ES2963268T3 - Proteína 2 que contiene el dominio de esperma móvil e inflamación - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un inhibidor de la proteína 2 que contiene el dominio móvil del esperma (MOSPD2) para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno inflamatorio, en el que el inhibidor es un polipéptido, ADN o ARN. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteína 2 que contiene el dominio de esperma móvil e inflamación

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un inhibidor de la Proteína 2 que contiene el dominio de esperma móvil (MOSPD2, del inglésMotile Sperm Domain containing Protein 2)para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno inflamatorio, en donde el inhibidor es un agente de silenciamiento de ARN, en donde el agente de silenciamiento de ARN inhibe o silencia específicamente la expresión de MOSPD2. La invención se refiere además a un inhibidor de MOSPD2 para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno inflamatorio, en donde el inhibidor es ADN, en donde el ADN hibrida con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido MOSPD2.

Antecedentes de la invención

Los leucocitos son las células del sistema inmunitario que participan en la defensa del cuerpo contra enfermedades infecciosas y materiales extraños. Los monocitos son un tipo de leucocitos y tienen funciones cruciales en la inmunidad innata y adaptativa, la vigilancia inmunitaria y eliminación de partículas. Si bien una subpoblación de monocitos es "residente" y se reclutado en los tejidos independientemente de los estímulos inflamatorios para ayudar en la vigilancia en el estado estacionario, la curación de heridas y la resolución de la inflamación, la mayoría (80-90 %) de los monocitos circulantes humanos se clasifican como "inflamatorios". Los monocitos circulantes pueden detectar estímulos inflamatorios y migrar rápidamente a través del endotelio vascular o linfático hacia la periferia, donde pueden diferenciarse en macrófagos y células dendríticas (las CD) que cooperan con subpoblaciones de células adicionales para propiciar la inflamación. Si bien desempeñan un papel necesario en la defensa del hospedador, no obstante, los monocitos se identifican como mediadores cruciales de varios trastornos inflamatorios, incluyendo ateroesclerosis, artritis reumatoide (AR) y esclerosis múltiple (EM).

Los receptores de quimiocinas y las moléculas de adhesión desempeñan un papel clave en la regulación del tráfico de leucocitos. Una compleja serie de receptores de quimiocinas, receptores acoplados a proteína G (GPCR) que se expresan diferencialmente en linajes y subpoblaciones de leucocitos, regula qué tipos de células migrarían y a qué tejido, en diferentes condiciones. Las quimiocinas o citocinas quimiotácticas son proteínas secretadas que regulan la migración y activación de leucocitos y células estromales. La unión de quimiocinas a receptores de quimiocinas activa vías de señalización tales como las vías de MAPK/ERK y PI3K/AKT, dando como resultado la fosforilación de ERK y AKT, respectivamente. En el caso de los monocitos inflamatorios, la salida de la médula ósea a través de una monocapa de células endoteliales (diapédesis) para ingresar al sistema circulatorio (intravasación) y migrar al tejido inflamado depende de la señalización del receptor del motivo C-C 2 (CCR2), en respuesta a la activación por el ligando motivo C-C de quimiocina 2 (CCL) (también conocido como proteína quimiotáctica de monocitos-1); m CP-1) y CCL7 (MCP-3). Por otra parte, la migración constitutiva de monocitos residentes a tejidos no inflamados depende principalmente de c CL3 (también conocida como Proteína inflamatoria de macrófagos-1a; MIP-1a) y del ligando de quimiocina (motivo C-X3-C) 1 (CX3CL1).

La inhibición de la migración de células inflamatorias (por ejemplo, quimiotaxia de leucocitos) hacia sitios inflamatorios es un enfoque antiinflamatorio atractivo para tratar enfermedades crónicas. La supresión de la acumulación de monocitos y/o macrófagos no deseados en tejidos crónicamente inflamados tiene potencial terapéutico y, en consecuencia, los inhibidores de la migración han demostrado resultados terapéuticos beneficiosos en modelos animales y ensayos clínicos. No obstante, ha habido varios ensayos clínicos de fase II fallidos con quimiocinas y antagonistas de los receptores de quimiocinas, posiblemente debido a la redundancia del receptor diana y la complejidad de enfermedades heterogéneas tales como la esclerosis múltiple y la artritis reumatoide.

Adicionalmente, la inhibición de la inflamación también es importante para el tratamiento de la osteoporosis, dado que la inflamación ejerce influencia sobre el recambio óseo, induciendo la osteoporosis.

La Proteína 2 que contiene el dominio de esperma móvil (MOSPD2) es una proteína de 518 aminoácidos de longitud, altamente conservada, con un 90 % de homología entre el ser humano y el ratón. Los análisis bioinformáticos indican que MOSPD2 contiene una región CRAL-TRIO, llamada así por la proteína de unión a retinaldehído celular (CRALBP) y la proteína TRIO. MOSPD2 también contiene una región estructuralmente relacionada con la proteína principal del esperma del nematodo y una región transmembrana. Aún no se ha descrito una función biológica para MOSPD2.

El documento WO 2013/088245 divulga métodos específicos para tratar enfermedades o trastornos inflamatorios. El documento WO 01/87981 describe anticuerpos humanos que se unen a AILIM (molécula inmunomoduladora de linfocitos inducible por activación).

Sumario de la invención

La presente invención, que se define en las reivindicaciones, se refiere a un inhibidor de la Proteína 2 que contiene el dominio de esperma móvil (MOSPD2) para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno inflamatorio, en donde el inhibidor es un agente de silenciamiento de ARN, en donde el agente de silenciamiento de ARN inhibe o silencia específicamente la expresión de MOSPD2.

En algunas realizaciones, el agente de silenciamiento de ARN es capaz de inducir interferencia por ARN. En algunas realizaciones, el agente de silenciamiento de ARN es un ARN horquillado corto (ARNhc). En algunas realizaciones, el agente de silenciamiento de ARN es un ARN de antisentido.

La presente invención se refiere además a un inhibidor de la Proteína 2 que contiene el dominio de esperma móvil (MOSPD2) para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno inflamatorio, en donde el inhibidor es ADN, en donde el ADN hibrida con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido MOSPD2.

En algunas realizaciones, el inhibidor es un ADN de antisentido, un ADN señuelo(decoy),un ADN bicatenario, un ADN monocatenario, un ADN formando complejo, un ADN encapsulado, un ADN vírico, un ADN plasmídico o un sistema de edición génica. En algunas realizaciones, el sistema de edición génica es un sistema CRISPR-CAS9.

En algunas realizaciones, el inhibidor de MOSPD2 para su uso de acuerdo con la invención (como se describe anteriormente en el presente documento y en las reivindicaciones) inhibe, previene o reduce la incidencia de una o más actividades en una célula, en donde la una o más actividades es uno o más de: expresión de MOSPD2, migración de células inflamatorias (por ejemplo, migración de leucocitos o monocitos), quimiotaxia (por ejemplo, quimiotaxia de leucocitos o monocitos), una vía de señalización de quimiocinas, fosforilación de ERK y fosforilación de AKT. En algunas realizaciones, el inhibidor de MOSPD2 para su uso de acuerdo con la invención inhibe a MOSPD2 en una célula, en donde dicho uso comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz del inhibidor de MOSPD2.

En algunas realizaciones, el inhibidor de MOSPD2 se une a MOSPD2 expresado en una superficie celular (por ejemplo, una superficie de célula inflamatoria).

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra la inhibición de la expresión del ARNm de la Proteína 2 que contiene el dominio de esperma móvil (MOSPD2) obtenida con ARN horquillado pequeño (ARNhc) contra MOSPD2 (sh-MOSPD2). Las células U937 se transdujeron con partículas de lentivirus de control (sh-Cont) o partículas de lentivirus dirigidas contra tres regiones de ARNm diferentes de MOSPD2 (marcadas como Sh-MoSpD2 n.° 12, n.° 25, n.° 42, n.° 62 y n.° 96). La expresión del ARNm de MOSPD2 en las células se evaluó mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (PCR) y se normalizó mediante la expresión de p-actina. Se indica la disminución porcentual de la expresión de MOSPD2 con sh-MOSPD2 en comparación con sh-control.

FIG. La Figura 2 muestra el efecto de la inhibición de MOSPD2 sobre la migración de células U937 inducida por RANTES. Se analizó la migración de células U937 transducidas con partículas de lentivirus de control (Lenti sh-Cont) o sh-MOSPD2 (Lenti sh-MOSPD2) hacia RANTES en un ensayo de transpocillo. Los resultados mostrados son porcentajes medios de células migratorias ± desviación típica de pocillos por triplicado. *p <0,05.

FIG. La Figura 3 muestra efectos adicionales de la inhibición de MOSPD2 sobre la migración de células U937 inducida por RANTES. Se trataron células U937 transducidas con partículas de lentivirus de control (Lenti sh-Cont) o sh-MOSPD2 (Lenti sh-MOSPD2) dirigidas contra diferentes regiones en el transcrite del gen (Lenti sh n.° 25 o Lenti sh n.° 42 o Lenti n.° 96) con disolvente (Sol) y luego se analiza la migración hacia RANTES en un ensayo de transpocillo. Los resultados mostrados son los porcentajes medios de células migratorias ± desviación típica de pocillos por triplicado.

La FIG. 4 presenta imágenes de transferencias de Western que muestran el efecto de la inhibición de MOSPD2 sobre los niveles de ERK fosforilada (p-ERK) y AKT fosforilada (p-AKT) después de la activación con RANTES. Las células U937 transducidas con partículas de lentivirus de control (Lenti sh-Cont) o sh-MOSPD2 (Lenti sh-MOSPD2 n.° 25 o Lenti sh-MOSPD2 n.° 42) se trataron con RANTES durante 2 o 5 minutos. La expresión de la proteína de choque térmico 90 (HSP90) también se muestra como control de carga.

