ES2967613T3 - Inmunoglobulinas conjugadas en Cys80 - Google Patents

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Luigi Grasso
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James Kline
Earl Albone
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Abstract

En el presente documento se proporcionan métodos para generar inmunoglobulinas conjugadas, comprendiendo el método: descapitar una cisteína en la posición del aminoácido 80 ("Cys80") en una región variable de cadena ligera de una inmunoglobulina, en donde la inmunoglobulina comprende una región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera región; y conjugar un compuesto reactivo con tiol con Cys80, en el que el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol. También se proporcionan moléculas de unión a antígeno y métodos para generar las mismas, inmunoglobulinas así como moléculas de ácido nucleico que codifican las inmunoglobulinas y células huésped que comprenden las moléculas de ácido nucleico, inmunoglobulinas conjugadas y regiones variables de cadena ligera para uso en una inmunoglobulina conjugada. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Inmunoglobulinas conjugadas en Cys80
LISTADO DE SECUENCIAS
La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias que ha sido presentado electrónicamente en formato ASCII y se incorpora con ello como referencia en su totalidad. La copia ASCII, creada el 16 de junio de 2016, se denomina 104018.000953_SL.txt y tiene un tamaño de 379.441 bytes.
CAMPO TÉCNICO
En esta memoria se proporcionan inmunoglobulinas conjugadas en Cys80 y métodos para crearlas.
ANTECEDENTES
La utilidad de anticuerpos monoclonales se extiende desde la investigación básica hasta las aplicaciones terapéuticas y diagnósticas. La capacidad de conjugar anticuerpos con agentes funcionales amplía adicionalmente su funcionalidad. La fabricación de anticuerpos conjugados implica habitualmente la conjugación de un enlazador, fármaco u otro agente funcional con residuos reactivos de lisina o cisteína en las cadenas pesada (HC) y ligera (LC) de un anticuerpo monoclonal (mAb). La conjugación de lisina es mediada típicamente por química basada en succinimida (NHS) o basada en isotiocianato. Dado el número de lisinas expuestas en la superficie de un anticuerpo, los enfoques de conjugación basados en aminas dan como resultado la modificación de múltiples lisinas, aunque no todos los residuos de lisina se modifican en la misma medida. Por lo tanto, el producto final es una mezcla heterogénea de mAbs con una distribución de relaciones fármaco-anticuerpo (DAR, por sus siglas en inglés).
La mayoría de las cisteínas dentro de un anticuerpo están implicadas en enlaces disulfuro entre-cadenas o intracadenas. Por lo tanto, la conjugación con cisteínas requiere al menos una reducción parcial del anticuerpo. Al igual que la conjugación basada en lisina, la conjugación basada en cisteína da como resultado una mezcla heterogénea de anticuerpos conjugados que difieren en la carga del fármaco y el sitio de conjugación. Cada especie de anticuerpo conjugado puede tener propiedades distintas, lo cual, a su vez, podría dar lugar a una amplia variación de las propiedades farmacocinéticasin vivo.Además, una heterogeneidad de este tipo puede presentar desafíos en la fabricación del anticuerpo conjugado.
El documento WO 2008/136694 A1 describe "métodos para detectar y producir polipéptidos que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno, los cuales: los polipéptidos comprenden dominios de unión que se derivan de inmunoglobulina de conejo. Utilizando armazones de la cadena pesada o ligera de anticuerpo de conejo, los métodos... permiten la identificación de nuevos bucles CDR y regiones marco que confieren estabilidad y/o afinidad potenciadas a dominios variables de inmunoglobulina aislados, en particular, en relación con los derivados de anticuerpos de roedores".
El documento WO 2011/156328 A1 describe "anticuerpos modificados por ingeniería genética con cisteína que comprenden un aminoácido cisteína libre en la cadena pesada o en la cadena ligera".
El documento WO 2008/144757 A1 describe "métodos para humanizar regiones variables pesadas y ligeras de conejo". Las cadenas pesada y ligera de conejo humanizadas resultantes y los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que contienen son muy adecuados para su uso en inmunoterapia e inmunodiagnóstico, ya que conservan la afinidad de unión al antígeno del anticuerpo parental y, basándose en su muy alto nivel de identidad de secuencia con las secuencias de anticuerpos humanos, deberían ser esencialmente no inmunógenos en seres humanos".
El documento WO 2005/016950 A1 describe "un método para humanizar un anticuerpo monoclonal de conejo".
El documento WO 2014/031476 A1 describe "el uso de tecnología de hibridoma de conejo, junto con un panel de fragmentos de dominio de mesotelina truncados, para identificar mAbs anti-mesotelina que se unen a regiones específicas de mesotelina".
El documento WO 2006/017759 describe "anticuerpos que se unen al marcador endotelial tumoral 1 (TEM1)".
Lyon et al. Methods in Enzymology, capítulo 6, vol. 502, 01 -01 -2012, páginas 123-138 describe un método que "puede reducirse para producir cantidades de microgramos de conjugado para la detección temprana, y en un entorno de fabricación puede ampliarse para producir gramos o kilogramos de conjugado para ensayos clínicos y comercialización".
El documento WO 2014/033074 A1 describe "lanzaderas de la barrera hematoencefálica que se unen a receptores en la barrera hematoencefálica (R/BBB) y métodos para utilizarlos".
Popkov et al. Journal of Molecular Biology, vol. 325, n° 2, 10-01-2003, páginas 325-335" evaluó la diversidad de colecciones Fab quiméricas de conejo/ser humano seleccionadas y no seleccionadas que se derivaron de diferentes alotipos de cadena ligera kappa".
SUMARIO
En esta memoria se describen métodos para generar una inmunoglobulina conjugada, comprendiendo los métodos: desencapsular una cisteína en la posición del aminoácido 80 ("Cys80") en una región variable de la cadena ligera de una inmunoglobulina derivada de conejo, en donde la inmunoglobulina comprende una región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera; y conjugar un compuesto reactivo con tiol con Cys80, en donde el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol.
También se describen métodos para generar una molécula de unión a antígeno, comprendiendo los métodos incubar una primera inmunoglobulina conjugada con una segunda inmunoglobulina conjugada para generar la molécula de unión a antígeno, en donde: la primera inmunoglobulina conjugada comprende una primera región variable de la cadena pesada y una primera región variable de la cadena ligera, teniendo la primera región variable de la cadena ligera una cisteína en la posición 80 ("Cys801"), en donde Cys801 está conjugado con un primer compuesto reactivo con tiol que comprende un primer grupo reactivo con tiol; y la segunda inmunoglobulina conjugada comprende una segunda región variable de la cadena pesada y una segunda región variable de la cadena ligera, teniendo la segunda región variable de la cadena ligera una cisteína en la posición 80 ("Cys802") en donde Cys802 está conjugada con un segundo compuesto reactivo con tiol que comprende un segundo grupo reactivo con tiol.
También se describen en esta memoria inmunoglobulinas que comprenden una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, teniendo la región variable de la cadena ligera una cisteína en la posición 80 ("Cys80") y un aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys en la posición 83, al igual que las moléculas de ácido nucleico que codifican las inmunoglobulinas y las células huésped que comprenden las moléculas de ácido nucleico.
Además se describen inmunoglobulinas conjugadas que comprenden las inmunoglobulinas descritas, en donde la cisteína en la posición 80 está conjugada con un compuesto reactivo con tiol, comprendiendo el compuesto reactivo con tiol un grupo reactivo con tiol.
También se describen en esta memoria métodos para tratar el cáncer en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de una inmunoglobulina mesotelina conjugada, en donde la inmunoglobulina de mesotelina conjugada comprende: cualquiera de las inmunoglobulinas de mesotelina descritas, y un compuesto reactivo con tiol que comprende un grupo reactivo con tiol, un enlazador y un agente funcional.
Se describen moléculas de unión a antígeno que comprenden: una primera inmunoglobulina conjugada que comprende una primera región variable de la cadena pesada y una primera región variable de la cadena ligera, teniendo la primera región variable de la cadena ligera una cisteína en la posición 80 ("Cys801"), en donde Cys801 está conjugada con un primer compuesto reactivo con tiol que comprende un primer grupo reactivo con tiol, y una segunda inmunoglobulina conjugada que comprende una segunda región variable de la cadena pesada y una segunda región variable de la cadena ligera, teniendo la segunda región variable de la cadena ligera una cisteína en la posición 80 ("Cys802") en donde Cys802 está conjugada con un segundo compuesto reactivo con tiol que comprende un segundo grupo reactivo con tiol.
También se describen en esta memoria regiones variables de la cadena ligera para uso en una inmunoglobulina conjugada, teniendo la región variable de la cadena ligera una cisteína en la posición de aminoácido 80 ("Cys80") y un residuo de aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys en la posición de aminoácido 83, en donde la Cys80 no está apareada.
Realizaciones de la presente invención se exponen en las reivindicaciones adjuntas. En una realización, la presente invención proporciona un método para generar una inmunoglobulina conjugada, comprendiendo el método:
incubar una inmunoglobulina derivada de conejo con un tampón reductor suave que comprende cisteína, ditiotreitol (DTT) o tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) para desencapsular una cisteína en la posición de aminoácido 80 ("Cys80") en una región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina, la Cys80 basada en el sistema de numeración de Kabat o Chothia, en donde la inmunoglobulina comprende una región variable de la cadena pesada y la región variable de cadena ligera; y
conjugar un compuesto reactivo con tiol con Cys80, en donde el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol.
En otra realización, la presente invención proporciona un método para generar una molécula de unión a antígeno, comprendiendo el método:
incubar una primera inmunoglobulina derivada de conejo con un tampón reductor suave que comprende cisteína, ditiotreitol (DTT) o tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) para desencapsular una Cys801 en una región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina, en donde la inmunoglobulina comprende una primera región variable de la cadena pesada y una primera región variable de la cadena ligera y el Cys801 se basa en el sistema de numeración de Kabat o Chothia;
incubar una segunda inmunoglobulina derivada de conejo con un tampón reductor suave que comprende cisteína, ditiotreitol (DTT) o tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) para desencapsular una Cys802 en una región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina, en donde la inmunoglobulina comprende una segunda región variable de la cadena pesada y una segunda región variable de la cadena ligera y el Cys802 se basa en el sistema de numeración de Kabat o Chothia;
conjugar un primer compuesto reactivo con tiol con la Cys801 desencapsulada para generar una primera inmunoglobulina conjugada y conjugar un segundo compuesto reactivo con tiol con la Cys802 desencapsulada para generar una segunda inmunoglobulina conjugada; e
incubar la primera inmunoglobulina conjugada y la segunda inmunoglobulina conjugada para generar la molécula de unión a antígeno.
En otra realización, la presente invención proporciona una molécula de unión a antígeno producida de acuerdo con un método de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
El sumario, así como la siguiente descripción detallada, se entienden mejor cuando se leen junto con los dibujos adjuntos. Con el fin de ilustrar los métodos descritos, en los dibujos se muestran realizaciones ejemplares de inmunoglobulinas conjugadas, moléculas de unión a antígeno, inmunoglobulinas y regiones variables de la cadena ligera; sin embargo, los métodos, las inmunoglobulinas conjugadas, las moléculas de unión a antígeno, las inmunoglobulinas y las regiones variables de la cadena ligera no se limitan a las realizaciones específicas descritas. En los dibujos:
FIG. 1representa un alineamiento de secuencias de las cadenas ligeras de conejo y humana.(A)Alineamiento de las secuencias Vkde la línea germinal de conejo (IGKV1S2, X02336) y humana (IGKV1-5, Z00001). El residuo en negrita indicen Cys80 (de acuerdo con la numeración de Kabat o Chothia) en la secuencia de conejo.(B)Alineamiento de las secuencias Ckde la línea germinal de conejo (IGKC1, K01360) y humana (IGKC, J00241). El residuo en negrita indica Cys171 (numeración de EU) en la secuencia de conejo.
FIG. 2representa modelos estructurales de(A)mAb de conejo, que muestra el enlace disulfuro Cys80-Cys171,(B)mAb humano y(C)mAb quimérico de conejo-ser humano que muestra la Cys80 no apareada.
FIG. 3ilustra un alineamiento de familias Vx de línea germinal de conejo. El residuo en la posición 80 está indicado por la flecha.
FIG. 4ilustra un análisis de espectrometría de masas ejemplar de la cadena ligera xi155D5 cuando(A)se redujo utilizando condiciones duras (DTT 20 mM, 60 °C, 5 minutos) y(B)se redujo utilizando condiciones suaves (DTT 100 pM, 22 °C, 30 minutos).
FIG. 5ilustra un análisis SE-HPLC ejemplar de la estabilidad de xi155D5.(A)Estabilidad de x1155D5 almacenado a -80 °C.(B)Estabilidad de xi155D5 almacenado a 37 °C durante 1 semana. Solo se observó un muy ligero aumento en la formación de agregados o productos de degradación. Eje Y, mAU; eje x, tiempo de retención (minutos).
FIG. 6representa un experimento de desencapsulación ejemplar que muestra que la cisteína que recubre Cys80 se puede eliminar mediante condiciones reductoras suaves (tampón que contiene cisteína 5 mM durante 16 horas, seguido de lavado con un tampón que contiene Tris libre de cisteína durante 60 horas; todas las incubaciones se llevaron a cabo a 4 °C). La masa de x1155D5 antes(A)y después(B)de la desencapsulación fue de 145.464 y 145.221 Da, respectivamente. La diferencia (243 Da) corresponde aproximadamente a dos cisteínas libres.
FIG. 7representa un experimento de conjugación ejemplar que muestra que una Cys80 no encapsulada se puede conjugar en maleimida-PEG2-biotina.(A)La cadena ligera de xi155D5 reducida (masa predicha de 23.399 Da) tenía una masa de 23.384 Da, y(B)después de la incubación con maleimida-PEG2-biotina, el 94 % del producto mostró un aumento de masa de 526 Da (23.910 Da). Los asteriscos indican picos de cadenas no ligeras.
FIG. 8representa secuencias Vky VH de 155D5 de conejo alineadas con los dominios variables de la línea germinal humana más homólogos. La región marco (FWR) y la región determinante de la complementariedad (CDR) basadas en la numeración de Kabat se identifican encima de las secuencias. Las CDRs basadas en la numeración de Chothia están subrayadas. La mitad C-terminal de CDR2 de Kabat no se considera una CDR de acuerdo con la numeración de Chothia y está en cursiva.
FIG. 9ilustra una purificación de proteína A estándar ejemplar de zu155D5-1. zu155D5-1 se encontró encapsulada(A),como lo demuestra el cambio de masa después de la desencapsulación(B)en 233 Da, lo que corresponde aproximadamente a dos cisteínas encapsulantes.
FIG. 10ilustra modelos estructurales ejemplares de xi155D5 quimerizado. El modelado para determinar la proximidad de Cys80 se realizó como en la FIG. 2. Se resaltaron los residuos que diferían entre xi155D5 y zu155D5-1 y se midió la distancia en Cys80 para cada uno.(A)Residuos Val 11, Ala14, Gly17, Thr18;(B)Lys63;(C)Thr76, Gly77, Val78, Ala83; y(D)Glu103 y Leu104, están dentro de los 11 Á de Cys80, excepto Lys63 (18 Á). Estos residuos se volvieron a cambiar a aminoácidos de conejo en presencia de Cys80.
FIG. 11ilustra mAbs humanizados ejemplares de secuencias de cadenas ligeras 155D5, 1E4, 166B3 y 33011.
FIG. 12representa(A-D)la detección por citometría de flujo de sueros de animales inmunizados y(E)la detección por ELISA de sueros de animales inmunizados.(A-D)Las células se incubaron con sueros sangrantes post-inmunización en las diluciones indicadas(A:post-sangrado, suero de conejo 1 diluido a razón de 1:1000;B: post-sangrado, suero de conejo 1 diluido a razón de 1:5000;C:post-sangrado, suero de conejo 2 diluido a razón de 1:1000 yD:post sangrado, suero de conejo 2 diluido a razón de 1:5000). Se muestran la señal de células que expresan transitoriamente MSLN humana (+MSLN) y la de células MSLN negativas (-MSLN).(E)Se recubrieron placas de ELISA con 1 pg/mL de MSLN humana a 4 °C durante la noche y se bloquearon utilizando BSA al 1 % en PBS con Tween al 0,01 % (PBST) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de eliminar el tampón de bloqueo, se añadieron a los pocillos muestras diluidas en serie de sangrados previos y posteriores a la inmunización. La placa se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente y luego se lavó tres veces con PBST. Se añadió anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con HRP en tampón de bloqueo y se incubó durante 1 hora. La placa se lavó tres veces y se añadió sustrato TMB. Se detuvo la reacción y se midió la absorbancia a 450 nm.
FIG. 13representa un pico de proteína ejemplar de análisis de espectrometría de masas desconvolucionada antes y después de la conjugación de maleimido-PEG2-auristatina F (AuF) en Cys80.
FIG. 14ilustra(A)la citotoxicidad de mAbs conjugados de MSLN-AuF en Cys80 contra células A431 MSLN-negativas y(B)la citotoxicidad de mAbs conjugados de MSLN-AuF en Cys80 contra células A431 MSLN-positivas.
FIG. 15representa los volúmenes de tumores promedio entre diferentes grupos de tratamiento.
FIG. 16representa(A)los volúmenes promedio de tumores A431-MSLN (flanco izquierdo) entre diferentes grupos de tratamiento y(B)los volúmenes promedio de tumores entre diferentes grupos de tratamiento para A431 (flanco derecho).
FIG. 17representa un análisis SDS-PAGE de un anticuerpo conjugado xi155D5-800CW ejemplar.(A)mwm, marcador de peso molecular; pista 1, xi155D5, no conjugado, no reducido; pista 2, xi155D5, xi155D5-800CW, no reducido; pista 3, en blanco; pista 4, xi155D5 no conjugado, reducido; pista 5, xi155D5, xi155D5-800CW, reducido. Todas las pistas contienen 5 pg de proteína, teñidos con Coomassie.(B)Mismo gel que en A, fotografiado en el sistema IVIS. Los resultados indican que IRDye 800CW está conjugado solo en la cadena ligera de xi155D5. El análisis ELISA de xi155D5-800CW indica que se conserva la unión completa a CA9 (datos no mostrados).
FIG. 18ilustra la localización específica de tumor de un anticuerpo conjugado en DyeIR 800CW ejemplar (xi155D5-800CW). Se injertaron células humanas colo205(A-D)y HT-29(E-H)en ratones inmunológicamente deficientes, a los que luego se les inyectó xi155D5-800CW. La señal fluorescente (rojo anaranjado) se controló en diversos momentos, incluyendo 0 h(A y E),4 h(B y F),24 h(C y G)y 72 h(D y H)(se muestra solo de 0 a 72 h ). horas y flanco derecho). Se muestra la ubicación aproximada del riñón (K) y el tumor (T).
FIG. 19ilustra una purificación ejemplar de una molécula de unión a antígeno bivalente/biespecífica xi155D5/xi1 -55-2. Gráfico de cromatografía de filtración en gel que muestra el pico correspondiente a la molécula de unión al antígeno bivalente/biespecífica xi155D5/xi1 -55-2 (a la que se alude como "biFab")(A).
El tamaño molecular de la fracción se analizó mediante SDS-PAGE(B).Las fracciones que contenían la molécula de unión a antígeno bivalente/biespecífica (biFab) xi155D5/xi1 -55-2 se combinaron y la masa se determinó mediante espectrometría de masas(C).
FIG. 20ilustra la biespecificidad de una molécula de unión a antígeno bivalente/biespecífica xi155D5/xi1 -55 2 ejemplar (biFab). CA9 humana biotinilada se capturó en puntas de biosensores Octet de estreptavidina. Se añadieron los compuestos como indica la primera flecha ("compuesto") y luego se dejó que se unieran. Posteriormente, se añadió TEM-1 humana soluble (segunda flecha; 'TEM-1") y se midió su unión a los complejos CA9/compuesto capturados. El cambio de respuesta (flecha doble), que indica la captura de la TEM-1 soluble, se observó solo con la molécula de unión al antígeno xi155D5/xi1 -55-2 bivalente/biespecífica (biFab).
FIG.21ilustra un análisis SDS-PAGE de mAb conjugados de xi33O11 -Ap(1 -16) en Cys80 y mAbs conjugados de xi1-55-2-Ap(1-16) en Cys80. Se muestran los productos antes (B) y después (A) de la conjugación de mAb-DBCO con el péptido Ap(1 -16). MW, marcador de peso molecular. Lc , cadena ligera. MW, marcador de peso molecular. LC, cadena ligera.
FIG. 22ilustra un análisis de espectrometría de masas ejemplar de la cadena ligera parental (LC) de xi1-55-2 y xi33O11 (A y B,respectivamente), LC conjugada en xi1-55-2-DBCO Cys80 y LC conjugada en xi33O11 -DBCO Cys80 (C y D, respectivamente), y LC conjugada en xi1-55-2-Ap(1-16) Cys80 y LC conjugada en xi33O11 -Ap(1 -16) Cys80 (E y F,respectivamente).
FIG. 23ilustra un esquema ejemplar para generar moléculas de unión a antígeno. Las inmunoglobulinas derivadas de conejo se pueden digerir con papaína para generar Fabs. Se puede incubar un primer Fab con maleimido-DBCO y se puede incubar un segundo Fab con maleimido-azida. El primer y segundo Fab se pueden combinar para formar una molécula de unión biespecífica Fab-Fab. SPAAC = conjugación alquinaazida fomentada por cepa.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE REALIZACIONES ILUSTRATIVAS
Los métodos, inmunoglobulinas conjugadas, moléculas de unión a antígeno, inmunoglobulinas y regiones variables de la cadena ligera descritos pueden entenderse más fácilmente con referencia a la siguiente descripción detallada tomada en relación con las figuras adjuntas, que forman parte de esta divulgación. Debe entenderse que los métodos, inmunoglobulinas conjugadas, moléculas de unión a antígeno, inmunoglobulinas y regiones variables de la cadena ligera descritos no se limitan a las realizaciones específicas descritas y/o mostradas en esta memoria, y que la terminología utilizada en esta memoria tiene el propósito de describir realizaciones particulares a modo de ejemplo únicamente y no pretende ser limitante de los métodos, inmunoglobulinas conjugadas, moléculas de unión a antígeno, inmunoglobulinas y regiones variables de la cadena ligera reivindicados.
A menos que se indique específicamente lo contrario, cualquier descripción de un posible mecanismo o modo de acción o motivo de mejora pretende ser únicamente ilustrativa, y los métodos, las inmunoglobulinas conjugadas, las moléculas de unión a antígenos, las inmunoglobulinas y las regiones variables de la cadena ligera descritos no deben estar limitados por la exactitud o incorrección de cualquier mecanismo o modo de acción sugerido o motivo de mejora.
A lo largo de este texto, las descripciones se refieren a inmunoglobulinas conjugadas, moléculas de unión a antígeno, inmunoglobulinas y regiones variables de la cadena ligera y a métodos para generar las mismas. Cuando la divulgación describe o reivindica una característica o realización asociada con una inmunoglobulina conjugada, una molécula de unión a antígeno, una inmunoglobulina o una región variable de la cadena ligera, una característica o realización de este tipo es igualmente aplicable a los métodos para generar la misma. Asimismo, en los casos en los que la divulgación describe o reivindica una característica o realización asociada con un método para generar una inmunoglobulina conjugada, molécula de unión a antígeno, inmunoglobulina o región variable de la cadena ligera, una característica o realización de este tipo es igualmente aplicable a la inmunoglobulina conjugada, molécula de unión a antígeno, inmunoglobulina o región variable de la cadena ligera.
La referencia a un valor numérico particular incluye al menos ese valor particular, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Cuando se expresa un intervalo de valores, otra realización incluye desde un valor particular y/o hasta el otro valor particular. Además, la referencia a valores establecidos en intervalos incluye todos y cada uno de los valores dentro de ese intervalo. Todos los intervalos son inclusivos y combinables.
Cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente "aproximadamente", se entenderá que el valor particular forma otra realización.
Debe apreciarse que determinadas características de los métodos, inmunoglobulinas conjugadas, moléculas de unión a antígeno, inmunoglobulinas y regiones variables de la cadena ligera descritos que, para mayor claridad, se describen en esta memoria en el contexto de realizaciones separadas, también se pueden proporcionar en combinación en una única realización. Por el contrario, diversas características de los métodos, inmunoglobulinas conjugadas, moléculas de unión a antígeno, inmunoglobulinas y regiones variables de la cadena ligera descritos que, por brevedad, se describen en el contexto de una única realización, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación.
Tal como se utiliza en esta memoria, las formas en singular "un", "una" y "el", “la” incluyen el plural.
La expresión "que comprende" pretende incluir ejemplos abarcados por las expresiones "que consiste esencialmente en" y "que consiste en"; de manera similar, la expresión "que consiste esencialmente en" pretende incluir ejemplos abarcados por la expresión "que consiste en".
A lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones se utilizan diversos términos y expresiones relacionados con aspectos de la descripción. A términos y expresiones de este tipo se les debe dar su significado ordinario en la técnica, a menos que se indique lo contrario. Otros términos y expresiones específicamente definidos deben interpretarse de manera consistente con las definiciones proporcionadas en esta memoria.
El término "aproximadamente", cuando se utiliza en referencia a intervalos numéricos, cortes o valores específicos, se utiliza para indicar que los valores indicados pueden variar hasta en un 10 % del valor indicado. Por lo tanto, el término "aproximadamente" se utiliza para abarcar variaciones de ± 10 % o menos, variaciones de ± 5 % o menos, variaciones de ± 1 % o menos, variaciones de ± 0,5 % o menos, o variaciones de ± 0,1 % o menos del valor especificado.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "muestra biológica" se refiere a una muestra obtenida de un sujeto, incluida una muestra de tejido biológico o de origen fluido obtenidain vivooin vitro.Muestras de este tipo pueden ser, pero no se limitan a fluidos corporales (p. ej., sangre, plasma sanguíneo, suero, leche, líquido cefalorraquídeo, ascitis u orina), órganos, tejidos, fracciones y células aisladas de mamíferos, incluyendo seres humanos. Las muestras biológicas también pueden incluir secciones de la muestra obtenida de un sujeto que incluye tejidos (p. ej., porciones en sección de un órgano o tejido). Muestras biológicas también pueden incluir extractos de una muestra obtenida de un sujeto, por ejemplo, un antígeno de un fluido biológico (p. ej., sangre u orina).
La expresión "cisterna encapsulante" se refiere a una cisteína libre de una solución que forma un enlace disulfuro con Cys80 de la región variable de cadena ligera.
El término "quimerizado", "quimérico", la expresión "anticuerpo quimérico" y términos y expresiones similares se refieren a una inmunoglobulina que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera,es decir,una región de unión a antígeno, de una fuente o especie y al menos una porción de una región constante de la cadena pesada y una región constante de la cadena ligera derivadas de una fuente o especie diferente. Estas porciones pueden unirse químicamente mediante técnicas convencionales (p. ej., sintéticas) o pueden prepararse como un polipéptido contiguo utilizando técnicas de ingeniería genética (p. ej., ADN que codifica las porciones de proteína del anticuerpo quimérico puede expresarse para producir una cadena polipeptídica contigua). Inmunoglobulinas quiméricas ejemplares incluyen las que comprenden una región variable de conejo y una región constante humana. Inmunoglobulinas quiméricas de conejo/ser humano de este tipo son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que comprenden segmentos de ADN que codifican regiones variables de la inmunoglobulina de conejo y segmentos de ADN que codifican regiones constantes de la inmunoglobulina humana. Otras formas de "inmunoglobulinas quiméricas" abarcadas por la presente divulgación son aquellas en las que la clase o subclase se ha modificado o cambiado respecto de la inmunoglobulina original (a las que también se alude como "inmunoglobulinas con cambio de clase"). A lo largo de la divulgación, las inmunoglobulinas quiméricas se denominan "xi." En esta memoria, "inmunoglobulina quimérica" y términos similares se refieren a la secuencia de la inmunoglobulina en lugar del procedimiento utilizado para generar el anticuerpo.
Tal como se utiliza en esta memoria, "Cys80" se refiere a un residuo cisteína en la posición 80 del aminoácido de la región variable de la cadena ligera con respecto a una región variable de la cadena ligera sin una secuencia conductora. Por ejemplo, las regiones variables de la cadena ligera descritas en la Tabla 25 comprenden una secuencia conductora de 19 aminoácidos (codificada por una secuencia conductora de 57 nucleótidos). "Cys80" aparece en la posición 99 del aminoácido cuando la secuencia conductora está presente y en la posición 80 del aminoácido cuando la secuencia conductora está ausente. La numeración Cys80 se basa en el sistema de numeración Kabat/Chothia.
El término "desencapsulación" se refiere a la eliminación de la cisteína desencapsulante utilizando los métodos proporcionados en esta memoria en condiciones que minimicen la alteración de los disulfuros intra- e inter-cadena nativos de la inmunoglobulina.
La expresión "inmunoglobulina derivada de" se refiere a inmunoglobulinas, o porciones de las mismas, que tienen al menos las regiones CDR de una inmunoglobulina de conejo. "Inmunoglobulina derivada de" incluye quimeras de conejo/ser humano o inmunoglobulinas de conejo humanizadas. El nivel de variabilidad tolerado al derivar una inmunoglobulina de un conejo puede ser determinado, por ejemplo, por el Consejo de Nombres Adoptados de los Estados Unidos (USAN) de la Asociación Médica Americana (AMA).
Tal como se utiliza en esta memoria, "agente funcional" se refiere a un agente que tiene una propiedad o propiedades terapéuticas, de diagnóstico u otras propiedades funcionales. Diversos agentes funcionales que caen dentro del alcance de la divulgación se describen en otra parte de esta memoria.
El término "humanizado", la expresión"inmunoglobulina humanizada" y términos/expresiones similares se refieren a inmunoglobulinas de origen de conejo en las que la secuencia de aminoácidos en todas las regiones variables se cambia a secuencias que tienen homología con una región variable humana. Inmunoglobulinas humanizadas ejemplares pueden comprender un dominio variable de conejo mediante el cual los residuos en toda la región marco (FWR) y/o las CDRs se reemplazan por secuencias homólogas a una inmunoglobulina humana. En algunos casos, los residuos FWR de la inmunoglobulina de conejo no se reemplazan por los residuos humanos correspondientes. Alternativamente, "humanizada", "inmunoglobulina humanizada" y términos/expresiones similares pueden referirse a inmunoglobulinas de origen humano en las que los residuos en todo el FWR y/o las CDRs se reemplazaron por secuencias homólogas a una inmunoglobulina de conejo. Por ejemplo, las inmunoglobulinas humanizadas pueden ser inmunoglobulinas humanas en las que los residuos de una región hipervariable de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una inmunoglobulina de conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. Además, las inmunoglobulinas humanizadas pueden comprender residuos que no se encuentran en la inmunoglobulina del receptor o en la inmunoglobulina del donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento de las inmunoglobulinas. En general, la inmunoglobulina humanizada comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los FWRs son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. La inmunoglobulina humanizada también puede comprender opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Véase, p. ej., Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; y Neuberger, M. S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. A lo largo de la divulgación, las "inmunoglobulinas humanizadas" se denominan "zu." En esta memoria, "inmunoglobulina humanizada" y expresiones similares se refieren a la secuencia de la inmunoglobulina en lugar del procedimiento utilizado para generar la inmunoglobulina.
