FI104220B - Menetelmä, jolla voidaan valmistaa viljellyistä soluista tromboplastiinireagenssi, joka soveltuu käytettäväksi protrombiiniaikatestissä - Google Patents

Description

! 104220

Menetelmä, jolla voidaan valmistaa viljellyistä soluista tromboplastiinireagenssi, joka soveltuu käytettäväksi protrombiiniaikatestissä 5 Keksinnön tausta

Keksintö koskee kliinisen hematologian alaa ja erityisesti ihmisen plasman hyytymistekijän tarkkailua. Keksintö kohdistuu menetelmään jolla voidaan valmistaa tromboplastiinireagenssi viljellyistä ihmissoluista sekä mene-10 telmällä valmistettuun tromboplastiinireagenssiin.

Protrombiiniaikatesti

Protrombiiniaika (PT) -testi on yksi useista plasman kliinisistä hematologisista määrityksistä, jossa tulos perustuu aikaan, joka fibriinihyytymän muodostumiseen vaa-15 ditaan. Se tarjoaa diagnostisesti hyödyllistä tietoa, joka koskee kudostekijäreitissä (aikaisemmin tunnettu ulkopuolisena hyytymisreittinä; Rapaport, 1991) mukana olevien hyytymistekijöiden, nimittäin tekijöiden I, II, III, V, VII ja X, toimivuutta tai toiminnan eheyttä. Se on myös 20 hyödyllinen tarkkailtaessa potilaita, jotka saavat suun kautta annettavaa antikoagulanttihoitoa. Käytännössä tämä testi on herkin hyytymistekijöiden V, VII ja X konsentraa-tion ja/tai aktiivisuuden suhteen.

Plasma, jossa on puutetta tai vikaa yhdessä tai : 25 useammassa yllä mainitussa hyytymistekijässä, tuottaa tyy pillisesti PT:n, joka on > 20 % pitempi kuin normaalien plasmanäytteiden ryhmästä saatu keskimääräinen PT. Täten protrombiinitesti edustaa hyödyllistä keinoa, jolla voidaan havaita hyytymistekijäpuutokset ja tarkkailla suun 30 kautta annettavan antikoagulaation tasoa.

”Tromboplastiinit PT-testi tarvitsee "tromboplastiinin" hyytymisreak-' tion aloittamiseen. Tromboplastiini voidaan määritellä yleisesti aineeksi, jolla on hyytymää indusoivia ominai-35 suuksia tai aktiivisuutta. PT-testin erityisessä asiayh- • 2 104220 teydessä tromboplastiini sisältää merkittäviä määriä ku-dostekijää (hyytymistekijä III), joka on olennainen kofak-tori hyytymistekijä VII:n aktivaatiossa (Nemerson, 1988). Aktivoidun tekijä Vilin syntyminen aloittaa muiden reakti-5 oiden sarjareaktion, joka huipentuu fibriinihyytymän muo dostumiseen. Sellainen hyytymä voidaan havaita käsin tutkimalla visuaalisesti tai automaattisesti laitteiston avulla, joka on suunniteltu tarkkailemaan liuoksen viskoo-sisuutta tai läpikuultavuutta.

10 Menneisyydessä monet laboratoriot valmistivat omia tromboplastiinejaan ihmis- tai eläinkudoksista. Tämä käytäntö johti hyvin vaihteleviin reagensseihin, joilla keskimääräisen normaalin plasman hyytymisajoiksi saatiin arviolta 11 - 2!0 sekuntia. Koska nämä paikallisesti tuotetut 15 tromboplastiinit eivät sisältäneet kalsiumia, yksiosainen PT-testi oli todellisuudessa kaksivaiheinen menetelmä, joka suoritettiin 1) sekoittamalla 0,1 ml normaalia sit-raattiplasmaa 0,1 mliaan tromboplastiinia ja 2) - sen jälkeen kun seos oli lämmitetty 37 °C:n lämpötilaan - aloit-20 tamalla hyytymisreaktio lisäämällä 0,1 ml 0,025 M CaCl2:ta (Biggs, 1976; s. 330; s. 677).

Viimeisen 20 vuoden aikana kaupallisesti saatavilla olevat tromboplastiinit ovat tulleet laajaan käyttöön. Tämän seurauksena kliinisten hematologisten laboratorioi-: 25 den valtava enemmistö on lakannut tekemästä omia trombo plastiinejaan, ja PT-kokeen klassiseen menetelmään on tehty useita muutoksia, varsinkin: 1) Koska kaikki kaupalliset tromboplastiinit sisältävät nyt kalsiumia, alkuperäinen "kaksivaiheinen" menetelmä on korvattu "yksivaiheisel-30 la" tai todella yksiosaisella määrityksellä, jossa 0,1 ml normaalia sitraattiplasmaa yhdistetään 0,2 mliaan trombo-plastiinia, johon on lisätty kalsiumia; ja 2) koska kaupalliset tromboplastiinit ovat yleensä vähemmän vaihtele-via ja aktiivisempia kuin klassiset tromboplastiinit, nor-35 maalin plasman hyytymisajän hyväksyttävät rajat ovat vä hentyneet noin 10 - 14 sekuntiin, ja keskimääräiset normaalit protrombiiniajat ovat noin 11 - 13 sekuntia.

3 104220

Painottaaksemme tromboplastiinin, joka on formuloitu klassisin menetelmin ja jota käytetään kaksivaiheisessa ' menetelmässä, ja nykyisten kaupallisesti saatavien trom boplastiinien, jotka sisältävät kalsiumia ja joita käyte-' 5 tään yksivaiheisessa menetelmässä, välistä eroa, kutsumme jälkimmäistä nimellä "tromboplastiinireagenssi".

Juuri tämä nykyinen yksivaiheinen/yksiosainen PT-testi ja tämä nykyinen kalsiumilla rikastettu tromboplas-tiinitesti määrittää tämän keksinnön kohteen ja koskee 10 sitä erityisesti: tromboplastiini, joka soveltuu käytettäväksi PT-testissä.