FIG. La Figura 5 muestra el efecto de la inhibición de MOSPD2 sobre la migración de células U937 inducida por quimiocinas. Se probó la migración hacia MCP-3 de células U937 transducidas con partículas de lentivirus de control (Lenti sh-Cont) o partículas de lentivirus Lenti con sh-MOSPD2 (Lenti sh-MOSPD2), MCP-1, RANTES y SDF-1 en un ensayo de transpocillo. Los resultados mostrados son los porcentajes medios de células migratorias ± desviación típica de pocillos por triplicado. *p <0,05.

La FIG. 6 presenta imágenes de transferencias de Western que muestran el efecto de la inhibición de MOSPD2 sobre los niveles de ERK fosforilada (p-ERK) y AKT fosforilada (p-AKT) después de la activación con quimiocinas. Las células U937 transducidas con partículas de lentivirus de control (sh-Con) o sh-MOSPD2 se trataron con RANTES, MCP-3, MCP-1 y SDF-1. La expresión de tubulina (Tub) también se muestra como control de carga. La FIG. 7 muestra el efecto de la inhibición de MOSPD2 sobre la proliferación de células U937. Se sembraron células U937 transducidas con partículas de lentivirus de control (Lenti sh-Cont, -♦ -) o partículas de lentivirus con sh-MOSPD2 (Lenti sh-MOSPD2, -■-) y se contaron cada 24 horas durante tres días consecutivos (día 1, día 2 y día 3). Los resultados mostrados son el número medio de células por día ± desviación estándar de triplicados. Las FIG. 8A-8B presentan imágenes de transferencias de Western que muestran que los anticuerpos policlonales a-MOSPD2 de conejo aislados detectan y precipitan MOSPD2 humana endógena. En la FIG. 8A, el lisado celular se preparó a partir de células U937 transducidas con partículas de control o partículas de lentivirus con sh-MOSPD2 (Lenti sh-Control o Lenti sh-MOSPD2, respectivamente). Las muestras se cargaron en un gel y se transfirieron con los anticuerpos a-MOSPD2 aislados. También se determinó la expresión de HSP90 como control de carga. En la FIG. 8B, se inmunoprecipitó lisado de células U937 con los anticuerpos a-MOSPD2 aislados o IgG de conejo como control. Los precipitados resultantes se analizaron mediante inmunotransferencia con los anticuerpos a-MOSPD2 aislados, seguido de incubación con anticuerpo de cabra anti-conejo-HRP.

La FIG. 9 presenta un histograma que muestra que MOSPD2 se expresa en la superficie celular de células HEK293 transfectadas. En la FIG. 9, se transfectaron células HEK293 con un vector vacío o un plásmido HA-rhMOSPD2 (MOSPD2-HA). Las células transfectadas se recogieron y se tiñeron con anticuerpo anti HA-PE. La expresión de MOSPD2 se evaluó utilizando FACSCalibur (BD Bioscience).

La FIG. 10 presenta una imagen que muestra que MOSPD2 está localizada en la fracción de membranas en monocitos CD14 humanos aislados de sangre periférica. La FIG. 10 se basa en un análisis de fracciones de proteínas subcelulares de monocitos CD14 humanos y fracciones de membranas (M) y citoplásmicas (C), usando anticuerpo anti-MOSPD2. Se utilizaron anticuerpos anti-ERK o anti-MHC de Clase I para evaluar la pureza del fraccionamiento de proteínas citoplásmicas y de membrana, respectivamente.

La FIG. 11 presenta imágenes de transferencias de Western que muestran que VB-201 se une a MOSPD2 del lisado celular de monocitos CD14 humanos. Se añadió VB-201 o VB-221 (OB201 u OB221) marcado al lisado celular y se precipitaron las proteínas. Las muestras se procesaron en un gel y se transfirieron contra TLR2 y MOSPD2, mostrándose los resultados en la FIG. 11.

La FIG. 12 presenta un histograma que muestra que las células HEK293 teñidas positivamente para hemaglutinina (HA) tienen una fuerte unión a OB<2>O<1>, pero no a OB221. La FIG. 12 muestra así que VB-201 se une a MOSPD2 en la superficie celular de células HEK293 transfectadas con el vector de expresión de MOSPD2 etiquetado con HA. En la FIG. 12, se incubaron células HEK293 con VB-201 o VB-221 (OB201 u OB221) marcado seguido de tinción con estreptavidina-APC.

La FIG. 13 enumera 17 clones de anticuerpos monoclonales (mAb) de F(ab')<2>anti-MOSPD2 que se identificaron después de una selección primaria para determinar la unión a células que sobreexpresan MOSPD2. Un análisis adicional de los clones en cuanto a la unión de MOSPD2 con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) identificó 12 clones que tenían valores de D.O. superiores a 5 veces sobre el fondo (* en la FIG. 13). Las FIG. 14A-14B muestran la unión de dos clones de mAb de F(ab')<2>anti-MOSPD2 representativos para células que sobreexpresan MOSPD2.

Las FIG. 15A-15D muestran la especificidad de la expresión celular y la localización de MOSPD2.

Las FIG. 16A-16C muestran que MOSPD2 se expresa en monocitos que se han infiltrado en tejidos inflamados. Las FIG. 17A-17B muestran que MOSPD2 no afecta la fosforilación de STAT1 inducida por IFN gamma (p-Stat1) o la fosforilación de ERK1/2 mediada por PMA (p-ERK1/2), respectivamente.

Descripción detallada de la invención

La divulgación técnica que se expone más adelante puede, en algunos aspectos, ir más allá del alcance de las reivindicaciones. Los elementos de la divulgación que no entran en el alcance de las reivindicaciones se proporcionan a título informativo.

Definiciones generales

Las expresiones "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugaciones significan "que incluye pero no limitado a".

La expresión "que consiste en" significa "que incluye y se limita a".

La expresión "que consiste esencialmente en" significa el material especificado de una composición, o las etapas especificadas de un método, y los materiales o etapas adicionales que no afectan materialmente las características básicas del material o método.

El término "ilustrativo" se usa en el presente documento con el significado de "que sirve como un ejemplo, caso o ilustración". Cualquier realización descrita como "ilustrativa" no debe interpretarse necesariamente como preferida o ventajosa sobre otras realizaciones y/o excluir la incorporación de características de otras realizaciones.

La palabra "opcionalmente" se usa en el presente documento con el significado de "se proporciona en algunas realizaciones y no se proporciona en otras realizaciones". Cualquier realización particular de la invención puede incluir una pluralidad de características "opcionales" a menos que dichas características entren en conflicto.

Como se usa en el presente documento, la forma en singular "un", "una" y "el/la" incluyen referencias en plural, salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Por ejemplo, la expresión "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.

Como se usa en el presente documento, la expresión "aproximadamente" que modifica una cantidad relacionada con la invención se refiere a la variación en la cantidad numérica que puede producirse, por ejemplo, a través de pruebas y manipulación de rutina; a través de error involuntario en dichas pruebas y manipulación; a través de diferencias en la fabricación, la fuente o la pureza de los ingredientes empleados en la invención; y similares. En una realización, el término "aproximadamente" significa dentro del 10% del valor numérico indicado. En otra realización, el término "aproximadamente" significa dentro del 5 % del valor numérico indicado.

A lo largo de la presente memoria descriptiva, diversas realizaciones de la presente invención pueden presentarse en un formato de intervalo. Ha de comprenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad, y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. Por consiguiente, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha divulgado específicamente todos los posibles subintervalos, así como valores numéricos individuales en ese intervalo. Por ejemplo, la descripción de un intervalo, tal como de 1 a 6 debe considerarse que tienen subintervalos específicamente divulgados tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6etc.,así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto es aplicable independientemente de la amplitud del intervalo.

Como se usa en el presente documento, el término "método" se refiere a formas, medios, técnicas y procedimientos para llevar a cabo una tarea dada incluyendo, pero no limitado a, las formas, medios, técnicas y procedimientos tanto conocidos como desarrollados a partir de formas, medios, técnicas y procedimientos conocidos por profesionales de la técnica química, farmacológica, biológica, bioquímica y médica.

Como se usa en el presente documento, el término "tratar" incluye anular, inhibir sustancialmente, ralentizar o invertir la progresión de una afección, aliviar sustancialmente síntomas clínicos o estéticos de una afección o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos o estéticos de una afección.

Como se usa en el presente documento, "MOSPD2" se refiere a cualquiera de los polipéptidos de las SEQ ID NO: 1 4, o cualquier variante de las mismas que tenga una secuencia al menos el 98 % o al menos el 99 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4. En algunos casos, la MOSPD2 como se define anteriormente está codificada por un polinucleótido de una cualquiera de las SEQ ID NO: 5-8, o cualquier polinucleótido al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99% idéntico a cualquiera de las SEQ ID NO: 5-8. Las secuencias de polinucleótidos que codifican MOSPD2 pueden optimizarse mediante codones para su expresión en un organismo particular mediante métodos conocidos en la técnica.

Como se usa en el presente documento, "una actividad de MOSPD2" o "una actividad MOSPD2" incluye cualquier función conocida o descrita en el presente documento de la Proteína 2 que contiene el dominio de esperma móvil. Dichas actividades incluyen, por ejemplo, regulación de la migración de células inflamatorias (por ejemplo, migración de leucocitos o monocitos), quimiotaxia, migración de leucocitos inducida por quimiocinas o quimiotaxia, vías de señalización de receptores de quimiocinas, vías de señalización de factores de crecimiento, fosforilación del receptor de EGF, fosforilación de ERK, fosforilación de AKT, fosforilación de FAK o inflamación.

Como se usa en el presente documento, "una célula inflamatoria" incluye, pero sin limitación, un leucocito, granulocito, neutrófilo, basófilo, eosinófilo, monocito, macrófago o mastocito.

Como se usa en el presente documento, "quimiotaxia" se refiere al movimiento de una célula en respuesta a un estímulo químico. La quimiotaxia incluye, pero sin limitación, el movimiento de una célula inflamatoria, tal como un monocito, hacia una quimiocina.

