898 0 vo O iti - o m> s i <3 «x pe 126 104898 0 vo O iti - o m

r-i ΙΟ (\l «“ t— f\J ·“ CMr-i ΙΟ {\ l «" t— f \ J · "CM

*H ^ PV K ^ x 1 rt o o o m — o o 3 +» ** H ^ PV K ^ x 1 rt o o o m - o o 3 + »*

£ U£ U

0 0) 2 Λ >_______ rt O ~0— ™ (\i .►> ro — — on — m ·— k OO^rr-coin^r n n( p-pv^nv^si^ S •ΗΟ’-'-σΝιηοο c * - -rO «n o __^-------0 0) 2 Λ> _______ rt O ~ 0— ™ {\ i .►> ro - - on - m · - k OO ^ rr-coin ^ rnn {p-pv ^ nv ^ si ^ S • ΗΟ'- ' -σΝιηοο c * - -rO «no __ ^ -------

HB

O 3 CO — (Mr-~— (MOO 3 CO - {Mr- ~ - {MO

•H 'J O CO >- on CM ·- 5 o o o αο *- o o• H 'J O CO> - on CM · - 5 o o o αο * - o o

s Ss S

E j3 > w Ä Jl________E j3> w Ä Jl________

**» CO** »CO

m 2r r mcoon— mc— onm 2r r mcoon— mc— on

n h nn^-moNON’— (Mn h nn ^ -moNON'— (M

r· V- ·- tv r· p- .r · V- · - tv r · p-.

c -r! o 5· m - T - o 0 ^ ίΛ p—c -r! o 5 · m - T - o 0 ^ ίΛ p—

TJ MTJ M

•H O) 0 « -P - ------------ -¾ fj mojinor-inm „21 — m^r — oro — ffl tn tn *H p- ^ ^ ^ v. p.• H O) 0 «-P - ------------ -¾ fj mojinor-inm„ 21 - m ^ r - Air - ffl tn tn * H p- ^ ^ ^ v. P.

H .5 ~ £ 2 ooocoooo <Ö il U * O ad -P c 4> ^ c «n w ' - > M ·· Φ Λ —o-------- O on tn zr ,η^τ λ; rvj ζ in 3- n co en - en 3 1 o J^roorjc^-om·— fO U C " .5 - — — Vv Pv »S _H .5 ~ £ 2 ooocoooo <Ö il U * O ad -P c 4> ^ c «nw '-> M ·· Φ Λ —o -------- O on tn zr, η ^ τ λ ; rvj ζ in 3- n co en - en 3 1 o J ^ roorjc ^ -om · - fO U C «.5 - - - Vv Pv» S _

EhU C rjcdinmcoco — o 1 (ö *5 ^ ™ 0) <0 ui -P----------- Λ ω 0 . rt 0 '-•Norvj^rrnmc^co • — ό -H t- o o o in o -h nj 1 o +> o o o in o o o r> -P ^ _J M tt) <4 O > H -n χ _________EhU C rjcdinmcoco - o 1 (ö * 5 ^ ™ 0) <0 ui -P ----------- Λ ω 0. rt 0 '- • Norvj ^ rrnmc ^ co • - ό -H t- o o o in o -h nj 1 o +> o o o in o o o r> -P ^ _J M tt) <4 O> H -n χ _________

O C PO C P

Q -H iti ^^rmocoONmo ^ ^ , »- k V «>. <, Λ <** "2 ~ t' e· - t- (M o __ e ω ^ *· en e w <u ilQ -H iti ^^ rmocoONmo ^^, »- k V«>. <, Λ <** "2 ~ t 'e · - t- {M o __ e ω ^ * · en e w <u il

* m a) 0 W* m a) 0 W

. in C O -—:--------C. in C O -—: -------- C

r-i -rt W * ^ e ° „ „ e &— Φ <utr e e C B- *H *rt H rt rt rt rt -H rt rt m -rtinc3>w>w m ^ P e ω -h tnw Φ rt a) 0 rt a) rtrtri -rt W * ^ e ° „„ e & - Φ <utr ee C B- * H * rt H rt rt rt rt -H rt rt m -rtinc3> w> wm ^ P e ω -h tnw Φ rt a. ) 0 rt a) rtrt

> S d* S « 04 *E> S d * S «04 * E

127 104898 rj a· ίο o m o co ip M 5\ in N 3· 3· - H v v.127 104898 rj a · ίο o m o co ip M 5 \ in N 3 · 3 · - H v.

ni no·- o m o oni no · - o m o o

~ +> * * (VJ~ +> * * {VJ

-p M-p M

° g p —o-- --° g p —o-- -

C t>OOvOOO>v£>t— OC t> OOvOOO> v £> t— O

nJ M vOftlf-q-CM’-CVInJ M vOftlf-q-CM'-CVI

-¾ id k*s».c rt -H oo^rmroin— o ^ M co • w C <r> <1) κέ C --—-—------ 5 m o in e- m o vo o " ιη^Γηιητηο o j0. O o' O o~ ·—~ o~ o •H M * * *~-¾ id k * s ».c rt -H oo ^ rmroin— o ^ M co • w C <r> <1) κέ C --—-—------ 5 mo in e- mo vo o "ιη ^ Γηιητηο o j0. O o 'O o ~ · - ~ o ~ o • HM * * * ~

Xl 0) ^ X3 > c —n-------- e 2 > - in co s t co o co M vo m t— «— co o c\i n ™ ·-->»"·>·>*.«- ιη ·γ· m in a· m in n o ^ tn c « 0 __Ξ________ •O rt <-w ^ p o\ (m s vo in in r mo en jC— ooros-mo M-P ~ 3 v ^ ^ ^ ^Xl 0) ^ X3> c —n -------- e 2> - in co st co o co M vo mt— «- co oc \ in ™ · ->» "·> ·> *. «- ιη · γ · m in a · m in no ^ tn c« 0 __Ξ ________ • O rt <-w ^ po \ {ms vo in in r mo en jC— ooros-mo MP ~ 3 v ^ ^ ^ ^

M M O^—OvOOOM M O ^ —OvOOO

Q) id in f v-> w ^ uQ) id in f v-> w ^ u

O -n -P M PO -n -P M P

.* C M C -h « M -H Q) w ·Ρ > C W —O—— --—---. * C M C -h «M -H Q) w · Ρ> C W —O—— --—---

Ti :5 oi !>; mvomoin-MTi: 5 oh!>; mvomoin M

£ „ g g in^ocMoo -£ „g g in ^ ocMoo -

Men e .2*»νν*-ν·~·- H 5 § m ^ *n in m a - o 1 UI m u ro <uMen e .2 * »νν * -ν · ~ · - H 5 § m ^ * n in m a - o 1 UI m u ro <u

u +j Mu + j M.

i en --=— —------ en ir) M enen — oo^roj M -h -H m t~ vo in oun n i o S '"·'*'·-*«--··-i en - = - —------ en ir) M enen - oo ^ roj M -h -H m t ~ vo in oun n i o S '"·' * '· - *« - ·· -

. +j -P — OOOOJOO. + j -P - OOOOJOO

«< o Ä 5! i M -n in ^ ' O C * —n—;------- q -h ^ i; l ^ r o m m s- - s· r < —. S ® in in o - in m 0Q dP .3 1*.^·.-.*.*.^.«<O Ä 5! i M -n in ^ 'O C * —n -; ------- q -h ^ i; l ^ r o m m s- - s · r <-. S ® in in o - in m 0Q dP .3 1 *. ^ · .-. *. *. ^.

— ~ _v - f- in m e n o __ e „ Tn cm - ^ en e m ä ., en O 0 S 11 in e O __rv.- ~ _v - f- in m e n o __ e „Tn cm - ^ en e m ä., En O 0 S 11 in e O __rv.

• r) ·Η M - P• r) · Η M - P

^ e ° e c~ * Q) 0)0 cc ε~^ e ° e c ~ * Q) 0) 0 cc ε ~

C ·Η τ| HC · Η τ | B

.3 id n) id id -h idid rt« -h m e C > en >« ro M X P C to -H into O) id <u 3 id o id id.3 id n) id id -h idid rt «-h m e C> en>« ro M X P C to -H into O) id <u 3 id o id id.

> S Ok a « cö <E> S Ok a «cö <E

128 104898 m o t— — m o 'j o CM m vo in m *— , £ooocmcmoo 3 M * +) 0> 3 Ä > <0 0 —0128 104898 m o t— - m o 'j o CM m vo in m * -, £ ooocmcmoo 3 M * +) 0> 3 Ä> <0 0 —0

•ί M > momoo>oiM• ί M> momoo> oiM

.z. yoin a- σ\ m vo ·— 3 ^o-r-s-f^oo 0) w ™ G m ·*· tT> --=-------- o 4 rH rr co co ifl in es io.z. yoin a- σ \ m vo · - 3 ^ o-r-s-f ^ oo 0) w ™ G m · * · tT> - = -------- o 4 rH rr co co ifl in es io

o HOCOmf-CMCMOo HOCOmf-CMCMO

•H η}-·>··~-·~*--·.• H η} - ·> ·· ~ - · ~ * - ·.