La expresión "inmunoglobulina donante" se refiere a una inmunoglobulina no humana que aporta las secuencias de aminoácidos de sus regiones variables, CDRs u otros fragmentos funcionales o análogos de los mismos a la inmunoglobulina humanizada y, con ello, proporciona a la inmunoglobulina humanizada la especificidad antigénica y la actividad característica neutralizante de la inmunoglobulina donante.
La expresión "inmunoglobulina receptora" se refiere a una inmunoglobulina heteróloga a la inmunoglobulina donante, que proporciona las secuencias de aminoácidos de sus regiones marco de la cadena pesada y/o ligera y/o sus regiones constantes de la cadena pesada y/o ligera a la inmunoglobulina humanizada. La inmunoglobulina receptora puede derivarse de cualquier mamífero. En realizaciones preferidas, la inmunoglobulina receptora no es inmunogénica en seres humanos. Preferiblemente, la inmunoglobulina receptora es una inmunoglobulina humana.
"Humanizar" se refiere a un procedimiento de generar una inmunoglobulina humanizada e incluye cualquier procedimiento para generar inmunoglobulinas humanizadas que tengan las características anteriores, que incluyen, pero no se limitan a la humanizaciónin silico,la ingeniería de CDRs de especie/huésped en inmunoglobulinas humanas, la sustitución de residuos de la región marco de una inmunoglobulina quimérica para que coincida con una región marco humana correspondiente, etc.
"Aminoácido hidrófobo" se refiere a un aminoácido que exhibe una hidrofobicidad mayor que cero de acuerdo con la escala de hidrofobicidad de consenso normalizada de Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142. Aminoácidos hidrófobos codificados genéticamente incluyen Pro (P), Ile (I), Phe (F), Val (V), Leu (L), Trp (W), Met (M), Ala (A), Gly (G). y Tyr (Y).
"Inmunoglobulina", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una proteína que consiste en uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina que incluyen las cadenas ligeras kappa y lambda y las cadenas pesadas alfa, gamma, delta, épsilon y mu. Las "cadenas ligeras" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 25 Kd o 214 aminoácidos) están codificadas por un gen de la región variable en el extremo NH2 (aproximadamente 110 aminoácidos) y un gen de la región constante kappa o lambda en el extremo COOH. Las "cadenas pesadas" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 50 Kd o 446 aminoácidos) están codificadas de manera similar por un gen de la región variable (aproximadamente 116 aminoácidos) y uno de los otros genes de la región constante antes mencionados, p. ej., gamma (que codifica aproximadamente 330 aminoácidos). "Inmunoglobulinas" incluyen: (a) polipéptidos de inmunoglobulinas,esdecir,polipéptidos de la familia de las inmunoglobulinas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno específico (p. ej., MSLN, CA9, TEM1, etc.), incluyendo todos los isotipos de inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgE, IgM, IgD e IgY), clases (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), subclases y diversas formas monoméricas y poliméricas de cada uno de los isotipos, a menos que se especifique lo contrario; y (b) variantes sustituidas de forma conservadora de polipéptidos de este tipo de inmunoglobulina que se unen inmunoespecíficamente al antígeno (p. ej., MSLN, CA9, TEM1, etc.). Las inmunoglobulinas se describen generalmente, por ejemplo, en Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988).
Una forma de inmunoglobulina descrita en esta memoria constituye la unidad estructural básica de un anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir un tetrámero y puede consistir en dos pares idénticos de cadenas de inmunoglobulina, teniendo cada uno de los pares una cadena ligera y una cadena pesada. Generalmente, en cada uno de los pares, las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada son juntas responsables de la unión a un antígeno, y las regiones constantes son responsables de las funciones efectoras del anticuerpo.
Además de los anticuerpos, las inmunoglobulinas pueden existir en una diversidad de otras formas que incluyen, por ejemplo: fragmentos de unión a antígeno o porciones de una inmunoglobulina, tales como fragmentos Fv, Fab, (Fab')2 y Fv; y formatos de anticuerpos alternativos, tales como inmunoglobulinas de cadena sencilla (scFV y scFab), diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, anticuerpos lineales y anticuerpos multiespecíficos, por nombrar unos pocos. Véase, por ejemplo, James D. Marks, Antibody Engineering, Capítulo 2, Oxford University Press (1995) (Carl K. Borrebaeck, Ed.)
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "inmunoespecíficamente" se refiere a la capacidad de una inmunoglobulina de unirse específicamente a un antígeno contra el que se generó la inmunoglobulina y no unirse específicamente a otros péptidos o proteínas. Una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a un antígeno contra el cual se generó la inmunoglobulina puede no unirse a otros polipéptidos o proteínas, o puede unirse a otros polipéptidos o proteínas con una afinidad de unión más baja que el antígeno contra el cual se generó la inmunoglobulina según se determina, por ejemplo, por inmunoensayos, BIAcore u otros ensayos conocidos en la técnica Una inmunoglobulina se une inmunoespecíficamente a un antígeno contra el cual se generó la inmunoglobulina cuando se une al antígeno con una mayor afinidad de unión que a cualquier antígeno de reactividad cruzada, según se determina utilizando técnicas experimentales, tales como, pero no limitadas a radioinmunoensayos (RIA) y ensayos por inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISAs) (Véase, por ejemplo, Paul, ed., Fundamental Immunology, 2a ed., Raven Press, Nueva York, páginas 332-336 (1989) para una discusión sobre la especificidad del anticuerpo).
"Enlazador", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un espaciador, que puede ser una cadena lineal o ramificada, para conectar una inmunoglobulina (a través de un grupo reactivo con tiol en la Cys80 desapareada) a un agente funcional. Enlazadores de este tipo pueden ser escindibles (p. ej., lábiles a ácidos o escindibles por proteasas) o no escindibles.
La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un solo clon de células, incluyendo cualquier clon de células eucariotas o procariotas, o un clon de fagos, y no al método por el cual se produce. Un anticuerpo monoclonal muestra una única especificidad de unión y afinidad por un epítopo particular. La expresión "anticuerpo monoclonal" no se limita a anticuerpos producidos a través de la tecnología de hibridomas.
"Nativa" se refiere a la secuencia de inmunoglobulina de tipo salvaje de la especie de la que se deriva la inmunoglobulina. Por ejemplo, en realizaciones en las que una Cys80 está presente en la región variable de la cadena ligera de la especie de la que deriva, se dice que la Cys80 está presente en la región variable de la cadena ligera nativa.
Tal como se utiliza en esta memoria, "porcentaje de identidad" y expresiones similares se utilizan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos, polinucleótidos, proteínas o polipéptidos, y se entiende en el contexto y en unión con las expresiones que incluyen: (a) secuencia de referencia, (b) ventana de comparación, (c) identidad de secuencia y (d) porcentaje de identidad de secuencia.
(a) Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida que se utiliza como base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, un segmento de una secuencia de ADNc o génica de longitud completa, o la secuencia de ADNc o génica completa. Para los polipéptidos, longitudes ejemplares de la secuencia polipeptídica de referencia incluyen al menos aproximadamente 16 aminoácidos, al menos aproximadamente 20 aminoácidos, al menos aproximadamente 25 aminoácidos, al menos aproximadamente 35 aminoácidos, al menos aproximadamente 50 aminoácidos o al menos aproximadamente 100 aminoácidos. Para los ácidos nucleicos, la longitud ejemplar de la secuencia de ácidos nucleicos de referencia incluye al menos aproximadamente 50 nucleótidos, al menos aproximadamente 60 nucleótidos, al menos aproximadamente 75 nucleótidos, al menos aproximadamente 100 nucleótidos o al menos aproximadamente 300 nucleótidos, o cualquier número entero alrededor de o entre ellos. .
(b) Una "ventana de comparación" incluye la referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia polinucleotídica o polipeptídica, en donde la secuencia polinucleotídica o polipeptídica puede compararse con una secuencia de referencia y en donde la porción de la secuencia polinucleotídica o polipeptídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones, sustituciones o eliminaciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones, sustituciones o deleciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. Ventanas de comparación ejemplares pueden tener una longitud de al menos 20 nucleótidos o aminoácidos contiguos y, opcionalmente, pueden tener 30, 40, 50, 100 o más. Los expertos en la técnica entienden que para evitar una similitud engañosamente alta con una secuencia de referencia debido a la inclusión de huecos en la secuencia polinucleotídica o polipeptídica, normalmente se introduce una penalización por huecos y se resta del número de coincidencias.
(c) Métodos de alineamiento de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de las secuencias para la comparación puede realizarse mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482, 1981; por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443, 1970; por el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8: 2444, 1988; mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos, que incluyen, pero no se limitan a: CLUSTAL en el programa PC/Gene de Intelligenetics, Mountain View, Calif., GAP,<b>E<s t>F<i>T, BLAST, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 7 Science Dr., Madison, Wis., USA; el programa CLUSTAL se describe bien por Higgins y Sharp, Gene, 73: 237-244, 1988; Corpet, et al., Nucleic Acids Research, 16:881-90, 1988; Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences, 8:1-6, 1992; y Pearson, et al., Methods in Molecular Biology, 24:7-331, 1994. La familia de programas BLAST que puede utilizarse para búsquedas de similitud en bases de datos incluye: BLASTN para secuencias de consulta de nucleótidos frente a secuencias de bases de datos de nucleótidos; BLASTX para secuencias de consulta de nucleótidos frente a secuencias de bases de datos de proteínas; BLASTP para secuencias de consulta de proteínas frente a secuencias de bases de datos de proteínas; TBLASTN para secuencias de consulta de proteínas frente a secuencias de bases de datos de nucleótidos; y TBLASTX para secuencias de consulta de nucleótidos frente a secuencias de bases de datos de nucleótidos. Véase, Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York, 1995. Indudablemente, en el futuro estarán disponibles nuevas versiones de los programas anteriores o programas completamente nuevos. y pueden utilizarse con la presente divulgación.
(d) "Porcentaje de identidad" significa el valor determinado al comparar dos secuencias alineadas de manera óptima en una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos o polipéptidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones, sustituciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones, sustituciones o deleciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece la base de ácido nucleico o el residuo de aminoácido idénticos en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de la secuencia.
"Cantidad farmacéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de una inmunoglobulina que trata al sujeto.
"Aminoácido polar" se refiere a un aminoácido hidrófilo que tiene una cadena lateral que no está cargada a pH fisiológico, pero que tiene al menos un enlace en el que el par de electrones compartidos por dos átomos se mantiene más estrechamente por uno de los átomos. Aminoácidos polares codificados genéticamente incluyen Asn (N), Gln (Q), Ser (S) y Thr (T).
El término "sujeto", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un organismo humano o no humano. Por lo tanto, los métodos, las inmunoglobulinas y las inmunoglobulinas conjugadas descritos en esta memoria son aplicables a enfermedades y afecciones tanto humanas como veterinarias. Los sujetos pueden ser "pacientes",es decir,seres humanos vivos u organismos no humanos que reciben atención médica por una enfermedad o afección, o seres humanos u organismos no humanos sin una enfermedad definida que están siendo investigados en busca de signos de patología o presencia/ausencia de una afección particular.
"Sustituir" se refiere al reemplazo de un residuo de aminoácido por otro. "Sustituir" incluye, por ejemplo, mutaciones sin sentido en uno o más pares de bases de ADN que codifican el residuo de aminoácido o modifican la proteína para intercambiar un aminoácido por otro.
Tal como se utiliza en esta memoria, "tratar" y términos similares se refieren a reducir la gravedad y/o la frecuencia de los síntomas de la enfermedad, eliminar los síntomas de la enfermedad y/o la causa subyacente de dichos síntomas, reducir la frecuencia o probabilidad de los síntomas de la enfermedad y/o su causa subyacente y mejorar o remediar el daño causado, directa o indirectamente, por la enfermedad. Enfermedades ejemplares incluyen, pero no se limitan a cáncer.
"Grupo reactivo con tiol" se refiere a un reactivo o grupo que puede formar un enlace covalente con el grupo tiol en una cisteína.
"Cys80 no apareada" se refiere a una Cys80 presente en una inmunoglobulina que tiene un grupo funcional tiol que no está implicado en un enlace disulfuro intramolecular o intermolecular. Por ejemplo, un grupo funcional tiol de una "Cys80 no apareada" no está implicado en un enlace disulfuro con Cys171.
Tal como se utiliza en esta memoria, "90 % idéntico a" abarca al menos 90 % idéntico, 91 % idéntico, 92 % idéntico, 93 % idéntico, 94 % idéntico, 95 % idéntico, 96 % idéntico, 97 % idéntico, 98 % idéntico, 99 % idéntico o 100 % idéntico al elemento de referencia (p. ej., una secuencia biológica).
Se utilizan las siguientes abreviaturas en toda la divulgación: conjugados de fármaco-anticuerpo (ADCs); fármacoanticuerpo (DAR); región marco (FWR); región determinante de la complementariedad (CDR); anhidrasa carbónica IX (CA9); mesotelina (MSLN); auristatina F (AuF); región pesada variable (VH); región ligera variable (VL); kappa variable (Vk); conejo (Rb; rabb); región constante gamma (Cy); región constante kappa (Ck); anticuerpo monoclonal (mAb); cisteína en la posición del aminoácido 80 (Cys80).
Generación de inmunoglobulinas conjugadas
En esta memoria se describen métodos para generar una inmunoglobulina conjugada, comprendiendo los métodos:
desencapsular una cisteína en la posición del aminoácido 80 ("Cys80") en una región variable de la cadena ligera de una inmunoglobulina derivada de conejo, en donde la inmunoglobulina comprende una región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera; y
conjugar un compuesto reactivo con tiol con Cys80, en donde el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol.
Regiones variables de la cadena ligera adecuadas incluyen, por ejemplo, una región variable de la cadena ligera kappa. La región variable de la cadena ligera de las inmunoglobulinas descritas se deriva de conejo. En algunas realizaciones, la Cys80 puede estar presente en la región variable de la cadena ligera nativa de la inmunoglobulina de conejo. Conejos ejemplares de los que se puede derivar una región variable de la cadena ligera que tiene una Cys80 incluyen, pero no se limitan aOryctolagus cuniculus.En algunos aspectos, por ejemplo, la región variable de la cadena ligera puede derivarse de un conejo blanco de Nueva Zelanda (NZW). En otros aspectos, la región variable de la cadena ligera puede derivarse de un conejo b9.
Métodos ejemplares para desencapsular una Cys80 en una región variable de la cadena ligera de una inmunoglobulina incluyen incubar la inmunoglobulina con un tampón reductor, seguido de incubar la inmunoglobulina con un tampón oxidante. Tampones reductores comprenden uno o más agentes reductores. Agentes reductores adecuados incluyen, por ejemplo, cisteína (incluyendo L-cisteína y D-cisteína), 2-mercaptoetilamina, Tris(2-carboxietil)fosfina, ácido 2-mercaptoetanosulfónico, ácido 2-mercaptopropiónico o combinaciones de los mismos. En realizaciones preferidas, el tampón reductor puede comprender un reductor suave tal como cisteína. La concentración de agente reductor puede variar desde aproximadamente 0,2 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 40 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 0,2 mM hasta aproximadamente 90 mM, desde aproximadamente 0,2 mM hasta aproximadamente 80 mM, desde aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 70 mM, desde aproximadamente 0,2 mM hasta aproximadamente 50 mM, desde aproximadamente 0,2 mM hasta aproximadamente 30 mM, desde aproximadamente 0,2 mM hasta aproximadamente 25 mM, desde aproximadamente 0,2 mM hasta aproximadamente 10 mM o desde aproximadamente 0,2 mM hasta aproximadamente 5 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 0,2 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 1 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 2 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 5 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 10 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 15 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 20 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 25 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 30 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 40 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 50 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 60 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 70 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 80 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 90 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 100 mM.
En algunas realizaciones, por ejemplo, el agente reductor puede comprender cisteína de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 10 mM. En algunas realizaciones, el agente reductor puede comprender D-cisteína de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 10 mM. En algunas realizaciones, el agente reductor puede comprender L-cisteína de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 10 mM. En algunas realizaciones, el agente reductor puede comprender 2-mercaptoetilamina de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM. En algunas realizaciones, el agente reductor puede comprender Tris(2-carboxietil) fosfina de aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 5 mM. En algunas realizaciones, el agente reductor puede comprender ácido 2-mercaptoetanosulfónico de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 20 mM. En algunas realizaciones, el agente reductor puede comprender ácido 2-mercaptorpopiónico de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 20 mM.
El tampón reductor puede comprender, además, agentes tampón tales como fosfato sódico, fosfato potásico, MOPS, HEPES, borato sódico, borato potásico o cualquier combinación de los mismos. Concentraciones adecuadas de agente tampón incluyen, pero no se limitan a desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 15 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 30 mM hasta aproximadamente 100 mM, aproximadamente 35 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 40 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 60 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 80 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 90 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 80 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 60 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 40 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 30 mM o desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 20 mM.
En algunas realizaciones, por ejemplo, el tampón reductor puede contener fosfato sódico de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM. En algunas realizaciones, el tampón reductor puede comprender fosfato potásico de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM. En algunas realizaciones, el tampón reductor puede comprender MOPS de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM. En algunas realizaciones, el tampón reductor puede comprender HEPES de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM. En algunas realizaciones, el tampón reductor puede comprender borato sódico de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM. En algunas realizaciones, el tampón reductor puede comprender borato potásico de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM.
El tampón reductor también puede contener un agente quelante que incluye, pero no se limita a EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético) o una combinación de los mismos. Concentraciones adecuadas de agentes quelantes incluyen desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 80 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 60 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 40 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 30 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 20 mM, desde aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 30 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 40 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 60 mM hasta aproximadamente 100 mM o desde aproximadamente 80 mM hasta aproximadamente 100 mM.
Intervalos de pH adecuados del tampón reductor incluyen desde aproximadamente 6,8 hasta aproximadamente 8,0. En algunas realizaciones, el pH del tampón reductor puede ser aproximadamente 6,8. En algunas realizaciones, el pH del tampón reductor puede ser aproximadamente 6,9. En algunas realizaciones, el pH del tampón reductor puede ser aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, el pH del tampón reductor puede ser aproximadamente 7,1. En algunas realizaciones, el pH del tampón reductor puede ser aproximadamente 7,2. En algunas realizaciones, el pH del tampón reductor puede ser aproximadamente 7,3. En algunas realizaciones, el pH del tampón reductor puede ser aproximadamente 7,4. En algunas realizaciones, el pH del tampón reductor puede ser aproximadamente 7,5. En algunas realizaciones, el pH del tampón reductor puede ser aproximadamente 7,6. En algunas realizaciones, el pH del tampón reductor puede ser aproximadamente 7,7. En algunas realizaciones, el pH del tampón reductor puede ser aproximadamente 7,8. En algunas realizaciones, el pH del tampón reductor puede ser aproximadamente 7,9. En algunas realizaciones, el pH del tampón reductor puede ser aproximadamente 8,0.
La inmunoglobulina se puede incubar con el tampón reductor durante aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 18 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 30 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 36 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 42 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 48 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 54 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 60 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 12 horas a aproximadamente 90 horas, desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 84 horas, desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 78 horas, desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 72 horas, desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 66 horas, desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 60 horas, desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 54 horas, desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 48 horas, de aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 42 horas, desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 36 horas o desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 30 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón reductor durante aproximadamente 12 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón reductor durante aproximadamente 18 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón reductor durante aproximadamente 24 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón reductor durante aproximadamente 30 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón reductor durante aproximadamente 36 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón reductor durante aproximadamente 42 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón reductor durante aproximadamente 48 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón reductor durante aproximadamente 54 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón reductor durante aproximadamente 60 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón reductor durante aproximadamente 66 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón reductor durante aproximadamente 72 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón reductor durante aproximadamente 78 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón reductor durante aproximadamente 84 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón reductor durante aproximadamente 90 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón reductor durante aproximadamente 96 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón reductor durante más de 96 horas.
Tampones oxidantes adecuados incluyen, pero no se limitan a tampones basados en Tris, basados en glutamina, basados en arginina u otros aminoácidos, o basados en aminas primarias. La concentración de tampón oxidante puede variar desde aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 40 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 60 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 80 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 80 mM mM, desde aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 60 mM o desde aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 40 mM. La concentración de tampón oxidante puede ser de aproximadamente 20 mM. La concentración de tampón oxidante puede ser de aproximadamente 25 mM. La concentración de tampón oxidante puede ser de aproximadamente 30 mM. La concentración de tampón oxidante puede ser de aproximadamente 40 mM. La concentración de tampón oxidante puede ser de aproximadamente 50 mM. La concentración de tampón oxidante puede ser de aproximadamente 60 mM. La concentración de tampón oxidante puede ser de aproximadamente 70 mM. La concentración de tampón oxidante puede ser de aproximadamente 80 mM. La concentración de tampón oxidante puede ser de aproximadamente 90 mM. La concentración de agente reductor puede ser de aproximadamente 100 mM.
La inmunoglobulina se puede incubar con el tampón oxidante durante aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 30 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 36 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 42 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 48 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 54 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 60 horas hasta aproximadamente 96 horas, desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 90 horas, desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 84 horas, desde aproximadamente 24 horas a aproximadamente 78 horas, desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 72 horas, desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 66 horas, desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 60 horas, desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 54 horas, desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 48 horas, desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 42 horas o desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 36 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón oxidante durante aproximadamente 24 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón oxidante durante aproximadamente 30 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón oxidante durante aproximadamente 36 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón oxidante durante aproximadamente 42 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón oxidante durante aproximadamente 48 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón oxidante durante aproximadamente 54 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón oxidante durante aproximadamente 60 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón oxidante durante aproximadamente 66 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón oxidante durante aproximadamente 72 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón oxidante durante aproximadamente 78 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón oxidante durante aproximadamente 84 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón oxidante durante aproximadamente 90 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón oxidante durante aproximadamente 96 horas. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede incubar con el tampón oxidante durante más de 96 horas.
Intervalos de pH adecuados del tampón oxidante incluyen desde aproximadamente 7,5 hasta aproximadamente 9,0. En algunas realizaciones, el pH del tampón oxidante puede ser aproximadamente 7,5. En algunas realizaciones, el pH del tampón oxidante puede ser aproximadamente 7,6. En algunas realizaciones, el pH del tampón oxidante puede ser aproximadamente 7,7. En algunas realizaciones, el pH del tampón oxidante puede ser aproximadamente 7,8. En algunas realizaciones, el pH del tampón oxidante puede ser aproximadamente 7,9. En algunas realizaciones, el pH del tampón oxidante puede ser aproximadamente 8,0. En algunas realizaciones, el pH del tampón oxidante puede ser aproximadamente 8,1. En algunas realizaciones, el pH del tampón oxidante puede ser aproximadamente 8,2. En algunas realizaciones, el pH del tampón oxidante puede ser aproximadamente 8,3. En algunas realizaciones, el pH del tampón oxidante puede ser aproximadamente 8,4. En algunas realizaciones, el pH del tampón oxidante puede ser aproximadamente 8,5. En algunas realizaciones, el pH del tampón oxidante puede ser aproximadamente 8,6. En algunas realizaciones, el pH del tampón oxidante puede ser aproximadamente 8,7. En algunas realizaciones, el pH del tampón oxidante puede ser aproximadamente 8,8. En algunas realizaciones, el pH del tampón oxidante puede ser aproximadamente 8,9. En algunas realizaciones, el pH del tampón oxidante puede ser aproximadamente 9,0.
El método puede comprender, además, inmovilizar la inmunoglobulina en una matriz antes de la incubación con el agente reductor y eluir la inmunoglobulina de la matriz después de la incubación con el tampón oxidante. Matrices adecuadas incluyen cualquier superficie a la que se pueda unir y eluir una inmunoglobulina, incluyendo, pero no limitadas a proteína A, proteína G, proteína L, anticuerpo anti-Fab, anticuerpo anti-Fc, soportes de afinidad basados en anti-Mab y resinas de intercambio catiónico fuertes. En algunas realizaciones, la matriz puede ser proteína A. En algunas realizaciones, la matriz puede ser proteína G. En algunas realizaciones, la matriz puede ser proteína L. En algunas realizaciones, la matriz puede comprender un anticuerpo anti-Fab. En algunas realizaciones, la matriz puede comprender un anticuerpo anti-Fc. En algunas realizaciones, la matriz puede comprender un anticuerpo anti-MAb. En algunas realizaciones, la matriz puede comprender una resina de intercambio catiónico fuerte.
Los métodos descritos para desencapsular una inmunoglobulina pueden comprender: equilibrar una matriz; inmovilizar la inmunoglobulina sobre la matriz; incubar la inmunoglobulina inmovilizada sobre la matriz con un tampón reductor para eliminar el grupo encapsulante; incubar la inmunoglobulina inmovilizada sobre la matriz con un tampón oxidante; eluir la inmunoglobulina de la matriz y neutralizar la inmunoglobulina.
Los expertos en la técnica reconocerán que el tampón, la concentración, el pH y el tiempo para eluir la inmunoglobulina de la matriz dependerán, al menos en parte, de la matriz. Por ejemplo, en realizaciones en las que la matriz es proteína A, la inmunoglobulina se puede eluir de la proteína A utilizando glicina (por ejemplo, 0,1 M a pH 2,9). En algunas realizaciones, la elución se puede realizar en un tampón de pH bajo.
Neutralizar la inmunoglobulina puede comprender incubar la inmunoglobulina en un tampón basado en Tris, basado en fosfato sódico o basado en fosfato potásico (al que se alude en esta memoria como "tampón de neutralización"). El tampón de neutralización puede tener una concentración de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 2 M, y un pH de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 9,5.
La conjugación se puede realizar disolviendo un compuesto reactivo con tiol en una solución de disolución e incubando el compuesto reactivo con tiol disuelto con la inmunoglobulina en un tampón de conjugación.
Para compuestos reactivos con tiol insolubles en medios acuosos, que pueden incluir, pero no se limitan a compuestos basados en maleimida, soluciones de disolución adecuadas incluyen disolventes orgánicos miscibles en agua tales como dimetilsulfóxido (DMSO). Para compuestos reactivos con tiol solubles en medios acuosos, las soluciones de disolución adecuadas incluyen, pero no se limitan a agua o soluciones acuosas tamponadas, tales como solución salina tamponada con fosfato, pH 7,2 (1 x PBS).
Concentraciones adecuadas de compuestos reactivos con tiol incluyen desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 40 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 55 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 70 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 90 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 75 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 60 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 50 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 40 mM o desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 30 mM. En algunas realizaciones, la concentración del compuesto reactivo con tiol puede ser aproximadamente 10 mM. En algunas realizaciones, la concentración del compuesto reactivo con tiol puede ser aproximadamente 20 mM. En algunas realizaciones, la concentración del compuesto reactivo con tiol puede ser aproximadamente 30 mM. En algunas realizaciones, la concentración del compuesto reactivo con tiol puede ser aproximadamente 40 mM. En algunas realizaciones, la concentración del compuesto reactivo con tiol puede ser aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, la concentración del compuesto reactivo con tiol puede ser aproximadamente 60 mM. En algunas realizaciones, la concentración del compuesto reactivo con tiol puede ser aproximadamente 70 mM. En algunas realizaciones, la concentración del compuesto reactivo con tiol puede ser aproximadamente 80 mM. En algunas realizaciones, la concentración del compuesto reactivo con tiol puede ser aproximadamente 90 mM. En algunas realizaciones, la concentración del compuesto reactivo con tiol puede ser aproximadamente 100 mM.
Concentraciones adecuadas de inmunoglobulina incluyen de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 12 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg /ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml o de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 0,1 mg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 0,5 mg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 1 mg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 2 mg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 5 mg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 10 mg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 15 mg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 20 mg/ml.
Relaciones adecuadas de compuesto reactivo con tiol:inmunoglobulina incluyen de aproximadamente 3:1 a 20:1. En algunas realizaciones, la relación del compuesto reactivo con tiol puede ser 3: 1 En algunas realizaciones, la relación del compuesto reactivo con tiol puede ser 4: 1 En algunas realizaciones, la relación del compuesto reactivo con tiol puede ser 5: 1 En algunas realizaciones, la relación del compuesto reactivo con tiol puede ser 6: 1 En algunas realizaciones, la relación del compuesto reactivo con tiol puede ser 7: 1 En algunas realizaciones, la relación del compuesto reactivo con tiol puede ser 8: 1 En algunas realizaciones, la relación del compuesto reactivo con tiol puede ser 9: 1 En algunas realizaciones, la relación del compuesto reactivo con tiol puede ser 10: 1 En algunas realizaciones, la relación del compuesto reactivo con tiol puede ser 11: 1 En algunas realizaciones, la relación del compuesto reactivo con tiol puede ser 12: 1 En algunas realizaciones, la relación del compuesto reactivo con tiol puede ser 13: 1 En algunas realizaciones, la relación del compuesto reactivo con tiol puede ser 14: 1 En algunas realizaciones, la relación del compuesto reactivo con tiol puede ser 15: 1 En algunas realizaciones, la relación del compuesto reactivo con tiol puede ser 16: 1 En algunas realizaciones, la relación del compuesto reactivo con tiol puede ser 17: 1 En algunas realizaciones, la relación del compuesto reactivo con tiol puede ser 18: 1 En algunas realizaciones, la relación del compuesto reactivo con tiol puede ser 19: 1 En algunas realizaciones, la relación del compuesto reactivo con tiol puede ser 20: 1
La incubación se puede realizar en un cierto número de tampones de conjugación adecuados que incluyen, por ejemplo, 1xPBS, pH 7,2, fosfato sódico, fosfato potásico, borato sódico y HEPES, por nombrar unos pocos. La concentración de tampón de conjugación incluyen desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 30 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 45 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 60 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 90 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 75 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 60 mM, desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 45 mM o desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 30 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 10 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 20 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 30 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 40 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 60 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 70 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 80 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 90 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 100 mM.
El tampón de conjugación puede incluir, además, cloruro de sodio. Concentraciones adecuadas de cloruro sódico incluyen desde aproximadamente 0 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 150 mM hasta aproximadamente 500 mM,desde aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 250 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 300 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 350 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 400 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 0 mM hasta aproximadamente 400 mM, desde aproximadamente 0 mM hasta aproximadamente 350 mM, desde aproximadamente 0 mM a aproximadamente 300 mM, desde aproximadamente 0 mM hasta aproximadamente 250 mM, desde aproximadamente 0 mM hasta aproximadamente 200 mM, desde aproximadamente 0 mM hasta aproximadamente 150 mM, desde aproximadamente 0 mM hasta aproximadamente 100 mM, desde aproximadamente 0 mM hasta aproximadamente 50 mM o desde aproximadamente 0 mM hasta aproximadamente 25 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 25 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 75 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 100 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 150 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 200 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 250 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 300 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 350 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 400 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 500 mM.
El pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,5. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 6,5. En algunas realizaciones, el pH
del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 6,6. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 6,7. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 6,8. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 6,9. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente
7,0. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,1. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,2. En algunas realizaciones, el pH
del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,3. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,4. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,5. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,6. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente
7,7. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,8. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,9. En algunas realizaciones, el pH
del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 8,0. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 8,1. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 8,2. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 8,3. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente
8,4. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 8,5.