Como se usa en el presente documento, "un inhibidor de MOSPD2" e "inhibidor de MOSPD2" se refieren a cualquier compuesto que regula negativamente una actividad de MOSPD2. De acuerdo con la invención, el inhibidor es<a>D<n>o un agente de silenciamiento de ARN, como se define anteriormente en el presente documento y en las reivindicaciones. El inhibidor puede ser, por ejemplo, una iARN, miARN, ARNpi, ARNhc, ARN de antisentido, ADN de antisentido, molécula señuelo, ADN señuelo, ADN bicatenario, ADN monocatenario, ADN formando complejo, ADN encapsulado, ADN vírico, ADN plasmídico, ARN desnudo, ARN encapsulado, ARN vírico, ARN bicatenario, una molécula capaz de generar interferencia por ARN, o combinaciones de las mismas, que hibrida con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido MOSPD2.

El inhibidor también puede ser, por ejemplo, un sistema CRISPR-CAS9 de grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares. Los sistemas CRISPR-CAS9 se han descrito en la bibliografía y pueden incluir, por ejemplo, CAS9 y un ARN de guía. También se han descrito en la bibliografía otras técnicas de edición génica, y también pueden usarse.

La expresión "porcentaje de identidad", como se conoce en la materia, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, determinada por comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad" e "identidad de secuencia" también significan el grado de relación de secuencia entre secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, según sea el caso, según lo determinado por la coincidencia entre cadenas de dichas secuencias. La "identidad" y la "similitud" se pueden calcular fácilmente mediante métodos conocidos y recursos disponibles públicamente, incluidos, entre otros, los descritos en: (1) Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Ed.) Oxford University: NY (1988); (2) Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993); (3) Computer Analysis of Sequence Data, Parte I (Griffin, A. M. y Griffin, H. G., Eds.) Humania: NJ (1994); (4) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987); y (5) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. y Devereux, J., Eds.) Stockton: NY (1991).

Un polinucleótido puede "hibridar" con otro polinucleótido, cuando una forma monocatenaria del fragmento de ácido nucleico puede hibridar con el otro fragmento de ácido nucleico en las condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica de la solución. Las condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas y se ejemplifican, por ejemplo, en Sambrooket al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), en particular el Capítulo 11 y la Tabla 11.1 del mismo. Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la "rigurosidad" de la hibridación. Las condiciones de rigurosidad se pueden ajustar para cribar de fragmentos moderadamente similares (tal como secuencias homólogas de organismos relacionados de forma distante), hasta fragmentos muy similares (tal como genes que duplican enzimas funcionales de organismos estrechamente relacionados). Los lavados después de la hibridación determinan las condiciones de rigurosidad. Un conjunto ilustrativo de condiciones rigurosas utiliza una serie de lavados que comienzan con SSC 6x, SDS al 0,5 % a temperatura ambiente durante 15 min, luego se repite con SSC 2x, SDS al 0,5 % a 45 °C durante 30 min y luego se repite dos veces con SSC 0,2x, SDS al 0,5 % a 50 °C durante 30 min. Otro conjunto de condiciones rigurosas ilustrativo utiliza temperaturas más altas en las que los lavados son idénticos a los anteriores, excepto por la temperatura de los dos lavados finales de 30 minutos en SSC 0,2x, El SDS 0,5 % se aumentó a 60 °C. Este conjunto de condiciones rigurosas se puede modificar a una "condición altamente rigurosa" añadiendo dos lavados finales en SSC 0,1x, SDS al 0,1 % a 65 °C. Un conjunto ilustrativo adicional de condiciones rigurosas incluye la hibridación en SSC 0,1x, SDS al O, 1 %, 65 °C y lavados con SSC 2x, SDS al 0,1 %, seguido de SSC 0,1x, SDS al 0,1 %, por ejemplo.

La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la rigurosidad de la hibridación, los desapareamientos entre bases son posibles. La rigurosidad apropiada para hibridar ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. Cuanto mayor sea el grado de similitud u homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor será el valor de la Tm para híbridos de ácidos nucleicos que tengan esas secuencias. La estabilidad relativa (correspondiente a una Tm más alta) de las hibridaciones de ácidos nucleicos disminuye en el siguiente orden: A<r>N:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. Para híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud, se han obtenido ecuaciones para calcular la Tm (véase Sambrooket al.,9,50-9,51). Para hibridaciones con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos, la posición de los desapareamientos se vuelve más importante y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook,et al.,citado anteriormente, 11,7-11,8). En una realización, la longitud de un ácido nucleico hibridable es de al menos aproximadamente 10 nucleótidos. En otras realizaciones, una longitud mínima para un ácido nucleico hibridable es de al menos aproximadamente 15 nucleótidos, o de al menos aproximadamente 20 nucleótidos.

El término "sal" incluye tanto sal interna como sal externa. En algunas realizaciones, la sal es una sal interna, es decir,una estructura zwitteriónica. En algunas realizaciones, la sal es una sal externa. En algunas realizaciones, la sal externa es una sal farmacéuticamente aceptable que tiene un contraión adecuado. En la técnica se conocen contraiones adecuados para uso farmacéutico.

El término "VB-201" se refiere a 1-hexadecil-2-(4'-carboxi)butil-glicero-3-fosfocolina. VB-201 puede ser un enantiómero quiral de 1-hexadecil-2-(4'-carboxi)butil-glicero-3-fosfocolina, es decir, ya sea el enantiómero(R)((R)-1-hexadecil-2-(4'-carboxi)butil-sn-glicero-3-fosfocolina) o el enantiómero (S) ((S)-1-hexadecil-2-(4'-carboxi)butil-sn-glicero-3-fosfocolina), o una mezcla de los mismos (por ejemplo, un racemato). Como entienden los expertos en la materia, designar VB-201 como enantiómero (R) o enantiómero (S) no requiere una pureza enantiomérica del 100 %, sino que en cambio se refiere a un enantiómero único sustancialmente enriquecido, ya sea como un isómero R o S (por ejemplo, que tiene un exceso enantiomérico de al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o más). Por consiguiente, VB-201 puede ser, por ejemplo, (R)-1-hexadecil-2-(4'-carboxi)butil-sn-glicero-3-fosfocolina que tiene al menos el 90 % de exceso enantiomérico. El término OB201 se refiere a VB-201 unido a ovoalbúmina como se describe en el apartado de Ejemplos.

El término "VB-221" se refiere a 1-(2'-octil)dodecil-2-(4'-carboxi)butil-glicero-3-fosfocolina. VB-221 puede ser un enantiómero quiral de 1-(2'-octil)dodecil-2-(4'-carboxi)butil-glicero-3-fosfocolina, es decir, ya sea el enantiómero (R) o el enantiómero (S), o cualquier mezcla de los mismos (por ejemplo, un racemato). Por consiguiente, VB-221 puede ser, por ejemplo, (R)-1-(2'-octil)dodecil-2-(4'-carboxi)butil-sn-glicero-3-fosfocolina. De forma similar, como entienden los expertos en la materia, designar VB-221 como enantiómero (R) o enantiómero (S) no requiere una pureza enantiomérica del 100 %, sino que en cambio se refiere a un enantiómero único sustancialmente enriquecido, ya sea como un isómero R o S (por ejemplo, que tiene un exceso enantiomérico de al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o más). En particular, VB-221 puede ser, por ejemplo, (R)-1-1-(2'-octil)dodecil-2-(4'-carboxi)butil-sn-glicero-3-fosfocolina que tiene al menos el 90% de exceso enantiomérico. El término OB221 se refiere a VB-221, unido a ovoalbúmina como se describe en el apartado de Ejemplos.

Se aprecia que determinadas características de la invención, que están, por motivos claridad, descritas en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una sola realización. Por el contrario, diversas características de la invención, que están, por brevedad, descritas en el contexto de una sola realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada, o como sea adecuado en cualquier otra realización descrita de la invención. Determinadas características descritas en el contexto de diversas realizaciones no han de considerarse características esenciales de esas realizaciones, a menos que la realización no funcione sin esos elementos.

MOSPD2 e inhibidores de MOSPD2

La presente invención se basa, en parte, en la identificación de una función biológica para la Proteína 2 que contiene el dominio de esperma móvil (MOSPD2). Se ha descubierto que la inhibición de MOSPD2 inhibe la migración de monocitos hacia diferentes quimiocinas y bloquea la activación de las vías de señalización del receptor de quimiocinas. Estos resultados indican que MOSPD2 es fundamental para la migración de leucocitos y monocitos y que bloquear su actividad inhibe la inflamación y tiene beneficios terapéuticos en enfermedades y trastornos inflamatorios.

Como se explica anteriormente, la invención se refiere a un inhibidor de MOSPD2 (como se define anteriormente en el presente documento y en las reivindicaciones) para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno inflamatorio. En algunas realizaciones, el inhibidor es ADN (como se define anteriormente en el presente documento y en las reivindicaciones). En otras realizaciones, el inhibidor es un agente de silenciamiento de ARN (como se define anteriormente en el presente documento y en las reivindicaciones).

En realizaciones adicionales de la invención, la inhibición de MOSPD2 y la regulación a la baja de la actividad de MOSPD2 se pueden efectuar a nivel genómico y/o de transcripción usando una variedad de moléculas (como se define anteriormente en el presente documento y en las reivindicaciones) que interfieren con la transcripción y/o traducción [por ejemplo, agentes de silenciamiento de ARN (por ejemplo, antisentido, ARNpi, ARNhc, micro-ARN), Ribozima y ADNzima].

A continuación se muestra un listado ilustrativo de agentes capaces de regular a la baja el nivel de expresión y/o la actividad de una diana tal como MOSPD2.

La regulación a la baja de MOSPD2 se puede lograr mediante la edición génica. Se puede realizar la edición genética, por ejemplo, con un sistema CRISPR-CAS9 de grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares. Los sistemas CRISPR-CAS9 se han descrito en la bibliografía y pueden incluir, por ejemplo, CAS9 y un ARN de guía. También se han descrito en la bibliografía otras técnicas de edición génica, y también pueden usarse.