Λ jjOOOt— moo - * C d) c x: > m co "g-------- n ja- r aoojco^-inmt— m Jj (M (\i co a· o o - G OTNOC-'-o •O « <11 0 ·__«_ 3 miu _ h cm cm cm cm — in c- h *® 9 .H ~ co in cm co - o lj H w Ig ** ** *· ^ ** h -h in 4j o o o m *- o o (0 II P * o ad -pc.. o> ; λ; ·· a) ^ —o—;------- 3 σ» tn Jr Σ»Λ jjOOOt— moo - * C d) cx:> m co "g -------- n ja- r aoojco ^ -inmt— m Jj {M (\ i co a · oo - G OTNOC -'- o • O «<11 0 · __« _ 3 miu _ h cm cm cm cm - in c- h * ® 9 .H ~ co in cm co - o lj H w Ig ** ** * · ^ ** h -h in 4j ooom * - oo (0 II P * o ad -pc .. o>; λ; ·· a) ^ —o -; ------- 3 σ »tn Jr Σ»

,π ,¾ CM r (MOCOIOON, π, ¾ CM r {MOCOIOON

οι o S - ^ ^ n m - ίου c ^ - fh m c cMomr—jr — o 1 (0 m t cmοι o S - ^ ^ n m - ίου c ^ - fh m c cMomr — jr - o 1 {0 m t cm

CM QJCM QJ

-—. UJ-. UJ

+J--=—_________ Λ in 5 (0 3 r-l O -- M O' J o oo : — Ό ] ot-iociiM-o . U-i Ή I Ο Τ' OOO — ΓΜΟΟ ^ ^ £ * <C ai > £ ·Ρ Λ —rj—_______ O G r Q -H u' r cMO\mo'camc'- I ·Λ O on Λ| in - f- ί5 " ' »- r- *~ »- r- T- r- ^ m c— — o — cm o n w *“ m — co c m 3 *c • n a) 3__*< * Η ή w - - lo g o G G—+ J - = —_________ Λ in 5 {0 3 rl O - MO 'J o oo: - Ό] ot-iociiM-o. Ui Ή I Ο Τ' OOO - ΓΜΟΟ ^ ^ £ * <C ai> £ · Ρ Λ —rj —_______ OG r Q -H u 'r cMO \ mo'camc'- I · Λ O on Λ | in - f- ί5 "'» - r- * ~ »- r- T- r- ^ mc— - o - cm onw * "m - co cm 3 * c • na) 3 __ * <* Η ή w - - lo go GG—

^ c ^ <U (DO^ c ^ <U {DO

3 3 &— ^ Ή ·Η Ή .3 rd (0 <0 (0 ·Η f0<0 «—I ·η ui 3 3 > ui>tfl M C4 M u 3 w -H win 0) ia o 3 <0 a) <oio3 3 & - ^ Ή · Η Ή .3 rd (0 <0 (0 · Η f0 <0 «—I · η ui 3 3> ui> tfl M C4 M u 3 w -H win 0) ia o 3 < 0 a) <oio

> s Λ a « « *E> s Λ a «« * E

129 104898 O — m cm in c\j ctn — H <- vo co * m o Ή r* t t. *s k i. ·— *d ro o »- m o o +> — * * U m 0) A > h. ' U—129 104898 O - m cm in c \ j ctn - H <- vo co * mo Ή r * t t. * Sk i. · - * d ro o »- moo +> - * * U m 0) A> h. . 'U—

1 tncMO1 tncMO

3 «— Wc— t—minocn·- 4-J id * 3 ή i-ffinnwi-o «3 Λί — · C\ M 10 id Q) -<-> __w_________3 «- Wc— t — minocn · - 4-J id * 3 ή i-ffinnwi-o« 3 Λί - · C \ M 10 id Q) - <-> __w_________

£ 5 CM «- «- O ;=r Cs C\J£ 5 CM «-« - O; = r Cs C \ J

2 >] t-^nnrjno -5 Ία ·* * * * v *~.2>] t- ^ nnrjno -5 Ία · * * * * v * ~.

i 5 —οοο-οο o u * * * I—I 0) o A > A CO “5-------- 2- r ONr-mmvo— co G « oo ·- sr *- m «- o 0 '[1 t m e m vo cm o . Ί λ I— ir\ 5 _J________ >c *ί o\ ·— a- in «— ocm.i 5 —οοο-οο ou * * * I-I 0) o A> A CO „5 -------- 2- r ONr-mmvo— co G« oo · - sr * - m «- o 0 '[1 tmem vo cm o. Ί λ I— ir \ 5 _J________> c * ί o \ · - a- in «- ocm.

ho -jinmcMs-CMroo 0-H 37 2— O’-omoo ^ O _ ^ f ******* PM ^ c « HQ) id — _c O-η +J U 1 -------- ® 5 m rj ^ fdit-rOmiDOl H-Η o CM u =T r- =r *- o o 2 2 *'·'·'·'·*·' *- *2 *0 ‘3 ΟΌ ΙΛ C Oi rj o .. G *--***;r** σι c Q) * * Ί3* id t>< 1 --jg— ------- ; H 2 H f\j a· o in σι o o\ .. I to -h mmincomoo 0 <0ho -jinmcMs-CMroo 0-H 37 2— O'-omoo ^ O _ ^ f ******* PM ^ c «HQ) id - _c O-η + JU 1 -------- ® 5 m rj ^ fdit-rOmiDOl H-Η o CM u = T r- = r * - oo 2 2 * '·' · '·' · * · '* - * 2 * 0' 3 ΟΌ ΙΛ C Oi rj. o .. G * - ***; r ** σι c Q) * * Ί3 * id t> <1 --jg— -------; H 2 H f \ j a · o in σι o o \ .. I to -h mmincomoo 0 <0

Cn Ό f1 om·— OCn Ό f1 om · - O

V ’3 IV '3 I

S £ -c 4-_______ rtj 0) .Λ fe; H -1-v u' JjOr-ONOa-C^m 0 C 3 ins-wooir-'- Q -H .j — *·»«»» — ·-·_ 1 o ot-om— c\joS £ -c 4 -_______ rtj 0) .Λ fe; H -1-v u 'JjOr-ONOa-C ^ m 0 C 3 ins-wooir -'- Q -H .j - * · »« »» - · - · _ 1 o ot-om— c \ jo

< — (0 CM *— II<- {0 CM * - II

• 'Z ~ _ « c Ω C to ——J——I----i------ * f'- OP - - h -S S See® ^ E O -5 H ^ .:3 id id id id h id io h hw C O > co>tn• 'Z ~ _ «c Ω C to ——J —— I ---- i ------ * f'- OP - - h -SS See® ^ EO -5 H ^.: 3 id id. id id h id io h hw CO> co> tn

ro WiiWGlOHWWro WiiWGlOHWW

0) id « O « m die > s Oi S « K pe 130 104898 3 m f- m o m ro r-ι o ro <\i — r~- c\j —0) id «O« m die> s Oi S «K pe 130 104898 3 m f- m o m ro r-ι o ro <\ i - r ~ - c \ j -

«Ö oooojoocT«Ö oooojoocT

P 3* *C *P 3 * * C *

MM

3 35 ^ 0) ** ,,------- G o 0 •H oo ·> -=r O m cd co> cr\ tr ·— j-ι o m m o io a· - q id *- · ^ *- ,Η -H o — *— in^xoo 0 M ·-3 35 ^ 0) ** ,, ------- G o 0 • H oo ·> - = r O m cd co> cr \ tr · - j-ι ommo io a · - q id * - · ^ * -, Η -H o - * - in ^ xoo 0 M · -

•rl W• rl W

Λ (UΛ (U

K__ G ---" - - ----- " 3 a in i· t- in γλ vd 3 ^03-0-=ΓΓΟΖΓΟK__ G --- "- - -----" 3 a in i · t- in γλ vd 3 ^ 03-0- = ΓΓΟΖΓΟ

^ * O O O v£> C\J O O^ * O O O v £> C \ J O O

r- 4-»r- 4- »

rH MrH M

a) G Λ > G -U-“----—-- *2 2 > ma o in j in t'a) G Λ> G -U - “----—-- * 2 2> ma o in j in t '

χ M 3· M o ~ 3· O Oχ M 3 · M o ~ 3 · O O

H ro — ^ 2 -h o ro ro co in o o a> m ~ ^ •n» Φ 3 Cn__frS________ m 2 3 co — tn m co on m m 3 % 3 ^ ^ ~ o ^ oH ro - ^ 2 -h o ro ro co in o o a> m ~ ^ • n »Φ 3 Cn__frS________ m 2 3 co - tn m co on m m 3% 3 ^ ^ ~ o ^ o