Tämänhetkiset tarkat ohjeet protrombiiniaikatestil- le Tämän keksinnön lähtökohdalle on tärkeää ja hyvin 15 asiaankuuluvaa, että PT-testiä varten soveltuvalla uudella ja hyödyllisellä tromboplastiinireagenssilla täytyy olla kaupallisesti saatavilla olevien tromboplastiinien, joita kliiniset laboratoriot tätä tarkoitusta varten tällä hetkellä käyttävät, suoritusominaisuudet tai paremmat kuin 20 ne. Eli i) kuten yllä on kuvattu, sen pitäisi olla yksivaiheinen/yksiosainen hyytymään perustuva määritys ii) normaalille plasmalle hyytymisaikojen pitäisi olla noin 10 - 14 sekuntia ja keksimääräisen normaalin PT:n pitäisi olla noin 11 - 13 sekuntia; iii) kun verrataan kansainvä-” 25 lisen referenssitromboplastiinin kanssa normaalien ja kou- madiinilla antikoaguloitujen plasmanäytteiden joukkoa vastaan yleisesti hyväksyttyä menetelmää käyttäen (katso alempana), hyytymisaikojen logaritmien pistediagrammin pitäisi osoittaa hyvin positiivinen korrelaatio; ja iv) 30 hyödyllinen tromboplastiinireagenssi on stabiili normaa- ’ · leissa käyttöolosuhteissa. Edellä olevia piirteitä ja PT- * testissä käytettäväksi sopivien tromboplastiinien suori-’ tuskykyä ja menetelmiä koskevaa lisätietoa kuvataan lisäk si pakkausten mukana tulevissa liitteissä kaupallisille 35 tromboplastiinireagensseille Simplastin* (Organon Teknika 4 104220

Corp., Durham, NC); Dade Thromboplastin C (Baxter Healthcare Corp., Dade Division, Miami, FL); Ortho kanin aivokudoksen tromboplastiini (Ortho Diagnostics Systems, Raritan, NJ); ja ThromborelR S (Behringwerke AG, Marburg, Sak-5 sa), jotka liitetään tähän viitteenä.

Tromboplastiinien valmistusmenetelmiä

Quick ym. (1935; 1938) kuvasivat ensimmäisenä klassisen menetelmän, jolla voidaan valmistaa tromboplastiinia PT-testiä varten. Quickin tromboplastiini (Quick, 1938) 10 valmistettiin jauhetuista kanin aivoista menetelmällä, joka sisälsi seuraavat vaiheet; i) veden poisto ja osittainen lipidien poisto jauhetusta kudoksesta toistetulla asetonipesulla, jota seurasi kuivatus 37 °C;n lämpötilassa; 2) asetonijauheen (0,3 g) uudelleen koostaminen 15 "5 cm3:een natriumkloridin fysiologista suolaliuosta, joka sisälsi 0,1 cm3 natriumoksalaattia" (eli 5 ml:aan vesi-liuosta, joka oli noin 0,15 M NaCl:n ja 0,002 M Na2C204:n suhteen); 3) suspension inkubaatio 45 °C;n lämpötilassa 10 minuuttia; ja 4) sentrifugaatio alhaisella nopeudella 3 20 minuutin ajan suurikokoisten partikkeleiden poistamiseksi. Tromboplastiiniaktiivisuus on jäljellä "maitomaisessa su-pernatanttinesteessä".

Quickin ym. alkuperäinen menetelmä, jossa on pieniä muutoksia (Biggs, 1976; s. 663-664) on toiminut perustana ' 25 nykyisille tromboplastiinin valmistusmenetelmille. Vaihtoehtoisia menetelmiä tunnetaan myös: esimerkiksi Biggs (1976; s. 664) opettaa menetelmää, joka sisältää kokonaisten aivojen hienontamisen "noin 2 minuutin ajan Waring-sekoittimella lämpimässä 0,85-prosenttisessa suolaliuok-30 sessa". Tämä menetelmä on vain pieni muutos Quickin menetelmään, ja huomiotaherättävää on se, että siinä jätetään pois asetoniuutto/kuivatusvaihe. Toisessa esimerkissä Hvatum & Prydz (1966) opettavat menetelmää, johon kuuluu mikrosomifraktion detergenttiuutto ihmisen aivoista, jota 35 seuraa dialyysi puskuroitua suolaliuosta vastaan detergen- 104220 tin poistamiseksi, joka inhiboi kudosfaktorin aktiivisuutta. Koska mikrosomit pitää valmistaa sentrifugoimalla suurella nopeudella ja detergentti pitää poistaa dialysoimal-la, tämä menetelmä on kömpelö eikä sovellu suurten trom-5 boplastiinimäärien valmistamiseen, joita vaaditaan kaupallisiin sovellutuksiin.

Yhteenvetona tekniikan nykyinen taso tromboplastii-nin tuottamiseksi (ihmisen tai eläimen kudoksista), joka soveltuu PT-testissä käytettäväksi, sisältää 1) soveliaan 10 kudoksen valinnan, jolla on suuri tromboplastiini (kudos-tekijä) aktiivisuus [esim. kanin, naudan tai ihmisen aivot; ihmisen istukka; tai kanin tai naudan keuhko]; 2) veden poisto ja osittainen lipidien poisto jauhetusta kudoksesta asetonilla, ja lisäksi kuivatus huoneenlämmössä 15 tai kohotetussa lämpötilassa, jolloin saadaan asetonijauhe, ja asetonijauheen koostaminen uudestaan soveliaassa laimennusnesteessä, tai kudoksen hienontaminen; ja 3) suurien partikkelien poistaminen sentrifugoimalla. Trombo-plastiinit voidaan myös formuloida muuttamalla vaiheita 2 20 ja 3 kuten yllä on kuvattu.

Tromboplastiinien arviointimenetelmiä

Kaupallisesti saatavia tromboplastiinireagensseja on kahta laatua: heterologisia tromboplastiineja kuten ne, jotka ovat peräisin eläinkudoksista (esim. kanin aivoista : 25 tai naudan keuhkoista) ja homologisia tromboplastiineja kuten ne, jotka ovat peräisin ihmiskudoksista (esim. ihmisen istukasta). Kuten ovat kuvanneet Kirkwood (Thromb, Haemostas. 49: 238 - 244, 1983) ja Hirsh ym., Chest, 95: 5S - HS, 1989), tromboplastiinireagenssien kyky havaita 30 suun kautta annettavien antikoagulanttien aiheuttamat hyy-" . tymistekijäaktiivisuuden vähenemiset vaihtelee. Yleisesti ymmärretään, että homologiset tromboplastiinit ovat her-r kempiä näille hyytymistekijän aktiivisuuden muutoksille kuin niiden heterologiset vastineet. Tämä lisääntynyt 35 herkkyys on suotavaa koska se i) mahdollistaa antikoa- 4 6 104220 gulanttihoidon paremman kontrollin ja vähentää näin liiallisen antikoagulaation aiheuttaman epänormaalin verenvuodon vaaraa ja ii) lisää reagenssin herkkyyttä vähäisille epänormaalisuuksille kudostekijäreitin hyytymisteki-5 jöissä.