La regulación a la baja de MOSPD2 puede alcanzarse también mediante silenciamiento de ARN. Como se usa en el presente documento, la frase "silenciamiento de ARN" se refiere a un grupo de mecanismos reguladores [por ejemplo, interferencia por ARN (iARN), silenciamiento génico transcripcional (TGS), silenciamiento génico postranscripcional (PTGS), supresión, cosupresión y represión traduccional] mediados por moléculas de ARN que dan como resultado la inhibición o el "silenciamiento" de la expresión de un correspondiente gen codificante de proteína. El silenciamiento del ARN se ha observado en muchos tipos de organismos, incluyendo plantas, animales y hongos.

Como se usa en el presente documento, la expresión "agente de silenciamiento de ARN" se refiere a un ARN que es capaz de inhibir específicamente o "silenciar" la expresión de un agente diana. En algunas realizaciones, el agente de silenciamiento de ARN es capaz de impedir el procesamiento completo (por ejemplo, la traducción y/o expresión completa) de una molécula de ARNm a través de un mecanismo de silenciamiento postranscripcional. Los agentes de silenciamiento de ARN incluyen moléculas de ARN no codificantes, por ejemplo, dúplex de ARN que comprenden hebras emparejadas, así como ARN precursores a partir de los cuales pueden generarse pequeños ARN no codificantes. Los agentes de silenciamiento de ARN ilustrativos incluyen ARNbc tales como ARNpi, miARN y ARNhc. En una realización, el agente de silenciamiento de ARN es capaz de inducir interferencia por ARN. En otra realización, el agente de silenciamiento de ARN es capaz de mediar la represión traduccional.

Interferencia por ARN se refiere al proceso de silenciamiento génico postraduccional específico de secuencia en animales mediado por ARN pequeños de interferencia (ARNpi). El proceso correspondiente en plantas se denomina comúnmente silenciamiento génico postranscripcional o silenciamiento de ARN y también se denomina sofocamiento en hongos. Se cree que el proceso de silenciamiento génico postranscripcional es un mecanismo de defensa celular evolutivamente conservado usado para prevenir la expresión de genes extraños y se comparte de manera común por varias floras y filos. Dicha protección frente a la expresión de genes extraños puede haber evolucionado en respuesta a la producción de ARN bicatenarios (ARNbc) procedentes de infecciones víricas o procedentes de la integración aleatoria de elementos de transposón en un genoma hospedador mediante una respuesta celular que destruye específicamente el ARN monocatenario homólogo o ARN genómico vírico.

Algunas realizaciones de la invención contemplan el uso de ARNbc para regular a la baja la expresión proteica del ARNm.

El término "ARNpi" se refiere a pequeños dúplex de ARN inhibidores (generalmente 18-30 pares de bases) que inducen la vía de interferencia por ARN (iARN). Normalmente, los ARNpi se sintetizan químicamente con 21 unidades con una región dúplex central de 19 pb y salientes en 3' simétricos de 2 bases en los extremos, aunque se ha descrito recientemente que los dúplex de ARN sintetizados químicamente de 25-30 bases de longitud pueden tener un aumento de potencia de hasta 100 veces en comparación con 21 unidades en la misma ubicación. Se plantea la teoría de que el aumento de potencia observado obtenido usando ARN más largos en la activación de la iARN es el resultado de proporcionar a Dicer un sustrato (27 unidades) en lugar de un producto (21 unidades) y que esto mejora la velocidad o la eficacia de entrada del dúplex de ARNpi en el RISC.

Las cadenas de un ARN de interferencia bicatenario (por ejemplo, un ARNpi) se pueden conectar para formar una estructura de horquilla o tallo-bucle (por ejemplo, un ARNhc o ARN-hc). Por tanto, como se ha mencionado, el agente de silenciamiento de algunas realizaciones de la invención también puede ser un ARN horquillado corto (ARNhc).

Los términos "ARNhc" o "ARN-hc", como se usa en el presente documento, se refieren a un agente de ARN que tiene una estructura de tallo-bucle, que comprende una primera y una segunda región de secuencia complementaria, siendo el grado de complementariedad y la orientación de las regiones suficientes para que se produzca el emparejamiento de bases entre las regiones, estando unidas la primera y la segunda regiones por una región de bucle, siendo el bucle el resultado de la falta de emparejamiento de bases entre nucleótidos (o análogos de nucleótidos) dentro de la región en bucle. El número de nucleótidos en el bucle es un número entre 3 y 23 ambos incluidos, o entre 5 y 15, o entre 7 y 13, o entre 4 y 9, o entre 9 y 11. Algunos de los nucleótidos del bucle pueden participar en interacciones de pares de bases con otros nucleótidos del bucle.

Se apreciará que el agente de silenciamiento de ARN de algunas realizaciones de la invención no necesita limitarse a las moléculas que contienen únicamente ARN, pero incluye además nucleótidos modificados químicamente y no nucleótidos.

En algunas realizaciones, el agente de silenciamiento de ARN proporcionado en el presente documento puede asociarse funcionalmente con un péptido que penetra en las células. Como se usa en el presente documento, un "péptido que penetra en las células" es un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos corta (aproximadamente 12-30 restos) o motivo funcional que confiere propiedades de translocación independientes de la energía (es decir, no endocíticas) asociadas al transporte del complejo permeable a la membrana a través de las membranas plasmática y/o nuclear de una célula.

De acuerdo con otra realización, el agente de silenciamiento de ARN puede ser un miARN o un mimético del mismo.

El término "microARN", "miARN" y "miR" son sinónimos y se refieren a un conjunto de moléculas de ARN monocatenario no codificante de aproximadamente 19-28 nucleótidos de longitud, que regulan la expresión génica. Los miARN se encuentran en una amplia gama de organismos y se ha demostrado que desempeñan un papel en el desarrollo, la homeostasis y la etiología de la enfermedad.

La expresión "mimético de microARN" se refiere a ARN sintéticos no codificantes que son capaces de ingresar a la vía del iARN y regular la expresión génica. Los miméticos de miARN imitan la función de los microARN endógenos (miARN) y pueden diseñarse como moléculas maduras bicatenarias o precursores de miméticos (por ejemplo, o premiARN). Los miméticos de miARN pueden estar compuestos de ARN modificado o no modificado, ADN, híbridos de ARN-ADN o productos químicos de ácido nucleico alternativas (por ejemplo, LNA o ácidos nucleicos con puente de 2'-O,4'-C-etileno (ENA)). Para miméticos de miARN maduros bicatenarios, la longitud de la región dúplex puede variar entre 13-33, 18-24 o 21-23 nucleótidos. El miARN también puede comprender un total de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleótidos. La secuencia del miARN puede ser los primeros 13-33 nucleótidos del pre-miARN. La secuencia del miARN también puede ser los últimos 13-33 nucleótidos del pre-miARN.

Otro agente capaz de regular a la baja una diana es una molécula de ADNzima capaz de escindir específicamente un transcrito de ARNm o una secuencia de ADN de la diana. Las ADNzimas son polinucleótidos monocatenarios que son capaces de escindir secuencias diana tanto monocatenarias como bicatenarias. (Breakeret al.,Chemistry and Biology 1995; 2:655; Santoroet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997; 943:4262.) Se ha propuesto un modelo general (el modelo "10-23") para la ADNzima. Las ADNzimas "10-23" tienen un dominio catalítico de 15 desoxirribonucleótidos, flanqueado por dos dominios de reconocimiento de sustrato de siete a nueve desoxirribonucleótidos cada uno. Este tipo de ADNzima puede escindir eficazmente su sustrato de ARN en las uniones purina:pirimidina. (Santoroet al.;Khachigian, Curr. Opin. Mol. Ther. 2002; 4:119-121.)

La regulación a la baja de una diana puede efectuarse también usando un polinucleótido antisentido capaz de hibridar específicamente con un transcrito de ARNm que codifica la diana.

Otro agente capaz de regular a la baja una diana es una molécula de ribozima capaz de escindir específicamente un transcrito de ARNm que codifica una diana. Las ribozimas se utilizan cada vez más para la inhibición específica de secuencia de la expresión génica mediante la escisión de ARNm que codifican proteínas de interés. (Welchet al.,Curr. Opin. Biotechnol. 1998; 9:486-96.)

Otro agente capaz de regular a la baja una diana es cualquier molécula que se una a la diana y/o la escinda.

Otro agente que se puede usar junto con algunas realizaciones de la invención para regular a la baja una diana es una molécula que previene la activación de la diana o la unión del sustrato.

En algunas realizaciones, un inhibidor de una proteína diana determinada inhibe la proteína uniéndose a la proteína, uniéndose a un compuesto que se une a la proteína (por ejemplo, un sustrato, una proteína reguladora) y/o uniéndose a un oligonucleótido (por ejemplo, ARNm) que codifica la proteína.

También se divulga en el presente documento (no reivindicado) un inhibidor de MOSPD2 que es una molécula pequeña (por ejemplo, caracterizada por un peso molecular de menos de 800 Da), por ejemplo, un tocoferol o un derivado del mismo (por ejemplo, alfa-tocoferol, beta-tocoferol, gamma-tocoferol, delta-tocoferol, a triterpeno (por ejemplo, escualeno), una vitamina A o un derivado de la misma (por ejemplo, retinaldehído), un fosfatidilglicérido (por ejemplo, fosfatidilinositol) o un fosfolípido (por ejemplo, fosfatidilcolina, un fosfolípido oxidado).

El fosfolípido oxidado mencionado anteriormente divulgado en el presente documento (no reivindicado) puede ser, por ejemplo, 1-hexadecil-2-(4'-carboxi)butil-glicero-3-fosfocolina. El fosfolípido oxidado también puede ser (R)-1-hexadecil-2-(4'-carboxi)butil-sn-glicero-3-fosfocolina.