H O' S 5 OOOOOJOOH O 'S 5 OOOOOJOO

t3> 2 Τ'******* oi o c Φ ^ a c -3 ________ h cm 10 7Γ > o — o o o m o 3 ~ ro w £* — in o jr- — — >- ro +j Ε-ιΛ m ‘3 ro in n c on ^ o ro 3 * * * * f. r- * * Γ *3 S * * 1 o__iz____ o-, -P 3 — λ; rHo- i>- m im cn m rot3> 2 Τ '******* oi oc Φ ^ ac -3 ________ h cm 10 7Γ> o - ooomo 3 ~ ro w £ * - in o jr- - -> - ro + j Ε-ιΛ m '3 ro in nc on ^ o ro 3 * * * * f. R- * * Γ * 3 S * * 1 o__iz____ o-, -P 3 - λ; rHo- i> - m im cn m ro

< <D ·<Η C3 f\l t?\ r o O O<<D · <Η C3 f \ l t? \ R o O O

H M—1 ro - r- r- K. ^H M — 1 ro - r- r- K. ^

O G G -P OOOOOvJOOO G G -P OOOOOvJOO

- - o <u -h M * * i e a> < ’H Λ > λ e #> - “3 — ·« —--------- j 3 ω 10 rinoNr-oocjNrroo ^ rT ro 3 S omNeo·-- r~, vf ro .ro - *- — n- - o <u -h M * * iea> <'H Λ> λ e #> -' 3 - · «—--------- j 3 ω 10 rinoNr-oocjNrroo ^ rT ro 3 S omNeo · - r ~, vf ro .ro - * - - n

iro ro n 5 ^--ooNOiro ro n 5 ^ - ooNO

'-J -n o tn m— G'-J -n o tn m— G

oj *oj *

KK

G G—G G—

O) Φ OO) Φ O

_ G G g— G ·Η -ro h •ri ro ro ro ro ή ro ro ή -h w c 3 > i» >» W II A! Vi c M -H min a) ro a) 3 ro a) roro_ G G g— G · Η -ro h • ri ro ro ro ro ή ro ro ή -h w c 3> i »>» W II A! Vi c M -H min a) ro a) 3 ro a) roro

> g Oi S « « *:E> g Oi S «« *: E

131 104898 3 a- o o m - m »J oi n o m rn r131 104898 3 a- o o m - m »J oi n o m rn r

fl CNi - O O *“ Ofl CNi - O O * “O

S w tt) C ,nÄ > g "o ~TJ------- 3 II <\l ·> (VI CO 0\ t~ N ^S w tt) C, nÄ> g "o ~ TJ ------- 3 II <\ l ·> (VI CO 0 \ t ~ N ^

2 ·— Vt O vO *- iT ro O2 · - See O vO * - iT ro O

5 c id ·,·.·.·».·* v5 c id ·, ·. ·. · ». · * V

Jj •H vO IIV ϊ (VI O ^ 3 ^ f— 3 in S o» ie __*__-_____ •rv ,-f P — vO OO O 03 *- c Π =o ον n λ a· >- oi ‘d *.*-*-**»- ·> c 2 o o o o in o •H tl 5,1 * * * S' » 0 ^ “Ό------- •h ~ > m (M vo o <- σ\ Λ 11 y o in (O ιΰ " t~Jj • H vO IIV ϊ {VI O ^ 3 ^ f— 3 in S o »ie __ * __-_____ • rv, -f P - vO OO O 03 * - c Π = o ον n λ a ·> - oi. 'd *. * - * - ** »- ·> c 2 oooo in o • H tl 5,1 * * * S'» 0 ^ "Ό ------- • h ~> m {M vo. o <- σ \ Λ 11 yo in {O ιΰ «t ~

IQ K v VIQ K v V

G c ‘d in o ιλ m o >- · "f; *— voG c 'd in o ιλ m o> - · «f; * - vo

>H W> H W

O 0» σν « c --“—------ ^ S ,ί: cr\ t« m o m cO 0 »σν« c - “—------ ^ S, ί: cr \ t« m o m c

o £ en -H o f- e- O - (Ao £ en -H o f- e- O - {A

3 o * * oi"o o 3 4J +) H * •H .K tn 4) 1,1 0 (DO) > id ·ι—ι tn tr>·^ —q— — — —— — — — H -HO 11 ^ £ cj *- © tn m — e 2 M O KV m M3 ad e G .3 ~ fi <3 £ 3 N m ^ ·· tn *“ — σι (0 m 'S· +· s* 1 tn--2—______ US 3 : u Ό η o n vo o oun • i -h ‘3 av — c\j tn r— ·— U O « r- -3 o * * oi "oo 3 4J +) H * • H .K tn 4) 1,1 0 (DO)> id · ι — ι tn tr> · ^ —q— - - —— - - - H - HO 11 ^ £ cj * - © tn m - e 2 MO KV m M3 ad e G .3 ~ fi <3 £ 3 N m ^ ·· tn * “- σι {0 m 'S · + · s * 1 tn. --2 —______ US 3: u Ό η on vo o oun • i -h '3 av - c \ j tn r— · - UO «r- -

DV-P f-^-OOOOODV-P f - ^ - OOOOO

M -V ft 1 φ ω e -h ~ P :------ H 11 “* r ;in in ra ? in kv 2 * G S ~.°M -V ft 1 φ ω e -h ~ P: ------ H 11 „* r; in in ra? in kv 2 * G S ~. °

JL ^ u iin o in m (\i (MJL ^ u iin o in m {\ i {M

£ tn « ™ • —-3 0) I* O ^ « _ O M —-----ro£ tn «™ • — -3 0) I * O ^« _ O M —----- ro

^4 ° C II II^ 4 ° C II II

a> cc cc C τ| ·η * * •h id id id id ή *a> cc cc C τ | · Η * * • h id id id id ή *

,π -H in e S > M, π -H in e S> M

to vt ,¾ vt e tn -h <u id a) s id Q) > S o* S * « 132 104898to vt, ¾ vt e tn -h <u id a) s id Q)> S o * S * «132 104898

3 iCM (Μ =τ Ο Os CM3 iCM {Μ = τ Ο Os CM

f—t o m m o o —f — t o m m o o -

•H•B

id ;o o o tv c\i o S s <d a> .5 Ä t>______id; o o o tv c \ i o S s <d a> .5 Ä t> ______

e O Ue O U

5 fy ·> a-iomvonco R .-koinmmoocn tl id - - — *-*-»- a -H o - - CM in o -¾ « 10 Q) __K______ £ ii m m t— o% co c o m f- io o ·- "&» «* o o o sr in o ° s *5 fy ·> a-iomvonco R.-Koinmmoocn tl id - - - * - * - »- a -H o - - CM in o -¾« 10 Q) __K______ £ ii mmt— o% co com f- io o. · - "&» «* ooo sr in o ° s *

0 <U0 <U

•S X!>______ -° —"TT~ oo j> *— *— =r — cj\ G ^ M pooinmcom ·· id »·.*·. >s• S X!> ______ - ° - "TT ~ oo j> * - * - = r - cj \ G ^ M pooinmcom ·· id» ·. * ·.> S

X -H O m N N OX -H O m N N O

o M =r — en V) a) e « CP CJ --— — — — — >T3 3 o cm en cm e— sr 00 d = = 1 S - «ooom^o- 3 a) tn „ u Ή τη f. φ 3 e Id 3 - >o M = r - en V) a) e «CP CJ --— - - - -> T3 3 o cm en cm e— sr 00 d = = 1 S -« ooom ^ o- 3 a) tn „u Ή τη f. φ 3 e Id 3 ->

Id ·Η 4J *®· --——--— H :<d S £ £ ™ ? 2 3 ™ S 5 2 - o · en O -H OJ m un OJ - '»C „ ° ™ 1 e 0) u Id « U --=------- i id ^Id · Η 4J * ® · --——--— H: <d S £ £ ™? 2 3 ™ S 5 2 - o · en O -H OJ m un OJ - '»C„ ° ™ 1 e 0) u Id «U - = ------- i id ^

CSJ4J rH en — in CM CO CMCSJ4J rH en - in CM CO CM

_ m -H — CD ro in CO CM_ m -H - CD ro in CO CM

: “3 rd->*.-.v^-> λό f *- o o in o o <d —i ft * — o ®: "3 rd -> * .-. V ^ -> λό f * - o o in o o <d —i ft * - o ®

