ES2971646T3 - Estabilización y aislamiento de ácidos nucleicos extracelulares - Google Patents
Estabilización y aislamiento de ácidos nucleicos extracelularesInfo
- Publication number
- ES2971646T3 ES2971646T3 ES18177073T ES18177073T ES2971646T3 ES 2971646 T3 ES2971646 T3 ES 2971646T3 ES 18177073 T ES18177073 T ES 18177073T ES 18177073 T ES18177073 T ES 18177073T ES 2971646 T3 ES2971646 T3 ES 2971646T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- sample
- nucleic acids
- blood
- cells
- stabilization
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 370
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 370
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 369
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 title claims description 189
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 title claims description 189
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title description 38
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 145
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 97
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims abstract description 89
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 68
- 229940123169 Caspase inhibitor Drugs 0.000 claims abstract description 56
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 341
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 259
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 215
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 215
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 110
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 37
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 36
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 32
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 29
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 26
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 26
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 25
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 24
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 24
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 19
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 15
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 12
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 9
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 9
- MBHINSULENHCMF-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpropanamide Chemical group CCC(=O)N(C)C MBHINSULENHCMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 7
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 4
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 4
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims description 4
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 claims description 3
- 229940127255 pan-caspase inhibitor Drugs 0.000 claims description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 206010048629 Wound secretion Diseases 0.000 claims description 2
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 claims description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 97
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 89
- 229940088872 Apoptosis inhibitor Drugs 0.000 abstract description 66
- 239000000158 apoptosis inhibitor Substances 0.000 abstract description 66
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 152
- RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone Chemical compound OCC(=O)CO RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 140
- 229940120503 dihydroxyacetone Drugs 0.000 description 70
- -1 DNA and/or RNA Chemical class 0.000 description 56
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 48
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 43
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 35
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 35
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 33
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 32
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 32
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 32
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 28
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 28
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 27
- OOBJCYKITXPCNS-REWPJTCUSA-N (3s)-5-(2,6-difluorophenoxy)-3-[[(2s)-3-methyl-2-(quinoline-2-carbonylamino)butanoyl]amino]-4-oxopentanoic acid Chemical group O=C([C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C=1N=C2C=CC=CC2=CC=1)C(C)C)COC1=C(F)C=CC=C1F OOBJCYKITXPCNS-REWPJTCUSA-N 0.000 description 26
- 108091092240 circulating cell-free DNA Proteins 0.000 description 23
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 23
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 22
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 21
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 19
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 19
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 18
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 16
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 14
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 13
- 108091007065 BIRCs Proteins 0.000 description 12
- 102000055031 Inhibitor of Apoptosis Proteins Human genes 0.000 description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 12
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- MIFGOLAMNLSLGH-QOKNQOGYSA-N Z-Val-Ala-Asp(OMe)-CH2F Chemical compound COC(=O)C[C@@H](C(=O)CF)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 MIFGOLAMNLSLGH-QOKNQOGYSA-N 0.000 description 9
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 9
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 9
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 9
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 9
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 8
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone phosphate Chemical compound OCC(=O)COP(O)(O)=O GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 8
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 description 7
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 7
- 238000013382 DNA quantification Methods 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 7
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 7
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 7
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- VQHSOMBJVWLPSR-WUJBLJFYSA-N maltitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O VQHSOMBJVWLPSR-WUJBLJFYSA-N 0.000 description 7
- 239000000845 maltitol Substances 0.000 description 7
- 235000010449 maltitol Nutrition 0.000 description 7
- 229940035436 maltitol Drugs 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 6
- 108091058560 IL8 Proteins 0.000 description 6
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 6
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 6
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 6
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 6
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 6
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 6
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 6
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 6
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000006527 (C1-C5) alkyl group Chemical group 0.000 description 5
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 5
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 description 5
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 5
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 5
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000011593 sulfur Chemical group 0.000 description 5
- HKIPCXRNASWFRU-UHFFFAOYSA-N 1,3-difluoropropan-2-one Chemical compound FCC(=O)CF HKIPCXRNASWFRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 4
- 102100029855 Caspase-3 Human genes 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 4
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 4
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 4
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 4
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 4
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 4
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- 125000003748 selenium group Chemical group *[Se]* 0.000 description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 4
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SUAKHGWARZSWIH-UHFFFAOYSA-N N,N‐diethylformamide Chemical compound CCN(CC)C=O SUAKHGWARZSWIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 3
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 3
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 3
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 3
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 3
- 125000001188 haloalkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 3
- 102000004068 Caspase-10 Human genes 0.000 description 2
- 108090000572 Caspase-10 Proteins 0.000 description 2
- 108090000570 Caspase-12 Proteins 0.000 description 2
- 102000004066 Caspase-12 Human genes 0.000 description 2
- 102100026548 Caspase-8 Human genes 0.000 description 2
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 2
- 102000004039 Caspase-9 Human genes 0.000 description 2
- 108090000566 Caspase-9 Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091007413 Extracellular RNA Proteins 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 239000000061 acid fraction Substances 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 2
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005103 alkyl silyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 125000000732 arylene group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 108091092259 cell-free RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 2
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- CTLSWQCNBBIODE-UHFFFAOYSA-N n,n-diethylacetamide;n,n-dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O.CCN(CC)C(C)=O CTLSWQCNBBIODE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N propionamide Chemical compound CCC(N)=O QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940080818 propionamide Drugs 0.000 description 2
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 2
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 2
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 125000004191 (C1-C6) alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006552 (C3-C8) cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 125000002030 1,2-phenylene group Chemical group [H]C1=C([H])C([*:1])=C([*:2])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- HGXSRHURBLKSOD-UHFFFAOYSA-N 1,3-dichloropropan-2-one;hydrochloride Chemical compound Cl.ClCC(=O)CCl HGXSRHURBLKSOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001989 1,3-phenylene group Chemical group [H]C1=C([H])C([*:1])=C([H])C([*:2])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000001140 1,4-phenylene group Chemical group [H]C1=C([H])C([*:2])=C([H])C([H])=C1[*:1] 0.000 description 1
- FJGNTEKSQVNVTJ-UHFFFAOYSA-N 1-Deoxy-D-ribitol Chemical compound CC(O)C(O)C(O)CO FJGNTEKSQVNVTJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SKCKOFZKJLZSFA-UHFFFAOYSA-N 1-deoxy-D-glucitol Chemical compound CC(O)C(O)C(O)C(O)CO SKCKOFZKJLZSFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 7028-40-2 Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- WSVLPVUVIUVCRA-KPKNDVKVSA-N Alpha-lactose monohydrate Chemical compound O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WSVLPVUVIUVCRA-KPKNDVKVSA-N 0.000 description 1
- 125000000882 C2-C6 alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007590 Calpain Human genes 0.000 description 1
- 108010032088 Calpain Proteins 0.000 description 1
- 101710094818 Caspase a Proteins 0.000 description 1
- 102100035904 Caspase-1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000426 Caspase-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100025597 Caspase-4 Human genes 0.000 description 1
- 101710090338 Caspase-4 Proteins 0.000 description 1
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- OXQKEKGBFMQTML-UHFFFAOYSA-N D-glycero-D-gluco-heptitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)CO OXQKEKGBFMQTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 108010010974 Proteolipids Proteins 0.000 description 1
- 102000016202 Proteolipids Human genes 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005775 apoptotic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000002029 aromatic hydrocarbon group Chemical group 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- GIXWDMTZECRIJT-UHFFFAOYSA-N aurintricarboxylic acid Chemical compound C1=CC(=O)C(C(=O)O)=CC1=C(C=1C=C(C(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C(C(O)=O)=C1 GIXWDMTZECRIJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000006177 biological buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 108010079785 calpain inhibitors Proteins 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000006721 cell death pathway Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000006800 cellular catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002487 chromatin immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960001855 mannitol Drugs 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010338 mechanical breakdown Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- AJFDBNQQDYLMJN-UHFFFAOYSA-N n,n-diethylacetamide Chemical compound CCN(CC)C(C)=O AJFDBNQQDYLMJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YFCUZWYIPBUQBD-ZOWNYOTGSA-N n-[(3s)-7-amino-1-chloro-2-oxoheptan-3-yl]-4-methylbenzenesulfonamide;hydron;chloride Chemical compound Cl.CC1=CC=C(S(=O)(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)CCl)C=C1 YFCUZWYIPBUQBD-ZOWNYOTGSA-N 0.000 description 1
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000003014 phosphoric acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 1
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000009598 prenatal testing Methods 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000012421 spiking Methods 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012815 thermoplastic material Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012780 transparent material Substances 0.000 description 1
- 229920006352 transparent thermoplastic Polymers 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- OXQKEKGBFMQTML-KVTDHHQDSA-N volemitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(O)[C@H](O)[C@H](O)CO OXQKEKGBFMQTML-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
La presente invención proporciona métodos, composiciones y dispositivos para estabilizar la población de ácido nucleico extracelular en una muestra biológica que contiene células usando un inhibidor de la apoptosis, preferiblemente un inhibidor de caspasa, un agente hipertónico y/o un compuesto de acuerdo con la fórmula (1) como se define en las reclamaciones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCION
Estabilización y aislamiento de ácidos nucleicos extracelulares
El trabajo que ha dado lugar a esta invención ha recibido financiación del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea (7PM/2007-2013) en virtud del acuerdo de subvención n° 222916.
Campo de la invención.
La tecnología descrita en el presente texto se refiere a métodos y composiciones adecuadas para estabilizar la población de ácido nucleico extracelular en una muestra que contiene células, en particular en una muestra de sangre, y a un método para aislar ácidos nucleicos extracelulares de muestras biológicas estabilizadas respectivamente.
Antecedentes.
Se han identificado ácidos nucleicos extracelulares en sangre, plasma, suero y otros fluidos corporales. Los ácidos nucleicos extracelulares que se encuentran en muestras respectivas son hasta cierto punto resistentes a la degradación debido al hecho de que están protegidos de las nucleasas (por ejemplo, porque se segregan en forma de un complejo proteolipídico, están asociados con proteínas o están contenidos en vesículas). La presencia de niveles elevados de ácidos nucleicos extracelulares, tales como ADN y/o ARN, en muchas afecciones médicas, tumores malignos y procesos infecciosos es de interés, entre otras cosas, para el cribado, el diagnóstico, el pronóstico, la vigilancia de la progresión de la enfermedad, para identificar dianas terapéuticas potenciales, y para monitorizar la respuesta al tratamiento. Además, se usa ADN/ARN fetal elevado en sangre materna para determinar p. ej. la identidad del género, evaluar anomalías cromosómicas y monitorizar las complicaciones asociadas con el embarazo. Por tanto, los ácidos nucleicos extracelulares son particularmente útiles en el diagnóstico y el pronóstico no invasivos y pueden usarse, p. ej., como marcadores de diagnóstico en muchos campos de aplicación, tales como pruebas genéticas prenatales no invasivas, oncología, medicina de trasplantes u otras muchas enfermedades y, por tanto, son de relevancia diagnóstica (por ejemplo, ácidos nucleicos fetales o derivados de tumores). Sin embargo, los ácidos nucleicos extracelulares también se encuentran en seres humanos sanos. Las aplicaciones comunes y los métodos de análisis de ácidos nucleicos extracelulares se describen p. ej. en los documentos WO97/035589, WO97/34015, Swarup et al., FEBS Letters 581 (2007) 795 - 799, Fleischhacker Ann. N. Y. Acad. Sci. 1075: 40 - 49 (2006), Fleischhacker y Schmidt,
Biochimica et Biophysica Acta 1775 (2007) 191 - 232, Hromadnikova et al. (2006) DNA and Cell Biology, Volumen 25, Número 11, pp 635 - 640; Fan et al. (2010) Clinical Chemistry 56: 8. En este contexto, cabe mencionar el documento WO 2008145710, que se considerará el estado de la técnica más próximo. El documento WO2008145710 enseña a estabilizar muestras celulares añadiendo N,N-dialquilformamida o N,N-dialquilacetamida. Por lo tanto, este documento reconoce la ventaja de utilizar una N,N-ialquilcarboxamida para estabilizar el contenido celular cuando, por ejemplo, se extrae sangre.
T radicionalmente, la primera etapa del aislamiento de ácidos nucleicos extracelulares a partir de una muestra biológica que contiene células, tal como sangre, es obtener una fracción esencialmente libre de células de dicha muestra, p. ej. bien sea suero o bien plasma en el caso de la sangre. Los ácidos nucleicos extracelulares se aíslan después de dicha fracción libre de células, comúnmente plasma, cuando se procesa una muestra de sangre. Sin embargo, obtener una fracción de una muestra esencialmente libre de células puede ser problemático y la separación es frecuentemente un proceso tedioso y lento de múltiples etapas, ya que es importante usar condiciones controladas cuidadosamente para evitar la rotura de las células durante la centrifugación, que podría contaminar los ácidos nucleicos extracelulares con ácidos nucleicos celulares liberados durante la rotura. Además, frecuentemente es difícil eliminar todas las células. Así pues, muchas muestras procesadas que a menudo y comúnmente se clasifican como "libres de células", tales como plasma o suero, todavía contienen de hecho cantidades residuales de células que no se eliminaron durante el proceso de separación. Otra consideración importante es que el ácido nucleico celular se libera de las células contenidas en la muestra debido a la rotura celular durante la incubaciónex vivo,típicamente dentro de un período de tiempo relativamente corto desde una operación de extracción de sangre. Una vez que comienza la lisis celular, las células lisadas liberan ácidos nucleicos adicionales que se mezclan con los ácidos nucleicos extracelulares, y se hace cada vez más difícil recuperar los ácidos nucleicos extracelulares para pruebas. Estos problemas se discuten en la técnica anterior (véase, por ejemplo, Chiu et al. (2001), Clinical Chemistry 47: 9 1607 - 1613, Fan et al (2010) y US2010/0184069). Además, la cantidad y la recuperabilidad de los ácidos nucleicos extracelulares disponibles pueden disminuir sustancialmente durante un período de tiempo debido a la degradación.
Además de ácidos nucleicos extracelulares de mamífero que se derivan p. ej. de células tumorales o del feto, las muestras que contienen células también pueden comprender otros ácidos nucleicos de interés que no están comprendidos en las células. Un ejemplo importante, no limitante, son ácidos nucleicos patógenos tales como ácidos nucleicos virales. La preservación de la integridad de los ácidos nucleicos virales en muestras que contienen células, como en particular en muestras de sangre, durante el envío y la manipulación, también es crucial para el posterior análisis y monitorización de la carga viral.
Los problemas discutidos anteriormente son en particular un problema, si la muestra comprende una gran cantidad de células como es el caso, p. ej., con las muestras de sangre entera. Por lo tanto, para evitar respectivamente reducir los problemas descritos anteriormente, es común separar una fracción esencialmente libre de células de la muestra de las células contenidas en la muestra, básicamente, inmediatamente después de obtenerse la muestra. P. ej. se recomienda obtener plasma sanguíneo a partir de sangre entera, básicamente, directamente después de extraer la sangre y/o enfriar la sangre completa y/o el plasma o suero obtenido con el fin de preservar la integridad de los ácidos nucleicos extracelulares y evitar contaminaciones de la población de ácido nucleico extracelular con ácidos nucleicos intracelulares que se liberan de las células contenidas. Sin embargo, la necesidad de separar directamente p. ej. el plasma de la sangre es una importante desventaja porque muchas instalaciones en donde se extrae sangre (por ejemplo, la consulta de un médico) carecen de una centrífuga que permita la separación eficaz del plasma sanguíneo. Además, el plasma que se obtiene en condiciones regulares comprende a menudo cantidades residuales de células que, en consecuencia, pueden también dañarse o morir durante la manipulación de la muestra, liberando así ácidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genómico, como se describió anteriormente. Estas células remanentes también plantean un riesgo de dañarse durante la manipulación de modo que su contenido de ácido nucleico, particularmente ADN genómico (nuclear) y ARN citoplasmático, se fusionaría y por tanto contaminaría o diluiría la fracción de ácido nucleico extracelular circulante. Para eliminar estas células contaminantes remanentes y para evitar/reducir los problemas anteriormente mencionados, se conocía la realización de una segunda etapa de centrifugación a una velocidad más elevada. Sin embargo, una vez más, estas potentes centrífugas no suelen estar disponibles en las instalaciones en donde se obtiene la sangre. Además, incluso si el plasma se obtiene directamente después de extraer la sangre, se recomienda congelarlo a -80 °C para conservar los ácidos nucleicos contenidos en él, si los ácidos nucleicos no pueden aislarse directamente. Esto también impone restricciones prácticas sobre el procesamiento de las muestras, como p. ej. que las muestras de plasma deben enviarse congeladas. Esto aumenta los costes y, además, presenta el riesgo de que la muestra se vea comprometida en caso de que se interrumpa la cadena de frío.
Por lo general y en el momento presente, las muestras de sangre se recogen habitualmente en tubos de recogida de sangre que contienen EDTA líquido o secado por pulverización (por ejemplo, BD Vacutainer K<2>EDTA). El EDTA quela el calcio y otros iones de metales bivalentes, inhibiendo de ese modo las reacciones enzimáticas, como p. ej. la coagulación de la sangre o la degradación del ADN debido a DNasas. Sin embargo, aun cuando es un anticoagulante eficaz, el EDTA no previene eficazmente la dilución, respectivamente la contaminación de la población de ácido nucleico extracelular por los ácidos nucleicos intracelulares liberados. Por lo tanto, la población de ácido nucleico extracelular que se encuentra en la porción libre de células de la muestra cambia durante el almacenamiento. Según esto, el EDTA no es capaz de estabilizar suficientemente la población de ácido nucleico extracelular, en particular porque no puede evitar la contaminación de la población de ácido nucleico extracelular, p. ej. con fragmentos de ADN genómico que se generan después de la extracción de sangre por degradación celular e inestabilidad celular durante el transporte y almacenamiento de la muestra.
Se conocen métodos en la técnica anterior que apuntan específicamente a estabilizar los ácidos nucleicos circulantes contenidos en la sangre completa. Un método emplea el uso de formaldehído para estabilizar las membranas celulares, reduciendo así la lisis celular y, además, el formaldehído inhibe las nucleasas. Los métodos respectivos se describen, p. ej., en los documentos US 7,332,277 y US 7,442,506. Sin embargo, el uso de formaldehído o sustancias que liberan formaldehído tiene inconvenientes, ya que pueden comprometer la eficacia del aislamiento del ácido nucleico extracelular mediante la inducción de reticulaciones entre moléculas de ácido nucleico o entre proteínas y ácidos nucleicos. Los métodos alternativos para estabilizar muestras de sangre se describen p. ej. en los documentos US 2010/0184069 y US 2010/0209930. Estos métodos recientemente desarrollados demuestran la gran necesidad de proporcionar medios para estabilizar muestras biológicas que contienen células, para permitir la recuperación eficiente de, p. ej., ácidos nucleicos extracelulares contenidos en tales muestras.
Sin embargo, a pesar de estos desarrollos bastante recientes, todavía hay una continua necesidad de desarrollar técnicas de procesamiento de muestras que den como resultado una estabilización de la población de ácido nucleico extracelular comprendida en una muestra biológica, en particular una muestra que contiene células, incluyendo muestras sospechosas de contener células, en particular sangre completa, plasma o suero, haciendo así más fácil la manipulación y el procesamiento de dichas muestras (p. ej. evitando la necesidad de separar directamente el plasma de la sangre completa o enfriar o incluso congelar el plasma aislado) haciendo así también fiable el aislamiento y las pruebas de los ácidos nucleicos extracelulares contenidos en tales muestras y mejorando de esta forma las capacidades de diagnóstico y pronóstico de los ácidos nucleicos extracelulares. En particular, hay una continua necesidad de una solución para conservar ácidos nucleicos extracelulares en muestras de sangre completa, p. ej. para pruebas prenatales y/o para el cribado de enfermedades neoplásicas, en particular enfermedades premalignas o malignas.
El objeto de la presente invención es superar al menos uno de los inconvenientes de los métodos de estabilización de muestras de la técnica anterior. Por tanto, entre otros, un objetivo de la presente invención es proporcionar un método que es capaz de estabilizar una muestra que contiene células, en particular sangre completa. En particular, es un objeto de la presente invención estabilizar la población de ácido nucleico extracelular contenida en una muestra biológica y en particular evitar una contaminación de la población de ácido nucleico extracelular con ADN genómico, en particular ADN genómico fragmentado. Además, un objeto particular de la presente invención es proporcionar un método adecuado para estabilizar una muestra biológica, preferiblemente una muestra de sangre completa, incluso a temperatura ambiente, preferiblemente durante un período de al menos dos, preferiblemente al menos tres días. Además, es un objeto de la presente invención proporcionar un recipiente colector de muestras, en particular un tubo colector de sangre, que sea capaz de estabilizar eficazmente una muestra biológica y en particular la población de ácido nucleico extracelular comprendida en la muestra.
Compendio de la invención.
La presente invención está basada en el descubrimiento de que ciertos aditivos son sorprendentemente eficaces en la estabilización de muestras biológicas que contienen células, que comprenden ácidos nucleicos extracelulares, en particular muestras de sangre completa o muestras derivadas de sangre completa tales como, por ejemplo, plasma sanguíneo. Se descubrió que estos aditivos son altamente eficaces para estabilizar la población de ácido nucleico extracelular y en particular son capaces de evitar, o al menos reducir significativamente, la contaminación con ADN genómico, en particular ADN genómico fragmentado.
Según un primer aspecto, se proporciona un método adecuado para estabilizar una población de ácido nucleico extracelular comprendida en una muestra que contiene células, en donde una muestra se pone en contacto con
a) al menos un inhibidor de la apoptosis,
b) al menos un agente hipertónico, que estabiliza las células comprendidas en la muestra, y/o
c) al menos un compuesto según la fórmula 1
en donde R1 es un resto de hidrógeno o un resto alquilo, preferiblemente un resto alquilo C1-C5, siendo más preferido un resto metilo, R2 y R3 son restos de hidrocarburo idénticos o diferentes, con una longitud de la cadena de carbono de 1 - 20 átomos dispuesta de forma lineal o ramificada, y R4 es un resto de oxígeno, azufre o selenio.
Según un primer sub-aspecto, se proporciona un método adecuado para estabilizar una población de ácido nucleico extracelular comprendido en una muestra que contiene células, en donde la muestra se pone en contacto con al menos un inhibidor de la apoptosis. Preferiblemente, la muestra que contiene células se elige entre sangre completa, plasma o suero. Sorprendentemente, se encontró que el inhibidor de apoptosis reduce las contaminaciones de la población de ácido nucleico extracelular con ácidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genómico fragmentado, que se originan a partir de células contenidas en la muestra, p. ej. de células dañadas o moribundas. Además, los autores de la presente invención encontraron que el inhibidor de la apoptosis reduce la degradación de los ácidos nucleicos presentes en la muestra. Por tanto, la estabilización descrita en este documento usando un inhibidor de la apoptosis tiene el efecto de que la población de ácido nucleico extracelular contenida en la muestra se conserva sustancialmente en el estado que había mostrado en el momento en que se obtuvo o se recogió la muestra biológica.
Según un segundo sub-aspecto, se proporciona un método adecuado para estabilizar una población de ácido nucleico extracelular comprendida en una muestra que contiene células, en donde una muestra se pone en contacto con al menos un agente hipertónico que es capaz de estabilizar las células comprendidas en la muestra. Sorprendentemente, se descubrió que la contracción o encogimiento celular inducido por efectos hipertónicos leves (ósmosis) da como resultado un aumento considerable de la estabilidad celular. Al aumentar la estabilidad celular, el agente hipertónico en particular reduce la liberación de ácidos nucleicos intracelulares, en particular el ADN genómico, desde las células contenidas a la porción o compartimento extracelular de la muestra. Por lo tanto, la estabilización según la presente invención usando un agente hipertónico tiene el efecto de que la población de ácido nucleico extracelular contenida en la muestra se conserva sustancialmente en el estado que había mostrado en el momento en que se obtuvo o se recogió respectivamente la muestra biológica.
Según un tercer sub-aspecto de la presente invención, se proporciona un método adecuado para estabilizar una población de ácido nucleico extracelular comprendida en una muestra que contiene células, en donde una muestra se pone en contacto con al menos un compuesto según la fórmula 1
en donde R1 es un resto de hidrógeno o un resto alquilo, preferiblemente un resto alquilo C1 - C5, más preferiblemente un resto metilo, R2 y R3 son restos hidrocarburo idénticos o diferentes con una longitud de cadena de carbono de 1 -20 átomos dispuestos de forma lineal o ramificada, y R4 es un resto de oxígeno, azufre o selenio. Se encontró que añadiendo un compuesto respectivo tiene un efecto estabilizante ventajoso sobre la población de ácido nucleico extracelular.
Según un cuarto sub-aspecto, se proporciona un método adecuado para estabilizar una población de ácido nucleico extracelular comprendido en una muestra que contiene células, en donde una muestra se pone en contacto con
a) al menos un inhibidor de la apoptosis, y
b) al menos un agente hipertónico, que estabiliza las células comprendidas en la muestra.
Se encontró que la combinación de estos agentes estabilizantes (y opcionalmente aditivos adicionales) es notablemente eficaz en la inhibición de la liberación de ácidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genómico, desde las células contenidas a la porción extracelular de la muestra. Además, se demostró que la degradación de los ácidos nucleicos presentes en la muestra se previene de manera altamente eficiente. En particular, se encuentra menos ADN genómico fragmentado en muestras estabilizadas. Por lo tanto, la estabilización según este documento usando esta combinación de aditivos estabilizantes tiene el efecto de que la población de ácido nucleico extracelular contenida en la muestra se conserva sustancial y efectivamente en el estado que había mostrado en el momento en que se obtuvo o se recolectó respectivamente la muestra biológica (p. ej. se extrajo en el caso de la sangre) y que en particular se reducen las contaminaciones de la población de ácido nucleico extracelular con ADN genómico fragmentado.