El fosfolípido oxidado puede ser

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

El fosfolípido oxidado puede ser

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Como entienden los expertos en la materia, un valor de CI<50>indica la cantidad de un fármaco u otra sustancia (inhibidor) particular que se necesita para inhibir un proceso biológico dado (o componente de un proceso, es decir, una enzima, célula, receptor celular o microorganismo) a la mitad. Los métodos para determinar valores de CI50 con conocen en la materia.

En algunas realizaciones, un inhibidor de una proteína dada inhibe la proteína uniéndose a la proteína y/o a un oligonucleótido (por ejemplo, ARNm) que codifica la proteína.

En algunas realizaciones, el inhibidor es una iARN, miARN, ARNpi, ARNhc, un ARN de antisentido, un ADN de antisentido, una molécula señuelo, un ADN señuelo, un ADN bicatenario, un ADN monocatenario, un ADN formando complejo, un ADN encapsulado, un ADN vírico, un ADN plasmídico, un ARN desnudo, un ARN encapsulado, un ARN vírico, un ARN bicatenario, una molécula capaz de generar interferencia por ARN, o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, el inhibidor hibrida con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido MOSPD2. En algunas realizaciones, la hibridación es en condiciones rigurosas o en condiciones muy rigurosas.

En algunas realizaciones, el inhibidor es un sistema CRISPR-CAS9 de grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares.

Un polipéptido MOSPD2 tiene una secuencia al menos el 98 %, al menos el 99%o el 100%idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4. En algunas realizaciones, el polipéptido MOSPD2 tiene una secuencia con el 98 % o el 99 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4. En otras realizaciones, el polipéptido MOSPD2 tiene una secuencia con del 98 % al 100 % de identidad, del 99 % al 100 % de identidad, del 98 % al 99 % de identidad, o del 99 % al 100 % de identidad, con una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4.

En algunos casos, el polipéptido MOSPD2 como se define anteriormente está codificado por una secuencia de polinucleótido que tiene al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99% o al menos el 100% de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO: 5-8. En otras realizaciones, el polipéptido MOSPD2 como se define anteriormente está codificado por una secuencia de polinucleótido que tiene al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO: 5-8. En otras realizaciones, el polipéptido MOSPD2 como se define anteriormente está codificado por una secuencia de polinucleótido que tiene aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 % o aproximadamente el 99 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO: 5-8. En otras realizaciones, el polipéptido MOSPD2 como se define anteriormente está codificado por una secuencia de polinucleótido que tiene de aproximadamente el 75 % al 100 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO: 5 8, o cualquier intervalo de valores de las mismas, por ejemplo, de aproximadamente el 80 % al 100 % de identidad, de aproximadamente el 85% al 100% de identidad, de aproximadamente el 90% al 100% de identidad, de aproximadamente el 95% al 100% de identidad, de aproximadamente el 96% al 100% de identidad, de aproximadamente el 97% al 100% de identidad, de aproximadamente el 98% al 100% de identidad, desde aproximadamente el 99% a aproximadamente el 100% de identidad, desde aproximadamente el 75% a aproximadamente el 99 % de identidad, desde aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 99 % de identidad, desde aproximadamente el 85 % a aproximadamente el 99 % de identidad, desde aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 99 % de identidad, desde aproximadamente el 95 % a aproximadamente el 99 % de identidad, desde aproximadamente el 96 % a aproximadamente el 99 % de identidad, desde aproximadamente el 97 % a aproximadamente el 99 % de identidad, desde aproximadamente el 98 % a aproximadamente el 99 % de identidad, desde aproximadamente el 99% a aproximadamente el 100% de identidad, desde aproximadamente el 75% a aproximadamente el 95 % de identidad, desde aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 95 % de identidad, de aproximadamente el 85 % a aproximadamente el 95 % de identidad, o de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 95 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO: 5-8.

Composiciones farmacéuticas

Otras realizaciones de la invención se refieren a una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de MOSPD2 (como se define anteriormente en el presente documento y en las reivindicaciones) para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno inflamatorio. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende el inhibidor de MOSPD2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otras realizaciones, la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor de MOSPD2.

En algunas realizaciones, el inhibidor de MOSPD2 está presente en una cantidad tal que la administración del inhibidor de MOSPD2 causa al menos el 10 % (por ejemplo, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o más) de inhibición de una o más actividades de MOSPD2 (por ejemplo, MOSPD2 humano) (por ejemplo, expresión de MOSPD2, migración de células inflamatorias (por ejemplo, migración de leucocitos o monocitos), quimiotaxia (por ejemplo, quimiotaxia de leucocitos o monocitos), una vía de señalización de quimiocinas, fosforilación del receptor de EGF, fosforilación de ERK y fosforilación de AKT. En algunas realizaciones, la administración del inhibidor de MOSPD2 a un sujeto humano causa al menos el 10 % (por ejemplo, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 %, o más) de inhibición de una o más actividades de un MOSPD2 humano.

En otro aspecto, la administración del inhibidor de MOSPD2 causa de aproximadamente el 10% al 100%, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente e aproximadamente a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente e aproximadamente a aproximadamente el 85 %, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente e aproximadamente a aproximadamente el 70 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente e aproximadamente a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente e aproximadamente a aproximadamente el 85 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente e aproximadamente a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente e aproximadamente a aproximadamente el 85 %, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente e aproximadamente a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 40 % a aproximadamente e aproximadamente a aproximadamente el 85 %, de aproximadamente el 40 % a aproximadamente e aproximadamente a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 50% aaproximadamente el 90 %, de aproximadamente el 50% aaproximadamente el 85 %, de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 80 %, de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 90 %, de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 85 %, o de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 80 % de inhibición de una o más actividades de MOSPD2, por ejemplo, regulación de la migración de células inflamatorias, vías de señalización de quimiocinas, vías de señalización de factores de crecimiento, fosforilación del receptor de EGF, fosforilación de ERK, fosforilación de AKT, y/o fosforilación de FAK.

Como se usa en el presente documento, una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de uno o más agentes como se describe en el presente documento (por ejemplo, un inhibidor de MOSPD2, o un inhibidor de MOSPD2 con uno o más agentes descritos en el presente documento), o sales o profármacos fisiológicamente aceptables de los mismos, con otros componentes químicos, incluyendo, pero no limitado a, transportadores farmacéuticamente aceptables, excipientes, lubricantes, agentes tamponantes, agentes antibacterianos, agentes formadores de volumen (por ejemplo, manitol), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico o bisulfito de sodio), y similares. El fin de la composición farmacéutica es facilitar la administración del agente o agentes a un sujeto.

Como se usa en el presente documento, "administración" o "administrar" a un sujeto incluye, pero sin limitación, el acto de un médico u otro profesional médico que prescribe una composición farmacéutica de la invención a un sujeto.

En el presente documento, la expresión "transportador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un transportador o diluyente que no causa irritación significativa al sujeto y no anula la actividad biológica y las propiedades del agente o agentes descritos en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el término "transportador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el agente terapéutico.

En el presente documento, el término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de un principio activo.

En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de MOSPD2 comprende además uno o más agentes activos adicionales.

Cuando se administran dos o más agentes como una composición farmacéutica, cada agente puede administrarse opcionalmente en una composición separada y/o mediante una vía de administración diferente. Las posibles vías de administración para cada agente de forma independiente incluyen, pero no se limitan a, administración parenteral, administración transmucosa, administración rectal, administración bucal y/o inhalación (por ejemplo, como se describe en el presente documento).

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es adecuada para administración sistémica o local. En otras realizaciones, la composición farmacéutica es adecuada para administración nasal, oral o intraperitoneal. En otras realizaciones, la composición farmacéutica está adecuada para administración intravenosa, administración intramuscular o administración subcutánea.

Tratamiento, prevención o reducción de la incidencia de la inflamación y de enfermedades o trastornos inflamatorios

Las realizaciones de la invención se refieren a un inhibidor de MOSPD2 (como se define anteriormente en el presente documento y en las reivindicaciones) para su uso en el tratamiento, la prevención o la reducción de la incidencia de la inflamación. En algunas realizaciones, la invención se refiere a un inhibidor de MOSPD2 (como se define anteriormente en el presente documento y en las reivindicaciones) para su uso en el tratamiento, la prevención o la reducción de la incidencia de una enfermedad o trastorno inflamatorio. En otras realizaciones, el uso comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor de MOSPD2 a un sujeto que lo necesite.

En algunas realizaciones, el inhibidor de MOSPD2 causa al menos el 10 % (por ejemplo, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o más) de inhibición de una o más actividades de MOSPD2 (por ejemplo, MOSPD2 humano) (por ejemplo, expresión de MOSPD2, migración de células inflamatorias (por ejemplo, migración de leucocitos o monocitos), quimiotaxia (por ejemplo, quimiotaxia de leucocitos o monocitos), una vía de señalización de quimiocinas, fosforilación del receptor de EGF, fosforilación de ERK y fosforilación de AKT. En algunas realizaciones, la administración del inhibidor de MOSPD2 a un sujeto humano causa al menos el 10 % (por ejemplo, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 %, o más) de inhibición de una o más actividades de un MOSPD2 humano.

En otro aspecto, la administración del inhibidor de MOSPD2 causa de aproximadamente el 10% al 100%, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 99 %, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 90 %, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 85 %, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 80 %, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 70 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 99 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 90 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 85 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 80 %, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 90 %, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 85 %, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 80 %, de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 90 %, de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 85 %, de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 80 %, de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 90 %, de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 85 %, de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 80 %, de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 90 %, de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 85 %, o de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 80 % de inhibición de una o más actividades de MOSPD2, por ejemplo, regulación de la migración de células inflamatorias, vías de señalización de quimiocinas, vías de señalización de factores de crecimiento, fosforilación del receptor de EGF, fosforilación de ERK, fosforilación de AKT, y/o fosforilación de FAK.

En otras realizaciones, el sujeto es un mamífero o un ser humano.

