ES2973017T3 - Derivado del glucagón y una composición que comprende un conjugado de acción prolongada del mismo - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a un derivado de glucagón, un conjugado de acción prolongada del derivado de glucagón y un uso del mismo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Derivado del glucagón y una composición que comprende un conjugado de acción prolongada del mismo
Campo Técnico
La presente invención se refiere a un derivado del glucagón, un conjugado de acción prolongada del derivado del glucagón y un uso del mismo.
Técnica anterior
Debido al reciente crecimiento económico y cambios en los hábitos dietéticos, etc., la incidencia de enfermedades asociadas al síndrome metabólico que incluyen diversas enfermedades tales como obesidad, hiperlipidemia, hipertensión, arteriosclerosis, hiperinsulinemia, diabetes y enfermedades hepáticas ha aumentado rápidamente. Estas enfermedades pueden ocurrir independientemente, pero en general ocurren en relación estrecha entre sí, acompañándose de diversos síntomas.
En particular, según la Organización Mundial de la Salud (OMS), más de mil millones de adultos tienen sobrepeso en todo el mundo, entre ellos más de 3 millones son clínicamente obesos y 250.000 personas mueren cada año en Europa y más de 2,5 millones de personas en todo el mundo mueren cada año debido a enfermedades relacionadas con el sobrepeso.
El peso excesivo y la obesidad son responsables de aumentar la presión arterial y los niveles de colesterol y causar o empeorar diversas enfermedades, tales como enfermedades cardíacas, diabetes, artritis, etc. Además, el problema de la obesidad también se está convirtiendo en una causa importante en la mayor incidencia de arteriosclerosis, hipertensión, hiperlipidemia, o enfermedades cardíacas en niños o adolescentes, así como en adultos.
Aunque la obesidad es una afección grave que causa diversas enfermedades en todo el mundo como se ha descrito anteriormente, se cree que se supera por un esfuerzo individual, y también se cree que los pacientes obesos carecen de autocontrol. Sin embargo, la obesidad no es fácil de tratar, porque es una enfermedad compleja asociada con los mecanismos de control del apetito y el metabolismo energético. En consecuencia, el tratamiento de la obesidad requiere no solo los esfuerzos de los pacientes obesos, sino también un método capaz de tratar mecanismos anormales asociados con el control del apetito y el metabolismo energético. Por lo tanto, se han realizado muchos esfuerzos para desarrollar fármacos para tratar los mecanismos anormales.
Como resultado de estos esfuerzos, se han desarrollado fármacos tales como Rimonabant® (Sanofi-Aventis), Sibutramin® (Abbott), Contrave® (Takeda), Orlistat® (Roche), etc., pero tienen las desventajas de efectos adversos graves o efectos contra la obesidad muy débiles. Por ejemplo, según un informe, Rimonabant ® muestra como efecto secundario trastornos del sistema nervioso central, Sibutramina® y Contrave® muestran efectos secundarios cardiovasculares y Orlistat® muestra solo aproximadamente 4 kg de pérdida de peso cuando se toman durante un año. En consecuencia, no hay agentes terapéuticos para la obesidad que se puedan prescribir de forma segura para pacientes obesos.
Se han realizado muchos estudios extensos para desarrollar nuevos agentes terapéuticos para la obesidad que puedan resolver los problemas de los fármacos convencionales contra la obesidad. Recientemente, los derivados de glucagón han recibido mucha atención. El glucagón es producido por el páncreas cuando los niveles de glucosa en la sangre descienden como resultado de otros medicamentos o enfermedades, deficiencias hormonales o enzimáticas. El glucagón envía una señal para la degradación de glucógeno en el hígado y una liberación de glucosa posterior y desempeña un papel en el aumento de los niveles de glucosa en sangre a un intervalo normal. Además del efecto de aumentar el nivel de glucosa en sangre, el glucagón suprime el apetito y activa la lipasa sensible a hormonas de los adipocitos para facilitar la lipólisis, mostrando de este modo un efecto contra la obesidad. Sin embargo, el uso de glucagón como un agente terapéutico se ha limitado porque tiene una baja solubilidad y precipita a un pH neutro.
En consecuencia, el glucagón con propiedades mejoradas solo puede usarse eficazmente para el tratamiento de la hipoglucemia grave, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), dislipidemia, etc., debido a sus actividades de descomposición de grasas y p-oxidación en el hígado.
Uno de los derivados del glucagón, el péptido similar al glucagón-1 (GLP-1), está en desarrollo como un agente terapéuti
La exendina-4, preparada a partir de veneno de lagarto y que tiene una homología de aminoácidos de aproximadamente el 50 % con GLP-1, también se ha descrito que activa el receptor de GLP-1, lo que mejora de esta manera la hiperglucemia en pacientes con diabetes (J Biol Chem. 15 de abril de 1992; 267 (11): 7402-5). Sin embargo, se ha descrito que los fármacos contra la obesidad que incluyen GLP-1 muestran efectos secundarios tales como vómitos y náuseas.
Por lo tanto, como alternativa al GLP-1, se ha prestado mucha atención a la oxintomodulina, que puede unirse a ambos receptores de los dos péptidos, GLP-1 y glucagón. La oxintomodulina es un péptido preparado a partir de un precursor de glucagón, preglucagón y tiene las funciones de inhibir la ingesta de alimento y mejorar la saciedad del GLP-1 y tiene actividad lipolítica como el glucagón aumentando, por lo tanto, su potencia en la terapia contra la obesidad.
Sin embargo, la oxintomodulina o sus derivados tienen un grave inconveniente porque se debe administrar diariamente una cantidad en exceso del fármaco porque tienen una baja eficacia y una semividain vivocorta.
De forma adicional, cuando las actividades del GLP-1 y del glucagón están presentes en un solo péptido, la relación de actividad de las mismas se fija y, por lo tanto, es difícil usar un agonista doble con varias relaciones. En consecuencia, una terapia combinada capaz de usar diversas relaciones de actividad mediante el ajuste del contenido de GLP-1 y glucagón puede ser más eficaz. Sin embargo, para la terapia combinada, se requiere mejorar las características físicas del glucagón, que se agrega a un pH neutro y precipita con el tiempo mostrando, por lo tanto, una solubilidad deficiente.
El documento EP 3241841 A1 pertenece al estado de la técnica en los términos del Artículo 54(3) EPC y describe péptidos derivados del glucagón y su uso en la prevención y el tratamiento de la hipoglucemia y la obesidad.
El documento WO 2012/169798 A2 describe agonistas del receptor de GLP-1 para usar en el tratamiento de la obesidad, usados junto con otros compuestos que tienen una actividad terapéutica contra el síndrome metabólico.
El documento WO 2011/075393 A2 describe derivados del glucagón que son los co-agonistas del receptor de glucagón/GLP-1 y los conjugados relacionados, las composiciones farmacéuticas y los usos de los mismos.
El documento WO 2014/073842 A1 describe un conjugado de oxintomodulina-Fc de inmunoglobulina de acción prolongada.
En estas circunstancias, los presentes inventores han desarrollado derivados del glucagón con modificaciones parciales de la secuencia de aminoácidos del glucagón para mejorar los efectos terapéuticos del glucagón sobre la hipoglucemia y la obesidad al mejorar las propiedades físicas del glucagón, y han descubierto que estos derivados del glucagón, debido a los valores de pI alterados que son diferentes de los del glucagón natural, tienen una solubilidad mejorada y una mayor estabilidad a un pH neutro y han confirmado que el derivado del glucagón desarrollado activa sus receptores en un ensayo invitrocompletando de este modo la presente invención.
Descripción de la invención
Problema técnico
Un objetivo de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica para tratar o prevenir el síndrome metabólico, que contiene
i) un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o 37 y ii) al menos un compuesto o material que tiene una actividad terapéutica para el péptido insulinotrópico del síndrome metabólico, en donde el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o 37 está en forma de un conjugado de acción prolongada, al que se une un material biocompatible capaz de aumentar la semivida invivodel péptido, y el péptido insulinotrópico está en forma de un conjugadoin vivode acción prolongada, al que se une un material biocompatible capaz de aumentar la semivida del péptido insulinotrópico.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un derivado del glucagón novedoso que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37.
Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar un polinucleótido aislado que codifica el derivado del glucagón, un vector que incluye el polinucleótido y una célula aislada que incluye el polinucleótido o el vector.
Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar un conjugado aislado en donde el derivado del glucagón y un material biocompatible que es capaz de aumentar la semivida invivoestán unidos.
Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar una composición que contiene el derivado del glucagón y el conjugado aislado.
Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica para tratar o prevenir la hipoglucemia o el síndrome metabólico que contiene el derivado del glucagón o el conjugado aislado.
Solución al problema
La composición farmacéutica de la invención se define en las reivindicaciones.
En una realización específica, el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o 37 se caracteriza porque tiene un valor de pI diferente al del glucagón natural, por ejemplo, un pI de 6,5 o menos, o un pI de 7,0 o superior.
En una realización específica, el péptido insulinotrópico se caracteriza porque se selecciona del grupo que consiste en GLP-1, exendina-3, exendina-4, un agonista de los mismos, un derivado de los mismos, un fragmento de los mismos, una variante de los mismos y una combinación de los mismos.
En otra realización específica más, el péptido insulinotrópico se caracteriza porque es un derivado del péptido insulinotrópico en donde el resto de histidina N-terminal del péptido insulinotrópico está sustituido con uno seleccionado del grupo que consiste en desamino-histidilo, N-dimetil-histidilo, p-hidroxi imidazopropionilo, 4-imidazoacetilo y p-carboxi imidazopropionilo.
En otra realización específica más, el péptido insulinotrópico se caracteriza porque se selecciona del grupo que consiste en una exendina-4 natural; un derivado de la exendina-4 en donde el grupo amina N-terminal de la exendina-4 está eliminado; un derivado de la exendina-4 en donde el grupo amina N-terminal de la exendina-4 está sustituido con un grupo hidroxilo; un derivado de la exendina-4 en donde el grupo amina N-terminal de la exendina-4 está modificado con un grupo dimetilo; un derivado de la exendina-4 en donde el carbono a del 1.er aminoácido de la exendina-4, histidina, está eliminado; un derivado de la exendina-4 en donde el 12.° aminoácido de la exendina-4, lisina, está sustituido con serina y un derivado de la exendina-4 en donde el 12.° aminoácido de la exendina-4, lisina, está sustituido con arginina.
En otra realización específica más, el material biocompatible se caracteriza porque se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol, ácido graso, colesterol, albúmina y un fragmento de la misma, un material de unión a la albúmina, un polímero de unidades repetitivas de una secuencia de aminoácidos particular, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un material de unión a FcRn, tejido conjuntivoin vivoo un derivado del mismo, un nucleótido, fibronectina, transferrina, un sacárido y un polímero.
En otra realización específica más, el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o 37 y el péptido insulinotrópico se caracteriza porque están unidos respectivamente a un material biocompatible por un enlazador seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, un copolímero de etilenglicolpropilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol polivinílico, un polisacárido, dextrano, polivinil etil éter, un polímero biodegradable tal como ácido poliláctico (PLA) y ácido poliláctico-glicólico (PLGA), polímero lipídico, quitina, ácido hialurónico, ácido graso, un polímero, un compuesto de bajo peso molecular, un nucleótido y una combinación de los mismos.
En otra realización específica más, el material biocompatible se caracteriza porque es un material de unión a FcRn, y el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos o SEQ ID NO: 20 o 31 1 y el péptido insulinotrópico se unen respectivamente a un material biocompatible mediante un enlazador peptídico o un enlazador no peptídico seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, un copolímero de etilenglicol-propilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol polivinílico, un polisacárido, polivinil etil éter, dextrano, un polímero biodegradable tal como ácido poliláctico (PLA) y ácido poliláctico-glicólico (PLGA), polímero lipídico, quitina, ácido hialurónico y una combinación de los mismos.
