FI104264B - Menetelmä sekundääristen metaboliittien tuoton parantamiseksi käyttämällä rykelmöityjä biosynteettisiä geenejä - Google Patents

Menetelmä sekundääristen metaboliittien tuoton parantamiseksi käyttämällä rykelmöityjä biosynteettisiä geenejä Download PDF

Info

Publication number
FI104264B
FI104264B FI893722A FI893722A FI104264B FI 104264 B FI104264 B FI 104264B FI 893722 A FI893722 A FI 893722A FI 893722 A FI893722 A FI 893722A FI 104264 B FI104264 B FI 104264B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
gene
penicillin
genes
host cell
dna construct
Prior art date
Application number
FI893722A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI893722A (fi
FI893722A0 (fi
FI104264B1 (fi
Inventor
Juan Francisco Martin
Emilio Alvarez
Jose Luis Barredo
Martinus Antonius Math Groenen
Solingen Pieter Van
Bertus Pieter Koekman
Annemarie E Veenstra
Der Voort Lucia Helena Mar Van
Santiago Gutierrez
Bruno Dies
Christina Esmahan
Original Assignee
Dsm Ip Assets Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26115259&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI104264(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Dsm Ip Assets Bv filed Critical Dsm Ip Assets Bv
Publication of FI893722A0 publication Critical patent/FI893722A0/fi
Publication of FI893722A publication Critical patent/FI893722A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI104264B publication Critical patent/FI104264B/fi
Publication of FI104264B1 publication Critical patent/FI104264B1/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/375—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Basidiomycetes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P37/00—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