En otras realizaciones, la enfermedad o trastorno inflamatorio es una enfermedad o trastorno inflamatorio idiopático, una enfermedad o trastorno inflamatorio crónico, una enfermedad o trastorno inflamatorio agudo, una enfermedad o trastorno autoinmunitario, una enfermedad o trastorno infeccioso, una enfermedad o trastorno inflamatorio maligno, una enfermedad o trastorno inflamatorio relacionado con trasplante, una enfermedad o trastorno inflamatorio degenerativo, una enfermedad o trastorno asociado con una hipersensibilidad, una enfermedad o trastorno inflamatorio cardiovascular, una enfermedad o trastorno inflamatorio cerebrovascular, una enfermedad o trastorno vascular periférico, una enfermedad o trastorno inflamatorio glandular, una enfermedad o trastorno inflamatorio gastrointestinal, una enfermedad o trastorno inflamatorio cutáneo, una enfermedad o trastorno inflamatorio hepático, una enfermedad o trastorno inflamatorio neurológico, una enfermedad o trastorno inflamatorio osteomuscular, una enfermedad o trastorno inflamatorio renal, una enfermedad o trastorno inflamatorio reproductivo, una enfermedad o trastorno inflamatorio sistémico, una enfermedad o trastorno inflamatorio del tejido conjuntivo, necrosis, una enfermedad o trastorno inflamatorio relacionado con implante, un proceso inflamatorio de envejecimiento, una enfermedad o trastorno de inmunodeficiencia o una enfermedad o trastorno inflamatorio pulmonar.

En algunas realizaciones, la hipersensibilidad es hipersensibilidad de tipo I, hipersensibilidad de tipo II, hipersensibilidad de tipo III, hipersensibilidad de tipo IV, hipersensibilidad inmediata, hipersensibilidad mediada por anticuerpos, hipersensibilidad mediada por inmunocomplejos, Hipersensibilidad mediada por linfocitos T, hipersensibilidad de tipo retardado, hipersensibilidad mediada por linfocitos T auxiliares, hipersensibilidad mediada por linfocitos T citotóxicos, hipersensibilidad mediada por linfocitos TH1 o hipersensibilidad mediada por linfocitos TH2.

En otras realizaciones, la enfermedad o trastorno inflamatorio cardiovascular es una enfermedad o trastorno oclusivo, ateroesclerosis, una enfermedad valvular cardíaca, estenosis, reestenosis, estenosis en endoprótesis vascular, infarto de miocardio, arteriopatía coronaria, síndromes coronarios agudos, insuficiencia cardíaca congestiva, angina de pecho, isquemia miocárdica, trombosis, granulomatosis de Wegener, arteritis de Takayasu, síndrome de Kawasaki, enfermedad o trastorno autoinmunitario anti-factor VIII, vasculitis necrotizante de vasos pequeños, poliangitis microscópica, síndrome de Churg y Strauss, glomerulonefritis necrosante focal pauci-inmunitaria, glomerulonefritis con semilunas, síndrome antifosfolipídico, insuficiencia cardíaca inducida por anticuerpos, púrpura trombocitopénica, anemia hemolítica autoinmunitaria, autoinmunidad cardíaca, enfermedad o trastorno de Chagas o autoinmunidad antilinfocitos T auxiliares.

Las otras realizaciones, la enfermedad o trastorno inflamatorio cerebrovascular es accidente cerebrovascular, inflamación cerebrovascular, hemorragia cerebral o insuficiencia arterial vertebral.

En otras realizaciones, la enfermedad o trastorno vascular periférico es gangrena, vasculopatía diabética, enfermedad isquémica del intestino, trombosis, retinopatía diabética o nefropatía diabética.

En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno autoinmunitario es artritis reumatoide crónica, artritis reumatoide juvenil, lupus eritematoso sistémico, esclerodermia, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, panarteritis nudosa, polimiositis/dermatomiositis, síndrome de Sjogren, enfermedad de Bechet, esclerosis múltiple, diabetes autoinmunitaria, enfermedad de Hashimoto, psoriasis, mixedema primario, anemia perniciosa, miastenia grave, hepatitis activa crónica, anemia hemolítica autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica idiopática, uveítis, vasculitis o trombocitopenia inducida por heparina.

En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno inflamatorio glandular es una enfermedad o trastorno pancreático, diabetes de tipo I, enfermedad o trastorno de la tiroides, enfermedad o trastorno de Graves, tiroiditis, tiroiditis autoinmunitaria espontánea, tiroiditis de Hashimoto, mixedema idiopático, autoinmunidad ovárica, infertilidad autoinmunitaria anti-espermatozoides, prostatitis autoinmunitaria o síndrome poliglandular autoinmunitario de tipo I.

En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno inflamatorio gastrointestinal es colitis, ileítis, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal crónica, síndrome inflamatorio del intestino, enfermedad inflamatoria del intestino, síndrome de intestino irritable, enfermedad inflamatoria del intestino crónica, enfermedad celíaca, colitis ulcerosa, una úlcera, una úlcera de la piel, una úlcera de decúbito, una úlcera gástrica, una úlcera péptica, una úlcera bucal, una úlcera nasofaríngea, una úlcera esofágica, una úlcera duodenal o una úlcera gastrointestinal.

En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno inflamatorio cutáneo es el acné, enfermedad o trastorno ampolloso autoinmunitario de la piel, pénfigo vulgar, penfigoide ampolloso, pénfigo filiar, dermatitis de contacto o erupción por fármacos.

En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno inflamatorio hepático es hepatitis autoinmunitaria, cirrosis hepática o cirrosis biliar.

En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno inflamatorio neurológico es la esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, miastenia grave, neuropatía motora, síndrome de Guillain-Barre, neuropatía autoinmunitaria, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, enfermedad o trastorno neurológico paraneoplásico, atrofia cerebelosa paraneoplásica, síndrome de la persona rígida no paraneoplásico, atrofia cerebelosa progresiva, encefalitis de Rasmussen, esclerosis lateral amiotrófica, corea de Sydeham, síndrome de Gilles de la Tourette, poliendocrinopatía autoinmunitaria, neuropatía disinmunitaria, neuromiotonía adquirida, artrogriposis múltiple, enfermedad de Huntington, demencia asociada al SIDA, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, accidente cerebrovascular, una enfermedad o trastorno inflamatorio de la retina, una enfermedad o trastorno inflamatorio ocular, neuritis óptica, encefalopatía espongiforme, migraña, cefalea, cefalea en racimos o síndrome del hombre rígido.

En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno inflamatorio del tejido conjuntivo es distrofia muscular de Duchenne (DMD), miositis autoinmunitaria, síndrome de Sjogren primario, enfermedad o trastorno autoinmunitario del músculo liso, miositis, tendinitis, una inflamación de ligamentos, condritis, una inflamación de las articulaciones, una inflamación sinovial, síndrome del túnel carpiano, artritis, artritis reumatoide, artrosis, espondilitis anquilosante, una inflamación esquelética, una enfermedad o trastorno autoinmunitario del oído, o una enfermedad o trastorno autoinmunitario del oído interno.

En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno inflamatorio renal es nefritis intersticial autoinmunitaria.

En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno inflamatorio reproductivo es muerte fetal repetida, quiste ovárico, o una enfermedad o trastorno asociado a la menstruación.

En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno inflamatorio sistémico es lupus eritematoso sistémico, esclerosis sistémica, choque séptico, síndrome de choque tóxico o caquexia.

En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno infeccioso es una enfermedad o trastorno infeccioso crónico, una enfermedad o trastorno infeccioso subagudo, una enfermedad o trastorno infeccioso agudo, una enfermedad o trastorno vírico, una enfermedad o trastorno bacteriano, una enfermedad o trastorno protozoario, una enfermedad o trastorno parasitario, una enfermedad o trastorno fúngico, una enfermedad o trastorno por micoplasma, gangrena, septicemia, una enfermedad o trastorno priónico, gripe, tuberculosis, paludismo, síndrome de inmunodeficiencia adquirida o síndrome respiratorio agudo grave.

En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno inflamatorio relacionado con trasplante es el rechazo del injerto, rechazo crónico de injerto, rechazo subagudo de injerto, rechazo de injerto agudo rechazo de injerto hiperagudo, o enfermedad o trastorno del injerto contra el hospedador.

En algunas realizaciones, el implante es un implante protésico, un implante mamario, un implante de silicona, un implante dental, un implante del pene, un implante cardíaco, una prótesis articular, un dispositivo de reparación de fracturas óseas, un implante de reemplazo óseo, un implante de suministro de fármacos, un catéter, un marcapasos, un corazón artificial, una válvula cardíaca artificial, un implante de liberación de fármacos, un electrodo o un tubo de respirador.

En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno inflamatorio pulmonar es asma, asma alérgica, enfisema, enfermedad o trastorno pulmonar obstructivo crónico, sarcoidosis o bronquitis.

En otras realizaciones, la enfermedad o trastorno inflamatorio es fibrosis.

En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno inflamatorio es inflamación vascular en un sujeto que padece una enfermedad autoinmunitaria crónica o inflamatoria crónica. En algunas realizaciones, la enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria crónica es psoriasis. En algunas realizaciones, la inflamación vascular está asociada con una enfermedad cardiovascular, una vasculopatía periférica, una arteriopatía coronaria, una enfermedad cerebral vascular, una estenosis en la arteria renal, una enfermedad isquémica o un aneurisma aórtico. En algunas realizaciones, la inflamación vascular está asociada con una cardiopatía isquémica, ateroesclerosis, síndrome coronario agudo, angina inestable, angina estable o accidente cerebrovascular. En otras realizaciones, la inflamación vascular es la inflamación de la arteria carótida. En otras realizaciones, la inflamación vascular es la inflamación de la aorta.