Para facilitar la solubilidad del compuesto reactivo con tiol en el tampón de conjugación, una concentración final de disolvente orgánico miscible en agua en el tampón de conjugación puede ser desde aproximadamente 0 % hasta aproximadamente 20 %, desde aproximadamente 2 % hasta aproximadamente 20 %, desde aproximadamente 5 %
hasta aproximadamente 20 %, desde aproximadamente 8 % hasta aproximadamente 20%, desde aproximadamente
11 % hasta aproximadamente 20 %, desde aproximadamente 16 % hasta aproximadamente 20 %, desde aproximadamente 0 % hasta aproximadamente 18 %, desde aproximadamente 0 % hasta aproximadamente 15 %, desde aproximadamente 0 % hasta aproximadamente 12 %, desde aproximadamente 0 % hasta aproximadamente
10 %, desde aproximadamente 0 % hasta aproximadamente 8 %, desde aproximadamente 0 % hasta aproximadamente 6 % o desde aproximadamente 0 % a aproximadamente 2 %.
El tampón de conjugación puede comprender, además, propilenglicol para facilitar la solubilidad del compuesto reactivo con tiol en el tampón de conjugación. Concentraciones adecuadas de propilenglicol incluyen de aproximadamente 10 % a aproximadamente 50 %, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 50 %, de aproximadamente 30 % a aproximadamente 50 %, de aproximadamente 40 % a aproximadamente 50 %, d aproximadamente 10 % a aproximadamente 40 %, de aproximadamente 10 % a aproximadamente 30 % o de aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 %. En algunas realizaciones, la concentración de propilenglicol puede ser de aproximadamente 10 %. En algunas realizaciones, la concentración de propilenglicol puede ser de aproximadamente 20 %. En algunas realizaciones, la concentración de propilenglicol puede ser de aproximadamente
30 %. En algunas realizaciones, la concentración de propilenglicol puede ser de aproximadamente 40 %. En algunas realizaciones, la concentración de propilenglicol puede ser de aproximadamente 50 %.
El tampón de conjugación puede comprender, además, un detergente no iónico para facilitar la solubilidad de la inmunoglobulina conjugada en el tampón de conjugación. Detergentes no iónicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a polisorbato-20 o polisorbato-80. Concentraciones adecuadas de detergente no iónico incluyen de aproximadamente 0 % a aproximadamente 1 %, de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 1 %, de aproximadamente 0,3 % a aproximadamente 1 %, de aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 1 %, de aproximadamente 0,7 % a aproximadamente 1 %, de aproximadamente 0 % a aproximadamente 0,8 %, de aproximadamente 0 % a aproximadamente 0,6 %, de aproximadamente 0 % a aproximadamente 0,4 % o de aproximadamente 0 % a aproximadamente 0,2 %. En algunas realizaciones, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,1 %. En algunas realizaciones, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,2 %. En algunas realizaciones, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,3 algunas realizaciones, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,4 algunas realizaciones, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,5 algunas realizaciones, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,6 algunas realizaciones, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,7 algunas realizaciones, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,8 %. En algunas realizaciones, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,9 %. En algunas realizaciones, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 1,0 %.
La incubación se puede realizar durante aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 48 horas, desde aproximadamente 6 horas hasta aproximadamente 48 horas, desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 48 horas, desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 48 horas, desde aproximadamente 30 horas hasta aproximadamente 48 horas, desde aproximadamente 36 horas hasta aproximadamente 48 horas, desde aproximadamente 42 horas hasta aproximadamente 48 horas, desde aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 42 horas, desde aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 36 horas, desde aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 30 horas, desde aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 24 horas, desde aproximadamente 2 horas a aproximadamente 18 horas, desde aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 12 horas o desde aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 6 horas. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar durante 2 horas. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar durante 6 horas. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar durante 12 horas. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar durante 18 horas. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar durante 24 horas. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar durante 30 horas. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar durante 36 horas. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar durante 42 horas. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar durante 48 horas.
La temperatura de incubación puede ser desde aproximadamente 18 °C hasta aproximadamente 37 °C, desde aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 37 °C, desde aproximadamente 22 °C hasta aproximadamente 37 °C, desde aproximadamente 24 °C hasta aproximadamente 37 °C, desde aproximadamente 26 °C hasta aproximadamente 37 °C, desde aproximadamente 28 °C hasta aproximadamente 37 °C, desde aproximadamente 30 °C hasta aproximadamente 37 °C, desde aproximadamente 32 °C hasta aproximadamente 37 °C, desde aproximadamente 34 °C hasta aproximadamente 37 °C, desde aproximadamente 18 °C hasta aproximadamente 34 °C, desde aproximadamente 18 °C hasta aproximadamente 32 °C, desde aproximadamente 18 °C hasta aproximadamente 30 °C, desde aproximadamente 18 °C hasta aproximadamente 28 °C, desde aproximadamente 18 °C hasta aproximadamente 26 °C o desde aproximadamente 18 °C hasta aproximadamente 24°C. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar a 18 °C. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar a 20 °C. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar a 22 °C. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar a 24 °C. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar a 26 °C. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar a 28 °C. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar a 30 °C. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar a 32 °C. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar a 34 °C. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar a 37 °C.
Los compuestos reactivos con tiol no incorporados se pueden separar de la inmunoglobulina conjugada mediante cromatografía de desalinización utilizando un cierto número de resinas adecuadas que incluyen, pero no se limitan a resina G-25, resina G-50, Biogel P10 u otras resinas con límites de exclusión de intervalos 5.000 -10.000 Da. La cromatografía se puede realizar en formato de columna o en formato de columna por rotación, dependiendo de la escala. Tampones adecuados para desalar incluyen, por ejemplo, 1xPBS, fosfato sódico, fosfato potásico, borato sódico o tampones basados en HEPES que pueden sustituir al 1xPBS.
En una realización ejemplar, la conjugación se puede realizar disolviendo un compuesto reactivo con tiol a base de maleimido en dimetilsulfóxido (DMSO) al 100 % a una concentración final de compuesto reactivo con tiol de 10 mM. A continuación, el compuesto reactivo con tiol disuelto se puede incubar con una inmunoglobulina a una concentración de inmunoglobulina de 5 mg/ml en 1xPBS, pH 7,2 en una relación molar de compuesto reactivo con tiol:inmunoglobulina de 5:1 y se mezcla a fondo. La incubación se puede realizar durante 24 horas a 22 °C. El compuesto reactivo con tiol no incorporado se puede eliminar de la inmunoglobulina conjugada mediante cromatografía de desalinización utilizando resina G-25 con 1x PBS como tampón de desarrollo.
Preferiblemente, el compuesto reactivo con tiol se conjuga en Cys80 a través del grupo reactivo con tiol. Grupos reactivos con tiol incluyen haloacetilos, maleimidas, aziridinas, acriloilos, agentes arilantes, vinilsulfonas, disulfuros de piridilo, TNB-tioles y agentes reductores de disulfuro. En algunas realizaciones, el grupo reactivo con tiol puede comprender una maleimida. En algunas realizaciones, el grupo reactivo con tiol puede comprender un haloacetilo. En algunas realizaciones, el grupo reactivo con tiol puede comprender una aziridina. En algunas realizaciones, el grupo reactivo con tiol puede comprender un acriloílo. En algunas realizaciones, el grupo reactivo con tiol puede comprender un agente arilante. En algunas realizaciones, el grupo reactivo con tiol puede comprender una vinilsulfona. En algunas realizaciones, el grupo reactivo con tiol puede comprender un disulfuro de piridilo. En algunas realizaciones, el grupo reactivo con tiol puede comprender un TNB-tiol. En algunas realizaciones, el grupo reactivo con tiol puede comprender un agente reductor de disulfuro.
Grupos reactivos con tiol pueden derivarse de un cierto número de reactivos adecuados que incluyen yodoacetamidas, maleimidas, haluros bencílicos y bromometilcetonas, que pueden reaccionar mediante S-alquilación de tioles para generar productos tioéter estables.
El grupo reactivo con tiol se puede añadir a un enlazador. Los enlazadores pueden ser enlazadores no escindibles o enlazadores escindibles. Enlazadores ejemplares incluyen, por ejemplo, enlazadores que contienen disulfuro, enlazadores basados en acetal y enlazadores basados en cetal. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador no escindible. Enlazadores no escindibles adecuados incluyen, pero no se limitan a polietilenglicol (PEG) o un alquilo. En algunas realizaciones, el enlazador puede comprender PEG. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador escindible. Enlazadores escindibles adecuados incluyen, por ejemplo, valina-citrulina-para aminobencilo. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador que contiene disulfuro. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador basado en acetal. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador basado en cetal. Se proporcionan ejemplos de enlazadores unidos covalentemente a un grupo reactivo con tiol, por ejemplo, en la Publ. de Ee .UU. N° 20140050746.
El compuesto reactivo con tiol puede comprender, además, un agente funcional. Agentes funcionales adecuados incluyen, por ejemplo, fluoróforos, colorantes fluorescentes, polipéptidos, inmunoglobulinas, antibióticos, ácidos nucleicos, radionucleidos, enlazadores químicos, moléculas pequeñas, quelantes, lípidos y fármacos. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un fluoróforo. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un colorante fluorescente. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un polipéptido. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender una inmunoglobulina. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un antibiótico. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un ácido nucleico (tal como ADN o ARN). En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un radionucleido. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un enlazador químico (por ejemplo, dibencilciclo-octino (DBCO) o azida). En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender una molécula pequeña. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un quelante (por ejemplo, DOTA, CHX-A"-DTPA, NOTA, entre otros). En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un lípido. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un fármaco. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender una combinación de cualquiera de los agentes funcionales arriba enumerados.
El compuesto reactivo con tiol (es decir, un primer compuesto reactivo con tiol) puede unirse a un segundo compuesto reactivo con tiol, estando unido el segundo compuesto reactivo con tiol a una segunda inmunoglobulina que tiene una segunda región variable de la cadena pesada y una segunda región variable de la cadena ligera, teniendo la segunda región variable de la cadena ligera una cisteína en la posición del aminoácido 80 ("Cys802"), en donde el segundo compuesto reactivo con tiol comprende un segundo grupo reactivo con tiol unido en Cys802. Por ejemplo, el primer compuesto reactivo con tiol y el segundo compuesto reactivo con tiol pueden tener un primer y segundo enlazador químico como primer y segundo agentes funcionales, respectivamente. Los primer y segundo enlazadores químicos pueden unirse entre sí por un cierto número de medios adecuados que incluyen, por ejemplo, química de clic.
En realizaciones preferidas, el Cys80 puede estar no apareado. Medios adecuados para no aparear Cys80 incluyen, por ejemplo, quimerizar una región variable de la cadena ligera que tiene Cys80 con un dominio constante que tiene un residuo de aminoácido distinto de cisteína en la posición 171.
Los métodos descritos se pueden realizar en una inmunoglobulina quimerizada. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la inmunoglobulina puede ser una inmunoglobulina quimerizada. En realizaciones en las que la inmunoglobulina está quimerizada, los métodos para generar una inmunoglobulina conjugada pueden comprender: desencapsular una Cys80 en una región variable de la cadena ligera de una inmunoglobulina quimerizada, en donde la inmunoglobulina quimerizada comprende una región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera; y conjugar un compuesto reactivo con tiol en Cys80, en donde el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol.
Alternativamente, los métodos descritos pueden comprender, además, quimerizar una inmunoglobulina antes de desencapsular. Por ejemplo, los métodos para generar una inmunoglobulina conjugada pueden comprender: quimerizar una inmunoglobulina que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, teniendo la región variable de la cadena ligera una Cys80; desencapsular el Cys80; y conjugar un compuesto reactivo con tiol en Cys80, en donde el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol.
Los métodos descritos se pueden realizar en una inmunoglobulina humanizada. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la inmunoglobulina puede ser una inmunoglobulina humanizada. En realizaciones en las que la inmunoglobulina está humanizada, los métodos para generar una inmunoglobulina conjugada pueden comprender: desencapsular una Cys80 en una región variable de la cadena ligera de una inmunoglobulina quimerizada, en donde la inmunoglobulina quimerizada comprende una región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera; y conjugar un compuesto reactivo con tiol en Cys80, en donde el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol.
Alternativamente, los métodos descritos pueden comprender, además, humanizar una inmunoglobulina antes de desencapsular. Por ejemplo, los métodos para generar una inmunoglobulina conjugada pueden comprender: humanizar una inmunoglobulina que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, teniendo la región variable de la cadena ligera una Cys80; desencapsular la Cys80; y conjugar un compuesto reactivo con tiol en Cys80, en donde el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol.
Los métodos pueden comprender, además, sustituir un aminoácido en la posición 83 con un residuo de aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys. En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con alanina ("Ala83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con valina ("Val83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con isoleucina ("Ile83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con treonina ("Thr83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con arginina ("Arg83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con asparagina ("Asn83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con ácido aspártico ("Asp83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con ácido glutámico ("Glu83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con glutamina ("Gln83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con glicina ("Gly83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con histidina ("His83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con leucina ("Leu83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con metionina ("Met83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con prolina ("Pro83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con serina ("Ser83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con triptófano ("Trp83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir la fenilalanina en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con tirosina ("Tyr83"). En algunas realizaciones, los métodos pueden comprender sustituir un aminoácido en la posición 83 con un aminoácido polar o hidrófobo que incluye, pero no se limita a alanina, valina, isoleucina o treonina.
El residuo de aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys en la posición de aminoácido 83 en combinación con los métodos de desencapsulación descritos puede disminuir la agregación y aumentar la eficiencia de conjugación de Cys80 de la inmunoglobulina. La agregación de inmunoglobulinas adecuada lograda mediante los métodos descritos incluye, por ejemplo, menos de aproximadamente el 5 %, menos de aproximadamente el 7 %, menos de aproximadamente el 10 %, menos de aproximadamente el 12 %, menos de aproximadamente el 15 %, menos de aproximadamente el 17 %, menos de aproximadamente el 20 %, menos de aproximadamente el 22 % o menos de aproximadamente el 25 %. Eficiencias de conjugación adecuadas conseguidas mediante los métodos descritos incluyen, por ejemplo, más de aproximadamente el 70 %, más de aproximadamente el 73 %, más de aproximadamente el 76 %, más de aproximadamente el 79 %, más de aproximadamente el 82 %, más de aproximadamente el 85 %, más de aproximadamente el 88 %, más de aproximadamente el 91 %, más de aproximadamente el 94 %, más de aproximadamente el 97 % o más de aproximadamente el 99 %.
Métodos para generar moléculas d e u n ió n a a n t íg e n o s
También se describen en esta memoria métodos para generar una molécula de unión a antígeno, comprendiendo el método incubar una primera inmunoglobulina conjugada con una segunda inmunoglobulina conjugada para generar la molécula de unión a antígeno, en los que:
la primera inmunoglobulina conjugada comprende una primera región variable de la cadena pesada y una primera región variable de la cadena ligera, teniendo la primera región variable de la cadena ligera una cisteína en la posición 80 ("Cys801"), en donde Cys801 está conjugada en un primer compuesto reactivo con tiol que comprende un primer grupo reactivo con tiol; y
la segunda inmunoglobulina conjugada comprende una segunda región variable de la cadena pesada y una segunda región variable de la cadena ligera, teniendo la segunda región variable de la cadena ligera una cisteína en la posición 80 ("Cys802"), en donde Cys802 está conjugada en un segundo compuesto reactivo con tiol que comprende un segundo grupo reactivo con tiol.
Moléculas de unión a antígeno incluyen moléculas de unión a antígeno multivalentes y/o multiespecíficas. Por ejemplo, las moléculas de unión a antígeno incluyen moléculas de unión a antígeno bivalentes, trivalentes y tetravalentes que son monoespecíficas o biespecíficas. En algunos aspectos, la molécula de unión al antígeno puede ser bivalente y monoespecífica. En algunos aspectos, la molécula de unión al antígeno puede ser bivalente y biespecífica. En algunos aspectos, la molécula de unión al antígeno puede ser trivalente y monoespecífica. En algunos aspectos, la molécula de unión al antígeno puede ser trivalente y biespecífica. En algunos aspectos, la molécula de unión al antígeno puede ser tetravalente y monoespecífica. En algunos aspectos, la molécula de unión al antígeno puede ser tetravalente y biespecífica. En algunos aspectos, la valencia puede ser mayor que tetravalente. En algunos aspectos, la valencia puede ser mayor que biespecífica.
La Cys801, la Cys802, o ambas pueden estar no apareadas. Medios adecuados para no aparear Cys80 incluyen, por ejemplo, quimerizar una región variable de la cadena ligera que tiene Cys80 con un dominio constante que tiene un residuo de aminoácido distinto de cisteína en la posición 171.
En algunos aspectos, los métodos pueden comprender, además, desencapsular la Cys801. En algunos aspectos, los métodos pueden comprender, además, desencapsular la Cys802. En algunos aspectos, los métodos pueden comprender, además, desencapsular la Cys801 y la Cys802.
La desencapsulación puede comprender incubar la primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina o ambas con un tampón reductor seguido de la incubación de la primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina o ambas con un tampón oxidante. En algunos aspectos de los métodos para generar moléculas de unión a antígeno, la desencapsulación puede comprender, además, inmovilizar la primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina o ambas en una matriz antes de la incubación con el tampón reductor y eluir la primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina, o ambos de la matriz después de la incubación con el tampón oxidante.
Condiciones adecuadas de desencapsulación y conjugación, incluyendo tampones reductores, tampones oxidantes, concentraciones, pHs, tiempos y matrices, se describen en la sección titulada"generación de inmunoglobulinas conjugadas”y son igualmente aplicables en esta memoria.
En algunos aspectos, los métodos pueden comprender, además, conjugar un primer compuesto reactivo con tiol con Cys801, en donde el primer compuesto reactivo con tiol comprende un primer grupo reactivo con tiol. En algunos aspectos, los métodos pueden comprender, además, conjugar un segundo compuesto reactivo con tiol con Cys802, en donde el segundo compuesto reactivo con tiol comprende un primer grupo reactivo con tiol. Aún en otros aspectos, los métodos pueden comprender, además, conjugar un primer compuesto reactivo con tiol con Cys801 y un segundo compuesto reactivo con tiol con Cys802, en donde el primer compuesto reactivo con tiol comprende un primer grupo reactivo con tiol y el segundo compuesto reactivo con tiol comprende un segundo grupo reactivo con tiol.
Los métodos pueden comprender, además, tanto desencapsular como conjugar. Por ejemplo, los métodos pueden comprender, además, antes de la etapa de incubación,
desencapsular la Cys801, Cys802, o ambas; y
conjugar un primer compuesto reactivo con tiol con Cys801 y un segundo compuesto reactivo con tiol con Cys802, o ambas, en donde el primer compuesto reactivo con tiol comprende un primer grupo reactivo con tiol y el segundo compuesto reactivo con tiol comprende un segundo grupo reactivo con tiol.
Se pueden quimerizar la primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina o ambas. A la inversa, los métodos pueden comprender, además, quimerizar la primera inmunoglobulina, quimerizar la segunda inmunoglobulina o quimerizar tanto la primera inmunoglobulina como la segunda inmunoglobulina. Por ejemplo, y sin pretender ser limitantes, los métodos pueden comprender, además, antes de la etapa de incubación:
quimerizar una primera inmunoglobulina que comprende una Cys801 para generar una primera inmunoglobulina quimérica;
quimerizar la segunda inmunoglobulina que comprende una Cys802 para generar una segunda inmunoglobulina quimérica;
desencapsular la Cys801, Cys802, o ambas; y
conjugar un primer compuesto reactivo con tiol con Cys801 y un segundo compuesto reactivo con tiol con Cys802, o ambas, en donde el primer compuesto reactivo con tiol comprende un primer grupo reactivo con tiol y el segundo compuesto reactivo con tiol comprende un segundo grupo reactivo con tiol.
Se pueden humanizar la primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina o ambas. A la inversa, los métodos pueden comprender, además, humanizar la primera inmunoglobulina, humanizar la segunda inmunoglobulina o humanizar tanto la primera inmunoglobulina como la segunda inmunoglobulina. Por ejemplo, y sin pretender ser limitantes, los métodos pueden comprender, además, antes de la etapa de incubación:
humanizar una primera inmunoglobulina que comprende una Cys801 para generar una primera inmunoglobulina humanizada;
humanizar la segunda inmunoglobulina que comprende una Cys802 para generar una segunda inmunoglobulina humanizada;
desencapsular la Cys801, Cys802, o ambas; y
conjugar un primer compuesto reactivo con tiol con Cys801 y un segundo compuesto reactivo con tiol con Cys802, o ambas, en donde el primer compuesto reactivo con tiol comprende un primer grupo reactivo con tiol y el segundo compuesto reactivo con tiol comprende un segundo grupo reactivo con tiol.
Preferiblemente, el primer y segundo compuestos reactivos con tiol se conjugan con Cys801 y Cys802, respectivamente, a través del primer grupo reactivo con tiol y el segundo grupo reactivo con tiol. De manera adecuada, grupos reactivos con tiol incluyen haloacetilos, maleimidas, aziridinas, acriloilos, agentes arilantes, vinilsulfonas, disulfuros de piridilo, TNB-tioles y agentes reductores de disulfuro. En algunas realizaciones, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender una maleimida. En algunas realizaciones, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un haloacetilo. En algunas realizaciones, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender una aziridina. En algunas realizaciones, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un acriloilo. En algunas realizaciones, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un agente arilante. En algunas realizaciones, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender una vinilsulfona. En algunas realizaciones, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un disulfuro de piridilo. En algunas realizaciones, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un TNB-tiol. En algunas realizaciones, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un agente reductor de disulfuro.
El primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden agregarse a un enlazador. En algunos aspectos, el primer grupo reactivo con tiol se puede agregar a un enlazador ("primer enlazador"). En algunos aspectos, el segundo grupo reactivo con tiol se puede agregar a un enlazador ("segundo enlazador"). Aún en otros aspectos, el primer grupo reactivo con tiol se puede agregar a un primer enlazador y el segundo grupo reactivo con tiol se puede agregar a un segundo enlazador. Primeros y segundos enlazadores adecuados pueden ser enlazadores no escindibles o enlazadores escindibles. Primeros y segundos enlazadores ejemplares incluyen, por ejemplo, enlazadores que contienen disulfuro, enlazadores basados en acetal y enlazadores basados en cetal. En algunos aspectos, el primer enlazador, el segundo enlazador o ambos pueden ser un enlazador no escindible. Enlazadores no escindibles adecuados incluyen, pero no se limitan a polietilenglicol (PEG) o un alquilo. En algunos aspectos, el primer enlazador, el segundo enlazador o ambos pueden comprender PEG. En algunos aspectos, el primer enlazador, el segundo enlazador o ambos pueden ser un enlazador escindible. Enlazadores escindibles adecuados incluyen, por ejemplo, valina-citrulina-para aminobencilo. En algunos aspectos, el primer enlazador, el segundo enlazador o ambos pueden ser un enlazador que contiene disulfuro. En algunos aspectos, el primer enlazador, el segundo enlazador o ambos pueden ser un enlazador basado en acetal. En algunos aspectos, el primer enlazador, el segundo enlazador o ambos pueden ser un enlazador basado en cetal. Se proporcionan ejemplos de enlazadores unidos covalentemente a un grupo reactivo con tiol, por ejemplo, en la Publ. de EE.UU. N° 20140050746.
El primer compuesto reactivo con tiol, el segundo compuesto reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender, además, un agente funcional. En algunos aspectos, el primer compuesto reactivo con tiol puede comprender, además, un agente funcional ("primer agente funcional"). En algunos aspectos, el segundo compuesto reactivo con tiol puede comprender, además, un agente funcional ("segundo agente funcional"). Aún en otros aspectos, el primer compuesto reactivo con tiol puede comprender, además, un primer agente funcional y el segundo compuesto reactivo con tiol puede comprender, además, un segundo agente funcional.
Agentes funcionales adecuados incluyen, por ejemplo, enlazadores químicos. Preferiblemente, se pueden acoplar el enlazador químico del primer compuesto reactivo con tiol ("primer enlazador químico") y el enlazador químico del segundo compuesto reactivo con tiol ("segundo enlazador químico"). Por ejemplo, y sin intención de ser limitante, uno de los primeros o segundos enlazadores químicos puede ser dibencilciclo-octina (DBCO) y el otro de los primeros o segundos enlazadores químicos puede ser azida. En algunas realizaciones, por ejemplo, el primer enlazador químico puede ser DBCO y el segundo enlazador químico puede ser azida. A la inversa, el primer enlazador químico puede ser azida y el segundo enlazador químico puede ser DBCO. El DBCO y la azida se pueden acoplar, dando como resultado la conjugación de la primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina. Por ejemplo, la primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina pueden conjugarse entre sí mediante química de clic.
En una realización ejemplar, los compuestos reactivos con tiol pueden incluir maleimido-PEG4-azida y maleimido-PEG4-dibenzociclo-octina. En algunos aspectos, por ejemplo, el primer compuesto reactivo con tiol puede ser maleimido-PEG4-azida y el segundo compuesto reactivo con tiol puede ser maleimido-PEG4-dibenzociclo-octina. En algunos aspectos, por ejemplo, el primer compuesto reactivo con tiol puede ser maleimido-PEG4-dibenzociclo-octina y el segundo compuesto reactivo con tiol puede ser maleimido-PEG4-azida.
La primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina o ambas pueden ser Fabs. En algunas realizaciones, la primera inmunoglobulina puede ser un Fab ("primer Fab"). En algunas realizaciones, la segunda inmunoglobulina puede ser un Fab ("segundo Fab"). Aún en otras realizaciones, la primera inmunoglobulina puede ser un primer Fab y la segunda inmunoglobulina puede ser un segundo Fab.
En algunas realizaciones, los métodos comprenden generar un primer Fab, un segundo Fab o ambos, antes de la incubación. Técnicas adecuadas para generar Fabs se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, digerir una inmunoglobulina total o parcial para producir un Fab o expresar recombinantemente la inmunoglobulina como un Fab. Por ejemplo, los métodos para generar moléculas de unión a antígeno pueden comprender, además, antes de la incubación,
digerir una primera inmunoglobulina, una segunda inmunoglobulina, o ambas, con papaína para generar un primer Fab, un segundo Fab o un primer y un segundo Fab, en donde la primera inmunoglobulina comprende una primera cadena pesada y una primera cadena ligera, teniendo la primera cadena ligera una cisteína en la posición 80 ("Cys801"), y en donde la segunda inmunoglobulina comprende una segunda cadena pesada y una segunda cadena ligera, teniendo la segunda cadena ligera una cisteína en la posición 80 ("Cys802"); o
expresar recombinantemente un primer Fab que comprende una primera cadena pesada y una primera cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 (Cys801), expresar recombinantemente un segundo Fab que comprende una segunda cadena pesada y una segunda cadena ligera que tiene una cisteína en la posición 80 (Cys802), o ambos;
y conjugar el primer Fab en Cys801 con un primer compuesto reactivo con tiol para generar un primer Fab conjugado, conjugar el segundo Fab en Cys802 con un segundo compuesto reactivo con tiol para generar un segundo Fab conjugado, o ambos.
Los métodos para generar moléculas de unión a antígeno pueden comprender, además, sustituir un aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera con un residuo de aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys. Los métodos para generar moléculas de unión a antígeno pueden comprender, además, sustituir un aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera con un residuo de aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys. Los métodos para generar moléculas de unión a antígeno pueden comprender, además, sustituir un aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera con un residuo de aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys y sustituir un aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera con un residuo de aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys.
En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir un aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera, sustituir un aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera, o sustituir un aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera y la segunda región variable de la cadena ligera con alanina ("Ala83"), valina ("Val83"), isoleucina ("Ile83"), treonina ("Thr83"), arginina ("Arg83"), asparagina ("Asn83"), ácido aspártico ("Asp83"), ácido glutámico ("Glu83"), glutamina ("Gln83"), glicina ("Gly83"), histidina ("His83"), leucina ("Leu83"), metionina ("Met83"), prolina ("Pro83"), serina ("Ser83"), triptófano ("Trp83") o tirosina ("Tyr83").
El aminoácido en la posición 83 en la primera región variable de la cadena ligera puede ser el mismo que el aminoácido en la posición 83 en la segunda región variable de la cadena ligera. A la inversa, el aminoácido en la posición 83 en la primera región variable de la cadena ligera puede ser diferente del aminoácido polar o hidrófobo en la posición 83 en la segunda región variable de la cadena ligera. El aminoácido en la posición 83 distinto de Phe, Lys o Cys en la primera región variable de la cadena ligera y/o el aminoácido en la posición 83 distinto de Phe, Lys o Cys en la segunda región variable de la cadena ligera puede ser un aminoácido polar o hidrófobo que incluye, pero no se limita a alanina, valina, isoleucina o treonina. En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir un aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera, sustituir un aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera o sustituir un aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera y la segunda región variable de la cadena ligera con valina ("Val83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir un aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera, sustituir un aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera o sustituir un aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera y la segunda región variable de la cadena ligera con isoleucina ("Ile83"). En algunos aspectos, los métodos pueden comprender sustituir un aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera, sustituir un aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera o sustituir un aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera y la segunda región variable de la cadena ligera con treonina ("Thr83"). El aminoácido polar o hidrófobo en la posición 83 en la primera región variable de la cadena ligera puede ser igual o diferente del aminoácido polar o hidrófobo en la posición 83 en la segunda región variable de la cadena ligera.
Regiones variables de la cadena ligera adecuadas incluyen, por ejemplo, una región variable de la cadena ligera kappa. En algunas realizaciones, la Cys801, Cys802, o ambas, pueden estar presentes en la región variable de la cadena ligera nativa. La primera región variable de la cadena ligera y la segunda región variable de la cadena ligera se derivan de conejo. Conejos ejemplares de los que se puede derivar una primera región variable de la cadena ligera, una segunda región variable de la cadena ligera o ambas incluyen, pero no se limitan aOryctolagus cuniculus.En algunos aspectos, por ejemplo, la(s) región(es) variable(s) de la cadena ligera pueden derivarse de un conejo blanco de Nueva Zelanda (NZW). En otros aspectos, la(s) región(es) variable(s) de la cadena ligera puede derivarse de un conejo b9.
Componentes de inmunoglobulinas de inmunoglobulinas conjugadas
También se describen en esta memoria inmunoglobulinas que comprenden una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, teniendo la región variable de la cadena ligera una cisteína en la posición 80 ("Cys80") y un aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys en la posición 83.
Regiones variables de la cadena ligera adecuadas incluyen, por ejemplo, una región variable de la cadena ligera kappa. La región variable de la cadena ligera se deriva de conejo. En algunas realizaciones, la Cys80 puede estar presente en la región variable de la cadena ligera nativa de la inmunoglobulina de conejo. Conejos ejemplares de los que se puede derivar una región variable de la cadena ligera que tiene una Cys80 incluyen, pero no se limitan aOryctolagus cuniculus.En algunos aspectos, por ejemplo, la región variable de la cadena ligera puede derivarse de un conejo blanco de Nueva Zelanda (NZW). En otros aspectos, la región variable de la cadena ligera puede derivarse de un conejo b9.
El aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys en la posición 83 incluye alanina ("Ala83"), valina ("Val83"), isoleucina ("Ile83"), treonina ("Thr83"), arginina ("Arg83"), asparagina ("Asn83"), ácido aspártico ("Asp83"), ácido glutámico ("Glu83"), glutamina ("Gln83"), glicina ("Gly83"), histidina ("His83"), leucina ("Leu83"), metionina ("Met83"), prolina ("Pro83"), serina ("Ser83"), triptófano ("Trp83") o tirosina ("Tyr83").
En algunas realizaciones, el aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys en la posición 83 puede ser un aminoácido polar o hidrófobo que incluye, pero no se limita a alanina, valina, isoleucina o treonina. En algunos aspectos, el aminoácido polar o hidrófobo distinto de Phe en la posición 83 es alanina ("Ala83"). En algunos aspectos, el aminoácido polar o hidrófobo distinto de Phe en la posición 83 es valina ("Val83"). En algunos aspectos, el aminoácido polar o hidrófobo distinto de Phe en la posición 83 es isoleucina ("Ile83"). En algunos aspectos, el aminoácido polar o hidrófobo distinto de Phe en la posición 83 es treonina ("Thr83").
La Cys80 puede no estar apareada. Por ejemplo, una región variable de LA cadena ligera que tiene Cys80 se puede quimerizar con un dominio constante que tiene un residuo de aminoácido distinto de cisteína en la posición 171.
Preferiblemente, la Cys80 está desencapsulada.
En algunas realizaciones, la inmunoglobulina puede estar quimerizada. En realizaciones preferidas, la inmunoglobulina puede estar humanizada.
En alguna realización, la inmunoglobulina descrita se une inmunoespecíficamente a CA9 humana. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a CA9 humana comprende:
a. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-141 de xi155D5HC (SEQ ID NO:52) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -130 de xi155D5LC (SEQ ID NO:78);
b. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-144 de zu155D5HC (SEQ ID NO:54) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 of zu155D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zu155D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zu155D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zu155D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zu155D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO:102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO:104); o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEQ ID NO:106);
c. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-138 de xi1E4HC (SEQ ID NO:58) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -130 de xi1E4LC (SEQ ID NO:110);
d. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-140 de zu1 E4HC (SEQ ID NO:60) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -130 de zu1E4LC-CXXA (SEQ ID NO:114);
e. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-142 de xi166B3HC (SEQ ID NO:74) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -130 de xi166B3LC (SEQ ID NO:132); o
f. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-145 de zu166B3HC (SEQ ID NO:76) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -130 de zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:136).
En algunas realizaciones, la inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a CA9 humana comprende: a. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-141 de xi155D5HC (SEQ ID NO:52) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-130 de xi155D5LC (SEQ ID NO:78);
b. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-144 de zu155D5HC (SEQ ID NO:54) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-130 de zu155D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zu155D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zu155D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zu155D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zu155D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO:102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO:104); o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEQ ID NO:106);
c. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-138 de xi1 E4HC (SEQ ID NO:58) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20 -130 de xi1 E4LC (SEQ ID NO:110);
d. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-140 de zu1 E4HC (SEQ ID NO:60) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-130 de zu1 E4LC-CXXA (SEQ ID NO:114);
e. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-142 de xi166B3HC (SEQ ID NO:74) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-130 de xi166B3LC (SEQ ID NO:132); o
f. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-145 de zu166B3HC (SEQ ID NO:76) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-130 de zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:136).
En algunas realizaciones, la inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a CA9 humana comprende:
a. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi155D5HC como se recoge como SEQ ID NO: 146, 148 y 150, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi155D5LC como se recoge como SEQ ID NO: 224, 226 y 228, respectivamente;
b. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de zu155D5HC como se recoge como SEQ ID NO: 152, 154 y 156, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de zu155D5LC-3 como se recoge como S<e>Q ID NO: 242, 244 y 246, respectivamente, zu155D5LC-4 como se recoge como SEQ ID NO: 248, 250 y 252, respectivamente, zu155D5LC-5 como se recoge como SEQ ID NO: 254, 256 y 258, respectivamente, zu155D5LC -6 como se recoge como SEQ ID NO: 260, 262 y 264, respectivamente, zu155D5LC-7 como se recoge como SEQ ID NO: 266, 268 y 270, respectivamente, zu155D5LC-huVK2-40 como se recoge como SEQ ID NO 278, 280 y 282, respectivamente, zu155D5LC-huVK4-1 como se recoge como SEQ ID NO 290, 292 y 294, respectivamente, zu155D5LC-huVK6-21 como se recoge como SEQ ID NO 296, 298 y 300, respectivamente, zu155D5LC-huVK6D-41 como se recoge como SEQ ID NO 302, 304 y 306, respectivamente; o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 como se recoge como SEQ ID NO 308, 310 y 312, respectivamente;
c. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xilE4HC como se recoge como SEQ ID NO: 164, 166 y 168, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xilE4LC como se recoge como SEQ ID NO: 320, 322 y 324, respectivamente;
d. una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada de zu1E4HC como se recoge como SEQ ID NO: 170, 172 y 174, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de zu1 E4LC-CXXA como se recoge como s Eq ID NO: 332, 334 y 336, respectivamente;
e. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi166B3HC como se recoge como SEQ ID NO: 212, 214 y 216, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi166B3LC como se recoge como S<e>Q ID NO: 386, 388 y 390, respectivamente; o
f. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de zu166B3HC como se recoge como SEQ ID NO: 218, 220 y 222, respectivamente, y una CDR1, c Dr 2 y CDR3 de la cadena ligera de zu166B3LC-CXXA como se recoge como SEQ ID NO: 398, 400 y 402.
En algunas realizaciones, las inmunoglobulinas descritas se unen inmunoespecíficamente a TEM1 humana. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a TEM1 humano comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20 139 de xi1-55-2HC (SEQ ID NO:56) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-129 de xi1-55-2LC (SEQ ID NO:108).
En algunas realizaciones, la inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a TEMI humano comprende una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-139 de xi1-55-2HC (SEQ ID NO: 56) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como aminoácidos 20-129 de xi 1-55-2LC (SEQ ID NO:108).
En algunas realizaciones, la inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a TEM1 humano comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi1-55-2HC como se recoge en SEQ ID NO: 158, 160 y 162, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi1-55-2LC como se recoge en SEQ ID NO: 314, 316 y 318, respectivamente.
En algunas realizaciones, las inmunoglobulinas descritas se unen inmunoespecíficamente a mesotelina humana. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a mesotelina humana comprende:
a. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-142 de xi33O11HC (SEQ ID NO:62) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -131 de xi33O11LC (SEQ ID NO:116);
b. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-145 de zu33O11 HC (SEQ ID NO:64) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -131 de zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
c. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi324O5HC (SEQ ID NO:66) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124);
d. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi178F16HC (SEQ ID NO:68) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -127 de xi178F16Lc (SEQ ID NO: 126;
e. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-132 de xi237N18HC (SEQ ID NO:70) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -127 de xi237N18LC (SEQ ID NO:128); o
f. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi383I18HC (SEQ ID NO:72) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -127 de xi383I18L<c>(SEQ ID NO:130).
En algunas realizaciones, la inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a mesotelina humana comprende:
a. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-142 de xi33O11 HC (SEQ ID NO:62) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-131 de xi33O11 LC (SEQ ID NO:116);
b. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-145 de zu33O11 HC (SEQ ID NO:64) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-131 de zu33O11 LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33O11 LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
c. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-137 de xi324O5HC (SEQ ID NO:66) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124);
d. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-137 de xi178F16HC (SEQ ID NO:68) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-127 de xi178F16LC (SEQ ID NO:126);
e. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-132 de xi237N18HC (SEQ ID NO:70) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-127 de xi237N18LC (SEQ ID NO:128); o
f. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-137 de xi383I18HC (SEQ ID NO:72) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-127 de xi383I18LC (SEQ ID NO:130).
En algunas realizaciones, la inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a mesotelina humana comprende:
a. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi33O11HC como se recoge como SEQ ID NO: 176, 178 y 180, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi33O11LC como se recoge como SeQ ID NO: 338, 340 y 342, respectivamente;
b. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de zu33O11 HC como se recoge como SEQ ID NO: 182, 184 y 186, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de zu33O11 LC-CXXA como se recoge como SEQ ID NO:350, 352 y 354, respectivamente o zu33O11LC-CXXI como se recoge como SEQ ID NO:356, 358 y 360, respectivamente;
c. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi324O5HC como se recoge como SEQ ID NO: 188, 190 y 192, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi324O5LC como se recoge como SeQ ID NO: 362, 364 y 366, respectivamente;
d. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi178F16HC como se recoge como SEQ ID NO: 194, 196 y 198, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi178F16LC como se recoge como SEQ ID NO: 368, 370 y 372, respectivamente;
e. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi237N18HC como se recoge como SEQ ID NO: 200, 202 y 204, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi237N18LC como se recoge como SeQ ID NO: 374, 376 y 378, respectivamente; o
f. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi383I18HC como se recoge como SEQ ID NO: 206, 208 y 210, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi383I18LC como se recoge como SeQ ID NO: 380, 382 y 384, respectivamente.
Inmunoglobulinas conjugadas
En esta memoria se describen también inmunoglobulinas conjugadas que comprenden cualquiera de las inmunoglobulinas descritas en esta memoria, en donde la cisteína en la posición 80 ("Cys80") está conjugada con un compuesto reactivo con tiol, comprendiendo el compuesto reactivo con tiol un grupo reactivo con tiol.
En algunas realizaciones, las inmunoglobulinas conjugadas comprenden una inmunoglobulina que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, teniendo la región variable de la cadena ligera una Cys80 y un aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys en la posición 83, en donde Cys80 está conjugada con un compuesto reactivo con tiol, comprendiendo el compuesto reactivo con tiol un grupo reactivo con tiol. En algunas realizaciones, la región variable de la cadena ligera puede tener una Cys80 y un aminoácido polar o hidrófobo distinto de Phe, Lys o Cys en la posición 83.
La inmunoglobulina comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera. Regiones variables de la cadena ligera adecuadas incluyen, por ejemplo, una región variable de la cadena ligera kappa. La región variable de la cadena ligera se deriva de conejo. En algunas realizaciones, la Cys80 puede estar presente en la región variable de la cadena ligera nativa de la inmunoglobulina de conejo. Conejos ejemplares de los que se puede derivar una región variable de la cadena ligera que tiene una Cys80 incluyen, pero no se limitan aOryctolagus cuniculus.En algunos aspectos, por ejemplo, la región variable de la cadena ligera puede derivarse de un conejo blanco de Nueva Zelanda (NZW). En otros aspectos, la región variable de la cadena ligera puede derivarse de un conejo b9.
La región variable de la cadena ligera puede tener una Cys80 y un aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys en la posición 83. El aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys en la posición 83 incluye alanina ("Ala83"), valina ("Val83"), isoleucina ("Ile83"), treonina ("Thr83"), arginina ("Arg83"), asparagina ("Asn83"), ácido aspártico ("Asp83"), ácido glutámico ("Glu83"), glutamina ("Gln83"), glicina ("Gly83"), histidina ("His83"), leucina ("Leu83"), metionina ("Met83"), prolina ("Pro83"), serina ("Ser83"), triptófano ("Trp83") o tirosina ("Tyr83"). En algunas realizaciones, la región variable de la cadena ligera puede tener una Cys80 y un aminoácido polar o hidrófobo distinto de Phe, Lys o Cys en la posición 83. Aminoácidos polares o hidrófobos adecuados incluyen, pero no se limitan a alanina, valina, isoleucina o treonina. En algunos aspectos, el aminoácido polar o hidrófobo distinto de Phe en la posición 83 es alanina ("Ala83"). En algunos aspectos, el aminoácido polar o hidrófobo distinto de Phe en la posición 83 es valina ("Val83"). En algunos aspectos, el aminoácido polar o hidrófobo distinto de Phe en la posición 83 es isoleucina ("Ile83"). En algunos aspectos, el aminoácido polar o hidrófobo distinto de Phe en la posición 83 es treonina ("Thr83").
La Cys80 puede no estar apareada. Por ejemplo, una región variable de la cadena ligera que tiene Cys80 se puede quimerizar con un dominio constante que tiene un residuo de aminoácido distinto de cisteína en la posición 171.
Preferiblemente, la Cys80 está desencapsulada.
En algunas realizaciones, la inmunoglobulina puede estar quimerizada. En otras realizaciones, la inmunoglobulina puede estar humanizada.
Preferiblemente, el compuesto reactivo con tiol se conjuga en Cys80 a través del grupo reactivo con tiol. Grupos reactivos con tiol incluyen haloacetilos, maleimidas, aziridinas, acriloilos, agentes arilantes, vinilsulfonas, disulfuros de piridilo, TNB-tioles y agentes reductores de disulfuro. En algunas realizaciones, el grupo reactivo con tiol puede comprender una maleimida. En algunas realizaciones, el grupo reactivo con tiol puede comprender un haloacetilo. En algunas realizaciones, el grupo reactivo con tiol puede comprender una aziridina. En algunas realizaciones, el grupo reactivo con tiol puede comprender un acriloílo. En algunas realizaciones, el grupo reactivo con tiol puede comprender un agente arilante. En algunas realizaciones, el grupo reactivo con tiol puede comprender una vinilsulfona. En algunas realizaciones, el grupo reactivo con tiol puede comprender un disulfuro de piridilo. En algunas realizaciones, el grupo reactivo con tiol puede comprender un TNB-tiol. En algunas realizaciones, el grupo reactivo con tiol puede comprender un agente reductor de disulfuro.
El grupo reactivo con tiol se puede añadir a un enlazador. Los enlazadores pueden ser enlazadores no escindibles o enlazadores escindibles. Enlazadores ejemplares incluyen, por ejemplo, enlazadores que contienen disulfuro, enlazadores basados en acetal y enlazadores basados en cetal. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador no escindible. Enlazadores no escindibles adecuados incluyen, pero no se limitan a polietilenglicol (PEG) o un alquilo. En algunas realizaciones, el enlazador puede comprender PEG. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador escindible. Enlazadores escindibles adecuados incluyen, por ejemplo, valina-citrulina-para aminobencilo. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador que contiene disulfuro. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador basado en acetal. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador basado en cetal. Se proporcionan ejemplos de enlazadores unidos covalentemente a un grupo reactivo con tiol, por ejemplo, en la Publ. de Ee .UU. N° 20140050746.
El compuesto reactivo con tiol puede comprender, además, un agente funcional. Agentes funcionales adecuados incluyen, por ejemplo, fluoróforos, colorantes fluorescentes, polipéptidos, inmunoglobulinas, antibióticos, ácidos nucleicos, radionucleidos, enlazadores químicos, moléculas pequeñas, quelantes, lípidos y fármacos. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un fluoróforo. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un colorante fluorescente. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un polipéptido. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender una inmunoglobulina. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un antibiótico. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un ácido nucleico (tal como ADN o ARN). En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un radionucleido. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un enlazador químico (por ejemplo, dibencilciclo-octino (DBCO) o azida). En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender una molécula pequeña. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un quelante (por ejemplo, DOTA, CHX-A"-DTPA, NOTA, entre otros). En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un lípido. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un fármaco. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender una combinación de cualquiera de los agentes funcionales arriba enumerados.
Por consiguiente, las inmunoglobulinas conjugadas descritas incluyen: conjugados de inmunoglobulina-fluoróforo en Cys80, conjugados de inmunoglobulina-colorante fluorescente en Cys80, conjugados de inmunoglobulina-polipéptido en Cys80, conjugados de inmunoglobulina-inmunoglobulina en Cys80, conjugados de inmunoglobulina-antibiótico en Cys80, conjugados de inmunoglobulina-ácido nucleico en Cys80, conjugados de inmunoglobulina-radionucleido en Cys80, conjugados de inmunoglobulina-enlazador químico en Cys80, conjugados de inmunoglobulina-Cys80 de molécula pequeña, conjugados de inmunoglobulina-quelante en Cys80, conjugados de inmunoglobulina-lípido en Cys80 y conjugados de inmunoglobulina-fármaco en Cys80.
Cualquiera de las inmunoglobulinas descritas en esta memoria puede conjugarse con cualquiera de los agentes funcionales descritos en esta memoria. Por ejemplo, la inmunoglobulina conjugada puede comprender una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a CA9 humana y un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionucleido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido o fármaco. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de CA9-fluoróforo en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado CA9-colorante fluorescente en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de CA9-polipéptido en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de CA9-inmunoglobulina en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de CA9-antibiótico en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de Ca9-ácido nucleico en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de CA9-radionucleido en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de CA9-enlazador químico en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de CA9-molécula pequeña en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de CA9-quelante en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de CA9-lípido en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de CA9-fármaco en Cys80.
Inmunoglobulinas adecuadas que se unen inmunoespecíficamente a CA9 humana y que pueden conjugarse en Cys80 con cualquiera de los agentes funcionales anteriores incluyen:
a. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-141 de xi155D5HC (SEQ ID NO:52) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -130 de xi155D5LC (SEQ ID NO:78);
b. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-144 de zu155D5HC (SEQ ID NO:54) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de zu155D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zu155D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zu155D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zu155D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zu155D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO: 102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO: 104); o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEQ ID NO: 106;
c. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-138 de xi1E4HC (SEQ ID NO:58) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -130 de xi1E4LC (SEQ ID NO: 110;
d. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-140 de zu1 E4HC (SEQ ID NO:60) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -130 de zu1E4LC-CXXA (SEQ ID NO:114);
e. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-142 de xi166B3HC (SEQ ID NO:74) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -130 de xi166B3LC (SEQ ID NO:132);
f. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-145 de zu166B3HC (SEQ ID NO:76) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -130 de zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:136);
g. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-141 de xi155D5HC (SEQ ID NO:52) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-130 de xi155D5LC (SEQ ID NO:78);
h. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-144 de zu155D5HC (SEQ ID NO:54) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-130 de zu155D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zu155D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zu155D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zu155D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zu155D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO:102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO:104); o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEQ ID NO:106);
i. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-138 de xi1 E4HC (SEQ ID NO:58) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20 -130 de xi1 E4LC (SEQ ID NO:110);
j. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-140 de zu1 E4HC (SEQ ID NO:60) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-130 de zu1 E4LC-CXXA (SEQ ID NO:114);
k. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-142 de xi166B3HC (SEQ ID NO:74) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-130 de xi166B3LC (SEQ ID NO:132);
l. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-145 de zu166B3HC (SEQ ID NO:76) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-130 de zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:. 136;
m. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de x1155D5HC como se recoge como SEQ ID NO: 146, 148 y 150, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi155D5LC como se recoge como SEQ ID NO: 224, 226 y 228, respectivamente;
n. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de zu155D5HC como se recoge como SEQ ID NO: 152, 154 y 156, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de zu155D5LC-3 como se recoge como SeQ ID NO: 242, 244 y 246, respectivamente, zu155D5LC-4 como se recoge como SEQ ID NO: 248, 250 y 252, respectivamente, zu155D5LC-5 como se recoge como SEQ ID NO: 254, 256 y 258, respectivamente, zu155D5LC -6 como se recoge como SEQ ID NO: 260, 262 y 264, respectivamente, zu155D5LC-7 como se recoge como SEQ ID NO: 266, 268 y 270, respectivamente, zu155D5LC-huVK2-40 como se recoge como SEQ ID NO 278, 280 y 282, respectivamente, zu155D5LC-huVK4-1 como se recoge como SEQ ID NO 290, 292 y 294, respectivamente, zu155D5LC-huVK6-21 como se recoge como SEQ ID NO 296, 298 y 300, respectivamente, zu155D5LC-huVK6D-41 como se recoge como SEQ ID NO 302, 304 y 306, respectivamente; o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 como se recoge como SEQ ID NO 308, 310 y 312, respectivamente;
o. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xilE4HC como se recoge como SEQ ID NO: 164, 166 y 168, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi1 E4LC como se recoge como SEQ ID NO: 320, 322 y 324, respectivamente;
p. una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada de zu1 E4HC como se recoge como SEQ ID NO: 170, 172 y 174, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de zu1 E4LC-CXXA como se recoge como SEQ ID NO: 332, 334 y 336, respectivamente;
q. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi166B3HC como se recoge como SEQ ID NO: 212, 214 y 216, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi166B3LC como se recoge como SEQ ID NO: 386, 388 y 390, respectivamente; o
r. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de zu166B3HC como se recoge como SEQ ID NO: 218, 220 y 222, respectivamente, y una CDR1, c Dr 2 y CDR3 de la cadena ligera de zu166B3LC-CXXA como se recoge como s Eq ID NO: 398, 400 y 402, respectivamente.
La inmunoglobulina conjugada puede comprender una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a TEM1 humano y un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionucleido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido o fármaco. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de TEM1-fluoróforo en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina es un conjugado de TEM1-colorante fluorescente en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de TEM1-polipéptido en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de TEM1-inmunoglobulina en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de TEM1-antibiótico en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de TEM1 -ácido nucleico en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de TEM1-radionucleido en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de TEM1-enlazador químico en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de TEM1-molécula pequeña en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de TEM1-quelante en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de TEM1-lípido en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de TEM1-fármaco en Cys80.
Inmunoglobulinas adecuadas que se unen inmunoespecíficamente a TEM1 humana y que pueden conjugarse en Cys80 con cualquiera de los agentes funcionales anteriores incluyen:
a. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-139 de xi1-55-2HC (SEQ ID NO:56) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -129 de xi1-55-2LC (SEQ ID NO: 108;
b. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-139 de xi1-55-2HC (SEQ ID NO:56) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-129 de xi1-55-2LC (SEQ ID NO: 108); o
c. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi1-55-2HC como se recoge como SEQ ID NO: 158, 160 y 162, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi1-55-2LC como se recoge como S<e>Q ID NO: 314, 316 y 318, respectivamente.
La inmunoglobulina conjugada puede comprender una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a MSLN humana y un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionucleido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido o fármaco. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de MSLN-fluoróforo en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de MSLN-colorante fluorescente en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de MSLN-polipéptido en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de MSLN-inmunoglobulina en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de MSLN-antibiótico en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de MSLN-ácido nucleico en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de MSLN-radionucleido en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de MSLN-enlazador químico en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de MSLN-molécula pequeña en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de MSLN-quelante en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de MSLN-lípido en Cys80. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina conjugada es un conjugado MSLN-fármaco en Cys80.
Inmunoglobulinas adecuadas que se unen inmunoespecíficamente a MSLN humana y que pueden conjugarse en Cys80 con cualquiera de los agentes funcionales anteriores incluyen:
a. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-142 de xi33O11HC (SEQ ID NO:62) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -131 de xi33O11LC (SEQ ID NO:116);
b. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-145 de zu33O11 HC (SEQ ID NO:64) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -131 de zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
c. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi324O5HC (SEQ ID NO:66) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124);
d. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi178F16HC (SEQ ID NO:68) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -127 de xi178F16L<c>(SEQ ID NO: 126;
e. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-132 de xi237N18HC (SEQ ID NO:70) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi237N18LC (SEQ ID NO:128);
f. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi383I18HC (SEQ ID NO:72) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi383I18LC (SEQ ID NO:130);
g. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-142 de xi33O11 HC (SEQ ID NO:62) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-131 de xi33O11 LC (SEQ ID NO:116);
h. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-145 de zu33O11 HC (SEQ ID NO:64) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-131 de zu33O11 LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33O11 LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
i. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-137 de xi324O5HC (SEQ ID NO:66) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124);
j. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-137 de xi178F16HC (SEQ ID NO:68) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-127 de xi178F16LC (SEQ ID NO:126);
k. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-132 de xi237N18HC (SEQ ID NO:70) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-127 de xi237N18LC (SEQ ID NO:128);
l. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-137 de xi383I18HC (SEQ ID NO:72) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-127 de xi383I18LC (SEQ ID NO:130).
m. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi33O11HC como se recoge como SEQ ID NO: 176, 178 y 180, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi33O11LC como se recoge como SEQ ID NO: 338, 340 y 342, respectivamente;
n. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de zu33O11 HC como se recoge como SEQ ID NO: 182, 184 y 186, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de zu33O11 LC-CXXA como se recoge como SEQ ID NO:350, 352 y 354, respectivamente o zu33O11LC-CXXI como se recoge como SEQ ID NO:356, 358 y 360, respectivamente;
o. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi324O5HC como se recoge como SEQ ID NO: 188, 190 y 192, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi324O5LC como se recoge como SeQ ID NO: 362, 364 y 366, respectivamente;
p. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi178F16HC como se recoge como SEQ ID NO: 194, 196 y 198, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi178F16LC como se recoge como SEQ ID NO: 368, 370 y 372, respectivamente;
q. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi237N18HC como se recoge como SEQ ID NO: 200, 202 y 204, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi237N18LC como se recoge como S<e>Q ID NO: 374, 376 y 378, respectivamente; o
r. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi383I18HC como se recoge como SEQ ID NO: 206, 208 y 210, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi383I18LC como se recoge como SEQ ID NO: 380, 382 y 384, respectivamente.
En algunas realizaciones, la inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a MSLN humana se puede conjugar con un agente antineoplásico de molécula pequeña tal como auristatina. En algunos aspectos, el agente funcional puede ser auristatina F (AuF). Por lo tanto, las inmunoglobulinas conjugadas descritas incluyen cualquiera de las inmunoglobulinas arriba descritas que se unen inmunoespecíficamente a MSLN humana, en donde la inmunoglobulina está conjugada con auristatina F (conjugado de MSLN-AuF en Cys80).
En realizaciones en las que la inmunoglobulina comprende dos regiones variables de la cadena ligera, la inmunoglobulina conjugada puede tener una relación inmunoglobulina:agente funcional de 2:1, teniendo cada una de las cadenas ligeras un agente funcional conjugado en Cys80.
Moléculas de unión a antígenos
Además se describen en esta memoria moléculas de unión a antígeno que comprenden:
una primera inmunoglobulina conjugada que comprende una primera región variable de la cadena pesada y una primera región variable de la cadena ligera, teniendo la primera región variable de la cadena ligera una cisteína en la posición 80 ("Cys801"), en donde Cys801 está conjugada en un primer compuesto reactivo con tiol que comprende un primer grupo reactivo con tiol, y
una segunda inmunoglobulina conjugada comprende una segunda región variable de la cadena pesada y una segunda región variable de la cadena ligera, teniendo la segunda región variable de la cadena ligera una cisteína en la posición 80 ("Cys802"), en donde Cys802 está conjugada en un segundo compuesto reactivo con tiol que comprende un segundo grupo reactivo con tiol.
La primera inmunoglobulina conjugada y la segunda inmunoglobulina conjugada pueden ser una cualquiera de las inmunoglobulinas conjugadas descritas en esta memoria.
Regiones variables de la cadena ligera adecuadas incluyen, por ejemplo, una región variable de la cadena ligera kappa. La primera región variable de la cadena ligera y la segunda región variable de la cadena ligera se derivan de conejo. En algunas realizaciones, la Cys801, Cys802, o ambas, pueden estar presentes en la región variable de la cadena ligera nativa de la inmunoglobulina de conejo. Conejos ejemplares de los que se puede derivar una primera región variable de la cadena ligera, una segunda región variable de la cadena ligera o ambas incluyen, pero no se limitan aOryctolagus cuniculus.En algunos aspectos, por ejemplo, la(s) región(es) variable(s) de la cadena ligera pueden derivarse de un conejo blanco de Nueva Zelanda (NZW). En otros aspectos, la(s) región(es) variable(s) de la cadena ligera puede derivarse de un conejo b9.
La Cys801, la Cys802, o ambas pueden estar no apareadas. Medios adecuados para desaparear Cys801 y/o Cys802 incluyen, por ejemplo, quimerizar una región variable de la cadena ligera (una primera región variable de la cadena ligera, una segunda región variable de la cadena ligera, o ambas) que tiene una Cys80 con un dominio constante que tiene un residuo aminoácido distinto de cisteína en la posición 171.
Se pueden quimerizar la primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina o ambas. En algunas realizaciones, la primera inmunoglobulina puede estar quimerizada. En algunas realizaciones, la segunda inmunoglobulina puede estar quimerizada. En algunas realizaciones, la primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina pueden estar quimerizadas.
Se pueden humanizar la primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina o ambas. En algunas realizaciones, la primera inmunoglobulina puede estar humanizada. En algunas realizaciones, la segunda inmunoglobulina puede estar humanizada. En algunas realizaciones, la primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina pueden estar humanizadas.
En algunas realizaciones, la primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina pueden estar humanizadas. En algunas realizaciones, la primera inmunoglobulina puede estar humanizada y la segunda inmunoglobulina puede estar quimerizada.
El aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera puede ser un aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys si el aminoácido en la posición 83 es Phe El aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera puede ser un aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys si el aminoácido en la posición 83 es Phe. El aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera puede ser un aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys si el aminoácido en la posición 83 es Phe y el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera puede ser un aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys si el aminoácido en la posición 83 es Phe. El aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera y/o la segunda región variable de la cadena ligera puede ser alanina ("Ala83"), valina ("Val83"), isoleucina ("Ile83"), treonina ("Thr83"), arginina ("Arg83"), asparagina ("Asn83"), ácido aspártico ("Asp83"), ácido glutámico ("Glu83"), glutamina ("Gln83"), glicina ("Gly83"), histidina ("His83"), leucina ("Leu83"), metionina ("Met83"), prolina ("Pro83"), serina ("Ser83"), triptófano ("Trp83") o tirosina ("Tyr83"). El aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera puede ser el mismo que el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera. A la inversa, el aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera puede ser diferente del aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera.
En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera puede ser un residuo polar o hidrófobo distinto de Phe si el aminoácido en la posición 83 es Phe. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera puede ser un aminoácido distinto de Phe si el aminoácido en la posición 83 es Phe. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera puede ser un residuo polar o hidrófobo distinto de Phe, si el aminoácido en la posición 83 es Phe y el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera puede ser un residuo polar o hidrófobo distinto de Phe, si el aminoácido en la posición 83 es Phe. Aminoácidos polares o hidrófobos adecuados incluyen, pero no se limitan a alanina, valina, isoleucina o treonina. En algunos aspectos, el aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera, el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera o el aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera y el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera puede ser alanina ("Ala83"). En algunos aspectos, el aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera, el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera o el aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera y el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera puede ser valina ("Val83"). En algunos aspectos, el aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera, el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera o el aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera y el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera puede ser isoleucina ("Ile83"). En algunos aspectos, el aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera, el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera o el aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera y el aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera puede ser treonina ("Thr83"). El aminoácido polar o hidrófobo en la posición 83 en la primera región variable de la cadena ligera puede ser igual o diferente del aminoácido polar o hidrófobo en la posición 83 en la segunda región variable de la cadena ligera.
La primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina pueden unirse a los mismos antígenos. En algunos aspectos, la primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina pueden unirse al mismo epítopo del mismo antígeno. En algunos aspectos, la primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina pueden unirse a diferentes epítopos del mismo antígeno. En algunas realizaciones, por ejemplo, la primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina pueden ser una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a CA9 humana, en donde la primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina o ambas están conjugadas con uno cualquiera de un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionucleido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido o fármaco. En algunas realizaciones, la primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina pueden ser una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a TEMI humano, en donde la primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina o ambas están conjugadas en uno cualquiera de un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionucleido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido o fármaco. En algunas realizaciones, la primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina pueden ser una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a MSLN humana, en donde la primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina o ambas están conjugadas en uno cualquiera de un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionucleido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido o fármaco.
La primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina pueden unirse a diferentes antígenos. En algunas realizaciones, por ejemplo, la primera inmunoglobulina conjugada puede ser una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a CA9 humana, en donde la primera inmunoglobulina que se une a CA9 humana está conjugada en uno cualquiera de un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionucleido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido o fármaco, mientras que la segunda inmunoglobulina puede ser una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a TEM1 humano o MSLN humana. En realizaciones de este tipo, la segunda inmunoglobulina se puede conjugar en uno cualquiera de un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionucleido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido o fármaco. En algunas realizaciones, la primera inmunoglobulina conjugada puede ser una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a TEM1 humano, en donde la inmunoglobulina está conjugada en uno cualquiera de un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionucleido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido o fármaco, mientras que la segunda inmunoglobulina puede ser una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a CA9 humana o a MSLN humana. En realizaciones de este tipo, la segunda inmunoglobulina se puede conjugar en uno cualquiera de un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionucleido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido o fármaco. En algunas realizaciones, la primera inmunoglobulina conjugada puede ser una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a MSLN humana, en donde la inmunoglobulina está conjugada en uno cualquiera de un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionucleido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido o fármaco, mientras que la segunda inmunoglobulina puede ser una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a CA9 humana o TEM1 humano. En realizaciones de este tipo, la segunda inmunoglobulina se puede conjugar en uno cualquiera de un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionucleido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido o fármaco.
De manera adecuada, grupos reactivos con tiol incluyen haloacetilos, maleimidas, aziridinas, acriloilos, agentes arilantes, vinilsulfonas, disulfuros de piridilo, TNB-tioles y agentes reductores de disulfuro. En algunas realizaciones, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender una maleimida. En algunas realizaciones, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un haloacetilo. En algunas realizaciones, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender una aziridina. En algunas realizaciones, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un acriloilo. En algunas realizaciones, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un agente arilante. En algunas realizaciones, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender una vinilsulfona. En algunas realizaciones, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un disulfuro de piridilo. En algunas realizaciones, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un TNB-tiol. En algunas realizaciones, el primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender un agente reductor de disulfuro.
El primer grupo reactivo con tiol, el segundo grupo reactivo con tiol, o ambos, pueden agregarse a un enlazador. En algunos aspectos, el primer grupo reactivo con tiol se puede agregar a un enlazador ("primer enlazador"). En algunos aspectos, el segundo grupo reactivo con tiol se puede agregar a un enlazador ("segundo enlazador"). Aún en otros aspectos, el primer grupo reactivo con tiol se puede agregar a un primer enlazador y el segundo grupo reactivo con tiol se puede agregar a un segundo enlazador. Primeros y segundos enlazadores adecuados pueden ser enlazadores no escindibles o enlazadores escindibles. Primeros y segundos enlazadores ejemplares incluyen, por ejemplo, enlazadores que contienen disulfuro, enlazadores basados en acetal y enlazadores basados en cetal. En algunos aspectos, el primer enlazador, el segundo enlazador o ambos pueden ser un enlazador no escindible. Enlazadores no escindibles adecuados incluyen, pero no se limitan a polietilenglicol (PEG) o un alquilo. En algunos aspectos, el primer enlazador, el segundo enlazador o ambos pueden comprender PEG. En algunos aspectos, el primer enlazador, el segundo enlazador o ambos pueden ser un enlazador escindible. Enlazadores escindibles adecuados incluyen, por ejemplo, valina-citrulina-para aminobencilo. En algunos aspectos, el primer enlazador, el segundo enlazador o ambos pueden ser un enlazador que contiene disulfuro. En algunos aspectos, el primer enlazador, el segundo enlazador o ambos pueden ser un enlazador basado en acetal. En algunos aspectos, el primer enlazador, el segundo enlazador o ambos pueden ser un enlazador basado en cetal. Se proporcionan ejemplos de enlazadores unidos covalentemente a un grupo reactivo con tiol, por ejemplo, en la Publ. de EE.UU. N° 20140050746.
El primer compuesto reactivo con tiol, el segundo compuesto reactivo con tiol, o ambos, pueden comprender, además, un agente funcional. En algunos aspectos, el primer compuesto reactivo con tiol puede comprender, además, un agente funcional ("primer agente funcional"). En algunos aspectos, el segundo compuesto reactivo con tiol puede comprender, además, un agente funcional ("segundo agente funcional"). Aún en otros aspectos, el primer compuesto reactivo con tiol puede comprender, además, un primer agente funcional y el segundo compuesto reactivo con tiol puede comprender, además, un segundo agente funcional.
Agentes funcionales adecuados incluyen, por ejemplo, enlazadores químicos. Preferiblemente, se pueden acoplar el enlazador químico del primer compuesto reactivo con tiol ("primer enlazador químico") y el enlazador químico del segundo compuesto reactivo con tiol ("segundo enlazador químico"). Por ejemplo, y sin intención de ser limitante, uno de los primeros o segundos enlazadores químicos puede ser dibencilciclo-octina (DBCO) y el otro de los primeros o segundos enlazadores químicos puede ser azida. En algunas realizaciones, por ejemplo, el primer enlazador químico puede ser DBCO y el segundo enlazador químico puede ser azida. A la inversa, el primer enlazador químico puede ser azida y el segundo enlazador químico puede ser DBCO. El DBCO y la azida se pueden acoplar, dando como resultado la conjugación de la primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina. Por ejemplo, la primera inmunoglobulina y la segunda inmunoglobulina pueden conjugarse entre sí mediante química de clic.
En una realización ejemplar, los compuestos reactivos con tiol pueden incluir maleimido-PEG4-azida y maleimido-PEG4-dibenzociclo-octina. En algunos aspectos, por ejemplo, el primer compuesto reactivo con tiol puede ser maleimido-PEG4-azida y el segundo compuesto reactivo con tiol puede ser maleimido-PEG4-dibenzociclo-octina. En algunos aspectos, por ejemplo, el primer compuesto reactivo con tiol puede ser maleimido-PEG4-dibenzociclo-octina y el segundo compuesto reactivo con tiol puede ser maleimido-PEG4-azida. Por lo tanto, el primer compuesto reactivo con tiol puede diferir del segundo compuesto reactivo con tiol.
La primera inmunoglobulina, la segunda inmunoglobulina o ambas pueden ser Fabs. En algunas realizaciones, la primera inmunoglobulina puede ser un Fab ("primer Fab"). En algunas realizaciones, la segunda inmunoglobulina puede ser un Fab ("segundo Fab"). Aún en otras realizaciones, la primera inmunoglobulina puede ser un primer Fab y la segunda inmunoglobulina puede ser un segundo Fab.
Métodos de tratamiento del cáncer en un sujeto
También se describen en esta memoria métodos para tratar el cáncer en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de una inmunoglobulina de mesotelina conjugada, en los que la inmunoglobulina de mesotelina conjugada comprende:
cualquiera de las inmunoglobulinas de mesotelina conjugadas descritas en esta memoria, y
un compuesto reactivo con tiol que comprende un grupo reactivo con tiol, un enlazador y un agente funcional.
Debe entenderse que cualquiera de las características, rasgos y aspectos relacionados con las inmunoglobulinas conjugadas descritas son igualmente aplicables a las inmunoglobulinas conjugadas utilizadas en los métodos descritos para tratar el cáncer. Por consiguiente, los métodos descritos pueden comprender administrar al sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de una inmunoglobulina mesotelina conjugada, en donde la inmunoglobulina mesotelina conjugada comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, teniendo la región variable de la cadena ligera una cisteína en la posición 80 ("Cys80") y un aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys en la posición 83, en donde la Cys80 está conjugada en un compuesto reactivo con tiol, comprendiendo el compuesto reactivo con tiol un grupo reactivo con tiol, un enlazador y un agente funcional. En algunos aspectos, el aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys en la posición 83 es un aminoácido polar o hidrófobo.
Preferiblemente, el cáncer es un cáncer que expresa mesotelina. En algunos aspectos, los anticuerpos conjugados para uso en los métodos descritos pueden comprender:
a. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-142 de xi33O11HC (SEQ ID NO:62) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -131 de xi33011LC (SEQ ID NO:116);
b. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-145 de zu33O11 HC (SEQ ID NO:64) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -131 de zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
c. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi324O5HC (SEQ ID NO:66) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124);
d. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi178F16HC (SEQ ID NO:68) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -127 de xi178F16Lc (SEQ ID NO: 126);
e. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-132 de xi237N18HC (SEQ ID NO:70) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -127 de xi237N18LC (SEQ ID NO:128); o
f. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi383I18HC (SEQ ID NO:72) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -127 de xi383I18Lc (SEQ ID NO:130).
Los anticuerpos (a)-(f) se pueden conjugar en varios compuestos reactivos con tiol adecuados, incluyendo, pero no limitados a aquellos que tienen un agente antineoplásico, tal como una auristatina, como agente funcional. Por lo tanto, en algunos aspectos, los métodos pueden comprender administrar al sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de una inmunoglobulina conjugada, en donde la inmunoglobulina conjugada comprende una o más de las inmunoglobulinas (a)-(f), estando cada una conjugada en un compuesto reactivo con tiol. que comprende auristatina F, en donde el compuesto reactivo con tiol está conjugado en la región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina en la Cys80.
En algunos aspectos, los anticuerpos conjugados para uso en los métodos descritos pueden comprender:
a. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-142 de xi33O11HC (SEQ ID NO:62) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-131 de xi33O11LC (SEQ ID NO:116);
b. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-145 de zu33O11 HC (SEQ ID NO:64) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-131 de zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
c. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-137 de xi324O5HC (SEQ ID NO:66) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124);
d. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-137 de xi178F16HC (SEQ ID NO:68) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-127 de xi178F16LC (SEQ ID NO:126);
e. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-132 de xi237N18HC (SEQ ID NO:70) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-127 de xi237N18LC (SEQ ID NO:128); o
f. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-137 de xi383I18HC (SEQ ID NO:72) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-127 de xi383I18LC (SEQ ID NO: 130).
Los anticuerpos (a)-(f) se pueden conjugar en varios compuestos reactivos con tiol adecuados, incluyendo, pero no limitados a aquellos que tienen un agente antineoplásico, tal como una auristatina, como agente funcional. Por lo tanto, en algunos aspectos, los métodos pueden comprender administrar al sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de una inmunoglobulina conjugada, en donde la inmunoglobulina conjugada comprende una o más de las inmunoglobulinas (a)-(f), estando cada una conjugada en un compuesto reactivo con tiol. que comprende auristatina F, en donde el compuesto reactivo con tiol está conjugado en la región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina en la Cys80.
En algunos aspectos, los anticuerpos conjugados para uso en los métodos descritos pueden comprender:
a. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi33O11 HC como se recoge como SEQ ID NO: 176, 178 y 180, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi33O11 LC como se recoge como S<e>Q ID NO: 338, 340 y 342, respectivamente;
b. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de zu33O11 HC como se recoge como SEQ ID NO: 182, 184 y 186, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de zu33O11 LC-CXXA como se recoge como SEQ ID NO:350, 352 y 354, respectivamente o zu33O11LC-CXXI como se recoge como SEQ ID NO:356, 358 y 360, respectivamente;
c. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi324O5HC como se recoge como SEQ ID NO: 188, 190 y 192, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi324O5LC como se recoge como S<e>Q ID NO: 362, 364 y 366, respectivamente;
d. una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada de xi178F16HC como se recoge como SEQ ID NO: 194, 196 y 198, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi178F16LC como se recoge como SeQ ID NO: 368, 370 y 372, respectivamente;
e. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi237N18HC como se recoge como SEQ ID NO: 200, 202 y 204, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi237N18LC como se recoge como SeQ ID NO: 374, 376 y 378, respectivamente; o
f. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi383I18HC como se recoge como SEQ ID NO: 206, 208 y 210, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi383I18LC como se recoge como SeQ ID NO: 380, 382 y 384, respectivamente.
Los anticuerpos (a)-(f) se pueden conjugar en varios compuestos reactivos con tiol adecuados, incluyendo, pero no limitados a aquellos que tienen un agente antineoplásico, tal como una auristatina, como agente funcional. Por lo tanto, en algunos aspectos, los métodos pueden comprender administrar al sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de una inmunoglobulina conjugada, en donde la inmunoglobulina conjugada comprende una o más de las inmunoglobulinas (a)-(f), estando cada una conjugada en un compuesto reactivo con tiol. que comprende auristatina F, en donde el compuesto reactivo con tiol está conjugado en la región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina en la Cys80.
Métodos para detectar el cáncer
También se describen en esta memoria métodos para detectar cáncer en un sujeto. En algunos aspectos, los métodos se pueden realizar en el sujeto. Por ejemplo, los métodos pueden comprender administrar al sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de una inmunoglobulina conjugada, en donde la inmunoglobulina conjugada comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, teniendo la región variable de la cadena ligera una cisteína en la posición 80 ("Cys80") y un aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys en la posición 83, en donde la Cys80 está conjugada en un compuesto reactivo con tiol, comprendiendo el compuesto reactivo con tiol un grupo reactivo con tiol, un enlazador y un agente funcional. En algunos aspectos, el aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys en la posición 83 es un aminoácido polar o hidrófobo.
Alternativamente, los métodos se pueden realizar en una muestra biológica obtenida del sujeto. Por ejemplo, los métodos pueden comprender poner en contacto una muestra biológica con una inmunoglobulina conjugada, en donde la inmunoglobulina conjugada comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, teniendo la región variable de la cadena ligera una cisteína en la posición 80 ("Cys80") y un aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys en la posición 83, en donde la Cys80 está conjugada en un compuesto reactivo con tiol, comprendiendo el compuesto reactivo con tiol un grupo reactivo con tiol, un enlazador y un agente funcional. El aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys en la posición 83 es uno polar o hidrófobo. En algunos aspectos, los métodos se pueden realizarex vivo.En algunos aspectos, los métodos se pueden realizarin vivo.
El agente funcional es un fluoróforo o colorante fluorescente.
Cualquiera de las inmunoglobulinas descritas en esta memoria puede conjugarse en un fluoróforo o colorante fluorescente y utilizarse en los métodos descritos para detectar cáncer. En algunos aspectos, el cáncer es un cáncer que expresa CA9 y la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de CA9-fluoróforo en Cys80 o un conjugado de CA9-colorante fluorescente en Cys80, que comprende:
a. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-141 de xi155D5HC (SEQ ID NO:52) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -130 de xi155D5LC (SEQ ID NO:78);
b. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-144 de zu155D5HC (SEQ ID NO:54) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 of zu155D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zu155D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zu155D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zu155D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zu155D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO:102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO:104); o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEQ ID NO:106);
c. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-138 de xi1E4HC (SEQ ID NO:58) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de xi1E4LC (SEQ ID NO:110);
d. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-140 de zu1 E4HC (SEQ ID NO:60) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de zu1E4LC-CXXA (SEQ ID NO:114);
e. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-142 de xi166B3HC (SEQ ID NO:74) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -130 de xi166B3LC (SEQ ID NO:132);
f. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-145 de zu166B3HC (SEQ ID NO:76) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:136);
g. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-141 de xi155D5HC (SEQ ID NO:52) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-130 de xi155D5LC (SEQ ID NO:78);
h. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-144 de zu155D5HC (SEQ ID NO:54) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-130 de zu155D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zu155D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zu155D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zu155D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zu155D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO: 102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO: 104); o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEQ ID NO: 106;
i. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-138 de xi1 E4HC (SEQ ID NO:58) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-130 de xi1 E4LC (SEQ ID NO: 110;
j. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-140 de zu1 E4HC (SEQ ID NO:60) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-130 de zu1 E4LC-CXXA (SEQ ID NO: 114;
k. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-142 de xi166B3HC (SEQ ID NO:74) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-130 de xi166B3LC (SEQ ID NO: 132;
l. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-145 de zu166B3HC (SEQ ID NO:76) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-130 de zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:. 136;
m. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi155D5HC como se recoge como SEQ ID NO: 146, 148 y 150, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi155D5LC como se recoge como SEQ ID NO: 224, 226 y 228, respectivamente;
n. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de zu155D5HC como se recoge como SEQ ID NO: 152, 154 y 156, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de zu155D5LC-3 como se recoge como SeQ ID NO: 242, 244 y 246, respectivamente, zu155D5LC-4 como se recoge como SEQ ID NO: 248, 250 y 252, respectivamente, zu155D5LC-5 como se recoge como SEQ ID NO: 254, 256 y 258, respectivamente, zu155D5LC -6 como se recoge como SEQ ID NO: 260, 262 y 264, respectivamente, zu155D5LC-7 como se recoge como SEQ ID NO: 266, 268 y 270, respectivamente, zu155D5LC-huVK2-40 como se recoge como SEQ ID NO 278, 280 y 282, respectivamente, zu155D5LC-huVK4-1 como se recoge como SEQ ID NO 290, 292 y 294, respectivamente, zu155D5LC-huVK6-21 como se recoge como SEQ ID NO 296, 298 y 300, respectivamente, zu155D5LC-huVK6D-41 como se recoge como SEQ ID NO 302, 304 y 306, respectivamente; o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 como se recoge como SEQ ID NO 308, 310 y 312, respectivamente;
o. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi1E4HC como se recoge como SEQ ID NO: 164, 166 y 168, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi1E4LC como se recoge como SEQ ID NO: 320, 322 y 324, respectivamente;
p. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de zu1 E4HC como se recoge como SEQ ID NO: 170, 172 y 174, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de zu1 E4LC-CXXA como se recoge como s Eq ID NO: 332, 334 y 336, respectivamente;
q. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi166B3HC como se recoge como SEQ ID NO: 212, 214 y 216, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi166B3LC como se recoge como SEQ ID NO: 386, 388 y 390, respectivamente; o
r. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de zu166B3HC como se recoge como SEQ ID NO: 218, 220 y 222, respectivamente, y una CDR1, c Dr 2 y CDR3 de la cadena ligera de zu166B3LC-CXXA como se recoge como<s>E<q>ID NO: 398, 400 y 402, respectivamente.
En algunos aspectos, el cáncer es un cáncer que expresa TEM-1 y la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de TEM-1-fluoróforo en Cys80 o un conjugado de TEM-1-colorante fluorescente en Cys80, que comprende:
a. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-139 de xi1-55-2HC (SEQ ID NO:56) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-129 de xi1-55-2LC (SEQ ID NO: 108);
b. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-139 de xi1-55-2HC (SEQ ID NO:56) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-129 de xi1-55-2LC (SEQ ID NO: 108); o
c. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi1-55-2HC como se recoge como SEQ ID NO: 158, 160 y 162, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi1-55-2LC como se recoge como S<e>Q ID NO: 314, 316 y 318, respectivamente.
En algunos aspectos, el cáncer es un cáncer que expresa MSLN y la inmunoglobulina conjugada es un conjugado de MSLN-fluoróforo en Cys80 o un conjugado de MSLN-colorante fluorescente en Cys80, que comprende:
a. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-142 de xi33O11HC (SEQ ID NO:62) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -131 de xi33O11LC (SEQ ID NO:116);
b. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-145 de zu33O11 HC (SEQ ID NO:64) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-131 de zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
c. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi324O5HC (SEQ ID NO:66) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124);
d. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi178F16HC (SEQ ID NO:68) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -127 de xi178F16Lc (SEQ ID NO: 126;
e. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-132 de xi237N18Hc (SEQ ID NO:70) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi237N18LC (SEQ ID NO:128);
f. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi383I18HC (SEQ ID NO:72) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-127 de xi383I18LC (SEQ ID NO:130);
g. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-142 de xi33O11HC (SEQ ID NO:62) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-131 de xi33O11LC (SEQ ID NO:116);
h. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-145 de zu33O11 HC (SEQ ID NO:64) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-131 de zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
i. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-137 de xi324O5HC (SEQ ID NO:66) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124);
j. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-137 de xi178F16HC (SEQ ID NO:68) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-127 de xi178F16LC (SEQ ID NO: 126;
k. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-132 de xi237N18HC (SEQ ID NO:70) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-127 de xi237N18LC (SEQ ID NO: 128;
l. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-137 de xi383I18HC (SEQ ID NO:72) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-127 de xi383I18LC (SEQ ID NO: 130;
m. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi33O11 HC como se recoge como SEQ ID NO: 176, 178 y 180, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi33O11LC como se recoge como SEQ ID NO: 338, 340 y 342, respectivamente;
n. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de zu33O11 HC como se recoge como SEQ ID NO: 182, 184 y 186, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de zu33O11 LC-CXXA como se recoge como SEQ ID NO:350, 352 y 354, respectivamente o zu33O11 LC-CXXI como se recoge como SEQ ID NO:356, 358 y 360, respectivamente;
o. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi324O5HC como se recoge como SEQ ID NO: 188, 190 y 192, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi324O5LC como se recoge como SEQ ID NO: 362, 364 y 366, respectivamente;
p. una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada de xi178F16HC como se recoge como SEQ ID NO: 194, 196 y 198, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi178F16LC como se recoge como SEQ ID NO: 368, 370 y 372, respectivamente;
q. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi237N18HC como se recoge como SEQ ID NO: 200, 202 y 204, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi237N18LC como se recoge como SeQ ID NO: 374, 376 y 378, respectivamente; o
r. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi383I18HC como se recoge como SEQ ID NO: 206, 208 y 210, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi383I18LC como se recoge como SeQ ID NO: 380, 382 y 384, respectivamente.
Fluoróforos ejemplares para la conjugación con la inmunoglobulina incluyen, por ejemplo, IRDye-800CW.
Los métodos pueden comprender administrar la inmunoglobulina conjugada al sujeto o poner en contacto la muestra biológica con la inmunoglobulina conjugada y detectar la unión de la inmunoglobulina conjugada a un antígeno (CA9, TEM1 o MSLN) presente en el sujeto o en la muestra biológica, respectivamente. Métodos de detección adecuados incluyen, por ejemplo, formación de imágenes fluorescentes. La detección de la unión de la inmunoglobulina conjugada al antígeno (a través de la emisión de una señal fluorescente, por ejemplo) es indicativa de cáncer.
Composiciones farmacéuticas
También se proporcionan en esta memoria composiciones farmacéuticas. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden comprender cualquiera de las inmunoglobulinas descritas en esta memoria. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden comprender cualquiera de las inmunoglobulinas conjugadas descritas en esta memoria.
La administración de una inmunoglobulina conjugada de acuerdo con los métodos de tratamiento o diagnóstico descritos en esta memoria puede ser por cualquier medio conocido en la técnica.
Regiones variables de cadenas ligeras para uso en inmunoglobulinas conjugadas
También se describen en esta memoria regiones variables de la cadena ligera para uso en una inmunoglobulina conjugada, teniendo la región variable de la cadena ligera una cisteína en la posición de aminoácido 80 ("Cys80") y un residuo de aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys en la posición de aminoácido 83, en donde la Cys80 no está apareada. En algunos aspectos, el aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys en la posición 83 es un aminoácido polar o hidrófobo.
En aspectos preferidos, la cadena ligera tiene un motivo Cys80-Xaa1-Xaa2-Xaa3, en donde Xaas es un aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys.
Regiones variables de la cadena ligera adecuadas incluyen, por ejemplo, una región variable de la cadena ligera kappa. La región variable de la cadena ligera se deriva de conejo. En algunos aspectos, la Cys80 puede estar presente en la región variable de la cadena ligera nativa de la inmunoglobulina de conejo. Conejos ejemplares de los que se puede derivar una región variable de la cadena ligera que tiene una Cys80 incluyen, pero no se limitan aOryctolagus cuniculus.En algunos aspectos, por ejemplo, la región variable de la cadena ligera puede derivarse de un conejo blanco de Nueva Zelanda (NZW). En otros aspectos, la región variable de la cadena ligera puede derivarse de un conejo b9.
La Cys80 puede estar desencapsulada, puede estar implicada en un enlace disulfuro intramolecular o intermolecular, o puede tener una cisteína encapsulante.
En algunos aspectos, la región variable de la cadena ligera puede estar quimerizada. En otros aspectos, la región variable de la cadena ligera puede estar humanizada.
La región variable de la cadena ligera puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en:
a. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 90 % a los aminoácidos 20-130 de xi155D5LC (SEQ ID NO:78);
b. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de zu155D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zu155D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zu155D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zu155D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zu155D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO:102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO:104); o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEQ ID NO:106);
c. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 90 % a los aminoácidos 20-130 de xi1 E4LC (SEQ ID NO:110);
d. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 90 % a los aminoácidos 20-130 de zu1 E4LC-CXXA (SEQ ID NO:114);
e. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 90 % a los aminoácidos 20-130 de xi166B3LC (SEQ ID NO:132);
f. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 90 % a los aminoácidos 20-130 de zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:136);
g. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 90 % a los aminoácidos 20-129 de xi1 -55-2L<c>(SEQ ID NO:108);
h. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 90 % a los aminoácidos 20-131 de xi33O11LC (SEQ ID NO:116);
i. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 90 % a los aminoácidos 20-131 de zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
j. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 90 % a los aminoácidos 20-127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124);
k. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 90 % a los aminoácidos 20-127 de xi178F16LC (SEQ ID NO:126);
l. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 90 % a los aminoácidos 20-127 de xi237N18LC (SEQ ID NO:128); o
m. una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 90 % a los aminoácidos 20-127 de xi383I18LC (SEQ ID NO:130).
Moléculas de ácido nucleico que codifican inmunoglobulinas y células huésped que comprenden las mismas
También se describen en esta memoria moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las inmunoglobulinas arriba descritas. En algunos aspectos, las moléculas de ácido nucleico codifican una inmunoglobulina que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, teniendo la región variable de la cadena ligera una cisteína en la posición 80 ("Cys80") y un aminoácido distinto de Phe, Lys, o Cys en la posición 83. En algunos aspectos, el aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys en la posición 83 es un aminoácido polar o hidrófobo.
Las moléculas de ácido nucleico descritas pueden codificar una inmunoglobulina que puede unirse inmunoespecíficamente a CA9 humana. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico codifica:
a. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-141 de xi155D5HC (SEQ ID NO:52) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de xi155D5LC (SEQ ID NO:78);
b. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-144 de zu155D5HC (SEQ ID NO:54) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 of zu155D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zu155D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zu155D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zu155D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zu155D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO:102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO:104); o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEQ ID NO:106);
c. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-138 de xi1 E4HC (SEQ ID NO:58) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de xi1E4LC (SEQ ID NO:110);
d. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-140 de zu1 E4HC (SEQ ID NO:60) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de zu1E4LC-CXXA (SEQ ID NO:114);
e. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-142 de xi166B3HC (SEQ ID NO:74) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-130 de xi166B3LC (SEQ ID NO:132); o
f. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-145 de zu166B3HC (SEQ ID NO:76) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -130 de zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:136).
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico codifica:
a. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-141 de xi155D5HC (SEQ ID NO:52) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-130 de xi155D5LC (SEQ ID NO:78);
b. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-144 de zu155D5HC (SEQ ID NO:54) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-130 de zu155D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zu155D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zu155D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zu155D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zu155D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO:102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO:104); o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEQ ID NO:106);
c. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-138 de xi1 E4HC (SEQ ID NO:58) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20 -130 de xi1 E4LC (SEQ ID NO:110);
d. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-140 de zu1 E4HC (SEQ ID NO:60) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-130 de zu1 E4LC-CXXA (SEQ ID NO:114);
e. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-142 de xi166B3HC (SEQ ID NO:74) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-130 de xi166B3LC (SEQ ID NO:132); o
f. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-145 de zu166B3HC (SEQ ID NO:76) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-130 de zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:136).
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico codifica:
a. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi155D5HC como se recoge como SEQ ID NO: 146, 148 y 150, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi155D5LC como se recoge como SEQ ID NO: 224, 226 y 228, respectivamente;
b. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de zu155D5HC como se recoge como SEQ ID NO: 152, 154 y 156, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de zu155D5LC-3 como se recoge como SeQ ID NO: 242, 244 y 246, respectivamente, zu155D5LC-4 como se recoge como SEQ ID NO: 248, 250 y 252, respectivamente, zu155D5LC-5 como se recoge como SEQ ID NO: 254, 256 y 258, respectivamente, zu155D5LC -6 como se recoge como SEQ ID NO: 260, 262 y 264, respectivamente, zu155D5LC-7 como se recoge como SEQ ID NO: 266, 268 y 270, respectivamente, zu155D5LC-huVK2-40 como se recoge como SEQ ID NO 278, 280 y 282, respectivamente, zu155D5LC-huVK4-1 como se recoge como SEQ ID NO 290, 292 y 294, respectivamente, zu155D5LC-huVK6-21 como se recoge como SEQ ID NO 296, 298 y 300, respectivamente, zu155D5LC-huVK6D-41 como se recoge como SEQ ID NO 302, 304 y 306, respectivamente; o zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 como se recoge como SEQ ID NO 308, 310 y 312, respectivamente;
c. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi1 E4HC como se recoge como SEQ ID NO: 164, 166 y 168, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi1E4LC como se recoge como SEQ ID NO: 320, 322 y 324, respectivamente;
d. una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada de zu1 E4HC como se recoge como SEQ ID NO: 170, 172 y 174, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de zu1 E4LC-CXXA como se recoge como SEQ ID NO: 332, 334 y 336, respectivamente;
e. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi166B3HC como se recoge como SEQ ID NO: 212, 214 y 216, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi166B3LC como se recoge como SeQ ID NO: 386, 388 y 390, respectivamente; o
f. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de zu166B3HC como se recoge como SEQ ID NO: 218, 220 y 222, respectivamente, y una CDR1, c Dr 2 y CDR3 de la cadena ligera de zu166B3LC-CXXA como se recoge como SEQ ID NO: 398, 400 y 402.
Las moléculas de ácido nucleico descritas pueden codificar una inmunoglobulina que puede unirse inmunoespecíficamente a TEM1 humana. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico codifica una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-139 de xi1-55-2HC (SEQ Id NO:56) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-129 de xi1-55-2LC (SEQ ID NO: 108). En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico codifica una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-139 de xi1 -55-2HC (SEQ ID NO:56) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-129 de xi1 -55-2LC (SEQ ID NO: 108). En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico codifica una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi1 -55-2HC como se recoge como SEQ ID NO: 158, 160 y 162, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi1-55-2LC como se recoge como SEQ ID NO: 314, 316 y 318, respectivamente.
Las moléculas de ácido nucleico descritas pueden codificar una inmunoglobulina que puede unirse inmunoespecíficamente a MSLN humana. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico codifica:
a. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-142 de xi33O11HC (SEQ ID NO:62) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-131 de xi33O11LC (SEQ ID NO:116);
b. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-145 de zu33O11HC (SEQ ID NO:64) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -131 de zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
c. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi324O5HC (SEQ ID NO:66) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124);
d. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi178F16HC (SEQ ID NO:68) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -127 de xi178F16Lc (SEQ ID NO: 126);
e. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-132 de xi237N18HC (SEQ ID NO:70) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -127 de xi237N18LC (SEQ ID NO:128); o
f. una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20-137 de xi383I18HC (SEQ ID NO:72) y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a los aminoácidos 20 -127 de xi383I18L<c>(SEQ ID NO:130).