104264
Menetelmä sekundääristen metabolIittien tuoton parantamiseksi käyttämällä rykelmöityjä biosynteettisiä geenejä
Keksinnön kohteena on sekundääristen metaboliittien tuottoon osallistuvien rykelmöityjen biosynteettisten geenien eristäminen ja käyttö.
Klassisten kannan parannusmenetelmien ansiosta penisilliinin tuotto on parantunut valtavasti neljän viime vuosikymmenen aikana. Nämä klassiset kannan parannusmenetelmät perustuivat ensisijaisesti Penicllllum chrysogenum1homeen satunnaiseen mutagenisointikäsittelyyn ja sitä seuraavaan paremman penisilliinintuoton omaavien kantojen valintaan. Kloonaus tekniikoiden kehittyminen on kuitenkin antanut uuden tehokkaan menetelmän edelleen lisätä tämän homeen penisilliinin tuottoa.
Penisilliiniä tuottaa rihmamainen sieni, P_;_ chrysoqenum, useiden entsymaattisten välivaiheiden kautta (esim. E. Alvarez et ai. Antimicrob. Agents Chemoter. (1987) s. 1765-1682). Nämä välivaiheet on esitetty kuvassa 1. Läpi tämän selityksen tarkoitetaan suoraan biosynteettiseen reittiin kuuluvilla geeneillä niitä geenejä, jotka koodaavat niitä entsyymejä, jotka esiintyvät aktiivisina niissä useissa välivaiheissa, jotka johtavat sekundääristen metaboliittien tuottamiseen, eli kuten kuvassa 1 on tarkoitettu geenejä, jotka koodaavat penisilliini G:n tai V:n tuottoon tarvittavia entsyymejä. Ensimmäinen reaktio on tripeptidin, 6-(L-a-aminoadipyyli)-L-kysteinyyli-D-valiinin, muodostuminen a-aminoadipiinihaposta, kysteiinistä ja valiinista. Tämän reaktion suorittava entsyymi on ACV-syntetaasi (tästä lähin lyhennetty ACVS), suuri, usein eri tavoin toimiva entsyymi. Tripeptidi syklisoituu isopenisilliini N-syntetaasin (tästä lähin lyhennetty IPSN) tai syklaasin vaikutuksesta. Reaktio-tuote on isopenisilliini N, yhdiste, jolla on tyypillinen β-laktaamin rengasrakenne, ja jolla on antimikrobista tehoa. Lopullinen vaihe penisilliinin muodostuksessa on isopenisil- 104264 2 liini N:n sivuketjuna olevan α-adipiinihapon vaihtaminen hydrofobiseksi sivuketjuksi. Teollisessa tuotannossa yleisesti käytettyjä hydrofobisia sivuketjuja ovat fenyylietik-kahappo, jolloin saadaan penisilliini G:tä, ja fenoksietik-kahappo, jolloin saadaan penisilliini V:tä. Sivuketjun vaihtoa on pidetty yhden entsyymin aikaansaamana reaktiona (A.L. Demain (1983): A.L. Demain ja N.A. Solomon (toim.), Antibiotics containing β-lactam structure I. Springer Verlag, Berlin; s. 189 - 228). Kuitenkin kaksivaiheinen reaktio, jossa 6-APA on välituotteena, on myös mahdollinen (E. Alvarez et ai., ks. edellä). Viimeiseen reaktioon osallistuvaksi entsyymiksi on tunnistettu asyyliCoA:6-APA asyylitransferaasi (tästä lähin lyhennetty AT), joka on puhdistettu homogeeniseksi (E. Alvarez et ai. ks. edellä). Toisen entsyymin osallistumista reaktioon, jossa IPN katalysoidaan 6-APA:ksi, ei ole voitu vahvistaa eikä sulkea pois.
Ei ole selvää onko yksi tai useampi entsymaattinen reaktio nopeutta rajoittavana tekijänä penisilliinin biosynteesissä, ja jos niin on, niin mitä entsymaattista reaktioita ne ovat.
Koska penisilliinin biosynteettinen reitti alkaa kolmesta aminohaposta, joista jokainen omalta osaltaan on osana muissa metabolireiteissä, vaikuttavat myös näissä reiteissä olevat ohjaavat tekijät penisilliinin biosynteesiin. Toisaalta penisilliinin tuottoon liittyy monimutkaisella reaktiolla hiilen kataboliittinen repressio ja typen lähteen kontrolli (J.F. Martin et ai., teoksessa H. Kleinkauf, H. von Döhren, H. Donnauer ja G. Nesemann (toim.), Regulation of secondary metabolite formation. VCH Verlaggesellschaft, Weinheim (1985), s. 41-75). Säätelyproteiinit voivat myös ottaa osaa tämänkaltaiseen säätelyyn. Näiden säätelyproteiinien ja niiden säätelemien proteiinien on todettu olevan epäsuorasti osallisena sekundääristen metaboliittien, tässä tapauksessa penisilliinin biosynteettisessä reitissä.
104264 Tähän mennessä vain yhden penisilliini G:n biosynteettisessä reitissä aktiivisen entsyymin, isopenisilliini N-syntetaasin (IPSN) eli syklaasin, geeni on kloonattu ja sekvenoitu (L.G. Carr et ai., Gene 4i3 (1986 ) s. 257-266), käyttämällä vas-• taavaa Acremonlum chrysogenum-geenlä (S.M. Samson et ai. Na ture 318 (1985) s. 191-194). Viimeksi mainittu geeni kloonattiin ja tunnistettiin puhdistettaessa IPNS-proteiinia määrittämällä aminoterminaalinen aminohapposekvenssi, valmistamalla tätä sekvennsiä vastaavat synteettiset oligodeok-siribonukleotidikoettimet ja tutkimalla tällä oligodeoksiri-bonukleotidiseoskoettimella perimän kosmidikirjastoa (S.M. Samson, kuten edellä).
Sekä Penlclllium chrysoqenumista että Acremonlum chrysoqenu-mlsta eristettyjä, IPSN:ää koodaavia geenejä on käytetty kannan parantamiseen. Penicillium chrysocenumin tapauksessa kohonnut entsyymiaktiivisuus on voitu todeta, kuitenkin penisilliinin biosynteesin stimuloitumista ei ole voitu todeta (P.L. Skatrud et ai., Poster presentation 1987 annual meeting of the Society of Industrial Microbiology, Baltimore, August 1987, Abstract published in SIM News 2J_ (1987) s.
77). Acremonlum chrysoqenumin kohdalla on todettu samanlaisia tuloksia (J.L. Chapman et ai., (1987), Developments in Industrial Microbiology; S.W. Queener, 4th ASM conference on the Genetics and Molecular Biology of Industrial Microorganisms, Bloomington, October 1988, Proceedings ilmestyy v. 1989) .
Täten tähän mennessä ei ole saatu mitään todisteita siitä, että IPNS-geeniä olisi voitu käyttä geeniamplifikoinnin avulla tehostamaan penisilliinin tai kefalosporiinin tuottoa.
On havaittu, että β-laktaamiantibioottien biosynteesi on glukoosirepression kohteena (J.F. Martin ja P. Liras, TIBS 3 (1985), s. 39-44). Tämä glukoosin aiheuttama repressio on , 104264 4 todettu yksiselitteisesti ACVS:n katalysoimassa tripeptidin muodostusreaktiossa ja vaikuttavan IPNS:n aktiivisuuteen (Revilla et ai., J. Bact. 168 (1986), s. 947-952). Toisaalta asyylitransferaasin kohdalla havainnot ovat vähemmän vakuuttavia. Revilla et ai. (kuten edellä) ilmoittavat, että AT:llä ei esiinny glukoosin aihettamaa repressiota, mutta toisissa havainnoissa ilmoitetaan AT:n aktiivisuuden häviävän tai ainakin alenevan, kun glukoosia on läsnä (B. Spencer ja T. Maung, Proc. Biochem. Soc. 1970, s. 29-30).
Ei tiedetä missä ilmentymisen vaiheessa glukoosin repressio vaikuttaa, se voi tapahtua transkriptio- tai translaa-tiovaiheessa. Jos ensimmäinen sääntely pitää paikkansa, niin eroja mRNA:n pitoisuuksia tuottavissa ja tuottamattomissa viljelmissä voidaan käyttää hyväksi eristettäessä penisilliinin biosynteesiin osallistuvia geenejä. Tämä menetelmä, sekundääristen metaboliittien biosynteesiin osallistuvien geenien eristämiseksi, on aiheena rinnakkaisessa patenttihakemuksessamme, joka on otsikoitu: "Menetelmä biosynteettis-ten tai säätelygeenien identifioimiseksi ja käyttämiseksi sekundääristen metaboliittien tuoton parantamiseksi", ja joka on jätetty samana päivänä kuin tämä hakemus, ja joka on esitetty tässä viitteenä.
Antibioottien biosynteesiin osallistuvien geenien rykelmöin-ti on kuvattu streptomycetes-homeelle. Esimerkkejä rykelmöinnistä ovat aktinorhodiinin tuottoon osallistuvien biosynteettisten geenien rykelmöinti S. coelicolorissa (F. Malpartida ja D. A. Hopwood, 1984, Nature 309, 462-464) tai tetracenomysiini C:n tuottoon S. qlaucescensissä osallistuvien biosynteettisten geenien rykelmöinti (H. Motamedi ja C.R. Hutchinson, 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 84, 4445-4449) .
Sienissä on β-laktaamin biosynteesiin osallistuvien geenien järjestäytymistä tutkittu sellaisten mutanttien geneettisel- 104264 lä analyysillä, joilla mutanteilla penisilliinin tuotto on alentunut. Aspergillus nidulansllla on neljän lokuksen (npe A, B, C ja D) todettu ottavan osaa penisilliinin biosynteesiin, nämä lokukset on paikannettu neljään eri liitosryhmään (s.o. kromosomeihin), viz. VI, IV, III ja vastaavasti II, (J. F. Makins et ai., 1980, Advantages in Biotechnology 3, 51-60; J. F. Makins et ai., 1983, Journal of General Microbiology 123, 3027-3033). Penicllllum chrysoqenumilla on tunnistettu viisi lokusta (npe V, W, X, Y ja Z), nämä lokukset on paikannettu kolmeen liitosryhmään, viz. I (npe W, Y, Z) ja kaksi muuta sisältäen npe V:n ja vastaavasti npe X:n, (P.J.M. Normansell et ai., 1979, Journal of General Microbi ol. 112, 113-126; J.F. Makins et ai., 1980, kuten edellä). Mutaatioiden, jotka vaikuttavat renkaansulkuentsyymeihin (IPSN:ään eli syklaasiin; npe W), sivuketjun vaihtajaentsyy-miin (asyylitransferaasiin; npe V); on havaittu olevan erillisissä liitosryhmissä. Täten tämän geneettisen tiedon perusteella on oletettavaa, että ainakin eräät penisilliinin biosynteesiin osallistuvat geenit sijaitsevat erillään sienen genomissa, ja että esim. syklaasi- ja asyylitransferaa-sientsyymien rykelmöittäminen ei mitenkään ole ennakoitavissa näiden tietojen pohjalta.
Tässä hakemuksessa on esitelty antibioottien biosynteesiin osallistuvat, rykelmöidyt geenit ja niitä on käytetty menestyksellisesti tehostamaan antibioottien tuotantoa mikro-organismeissa ja eristettäessä muita antibioottien synteesiin osallistuvia geenejä. Esimerkkinä keksinnöstä on esitetty penisilliinin parannettu tuotto Penlclllium chrysoge-numissa, eristämällä muita biosynteettisiä rykelmöityjä geenejä ja ilmentämällä rykelmöityjä penisilliinin biosynteesiin osallistuvia geenejä Acremonium chrysogenlumissa.
Lyhyt kuvaus piirustuksista
Kuvassa 1. on esitetty kaavamaisesti penisilliini G:n tai V:n biosynteettinen reitti P. chrysoqenumissa.
104264 6
Kuvassa 2. on esitetty lambda-kloonien G2 ja B21, jotka sisältävät rykelmöidyt (IPSN ja AT)geenit, restriktiokartta. E=EcoRI; B=BamHI; C=ClaI; H=HindIII; K=KpnI; S=SalI;
Sa=Sacl; Sp=SphI; P=PstI; X=XhoI; Xb=XbaI; Hp=HpaI; N=NcoI; Bq=BqlII.
= bakteriofagi lambda EMBL 3:n (9 kb) oikea käsivarsi = bakteriofagi lambda EMBL 3:n (20,3 kb) vasen käsivarsi.
Kuvassa 3. on esitetty P. chrysoqenumin asyylitransferaasi-geenin nukleotidisekvessi ja siitä määritetty aminohapposekvenssi .
Kuvassa 4. on esitetty kosmidikloonausvektori pPS07:n rest-riktio- ja toimintakartta.
Kuvassa 5. on esitetty pPS47:n restriktio- ja toimintakartta.
Kuvassa 6. on esitetty pGlOl A:n ja B:n restriktio- ja toimintakartta.
Kuvassa 7. on esitetty pG102 A:n ja B:n restriktio- ja toimintakartta.
Kuvassa 8. on esitetty kosmidi HM193:n restriktio- ja toimintakartta (kaikkia olemassaolevia restriktiokohtia ei ole merkitty, katkoviiva kuvaa vähemmän karakterisoitua aluetta.)
Kuvassa 9. on esitetty graafisesti penisilliinin tuotto kannoilla, joita on transformoitu ((¾¾ )pPS47 :llä tai <l^> pGJ102A:lla.
Tämän keksinnön mukaisesti on eristetty DNA:n fragmentteja, jotka omaavat sekvenssejä, jotka ovat joko mono- tai poly- 104264 7 kistronisia. Sekvenssien koodaamat geenit translatoidaan entsyymeiksi, jotka ottavat osaa sekundääristen metaboliit-tien tai muiden kaupallista mielenkiintoa omaavien yhdisteiden tuottoon. Mielenkiinnon kohteena olevat sekvenssit on tunnistettu vertaamalla niitä DNA-sekvensseihin, jotka on eristetty riittävän sekundääristen metabolIittien tuotantokyvyn omaavista mikro-organismeista, joissa mielenkiinnon kohteena olevat geenit aktiivisesti ilmentyvät sekä mikro-organismeihin, joissa ilmentyminen on olematon. Täten DNA-fragmentit koodaavat yhtä tai useampaa geeniä edellyttäen, että ne ilmentyvät erillisinä tai, että ne ottavat osaa kaupallisesti mielenkiintoisten yhdisteiden tuottoon. Erillisilmentymisellä ymmärretään tässä hakemuksessa mielenkiinnon kohteena olevien geenien sellaista ilmentymistä, joka on erityisesti aktiivinen tietyissä, määritellyissä olosuhteissa ja jota ei esiinny (minkä tässä hakemuksessa tarkoitetaan esiintyvän matalalla tasolla, esim. 5 % tai vähemmän verrattuna aktiiviseen tasoon) toisissa, vastaavasti . tarkoin määritellyissä olosuhteissa.
Ilmentymisen esiintymättömyys voi johtua repressiosta tai geeniilmentymisen indusoitumisen puutteesta, mutaatiosta tai mistä muusta tahansa tapahtumasta, joka johtaa mielenkiinnon kohteena olevan (olevien) geenin (geenien) transkription estymiseen. Eristetty DNA voi olla saatu haulla geenikirjas-tosta, joko genomisesta tai cDNA-kirjastosta, joka on ollut esim. lambda- tai kosmidi-kloonausvektorissa tai ekspressio-vektorissa. Käyttämällä hyväksi cDNA-koetinta, joka on rikastettu niiden sekvenssien suhteen, jotka sekvenssit ilmentyvät sekundääristen metaboliittien biosynteesin aikana, voidaan positiiviset hybridit tunnistaa kirjastosta sitä ’ seuraavaa toimenpidettä varten, jossa saadaan ilmentymisra- kenteita entsyymille/entsyymeille, jotka ovat mukana sekundäärisen metaboliitin tuotossa.
Siksi mikro-organismin geenikirjasto tutkitaan kahdella cDNA-koettimella, joista toinen on rikastettu transkriptionaan- β 104264 sesti aktiivisen tilan geenien suhteen ja toinen perustuu transkriptionaalisesti passiiviseen tilaan. Vertaamalla ja vähentämällä voidaan eristää kloonit, jotka sisältävät geenin (geenejä), jotka aktiivisesti ilmentyvät vain kuvatuissa aktiivisissa olosuhteissa.
Menetelmä on esitetty esimerkillä eristämällä geenit, jotka ovat mukana sekundäärisen metaboliitin biosynteesissä, tarkemmin penisilliinin biosynteesissä, käyttämällä kahta cDNA-koetinta, jotka on saatu laktoosilla kasvatetusta (tuottavasta) ja glukoosilla kasvatetusta (tuottamattomasta) rihmastosta .
Kerrotun menetelmän sovellutuksessa yllättäen eristettiin rykelmöidyt, penisilliinin biosynteettiset geenit, jotka koodaavat syklaasia ja asyylitransferaasia, P. chrysoqenu-mista (vertaa rinnakkaiseen hakemukseemme, ks. edellä).
Tätä tietoa voidaan käyttää menestyksellisesti hyväksi . eristettäessä muita geenejä kerrotulta antibioottien biosynteettiseltä reitiltä käyttämällä alalla tunnettua "chromosome walking"-tekniikkaa. Tämä viimeksi mainittu menetelmä on erittäin hyödyllinen tapauksissa, joissa mielenkiinnon kohteena olevat geenit eivät ilmenny erikseen, mikä tarkoittaa, että geenin koodaamaa entsyymiä ei saada puhdistettua, mitä puhdistettua entsyymiä tarvitaan geenin eristämiseen "reversed genetics"-menetelmällä tai muilla alalla yleisesti tunnetuilla geenien eristysmenetelmillä ja joissa tapauksissa ei onnistuta saamaan mielenkiinnon kohteena olevaa geeniä.
Rykelmöintiä käytetään läpi tämän hakemuksen, kun kysymyk- 1 t sessä on kaksi tai useampia geenejä, joilla on vastaava toiminta (esim. ne ovat mukana sekundääristen metaboliittien biosynteettisessä reitissä) ja jotka ovat samassa DNA-frag-mentissa, joka on kloonattavissa kosmidi-kloonausvektoriin, ja joiden välissä ei ole muita asiaan kuulumattomia geenejä.
104264 9
Esitetty rykelmä voi olla luonnollinen tai, keksinnön erään toisen suoritusmuodon mukaan, se voidaan valmistaa keinotekoisesti alalla yleisesti tunnetuilla menetelmillä liittämällä kaksi tai useampia mielenkiinnon kohteena olevia geenejä yhteen DNA-fragmenttiin.
Onnistuneena sovellutuksena penisilliinin biosynteettisten geenien rykelmöinnistä muiden penisilliinin biosynteettisten geenien eristämiseksi on esimerkein esitetty tässä ACV-syntetaasia koodaavan geenin eristäminen käyttäen hyväksi "chromosome walking"-menetelmää.
Edelleen penisilliinin biosynteettisten geenien rykelmöintiä on menestyksellisesti käytetty hyväksi sekä syklaasi- että asyylitransferaasigeenien monistamiseen P. chrysoqenumissa, mikä monistaminen johtaa lisääntyneeseen penisilliinin tuottoon.