Para potenciar el efecto de estabilización hacia ácidos nucleicos extracelulares, es también un objeto de la presente invención proporcionar otras combinaciones de agentes estabilizadores con el fin de estabilizar la población de ácido nucleico extracelular comprendida en una muestra que contiene células. Una combinación puede comprender al menos un inhibidor de la apoptosis, al menos un agente hipertónico y/o al menos un compuesto según la fórmula 1 como se definió anteriormente, por ejemplo (1) una combinación de al menos un inhibidor de la apoptosis y al menos un compuesto según la fórmula 1 como se definió anteriormente, (2) una combinación de al menos un agente hipertónico y al menos un compuesto según la fórmula 1, o (3) una combinación de los tres agentes estabilizantes, es decir, al menos un inhibidor de la apoptosis, al menos un agente hipertónico y al menos un compuesto según la fórmula 1. Una combinación respectiva también puede comprender aditivos adicionales que potencian el efecto estabilizador tal como, p. ej., agentes quelantes. En caso de que la muestra sea sangre o una muestra derivada de sangre, normalmente se agrega también un anticoagulante. Agentes quelantes como p. ej. EDTA son adecuados para este propósito. Las respectivas combinaciones de estabilización pueden ser según un quinto sub-aspecto utilizado ventajosamente en un método adecuado para estabilizar una población de ácido nucleico extracelular comprendida en una muestra que contiene células según el primer aspecto de la presente invención.
Según un segundo aspecto, se proporciona un método para el aislamiento de ácidos nucleicos extracelulares de una muestra biológica, en donde dicho método comprende las etapas de:
a) estabilizar la población de ácido nucleico extracelular comprendida en una muestra según el método definido en el primer aspecto de la presente invención; y
b) aislar los ácidos nucleicos extracelulares de dicha muestra.
La estabilización en la etapa a) se puede lograr p. ej. según uno de los cinco sub-aspectos del primer aspecto según la presente invención, como se describió anteriormente. Como se discutió anteriormente, la estabilización según la presente invención tiene el efecto de que la población de ácido nucleico extracelular contenida en la muestra se conserva sustancialmente en el estado que había mostrado en el momento en que se obtuvo o respectivamente se recolectó la muestra biológica. Por lo tanto, los ácidos nucleicos extracelulares obtenidos a partir de una muestra estabilizada respectivamente comprenden menos contaminaciones con ácidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genómico fragmentado, que resulta p. ej. de células en descomposición comprendidas en la muestra, en comparación con los ácidos nucleicos extracelulares que se obtienen de una muestra no estabilizada. La preservación sustancial de la población de ácido nucleico extracelular es una ventaja importante porque esta estabilización/preservación mejora la precisión de cualquier prueba posterior. Permite estandarizar el aislamiento y el análisis subsiguiente de la población de ácido nucleico extracelular, haciendo así que las aplicaciones de diagnóstico o pronóstico que se basan en la fracción de ácido nucleico extracelular sean más fiables y más independientes de las condiciones de almacenamiento/manipulación utilizadas. De ese modo, se mejora la aplicabilidad en diagnóstico y pronóstico de los ácidos nucleicos extracelulares respectivamente aislados. En particular, las enseñanzas de la presente invención tienen la ventaja de que la relación de ciertas moléculas de ácido nucleico extracelular pueden mantenerse sustancialmente constantes en comparación con la relación en el momento en que se recolectó la muestra. La estabilización consigue que los ácidos nucleicos intracelulares se mantengan sustancialmente dentro de las células y que los ácidos nucleicos extracelulares sean sustancialmente estabilizados.
Según un tercer aspecto, se describe una composición adecuada para estabilizar una muestra biológica que contiene células, que comprende:
a) al menos un inhibidor de la apoptosis, preferiblemente un inhibidor de la caspasa, y/o
b) al menos un agente hipertónico que es adecuado para estabilizar las células comprendidas en la muestra, preferiblemente un compuesto orgánico hidroxilado; y/o
c) al menos un compuesto según la fórmula 1 como se definió anteriormente; y/o
d) opcionalmente al menos un anticoagulante, preferiblemente un agente quelante.
Una composición estabilizante respectiva es particularmente efectiva en la estabilización de una muestra biológica que contiene células, en particular sangre completa, plasma y/o suero, estabilizando las células y el población de ácido nucleico extracelular comprendida en dicha muestra. Preferiblemente, al menos dos de los agentes estabilizantes definidos en los apartados de a) a c) más preferidos, todos los agentes estabilizadores definidos en dichos apartados a) a c) están presentes en la composición de estabilización. Una composición de estabilización respectiva permite el almacenamiento y/o la manipulación, p. ej. su envío, de la muestra, p. ej. sangre completa, a temperatura ambiente durante al menos dos, o preferiblemente al menos tres días sin comprometer sustancialmente la calidad de la muestra, respectivamente, la población de ácido nucleico extracelular contenida en la misma. Por lo tanto, cuando se utiliza la composición de estabilización descrita en este documento, el tiempo entre la recogida de muestras, p. ej. la extracción de sangre y la extracción de ácido nucleico, puede variar sin un efecto sustancial sobre la población de ácido nucleico extracelular contenida en la muestra. Esto es una ventaja importante ya que reduce la variabilidad en la población de ácido nucleico extracelular atribuible a diferentes procedimientos de manipulación.
Según un cuarto aspecto, se describe un recipiente para recoger una muestra biológica que contiene células, preferiblemente una muestra de sangre, en donde el contenedor comprende una composición según el tercer aspecto de la presente invención. Proporcionar un contenedor respectivo, p. ej. un tubo colector de muestras que comprende la composición de estabilización, tiene la ventaja de que la muestra se estabiliza inmediatamente tan pronto como la muestra se recoge en el recipiente correspondiente. Además, un recipiente colector de muestras respectivo, en particular un tubo colector de sangre, es capaz de estabilizar células sanguíneas y ácidos nucleicos extracelulares y opcionalmente, virus respectivamente ácidos nucleicos virales contenidos en una muestra de sangre o una muestra derivada de sangre. De ese modo, se solucionó otro problema.
Según un quinto aspecto, se proporciona un método que comprende la etapa de recoger, preferiblemente extraer, una muestra biológica de un paciente, preferiblemente sangre, directamente en una cámara de un recipiente según el cuarto aspecto de la presente invención.
Según un sexto aspecto, se proporciona un método para producir una composición según el tercer aspecto de la presente invención, en donde los componentes de la composición se mezclan, preferiblemente se mezclan en una solución. El término "solución", como se usa en el presente texto en particular, se refiere a una composición líquida, preferiblemente una composición acuosa. Puede ser una mezcla homogénea de una sola fase, pero también está dentro del alcance de la presente invención que una solución comprenda componentes sólidos tales como, p. ej., precipitados.
Otros objetos, características, ventajas y aspectos de la presente solicitud serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción que sigue y de las reivindicaciones adjuntas. Sin embargo, ha de entenderse que la siguiente descripción, las reivindicaciones adjuntas y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones de la solicitud preferidas, se dan solamente a título de ilustración. Diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y del alcance de la invención descrita resultarán evidentes para los expertos en la técnica al leer lo que sigue.
Breve descripción de los dibujos.
La Fig. 1a muestra una imagen del gel después de la electroforesis con chip de ADN aislado de muestras tratadas con inhibidores de la caspasa (Ejemplo 1).
La Fig. 1b es un diagrama que muestra el efecto de los inhibidores de la caspasa sobre el aumento de ADN 18S ribosómico en el plasma (Ejemplo 1).
La Fig. 2a muestra una imagen del gel después de la electroforesis con chip del ADN aislado de muestras tratadas con diferentes concentraciones del inhibidor de la caspasa Q-VD-OPH en combinación (Ejemplo 2).
La Fig. 2b es un diagrama que muestra los efectos de diferentes concentraciones del inhibidor de la caspasa Q-VD-OPH en combinación con glucosa sobre el aumento de ADN de 18S ribosómico en el plasma (Ejemplo 2).
La Fig. 3 muestra la integridad de las células sanguíneas medida mediante citometría de flujo para las células sanguíneas tratadas con dihidroxiacetona disuelta en diferentes tampones (Ejemplo 3).
La Fig. 4a muestra una imagen del gel después de la electroforesis con chip del ADN aislado de muestras tratadas con dihidroxiacetona disuelta en diferentes tampones (Ejemplo 3).
La Fig. 4b es un diagrama que muestra el efecto de la dihidroxiacetona sobre el aumento del ADN 18S ribosómico (Ejemplo 3).
La Fig. 5 muestra la integridad de las células sanguíneas medida por citometría de flujo para las células sanguíneas tratadas con diferentes concentraciones de dihidroxiacetona (Ejemplo 4).
La Fig. 6a muestra una imagen del gel después de la electroforesis con chip del ADN aislado de muestras tratadas con diferentes concentraciones de dihidroxiacetona (Ejemplo 4).
La Fig. 6b es un diagrama que muestra el efecto de diferentes concentraciones de dihidroxiacetona sobre el aumento del ADN 18S ribosómico (Ejemplo 4).
La Fig.7a muestra la integridad de las células sanguíneas medida mediante citometría de flujo para células sanguíneas tratadas con una combinación de K<2>EDTA, Q-VD-OPH y DHA elevados (Ejemplo 5).
La Fig. 7b es un diagrama que muestra el efecto de la combinación de EDTA, DHA y Q-VD-OPH sobre el aumento del ADN 18S (Ejemplo 5).
La Fig. 8 es un diagrama que muestra el efecto de la combinación de EDTA, DHA y Q-VD-OPH sobre el nivel de transcripción del ARNm en libre circulación en el plasma (Ejemplo 6).
La Fig. 9 es un diagrama que muestra los efectos de diferentes concentraciones de DMAA sobre el aumento del ADN
18S ribosómico en el plasma.
La Fig. 10 es un diagrama que muestra la influencia de diferentes alcoholes de azúcar sobre el aumento del ADNr 18S (Ejemplo 8).
La Fig. 11 es un diagrama que muestra la influencia de las sust ealn acuiamsento de slo AbDreNr 18S (Ejemplo 9).
La Fig. 12 es un diagrama que muestra la influencia de las sust ealn acuiamsento de slo AbDreNr 18S (Ejemplo 10).
La Fig. 13 es un diagrama que muestra la influencia de las sust ealn acuiamsento de slo AbDreNr 18S (Ejemplo 11).
La Fig. 14 es un diagrama que muestra la influencia de las sust ealn acuiamsento de slo AbDreNr 18S (Ejemplo 11).
La Fig. 15 es un diagrama que muestra la influencia de las sust ealn acuiamsento de so AbDreNr 18S.
La Fig. 16 es un diagrama que muestra el aumento de ADNccf en la fracción de plasma de sangre completa incubada durante un tiempo de hasta 6 días a 37 °C (Ejemplo 13).
La Fig. 17 es un diagrama que muestra el aumento de ADNccf en la fracción de plasma de sangre completa incubada durante un tiempo de hasta 6 días a 37 °C (Ejemplo 13).
La Fig. 18 es un diagrama que muestra los porcentajes de aciertos de fragmentos de ADNspiked-in(Ejemplo 14). La Fig. 19 es un diagrama que muestra las copias promedio (Ejemplo 14).
La Fig. 20 es un diagrama que muestra el porcentaje de 18S en comparación con BD Vacutainer K2E (Ejemplo 14). La Fig. 21 es un diagrama que muestra la disminución del VIH, incubado en sangre completa a 37 °C, purificado del plasma (Ejemplo 15).
La Fig. 22 es un diagrama que muestra la disminución del VHC, incubado en sangre completa a 37 °C, purificado del plasma (Ejemplo 15).
La Fig. 23 es un diagrama que muestra la influencia de la propionamida sobre el aumento del ADNr 18S, Donante 1 (Ejemplo 16).
La Fig. 24 es un diagrama que muestra la influencia de la propionamida sobre el aumento del rDNA 18S Donante 2 (Ejemplo 16).
Descripción detallada de esta invención.
La presente invención se dirige a métodos, composiciones y dispositivos, y por tanto a tecnologías adecuadas para estabilizar la población de ácido nucleico extracelular comprendida en una muestra biológica que contiene células.
Las tecnologías de estabilización descritas en el presente texto reducen el riesgo de que la población de ácido nucleico extracelular esté contaminada con ácidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genómico fragmentado, que se deriva, p. ej. se libera, de células dañadas y/o moribundas contenidas en la muestra. Por lo tanto, la presente invención logra la estabilización de la muestra y, por tanto, la estabilización de la población de ácido nucleico extracelular comprendida en la misma, sin la lisis de las células contenidas. Más bien las células contenidas en la muestra se estabilizan, previniendo o reduciendo sustancialmente la liberación de ácidos nucleicos intracelulares. La notable estabilización que se logra con la presente invención permite el almacenamiento y/o la manipulación de la muestra estabilizada durante un período de tiempo prolongado a temperatura ambiente, sin menoscabar la calidad de la muestra, respectivamente, los ácidos nucleicos extracelulares contenidos en la misma. Como la composición de la población de ácido nucleico extracelular está estabilizada y así se conserva sustancialmente en el momento en que se obtiene la muestra usando las enseñanzas de la presente invención, el tiempo entre la recogida de la muestra y la extracción del ácido nucleico puede variar sin un efecto significativo sobre la composición de la población de ácidos nucleicos extracelulares. Esto permite la estandarización de, p. ej., el análisis de ácido nucleico extracelular de diagnóstico o de pronóstico porque las variaciones en la manipulación o el almacenamiento de las muestras tienen menos influencia sobre la calidad, respectivamente de la composición de la población de ácido nucleico extracelular, proporcionando así una ventaja importante sobre los métodos de la técnica anterior. Por tanto, las muestras, respectivamente los ácidos nucleicos extracelulares obtenidos a partir de muestras respectivamente estabilizadas se vuelven más comparables. Además, las enseñanzas de la presente invención obvian la necesidad de separar directamente las células contenidas en la muestra de la porción libre de células de la muestra para evitar, respectivamente reducir las contaminaciones de los ácidos nucleicos extracelulares con ácidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genómico fragmentado, que de no ser así se libera de las células en descomposición. Esta ventaja simplifica considerablemente la manipulación de las muestras, en particular la manipulación de muestras de sangre completa. P. ej., las muestras de sangre completa obtenidas en una clínica y estabilizadas según las enseñanzas de la presente invención se pueden enviar a temperatura ambiente, y el plasma que contiene los ácidos nucleicos extracelulares se puede separar convenientemente en el laboratorio clínico receptor. Sin embargo, las enseñanzas de la invención son también ventajosas cuando se procesan muestras biológicas agotadas en células, o muestras comúnmente denominadas "libres de células", tales como p. ej. plasma sanguíneo o suero. Las muestras biológicas respectivas agotadas o "libres de células" pueden aún (dependiendo del procedimiento de separación usado) comprender células residuales, en particular glóbulos blancos que comprenden ADN genómico, que, en consecuencia, presentan el riesgo de que la población de ácido nucleico extracelular se vuelva cada vez más contaminada con ácidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genómico fragmentado, si las células remanentes (potencialmente) se dañan o mueren durante el envío del proceso de almacenamiento. Este riesgo se reduce considerablemente cuando se usa el método de estabilización que enseña la presente invención. Debido a que la tecnología de la presente invención permite preservar de manera eficiente la población de ácido nucleico extracelular de la muestra en el momento donde la muestra se recoge y se pone en contacto con los agentes estabilizadores, dichas muestras pueden tratarse apropiadamente en las instalaciones receptoras con el fin de aislar de dichas muestras los ácidos nucleicos extracelulares al tiempo que se evitan y se reducen respectivamente de forma sustancial las contaminaciones de la población nucleica extracelular con ácidos nucleicos intracelulares. Las instalaciones que reciben las muestras, como p. ej. los laboratorios, tienen también generalmente el equipo necesario, como p. ej. centrífugas de alta velocidad (u otros medios, véase también más adelante) para eliminar de manera eficiente las células comprendidas en las muestras, incluidas las células residuales que podrían estar presentes en las muestras agotadas de células tal como, p. ej. en plasma sanguíneo. Tal equipo no suele estar presente en las instalaciones donde se obtiene la muestra. Por lo tanto, la presente invención tiene muchas ventajas cuando se estabilizan muestras biológicas que comprenden una gran cantidad de células tales como p. ej. muestras de sangre entera, pero también tienen ventajas importantes cuando se estabilizan muestras biológicas que comprenden solamente una pequeña cantidad de células, o que solo pueden ser sospechosas de contener células tales como p. ej. plasma, suero, orina, saliva, fluidos sinoviales, líquido amniótico, fluido lagrimal, icores, fluido linfático, licor, fluido cerebroespinal y similares.
Según un primer aspecto, se proporciona un método adecuado para estabilizar la población de ácido nucleico extracelular comprendida en una muestra que contiene células, preferiblemente una muestra de sangre, poniendo en contacto la muestra con
a) al menos un inhibidor de la apoptosis, y/o
b) al menos un agente hipertónico, que estabiliza las células comprendidas en la muestra, y/o
c) al menos un compuesto según la fórmula 1
en donde R1 es un resto de hidrógeno o un resto alquilo, preferiblemente un resto alquilo C1 - C5, más preferido un resto metilo, R2 y R3 son restos hidrocarburo idénticos o diferentes con una longitud de cadena de carbono de 1 - 20 átomos dispuestos de manera lineal o ramificada, y R4 es un resto de oxígeno, azufre o selenio.
Con ello se reduce el riesgo de que la población de ácido nucleico extracelular se contamine con ácidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genómico fragmentado que se origina a partir de células contenidas, p. ej. desde células dañadas o moribundas y/o la degradación de los ácidos nucleicos presentes en la muestra se reduce, respectivamente, se inhibe. Esto tiene el efecto de que la composición de la población de ácido nucleico extracelular comprendida en dicha muestra es sustancialmente conservada, respectivamente estabilizada.
La expresión "ácidos nucleicos extracelulares" o "ácido nucleico extracelular" como se usa en este documento, se refiere en particular a ácidos nucleicos que no están contenidos en las células. Los respectivos ácidos nucleicos extracelulares también se denominan a menudo ácidos nucleicos libres de células. Estos términos se usan como sinónimos en este documento. Por tanto, los ácidos nucleicos extracelulares normalmente están presentes en el exterior de una célula o en el exterior de una pluralidad de células dentro de una muestra. La expresión "ácidos nucleicos extracelulares" se refiere p. ej. al ARN extracelular así como al ADN extracelular. Ejemplos de ácidos nucleicos extracelulares típicos que se encuentran en la fracción libre de células (respectivamente porción) de muestras biológicas tales como fluidos corporales tales como p. ej. el plasma sanguíneo, incluyen, pero no se limitan a ellos, ácidos nucleicos extracelulares de mamífero, tales como p. ej. ADN y/o ARN extracelular asociado a un tumor o derivado de un tumor, otro ADN y/o ARN extracelular relacionado con la enfermedad, ADN modificado epigenéticamente, ADN y/o ARN fetal, ARN interferente pequeño tal como p. ej. ARNmi y ARNsi, y ácidos nucleicos extracelulares no mamíferos tales como p. ej. ácidos nucleicos víricos, ácidos nucleicos patógenos liberados en la población de ácido nucleico extracelular, p. ej. de procariotas (por ejemplo, bacterias), virus, parásitos eucarióticos u hongos. Según una realización, el ácido nucleico extracelular se obtiene a partir de, respectivamente está comprendido, en un fluido corporal como muestra biológica que contiene células, tal como p. ej. sangre, plasma, suero, saliva, orina, licor, líquido cefalorraquídeo, esputo, líquido lagrimal, sudor, líquido amniótico o linfático. Aquí, los autores de la presente invención se refieren a ácidos nucleicos extracelulares que se obtienen a partir de fluidos corporales circulantes, como ácidos nucleicos circulantes extracelulares o circulantes libres de células. Según una realización, la expresión ácido nucleico extracelular se refiere en particular a ácidos nucleicos extracelulares de mamíferos, preferiblemente ácidos nucleicos extracelulares asociados a enfermedades o derivados de enfermedades, tales como ácidos nucleicos extracelulares asociados a tumores o derivados de tumores, ácidos nucleicos extracelulares liberados debido a inflamaciones o lesiones, en particular traumatismos, ácidos nucleicos extracelulares relacionados y/o liberados debido a otras enfermedades, o ácidos nucleicos extracelulares derivados de un feto. La expresión "ácidos nucleicos extracelulares" o "ácido nucleico extracelular" como se describe en este documento también se refiere a ácidos nucleicos extracelulares obtenidos a partir de otras muestras, en particular muestras biológicas distintas de los fluidos corporales. Habitualmente, en una muestra está comprendido más de un ácido nucleico extracelular. Normalmente, una muestra comprende más de un tipo o clase de ácidos nucleicos extracelulares. La expresión "población de ácido nucleico extracelular" como se usa en la presente memoria se refiere en parte al conjunto de diferentes ácidos nucleicos extracelulares que están comprendidos en una muestra que contiene células. Una muestra que contiene células generalmente comprende una población de ácido nucleico extracelular característica y, por tanto única. Así pues, el tipo, la clase y/o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos extracelulares comprendidos en la población de ácido nucleico extracelular de una muestra específica son características de la muestra importantes. Como se discutió anteriormente, es por ello importante estabilizar y preservar sustancialmente dicha población de ácido nucleico extracelular ya que su composición y/o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos extracelulares comprendidos en la población de ácido nucleico extracelular de una muestra puede proporcionar información valiosa en el campo médico, del pronóstico o del diagnóstico. En particular, es importante reducir la contaminación y, por tanto la dilución de la población de ácido nucleico extracelular por ácidos nucleicos intracelulares, en particular por ADN genómico, después de recoger la muestra. La preservación sustancial de la población de ácido nucleico extracelular que se puede lograr con las tecnologías de estabilización según la invención permite que la población de ácidos nucleicos extracelulares dentro de una muestra se mantenga sustancialmente sin cambios durante el período de estabilización, en comparación con la población de ácidos nucleicos extracelulares en el momento de la estabilización de la muestra. Al menos, los cambios en la población de ácido nucleico extracelular con respecto a la cantidad, la calidad y/o la composición de los ácidos nucleicos extracelulares comprendidos, en particular cambios atribuibles a un aumento del ADN genómico liberado, se reducen considerablemente a lo largo del período de estabilización (preferiblemente en al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95%) en comparación con una muestra no estabilizada o una muestra correspondiente que es, p. ej., estabilizado por EDTA en el caso de una muestra de sangre o una muestra derivada de la sangre.
Según un primer sub-aspecto del primer aspecto, se usa al menos un inhibidor de la apoptosis para estabilizar la muestra. Como se indica por los ejemplos proporcionados, el inhibidor de apoptosis es ya por sí solo eficaz para estabilizar una muestra que contiene células y para preservar sustancialmente la población de ácidos nucleicos extracelulares a partir de cambios en su composición, en particular procedentes de contaminaciones con ADN genómico fragmentado. La muestra puede ponerse en contacto con el inhibidor de la apoptosis, p. ej. añadiendo el inhibidor de la apoptosis a la muestra o viceversa. El al menos un inhibidor de la apoptosis presente en la mezcla resultante es compatible con la estabilización de las células contenidas en la muestra e inhibe la degradación de los ácidos nucleicos comprendidos en la muestra, preservando así sustancialmente la población de ácidos nucleicos extracelulares.
La expresión "inhibidor de la apoptosis", como se usa en el presente texto se refiere en particular a un compuesto cuya presencia en una muestra biológica que contiene células proporciona una reducción, una prevención y/o una inhibición de los procesos apoptóticos en las células, y/o hace a las células más resistentes a los estímulos apoptóticos.
Los inhibidores de la apoptosis incluyen, pero no se limitan a ellos, proteínas, péptidos o moléculas similares a proteínas o péptidos, moléculas orgánicas e inorgánicas. Los inhibidores de la apoptosis incluyen compuestos que actúan como inhibidores metabólicos, inhibidores de la degradación de ácidos nucleicos, respectivamente rutas de ácidos nucleicos, inhibidores de enzimas, en particular inhibidores de la caspasa, inhibidores de calpaína e inhibidores de otras enzimas implicadas en procesos apoptóticos. Los respectivos inhibidores de la apoptosis se enumeran en la Tabla 1. Preferiblemente, el al menos un inhibidor de apoptosis que se usa para estabilizar la muestra biológica que contiene células se selecciona del grupo que consiste en inhibidores metabólicos, inhibidores de la caspasa e inhibidores de calpaína. Los ejemplos adecuados para cada clase se enumeran en la Tabla 1 en la categoría respectiva. Preferiblemente, el inhibidor de la apoptosis es permeable a las células.
También está dentro del alcance de la presente invención utilizar una combinación de inhibidores de la apoptosis diferentes, ya sea de la misma o de una clase diferente de inhibidores de la apoptosis, respectivamente para utilizar una combinación de diferentes inhibidores de la apoptosis que inhiben la apoptosis ya sea mediante el mismo mecanismo de trabajo o uno diferente.
En una realización ventajosa de la presente invención, el inhibidor de la apoptosis es un inhibidor de la caspasa. Los miembros de la familia de genes caspasa desempeñan un importante papel en la apoptosis. Las preferencias del sustrato o las especificidades de las caspasas individuales se han explotado para el desarrollo de péptidos que compiten con éxito en la unión a caspasas. Es posible generar inhibidores reversibles o irreversibles de la activación de la caspasas mediante el acoplamiento de péptidos específicos de la caspasa a, p. ej., compuestos de aldehído, de nitrilo o de cetona. P. ej., los péptidos derivatizados con fluorometilcetona (FMK) tales como Z-VAD-FMK actúan como inhibidores irreversibles efectivos sin efectos citotóxicos añadidos. Los inhibidores sintetizados con un grupo benciloxicarbonilo (BOC) en las cadenas laterales N-terminal y O-metilo exhiben una permeabilidad celular mejorada. Otros inhibidores de la caspasa adicionales adecuados se sintetizan con un grupo fenoxi en el extremo C-terminal. Un ejemplo es Q-VD-OPh, que es un inhibidor de la caspasa, de amplio espectro, permeable a la célula, irreversible, que es incluso más eficaz en la prevención de la apoptosis que Z-VAD-FMK.