Yksi tromboplastiinin laadun tai herkkyyden mitta on kansainvälinen herkkyysindeksi (International Sensitivity Index) (ISI), joka lasketaan testattavan tromboplastiinin ortogonaalisesta regressiosta referenssitrombo-10 plastiinin suhteen (katsaus: Kirkwood ja Hirsh ym.). Seu-raava on esimerkki siitä kuinka sellaisia testejä suoritetaan: hankitaan referenssitromboplastiini, jonka ISI tunnetaan. Käyttämällä tätä referenssitromboplastiinia ja testattavaa tromboplastiinia suoritetaan PT:n määritys 15 normaaleille ja koumadiinilla antikoaguloiduille plasma- näytteille. Tulokset piirretään kuvaajaan referenssitrom-boplastiinin (ordinaatta) protrombiiniaikojen logaritmeina testattavan tromboplastiinin (abskissa) funktiona. Käytetään ortogonaalista pienimpien neliösummien regressioana-20 lyysiä määrittämään sen suoran kulmakerroin, joka sopii parhaiten tuloksiin. Testattavan tromboplastiinin ISI lasketaan laskemalla referenssitromboplastiinin ISI:n ja regressiosuoran kulmakertoimen tulo.

Kuten Kirkwood on huomauttanut, edellä oleva mene-" 25 telmä testattavan tromboplastiinin ISI:n laskemiseksi edustaa yleisesti hyväksyttyä lähestymistapaa, jolla määritetään tromboplastiinireagenssin sopivuus PT-testissä käytettäväksi. Sellaista koetta käytettiin osoittamaan tämän keksinnön arvo ja hyödyllisyys. Tuore esimerkki tä-30 män menetelmän sovellutuksesta löytyy van den Besselaarin ja Bertinsin artikkelista (1991).

Tromboplastiinit viljellyistä soluista

Kun Quick ym. kuvasivat menetelmän, jolla voidaan tuottaa tromboplastiini, joka on sovelias PT-koetta var-35 ten, tiedettiin vähän taustalla piilevistä mekanismeista * 7 104220 ja reaktioista. Nyt on hyvin selvillä, että eläinkudoksista, kuten aivoista, keuhkosta ja istukasta, valmistettujen tromboplastiinien aktiivinen perusaine on membraanin läpäisevä, lipideihin liittynyt glykoproteiini, joka tunne-5 taan nimellä "kudostekijä" tai tekijä III (Nemerson & Bach, 1982; Spicer ym. 1987; Nemerson, 1988). On myös laajalti ymmärretty (katsaus: Nemerson & Bach, 1982 ja Drake ym., 1989), että lähes kaikki suoniston ulkopuoliset kudokset (eli kaikki kudokset paitsi endoteelisolut tai ve-10 risolut) sisältävät kudostekijää. Lisäksi (katsaus Nemerson ja Bach, 1982), kun suoniston ulkoisista kudoksista peräisin olevia normaaleja tai transformoituneita soluja kasvatetaan viljelmässä, voidaan myös ekspressoida kudos-tekijä/tromboplastiiniaktiivisuutta, ja että endoteeliso-15 lut tai valkoiset verisolut voidaan indusoida in vitro ekspressoimaan kudostekijää erilaisilla kemiallisilla tai biologisilla agensseilla.

Nyt huomio suunnataan tekniikan tasoon, joka koskee menetelmiä, jolla valmistetaan tromboplastiineja soluvil-20 jelmistä (eri kuin eläinkudokset) ja sellaisten tromboplastiinien soveltuvuutta PT-testissä käytettäväksi. Tuoreen kirjallisuuden katsaus paljasti seuraavaa: 1) Naito ym. (1983) valmisti tromboplastiineja kahdeksasta viljellystä ihmisen mahasyöpäsolulinjasta mene-" 25 telmällä, joka sisälsi "jäädytyksen, sulatuksen ja soni- koinnin", jolloin tuotettiin solulysaatti, joka uutettiin tämän jälkeen "fysiologisella suolaliuoksella", jolloin saatiin liuos, jossa oli paljon tromboplastiiniaktiivi-suutta. "Plasman rekalsifikaatioaikaa" käytettiin havait-30 semaan kudostekijäaktiivisuutta, ja raportoitiin hyytymis- aikoja, jotka olivat välillä 21,1 - 77,4 sekuntia. Solun hajotusmenetelmää lukuunottamatta tämä tromboplastiini ' valmistettiin yllä kuvattujen klassisten menetelmien mu kaisesti; koska kuitenkin normaalin plasman PT ei ollut 35 10 - 14 sekunnin alueen sisällä, Naito ym. (1983) eivät β 104220 opettaneet menetelmää, jolla voidaan tuottaa tromboplas-tiinireagenssi, joka soveltuu PT-testissä käytettäväksi.

2) Silverberg ym. (1989) tunnistivat kudostekijän kahdessa ihmisen haimasyöpäsolulinjassa ja valmistivat 5 liuoksia, joissa oli tromboplastista aktiivisuutta, "kokonaisista soluista, jäädytetyistä ja sulatetuista soluista, mikrovesikkeleistä ja membraanivalmisteista". Valmistusmenetelmää ei tässä artikkelissa yksilöity eikä siitä esitetty ristiviitettä. Tromboplastiiniaktiivisuus määritet-10 tiin kaksiosaisella rekalsifikaatioaikatestillä, ja raportoitiin niinkin alhaisia hyytymisaikoja kuin 17 sekuntia. Koska tämänhetkistä PT-määritysmenetelmää ei käytetty ja koska normaalin plasman PT ei ollut 10 - 14 sekunnin alueen sisällä, Silverberg ym. eivät opettaneet menetelmää, 15 jolla voitaisiin tuottaa tromboplastiinireagenssi, joka on sopiva PT-testissä käytettäväksi.

3) Andoh ym. (1990) opettivat, mitä he kuvasivat "yksiosaiseksi menetelmäksi", jolla voidaan havaita kudos-tekijäaktiivisuutta leukemiasoluissa. Itse asiassa se oli 20 kaksivaiheinen PT-testi, joka sisälsi i) leukemiasoluhomo-genaatin inkuboinnin ihmisen plasman kanssa 3 minuutin ajan ja sen jälkeen ii) CaCl2:n lisäämisen koaguloitumisen aloittamiseksi. Raportoitiin normaaleja plasman hyytymisaikoja, jotka olivat yhtäsuuria tai suurempia kuin 54 ;· 25 sekuntia. Koska normaalin plasman PT ei ollut alueella 10 - 14 sekuntia, Andoh ym. eivät opettaneet menetelmää, jolla voidaan tuottaa tromboplastiinireagenssi, joka on sovelias PT-testissä käytettäväksi.