Tunnistetut DNA-jaksot sisältävät ainakin yhden geenin, edullisesti kaksi tai useampia geenejä, jotka koodaavat antibioottista biosynteettistä entsyymiä ja/tai kokonaisen biosynteettisen reitin säätelyproteiinia, tai yleisimmin, mitä tahansa proteiinia, joka on jollain tavalla tekemisissä, joko positiivisella tai negatiivisella tavalla, sanotun antibiootin biosynteesissä.
Positiivisesti vaikuttavat rakenteet, kun ne on viety kunnolla sopivaan isäntämikro-organismiin, lisäävät biosynteettisen reitin tehoa β-laktaamin tuotossa mikro-organismissa lisääntyneellä geeniannoksella tai korkeammalla geeni-ilmentymisellä. Toisaalta voidaan eristää rakenteita, joilla • · on negatiivisia vaikutuksia antibiootin tuottoon (esim. sivutuotteiden muodostumiseen). Näiden rakenteiden tarkoituksena on inaktivoida negatiivisesti toimiva geeni geenin korvauksella tai toisilla saman vaikutuksen omaavilla menetelmillä. Molemmat käytöt johtavat halutun antibiootin suurem 104264 10 piin saantoihin teollisessa tuotannossa. Tämä menetelmä on esimerkein esitetty ja sillä on erityinen sovellutus antibioottien tuotossa, erityisesti penisilliinin tuotossa, käytettäessä β-laktaamia tuottavien mikro-organismien kanssa. Edullisesti ekspressioyksikkö voi sisältää geenejä, jotka koodaavat entsyymejä, jotka katalysoivat tuottonopeutta rajoittavia välireaktioita, tai geenejä, jotka koodaavat proteiineja, joita tarvitaan transkription induktiossa tai muulla tavalla.
Edelleen keksinnön kohteena olevalla menetelmällä voidaan tuottaa sekvenssejä, joiden koodaamaa tuotetta ei tunneta, mutta sekvenssin on todettu parantavan halutun tuotteen saantoa. Näitä sekvenssejä kutsutaan "kryptisiksi geeneiksi", joilla tarkoitetaan sekvenssejä, joita voidaan eristää tässä kuvatuilla menetelmillä, jotka sekvenssit sisältävät geenejä, joilla ei vielä ole todennettu mitään tunnettua merkitystä. Näitä geenejä on karakterisoitu lisäämällä ja/tai ilmentämällä niitä suurissa määrissä transformoiduissa isäntämikro-organismeissa ja vertaamalla näitä isäntämikro-organismeja transformoimattomiin isäntämikro-organismeihin. "Kryptisten geenien" ja IPNS:n ja asyyli-transferaasin, rinnakkaisesta hakemuksestamme (ks. edellä), lisäksi tämän keksinnön kohteena on geeni, joka koodaa penisilliinin, kefalosporiinin ja kefamysiinin (cephamycin) bio-synteettisen reitin ensimmäistä entsyymiä, joka on 6-(L-a-aminoadipyyli)-L-kysteinyyli-D-valiini-syntetaasi, tästä lähin lyhennetty ACVS.
Edellä mainitussa toisessa hakemuksessa kryptisen, Y-. geeniksi nimetyn geenin todettiin tehostavan penisilliinin biosynteesiä. Tässä keksinnössä osoitetaan penisilliinin tuoton lisääntyvän monistamalla [IPNS- ja AT]-geenirykelmää.
Keksinnössä käytettäviin mikro-organismeihin kuuluu sekä prokaryootteja että eukaryootteja, käsittäen bakteerit kuten 11 104264 sellaiset, jotka kuuluvat taksonomisiin ryhmiin Actinomyce-tes tai Flavobacterlum tai sienet (käsittäen hiivat) kuuluen sukuihin Aspergillus, Acremonlum tai Penlclllium.
Riippuen fragmentin alkuperästä, joko genominen tai cDNA, joko prokaryoottinen tai eukaryoottinen, voidaan valmistaa erilaisia ilmentymiskokonaisuuksia. Bakteeriperäinen genominen DNA, fragmentin sisältäessä mono- tai polykistronisen koodausalueen, voi siinä olla sen oma transkription aloitusta säätelevä alue samoin kuin transkriptionlo^etusalue ja tarkoituksenmukaiset translationaaliset signaalit, kuten esimerkiksi Shine-Dalgarno-jaksot ja lopetuskodonit. Mikäli genominen DNA on sieniperäinen niin normaalisti vain yksi geeni on yhteydessä transkription aloitusta ohjaavaan alueeseen siten, että jokaisella geenillä on oma, toisesta riippumaton transkription aloitusta säätelevä alue. Mikäli käytetään cDNA:ta on välttämätöntä osoittaa transkription aloitusta säätelevä alue riippuen seuraavassa ekspressiossa käytettävästä isäntämikroorganismista.
Mielenkiinnon kohteena olevia geenejä voidaan saada satunnaisesti korkean β-laktaamin tuotantokyvyn omaavan kannan tai sen villityypin esikannan geenikirjastosta (esim. genominen tai cDNA-kirjasto), tai se voidaan seuloa kirjaston alaosasta (subset), joka sisältää geenejä, jotka saattavat olla synteesinopeutta rajoittavina antibiootin biosynteesissä. Erityisen arvokkaita ovat geenit, jotka spesifisesti ilmentyvät antibiootin biosynteesin aikana, mukaanlukien geenit, jotka koodaavat β-laktaamin biosynteettisiä entsyymejä, mitkä entsyymit ovat yleisesti tunnettuja, kuten tripeptidi-syntetaasi (ACVS), syklaasi (IPNS), asyylitransferaasi (AT), epimeraasi, ekspandaasi, hydroksylaasi, transasetylaasi, transkarbamoylaasi, metoksilaasi. Ensisijaisesti geenejä, jotka koodaavat sekä isopenisilliini N-syntetaasia että asyylitransferaasia, ovat suuremmissa määrin annostelun tai ilmentymisen kohteena, jolloin päästään halutun antibiootin suurempiin saantoihin transformoiduissa sienissä.
104264 12
Alan asiantuntijat tietävät, että ilmentyvät geenit β-laktaamia tuottavassa isäntäkannassa voivat joko sisältää oman alkuperäisen promoottorisekvenssin, jonka tunnistaa isäntäsolun RNA-polymeraasi, tai ne voidaan liittää mihin tahansa toiseen sopivaan promoottoriin, esim. toiseen β-laktaamin biosynteettiseen geeniin tai glykolyyttisegee-niin kuten fosfoglyseraattikinaasiin, glyseraldehydifosfaat-tidehydrogenaasiin, trioosifosfaatti-isomeraasiin tai translationaaliseen pidennystekijään (elongation factor), Ef-Tu, tai sen kaltaiseen.
Sellaista promoottoria voidaan käyttään haluttaessa vaikuttaa yhden tai useamman sanottuja entsyymejä koodaavien geenien ilmentymisen säätelyyn. Tämä johtaa antibiootin lisääntyneeseen tuotantoon transformaation jälkeen, sillä penisilliinin tuotto on nyt myös mahdollista olosuhteissa, joissa tarsformoimaton isäntäsolu ei kykene tuottamaan penisilliiniä, esim. glykolyyttiset entsyymit ovat ilmentyneet glukoo-• sin läsnäollessa, kun ne toisaalta repressoitunut glukoosin läsnäollesa (J.F. Martin, kuten edellä). Järjestämällä penisilliinin biosynteettisten geenien ilmentyminen glykolyytti-sen geenin promoottorin kontrolloitavaksi voidaan geenit saada ilmentymään glukoosin läsnäollessa ja täten penisilliiniä voidaan tuottaa fermentoinnin alkuvaiheessa, kun korkeaa glukoosipitoisuutta tarvitaan tuottamaan riittävää rihmastoa. Myös selektointimarkkeri voidaan järjestää sellaisen promoottorin kontrolliin.
Penicilljumin transformaatioon käytetään rakenteita, joissa on vähintään yksi markkeri transformoitujen solujen valitsemiseksi ja mieluiten tehostamaan integroidun DNA:n säilymistä. Siksi käytetty vektori sisältää mieluiten sellaisen tunnetun sekvenssin, jonka tiedetään lisäävän transformaatiote-hokkuutta. Esimerkkinä sellaisesta DNA-sekvenssistä on "ans"-elementti, joka on eristetty Aspergillus nidulansista (vrt. Ballance ja Turner, Gene 36^ (1985) s. 321-331 ). Rin- 13 104264 nakkaisessa patenttihakemuksessamme (ks. edellä) esitetään DNA-sekvenssi, joka on eristetty P^ chrysoqenumln genomista, ja joka on todettu sekvenssiksi, jolla on samanlainen vaikutus kuin "ans"-sekvenssillä. Koska tämä sekvenssi on peräisin P_^ chrysoqenumlsta, voidaan sitä käyttää lisäämään transformaatiotehokkuutta P^ chrysoqenumissa. DNA-sekvenssi sisältää chrysoqenumln pyrG-geenln, joten sitä voidaan käyttää joko yksin, yhdessä pyrG-isännän kanssa, jolloin sanottu DNA-sekvenssi edesauttaa sekä transformanttien valikoinnissa että lisää transformaatiotehokkuutta (vertaa EP-A-260762), tai yhdessä toisen valintamarkkerin kanssa, esim. geenin kanssa, joka koodaa biosidiresistenssiä, kuten fleomysiiniresistenssiä. Jälkimmäisessä tapauksessa transformanttien valintaa ja transformaation tehostumisvaikutusta ohjaavat kaksi eri DNA-sekvenssiä ja pyrG-elementin ainoa tehtävä on lisätä transformaatiofrekvenssiä.
Käyttökelpoisia markkereita transformanttikloonien valinnassa voivat olla joko homologiset tai heterologiset biosyn-teettiset geenit, jotka täydentävät isäntäsolun auksotrofi-sia kasvuvaatimuksia, kuten vajetta metabolisessa reitissä aminohappoon, esim. arginiiniin, nukleotidiprekursoriin, esim. urasiilin ja vastaaviin.
Rakenteellinen geeni, joka omaa selektiomarkkerin, voi olla lähtöisin Penlclllium-isännän villityypistä tai heterologi-nen rakenteellinen geeni, joka on toimiva isännässä. Esimerkiksi metabolisessa reitissä olevaa entsyymiä koodaava rakenteellinen geeni voidaa eristää Penicllliumista tai muusta rihmamaisesta sienestä, esim. Asperqilluksesta, Neurosporas-ta, Podosporasta, tai hiivasta, jolloin rakenteellinen geeni on toimiva Penlcilljumissa ja täydentää aukstrotrofiaa pro-totrofiäksi.
Täydentävä rakennegeeni voidaan saada metabolisen reitin geenistä, kuten puriinien tai pyrimidiinien (nukleosidien) 104264 tai aminohappojen synteesireitiltä. Erityisen mielenkiinnon kohteena ovat sellaiset rakenteelliset geenit, jotka koodaa-vat pyrimidiinireitin entsyymejä, esim. geeni, joka koodaa orotidiini-5'-fosfaattidekarboksylaasi (pyrG tai pyr4) -entsyymiä. Muita mielenkiintoisia geenejä ovat aminohappojen biosynteettiset geenit, esim. ornitiinikarbamoyylitrans-feraasi (argB) ja argininosukkinaattilyaasi (arq4). Yllä mainittujen selektiomarkkereiden käyttö on esitetty EP-pa-tenttihakemuksessa A-260762.
Auksotrofiamarkkereiden sijasta voidaan käyttää fermentoin-timarkkereita, kuten kykyä käyttää amideja ainoana hiilen tai typen lähteenä, kasvua erilaisilla sokereilla, esim. ga-laktoosilla tai vastaavilla.
Edelleen geenejä, jotka koodaavat biosidiresistenssiä, voidaan käyttää hyväksi, kuten hygromysiini-, gentamisidiini-, fleomysiini-, glyfosaatti-, bialafossiresistenssiä ja vastaavia.
Esitetään rakenteita, joissa on haluttu sekvenssi, ja ne voivat sisältää myös muita toimintoja, kuten replikaatio-järjestelmiä yhdessä tai useammassa isännässä, esim. kloo-nausisännissä ja/tai sekundääristen metaboliittien ekspression kohde isännissä; yhden tai useamman selektiomarkkerin yhdessä tai useammassa isännässä, kuten aikaisemmin on mainittu; geenejä, jotka lisäävät transformaatiotehokkuutta; tai muu erikoistunut toiminta.
Rakenne voi sisältää vähintään yhden geenin, mieluimmin kaksi tai useampia geenejä. Rakenne voidaan valmistaa tavanomaisin menetelmin eristämällä muut tarvittavat geenit tarkoituksenmukaisesta isännästä, syntetisoimalla kaikki tai osa geeneistä tai niiden yhdistelmä siitä. Vastaavasti säätelevät alueet, transkriptionaaliset ja translationaali-set aloitus- ja lopetusalueet, voidaan eristää luonnollises 104264 15 ta lähteestä, syntetisoida, tai käyttää niiden yhdistelmää. Erilaisia fragementteja voidaan hajottaa endonukleaasikäsit-telyllä (restriktiolla), liittämällä, sekvenoimalla, in vltro-mutaatjolla, alukkeen korjaamisella tai vastaavalla. Erilaiset käsittelymenetelmät ovat yleisesti tunnettuja alan kirjallisuudessa ja niitä voidaan käyttää halutun tarkoituksen saavuttamiseksi.
Erilaisia fragmentteja voidaan yhdistää, kloonata ja sekve-noida konventionaalisten menetelmien mukaisesti. Jokaisen toimenpiteen jälkeen DNA-fragmentti tai fragmenttien yhdistelmä voidaan liittää kloonausvektoriin, vektori transformoida kloonausisäntään, esim. E. coliin, kasvattaa isäntä-soluja, hajottaa ne, eristää plasmidi ja analysoida fragmentti restriktioanalyysillä, sekvenoimalla, niiden yhdistelmällä, tai vastaavalla. E. colla voidaan käyttää myös mielenkiinnon kohteena olevien geenien ilmentymisisäntänä suurten proteiinimäärien tuottamiseksi.
Erilaisia vektoreita voidaan käyttää rakenteen kehittämiseen ja isäntäsolun transformaatioon. Nämä vektorit voivat olla kloonausvektoreita, ekspressiovektoreita ja vektoreita, jotka soveltuvat integroitumaan isäntäsoluun tai pelkän DNA:n käyttöön transformaatiossa ja integraatiossa.
Kloonausvektori karakterisoidaan, suurimmalta osaltaan, kloonausvektorin sisältävän isännän selektiomarkkerilla ja vaihtoehtoisesti transformaatiota stimuloivalla sekvenssillä, jossa voi olla yksi tai useampia polylinkkereitä, tai lisäsekvenssejä insertiota, selektiota, käsittelyä, sekve-·. noinnin helpottamista, ekskisiota (excision) tai vastaavaa varten.
Ekspressiovektorit sisältävät insertiota varten rakenteen, joka sisältää transkription ja translation aloitusalueen ja lopetusalueet; vaihtoehtoisesti rakenteelta voi puuttua toi 104264 nen tai molemmat säätelyalueet, jotka voidaan lisätä eks-pressiovektorin kanssa sen sekvenssin insertion yhteydessä, joka sekvenssi koodaa proteiinin tuottoa.
Mielenkiinnon kohteena olevaa entsyymiä (entsyymejä) koodaa-va DNA voidaan siirtää Penlcilllumiin vastaavin menetelmin kuin on kuvattu patenttihakemuksessa EP-A-260762.
Penicllliumln tehokkaalla transformoinnilla tuotetaan trans-formantteja, joilla on yksi tai useampia ilmentymiseen kykeneviä rankenteellisia geenejä erityisesti silloin kun ne ovat integroituneet isäntäsolun genomiin (integrantit). DNA-rakenteet valmistetaan siten, että on mahdollista selektoida transformoituneet isäntäsolut. Olosuhteet transformaatiota varten valitaan sellaisiksi, että ne mahdollistavat korkean transformaatiofrekvenssin, mahdollistavat selektion ja mahdollistavat mielenkiinnon kohteena olevia, eskpressoituvia rakenteellisia geenejä (geenin) sisältävien tranformoitunei-den isäntäsolujen eristämisen. Saadut transformantit kykenevät jatkuvaan kasvuun ja ilmentämään integroitunutta DNA:ta. On selvää, että keksinnön mukaisesti tranformoitua isäntäso-lua voidaan käyttää lähtökantana muunlaisissa kannanparan-nusmenetelmissä kuin DNA-välitteisessä transformaatiossa, esim. protoplastien fuusiossa, massapariutuksessa ja mutaatiossa. Saatuja kantoja pidetään keksinnön osana.
Transformaatiolla saadut, mielenkiinnon kohteena olevat geenit voivat muodostaa kiinteän osan transformaatiovektoria, mutta on usein edullista, että näitä geenejä käytetään erillisen vektorin avulla transformaatioseoksessa eli sanottuja geenejä käytetään yhdessä selektiivisen vektorin kanssa yh-teistransformaatiossa, mikä on erittäin tehokas menetelmä rihmamaisten sienten ollessa kyseessä (vertaa P.J. Punt et ai., Gene 56 (1987) s. 117-124; K.Wernars et ai., Mol. Gen. Genet. 209 (1987) s. 71-77; I.E. Mattern et ai., Mol. Gen. Genet. 210 (1987) s. 460-461).
104264
-J
Transformaation tuloksena saadaan vähintään yksi kopio halutusta geenistä (geeneistä), mahdollisesti kaksi tai useampi-a, tavallisesti määrä ei ylitä noin sataa, vielä tavallisemmin määrä ei ylitä noin kymmentä. Määrä riippuu joko integraatiosta tai saavutetusta vakaasta episomaalisesta ylläpidosta, integroituneiden kopioden lukumäärästä, siitä onko kohteena olevia rakenteita monistettu ja vastaavista seikoista .
Yleisesti tunnetaan useita menetelmiä mielenkiinnon kohteena olevien geenien eristämiseksi valikoitujen lajien geenikir-jastoista (vertaa Maniatis et ai., Molecular Cloning, 1982, a Laboratory Manual). Olemme käyttäneet differentiaaliseulon-tamenetelmää penisilliinin biosynteesiin osallistuvien geenien eristämisessä. Tämä tapahtuu siten, että mRNA eristetään sekä laktoosilla kasvavasta (tuottavasta) että glukoosilla kasvavasta (tuottamattomasta) rihmastosta. Syntetisoitiin leimattu cDNA-koetin molemmista mRNA-populaatioista ja tuottavan cDNA-koettimen rikastamisen jälkeen (eliminoimalla kaikki ei-tuottavan mRNA:n kanssa hybridisoituva cDNA) on eristetty genomisia klooneja, jotka hybridisoituvat vain tuottavan cDNA-koettimen kanssa. Yksityiskohdat on esitetty esimerkissä 2. Suuri osa näin eristetyistä klooneista näyttää koodaavan penisilliinin biosynteettistä entsyymiä isope-nisilliini N-syntetaasia (IPNS:ää eli syklaasia).