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico codifica:
a. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-142 de xi33O11 HC (SEQ ID NO:62) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-131 de xi33O11LC (SEQ ID NO:116);
b. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-145 de zu33O11 HC (SEQ ID NO:64) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-131 de zu33O11 LC-CXXA (SEQ ID NO:120) o zu33O11 LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
c. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-137 de xi324O5HC (SEQ ID NO:66) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-127 de xi324O5LC (SEQ ID NO:124);
d. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-137 de xi178F16HC (SEQ ID NO:68) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-127 de xi178F16LC (SEQ ID NO:126);
e. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-132 de xi237N18HC (SEQ ID NO:70) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-127 de xi237N18LC (SEQ ID NO:128); o
f. una región variable de la cadena pesada como se recoge como los aminoácidos 20-137 de xi383I18HC (SEQ ID NO:72) y una región variable de la cadena ligera como se recoge como los aminoácidos 20-127 de xi383I18LC (SEQ ID NO:130).
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico codifica:
a. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi33O11 HC como se recoge como SEQ ID NO: 176, 178 y 180, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi33O11 LC como se recoge como S<e>Q ID NO: 338, 340 y 342, respectivamente;
b. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de zu33O11 HC como se recoge como SEQ ID NO: 182, 184 y 186, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de zu33O11 LC-CXXA como se recoge como SEQ ID NO:350, 352 y 354, respectivamente o zu33O11 LC-CXXI como se recoge como SEQ ID NO:356, 358 y 360, respectivamente;
c. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi324O5HC como se recoge como SEQ ID NO: 188, 190 y 192, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi324O5LC como se recoge como SEQ ID NO: 362, 364 y 366, respectivamente;
d. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi178F16HC como se recoge como SEQ ID NO: 194, 196 y 198, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi178F16LC como se recoge como SEQ ID NO: 368, 370 y 372, respectivamente;
e. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi237N18HC como se recoge como SEQ ID NO: 200, 202 y 204, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi237N18LC como se recoge como SeQ ID NO: 374, 376 y 378, respectivamente; o
f. una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de xi383I18HC como se recoge como SEQ ID NO: 206, 208 y 210, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de xi383I18LC como se recoge como SEQ ID NO: 380, 382 y 384, respectivamente.
También se describen células huésped que comprenden cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas. Células huésped adecuadas incluyen, pero no se limitan a células de mamífero, células bacterianas, células de levadura, células de insecto, por nombrar unas pocas.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir adicionalmente algunas de las realizaciones descritas en esta memoria. Los ejemplos pretenden ilustrar, no limitar, las realizaciones descritas.
EJEMPLOS
Ejemplo 1- Métodos Ejemplares
Generación de mAbs de conejo específicos para TEMI humano (endosialina/CD248)
Inmunización de conejos: Para generar mAbs de conejo específicos para TEM1 humano (hTEM1), se preparó una proteína de fusión del dominio extracelular de endosialina humana-Fc de ratón ("dominio extracelular de endosialina humana/TEM1 fusionado a Fc de IgG2b de ratón"). El dominio extracelular de hTEM1 se clonó en marco EcoRI/Hpal en pEF6-EK-IgG2b, que contenía un sitio de escisión de enteroquinasa seguido del fragmento Fc gamma de IgG2b murino. Se transfectaron células CHO-K1 con esta construcción y se seleccionaron con 5 pg/mL de blasticidina. La TEM1-Fc secretada se sometió a electroforesis en un gel PAGE al 4-12 % y se tiñó con Coomassie, seguido de la escisión de las bandas. Las rodajas de gel se emulsionaron en adyuvante completo/incompleto y se inyectaron en conejos blancos de Nueva Zelanda cada 3 a 4 semanas, cuatro inyecciones. Se recogió el bazo de un conejo que mostraba los mejores títulos contra hTEM1 según lo evaluado mediante ELISA para la generación de hibridomas.
Generación de hibridomas: Las fusiones se realizaron de la siguiente manera: células del bazo (1,5-3 x 108) de conejos inmunizados y el participante en la fusión 240E 1 -1 -2 se fusionaron en una relación de 2:1 con PEG 4000 al 50 % (E<m>Science, Cherry Hill, NJ) a 37 °C en medio sin suero. Las células se sembraron en placas de microtitulación de 48 pocillos, a razón de aproximadamente 2x105 células de bazo por pocillo, en medio con FCS al 15 %. Después de 72 h, se añadió hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT). El medio se cambió cada 5-6 días. Los sobrenadantes se detectaron mediante ELISA en cuanto a la presencia de anticuerpos específicos para TEM-1 utilizando placas recubiertas con TEM1-Fc y se contra-detectaron contra Fc de ratón. Se detectaron los sobrenadantes de los hibridomas para determinar la reactividad de hTEM1 mediante ELISA y se eligió el clon 1-55-2 para la clonación recombinante.
Amplificación de regiones variables de la cadena ligera y pesada anti-hTEM1 1-55-2: Se aisló ARN del hibridoma 1 55-2 de conejo utilizando el mini kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). Se utilizaron dos pg de ARN para RT-PCR utilizando el sistema de RT-PCR de un solo paso SuperScript III con Platinum Taq High Fidelity (Invitrogen). Los fragmentos del gen de la cadena pesada variable y de la cadena ligera completa de conejo se amplificaron utilizando los pares de cebadores N02937/N02898 y N02937/N02347, respectivamente (Tabla 1). Los parámetros de ciclación para la amplificación por RT-PCR fueron los siguientes: 55 °C 30 min; 94 °C 2 min; 30 ciclos de (94 °C 15 s, 55 °C 30 s, 68 °C 1 min); 68 °C 2 min.
Estos productos de PCR se utilizaron posteriormente en una segunda ronda de PCR para amplificar fragmentos susceptibles de generar IgGs quiméricas de conejo/ser humano utilizando los pares de cebadores N02416/N02761 y N02417/N02764 (Tabla 1). Los parámetros de ciclación para la segunda ronda de PCR fueron los siguientes: 94 °C 2 min; 30 ciclos de (94 °C 30 s, 55 °C 30 s, 68 °C 1 min); 68 °C 2 min,
Tabla 1.Cebadores utilizados para RT-PCR clonación de anti-hTEM1 1 -55-2
Luego los productos de la PCR se separaron mediante electroforesis en un gel de agarosa. Los productos de la PCR que tenían los tamaños moleculares correctos para los productos VL y VH se purificaron mediante el kit de extracción en gel QIAquick® (Qiagen, Valencia, CA) y se clonaron como se describe más adelante.
Generación de mAbs de conejo específicos para CA9 humana
Inmunización de conejos: Para generar anticuerpos de conejo específicos para CA9 humana, se generó de forma recombinante el dominio extracelular de CA9 humana ("dominio extracelular de CA9 humana" o "CA9-ECD"). Se inmunizaron dos conejos b9 utilizando CA9-ECD. Brevemente, a los conejos se les inyectaron los antígenos por vía subcutánea cada 21 días. Cada uno de los conejos recibió 400 gg de CA9-ECD y adyuvante completo de Freund (FCA) en la primera inyección y 200 gg de CA9-ECD y adyuvante incompleto de Freund (FIA) en los refuerzos posteriores. Se recogieron el sangrado previo y de prueba para la prueba del título de anticuerpos.
La sangre previa y posterior a la inmunización se analizó para determinar la unión de CA9 utilizando un ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) como se describe en esta memoria. Los sangrados se diluyeron en serie y se añadieron a microplacas recubiertas de proteína CA9-ECD. Cuando el título alcanzó 1: 15.000 después de cuatro inyecciones, los conejos finalmente recibieron un refuerzo mediante una inyección intravenosa de 400 gg de CA9-ECD sin adyuvante. Se recogieron bazos de conejo una semana después del refuerzo final. Se recogieron hasta 100 mL de sangrado de desangramiento en presencia de anticoagulante y se aislaron los linfocitos del bazo y los ganglios linfáticos de cada uno de los conejos.
Generación de hibridomas: Los esplenocitos de conejo se descongelaron rápidamente, se centrifugaron a 1200 rpm a temperatura ambiente durante 5 min y se resuspendieron en cIMDM más FBS al 10 % que contenía 100 gg/mL de DNasa. Las células se estimularon con 2,5 gg/mL de mitógeno de Phytolacca americana a 37 °C durante al menos 1 hora. Después de la estimulación, las células se centrifugaron a 1200 rpm a temperatura ambiente durante 5 min y se resuspendieron en medio nuevo. Se determinaron los recuentos celulares y la viabilidad.
Las células participantes en la fusión CBF7 se descongelaron y se cultivaron a 37 °C con 5 % de CO2 durante una semana antes de la fusión. Se mezcló una cantidad adecuada de esplenocitos de conejo y células participantes en la fusión CBF7 en la relación deseada (1: 1,55 ~ 1:4) en tubos de 50 mL. La mezcla de células se centrifugó a 1000 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos y se lavó dos veces con 20 ml de medio CytoPulse Fusion enfriado con hielo (CPFM Fórmula C: CytoPulse Sciences #LCM-C) a 4 °C. Las células se resuspendieron en CPFM a razón de 106 células/mL.
Para la fusión se utilizó el aparato de fusión de células CytoPulse CEEF-50 (CytoPulse Sciences). Se movió un volumen apropiado de células a la cámara de fusión y se realizó la fusión activando la conexión de alta tensión. Después de la fusión, las células se incubaron en la cámara a TA (temperatura ambiente) durante 5 min, se resuspendieron suavemente en medio de Post-Fusion (RPMI1640 con FBS al 10 %, que contenía glutamato, piruvato, aminoácidos no esenciales, p-mercaptoetanol, penicilina, estreptomicina y sin rojo fenol) y luego se transfirió a un matraz. La cámara se lavó con el mismo volumen de medio de Post-Fusion para obtener células adicionales. Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 25 min y luego durante la noche a 37 °C, 5 % de CO2.
Un día después de la fusión, las células se diluyeron en medio de siembra precalentado (cIMDM más FBS al 10 % que contenía 1X hipoxantina-aminopterina-timidina) hasta la densidad deseada (35.000 células/mL) y se sembraron en placas a razón de 200 pL/pocillo en microplacas de 96 pocillos. Las placas se incubaron a 37 °C, 5 % de CO2 y se alimentaron con medio fresco semanalmente durante 3-4 semanas.
Detección de mAbs anti-CA9: Se fusionaron células B de esplenocitos de conejo con células participantes en la fusión CBF7 para generar hibridomas como se describe en esta memoria. Cuatro semanas después de sembrar las células en placas, se recogieron y rastrearon los sobrenadantes de los cultivos de hibridoma individuales utilizando un ELISA específico para CA9. Las placas de ensayo (placa transparente de 384 pocillos Greiner Bio-One High Binding, n° de catálogo 655081) se recubrieron con 1 pg/ml de CA9 ECD durante la noche a 4 °C y se bloquearon con tampón de ensayo 1X (PBS más BSA al 1 %, que contiene Tween-20 al 0,05 %). Luego, se añadieron 25 pL/pocillo de sobrenadantes y controles a las placas bloqueadas y se incubaron durante la noche a 4 °C. Las placas de ensayo se lavaron tres veces y se añadieron a las placas 25 pL/pocillo de anticuerpos secundarios (IgG anti-ratón de cabra conjugada con HRP, Jackson n° 115-035-146) diluidos a razón de 1:10.000 en tampón de ensayo. Después de la incubación a temperatura ambiente durante una hora, las placas de ensayo se lavaron tres veces y se añadieron a las placas 25 pL/pocillo de sustrato TMB (KPL n° 52-000-04). Después de la incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos, se añadieron 25 pL/pocillo de solución de parada 1X (1:10 H2SO4, VWR n° EM-SX1244-75). La absorbancia de la muestra a 450 nm se midió utilizando un lector de placas Paradigm (Beckman). Los resultados positivos de la detección primaria fueron confirmados mediante un segundo ELISA específico para CA9.
Clonación y mutagénesis
Amplificación de regiones VH y Vkde mAbs CA9 y hTEM1: Se lisaron células de hibridoma que secretan mAbs de conejo de interés para extraer ARN. Luego se utilizó ARN para la amplificación de ADN de regiones variables kappa (Vk) y variables de la cadena pesada (VH) utilizando el método de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). Se lavaron de cien a 10.000 células de hibridoma cultivadas con PBS enfriado con hielo y se lisaron añadiendo 100 pL de solución de lisis/unión (Ambion, 8540G5) y pipeteando. Las células lisadas se congelaron rápidamente en hielo seco. El ARN se aisló con el kit Ambion RNAqueous de acuerdo con el procedimiento de fabricación. Se sometieron aproximadamente 5 ng de ARN a la primera ronda de RT-PCR utilizando los cebadores enumerados en la Tabla 2 en cada reacción.
T l 2.r iliz r l rim r r n RT-P R
Los parámetros de ciclación para la amplificación por RT-PCR fueron los siguientes: 55 °C 30 min; 95 °C 2 min; 30 ciclos de (94 °C 1 min, 55 °C 50 s, 68 °C 1,5 min); 68 °C 10 min.
Los productos de la primera ronda de RT-PCR se sometieron a una segunda ronda de amplificación por PCR en una reacción separada para la cadena pesada y la cadena ligera, utilizando los cebadores enumerados en la Tabla 3.
Tabla 3.Cebadores utilizados para la segunda ronda de amplificación por PCR
Cadena Pesada
Idr-Rabb. VHA1.F gccaccggcgtgcactccCAGTCGGTGRAGGAGTCCRGGGG (SEQ ID NO: 16)
R-Rb-VH1-hu- gggcccttggtggatgcTGARGAGAYGGTGACCAGGGTGCC (SEQ ID NO: 17)
gamma
Cadena Ligera
Los parámetros de ciclación para la segunda ronda de amplificación por PCR fueron los siguientes: 95 °C 5 min; 40 ciclos de (94 °C 1 min, 54 °C 50 s, 68 °C 1,5 min); 68 °C 10 min; Remojo a 4 °C.
Luego los productos de la PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Los productos de la PCR que tenían los tamaños moleculares correctos para los productos VL y VH se purificaron mediante el kit de extracción en gel QIAquick® (Qiagen, Valencia, CA) y los fragmentos se subclonaron en un plásmido de expresión que contenía una región constante gamma (Cy) o kappa (Ck) humana, utilizando un kit de clonación InFusion HD (Clontech). Todos los clones fueron secuenciados para confirmar la presencia y fidelidad de las inserciones.
Síntesis de genes: Dominios VH humanizados y dominios zu155D5LC-1, -huVK1 -39, - huVK2-40, -huVK3-11, -huVK4-1, -huVK5-2, -huVK6-21, -huVK6D-41, -huVK7-3, zu1 E4LC-1 y zu166B3LC-1 Vk, se optimizaron con codones para su expresión en células humanas y se sintetizaron mediante<d>N<a>2.0. Los dominios variables se sintetizaron con una secuencia de Kozak y una secuencia conductora de Ig, e incluyeron 15 pares de bases en los extremos 5' y 3' homólogos al sitio de clonación dentro del vector de subclonación. Después de la escisión del vector ADN 2.0, los fragmentos se subclonaron en un plásmido de expresión que contenía una región Cyo Ckhumana utilizando un kit de clonación InFusion HD. Todos los clones fueron secuenciados para confirmar la presencia y fidelidad de las inserciones.
OuikChange: La mutagénesis de los dominios Vkoptimizados por codones se realizó utilizando QuikChange XL de Stratagene de acuerdo con el protocolo del fabricante. Todos los clones fueron secuenciados para confirmar la presencia de la mutación.
Cultivo Celular
Transfección y generación de líneas celulares estables: Un día antes de la transfección, se sembraron células 293F a razón de 6,0x105 células/mL en medio 293FreeStyle (Thermo Fisher Scientific) en un matraz con agitación y se incubaron a 37 °C, 8 % de CO2, con agitando a 125 rpm. El día de la transfección, las células se sembraron a razón de 1x106 células/mL como anteriormente. Las células se transfectaron utilizando PEI (25 kDa, lineal; Polysciences) o ExpiFectamine (Thermo Fisher Scientific). Para las transfecciones de PEI, se incubaron 166,7 ng de plásmido HC, 166,7 ng de plásmido LC, 2,2 pg de PEI y 50 pL de OptiPro (Thermo Fisher Scientific) por mL de células transfectadas durante 15 min a 22 °C. La mezcla de ADN:PEI se añadió a las células mientras se agitaban y se incubaron a 37 °C, 8 % de CO2. agitando a 125 rpm. Después de 48-72 h, las células se alimentaron con una concentración final de 10 g/L de levaduratolato (BD Biosciences), ácido valérico 5 mM (Sigma Aldrich) y concentrado de lípidos CD 1 :100 (Thermo Fisher Scientific).
Para cada mL de células que se han de transfectar con ExpiFectamine, se incubaron 333,3 ng de plásmido HC y 333,3 ng de plásmido LC durante 10 min en 50 pL de Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific). Asimismo, se incubaron 2,67 pL de ExpiFectamine en 50 pL de Opti-MEM. La solución de ExpiFectamine se añadió a la mezcla de ADN y se incubó durante 30 min a 22 °C. La mezcla de ADN:ExpiFectamine se añadió a las células mientras se agitaban y se incubaron a 37 °C, 8% de CO2, agitando a 125 rpm. Al día siguiente, se añadieron a la transfección 3 pL de potenciador 1 y 30 pL de potenciador 2 por mL de células y se continuó incubando durante otros 7 o 10 días, dependiendo de la densidad celular.
Se seleccionaron agrupaciones estables que expresan anticuerpos añadiendo 3 mL de transfectantes a 12 mL de DMEM en un matraz T75 con 5 pg/mL de blasticidina y 400 pg/mL de zeocina (Thermo Fisher Scientific) de uno a tres días después de la transfección. Después de que las células resistentes a los medicamentos crecieron hasta la confluencia, el medio se reemplazó por medio de expresión FreeStyle 293. Después de 24 o 48 h, las células se desalojaron físicamente golpeando ligeramente el matraz (la tripsinización dio como resultado una baja viabilidad; no se muestran datos) y luego se sembraron a razón de 6x105 células/mL en 30 mL de medio de expresión FreeStyle 293 en un matraz de agitación de 125 mL. Los cultivos se incubaron a 37 °C en 8 % de CO2 con agitación a 125 rpm.
Producción de mAb: La producción de anticuerpos a partir de agrupaciones estables se realizó mediante uno de dos métodos:
1. Se sembraron agrupaciones de líneas celulares transfectadas estables a razón de 0,6 a 1x106 células/mL en medio 293FreeStyle. Dos días después de que el cultivo alcanzara una densidad de 1x106 células/mL, los cultivos se alimentaron como se describe en esta memoria; o
2. Agrupaciones de líneas celulares transfectadas estables se centrifugaron a 1000 rpm en una centrífuga Beckman Allegra 6 durante 5 min. Se eliminó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 1 L de medio expi293 (Gibco) a razón de 0,5-0,8x106 células/mL en un matraz agitado de 2,8 L. Las células se incubaron a 37 °C, 8 % de CO2, agitando a 125 rpm.
Para ambos métodos, los cultivos se incubaron a 37 °C en 8 % de CO2con agitación a 125 rpm durante 7-10 días, dependiendo de cuándo la viabilidad celular cayó a aproximadamente el 50 %, momento en el cual los cultivos se centrifugaron durante 1 h a 8000 rpm en un rotor Beckman JLA8.1000. A continuación, el sobrenadante se filtró a través de un filtro PES de 0,2 gm y se almacenó a 4 °C o -20 °C hasta la purificación.
Purificación de mAb
Purificación de anticuerpos mediante cromatografía de afinidad de proteína A: Utilizando un AKTA Explorer (GE Healthcare), se equilibró una columna de proteína A (GE Healthcare) con 10 volúmenes de columna (CV) de fosfato de sodio 20 mM, EDTA 10 mM, pH 7,2. Luego se cargó la muestra, seguido de lavado del material no unido con 10 CV de tampón de equilibrio. La muestra se eluyó utilizando 5 CV de glicina 0,1 M, pH 2,9. Las fracciones que contenían el mAb se combinaron y se dializaron en tampón fosfato de Dulbecco (DPBS) utilizando un MWCO 20K Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific).
Desencapsulación de cisteína: Utilizando un AKTA Explorer (GE Healthcare), se equilibró una columna de proteína A (GE Healthcare) con 10 CV de fosfato de sodio 20 mM, EDTA 10 mM, pH 7,2 (tampón de equilibrio). Luego se cargó la muestra, seguido de lavado del material no unido con 10 CV de tampón de equilibrio. La columna se lavó con 16 CV de fosfato sódico 20 mM, EDTA 10 mM, cisteína 5 mM, pH 7,2 a razón de 0,5 mL/min durante 16 h a 4 °C para eliminar el grupo encapsulante. Luego se lavó la columna con 60 CV de Tris 20 mM, pH 7,5 a razón de 0,5 mL/min durante 60 h a 4 °C. La muestra se eluyó utilizando 5 CV de glicina 0,1 M, pH 2,9, y se neutralizó inmediatamente utilizando un volumen de 5 % de Tris 2 M, pH 9,0. Las fracciones que contenían el mAb se combinaron y se dializaron en DPBS utilizando un MWCO 20K Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific).
A n á lis is d e m a p e o d e e n la c e s d is u lfu r o y c is te in i la c ió n LC-MS/MS
El mAb se intercambió con tampón por tampón de bicarbonato de amonio 50 mM, pH 7,8 utilizando una columna de desalinización por rotación Zeba (Thermo-Fisher). La concentración se ajustó a 1 mg/mL y se añadió RapiGest (Waters) al 0,1 %. Luego, el mAb se digirió con Glu-C (New England BioLabs) (25:1 p/p) a 37 °C durante 4 h, seguido de digestión con Asp-N (New England BioLabs) (25:1 p/p). a 37 °C durante 18 h. Después de la digestión, se añadió ácido trifluoroacético (TFA) al 5 % hasta el 0,5 % y se incubó a 37 °C durante 90 min. La muestra se centrifugó a 13.000 rpm durante 30 min para eliminar los sedimentos y se analizó por LC-MS/MS utilizando la metodología MSE en la segunda fase de ionización. La metodología MSE utiliza una tensión en rampa en lugar de una tensión fija en la segunda fase de ionización para generar un perfil iónico más completo. Las muestras se analizaron utilizando un espectrómetro de masas Waters Acquity UPLC y Q-Tof Premier. Las muestras se inyectaron en un Waters BEH 300 C18, tamaño de poro de 1,7 gm, 2,1 x 100 mm, se eluyeron de la columna con un equilibrio de 3 min en 97 % de la fase móvil A (ácido fórmico al 0,1 % en H2O), un gradiente lineal de 55 min (3-45 % de fase móvil B (ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo)), un gradiente lineal de 5 min (45 %-90 % de fase móvil B), una fase isocrática de 5 min (90 % de fase móvil B), un gradiente lineal de 5 min (90 %-3 % de fase móvil B) y un re-equilibrio de 5 min en el 97 % de la fase móvil A, a razón de 0,05 mL/min. El espectrómetro de masas Q-Tof se hizo funcionar en modo V de iones positivos con detección en el intervalo de 200-2000 m/z. Los parámetros de la fuente fueron los siguientes: tensión capilar, 3,0 kV, tensión del cono de muestreo, 40 V; temperatura de la fuente, 120 °C; temperatura de desolvatación, 250 °C; flujo de gas de desolvatación, 600 L/h. El patrón de referencia de masa del Lockspray fue glu-fib. El método MSE fue el siguiente: tiempo de adquisición, 3-70 min; intervalo de datos, 200-2000 m/z; tiempo de exploración, 1,5 s; expresión, baja energía 6 V, rampa de alta energía de 10-30 V.
La agregación de anticuerpos se analizó mediante el método de cromatografía líquida de alta resolución con exclusión por tamaño (SEC-HPLC) utilizando un Agilent 1100. El mAb se diluyó a 1 mg/mL en DPBS. El anticuerpo (20 gL) se inyectó en una columna protectora TSKgel SuperSW (4,6 mm x 3,5 cm, tamaño de poro de 4 gm, Tosoh Bioscience), seguido de una columna TSKgel SuperSW3000 (4,6 mm x 30 cm, tamaño de poro de 4 gm), se eluyó de la columna con PBS 0,1 M que contenía NaCl 0,15 M y NaNa al 0,05 %, a pH 7,4, a un caudal de 0,3 mL/min durante 20 min. Todos los datos se analizaron utilizando el software Agilent ChemStation. El porcentaje de agregación se calculó como [PAagregadoPAtotal]*100, en que PA = área del pico integrado.
Análisis UPLCIESI-MS de conjugación malemida-biotina:mAb
Los anticuerpos purificados se diluyeron a 1 mg/mL en DPBS (las muestras se dejaron en la concentración original si era inferior a 1,0 mg/mL). Se disolvió maleimida-PEG2-biotina ((mal)-PEG2-biotina) (Thermo Fisher Scientific) en DPBS para producir una solución madre 20 mM, seguida de una dilución a 1 mM en DPBS. Se añadió Mal-PEG2-biotina a 1 mL de mAb desencapsulado en una relación de conjugación de 5:1 y se incubó a 22 °C con rotación suave durante 2 h. La reacción se desalinizó utilizando una columna de desalinización giratoria Zeba. Luego, los mAbs se desglicosilaron utilizando PNGasa F (New England BioLabs). Se añadieron tampón G7 (10 pL) y PNGasa F (2 pL) al mAb (90 pL). La reacción se incubó en un microondas Discover (CEM) durante 2 ciclos: 1) potencia de microondas 10 W, 37 °C, 10 min, seguido de una pausa de 5 min; y 2) potencia de microondas 2 W, 37 °C, 10 min. Una porción de la muestra se redujo añadiendo ditiotreitol (DTT) hasta una concentración final de 20 mM, seguido de una incubación a 60 °C durante 3 min.
A continuación, las muestras se analizaron utilizando un espectrómetro de masas Waters Acquity UPLC y Q-Tof Premier. Las muestras (0,5-2 pg cada una) se inyectaron en una microcolumna de desalinización MassPrep a 65 °C, se eluyeron de la columna con un equilibrio de 5 min en el 95 % de la fase móvil A, un gradiente de 10 min (5-90 % de B), y un reequilibrio de 10 min en el 95 % de la fase móvil A, a 0,05 mL/min. La fase móvil A era ácido fórmico al 0,1 % en agua. La fase móvil B era ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo. El espectrómetro de masas Q-Tof se hizo funcionar en modo V de iones positivos con detección en el intervalo de 500-4000 m/z. Los parámetros de la fuente fueron los siguientes: tensión capilar, 2,25 kV (anticuerpo intacto)-2,50 kV (anticuerpo reducido); tensión del cono de muestreo, 65,0 V (anticuerpo intacto) o 50,0 V (anticuerpo reducido); temperatura de la fuente, 100 °C; temperatura de desolvatación, 250 °C; flujo de gas de desolvatación, 550 L/h. El pico de proteína se desconvolucionó utilizando la función MassLynx MaxEnt 1. La eficiencia de conjugación se calculó como
[Ibiotiniiado /Gbiotiniiado I nomodificado)]* 100 del espectro de masas desconvolucionado, en que
I = intensidad pico de masa.
Análisis BIAcore de afinidad por mAb: antígeno
Las concentraciones de anticuerpos se ajustaron para generar una señal de 30 a 40 RU cuando se unieron al antígeno. Se inyectaron mAbs humanizados purificados mediante cromatografía de afinidad de proteína A estándar o mediante el método de desencapsulación sobre un sensor de IgG anti-humana en un BIAcore T100 (GE Healthcare) durante 1 min a un caudal de 10 pL/min. La superficie del sensor se lavó inyectando tampón HBS-P durante 1 min a un caudal de 50 pL/min. Para registrar la asociación del antígeno con el mAb capturado, se inyectó una serie de concentraciones crecientes de antígeno durante 60 s a un caudal de 50 pL/min. La disociación del antígeno se controló durante 30 min al mismo caudal. La superficie del sensor se regeneró inyectando MgCl23 M durante 1 min y luego durante 30 s a un caudal de 30 pL/min. Los sensogramas se analizaron con el software de evaluación Biacore T100 utilizando un modelo de unión Langmuir 1:1.
Preparación Fab bivalente/ biespecííica
Fragmentos Fab derivados de mAb se prepararon por separado utilizando papaína inmovilizada, seguido del aislamiento de los fragmentos Fab puros de Fc/mAb no digerido utilizando cromatografía de proteína A. La maleimido-PEG4-azida se sintetizó combinando NHS-maleimida y azido-PEG4-amina en DMSO durante 1 h en una relación molar de 1:1. El NHS que no ha reaccionado se inactivó mediante la adición de tampón Tris-HCl para evitar la homodimerización. Fabs se conjugaron con maleimido-PEG4-azida o maleimido-PEG4-dibenzociclo-octina (DBCO) en una relación molar de maleimida:Fab de 5:1 y se hicieron reaccionar durante 4 h a 22 °C. Los fragmentos Fab modificados se desalinizaron dos veces cada uno en DPBS para eliminar todos los productos que no han reaccionado, y los fragmentos Fab se combinaron en una relación molar de 1:1 a una concentración final de 2 mg/mL y se dejó que se formaran dímeros durante la noche a 22 °C. La reacción se analizó mediante SDS-PAGE y la eficiencia de dimerización se estimó en 20 %. La preparación de dímero se purificó del monómero que no ha reaccionado mediante cromatografía de filtración en gel S-200.
Ensayo de octeto bivalente/biespecííico
CA9 humana biotinilada se capturó en puntas de biosensores de estreptavidina (Pall) durante 4 min. Después de la incubación en PBS durante 2 min, las puntas se incubaron con los Fabs bivalentes/biespecíficos, mAb solo o Fab solo durante 5 min. Después de la incubación en PBS durante 2 min, las puntas se incubaron con endosialina humana/TEM-1 durante 5 min. Finalmente, las puntas se incubaron en PBS durante otros 2 min. Se midió en todo momento la proteína de asociación y disociación de las puntas.
Ejemplo 2 - conjugación de Cys80
Objetivo
Las tecnologías de conjugación específicas del sitio son deseables para producir un producto homogéneo con una relación fármaco-anticuerpo (DAR) definida. El dominio Vkde un mAb de conejo, tal como el derivado deOryctolaguscuniculus,puede contener una cisteína en la posición 80 (denominada "Cys80") (FIG. 1A) y la región Ckpuede contener una cisteína en la posición 171 ("Cys171 ") (FIG. 1B). El modelado in silico predijo que Cys80 y Cys171 podrían estar formando un enlace disulfuro, ya que se predice que los dos átomos de S estarán separados aproximadamente 1,6 Á (FIG. 2A). Los mAbs humanos tienen residuos de prolina, serina o alanina en la posición 80 (FIG. 1A) y serina en la posición 171 (FIG. 1B), por lo que no hay puente disulfuro entre la región variable y constante (FIG. 2B).