4) Rehemtulla ym. (1991) transfektoivat ihmisen 30 kudostekijää koodittavan geenin jyrsijäsolulinjaan, ja osoittivat että ekspressoidulla rekombinanttisella ihmisen kudostekijäproteiinilla oli fysikaalis-kemiallisia ja biologisia ominaisuuksia, jotka olivat samanlaisia kuin sen luonnollisella ihmisvastineella. Kuvattiin menetelmä trom-35 boplastiinin valmistamiseksi: "Solususpensiot tiheydessä • 9 104220 1 x 10® solua/ml TBSrssä [20 πιΜ Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4] pakastettiin kuivajää/etanolihauteessa ja sulatettiin 37 °C:n lämpötilassa kolme kertaa, ja 0,1 ml tätä lysaat-tia käytettiin standardinomaisessa yksiosaisessa hyytymis-5 määrityksessä, jotta esikoagulanttiaktiivisuus saatiin määritettyä." Erittelemättä varsinaista käytettyä PT-mene-telmää kirjoittajat ilmoittivat, että näistä jäädytetyis-tä/sulatetuista rekombinanttisolulysaateista tuotetut tromboplastiinit arvioitiin kahdella eri kaksivaiheisella 10 PT-menetelmällä (Levy & Edgington, 1980; Tsao ym., 1984). Tässä esimerkissä saatiin todellakin normaalin plasman hyytymisajat 10 - 14 sekunnin rajoihin. Koska kuitenkin määritysmenetelmät sisälsivät merkittäviä poikkeamia yleisesti hyväksytystä PT-testimenetelmästä, on mahdotonta 15 määrittää tuotettiinko sopivaa tromboplastiinia jäädy- tys/sulatusmenetelmällä. Lisäksi Rehemtullan ym. esimerkissä tromboplastiinin raaka-aine tuotettiin jyrsijän re-kombinanttisoluissa, jotka ekspressoivat ihmisen kudos-tekijää yli normaalien määrien. Täten on mahdotonta mää-20 rittää tästä tekniikan tason esimerkistä, olisiko tromboplastiinin valmistusmenetelmä sovelias viljellyille ei-rekombinanttisoluille, tämän keksinnön kohteelle. Valmistimme tromboplastiinireagenssin viljellyistä ei-rekombi-nanttisoluista Rehemtullan ym. menetelmällä. Tämän kokeen 25 tulokset, jotka on raportoitu taulukossa 1, osoittavat selvästi, että tämä menetelmä ei tuota tyydyttävää rea-genssia.

Tekniikan tason yhteenveto

Hyödyllinen protrombiiniaikatesti täytyy suorittaa 30 yksivaiheisessa/yksiosaisessa muodossa, niin että trombo-plastiinireagenssi sisältää sekä kudostekijäpitoisen mem-braanivalmisteen, jolla on noin neutraali pH ja fysiologi-' nen ionivahvuus, ja kalsiumia noin 20 - 30 mM konsentraa- tiona. On olemassa useita menetelmiä, joilla voidaan tuot-35 taa tromboplastiineja eläinkudoksista: Quickin ym. (Biggs, 10 104220 1974; s. 663) klassinen asetoniuutto/kuivatusmenetelmä, suolauuttomenetelmä (Biggs, 1974, s. 664), ja detergent tiuut tomenetelmä (Hvatum & Prydz, 1966), joka on epäkäytännöllinen kaupallista sovellutusta varten. Tehdään 5 ero näillä menetelmillä tuotettujen tromboplastiinien ja "tromboplastiinireagenssien" välillä, joihin on lisätty kalsiumia ja joita voidaan näin ollen käyttää yksivaihei-sessa/yksiosaisessa menetelmässä. Ihmisen kudoksesta valmistettu tromboplastiini on hyödyllinen ja edullinen, kos-10 ka sellaisilla homologisilla tromboplastiineilla on li sääntynyttä herkkyyttä ihmisen hyytymistekijöille hetero-logisiin vastineisiinsa verrattuna. Tiedetään hyvin, että suoniston ulkoista alkuperää olevat viljellyt ihmissolut sisältävät ihmisen kudostekijää, ja että tromboplastiineja 15 voidaan tuottaa sellaisista soluista. Yksikään viljellyis tä ihmissoluista tuotettu tromboplastiini ei ole kuitenkaan ollut sovelias PT-testissä käytettäväksi. Täten tämän keksinnön tavoite on kehittää menetelmä, jolla voidaan tuottaa viljeltyjä, ei-rekombinanttisia ihmissoluja käyt-20 tämällä tromboplastiinireagenssi, joka on sovelias käytet täväksi yksivaiheisessa/yksiosaisessa protrombiiniaikates-tissä.

Keksinnön yhteenveto

Keksinnön mukaiselle menetelmälle tromboplas-: 25 tiinireagenssin valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Keksinnön mukaiselle trombiiniplastiinireagenssille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 5 esitetään. Keksinnön mukainen tromboplastiinireagenssi on sovelias käytettäväksi PT-tes-30 tissä, jossa i) määritys on yksivaiheinen/yksiosainen me- ’ netelmä; ii) normaali ihmisplasma hyytyy tyypillisesti noin 10-14 sekunnissa ja keskimääräinen normaali PT on noin 11 - 13 sekuntia; iii) tulokset ovat hyvin korrelaatiossa kansainvälisestä referenssitromboplastiinireagens-35 sista saatavien tulosten kanssa; ja iv) tromboplas- 11 104220 tiinireagenssi on stabiili nestemäisessä muodossa ainakin 8 tuntia 37 °C:n lämpötilassa ja 5 päivää 4 °C:n lämpötilassa.

Kuvioiden lyhyt kuvaus 5 Kuvio 1 havainnollistaa protrombiiniaikoja normaa lissa plasmassa useissa testatuissa tromboplastiineissa. Vertailun vuoksi mukana on kolme kaupallisesti saatavilla olevaa tromboplastiinia, jotka on valmistettu olennaisesti Quickin (1938) menetelmällä. Thr-S: Thromborel*-S (Behring-10 werke AG, Marburg, Saksa) valmistettiin ihmisen istukasta.

Spl-XLS ja Spl-XL: SimplastinR Excel-S ja SimplastinR Excel (Organon Teknika Corp., Durham, NC) valmistettiin kanin aivoista. Seuraavat ihmissolulinjat arvioitiin: H4 (ATCC HTB 148): ihmisen aivojen neurogliooma; U-87 MG (ATCC HTB 15 14): Ill-asteen ihmisen glioblastooma, astrosytooma; Hs683 (ATCC HTB 138): ihmisen gliooma; WI-38 (ATCC CCL 75): ihmisen keuhkosta; WI-38 VA13 alalinja 2RA (ATCC CCL 75.1): SV40-virustransformoidusta ihmisen keuhkosta; SK-LU-1 (ATCC HTB 57) : ihmisen keuhkon adenokarsinooma; Calu-1 20 (ATCC HTB-54): epidermaalinen Ill-asteen keuhkokarsinooma;

Hs888Lu (ATCC CCL 211): ihmisen keuhkosta; JAR (ATCC HTB 144): ihmisen istukan koriokarsinooma; WISH (ATCC CCL 25): ihmisen amnionkalvosta; FHC:TAC ja FHC:KEN: kaksi talon sisäistä ihmisen histiosytoomaa. Kahta talon sisäistä so-j' 25 lulinjaa lukuun ottamatta kaikki hankittiin ATCC:Itä,

Rockville, MD.