Edelleen kloonien joukossa on havaittu olevan sellaisia geenien kopioita, jotka koodaavat sivuketjun vaihdosta vastaavaa entsyymiä (asyylitransferaasia). Tämä todettiin kokeissa, joissa käytettiin DNA-koetinta, joka oli valmistettu puhdistetun entsyymin aminoterminaalisen peptidin sekvenssiä vastaavaksi. Näiden kloonien identtisyyttä on arvioitu bio-kemiallisesti ja biologisesti. Asyylitransferaasigeenin nukleotidisekvenssi ja siitä määritelty aminohapposekvenssi on esitetty kuvassa 3. Yllättävää kyllä, geenit jotka koodaavat sekä isopenisilliini N-syntetaasi- että asyylitrans-feraasientsyymejä, esiintyvät samassa DNA-fragmentissa. Tämä 1β 104264 osoitettiin hybridisoimalla P. chrysoqenumin geenikirjastoa EMBL 3-lambda vektorissa erillisillä koettimilla, jotka olivat spesifisiä näille geeneille. Identtiset kloonit hybridi-soituvat erikseen molemmilla koettimilla.
Edelleen, kun yhden genomisen lambda-kloonin rakennekartta oli tehty ja lambda-kloonin restriktiodigestejä oli hybri-disoitu molempien geenien erillisillä koettimilla, saatiin genominen järjestys selville sellaisena kuin se on esitetty kuvassa 2 (kloonit B21 ja G2). Molempien geenien esiintyminen samassa suuressa DNA-fragmentissa mahdollistaa sellaisten P. chrysoqenum-kantojen valmistamisen, joissa kannoissa on suuremmat määrät sekä isopenisilliini N-syntetaasin että asyylitransferaasin geenejä, ilman että häiritään vastaavaa järjestystä tai molempien geenien tasapainotettua ilmentymistä. Edelleen useiden kopioiden tuottaminen suuresta DNA-fragmentista mahdollistaa DNA-fragmentin molempien geenien ilmentymisen niiden luonnollisessa ympäristössä yhdessä ylä-·: ja alapuolella olevien sekvenssien kanssa samoin kuin nor maalitilanteessa.
Sekä tasapainoinen ekspressio että luonnollisen ympäristön ylläpito on osoittautunut olevan edullista geeniekspression tehokkuudelle ja siten penisilliinin tuotolle, josta on esimerkkinä penisilliinin lisääntynyt tuotto (jopa 40 %) transformanteilla, joissa on DNA-rakenne, joka sisältää sekä AT- että IPNS-geenit, josta rakenteesta käytetään vastedes nimitystä [IPNS ja AT]-geenirykelmä. Täten AT:ä ja IPNS:ää koodaavien geenien rykelmöintiä on käytetty menestyksellisesti hyväksi Penicilliumin kannan parantamisessa. Käyttä-' mällä DNA-rakennetta, joka sisältää ainoastaan IPNS-geenin, ei johtanut penisilliinin lisääntyneeseen tuottoon (Skatrud et ai. kuten edellä).
Edelleen keksintö on osoittautunut erittäin hyödylliseksi sovellettaessa [IPNS ja AT]-geenirykelmän eristämistä 19 104264 eristettäessä muita, β-laktaamiantibioottien biosynteesiin osallistuvia geenejä (geeniä), "chromosome walking"-menetelmällä (s.o. menetelmällä, jossa ensin aloitetaan rekombi-nanttikloonista ja jatketaan aloituskloonin viereisellä kloonilla, jonka kloonin genomissa on aloituskloonin geno-miin verrattuna päällekkäistä tietoa). Tämä on esitetty esimerkillä eristämällä kosmidiklooni, joka on homologinen IPNS-geenin kanssa, ja täydentämällä käyttämällä tuottamattoman mutantin sanottua kosmidikloonia, jonka mutantin tiedetään sisältävän [IPNS ja AT]-geenirykelmän koodaamaa entsyymiaktiivisuutta. Täten IPNS- ja AT-geenien rykelmöin-tiä on sovellettu onnistuneesti eristettäessä toinen penisilliinin biosynteesiin osallistuva geeni, s.o. ACVS-geeni. Sanottu ACVS-geeni (geenit) on myös rykelmöity [IPNS ja AT)-geenirykelmään ja se on osa HM193 kosmidia. Keksinnön tarkaksi määrittelemiseksi on kuvassa 8 esitetty sanotun kosmi-din fyysinen kartta. Edelleen kosmidiklooni on talletettu CBS:ään numerolla 179.89. On huomattava, että kuvassa 8 on esitetty restriktioentsyymien oletetut leikkauskohdat, jotka on laskettu kokomäärityksillä agaroosigeelielektrofo-reesin avulla, jolloin kaikki mahdolliset restriktioleik-kauskohdat kyseisestä DNA-molekyylistä eivät välttämättä tule esille. Toisen geenin, esim. säätelevää proteiinia koodaa-van geenin, olemassaoloa ei vielä voida sulkea pois. Penisilliinin biosynteettisellä reitiltä ACVSrää koodaava, eristetty geeni on kloonattu ja voidaan siirtää mihin tahansa mikro-organismiin, kuten hiivaan.
Tässä hakemuksessa on edelleen esitetty esimerkki Penicil-lium chrysoqenumin transformoinnista geeneillä, jotka erityisesti ilmentyvät olosuhteissa, joissa antibiootti syntetisoituu, ja jotka koodaavatt geenituotteita, jotka katalysoivat sellaisia biosynteettisiä reaktioita, jotka johtavat sanottuihin antibiootteihin.
Yksi sellainen entsyymi, asyylitransferääsi (vastedes AT) katalysoi viimeistä vaihetta penisilliinin biosynteesissä, 104264 20 s.o. isopenisilliini N:n aminoadipyyliosan vaihtoa hydrofobiseen asyylisivuketjun esiasteeseen, esim. fenyylietikka tai fenoksietikkahapoksi, mikä johtaa penisilliini G:hen tai vastaavasti V:hen.
Esitetään P. chrysoqenumin asyylitransferaasigeeni, mukaanlukien nukleiinihapposekvenssi, konservatiiviset mutaatiot, jossa sekvenssi koodaa samaa aminohapposekvenssiä, mutta se voi omata jopa 30 % eri emäksiä, useimmin ei kuitenkaan enempää kuin 10 % eri emäksiä, tai mutaatiot, jotka ovat ei-konservatiivisia, joissa vähemmän kuin 10 %, useimmin vähemmän kuin 5 % ja mieluiten noin 1 % siirretyistä aminohapoista on vaihdettu tai poistettu, ja joissa prosenttiosuus lasketaan luonnollisesti esiintyvien aminohappojen määrästä. Lisäksi voidaan käyttää fragmentteja molemmista entsyymiä koodaavista nukleiinihapoista, tavallisesti vähintään noin yhdeksää kodonia, useimmin vähintään noin viittätoista kodo-nia, kuin myös niiden ekspressiotuotteita, kuten koettimia vasta-aineiden tuottoon tai vastaavaan. Koettimia voidaan käyttää tunnistamaan entsyymi toisessa lajissa nukleiinihap-pohybridisaation avulla tai vasta-aineita tunnistamaan ris-tiinreagoivia proteiineja.
Toinen entsyymi, ACVS, katalysoi ensimmäistä vaihetta β-laktaamiantibioottien, penisilliinin, kefalosporiinin ja kefamysiinin biosynteesissä, s.o. kolmen aminohapon, L-a-aminoadipiinihapon, L-kysteiinin ja L-valiinin, kondensoitumista tripeptidiksi, s.o. 6-(L-a-aminoadipyyli)-L-kysteinyy-li-D-valiiniksi. ACVS-geeniä käytetään kosmidin HM193 muodossa. Osia tästä kosmidista, tai ehjää kosmidia, voidaan käyttää hybridisaationkoettimena tunnistettaessa toisista lajeista sellaisia DNA-fragmentteja, jotka myös koodaavat ACVS-entsyymiä. Kloonia voidaan myös käyttää "hybridin esto"-in vitro-translaatiokokeissa, jolloin ensivaiheessa eristetään mRNA-populaatio, joka omaa riittävästi homologiaa klooniin hybridisoidakseen sitä. Seuraava vaihe on sanotun 21 104264 mRNA-populaation eristäminen ja sitä seuraava translaatio tuottavaksi proteiiniksi käyttäen yleisesti tunnettuja in vitro-transkriptiomenetelmlä. Näin eristettyä proteiinia voidaan käyttää esim. aktiivisuustesteissä tai vasta-aineiden tuotossa.
AT-, ACVS-, Y- ja muiden penisilliinin biosynteettisten geenien eristäminen mahdollistaa yksittäisten geenien säätelevien osien tunnistamisen, kuten promoottorin tunnistamisen, yläpuolisen aktivoivan sekvenssin (UAS) tunnistamisen, ter-minaattorin ja vastaavien tunnistamisen. Tämä tapahtuu vertaamalla geenien sekvenssejä keskenään ja isopenisilliini N-syntetaasin biosynteettisen geenin sekvenssiin ja muiden vastaavien geenien sekvenssiin. Jälkimmäinen vertailu ilmaisee penisilliinin biosynteettisten geenien ryhmän geenieks-pression säätelyn tarkan luonteen.
Tällaisen penisilliinin biosynteesin säätelyelementin tunnistaminen johtaa säätelevien proteiinien tarkkaan tunnista-*: miseen väki©työmenetelmien avulla, tällaisia menetelmiä ovat geelisuodatus, ristikytkentä (cross-linking), DNA-sormen-jälkitunnistus ja vastaavat. Spesifisen säätelyproteiinin eristäminen affiniteettikromatografiällä johtaa sanot-tua proteiinia koodavan geenin kloonaukseen ja sitä seuraavaan manipulointiin sopivassa isäntäsolussa.
Kloonattujen AT-, ACVS-, Y- ja muiden penisilliinin biosynteettisten geenien käyttö mahdollistaa modifioitujen entsyymien suunnittelun ja syntetisoinnin. Nämä muunnokset johtavat modifioitujen entsyymien ominaisuuksien muuttumiseen, kuten muutoksiin pH- ja lämpötilaoptimeissa, muutoksiin stabiili-·. suudessa tai muutoksiin substraattispesifisyydessä. Isäntä- solut, jotka on transformoitu näitä modifioituja entsyymejä koodaavilla geeneillä, voidaan ohjelmoida antibioottisyntee-siin erilaisissa olosuhteissa tai syntetisoimaan vaihtoehtoisia antibiootteja, esim. ampisilliiniä penisilliinin sijasta.
22 1 0 4 2 6 4
Keksinnön toisessa suoritusmudoossa kloonattuja geenejä voidaan käyttää sellaisten isäntäsolujen transformoimiseen, joissa isäntäsoluissa ei näitä entsyymejä alunperin ole. On tunnettua, että Streptomyces ja Acremonium eivät sisällä AT-entsyymiä, kun toisaalta Penicilllumlsta puuttuvat kefalos-poriinin ja kefamysiinin biosynteettiset entsyymit. Sellaisten geenien lisääminen isäntäsoluun johtaa kefalosporiinin tai kefamysiinin biosynteesiin Penicilljumilla tai hydrofobisen sivuketjun omaavien penisilliinin tai kefalosporiinien biosynteesiin Acremoniumilla. Tämä esitetään esimerkillä Pe-nicillium chrysoqenumin [IPNS ja AT]-geenirykelmän ekspres-siolla Acremonium chrysoqenumissa.
Seuraavien tulosten perusteella on selvää, että sekundääristen metaboliittien tuottoa voidaan suuresti muuttaa käyttämällä seulontamenetelmiä, jotka mahdollistavat sekundääristen metaboliittien tuottoon osallistuvien DNA-sekvenssien tunnistamisen. Käyttämällä vähennys menetelmiä (subtraction) tunnistettaessa spesifisiä, sekundääristen metaboliittien tuottoon osallistuvia sekvenssejä, voidaan mRNA ja cDNA eristää ja tunnistaa käytettäväksi koettimina. Täten osien, jotka sisältävät kryptisiä geenejä, ja joiden toimintaa ei vielä tunneta, on todettu muuttavan suuresti sekundääristen metaboliittien tuottoa ja niitä voidaan siirtää isäntäsoluun sekundääristen metaboliittien tuottoa varten. Tämä toimenpide on esitetty penisilliini esimerkkinä.
Edelleen asyylitransferaasigeeniä käytetään monin eri tavoin, entsyyminä β-laktaamiyhdisteiden modifioimiseen, leimana, asyylitransferaasin vasta-aineiden tuottoon käytettä-vänä antigeenin lähteenä, promoottorisekvenssin lähteenä, lähteenä ekspressoitaessa suuria määriä proteiinia kiteyttämistä varten, templaattina iji vitro-mutageneesiin modifioituja ominaisuuksia omaavien entsyymien tuottamiseksi ja vastaaviin. AT-geenin siirtäminen [IPNS ja AT]-geenirykelmään johtaa huomattavaan penisilliinin tuoton lisääntymiseen 23 104264 transformoiduissa soluissa. Rykelmöityä genotyyppiä on edelleen käytetty eristettäessä muita penisilliinin biosynteesiin osallistuvia muita geenejä (geeniä), se on ACVSrää koo-daava geeni. Geenirykelmän siirtäminen Acremonium chrysoge-numiin johtaa tämän geenirykelmän aktivoitumiseen ja penisilliinin tuottoon Acremonium chrysogenumlssa.
Edelleen on esitetty kosmidiklooni, joka sisältää ACVS:ää koodaavan geenin. Tällä geenillä kuten AT:täkin koodaavalla geenillä on käyttöä aiemmin mainituissa sovellutuksissa. On mahdollista, että muita (sääteleviä) geenejä on kosmidissa HM193.
Kaikkia julkaisuja ja patenttihakemuksia, joihin on viitattu tässä hakemuksessa, on viitattu siten kuin jokainen yksittäinen julkaisu tai patenttihakemus olisi erityisesti ja yksittäisesti tarkoitettu esiteltäväksi viitteenä.
·; Vaikka tätä keksintöä on kuvattu joissain yksityiskohdissa kuvin ja esimerkein, joilla on tarkoituksena helpottaa keksinnön ymmärrettävyyttä, on selvää, että tässä keksinnössä käytettyjen, yleisesti alalla tunnettujen menetelmien suhteen voidaan tehdä tiettyjä muutoksia ja modifikaatioita, jotka eivät muuta esitettyjen patenttivaatimusten henkeä tai piiriä.
Seuraavat esimerkit on esitetty kuvaavina eikä millään tavoin rajoittavina.
Esimerkki 1
Penicillium chrysoqenumln genomisen kirjaston valmistaminen
Penicillium chrysogenumin (ATCC 28089) genominen kirjasto valmistettiin alalla yleisesti tunnetuilla menetelmillä (T. Maniatis et ai., (1982), Molecular cloning, A Laboratory Ma- 104264 24 nual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.). Kromosomaalinen DNA uutettiin Penicillium chrysogenumista muuttamalla mysee-li protoplasteiksi kuten EP-patenttihakemuksessa 260762 on esitetty.
Protoplastit hajotettiin laimentamalla isotoninen (0,7 M KCl) suspensio nelinkertaisella tilavuudella TES-puskuria (0,05 M Tris-HCl pH 8,0, 0,1 M EDTA, 0,15 M NaCl). Näin saatu seos tehtiin l%:iseksi natriumlauryylisulfaatilla ja seosta inkuboitiin 55 °C:ssa 30 min. ajan. Yhden fenoli- ja kahden kloroformiuuton jälkeen DNA liuotettiin TE-puskuriin (lOmM Tris, ImM EDTA pH 8,0). DNA-liuosta käsiteltiin sitten RNaasilla (100 yg/ml) 37 eC:ssa 1 h ajan ja tämän jälkeen proteinaasi K:lla (200 pg/ml) 42 eC:ssa 1 h ajan. Seos uutettiin kertaalleen fenolilla ja kahdesti kloroformilla. Vastaava tilavuus isopropanolia kerrostettiin vesifaasin päälle ja DNA koottiin lasisauvaan sekoittaen välikerroksesta. Kuivauksen jälkeen DNA liuotettiin TE-puskuriin. Näin saadun DNA-preparaatin molekyylipaino oli noin 108. DNA hajotettiin osittain Sau3A:lla, liitettiin fosforittomaan EMBL 3-käsivarteen, leikattiin BamHI:llä (Promega Biotec, Madison WI, USA) ja pakattiin bakteriofagi lambda-kapsideihin käyttäen Promega Biotecin Packagene-systeemiä. Kaikki reaktiot suoritettiin valmistajan antamien työohjeiden mukaisesti lukuunottamatta pakkausreaktiota, joka suoritettiin 22 eC:ssa 2-3 h ajan. Kirjastot monistettiin maljaamalla pakatut fa-git, inkuboimalla 7-8 h ajan 37 °C:ssa ja uuttamalla fagit 4 ml :11a SM-puskuria (0,1 M NaCl, 0,01 M MgS04, 0,05 M Tris HCl pH 7,5, 0,01% gelatiini) yhtä petrimaljaa kohti.
104264
Esimerkki 2
Penisilliinin biosynteesin aikana ekspressoituvien geenien eristäminen erottavalla seulontamenetelmällä
Geenit, jotka erityisesti tai ensisijaisesti ekspressoituvat penisilliinin biosynteesin aikana, tunnistettiin koettamalla esimerkistä 1 saatua genomista kirjastoa leimatulla cDNA koettimilla, jotka oli saatu tuottavasta (laktoosilla kasvavasta) ja tuottamattomasta (glukoosilla kasvavasta) isäntäsoluista uutetuista mRNA-templaateista, ja valikoimalla kloonit, jotka antoivat positiivisen signaalin ensimmäisellä (+)-koettimella.
mRNAtt eristettiin kasvustoista, jotka olivat kasvaneet 3 tai 6 vuorokautta tuottavalla alustalla (vertaa esimerkki 3) (+ valmiste) tai samalla alustalla, jossa laktoosi oli korvattu glukoosilla (- valmiste). Myseeli koottiin suodattamalla, jäädytettiin nestetypellä, homogenisoitiin ja mRNA · eristettiin käyttämällä T. Maniatiksen kuvaamaa guanidiini- isotiosyanaattimenetelmää (T. Maniatis et ai., kuten edellä).
cDNA syntetisoitiin ja leimattiin korkeaan, spesifiseen aktiivisuuteen [a-32p] dATP:llä käyttämällä molempia mRNA-populaatioita 30 plrssa reaktioseosta, jossa oli: 12,5 mM MgCl2 50 mM Tris-HCl pH 8,3 100 mM KC1
125 mM DTT
2 u/μΐ RNaasi
500 μΜ dGTP
500 μΜ dCTP
500 μΜ dTTP
25 μΜ dATP
26 104264
0,1 pg/ml BSA
100-200 pg/ml poly A+RNA
50-60 yg/ml oligo dT12_ie 12 u/μΐ käänteistranskriptaasi
1,67 pCi/μΙ [α-32Ρ] dATP
jossa polyA+RNA ja oligo-dT sekoitettin erikseen, kuumennettiin 100 eC:seen yhdeksi minuutiksi ja jäähdytettiin jäähau-teessa ennen lisäämistään reaktioseokseen. 1,5 h 42 °C:ssa tapahtuneen inkuboinnin jälkeen lisättiin 5 μΐ ImM dATP:tä ja inkubointia jatkettiin 30 min. ajan. Tämän jälkeen reaktio-seos tehtiin 20 mM:ksi EDTA:n suhteen, 40 mM:ksi NaOH:n suhteen (lopputilavuus 100 μΐ) ja sitten seos kuumennettiin 65 eC:seen. Tunnin inkuboinnin jälkeen lisättiin 5 μΐ 1 M Tris-HCl pH 8,3, 40 μΐ, 0,1 N HCl, 7 μg vasikan tyymuksen DNA:ta, 100 μΐ TES-puskuria (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 1% SDS pH 7,5) ja 200 μΐ 5 M ammoniumasetaattia ja DNA seostettiin 800 μ1:11β etanolia 16 tunnin ajan -20 °C:ssa.