La estructura cristalina más cercana a las secuencias Vky Ckde conejo o ser humano se identificó utilizando la base de datos BLAST pdb y se utilizó como un molde para modelar la estructura de mAb 155D5. Los modelos se generaron utilizando la herramienta "Build Homology Models" de Discovery Studio (Accelrys). Se seleccionó el modelo con la energía total más baja, se tipificó con el campo de fuerza CHARMm y la energía se minimizó adicionalmente mediante dos rondas de minimización de energía utilizando la herramienta "Minimize". Luego, los bucles de CDR se refinaron utilizando la herramienta "Model Antibody Loops". Se seleccionó el modelo con la energía total más baja, se tipificó con el campo de fuerza CHARMm y la energía se minimizó adicionalmente como arriba. La proximidad de Cys80 y Cys171 (FIG. 2A) predice que estas cisteínas pueden estar formando un enlace disulfuro. Se utilizó la herramienta "Build Mutants" para representar este enlace disulfuro.
Dado que los enlaces disulfuro son críticos para mantener la integridad estructural secundaria y terciaria, que a su vez es necesaria para la actividad biológica de un anticuerpo, era importante demostrar si el enlace Cys80-Cys171 previsto realmente existía. Por lo tanto, se realizaron experimentosad hocque demostraron inequívocamente que los mAbs de conejo contenían un enlace de este tipo (Tabla 4).
Tabla 4.Demostración de la existencia del enlace disulfuro C s80-C s171
Un mAb quimerizado de especie humana se elabora mediante la fusión entre: i) la región variable de la especie en la que se generó el mAb; y ii) la región constante humana. Este proceso se denomina quimerización. Un mAb humanizado está formado principalmente por regiones humanas variables y constantes, excepto aquellos residuos necesarios para la unión al antígeno, que provienen de la misma especie del huésped a partir del cual se generó el mAb. Este proceso se denomina humanización. Para modificar por ingeniería genética mAbs humanos quimerizados o humanizados, mediante los cuales los mAbs se generaron en huéspedes que pertenecen a la especieOryctolagus cuniculus,todos los dominios constantes, así como la mayoría de las regiones variables (si se humanizaron), se reemplazaron genéticamente por las secuencias variables humanas y constantes humanas. Después de la quimerización o la humanización, la Cys80 en Vkya no formó un enlace disulfuro con la posición 171 en Ck(FIG. 2C) y, por lo tanto, no está apareada.
Las familias Vkde conejos de línea germinal NZW tienen una cisteína en la posición 80 como se muestra en la FIG.
3 (se eliminaron las regiones CDR y se alinearon los marcos (FWR) 1, 2 y 3).
Descubrimiento y caracterización de una cisteína no apareada en la posición 80
Las regiones constantes de conejo de 155D5 y 1E4 (anti-CA9), 1-55-2 (anti-hTEM1), así como 33011 (anti-MSLN), todas las cuales contienen Cys80 y se generaron como se describe en el Ejemplo 1, se reemplazaron por las regiones constantes humanas de una IgG1kpara generar mAb quimerizado de conejo/ser humano, como se describe en otra parte de esta memoria. Específicamente, la región VH de conejo de 155D5 se fusionó con la región Cyhumana para generar xi155D5HC, y la región Vkde conejo de 155D5 se fusionó con la región Ckhumana para generar xi155D5LC. Al mAb 155D5 quimerizado de conejo/ser humano con el Cys80 no apareado se le alude en esta memoria como xi 155D5.
La región VH de 1-55-2 se fusionó con la región Cyhumana para generar xi1-55-2H, y la región Vkde conejo de 1 55-2 se fusionó con la región Ckhumana para generar xi1-55-2LC. Al mAb 1 -55-2 quimerizado de conejo/ser humano con la Cys80 no apareada se le alude en esta memoria como xi 1-55-2.
La región VH de conejo de 1E4 se fusionó con la región Cyhumana para generar xi1 E4HC, y la región Vkde conejo de 1E4 se fusionó con la región Ckhumana para generar xi1 E4LC. Al mAb 1E4 quimerizado de conejo/ser humano con el Cys80 no apareado se le alude en esta memoria como xi1 E4.
La región VH de conejo de 33011 se fusionó con la región Cyhumana para generar xi33O11HC, y la región Vkde conejo de 33011 se fusionó con la región Ckhumana para generar xi33O11LC. Al mAb 33011 quimerizado de conejo/ser humano con la Cys80 no apareada se le alude en esta memoria como xi33O11.
Debido a que Cys171 se sustituyó con Ser171 durante la quimerización, los anticuerpos quimerizados (xi155D5, xi1-55-2, xi1 E4 y xi33O11) contenían una cisteína no apareada en la posición 80 en Vk(a la que se alude como "Cys80"). Cuando se redujo utilizando condiciones duras (DTT 20 mM a 60 °C durante 5 min), el peso (masa) molecular de la cadena ligera del mAb xi155D5 purificado con proteína A fue de 23.382 Da (FIG. 4A). Sin embargo, cuando se sometió a condiciones reductoras suaves (DTT 100 pM, RT, 30 min), la masa aumentó en 120 Da (FIG. 4B). Este aumento de masa sugirió que Cys80 podría estar formando un enlace disulfuro con una cisteína libre, conocida como cisteína "encapsulante". A esta estructura molecular, que resulta de una reacción denominada "cisteinilación", se la alude como Cys80 ''encapsulada''. Para confirmar esta hipótesis, mAb xi155D5 se digirió con Asp-N y Glu-C, y se analizaron las masas de los péptidos. El análisis por espectrometría de masas de fragmentos peptídicos correspondientes a los residuos 71 a Cys80 (FTLTITGVQC) (SEQ ID NO: 24) indicó un peso molecular aumentado en 119 Da (Tabla 5), confirmando así que Cys80 estaba encapsulada.
T l .E r m rí m fr m n l i 71- xi1 D
Debido a que la ausencia del enlace disulfuro Cys80-Cys171 podría haber conducido a una inestabilidad del anticuerpo, la interrupción de la unión del antígeno o ambas, se realizaron pruebas de estabilidad del anticuerpo y unión al antígeno. La estabilidad de xi155D5 se testó utilizando un ensayo SE-HPLC. Este ensayo testa si la carencia del enlace disulfuro Cys80-Cys171 podría conducir a una agregación (debido a posibles enlaces intermoleculares Cys80-Cys80) o a una degradación (debido a una mayor sensibilidad a las proteasas). El anticuerpo purificado a 1 mg/mL en 1X PBS se almacenó a -80 °C o 37 °C durante 1 semana. Se inyectaron diez pL de xi155D5 en una columna SuperSW3000 (TOSOH Biosciences, 4,6 mm x 30 cm, tamaño de partícula de 4 pm) equipada con una columna de protección TSKgel en línea de 4,6 mm x 3,5 cm a un caudal de 0,3 mL/min con fosfato de sodio 0,1 M, NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05 % como fase móvil. No se observó cambio significativo alguno en la agregación entre las dos condiciones de almacenamiento (FIG. 5A y 5B). El nivel de agregación estaba en el intervalo del 3-4 % y, por lo tanto, dentro del intervalo normal de una IgG1 humana típica (datos no mostrados). Se observaron pocos o ningún producto de degradación en cualquiera de las condiciones de almacenamiento (FIG. 5). Estos resultados sugieren que xi 155D5 que carece del enlace disulfuro Cys80-Cys171 es una proteína estable en las condiciones de almacenamiento testadas.
Para determinar si la quimerización y, por lo tanto, la pérdida del enlace disulfuro Cys80-Cys171, resulta en perturbaciones estructurales que conducen a la pérdida de la unión al antígeno, se evaluó la afinidad de unión de los mAbs 155D5, xi155D5, 1 -55-2 y xi1 -55-2 la resonancia de plasmón de superficie. El ligando biotinilado (biotina-hTEM1 para 1-55-2, biotina-CA9 para 155D5) se capturó en un chip CAP BIAcore de biotina recubierto (GE Healthcare, Piscataway, NJ) utilizando HBS-EP como tampón de desarrollo. Los niveles finales de captura de antígeno fueron 130 RU y 280 RU, respectivamente, para biotina-TEM1 y biotina-CA9. Se pasaron diluciones en serie de anticuerpo (120 pL de 0-50 nM) sobre el chip recubierto de ligando. La disociación se observó durante 25 min. La superficie del chip se regeneró con GuHCl 6 M, NaOH 250 mM. Los sensogramas fueron doblemente referenciados y los parámetros cinéticos se determinaron utilizando el software BIAEvaluations (ver. 4,1). Se observó poca o ninguna pérdida de afinidad de unión debido a la quimerización de dos mAb diferentes (Tabla 6), lo que sugiere que la carencia del enlace disulfuro Cys80-Cys171 no conduce a la alteración de la región de unión.
Tabla 6.Constantes cinéticas de mAbs uimerizados de coneo
Evaluación de la utilidad de Cys80 para conjugaciones de agentes funcionales
Después de haber establecido que la carencia del enlace disulfuro Cys80-Cys171 no conduce a perturbaciones estructurales, se exploró la posibilidad de reemplazar la cisteína encapsulante con un compuesto reactivo con tiol. Se puede fijar un grupo reactivo con tiol a un enlazador, que a su vez se puede fijar a una molécula de utilidad diagnóstica o terapéutica, denominada en esta memoria "agente funcional". Los agentes funcionales pueden incluir fluoróforos, colorantes fluorescentes, polipéptidos, inmunoglobulinas, antibióticos, ácidos nucleicos, radionucleidos, enlazadores químicos, moléculas pequeñas (tales como agentes quimioterapéuticos), quelantes, lípidos y fármacos.
Para sustituir la cisteína encapsulante con un agente funcional, primero se eliminó la cisteína encapsulante. La exposición de mAbs purificados a condiciones reductoras podría romper el enlace disulfuro entre Cys80 y la cisteína encapsulante, denominada en esta memoria "desencapsulación". Sin embargo, las condiciones reductoras subóptimas, por ejemplo, condiciones reductoras severas, también podrían romper los enlaces disulfuro entre- e intracadenas, comprometiendo con ello la estructura y actividad del mAb. Por lo tanto, se desarrolló un método de desencapsulación que implica la eliminación de la cisteína encapsulante utilizando una reducción suave, seguida de una reoxidación con un tampón que contiene Tris que no altera la estructura y actividad del mAb, y al mismo tiempo permite la eliminación de la cisteína encapsulante. Inicialmente se evaluó un cierto número de agentes reductores, incluyendo glutatión reducido, cisteína, TCEP y DTT. El glutatión no eliminó eficientemente la cisteína encapsulante (datos no mostrados). Tanto DTT como TCEP eliminaron eficientemente la cisteína encapsulante, pero concentraciones más altas también dieron como resultado la rotura casi completa de los disulfuros entre cadenas y probablemente también de algunos disulfuros intra-cadena (datos no mostrados). La cisteína reductora suave eliminó eficientemente la cisteína encapsulante y solo se observó una rotura limitada entre cadenas. La reoxidación se examinó utilizando tampón fosfato, tampón Tris y el oxidante fuerte CuSO4. No se observó reoxidación de los disulfuros entre cadenas interrumpidos con tampón fosfato, mientras que CuSO4 reformó eficiente y rápidamente los disulfuros, pero no se evaluó más a fondo debido a su toxicidad inherente en comparación con Tris. Las condiciones optimizadas se adaptaron a un formato de columna para permitir la purificación secuencial y la desencapsulación del material de alimentación. Con este método, el anticuerpo se unió a una resina de proteína A y se incubó con flujo limitado (0,5 mL/min) con un tampón que contenía cisteína 5 mM durante 16 h para reducir (romper) el enlace disulfuro Cys80-cisteína, seguido de lavado con un tampón que contiene Tris libre de cisteína durante 60 h para eliminar las cisteínas liberadas por este tratamiento y volver a oxidar los enlaces disulfuro entre cadenas reducidos. Luego se eluyó el mAb en un tampón glicina de pH bajo. En un experimento ejemplar en el que se aplicó el método de desencapsulación a xi155D5, se determinó la masa del mAb purificado no reducido y se encontró el ~ 99 % del mAb desencapsulado, como lo demuestra la caída en la masa equivalente a dos cisteínas libres (FIG. 6A y 6B). El ensayo de tiol libre confirmó la presencia de dos grupos tiol por mAb, lo que también demuestra una reoxidación eficiente (datos no mostrados).
Cys80 desencapsulada se puede conjugar en maleimida
La cisteína es un a-aminoácido con una cadena lateral no polar (tiol; -SH). La cadena lateral de tiol reducida en una cisteína no apareada podría servir como un nucleófilo que puede reaccionar con una molécula electrófila tal como maleimida, un compuesto químico con la fórmula H2C2(CO)2Nh . El doble enlace electrófilo de la maleimida reacciona fácilmente con el grupo tiol nucleófilo que se encuentra en la cisteína para formar un enlace tioéter carbono-azufre estable. La no polaridad de la cadena lateral del tiol, dependiendo de los residuos circundantes, podría conferir una propiedad hidrófoba a una cisteína que puede evitar la exposición a disolventes necesaria para modificaciones químicas. Además, la ubicación de la cisteína en el contexto de la estructura secundaria del péptido en el que se encuentra puede impedir adicionalmente el acceso de la molécula reactiva con tiol. Se realizaron pruebas experimentales para determinar si Cys80 podría reaccionar con una molécula reactiva con tiol después de la desencapsulación. El xi115D5 desencapsulado se incubó con maleimida-PEG2-biotina como se describe en otra parte de esta memoria. El análisis de espectrometría de masas demostró que el 94 % del mAb estaba conjugado con maleimida-PEG2-biotina como lo indica un aumento en la masa molecular de 526 Da (FIG. 7), correspondiente a la masa del agente funcional. Como se encontró que cada cadena ligera estaba conjugada (pico de masa único, FIG.
7), la relación maleimida-PEG2-biotina a xi155D5 fue homogéneamente igual a 2:1. Se conjugó una maleimida-PEG2-biotina con una Cys80 en cada una de las dos cadenas ligeras en el mAb quimerizado (Cys801 y Cys802).
Estos resultados demuestran que Cys80 y Cys171 forman un enlace disulfuro que une las regiones Vky Ckde un mAb de conejo. Cuando se quimerizaron mAbs de conejo, Cys171 se sustituyó con Ser171 presente en la región Ckhumana. Esta sustitución abolió el enlace disulfuro Cys80-Cys171. Cuando se evaluaron los efectos de la pérdida de este puente disulfuro sobre la estabilidad estructural y la actividad del mAb quimerizado resultante en comparación con el mAb de conejo parental, se observó que el mAb quimerizado era estable y activo. Se descubrió que tanto Cys801 como Cys802, que permanecían no apareados en el mAb quimerizado, estaban encapsulados por una cisteína libre (cisteína encapsulante). Posteriormente, se desarrolló un método para eliminar la cisteína encapsulante (desencapsulación), manteniendo al mismo tiempo la estabilidad estructural y la actividad del mAb quimérico resultante. Además, se demostró que se podían lograr altos rendimientos de mAb conjugado con maleimida-PEG2-biotina con una relación de agente funcional a mAb igual a 2:1.
Humanización de mAbs de conejo
mAbs quimerizados podrían ser inmunogénicos cuando se administran a seres humanos y, por lo tanto, es deseable humanizar los mAbs de conejo sustituyendo secuencias de conejo con secuencias humanas en las regiones Vky VH. La secuencia de aminoácidos de mAb 155D5 se analizó utilizando una búsqueda BLAST en una base de datos de dominio variable humano en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/ para identificar la secuencia humana con la mayor homología con la secuencia de conejo. Se identificaron IGHV3-64*04 e IGKV 1-5*03 como las mejores secuencias para la humanización, ya que su uso daría como resultado el menor número de sustituciones de residuos de conejo (FIG. 8).
Las secuencias 155D5 correspondientes a los dominios de unión a antígeno identificados por Kabat y Chothia CDRH1, Chothia CDRH2, CDRH3,<c>D<r>L1, CDRL2 y CDRL3 se insertaron en las regiones marco (FWR) de IGHV3-64*04 o IGKV1-5*03 humano para generar el mAb 155D5 humanizado, denominado zu155D5-1 (Tabla 7 y Tabla 8).
Durante la humanización de 155D5LC (zu155D5LC), se mantuvo Cys80, que no estaba apareado, ya que la secuencia kappa humana tiene Ser171 en lugar de Cys171. Se produjo y purificó zu155D5-1 utilizando purificación de proteína A estándar, y se encontró que estaba encapsulado, como lo evidencia el cambio de masa después de la desencapsulación en 233 Da, que corresponde aproximadamente a dos cisteínas encapsulantes (FIG. 9). Como se observó con xi155D5, zu155D5-1 también se pudo desencapsular con una eficiencia cercana al 100 % (Tabla 9). Sin embargo, la desencapsulación dio lugar a niveles masivos de agregación (70 %) frente a solo el 14 % en xi155D5. Cuando se hizo reaccionar zu155D5-1 con maleimida-PEG2-biotina, se observó una conjugación del 0 % mientras que xi155D5 estaba conjugado en un 93 % (Tabla 9). Estos resultados fueron sorprendentes, ya que sugieren que: 1) tener una cisteína en la posición 80, aunque es necesario, no es suficiente para permitir la conjugación específica del sitio de un agente funcional; y 2) en algunas condiciones, intentar la conjugación en Cys80 podría conducir a una alta agregación que no es compatible con la capacidad de fabricación del fármaco. Sin embargo, dado que los estudios descritos, que caracterizaron xi155D5, demostraron que al menos en algunas condiciones la conjugación de un agente funcional en Cys80 podría ser muy eficiente, a continuación se investigó cómo los residuos que rodean a Cys80 pueden influir en la eficiencia de la conjugación. En consecuencia, se generaron modelos estructurales de xi155D5 quimerizado (FIG. 10), lo que indicó que los residuos Val11, Ala14, Gly17, Thr18, Lys63, Thr76, Gly77, Val78, Ala83, Glu103 y Leu104 estaban muy próximos (dentro de 18 Á) a Cys80 y, por lo tanto, podrían estar afectando potencialmente la eficiencia de su conjugación.
Se diseñaron dos versiones de FWR1 (FWR1a-b), una versión de FWR2, tres versiones de FWR3 (FWR3a-c) y dos versiones de FWR4 (FWR4a-b) en base a los residuos antes mencionados (Tabla 7).
Tabla 7.Versiones de estructuras derivadas de IGKV1-5 de la familia Vkhumana
Los residuos en negrita indican diferencias entre las variantes marco, n/a, no aplicable.
Se generó una serie de variantes humanizadas de 155D5 que contenían combinaciones de estos marcos y Cys80-Xaa1-Xaa2-Phe83 (a la que también se alude como C-X-X-F o CXXF) o Cys80-Xaa1-Xaa2-Ala83 (a la que también se alude como C-X-X-A o CXXA), en donde "Xaa" o "X" indican aminoácidos en la posición 81 y 82 (Tabla 8).
Tabla 8.Variantes de 155D5 humanizadas derivadas de IGKV1-5 de la familia Vkhumana
Se observó que, independientemente de la versión de FWR utilizada, los mAbs humanizados que tenían el motivo C-X-X-F mostraban una alta agregación (después de la desencapsulación) y una mala conjugación (Tabla 9). Por el contrario, 4 de las 5 variantes de mAb que contienen el motivo C-X-X-A, e independientemente de la versión FWR utilizada, mostraron un alto porcentaje de eficiencia de conjugación (> 80 %) y una baja agregación (después de la desencapsulación) de < 18 % (Tabla 9). zu155D5-4 es un valor atípico que exhibió un bajo porcentaje de eficiencia de conjugación y una alta agregación después de la desencapsulación. Se observa que el anticuerpo zu155D5-4 tiene propensión a agregarse independientemente de la desencapsulación, lo que puede explicar los resultados observados. Estos datos sugirieron que Phe83 está implicada en provocar una alta agregación después de la desencapsulación y no favorece la conjugación en Cys80.
Tabla 9.N iveles de a re ación eficiencia de conu ación de xi 155D5 frente a diferentes variantes de zu155 D5
Es deseable lograr una agregación del 25 % o menos como punto de partida de la optimización del proceso posterior, mediante el cual una optimización adicional de los parámetros de fermentación, las condiciones de purificación y las formulaciones de fármacos pueden lograr un nivel de agregación más deseable del 5 % o menos. También es deseable lograr una eficiencia de conjugación del 70 % o más para minimizar el desperdicio de producto, el costo de los bienes y maximizar la homogeneidad del producto. De ahora en adelante, la investigación se centró en cumplir y superar estas especificaciones extrapolando reglas para aplicarlas a los métodos de humanización de mAbs de conejo.
155D5-1 se generó siguiendo una práctica estándar, que implica utilizar las secuencias de la línea germinal humana más homólogas a la secuencia parental. Debido a esta práctica, se utilizó la subfamilia Vkhumana IGKV1-5 para humanizar 155D5, que tiene un porcentaje de identidad del 70,5 % (datos no mostrados) y contiene Phe83. Las subfamilias Vk alternativas, que tienen un porcentaje de identidad similar (datos no mostrados), también contenían Phe83 (FIG. 8). Como este residuo parecía influir negativamente en la eficiencia de conjugación de Cys80 y provocar una alta agregación, se evaluó la presencia o ausencia de Phe83 en otras familias Vk humanas, a pesar del hecho de que la identidad más alta encontrada en estas familias Vkfue menor (68,4 %) y, por lo tanto, típicamente no se utilizaría para humanizar 155D5. Dado que todas las familias Vkhumanas, excepto IGKV4, IGKV5 e IGKV7, tienen múltiples subfamilias, todas las subfamilias se alinearon dentro de su familia (datos no mostrados). Después de eliminar las secuencias redundantes, solo quedó una secuencia para cada una de las familias IGKV-4, -5, -6, -6D y -7, que podría utilizarse para la humanización. Para las familias IGKV-1, -2 y -3, se eligió la subfamilia con la homología más cercana al consenso como marco para humanizar 155D5. Un análisis preliminar indicó que, si bien algunas de estas familias Vkcontenían Phe83, otras no (y la Tabla 10).
Para estudiar el efecto de la presencia o ausencia de Phe83 en el contexto de estas familias Vk, las regiones CDR de 155D5 se injertaron genéticamente en los marcos humanos IGKV1-39*01, IGKV2-40*01, IGKV3-11*01, IGKV4-1*01, IGKV5-2*01, IGKV6-21*01, IGKV6D-41*01 e IGKV7-3*01. IGKV5-2*01 Asn20, que contiene un sitio de glicosilación ligado a N en los residuos 20, y su variante Thr20 no se incluyeron en este análisis porque el primero no pudo analizarse mediante espectrometría de masas debido a la heterogeneidad y el segundo no se expresó bien. IGKV7-3*01 Asn81 no se incluyó en el análisis porque no pudo analizarse mediante espectrometría de masas. Sin embargo, se incluyó en el análisis la variante IGKV7-3*01-Glu81. Del análisis se obtuvieron los siguientes resultados (Tabla 10):
1. El mAb humanizado con la secuencia huIGKV1-39 y que contenía Phe83 mostró un aumento de agregación del 0 al 26 % después de la desencapsulación; la eficacia de la conjugación estaba en el límite de lo aceptable (68 %), pero una agregación >25 % no lo era;
2. El mAb humanizado con la secuencia huIGKV2-40 contenía una línea germinal humana Val83; este mAb mostró agregación < 25 % después de la desencapsulación (11 %) y eficiencia de conjugación >70 % (92 %). Estos parámetros fueron aceptables, lo que sugiere que la línea germinal humana Val83 es propicia para el emparejamiento con Cys80 para permitir la conjugación de Cys80;
3. El mAb humanizado con la secuencia huIGKV3-11 contenía una línea germinal humana Phe83; mientras que la agregación estaba por debajo del 25 %, la eficiencia de conjugación era del 55 %, por lo que no cumplía el criterio de >70 %;
4. El mAb humanizado con la secuencia huIGKV4-1 contenía una línea germinal humana Val83; este mAb mostró agregación < 25 % después de la desencapsulación (6 %) y eficiencia de conjugación >70 % (82 %). Estos parámetros fueron aceptables, lo que sugiere que la Val83 humana es propicia para emparejarse con Cys80 para permitir la conjugación de Cys80, como se ve con la secuencia huIGKV2-40;
5. Los mAbs humanizados con las secuencias huIGKV6-21 o huIGKV6D-41 contenían ambos una línea germinal humana Ala83; estos mAbs mostraron agregación < 25 % después de la desencapsulación y eficiencia de conjugación >70 %. Estos parámetros fueron aceptables, lo que sugiere que la línea germinal humana Ala83 es propicia para el emparejamiento con Cys80 para permitir la conjugación de Cys80, como se ve con la secuencia xi155D5; y
6. El mAb humanizado con la secuencia huIGKV7-3-Glu81 contenía una línea germinal humana Thr83; este mAb mostró agregación < 25 % después de la desencapsulación (6 %) y eficiencia de conjugación próxima al 100 %. Estos parámetros fueron aceptables, lo que sugiere que la línea germinal humana Thr83 es propicia para el emparejamiento con Cys80 para permitir la conjugación de Cys80.
Tabla 10.Niveles de agregación y eficiencia de conjugación de diferentes variantes de zu155D5 generadas mediante el uso de diversas subfamilias Vk humanas
Estos resultados respaldan el descubrimiento de que la posición 83 influye negativamente en la eficiencia de la conjugación de Cys80 cuando está ocupada por fenilalanina e indican que, además de la alanina, la valina y la treonina pueden sustituir a Phe83 para permitir la conjugación de Cys80.
Para confirmar que, en el contexto de otros mAb, Phe83 participa en la causa de una alta agregación después de la desencapsulación y no favorece la conjugación en Cys80, se generaron variantes de mAb humanizadas de 1E4 (anti-CA9), 166B3 (anti-CA9) y 33011 ( anti-MSLN) que contenían C-X-X-F o C-X-X-A.
Las variantes de anticuerpos monoclonales que tenían el motivo C-X-X-F cumplieron con las especificaciones de conjugación pero no con las especificaciones de agregación, mientras que todas las variantes de mAb humanizadas que tenían C-X-X-A mostraron una agregación inferior al 25 % y una eficiencia de conjugación superior al 70 % (Tablas 11 y 12). Estos estudios demuestran que el C-X-X-(no) F o K es un motivo que permite cumplir con las especificaciones de conjugación.
Tabla 11.Niveles de agregación y eficiencia de conjugación de diferentes variantes de mAb humanizados que comparan C-X-X-F frente a motivos C-X-X-A C-X-X-I
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Además de Ala83, Val83 y Thr83, que se pueden encontrar en secuencias Vkque pertenecen a las subfamilias de la línea germinal huIGKV1-7, Ile83 también se puede encontrar, aunque raramente, en la familia de la línea germinal huIGKV1. Debido a que ya se encontró que Ala83, Val83 y Thr83 eran propicios para la conjugación de Cys80 (Tabla 9 y Tabla 11), quedaba por determinar si Ile83 sería un residuo favorable o desfavorable con respecto a la conjugación en Cys80. Por lo tanto, se generó la variante de mAb humanizado de 33011 que contenía el motivo Cys80-Xaa1-Xaa2-Ile83 (al que también se alude como C-X-X-I o CXXI), que mostró una agregación inferior al 25 % y una eficiencia de conjugación superior al 70 % (Tabla 11), consistente con motivos C-X-X-(no)F anteriores testados. Este resultado respalda el descubrimiento de que, además de Ala83, Val83 y Thr83, Ile83 también puede sustituir a Phe83 para permitir la conjugación de Cys80 cumpliendo con las especificaciones de conjugación.
Los estudios descritos indican que, mientras que los mAbs de conejo quimerizados son adecuados para la conjugación específica del sitio en Cys80 solo después de aplicar el método de desencapsulación descrito como se comentó anteriormente, los mAbs de conejo humanizados que tienen el motivo C-X-X-F o el motivo C-X-X-K no son muy adecuados para modificaciones de este tipo debido a la alta agregación después de la desencapsulación y/o baja eficiencia de conjugación. Se planteó la hipótesis de que los residuos que rodean a Cys80 pueden desempeñar un papel en este fenómeno. Debido a que la región Vkabarca más de 100 residuos, comprender la interacción entre los residuos circundantes clave y Cys80 requirió el uso de modelos estructurales junto con pruebas experimentales. Se descubrió que entre los residuos muy próximos a Cys80, Phe83 ejercía un efecto negativo sobre la eficiencia de conjugación en Cys80. También se observó que todos los mAbs de conejo contenían Phe83 después de la humanización utilizando un enfoque de humanización clásico (FIG. 11), a pesar de que las secuencias Vkhumanas también pueden contener otros aminoácidos en la posición 83, incluyendo alanina, treonina, valina e isoleucina. Cuando estas familias Vkse utilizaron para la humanización, se confirmó que Phe83 y Lys83 son suficientes para dotar al mAb humanizado de propiedades indeseables, tales como alta agregación y/o baja eficiencia de conjugación, mientras que los residuos de aminoácidos restantes (con la excepción de Cys, que no se testó debido al deseo de obtener una única Cys para la conjugación) fueron propicios para la conjugación en Cys80.
Estos resultados sugieren que se deben evitar los motivos C-X-X-F y C-X-X-K cuando se conjugan en Cys80. Utilizando un motivo C-X-X-(no)F o K, por ejemplo el motivo C-X-X-A, C-X-X-T, C-X-X-V y C-X-X-I mediante la sustitución de Phe83, se generaron mAbs quimerizados y humanizados que cumplían con las especificaciones de conjugación deseadas.
Afinidad de xi155D5 y las variantes humanizadas
xi155D5 y las variantes humanizadas se purificaron mediante cromatografía de proteína A estándar o el método de desencapsulación, y su afinidad se analizó utilizando BIAcore (Tabla 13). Hubo menos de 2 veces de diferencia en la KD entre 155D5 quimérico y humanizado, y poca diferencia entre las muestras purificadas mediante los dos métodos diferentes.
Tabla 13. Análisis BIAcore de la unión al antí eno de mAbs 155D5 humanizados quiméricos
Ejemplo 3 - Generación de anticuerpos monoclonales conjugados con mesotelina-auristatina
La mesotelina (MSLN) es una proteína de la superficie celular que se expresa en el cáncer, incluyendo determinados tumores de ovario, pulmón, páncreas y mesotelioma. Para mejorar la potencia de los agentes dirigidos a MSLN, se desarrollaron anticuerpos monoclonales de conejo (mAbs) anti-MSLNde novoy posteriormente se modificaron por ingeniería genética y conjugaron con auristatina F (AuF) en Cys80 para generar un panel de mAbs conjugados en MSLN-AuF.
Generación y caracterización de mAbs anti-MSLN de conejo
Se inmunizaron conejos de Nueva Zelanda(Oryctolagus cuniculus)en Aldevron (Alemania) utilizando ADN plasmídico que codifica la proteína MSLN humana ("MSLN"). El día 52, se recogieron sueros de animales y posteriormente se analizaron para determinar la unión de MSLN mediante citometría de flujo utilizando células de mamífero que expresaban transitoriamente MSLN humana. FIG. 12-D muestra que los sueros de ambos animales contenían anticuerpos de unión a MSLN. Posteriormente, un ensayo ELISA confirmó este resultado (FIG. 12E). Luego, se sacrificaron los animales y se recogieron y crioconservaron PBMCs de la sangre, así como los linfocitos del bazo y los ganglios linfáticos.