Cm -U > 1 -¾ A —n_______Cm -U> 1 -¾ A —n _______

K, a> PK, a> P

—J-r-t in rf-cot— ococm < G 3 co en cm o O ~ H Ή 5 s »- K s ». »s 0 TI en id =r — m »- Q ^ ^ 1 -p « <c - ω . Dj Im — 0) ------— • iH 3—J-r-t in rf-cot— ococm <G 3 co en cm o O ~ H Ή 5 s »- K s». »S 0 TI en id = r - m» - Q ^ ^ 1 -p «<c - ω. Dj Im - 0) ------— • iH 3

° 3 C II° C 3

o? w (DNo? w (D

^ O C C C^ O C C C

h ·Η *H ♦ •H id id id id -h ri -h tn e 3 > mh · Η * H ♦ • H id id id -h ri -h tn e 3> m

W n m le e w -HW n m le e w -H

ω ιΰ ω 3 id m > S P* S « « 104898 c --ω ιΰ ω 3 id m> S P * S «« 104898 c -

0) r) IvO N - O' N O0) r) IvO N - O 'N O

C iH , O (\l 3- - O' " -H ^ k. p‘ s k,C i H, O (\ l 3- - O '"-H ^ k. P' s k,

6 rt — O O O — O6 rt - O O O - O

3 -P CM3 -P CM

+J n 3 rt rt Ό'Λ > Λ n O “Ο ™ 11 cm · > ^ 3· m i» λ σ> π u -rt- m m s· cm cm G rt ~^ 5 ^ es sr sr m £ - c ui -rl o> U* k* O --S----«rt--- o 3 ® r- m ιλ o en e- S’ O' 3- N (\l Λ 5 O O θ' θ' ΙΤί ο" C u e « e Δ > V3 ** . JL,-------+ J n 3 rt rt Ό'Λ> Λ n O „Ο ™ 11 cm ·> ^ 3 · mi» λ σ> π u -rt- mms · cm cm G rt ~ ^ 5 ^ es sr sr m £ - c. ui -rl o> U * k * O --S ---- «rt --- o 3 ® r- m ιλ o en e- S 'O' 3- N {\ l Λ 5 OO θ 'θ' ΙΤί ο "C ue« e Δ> V3 **. JL, -------

unm JJunm JJ

m ~ > ω N θ' e- 5· m .π π ^ jj ' o\ en o ? m o e C -h m o sr m cd cm 3 Mr- m Ό w •H rt 0 *4 P --------- ---m ~> ω N θ 'e- 5 · m .π π ^ jj' o \ en o? m o e C -h m o sr m cd cm 3 Mr- m Ό w • H rt 0 * 4 P --------- ---

5 CO CO sr - e- CM5 CO CO sr - e- CM

< a> ~ ^ <- ό ό r m m ί^ Γ> tn *3 - - . r- ^ ^ w £ — o O o m o '<a> ~ ^ <- ό ό r m m ί ^ Γ> tn * 3 - -. r- ^^ w £ - o O o m o '

o m Mo m M

X M +i rt X C en inn. > 3-0) Λ —π— — ——--- •h en m nsr S . _ _ _ _ 3 v pj Γ C~ CM O ΓΟ — — iöi o e 2 1Λ (M O N ΰ O'X M + i rt X C en inn. > 3-0) Λ —π— - ——--- • h en m nsr S. _ _ _ _ 3 v pj Γ C ~ CM O ΓΟ - - iöi o e 2 1Λ {M O N ΰ O '

Eh U C .2 *- ** - - - u e £ sr o sr m = - 1 rt m *“ - C3 a)Eh U C .2 * - ** - - - u e £ sr o sr m = - 1 rt m * '- C3 a)

Cn rt ui H 4J -------- —=_______ i m rv. s •h in m o - - nCn rt ui H 4J -------- - = _______ i m rv. s • h in m o - - n

—} >rt ·2 f* O' e (\l O' N-}> rt · 2 f * O 'e {\ l O' N

< -h S ·* *· - »- *- *-<-h S · * * · - »- * - * -

*· · Eho t; O ·- «- O CO O* · · Eho t; O · - «- O CO O

0 4J S * * Q Ai g 1 d) in ·* < 1—1 *C “"'M" __ _„ ___ __ m e n._. k! i -h 10 L o o o> co o — Q C 30000—010 Q) ^ -rj _ — ·*_ — s <#> - σ> in ίο o c\j 'a ^ to ™ — W (0 Ä n 3 ______ ‘. in 3 ------ • rh m *^t o e n ai cc e C -H -H * •H rt rt rt rt *h rj -h to e 3 > en w u M M C to -rt ® rt a> 3 rt a) > S CU S * 05 134 104898 3 m m co jt m o ·] o u*\ ud t— o —0 4J S * * Q Ai g 1 d) in · * <1—1 * C "" 'M "__ _" ___ __ m e n._. k! i -h 10 L ooo> co o - QC 30000—010 Q) ^ -rj _ - · * _ - s <#> - σ> in ίο oc \ j 'a ^ to ™ - W (0 Ä n 3 ______ '. in 3 ------ • rh m * ^ toen ai cc e C -H -H * • H rt rt rt rt * h rj -h to e 3> en wu MMC to -rt ® rt a> 3 rt a)> S CU S * 05 134 104898 3 mm co jt mo ·] ou * \ ud t— o -

f? O O O M O Of? O O O M O O

m * * 0) * Λ > o ”"0 cxi · > in λ co in »· esm * * 0) * Λ> o ”„ 0 cxi ·> in λ co in »· es

·“ H O 3· -- (M (\l O· “H O 3 · - {M {\ l O

rara

Tl o cj (M sr in o M pjTl o cj {M sr in o M pj

C MC M

ra at C Ui •H ” '" ™" “[_r -* — ' ΪΓ 2 m t- o en o mra at C Ui • H "'" ™ "" [_r - * -' ΪΓ 2 m t- o en o m

^ 5 O N ? ΛΙ O O^ 5 O N? ΛΙ O O

O (rt - V- —O (rt - V- -

pOOOvOOOpOOOvOOO

Λ M * * 0) C Ä > g CO · “P------- LO Sr r — n o\ ω m o fn « m vo in vo m σ\ in .2 ^ *- »~ rH o a· (M t- (M o c ra 5 a) -a __«__ •H 3 0 1 MO O M O r.Λ M * * 0) C Ä> g CO · “P ------- LO Sr r - no \ ω mo fn« m vo in vo m σ \ in .2 ^ * - »~ rH oa · ( M t- (M oc ra 5 a) -a __ «__ • H 3 0 1 MO OMO r.

+> Π m ·— c~ o Ό m mat ~ ij o — o co o > ? ΐ tl > -5 c . « O — XJ ^ λ: aa ~σ------- •*C S' Kjgrof-rnvoO’- H * ra ra ra 7 ra 3+> Π m · - c ~ o Ό m mat ~ ij o - o co o>? ΐ tl> -5 c. «O - XJ ^ λ: aa ~ σ ------- • * C S 'Kjgrof-rnvoO'- H * ra ra ra 7 ra 3

Eh u a) w ^ ,Eh u a) w ^,

Uw raUw ra

1 a: K1a: K

(N O "3—r—----- ~ S '“j o o c— in o o xi JS ^ m - in o oim(N O "3 — r —----- ~ S '" j o o c— in o o xi JS ^ m - in o oim

: ; — (0 £ O O O LH ΓΟ O:; - (0 £ O O O LH ΓΟ O

— fci 4-* (D * * IM > * * K 3 ^ —Jo λ —pr-______ <ί ·η m p- fci 4- * {D * * IM> * * K 3 ^ —Jo λ —pr -______ <ί · η m p

En O Jrt so co in t~- σ> — 0 +> ra O' m en o in 43 Q Ai -H ~ 1 a) Ai c\i o m r~- oj r\j < -n ra — -e- — m e e a> i a) -n o e -- •, Q) -rl .—. ------ s e <#>En O Jrt so co in t ~ - σ> - 0 +> ra O 'm en o in 43 Q Ai -H ~ 1 a) Ai c \ iomr ~ - oj r \ j <-n ra - -e- - meea> ia) -noe - •, Q) -rl .—. ------ s e <#>

CC

6 +) ra co 3 ra _, CC <n «*6 +) ra co 3 ra _, CC <n «*

n ro e .5 H *«Hn ro e .5 H * «H

m x s Σ <a ra ra ra -h n u rH ra m S -rHraCC>«m x s Σ <a ra ra ra -h n u rH ra m S -rHraCC> «

Vj-1-ιΟ M Jrt C W -H cc ra ra ra e ra ra *·* > s m S ui « * 104898 ρ - own λ o ο «-J on νο m co vo oVj-1-ιΟ M Jrt C W -H cc ra ra ra e r ra * · *> s m S ui «* 104898 ρ - own λ o ο« -J on νο m co vo o

rt o O O O m Ort o O O O m O

MM

0) *3 > o *TJ-------0) * 3> o * TJ -------

S r-kpNt—t-’-a’C'JS r-kpNt — t -'- a'C'J

QJ rt v ·“ 5 ·Η 33 rr m m vo »—QJ rt v · “5 · Η 33 rr m m vo» -

e ·* vOe · * vO

E 10 3 rt P w 3 --2— —----- 5 P λ n ιλ in m o S 3 5 o o o o o o c u * - a; ai 5 Λ -> o· co ”P------- o S- p . a co ie in o ^ f-h h t— on vo σν t~ a* 0 * v..E 10 3 rt P w 3 --2——----- 5 P λ n ιλ in m o S 3 5 o o o o o o c u * - a; ai 5 Λ -> o · co ”P ------- o S- p. a co ie in o ^ f-h h t— on vo σν t ~ a * 0 * v ...