·· Sakka kerättiin sentrifugoimalla, pestiin 70%:isella etano lilla, kuivattiin ja liuotettiin 32,5 μ1:β3η TE-puskuria (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8,0). (+) cDNA-preparaatti rikastettiin sisältämään erityisesti sellaisia sekvenssejä, jotka ekspressoituvat penisilliinin biosynteesin aikana, kahdella tehokkaalla hybridisaatiokierroksella (kaskadilla) (-)mRNA preparaattia vastaan 75 μΐιεββ reaktioseosta, jossa oli
32.5 μΐ (+) cDNA
10 μΐ (-) mRNA (1 μg/μl) 30 μΐ IM NaP04 pH 6,8
1.5 μΐ 10% SDS
1 μΐ 0,5 M EDTA
16 h inkuboinnin jälkeen 68 °C:ssa lisättiin 102 μΐ vettä (lopullinen fosfaattikonsentraatio 170 mM) ja seos ajettiin 170 mM fosfaatilla tasapainotetun hydroksiapatiittipylvään 27 104264 läpi 68 °C:ssa. Näissä olosuhteissa kaksijuosteinen DNA sitoutuu pylvääseen ja yksijuosteinen nukleiinihappo eluoituu pylväästä ulos. Eluaatti kerättiin talteen ja sitä dialysoi-tiin TE-puskuria vastaan 1,5 h ajan ja, kun seokseen oli lisätty 4 pg kantaja-DNA:ta (vasikan tyymuksen DNA), suoritettiin etanolisaostus. Tämä työvaihe toistettiin ja lopullista sitoutumatonta cDNA:ta käytettiin suoraan koettimena seulottaessa Penlcllllum-kannan genomista kirjastoa seuraavasti: Näyte esimerkin 1 monistetusta kirjastosta maljattiin viidelle petrimaljalle, noin 1500 pesäkettä/malja. Pesäkkeet siirrettiin kopiona Gene Screen Plus suodattimille (New England Nuclear) valmistajan ohjeiden mukaan. Ensimmäiset kopiot suodattimista koetettiin leimatulla, rikastetulla (+)cDNA-preparaatilla; toiset kopiot koetettiin leimatulla (-)cDNA:lla kontrolliksi.
Positiiviset pesäkkeet puhdistettiin ja käytettiin seuraa-vaan seulontaan. Näin valittiin 96 pesäkettä, jotka antoivat positiivisen singnaalin (+)cDNA-koettimella.
DNA niistä rekombinanttifageista, jotka antoivat voimakkaan tai kohonneen signaalin alkuseulonnassa, leimattiin 32P:lla ja käytettiin koettimina seulottaessa tuottavasta ja ei-tuottavasta myseelistä eristettyjä Penicllliumln RNA:ta Northern bloteilla, jotta voitaisiin arvioida ekspression tasoa molemmissa olosuhteissa. Näin menetellen rekombinant-tikloonit jaettiin kolmeen ryhmään:
Luokka 1 käsittää penisilliinin biosynteesin aikana voimakkaasti ekspressoituneet geenit, esimerkkeinä kloonit * G2 ja B21 * B9, L5 ja G5 * L12 * K9 104264 28
Luokka 2 kohonnut ekspressio, esimerkkeinä * Cl 2
* P3 ja KU
* B13 * B20
Luokka 3 heikosti ekspressoituneet, esimerkkeinä * G3 * G1 * L10 * K16 * B23
Rekombinanttifagien G2 ja B21 kartat on esitetty kuvassa 2. Kloonit G2 ja B21 antoivat positiivisen hybridisaatiosignaa-lin isopenisilliini N-syntetaasispesifistä koetinta vastaan (S.M. Samson et ai., kuten edellä). Yllättävää kyllä samat kloonit hybridisoituivat myös asyylitransferaasispesifisen koettimen kanssa (katso esimerkki 5).
Esimerkki 3
Asyylitransferaasin puhdistaminen
Penicillium chrysoqenum-kantaa (ATCC 28089) siirrostettiin (2 x 106 konidiaa/ml) kompleksiselle siemenalustalle: maissin jyvän liotuslientä (20 g/1); "distiller solubles" (20 g/1); sakkaroosia (20 g/1); CaC03 (5 g/1) (pH ennen sterilisoimista 5,7). 36 h inkuboinnin jälkeen 25 °C:ssa, sekoituksella (250 kierrosta/min), saatua kasvustoa käytettiin siir-rostamaan kaksikymmentä kertaa suurempi tilavuus kompleksista tuotantoalustaa, jossa oli: maissin liotusveden kiinteää ainesta (35 g/1), laktoosia (25 g/1), kaliumfenyyliasetaat-tia (2,5 g/1); MgS04 x 7H20 (3 g/1); kh2P04 (7 g/1); maissi-öljyä (2,5 g/1); CaC03 (10 g/1). Kun inkubointia oli jatket- 104264 29 tu vielä 48 tuntia, myseeli kerättiin suodattamalla ja kakku pestiin neljästi kylmällä 0,15 M NaClrlla.
200 g (märkäpaino) myseeliä suspendoitiin 700 ml:aan 0,05 M Tris-HCl-puskuria (pH 8), jossa puskurissa oli 5 mM ditio-treitolia (tätä puskuria sanotaan tästälähin TD-puskuriksi), ja hajotettiin Braun tehosekoittimessa (Braun, Melsungen), F.R.G.) yhdessä Ballotini-lasihelmien kanssa (Sigma tyyppi V, halkaisija 450 - 500 pm) 30 sekunnin jaksoissa 15 sekunnin välein samalla jäähdyttäen etanoli/kuivajää-hauteella. Ekstraktia sentrifugoitiin sitten 30 min. 20 000 x g. Tämä ja kaikki seuraavat työvaiheet suoritettiin 4 eC:ssa. 640 ml:aan ekstraktia lisättiin hitaasti 27 ml 10%:ista (w/v) protamiinisulfaattiliuosta 0,05 M Tris-HCl pH 8 puskurissa. 45 minuutin sekoituksen jälkeen nukleiinihapposakka erotettiin sentrifugoimalla 20 000 x g ja supernatantti fraktioitiin ammoniumsulfaattisaostuksella pitäen seoksen pH koko ajan 8,0:na. Saostusfraktio 40 % - 55 % (% kyllästymisestä) liuotettiin TD-puskuriin, joka sisälsi 1 M ammoniumsulfaat-tia, ja siirrettiin fenyylisefaroosi CL-4B pylvääseen (1,8 x 16 cm), joka oli tasapainotettu samalla puskurilla. Pylvästä pestiin TD-puskurilla virtausnopeudella 5 ml/min kunnes sitoutumatonta proteiinia ei enää eluoitunut. Sitten asyyli-transferaasi eluoitiin kolonnista 40%:isella etyleeniglyko-lilla 0,05 M Tris-HCl pH 8,0 puskurissa.
Eluoituneista fraktioista määritettiin asyylitransferaasiak-tiivisuus inkuboimalla 25 eC:ssa reaktioseoksessa, joka sisälsi 0,2 mM fenyyliasetyylikoentsyymi A:ta, 0,2 mM 6-amino-penisillaanihappoa, 5 mM ditiotreitolia, 0,1 M Tris-HCl pH
8,0 puskurissa, ja entsyymiekstraktia siten, että lopputila-vuus oli 200 pl. 10 minuutin inkuboinnin jälkeen reaktio keskeytettiin lisäämällä 200 pl metanolia. Näytteet sentrifugoitiin 5000 x g ja penisilliini G määritettiin superna-tantista tavallisilla mikrobiologisilla tai kromatografisilla menetelmillä.
104264 30
Fenyylisefaroosipylväästä saadut aktiiviset fraktiot yhdistettiin ja siirrettiin DEAE-Sephacel kolonniiin (1,5 x 20 cm) tasapainotettiin TD-puskurilla ja asyylitransferaasiak-tiivisuus eluoitiin lineaarisella (0 - 0,25 M) NaCl-gradientilla TD-puskurissa virtausnopeudella 0,25 ml/min. Yhdistetyt aktiiviset fraktiot seostettiin 70%:isella ammoniumsulfaatilla ja saatu sakka liuotettiin 3 ml:aan TD-puskuria ja tämä seos siirrettiin Sephadex G-25 (coarse) kolonniin (2,6 x 70 cm), joka oli tasapainotettu TD-puskurilla. Asyylitransferääsi eluoitiin TD-puskurilla 9 ml:n virtausnopeudella ja kerättiin eluoituneista loppufraktioista symmetrisenä proteiinipiikkinä, joka vastasi asyylitransfe-raasiaktiivisuutta. Lopullinen puhdistuminen oli 258-kertai-nen.
Esimerkki 4
Asyylltransferaasin aminohappoterminaalisen sekvenssin määrittäminen ja vastaavan oligonukleotidikoetinseoksen valmistaminen.
Esimerkissä 3 kuvatun kaltainen entsyymipreparaatti ajettiin SDS-PAGE geelissä (U.K. Laemmli, Nature, 227 (1970) s. 680 eteenpäin) (13% akryyliamidi, 50 mA). 29 kD:n näytevyöhyke (noin 10 vig proteiinia) leikattiin SDS-geelistä ja proteiini siirrettiin elektroforeettisesti PCGM-2-membraanille (poly-breenillä impregnoitu lasivilla, Janssen, Breese, Belgia), käyttäen Multiphor Nova II blottausyksikköä (LKB; 0,8 mA/cm2; 90 min; elektrodipuskuri 5 mM Na-boraatti pH 8,0). Blottauksen jälkeen PCGM-membraani pestiin neljästi 25 mM NaCl, 10 mM Na-boraatti pH 8,0 ja ilmakuivattiin. Näin saa-* dusta PCGM:ään adsorboituneesta proteiinivyöhykkeestä analy soitiin N-terminaalinen aminohapposekvenssi käyttäen kaasu-faasisekvenaattoria (Applied Biosystems model 470 a). Saatiin seuraava sekvenssi:
Thr-Thr-Ala-Tyr-Cys-Gln-Leu-Pro-Asn-Gly-Ala-Leu-Gln-Gly-Gln- 104264
Asn-Trp-Asp.
Alleviivattua aminohapposekvenssiä vastaavasti syntetisoitiin seuraavat oligodeoksiribonukleotidijoukot: Met-Leu-His-Ile-Leu-X-Gln-Gly-Thr-Pro-Phe-Glu-Ile-Gly-Tyr-Glu-His-Gly-Ser-Ala-Ala-Lys-Ala-Val-Ile-Ala.
10 kD:n vyöhykkeen, joka silloin tällöin esiintyy preparaateissa, aminoterminaalinen sekvenssi määritettiin myös, mutta sitä ei käytetty oligodeoksiribonukleotidikoettimen valmistukseen. Havaittu sekvenssi oli:
Met-Leu-His-Ile-Leu-X-Gln-Gly-Thr-Pro-Phe-Glu-Ile-Gly-Tyr-
Glu-His-Gly-Ser-Ala-Ala-Lys-Ala-Val-Ile-Ala.
Esimerkki 5
Asyylitransferaasiqeenin tunnistaminen
Useiden esimerkin 2 lambda-kloonien DNA:ta hajotettiin rest-riktioendonukleaasi Sällillä, fragmentti eroteltiin 0,7%:i-sessa agaroosigeelissä, siirrettiin Genescreen Plus-membraa-nille ja hybridisoitiin esimerkin 4 [32P]-pääteleimatulla oligonukleotidiseoksella. Positiivisen signaalin antaneet kloonit kartoitettiin restriktioanalyysillä käyttäen standardimenetelmiä. Rekombinanttifageja lambda B21 ja lambda G2, vastaavat fyysiset kartat on esitetty kuvassa 2. EcoRI/Hlndlll alafragmentteja vastaan erityisesti hybridi-soitunut oligodeoksiribonukleotidiseos on esitetty kartassa. Tämä ja viereiset fragmentit kloonattiin uudelleen pTZ 18/19:sta (United States Biochemical Corporation) ja niistä suoritettiin nukleotidisekvenssianalyysi. Määritetty sek-.· venssi ja johdettu aminohapposekvenssi on esitetty kuvassa 3.
Preparaatissa esiintyvän 10 kD:n vyöhykkeen aminoterminaalinen aminohapposekvenssi määritettiin ja todettiin vastaavan yläpuolella olevan 29 kD:n sekvenssiä. Täten AT syntetisoi 104264 32 tuu 40 kD:n proteiinina. Havainto on varmistettu AT:n viestittäjän (messenger) pituudella, jonka on laskettu olevan noin 1500 emäksen pituinen (vastaava kuin isopenisilliini N-syntetaasin mRNA, joka koodaa 38 kD:n proteiinia, mikä tekee mahdolliseksi 5'- ja 3'-päissä 100 emäksen transloitumatto-man alueen.
29 kD:n proteiinin aminohapposekvenssi (joka on pidennetty sekvenssiksi Thr-Thr-Ala-Tyr-Cys-Gln-Leu-Pro-Asp-Gly-Ala-Leu-Gln-Gly-Gln-Asn-Trp-Asp-Phe-Phe-Ser-Ala-Thr-Lys-Glu-Ala) ja 10 kD:n proteiinin on todettu sisältävän kaksi intronia. Kolmannen intronin on oletettu esiityvän 10 kD:n proteiinin (97 aminohappoa) vastaavan (gross) aminohapposekvenssin perusteella ja sen reunojen konsensussekvenssien perusteella (D.J. Ballance, Yeast 2 (1986) s. 229-236). Kolmannen intronin olemassaolo varmistettiin alukkeen pidennyksellä (extension) ja Northern Blot-hybridisaatiolla käyttäen koet-timina koodaavia ja ei-koodaavia alueita.
Esimerkki 6 pPS47:n rakentaminen
Fosfoglyseraattikinaasi (pgk)-geeni eristettiin Penicilliu-mln genomisesta kirjastosta yleisin menetelmin (Maniatis; esimerkki 1) käyttäen vastaavaa hiivan geeniä (Hitzeman et ai., kuten edellä) hybridisaatiokoettimena.
P. chrysogenumin pgk-promoottori kloonattiin 1,5 kb:n Hindi!I-fragmenttina pTZ18R:ään ja valittiin klooni, jolla oli haluttu orientaatio.
Edelleen fleomysiiniresistentti geeni kloonattiin tämän kloonin polylinkkerin BamHI kohtaan 1,0 kb:n BamHI- ja Bglll-fragmenttina, joka oli eristetty pUT702:sta (Cayla,
Toulouse Codex, Ranska), pgk-promoottori liitettiin luku-kehyksessä (frame) fleomysiiniresistenssigeeniin silmukoi- 104264 33 maila pois poistettava sekvenssi käyttämällä seuraavan sekvenssin omaavaa oligonukleotidia: 5'-GGA ACG GCA CTG GTC AAC TTG GCC ATG GTG GGT AGT TAA TGG TAT G-3' Tämä oligonukleotidi omaa Ncol-katkalsukohdan ATG-alueella (alleviivattu).
Esimerkki 7
Korkean transformaatiotehon omaavan transformaatiovektorin valmistaminen (pPS 54).
Jotta voitaisiin saavuttaa P. chrysogenumilla sellainen transformaatiofrekvenssi, joka on riittävän korkea geenien siirtoon transformaatiolla tai kotransformaatiolla -laktaamin biosynteesiin osallistuvien ei-selektiivisten geenien komplementoimiseksi tai monistamiseksi, on välttämätöntä lisätä transformaatiovektoriin transformaatiota tehostava sekvenssi (vertaa ans Asperqilluksessa, D.J. Ballan-ce ja G. Turner, Gene (1985) s. 321-331). Yllättävää kyllä transformaatiota stimuloiva sekvenssi, joka on toimiva P. chrysogenumissa, on mukana DNA-fragmentissa, jossa on P. chrysoqenumin pyrG-qeeni♦ Tämä DNA-fragmentti muodostaa osan 4 kb:n Sau3A:n osafragmentista, joka on kloonattu pUCl3-plasmidin BamHI-lelkkauskohtaan (J. Messing, Meth. En-zymol. 101 (Acad. Press, 1983) s. 20 eteenpäin). Tätä plas-midia kutsutaan tästä lähin pUC13::pyrG:ksl (EP-patentti-hakemus 260762).
2,4 kb:n EcoRI-fragmentti liitettin mukaan plasmidiin (pPS47), joka sisälsi Streptoalloteichus hlndustanuksen fleomysiiniresistenssigeenin, jota kontrolloi P. chrysoqenumin fosfoglyseraattikinaasi (pgk) geenin promoottori. Saatu rakenne on pPS 54.
104264 34 pyrG-fragmentin stimuloiva vaikutus transformaatiotrekvens-siin on esitetty alla taulukossa 1:
Taulukko 1 plasmidi transformantteja/yg DNA:ta pPS 47 (phleoR) 37 pPS 54 (phleoR, pyrG) 186
Esimerkki 8 AT-kloonlen Identtisyyden biologinen 1a biokemiallinen vertailu.
AT-kloonien identtisyyttä verrattiin biologisesti asyyli-transferaasinegatiiviseen P. chrysogenumln mutanttiin (ATCC 28089 , npe 8).
Urasiilia vaativaa ATCC 28089 npe 8-kannan johdannaisen 2 x 107 protoplastia kotransformoitiin seoksen kanssa, jossa oli 5 yg selektiivistä plasmidia pUC 13::pyrG ja 15 g lambda B21-DNA:ta, joka on aiemmin kuvattu EP-patenttihakemuk-sessa 260762.
Saatiin useita satoja transformantteja, joista konidiat koottiin ja maljattiin esimerkin 1 mukaiselle kompleksiselle tuottoalustalle konsentraatiossa 1-10 koloniaa/petrimalja. Kolmen päivän inkubaation jälkeen 25 °C:ssa maljojen päälle valettiin penisilliinisensitiivisen Bacillus subtilis-indikaattorikannan itiösuspensio ja inkuboitiin yli yön 30 eC:ssa estorenkaiden määrittämiseksi bakteerimatossa.
Useimmilla transformanteilla (75 %) oli vain pieni estoren-gas, saman kokoinen kuin penisilliiniä tuottamattomalla kannalla npe 8 pyrG. Lopuilla 25 %:lla oli suuret estorenkaat 104264 35 verrattuna villiin kantaan ATCC 28089. Tästä pääteltiin, että ensimmäinen joukko oli saanut vain selektoivan plasmi-din, pUC 13::pyrG, kun taas jälkimmäinen joukko oli saanut molemmat pUC 13::pyrG:n ja lambda B21:n, joka sisältää penisilliinin tuottokyvyn.
Molempien ryhmien useille tranformanttiklooneille tehtiin AT-aktiivisuuden määritys soluvapaista ekstrakteista seuraavasti: Myseeli koottiin kahden päivän kasvatuksen jälkeen, kuten kuvattiin esimerkissä 3, pestiin, jäädytettiin neste-typessä ja pulverisoitiin. Jokaista määritystä varten 2,5 g rouhittua myseeliä suspendoitiin 50 mMriseen kaliumfosfaat-tipuskuriin (pH 8,0), jossa oli 5 mM ditiotreitolia ja 5mM EDTA:ta (lopputilavuus 12,5 ml), ja sekoitettiin 25 minuutin ajan. Soluvapaa ekstrakti saatiin sentrifugoimalla suspensio (5 min. 1000 x g).
AT-aktiivisuus määritettiin inkuboimalla 2 ml soluvapaata suspensiota yhdessä 0,1 ml:n ditiotreitolia (10 mg/ml), 0,2 ml:n 6-aminopenisillaanihappoa (10 mg/ml) ja 0,2 ml:n fenyy-liasetyylikoentsyymi A:ta (20 mg/ml) kanssa 25 °C:ssa.
15 tai 30 minuutin jälkeen reaktio keskeytettiin lisäämällä vastaava tilavuus metanolia ja näyte sentrifugoitiin (20 min. 5000 x g). Sitten supernatantista määritettiin muodostunut penisilliini G kromatografisesti (HPLC) yleisesti tunnetuilla menetelmillä. Tulokset tyypillisestä kokeesta on esitetty taulukossa 2. Nämä tulokset osoittavat, että AT-aktiivisuus on noussut 2- - 3-kertaisesti transformoiduissa kannoissa (3) ja (4) verrattuna villiin kantaan (5), vastaten kohonnutta geeniannosta.
[IPNS ja AT]-geenirykelmä kloonattin edelleen pPS54:ään, jolloin saatiin pGJOl A ja B (vertaa kuva 6) ja pPS47:ään, jolloin saatiin pGJ02 A ja B (vertaa kuva 7). 5 kb:n Sali-fragmentti käsiteltiin T4 DNA-polymeraasilla ja liitettiin 104264 36 pPS54:n tai PPS47:n Hindlll leikkauskohtaan sen jälkeen kun kyseistä vektoria oli käsitelty T4 DNA-polymeraasilla.
104264 37 >ι I I -ΡΛ 3+) >i X 0JX3 (0 3- P rH rl*H β rl MHO C:i0 <ϋ -H 0):(0.3 +>
flg+) « * + rH H
•H 3 (0 + *
OmOOW rH rH Λ Λ rH
-r| H CO -H
CPiO Ό 0:(0:(0 -H « 6 C M
I σι rH m o i" 0 C · · ...
I I M CO) O H CP Γ' CM
01 rH O, -rH <D
O-M BX
Ό w tji h O -H H o :(0 3 η·η B 0) :(0
CM * G|-P
:(0 ·· C' O :0 (0 O (0 C 0) r- cp co in X X 4-> -H -rl <u · ...
X X-P-H C BX rH rH O Tt
3 -H 3 C -M rH rH rH
rH 0) C-ri -H in:(0: 3 ,* 3 -H 0) *-(-» 03 03 >H JJrH 4-) (/)
Eh (/) a; I w a) 0 (0 4-) -P CP I I + + +4-) tO C 3 WO) 3