Kuvio 2 esittää havainnollisesti pistediagrammin ISI-määrityksestä, jonka suoritti RELAC, kansainvälinen referenssilaboratorio, joka sijaitsee Leidenissä, Alanko-30 maissa. Viljellyistä soluista peräisin oleva tromboplas- tiini kalibroitiin kansainvälistä referenssistandardia (BCT/253) vastaan ja ortogonaalinen pienimpien neliösum-' mien regressioanalyysi paljasti ISI:n olevan 1,09 (keski hajonta 0,019; N = 80), ja keskimääräinen normaali PT oli 35 12,6 sekuntia (keskihajonta 0,7 sekuntia; N = 20).

Kuvio 3 esittää havainnollisesti pistediagrammin \ ISI-määrityksestä, jonka keksijät suorittivat, ja jossa 12 104220 viljellyistä soluista peräisin olevaa tromboplastiinia (yhtenäinen viiva; täytetyt kolmiot) verrattiin kaupallisesti saatavilla olevaan ihmisen tromboplastiiniin (Throm-borelR-S; Behringwerke AG, Marburg, Saksa), joka valmistet-5 tiin ihmisen istukasta (katkoviiva; avoimet ympyrät). Tu lokset olivat hyvin korrelaatiossa (r = 0,995) ja täten osoittavat, että viljellyistä soluista peräisin oleva tromboplastiini soveltuu käytettäväksi PT-testissä.

Kuvio 4 havainnollistaa keskimääräistä PT:tä, joka 10 saatiin 6 normaalin plasmanäytteen (kukin määritettiin kaksoisnäytteenä) joukolle, tromboplastiiniproteiinikon-sentraation funktiona (määritetty tehostetulla BCA-prote-iinimäärityksellä, katso alla). Virherajajanat osoittavat keskihajontoja 6 näytteen keskimääräisestä PT:stä.

15 Edullisten suoritusmuotojen kuvaus

Menetelmä, jolla voidaan valmistaa tromboplastiinia viljellyistä ihmissoluista

Solujen kasvatus ja keräys

Ihmissolulinjaa, edullisesti sellaista jolla on 20 korkea pysyvä tromboplastiinin/kudostekijäaktiivisuuden ekspressio, kasvatetaan optimaalisissa soluviljelyolosuh-teissa korkeaan tai maksimaaliseen solutiheyteen ja kerätään tavanomaisin menetelmin. Suositellut soluviljelyolo-suhteet antaa ATCC, Rockville, MD, teoksessa ATCC Catalo-;· 25 gue of Cell Lines and Hvbridomas, 7. painos (1992), jotka liitetään tähän viitteenä. Koska nisäkässolulinjat vaativat yleensä kiinnittymisen kiinteään aineeseen maksimaalista kasvua varten, kerääminen sisältää tyypillisesti sen, että viljelmä käsitellään trypsiinillä ja/tai etylee-30 nidiamiinitetraetikkahapolla (EDTA) solujen suspensoimi- ’ seksi viljelyelatusaineeseen. On kuitenkin myös mahdollis ta eikä tämän keksinnön suoja-alan ulkopuolella, että so-lulinja, joka ekspressoi riittävästi kudostekijää, voitaisiin kasvattaa ja kerätä suspensioviljelmässä, ja näin 35 poistaa tarve irrottaa solut kiinnittymisalustasta. Solut konsentroitiin sakaksi sentrifugoimalla ja supernatantti- 13 104220 elatusalne heitettiin pois. Solut resuspendoitiin sitten puskuroituun isotoniseen suolaliuokseen (Dulbeccon fos-faattipuskuroitu suolaliuos; D-PBS; noin 3-5 tilavuuden ylimäärä D-PBS:ää solusakkaan) ja sentrifugoitiin uudes-5 taan jotta viljelyelatusaineen, trypsiinin tai EDTA:n jäljellä olevat pienet määrät saatiin poistettua. Solusakka resuspendoitiin D-PBS:ään ja sentrifugoitiin vielä kerran kuten yllä. Supernatantti heitettiin pois, solusakka resuspendoitiin 1-2 tilavuuden ylimäärään D-PBS:ää ja seos 10 jäädytettiin -20 - -70 eC:n lämpötilassa.

Solun hajotus ja uudelleen muodostaminen trombo-plastiinilaimennusaineessa Jäädytetyt solut sulatettiin, D-PBS lisättiin (noin 1.5 ml per 0,1 g solujen märkäpaino) ja ajettiin sakaksi 15 sentrifugoimalla noin 10 000 g:ssä 30 minuutin ajan. Solut resuspendoitiin hypotoniseen puskuriliuokseen, joka oli 10 mM NaHC03:n, 2 mM NaEDTArn ja 0,5 mg/ml naudan seerumi-albumiinin (BSA) suhteen, konsentraatioksi joka oli noin 1.5 ml puskuria/0,1 g solujen märkäpaino. Suspensiota se-20 koitettiin läpikotaisin ja sentrifugoitiin 10 000 g:ssä kuten yllä. Solut resuspendoitiin uudestaan hypotoniseen puskuriliuokseen, sekoitettiin ja sentrifugoitiin 10 000 g:ssä kuten yllä. Vaikkakin hypotoninen hajotus on edullisin menetelmämme, voidaan käyttää mitä tahansa fysikaali-Γ 25 siä keinoja solujen hajottamiseksi.

Lopullinen solusakka suspensoitiin tromboplastiini-laimennusaineeseen, joka oli l,5-%:inen polyetyleenigly-kolin 1450, 103 mM NaCl:n, 30 mM Ca-glukonaatin, 0,025 % NaN3:n, 0,25 mg/ml BSA:n ja 10 mM imidatsolin (pH 7,2) suh-30 teen, konsentraatioksi joka oli noin 1 ml puskuria per - ·. 0,05 g solujen märkäpaino.

t

Keksinnön suoja-alan sisällä ajatellaan, että tämän ' laimennusaineen kunkin komponentin likimääräinen konsent- raatio voi vaihdella, niin kauan kuin reagenssi tuottaa 35 yksiosaisen protrombiiniajan noin 10 - 15 sekunnissa, ja 1 i 14 104220 keskimääräinen normaali protrombiiniaika on noin 11 - 13 sekuntia, kun se lisätään normaaliin sitraattiplasmaan noin 2:1 tilavuussuhteessa, reagenssi plasmaan. Variaation edullinen alue on plus tai miinus 50 %, mutta rajoitus on 5 vain aktiivisuus suhteessa protrombiiniaikaan, kuten yllä on esitetty. Lisäksi Ca-glukonaatti voidaan korvata millä tahansa liukoisella kalsiumsuolalla ja NaCl voidaan korvata millä tahansa muulla suolalla, joka antaa vertailukelpoisen ionivahvuuden. Laimennusaineen koostumus voi vaih-10 della niin kauan kuin se edustaa arvioitua fysiologista ionivahvuutta noin 0,1 - 0,25 alueella ja arvioitu pH-alue on noin 6,8 - 7,8. BSA voidaan korvata myös toisella albumiinilla, kuten ihmisen seerumialbumiinilla (HSA). Kaikki nämä variaatiot otetaan keksinnössä lukuun.