•h ·π *· s· n m r » Λ -¾ — s-• h · π * · s · n m r »Λ -¾ - s-

MM

C rt H ---------- ^ W ? r— O LH *- (M r-C rt H ---------- ^ W? r— O LH * - (M r-

H S -HH S -H

>·-' ^ S - - o O M O> · - '^ S - - o O M O

UI j r O G II M * Λί O C ® Λί Ό *_* r*. > 3 -H -° —O------- «R ϊΓ ^ 3 0 0 f- in o rt £ ON 3 un vO C\J o CO o * £ ^ 3UI j r O G II M * Λί O C ® Λί Ό * _ * r *. > 3 -H - ° —O ------- «R ϊΓ ^ 3 0 0 f- in o rt £ ON 3 un vO C \ J o CO o * £ ^ 3

G -P « *“ MG -P «* 'M

-H 10 φ Q) k ao W ———TS— — — -· — — — ..o '"l — — ro ro o o-H 10 φ Q) k ao W ——— TS— - - - · - - - ..o '"l - - ro ro o o

.. en c ·2 <- tn o (v »· (M.. en c · 2 <- tn o {v »· {M

:. ^ c .S:. ^ c .S

1 fö +> —* O ’— O CM o u « * U rt > I -P ^ 0 in Λ —rt”_____1 fö +> - * O '- O CM o u «* U rt> I -P ^ 0 in Λ —rt” _____

Cn G in > ---- h ό μ o ^ in o o 3·Cn G in> ---- h ό μ o ^ in o o 3 ·

l-H (H O f— O O ~ ONl-H (H O f— O O ~ ON

'S. R *r| V'S. R * r | V

-P ^mc^vomo’— a ·* w im — S « * fcn Π iy : O G * • D -H ------•«S·-P ^ mc ^ vomo'— a · * w im - S «* fcn Π iy: O G * • D -H ------ •« S ·

< — G II<- G II

1¾ dP 0)1¾ dP 0)

” ” - G G G"" - G G G

g G -H ·Η * tn en rt rt rt rt ή rop rj -H tn g 0 > in mo w μ ^ ti e n ·η •H» rt rt a) G rt 0) M O > S & S ^ ^ 136 104898 Γ" T~' ""Τ' 3 (M t\i m ο *- a· h o m «— vo o c\j ·*} o o o o m o f * * t-i e) Ä > o ~0------- (M i> r— m oj in o cr\ »- H O On O'* CO O' t- id ·> ·- . ·- *- *-g G -H · Η * tn en rt rt rt rt ή rop rj -H tn g 0> in mo w μ ^ ti en · η • H »rt rt a) G rt 0) MO> S & S ^ ^ 136 104898 Γ "T ~ '" "Τ' 3 (M t \ im ο * - a · Hom« - vo oc \ j · *} oooomof * * ti e) Ä> o ~ 0 ------- ( M i> r— m oj in o cr \ »- HO On O '* CO O' t- id ·> · -. · - * - * -

- Ή O ^ O C T O- Ή O ^ O C T O

^ ^ f» 2 io 5 oi £ --*------- J3 3 tn w ? no co O ^JOvOvOOOOCd *H **J ·* ·* *·^^ f »2 io 5 oi £ - * ------- J3 3 tn w? no co O ^ JOvOvOOOOCd * H ** J · * · * * ·

2 O O O t- C\j O2 O O O t- C \ j O

c Mc M

c Φ P Ä > m “0------- n ~ > o in o\ o> o o m ^ h 1 n « o N N o» r{ Id ^ ·- #- ·«.»..·.c Φ P Ä> m «0 ------- n ~> o in o \ o> o o m ^ h 1 n« o N N o »r {Id ^ · - # - ·«. ».. ·.

•H o m oj in in O• H o m oj in in O

c ^4 ja* «- 3 in O 0) •H « 0 ---------- _ Ή i ro Ch - m w m S ^ ^ - 5· m «o o - >'c n * o o o m - oc ^ 4 ja * «- 3 in O 0) • H« 0 ---------- _ Ή i ro Ch - m w m S ^ ^ - 5 · m «o o -> 'c n * o o o m - o.

Λ Ή CH HΛ Ή CH H

° ^ C e> M vo cd w ö. ^ A< C -P ^ -O--------- ΓΗΟΛ S c\j F* ^rococ^t-'-o 3 S n <d go m ra m ru o° ^ C e> M vo cd w ö. ^ A <C -P ^ -O --------- ΓΗΟΛ S c \ j F * ^ rococ ^ t -'- o 3 S n <d go m ra m ru o

Suo 5 ^ to ^ U c «n in »- 1 c 0)Suo 5 ^ to ^ U c «n in» - 1 c 0)

(N (0 __K(N (0 __K

. . - m fj — — — — — ——. . - m fj - - - - - ——

• XI 4J ·] O C\) f- v£> m O• XI 4J ·] O C \) f- v £> m O

‘ ia oi υ o in m cm (M o — 3 3 - -'Ia oi υ o in m cm (M o - 3 3 - -

fxi Ό M - O O in N Ofxi Ό M - O O in N O

I -H 0) ^ ° >I -H 0) ^ °>

^ Φ Λ —n—— — — ---S^ Φ Λ —n—— - - --- S

E-· -r-> Cinrucocoint— o c c «i =o *- o cu ο ία £ -h " ,Λ ~ - J C (M iT O *“ *" < ’2 in — in — : ‘ fr £ #> a, :> e B w __*_ co 3 oi — —--- n id 3 in M 3 c - ' «H id oi a) ^ -1-1 o _ cc Z! m id (d <d w nE- · -r-> Cinrucocoint— occ «i = o * - o cu ο ία £ -h", Λ ~ - JC {M iT O * "*" <'2 in - in -:' fr £ #> a,:> e B w __ * _ co 3 oi - —--- n id 3 in M 3 c - '«H id oi a) ^ -1-1 o _ cc Z! m id {d <d w n

s -H UI C 3 > -Hs -H UI C 3> -H

w UXl-lCUld) Cw UXl-lCUld) C

<u (d <u 3 id oi * > z Oi S * 137 104898 III ad ·<η ad rd ™ σι in in o > jj οο m ιλ in m -h u _ d" d- 0s* o'- ad -0) 3 C '?« _£_d______ a) _<u {d <u 3 id oi *> z Oi S * 137 104898 III ad · <η ad rd ™ σι in o> jj οο m ιλ in m -hu _ d "d- 0s * o'- ad - 0) 3 C '? «_ £ _d ______ a) _

C Γ1 IC Γ1 I

•h ^ m co r- m r* r-» g λ; o «5 >? ο *- io 3 ?, > d" rsP f-x p t4 id __ 10 .li " .2, {+ in t- co m m• h ^ m co r- m r * r- »g λ; o «5>? ο * - io 3?,> d "rsP f-x p t4 id __ 10 .li" .2, {+ in t- co m m

° ’ ^U O v© On ,=r f\J° '^ U O v © On, = r f \ J

c Μ φ 3 - ^ - ^ - _T *-c Μ φ 3 - ^ - ^ - _T * -

a) ad > γη O Ο O Oa) ad> γη O Ο O O

c cu ------ •rl 3· I __ tjl r- *3 ^c cu ------ • rl 3 · I __ tjl r- * 3 ^

π o *“ vO On ,=r vOπ o * “vO On, = r vO

rH tO > *- t““ Ο ~ ΓΟ o 0)1-1 *- *- w *-rH tO> * - t "" Ο ~ ΓΟ o 0) 1-1 * - * - w * -

•H Jää Id »— VO CO m CM• H Ice Id »- VO CO m CM

Λ ------- c ·Η ·> ad id o 3 ad +i *- on co ρ- o ►q > μ ; t— e— ·* o» ·— r— · *H <d 3 «.. ·* o »-. ·-Λ ------- c · Η ·> ad id o 3 ad + i * - on co ρ- o ►q> μ; t— e— · * o »· - r— · * H <d 3« .. · * o »-. · -

r- ad>iH o O* O Or- ad> iH o O * O O

rH (X ---— ..... -rH (X ---— ..... -

. I. I

< C t- -rj on m3 to ^ P ” ·“ t— ·“ ~<C t- -rj is m3 to ^ P ”·“ t— · “~

Η Ό II p* ·- NO CM COΗ Ό II p * · - NO CM CO

M-H C 0} £ CJ ·> O VM-H C 0} £ CJ ·> O V

>0 i*i 3 <\i co — in oj +-i . --------------- 0 M O'> 0 i * i 3 <\ i co - in oj + -i. --------------- 0 M O '