M
H (/) 4-> 3 1 Ο Ο -H 3 i i if 3 3 ! 3
Μ · · · · E Q) <U 4H -H0J
O .. .. (0 rH ^ *0 tg -he m3 m r> <-h cm ® ® b -p-h W4-) rHrHCQqcS .* 0 C W aj δ -P <0 >
(0 O U 3 -p -p I -H
M J3 3 Ή 3 3 'd Eh -P
(0 c c a; -h co ® “9 =3 σ\ c oo □ □ d co -h c *0) a) (1) o rH o
(0 cm n5 'öxjeorH-H
4- 1 rH® Φ (D CM Φ 4-) ζ in _ e h ® <0
5 S 8 S H
fcn CO +3 4J 4J Ο Λ +) 0 3 3 3 Eh 3 3
U X! X < (0 E
rH cm r> ·μ· in + + 3β 104264
Esimerkki 9
Lisääntynyt penisilliinin tuotto kryptisellä geenillä Y transformoidussa isäntäkannassa.
Jotta voitaisiin osoittaa penisilliinin tuottoon tunnistettujen geenien teho, niin erään näistä geeneistä annostusta lisättiin Penicillium-isäntäkannassa. Geeni "Y", joka on lambda-klooneissa B9, L5 ja G5, kloonattiin edelleen 3,0 kb:n BamHI ja Sphl fragmenttina pPS47:ään. Saatu rakenne, pRHO5, transformoitiin P. chrysogenumlin Wis 54-1255 (ATCC 28089) ja eristettiin fleomysiiniresistentit kannat. Useista klooneista testattiin penisilliinin tuotto ravistelupullois-sa.
Tulokset erään eristetyn transformantin testeistä on esitetty taulukossa 3.
Taulukko 3 kanta penisilliinin suhteellinen tuotto ATCC 28089 100 ATCC 28089; :pRH05_122_
Geeni "Y":n lisääntynyt annos transformantissa verrattuna transformoimattomaan isäntään varmistettiin Southern blot-analyysillä. Geeni "Y":n, kryptinen geeni, joka on eristetty keksinnön mukaisesti, lisääntynyt annos johtaa penisilliinin lisääntyneeseen tuottoon.
Geeni "Y":n transkriptiokoko on määritetty Northern blot-hybridisaatiolla; transkriptioalue on noin 1 kb:n pituinen.
39 104264
Esimerkki 10 pGJ02A:lla transformoidun isäntäsolun lisääntynyt penisilliinin tuotto.
[IPNS ja AT]-geenirykelmän vaikutuksen tehoa penisilliinin tuottoon verrattuna IPNS-geenin vaikutuksen tehoa yksinään tutkittiin transformoimalla 2 x 107 ATCC 28089 (=Wis54-1255) kannan protoplastia pGJ02A:lla (kuva 6) käyttäen EP-patent-tihakemuksessa A-260762 kuvattua menetelmää. Transformantit valikoitiin käyttäen fleomysiinikonsentraatiota 30 g/ml. Arviolta sata transformanttia ja vastaava määrä kontrolli-transformantteja (transformoitu vain pPS47:n vektorilla) analysoitiin tuoton määrittämiseksi käyttäen biomääritystä, joka on kuvattu esimerkissä 7. 26 transformanttia, jotka tuottivat estorenkaan, joka oli halkaisijaltaan huomattavasti suurempi kuin kontrollitransformanttien tuottama estoren-gas, analysoitiin ravistelupulloissa erikseen tuoton suhteen. Näiden transformanttien penisilliinin tuottoa verrattiin kahdeksan kontrollitransformantin tuottokyvyn keskiarvoon: 26 transformantin penisilliinin tuottokyvyn keskiarvo oli 18 % suurempi kuin kontrollitransformanttien, edelleen havaittiin kahden valitun transformantin tuottavan noin 40 % enemmän verrattuna kontrollitransformanttien tuoton keskiarvoon. Tämä on esitetty kuvassa 9 graafisesti. Näin [IPNS ja AT]-geenirykelmää on onnistuneesti käytetty parantamaan P. chrysoqenum-kantaa.
Esimerkki 11 ·· Penlcillium chrysoqenumin kosmidiklrjaston valmistaminen.
Eristettiin P. chrysoqenumin kromosomaalista DNA:ta ja käsiteltiin sitä kuten on kuvattu esimerkissä 1. Osittaisen DNA:n osittaisen hajottamisen jälkeen eristettiin 20-35 kb:n suuruiset osat ja liitettiin BamHI-hajotettuun kosmidivekto- 104264 40 riin pPS07 (katso EP-patenttihakemus 0260762; vertaa kuva 4) käyttäen yleisesti tunnettuja menetelmiä (esim. Maniatis et ai., kuten edellä). Yhdisteseos (ligaatioseos) pakattiin in vitro ja fagilysaatti siirrettiin E. coliin (HB101, ATCC 33694) käyttäen yleisesti tunnettuja menetelmiä. Tuoreita siirroskasvustoja kasvatettiin 10 mlrssa L-broth-alustaa (10 g NaCl:ia, 10 g Bacto-tryptonia ja 5 g Bacto-Yeast ekstrak-tia per litra) käyttäen ampisilliiniselektiota. Kosmidi-DNA eristettiin ja insertti-DNA:n olemassaolo varmistettiin Eco-RI hajotuksella. Siirrokset, jotka sisälsivät kosmidin, säilytettiin mikrotiitterilevyillä -20 °C:ssa.
Esimerkki 12 IPNS-geenin sisältämän kosmidl-HMl93:n eristäminen.
IPNS-geenin ja suuria määriä reuna-alueita sisältävien kos-midikloonien eristämiseksi esimerkin 11 kosmidikirjasto seulottiin IPNS-geenejä sisältävien kloonien löytämiseksi. Käytettiin kosmidikirjastoa, päinvastoin kuin esimerkissä 1, jossa käytettiin lambdafagikirjastoa, koska tiedetään yleisesti, että kosmidivektorit sisältävät suurempia inserttejä (20-40 kb) kuin lambdavektorit (9-23 kb). Koettimina käytettiin kahta oligonukleotidiä, jotka perustuivat P. chrysoge-numin IPNS-geenin N-terminaaliseen aminohapposekvenssiin: 5'-TTG GGC GAT AAC ATG GAG-3' ja 5'-TTC GGC GAT AAT ATG GAG-3'. Koettimet leimattiin yleisesti tunnetuilla menetelmillä (Maniatis et ai., kuten edellä).
Koettimiin hybridisoituvat kosmidit eristettiin, ja IPNS-geenin olemassaolo todettiin edelleen kloonauksella, sekvenssianalyysillä ja vertaamalla tietoja L. Carr et ai. (kuten edellä) esittämään sekvenssiin. Alustava kosmidi HM193:n kartta on esitetty kuvassa 8. Kosmidiklooni sisältää noin 23 kb:n DNA:n IPNS-geenin ylävirrassa; klooni on vain osittain samankaltainen lambdakloonien B21 ja G2 kanssa (vertaa kuva 2).
Esimerkki 13 104264 41
Tuottamattomien mutanttlen täydentäminen käyttäen kosmidia HM193
Muiden kuin tunnetun IPNS-geenin olomassaolon tutkimiseksi HM193-kosmidissa (CBS 179.89) em. kosmidi kotransformoitiin pGJ02A:lla toiseen npe-kantaan. Kannan npe 5 (CBS 178.89) on todettu omaavan sekä IPNS- että AT-aktiivisuutta ja siltä on todettu puuttuvan ACVS-aktiivisuuden. Jotta voitaisiin sulkea pois IPNS-geenin siirron aiheuttama pelkkä täydennysvai-kutus, niin myös vain pGJ02A:n omaavat transformantit tutkittiin. Transformaatio suoritettiin kuten on aiemmin kuvattu ja (ko)transformantit tutkittiin käyttäen biomääritystä, joka kuvattiin aiemmin. Tulokset on esitetty taulukossa 4.
Taulukko 4 kanta testattujen estorenkaal- % (ko)transfor- listen (ko)- manttien transformant- lukumäärä tien lkm npe5 31 01 0 npe5::pGJ02A 72 11 1,3 npe5::pGJ02A+HM193 19 5 26
Kanta npe5:llä on palautumisfrekvenssi noin 1,5 % I Taulukosta 4 voidaan todeta kosmidi HM193:n kykenevän täy dentämään kannan npe5 mutaatiota, kun taas plasmidi pGJ02A ei sitä tee. Näin on todettu toisen penisilliinin biosynteesiin osallistuvan geenin alkavan IPNS-geenistä. Tämä geeni on mukana samassa [IPNS ja AT]-geenirykelmän omaavassa kos-midissa ja se on vähemmän kuin 23 kb:n etäisyydellä [IPNS ja AT]-geenirykelmästä.
Esimerkki 14 42 1 0 4 2 6 4
Biokemialliset ja biologiset todisteet ACVS-qeenin olemassaolosta HM193-kosmldissa.
Jonkin HM193-kosmidissa sijaitsevan geenin ACVS:n koodauksen tutkimiseksi ACVS-aktiivisuus mitattiin kannasta npe 5, tämän kannan pGJ02A-transformanteista ja npe 5:n pGJ02A ja HM193-kosmidin kotransformanteista.
Kantoja kasvatettiin 48 tunnin ajan tuottoalustalla, joka sisälsi laktoosia ja 0,75 % fenoksietikkahappoa. Valmistettiin soluvapaat uutteet ja ACVS-aktiivisuus mitattiin Van Liemptin kuvaamalla tavalla (H. van Liempt et ai., J. Biol. Chem. 264 (1989), s. 3680-3684). Uutto puskurilla A suoritettiin 30 min. ajan. Määrityksessä käytetyn leimatun valii-nin määrä oli 12,5 pCi ja reaktio keskeytettiin 30 min. ajan jälkeen. Reaktioseos seostettiin kuten oli kuvattu ja siirrettiin sen jälkeen Porapak Q-kolonneihin. Kolonneja pestiin 2 ml:11a tasapainotuspuskuria ja eluoitiin 2x1 ml:11a me-tanolia. ACV:n määrä mitattiin HPLC:llä. 100 μ1:η näytteet injektoitiin RP18-kolonniin ja eluoitiin 10%:isella metano-lilla 50 mM KH2P04:ssä, pH 6,00 seoksen sisältäessä 0,1 mM DTT:ä huoneenlämpötilassa. Virtausnopeus oli 1,0 ml/min ja ilmaisimena käytettiin Berthold LB503 tuikeilmaisinta 200 μΐ kyvetillä. Leiman omaava piikki, jolla oli sama retentioaika kuin pelkistyneellä tripeptidillä, kerättiin ja leiman määrä mitattiin käyttäen tuikelaskinta (Packard).
Tulokset on esitetty taulukossa 5. ACVS-aktiivisuutta ei ; voitu osoittaa npe 5:stä valmistetuista soluvapaista uut teista, mutta sitä vastoin soluvapaat uutteet, jotka oli valmistettu pGJ02A:lla [IPNS ja AT] tranformanteista, Wis 54-1255:stä valmistettu soluvapaa uute ja pGJ02A:n ja HM193:n kotransformantin soluvapaa uute sisälsivät ACVS-aktiivisuutta. Täten ACVS-aktiivisuus on "varastoitu" npe 5- 104264 43 kantaan HM193 kosmidin siirtämisellä. Soluvapaiden uutteiden analysointi SDS-PAGE:lla osittaa, että jälkimmäinen kanta sisältää 250 kD:n vyöhykkeen, jota ei edellisessä kannassa ole. A. nldulansln ACVS-entsyymin molekyylipaino on suunnilleen tämän kokoinen (Van Liempt, kuten edellä) ja olemme päätelleet penlc111lumin entsyymin olevan saman kokoinen. Näin voidaan olettaa HM193-kosmidin sisältävän ACVS-geenin.
Taulukko 5 dpm x 103 250 kDa:n kanta + ATP -ATP polypeptidi
Wis 54-1255 490,8 nd + npe5 3,3 nd npe5:pGJ02A 2,5 nd npe5:pGJ02A + HM193 261,3 1,1 + nd = ei määritetty
Esimerkki 15
Acremonium chrysogenumln transformointi 50 ml:aan MMC-alustaa (31,6 g sakkaroosia, 2,2 g glukoosia, 3 g CaC03; q^5 g corn steep solids; 7,5 g L-aspargiinia; 0,22 g ammoniumasetaattia; 15 g KH2P04; 21 g K2P04; 0,75 g Na2S04; 0,18 g MgS04.7H20; 0,06 g CaCl2; 1 ml suolaliuosta (13 g Fe(NH4)2(S04).6H20; 3 g MnS04.4H20; 3 g ZnS04.7H20; 0,8 g CuS04.5H20 per litra) siirrostettiin 250 ml:aan sekoi-tuspullossa (baffled shake flask) kahdella itiömaljalla, joita oli kasvatettu 6 päivää Le Page-Campbell-itiöalustalla (1 g sakkaroosia; 1 g hiivauutetta; 0,5 g NaCl; 10 g CaCl2; 20 g agaria; litrassa; pH 6,8). Kasvustoa inkuboitiin 24-30 tuntia 28 eC:ssa sekoittaen 200 rpm. Myseeli kerättiin suo- 104264 44 dattamalla nailonsuodattimen läpi (25 pm huokoset) ja ylimääräinen vesi puristettiin kakusta suodatinpaperin välissä. Eristetty myseeli suspendoitiin konsentraatiossa 50 mg/ml TPC-puskuriin (0,8 M NaCl; 0,02 M MgS04; 50 mM kaliumfos-taattipuskuri, pH 7,0), jossa oli 10 mM DTT, myseeliä inku-boitiin sekoittaen 28 eC:ssa 90 min ajan. Myseeli kerättiin sentrifugoimalla (5 min. 2500 rpm; pöytäsentrifugi) ja suspendoitiin uudelleen konsentraatiossa 25 mg/ml TPC puskuriin, jossa oli 2 mg/ml Novozym (TM). Suspensiota inkuboi-tiin sekoittaen 2-5 tuntia 28 eC:ssa. Protoplastit suodatettiin 25 m huokoskoon nailonsuodattimen läpi ja eristettiin sentrifugoimalla (5 min; 2000 rpm, pöytäsentrifugi). Proto-plastinappi pestiin kolmesti 0,8 M NaCl:lla. Protoplastit suspendoitiin uudelleen NMC-puskuriin (0,8 M NaCl; 50 mM CaCl2; 10 mM MOPS, pH 7), sentrifugoitiin napiksi ja suspendoitiin uudelleen noin viisinkertaisella napin tilavuudella NMC-puskuriin (noin 10® protoplastia/ml) ja seokseen lisättiin 0,1 tilavuutta CCM puskuria (0,8 M NaCl; 50 mM CaCl2; 10 mM MOPS, pH 7; 18 % polyetyleeniglykolia (PEG), Sigma). Jokaista transformaatiota varten DNA ja 100 μΐ protoplasti-suspensiota pipetoitiin 10 ml:n putken pohjalle, suspensiota sekoitettiin varovasti ja säilytettiin jäissä 20 min. 500 μΐ CCM-puskuria lisättiin jokaiseen putkeen ja seosta säilytettiin toiset 20 min. huoneenlämmössä. Transformaatioseos laimennettiin 600 μ1:1ΐ8 NMC puskuria ja maljattiin TSA-sakka-roosialustoille (S.W. Queener et ai., 1985, Microbiology (ASM), s. 468-472), jotka sisälsivät 10 μg/ml fleomysiiniä. Maljoja inkuboitiin 28 eC:ssa 2-6 päivää. Transformantit siirrostettiin fleomysiiniä sisältävälle maljalle; kasvun jälkeen valmistettiin itiöt Le Page-Campbell-itiöalustalla.
104264
Esimerkki 16
Acremonium chrysoqenumin mutantin täydentäminen ja penisilliinin tuottaminen nallia transformantellla
Acremonium chrysoqenum-kantaa N2 (Shirafuji et ai., 1979, Agric. Biol. Chem., £3, 155-160; J.L. Chapman et ai., Developments in Industrial Microbiology, voi. 27, s. 165,
Toim. G. Pierce, 1987, Society for Industrial Microbiology; F.R. Ramos et ai., FEMS Microbiology Letters (1986), s. 123) transformoitiin kuten on kuvattu esimerkissä 15 lambdafagi G2:lla (kuva 2), joka sisältää P. chrysoqenumin [IPNS ja AT]-geenirykelmän. Valintarakenteena käytettiin kotransformaatiokokeessa pPS47:ää, joka sisältää fleomysii-niresistenssigeenin. Kanta N2:ssa on IPNS-geenissä mutaatio (Shirafuji et ai., kuten edellä) ja täten se ei tuota kefa-losporiini C:tä.
>, Kotransformantit eristettiin ja tuottokyky testattiin. Anti bioottia tuottavat kloonit eristettiin noin 25 %:n frekvenssillä, mikä tarkoittaa, että P. chrysoqenumin IPNS-geeni on ekspressoitunut A. chrysoqenumissa, ja että P. chrysoqenumin entsyymi voi toimivasti korvata A. chrysoqenumin entsyymin. Transformantit siirrostettiin Caltriderin ja Nissin kompleksiselle, kiinteälle tuotantoalustalle (1966; Appi. Microbi ol. 14, 746-753) sekä fenyyliasetaatin kanssa ja ilman sitä, inkuboitiin 5 päivää 27 eC:ssa ja tuotetut antibiootit määritettiin maljaamalla näytteet Micrococcus luetus, joka on erittäin herkkä penisilliini G:lie, mutta kestää kefalospo-riini C:tä (ainakin konsentraatioon 10 pg/ml), maljoille ja ;* E. coli (ESS2231), joka on erittäin herkkä kefalosporiini C:lle, mutta vähemmän herkkä penisilliini G:lie, maljoille. Micrococcus luteus ja E. coli katso: J.M. Luengo et ai., J. Antibiotics 39^, 1565 (1986), M.J. Löpez-Nieto et ai., Appi. Microbiol. Biotechnol. 22, 343 (1985), G. Revilla et ai., J. Bacteriol. 168, 947 (1986). Tulokset useiden transformant- 104264 46 tien testauksista on esitetty taulukossa 6. Vertaamalla an-tibioottiaktiivisuutta M. luteuksella testattaessa sekä fe-nyylietikkahapon (PA) läsnäollessa että ilman sitä voidaan osoittaa, että monilla transformanteilla on antibiootin tuottokyky stimuloitunut PA:n läsnäollessa, mikä tulos osoittaa, että on tuotettu penisilliini G:tä. Ilman PA:ta tuotettu antibiootti saattaa olla penisilliini N:ää tai iso-penisilliini N:ää; molemmilla yhdisteillä on voimakas antibioottinen vaikutus. Yhtä valittua transformanttia kasvatettiin nestemäisessä tuottoalustassa (Caltrider ja Niss, 1966, kuten edellä), johon oli lisätty 0,8 mg/ml PA.
Muodostunut penisilliini G eristettiin uuttamalla dietyyli-eetterillä, sen jälkeen kun pH oli säädetty 2,0:ksi fosfori-hapolla.
Penisilliini G voidaan uuttaa orgaaniseen faasiin sen hydrofobisen sivuketjun (PA) ansiosta. Kefalosporiini C (jolla on hydrofiilinen sivuketju; α-aminoadipiinihappo) ei uutu or-" gaaniseen faasiin.
Erottamisen jälkeen orgaanista faasia uutettiin edelleen 0,1 M kaliumfosfaattipuskurilla, pH 7,0; tämä uutto siirtää penisilliini G:n vesifaasiin.
Vesifaasilla oli antibioottista aktiivisuutta biomäärityk-sellä mitattuna; M. luteus oli herkempi tälle aktiivisuudelle kuin E. coli. Aktiivisuus voitiin hävittää inkuboimalla näytettä kaupallisella penisilliinispesifisellä penisilli-naasilla (Difco). Nämä tulokset osoittavat transformanttien todella tuottaneen penisilliini G:tä. Edelleen näyte vesi-faasista analysoitiin HPLC:llä; tulokset tästä analyysistä (retentioaika, eluutioprofiili) osoittavat antibioottisen komponentin olevan penisilliini G:tä. Vastaavat analyysit käyttäen isäntäkannan N2 fermentointialustaa osoittavat, että antibioottista aktiivisuutta ei esiinny ja että tämä 104264 47 kanta ei tuota penisilliini G:tä. p. chrysoqenumin AT-geeni on ekspressoitu A. chrysoqenumiin ja kyky tuottaa penisilliini G:tä, mikä kyky on tavallisesti rajoittunut Penicil-lium- ja Asperqillus-lajelhln, on siirretty A. chrysogenu-mlin P. chrysoqenumin [IPNS ja AT]-geenirykelmän transformaation avulla.
Taulukko 6 estorenkaan halkaisija biomäärityksessä1 transformantti M. luteus E. coli
+PA -PA +PA -PA
1 36 24 29 29 2 29 23,5 22 13 3 28 11,5 30 30 4 21 18 28 27 5 34 29 10 7 6 20 14 10 7 7 22 16 19 17,5 8 43 36 29 28
Huom: Estorenkaan halkaisija on verrannollinen läsnäolevan antibiootin konsentraation logaritmiin.