15 Proteiinikonsentraatio määritettiin tehostetulla BCA-proteiinimäärityksellä (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) ja tromboplastiinin lopullinen konsentraatio säädettiin arvoon noin 0,5 - 1-2 mg/ml.

Ihmisen solulinjojen vertailu tromboplastiinin 20 tuottamiseksi

Yllä kuvatun menetelmän yleinen sovellettavuus ihmisen tromboplastiinin tuottamiseksi on osoitettu valmistamalla tromboplastiineja useista ihmissolulinjöistä. Kuten kuviosta 1 on ilmeistä, kolmella kaupallisella trombo-25 plastiinilla on noin 12 - 14 sekunnin protrombiiniajat. Tromboplastiineilla, jotka valmistettiin kuudesta testatusta solulinjasta (U-87 MG, Hs683, WI-38, WI-38 VA13,

Calu-1 ja Hs888Lu), oli normaalit hyytymisajat alueella 10 - 14 sekuntia ja näin ollen täyttävät tämän soveliaan 30 ihmisen tromboplastiinin kriteerin. Tämä havainnollistaa :1 menetelmän yleistä sovellutusta ja hyödyllisyyttä. Jäljel- läolevilla solulinjoilla (H4, SK-LU-1, JAR, WISH, FHC:TAC ja FHC:KEN) oli pitemmät hyytymisajat, mikä oletettavasti heijastaa alempaa kudostekijäekspression tasoa. Nämä jäi- 15 104220 jemmät tromboplastilnit eivät sovellu PT-testissä käytettäväksi .

Tromboplastiinireagenssin valmistus viljellyissä soluissa alkuperäisellä Quickin (1938) menetelmäl-5 lä: soveltumattomuus protrombiiniaikatestiä varten

Yhtä kuviossa 1 kuvatuista solulinjoista, WI-38 VA13 alalinja 2RA, käytettiin raaka-aineena valmistettaessa tromboplastiini Quickin (1938) alkuperäisen menetelmän mukaisesti, joka sisälsi vaiheet, joissa tehtiin asetoni-10 uutto, kuivatus ja uudelleen koostaminen suolan vesiliuoksessa, kuten yllä on kuvattu. Tämä tromboplastiini tuotti 28,9 sekunnin hyytymisajan normaalissa yhdistetyssä plasmassa (joka tässä määritellään ihmisen plasmavalmisteeksi, joka sisältää sitraatilla antikoaguloitua plasmaa 20 ter-15 veeltä luovuttajalta). Kuten yllä on mainittu, PT-testissä käytettäväksi soveltuvan tromboplastiinin täytyy hyydyttää normaali plasma noin 10 - 14 sekunnissa; näin ollen tämä tromboplastiini ei ollut sovelias PT-testissä käytettäväksi .

20 Viljellyistä soluista peräisin olevan tromboplas tiinin vertaaminen kansainväliseen referenssitrom-boplastiiniin

Yksi kuviossa 1 kuvatuista solulinjoista, WI-38 VA13 alalinja 2RA, valittiin ihmisen tromboplastiinin suu-25 rimittaista tuottamista varten. Tämä tromboplastiini tuotettiin keräys-, solunhajotus- ja uudelleenkoostamismene-telmien mukaisesti, jotka on kuvattu yllä tätä keksintöä varten. Kun RELAC, kansainvälinen referenssilaboratorio, kalibroi niitä ihmisen aivojen kansainvälisen referenssi-30 tromboplastiinia (BCT/253) vastaan käyttämällä vakiintu-'neita ja yleisesti hyväksyttyjä menetelmiä, saatiin kuvassa 2 esitetyt tulokset. Yhteenvetona näistä tuloksista, jotka saatiin 20 normaalista ja 60 pitkän aikaa antikoagu-loiduista plasmanäytteistä, viljellyistä soluista tuote-35 tulla tromboplastiinilla oli normaali plasman hyytymisaika 16 104220 12,6 ±0,7 sekuntia, ja ISI 1,09 ± 0,019 (keskiarvo ± keskihajonta). Täten tämä ihmisen tromboplastiini vastaa yllä kuvattuja määritelmiä tromboplastiinille, joka soveltuu PT-testissä käytettäväksi.

5 Viljellyistä soluista peräisin olevan tromboplas- tiini vertailu kaupallisesti saatavilla olevaan ihmisen tromboplastiiniin ISI-määritysmenetelmää käytettiin verrattaessa viljellyistä soluista peräisin olevaa, keksinnön mukaista 10 tromboplastiinia kaupallisesti saatavilla olevaan ihmisen tromboplastiiniin (ThromborelR-S; Behringwerke AG, Marburg, Saksa), joka oli valmistettu ihmisen istukasta. Tässä esimerkissä plasmanäytteet koostuivat vasta jäädytetystä normaalista plasmasta, kahdesta lyofilisoidusta epänormaalis-15 ta plasmavalmisteesta (Veirfy Abnormal I; Verify Abnormal II; Organon Teknika Corp., Durham., NC) ja kolmesta plas-manäytteestä, jotka olivat peräisin potilailta, jotka saivat pitkäaikaista suun kautta annettavaa antikoagulaati-ota. Tulokset (kuvio 3) olivat hyvin korrelaatiossa (r -20 0,995), mikä täten taas osoitti viljellyistä soluista pe räisin olevan tromboplastiinin soveltuvuuden PT-testissä käytettäväksi.