En otra realización específica más, el material de unión a FcRn se caracteriza porque es un polipéptido que incluye una región Fc de inmunoglobulina.
En otra realización específica más, la región Fc de inmunoglobulina se caracteriza porque está aglicosilada.
En otra realización específica más, la región Fc de inmunoglobulina se caracteriza porque se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un dominio CH1, un dominio CH2, un dominio CH3 y un dominio CH4;
(b) un dominio CH1 y un dominio CH2;
(c) un dominio CH1 y un dominio CH3;
(d) un dominio CH2 y un dominio CH3;
(e) una combinación entre uno o dos o más dominios entre un dominio CH1, un dominio CH2, un dominio CH3 y un dominio CH4 y una región bisagra de inmunoglobulina o una parte de la región bisagra; y
(f) un dímero entre cada dominio de la región constante de la cadena pesada y la región constante de la cadena ligera.
En otra realización específica más, el polipéptido que incluye la región Fc de inmunoglobulina está en forma de un dímero.
En otra realización específica más, la región Fc de inmunoglobulina se caracteriza porque es un derivado de Fc natural en donde se elimina la región capaz de formar un enlace disulfuro, un derivado de Fc natural en donde una parte de los aminoácidos en el extremo N se elimina, un derivado de Fc natural en donde se añade una metionina al extremo N, un derivado de Fc natural en donde se elimina un sitio de unión al complemento, o un derivado de Fc natural en donde se elimina un sitio de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC).
En otra realización específica más, la región Fc de inmunoglobulina se caracteriza porque es una región Fc derivada de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en IgG, IgA, IgD, IgE e IgM.
En otra realización específica más, la región Fc de inmunoglobulina se caracteriza porque es una región Fc de IgG4.
En otra realización específica más, la región Fc de inmunoglobulina se caracteriza porque es una región Fc aglicosilada derivada de la IgG4 humana.
En otra realización específica más, el enlazador no peptídico se caracteriza porque está unido al residuo de cisteína de un péptido que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o 37.
En otra realización específica más, el enlazador no peptídico se caracteriza porque ambos extremos del enlazador no peptídico están unidos respectivamente a un grupo amina o un grupo tiol de un péptido, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o 37 o un péptido insulinotrópico, y un material biocompatible.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un derivado del glucagón novedoso que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica el derivado del glucagón, un vector que incluye el polinucleótido y una célula aislada que incluye el polinucleótido o el vector.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona un conjugado aislado en donde un derivado del glucagón y un material biocompatible capaz de aumentar la semivida¡n vivoestán unidos.
En una realización específica, el material biocompatible se caracteriza porque el material biocompatible se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol, ácido graso, colesterol, albúmina y un fragmento de la misma, un material de unión a la albúmina, un polímero de unidades repetitivas de una secuencia de aminoácidos particular, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un material de unión a FcRn, tejido conjuntivoin vivoo un derivado del mismo, un nucleótido, fibronectina, transferrina, un sacárido y un polímero.
En una realización específica, el péptido aislado se caracteriza porque está unido a un material biocompatible por un enlazador seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, un copolímero de etilenglicolpropilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol polivinílico, un polisacárido, dextrano, polivinil etil éter, un polímero biodegradable tal como ácido poliláctico (PLA) y ácido poliláctico-glicólico (PLGA), polímero lipídico, quitina, ácido hialurónico, ácido graso, un polímero, un compuesto de bajo peso molecular, un nucleótido y una combinación de los mismos.
En una realización específica, el material biocompatible se caracteriza porque es un material de unión a FcRn, y
el péptido aislado y el péptido insulinotrópico están unidos respectivamente a un material biocompatible por un enlazador peptídico o un enlazador no peptídico seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, un copolímero de etilenglicol-propilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol polivinílico, un polisacárido, polivinil etil éter, dextrano, un polímero biodegradable tal como ácido poliláctico (PLA) o ácido poliláctico-glicólico (PLGA), polímero lipídico, quitina, ácido hialurónico y una combinación de los mismos.
En una realización específica, el material de unión a FcRn se caracteriza porque es un polipéptido que incluye una región Fc de inmunoglobulina.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona una composición que incluye el derivado del glucagón o el conjugado aislado.
En una realización específica, la composición se caracteriza porque es una composición farmacéutica para tratar o prevenir la hipoglucemia o el síndrome metabólico.
Efectos ventajosos de la invención
Los derivados del glucagón de la presente invención tienen propiedades físicas mejoradas en comparación con las del glucagón natural y, por lo tanto, pueden usarse eficazmente como un agente terapéuti
mediante la mejora del cumplimiento de los pacientes. De forma adicional, los derivados del glucagón de la presente invención pueden usarse eficazmente para la prevención y el tratamiento de la hipoglucemia y el síndrome metabólico tales como la obesidad, la diabetes y la esteatohepatitis no alcohólica (NASH).
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra un gráfico que ilustra los cambios en el peso corporal de los modelos animales con obesidad (ratas), que se prepararon mediante una dieta rica en grasas, durante una administración única o combinada de un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada (denominado derivado de la exendina-4 de acción prolongada) y un conjugado derivado del glucagón de acción prolongada (denominado derivado de acción prolongada de SEQ ID NO: 12) con una dosis ajustada a las ratas, a intervalos de 3 días durante 15 días.
La Figura 2 muestra un resultado que ilustra la cantidad de grasa mesentérica de modelos animales con obesidad (ratas), que se prepararon mediante una dieta rica en grasas, medida después de una administración única o combinada de un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada (denominado derivado de la exendina-4 de acción prolongada) y un conjugado derivado del glucagón de acción prolongada (denominado derivado de acción prolongada de SEQ ID NO: 12) con una dosis ajustada a las ratas durante 15 días (*p<0,05, **p<0,01 frente a vehículo mediante la prueba ANOVA).
La Figura 3 muestra un resultado que ilustra la diferencia en el peso hepático de los modelos animales con obesidad (ratas), que se prepararon mediante una dieta rica en grasas, medida después de una administración única o combinada de un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada (denominado derivado de la exendina-4 de acción prolongada) y un conjugado derivado del glucagón de acción prolongada (denominado derivado de acción prolongada de SEQ ID NO: 12) con una dosis ajustada a las ratas durante 15 días (***p<0,01 ***p<0,001 frente a vehículo mediante la prueba ANOVA).
La figura 4 muestra un gráfico que ilustra los cambios en el peso corporal (PC) de los modelos animales de obesidad (ratones), que se prepararon mediante una dieta rica en grasas, después de una administración única o combinada de un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada (denominado derivado de la exendina-4 de acción prolongada) y un conjugado derivado del glucagón de acción prolongada (denominado derivado de acción prolongada de SEQ ID NO: 20) con una dosis ajustada a las ratas durante 22 días.
La figura 5 muestra un resultado que ilustra los cambios en el contenido de colesterol en la sangre de modelos animales de obesidad (ratones), que se prepararon mediante una dieta rica en grasas, después de una administración única o combinada de un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada (denominado derivado de la exendina-4 de acción prolongada) y un conjugado derivado del glucagón de acción prolongada (denominado derivado de acción prolongada de SEQ ID NO: 20) con una dosis ajustada a las ratas durante 22 días.
Mejor modo para llevar a cabo la invención
Los detalles específicos de la presente invención se pueden explicar como sigue. En particular, las explicaciones y realizaciones descritas en la presente invención pueden aplicarse a otras explicaciones y realizaciones, respectivamente. Es decir, todas las combinaciones de los diversos elementos descritos en la presente invención pertenecen al alcance de la presente invención. De forma adicional, el alcance de la presente invención no debe estar limitado por las descripciones específicas descritas a continuación en el presente documento.
A lo largo de la descripción de la presente invención, no solo se usan los códigos convencionales de 1 letra y los códigos de 3 letras para los aminoácidos presentes en la naturaleza, sino también los códigos de 3 letras, tales como Aib (ácido a-aminoisobutírico), Sar (N-metilglicina) generalmente usados para otros aminoácidos. De forma adicional, los aminoácidos mencionados en abreviatura en la presente descripción se describen según la Nomenclatura de la IUPAC-IUB.
alanina A arginina R
asparagina N ácido aspártico D
cisteína C ácido glutámico E
glutamina Q glicina G
histidina H isoleucina I
leucina L lisina K
metionina M fenilalanina F
prolina P serina S
treonina T triptófano W
tirosina Y valina V
Un derivado del glucagón incluye un péptido que tiene al menos una diferencia en la secuencia de aminoácidos en comparación con el glucagón natural, un péptido en donde la secuencia del glucagón natural se modifica modificando el glucagón natural y un mimético del glucagón natural que puede activar los receptores de glucagón como el glucagón natural.
Dicho derivado del glucagón puede ser uno que tenga propiedades físicas mejoradas al tener un pI alterado en relación con el glucagón natural. De forma adicional, el derivado del glucagón puede ser uno con una solubilidad mejorada a la vez que mantiene la actividad de activar los receptores de glucagón, pero no se limita al mismo.
De forma adicional, el derivado del glucagón puede ser un glucagón no natural.
En particular, el glucagón natural puede tener la siguiente secuencia de aminoácidos:
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (SEQ ID NO: 1)
Como se usa en la presente descripción, el término “ pI” o “ punto isoeléctrico” se refiere al valor del pH al cual una macromolécula tal como un polipéptido no tiene carga neta (0). En el caso de un polipéptido con diversos grupos funcionales cargados, la carga neta del polipéptido total es “ 0” en un punto donde el valor del pH es el mismo que el del pI. La carga neta del polipéptido a un pH mayor que el pI será negativa, mientras que la carga neta del polipéptido a un pH menor que el pI será positiva.
Los valores de pI pueden determinarse en un gel de gradiente de pH inmovilizado que consiste en poliacrilamida, almidón o agarosa mediante electroforesis isoeléctrica, o pueden estimarse, por ejemplo, a partir de una secuencia de aminoácidos mediante el uso de la herramienta pI/MW (http://expasy.org/tools/pi_tool.html; Gasteiger y col., 2003) en un servidor ExPASy.
Como se usa en la presente descripción, la expresión “ pI alterado” se refiere a un pI que es diferente al del glucagón natural debido a la sustitución de una parte de la secuencia de aminoácidos del glucagón natural con un residuo de aminoácido que tiene una carga negativa o una carga positiva, es decir, un valor de pI menor o mayor. El péptido con tal pI alterado puede presentar una solubilidad mejorada y una alta estabilidad a un pH neutro como un derivado del glucagón.
Más específicamente, un derivado del glucagón puede tener un valor de pI alterado, no el valor de pI (6,8) del glucagón natural, e incluso más específicamente, un valor de pI de menos de 6,8, más específicamente, 6,7 o menos, más específicamente 6,5 o menos, y de forma adicional, un valor de pI que excede 6,8, 7 o superior, más específicamente, 7,5 o superior, cuando el valor del pI es diferente del valor del glucagón natural, un derivado del glucagón presenta una solubilidad mejorada a un pH neutro en comparación con el del glucagón natural, mostrando, por lo tanto, un bajo nivel de agregación.
Más específicamente, el derivado del glucagón puede tener un valor de pI de 4 a 6,5 y/o de 7 a 9,5, específicamente de 7,5 a 9,5, y más específicamente, de 8,0 a 9,3, pero el valor de pI no se limita a los mismos. En este caso, debido al valor de pI inferior o superior en comparación con el del glucagón natural, puede mostrarse una solubilidad mejorada y una alta estabilidad a un pH neutro en comparación con el del glucagón natural.