En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno inflamatorio es una inflamación asociada con un implante. En algunas realizaciones, la inflamación asociada con un implante es una inflamación local o una reacción inflamatoria sistémica. En algunas realizaciones, el implante es de silicona, solución salina, metal, plástico o polimérico. En algunas realizaciones, el implante es un implante estético, un implante protésico, un implante subdérmico, un implante transdérmico, un implante de reemplazo óseo o un dispositivo de reparación de fracturas óseas. En algunas realizaciones, el implante es un implante de suministro de fármacos o un implante de liberación de fármacos. En otras realizaciones, el implante es una prótesis articular, un corazón artificial, una válvula cardíaca artificial, una prótesis testicular, un implante mamario, un implante dental, un implante ocular, un implante coclear, un implante del pene, un implante cardíaco, un catéter, un dispositivo implantable de continencia urinaria, un marcapasos, un electrodo, un dispositivo de soporte para hernias o un tubo de respirador.

En otras realizaciones, la enfermedad o trastorno inflamatorio es hepatitis o esteatohepatitis. En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno inflamatorio es esteatohepatitis no alcohólica (ENA). En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno inflamatorio es glomerulonefritis. En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno inflamatorio es glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GFS).

Dado que la inflamación ejerce influencia sobre el recambio óseo, induciendo la osteoporosis, la osteoporosis es también un ejemplo de una enfermedad o trastorno inflamatorio de la presente invención. Por consiguiente, en algunas realizaciones de la invención, la enfermedad o trastorno inflamatorio es osteoporosis.

Inhibir o prevenir una o más actividades celulares

Las realizaciones de la invención también se refieren a un inhibidor de MOSPD2 (como se define en el presente documento anteriormente y en las reivindicaciones) para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno inflamatorio, en donde dicho uso comprende inhibir o prevenir una o más actividades en una célula. En algunas realizaciones, el uso comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor de MOSPD2 a un sujeto que lo necesite.

En algunas realizaciones, el inhibidor de MOSPD2 causa al menos aproximadamente el 10 % (por ejemplo, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 99 % o más) de inhibición de una o más actividades de MOSPD2 (por ejemplo, MOSPD2 humano) (por ejemplo, expresión de MOSPD2, migración de células inflamatorias (por ejemplo, migración de leucocitos o monocitos), quimiotaxia (por ejemplo, quimiotaxia de leucocitos o monocitos), una vía de señalización de quimiocinas, fosforilación del receptor de EGF, fosforilación de ERK, fosforilación de AKT y/o fosforilación de FAK. En algunas realizaciones, la administración del inhibidor de MOSPD2 a un sujeto humano causa al menos aproximadamente el 10% (por ejemplo, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 99 %, o más) de inhibición de una o más actividades de un MOSPD2 humano.

En algunas realizaciones, la una o más actividades es una o más de: expresión de MOSPD2, migración de una célula inflamatoria, quimiotaxia, una vía de señalización de quimiocinas, fosforilación de ERK, fosforilación de AKT y/o fosforilación de FAK. En algunas realizaciones, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o todas estas actividades están inhibidas.

En algunas realizaciones, al menos están inhibidas la quimiotaxia de leucocitos y una vía de señalización de quimiocinas. En otras realizaciones, la inhibición de una vía de señalización de quimiocinas es la inhibición de la fosforilación de ERK y/o la fosforilación de AKT. En otras realizaciones, la quimiotaxia es inducida por más de una quimiocina o receptor de quimiocina.

En algunas realizaciones, la célula inflamatoria es, por ejemplo, un leucocito, granulocito, neutrófilo, basófilo, eosinófilo, monocito, macrófago o mastocito.

En otras realizaciones, la quimiotaxia se asocia con una célula inflamatoria tal como un leucocito o un monocito.

En algunas realizaciones, la quimiocina es CCL14, CCL19, CCL20, CCL21, CCL25, CCL27, CXCL12, CXCL13, CXCL-8, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL11, CXCL10, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17 o CCL22. En otras realizaciones, la migración o quimiotaxia es inducida por uno o más de RANTES, MCP-3, MCP-1 y SDF-1.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran la invención pero no limitan el alcance de las reivindicaciones.

Materiales y métodos

Inhibición de MOSPD2

La línea celular monocítica U937 (CRL-1593.2) se obtuvo de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) (Manassas, VA). Las células (2 * 106 en 2 ml) se colocaron en un tubo de 15 ml. El control de partículas de lentivirus<( 2>* 105 partículas víricas) (SHC202V, Sigma, Israel) o partículas de lentivirus que contenían ARN-hc de MOSPD2 (2 * 106 partículas víricas; Sigma) se aplicó a las células, las cuales se centrifugaron luego durante 60 min a 2000 rpm, temperatura ambiente en presencia de polibreno 8 pg/ml (Sigma). Las secuencias en horquilla de ARNhc artificiales y sus correspondientes secuencias diana en MOSPD<2>se proporcionan en las SEQ ID NO: 9-14. Luego se sembraron las células en una placa de 6 pocillos en medio RPMI que contenía glutamina, suero fetal de ternera (SFT) al 10 % y penicilina/estreptomicina, todos de Biological Industries (Beit Haemek, Israel). Después de 72 horas, se añadió medio nuevo que contenía puromicina (4 pg/ml, Sigma) para la selección de las células transducidas.

Ensayo de transpocillo de migración celular

Para probar la migración celular inducida por quimiocinas, RANTES (CCL5, 100 ng/ml), MCP-1 (CCL2, 100 ng/ml), MCP-3 (CCL7, 100 ng/ml) o SDF-1 (CXCL12, 25 ng/ml) (PeproTech, Israel) se disolvieron en medio RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal (SFB) al 0,5 % y se colocaron en la cámara inferior de placas de ensayo de migración QCM de 24 pocillos y poro de 5 mm (Corning-Costar, Corning, NY). Se transdujeron células U937 (3 * 105) con partículas de lentivirus de control o partículas de lentivirus que contenían ARN-hc de MOSPD2 (sh-MOSPD2), se sembraron en la cámara superior y se incubaron durante 2-4 horas. Posteriormente, el número de células que migraron al compartimento inferior se determinó mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).

Análisis por transferencia de Western

Células U937 transducidas con lentivirus sh-control o con sh-MOSPD2 (106) se privaron de nutrientes durante 3 horas en medio RPMI que contenía SFT al 0,5 % (Biological Industries, Beit Haemek, Israel) y luego se activaron con RANTES (100 ng/ml), MIP-1a (100 ng/ml), MCP-3 (100 ng/ml) o SDF-1 (25 ng/ml) durante 5 minutos. Las células se lavaron y se resuspendieron en tampón de lisis que contenía ditiotreitol (DTT) 1:100, inhibidores de fosfatasa y proteasa (Thermo Scientific). Las muestras se cargaron en un gel Criterion TGX prefabricado (Bio-Rad, Hemel Hempstead, RU) y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa. Las transferencias se bloquearon con leche al 5 % o seroalbúmina bovina (BSA) en solución salina tamponada con Tris y Tween 20 (TBST) durante 1 hora, seguido de incubación con anticuerpos primarios y secundarios. Las membranas se desarrollaron utilizando el kit ECL (Thermo Scientific). Para la inmunotransferencia se utilizaron los siguientes anticuerpos:

Anticuerpos primarios: los anticuerpos anti-tubulina (1:4000) y anti-fosfo cinasa regulada extracelular (p-ERK1/2) (Thr 183 y Tyr 185, 1:4000) se adquirieron de Sigma (Israel). Los anticuerpos anti-fosfo-AKT (Ser 473, 1:1000) se adquirieron en Cell Signaling. Los anticuerpos contra la proteína de choque térmico 90 (HSP90) (1:1000) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX).

Anticuerpos secundarios: Los anticuerpos de burro anti-conejo peroxidasa de rábano picante (HRP) (1:5000) y de cabra anti-ratón HRP (1:5000) de peroxidasa de rábano picante (HRP) se adquirieron en Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA).

Q-PCR

Para determinar la inhibición de MOSPD2, Se extrajo ARN de células U937 transducidas con partículas de lentivirus de control o partículas de lentivirus que contenían sh-MOSPD2 usando un mini kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). Para la preparación de ADNc, se combinaron 2 pg de ARN con la mezcla de reacción qScript y la transcriptasa inversa qScript (Quanta Bioscience, Gaithersburg, MD). La reacción se colocó en un termociclador (BioRad, Hercules, CA) y se configuró un programa de ejecución de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones de PCR en tiempo real se realizaron en un sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems 7300 (Grand Island, NY) utilizando juegos de cebadores para MOSPD2 humana, 28S para normalizar los niveles de ARN (Biosearch Technologies, Petaluma, CA) y mezcla maestra de PCR SYBR Green (Applied Biosystems), Warrington, R.U.).

Transfección de MOSPD2

Se transfectaron células HEK293 durante 48 horas con un plásmido vacío o un plásmido que codifica MOSPD2 humano etiquetado con hemaglutinina (HA) utilizando el reactivo de transfección jetPRIME (Polyplus transfection, Francia). La eficacia de la transfección se determinó mediante citometría de flujo utilizando anticuerpo anti-HA-PE (miltenyi Biotec, Alemania).

Aislamiento de monocitos humanos

Se obtuvieron muestras de sangre venosa de donantes varones sanos de conformidad con la Junta de Revisión Institucional del Centro Médico Sheba, Ramat Gan, Israel. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (las CMSP) en Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare, Suecia) utilizando tubos Leucosep de 50 ml (Greiner Bio-One, Alemania). Las células se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Beit Haemek, Israel) y se incubaron a 4 °C durante 15 minutos en un tampón que contenía PBS y seroalbúmina bovina (BSA) al 0,5 % con microperlas de CD14 humano (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania).

Fraccionamiento subcelular

El fraccionamiento de los compartimentos celulares se realizó utilizando el kit Subcellular Protein Fractionation Kit (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Proliferación celular

Se sembraron células U937 transducidas con partículas de lentivirus de control o partículas de lentivirus que contenían sh-MOSPD2 en placas de 6 pocillos (104 por pocillo) en medio RPMI que contenía glutamina,<s>F<t>al 10% y penicilina/estreptomicina, todos de Biological Industries (Beit Haemek, Israel). Las células se contaron mediante FACS cada 24 horas en pocillos por triplicado durante 3 días consecutivos.