Los linfocitos de los ganglios linfáticos previamente congelados se recuperaron y se trataron con ADNasa I y mitógeno de hierba carmín durante una hora a 37 °C/5 % de CO2. Las células se contaron y se sembraron a razón de 5 células/40 qL/pocillo en medio IMDM completo que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10 % y citoquinas (IL-2 e IL-21 a razón de 10,5 ng/mL) en placas de 384 pocillos pre-sembradas con células CHO-K1 que expresan CD 154 como células alimentadoras. Las células se alimentaron nuevamente añadiendo 20 qL/pocillo del mismo medio que anteriormente después de una semana. Dos semanas después de la siembra, se recogieron los sobrenadantes del cultivo de células B para la detección para identificar clones con reactividad específica frente a MSLN humana. Las placas con células se congelaron y almacenaron a -80 °C para un futuro aislamiento de ARN y amplificación de genes. Los sobrenadantes de cultivos de células B se examinaron primero para determinar la producción de IgG mediante el ensayo FRET de IgG de conejo. Se seleccionaron y detectaron clones productores de IgG (5.775) utilizando ELISA para determinar la unión a MSLN humana (1a detección). Algunos de los clones reactivos anti-MSLN se volvieron a analizar (2a detección) para determinar su reactividad con MSLN pero no con un antígeno de control (CD73 humano). Se seleccionaron cinco mAbs y se muestran en la Tabla 14.
Tabla 14. Clones con reactividad específica a MSLN humana
Las placas que contenían los mAbs seleccionados se descongelaron y las células B se lisaron para aislar los ARNs utilizando el kit RNAqueous (Ambion). Los ARN se utilizaron para configurar reacciones de RT-PCR para amplificar las regiones variables del anticuerpo. Los ADN resultantes se secuenciaron y los cebadores se diseñaron para que fueran compatibles con el sistema de clonación InFusion HD® como lo describe el fabricante (Clontech, Mountain View, CA). Los fragmentos de PCR de la región variable se clonaron en un plásmido de expresión que contenía una región constante gamma o kappa humana. Estos plásmidos se transfectaron utilizando el sistema de expresión FreeStyle 293 (Thermo Fisher Scientific) para producir mAbs como se describe en otra parte de esta memoria.
Generación y caracterización de mAbs conjugados de MSLN-AuF en Cys80
Se generaron mAbs quimerizados como se describe en el Ejemplo 2, en donde xi33011 es uno de los cinco mAbs anti-MSLN y los otros cuatro mAbs se quimerizaron siguiendo el mismo método. Por lo tanto, estos mAbs anti-MSLN contienen Cys80 no apareada, específicamente, el motivo C-X-X-A. En esta memoria se los alude como xi32405, xi178F16, xi237N18, xi33011 y xi383I18.
Después de su producción, los cinco mAbs quimerizados seleccionados se conjugaron con auristatina F (AuF) de acuerdo con los siguientes métodos para generar mAbs conjugados de MSLN-AuF en Cys80.
Purificación de anticuerpos con "desencapsulación": La desencapsulación de mAbs de conejo/ser humano es una etapa requerida para la conjugación en Cys80. Utilizando un AKTA Explorer (GE Healthcare), se equilibró una columna de proteína A (Ge Healthcare) con 10 Cv de fosfato de sodio 20 mM, EDTA 10 mM, pH 7,2. Luego se cargó la muestra, seguido de lavado del material no unido con 10 CV de tampón de equilibrio. La columna se lavó con 16 CV de fosfato sódico 20 mM, EDTA 10 mM, cisteína 5 mM, pH 7,2 a razón de 0,5 mL/min durante 16 h. Luego se lavó la columna con 60 CV de Tris 20 mM, pH 7,5 a razón de 0,5 mL/min durante 60 h. La muestra se eluyó utilizando 5 CV de glicina 0,1 M, pH 2,9. Las fracciones que contenían el mAb se agruparon y se dializaron en DPBS utilizando un MWCO 20K Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific). La recuperación de proteínas se determinó mediante el ensayo BCA.
Conjugación de auristatina F: Se incubaron mAbs-MSLN quimerizados purificados y desencapsulados que contenían el motivo C-X-X-A con maleimido-PEG2-auristatina F (mal-PEG2-AuF) (estructura que se muestra a continuación), diluidos a partir de una solución madre 10 mM en DMSO (Concortis Biosystems, San Diego, CA) en una relación molar de 5:1 (AuF:MAb) a una concentración final de anticuerpo de 5 mg/mL en 1x PBS. La conjugación se realizó durante 2 h a 22 °C. La mal-PEG2-AuF que no ha reaccionado se eliminó mediante purificación por desalación en un FPLC AKTA equipado con una columna de desalación 26/10 (GE Healthcare) utilizando 1x PBS como tampón de desarrollo. Se agruparon las fracciones que contenían anticuerpos y se determinó la concentración de proteínas mediante ensayo BCA.
Maleimido-PEG2-auristatina F:
Análisis UPLC/ESI-MS: Las muestras se redujeron añadiendo DTT a una concentración final de 20 mM, seguido de una incubación a 60 °C durante 3 min. Luego, las muestras se analizaron utilizando un espectrómetro de masas Waters Acquity UPLC y Q-Tof Premier. Las muestras (0,5-2 pg cada una) se inyectaron en una microcolumna de desalinización MassPrep a 65 °C, se eluyeron de la columna con un equilibrio de 5 min en el 95 % de la fase móvil A, un gradiente de 10 min (5-90 % de B), y un reequilibrio de 10 min en el 95 % de la fase móvil A, a 0,05 mL/min. La fase móvil A era ácido fórmico al 0,1 % en agua. La fase móvil B era ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo. El espectrómetro de masas Q-Tof se hizo funcionar en modo V de iones positivos con detección en el intervalo de 500 4000 m/z. Los parámetros de la fuente fueron los siguientes: tensión capilar, 2,25 kV (anticuerpo intacto) -2,50 kV, tensión del cono de muestreo, 65,0 V (anticuerpo intacto) o 50,0 V (anticuerpo intacto); temperatura de la fuente, 100 °C; temperatura de desolvatación, 250 °C; flujo de gas de desolvatación, 550 L/h. El pico de proteína se desconvolucionó utilizando la función MassLynx MaxEnt 1. Un análisis representativo se muestra en la FIG. 13. Típicamente, > 90 % de los mAbs conjugados tenían una relación de anticuerpo a agente funcional de 2, lo que significa que cada uno de los mAbs anti-MSLN quimerizados portaba una molécula de AuF conjugada en cada una de Cys801 y Cys802.
Citotoxicidad in vitro
A431 -MSLN son células derivadas de células A431 (ATCC® CRL-1555™) que expresan establemente MSLN humana. Se sub-cultivaron células A431-MSLN y se sembraron en placas de 96 pocillos a razón de 10.000 células/pocillo/100 pL en medio RPMI que contenía FBS al 10 % y se incubaron a 37 °C, 5 % de CO2 durante 16 horas. Los mAbs conjugados de MSLN-AuF en Cys80 se diluyeron en serie 1:4 en placas de dilución de pocillos profundos de 2 mL. Se añadieron compuestos diluidos (100 pL) a las placas de células, con concentraciones finales que oscilaron entre 0,28-75 pg/mL. Se utilizó Mal-PEG2-AuF a una concentración equimolar de los mAbs conjugados. Por ejemplo, 10 pg/mL de mAb conjugado de MSLN-AuF en Cys80 (DAR=2) equivalen a 0,14 pg/mL de mal-PEG2-AuF. Las placas se incubaron a 37 °C, 5% de CO2 durante 48 horas adicionales. Se desechó el medio, las placas se lavaron una vez con 200 pL de DPBS, se tiñeron con 50 pL de solución de cristal violeta al 0,2 % a 22 °C durante 15 minutos y luego se lavaron exhaustivamente con agua del grifo. Las placas se secaron al aire y el cristal violeta se disolvió con 200 pL de solución de SDS al 1%. La densidad óptica colorimétrica se determinó a 570 nm. Se utilizó Excel para extrapolar el número de células a partir de densidades ópticas y se utilizó GraphPad Prism 6 para representar el porcentaje de citotoxicidad.
Cuando se trataron células A431 MSLN-negativas con mAbs conjugados de MSLN-AuF en Cys80, no se observó citotoxicidad significativa, mientras que mal-PEG2-AuF fue citotóxico solo en la concentración más alta testada (FIG.
14A). Cuando las células A431-MSLN MSLN-positivas se trataron con mAbs conjugados de MSLN-AuF en Cys80, se observó una citotoxicidad significativa. En base a las curvas de dosis-respuesta (FIG. 14B), los mAbs conjugados de MSLN-AuF en Cys80 se podrían clasificar en 2 grupos:Citotoxicidad media- xi32405-AuF, y xi178F16-AuF; yCitotoxicidad alta- xi237N18-AuF, xi33011 -AuF y xi383I18-AuF.
Evaluación in vivo - Selección inicial de mAbs de conjugados de MSLN-AuF en Cys80
La eficaciain vivode los mAbs conjugados de MSLN-AuF en Cys80 se testó contra tumores que expresan MSLN, con el objetivo de seleccionar unos pocos compuestos con alta eficacia y baja toxicidad.
Las células A431-MSLN se propagaron en cultivo celular, se suspendieron en medio de crecimiento sin suero, se mezclaron 1:1 con Matrigel™ y se implantaron por vía subcutánea (s.c.) 5 millones de células/0,2 mL/ratón en ratones atímicos NCr nu/nu. El volumen del tumor se determinó mediante mediciones con calibre (mm) y utilizando la fórmula para una esfera elipsoide: Longitud x Anchura2/2 = Volumen (mm3). Cuando el volumen del tumor osciló entre 100250 mm3, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos de tratamiento. Los pesos corporales de los animales y el tamaño del tumor se registraron dos veces por semana. El diseño general de este estudio se resume en la Tabla 15. Los mAbs conjugados de MSLN-AuF en Cys80 se administraron por vía intravenosa (i.v.) Q7D comenzando el día de aleatorización (día 1), dos dosis en total.
Tabla 15.Diseño del estudio
La FIG. 15 muestra los volúmenes de tumores promedio entre diferentes grupos de tratamiento, hasta el día 18 después de la implantación, cuando 3 de 8 animales tuvieron que ser sacrificados en el grupo tratado con solución salina debido a la alta carga tumoral y/o ulceración del tumor. El día 4 posterior a la implantación corresponde al día en que los ratones fueron asignados aleatoriamente a diferentes grupos de tratamiento, con un volumen tumoral promedio de 157 a 160 mm3 en todos los grupos. En este día, se administró la primera dosis de mAbs conjugados de MSLN-AuF en Cys80 seguida de una segunda dosis el día 11.
Todos los mAbs conjugados de MSLN-AuF en Cys80 mostraron una respuesta antitumoral, como lo evidencia el hecho de que el volumen del tumor el día 18 fue 20 % o menos en comparación con el grupo tratado con solución salina (Tabla 16). Por el contrario, mal-PEG2-AuF no mostró respuesta antitumoral.
Tabla 16.Porcentae de volumen tumoral frente a rupo de solución salina
La toxicidad también se evaluó observando cualquier pérdida de peso corporal el día 18 (basado en el peso promedio de los animales en estudio en cada uno de los grupos) en comparación con el día 4, así como observando cualquier animal muerto o moribundo (Tabla 17). En el grupo tratado con xi32405-AuF, se observó una pérdida de peso corporal del 11 % en los animales supervivientes, así como en dos animales muertos/moribundos. En los grupos tratados con xi178F16-AuF, xi237N18-AuF y xi383I18-AuF, no se observó pérdida corporal significativa alguna, pero se observaron uno o dos animales muertos/moribundos. Todos los demás grupos de tratamiento no mostraron pérdida de peso corporal ni animales muertos/moribundos.
Tabla 17.Evaluación de la toxicidad bruta
En base a las respuestas antitumorales así como en la toxicidad mínima, se eligieron los mAbs xi33011-AuF y xi237N18-AuF para una evaluación adicional.
Evaluación de la especificidad diana de la actividad antitumoral mediada por mAbs conjugados de MSLN-AuF en Cys80
El método utilizado para este estudio fue el mismo que el descrito anteriormente(Evaluación in vivo-Selección inicial de mAbs conjugados de MSLN-AuF en Cys80).Además de las células A431-MSLN, que se implantaron en el flanco izquierdo de cada uno de los ratones el Día 4, se implantaron células A431 MSLN-negativas en el mismo ratón en el flanco opuesto (derecho) el Día 1. Las primeras células desarrollan tumores más rápidamente que este último y, por lo tanto, se implantaron 3 días más tarde, de modo que la primera dosis del fármaco de ensayo se administró cuando el tumor en ambos flancos tenía un volumen similar. El diseño general de este estudio se resume en la Tabla 18.Tabla 18.Diseño del Estudio
Tumores MSLN-positivos: La FIG. 16A muestra los volúmenes de tumores promedio entre diferentes grupos de tratamiento, hasta el día 18 después de la implantación, cuando 4 de 8 animales tuvieron que ser sacrificados en el grupo tratado con solución salina debido a la alta carga tumoral y/o ulceración del tumor. El Día 4 posterior a la implantación corresponde al día en que los ratones fueron asignados aleatoriamente a diferentes grupos de tratamiento, con un volumen del tumor promedio A431-MSLN de 169-178 mm3 en todos los grupos. En este día, se administró la primera dosis de mAbs conjugados de MSLN-AuF en Cys80 seguida de una segunda dosis el día 11. Respuestas antitumorales mediadas por xi33011-AuF que redujeron el volumen del tumor en el día 18 al 12 % en comparación con el grupo tratado con solución salina (Tabla 19). Respuestas antitumorales mediadas por xi237N18-AuF que redujeron el volumen del tumor al 24 % en comparación con el grupo tratado con solución salina (Tabla 19). Un test t de dos colas, no pareado, indicó un valor de p de 0,00039 y 0,00197, respectivamente, sugiriendo que estas respuestas antitumorales frente al grupo tratado con solución salina fueron estadísticamente significativas. Por el contrario, mal-PEG2-AuF o xi1-55-2-AuF, que fijan como objetivo endosialina/TEM1, no mostraron respuestas antitumorales significativas.
Tabla 19.P o r c e n t a j e d e v o l u m e n d e t u m o r d e A 431 - M S L N f r e n t e a g r u p o s o lu c ió n s a l in a
% Volumen
Tumores MSLN-negativos: La FIG. 16B muestra los volúmenes de los tumores promedio entre diferentes grupos de tratamiento, hasta el día 21 después de la implantación; este día corresponde al Día 18 de A431-MSLN después de la implantación, como se describió arriba, y el Día 7 después de la implantación corresponde al día en que los ratones fueron aleatorizados en diferentes grupos de tratamiento, con un volumen promedio de tumor de A431 que oscila entre 174-184 mm3 en todos los grupos. Respuestas antitumorales mediadas por xi33O11-AuF que redujeron el volumen del tumor el día 21 al 78 % en comparación con el grupo tratado con solución salina (Tabla 20). Respuestas antitumorales mediadas por mAb conjugado de xi237N18-AuF en Cys80 que redujeron el volumen del tumor en el día 21 al 64 % en comparación con el grupo tratado con solución salina (Tabla 20). Un test t de dos colas, no pareado, indicó un valor de p de 0,317 y 0,091, respectivamente, sugiriendo que estas respuestas antitumorales frente al grupo tratado con solución salina no fueron estadísticamente significativas. Estas respuestas fueron similares a las observadas con mal-PEG2-AuF o xi1-55-2-AuF.
Tabla 20. Porcentae de volumen tumoral A431 MSLN-ne ativo frente a rupo de solución salina
La toxicidad también se evaluó observando cualquier pérdida de peso corporal el Día 21 después de la implantación de células A431 en comparación con el Día 7, así como observando cualquier animal muerto o moribundo (Tabla 21). No se observó pérdida de peso corporal > 10% en ninguno de los grupos de tratamiento. Se observaron dos muertes tanto en el grupo tratado con xi33011-AuF como en el grupo tratado con xi237N18-AuF.
Tabla 21. Evaluación de la toxicidad bruta
Conclusión
Se generaron mAbs conjugados de MSLN-AuF en Cys80 y se seleccionaron en función de la citotoxicidadin vitroy la actividad antitumoralin vivo.El análisis de citotoxicidadin vitroindicó que estos compuestos fijaban como objetivo y mataban células tumorales MSLN-positivas pero no MSLN-negativas.
Todos los mAbs conjugados de MSLN-AuF en Cys80 testados tuvieron actividad antitumoral, algunos de los cuales parecían ser potencialmente más tóxicos que otros. La naturaleza de esta toxicidad no se caracterizó más. Se observó que los dos mAbs conjugados de MSLN-AuF en Cys80 testadosin vivopodían fijar como objetivo tumores MSLN-positivos e inhibir su crecimiento, mientras que no se observó efecto significativo alguno contra tumores MSLN-negativos en el flanco opuesto. Si bien el perfil de toxicidad de xi237N18 fue similar en ambos estudios, el tratamiento con xi33011 -AuF no mostró toxicidad en el primer estudio, pero se asoció con dos muertes en el segundo estudio. La naturaleza de esta toxicidad no se caracterizó más; sin embargo, como los ratones tratados con xi33011 -AuF todavía portaban un gran tumor MSLN-negativo en el otro flanco y, por lo tanto, estaban más enfermos que los animales del primer estudio, estos ratones pueden haber sido más sensibles al efecto de la lisis masiva de células tumorales contra el tumor MSLN-positivo.
Ejemplo 4 - Generación de conjugados de anticuerpo-colorante fluorescente
El mAb xi155D5 que contenía el motivo C-X-X-A se conjugó con el colorante 800CW (LI-COR Biotechnology, Lincoln, NE) para generar un mAb conjugado de xi155D5-800CW en Cys80 que tenía dos moléculas de colorante conjugadas en Cys801 y Cys802.
La conjugación de 800CW en Cys80 se llevó a cabo utilizando maleimida-(CH2)2-800CW (LiCor), en donde (CH2)2 es un enlazador alquilo. Brevemente, se disolvió maleimida-(CH2)2-800CW en DMSO al 100 % a una concentración final de 10 mM. Se añadió maleimida-(CH2)2- 800CW a xi155D5 (5 mg/ml en 1x PBS) en una relación molar de colorante:MAb de 5:1 y se incubó durante 4 h a temp. ambiente. El colorante no incorporado se eliminó mediante desalinización en columnas PD-10 (Millipore). Se pulió aún más xi155D5-800CW mediante cromatografía de exclusión por tamaño en Superdex 75. El material del volumen vacío se agrupó, se repartió en partes alícuotas y se congeló a -80 °C hasta su uso. SDS-PAGE y análisis de formación de imágenes de xi155D5-800CW reducido indicaron que el colorante estaba conjugado solo en la cadena ligera pero no en la cadena pesada (FIG. 17).
A ratones hembra inmunológicamente deficientes NCR se les inyectaron células tumorales humanas colo205 o HT-29 por vía subcutánea en las extremidades traseras derechas. El crecimiento del tumor se controló mediante medición con calibre. Cuando el volumen del tumor era de 200-300 mm3, se inyectó xi155D5-800CW a través de los velos de la cola a razón de 0,1 mg/200 gL/ratón. Para controlar la distribución de xi155D5-800CW mediante imágenes vivas fluorescentes, los animales se colocaron en una cámara de anestesia durante aproximadamente 3-4 minutos utilizando isofluorano/O2 hasta que los animales quedaron inconscientes. Se tomaron imágenes de los animales utilizando la configuración de fluorescencia de 745 de excitación y 840 de emisión en un instrumento IVIS® Lumina Il-Kinetic (PerkinElmer, Waltham, MA). Se tomaron imágenes de los lados dorsal, derecho, ventral e izquierdo en diferentes momentos como se indica en la FIG. 18. Después de cada imagen sucesiva, se permitió que el animal recuperara la conciencia en una cámara de recuperación que recibía oxígeno al 100 % seguido de aire normal.
Utilizando los modelos colo205 o HT-29, se observó que xi155D5-800CW se fijaba eficazmente como objetivo tumores humanos, como lo demuestra la localización específica del tumor de su señal fluorescente (FIG. 18).
Estos resultados demostraron que un mAb que contiene el motivo C-X-X-(no)F, K o C puede conjugarse con un colorante y que el mAb conjugado puede utilizarse para identificar y controlar el estado del tumor.
Ejemplo 5 - Generación de moléculas de unión a antígeno bivalentes/biespecíficas
Cuando un mAb que contiene el motivo C-X-X-(no)F, K o C se digiere con papaína o se expresa de forma recombinante como un fragmento Fab, contendrá una única Cys80 no apareada, ya que el Fab contiene solo una región Vk. Utilizando la química de conjugación ortogonal, los Fabs que contienen Cys80 se pueden utilizar para generar moléculas de unión a antígeno bivalentes/biespecíficas conjugadas químicamente tales como Fab-Fab bivalente/biespecífica, que se pueden utilizar para fijar como objetivo dos dianas independientes relevantes para la enfermedad, incluyendo dos ligandos. (citoquinas, quimioquinas), dos receptores de membrana o combinaciones de ligando/receptor, por nombrar unos pocos.
Como ejemplo, se generaron Fabs a partir de xi155D5 y xi1 -55-2 utilizando digestión limitada con papaína, seguida de cromatografía de proteína A para eliminar los fragmentos Fc y mAb no digeridos. Se demostró que los Fabs estaban completamente desencapsulados mediante espectrometría de masas (datos no mostrados). Posteriormente, los Fabs xi155D5 y xi1 -55-2 se conjugaron por separado utilizando maleimido-PEG4-dibencilciclo-octina (DBCO) y maleimido-PEG4-azida, respectivamente. El compuesto no conjugado se eliminó mediante cromatografía de desalinización y la ocupación completa de los sitios Cys80 se confirmó mediante espectrometría de masas (datos no mostrados). Luego, los fragmentos de xi155D5-maleimido-PEG4-DBCO y xi1-55-2-maleimido-PEG4-azida se conjugaron entre sí mediante química de clic libre de cobre fomentada por cepa mediante incubación en PBS a 22 °C durante 16 horas. Los productos conjugados se fraccionaron utilizando cromatografía de filtración en gel (FIG. 19A) y las diferentes especies se identificaron mediante SDS-PAGE en función de su tamaño molecular esperado (FIG.
19B). Se agruparon las fracciones que contenían la molécula de unión al antígeno bivalente/biespecífica xi155D5/xi1-55-2 y se confirmó la identidad de la molécula de unión al antígeno bivalente/biespecífica xi155D5/xi1 -55-2 mediante espectrometría de masas en función de su masa esperada (95.939 Da, FIG. 19C).
La biespecificidad de la molécula de unión al antígeno bivalente/biespecífica xi155D5/xi1 -55-2 se confirmó mediante análisis de inferometría de biocapa (BLI) utilizando un ensayo de sándwich inverso. Este análisis demostró la unión a CA9 humana inmovilizada (unida por el resto Fab xi155D5) seguido de la unión de TEM-1 soluble (unido por el resto Fab xi1 -55-2) (FIG. 20). Como se esperaba, mAb xi155D5, Fab xi155D5 y la molécula de unión al antígeno bivalente/biespecífica xi155D5/xi1 -55-2 se unieron a CA9 inmovilizada. Solo la molécula de unión a antígeno bivalente/biespecífica xi155D5/xi1 -55-2 inmovilizada con CA9 fue capaz de unirse también a endosialina/TEM-1 humana, como lo demuestra el cambio de respuesta adicional observado (FIG. 20, doble flecha). El análisis de resonancia de plasmón de superficie demostró que la afinidad de xi155D5/xi1 -55-2 por CA9 o TEM-1 era la misma o ligeramente reducida, respectivamente (Tabla 22).
Estos resultados demuestran que: 1) un mAb que contiene C-X-X-(no)F puede conjugarse con polipéptidos, tales como un fragmento de anticuerpo o un Fab; y 2) cuando dos mAbs o Fabs, de diferente especificidad, que contienen el C-X-X-(no)F se conjugan ortogonalmente, se puede generar un compuesto bivalente/biespecífico.
Tabla 22. Afinidad de la molécula de unión al antígeno bivalente/biespecífica xi155D5/xi1 -55-2 por CA9 y TEM-1
Ejemplo 6 - Generación de conjugados de anticuerpo-péptido
Los mAbs xi33011 y xi 1 -55-2 que contenían el motivo C-X-X-A se conjugaron con el péptido Ap(1 -16) modificado con azida (SEQ ID NO:40) (Tabla 23).
T l 2 . n i l i A 1 -1
La conjugación del péptido Ap(1 -16) en Cys80 se llevó a cabo utilizando un procedimiento de conjugación de dos etapas, mediante el cual Cys80 se conjugó primero con maleimido-dibencilciclo-octino (mal-DBCO). Luego se conjugó el péptido Ap(1 -16) modificado con azido con los mAbs modificados con DBCO utilizando química de clic libre de cobre fomentada por cepa. Brevemente, se incubó mAb (20 mg) con mal-DBCO (Click Chemistry Tools, cat A108) en una relación molar de mal-DBCO:MAb de 5:1 durante 16 h a 22 °C en 1x DPBS. El mal-DBCO no incorporado se eliminó del mAb conjugado mediante cromatografía de desalinización utilizando una columna HiPrep 26/10 con 1x DPBS como tampón de desarrollo. Se confirmó una eficacia de conjugación del 100 % (sin evidencia de cadena ligera no conjugada) para los dos mAbs mediante LC-MS (FIG. 21 y Tabla 24). Cada uno de los mAbs (50 gL/cada uno, 95 gg y 70 gg de xi 1 -55-2 y xi33011, respectivamente) se incubó con el péptido Ap(1-16) en una relación molar péptido:MAb de 20:1 en 1X DPBS durante 16 h a 22 °C. Las conjugaciones se analizaron mediante SDS-PAGE. Las muestras se procesaron en condiciones reductoras, con DTT 20 mM como reductor y se calentaron a 75 °C durante 10 min antes de la separación.
El análisis de SDS-PAGE indicó un retraso de la migración de la cadena ligera conjugada con péptido acompañado de una cadena ligera no conjugada detectable, lo que indica una conjugación eficaz (FIG. 21). No se observaron cambios en la movilidad de las cadenas pesadas. Luego, los conjugados se desalinizaron utilizando columnas de desalación por rotación Zeba 40k MWCO de 0,5 ml (Thermo-Fisher) para eliminar el péptido no conjugado y se analizaron mediante LC-MS. El análisis de espectrometría de masas (FIG. 22A-F) indicó que el péptido estaba conjugado con las cadenas ligeras de xi1 -55-2 y xi33011 con eficiencias del 85 %-100 % (Tabla 24).
Estos resultados demostraron que un mAb que contiene el motivo C-X-X-(no)F, K o C puede conjugarse eficazmente con péptidos.
T l 24. m ri n i n
Tabla 25.Anticuerpos monoclonales y LC y HC correspondientes
��
Tabla17.G=cjandas d= CDR

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método para generar una inmunoglobulina conjugada, comprendiendo el método:
incubar una inmunoglobulina derivada de conejo con un tampón reductor suave que comprende cisteína, ditiotreitol (DTT) o tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) para desencapsular una cisteína en la posición de aminoácido 80 ("Cys80") en una región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina, la Cys80 basada en el sistema de numeración de Kabat o Chothia, en donde la inmunoglobulina comprende una región variable de la cadena pesada y la región variable de cadena ligera; y
conjugar un compuesto reactivo con tiol con Cys80, en donde el compuesto reactivo con tiol comprende un grupo reactivo con tiol.
2. El método de la reivindicación 1, que comprende, además, incubar la inmunoglobulina con un tampón oxidante basado en Tris, basado en aminoácidos o basado en amina primaria después de la incubación con el tampón reductor suave.
3. El método de la reivindicación 2, en el que el tampón oxidante basado en aminoácidos es un tampón oxidante basado en glutamina o arginina.
4. El método de la reivindicación 2 o 3, que comprende, además, inmovilizar la inmunoglobulina en una matriz antes de la incubación con el tampón reductor suave y eluir la inmunoglobulina de la matriz después de la incubación con el tampón oxidante.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que el compuesto reactivo con tiol está unido a un agente funcional.
6. El método de la reivindicación 5, en el que el agente funcional comprende un fluoróforo, colorante fluorescente, polipéptido, inmunoglobulina, antibiótico, ácido nucleico, radionucleido, enlazador químico, molécula pequeña, quelante, lípido o fármaco.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que el compuesto reactivo con tiol está unido a un segundo compuesto reactivo con tiol, estando unido el segundo compuesto reactivo con tiol a una segunda inmunoglobulina derivada de conejo que tiene una segunda región variable de la cadena pesada y una segunda región variable de la cadena ligera, teniendo la segunda región variable de la cadena ligera una cisteína en la posición del aminoácido 80 ("Cys802"), la Cys802 basada en el sistema de numeración de Kabat o Chothia, en donde el segundo compuesto reactivo con tiol comprende un segundo grupo reactivo con tiol unido a la Cys802.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que la Cys801, Cys802 o ambas no están apareadas.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones previas, que comprende, además, sustituir un aminoácido en la posición 83 de la región variable de la cadena ligera con un residuo de aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys, la posición 83 se basa en el sistema de numeración de Kabat o Chothia.
10. Un método para generar una molécula de unión a antígeno, comprendiendo el método:
incubar una primera inmunoglobulina derivada de conejo con un tampón reductor suave que comprende cisteína, ditiotreitol (DTT) o tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) para desencapsular una Cys801 en una región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina, en donde la inmunoglobulina comprende una primera región variable de la cadena pesada y una primera región variable de la cadena ligera y la Cys801 se basa en el sistema de numeración de Kabat o Chothia;
incubar una segunda inmunoglobulina derivada de conejo con un tampón reductor suave que comprende cisteína, ditiotreitol (DTT) o tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) para desencapsular una Cys802 en una región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina, en donde la inmunoglobulina comprende una segunda región variable de la cadena pesada y una segunda región variable de la cadena ligera y la Cys802 se basa en el sistema de numeración de Kabat o Chothia;
conjugar un primer compuesto reactivo con tiol con la Cys80 desencapsulada para generar una primera inmunoglobulina conjugada y conjugar un segundo compuesto reactivo con tiol con la Cys80 desencapsulada para generar una segunda inmunoglobulina conjugada; e
incubar la primera inmunoglobulina conjugada y la segunda inmunoglobulina conjugada para generar la molécula de unión a antígeno.
11. El método de la reivindicación 10, en el que el primer compuesto reactivo con tiol comprende un primer grupo reactivo con tiol y el segundo compuesto reactivo con tiol comprende un segundo grupo reactivo con tiol.
12. El método de la reivindicación 10 u 11,
(a) en el que la Cys801, la Cys802 o ambas no están apareadas;
(b) en donde el primer compuesto reactivo con tiol comprende, además, un primer agente funcional y el segundo compuesto reactivo con tiol comprende, además, un segundo agente funcional, o ambos;
(c) en el que la primera inmunoglobulina es un primer Fab, la segunda inmunoglobulina es un segundo Fab, o ambos; y/o
(d) que comprende, además, sustituir un aminoácido en la posición 83 de la primera región variable de la cadena ligera con un residuo de aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys, sustituir un aminoácido en la posición 83 de la segunda región variable de la cadena ligera con un residuo de aminoácido distinto de Phe, Lys o Cys, o ambos, basándose la posición 83 de la primera y segunda regiones variables de la cadena ligera en el sistema de numeración de Kabat o Chothia.
13. La molécula de unión a antígeno producida de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 10-12.
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