Específicamente, un derivado del glucagón natural puede modificarse mediante cualquier método de sustitución, adición, deleción y modificación, o una combinación de los mismos en parte del aminoácido del glucagón natural.
Los ejemplos de los derivados del glucagón preparados mediante una combinación de los métodos anteriores incluyen un péptido que difiere en al menos un residuo de aminoácido de la secuencia de aminoácidos en comparación con el del glucagón natural y en donde el residuo de aminoácido N-terminal se desamina, tiene la función de activar un receptor de glucagón, pero no se limita a esto, y los derivados del glucagón nativos pueden prepararse mediante una combinación de diversos métodos para preparar los derivados.
De forma adicional, tal modificación para la preparación de derivados del glucagón nativos puede incluir todas las modificaciones usando aminoácidos de tipo L-o tipo D, y/o aminoácidos de tipo no natural; y/o una modificación de la secuencia natural, por ejemplo, modificación de un grupo funcional, una unión covalente intramolecular (por ejemplo, una formación de anillo entre cadenas laterales), metilación, acilación, ubiquitinación, fosforilación, aminohexanación, biotinilación, etc.
De forma adicional, la modificación también puede incluir todos aquellos donde uno o más aminoácidos se añaden al terminal amino y/o carboxi del glucagón natural.
Durante la sustitución o adición de aminoácidos, no solo se pueden usar los 20 aminoácidos comúnmente encontrados en proteínas humanas, sino también aminoácidos atípicos o que no son de origen natural. Las fuentes comerciales de aminoácidos atípicos pueden incluir Sigma-Aldrich, ChemPep Inc., y Genzyme Pharmaceuticals. Los péptidos que incluyen estos aminoácidos y secuencias peptídicas atípicas pueden sintetizarse y adquirirse de proveedores comerciales, por ejemplo, American Peptide Company, Bachem (EE. UU.) o Anygen (Corea).
Dado que el glucagón tiene un pH de aproximadamente 7, es insoluble en una solución que tiene un pH fisiológico (pH 4 a 8) y tiende a precipitar a un pH neutro. En una solución acuosa con un pH de 3 o inferior, el glucagón se disuelve en la etapa inicial pero precipita en una hora formando un gel. Dado que el glucagón gelificado consiste principalmente en fibrillas de lámina p, la administración del glucagón así precipitado a través de una aguja de inyección o inyección intravenosa bloqueará los vasos sanguíneos y, por lo tanto, no es adecuado para usar como agente de inyección. Para retrasar el proceso de precipitación, se usan comúnmente formulaciones ácidas (de pH 2 a 4), y al hacerlo, el glucagón puede mantenerse en un estado relativamente no agregado durante un corto período de tiempo. Sin embargo, el glucagón puede formar fibrillas muy rápidamente a un pH bajo y, por lo tanto, estas formulaciones ácidas deben inyectarse tras la preparación.
En este sentido, los presentes inventores han desarrollado derivados del glucagón con perfiles de acción prolongada modificando el pl del glucagón natural mediante la sustitución de residuos de aminoácidos que tienen cargas negativas y cargas positivas. Los derivados del glucagón de la presente invención, al tener un pl alterado en comparación con el del glucagón natural, se caracterizan por tener una solubilidad mejorada y/o una alta estabilidad a un pH neutro, en comparación con el glucagón natural.
El derivado del glucagón de la presente invención es un péptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
De forma adicional, aunque se describe como “ un péptido que consiste en una SEQ ID NO particular” en la presente invención, dicha expresión no excluye una mutación en el péptido que puede producirse por una adición de secuencia sin sentido en dirección 5' o dirección 3' de la secuencia de aminoácidos de la SEQ iD NO correspondiente, o una mutación natural en la misma, o una mutación silenciosa en la misma, siempre que el péptido que tiene dicha mutación tenga una actividad igual o correspondiente a la del péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO correspondiente. Incluso cuando la adición de secuencia o una mutación está presente, obviamente pertenece al alcance de la presente invención.
El péptido puede modificarse en su extremo amino o carboxilo terminal o protegerse por diversos grupos orgánicos para proteger el péptido de las enzimas de escisión de proteínas¡n vivo,a la vez que se aumenta su estabilidad, por ejemplo, uno en donde su extremo C está amidado.
De forma adicional, el péptido de la presente invención puede sintetizarse mediante un método bien conocido en la técnica, según su longitud, por ejemplo, mediante un sintetizador de péptidos automático, y puede producirse mediante tecnología de ingeniería genética.
Específicamente, el péptido de la presente invención puede prepararse mediante un método de síntesis estándar, un sistema de expresión recombinante o cualquier otro método conocido en la técnica. Por consiguiente, el derivado del glucagón de la presente invención puede sintetizarse mediante diversos métodos que incluyen, por ejemplo, los métodos descritos a continuación:
(a) un método para sintetizar un péptido mediante un método en fase sólida o fase líquida gradualmente o por ensamblaje de fragmentos, seguido de aislamiento y purificación del producto peptídico final; o
(b) un método para expresar un constructo de ácido nucleico que codifica un péptido en una célula huésped y recuperar el producto de expresión del cultivo de la célula huésped; o
(c) un método para realizar una expresión sin células invitrode un constructo de ácido nucleico que codifica un péptido y recuperar el producto de expresión del mismo; o
un método para obtener fragmentos peptídicos mediante cualquier combinación de los métodos (a), (b) y (c), obteniendo el péptido uniendo los fragmentos peptídicos y, a continuación, recuperando el péptido.
En un ejemplo más específico, puede producirse un derivado del glucagón deseado mediante manipulación genética, que incluye preparar un gen de fusión que codifica una proteína de fusión, que incluye una pareja de fusión y un derivado del glucagón, transformar la resultante en una célula huésped, expresar en forma de proteína de fusión y escindir el derivado del glucagón de la proteína de fusión mediante el uso de una proteasa o un compuesto que es capaz de la escisión de proteínas seguido de separación. Para este propósito, por ejemplo, una secuencia de ADN que codifica un residuo de aminoácido que puede ser escindida por una proteasa tal como el Factor Xa o la enteroquinasa, CNBr o un compuesto tal como la hidroxilamina, puede insertarse entre la pareja de fusión y un polinucleótido que codifica un derivado del glucagón.
En una realización específica de la presente invención, se confirmó que el péptido de la presente invención tiene un pI diferente en comparación con el del glucagón natural (véase Tabla 1). Como resultado, el péptido de la presente invención tiene una solubilidad mejorada y una mayor estabilidad a un pH neutro. En consecuencia, el péptido de la presente invención puede aumentar el cumplimiento del paciente cuando se usa como un agente hipoglucémico y también es adecuado para la administración combinada del péptido con otros agentes contra la obesidad y, por lo tanto, puede usarse eficazmente para la prevención y el tratamiento de la hipoglucemia y la obesidad.
A este respecto, el péptido de la presente invención puede proporcionar una selección terapéutica atractiva con respecto a la hipoglucemia, la obesidad o las enfermedades asociadas de la misma.
Por ejemplo, el péptido de la presente invención es una hormona principal que controla la respuesta a la insulina, y puede usarse eficazmente para el tratamiento de la hipoglucemia grave en pacientes diabéticos.
De forma adicional, el péptido de la presente invención puede usarse como un medicamento farmacéutico no solo para prevenir el aumento del peso corporal, la promoción de la disminución del peso corporal, la reducción del sobrepeso y la obesidad que incluye la obesidad mórbida (por ejemplo, controlando el apetito, la ingestión, la ingesta de alimento, la ingesta de calorías y/o el consumo de energía), sino también para tratar la inflamación relacionada con la obesidad, la enfermedad de la vesícula biliar relacionada con la obesidad y la apnea del sueño inducida por la obesidad, pero no se limita a esto, y se puede usar para tratar las enfermedades asociadas o las afecciones de salud de los mismos.
El péptido de la presente invención también puede usarse para tratar el síndrome metabólico distinto de la obesidad, es decir, enfermedades relacionadas con la obesidad tales como tolerancia a la glucosa alterada, hipercolesterolemia, dislipidemia, obesidad, diabetes, hipertensión, esteatohepatitis no alcohólica (esteatohepatitis no alcohólica, NASH), aterosclerosis causada por dislipidemia, aterosclerosis, arteriosclerosis, cardiopatía coronaria, accidente cerebrovascular, hipoglucemia, etc. Sin embargo, los efectos del péptido según la presente invención pueden estar mediados total o parcialmente por los efectos relacionados con el peso corporal descritos anteriormente o pueden ser independientes del mismo.
Los ejemplos del compuesto o material que tiene una actividad terapéutica para el síndrome metabólico que se va a incluir en la administración combinada o la composición de la presente invención pueden incluir un péptido insulinotrópico en forma de un conjugado de acción prolongada, al que se une un material biocompatible capaz de aumentar la semividain vivodel péptido insulinotrópico.
Específicamente, el péptido insulinotrópico puede seleccionarse del grupo que consiste en GLP-1, exendina-3, exendina-4, un agonista de los mismos, un derivado de los mismos, un fragmento de los mismos, una variante de los mismos y una combinación de los mismos.
Más específicamente, el péptido insulinotrópico puede ser un derivado de péptido insulinotrópico en donde la histidina N-terminal del péptido insulinotrópico está sustituida con uno seleccionado del grupo que consiste en desaminohistidilo, N-dimetil-histidilo, p-hidroxi imidazopropionilo, 4-imidazoacetilo y p-carboxi imidazopropionilo, pero no se limita a estos.
Más específicamente, el péptido insulinotrópico puede seleccionarse del grupo que consiste en una exendina-4 natural; un derivado de la exendina-4 en donde el grupo amina N-terminal de la exendina-4 está eliminado; un derivado de la exendina-4 en donde el grupo amina N-terminal de la exendina-4 está sustituido con un grupo hidroxilo; un derivado de la exendina-4 en donde el grupo amina N-terminal de la exendina-4 está modificado con un grupo dimetilo; un derivado de la exendina-4 en donde el carbono a del 1.er aminoácido de la exendina-4, histidina, está eliminado; un derivado de la exendina-4 en donde el 12.° aminoácido de la exendina-4, lisina, está sustituido con serina y un derivado de la exendina-4 en donde el 12.° aminoácido de la exendina-4, lisina, está sustituido con arginina, pero no se limita a esto.
En un “ conjugado de acción prolongada” , la duración de la eficacia del conjugado aumenta en comparación con el glucagón natural o un derivado del glucagón del mismo, al que no se une un material biocompatible.
Los ejemplos del material biocompatible pueden incluir polietilenglicol, ácido graso, colesterol, albúmina y un fragmento de la misma, un material de unión a la albúmina, un polímero de unidades repetitivas de una secuencia de aminoácidos particular, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un material de unión a FcRn, tejido conjuntivoin vivoo un derivado del mismo, un nucleótido, fibronectina, transferrina, un sacárido y un polímero, pero no se limitan a los mismos. Por ejemplo, al menos una cadena lateral de aminoácido dentro del péptido de la presente invención puede unirse al material biocompatible para aumentar invivola solubilidad y/o la semivida, y/o aumentar la biodisponibilidad del mismo. Se sabe que estas modificaciones reducen el aclaramiento de proteínas y péptidos terapéuticos.
Para el polímero biocompatible, los polímeros solubles (anfipáticos o hidrófilos), no tóxicos y farmacéuticamente inertes son apropiados y, por ejemplo, pueden incluir PEG, homopolímeros o copolímeros de PEG, polímeros sustituidos con monometilo (mPEG) y poliaminoácidos tales como polilisina, ácido poliaspártico y ácido poliglutámico, pero no se limitan a los mismos.