Claims (11)

104264 48
1. DNA-rakenne, tunnettu siitä, että se sisältää vähintään kaksi seuraavista geeneistä: isopenisilliini N-syn- 5 tetaasia (IPNS) koodaava geeni, asyylitransferaasia (AT) koodaava geeni ja ACVS:ää koodaava geeni.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA rakenne, tunnettu siitä, että se on pGJ02 A tai pGJ02 B, jotka on esitetty 10 kuvassa 7, tai HM 193, jonka talletusnumero on CBS 179.89.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että se täydentää ei-tuottavan tyyppisen 15 mutaation.
4. Vektori, joka sisältää jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaisen DNA-rakenteen, tunnettu siitä, että se sisältää valintamarkkerin sanottua sekundääristä metabo- 20 liittia tuottavalle isäntäsolulle ja/tai että se sisältää sekvenssin, joka parantaa sanotun vektorin transformaa-tiokykyä sanotussa isäntäsolussa.
5. Transformoitu isäntäsolu, tunnettu siitä, että se si- 25 sältää jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukaisen DNA-ra kenteen.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen transformoitu isäntä-solu, tunnettu siitä, että sanottu isäntäsolu on Penicil-
30 Hum, Aspergillus, Acremonium tai Actinomycete, mieluiten ; Penicillium chrysogenum. 1 Penisilliinin biosynteettisten geenien, muiden kuin isopenisilliini N-syntetaasia (IPNS) ja asyylitransferaa- 35 siä (AT) koodaavien geenien eristysmenetelmä, tunnettu siitä, että eristetään rakenne, joka sisältää ainakin yhden geenin, joka koodaa joko isopenisilliini N-synte- 104264 49 taasia (IPNS), asyylitransferaasia (AT) tai ACVS:ää ja käytetään "chromosome walking"-tekniikkaa DNA-rakenteen eristämiseksi, joka rakenne sisältää toisen geenin, joka suoraan tai epäsuorasti ottaa osaa penisilliinin biosyn-5 teesiin.
8. DNA-rakenne, tunnettu siitä, että se sisältää geenin, joka saadaan patenttivaatimuksen 7 mukaisella menetelmällä. 10
9. Transformoitu isäntäsolu, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 8 mukaisen DNA-rakenteen.
10. Menetelmä sekundääristen metaboliittien tuottamiseksi 15 mikrobisessa isäntäsolussa tai tällaisen tuoton paranta miseksi, tunnettu siitä, että valmistetaan jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen DNA-rakenne, transformoidaan mahdollinen isäntäsolu näillä DNA rakenteilla, kloonataan saadut transformantit, ja tunnistetaan kloonit, jotka : 20 tuottavat sanottua sekundääristä metaboliittia suurempia pitoisuuksia kuin sanotut mahdolliset isäntäsolut. • « • , 104264 50
FI893722A 1988-08-11 1989-08-07 Menetelmä sekundääristen metaboliittien tuoton parantamiseksi käyttämällä rykelmöityjä biosynteettisiä geenejä FI104264B1 (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP88201714 1988-08-11
EP88201714 1988-08-11
EP89201044 1989-04-21
EP89201044 1989-04-21