M 0) ^ IM 0) ^ I

·*·(?"} ^ on t- 3 “ · S " ’ * S “ 1 =g I * *3 ? - ? o' o" o CO - 2 ~ .1 in <v *-· * · (? "} ^ On t- 3" · S "'* S" 1 = g I * * 3? -? O' o "o CO - 2 ~ .1 in <v * -

T 3 * 0 C\l CvJ O'» ~ POT 3 * 0 C \ l CvJ O '»~ PO

u tn> _Γ ~ ., uid a) l-ι £, H Ξ ,Γ _J~ :.: i+J <d m — «- vo _ 0 in 1- 1 -u tn> _Γ ~., uid a) l-ι £, H Ξ, Γ _J ~:.: i + J <d m - «- vo _ 0 in 1- 1 -

tn 3 -Htn 3 -H

ho id _ _ 1 -r-ι 4J NO NO VO no in P^O μ no a- — o .=- _J 4J 0) 3 - *- — - «.-ho id _ _ 1 -r-ι 4J NO NO VO no in P ^ O μ no a- - o. = - _J 4J 0) 3 - * - - - «.-

ft Μ Λ > H l\) O — (NOft Μ Λ> H l \) O - {NO

s 0) " ' ' -—s 0) "'' -—

Η ·γη ~ IΗ · γη ~ I

0 c cm -h in ·- m q -Η λ: O on o *- f\j r~- 1 · m >-·»*. in on < —. 0) In *- o o : (¾ <*o aä id m »— »- o m0 c cm -h in · - m q -Η λ: O on o * - f \ j r ~ - 1 · m> - · »*. in on <-. 0) In * - o o: (¾ <* o aä id m »-» - o m

3 1 I3 1 I

3 w -H3w -H

j^. d 3 id id *h t r- 3 C-Hwesmj ^. d 3 id id * h t r- 3 C-Hwesm

MW -Η μ -H fi C -H IIMW -Η μ -H fi C -H II

kj o rH φ Id Id 3 0) IDkj o rH φ Id Id 3 0) ID

w > a sac « c 138 104898 aö ·Η m — m τγw> a sac «c 138 104898 aö · Η m - m τγ

5 <0 3 T <7 O ’V5 <0 3 T <7 O 'V

c > ti ^ ^ ^ ? c % jL3______c> ti ^^^? c% jL3______

-H JT-H JT

E r\j ’, ui r-~ -ςτ o -- 3 '•H coooot^ 3 m > CO" o" θ'- γνΓ~ r-"E r \ j ', ui r- ~ -ςτ o - 3' • H coooot ^ 3 m> CO "o" θ'- γνΓ ~ r- "

(0 OH(0 OH

Λί _i6 rt_______Ί _i6 rt______

3 I3 I

° « *S σ> - ^+J CO CO O — o S > M - ~ - "· ™ C .da)3 *~ - *~ · *- O *>.° «* S σ> - ^ + J CO CO O - o S> M - ~ -" · ™ C .da) 3 * ~ - * ~ · * - O *>.

•5 % > H _®__O - « O• 5%> H _®__O - «O

tri ~ o sr I „tri ~ o sr I "

,—| «— Ή CO, - | «- Ή CO

0 ^ o t— m t— o ^-H ω> Ό CM CM m 3 .Q 0) M “*--·«- ««.0 ^ o t— m t— o ^ -H ω> Ό CM CM m 3 .Q 0) M „* - ·« - ««.

0 «nj*-voo\mr\j M G -------0 «nj * -voo \ mr \ j M G -------

+> .. I+> .. I

rO 3 -HrO 3 -H

•n i3 ao »0 ~ r- 5+1 ro - in o — r- o o ro in ;r rtJrH .2 O) 3• n i3 ao »0 ~ r- 5 + 1 ro - in o - r- o o ro in; r rtJrH .2 O) 3

H aö^1-* *“ O OH aö ^ 1- * * “O O

H G O, —------H G O, —------

^ ^ I^^ I

> Ό ^ ·Η o CM> Ό ^ · Η o CM

•h m MO en o o co co 0 0 II w > V. (M v CTN 0\ M -P c <D >-r — .-· O »'t.• h m MO en o o co 0 0 II w> V. {M v CTN 0 \ M -P c <D> -r - .- · O »'t.

.* Λί tn « rt cm cr> ro 3 <U ^ --- - —- - - —. * Λί tn «rt cm cr> ro 3 <U ^ --- - —- - - -

Ή *r~i f0 IΉ * r ~ i f0 I

3 C -P -H3 C-P-H

(0 -H CD 3 ^vr<m ti CO t~- ~ en ^ C JS S 3 ^ ^ ^ ^ "O Ä > M ro —o"' o"(0 -H CD 3 ^ vr <m ti CO t ~ - ~ en ^ C JS S 3 ^ ^ ^ ^ "O Ä> M ro —o" 'o "

σι Gσι G

-a· 3 5 Λ 10 -H CM — in ura * 0-^=^2--a · 3 5 Λ 10 -H CM - in ura * 0 - ^ = ^ 2-

! : I 4J w > _ ' * & 'O! : I 4J w> _ '* &' O

σ 3 S ro cm - - m roσ 3 S ro cm - - m ro

M Ό IM Ό I

1 -H ’jj .1 -H 'et al.

® +> in — r— ro ro irt —. ro co o S <u a) 3 o® +> in - r— ro ro irt -. ro co o S <u a) 3 o

En to r > Ή * - — o O C _ ------------— " 1 — ^ H CM ' ro — oEn to r> Ή * - - o O C _ ------------— "1 - ^ H CM 'ro - o

< ί n rouocoi-LO<ί n rouocoi-LO

£ ** «5 > 0-· rT ^ ? ®s S ^ 2 t- „ *3 cd ——let— ,—·τ --£ ** «5> 0- · rT ^? ®s S ^ 2 t- "* 3 cd ——let—, - · τ -

r- 3 Ir-3 I

i" 3 -H _ o? . ® G 3 3 3 -H "~ O ή -H tn E 3 in „i "3 -H _ o?. ® G 3 3 3 -H" ~ O ή -H tn E 3 in "

—l U M -H C G -H—L U M -H C G -H

W (1) 3330 CU — __>_ ase. m -W (1) 3330 CU - __> _ ase. m -

Claims (21)