Tämän keksinnön menetelmän mukaisesti valmistetun tromboplastiinireagenssin vertailu niiden trombo-25 plastiinireagenssien kanssa, jotka on valmistettu asetoniuutto/vedenpoisto- tai suolauuttomenetelmil-lä, jotka on kuvattu Biggsin artikkelissa (1976), s. 663- 664, ja Rehemtullan ym. (1991) jäädytys-sulatus -soluhajotusmenetelmällä 30 Yllä viitatut menetelmät, joihin sisältyy kudoksen asetoni- tai suolauutto, tai viljeltyjen solujen sulatus-jäädytys -hajotus, edustavat lähestymistapoja, joilla tekniikan tasolla tuotetaan tromboplastiineja. Tromboplastiini tuotettiin viljellyistä, ei-rekombinanteista, ihmisen 35 keuhkosoluista käyttämällä jokaista näistä kolmesta mene- 104220 17 telmästä. Hyväksyttyjen menetelmien (Biggs, 1976; s. 677) mukaisesti kukin tromboplastiini tehtiin 25 mM:ksi kal-siumkloridin suhteen, jotta saatiin aikaan yllä kuvatun kaltainen tromboplastiinireagenssi. PT-testituloksia trom-5 boplastiinireagensseille, jotka valmistettiin kolmen tekniikan tason menetelmän mukaisesti, verrattiin tromboplas-tiinireagenssin tuloksien kanssa, joka oli valmistettu tämän keksinnön mukaisella menetelmällä.

Kukin neljästä tromboplastiinireagenssista arvioi-10 tiin proteiinikonsentraatioissa (määritetty yllä viitatulla menetelmällä), jotka vaihtelivat välillä 0,5 - 3,0 mg/ml. Protrombiiniaika kussakin proteiinikonsentraatiossa esitetään taulukossa 1 ja kuviossa 4. Tulokset osoittavat, että tromboplastiinit, jotka on valmistettu menetelmillä, 15 jotka on paljastettu tekniikan tasolla, eivät olisi soveliaita PT-testissä käytettäviksi, koska normaalin plasman PT-tulokset ovat yläpuolella hyväksyttävän alueen (10 - 14 sekuntia). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 35

Taulukko 1 2

Eri menetelmillä valmistettujen tromboplastiinien vertailu 3

Protrombiiniajat normaalille yhdistetylle plasmalle 4

Tromboplastiinin Hyytymisaika (sekuntia) 5 proteiinikonsen- Tämä Sulatus- Asetoni- Suola- 6 traatio (mg/ml) keksintö jäädytys1 uutto2 uutto3 7 0,5 12,9 26,9 18,8 17,9 8 1.0 12,2 24,5 18,0 18,1 9 1,5 11,5 23,3 17,5 16,9 10 2.0 11,2 22,7 16,3 16,6 11 3,0 10,9 21,0 15,4 15,3 • < 1Rahamtulla ym. (1991) 2Biggs ym., (1976; s. 663) 3Biggs ym., (1976; s. 664) 18 104220

Taulukosta 1 huomataan, että määritetyn proteiini-konsentraation rajoissa kaikki protrombiiniajat trombo-plastiinireagenssille, joka on valmistettu tämän keksinnön menetelmän mukaisesti, ovat alle 13 sekuntia, ja näin ol-5 Ien tämä tromboplastiinireagenssi soveltuu käytettäväksi protrombiiniaikatestissä. Yksikään protrombiiniaika niiden tromboplastiinien tapauksessa, jotka on valmistettu samoista viljellyistä ihmisen keuhkosoluista tekniikan tasolla paljastettujen menetelmien mukaisesti, ei ollut alle 10 14 sekuntia. Täten nämä tromboplastiinireagenssit eivät olisi soveliaita PT-testissä käytettäväksi. Johtopäätös tästä kokeesta on, että tekniikan taso ei paljasta soveliasta menetelmää, jolla voitaisiin tuottaa sellainen tromboplastiinireagenssi viljellyistä ihmissoluista, joka on 15 myös sovelias PT-testissä käytettäväksi.

Tätä johtopäätöstä tukevat tulokset toisesta kokeesta, jossa yllä kuvatut neljä tromboplastiinireagenssia arvioitiin PT-testissä 6 normaalin plasmanäytteen joukkoa vastaan. Tässä kokeessa keskimääräinen normaali PT saatiin 20 kullekin tromboplastiinille kussakin 5:ssä proteiinikon- sentraatiossa. Kuten yllä on huomautettu, keskimääräinen normaali PT hyödylliselle tromboplastiinireagenssille on noin 11 - 13 sekuntia. Tämän keksinnön menetelmän mukaisesti valmistetun tromboplastiinin keskimääräistä normaa-25 lia PT:tä verrattiin vastaaviin arvoihin 3 tromboplastii-nireagenssin tapauksessa, jotka oli valmistettu yllä kuvattujen kolmen tekniikan tason menetelmän mukaisesti. Tulokset (kuvio 4) paljastivat, että i) kussakin proteii-nikonsentraatiossa tämän keksinnön mukaisesti valmistetul-30 la tromboplastiinireagenssilla oli merkitsevästi alhaisempi PT (p < 0,001, Studentin t-testi) kuin vastineilla, f jotka valmistettiin muilla menetelmillä; ja ii) tämän keksinnön menetelmän mukaisesti valmistetun tromboplastiini-reagenssin normaali PT oli välillä 11,6 - 13,7 sekuntia, 35 kun taas se oli kolmelle muulle tromboplastiinille välillä 19 104220 14,3 sekuntia korkeimmassa proteilnlkonsentraatiossa (3 mg/ml) 45 sekuntia matallmmassa proteiinikonsentraati-ossa (0,5 mg/ml). Ei ole mahdotonta, että tekniikan tason menetelmillä valmistettu tromboplastiinireagenssi, joka on 5 formuloitu proteiinikonsentraatioissa (BCA-proteiinimää- ritysmenetelmä), joka ylittää 3 mg/ml, voisi olla sovelias PT-testissä käytettäväksi; sellainen formulaatio olisi kuitenkin tämän keksinnön suoja-alan ja patenttivaatimusten ulkopuolella. Yhteenvetona, tämä keksintö havainnol-10 listaa sen, että tromboplastiinin konsentraatio-alueella 0,5 - 3,0 mg/ml tämän keksinnön menetelmän mukaisesti formuloidulla tromboplastiinireagenssilla on merkitsevästi (p < 0,001) lyhyemmät protrombiiniajat kuin tromboplastii-nireagensseilla, jotka on formuloitu menetelmien mukaises-15 ti, jotka on paljastettu tekniikan tasolla. Tämä lyhyempi protrombiiniaika mahdollistaa uuden ja hyödyllisen trombo-plastiinireagenssin keksimisen viljellyistä soluista.

viljellyistä soluista peräisin olevan tromboplas-tiinin stabiilisuus 20 Yllä kuvatulla tavalla formuloitu, viljellyistä ihmissoluista peräisin oleva tromboplastiini on stabiili 1-3 päivää 37 °C:n lämpötilassa ja ainakin 3 kuukautta nestemäisessä muodossa 4 °C:n lämpötilassa. Stabiilisuus arvioitiin mittaamalla normaalien ja epänormaalien plasma-• 25 näytteiden hyytymisajat ilmoitetuin väliajoin. Tämän trom- boplastiinireagenssin stabiilisuus näissä olosuhteissa tukee johtopäätöstä, että se on sovelias käytettäväksi PT-testissä.