Es un hecho conocido para un experto en la técnica que el derivado del glucagón así modificado tendría un efecto terapéutico superior en comparación con el glucagón natural. Por consiguiente, las variantes del derivado del glucagón como se ha descrito anteriormente también pertenecen al alcance de la presente invención.
En una realización más específica, el derivado del glucagón y el péptido insulinotrópico pueden unirse respectivamente a un material biocompatible por un enlazador seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, un copolímero de etilenglicol-propilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol polivinílico, un polisacárido, dextrano, polivinil etil éter, un polímero biodegradable tal como ácido poliláctico (PLA) y ácido poliláctico-glicólico (PLGA), polímero lipídico, quitina, ácido hialurónico, ácido graso, un polímero, un compuesto de bajo peso molecular, un nucleótido y una combinación de los mismos, pero no se limita a esto.
En una realización aún más específica, el material biocompatible puede ser un material de unión a FcRn, y el derivado del glucagón, y el péptido insulinotrópico pueden unirse respectivamente a un material biocompatible mediante un enlazador peptídico o un enlazador no peptídico, pero no se limita a esto.
Como ejemplo específico, el material de unión a FcRn puede ser un polipéptido que incluye una región Fc de inmunoglobulina.
Como se usa en la presente descripción, “ enlazador no peptídico” incluye un polímero biocompatible al que se unen al menos dos unidades repetitivas. Las unidades repetitivas están unidas entre sí por un enlace covalente aleatorio en lugar de un enlace peptídico. El enlazador no peptídico puede ser una constitución que establece un resto de un conjugado de acción prolongada de la presente invención.
Como se usa en la presente descripción, la expresión “ enlazador no peptídico” puede usarse indistintamente con “ polímero no peptídico” .
De forma adicional, en una realización específica, el conjugado puede ser uno en donde el fármaco proteico se une covalentemente a la región Fc de inmunoglobulina por un enlazador no peptídico que incluye un grupo reactivo, que puede unirse a la región Fc de inmunoglobulina y un fármaco proteico en ambos extremos del conjugado.
Aunque no está particularmente limitado, el enlazador no peptídico puede seleccionarse del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, un copolímero de etilenglicol-propilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol polivinílico, un polisacárido, dextrano, polivinil etil éter, un polímero biodegradable tal como ácido poliláctico (PLA) y ácido poliláctico-glicólico (PLGA), polímero lipídico, quitina, ácido hialurónico, un polisacárido y una combinación de los mismos. En una realización más específica, el polímero no peptídico puede ser polietilenglicol, pero no se limita al mismo.
El enlazador no peptídico a usar en la presente invención puede ser cualquier polímero que tenga una resistencia a proteasas invivo,sin limitación. El peso molecular del polímero no peptídico puede estar en el intervalo de 1 kDa a 100 kDa, y específicamente, de 1 kDa a 20 kDa, pero no se limita a esto. De forma adicional, el enlazador no peptídico, que está unido al polipéptido que incluye la región Fc de inmunoglobulina, puede incluir no solo un solo tipo de polímero sino también una combinación de diferentes tipos de polímeros.
En una realización específica, ambos extremos del enlazador no peptídico pueden unirse respectivamente a un grupo amina o un grupo tiol de un péptido, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o 37 o un péptido insulinotrópico, y un material biocompatible.
Específicamente, el polímero no peptídico puede incluir un grupo reactivo en ambos extremos, respectivamente, que puede unirse a un fragmento Fc de inmunoglobulina y, un derivado del glucagón que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 30 o 37 o un péptido insulinotrópico; y específicamente, un grupo reactivo que puede unirse a un grupo amina del extremo N o lisina, o un grupo tiol de cisteína del derivado del glucagón que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o 37 o el péptido insulinotrópico, o el fragmento Fc de inmunoglobulina.
Adicionalmente, el grupo reactivo del polímero no peptídico al que se puede unir comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o 37, la región Fc de inmunoglobulina, el derivado del glucagón que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o 37, y el péptido insulinotrópico puede seleccionarse del grupo que consiste en un grupo aldehído, un grupo maleimida y un derivado de succinimida, pero no se limita a esto.
En lo anterior, los ejemplos del grupo aldehído pueden incluir un grupo propionaldehído o un grupo butiraldehído, pero no se limitan a los mismos.
En lo anterior, pueden usarse como derivado de succinimida, valerato de succinimidilo, metilbutanoato de succinimidilo, metilpropionato de succinimidilo, butanoato de succinimidilo, propionato de succinimidilo, N-hidroxisuccinimida, hidroxi succinimidilo, carboximetil succinimidilo, carbonato de succinimidilo, pero no se limitan a los mismos.
De forma adicional, el producto final generado por alquilación reductora con un enlace aldehído es más estable que el unido por un enlace amida. El grupo reactivo aldehído reacciona selectivamente con un extremo N-terminal en una condición de pH bajo a la vez que puede formar un enlace covalente con un residuo de lisina a un pH alto, por ejemplo, pH 9,0.
Los grupos reactivos en ambos extremos del enlazador no peptídico pueden ser iguales o diferentes entre sí, por ejemplo, se puede proporcionar un grupo reactivo maleimida en un extremo y un grupo aldehído, un grupo propionaldehído o un grupo butiraldehído en el otro extremo. Sin embargo, no está particularmente limitado que una región Fc de inmunoglobulina y un derivado del glucagón que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o 37 o un péptido insulinotrópico puedan conjugarse en cada extremo del enlazador no peptídico.
Por ejemplo, el polímero no peptídico puede poseer un grupo maleimida en un extremo, y un grupo aldehído, un grupo propionaldehído o un grupo butiraldehído en el otro extremo.
Cuando se usa un polietilenglicol que tiene un grupo hidroxilo reactivo en ambos extremos del mismo como polímero no peptídico, el grupo hidroxilo puede activarse a diversos grupos reactivos mediante reacciones químicas conocidas, 0 se puede usar un polietilenglicol que tiene un grupo reactivo modificado comercializado para preparar el conjugado de proteína de acción prolongada de la presente invención.
En una realización específica, el polímero no peptídico puede ser uno que pueda unirse a un residuo de cisteína de un derivado del glucagón que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o 37, y más específicamente, al grupo -SH de la cisteína, pero no se limita a esto.
Cuando se usa maleimida-PEG-aldehído, el grupo maleimida puede unirse al grupo -SH del derivado del glucagón que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o 37 por un enlace tioéter y el grupo aldehído puede unirse al -NH<2>del Fc de inmunoglobulina mediante alquilación reductora, pero no se limita a esto.
“ Región Fc de inmunoglobulina” se refiere a una región que incluye la región constante de la cadena pesada 2 (CH2) y/o la región constante de la cadena pesada 3 (CH3), excluyendo las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera de una inmunoglobulina. La región Fc de inmunoglobulina puede ser una constitución que establece un resto de un conjugado de una proteína de la presente invención.
La región Fc de inmunoglobulina puede incluir una región bisagra en la región constante de la cadena pesada, pero no se limita a esto. De forma adicional, la región Fc de inmunoglobulina puede ser una región Fc extendida que incluye una parte o la totalidad de la región constante de la cadena pesada 1 (CH1) y/o la región constante de la cadena ligera 1 (CL1), excluyendo las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera de la inmunoglobulina, siempre que la región Fc de inmunoglobulina tenga un efecto sustancialmente igual o mejorado en comparación con el tipo natural. De forma adicional, la región Fc de inmunoglobulina puede ser una región en donde se elimina una parte bastante larga de la secuencia de aminoácidos correspondiente a CH2 y/o CH3.
Por ejemplo, la región Fc de inmunoglobulina puede ser 1) un dominio CH1, un dominio CH2, un dominio CH3 y un dominio CH4; 2) un dominio CH1 y un dominio CH2; 3) un dominio CH1 y un dominio CH3; 4) un dominio CH2 y un dominio CH3; 5) una combinación entre uno o dos o más dominios entre un dominio CH1, un dominio CH2, un dominio CH3 y un dominio CH4 y una región bisagra de inmunoglobulina (o una parte de la región bisagra); y 6) un dímero entre cada dominio de la región constante de cadena pesada y la región constante de cadena ligera, pero no se limita a esto.
De forma adicional, en una realización específica, la región Fc de inmunoglobulina puede estar en una forma dimérica, y una molécula de un derivado del glucagón o péptido insulinotrópico puede unirse covalentemente a una región Fc en una forma dimérica, y en particular, la Fc de inmunoglobulina y el derivado del glucagón que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o 37 o el péptido insulinotrópico pueden estar interconectados por un polímero no peptídico. Además, dos moléculas del derivado del glucagón o péptido insulinotrópico pueden conjugarse posiblemente de manera simétrica a una sola región Fc en una forma dimérica. En particular, la Fc de inmunoglobulina y el derivado del glucagón o el péptido insulinotrópico pueden estar interconectados por un enlazador no peptídico, pero no se limitan a la realización descrita anteriormente.
De forma adicional, la región Fc de inmunoglobulina no solo incluye una secuencia de aminoácidos natural sino también un derivado de secuencia de la misma. Un derivado de secuencia de aminoácidos se refiere a una secuencia de aminoácidos que tiene una diferencia en al menos un residuo de aminoácido debido a la deleción, inserción, sustitución no conservadora o conservadora, o una combinación de las mismas.
Por ejemplo, los residuos de aminoácidos en las posiciones 214 a 238, 297 a 299, 318 a 322, o 327 a 331, que se sabe que participan en la unión a una región Fc de inmunoglobulina, pueden usarse como sitios adecuados para la modificación.
De forma adicional, son posibles otros diversos derivados, incluyendo uno que tiene una deleción de una región capaz de formar un enlace disulfuro, o una deleción de algunos residuos de aminoácidos en el extremo N-terminal del Fc natural o una adición de un residuo de metionina en el extremo N-terminal del Fc natural. Además, para eliminar las funciones efectoras, puede producirse una deleción en un sitio de unión al complemento, tal como un sitio de unión a C1q y un sitio de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). Las técnicas de preparación de tales derivados de secuencia de la región Fc de inmunoglobulina se describen en las publicaciones de patente internacional números WO 97/34631, WO 96/32478, etc.
Los intercambios de aminoácidos en proteínas y péptidos, que generalmente no alteran la actividad de las proteínas o péptidos, son conocidos en la técnica (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Los intercambios que se producen más comúnmente son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly, en ambas direcciones. Además, si es necesario, la región Fc puede modificarse mediante fosforilación, sulfatación, acrilación, glicosilación, metilación, farnesilación, acetilación, amidación, etc.
Los derivados de Fc descritos anteriormente muestran actividad biológica idéntica a la de la región Fc descrita anteriormente y tienen una mayor estabilidad estructural frente al calor, pH, etc.
Además, la región Fc de inmunoglobulina puede obtenerse de formas naturales aisladasin vivode seres humanos o animales, tales como vacas, cabras, cerdos, ratones, conejos, hámsteres, ratas, cobayas etc., o pueden ser recombinantes o derivados de las mismas, obtenidas de células animales o microorganismos transformados. En el presente documento, la región Fc puede obtenerse de una inmunoglobulina natural aislando una inmunoglobulina completa de un cuerpo humano o animal vivo y tratando la inmunoglobulina aislada con proteinasa. Cuando toda la inmunoglobulina completa se trata con papaína, se escinde en regiones Fab y Fc, mientras que cuando la inmunoglobulina completa se trata con pepsina, se escinde en fragmentos pF'c y F(ab)<2>. Fc o pF'c pueden aislarse usando cromatografía de exclusión por tamaño, etc. En una realización más específica, una región Fc derivada de humano es una región Fc de inmunoglobulina recombinante obtenida de un microorganismo.