1. Förfarande för framställning av en terapeutiskt aktiv metall- kömpiexförening med formeln (IA) 5 R2-// VS-(CH2)-C-M N'Q (IA) Q väri varje Q är självständigt väte eller (CHR5)pC02R,A process for the preparation of a therapeutically active metal carbon black compound of formula (IA) R2 - // VS- (CH2) -C-M N'Q (IA) Q wherein each Q is independently hydrogen or (CHR5) pCO2R, 2. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e - tecknat av att som förening enligt formeln IA an- 20 vänds 1-[2-(4-isotioeyanatofenyl)etyl]-1,4,7,-10-tetra-azacyklododekan-4,7,10-triättiksyra.2. Process according to claim 1, characterized in that 1- [2- (4-isothioeyanatophenyl) ethyl] -1,4,7, -10-tetra-azacyclododecane-4 is used as a compound of formula IA , 7,10-triacetic acid. 3. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e - tecknat av att som förening enligt formeln IA an-vänds 1-(2-metoxi-5-aminobentsyl)-1,4,7,10-tetra-azacyklo- ; 25 dodekan-4,7,10-triättiksyra.3. A process according to claim 1, characterized in that 1- (2-methoxy-5-aminobentyl) -1,4,7,10-tetra-azacyclo- is used as a compound of formula IA; Of dodecane-4,7,10-triacetic acid. 3. Q1 och R2 är väte och *. R4 är nitro, eller (H) produkten frän steg (G) bringas att reagera med ett hydreringsämne, säsom Pd/C och väte, under för reak-tionen normala förhällanden, för att ästadkomma en fö- 35 rening enligt formeln IA, väri 104898 R3 är den samma som ovan definierade R3', n är definierad ovan, Q1, R, R2 och Rs är väte och R4 är amino, eller 5 (I) en förening med formeln H yOMe /—\ Q1 \ / 10 // \\-(CH2)-c-N H- H (VIHA) n h no2 H 15 vari Q1 är C02R, R är C-^-alkyl och n är ett heltal frän noli till fem, bringas att reagera med ett α-halogenkarboxylsyraderivat 20 med formeln BrCH2C02R : 25 väri R är definierad ovan, dä en organisk solvens och bas är närvarande vid en temperatur mellan 0 °C och äterflö-destemperaturen, för att ästadkomma en förening enligt formeln IA, vari Q1, Q och n är definierade ovan,3. Q1 and R2 are hydrogen and *. R 4 is nitro, or (H) the product of step (G) is reacted with a hydrogenation agent, such as Pd / C and hydrogen, under normal reaction conditions, to provide a compound of formula IA wherein R 3 is the same as defined above R 3 ', n is defined above, Q 1, R, R 2 and R 5 are hydrogen and R 4 is amino, or (I) a compound of the formula H yOMe / - \ Q1 \ / 10 // Wherein Q 1 is CO 2 R, R is C 1-6 alkyl and n is an integer from noli to five, is reacted with an α-halo carboxylic acid derivative of the formula BrCH 2 CO 2 R: wherein R is defined above, where an organic solvent and base are present at a temperature between 0 ° C and the reflux temperature, to provide a compound of formula IA wherein Q 1, Q and n are defined above. 30 R2 är väte och R4 är nitro, eller (J) produkten frän steg (I) bringas att reagera med ett de-esterifieringsämne, säsom en stark syra, och däref-ter med ett hydreringsämne, säsom Pd/C och väte, under för 152 104898 reaktionen normala förhällanden, för att ästadkomma en förening enligt formeln IA, väri Q1, Q och n är definierade ovan, R, R2 och R5 är väte och 5 R4 är amino, eller (K) produkten frän steg (B) , (F) , (H) eller (J) bringas att reagera med tiofosgen för att ästadkomma mots-varande förening, väri R2 eller R4 är isotiocyanato; (L) föreningen möjligtvis enligt formeln IA bringas 10 genom kända förfaranden att reagera med en lämplig reagens för att ästadkomma kalium-, natrium-, litium-, ammonium-, kalcium-, magnesium- eller vätekloridadditioner av föreningen säsom farmaceutiskt godtagbara salter, och (M) en förening framställd enligt nägot av förfa- 15 randena (A) - (L) bringas att reagera med en metalljon, vilken metalljon är La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y eller Se.R 2 is hydrogen and R 4 is nitro, or (J) the product of step (I) is reacted with a deesterification agent, such as a strong acid, and then with a hydrogenation agent such as Pd / C and hydrogen. Reaction conditions to give a compound of formula IA wherein Q 1, Q and n are defined above, R, R 2 and R 5 are hydrogen and R 4 is amino, or (K) the product of step (B), ( F), (H) or (J) are reacted with the thiophosgene to provide the corresponding compound, wherein R 2 or R 4 is isothiocyanato; (L) the compound possibly of formula IA is reacted by known methods with a suitable reagent to effect potassium, sodium, lithium, ammonium, calcium, magnesium or hydrogen chloride additions of the compound as pharmaceutically acceptable salts, and ( M) a compound prepared according to any of the procedures (A) - (L) is reacted with a metal ion, which metal ion is La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho , Er, Tm, Yb, Lu, Y or Se. 3. R är C1-4 — alkyl och 104898 R2 är amino, eller (C) produkten frän steg (B) bringas att reagera med ett de-esterifieringsämne, säsom en stark syra, för att ästadkomma en förening enligt formeln IA, väri3. R is C 1-4 alkyl and R is amino, or (C) the product of step (B) is reacted with a deesterification agent, such as a strong acid, to afford a compound of formula IA wherein 4. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e - tecknat av att som förening enligt formeln IA an-vänds 1-(2-hydroxi-5-aminobentsyl)-1,4,7,10-tetra-azacy-klododekan-4,7,10-triättiksyra. 30 5. Förfarande enligt patentkrav 1, känne- t e c k n a t av att som förening enligt formeln IA an-vänds a-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetra-azacyklodo-dekani-1-(R,S-ättika)-4,7,10-tris-(R-metylättik)syrans 1-isopropyl-4,7,10-trimetylester. 104898 1534. A process according to claim 1, characterized in that 1- (2-hydroxy-5-aminobentsyl) -1,4,7,10-tetra-azacy-clododecane-4 is used as a compound of formula IA. 7,10-triacetic acid. Process according to claim 1, characterized in that α- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetra-azacyclododecane-1- (R, S-acetic) -4,7,10-tris- (R-methylacetic) acid 1-isopropyl-4,7,10-trimethyl ester. 104898 153 5 R3, R4 och R är väte och R2 är amino, eller (G) en förening med formeln H (f 'N-(CH2)-c-N N- h (IVA) n H / SO 2R 3, R 4 and R are hydrogen and R 2 is amino, or (G) a compound of the formula H (f 'N- (CH 2) -c-N N- h (IVA) n H / SO 2 5 Q1 och n är definierade ovan, R3, R4 och R5 är väte, R är väte och R2 är amino, eller (D) en förening enligt ovan definierade formel VA 10 bringas att reagera med ett optiskt aktivt a-bensensul- fonat med formeln R* \^C°0R 15 ▼Q 1 and n are as defined above, R 3, R 4 and R 5 are hydrogen, R is hydrogen and R 2 is amino, or (D) a compound of formula VA 10 defined above is reacted with an optically active α-benzenesulfonate of formula R * \ ^ C ° 0R 15 ▼ 0 H _ i ° —s=o ό väri R ja R5 är definierade ovan, för att ästadkomma en förening enligt formeln IA, väri Q1, R5 och n är definierade ovan, • ' 25 R3 och R4 är väte, R är Ci.4-alkyl och R2 är nitro, eller (E) produkten frän steg (D) bringas att reagera med ett hydreringsämne, säsom Pd/C och väte, under för reak- 30 tionen normala förhällanden, för att ästadkomma en fö-rening enligt formeln IA, väri Q1, R5 och n är definierade ovan, R3 och R4 är väte, R är C^-alkyl och 35 R2 är amino, eller 150 104898 (F) produkten frän steg (E) bringas att reagera med ett de-esterifieringsämne, säsom en stark syra, för att ästadkomma en förening enligt formeln IA, väri Q1, R5 och n är definierade ovan,Where R 1a R 5 is defined above to provide a compound of formula IA wherein Q 1, R 5 and n are defined above, R 3 and R 4 are hydrogen, R is C 1. 4-alkyl and R 2 are nitro, or (E) the product of step (D) is reacted with a hydrogenation agent, such as Pd / C and hydrogen, under normal reaction conditions to provide a compound of the formula IA where Q 1, R 5 and n are defined above, R 3 and R 4 are hydrogen, R 3 is C 1-4 alkyl and R 2 is amino, or the product of step (E) is reacted with a deesterification agent , as a strong acid, to provide a compound of formula IA wherein Q1, R5 and n are as defined above, 6. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e -tecknat av att som förening enligt formeln IA an-vänds a-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetra-azacyklodo-dekan-1-(R,S-ättika)-4,7,10-tris-(R-metylättik)syra. 56. Process according to claim 1, characterized in that α- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetra-azacyclododecane-1 is used as a compound of formula IA - (R, S vinegar) -4,7,10-tris- (R-methylacetic) acid. 5 7. Förfarande enligt patentkrav 1, kanne- tecknat av att som förening enligt formeln IA an-vänds a- [2-(4-isotiocyanatofenyl)etyl] -1,4,7,10-tetra-aza-cyklododekan-1-(R,S-ättika)-4,7,10-tris-(R-metylättik)syra. 10Process according to claim 1, characterized in that α- [2- (4-isothiocyanatophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetra-aza-cyclododecane-1- ( R, S-vinegar) -4,7,10-tris- (R-methylacetic) acid. 10 8. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e - tecknat av att som förening enligt formeln IA an-vänds a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetra-azacyklododekan- 1,4,7-triättiksyra.8. A process according to claim 1, characterized in that α- (4-aminophenyl) -1,4,7,10-tetra-azacyclododecane-1,4,7-triacetic acid is used as a compound of formula IA. 9. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e - 15 tecknat av att som förening enligt formeln IA an- vänds a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetra-azacyklododekan- 1.4.10- triättiksyra.9. A process according to claim 1, characterized in that α- (4-aminophenyl) -1,4,7,10-tetra-azacyclododecane-1,4.10-triacetic acid is used as a compound of formula IA. 10. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e -tecknat av att som förening enligt formeln IA an- 20 vänds a-(4-aminofenyl)-1,4,7,10-tetra-azacyklododekan- 1.4.7.10- tetraättiksyra.10. A process according to claim 1, characterized in that α- (4-aminophenyl) -1,4,7,10-tetra-azacyclododecane-1,4.7,10-tetraacetic acid is used as a compound of formula IA. 11. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e -tecknat av att som förening enligt formeln IA an-vänds a-(4-isotiocyanatofenyl)-1,4,7,10-tetra-azacyklodo- ;· 25 dekan-1,4,7,10-tetraättiksyra.11. A process according to claim 1, characterized in that α- (4-isothiocyanatophenyl) -1,4,7,10-tetra-azacyclodo-1,4-decane-1,4 is used as a compound of formula IA , 7,10-tetraacetic acid. 12. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e -tecknat av att som förening enligt formeln IA an-vänds a-[2-(4-nitrofenyl)etyl] -1,4,7,10-tetra-azacyklodo-dekan-1,4,7,10-tetraättiksyrans 1,4,7,10-tetrametylester. 3012. Process according to claim 1, characterized in that α- [2- (4-nitrophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetra-azacyclododecane-1 is used as a compound of formula IA , 4,7,10-tetraacetic acid 1,4,7,10-tetramethyl ester. 30 13. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e - ·· tecknat av att som förening enligt formeln IA an- vänds a-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetra-azacyklodo-dekan-1,4,7,10-tetraättiksyrans 1,4,7,10-tetrametylester.13. A process according to claim 1, characterized in that α- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetra-azacyclododecane is used as a compound of formula IA -1,4,7,10-tetraacetic acid 1,4,7,10-tetramethyl ester. 14. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e - 35 tecknat av att som förening enligt formeln IA an- 104898 154 vänds o-[2-(4-aminofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetra-azacyklodo-dekan-1,4,7,10-tetraättiksyra.14. A process according to claim 1, characterized in that o- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetra-azacyclododone is used as a compound of formula IA. decane-1,4,7,10-tetraacetic acid. 15. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e -tecknat av att som förening enligt formeln IA an- 5 vänds a-[2-(4-isotiocyanatofenyl)etyl]-1,4,7,10-tetra-aza- cyklododekan-1,4,7,10-tetraättiksyra.15. A process according to claim 1, characterized in that α- [2- (4-isothiocyanatophenyl) ethyl] -1,4,7,10-tetra-azacyclododecane can be used as the compound of formula IA 1,4,7,10-tetraacetic acid. 15 H väri R3' är C1_4-alkoxi, -0CH2C02H eller hydroxi och n är ett heltal frän noil till fem, 20 bringas att reagera med en a-halogenkarboxylsyra med formeln BrCH2C02H j' ' 25 dä en organisk solvens och bas är närvarande vid en tempe- ratur mellan 0 °C och äterflödestemperaturenen, för att ästadkomma en förening enligt formeln IA, väri R3 är den samma som ovan definierade R3', n är definierad ovan,H is R 3 'is C 1-4 alkoxy, -OCH 2 CO 2 H or hydroxy and n is an integer from noil to five, reacted with an α-halo carboxylic acid of the formula BrCH 2 CO 2 H 2 where an organic solvent and base are present at temperature between 0 ° C and the reflux temperature to provide a compound of formula IA wherein R 3 is the same as defined above R 3 ', n is defined above; 15 Q1 är väte eller C02R, varje R är självständigt väte eller C^-alkyl, under förutsättning, att ätminstone tvä av substituenterna Q och Q1 är annat än väte och att dä Q1 är väte, är R3 annat än väte, 20 varje R5 är självständigt väte eller C1.4-alkyl, n är ett heltal frän noil tili fem, p är 1 eller 2, R2 är väte eller en nitro-, amino-, isotiocyanato-, semi-karbazid-, tiosemikarbazid-, maleimid-, bromacetamid- el-1 25 ler karboxylgrupp, R3 är C^-alkoxi, -0CH2C02H, hydroxi eller väte, R4 är väte eller en nitro-, amino-, isotiocyanato-, semi-karbazid-, tiosemikarbazid-, maleimid-, bromacetamid- eller karboxylgrupp, 30 under förutsättning, att R2 och R4 icke vardera kan vara / väte men den ena av dem mäste vara väte, eller farmaceutiskt godtagbara salter därav komplexerade med en metalljon, som är La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y tai Se, 35 kännetecknat av att 148 104898 (A) en förening med fortneln H 5 ?' \ / <VA) o2ft—r -(CH2)-c-n n-h " H H 10 vari Q1 är C02R, R är C^-alkyl och 15 n är ett heltal frän noil till fern, bringas att reagera med en a-halogenkarboxylsyraester med formeln BrCH2C02R 20 väri R är -alkyl, dä en organisk solvens och bas är när-varande vid en temperatur mellan 0 °C och äterflödestempe-raturen, för att ästadkomma en förening enligt formeln IA, vari ; · 25 Q1 och n är definierade ovan, • « R3, R4 och R5 är väte, R är C1.4-alkyl och R2 är nitro, eller (B) produkten frän steg (A) bringas att reagera med 3. ett hydreringsämne, säsom Pd/C och väte, under för reak- .* tionen normala förhällanden, för att ästadkomma en fö rening enligt formeln IA, vari Q1 och n är definierade ovan, R3, R4 och R5 är väte,Q 1 is hydrogen or CO 2 R, each R is independently hydrogen or C 1-6 alkyl, provided that at least two of the substituents Q and Q 1 are other than hydrogen and that where Q 1 is hydrogen, R 3 is other than hydrogen, each R 5 is independently hydrogen or C 1-4 alkyl, n is an integer from noil to five, p is 1 or 2, R 2 is hydrogen or a nitro, amino, isothiocyanato, semi-carbazide, thiosemicarbazide, maleimide, bromoacetamide - or 1-carboxyl group, R 3 is C 1-4 alkoxy, -OCH 2 CO 2 H, hydroxy or hydrogen, R 4 is hydrogen or a nitro, amino, isothiocyanato, semi-carbazide, thiosemicarbazide, maleimide, bromoacetamide or provided that R2 and R4 cannot each be hydrogen but one of them must be hydrogen, or pharmaceutically acceptable salts thereof, complexed with a metal ion which is La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu , Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y tai Se, 35 characterized by having a compound having the accelerator H 5? ' Wherein Q 1 is CO 2 R, R is C 1-4 alkyl and n is an integer from no to ester, is reacted with an α-halo carboxylic acid ester of the formula Wherein R is -alkyl, where an organic solvent and base are present at a temperature between 0 ° C and the reflux temperature, to provide a compound of formula IA, wherein: Q1 and n are defined above; R 3, R 4 and R 5 are hydrogen, R is C 1-4 alkyl and R 2 is nitro, or (B) the product from step (A) is reacted with 3. a hydrogenation agent such as Pd / C and hydrogen under the reaction normal conditions, to provide a compound of formula IA wherein Q1 and n are defined above, R3, R4 and R5 are hydrogen, 16. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e -tecknat av att som förening enligt formeln IA an-vänds o-(2-metoxi-5-nitrofenyl)-1,4,7,10-tetra-azacyklo- 10 dodekan-1,4,7,10-tetraättiksyra.16. A process according to claim 1, characterized in that o- (2-methoxy-5-nitrophenyl) -1,4,7,10-tetra-azacyclodeodecane-1 is used as a compound of formula IA , 4,7,10-tetraacetic acid. 17. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e -tecknat av att som förening enligt formeln IA an-vänds a-(2-metoxi-5-aminofenyl)-1,4,7,10-tetra-azacyklo-dodekan-1,4,7,10-tetraättiksyra i form av tetra-ammonium- 15 sait.17. Process according to claim 1, characterized in that α- (2-methoxy-5-aminophenyl) -1,4,7,10-tetra-azacyclo-dodecane-1 is used as a compound of formula IA. 4,7,10-tetraacetic acid in the form of tetra-ammonium acid. 18. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e -tecknat av att som förening enligt formeln IA an-vänds o-(2-metoxi-5-isotiocyanatofenyl)-1,4,7,10-tetra-azacyklododekan-1,4,7,10-tetraättiksyra i form av tetra- 20 ammoniumsalt.18. Process according to claim 1, characterized in that o- (2-methoxy-5-isothiocyanatophenyl) -1,4,7,10-tetra-azacyclododecane-1,4 is used as a compound of formula IA. 7,10-tetraacetic acid in the form of tetraammonium salt. 19. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-18, kännetecknat av att metalljonen är 153Sm, 166Ho, 90Y, 149Pm, 159Gd, 140La, 177Lu, 17SYb, 47Sc eller 142Pr.Method according to any of claims 1-18, characterized in that the metal ion is 153Sm, 166Ho, 90Y, 149Pm, 159Gd, 140La, 177Lu, 17SYb, 47Sc or 142Pr. 20. Förfarande enligt patentkrav 19, k ä n n e- :· - 25 tecknat av att metalljonen är 153Sm, 177Lu eller 90Y.20. A method according to claim 19, characterized in that the metal ion is 153Sm, 177Lu or 90Y. 21. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-20, kännetecknat av att föreningen enligt formeln IA bringas att reagera med en metalljon genom att hetta upp reaktionsblandningen. 3021. A process according to any one of claims 1 to 20, characterized in that the compound of formula IA is reacted with a metal ion by heating the reaction mixture. 30