20 104220

Viitteet

Andoh, K., Sadakata, H., Uchiyama, T., Narahara, N., 5 Tanaka, H., Kobayashi, N. ja Maekawa, T. (1990) One-stage method for assay of tissue factor activity of leukemic cell with special reference to disseminated intravascular coagulation. Amer. J. Clin. Pathol. 93:679 - 684.

Biggs, R. (1976) "Human Blood Coagulation, Haemostasis and 10 Thrombosis" 2. laitos. Blackwell Scientific Publications, Lontoo.

Drake, T.A., Morrissey, J.H. ja Edgington, T.S. (1989) Selective cellular expression of tissue factor in human tissues. Am. J. of Pathol. 134:1087 - 1097 15 Hirsch, J., Poller, L., Deykin, D., Levine, M. ja Dalen, J.E. (1989) Optimal therapeutic range for oral anticoagulants. Chest 95:5S - 11S

Hvatum, M. , Prydz, H. (1966) Studies on tissue thromboplastin. I. Solubilization with sodium deoxycholate. Bio-20 chim. Biophys. Acta 130:92-101.

Kirkwood, T.B.L. (1983) Calibration of reference thromboplastins and standardisation of the prothrombin time ratio. Thromb. Hemostas. 49:238 - 244.

Levy, G.A. ja Edgington, T.S. (1980) Lymphocyte cooper-25 ation is required for amplification of macrophage procoagulant activity. J. Exp. Med. 151:1232 - 1244. Naito, S., Inoue, S., Kinjo, M. ja Tanaka, K. (1983) Thromboplastic and fibrinolytic activities of cultured human gastric cancer cell lines. Gann 74:240 - 247 30 Nemerson, Y. (1988) Tissue factor and hemostasis. Blood 71: l· - 8

Nemerson, Y., Bach, R. (1982) Tissue factor revisited. Hemostas. Thromb. 6:237 - 261.

Quick, A.J., Stanley-Brown, M., Bancroft, F.W. (1935) A 35 study of the coagulation defect in hemophilia and in jaundice. Am. J. Med. Sci. 190:501 - 551 21 104220

Quick, A.J. (1938) The nature of bleeding in jaundice. J. Am. Med. Assoc. 110:1658 - 1662 5 Rapaport, S.I. (1991) Regulation of the tissue factor pathway. Ann. NY Acad. Sei. 614:63 - 75

Rehemtulla, A., Pepe, M., Edgington, T.S. (1991) High level expression of recombinant human tissue factor in Chinese hamster ovary cells as a human thromboplastin. 10 Thromb. Haemostas. 65:521 - 527.

Silverberg, J.M., Gordon, S. ja Zucker, S. (1989) Identification of tissue factor in two human pancreatic cancer cell lines. Cancer Res. 4(3:5443 - 5447

Spicer, E.K., Horton, R., Bloem, L., Bach, R., Williams, 15 K.R., Guha, A., Kraus, J., Lin, T-C., Nemerson, Y. and Königsberg, W.H. (1987) Isolation of cDNA clones coding for human tissue factor: primary structure of the protein and cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5148 - 5152.

Tsao, B.P., Fair, D.S., Curtiss, L.K. ja Edgington, T.S. 20 (1984) Monocytes can be induced by lipopolysaccharide- triggered T lymphocytes to express functional factor VII/VIIa protease activity. J. Exp. Med. 159:1042 - 1057. van den Besselaar, A.M.H.P. ja Bertina, R.M. (1991) Multicenter calibration of the second reference material for 25 thromboplastin, rabbit, plain, coded CRM 149R. Thromb. Haemostas. 65:263 - 267.

w

Claims (7)

104220

1. Menetelmä, jolla voidaan valmistaa tromboplas-tiinireagenssi viljellyistä ihmissoluista, tunnettu 5 siitä, että solut pestään isotonisella vesipohjaisella suolaliuoksella, solut hajotetaan puskuriliuoksessa, joka sisältää EDTA:ta ja albumiinia, membraanipitoinen materiaali eristetään hajotetuista soluista ja eristetty membraanipitoinen materiaali resuspendoidaan vesipohjaiseen 10 laimennusaineeseen, jonka arvioitu fysiologinen ionivah-vuus on välillä 0,1 - 0,25.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u nn e t t u siitä, että solut hajotetaan hypotonisella shokilla.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u nn e t t u siitä, että eristetty membraanipitoinen materiaali resuspendoidaan laimennusaineeseen, joka sisältää polyetyleeniglykolia, kalsiumsuoloja, seerumialbumii-nia ja imidatsolia.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, t u nn e t t u siitä, että laimennusaine sisältää polyetyleeniglykolia noin 0,5 - 2,5 paino-%, NaCl:ia noin 50 - 150 mM konsentraationa, Ca-glukonaattia noin 10 - 50 mM konsentraationa, NaN3:a noin 0,01 -0,1 paino-%:n konsen- 25 traationa, naudan seerumialbumiinia noin 0,1 - 10 mg/ml konsentraationa, ja imidatsolia noin 5 - 75 mM konsentraationa, ja jossa laimennusaineen pH on alueella 6,8 - 7,8.

5. Tromboplastiinireagenssi, tunnettu siitä, että se on valmistettu niin, että viljellyt ihmis-30 solut pestään isotonisella vesipohjaisella suolaliuoksella, solut hajotetaan fysikaalisesti puskuriliuoksessa, joka sisältää EDTA:ta ja albumiinia, membraanipitoinen materiaali eristetään hajotetuista soluista ja eristetty membraanipitoinen materiaali resuspendoidaan vesipohjaiseen 35 laimennusaineeseen, jonka arvioitu fysiologinen ioninvah-vuus on välillä 0,1 - 0,25, ja jonka mainitun reagenssin 104220 tromboplastiiniproteiinikonsentraatio on, lisätty albumiini poislukien, noin alueella 0,5 - 3,0 mg/ml.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen tromboplastiini-reagenssi, tunnettu siitä, että mainittu trombo-5 plastiinireagenssi tuottaa yksiosaisen protrombiiniajan noin 10 - 15 sekunnissa, ja keskimääräinen normaali pro-trombiiniaika on noin 11 - 13 sekuntia, kun se lisätään normaaliin sitraattiplasmaan tilavuussuhteena noin 2:1, reagenssi plasmaan.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen tromboplastiini- reagenssi, tunnettu siitä, että tromboplastiini-reagenssi on stabiili ainakin 8 tuntia 37 C:n lämpötilassa ja ainakin 5 päivää 4 C:n lämpötilassa. 24 104220