Según una realización, el inhibidor de la caspasa es un inhibidor de pancaspasa y, por tanto, es un inhibidor de la caspasa de amplio espectro. Según una realización, el inhibidor de la caspasa comprende un péptido específico de la caspasa modificado. Preferiblemente, dicho péptido específico de la caspasa se modifica mediante un compuesto de aldehído, nitrilo o cetona. Según una realización preferida, el péptido específico de la caspasa se modifica preferiblemente en el extremo carboxilo con un grupo O-fenoxi o una fluorometilcetona (FMK). Según una realización, el inhibidor de la caspasa se elige entre el grupo que consiste en Q-VD-OPh y Z-VAD (OMe)-FMK. En una realización, se usa Z-VAD(OMe)-FMK, un inhibidor de pancaspasa, que es un inhibidor peptídico irreversible competitivo y bloquea las enzimas de la familia caspasa-1 y de la familia caspasa-3. En una realización preferida, se usa Q-VD-OPh, que es un inhibidor de amplio espectro para caspasas. Q-VD-OPh es permeable a las células e inhibe la muerte celular por apoptosis. Q-VD-OPh no es tóxico para las células incluso a concentraciones extremadamente altas y consiste en un grupo fenoxi carboxi terminal conjugado con los aminoácidos valina y aspartato. Es igualmente efectivo en la prevención de la apoptosis mediada por las tres principales rutas apoptóticas, caspasa-9 y caspasa-3, caspasa-8 y caspasa-10, y caspasa-12 (Caserta et al, 2003). En la Tabla 1 se enumeran más inhibidores de la caspasa. Según una realización, el inhibidor de la caspasa que se usa como inhibidor de la apoptosis para estabilizar la muestra que contiene células es un inhibidor que actúa sobre una o más caspasas situadas aguas abajo en la ruta de muerte celular intracelular de la célula, tal como la caspasa-3. En una realización de la presente invención, el inhibidor de la caspasa es un inhibidor para una o más caspasas seleccionadas entre el grupo que consiste en caspasa-3, caspasa-8, caspasa-9, caspasa-10 y caspasa-12. También está dentro del alcance de la presente invención usar una combinación de inhibidores de la caspasa.
La mezcla que se obtiene después de poner en contacto la muestra biológica con el al menos un inhibidor de la apoptosis puede comprender el inhibidor de la apoptosis (o una combinación de inhibidores de la apoptosis) en una concentración seleccionada entre el grupo de al menos 0,01 pM, al menos 0,05 pM, al menos 0,1 pM, al menos 0,5 pM, al menos 1 pM, al menos 2,5 pM o al menos 3,5 pM. Desde luego, también se pueden usar concentraciones más altas. Los intervalos de concentración adecuados para el inhibidor o los inhibidores de la apoptosis cuando se mezclan con la muestra biológica que contiene células incluyen, pero no están limitados a ellos, de 0,01 pM a 100 pM, de 0,05 pM a 100 pM, de 0,1 pM a 50 pM, de 0,5 pM a 50 pM, de 1 pM a 40 pM, más preferiblemente de 1 pM a 30 pM o de 2,5 pM a 25 pM. Se encontró que las concentraciones más altas eran más efectivas, si bien también se lograron buenos resultados de estabilización a concentraciones más bajas. Por tanto, también se consigue una estabilización eficiente a concentraciones más bajas, p. ej. en un intervalo elegido entre 0,1 pM a 10 pM, de 0,5 pM a 7,5 pM o de 1 pM a 5 pM, en particular si el inhibidor de la apoptosis se usa en combinación con un agente hipertónico (véase más adelante). Las concentraciones mencionadas anteriormente son válidas para el uso de un único inhibidor de la apoptosis así como para el uso de una combinación de inhibidores de la caspasa. Si se usa una combinación de inhibidores de la caspasa, la concentración de un inhibidor de la apoptosis individual que se usa en dicha mezcla de inhibidores de la apoptosis puede estar también por debajo de las concentraciones mencionadas anteriormente, si la concentración global de la combinación de inhibidores de la apoptosis satisface las características mencionadas anteriormente. El uso de una concentración más baja que todavía estabilice eficientemente las células y/o reduzca la degradación de ácidos nucleicos presentes en la muestra tiene la ventaja de que se pueden reducir los costes de estabilización. Se pueden usar concentraciones más bajas, p. ej. si el inhibidor de la apoptosis se usa en combinación con uno o más estabilizantes como se describen en este documento. Las concentraciones mencionadas anteriormente son en particular adecuadas cuando se usa un inhibidor de la caspasa, en particular un péptido específico de la caspasa modificado, tal como Q-VD-OPh y/o Z-VAD (OMe)-FMK como inhibidor de la apoptosis. Las concentraciones anteriormente mencionadas son, p. ej., muy adecuadas para estabilizar sangre completa, en particular 10 ml de sangre. Los intervalos de concentración adecuados para otros inhibidores de la apoptosis y/o para otras muestras biológicas que contienen células pueden determinarse por un profesional experto usando experimentos rutinarios, p. ej. ensayando los inhibidores de la apoptosis, respectivamente las diferentes concentraciones en los ensayos de ensayo descritos en los ejemplos.
Según una realización, el inhibidor de la apoptosis, en una cantidad efectiva, disminuirá o reducirá la apoptosis en una muestra biológica que contiene células en al menos un 25 por ciento, al menos un 30 por ciento, al menos un 40 por ciento, al menos un 50 por ciento, preferiblemente al menos un 75 por ciento, más preferiblemente al menos un 85 por ciento en comparación con una muestra testigo que no contiene inhibidor de la apoptosis respectivo.
Según un segundo sub-aspecto del primer aspecto, se usa al menos un agente hipertónico para estabilizar la muestra, en donde el agente hipertónico utilizado estabiliza las células comprendidas en la muestra. Como se indica por los ejemplos que se proporcionan, el agente hipertónico es eficaz ya por sí solo para estabilizar una muestra que contiene células y preservar sustancialmente la composición de la población de ácido nucleico extracelular comprendida en la misma. El agente hipertónico induce el encogimiento celular por efectos hipertónicos suaves (ósmosis), con lo que aumenta la estabilidad celular. Por lo tanto, las celdas son menos propensas, p. ej., a un daño celular inducido mecánicamente. La muestra puede ponerse en contacto con el agente hipertónico, p. ej. añadiendo el agente hipertónico a la muestra o viceversa. El agente hipertónico presente en la mezcla resultante en particular es adecuado para estabilizar las células contenidas en la muestra, reduciendo con ello la cantidad de ácidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genómico que se libera de las células dañadas. De ese modo, la población de ácido nucleico extracelular se conserva sustancialmente y se reduce el riesgo de contaminar respectivamente diluir los ácidos nucleicos extracelulares con ácidos nucleicos intracelulares, en particular el ADN genómico.
Según una realización, el agente hipertónico es activo osmóticamente lo suficiente como para inducir la contracción celular (las células liberan agua), pero sin dañar las células, es decir, sin inducir o promover la lisis celular, respectivamente la rotura celular. Por lo tanto, el agente hipertónico preferiblemente tiene un leve efecto osmótico. Además, es deseable que las interacciones entre el agente hipertónico y la muestra estén limitadas predominantemente al efecto de estabilización celular básicamente para evitar efectos secundarios no deseados. Por tanto, según la presente invención, se puede usar un agente hipertónico sin carga. El uso de un agente hipertónico no cargado tiene la ventaja de que aunque las células se encogen respectivamente se estabilizan debido al efecto osmótico del agente hipertónico, las interacciones entre el agente hipertónico y otros compuestos incluidos en la muestra son limitadas en comparación con el uso de un agente hipertónico cargado.
Según una realización ventajosa, el agente hipertónico es un compuesto orgánico hidroxilado y, en consecuencia, lleva al menos un grupo hidroxilo. Según una realización, el compuesto orgánico hidroxilado comprende al menos dos grupos hidroxilo. Según una realización, el compuesto orgánico hidroxilado es un poliol. Según una realización, el poliol comprende de 2 a 10 grupos hidroxilo, preferiblemente de 3 a 8 grupos hidroxilo. El compuesto orgánico hidroxilado puede comprender de 2 a 12 átomos de carbono, preferiblemente de 3 a 8 y puede ser una molécula cíclica o lineal, ramificada o no ramificada; puede ser saturado o insaturado; aromático o no aromático. Según una realización, el compuesto orgánico hidroxilado es un compuesto de hidroxicarbonilo. Un compuesto hidroxicarbonilo es un compuesto que posee uno o más grupos hidroxi (OH) y uno o más grupos carbonilo. Los compuestos orgánicos hidroxilados pueden incluir, pero sin limitarse a ellos, compuestos de cetona hidroxilados e hidratos de carbono, o compuestos derivados de los mismos. Según una realización, el compuesto orgánico hidroxilado es un polialcohol, en particular un alcohol de azúcar. Por lo tanto, los compuestos orgánicos hidroxilados incluyen, pero no se limitan a ellos, carbohidratos tales como glucosa, rafinosa, sucrosa, fructosa, alfa-d-lactosa monohidrato, inositol, maltitol, manitol, dihidroxiacetona, alcoholes tales como glicerol, eritritol, manitol, sorbitol, volemitol, o alcoholes de azúcar. Los ejemplos adecuados también se enumeran en la tabla que sigue. También se pueden usar combinaciones de compuestos orgánicos hidroxilados respectivos.
Según una realización, los polioles y alcoholes de azúcar enumerados anteriormente pueden reemplazarse por alcoholes con menos grupos hidroxilo (por ejemplo, hexano-1,2,3,4,5-pentol, pentano-1,2,3,4-tetraol). Según una realización, el compuesto orgánico hidroxilado no es un alcohol que tiene de 1 a 5 átomos de carbono y que lleva solamente un grupo hidroxilo. Según una realización, los alcoholes con un solo grupo hidroxilo se excluyen como compuesto orgánico hidroxilado. El compuesto orgánico hidroxilado que se puede usar como estabilizante según la presente invención es preferiblemente soluble en agua y no tóxico para las células comprendidas en la muestra biológica a estabilizar. Preferiblemente, el compuesto orgánico hidroxilado no induce o no soporta la lisis de las células contenidas en la muestra biológica y, en consecuencia, preferiblemente no funciona como un detergente o como un agente de disolución de la membrana celular. Un compuesto orgánico hidroxilado adecuado logra un efecto estabilizante de la muestra que contiene células mejorando la conservación de la composición de la población de ácido nucleico extracelular como puede probarse, p. ej., por los ensayos descritos en la sección de ejemplo.
Añadir un compuesto orgánico hidroxilado a una muestra biológica que contiene células tal como p. ej. sangre entera, aumenta la concentración de dicho compuesto orgánico hidroxilado en la porción respectivamente fracción libre de células (por ejemplo, el plasma sanguíneo) y así fuerza a las células sanguíneas a liberar agua en el plasma como resultado de un efecto osmótico (hipertónico). Según una realización, se usa un compuesto orgánico hidroxilado que está estrechamente relacionado con un producto del metabolismo celular, pero preferiblemente no puede ser utilizado por las células.
Según una realización preferida, las células contenidas en la muestra biológica son esencialmente impermeables para el agente hipertónico que se usa para la estabilización. Por tanto, el agente hipertónico, que preferiblemente es un compuesto orgánico hidroxilado como se describió con detalle anteriormente, es esencialmente impermeable a las células. Esencialmente impermeable a las células a este respecto significa en particular que la concentración del agente hipertónico, que preferiblemente es un compuesto orgánico hidroxilado, es sustancialmente mayor en la porción extracelular de la muestra que en el interior de las células contenidas en la muestra biológica, que está estabilizada según las enseñanzas de la presente invención. Según una realización preferida, el agente hipertónico, que preferiblemente es un compuesto orgánico hidroxilado, no es tóxico, de forma que no se ve comprometida la viabilidad celular. Esto se prefiere para evitar influencias perturbadoras sobre el metabolismo celular.
Según una realización, el agente hipertónico es dihidroxiacetona (DHA). La DHA es un carbohidrato y habitualmente sirve como sustancia bronceadora en lociones para el autobronceado. Como se demuestra mediante los ejemplos, la DHA tiene sorprendentemente un notable efecto estabilizador sobre muestras biológicas que contienen células, en particular muestras de sangre completa y muestras derivadas de sangre completa tal como plasma sanguíneo o suero. La DHA no se presenta de forma natural en células de mamíferos a excepción del éster de ácido fosfórico de DHA, fosfato de dihidroxiacetona, un producto intermedio de la glucólisis. Por lo tanto, no es de esperar que la DHA se transporte activamente ni se difunda en las células sanguíneas. Según una realización, el agente hipertónico no es dihidroxiacetona fosfato.
La mezcla que se obtiene cuando se pone en contacto la muestra biológica que contiene células con al menos un agente hipertónico puede comprender el agente hipertónico o la mezcla de agentes hipertónicos en una concentración de al menos 0,05 M, preferiblemente 0,1 M, preferiblemente al menos 0,2 M, más preferiblemente al menos 0,25 M. Por supuesto, también se pueden usar concentraciones más altas. Los intervalos de concentración adecuados para el agente hipertónico se pueden seleccionar entre 0,05 M a 2 M, de 0,1 M a 1,5 M, de 0,15 M a 0,8 M, de 0,2 M a 0,7 M o de 0,1 M a 0,6 M. Las concentraciones respectivas son particularmente adecuadas cuando se usa un compuesto orgánico hidroxilado, p. ej. un hidrato de carbono tal como dihidroxiacetona, como agente hipertónico. Las concentraciones mencionadas anteriormente son, p. ej. muy adecuadas para estabilizar sangre completa, en particular 10 ml de sangre. Los intervalos de concentración adecuados para otros agentes hipertónicos y/u otras muestras biológicas que contienen células pueden también ser determinadas por un experto en la técnica usando experimentos de rutina, p. ej. probando los agentes hipertónicos, respectivamente, diferentes concentraciones de los mismos en los ensayos de ensayo descritos en los ejemplos.
Según un tercer sub-aspecto del primer aspecto de la presente invención, para estabilizar la población de ácido nucleico extracelular en una muestra que contiene células, se usa al menos un compuesto según la fórmula 1
en donde R1 es un resto de hidrógeno o un resto alquilo, preferiblemente un resto alquilo C1 - C5, más preferiblemente un resto metilo, R2 y R3 son restos hidrocarburo idénticos o diferentes con una longitud de cadena de carbono de 1 -20 átomos dispuestos de forma lineal o ramificada, y R4 es un resto de oxígeno, azufre o selenio.
Como se muestra mediante los ejemplos proporcionados, un compuesto según la fórmula 1 descrito anteriormente es eficaz para lograr un efecto estabilizante notable y para preservar sustancialmente la composición de la población de ácido nucleico extracelular en la muestra estabilizada. También se puede usar para la estabilización una mezcla de uno o más compuestos según la fórmula 1.
Los restos hidrocarburo R2 y/o R3 se pueden elegir independientemente entre ellos dentro del grupo que comprende alquilo, incluyendo alquilo de cadena corta y alquilo de cadena larga, alquenilo, alcoxi, alcoxi de cadena larga, cicloalquilo, arilo, haloalquilo, alquilsililo, alquilsililoxi, alquileno, alquenodiilo, arileno, carboxilatos y carbonilo. Los grupos generales, por ejemplo, alquilo, alcoxi, arilo, etc. se reivindican y se describen en la descripción y las reivindicaciones. Preferiblemente, se usan los siguientes grupos dentro de los grupos generalmente descritos:
(1) alquilo: preferiblemente alquilos de cadena corta, en particular alquilos C1-C5 lineales y ramificados o alquilos de cadena larga: alquilos C5-C20 lineales y ramificados;
(2) alquenilo: preferiblemente alquenilo C2-C6;
(3) cicloalquilo: preferiblemente cicloalquilo C3-C8;
(4) alcoxi: preferiblemente alcoxi C1-C6;
(5) alcoxi de cadena larga: preferiblemente alcoxi C5-C20 lineal y ramificado;
(6) alquilenos: preferiblemente un resto de hidrocarburo alifático, cicloalifático o aromático lineal o ramificado divalente con 2 a 18 átomos de carbono que contiene opcionalmente heteroátomos, p. ej. seleccionados del grupo que comprende: metileno; 1,1-etileno; 1,1-propilideno; 1,2-propileno; 1,3-propileno; 2,2-propilideno; butan-2-ol-1,4-diilo; propan-2-ol-1,3-diilo; 1,4-butileno; 1,4-pentileno; 1,6-hexileno; 1,7-heptileno; 1,8-octileno; 1,9-nonileno; 1,10-decileno; 1,11-undecileno; 1,12-docedileno; ciclohexano-1,1-diilo; ciclohexano-1,2-diilo; ciclohexano-1,3-diilo; ciclohexano-1,4-diilo; ciclopentano-1,1-diilo; ciclopentano-1,2-diilo; y ciclopentano-1,3-diilo; (7) alquenodiilo: preferiblemente seleccionado entre el grupo que comprende: 1,2-propenodiilo; 1,2-butenodiilo; 2.3- butenodiilo; 1,2-pentenodiilo; 2,3-pentenodiilo; 1,2-hexenodiilo; 2,3-hexenodiilo; y 3,4-hexenodiilo; (8) alquinodiilo: es igual a -C = C-;
(9) arilo: preferiblemente seleccionado entre grupos aromáticos con un peso molecular inferior a 300 Da; (10) arilenos: preferiblemente seleccionados entre el grupo que comprende: 1,2-fenileno; 1,3-fenileno; 1,4-fenileno; 1,2-naftalenileno; 1,3-naftalenileno; 1,4-naftalenileno; 2,3-naftalenileno; 1-hidroxi-2,3-fenileno; 1 -hidroxi-2.4- fenileno; 1-hidroxi-2,5-fenileno; 1-hidroxi-2,6-fenileno;
(11) carboxilato: preferiblemente el grupo -C(O)OR, donde R se selecciona entre: hidrógeno; alquilo C1-C6; fenilo; (alquilo C1-C6)-C6H5; Li; Na; K; Cs; Mg; Ca;
(12) carbonilo: preferiblemente el grupo -C(O)R, donde R se selecciona entre: hidrógeno; alquilo C1-C6; fenilo; (alquilo C1-C6)-C6H5 y amina (resultando una amida) seleccionada del grupo: NR’2, donde cada R' se elige independientemente entre hidrógeno; alquilo C1-C6; (alquilo C1-C6)-C6H5 y fenilo, donde, si ambos Rs representan alquilo C1-C6, pueden formar un anillo heterocíclico NC3 a NC5 con sustituyentes alquilo del anillo que forma la otra cadena alquilo;
(13) alquilsililo: preferiblemente el grupo -SiR1R2R3, donde R1, R2 y R3 se seleccionan independientemente entre sí entre: hidrógeno; alquilo; alquilo de cadena larga; fenilo; cicloalquilo; haloalquilo; alcoxi; alcoxi de cadena larga;
(14) alquilsililoxi: preferiblemente el grupo -O-SiR1 R2R3, donde R1, R2 y R3 se seleccionan independientemente entre ellos entre: hidrógeno; alquilo; alquilo de cadena larga; fenilo; cicloalquilo; haloalquilo; alcoxi; alcoxi de cadena larga.
La longitud de cadena n de R2 y/o R3 puede tener en particular los valores 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20. Preferiblemente, R2 y R3 tienen una longitud de la cadena de carbonos de 1-10. En este caso, la longitud de cadena n puede tener, en particular, los valores 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10. Preferiblemente, R2 y R3 tienen una longitud de la cadena de carbonos de 1-5 y en este caso la longitud de la cadena puede tener particularmente los valores 1, 2, 3, 4 y 5. Particularmente preferida es una longitud de cadena de 1 o 2 para R2 y R3.
La longitud de cadena n de R1 preferiblemente tiene el valor 1, 2, 3, 4 o 5. Particularmente preferida es una longitud de cadena de 1 o 2 para R1.
R4 es preferiblemente oxígeno.
Según una realización preferida, el compuesto según la fórmula 1 es una amida del ácido N,N-dialquilcarboxílico. Los grupos R1, R2, R3 y R4 preferidos se han descrito anteriormente. Según una realización, el compuesto se elige entre el grupo que consiste en N,N-dimetilacetamida; N,N-dietilacetamida; N,N-dimetilformamida y N,N-dietilformamida. También son adecuados N,N-dialquilpropanamidas tales como N,N-dimetilpropanamida como se muestra en los ejemplos. Preferiblemente, la sustancia según la fórmula 1 es N,N-dimetilacetamida (DMAA). Las fórmulas estructurales de los compuestos preferidos son las siguientes:
También son adecuados los respectivos análogos tio, que comprenden azufre en vez de oxígeno como R4.
La mezcla que se obtiene cuando se pone en contacto la muestra biológica que contiene células con un compuesto según la fórmula 1, o una mezcla de compuestos respectivos, puede comprender dicho compuesto o mezcla de compuestos en una concentración final de al menos 0,1%, al menos 0,5%, al menos 0,75%, al menos 1%, al menos 1,25% o al menos 1,5%. Un intervalo de concentración adecuado incluye, pero sin limitarse al mismo, de 0,1% hasta 50%. Los intervalos de concentración preferidos se pueden elegir entre el grupo que consiste en 0,1% a 30%, 0,1% a 20%, 0,1% a 15%, 0,1% a 10%, 0,1% a 7,5%, 0,1% a 5%, 1% a 30%, 1% a 20%, 1% a 15%, 1% a 10%, 1% a 7,5%, 1 % a 5%; 1,25% a 30%, 1,25% a 20%, 1,25% a 15%, 1,25% a 10%, 1,25% a 7,5%, 1,25% a 5%; 1,5% a 30%, 1,5% a 20%, 1,5% a 15%, 1,5% a 10%, 1,5% a 7,5% y 1,5% a 5%. Las concentraciones respectivas son particularmente adecuadas cuando se usa una amida de ácido N,N-dialquilcarboxílico, p. ej. N,N-dimetilacetamida, N,N-dietilacetamida, N,N-dietilformamida o N,N-dimetilformamida o N,N-dimetilpropanamida como agente estabilizante. Las concentraciones mencionadas anteriormente son p. ej. muy adecuadas para estabilizar sangre completa o productos sanguíneos como el plasma. Los intervalos de concentración adecuados para otros compuestos según la fórmula 1 y/u otras muestras biológicas que contienen células pueden también ser determinados por un experto en la técnica usando experimentos de rutina, p. ej. ensayando el compuesto, respectivamente diferentes concentraciones del mismo, en los ensayos de prueba descritos en los ejemplos.
Preferiblemente, el compuesto según la fórmula 1 se usa en combinación con un agente quelante para estabilizar la muestra que contiene células. En particular, se puede usar un agente quelante como anticoagulante cuando se estabiliza una muestra de sangre o una muestra derivada de sangre tal como p. ej. plasma o suero. Más adelante se proporcionan agentes quelantes y rangos de concentración adecuados.
Según un cuarto sub-aspecto preferido, se proporciona un método adecuado para estabilizar una muestra que contiene células, preferiblemente una muestra de sangre, en donde dicho método comprende poner en contacto la muestra con
a) al menos un inhibidor de la apoptosis, y
b) al menos un agente hipertónico, que estabiliza las células comprendidas en la muestra.
Por tanto, según esta realización preferida, el inhibidor de la apoptosis y el agente hipertónico, que ambos solos son ya efectivos para estabilizar una muestra que contiene células (véase más arriba y ejemplos), se usan en combinación. De este modo, el efecto de estabilización puede aumentarse y/o la concentración de los componentes individuales (el inhibidor de la apoptosis y/o el agente hipertónico) puede también reducirse conservando de manera eficiente la población de ácido nucleico extracelular en la muestra, y en particular evitando, respectivamente reduciendo la contaminación por ácidos nucleicos intracelulares en particular ADN genómico fragmentado que se libera de células dañadas o en descomposición contenidas en la muestra. Como se muestra en los ejemplos, usar una combinación respectiva es particularmente eficaz en la estabilización de una muestra que contiene células, incluso muestras muy complejas tales como una muestra de sangre completa. También está dentro del alcance de la presente invención usar una mezcla de diferentes inhibidores de la apoptosis en combinación con diferentes agentes hipertónicos. Los ejemplos adecuados y preferidos del inhibidor de la apoptosis y el agente hipertónico, así como las concentraciones adecuadas y preferidas de los respectivos agentes adecuados para lograr una estabilización eficiente de la muestra, se describen anteriormente con detalle junto con los ejemplos, en donde se usa o bien un inhibidor de la apoptosis o bien un agente hipertónico para estabilizar la muestra biológica que contiene células. Se hace referencia a la descripción anterior que también es válida para el ejemplo, en donde se usa un inhibidor de la apoptosis en combinación con un agente hipertónico. Preferiblemente, al menos un inhibidor de la caspasa, preferiblemente un péptido específico de la caspasa modificado, preferiblemente modificado en el extremo C con un grupo O-fenoxi tal como Q-VD-OPh, se usa en combinación con al menos un compuesto orgánico hidroxilado, p. ej. un hidrato de carbono, tal como dihidroxiacetona o un poliol, como agente hipertónico. Como se demuestra mediante los ejemplos, una combinación respectiva es notablemente eficaz para estabilizar una muestra biológica que contiene células, en particular una muestra de sangre completa, a temperatura ambiente durante más de 3 días e incluso durante 6 días.