Además, la región Fc de inmunoglobulina puede tener glucanos naturales, mayor o menor número de glucanos en comparación con el tipo natural, o estar en una forma desglicosilada. El aumento, disminución o eliminación de los glicanos de la región Fc de inmunoglobulina se puede lograr mediante métodos convencionales tales como un método químico, un método enzimático y un método de ingeniería genética usando un microorganismo. La región Fc de inmunoglobulina obtenida mediante la eliminación de glicanos de la región Fc muestra una disminución significativa de la afinidad de unión a la parte C1q y una disminución o pérdida de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos o citotoxicidad dependiente del complemento y, por lo tanto, no induce respuestas inmunitarias innecesarias in vivo. En este sentido, una región Fc de inmunoglobulina en una región Fc de inmunoglobulina desglicosilada o aglicosilada puede ser una forma más adecuada para cumplir el objetivo de la presente invención como un portador de fármaco.
Como se usa en la presente descripción, el término “ desglicosilación” se refiere a la eliminación enzimática de restos de azúcar de una región Fc, y el término “ aglicosilación” se refiere a una región Fc no glicosilada producida en procariotas, más específicamente E.coli.
Por otra parte, la región Fc de inmunoglobulina puede derivarse de seres humanos u otros animales, incluyendo vacas, cabras, cerdos, ratones, conejos, hámsteres, ratas y cobayas. En una realización más específica, se deriva de seres humanos.
Además, la región Fc de inmunoglobulina (Ig) puede derivarse de IgG, IgA, IgD, IgE, IgM o una combinación o híbrido de los mismos. En una realización más específica, se deriva de IgG o IgM, que están entre las proteínas más abundantes en la sangre humana, y en una realización más específica, se deriva de IgG, que se sabe que aumenta las semividas de las proteínas de unión a ligando. En una realización aún más específica, la región Fc de inmunoglobulina es una región Fc de IgG4, y en la realización más específica, la región Fc de IgG4 es una región Fc aglicosilada derivada de IgG4 humana, pero no se limita a esto.
En particular, como se usa en la presente descripción, el término “ combinación” significa que los polipéptidos que codifican regiones Fc de inmunoglobulina de cadena sencilla del mismo origen están unidos a un polipéptido de cadena sencilla de un origen diferente para formar un dímero o multímero. Es decir, puede formarse un dímero o multímero a partir de dos o más fragmentos seleccionados del grupo que consiste en fragmentos Fc de IgG, Fc de IgA, Fc de IgM, Fc de IgD y Fc de IgE.
La composición de la presente invención puede usarse para prevenir o tratar la hipoglucemia o síndromes metabólicos como se establece en las reivindicaciones.
Como se usa en la presente descripción, el término “ prevención” se refiere a todo tipo de acciones asociadas con la inhibición o retraso de la aparición de hipoglucemia o síndrome metabólico mediante la administración del péptido o la composición, y el término “tratamiento” se refiere a todo tipo de acciones asociadas con la mejora o cambios ventajosos en los síntomas de hipoglucemia o síndrome metabólico por la administración del péptido o la composición.
Como se usa en la presente descripción, el término “ administración” se refiere a una introducción de un material particular a un paciente de una manera apropiada. La composición puede administrarse por una vía general que permita el suministro de la composición a un tejido dianain vivo,por ejemplo, administración intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, oral, tópica, intranasal, intrapulmonar e intrarrectal, pero no se limita particularmente a esto.
Como se usa en la presente descripción, la expresión “ síndrome metabólico” se refiere a un síntoma de una aparición única o compleja de diversas enfermedades debido al trastorno metabólico crónico, y en particular, ejemplos del síndrome metabólico pueden incluir tolerancia a la glucosa alterada, hipercolesterolemia, dislipidemia, obesidad, diabetes, hipertensión, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), aterosclerosis causada por dislipidemia, aterosclerosis, arteriosclerosis, cardiopatía coronaria, accidente cerebrovascular, etc., pero no se limita a esto.
Como se usa en la presente descripción, el término “ obesidad” se refiere a una afección médica con exceso de grasa corporal en el cuerpo, y una persona que tiene un índice de masa corporal (IMC; masa corporal (kg) dividida por el cuadrado de la altura corporal (m)) de 25 o superior se diagnostica como que tiene obesidad. La obesidad generalmente ocurre debido a un desequilibrio de energía a largo plazo en donde la ingesta de energía excede el gasto de energía. La obesidad es una enfermedad metabólica que afecta a todo el cuerpo y aumenta el riesgo de diabetes, hiperlipidemia, disfunción sexual, artritis y enfermedades cardiovasculares y, en algunos casos, está asociada a la ocurrencia de cáncer.
La diabetes puede presentar “ hipoglucemia” como síntoma agudo.
Como se usa en la presente descripción, el término “ hipoglucemia” se refiere a un síntoma agudo de diabetes, en donde los niveles de glucosa en sangre son inferiores a los de las personas normales, y en general, se refieren a un estado cuando los niveles de glucosa en sangre son 50 mg/dl o menos. La hipoglucemia se produce frecuentemente cuando una persona que toma un agente hipoglucémico oral o insulina ha comido menos de lo habitual o ha realizado actividades o ha realizado más ejercicio de lo habitual. Además, la hipoglucemia puede producirse debido al uso de fármacos que disminuyen el nivel de glucosa, enfermedades físicas graves, deficiencia en hormonas tales como hormonas adrenocorticales y glucagón, tumor en páncreas productor de insulina, síndrome de insulina autoinmunitaria, pacientes con gastrectomía, trastorno del metabolismo de carbohidratos hereditario, etc.
Los síntomas de hipoglucemia incluyen debilidad, temblor, piel pálida, sudores fríos, mareos, excitación, ansiedad, palpitaciones, estómago vacío, dolor de cabeza, fatiga, etc. En el caso de hipoglucemia persistente, puede conducir a convulsiones o temblores, y puede causar un choque y, por lo tanto, desvanecimiento.
La composición farmacéutica de la presente invención puede contener un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente descripción, la expresión “ farmacéuticamente aceptable” se refiere a las propiedades de tener una cantidad suficiente para presentar un efecto terapéutico y no causar efectos adversos, y puede determinarse fácilmente por un experto en la técnica en función de los factores bien conocidos en el campo médico, tales como el tipo de enfermedad, edad, peso corporal, estado de salud, sexo, sensibilidad a fármacos de un paciente, vía de administración, método de administración, frecuencia de administración, duración del tratamiento, un fármaco a mezclar o administrar simultáneamente en combinación, etc.
La composición farmacéutica de la presente invención que contiene el péptido de la presente invención puede contener además un portador farmacéuticamente aceptable. El portador farmacéuticamente aceptable puede incluir, para administración oral, un aglutinante, un deslizante, un disgregante, un excipiente, un agente solubilizante, un dispersante, un agente estabilizador, un agente de suspensión, un agente colorante, un agente saborizante, etc.; para inyecciones, un agente tamponador, un agente conservante, un analgésico, un agente solubilizante, un agente isotónico, un agente estabilizante, etc., que se puede combinar para usar; y para administraciones tópicas, una base, un excipiente, un lubricante, un agente conservante, etc., aunque no se limita a esto.
El tipo de formulación de la composición según la presente invención puede prepararse de diversas formas combinando con un portador farmacéuticamente aceptable como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, para la administración oral, la composición puede formularse en comprimidos, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, etc. Para inyecciones, la composición puede formularse en ampollas de dosis única o recipientes multidosis. La composición también puede formularse en soluciones, suspensiones, comprimidos, cápsulas y preparaciones de liberación sostenida.
Por otra parte, los ejemplos de portadores, excipientes y diluyentes adecuados pueden incluir lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, almidón, caucho de acacia, alginato, gelatina, fosfato de calcio, silicato de calcio, celulosa, metilcelulosa, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, agua, hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, talco, estearato de magnesio, aceite mineral, etc. De forma adicional, la composición puede contener además una carga, un anticoagulante, un lubricante, un humectante, un agente saborizante, un conservante, etc.
De forma adicional, la composición farmacéutica de la presente invención puede prepararse en cualquier tipo de formulación seleccionada del grupo que consiste en comprimidos, píldoras, polvos, gránulos, cápsulas, suspensiones, medicamentos líquidos para uso interno, emulsiones, jarabes, soluciones estériles para inyección, disolventes no acuosos, formulaciones liofilizadas y supositorios.
De forma adicional, la composición puede formularse en una forma de dosificación única adecuada para el cuerpo del paciente, y preferiblemente se formula en una preparación útil para fármacos peptídicos según el método típico usado en el campo farmacéutico para su administración por vía oral o parenteral, tal como a través de la piel, administración intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intraventricular, pulmonar, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, intragástrica, tópica, sublingual, vaginal o rectal, aunque no se limita a esto.
De forma adicional, el péptido puede utilizarse mediante mezcla con una variedad de portadores farmacéuticamente aceptables tales como solución salina fisiológica o disolventes orgánicos. Para aumentar la estabilidad o absortividad, pueden usarse carbohidratos tales como glucosa, sacarosa o dextranos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o glutatión; agentes quelantes; proteínas de bajo peso molecular; u otros estabilizadores.
La dosis de administración y la frecuencia de la composición farmacéutica de la presente invención se determinan según el tipo de principio(s) activo(s), junto con diversos factores tales como la enfermedad a tratar, vía de administración, edad del paciente, sexo, peso corporal y la gravedad de la enfermedad.
La dosis eficaz total de la composición de la presente invención puede administrarse a un paciente en una dosis única, o puede administrarse durante un período de tiempo prolongado en múltiples dosis según un protocolo de tratamiento fraccionado. En la composición farmacéutica de la presente invención, el contenido de principio(s) activo(s) puede variar dependiendo de la gravedad de la enfermedad. Específicamente, la dosis diaria total preferida del péptido de la presente invención puede ser de aproximadamente 0,0001 |jg a 500 mg por 1 kg de peso corporal de un paciente. Sin embargo, la dosis eficaz del péptido se determina considerando diversos factores que incluyen edad del paciente, peso corporal, estado de salud, sexo, gravedad de la enfermedad, dieta y velocidad de excreción, además de la vía de administración y frecuencia de tratamiento de la composición farmacéutica. En este sentido, los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente la dosis eficaz adecuada para el uso particular de la composición farmacéutica de la presente invención. La composición farmacéutica según la presente invención no está especialmente limitada a la formulación, ni a la vía y modo de administración, siempre que muestre los efectos de la presente invención.
La composición farmacéutica de la presente invención muestra una excelente duración de la eficacia y títuloin vivoy, por lo tanto, el número y la frecuencia de administración de la preparación farmacéutica de la presente invención pueden reducirse significativamente.
En particular, dado que la composición farmacéutica de la presente invención contiene, como principio activo, un derivado del glucagón que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o 30 que tiene un pl alterado diferente al del glucagón natural, muestra una solubilidad mejorada y una alta estabilidad según el pH de una solución dada y, por lo tanto, la composición farmacéutica de la presente invención puede usarse eficazmente en la preparación de una formulación de glucagón estable para tratar la hipoglucemia u obesidad como se establece en las reivindicaciones.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un derivado del glucagón novedoso que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37.
El extremo C-terminal del péptido que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 puede estar amidado, pero no se limita a esto.
De forma adicional, el péptido puede ser un derivado del glucagón capaz de activar un receptor de glucagón, pero no se limita a esto.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica el derivado del glucagón que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, un vector que incluye el polinucleótido y una célula aislada que incluye el polinucleótido o el vector.
De forma adicional, el polinucleótido aislado que codifica el derivado del glucagón incluye dentro del alcance de la presente invención una secuencia polinucleotídica que tiene una homología del 75 % o más, específicamente del 85 % o más, más específicamente del 90 % o más, e incluso más específicamente del 95 % o más, con la secuencia correspondiente.