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI893722A0 FI893722A0 (fi) 1989-08-07
FI893722A FI893722A (fi) 1990-02-12
FI104264B true FI104264B (fi) 1999-12-15
FI104264B1 FI104264B1 (fi) 1999-12-15

Family

ID=26115259

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI893722A FI104264B1 (fi) 1988-08-11 1989-08-07 Menetelmä sekundääristen metaboliittien tuoton parantamiseksi käyttämällä rykelmöityjä biosynteettisiä geenejä

Country Status (15)

Country Link
US (1) US5462862A (fi)
EP (1) EP0357119B1 (fi)
JP (2) JP3095391B2 (fi)
KR (1) KR900003364A (fi)
AT (1) ATE130033T1 (fi)
AU (1) AU631806B2 (fi)
CA (1) CA1340916C (fi)
DE (1) DE68924745T2 (fi)
DK (1) DK393089A (fi)
ES (1) ES2081831T3 (fi)
FI (1) FI104264B1 (fi)
GR (1) GR3018782T3 (fi)
HU (1) HU214244B (fi)
IE (1) IE72167B1 (fi)
PT (1) PT91411B (fi)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6258555B1 (en) 1987-12-09 2001-07-10 Beecham Group P.L.C. DNA encoding ACV synthetase
DE69129869T2 (de) * 1990-02-28 1999-01-14 Gist Brocades Nv Verfahren zur Beeinflussung der Produktion von beta-lactam Antibiotika und zur Isolierung grosser Mengen von ACV-Synthetase
US5662898A (en) * 1990-08-20 1997-09-02 Ciba-Geigy Corporation Genes for the synthesis of antipathogenic substances
US5639949A (en) * 1990-08-20 1997-06-17 Ciba-Geigy Corporation Genes for the synthesis of antipathogenic substances
US6495348B1 (en) 1993-10-07 2002-12-17 Regents Of The University Of Minnesota Mitomycin biosynthetic gene cluster
US6524812B1 (en) 1993-10-07 2003-02-25 Regents Of The University Of Minnesota Genes encoding resistance to DNA alkylating agents
US6117670A (en) * 1994-06-08 2000-09-12 Novartis Finance Corporation Pyrrolnitrin biosynthesis genes and uses thereof
EP0734452A1 (en) * 1994-06-10 1996-10-02 Gist-Brocades B.V. Improved acylation method for penicillins and cephalosporins
AU3517895A (en) * 1994-09-28 1996-04-19 Novo Nordisk A/S Process for the production of secondary metabolites
US6368820B1 (en) * 1996-07-16 2002-04-09 Dsm N.V. Process for the preparation of cephalosporins using acremonium chrysogenum
US5976836A (en) * 1997-05-07 1999-11-02 Fermalogic, Inc. Methods and compositions for enhancing erythromycin production
WO1999025735A1 (en) * 1997-11-19 1999-05-27 Microbia, Inc. Chimeric pre-activated transcription factors
EP1026248A3 (en) * 1999-01-29 2002-09-18 RAMOT UNIVERSITY AUTHORITY FOR APPLIED RESEARCH &amp; INDUSTRIAL DEVELOPMENT LTD. Gene cluster
US6284483B1 (en) * 1999-10-06 2001-09-04 Board Of Trustees Operating Michigan State University Modified synthetases to produce penicillins and cephalosporins under the control of bicarbonate
US6949356B1 (en) * 1999-10-20 2005-09-27 Microbia, Inc. Methods for improving secondary metabolite production in fungi
US20030194784A1 (en) * 2001-04-17 2003-10-16 Sherman David H. DNA encoding methymycin and pikromycin
EP2123772A1 (en) * 2008-04-29 2009-11-25 DSM IP Assets B.V. Beta-lactam antibiotic producing strains
CN109804061A (zh) * 2016-10-07 2019-05-24 出光兴产株式会社 产芽孢细菌的培养方法和有用物质的制造方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4892819A (en) * 1985-11-25 1990-01-09 Eli Lilly And Company Recombinant DNA expression vectors and DNA compounds that encode isopenicillin N synthetase from penicillium chrysogenum
DE3788764T2 (de) * 1986-09-16 1994-06-23 Gist Brocades Nv Penicilliumtransformanten und Verfahren zu ihrer Herstellung.
US4950603A (en) * 1987-11-02 1990-08-21 Eli Lilly And Company Recombinant DNA expression vectors and DNA compounds that encode isopenicillin N synthetase from Streptomyces lipmanii
GB8728811D0 (en) * 1987-12-09 1988-01-27 Beecham Group Plc Novel substance
US5108918A (en) * 1988-08-11 1992-04-28 Gist-Brocades Method for identifying and using biosynthetic genes for enhanced production of secondary metabolites

Also Published As

Publication number Publication date
AU631806B2 (en) 1992-12-10
IE72167B1 (en) 1997-03-26
HU214244B (hu) 1998-03-02
KR900003364A (ko) 1990-03-26
DE68924745T2 (de) 1996-04-11
EP0357119B1 (en) 1995-11-08
DK393089A (da) 1990-02-12
PT91411B (pt) 1995-05-31
EP0357119A3 (en) 1990-04-04
FI893722A (fi) 1990-02-12
JP3095391B2 (ja) 2000-10-03
ATE130033T1 (de) 1995-11-15
DE68924745D1 (de) 1995-12-14
HUT51335A (en) 1990-04-28
JP2000342289A (ja) 2000-12-12
GR3018782T3 (en) 1996-04-30
CA1340916C (en) 2000-02-29
US5462862A (en) 1995-10-31
AU3956989A (en) 1990-02-15
FI893722A0 (fi) 1989-08-07
DK393089D0 (da) 1989-08-10
ES2081831T3 (es) 1996-03-16
PT91411A (pt) 1990-03-08
FI104264B1 (fi) 1999-12-15
JPH02150284A (ja) 1990-06-08
IE892572L (en) 1990-02-11
EP0357119A2 (en) 1990-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI104264B (fi) Menetelmä sekundääristen metaboliittien tuoton parantamiseksi käyttämällä rykelmöityjä biosynteettisiä geenejä
Proctor et al. A polyketide synthase gene required for biosynthesis of fumonisin mycotoxins in Gibberella fujikuroi mating population A
Kolar et al. Transformation of Penicillium chrysogenum using dominant selection markers and expression of an Escherichia coli lacZ fusion gene
FI114481B (fi) Valintamerkkigeenittömät rihmasienikannat, menetelmä niiden valmistamiseksi, ja näiden kantojen käyttö
FI104984B (fi) Menetelmä biosynteettisten tai säätelygeenien identifioimiseksi ja käyttämiseksi sekundääristen metaboliittien tuoton parantamiseksi
US5108918A (en) Method for identifying and using biosynthetic genes for enhanced production of secondary metabolites
WO2001051639A2 (en) Everninomicin biosynthetic genes
US6051431A (en) Selection marker gene free recombinant strains: a method for obtaining them and the use of these strains
Chen et al. An efficient genetic transformation system for Chinese medicine fungus Tolypocladium ophioglossoides
EP0783581B1 (en) Process for the production of secondary metabolites
EP0448180B1 (en) A method of modulating the production of secondary metabolites
EP0549062B1 (en) A eukaryotic expression system
JP5864267B2 (ja) ピリピロペン生合成遺伝子群およびマーカー遺伝子を含む核酸構築物
JPS63192378A (ja) ペニシリウムのトランスフォーマント及びその製造方法
US5747285A (en) DNA comprising regulatory regions from gene y of penicillium chrysogenum
AU785214B2 (en) Mutant bank
US5882879A (en) Method for influencing β-lactam antibiotic production and for isolation of large quantities of ACV synthetase
US5925515A (en) Direct selection of transformants on acetate-containing media
EP0444758A1 (en) Method for modification of ACV synthetase and use of the modified enzyme for production of beta-lactam antibiotics
HU209941B (en) Method for identifying and using biosynthetic or regulatory genes for enhanced production of beta-lactam antibiotics, these comprising vector, and transformation of fungi cells
US20040077047A1 (en) Method for producing heterologous proteins in a homothallic fungus of the sordariaceae family
Whitehead Development of homologous transformation systems for the filamentous fungi'Cephalosporium acremonium'and'Penicillium chrysogenum'
WO2005040369A1 (en) Process for producing penicillin
PT91410B (pt) Processo para a identificacao e de utilizacao de genes biossinteticos ou de regulacao para a producao melhorada de metabolitos secundarios

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: DSM N.V.

FG Patent granted

Owner name: DSM IP ASSETS B.V.

MA Patent expired