Según una realización, se usa una combinación de agentes estabilizantes que comprende al menos un inhibidor de la apoptosis, al menos un agente hipertónico y/o al menos un compuesto según la fórmula 1 como se definió anteriormente. Los ejemplos de combinaciones respectivas incluyen (1) una combinación de al menos un inhibidor de la apoptosis y al menos un compuesto según la fórmula 1 como se definió anteriormente, (2) una combinación de al menos un agente hipertónico y al menos un compuesto según la fórmula 1 como se ha definido anteriormente, o (3) una combinación de los tres agentes estabilizantes, es decir, al menos un inhibidor de la apoptosis, al menos un agente hipertónico y al menos un compuesto según la fórmula 1 como se definió anteriormente. Una combinación respectiva también puede comprender aditivos adicionales que mejoran el efecto estabilizante tal como p. ej. anticoagulantes y agentes quelantes. Según una realización, la combinación de agentes estabilizantes comprende un inhibidor de la caspasa y un anticoagulante, preferiblemente un agente quelante tal como EDTA. Las combinaciones respectivas pueden ser según un quinto sub-aspecto utilizado ventajosamente en un método adecuado para estabilizar una población de ácido nucleico extracelular comprendida en una muestra que contiene células según el primer aspecto de la presente invención. El efecto estabilizante observado con combinaciones de agentes estabilizantes es más fuerte que el efecto observado para cualquiera de los agentes estabilizantes individuales cuando se usa solo y/o permite usar concentraciones más bajas, haciendo de este modo que el uso combinatorio de agentes estabilizantes sea una opción atractiva. Las realizaciones adecuadas y preferidas del inhibidor de la apoptosis, el agente hipertónico y el compuesto según la fórmula 1 definido anteriormente, así como las concentraciones adecuadas y preferidas de los respectivos agentes adecuados para lograr una estabilización eficiente de la muestra, se describen anteriormente con detalle junto con el ejemplos, en donde se usa o bien un inhibidor de la apoptosis, o un agente hipertónico o un compuesto según la fórmula 1 para estabilizar la muestra biológica que contiene células.
Como se discute en el fundamento de la invención, los ácidos nucleicos extracelulares no están generalmente presentes "desnudos" en el muestra, sino que están p. ej. estabilizados hasta cierto punto estando liberados protegidos en complejos o contenidos en vesículas y similares. Esto tiene el efecto de que los ácidos nucleicos extracelulares ya están estabilizados en cierta medida por naturaleza y, por ello, habitualmente no se degradan rápidamente por nucleasas en muestras que contienen células, tales como sangre completa, plasma o suero. Por lo tanto, cuando se pretende estabilizar ácidos nucleicos extracelulares que están comprendidos en una muestra biológica, uno de los problemas principales es la dilución, respectivamente la contaminación de la población de ácido nucleico extracelular por ácidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genómico fragmentado, que se origina a partir de células dañadas o moribundas que están contenidas en la muestra. Esto plantea también un problema cuando se procesan muestras agotadas de células, tales como plasma o suero (que a veces también se describe como "libre de células", aunque pueden comprender cantidades minoritarias de células). La tecnología de estabilización descrita aquí es de particular ventaja a este respecto porque no solo preserva sustancialmente los ácidos nucleicos extracelulares presentes en la muestra y p. ej. inhibe la degradación de los ácidos nucleicos extracelulares comprendidos (preferiblemente al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90% o lo más preferiblemente al menos en un 95% durante el período de estabilización comparado con una muestra no estabilizada o una muestra estabilizada con EDTA), sino que además reduce eficientemente la liberación de ADN genómico a partir de las células contenidas en la muestra y/o reduce la fragmentación del ADN genómico respectivo.
Según una realización, usando el inhibidor de la apoptosis el agente hipertónico y/o el compuesto según la fórmula 1 para estabilizar la muestra que contiene células según las enseñanzas de la presente invención tienen el efecto de que el aumento de ADN que resulta de una liberación de ADN de las células contenidas en la muestra se reduce en comparación con una muestra no estabilizada. Según una realización, dicha liberación de ADN genómico se reduce en al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 10 veces, al menos 12 veces, al menos 15 veces, al menos 17 veces o al menos 20 veces durante el período de estabilización en comparación con la muestra no estabilizada o una muestra correspondiente que es estabilizada con EDTA (en particular en el caso de una muestra de sangre o una muestra derivada de sangre, como plasma o suero). Según una realización, dicha liberación de ADN genómico se reduce en al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90% o al menos un 95% sobre el período de estabilización en comparación con una muestra no estabilizada o una muestra correspondiente que está estabilizada con EDTA (en particular en el caso de una muestra de sangre o una muestra derivada de sangre tal como plasma o suero). La liberación de ADN puede determinarse, p. ej., mediante la cuantificación del ADN 18S ribosómico como se describe en el presente texto en la sección de ejemplos. P. ej. las muestras de sangre estabilizadas con EDTA estándar muestran un aumento de 40 veces el ADN determinado p. ej. en el día 6 de almacenamiento a temperatura ambiente en un ensayo respectivo (ver Fig. 2b). La estabilización que se puede conseguir con las enseñanzas de la presente invención reduce notablemente esta liberación de ADN incluso por debajo, p. ej. a un máximo de 4 veces. Por lo tanto, la población de ácido nucleico extracelular contenida en la muestra se estabiliza considerablemente en comparación con las muestras estabilizadas en tubos de EDTA estándar. Por lo tanto, según una realización, el efecto de estabilización que se logra con el inhibidor de la apoptosis, el agente hipertónico y/o el compuesto según la fórmula 1 como se enseña en la presente invención, da como resultado que la liberación de ADN de las células contenidas en la muestra se reduce al menos hasta un máximo de 10 veces, preferiblemente 7 veces, más preferiblemente 5 veces y lo más preferiblemente se reduce al menos hasta un máximo de 4 veces, como puede determinarse p. ej. en el ensayo de ADN 18S descrito en los ejemplos. Como se muestra por los ejemplos, se puede lograr una estabilización efectiva de la población de ácido nucleico extracelular durante un período de hasta al menos 6 días. Durante un almacenamiento de las muestras más corto, p. ej. hasta tres días, la liberación de ADN puede reducirse al menos hasta un máximo de dos veces, como puede determinarse p. ej. en el ensayo de ADN 18S descrito en los ejemplos. Así, la liberación de ADN puede reducirse a 2 veces o menos hasta tres días de almacenamiento cuando se usan los métodos de estabilización según la presente invención. Esta es una mejora notable en la estabilización de la población de ácido nucleico extracelular en comparación con los métodos de la técnica anterior. Esto mejora significativamente la precisión de cualquier prueba posterior. En ciertos casos, por ejemplo, si el material de muestra debe ser transportado largas distancias o almacenado por períodos más largos, p. ej. a temperatura ambiente (como puede ser, por ejemplo, el caso en ciertos países), el proceso descrito en este documento hace posible por primera vez que estas pruebas se lleven a cabo después de dicho período de tiempo. Sin embargo, por supuesto, las muestras también pueden procesarse adicionalmente más temprano, si se desea. No es necesario hacer uso de todo el período de estabilización que cabe conseguir. La estabilización que se logra con la presente invención reduce las variaciones en la población de ácido nucleico extracelular que pueden resultar de una manipulación/procesamiento diferente de las muestras (p. ej. condiciones y períodos de almacenamiento) después de ser recogidas. Esto mejora en gran medida la estandarización de la manipulación y el análisis molecular.
Se pueden usar otros aditivos adicionales además del inhibidor de la apoptosis, el agente hipertónico y/o el compuesto según la fórmula 1 como se definió antes, con el fin de estabilizar adicionalmente la muestra que contiene células. La selección de aditivos adecuados que también pueden contribuir al efecto de estabilización puede depender también del tipo de muestra que contiene células que se ha de estabilizar. Por ejemplo cuando se procesa sangre completa como muestra biológica que contiene células, es ventajoso y también común incluir un anticoagulante, p. ej. seleccionado entre el grupo que consiste en heparina, ácido etilendiaminotetraacético, citrato, oxalato y cualquier combinación de los mismos. En una realización ventajosa el anticoagulante es un agente quelante. Un agente quelante es un compuesto orgánico que es capaz de formar enlaces de coordinación con metales a través de dos o más átomos del compuesto orgánico. Los agentes quelantes según la presente invención incluyen, pero sin limitarse a ellos, ácido dietilentriamino pentaacético (DTPA), ácido etilendinitrilo tetraacético (EDTA), ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) y N,N-bis (carboximetil) glicina (NTA). Según una realización preferida, se usa EDTA. Como se usa en el presente texto, el término "EDTA" indica, entre otras cosas, la porción de EDTA de un compuesto de EDTA tal como, por ejemplo, K2EDTA, K3EDTA o Na2EDTA. El uso de un agente quelante tal como EDTA tiene también el efecto ventajoso de que las nucleasas tales como las DNasas se inhiben, evitando por tanto, p. ej., una degradación del ADN extracelular por DNasas. Además, se descubrió que el EDTA usado/añadido en concentraciones más altas es capaz de reducir la liberación de ácidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genómico de las células, apoyando así el efecto estabilizador que se logra mediante el inhibidor de la apoptosis, el agente hipertónico y/o el al menos un compuesto según la fórmula 1. Sin embargo, el EDTA por sí solo no es capaz de inhibir eficazmente la fragmentación de, p. ej., ADN genómico que se libera de las células contenidas en la muestra. Así pues, el EDTA no logra un efecto de estabilización suficiente. Pero usado en combinación con las enseñanzas de la presente invención, en particular en combinación con el inhibidor de la apoptosis, en particular el inhibidor de la caspasa, puede mejorar adicionalmente la estabilización por las razones discutidas anteriormente. Además, también parece aumentar la estabilidad química del ARN. Según una realización, la concentración del agente quelante, preferiblemente EDTA, en la muestra biológica que se mezcla con uno o más de los compuestos estabilizantes descritos anteriormente está en el intervalo elegido entre el grupo que consiste en 0,05 mM a 100 mM, 0,05 mM a 50 mM, de 0,1 mM a 30 mM, de 1 mM a 20 mM y de 2 mM a 15 mM después de la etapa de puesta en contacto. Las concentraciones respectivas son particularmente efectivas cuando se estabilizan muestras de sangre, plasma y/o suero, en particular muestras de sangre de 10 ml.
También se pueden usar otros aditivos con el fin de soportar adicionalmente la estabilización de la muestra que contiene células, respectivamente soportar la preservación de la población de ácido nucleico extracelular. Los ejemplos de los aditivos respectivos incluyen, pero no se limitan a ellos, inhibidores de nucleasas, en particular compuestos inhibidores de RNasa y ADNasa. Los ejemplos de inhibidores de RNasa incluyen, pero no se limitan a ellos, anticuerpos anti-nucleasa o complejos de ribonucleósido-vanadilo. Cuando se elige otro aditivo adicional respectivo, se debe tener cuidado de no comprometer y/o no contrarrestar el efecto estabilizador del inhibidor de la apoptosis, el agente hipertónico y/o el compuesto según la fórmula 1. Así pues, no deben usarse aditivos en concentraciones que tengan como resultado la lisis, o la apoyen, y/o degradación de las células contenidas en la muestra biológica y/o que soportan la degradación de los ácidos nucleicos contenidos en la fracción libre de células de la muestra biológica.
En una realización ventajosa de la presente invención, la muestra biológica que contiene células, que preferiblemente es una muestra de sangre o una muestra derivada de sangre tal como plasma o suero, se pone en contacto con:
a) al menos un inhibidor de la caspasa como inhibidor de apoptosis, preferiblemente con Q-VD-OPh, preferiblemente en un intervalo de concentración de 1 pM a 30 pM;
b) opcionalmente al menos un compuesto orgánico hidroxilado tal como dihidroxiacetona como agente hipertónico, preferiblemente en un intervalo de concentración de 0,1 M a 0,6 M; y
c) opcionalmente al menos un compuesto según la fórmula 1 definida anteriormente (los ejemplos preferidos y las concentraciones se han descrito anteriormente) y / o
d) otro aditivo, preferiblemente un agente quelante preferiblemente en un intervalo de concentración de 4 mM a 50 mM, preferiblemente de 4 mM a 20 mM, lo más preferiblemente EDTA.
Los componentes de la composición de estabilización pueden estar comprendidos, respectivamente, disueltos en un tampón, p. ej. un tampón biológico tal como MOPS, TRIS, PBS y similares.
El inhibidor de la apoptosis, el agente hipertónico y/o el compuesto según la fórmula 1 como se definió anteriormente, así como los aditivos adicionales opcionalmente presentes pueden estar presentes p. ej. en un dispositivo, preferiblemente un recipiente, para recoger la muestra, o se puede añadir a un dispositivo de recolección respectivo inmediatamente antes de la recolección de la muestra biológica; o puede añadirse al dispositivo de recolección inmediatamente después de que la muestra se haya recogido en el mismo. También está dentro del alcance de la presente invención añadir el agente o agentes estabilizantes y, opcionalmente, los otros aditivos por separado, a la muestra biológica que contiene células. Sin embargo, para una mayor facilidad de manipulación, se prefiere que el uno o más agentes estabilizantes y opcionalmente los aditivos adicionales se proporcionen en una composición. Además, en una realización ventajosa, el inhibidor de la apoptosis, el agente hipertónico y/o el compuesto según la fórmula 1 como se describió anteriormente y opcionalmente el otro o los otros aditivos, están presentes en el dispositivo de recogida antes de añadir la muestra. Esto asegura que la muestra biológica que contiene células se estabiliza inmediatamente al contacto con el agente o los agentes de estabilización. El agente o agentes de estabilización están presentes en el recipiente en una cantidad efectiva para proporcionar la estabilización de la cantidad de muestra que contiene células que se va a recoger, respectivamente comprendida en dicho recipiente. Como se ha descrito, la muestra se puede mezclar con el agente o agentes de estabilización directamente después y/o durante la recogida de la muestra, proporcionando así una muestra estabilizada.
Preferiblemente, la muestra se mezcla con el agente o agentes de estabilización directamente después y/o durante la recolección de la muestra. Por tanto, preferiblemente, el agente o agentes de estabilización y los aditivos descritos anteriormente se proporcionan en forma de una composición de estabilización. Preferiblemente, dicha composición de estabilización se proporciona en forma líquida. Puede ser, p. ej., previamente introducida en el dispositivo de recolección de muestras de forma que la muestra se estabilice inmediatamente durante la recolección. Según un ejemplo, la composición de estabilización se pone en contacto con la muestra que contiene células en una relación volumétrica elegida entre 10:1 a 1:20, 5:1 a 1:15, 1:1 a 1:10 y 1:2 a 1:5. Una ventaja particular de las enseñanzas de la presente invención es que se puede lograr la estabilización de un gran volumen de muestra con un pequeño volumen de la composición de estabilización. Por tanto, preferiblemente, la relación de composición de estabilización a muestra se encuentra en un intervalo de 1:2 a 1:7, más preferiblemente 1:3 a 1:5.
La expresión "muestra que contiene células" como se usa en el presente documento, se refiere en particular a una muestra que comprende al menos una célula. La muestra que contiene células puede comprender al menos 2, al menos 10, al menos 50, al menos 100, al menos 250, al menos 500, al menos 1000, al menos 1500, al menos 2000 o al menos 5000 células. Además, también las muestras que contienen células que comprenden considerablemente más células están comprendidas en dicha expresión y se pueden estabilizar con las enseñanzas según la presente invención. Sin embargo, la expresión "muestra que contiene células" también se refiere, y de este modo abarca, a muestras agotadas de células, que incluyen muestras agotadas de células que comúnmente se denominan "libres de células", tales como p. ej. el plasma sanguíneo ya que las muestras respectivas a menudo incluyen células residuales. Al menos, frecuentemente no puede excluirse totalmente que incluso las muestras llamadas "libres de células" como el plasma sanguíneo comprendan cantidades residuales de células que, en consecuencia, plantean el riesgo de que la población de ácido nucleico extracelular se contamine con ácidos nucleicos intracelulares liberados de dichas células residuales. Por tanto, las respectivas muestras agotadas de células y "libres de células" están según una realización también comprendida por la expresión "muestra que contiene células". Así pues, la "muestra que contiene células" puede comprender grandes cantidades de células, como es el caso, p. ej., con la sangre completa, pero también puede comprender solo cantidades meramente menores de células. Por lo tanto, la expresión "muestra que contiene células" también abarca muestras que solo pueden ser sospechosas o que presentan un riesgo de contener células. Como se discutió anteriormente, también con respecto a las muestras biológicas que solo comprenden cantidades menores, respectivamente residuales, de células tales como p. ej. plasma sanguíneo (el plasma sanguíneo - dependiendo del método de preparación - contiene normalmente pequeñas cantidades residuales de células, aunque comúnmente se le conoce como libre de células), el método de la presente invención tiene ventajas considerables ya que estas células residuales también pueden dar como resultado una contaminación no deseada de los ácidos nucleicos extracelulares comprendidos. El uso de la tecnología de estabilización de la presente invención también asegura que las muestras respectivas que solo comprenden cantidades residuales de células o que son meramente sospechosas o plantean un riesgo de cantidades residuales de células, se estabilizan eficientemente como también se describió con detalle anteriormente. El uso del método de estabilización descrito aquí tiene la ventaja de que al margen de la composición de la muestra y el número de células contenidas en ella, la población de ácido nucleico extracelular contenida en la misma está sustancialmente preservada, respectivamente estabilizada, permitiendo así la estandarización del posterior aislamiento y/o análisis de los ácidos nucleicos extracelulares contenidos.
Según una realización, la muestra biológica que contiene células se elige entre el grupo que consiste en sangre completa, muestras derivadas de sangre, plasma, suero, esputo, fluido lagrimal, líquido linfático, orina, sudor, licor, líquido cefalorraquídeo, ascitis, leche, heces, lavado bronquial, saliva, líquido amniótico, secreciones nasales, secreciones vaginales, semen/líquido seminal, secreciones de heridas y sobrenadantes de cultivos celulares y sobrenadantes obtenidos de otras muestras de frotis. Según una realización, la muestra biológica que contiene células es un fluido corporal, una secreción corporal o excreción corporal, preferiblemente un fluido corporal, más preferiblemente sangre completa, plasma o suero. La muestra biológica que contiene células comprende ácidos nucleicos extracelulares. Según otra realización, la muestra biológica que contiene células es una muestra no fluida derivada de un ser humano o animal, tal como p. ej. heces, tejido o una muestra de biopsia. Otros ejemplos de muestras biológicas que contienen células y que se pueden estabilizar con el método según la presente invención incluyen, pero sin limitarse a ellos, suspensiones celulares de muestras biológicas, cultivos celulares, sobrenadante de cultivos celulares y similares, que comprenden ácidos nucleicos extracelulares.
Como se ha descrito con anterioridad, y como se demuestra por los ejemplos, el uso de los métodos de la presente invención permite estabilizar la muestra que contiene células sin refrigeración o congelación durante un período de tiempo prolongado. Por tanto, las muestras pueden mantenerse a temperatura ambiente o incluso a temperaturas elevadas, p. ej. de hasta 30 °C o hasta 40 °C. Según una realización, se consigue un efecto estabilizador durante al menos dos días, preferiblemente al menos tres días; más preferiblemente al menos de un día a seis días, lo más preferiblemente durante un tiempo desde al menos un día hasta al menos siete días a temperatura ambiente. Como se muestra en los ejemplos, las muestras que fueron estabilizadas según el método descrito de la presente invención no se vieron comprometidas sustancialmente cuando se almacenaron durante 3 días a temperatura ambiente. Incluso durante almacenamientos más prolongados durante un tiempo de hasta 6 o incluso 7 días a temperatura ambiente, la población de ácido nucleico extracelular estaba sustancialmente más estabilizada en comparación con muestras no estabilizadas o p. ej. en comparación con muestras que se estabilizaron usando un método estándar tal como un tratamiento con EDTA. Aunque el efecto de la estabilización puede disminuir con el tiempo, aún es suficiente preservar la composición de la población de ácido nucleico extracelular para permitir el análisis y/o el procesamiento adicional. Por lo tanto, las muestras que fueron estabilizadas según los métodos de la presente invención eran todavía adecuadas para aislar y opcionalmente analizar los ácidos nucleicos extracelulares contenidos en ellas incluso después de un almacenamiento más prolongado a temperatura ambiente. Por tanto, como las muestras no se vieron comprometidas en particular cuando se usa la combinación de agentes de estabilización preferida, son concebibles incluso tiempos de almacenamiento/envío más largos. Sin embargo, generalmente, no son necesarios períodos más largos, como el almacenamiento regular y, p. ej., el tiempo de transporte al laboratorio en donde se realiza el aislamiento y opcionalmente el análisis del ácido nucleico, generalmente no excede de 6 o 7 días, pero por lo general se completa incluso después de dos o tres días. Como se muestra en los ejemplos, la eficacia de la estabilización es particularmente buena durante este período de tiempo. Sin embargo, los tiempos de estabilización extraordinariamente largos y la eficacia de estabilización que se pueden lograr con el método según la presente invención proporcionan un importante factor de seguridad.
Los métodos y también las composiciones descritas posteriormente según la presente invención permiten también la estabilización de grandes volúmenes de muestras biológicas con pequeños volúmenes de sustancias añadidas porque los aditivos que se usan según las enseñanzas descritas en este documento son muy activos. Esta es una importante ventaja debido a que el tamaño/volumen de la muestra plantea considerables limitaciones en el procedimiento de aislamiento posterior, en particular cuando se pretende utilizar procesos automáticos para aislar los ácidos nucleicos extracelulares contenidos en las muestras. Además, hay que considerar que los ácidos nucleicos extracelulares a menudo solo están comprendidos en pequeñas cantidades en la muestra contenida. Por lo tanto, procesar volúmenes más grandes de una muestra que contiene células tal como p. ej. una muestra de sangre, tiene la ventaja de que se pueden aislar más ácidos nucleicos circulantes de la muestra y, por lo tanto, están disponibles para un análisis posterior.
La estabilización de la muestra biológica puede seguirse directamente por técnicas para analizar ácidos nucleicos, o los ácidos nucleicos pueden purificarse de la muestra. Por tanto, la muestra que se estabilizó según el método descrito en este documento puede analizarse en un método analítico y/o de detección de ácido nucleico y o puede procesarse adicionalmente. P. ej. el ácido nucleico extracelular se puede aislar de la muestra estabilizada y puede entonces analizarse en un método analítico y/o de detección de ácido nucleico o se puede procesar adicionalmente.
Además, según un segundo aspecto, se proporciona un método para aislar ácidos nucleicos extracelulares a partir de una muestra biológica que contiene células, en donde dicho método comprende las etapas de:
a) estabilizar la población de ácido nucleico extracelular comprendida en una muestra que contiene células, según el método definido en el primer aspecto de la presente invención;
b) aislar los ácidos nucleicos extracelulares.
Como se ha discutido anteriormente, la estabilización descrita en la presente memoria tiene el efecto de que la población de ácido nucleico extracelular contenida en la muestra se conserva sustancialmente en el estado que había mostrado en el momento en que fue obtenida, respectivamente extraída, la muestra biológica. En particular, el alto aumento generalmente observado en ácidos nucleicos que resulta de los ácidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genómico, más específicamente ADN genómico fragmentado, liberado de células dañadas o moribundas, se reduce eficientemente como se demuestra en los ejemplos. Por lo tanto, los ácidos nucleicos extracelulares obtenidos a partir de una muestra estabilizada respectivamente comprenden menos contaminaciones con ácidos nucleicos intracelulares que se originan de células degradadas o moribundas comprendidas en la muestra, y en particular comprenden menores cantidades de ADN genómico fragmentado en comparación con muestras no estabilizadas. Además, la etapa de estabilización única permite aumentar la cantidad de ácidos nucleicos extracelulares recuperables. El método de estabilización según la presente invención puede realizarse sin la reticulación de la muestra. Esto es una ventaja importante sobre el uso de agentes de reticulación tales como formaldehído o liberadores de formaldehído, ya que estos reactivos podrían reducir la cantidad recuperable de ácidos nucleicos extracelulares debido a la reticulación. Por tanto, el método según la presente invención mejora la capacidad de diagnóstico y pronóstico de los ácidos nucleicos extracelulares. Además, dicha estabilización permite almacenar y/o manipular la muestra, p. ej. transportarla, incluso a temperatura ambiente, durante un período de tiempo prolongado antes de separar las células contenidas en la muestra y/o antes de aislar los ácidos nucleicos extracelulares comprendidos en ella en la etapa b). Con respecto a los detalles de la estabilización, se hace referencia a la descripción anterior que también es válida aquí.
Según una realización, la muestra biológica que contiene células, tal como p. ej. una muestra de sangre completa, se estabiliza en la etapa a) como se describe con detalle anteriormente usando al menos un inhibidor de la apoptosis, al menos un agente hipertónico y/o al menos un compuesto según la fórmula 1 como se describió anteriormente, preferiblemente usando al menos dos de estos agentes de estabilización y, opcionalmente, otros aditivos. Los ejemplos adecuados y preferidos se describieron anteriormente. Particularmente preferido es el uso de un inhibidor de la caspasa en combinación con un anticoagulante, preferiblemente un agente quelante como se describió anteriormente, para estabilizar muestras de sangre entera.
Si la muestra comprende grandes cantidades de células como es p. ej. el caso la sangre completa, las células se separan del resto de la muestra con el fin de obtener una fracción de la muestra libre de células, respectivamente reducida en células o agotada en células, que comprende los ácidos nucleicos extracelulares. Por lo tanto, según una realización, las células se eliminan de la muestra que contiene células entre la etapa a) y la etapa b). Este paso intermedio es solo opcional y p. ej. puede ser obsoleto si se procesan muestras que meramente comprenden cantidades menores de células residuales tales como p. ej. plasma o suero. Sin embargo, con el fin de mejorar los resultados, se prefiere que también se eliminen las células restantes respectivas (o las células potencialmente restantes) ya que podrían contaminar la población de ácido nucleico extracelular durante el aislamiento. Dependiendo del tipo de muestra, las células, incluidas las células residuales, se pueden separar y eliminar, p. ej. por centrifugación, preferiblemente centrifugación a alta velocidad, o usando medios distintos a la centrifugación, tal como p. ej. filtración, sedimentación o unión a superficies sobre partículas (opcionalmente magnéticas) si se ha de evitar una etapa de centrifugación. Los pasos de eliminación de células respectivos también se pueden incluir fácilmente en un protocolo de preparación de muestras automatizado. Las células retiradas respectivamente con anticipación también pueden procesarse más. Las celdas pueden p. ej. almacenarse, y/o las biomoléculas tales como p. ej. ácidos nucleicos o proteínas se pueden aislar a partir de las células eliminadas.