Como se usa en la presente descripción, el término “ homología” indica similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos de tipo silvestre o secuencia de nucleótidos de tipo silvestre, y la comparación de homología puede realizarse a simple vista o mediante el uso de un programa de comparación comercializado. Usando un programa informático comercializado, la homología entre dos o más secuencias puede expresarse como un porcentaje (%), y puede calcularse la homología (%) entre secuencias adyacentes.
Como se usa en la presente descripción, la expresión “vector recombinante” se refiere a un constructo de ADN que incluye la secuencia de un polinucleótido que codifica un péptido diana, por ejemplo, un derivado del glucagón, que está unido operativamente a una secuencia reguladora apropiada para permitir la expresión del péptido diana, por ejemplo, un derivado del glucagón, en una célula huésped.
La secuencia reguladora incluye un promotor capaz de iniciar la transcripción, cualquier secuencia del operador para la regulación de la transcripción, una secuencia que codifica un dominio de unión al ribosoma de ARNm apropiado y una secuencia que regula la terminación de la transcripción y la traducción. El vector recombinante, después de transformarse en una célula huésped adecuada, puede replicarse o funcionar independientemente del genoma del huésped, o puede integrarse en el propio genoma del huésped.
El vector recombinante usado en la presente invención puede no estar particularmente limitado siempre que el vector sea replicable en la célula huésped, y puede construirse usando cualquier vector conocido en la técnica. Los ejemplos del vector convencionalmente usado pueden incluir plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos naturales o recombinantes. Los vectores que se usarán en la presente invención pueden ser cualquier vector de expresión conocido en la técnica.
El vector recombinante se usa para la transformación de una célula huésped para producir derivados del glucagón de la presente invención. De forma adicional, estas células transformadas, como parte de la presente invención, pueden usarse para la amplificación de fragmentos y vectores de ácido nucleico, o pueden ser células cultivadas o líneas celulares usadas en la producción recombinante de derivados del glucagón de la presente invención.
Como se usa en la presente descripción, el término “transformación” se refiere a un proceso de introducción de un vector recombinante que incluye un polinucleótido que codifica una proteína diana en una célula huésped, permitiendo de esta manera la expresión de la proteína codificada por el polinucleótido en la célula huésped. Para el polinucleótido transformado, no importa si está insertado en el cromosoma de una célula huésped y se ubica en el mismo o si se ubica fuera del cromosoma, siempre que pueda expresarse en la célula huésped, y se incluyen ambos casos.
De forma adicional, el polinucleótido incluye ADN y ARN que codifican la proteína diana. El polinucleótido puede insertarse en cualquier forma, siempre que pueda introducirse en una célula huésped y expresarse en la misma. Por ejemplo, el polinucleótido puede introducirse en una célula huésped en forma de un casete de expresión, que es un constructo génico que incluye todos los elementos esenciales requeridos para la autoexpresión. El casete de expresión puede incluir convencionalmente un promotor unido operativamente al polinucleótido, una señal de terminación de la transcripción, un dominio de unión al ribosoma y una señal de terminación de la traducción. El casete de expresión puede estar en forma de un vector de expresión capaz de autorreplicarse. De forma adicional, el polinucleótido puede introducirse en una célula huésped tal cual y unirse operativamente a una secuencia esencial para su expresión en la célula huésped, pero no se limita a esto.
De forma adicional, como se usa en la presente descripción, la expresión “ unido operativamente” se refiere a una conexión funcional entre una secuencia del promotor, que inicia y media la transcripción del polinucleótido que codifica el péptido diana de la presente invención, y la secuencia génica anterior.
Un huésped apropiado para usar en la presente invención puede no estar particularmente limitado siempre que pueda expresar el polinucleótido de la presente invención. Los ejemplos del huésped apropiado pueden incluir bacterias que pertenecen al géneroEscherichiatal como E.coli; bacterias que pertenecen al géneroBacillustal comoBacillus subtilis;bacterias que pertenecen al géneroPseudomonastal comoPseudomonas putida;levaduras tales comoPichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae,ySchizosaccharomyces pombe;células de insecto tales comoSpodoptera frugiperda(Sf9), y células animales tales como CHO, COS y BSC.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona un conjugado aislado en donde un derivado del glucagón que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 y un material biocompatible que es capaz de aumentar la semividain vivoestán unidos. El conjugado puede ser un conjugado de acción prolongada.
Con respecto al derivado del glucagón, el material biocompatible y la constitución del conjugado, se aplican todos los descritos anteriormente.
Específicamente, el material biocompatible se puede seleccionar del grupo que consiste en polietilenglicol, ácido graso, colesterol, albúmina y un fragmento de la misma, un material de unión a albúmina, un polímero de unidades repetitivas de una secuencia de aminoácidos particular, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un material de unión a FcRn, tejido conjuntivoin vivoo un derivado del mismo, un nucleótido, fibronectina, transferrina, sacárido y un polímero, pero no se limita a esto.
De forma adicional, el péptido aislado puede unirse a un material biocompatible mediante un enlazador seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, un copolímero de etilenglicol-propilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol polivinílico, un polisacárido, dextrano, polivinil etil éter, un polímero biodegradable tal como ácido poliláctico (PLA) y ácido poliláctico-glicólico (PLGA), polímero lipídico, quitina, ácido hialurónico, ácido graso, un polímero, un compuesto de bajo peso molecular, un nucleótido y una combinación de los mismos, pero no se limita a esto.
De forma adicional, el material biocompatible puede ser un material de unión a FcRn, y el péptido aislado puede estar unido a un material biocompatible por un enlazador peptídico o un enlazador no peptídico seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, un copolímero de etilenglicol-propilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol polivinílico, un polisacárido, dextrano, polivinil etil éter, un polímero biodegradable tal como ácido poliláctico (PLA) y ácido poliláctico-glicólico (PLGA), polímero lipídico, quitina, ácido hialurónico y una combinación de los mismos, pero no se limita a esto.
De forma adicional, el material de unión a FcRn puede ser un polipéptido que incluye la región Fc de inmunoglobulina, pero no se limita a esto.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona una composición que contiene el derivado del glucagón que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 o el conjugado aislado.
El derivado del glucagón y el conjugado aislado son los mismos que los mencionados anteriormente.
Específicamente, la composición puede ser una composición farmacéutica para tratar o prevenir la hipoglucemia o el síndrome metabólico, pero no se limita a esto. La composición farmacéutica es la misma que la descrita anteriormente.
Modo de la invención
De aquí en adelante, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos y ejemplos experimentales. Sin embargo, los siguientes ejemplos y ejemplos experimentales se proporcionan solo con fines ilustrativos, y el alcance de la presente invención no debe limitarse a los mismos de ninguna manera.
Ejemplo1: Producción de la línea celular que muestra la respuesta de AMPc a glucagón
Se realizó una PCR usando una región correspondiente al marco de lectura abierto (ORF) en el ADNc (OriGene Technologies, Inc., EE. UU.) del gen del receptor de glucagón humano como plantilla junto con los siguientes cebadores directos e inversos (SEQ ID NOS: 47 y 48, respectivamente), que incluyen cada uno de los sitios de restricciónEcoRI Xho I.
En particular, la PCR se realizó durante un total de 30 ciclos en las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 °C durante 60 segundos, hibridación a 55 °C durante 60 segundos y polimerización a 68 °C durante 30 segundos. Los productos de PCR amplificados se sometieron a una electroforesis en gel de agarosa al 1,0 % y se obtuvo una banda de 450 pb por elución.
Cebador directo (SEQ ID NO: 47):
5'-CAGCGACACCGACCGTCCCCCCGTACTTAAGGCC-3'
Cebador inverso (SEQ ID NO: 48):
5'-CTAACCGACTCTCGGGGAAGACTGAGCTCGCC-3'
El producto de PCR se clonó en un vector de expresión de células animales conocido, x0GC/dhfr, para preparar un vector recombinante x0GC/GCGR.
La línea celular CHO DG44 cultivada en medio DMEM/F12 (FBS al 10 %) se transfectó con el vector recombinante xOGC/GCGR utilizando Lipofectamine®, y se cultivó en un medio de selección que contenía G418 (1 mg/ml) y metotrexato 10 nM. Se seleccionaron líneas celulares de un solo clon de las mismas mediante una técnica de dilución límite, y finalmente se seleccionó una línea celular que muestra una excelente respuesta de AMPc a glucagón de una forma dependiente de la concentración.
Ejemplo2: Síntesis de derivado del glucagón
Para preparar derivados del glucagón con propiedades físicas mejoradas, la secuencia de aminoácidos del glucagón natural de SEQ ID NO: 1 se sustituyó con residuos de aminoácidos que tenían cargas positivas y negativas, y de este modo se sintetizaron derivados del glucagón como se muestra en la Tabla 1 a continuación. Las actividades relativasin vitrodescritas a continuación se midieron mediante el método descrito en el Ejemplo 4.
[Tabla 1]
En las secuencias de aminoácidos descritas en la Tabla 1, el aminoácido representado por X representa un aminoácido no natural, ácido aminoisobutírico (Aib), los residuos de aminoácidos subrayados representan la formación de un anillo y “ -” en la secuencia de aminoácidos indica que no hay residuo de aminoácido presente en la posición correspondiente.
Ejemplo 3: Medición del pI de derivados del glucagón
Para medir las propiedades físicas mejoradas de los derivados del glucagón sintetizados en el Ejemplo 2, los valores de pI se calcularon basándose en las secuencias de aminoácidos mediante el uso de la herramienta pI/Mw (http://expasy.org/tools/pi_tool.html; Gasteigeretal., 2003) en el servidor ExPASy.
Como se muestra en la Tabla 1 anterior, mientras que el glucagón natural de la SEQ ID NO: 1 tenía un pI de 6,8, algunos derivados del glucagón mostraron valores de pI en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 6.
Los derivados que tienen valores de pI inferiores o superiores al del glucagón natural pueden exhibir una solubilidad mejorada y una mayor estabilidad en una condición de pH neutro en comparación con el glucagón natural.
Por consiguiente, cuando los derivados del glucagón se usan como un agente terapéuti
pueden mejorar el cumplimiento del paciente, y también son adecuados para la administración junto con otros agentes contra la obesidad o agentes antidiabéticos y, por lo tanto, los derivados del glucagón de la presente invención pueden usarse eficazmente como un agente terapéuti
obesidad, diabetes, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), dislipidemia y cardiopatía coronaria.
Ejemplo 4: Medición de la actividad de AMPc de derivados del glucagón
Las actividades de los derivados del glucagón sintetizados en el Ejemplo 2 se midieron en líneas celulares que tenían los receptores de glucagón humanos producidos en el Ejemplo 1. Específicamente, la línea celular transfectada se subcultivó de 3 a 4 veces a la semana, se dividió en alícuotas en una placa de 384 pocillos en una cantidad de 6 x 10<3>líneas celulares/pocillo y se cultivaron durante 24 horas. Se suspendió glucagón natural y derivados del glucagón en el tampón de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), albúmina de suero bovino al 0,1 % (BSA) y ácido 4- (2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico 5 mM (HEPES) con las células de cultivo, a concentraciones de 200 nM y 1600 nM, respectivamente, se sometieron continuamente a una dilución de 4, 10 veces, se aplicaron a un kit de ensayo de AMPc (LANCE cAMP 384 kit, PerkinElmer) y se añadieron a las células cultivadas y se midió su valor de fluorescencia. Tras la medición, el valor de fluorescencia más alto se estableció en 100 % y a continuación se calcularon los valores de EC<50>del derivado del glucagón basándose en el mismo y en comparación con el del glucagón natural, respectivamente. Los resultados se muestran en la Tabla 1 anterior.