Además, está también dentro del alcance de la presente invención incluir otras etapas intermedias etapas adicionales para procesar la muestra.
Después se aíslan los ácidos nucleicos extracelulares en la etapa b), p. ej. de la fracción libre de células, respectivamente empobrecida en células, p. ej. de sobrenadantes, plasma y/o suero. Para aislar ácidos nucleicos extracelulares se puede usar cualquier método de aislamiento de ácidos nucleicos conocido que sea adecuado para aislar ácidos nucleicos de la muestra respectiva, respectivamente la muestra agotada de células. Los ejemplos de métodos de purificación respectivos incluyen, pero no están limitados a ellos, extracción, extracción en fase sólida, purificación basada en sílice, purificación basada en partículas magnéticas, extracción con fenol-cloroformo, cromatografía, cromatografía de intercambio aniónico (usando superficies de intercambio aniónico), electroforesis, filtración, precipitación, inmunoprecipitación de cromatina y combinaciones de los mismos. También está dentro del alcance de la presente invención aislar específicamente ácidos nucleicos extracelulares diana específicos, p. ej. usando sondas apropiadas que permiten una unión específica de secuencia y están acopladas a un soporte sólido. También puede ser utilizada cualquier otra técnica de aislamiento de ácidos nucleicos conocida por los expertos. Según una realización, los ácidos nucleicos se aíslan usando un agente caotrópico y/o alcohol. Preferiblemente, los ácidos nucleicos se aíslan uniéndolos a una fase sólida, preferiblemente una fase sólida que comprende sílice o grupos funcionales de intercambio aniónico. También están disponibles comercialmente métodos ykitsadecuados tales como elKitQlAamp® Circulating Nucleic Acid (QIAGEN), el kit Chemagic Circulating NA (Chemagen), el Kit NucleoSpin Plasma XS (Macherey-Nagel), el Kit Plasma/Serum Circulating DNA Purification (Norgen Biotek), el Kit Plasma/Serum Circulating DNA Purification (Norgen Biotek), el Kit High Pure Viral Nucleic Acid Large Volume (Roche) y otros kits disponibles comercialmente adecuados para extraer y purificar ácidos nucleicos circulantes.
Según una realización, todos los ácidos nucleicos que están comprendidos en la muestra que se obtiene después de la etapa a) u opcionalmente obtenida después de que las células han sido eliminadas en la etapa intermedia, se aíslan, p. ej. se aíslan de la fracción libre de células, respectivamente de la fracción de células agotadas. P. ej. los ácidos nucleicos totales pueden ser aislados del plasma o del suero y los ácidos nucleicos extracelulares estarán comprendidos como una porción en estos ácidos nucleicos extraídos. Si las células se eliminan de manera eficiente, los ácidos nucleicos totales aislados comprenderán predominantemente o incluso consistirán en ácidos nucleicos extracelulares. También está dentro del alcance de la presente invención aislar predominantemente al menos un ácido nucleico diana específico. Un ácido nucleico diana puede ser, p. ej., un cierto tipo de ácido nucleico, p. ej. ARN o ADN, incluyendo ARNm, microARN, otros ácidos nucleicos no codificadores, ácidos nucleicos modificados epigenéticamente y otros ácidos nucleicos. También está dentro del alcance de la presente invención, p. ej., digerir el ácido nucleico no diana utilizando nucleasas después del aislamiento. El término ácido nucleico diana se refiere también a un tipo específico de ácido nucleico, p. ej. un ácido nucleico extracelular específico que se sabe que es un cierto marcador de enfermedad. Como se discutió anteriormente, el aislamiento de ácidos nucleicos extracelulares también puede comprender el aislamiento específico de un ácido nucleico diana respectivo, p. ej. usando sondas de captura apropiadas. La expresión “un ácido nucleico diana” también se refiere a un ácido nucleico que tiene una cierta longitud, p. ej. un ácido nucleico que tiene una longitud de 2000 nt o menos, 1000 nt o menos o 500 nt o menos. El aislamiento de los ácidos nucleicos diana más pequeños respectivos puede ser ventajoso porque se sabe que los ácidos nucleicos extracelulares tienen normalmente un tamaño más pequeño de menos de 2000 nt, usualmente menos de 1000 nt , y frecuentemente incluso menos de 500 nt. Los tamaños, respectivamente los intervalos de tamaño indicados en el presente texto se refieren a la longitud de la cadena. Es decir, en el caso del ADN, se refiere a pb. Enfocar el aislamiento, respectivamente la purificación, sobre los ácidos nucleicos pequeños respectivos puede incrementar la porción de ácidos nucleicos extracelulares obtenidos en los ácidos nucleicos aislados. Los métodos de estabilización según la presente invención permiten, en particular debido a la inhibición de la fragmentación de ADN genómico intracelular, una separación más eficaz de dicho ADN genómico de alto peso molecular a partir de la población de ácido nucleico extracelular fragmentada, p. ej. durante el procedimiento de extracción de ácido nucleico. Como la diferencia sustancial de tamaño entre los ácidos nucleicos genómicos y circulantes se preserva esencialmente usando la tecnología de estabilización según la presente invención, el ADN genómico puede ser eliminado, p. ej. mediante la recuperación selectiva del tamaño de ADN de manera más eficiente que sin la estabilización respectiva. Métodos adecuados para lograr un respectivo aislamiento selectivo de la población de ácido nucleico extracelular, p. ej. agotando el ADN genómico de alto peso molecular son bien conocidos en la técnica anterior y, por lo tanto, no necesitan más descripción aquí. P. ej. sería suficiente usar un método de selección de tamaño que agote una muestra de cualquier ácido nucleico de más de 1.000 - 10.000 nucleótidos o pares de bases. Como la diferencia de tamaño entre los ácidos nucleicos genómicos (habitualmente con más de 10.000 bp) y extracelulares (habitualmente menos de 1.000 bp) en una muestra estabilizada según la tecnología descrita suele ser relativamente grande debido a la estabilización eficiente (la diferencia puede p. ej. basarse en un intervalo de 1.000 - 10.000 pb), podrían aplicarse métodos conocidos para aislar selectivamente ácido nucleico extracelular de una muestra biológica. Esto también proporciona otras oportunidades para reducir la cantidad de ácidos nucleicos intracelulares en la población de ácido nucleico extracelular aislada. Por ejemplo, la eliminación de ADN genómico durante el protocolo de extracción de ácido nucleico también podría suplementar o incluso reemplazar una centrifugación de alta fuerza g separada de una muestra de plasma antes de comenzar la extracción de ácido nucleico con el fin de eliminar las células residuales. Se evita que el ADN genómico que se libera de dichas células residuales se degrade masivamente debido a la estabilización según la presente invención y, en consecuencia, puede eliminarse mediante protocolos de aislamiento selectivos del tamaño. Esta opción es de ventaja particular, ya que muchos laboratorios clínicos no tienen una centrífuga capaz de realizar tal centrifugación de alta fuerza g u otros medios para eliminar en particular cantidades traza de células residuales.
Los ácidos nucleicos aislados pueden luego analizarse y/o procesarse adicionalmente en una etapa c) usando métodos analíticos y/o de ensayo adecuados. P. ej. pueden identificarse, modificarse, ponerse en contacto con al menos una enzima, amplificarse, someterse a transcripción inversa, clonarse, secuenciarse, ponerse en contacto con una sonda, detectarse (su presencia o ausencia) y/o cuantificarse. Los métodos respectivos son bien conocidos en la técnica anterior y se aplican comúnmente en el campo médico, de diagnóstico y/o de pronóstico para analizar ácidos nucleicos extracelulares (véase también la descripción detallada en el fundamento de la presente invención). Así pues, después de aislar los ácidos nucleicos extracelulares, opcionalmente como parte del ácido nucleico total, el ARN total y/o el ADN total (véase anteriormente), se pueden analizar para identificar la presencia, la ausencia o la gravedad de un estado patológico que incluye, pero no se limita a ellas, una multitud de enfermedades neoplásicas, en particular enfermedades premalignas y malignas como distintas formas de cáncer. P. ej. los ácidos nucleicos extracelulares aislados pueden analizarse para detectar marcadores de diagnóstico y/o pronóstico (por ejemplo, ácidos nucleicos extracelulares derivados de fetos o tumores) en muchos campos de aplicación que incluyen, sin limitarse a ellas, pruebas genéticas prenatales no invasivas, respectivamente, cribado, cribado de enfermedades, cribado de agentes patógenos, oncología, cribado de cáncer, cribado de cáncer en estadio temprano, monitorización de terapia del cáncer, pruebas genéticas (genotipado), pruebas de enfermedades infecciosas, diagnóstico de lesiones, diagnóstico traumatológico, medicina de trasplantes o muchas otras enfermedades y, por lo tanto, son de importancia en diagnóstico y/o pronóstico. Según una realización, los ácidos nucleicos extracelulares aislados se analizan para identificar y/o caracterizar una enfermedad o una característica fetal. Por lo tanto, como se discutió anteriormente, el método de aislamiento descrito en el presente texto puede comprender además una etapa c) de análisis y/o procesamiento de ácidos nucleicos. Por lo tanto, según un ejemplo, los ácidos nucleicos extracelulares aislados se analizan en la etapa c) para identificar, detectar, seleccionar, cribar o excluir una enfermedad y/o al menos una característica fetal. El análisis/procesamiento posterior de los ácidos nucleicos puede realizarse usando cualquier método de análisis/procesamiento de ácidos nucleicos incluyendo, pero sin limitarse a ellos, tecnologías de amplificación, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación isotérmica, reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), reacción en cadena de polimerasa en tiempo real cuantitativa (Q-PCR), PCR digital, electroforesis en gel, electroforesis capilar, espectrometría de masas, detección de fluorescencia, espectrometría ultravioleta, ensayos de hibridación, secuenciación de ADN o ARN, análisis de restricción, transcripción inversa, NASBA, reacción en cadena de polimerasa alelo específica, ensamblaje de ciclación de polimerasa (PCA), reacción en cadena de la polimerasa asimétrica, lineal después de la reacción en cadena de la polimerasa exponencial (LATE-PCR), amplificación dependiente de helicasa (HDA), reacción en cadena de la polimerasa de inicio en caliente, reacción en cadena de la polimerasa específica de intersecuencia (ISSR), reacción en cadena de la polimerasa inversa, reacción en cadena de la polimerasa mediada por ligamiento, reacción en cadena de la polimerasa específica de la metilación (MSP), reacción en cadena de la polimerasa múltiplex, reacción en cadena de la polimerasa anidada, reacción en cadena de la polimerasa en fase sólida, o cualquier combinación de las mismas. Las tecnologías respectivas son bien conocidas por los expertos y por tanto no necesitan una descripción adicional en el presente texto.
Según una realización, una o ambas de las etapas de aislamiento o análisis b) y c) ocurren al menos un día, hasta 7 días, después de que la muestra ha sido recolectada, respectivamente estabilizada según las enseñanzas de la presente invención. Los periodos de tiempo adecuados para los que la muestra, en particular una muestra de sangre, respectivamente la población de ácido nucleico extracelular contenida en la misma, pueden estabilizarse usando el método descrito en la presente memoria, también se describen anteriormente y también son válidas aquí. Según una realización, la etapa de aislamiento se realiza al menos un día, al menos 2 días, al menos 3 días, al menos 4 días, al menos 5 días o al menos 6 días después de recogerse la muestra y se estabiliza según el método según la presente invención. Según una realización, una o ambas etapas de aislamiento o de análisis se producen sin congelar la muestra y/o sin usar formaldehído para preservar la muestra biológica que contiene células. La muestra biológica se estabiliza después del contacto con el inhibidor de la apoptosis, el agente hipertónico y/o el compuesto según la fórmula 1 como se definió anteriormente, preferiblemente en combinación con otro aditivo tal como un anticoagulante como EDTA. Se usa un anticoagulante preferiblemente cuando se estabiliza sangre o una muestra derivada de sangre. Las muestras estabilizadas respectivamente se pueden manipular, p. ej. pueden ser almacenadas y/o enviadas a temperatura ambiente.
Además, según un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona una composición adecuada para estabilizar la población de ácido nucleico extracelular en una muestra biológica, que comprende:
a) al menos un inhibidor de la apoptosis, preferiblemente un inhibidor de la caspasa, y/o
b) al menos un agente hipertónico que estabiliza las células comprendidas en la muestra, preferiblemente dihidroxiacetona; y/o
c) al menos un compuesto según la fórmula 1 como se definió anteriormente; y
d) opcionalmente al menos un anticoagulante, preferiblemente un agente quelante.
Como se discutió anteriormente, una composición de estabilización respectiva es particularmente efectiva para estabilizar una muestra biológica que contiene células, en particular sangre completa, plasma y/o suero, estabilizando las células comprendidas y los ácidos nucleicos extracelulares comprendidos conservando sustancialmente, respectivamente estabilizando la población de ácido nucleico extracelular. Una composición de estabilización respectiva permite el almacenamiento y/o la manipulación, p. ej. el envío de la muestra, que preferiblemente es sangre completa, a temperatura ambiente durante al menos dos, preferiblemente al menos tres días, sin comprometer sustancialmente la calidad de la muestra, respectivamente la población de ácido nucleico extracelular contenida en la misma. Por supuesto, no es obligatorio hacer uso del período de estabilización completo posible; las muestras también pueden procesarse antes si se desea. La puesta en contacto de la muestra biológica con la composición de estabilización permite almacenar y/o manipular la muestra, p. ej. enviarla, incluso a temperatura ambiente, antes de aislar y opcionalmente analizar y/o procesar los ácidos nucleicos circulantes contenidos. Por lo tanto, el tiempo entre la recogida o la estabilización de la muestra y la extracción de ácido nucleico puede variar sin afectar sustancialmente a la población, respectivamente a la composición de la población de ácido nucleico extracelular contenida en la misma. En particular, se reducen las diluciones, respectivamente las contaminaciones con ácidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genómico fragmentado. Preferiblemente, la composición de estabilización se pone en contacto con la muestra inmediatamente después o durante la recogida de la muestra. Preferiblemente, cuando se estabiliza una muestra de sangre, la composición comprende al menos un inhibidor de la caspasa y al menos un anticoagulante, preferiblemente un agente quelante como se describió anteriormente. También puede comprender otros agentes estabilizantes como se describe en el presente texto.
Realizaciones adecuadas y preferidas del inhibidor de la apoptosis, el agente hipertónico y/o el compuesto según la fórmula 1, así como las concentraciones adecuadas y preferidas de los compuestos respectivos, se describen arriba con detalle junto con el método de estabilización. Se hace referencia a la descripción anterior que también se aplica con respecto a la composición de estabilización. Preferiblemente, al menos un inhibidor de la caspasa, preferiblemente un péptido específico de la caspasa modificado, preferiblemente modificado en el extremo C con un grupo O-fenoxi tal como Q-VD-OPh, se usa en combinación con al menos un agente hipertónico, preferiblemente un compuesto orgánico hidroxilado tal como dihidroxiacetona. Otros compuestos orgánicos hidroxilados adecuados también se describen con anterioridad, se hace referencia a la descripción respectiva. Como se demuestra por los ejemplos, una combinación respectiva es notablemente eficaz para estabilizar una muestra biológica que contiene células, en particular una muestra de sangre.
Preferiblemente, el al menos un compuesto según la fórmula 1 es una amida de ácido N,N-dialquil-carboxílico. Los grupos R1, R2, R3 y R4 preferidos se han descrito antes. Según una realización, el compuesto se elige entre el grupo que consiste en N,N-dimetilacetamida; N,N-dietilacetamida; N,N-dimetilformamida, N,N-dietilformamida y N,N-dimetilpropanamida. Dicho compuesto también puede usarse en combinación con un inhibidor de la apoptosis, preferiblemente un inhibidor de la caspasa (las realizaciones preferidas se describen más arriba, se refiere a la descripción anterior) y/o un agente hipertónico, preferiblemente un compuesto de hidroxi carbono (los ejemplos preferidos se describen anteriormente, se hace referencia a la descripción anterior).
Además, se prefiere que la composición de estabilización comprenda otros aditivos, por ej. un anticoagulante tal como un agente quelante en particular si la composición se usa para estabilizar sangre completa, plasma o suero.
Según una realización, la composición de estabilización consiste esencialmente en los estabilizantes y aditivos opcionales mencionados y, opcionalmente, agentes tampón. La composición de estabilización estabiliza la muestra y, por tanto, no promueve la lisis ni la rotura de las células contenidas en la muestra. La composición de estabilización puede reducir el daño de las células comprendidas en la muestra cómo puede determinarse, p. ej., por los métodos de ensayo descritos en la sección de ejemplos.
La composición se puede proporcionar en una forma sólida. Esto es una opción adecuada, p. ej., si la muestra biológica a estabilizar contiene líquido para disolver el sólido (tal como, por ejemplo, fluidos corporales que contienen células, células en el medio, orina) o si se añade líquido, p. ej. agua, para disolver el sólido. La ventaja de usar una composición de estabilización sólida es que los sólidos son generalmente más estables químicamente. Sin embargo, también se puede usar una composición líquida. Las composiciones líquidas a menudo tienen la ventaja de que la mezcla con la muestra a estabilizar puede conseguirse rápidamente, proporcionando así básicamente un efecto estabilizador inmediato tan pronto como la muestra entra en contacto con la composición de estabilización líquida. Preferiblemente, el agente o los agentes estabilizantes presentes en la composición de estabilización líquida permanecen estables en solución y no requieren pretratamiento -como por ejemplo la disolución de precipitados de solubilidad limitada- por el usuario porque los pretratamientos de este tipo presentan riesgo de variaciones en la eficacia de estabilización.
También se proporciona una mezcla que comprende la composición de estabilización según la presente invención mezclada con una muestra biológica. Los ejemplos adecuados y preferidos de muestras biológicas así como las concentraciones adecuadas del agente o de los agentes estabilizantes cuando se mezclan con la muestra biológica, se han descrito anteriormente junto con el método de estabilización. Se hace referencia a la descripción anterior que también es válida aquí. Preferiblemente, la composición de estabilización se introduce previamente en un dispositivo colector de muestras de modo que la muestra se estabiliza inmediatamente durante la recogida. Según una realización, la composición de estabilización se pone en contacto con la muestra biológica en una relación volumétrica seleccionada entre 10:1 a 1:20, 5:1 a 1:15, 1:1 a 1:10 y 1:2 a 1:5. Una ventaja particular de la composición de estabilización descrita en este documento es que puede lograrse la estabilización de un gran volumen de muestra con un pequeño volumen de la composición de estabilización. Por lo tanto, preferiblemente, la relación de composición de estabilización a muestra se encuentra en un intervalo de 1:2 a 1:7, más preferiblemente de 1:3 a 1:5.
La composición de estabilización según el tercer aspecto de la presente invención puede usarse para estabilizar la población de ácido nucleico extracelular comprendida en una muestra que contiene células. Además, la composición de estabilización según el tercer aspecto de la presente invención también puede usarse para estabilizar células contenidas en una muestra. Como se describió anteriormente, la composición de estabilización, entre otras cosas, reduce la liberación de ADN genómico de las células, que resulta de las células en descomposición. Por lo tanto, un uso respectivo es también ventajoso y proporcionado por las enseñanzas según la presente invención.
También se proporciona un método para fabricar una composición según el tercer aspecto de la presente invención, en donde los componentes de la composición se mezclan, preferiblemente en una solución acuosa.
La composición de la presente invención puede también incorporarse en un dispositivo de recogida de muestras, en particular un conjunto de recogida de sangre, proporcionando de ese modo una versión nueva y útil de dicho dispositivo. Tales dispositivos incluyen típicamente un contenedor que tiene un extremo abierto y un extremo cerrado. El contenedor es preferiblemente un tubo colector de sangre. El tipo de contenedor también depende de la muestra a recoger. Otros formatos adecuados se describen a continuación.
Además, la presente invención proporciona un recipiente para recoger una muestra biológica que contiene células, preferiblemente una muestra de sangre, en donde el recipiente comprende una composición de estabilización según la presente invención. Proporcionar un recipiente respectivo, p. ej. un tubo de recolección de muestra, que comprende la composición de estabilización según la presente invención, tiene la ventaja de que la muestra se estabiliza rápidamente cuando la muestra es recolectada en el contenedor respectivo. Se han descrito anteriormente detalles con respecto a la composición de estabilización; se hace referencia a la descripción anterior que también es válida aquí.
Según una realización, se proporciona un recipiente colector para recibir y recoger una muestra biológica, en donde el recipiente comprende:
a) al menos un inhibidor de la apoptosis tal que cuando se recoge la muestra la concentración del inhibidor de la apoptosis o la combinación de dos o más inhibidores de la apoptosis en la mezcla resultante se selecciona entre al menos 0,01 pM, al menos 0,05 pM, al menos 0,1 pM, al menos 0.5 pM, al menos 1 pM, al menos 2.5 pM 0 al menos 3,5 pM y preferiblemente está presente en un intervalo de concentración seleccionado entre 0,01 pM a 100 pM, 0,05 pM a 100 pM, 0,1 pM a 50 pM, 1 pM a 40 pM, 1,0 pM 30 pM o 2,5 pM a 25 pM; y/o
b) al menos un agente hipertónico de manera que cuando se recoge la muestra, la concentración del agente hipertónico o la combinación de dos o más inhibidores de la apoptosis en la mezcla resultante es al menos 0,05 M, al menos 0,1 M, preferiblemente al menos 0,25 M, y preferiblemente está presente en un intervalo de concentración de 0,05 M a 2 M, de 0,1 M a 1,5 M, de 0,15 M a 0,8 M, de 0,2 M a 0,7 M o de 0,1 M a 0,6 M; y/o
c) al menos un compuesto según la fórmula 1 como se definió anteriormente, de forma que cuando se recoge la muestra el compuesto según la fórmula 1 está comprendido en una concentración de al menos 0,1%, al menos 0,5%, al menos 0,75%, al menos 1%, al menos 1,25% o al menos 1,5% o en donde dicho compuesto está comprendido en un intervalo de concentración seleccionado entre 0,1% a 50%, 0,1 a 30%, 1% a 20%, 1% a 10%, 1 % a 7,5% y 1% a 5%; y/o
d) opcionalmente al menos otro aditivo, preferiblemente un anticoagulante tal como un agente quelante, preferiblemente EDTA si el contenedor es para recoger sangre o un producto sanguíneo. Las concentraciones adecuadas se describen anteriormente y preferiblemente están en el intervalo de 4 mM a 50 mM, más preferiblemente de 4 mM a 20 mM.
Los componentes precargados a), b), c) y/o d) pueden proporcionarse en forma líquida o en forma seca. Para estabilizar sangre completa se prefiere usar al menos los componente a) y d). Preferiblemente, los componentes de estabilización se proporcionan como una composición de estabilización. Una forma seca es p. ej. una opción adecuada si la muestra biológica a estabilizar contiene líquido para disolver el sólido (como, por ejemplo, fluidos corporales que contienen células, células en un medio, orina) o si es líquido p. ej. se añade agua para disolver el sólido. La ventaja de usar una composición de estabilización sólida es que los sólidos generalmente son químicamente más estables que los líquidos. Según una realización, la pared interna del recipiente se trata/recubre con una composición de estabilización según la presente invención. Dicha composición se puede aplicar a las paredes internas usando p. ej. un método de secado por pulverizaciónspray-dry.Las técnicas de eliminación de líquidos se pueden realizar en la composición de estabilización para obtener una composición protectora en estado sustancialmente sólido. Las condiciones de eliminación del líquido pueden ser tales que den como resultado la eliminación de al menos aproximadamente 50% en peso, al menos aproximadamente 75% en peso, o al menos aproximadamente 85% en peso, de la cantidad original de la composición de estabilización líquida dispensada. Las condiciones de eliminación del líquido pueden ser tales que den como resultado la eliminación del líquido suficiente para que la composición resultante esté en forma de una película, un gel u otra capa sustancialmente sólida o altamente viscosa. Por ejemplo, puede dar como resultado un recubrimiento sustancialmente inmóvil (preferiblemente un recubrimiento que puede volver a disolverse o dispersarse de otra forma al contacto con la muestra que contiene células que preferiblemente es una muestra de producto sanguíneo). Es posible que la liofilización u otras técnicas se puedan emplear para realizar una forma sustancialmente sólida del agente protector (por ejemplo, en forma de uno o más gránulos). Así pues, las condiciones de eliminación de líquido pueden ser tales que den como resultado un material que al contacto con la muestra bajo consideración (por ejemplo, una muestra de sangre completa) el agente protector se disperse en la muestra y conserve sustancialmente componentes (por ejemplo, ácidos nucleicos extracelulares) en la muestra. Las condiciones de eliminación de líquido pueden ser tales que den como resultado una composición remanente que está sustancialmente libre de cristalinidad, que tiene una viscosidad que es lo suficientemente alta como para que la composición restante sea sustancialmente inmóvil a temperatura ambiente, o ambas cosas.
Sin embargo, también se puede usar una composición líquida. Las composiciones líquidas a menudo tienen la ventaja de que la mezcla con la muestra a estabilizar puede conseguirse rápidamente, proporcionando así básicamente un efecto estabilizador inmediato tan pronto como la muestra entra en contacto con la composición de estabilización líquida. Preferiblemente, el agente o agentes de estabilización presentes en la composición de estabilización líquida permanecen estables en solución y no requieren pretratamiento -como, por ejemplo, la disolución de precipitados de solubilidad limitada - por parte del usuario porque los tratamientos previos de este tipo presentan un riesgo de variaciones en la eficiencia de estabilización.
La composición de estabilización está comprendida en el recipiente en una cantidad efectiva para proporcionar la estabilización de la cantidad de muestra a recoger en dicho recipiente. Según una realización, la composición de estabilización líquida se pone en contacto con la muestra biológica en una relación volumétrica elegida de 10:1 a 1:20, 5:1 a 1:15, 1:1 a 1:10 y 1:2 a 1: 5. Es una ventaja particular de la composición de estabilización de la presente invención que la estabilización de un gran volumen de muestra se pueda lograr con un pequeño volumen de la composición de estabilización. Por lo tanto, preferiblemente, la relación de composición de estabilización a muestra se encuentra en un intervalo de 1:2 a 1:7, más preferiblemente de 1:3 a 1:5.
Según una realización, el recipiente es evacuado. La evacuación es preferiblemente efectiva para extraer un volumen específico de una muestra de fluido al interior. De este modo, se asegura que la cantidad correcta de muestra se pone en contacto con la cantidad precargada de la composición de estabilización comprendida en el recipiente y, por consiguiente, que la estabilización es eficiente. Según una realización, el recipiente comprende un tubo que tiene un extremo abierto sellado por un tabique. P.ej. el recipiente se llena previamente con una cantidad definida de la composición de estabilización en forma sólida o líquida y se le dota con un vacío definido y se sella con un septo. El septo está construido de manera que sea compatible con los accesorios de muestreo estándar (por ejemplo, cánula, etc.). Cuando se contacta p. ej. con la cánula, se recoge en el recipiente una cantidad de muestra que está predeterminada por el vacío. Una realización respectiva es en particular ventajosa para recoger sangre. Un contenedor adecuado se describe p. ej. en el documento US 6,776,959.
El recipiente según la presente invención puede estar hecho de vidrio, material plástico u otros materiales adecuados. Los materiales plásticos pueden ser materiales impermeables al oxígeno o pueden contener una capa impermeable al oxígeno. Alternativamente, el contenedor puede estar hecho de material plástico permeable al agua y al aire. El recipiente según la presente invención está hecho preferiblemente de un material transparente. Entre los ejemplos de materiales termoplásticos transparentes adecuados se incluyen policarbonatos, polietileno, polipropileno y poli(tereftalato de etileno). El contenedor puede tener una dimensión adecuada elegida según el volumen requerido de la muestra biológica que se recoge. Como se describió anteriormente, preferiblemente, el recipiente se evacúa a una presión interna por debajo de la presión atmosférica. Tal realización es particularmente adecuada para recoger fluidos corporales tales como sangre completa. La presión se selecciona preferiblemente para extraer un volumen predeterminado de una muestra biológica en el contenedor. Además de tales tubos de vacío, también se pueden usar tubos no de vacío, tubos separadores mecánicos o tubos de barrera de gel como recipientes de muestra, en particular para la recogida de muestras de sangre. Ejemplos de contenedores adecuados y dispositivos de taponamiento se describen en los documentos US 5.860.397 y US 2004/0043505. Como recipiente para recoger la muestra que contiene células también se pueden usar dispositivos de recogida adicionales, por ejemplo, una jeringa, un dispositivo de recogida de orina u otros dispositivos de recogida. El tipo de recipiente también puede depender del tipo de muestra que se va a recoger y los recipientes adecuados también están disponibles para los expertos.
En una realización ventajosa el recipiente, respectivamente el dispositivo, se llena o se pre-llena con al menos un inhibidor de la apoptosis, preferiblemente un inhibidor de la caspasa, al menos un agente hipertónico, preferiblemente al menos un compuesto orgánico hidroxilado como se describió con detalle anteriormente, p. ej. dihidroxiacetona y opcionalmente otro aditivo tal como un anticoagulante, preferiblemente un agente quelante, más preferido EDTA. La mezcla de al menos un agente hipertónico, que preferiblemente es un compuesto orgánico hidroxilado, p. ej. un carbohidrato tal como dihidroxiacetona y al menos un inhibidor de la caspasa, preferiblemente Q-VD-OPH, estabiliza inesperadamente los ácidos nucleicos extracelulares en sangre completa, plasma o suero y previene la liberación de ácidos nucleicos celulares, en particular de glóbulos blancos que están contenidos en tales muestras. Por lo tanto, la población de ácido nucleico extracelular se conserva en el estado que había mostrado en el momento de la extracción de sangre. También se obtienen resultados beneficiosos cuando el recipiente, respectivamente el dispositivo, se llena o se prellena con al menos un inhibidor de la caspasa y al menos un compuesto según la fórmula 1 como se definió anteriormente, como agente de estabilización. Preferiblemente, se incluye un anticoagulante además del compuesto según la fórmula 1. El anticoagulante es preferiblemente un agente quelante tal como EDTA. Además, la composición de estabilización comprendida en el recipiente puede también comprender un inhibidor de la apoptosis, preferiblemente un inhibidor de la caspasa y/o al menos un agente hipertónico, preferiblemente al menos un compuesto orgánico hidroxilado como se describe en detalle anteriormente, p. ej. dihidroxiacetona y opcionalmente otros aditivos. Según una realización, la composición de estabilización comprendida en el contenedor comprende un inhibidor de la caspasa y un anticoagulante.
Según una realización, el recipiente tiene una parte superior abierta, un fondo y una pared lateral que se extiende entre ellas que definen una cámara, en donde la composición de estabilización según la presente invención está comprendida en la cámara. Puede estar comprendida en ella en forma líquida o sólida. Según una realización, el recipiente es un tubo, el fondo es un fondo cerrado, el recipiente comprende además un cierre en la parte superior abierta, y la cámara está a una presión reducida. Las ventajas de una presión reducida en la cámara se describieron anteriormente. Preferiblemente, el cierre puede ser perforado con una aguja o una cánula, y la presión reducida se elige para extraer un volumen concreto de una muestra de líquido en la cámara.
Según una realización, la cámara está a una presión reducida seleccionada para extraer un volumen especificado de una muestra líquida en la cámara, y la composición de estabilización es un líquido y está dispuesta en la cámara de manera que la relación volumétrica de la composición de estabilización al volumen especificado de la muestra que contiene células se selecciona de 10:1 a 1:20, 5:1 a 1:15, 1:1 a 1:10 y 1:2 a 1:5. Las ventajas asociadas se describieron anteriormente.
Preferiblemente, el recipiente es para extraer sangre de un paciente.
Según un quinto aspecto, se proporciona un método que comprende la etapa de recoger una muestra de un paciente directamente en una cámara de un recipiente según el cuarto aspecto de la presente invención. Los detalles con respecto al recipiente y la muestra se describieron anteriormente. Se hace referencia a la descripción respectiva. Según una realización, se recoge una muestra de sangre, preferiblemente se extrae del paciente.
Los métodos y composiciones descritos en el presente texto permiten la conservación y el aislamiento eficaces de los ácidos nucleicos extracelulares, al tiempo que reducen la posible mezcla con ácidos nucleicos, en particular ADN genómico fragmentado, que se origina de células comprendidas en la muestra biológica y que pueden entrar en una muestra biológica debido a un daño celular, respectivamente lisis celular. Los métodos según la presente invención, así como las composiciones y los dispositivos descritos (por ejemplo, los recipientes colectores) reducen la degradación de ácidos nucleicos extracelulares y también reducen la lisis celular y/o la liberación de ácidos nucleicos genómicos, en particular ADN genómico fragmentado, de forma que los ácidos nucleicos extracelulares contenidos en la muestra no se contaminan con ácidos nucleicos intracelulares, en correspondencia se reduce la contaminación mediante las enseñanzas según la presente invención. Como se discutió anteriormente, una entremezcla de ácidos nucleicos extracelulares y ácidos nucleicos celulares, en particular ADN genómico fragmentado, puede reducir la precisión de cualquier medición de la cantidad de ácidos nucleicos extracelulares en una muestra biológica. Como se discutió anteriormente, una importante ventaja de la presente invención es la posibilidad de estabilización esencialmente simultánea de las células contenidas en la muestra (en particular, glóbulos blancos en el caso de sangre completa, plasma o suero) y los ácidos nucleicos extracelulares. Esto contribuye a evitar que los ácidos nucleicos celulares, tales como el ADN genómico, se liberen en la porción libre de células de la muestra, y diluyendo adicionalmente los ácidos nucleicos extracelulares de interés (y los biomarcadores asociados), al tiempo que se mantiene la integridad estructural de los ácidos nucleicos extracelulares. Como se discute en el presente texto, poner en contacto la muestra biológica que contiene células, tal como sangre completa o plasma, con el agente o agentes de estabilización, permite que la muestra se almacene durante un período de tiempo antes de aislar los ácidos nucleicos extracelulares. Más preferiblemente, la muestra biológica que contiene células, p. ej. sangre o plasma, puede extraerse en un lugar (por ejemplo, un centro médico), ponerse en contacto con el agente o los agentes de estabilización, y luego transportarse a un lugar remoto diferente (por ejemplo, un laboratorio) para el proceso de aislamiento y prueba de ácido nucleico.
Además, los reactivos de estabilización, como se describen en el presente texto, proporcionan una ventaja sobre los reactivos de estabilización del estado de la técnica conocidos, que implican el uso de reactivos de reticulación, tales como formaldehído, liberadores de formaldehído y similares, ya que la estabilización de las muestras según la presente invención no implica el uso de tales reactivos de reticulación. Los reactivos de reticulación causan enlaces covalentes intermoleculares o intramoleculares entre moléculas de ácido nucleico o entre ácidos nucleicos y proteínas. Este efecto puede conducir a una recuperación reducida de tales ácidos nucleicos estabilizados y parcialmente reticulados después de una purificación o extracción de una muestra biológica compleja. Como, por ejemplo, la concentración de ácidos nucleicos en circulación en muestras de sangre entera es ya relativamente baja, se debe evitar cualquier medida que reduzca más el rendimiento de tales ácidos nucleicos. Esto puede ser de particular importancia cuando se detectan y analizan moléculas de ácido nucleico muy raras derivadas de tumores malignos o de un feto en desarrollo en el primer trimestre del embarazo. Por lo tanto, según una realización, ningún liberador de formaldehído está comprendido en la composición de estabilización, respectivamente, no se usa adicionalmente para la estabilización. Según una realización, el inhibidor de la apoptosis que se usa en las composiciones según la presente invención no se elige entre el grupo que consiste en ácido aurintricarboxílico, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), leupeptina y clorhidrato de Na-Tosil-Lys clorometil cetona (TLCK). Según una realización, el inhibidor de la apoptosis no se elige entre dicho grupo en particular si el inhibidor de la apoptosis no se usa en combinación con un agente hipertónico como estabilizante adicional.
Esta invención no está limitada por los ejemplos de métodos y materiales descritos en el presente texto, y cualquier método o material similar o equivalente a los descritos en el presente texto puede usarse en la práctica o pruebas de realizaciones de la presente invención. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. Los títulos proporcionados en este documento no son limitaciones de los diversos aspectos o realizaciones de esta invención, que pueden leerse por referencia a la especificación en su conjunto.
El término "solución" como se usa en el presente texto se refiere en particular a una composición líquida, preferiblemente una composición acuosa. Puede ser una mezcla homogénea de una sola fase, pero también está dentro del alcance de la presente invención que una solución comprenda aditivos sólidos tales como, p. ej., precipitados.
Los tamaños, respectivamente los intervalos de tamaño indicados en el presente texto con referencia a los nucleótidos nt, se refieren a la longitud de la cadena y, por tanto, se usan para describir la longitud de las moléculas monocatenarias así como de las bicatenarias. En las moléculas bicatenarias, dichos nucleótidos están emparejados.
Según una realización, la materia descrita en el presente texto como materia que comprende ciertos pasos en el caso de métodos o que comprende ciertos ingredientes en el caso de composiciones, soluciones y/o tampones, se refiere a la materia que consiste en los pasos o ingredientes respectivos. Se prefiere seleccionar y combinar realizaciones preferidas descritas en el presente texto, y la materia específica que surge de una combinación correspondiente de realizaciones preferidas pertenece también a la presente descripción.
Tabla 1:Resumen de los inhibidores de la apoptosis.
Ejemplos.
En los ejemplos que siguen se proporcionan materiales y métodos de la presente invención. Debe entenderse que estos ejemplos son solo para fines ilustrativos y no deben considerarse en modo alguno como limitantes de esta invención.
I. Materiales y métodos.
Se diseñó un sistema de ensayo, en donde las muestras biológicas que contienen células, en este caso muestras de sangre completa, se incubaron a temperatura ambiente (RT) durante un tiempo de hasta 6 o 7 días. De allí, las propiedades de estabilización de muestra de los aditivos de la presente invención se ensayaron el día 0, el día 3 y el día 6/7 las muestras. Las muestras se procesaron según los siguientes protocolos, en su caso (para más detalles, véanse también los ejemplos específicos en la sección de resultados):
1. Medida de la integridad de las células sanguíneas mediante clasificación de células activada por fluorescencia (FACS).
1.1. Lisis de glóbulos rojos.
- Transferencia de 2 ml de muestra de sangre a un tubo Falcon nuevo de 15 ml.
- Adición de Tampón EL dilución quíntuple (QIAGEN)
- Inversión de la muestra (10 X)
- Incubación en hielo (10 min.)
- Centrifugación durante 10 min. @ 400 x g y 4 °C
- Desechamiento del sobrenadante
- Adición de tampón EL doble dilución (QIAGEN) al sedimento de glóbulos blancos
- Resolución del sedimento en tampón EL (QIAGEN) mediante ligera agitación en vórtice
- Centrifugación durante 10 min @ 400 x g
- Desechamiento del sobrenadante
- Adición de 500 gl de FACS Flow (Becton, Dickinson Plymouth, Reino Unido) al sedimento de glóbulos blancos - Resolución del sedimento en FACS Flow mediante ligera agitación en vórtice.
- Transferencia de 1 ml de FACS Flow en un tubo FACS nuevo.
- Transferencia de 100 gl del sedimento resuelto en un tubo FACS.
Los glóbulos rojos se lisan porque, de lo contrario, las poblaciones de células decisivas (que pueden liberar, por ejemplo, ADN genómico) no son distinguibles en el análisis FACS debido a la gran cantidad de glóbulos rojos.
1.2. Medida de la integridad celular mediante citometría de flujo.
La medida se realizó según las instrucciones del fabricante (FACSCalibur; Becton, Dickinson Plymouth, Reino Unido).
2. Separación del plasma sanguíneo.
Para separar el plasma sanguíneo de la sangre completa, las muestras de sangre se centrifugaron durante 15 minutos a 5000 rpm, y las muestras de plasma obtenidas se centrifugaron de nuevo durante 10 min a 16.000 x g a 4 °C. El plasma sanguíneo resultante se usó para el aislamiento de los ácidos nucleicos contenidos en el mismo.
3. Purificación de ácidos nucleicos.
Los ácidos nucleicos extracelulares circulantes se purificaron a partir de las muestras de plasma obtenidas, utilizando el kit QIAamp® Circulating NA (según el manual). En resumen:
- 10 ml de entrada de muestra;
- lisis: 1 ml de proteinasa K y 8 ml de tampón ACL (QIAGEN)
- unión: 18 ml de tampón ACB (QIAGEN)
- etapas de lavado: sin cambios y según el manual
- en 60 gl de tampón AVE (QIAGEN)
4. Análisis de los eluatos.
Los eluatos obtenidos según 3. se almacenaron a -20 °C hasta que todas las muestras (incluidas las muestras del día 6/7) se purificaron. Después de esto, los eluatos de la misma condición se reunieron y se trataron de la siguiente manera:
4.1. Medida de la estabilidad de la célula sanguínea/liberación de ADN mediante la determinación de la distribución de tamaños de ADN usando electroforesis en gel con chip (2100 Bioanalyzer; Agilent Technologies; Inc., EE. UU.) según las instrucciones del fabricante (consúltese el manual Agilent DNA 7500 y DNA 12000 Kit Guide), pero en vez de 1 gl de muestra se transfirieron 1,5 gl a los pocillos.
4.2. Cuantificación del ADN con un ensayo de PCR en tiempo real, sensible para la degradación del ADN (objetivo: secuencias de codificación de a Dn 18S ribosómicas de 500 y 66 pb de longitud).
El ensayo dúplex de ADN se llevó a cabo según el manual QuantiTect® Multiplex PCR (Qiagen) con las siguientes adaptaciones:
- La concentración de cebador se hizo a una escala de 8 gM a 16 gM.
- La etapa de reasociación/alargamiento se extendió de 1 a 2 minutos.
(las muestras se diluyeron 1:10 antes de la amplificación).
4.3. Detección de ARN utilizando ensayos de PCR en tiempo real, sensible a variaciones en los niveles de ARN en circulación libre de células (objetivo: ARNr 18S, IL8, c-fos y p53). Los ensayos de ARN se llevaron a cabo según las condiciones descritas en las Tablas 2 a 4.
Tabla 2:muestra las composiciones de reactivos de PCR y condiciones de ciclización del ARNm de p53 en una etapa en tiempo real.
Ciclización:
30 min 50 °C
15 min 95 °C
40 ciclos
15 s 95 °C
Tabla 3:muestra las composiciones de los reactivos de la PCR y las condiciones de ciclización de la PCR en tiempo real en un solo paso de mRNA de IL8.
Ciclización:
30 min 50 °C
15 min 95 °C
40 ciclos
15 s 95 °C
1 min. 60 °C
Tabla 4:muestra las composiciones de los reactivos de PCR y las condiciones de ciclización de la PCR en tiempo real dúplex c-fos mRNA/rRNA 18S.
Ciclización:
30 min 50 °C
15 min 95 °C
40 ciclos
1 5 s 95 °C
1,30 min 60 °C
Tabla 5:resume la información de las secuencias diana de ADN utilizadas detectadas en 4.2 y 4.3.
II. Experimentos realizados y resultados
A continuación se explican los detalles de los experimentos realizados. Los detalles de los métodos usados en los ejemplos se describieron anteriormente en I.
Ejemplo 1: Estabilización mediante la adición de un inhibidor de la caspasa.
Se probaron dos oligopéptidos diferentes, Q-VD-OPh y Z-Val-Ala-Asp (OMe)-FMK que actúan como inhibidores de la caspasa de amplio espectro:
Tabla 6: Inhibidores de la caspasa ensayados.
Cada inhibidor de la caspasa ensayado se añadió a muestras de sangre completa (concentración final de 20 |<j>M en 10 ml de sangre; la sangre se recogió en tubos Vacutainer K2E; BD). La muestra de sangre completa se procesó como se describe en la sección I, véase 2. (preparación de plasma) y 3. (aislamiento de ácido nucleico).
Resultados de la electroforesis por gel con chip.
El ADN libre de células en circulación eluido se separó por tamaños usando electroforesis por gel con chip (para más detalles sobre el método, véase I, 4.1 anteriormente). La Fig. 1a muestra los resultados obtenidos. El control de DMSO y la sangre K2E (no tratada según las enseñanzas de la presente invención) muestran el mismo patrón de bandas en forma de escalera. Este patrón se presenta en muestras donde ocurre la apoptosis. Durante la apoptosis, las endonucleasas degradan el ADN genómico en las regiones de ligado internucleosómico y producen fragmentos de ADN de cerca de 180 pb o múltiplos de 180 pb. Por lo tanto, la apoptosis ocurre en muestras que manifiestan un claro patrón similar a una escalera. Además, la fuerza (oscuridad) del patrón es decisiva. Cuanto más oscuras son las bandas, más ADN genómico se liberó de las células y, por lo tanto, contamina la población de ácido nucleico extracelular.
La Fig. 1 a) muestra que el control DMSO y las muestras de sangre K2E muestran un fuerte patrón tipo escalera ya en el día 3, que se hace incluso más fuerte en el día 7. Por lo tanto, el ADN genómico se liberó de las células contenidas en la muestra y también fue degradado. Este ADN liberado y degradado contamina los ácidos nucleicos libres de células contenidos en la muestra. Por tanto, no se logra una estabilización aceptable con estas muestras.
En cambio, las muestras de sangre entera tratadas con Z-Val-Ala-Asp (OMe)-FMK muestran un patrón similar a la escalera reducido, en particular el día 7 en comparación con los controles, lo que indica una inhibición de la liberación de ADN genómico, respectivamente fragmentación de ADN genómico causada por apoptosis. Este efecto está confirmado por los resultados mostrados en la Fig. 1 b) (véase más adelante). El efecto es incluso más prominente en las muestras de sangre tratadas con Q-VD-OPh, que muestran patrones de tipo escalera reducidos significativamente ya en el día 3 y el día 7. Así pues, la liberación y degradación del ADN genómico se previenen de forma efectiva, respectivamente, reducidas por la adición del inhibidor de la caspasa Q-VD-OPh.
Resultados de la cuantificación de ADN.
El ADN libre de células circulantes eluido también se cuantificó con el ensayo de PCR en tiempo real que es sensible a la degradación del ADN (para detalles sobre el método, véase más arriba, I, 4.2). La Fig. 1 b) muestra el efecto de los inhibidores de la caspasa ensayados, sobre la estabilización de la población de ácido nucleico extracelular (ensayo dúplex de ADN 18S) dentro de los 7 días de almacenamiento a RT, en este caso el aumento en el ADN.
La detección del ADN 18S ribosómico mediante PCR cuantitativa en tiempo real permite calcular el incremento en xveces del ADN desde el día 0 hasta el día 3 o 7 (cálculo: división de copias del día 3 (o 7) por copias del día 0). Sorprendentemente, los resultados mostrados en la figura 1 b) demuestran un aumento reducido de ADN cuando se añadió un inhibidor de la caspasa, especialmente Q-VD-OPh, a muestras de sangre completa. El efecto estabilizador de Z-Val-Ala-Asp (OMe)-FMK en comparación con las muestras estándar fue más prominente el día 7, confirmando así los resultados que se muestran en la Fig. 1 a).
Resumen.
Resumiendo los resultados de la PCR en tiempo real y la electroforesis en gel, se demostró que la adición de Q-VD-OPh o Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK inhibe la fragmentación del ADN y, además, reduce la liberación de ADN genómico en el plasma sanguíneo. Por lo tanto, la adición de un inhibidor de la caspasa a sangre completa es efectiva para estabilizar la muestra y, en particular, la población de ácido nucleico extracelular, incluso a temperatura ambiente. Por lo tanto, la utilización del método de estabilización según la presente invención permite el envío de muestras de sangre entera incluso a temperatura ambiente sin comprometer la calidad de la muestra. Para prevenir por completo la liberación de ADN genómico también durante períodos de almacenamiento más largos, la concentración de Q-VD-OPh también puede aumentarse.
Ejemplo 2: Influencia de concentraciones más bajas del inhibidor de la caspasa Q-VD-OPh en la estabilidad de la sangre.
En este ejemplo, se ensayaron concentraciones más bajas del inhibidor de la caspasa Q-VD-OPh en combinación con glucosa, en donde la glucosa se añadió como compañero de combinación para respaldar que las células sanguíneas permanecen vivas (previniendo el daño celular). Se añadieron glucosa 21,4 mM y Q-VD-OPh 4 pM, 1 pM o nada, a 10 ml de sangre extraída en tubos BD Vacutainer y se almacenaron durante un tiempo de hasta 7 días a temperatura ambiente. La muestra de sangre completa se procesó como se describe en la sección I, véase 2. (preparación de plasma) y 3. (aislamiento del ácido nucleico).
Resultados de la electroforesis en gel con chip.
El ADN eluido se separó por tamaños usando electroforesis en gel con chip (para detalles sobre el método véase más arriba, I, 4.1). La Fig. 2a muestra que, en comparación con las muestras de control en donde no se añadió inhibidor de la caspasa, el inhibidor de la caspasa 1 pM ya redujo significativamente la liberación/fragmentación de ADN genómico el día 7. El efecto se mejora si se usa inhibidor de la caspasa 4 pM. Por lo tanto, las concentraciones muy bajas del inhibidor de la caspasa son ya eficaces para estabilizar la muestra de sangre, en particular cuando se combinan con un hidrato de carbono.
Resultados de la cuantificación de ADN.
La figura 2b muestra los efectos de las concentraciones ensayadas del inhibidor de la caspasa Q-VD-OPh en combinación con glucosa 21 mM sobre el aumento del ADN genómico en el plasma (ensayo dúplex de ADN 18S) dentro de los 7 días de almacenamiento a temperatura ambiente (RT). La adición de Q-VD-OPh en combinación con glucosa reduce significativamente la liberación de ADN genómico en el plasma. La Fig. 2b muestra solo un aumento menor de ADN genómico dentro de los 7 días de almacenamiento, incluso cuando solamente se añadió Q-VD-OPH 1 gM a la muestra de sangre completa para la estabilización. La adición de 4 gM de Q-VD-OPh inhibe la liberación de ADN genómico al plasma hasta un máximo de 4 veces. En cambio, extraer sangre completa en tubos K2E sin estabilización según la presente invención conduce a un aumento del ADN en el plasma de aproximadamente 40 veces.
Así pues, también la Fig. 2 b) confirma que el inhibidor de la caspasa tiene un efecto de estabilización sobre la sangre completa incluso a bajas concentraciones.
Ejemplo 3: Estabilización de células sanguíneas por efectos osmóticos.
Sorprendentemente, los inventores encontraron también que las células sanguíneas se pueden estabilizar añadiendo un reactivo que actúa como un medio hipertónico en la sangre completa. La generación de un medio hipertónico mediante la adición a la sangre completa de, por ejemplo, uno o más compuestos orgánicos hidroxilados, da como resultado una ligera liberación de agua de las células sanguíneas contenidas y produce una mayor estabilidad por encogimiento celular. Se supone que dicho encogimiento celular estabiliza las células contra las fuerzas mecánicas.