Ejemplo5: Preparación de un conjugado que incluye un derivado del glucagón y una región Fc de inmunoglobulina (SEQ ID NO: 12 o 20-conjugado de región Fc de inmunoglobulina)
Para la pegilación de un PEG de 10 kDa que tiene un grupo maleimida y un grupo aldehído, respectivamente, en ambos extremos (denominados “ maleimida-PEG-aldehído” , 10 kDa, NOF, Japón) en el residuo de cisteína de un derivado del glucagón (SEQ ID NOS: 12 y 20), los derivados del glucagón y maleimida-PEG-aldehído se hicieron reaccionar en una relación molar de 1: 1 a 5, a una concentración de proteína de 3 mg/ml a 10 mg/ml a baja temperatura durante 1 a 3 horas. En particular, la reacción se llevó a cabo en un entorno en donde se añadió del 20 % al 60 % de isopropanol. Una vez completada la reacción, los reactivos se aplicaron a SP sefarosa HP (GE Healthcare, EE. UU.) para purificar los derivados del glucagón mono-pegilados en la cisteína.
A continuación, los derivados del glucagón monopegilados purificados y una Fc de inmunoglobulina se hicieron reaccionar en una relación molar de 1: 2 a 10, a una concentración de proteína de 10 mg/ml a 50 mg/ml a 4 °C a 8 °C durante 12 horas a 18 horas. La reacción se llevó a cabo en un entorno en donde se añadió cianoborohidruro de sodio (NaCNBH<a>) y se añadió del 10 % al 20 % de isopropanol a tampón de fosfato de calcio 100 mM (pH 6,0). Una vez completada la reacción, los reactivos se aplicaron a la columna de purificación de butil sefarosa FF (GE Healthcare, EE. UU.) y la columna de purificación Source ISO (GE Healthcare, EE. UU.) para purificar el conjugado que incluye los derivados del glucagón y la Fc de inmunoglobulina.
Después de la preparación, se demostró que la pureza analizada por cromatografía de fase inversa, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico era del 95 % o superior.
En particular, el conjugado en donde el derivado del glucagón de SEQ ID NO: 12 y una Fc de inmunoglobulina estaban unidos por PEG se denominó “ el conjugado que incluye el derivado del glucagón de SEQ ID NO: 12 y una Fc de inmunoglobulina” o “ un derivado de acción prolongada de SEQ ID NO: 12” y se pueden usar indistintamente.
En particular, el conjugado en donde el derivado del glucagón de SEQ ID NO: 20 y una Fc de inmunoglobulina estaban unidos por PEG se denominó “ un conjugado que incluye el derivado del glucagón de SEQ ID NO: 20 y una Fc de inmunoglobulina” o “ un derivado de acción prolongada de SEQ ID NO: 20” y se pueden usar indistintamente.
Ejemplo6: Preparación de un conjugado que incluye un derivado de la exendina-4 y una Fc inmunoglobulina
Un PEG de 3,4 kDa que tiene un grupo propionaldehído en ambos extremos, es decir, PEG PropionALD (2) de 3,4k, se hizo reaccionar con la Lys de CA exendina-4 usando imidazo-acetil exendina-4 donde se eliminó el carbono alfa de la histidina N-terminal (CA exendina-4, AP, EE. UU.) y, a continuación, se realizó un acoplamiento basado en el pico del isómero en la parte más trasera (Lys27) entre los dos picos de Lys, que es bastante reactivo y se distingue claramente del isómero N-terminal.
Se hicieron reaccionar un péptido y una Fc de inmunoglobulina en una relación molar de 1: 8, a la concentración total de proteínas de 60 mg/ml a 4 °C durante 20 horas. El reactivo fue K-P 100 mM (pH 6,0) y se añadió, SCB 20 mM, un agente reductor. Los reactivos de acoplamiento se purificaron pasando a través de dos columnas de purificación. Primero, se eliminó una gran cantidad de Fc de inmunoglobulina no implicada en la reacción de acoplamiento usando SOURCE Q (XK-16 ml, Amersham Biosciences). La aplicación de un gradiente de sal usando NaCI 1 M a Tris 20 mM (pH 7,5) tiene como resultado la elución inmediata de la Fc de inmunoglobulina, que tiene una afinidad de unión relativamente débil, seguida inmediatamente por la elución de exendina-4-Fc de inmunoglobulina. La Fc de inmunoglobulina se elimina hasta cierto punto por la purificación primaria, sin embargo, la separación completa no se logró mediante la columna de intercambio iónico debido a la pequeña diferencia en la afinidad de unión entre la Fc de inmunoglobulina y la exendina-4-Fc de inmunoglobulina. Por consiguiente, la purificación secundaria se realizó usando la hidrofobicidad de los dos materiales diferentes. La muestra, que pasó a través de la purificación primaria, se unió a SOURCE ISO (HR16 ml, Amersham Biosciences) usando Tris 20 mM (pH 7,5) y sulfato de amonio 1,5 M y, a continuación, se eluyó mientras la concentración de sulfato de amonio se reducía gradualmente. Como resultado, la Fc de inmunoglobulina, que tiene una afinidad de unión débil por la columna de HIC, se eluyó primero, seguido de la elución de la muestra de exendina-4-Fc de inmunoglobulina, que tiene una fuerte afinidad de unión, a la parte posterior. La separación se realizó más fácilmente en comparación con la columna de intercambio iónico debido a la mayor diferencia en la hidrofobicidad.
Columna: SOURCE Q (XK 16 ml, Amersham Biosciences)
Caudal: 2,0 ml/min
Gradiente: A0 ->25 % 70 min B (A: Tris 20 mM pH 7,5, B: A+ NaCl 1 M)
Columna: SOURCE ISO (HR 16 ml, Amersham Biosciences)
Caudal: 7,0 ml/min
Gradiente: B 100 -> 0 % 60 min B [A: Tris 20 mM (pH 7,5), B: A sulfato de amonio 1,5 M ((NH4)2SO4)]
El conjugado así preparado, en donde el derivado de exendina-4 y la región Fc de inmunoglobulina estaban unidos por p Eg , se denominó “ un derivado de exendina-4 de acción prolongada” . Además, dicha expresión puede usarse indistintamente con “ un derivado de exendina de acción prolongada” .
Ejemploexperimental 1: Efecto de la reducción del peso corporal en ratas con obesidad inducida por una dieta rica en grasas
En este experimento, se usaron ratas con obesidad inducida por una dieta rica en grasas, que se usan ampliamente como modelos animales de obesidad. El peso corporal de las ratas antes de la administración fue de aproximadamente 600 g. Las ratas se alojaron individualmente durante el experimento con acceso libre al agua. Entre 6 AM y 6 PM no se proporcionó iluminación.
Los grupos de prueba alimentados con dieta rica en grasas incluyen: Grupo 1, con un excipiente (inyección una vez cada 3 días) - grupo control; Grupo 2, el derivado de exendina de acción prolongada del Ejemplo 6 a 3,3 nmol/kg (inyección una vez cada 3 días); Grupo 3, el derivado de acción prolongada de SEQ ID NO: 12 a 1,6 nmol/kg (inyección una vez cada 3 días); Grupo 4, el derivado de acción prolongada de SEQ ID NO: 12 a 3,3 nmol/kg (inyección una vez cada 3 días); Grupo 5, el derivado de acción prolongada de SEQ ID NO: 12 a 6,6 nmol/kg (inyección una vez cada 3 días); Grupo 6, el derivado de exendina de acción prolongada del Ejemplo 6 a 3,3 nmol/kg el derivado de acción prolongada de SEQ ID NO: 12 a 1,6 nmol/kg (inyección una vez cada 3 días, respectivamente); Grupo 7, el derivado de exendina de acción prolongada del Ejemplo 6 a 3,3 nmol/kg el derivado de acción prolongada de SEQ ID NO: 12 a 3,3 nmol/kg (inyección una vez cada 3 días, respectivamente); Grupo 8, el derivado de exendina de acción prolongada del Ejemplo 6 a 3,3 nmol/kg el derivado de acción prolongada de SEQ ID NO: 12 a 6,6 nmol/kg (inyección una vez cada 3 días, respectivamente); Grupo 9, una alimentación emparejada con la del Grupo 4; y Grupo 10, una alimentación emparejada con la del Grupo 7. El experimento se terminó en el 15.° día, y los cambios en el peso corporal de las ratas en cada grupo se midieron a intervalos de 3 días durante el progreso del experimento. Tras la terminación del experimento, la cantidad de grasa mesentérica y peso hepático se midió mediante autopsia. El análisis estadístico se realizó para comparar entre el grupo excipiente (grupo control) y los grupos de prueba mediante ANOVA unidireccional.
Como resultado de la medición de los cambios en el peso corporal, como se puede confirmar en la Figura 1, los grupos a los que se les administró el derivado de exendina de acción prolongada o el derivado de acción prolongada de SEQ ID NO: 12 solo mostraron una disminución en el peso corporal del -8 % y -7 % a -22 %, en comparación con el de antes de la administración, mientras que en grupos con una administración combinada del derivado exendina de acción prolongada y el derivado de acción prolongada de SEQ ID NO: 12, el efecto de reducción del peso corporal mejoró aún más del -22 % al -35 %.
De forma adicional, cuando el efecto de una disminución del peso corporal en el grupo al que se administró el derivado de acción prolongada de la SEQ ID NO: 12 solo y el grupo al que se administró la combinación del derivado exendina de acción prolongada y el derivado de acción prolongada de la SEQ ID NO: 12 se comparó con el del grupo de alimentación emparejada, respectivamente, se observó una diferencia de aproximadamente un -11 % y aproximadamente un -17 %, respectivamente, lo que confirma que el efecto reductor del peso corporal se observa cuando se administra con el derivado del glucagón solo o la administración combinada, por acciones distintas de la ingesta dietética.
Es decir, se confirmó que el derivado del glucagón de acción prolongada de la presente invención podría desempeñar un papel adicional en la reducción del peso corporal además del efecto de la anorexia.
De forma adicional, como resultado de la medición de la cantidad de grasa mesentérica y peso hepático, como se puede confirmar en las Figuras 2 y 3, la administración combinada del derivado de exendina de acción prolongada y el derivado de acción prolongada de la SEQ ID NO: 12 mostró una disminución significativa en la grasa corporal y también una disminución en el peso del hígado en comparación con la del grupo al que se administró un excipiente. En particular, el aumento/disminución del peso del hígado generalmente está causado por el aumento/disminución de la grasa presente en el hígado, y el efecto anterior de disminución en el peso del hígado muestra el efecto de reducir la grasa hepática. En consecuencia, la disminución de la grasa en el hígado puede medirse como un método para medir el efecto terapéutico del síndrome metabólico, tal como la obesidad, la diabetes, la esteatohepatitis no alcohólica, etc.
Ejemploexperimental 2: Efecto de la reducción del peso corporal en ratones con obesidad inducida por una dieta rica en grasas
En este experimento, se usaron ratones con obesidad inducida por dieta rica en grasas, que se usan ampliamente como modelos animales de obesidad. El peso corporal de los ratones antes de la administración fue de aproximadamente 55 g. Los ratones se alojaron a razón de 7 ratones por cada grupo durante el experimento y con acceso libre al agua. Entre 6 AM y 6 PM no se proporcionó iluminación.