La dihidroxiacetona (DHA) es un producto intermedio del metabolismo de la fructosa y su forma fosfato, fosfato de dihidroxiacetona (DHAP), es parte de la glucólisis. La DHA fue probada como agente hipertónico. La adición de este reactivo fuerza a las células sanguíneas a contraerse sin dañarlas. La DHA se disolvió primero en PBS (adquirido a SIGMA-Aldrich Kat. No: D8537) o 3 x MOPS (diluido a partir de 1 litro de 10 x MOPS: MOPS 200 mM; NaAc 50 mM, EDTA 10 mM; pH 5; suponiendo que un medio ácido también estabiliza el ARN ccf) obteniendo DHA disuelto 4,2 M. Después se añadieron 2 ml de DHA 4,2 M disuelto en tampón PBS o tampón 3 x MOPS, a 10 ml de sangre para obtener una concentración final de DHA 0,7 M en sangre completa. Los dos disolventes diferentes de DHA se compararon con tubos de PAXgene® Blood DNA (QIAGEN), un tubo de recolección de sangre del estado actual de la técnica, para la estabilización del ADN.
Resultados del análisis FACS.
La integridad de las células sanguíneas se analizó mediante FACS (para obtener detalles sobre el método véase más arriba, I, 1). La Fig. 3 muestra la integridad de las células sanguíneas medida por citometría de flujo. Las gráficas de puntos visualizan tres poblaciones celulares diferentes: granulocitos (1), monocitos (2) y linfocitos (3). La nube (4) en el campo inferior izquierdo de la gráfica representa los residuos, generados principalmente por la lisis de los eritrocitos.
Los resultados en la Fig. 3 muestran que las células sanguíneas recolectadas y almacenadas en los tubos de PAXgene® Blood DNA no son distinguibles entre ellos y los residuos del día 6 de almacenamiento. La adición de DHA permite una diferenciación de las subpoblaciones de células sanguíneas en el día 6 de almacenamiento incluso aunque estas células se hacen más pequeñas como resultado del encogimiento celular. Esto indica que las células contenidas en la muestra se estabilizaron por la adición de DHA.
Resultados de la electroforesis en gel con chip.
Los resultados presentados en la Fig. 4a también muestran una estabilización de las muestras de sangre mediante la adición de DHA, porque la liberación de ADN genómico es significativamente más baja con las muestras tratadas con DHA que en las muestras almacenadas en tubos PAXgene® Blood DNA. Además, como es evidente por la Fig. 4a, las muestras estabilizadas con DHA no muestran un patrón de degradación similar a una escalera que sugiere que se previene eficazmente la apoptosis, o una degradación del ADN.
Resultados de la cuantificación del ADN.
La Fig. 4b muestra el efecto de la DHA sobre el aumento de ADN (ensayo dúplex de ADN 18S) dentro de los 6 días de almacenamiento a temperatura ambiente. La DHA disuelta en 3 x MOPS proporcionó los mejores resultados, porque el nivel de ADN 18S ribosómico parece permanecer constante hasta el día 3 de almacenamiento.
La división del número de copias del amplicón corto por el número de copias del amplicón largo (66 pb/500 pb) indica si la cantidad de amplicones cortos o largos detectados cambia a lo largo del tiempo de forma similar. Una disminución de esta relación implica una liberación más intensa de moléculas de ADN más largas que más cortas, y puede interpretarse como la liberación de ADN genómico de alto peso molecular a partir de células sanguíneas. El diagrama mostrado en la Fig. 4b indica la liberación de ADN genómico para las tres condiciones. Los resultados muestran que la presencia de DHA ralentiza este proceso. Por lo tanto, también este experimento muestra que la adición de DHA a sangre completa con EDTA estabiliza las células sanguíneas y por lo tanto preserva la población de ADNccf en la fracción de plasma libre de células y evita contaminaciones con ADN liberado de las células contenidas en la muestra, p. ej. debido a la ruptura mecánica.
Ejemplo 4: Ensayo de diferentes concentraciones de dihidroxiacetona.
En este ejemplo, se probó el efecto estabilizador de diferentes concentraciones de DHA (0,7 M, 0,5 M y 0,2 M).
Resultados del análisis FACS.
La Fig. 5 muestra la integridad de las células sanguíneas medida por citometría de flujo. Las gráficas de puntos visualizan tres poblaciones celulares diferentes: granulocitos (1), monocitos (2) y linfocitos (3). La nube en el campo inferior izquierdo de la gráfica representa los residuos, causados principalmente por la lisis de los eritrocitos.
Debido a la adición de DHA a la sangre total, las diferentes poblaciones celulares se pueden distinguir incluso el día 6 de almacenamiento, al margen de la concentración de DHA. Con todo, los resultados del análisis de citometría de flujo (Fig. 5) no muestran diferencias en la integridad celular entre las diferentes concentraciones de DHA.
Resultados de la electroforesis en gel con chip.
Los resultados presentados en la Fig. 6a también muestran una estabilización de las muestras de sangre por la adición de las diferentes concentraciones de DHA, porque la liberación de ADN genómico y la degradación del ADN se previene eficazmente.
Resultados de la cuantificación del ADN.
La Fig. 6b muestra el efecto de diferentes concentraciones de DHA sobre el aumento de ADN (ensayo dúplex de ADN 18S) dentro de los 6 días de almacenamiento a temperatura ambiente. Como se muestra en la Fig. 6b, la DHA 0,5 M en sangre completa previene de la manera más eficaz la liberación de ADN genómico. Además, la relación entre el número de copias de amplicones cortos y largos se mantiene constante durante un tiempo de hasta 3 días y solo disminuye ligeramente hasta el día 6. Estos resultados demuestran el efecto notable del agente hipertónico DHA sobre la estabilización de la sangre completa.
Ejemplo 5: Combinación de un inhibidor de la apoptosis, un compuesto osmóticamente activo y un anticoagulante.
Un aumento de EDTA en los tubos de recogida de sangre inhibe la micro- y la macro-coagulación, como se sabe para los tubos PAXgene® Blood DNA. Por lo tanto, concentraciones más altas de EDTA pueden apoyar la estabilización de las células sanguíneas y los ácidos nucleicos extracelulares en el plasma. Además, los experimentos presentados anteriormente muestran un efecto inhibidor del inhibidor de la caspasa, en particular Q-VD-OPh, y el compuesto osmóticamente activo DHA, sobre el daño de las células sanguíneas y en particular indican que se reduce eficazmente un aumento de ADN genómico, en particular ADN genómico fragmentado, en la población de ácido nucleico extracelular. Sorprendentemente, los inhibidores de la caspasa probados también previnieron/inhibieron la fuga de ADN genómico a la fracción libre de células (plasma). Por lo tanto, la combinación de estos reactivos da como resultado una estabilización mejorada de los ácidos nucleicos extracelulares, en particular ADN extracelular, en sangre completa que dura al menos 6 días, y además, da como resultado una eficaz estabilización de las células sanguíneas, evitando así la liberación de ADN genómico, lo que de no ser así daría como resultado una dilución del nivel de ácido nucleico extracelular natural en el plasma.
En este ejemplo, la DHA se disolvió en 2 ml de 3 x MOPS (DHA 3M en 2 ml de 3 x MOPS), 50 mg de K<2>EDTA y se añadieron 2,4 pl de Q-VD-OPh 5 nM y luego se transfirieron a 10 ml de sangre completa, que se recogió en tubos K2E. Las muestras de plasma se centrifugaron durante 10 min a 16.000 x g, 4 °C y luego se purificaron usando el kit QlAamp® Circulating NA (Qiagen) (los detalles se describieron anteriormente en la sección I).
Resultados del análisis FACS.
La Fig.7a muestra la integridad de la célula sanguínea medida por citometría de flujo. Las gráficas de puntos visualizan tres poblaciones celulares diferentes: granulocitos (1), monocitos (2) y linfocitos (3). La nube en el campo inferior izquierdo de la gráfica representa los residuos, principalmente causados por la lisis de los eritrocitos que quedan.
La adición del inhibidor de la caspasa, el agente hipertónico y el agente complejante a la sangre completa dio como resultado un patrón de sangre distinguible de poblaciones de células sanguíneas después de 6 días de almacenamiento. Por lo tanto, las células contenidas en la muestra de sangre se estabilizaron eficazmente.
Resultados de la cuantificación del ADN.
La Fig. 7b muestra el efecto de la combinación de EDTA, DHA y el inhibidor de la caspasa Q-VD-OPH sobre el aumento de ADN (ensayo dúplex de ADN 18S) dentro de los 6 días de almacenamiento a temperatura ambiente. Los resultados indican que la combinación de EDTA, DHA y Q-VD-OPH conduce a una estabilización notablemente intensa del ADN extracelular en plasma (el nivel de ADNr 18S permanece constante hasta el día 6) y a una fuerte prevención de la liberación de ADN genómico a partir de las células sanguíneas (la relación de los números de copias de amplicón corto a largo permanece constante) hasta el día 3 de almacenamiento. Sólo un ligero aumento de ADN genómico en plasma se hace visible entre el día 3 y el día 6 de almacenamiento.
Por lo tanto, la combinación de agentes estabilizantes ensayada es particularmente eficaz para estabilizar muestras de sangre completa.
Ejemplo 6: Efecto de un inhibidor de la apoptosis, un compuesto osmóticamente activo y un agente de prevención sobre ARN circulante libre en sangre completa.
Como una combinación de K<2>EDTA, Q-VD-OPh y DHA mostraron unos efectos estabilizadores notables sobre el ADN circulante libre y la integridad de las células sanguíneas en sangre completa, también se analizó la capacidad de estabilización de estos agentes sobre el ARN circulante libre. Para preservar un nivel constante de ARN circulante libre en el plasma (como está presente cuando se recolecta la sangre), el reactivo estabilizador no solo debe proteger a los ARN de la degradación y evitar la liberación de ARN de células sanguíneas en descomposición, sino que también debe inhibir las rutas metabólicas, respectivamente, tener el efecto de que los cambios en la ruta metabólica no afectan al nivel en plasma de ARN extracelular, respectivamente, deberían reducir los efectos respectivos. Por lo tanto, se repitió el experimento 5 y se midió el nivel de ARNm mediante RT-PCR en tiempo real.
La Fig. 8 muestra el efecto de la combinación de EDTA, DHA y el inhibidor de la caspasa ensayado, sobre el nivel de transcripción en plasma dentro de los 6 días de almacenamiento. Con el fin de medir las variaciones en los niveles de ARN, se denominó a los ARNm diana como objetivo de referencia (ARNr 18S) calculando un ACt entre p53, IL8 o cfos y el patrón interno (ARNr 18S). Restar el ACt de las muestras del día 3 o 6 con las muestras de ACt del día 0 define el A ACt que visualiza una disminución relativa (valores - ) o un aumento (valores ) de los niveles de transcripción del ARNm. IL8 y c-fos son genes cuya transcripción se induce después de extracción de sangre. Por lo tanto, los niveles de transcripción de estos objetivos aumentarían drásticamente cuando las células liberan sus contenidos; la adición de la solución de estabilización descrita en el presente texto (combinación de EDTA elevado, dihidroxiacetona, inhibidor de la caspasa Q-VD-OPh) previene fuertemente la liberación de ácido nucleico desde las células sanguíneas hasta el día 3 de almacenamiento. Pero, sorprendentemente, los datos en el diagrama anterior no muestran ningún aumento significativo de mRNA de c-fos e IL8 hasta el día 6 de almacenamiento. Por lo tanto, la estabilización previene aparentemente la degradación del ARN (p53) y la liberación de ARNm (IL8/c-fos).
La transcripción de p53 se reprime durante el metabolismo continuado después de la extracción de sangre y, por ello, una degradación o regulación a la baja del mRNA p53 daría como resultado una disminución de (-) A Acts. Sin embargo, los resultados indican que la solución de estabilización de QGN ensayada previene que el nivel de ARNm de p53 se degrade durante el almacenamiento de sangre completa en un tiempo de hasta 6 días.
Este experimento demostró que la adición de una combinación de EDTA elevada, dihidroxiacetona, e inhibidor de la caspasa Q-VD-OPh a la sangre completa recién extraída actúa para preservar la población de ARNm de plasma circulante que estaba presente en el momento de la extracción de sangre, reduciendo los cambios específicos de ARNm en la concentración de ARNm. Esto es de especial importancia para el análisis de ARNm circulante en el plasma, por ejemplo, para la identificación y caracterización de especies potenciales de ARNm específicas de un tumor. Dichos estudios requieren que la población de ARNm en el plasma permanezca sustancialmente inalterada entre la extracción de sangre y la extracción y análisis de los ácidos nucleicos.
Ejemplo 7: Estabilización mediante la adición de dimetilacetamida (DMAA).
Se ensayaron dos concentraciones diferentes de DMAA junto con K<2>EDTA y se compararon con EDTA solo (K2E BD; 18 mg de K<2>EDTA).
Se añadió DMAA a replicados de muestras de sangre completa (0,75% y 1,5% de concentración final en 10 ml de sangre; la sangre se recogió en tubos Vacutainer K2E; BD).
Las muestras de sangre se incubaron durante un tiempo de hasta 6 días a temperatura ambiente. En los días 0, 3 y 6, las muestras de sangre completa se centrifugaron a 1912 x g durante 15 min a temperatura ambiente, seguido de una centrifugación de las muestras de plasma a 16.000 x g durante 10 min a 4 °C. Se utilizó 1 ml de la muestra de entrada para el aislamiento del ADN siguiendo el protocolo descrito en la sección de materiales y métodos. El ADN se eluyó en 80 pl de tampón EB y se cuantificó con el ensayo RT PCR descrito en I, 4.2.
Resultados de la cuantificación del ADN.
La Figura 11 muestra los efectos de las concentraciones de DMAA probadas sobre el aumento del ADN genómico en el plasma. La adición de DMAA reduce significativamente la liberación de ADN genómico en plasma. Cuanto más DMAA se añade a la sangre completa, menos ADN se libera. Solo se observó un aumento menor de ADN libre de células dentro de los 6 días de almacenamiento si se añade 1,5% de DMAA a la muestra de sangre completa. Además, como la adición de DMAA al 1,5% estabiliza los niveles de ADN libre de células en muestras de sangre entera más eficazmente que 0,75% y la relación de las copias de ADN 18S corto a largo disminuye del día 0 al día 6, unas concentraciones mayores de DMAA de más del 1,5% pueden dar como resultado efectos de estabilización más eficaces.
En resumen, la adición de DMAA reduce la liberación de ADN genómico en el plasma sanguíneo. Por lo tanto, la adición de DMAA a una muestra de sangre es eficaz para estabilizar la muestra incluso a temperatura ambiente.
Ejemplo 8: Influencia de los alcoholes de azúcar en la preservación del estado de ADNccf en sangre completa.
Se recogieron primero muestras de 10 ml de sangre de dos donantes en BD Vacutainer K2E-EDTA (EDTA 4,45mM = Referencia). A continuación, se añadieron 2 ml de las siguientes soluciones de estabilización (las concentraciones dadas representan la concentración final en solución de sangre estabilizada):
Las muestras estabilizadas respectivamente se incubaron a temperatura ambiente durante un tiempo de hasta seis días. En el día 0, día 3 y día 6, los replicados se procesaron de la siguiente manera. Las muestras se centrifugaron a 3.000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente con el fin de recoger el plasma. El plasma recogido se centrifugó a 16.000 x g durante 10 minutos a 4 °C. La fracción de plasma aclarada se recogió y los ácidos nucleicos extracelulares se aislaron usando el kit de ácido nucleico QIAamp Circulating (1 ml de material de entrada, 60 gl de volumen de elución). Los resultados se muestran en un cambio relativo en comparación con el tiempo de 0 días (copias del día X/copias del día 0) en la Fig. 10. Los valores que están próximos a 1 implican niveles conservados de ADNccf. Cuanto mayor sea el valor, menos estabilización se logra. A partir de los alcoholes de azúcar ensayados, se obtuvieron muy buenos resultados con DHA (0,5 M). Aquí, se observó el aumento más bajo de los niveles de ADNccf en la fracción de plasma. Otras alternativas adecuadas son inositol en concentraciones de, por ejemplo, 0,05 M, y maltitol en concentraciones < 0,01 M. Además, también se observaron efectos de estabilización durante 3 días con manitol.
Ejemplo 9: Influencia de DMAA, DHA y glicina sobre el nivel de ADNccf.
Primero se recogieron muestras de sangre completa de 10 ml de tres donantes en BD Vacutainer K2E-EDTA (EDTA 4,45 mM = referencia). A continuación, se añadieron 2 ml de las siguientes soluciones (las concentraciones dadas representan la concentración final en la solución de sangre estabilizada):
Las muestras se procesaron como se describe en el ejemplo 8. Los resultados así como las condiciones de ensayo se muestran en la figura 11. Como puede observarse, la DHA sola estabiliza el nivel de ADNccf durante un tiempo de hasta tres días (véase donante 1). Se obtuvieron niveles de ADNccf particularmente estables cuando se usó la mezcla QGN. Se pueden obtener resultados comparables a los de la mezcla QGN cuando se añade DMAA a la muestra en combinación, p. ej., con el aumento de las concentraciones de EDTA y agregando un inhibidor de la caspasa.
Ejemplo 10: Influencia del alcohol de azúcar en combinación con el inhibidor de la caspasa y concentraciones crecientes de EDTA sobre el nivel de ADNccf.
Primero se recogieron muestras de sangre completa de 10 ml de dos donantes en el BD Vacutainer K2E-EDTA (EDTA 4,45 mM = referencia). Luego, se añadieron 2 ml de las siguientes soluciones (las concentraciones dadas representan la concentración final en la solución de sangre estabilizada):
1: DHA 0,5 M, OPH 1 pM, EDTA 14 mM (mezcla QGN);
2: Inositol 0,5 M en la mezcla QGN (sin DHA);
3: Maltitol 0,01 M en la mezcla QGN (sin DHA).
Después se procesaron las muestras como se describe en el ejemplo 8. Los resultados se muestran en la figura 12. Los mejores resultados se obtuvieron para la mezcla QGN. Las combinaciones de alcohol de azúcar a la mezcla QGN indicaron también efectos estabilizantes en comparación con las muestras estabilizadas con EDTA.
Ejemplo 11: Influencia de las combinaciones de concentraciones de DMAA y OPH (inhibidor de la caspasa) sobre los niveles de ADNccf.
Primero se recogieron muestras de sangre completa de 10 ml en BD Vacutainer K2E-EDTA (EDTA 4,45 mM = referencia). Luego, se añadieron 2 ml de las siguientes soluciones (las concentraciones dadas representan la concentración final en la solución de sangre estabilizada). Cada condición se probó con seis tubos de diferentes donantes.
1: referencia EDTA (BD Vacutainer K2E);
2: mezcla QGN;
3: 50 mg de EDTA, OPH 1 pM;
4: 50 mg de EDTA, OPH 2 pM;
5: 50 mg de EDTA, OPH1 pM, 5% de DMAA;
6: 50 mg de EDTA, OPH 1 pM, 10% de DMAA;
7: 50 mg de EDTA, OPH 2 pM, 5% de DMAA;
8: 50 mg de EDTA; OPH 2 pM y 10% de DMAA.
La incubación de la muestra, el aislamiento del plasma y el aislamiento de ácidos nucleicos de la fracción plasmática eliminada, se realizaron como se describe en el ejemplo 8. Sin embargo, después de la primera etapa de centrifugación a 3.000 rpm, se agruparon muestras de plasma de condiciones de estabilización idénticas antes de llevarse a cabo el segundo paso de centrifugación para el aclaramiento del plasma (16.000 x g). Los resultados se muestran en la figura 13. Como puede observarse, diferentes concentraciones de DMAA en combinación con diferentes concentraciones de OPH muestran resultados comparables a la mezcla QGN. La Figura 14 muestra la influencia de combinaciones de concentraciones de DMAA y OPH sobre los niveles de ADNccf (diferente escala debido a la exclusión de datos de referencia).
Ejemplo 12: Influencia de la combinación de la mezcla QGN con alcoholes de azúcar sobre el nivel de ADNccf.
Se recogieron muestras de 10 ml de sangre completa en BD Vacutainer K2E-EDTA (EDTA 4,45 mM = referencia). A continuación, se añadieron 2 ml de las siguientes soluciones (las concentraciones dadas representan la concentración final en la solución de sangre estabilizada). Cada condición se ensayó con seis tubos y, por lo tanto, seis donantes diferentes.
1: Referencia EDTA (BD Vacutainer K2E);
2: mezcla QGN (DHA 0,01 M, EDTA 14 mM, OPH 1 pM);
3: DHA 0,01 M;
4: DMAA 5%, EDTA 14 mM, OPH 1 pM;
5: DHA 0,01 M, DMAA 3%, OPH 1 pM, EDTA 14 mM;
maltitol 0,01 M;
nositol 0,05 M;
8: OPH 14 mM, DHA 0,01 M, inositol 0,05 M, maltitol 0,01 M.
Las muestras se procesaron como se describe en el ejemplo 11. Sin embargo, las muestras no se almacenaron a temperatura ambiente, sino a 37 °C. Los resultados se muestran en la figura 15. Como puede verse, se consiguieron niveles estables de ADNccf, especialmente cuando se añadió DMAA al 5% en combinación con EDTA 14 mM y OPH 1 pM. Por lo tanto, inesperadamente, se pudo lograr una muy buena estabilización de ADNccf en sangre completa incluso a temperaturas elevadas (37 °C).
Ejemplo 13: Incubación a 37 °C - análisis de muestras de donantes individuales.
Muestras de sangre completa de seis donantes diferentes se recogieron en BD Vacutainers K2E, y luego se añadieron 2 ml de las siguientes soluciones de estabilización por 10 ml de sangre completa (las concentraciones dadas representan la concentración final en solución sanguínea estabilizada):
1: OPH 2 pM, EDTA 14 mM, DMAA al 5%;
2: OPH 1 pM, EDTA 14 mM, DMAA 3%;
3: OPH 1 pM, EDTA 14 mM, DHA 0,01 M, DMAA 3%.
Las muestras se incubaron a 37 °C durante un tiempo de hasta seis días. De otra forma, se siguió el mismo procedimiento que en el ejemplo 8. Los resultados se muestran en las figuras 16 y 17. Como puede observarse, para los seis donantes, el nivel de ADNccf fue preservado cuando se añadieron a las muestras de sangre diferentes concentraciones de DMAA en combinación con OPH y EDTA. Por lo tanto, se puede lograr una estabilización eficaz con el método descrito en la presente invención.
Ejemplo 14: Límite de detección (LoD).
Los ácidos nucleicos extracelulares suelen estar comprendidos en cantidades muy pequeñas en la muestra. Por lo tanto, es importante tener un procedimiento de estabilización que no solo preserve eficientemente los ácidos nucleicos extracelulares dentro de la muestra estabilizada, sino que además permita aislar posteriormente los ácidos nucleicos extracelulares con alto rendimiento de la muestra estabilizada. El ejemplo 14 demuestra que el método de estabilización descrito en la presente memoria es superior a los métodos de estabilización de la técnica anterior, por cuanto los ácidos nucleicos extracelulares se pueden aislar con mayor rendimiento de las muestras estabilizadas. Esto reduce ventajosamente el límite de detección y, por tanto, permite determinar de forma fiable también ácidos nucleicos diana raros dentro de la población de ácidos nucleicos extracelulares.
Se compararon las siguientes soluciones/tubos de estabilización:
1. El ARN libre de células BCT (Streck Inc, cat. n°: 218976 - comprende un agente de liberación de formaldehído como estabilizante).
2. BD Vacutainer K2E (BD, cat. n°: 367525 - comprende EDTA) = referencia.
3. Estabilización de QGN (DMAA al 5%, EDTA 14 mM, OPH 2 pM (inhibidor de la caspasa)).
Se recogieron muestras de sangre completa en tubos BCT y BD Vacutainer K2E de ARN libre de células. A la mitad de la sangre recogida en tubos BD, se añadió solución de estabilización QGN. Por lo tanto, la muestra estabilizada según la invención comprende una cantidad adicional de EDTA que es aportada por la estabilización Vacutainer BD. Las muestras se centrifugaron a 3.000 rpm durante 10 minutos, y el plasma obtenido se distribuyó en partes alícuotas a 1,5 ml de replicados. Posteriormente, se añadieron las siguientes cantidades de control de ADN “spike-in” (1.000 pb) por muestra: 1.000 copias, 5.000 copias, 100 copias, 50 copias y 10 copias.
Se prepararon 8 replicados de 500 a 10 copias/muestra, 4 réplicas de 1.000 copias/muestra y 5 copias/muestra. Las muestras se incubaron durante 3 días a temperatura ambiente. La preparación de la muestra se realizó en el sistema automatizado QIAsymphony SP, usando la aplicación QIAsymphony virus/bacteria Cell-free 1000, que permite aislar los ácidos nucleicos extracelulares de las muestras de plasma. Los ácidos nucleicos se eluyeron en 60 pl; la PCR subsiguiente se realizó por triplicado.
Los resultados se muestran en la figura 18. Como puede verse, se obtuvo un 100% de aciertos > 1.000 copias por muestra cuando se usaron los tubos de EDTA de BD, o bien la solución de estabilización según la presente invención. Esto indica que el aislamiento de ácidos nucleicos no se altera cuando se utiliza la solución de estabilización según la presente invención. En cambio, la estabilización que se basa en el uso de un agente de liberación de formaldehído (Streck) muestra una fuerte inhibición del aislamiento del ácido nucleico. Como puede verse, se pudieron aislar significativamente menos ácidos nucleicos de las muestras respectivas, incluso con aquellas muestras en donde se agregaron 500 o incluso 1.000 copias. Además, la figura 18 muestra que la mejor sensibilidad se obtuvo con una muestra estabilizada según la presente invención. Incluso para aquellas realizaciones en donde solo se agregaron 10 copias por muestra, todavía se obtuvieron 13% de aciertos de PCR positivos. Por lo tanto, el método descrito en la presente memoria no solo estabiliza eficazmente las muestras tales como las muestras de sangre, sino que además permite la recuperación posterior de ácidos nucleicos extracelulares incluso muy poco abundantes. Esta es una ventaja importante porque hace que este método sea particularmente adecuado para aplicaciones de diagnóstico y p. ej. la detección de ácidos nucleicos extracelulares diana raros tales como, p. ej., ácidos nucleicos extracelulares derivados de tumores o ácidos nucleicos fetales. En particular, en los números de copias inferiores, la solución de estabilización que se basa en el uso de agentes de liberación de formaldehído tuvo un rendimiento muy bajo y mostró el límite de detección más alto.