Los grupos de prueba alimentados con dieta rica en grasas incluyen: Grupo 1, con un excipiente (inyección una vez cada 2 días) - grupo control; Grupo 2, el derivado de exendina de acción prolongada del Ejemplo 6 a 4,3 nmol/kg (inyección una vez cada 2 días); Grupo 3, el derivado de acción prolongada de SEQ ID NO: 20 a 4,4 nmol/kg (inyección una vez cada 2 días); Grupo 4, el derivado de acción prolongada de SEQ ID NO: 20 a 8,8 nmol/kg (inyección una vez cada 2 días); Grupo 5, el derivado de exendina de acción prolongada del Ejemplo 6 a 4,3 nmol/kg el derivado de acción prolongada de SEQ ID NO: 20 a 4,4 nmol/kg (inyección una vez cada 2 días); Grupo 6, el derivado de exendina de acción prolongada del Ejemplo 6 a 2,1 nmol/kg el derivado de acción prolongada de SEQ ID NO: 20 a 6,6 nmol/kg (inyección una vez cada 2 días); y el Grupo 7, el derivado de exendina de acción prolongada del Ejemplo 6 a 0,8 nmol/kg el derivado de acción prolongada de SEQ ID NO: 20 a 8,0 nmol/kg (inyección una vez cada 2 días). El experimento se terminó en el día 22, y los cambios en el peso corporal de los ratones en cada grupo se midieron a intervalos de 2 días durante el progreso del experimento. Tras la terminación del experimento, se midió el peso de los hígados de ratón mediante autopsia.
Como resultado de la medición de los cambios en el peso corporal, como se puede confirmar en la Figura 4, cada uno de los grupos a los que se administró el derivado de acción prolongada de s Eq ID NO: 20 (8,8 nmol/kg, inyección una vez cada 2 días) solo mostró una disminución en el peso corporal del -25 % y -29 %, respectivamente, en comparación con la administración antes. De forma adicional, se demostró que el efecto de reducir el peso corporal aumenta adicionalmente cuando se administra junto con el derivado de exendina de acción prolongada. También se confirmó que la administración combinada del derivado exendina de acción prolongada y el derivado de acción prolongada de SEQ ID NO: 20 en una relación de 1:1, 1:3 y 1:10 aumentó aún más el efecto de reducción del peso corporal en -50 % o más. De forma adicional, el efecto de reducción del peso corporal según la relación entre el derivado de exendina de acción prolongada y el derivado de acción prolongada de SEQ ID NO: 20 no fue significativo, sin embargo, el efecto de la anorexia se incrementó junto con el aumento en el porcentaje del derivado de exendina de acción prolongada, lo que confirma que el derivado del glucagón de acción prolongada podría desempeñar un papel adicional en la reducción del peso corporal además del efecto de la anorexia.
De forma adicional, como resultado de la medición del colesterol total en la sangre, como se puede confirmar en la Figura 5, cada uno de los grupos a los que se administró el derivado de exendina de acción prolongada (4,4 nmol/kg, inyección una vez cada 2 días) y el derivado de acción prolongada de SEQ ID NO: 20 (8,8 nmol/kg, inyección una vez cada 2 días) mostró una disminución en el colesterol de -35 % y -71 %, respectivamente. A partir de lo anterior, se confirmó que el derivado del glucagón de acción prolongada podría desempeñar un papel adicional en la reducción del colesterol en sangre además del efecto de la anorexia. El análisis estadístico se realizó para comparar entre el grupo excipiente (grupo control) y los grupos de prueba mediante ANOVA unidireccional.
El alcance de la presente invención se indica mediante las reivindicaciones adjuntas en lugar de por la descripción anterior.

Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES
    i.Una composición farmacéutica para usar en un método para tratar o prevenir síndromes metabólicos que comprende i) un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o 37 y ii) un péptido insulinotrópico,
    en donde el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o 37 está en forma de un conjugado de acción prolongada, al que está unido un material biocompatible capaz de aumentar la semividain vivodel péptido, y el péptido insulinotrópico está en forma de un conjugado de acción prolongada, al que está unido un material biocompatible capaz de aumentar la semividain vivodel péptido insulinotrópico.
  2. 2. La composición farmacéutica para usar según la reivindicación 1, en donde el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o 37 tiene un valor de punto isoeléctrico (pl) diferente al del glucagón natural (6,8) o es un derivado del glucagón capaz de activar un receptor de glucagón.
  3. 3. La composición farmacéutica para usar según la reivindicación 1, en donde el péptido insulinotrópico se selecciona del grupo que consiste en GLP-1, exendina-3, exendina-4, un agonista de los mismos, un derivado de los mismos, un fragmento de los mismos, una variante de los mismos y una combinación de los mismos; y opcionalmente en donde el péptido insulinotrópico es un derivado peptídico insulinotrópico, en donde el residuo de histidina N-terminal está sustituido con uno seleccionado del grupo que consiste en desaminohistidilo, N-dimetil-histidilo, p-hidroxi imidazopropionilo, 4-imidazoacetilo y p-carboxi imidazopropionilo.
  4. 4. La composición farmacéutica para usar según la reivindicación 3, en donde el péptido insulinotrópico se selecciona del grupo que consiste en una exendina-4 natural; un derivado de la exendina-4 en donde el grupo amina N-terminal de la exendina-4 está eliminado; un derivado de la exendina-4 en donde el grupo amina N-terminal de la exendina-4 está sustituido con un grupo hidroxilo; un derivado de la exendina-4 en donde el grupo amina N-terminal de la exendina-4 está modificado con un grupo dimetilo; un derivado de la exendina-4 en donde el carbono a del 1.er aminoácido de la exendina-4, histidina, está eliminado; un derivado de la exendina-4 en donde el 12.° aminoácido de la exendina-4, lisina, está sustituido con serina y un derivado de la exendina-4 en donde el 12.° aminoácido de la exendina-4, lisina, está sustituido con arginina.
  5. 5. La composición farmacéutica para usar según la reivindicación 1, en donde
    (i) el material biocompatible se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol, ácido graso, colesterol, albúmina y un fragmento de la misma, un material de unión a albúmina, un polímero de unidades repetidas de una secuencia de aminoácidos particular, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un material de unión a FcRn, tejido conjuntivoin vivoo un derivado del mismo, un nucleótido, fibronectina, transferrina, un sacárido y un polímero; o
    (ii) el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o 37 y el péptido insulinotrópico están unidos respectivamente a un material biocompatible mediante un enlazador seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, un copolímero de etilenglicol-propilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol polivinílico, un polisacárido, dextrano, polivinil etil éter, un polímero biodegradable que incluye ácido poliláctico (p La ) o ácido poliláctico-glicólico (PLGA), polímero lipídico, quitina, ácido hialurónico, ácido graso, un polímero, un compuesto de bajo peso molecular, un nucleótido y una combinación de los mismos.
  6. 6. La composición farmacéutica para usar según la reivindicación 1,
    en donde el material biocompatible es un material de unión a FcRn, y
    el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o 37 y el péptido insulinotrópico están unidos respectivamente a un material biocompatible mediante un enlazador peptídico o un enlazador no peptídico seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, un copolímero de etilenglicol-propilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol polivinílico, un polisacárido, dextrano, polivinil etil éter, un polímero biodegradable que incluye ácido poliláctico (PLA) o ácido poliláctico-glicólico (PLGA), polímero lipídico, quitina, ácido hialurónico y una combinación de los mismos; y opcionalmente en donde el material de unión a FcRn es un polipéptido que comprende una región Fc de inmunoglobulina.
  7. 7. La composición farmacéutica para usar según la reivindicación 6, en donde
    (i) la región Fc de inmunoglobulina está aglicosilada;
    (ii) la región Fc de inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste en:
    (a) un dominio CH1, un dominio CH2, un dominio CH3 y un dominio CH4;
    (b) un dominio CH1 y un dominio CH2;
    (c) un dominio CH1 y un dominio CH3;
    (d) un dominio CH2 y un dominio CH3;
    (e) una combinación entre uno o al menos dos dominios entre un dominio CH1, un dominio CH2, un dominio CH3 y un dominio CH4, y una región bisagra de inmunoglobulina o una parte de la región bisagra; y
    (f) un dímero entre cada dominio de la región constante de la cadena pesada y la región constante de la cadena ligera;
    (iii) el polipéptido que comprende la región Fc de inmunoglobulina está en forma de un dímero; (iv) la región Fc de inmunoglobulina es un derivado de Fc natural en donde se elimina la región capaz de formar un enlace disulfuro, un derivado de Fc natural en donde se elimina una parte del aminoácido(s) en el extremo N, un derivado de Fc natural en donde se elimina una parte del aminoácido(s) en el extremo N, un derivado de Fc natural en donde se añade una metionina al extremo N, un derivado de Fc natural en donde se elimina un sitio de unión al complemento, o un derivado de Fc natural en donde se elimina un sitio de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC);
    (v) la región Fc de inmunoglobulina deriva de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en IgG, IgA, IgD, IgE e IgM, y opcionalmente en donde la región Fc de inmunoglobulina es una región Fc de IgG4; o
    (vi) la región Fc de inmunoglobulina es una región Fc aglicosilada derivada de la IgG4 humana.
  8. 8. La composición farmacéutica para usar según la reivindicación 6, en donde
    (i) el enlazador no peptídico está unido al residuo de cisteína del péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o 37; o
    (ii) ambos extremos del enlazador no peptídico están unidos respectivamente a un grupo amina o un grupo tiol del péptido, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o 37, o el péptido insulinotrópico, y el material biocompatible.
  9. 9. La composición farmacéutica para usar según la reivindicación 1, en donde el síndrome metabólico se selecciona del grupo que consiste en tolerancia alterada a la glucosa, hipercolesterolemia, dislipidemia, obesidad, diabetes, hipertensión, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), aterosclerosis causada por dislipidemia, aterosclerosis, arteriosclerosis, cardiopatía coronaria y accidente cerebrovascular.
  10. 10. Un péptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37.
  11. 11. Un polinucleótido aislado que codifica el péptido aislado de la reivindicación 10.
  12. 12. Un vector que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 11.
  13. 13. Un conjugado aislado, en donde el péptido aislado de la reivindicación 10 y un material biocompatible capaz de aumentar la semividain vivoestán unidos.
  14. 14. El conjugado aislado de la reivindicación 13, en donde
    (i) el material biocompatible se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol, ácido graso, colesterol, albúmina y un fragmento de la misma, un material de unión a albúmina, un polímero de unidades repetidas de una secuencia de aminoácidos particular, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un material de unión a FcRn, tejido conjuntivoin vivoo un derivado del mismo, un nucleótido, fibronectina, transferrina, un sacárido y un polímero; o
    (ii) el péptido está unido a un material biocompatible mediante un enlazador seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, un copolímero de etilenglicol-propilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol polivinílico, un polisacárido, dextrano, polivinil etil éter, un polímero biodegradable que incluye ácido poliláctico (PLA) o ácido poliláctico-glicólico (PLGA), polímero lipídico, quitina, ácido hialurónico, ácido graso, un polímero, un compuesto de bajo peso molecular, un nucleótido y una combinación de los mismos.
  15. 15. El conjugado aislado de la reivindicación 13,
    en donde el material biocompatible es un material de unión a FcRn, y
    el péptido aislado está unido a un material biocompatible mediante un enlazador peptídico o un enlazador no peptídico seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, un copolímero de etilenglicol-propilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol polivinílico, un polisacárido, dextrano, polivinil etil éter, un polímero biodegradable que incluye ácido poliláctico (PLA) o ácido poliláctico-glicólico (PLGA), polímero lipídico, quitina, ácido hialurónico y una combinación de los mismos; opcionalmente en donde el material de unión a FcRn es un polipéptido que comprende una región Fc de inmunoglobulina.
  16. 16. Una composición que comprende el péptido aislado de la reivindicación 10 o el conjugado aislado de la reivindicación 15.
  17. 17.Una composición farmacéutica para usar en un método para tratar o prevenir la hipoglucemia o el síndrome metabólico, comprendiendo la composición el péptido aislado de la reivindicación 10 o el conjugado aislado de la reivindicación 13.
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