Esto también se confirma en la siguiente tabla:
Como puede verse en dicha tabla, para el fragmento de 1.000 pb son comparables los resultados obtenidos con la muestra de EDTA y la solución de estabilización de la presente invención. Por lo tanto, la estabilización según la invención no perjudica el posterior aislamiento de los ácidos nucleicos. La estabilización que usó un agente de liberación de formaldehído mostró el límite más alto de detección y, por lo tanto, demuestra que el posterior aislamiento del ácido nucleico se vio fuertemente alterado. Por consiguiente, la estabilización según la presente invención es adecuada para la detección sensible de dianas de ADNccf raras, lo que no se logra utilizando los métodos del estado actual de la técnica.
Esto también se confirma por los resultados mostrados en las figuras 19 y 20. Como puede observarse, se obtienen rendimientos de ADNccf comparables para muestras estabilizadas con EDTA y muestras estabilizadas usando el método según la presente invención (medido por 18S rDNA qPCR). Sin embargo, se obtuvieron rendimientos de ADNccf reducidos para la estabilización, lo que implica el uso de liberadores de formaldehído (tubos Streck). El rendimiento de las muestras estabilizadas con formaldehído se redujo en aproximadamente un 50% en comparación con las muestras estabilizadas con EDTA. En cambio, el reactivo de estabilización según la presente invención no tiene efectos adversos sobre el rendimiento de ADNccf, cuando se usan métodos convencionales de aislamiento de ácidos nucleicos. Esto es una ventaja importante ya que permite integrar el método de estabilización según la presente invención en procedimientos de aislamiento de ácidos nucleicos y flujos de trabajo existentes.
Ejemplo 15:Spike-inde VIH 104 UI/ml, VHC a muestras de sangre completa de 3 donantes.
Se recogieron muestras de sangre completa en tubos Vacutainer 2KE de BD. Después se añadieron 2 ml de la solución de estabilización que sigue (las concentraciones dadas representan la concentración final en solución de sangre estabilizada). Luego, se añadieron VIH y VHC a las muestras de sangre completa a 104 UI/ml.
1: DMAA 5%, 50 mg EDTA, OPH 1 pM, Inositol 0,05 M;
2: DMAA 5%, 50 mg EDTA, OPH 1 pM, maltitol 0,01 M;
3: DMAA 5%, 50 mg de EDTA, OPH 1 pM, inositol 0,05 M; maltitol 0,01 M;
4: 2% de inositol, 4% de sorbitol.
Se usaron de nuevo muestras estabilizadas con BD Vacutainer K2E como referencia.
Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante un tiempo de hasta seis días a 37 °C. El día 0 y el día 3, los replicados se procesaron de la siguiente manera: las muestras se centrifugaron a 3.000 rpm, durante 15 minutos a temperatura ambiente para recoger el plasma. El plasma obtenido se centrifugó de nuevo a 16.000 x g durante 10 minutos, a 4 °C. Los ácidos nucleicos extracelulares obtenidos del sobrenadante de plasma aclarado se purificaron usando el protocolo QIAsymphony virus/bacteria Cell-free 1000. Se usó 1 ml de plasma como material de entrada, se utilizó un volumen de 60 |jl para elución. Los resultados se muestran en la figura 21. Como puede verse, la combinación de DMAA, EDTA y OPH con alcoholes de azúcar permite estabilizar los niveles de ácidos nucleicos virales durante un tiempo de hasta tres días a 37 °C. Por lo tanto, el método según la presente invención es particularmente adecuado para aplicaciones de diagnóstico y también es adecuado para estabilizar las muestras en entornos en donde posiblemente no se dispone de equipos de refrigeración. ACt entre el día 0 y el día 3 se reduce (ACt de aproximadamente 2,5 a ACt de aproximadamente 1) en comparación con la referencia de sangre con EDTA. Además, se observaron efectos de estabilización con una combinación de sorbitol en combinación con inositol (ACt de aproximadamente 1 a 1,4).
La figura 22 muestra la disminución del VHC en sangre completa que se incubó a 37°C. De nuevo, se muestra que cuando se combinan DMAA, EDTA y OPH con alcoholes de azúcar, el nivel de ácido nucleico del VHC se estabiliza, lo que se indica por una disminución lenta en los niveles de ARN viral, durante tres días a 37 °C. El ACt entre el día 0 y el día 3 se reduce (ACt de aproximadamente 1) en comparación con la referencia de sangre con EDTA (ACt de aproximadamente 2 - 3). Además, se consiguieron buenos efectos estabilizadores para el sorbitol en combinación con inositol.
Ejemplo 16: Estabilización con N,N dimetilpropanamida e inhibidor de la caspasa.
Se recogió sangre de dos donantes diferentes en tubos K2 EDTA de 10 ml (BD). Se mezclaron 4,5 ml de la sangre recogida respectivamente con 0,9 ml de solución de estabilización que contiene (por ml de solución de estabilización): 34,2 mg de EDTA K2, 1,2 ml de solución de quinoleína-Val-Asp-CH2-OPH (inhibidor de la caspasa) (1 mg disuelto en 388 j l de DMSO) y 0,15 g, 0,3 g o 0,45 g de N,N dimetilpropanamida o 0,3 ml de DMAA, respectivamente. Por tanto, se obtuvo la concentración final en la sangre/mezcla de estabilización que es como sigue: 5,7 mg de K2EDTA, quinoleína-Val-Asp-CH2-OPH 1 jM (inhibidor de la caspasa) y 2,5, 5 o 7,5% (p/v) de N,N-dimetilpropanamida o 5% (v/v) de DMAA, respectivamente.
Todas las muestras de sangre estabilizadas se prepararon por triplicado por condición y tiempo de la prueba. En el momento de tiempo 0 (referencia), inmediatamente después de mezclar la solución de estabilización y la sangre, se generó plasma y se extrajo el ADNccf. La muestra de sangre residual se almacenó durante tres días y seis días a temperatura ambiente. Como control, la muestra de sangre estabilizada con EDTA también se almacenó durante 3 y 6 días. El plasma se generó a partir de las muestras de sangre estabilizadas y no estabilizadas (EDTA) invirtiendo cuatro veces los tubos que contenían sangre. Después, los tubos se centrifugaron durante 15 minutos a 3.000 rpm / 1912 x g. Se transfirieron 2,5 ml de la fracción de plasma a un tubo Falcon nuevo de 15 ml y se centrifugó durante 10 minutos a 16.000 x g. Se usaron 2 ml del plasma aclarado respectivamente para aislar el ácido nucleico extracelular usando el kit de ácido nucleico circulante QlAamp.
Los resultados se muestran en las figuras 23 y 24. Se muestra el aumento de ADN en relación con el instante 0 con 2,5%, 5% y 7,5% de N,N-dimetilpropanamida o 5% de DMAA (cambio de pliegue) usando diferentes longitudes de amplicón del gen 18SrRNA. Las barras indican la media de las muestras triplicadas por condición y momento del ensayo. Todas las soluciones según la presente invención muestran cantidades significativamente más bajas de ADN liberado después del almacenamiento durante 3 y 6 días a temperatura ambiente, en comparación con la sangre EDTA no estabilizada.
Claims (15)
- REIVINDICACIONES 1. Un recipiente para recoger una muestra biológica que contenga células, preferiblemente una muestra de sangre, en donde el recipiente comprende una composición adecuada para estabilizar una muestra biológica que contenga células, comprendiendo la composición: a) al menos un compuesto según la fórmula 1,fórmula 1 en donde R1 es un residuo de alquilo C2, R2 y R3 son restos de hidrocarburo iguales o diferentes con una longitud de la cadena de carbono de 1 - 20 átomos dispuesta de forma lineal o ramificada, y R4 es un resto de oxígeno, y en donde dicho compuesto según la fórmula 1 es una N,N-dialquilpropanamida; y que comprende al menos otro compuesto seleccionado entre b) y c), en donde b) es al menos un inhibidor de caspasas; y c) es al menos un anticoagulante, preferiblemente un agente quelante.
- 2. El recipiente según la reivindicación 1, que comprende N,N-dialquilpropanamida y al menos un anticoagulante.
- 3. El recipiente según las reivindicación 2, en donde la N,N-dialquilpropanamida es N,N-dimetilpropanamida y el anticoagulante es un agente quelante.
- 4. El recipiente según las reivindicaciones 1 o 2, en donde al menos un compuesto según la fórmula 1 es N,N-dimetilpropanamida.
- 5. El recipiente según una o más de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende al menos un inhibidor de caspasas preferiblemente un inhibidor de la pancaspasa.
- 6. El recipiente según una o más de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la composición tienen una o más de las siguientes características: a) es capaz de reducir la liberación de ADN genómico de las células contenidas en la muestra a la porción libre de células de la muestra; b) es capaz de reducir la degradación de los ácidos nucleicos, en particular del ADN genómico, presentes en la muestra; c) no favorece la lisis y/o disrupción de las células contenidas en la muestra; d) no comprende reactivos de reticulación que provoquen enlaces covalentes inter o intramoleculares entre moléculas de ácido nucleico o entre ácidos nucleicos y proteínas; e) no contiene formaldehído ni liberadores de formaldehído; f) estabiliza las células comprendidas en la muestra biológica que contiene células; g) es capaz de reducir la dilución de la población de ácidos nucleicos extracelulares comprendidos en la muestra por ácidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genómico fragmentado, procedentes de células dañadas o moribundas que están contenidas en la muestra; h) se suministra en forma sólida o líquida; i) es capaz de estabilizar la población de ácido nucleico extracelular comprendida en la muestra; y/o j) es capaz de estabilizar la población de ácido nucleico extracelular contenida en dicha muestra a temperatura ambiente durante al menos 3 días, preferiblemente al menos 6 días.
- 7. El recipiente según una o más de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende la composición estabilizante mezclada con una muestra biológica que contiene células y en donde dicha muestra tiene una o más de las siguientes características: a) comprende ácidos nucleicos extracelulares b) se selecciona del grupo constituido por sangre total, plasma, suero, líquido linfático, orina, licor, líquido cefalorraquídeo, ascitis, leche, heces, lavado bronquial, saliva, líquido amniótico, semen/líquido seminal, hisopos/ frotis, fluidos corporales, secreciones corporales, secreciones nasales, secreciones vaginales, secreciones y excreciones de heridas y sobrenadantes de cultivos celulares; c) es un fluido corporal d) se selecciona entre sangre total, plasma y/o suero; y/o e) es sangre total; en donde preferiblemente, la relación volumétrica entre la composición estabilizante y el volumen especificado de la muestra se selecciona entre 10:1 y 1:20, 5:1 y 1:15, 1:1 y 1:10 y 1:2 y 1:5.
- 8. El recipiente según una o más de las reivindicaciones 1 a 7, en donde cuando la composición estabilizante se mezcla con una muestra biológica que contiene células, preferiblemente sangre, plasma o suero, la mezcla resultante tiene una o más de las características siguientes: a) comprende el inhibidor de la caspasa en una concentración seleccionada entre al menos 0,01 mM, al menos 0,05mM, al menos 0,1mM, al menos 0,5 mM, al menos 1 mM, al menos 2,5mM o al menos 3,5mM; b) comprende el inhibidor de caspasa en un intervalo de concentración seleccionado entre 0,01 mM y 100mM, 0,05mM y 100mM, 0,1mM a 50mM, 1mM a 40mM, 1mM a 30mM o 2,5mM a 25 mM; c) comprende el compuesto según la fórmula 1 en una concentración de al menos 0,1%, al menos 0,5%, al menos 1%, al menos 0,75%, al menos 1%, al menos 1,25% o al menos 1,5%; d) comprende el compuesto según la fórmula 1 en un intervalo de concentración seleccionado entre 0,1% y 50%, 0,5% a 25%, 0,75% a 20%, 1% a 15% o 1% a 10%; y/o e) comprende el anticoagulante, preferiblemente un agente quelante, en un intervalo de concentración seleccionado de 0,05mM a 100mM, 0,05mM a 50mM, 0,1 mM a 30mM, 1mM a 20mM o 2mM a 15mM.
- 9. El recipiente según una o más de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la composición estabilizadora está comprendida en el contenedor en una cantidad eficaz para proporcionar la estabilización de la cantidad de muestra a recoger en dicho contenedor, en donde preferiblemente la composición estabilizante es líquida y se pone en contacto con la muestra biológica que contiene células en una relación volumétrica seleccionada entre 10:1 y 1:20, 5:1 y 1:15, 1:1 y 1:10 y 1:2 y 1:5.
- 10. El recipiente según una o más de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el recipiente está evacuado.
- 11. El recipiente según una o varias reivindicaciones 1 a 10, en donde el recipiente está prellenado con una cantidad definida de la composición estabilizante, ya sea en forma sólida o líquida, y está provisto de un vacío definido y sellado con un tabique
- 12. El recipiente según una o más de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el recipiente tiene una parte superior abierta, un fondo y un una pared lateral que se extiende entre ambas y define una cámara, en donde la composición estabilizadora se encuentra en la cámara.
- 13. El recipiente según la reivindicación 12, en donde el recipiente es un tubo, el fondo es un fondo cerrado, el recipiente comprende además un cierre en la parte superior abierta, y la cámara está a una presión reducida, preferiblemente en donde el cierre puede perforarse con una aguja o cánula, y la presión reducida se selecciona para extraer un volumen especificado de una muestra líquida a la cámara.
- 14. El recipiente según la reivindicación 13, en donde la cámara está a una presión reducida seleccionada para atraer un volumen especificado de una muestra líquida a la cámara, y la composición estabilizante es un líquido y está dispuesta en la cámara de tal manera que la relación volumétrica de la composición estabilizante con respecto al volumen especificado de la muestra que contiene células se selecciona entre 10:1 y 1:20, 5:1 y 1:15, 1:1 y 1:10 y 1:2 y 1:5.
- 15. El recipiente según una o más de las reivindicaciones 1 a 14, en donde: a) el recipiente comprende un anticoagulante además del compuesto según la fórmula 1, preferiblemente en donde el anticoagulante es un agente quelante, opcionalmente EDTA; b) el recipiente se utiliza para extraer sangre de un paciente; y/o c) la muestra biológica que contiene células es una muestra de sangre.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161539245P | 2011-09-26 | 2011-09-26 | |
| EP11182819 | 2011-09-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2971646T3 true ES2971646T3 (es) | 2024-06-06 |
Family
ID=47994307
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES18177073T Active ES2971646T3 (es) | 2011-09-26 | 2012-09-25 | Estabilización y aislamiento de ácidos nucleicos extracelulares |
| ES12762295.9T Active ES2687126T3 (es) | 2011-09-26 | 2012-09-25 | Estabilización y aislamiento de ácidos nucleicos extracelulares |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES12762295.9T Active ES2687126T3 (es) | 2011-09-26 | 2012-09-25 | Estabilización y aislamiento de ácidos nucleicos extracelulares |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20140227688A1 (es) |
| EP (2) | EP2761020B1 (es) |
| JP (1) | JP6329072B2 (es) |
| CN (1) | CN103827322B (es) |
| AU (1) | AU2012314514B2 (es) |
| ES (2) | ES2971646T3 (es) |
| WO (1) | WO2013045457A1 (es) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MX347611B (es) | 2011-06-19 | 2017-05-04 | Abogen Inc | Dispositivos, soluciones y metodos para recoleccion de muestras. |
| US11021733B2 (en) | 2011-09-26 | 2021-06-01 | Qiagen Gmbh | Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids |
| ES2693672T3 (es) | 2011-09-26 | 2018-12-13 | Qiagen Gmbh | Método rápido para aislar ácidos nucleicos extracelulares |
| ES2574956T3 (es) | 2011-09-26 | 2016-06-23 | Preanalytix Gmbh | Estabilización y aislamiento de ácidos nucleicos extracelulares |
| CA2884915C (en) | 2012-09-25 | 2022-05-17 | Qiagen Gmbh | Stabilisation of biological samples |
| US10144952B2 (en) | 2013-03-18 | 2018-12-04 | Qiagen Gmbh | Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids |
| CN105283550A (zh) * | 2013-03-18 | 2016-01-27 | 凯杰有限公司 | 生物样品的稳定化 |
| JP6664332B2 (ja) * | 2014-03-18 | 2020-03-13 | キアゲン ゲーエムベーハー | 細胞外核酸の安定化および単離 |
| WO2016045022A1 (zh) * | 2014-09-25 | 2016-03-31 | 深圳华大基因科技有限公司 | 用于孕妇外周血样的保存液和孕妇外周血样的保存方法 |
| EP3250714A2 (en) * | 2015-01-30 | 2017-12-06 | RGA International Corporation | Devices and methods for diagnostics based on analysis of nucleic acids |
| EP3256849A4 (en) * | 2015-02-09 | 2018-12-05 | Abogen, Inc. | Devices, solutions and methods for sample collection related applications, analysis and diagnosis |
| WO2016133913A1 (en) * | 2015-02-16 | 2016-08-25 | Seed Research And Development Llc | Fluorescently labeled molecules containing modified tryptophan |
| EP3885438A1 (en) | 2015-06-10 | 2021-09-29 | QIAGEN GmbH | Method for isolating extracellular nucleic acids using anion exchange particles |
| CN108291250B (zh) | 2015-11-20 | 2022-05-27 | 凯杰有限公司 | 用于稳定细胞外核酸的已灭菌组合物的制备方法 |
| CN106932495B (zh) * | 2015-12-29 | 2021-05-28 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 分析氟甲基酮及其有关物质的液相色谱法、流动相和套装 |
| JP2019507588A (ja) * | 2016-01-08 | 2019-03-22 | パスクエスト | 無細胞体液中の核酸消化酵素に対する宿主核酸の到達性の調整 |
| EP3464588B1 (en) | 2016-05-27 | 2022-07-27 | Norgen Biotek Corporation | Preservation of cell-free nucleic acids in biological samples |
| EP3358020B1 (en) | 2017-01-05 | 2021-05-19 | Biodesix, Inc. | Diagnostic test system for specific, sensitive and reproducible detection of circulating nucleic acids in whole blood |
| WO2018222709A2 (en) | 2017-06-01 | 2018-12-06 | Nantomics, Llc | Dna stabilization of rna |
| US20220090998A1 (en) | 2019-01-04 | 2022-03-24 | Qiagen Gmbh | Urine stabilization |
| WO2020264313A1 (en) * | 2019-06-28 | 2020-12-30 | Zymo Research Corporation | Compositions for the stabilization of cell-free nucleic acids and methods thereof |
| WO2021058692A1 (en) | 2019-09-24 | 2021-04-01 | Qiagen Gmbh | Multimodal analysis of stabilized cell-containing bodily fluid samples |
Family Cites Families (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9215002D0 (en) * | 1992-07-15 | 1992-08-26 | Univ Singapore | Method of fixing biological tissue |
| EP0929694A4 (en) | 1996-03-15 | 2002-05-02 | Penn State Res Found | DETECTION OF TUMOR-RELATED EXTRACELLULAR NUCLEIC ACID USING PLASMA OR BLOOD SERUM USING NUCLEIC ACID AMPLIFICATION TESTS |
| CA2250118C (en) | 1996-03-26 | 2009-09-29 | Michael S. Kopreski | Method enabling use of extracellular rna extracted from plasma or serum to detect, monitor or evaluate cancer |
| WO1998041651A1 (en) * | 1997-03-18 | 1998-09-24 | Hsc Research & Development Limited Partnership | Method for preparing chromatin |
| DE19726362A1 (de) | 1997-06-21 | 1998-12-24 | Schaeffler Waelzlager Ohg | Vorrichtung zum Verändern der Steuerzeiten von Gaswechselventilen einer Brennkraftmaschine |
| DE19836559A1 (de) | 1998-08-12 | 2000-03-23 | Antigen Gmbh | Gefäß zur Entnahme von Blut |
| US6379930B1 (en) * | 1999-07-30 | 2002-04-30 | Applied Gene Technologies, Inc. | Stabilization of nucleic acid amplification cocktails |
| DE10006662A1 (de) * | 2000-02-15 | 2001-08-23 | Antigen Produktions Gmbh | Gefäß zur Nukleinsäureanalytik |
| US6977162B2 (en) | 2002-03-01 | 2005-12-20 | Ravgen, Inc. | Rapid analysis of variations in a genome |
| US20040043505A1 (en) | 2002-05-07 | 2004-03-04 | Matthew Walenciak | Collection assembly |
| US7442506B2 (en) | 2002-05-08 | 2008-10-28 | Ravgen, Inc. | Methods for detection of genetic disorders |
| WO2004032750A1 (en) * | 2002-10-10 | 2004-04-22 | Becton Dickinson And Company | Sample collection system with caspase inhibitor |
| US7601491B2 (en) * | 2003-02-06 | 2009-10-13 | Becton, Dickinson And Company | Pretreatment method for extraction of nucleic acid from biological samples and kits therefor |
| US7250270B2 (en) * | 2003-06-13 | 2007-07-31 | Ambion, Inc. | Methods and compositions for preparing tissue samples for RNA extraction |
| US20080176209A1 (en) * | 2004-04-08 | 2008-07-24 | Biomatrica, Inc. | Integration of sample storage and sample management for life science |
| EP1804045B1 (de) * | 2005-12-30 | 2014-03-12 | QIAGEN GmbH | Ein Verfahren und ein Kit zur Behandlung einer biologischen Probe |
| DE102007025277A1 (de) * | 2007-05-31 | 2008-12-04 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur Stabilisierung einer biologischen Probe |
| EP2027922A1 (de) * | 2007-08-02 | 2009-02-25 | Qiagen GmbH | Verfahren und Vorrichtung für das Fixieren/Stabilisieren einer Probe |
| US20100285468A1 (en) * | 2007-09-24 | 2010-11-11 | Allelogic Biosciences Corporation | Detection and/or quantification of nucleic acids |
| WO2010065420A2 (en) * | 2008-12-03 | 2010-06-10 | Integrated Nano-Technologies, Inc. | Universal biological sample processing |
| US11634747B2 (en) * | 2009-01-21 | 2023-04-25 | Streck Llc | Preservation of fetal nucleic acids in maternal plasma |
| ES2649572T3 (es) * | 2009-02-18 | 2018-01-12 | Streck Inc. | Conservación de ácidos nucleicos fuera de las células |
| US20100280233A1 (en) * | 2009-05-04 | 2010-11-04 | Connolly Dennis M | Method for sample preparation |
| JP2013509883A (ja) * | 2009-11-06 | 2013-03-21 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | 臓器移植患者における移植片拒絶反応の非侵襲的診断方法 |
| WO2011057184A1 (en) * | 2009-11-09 | 2011-05-12 | Streck, Inc. | Stabilization of rna in and extracting from intact cells within a blood sample |
| EP2560629B1 (en) * | 2010-04-23 | 2020-06-03 | Massachusetts Eye & Ear Infirmary | Methods and compositions for preserving photoreceptor and retinal pigment epithelial cells |
| WO2012018639A2 (en) * | 2010-07-26 | 2012-02-09 | Biomatrica, Inc. | Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures |
| US20140024598A1 (en) * | 2010-11-01 | 2014-01-23 | Demetrios Vavvas | Methods and compositions for preserving retinal ganglion cells |
-
2012
- 2012-09-25 ES ES18177073T patent/ES2971646T3/es active Active
- 2012-09-25 JP JP2014532356A patent/JP6329072B2/ja active Active
- 2012-09-25 EP EP12762295.9A patent/EP2761020B1/en active Active
- 2012-09-25 ES ES12762295.9T patent/ES2687126T3/es active Active
- 2012-09-25 AU AU2012314514A patent/AU2012314514B2/en active Active
- 2012-09-25 CN CN201280046947.5A patent/CN103827322B/zh active Active
- 2012-09-25 WO PCT/EP2012/068892 patent/WO2013045457A1/en active Application Filing
- 2012-09-25 US US14/347,051 patent/US20140227688A1/en not_active Abandoned
- 2012-09-25 EP EP18177073.6A patent/EP3401406B1/en active Active
-
2021
- 2021-04-29 US US17/244,268 patent/US20220017944A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2012314514A1 (en) | 2014-02-27 |
| EP3401406A1 (en) | 2018-11-14 |
| WO2013045457A1 (en) | 2013-04-04 |
| US20220017944A1 (en) | 2022-01-20 |
| JP6329072B2 (ja) | 2018-05-23 |
| CN103827322A (zh) | 2014-05-28 |
| EP2761020B1 (en) | 2018-06-13 |
| CN103827322B (zh) | 2017-05-31 |
| ES2687126T3 (es) | 2018-10-23 |
| EP3401406B1 (en) | 2023-11-29 |
| JP2014531902A (ja) | 2014-12-04 |
| AU2012314514B2 (en) | 2018-03-15 |
| US20140227688A1 (en) | 2014-08-14 |
| EP2761020A1 (en) | 2014-08-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2971646T3 (es) | Estabilización y aislamiento de ácidos nucleicos extracelulares | |
| CN103827303B (zh) | 细胞外核酸的稳定化和分离 | |
| AU2019200643B2 (en) | Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids | |
| CN105164258B (zh) | 细胞外核酸的稳定化和分离 | |
| JP6750178B2 (ja) | 生物試料の安定化 | |
| JP6608280B2 (ja) | 生物学的試料の安定化 | |
| US20220090998A1 (en) | Urine stabilization | |
| US11021733B2 (en) | Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids | |
| JP2019136044A (ja) | 細胞外核酸の安定化および単離 |