EJEMPLO 1

MOSPD2 y la migración de monocitos inducida por quimiocinas

Para evaluar el papel de MOSPD2 en la migración de monocitos, se silenció la expresión de MOSPD2 en células U937 como se describe en el apartado Materiales y métodos utilizando partículas de lentivirus que contienen ARN-hc dirigidas contra tres regiones diferentes del ARNm de MOSPD2 (sh-MOSPD2). La expresión del ARNm de MOSPD2 en las células se evaluó mediante PCR cuantitativa (Q-PCR) y se normalizó con respecto a la expresión de p-actina como control. La Figura 1 muestra que todos los sh-MOSPD2 probados redujeron profundamente los niveles de expresión de ARNm de MOSPD2 humano. Luego se analizó la migración hacia la quimiocina RANTES de células U937 transducidas con partículas de lentivirus de control o con partículas de lentivirus con sh-MOSPD2, utilizando un ensayo de migración de transpocillo. Las Figuras 2 y 3 muestran que la migración celular inducida por RANTES se inhibió significativamente en células transducidas con sh-MOSPD2 en comparación con células en las que MOSPD2 no se había silenciado.

EJEMPLO 2

MOSPD2, fosforilación de ERK y fosforilación de AKT

El efecto de la inhibición de MOSPD2 sobre la activación de las vías de señalización inducidas por quimiocinas se determinó probando los efectos de la inhibición de MOSPD2 sobre la fosforilación de ERK y AKT. Las células U937 transducidas con partículas de lentivirus de control o partículas de lentivirus con sh-MOSPD2 se trataron con RANTES durante 2 o 5 minutos y luego se analizaron mediante transferencia de Western para detectar ERK y AKT fosforiladas. Se utilizó la proteína de choque térmico 90 (HSP90) como control de carga. La Figura 4 muestra que la inhibición de MOSPD2 eliminó casi por completo la fosforilación de ERK y AKT inducida por RANTES.

EJEMPLO 3

MOSPD2 y la señalización dirigida por receptores de quimiocinas

También se probó el efecto de la inhibición de MOSPD2 sobre otras quimiocinas. Las células U937 transducidas con partículas de lentivirus de control o partículas de lentivirus con sh-MOSPD2 se probaron en cuanto a la migración hacia MCP-3, MCP-1, RANTES y SDF-1 en un ensayo de transpocillo y en cuanto a los niveles de ERK y AKT fosforiladas mediante transferencia de western. La Figura 5 muestra que la inhibición de MOSPD2 inhibió significativamente la migración celular inducida por todas las quimiocinas analizadas. Adicionalmente, la Figura 6 muestra que la inhibición de MOSPD2 eliminó casi por completo la fosforilación de ERK y AKT inducida por todas las quimiocinas probadas. Así pues, los efectos de la inhibición de MOSPD2 sobre la migración y la señalización no se limitan a una única vía de quimiocinas o de receptores de quimiocinas.

EJEMPLO 4

Proliferación celular de MOSPD2 y U937

También se probó el efecto de la inhibición de MOSPD2 sobre la proliferación de células U937. Se sembraron células U937 transducidas con partículas de lentivirus de control o partículas de lentivirus con sh-MOSPD2 como se describe en Métodos y materiales y se contaron cada 24 horas durante tres días consecutivos. La Figura 7 muestra que la inhibición de MOSPD2 no afectó la proliferación de U937, lo que sugiere que los efectos de la inhibición de MOSPD2 sobre la migración y la señalización se producen mediante la inhibición de procesos intracelulares aguas abajo de los receptores de quimiocinas y no por la inhibición de la actividad de los monocitos en general.

EJEMPLO 5 (de REFERENCIA)

Anticuerpos anti-MOSPD2

Se generaron anticuerpos policlonales anti-MOSPD2 de acuerdo con los siguientes métodos.

Materiales y métodos

Producción y purificación de MOSPD2 humano recombinante etiquetado con hemaglutinina (HA) (HA-rhMOSPD2)Se insertó ADNc de MOSPD2 humano de longitud completa, usando sitios de restricción EcoRI y XbaI, en el vector plasmídico de lentivirus pLVX-EF1a-IRES-Puro (Clonetech, CA). Se insertó un oligonucleótido que codifica la etiqueta<HA (YPYDVPDYA;>S<e>Q<ID NO:15) en la región aminoterminal de MOSPD2 con sitios de restricción EcoRI. Para la>transducción, se centrifugaron células de melanoma A2058 (ATCC CRL-11147, VA) durante 60 minutos a 2000 rpm a temperatura ambiente en presencia de polibreno 8 pg/ml (Sigma, Israel) y partículas lentivíricas que contenían el vector de expresión HA-rhMOSpD2. Luego se sembraron las células en una placa de 6 pocillos. Después de 72 horas, se añadió medio nuevo que contenía puromicina (4 pg/ml Sigma, Israel) para la selección de las células transducidas. Para purificar HA-rhMOSPD2, las células transducidas con A2058 se lisaron con reactivo de extracción de proteínas de mamíferos M-PER (Thermo Scientific) y se pasaron a través de perlas de agarosa anti-HA (Thermo Scientific). Se usó glicina o tiocianato de sodio para la elución de HA-rhMOSPD2 de las perlas, seguido de una diálisis exhaustiva contra PBS.

Generación y aislamiento de anticuerpos policlonales a-MOSPD2

Se inmunizaron conejos con aproximadamente 0,5 mg de HA-rhMOSPD2 emulsionado en adyuvante completo de Freund seguido de tres refuerzos cada tres semanas con aproximadamente 0,25 mg de HA-rhMOSPD2 emulsionado en adyuvante incompleto de Freund. Se recogió suero una semana después de cada refuerzo para evaluar la inmunogenicidad y los títulos de los anticuerpos. Los anticuerpos a-MOSPD2 se aislaron del suero utilizando perlas de proteína A/G (SantaCruz, CA).

Resultados

Los anticuerpos policlonales de conejo a-MOSPD2 detectan y precipitan MOSPD2 humana endógena

Se evaluó la capacidad de los anticuerpos policlonales a-MOSPD2 aislados para detectar y precipitar MOSPD2 endógena. El lisado celular se preparó a partir de células U937 transducidas con control o partículas de lentivirus con sh-MOSPD2. Las muestras se analizaron mediante transferencia de Western utilizando los anticuerpos a-MOSPD2 aislados (diluidos 1:5000). Se determinó la expresión de HSP90 como control de carga. También se realizó la inmunoprecipitación de un lisado de células U397 utilizando los anticuerpos a-MOSPD2 aislados o IgG de conejo (10 pg) como control. Los precipitados resultantes se analizaron mediante inmunotransferencia con los anticuerpos a-MOSPD2 aislados, seguido de incubación con anticuerpo de cabra anti-conejo-HRP (1:5000). La Figura 8 muestra que los anticuerpos a-MOSPD2 aislados detectan fácilmente (Figura 8A) e inmunoprecipitan (Figura 8B) a MOSPD2 expresada endógenamente en células U937.

EJEMPLO 6

Localización subcelular de MOSPD2

La localización subcelular de MOSPD2 se estudió utilizando células HEK293, que se transfectaron con plásmidos vacíos o con MOSPD2 humana etiquetada con HA como se describe en Métodos y Materiales. Luego, las células HEK293 se tiñeron con anticuerpo anti-HA en condiciones que solo permiten la tinción de la superficie (sin detergentes). La FIG. 9 muestra que las células transfectadas con plásmido con MOSPD2 etiquetada con HA expresaron la proteína en la membrana plasmática celular. Para determinar si MOSPD2 endógena también se puede localizar en la membrana celular, se aislaron fracciones subcelulares de monocitos CD14 humanos primarios y se analizaron en cuanto a la presencia de MOSPD2 (véase Métodos y materiales). Los resultados en la FIG. 10 muestran que MOSPD2 se encuentra en la membrana y no en la fracción citoplásmica. Para demostrar la pureza de las fracciones citoplásmicas y de membrana se utilizaron anticuerpos para ERK y para MHC de Clase I, respectivamente.

EJEMPLO 7 (de REFERENCIA)

VB-201 inhibe a MOSPD2

Mareaje de VB-201 y VB-221

VB-201 y VB-221 se marcaron con biotina de la siguiente manera. Se disolvieron VB-201, VB-221 y ovoalbúmina (OVA, Sigma, Israel) en tampón MES 0,1 M (Thermo Scientific, Rockford, IL) y conjugaron usando EDC [1-etil-3-(dimetilaminopropil)carbodiimida HCL] (Thermo Scientific) en una relación molar de 100 (VB-201/VB-221):1 (OVA):240 (EDC) durante 2-3 horas a temperatura ambiente. Después de esto, las muestras se transfirieron a casetes de diálisis de 10 kDa (Thermo Scientific) y se dializaron durante la noche frente a PBS. Luego se conjugaron VB-201 (OB201) y VB-221 (OB221) unidos a ovoalbúmina con amina-PEG2-biotina (en tampón MES 0,1 M) usando EDC en una relación molar de 1 (O<b>201/OB221):100 (amina- PEG2-biotina):700 (EDC). Se dejó que la reacción prosiguiera durante 2-3 horas a temperatura ambiente, después de lo cual las muestras se transfirieron nuevamente a un casete de diálisis de 10 kDa y se dializaron durante la noche frente a PBS.

Especificidad de unión a la superficie celular de VB-201 y VB-221 mediante citometría de flujo

Se utilizó estreptavidina-APC (eBioscience, San Diego, CA) para detectar la unión de VB-201 o VB-221 marcados en experimentos de citometría de flujo.

Precipitación

Las células se lisaron utilizando un tampón de lisis de NP-40 al 1 % que contenía inhibidores de proteasas y fosfatasa 1:100, seguido de 20 min de incubación en hielo y 15 min de centrifugación a máxima velocidad. Las muestras se incubaron durante la noche a 4 °C con disolvente, OB201 u OB221 en un rotador. Se añadieron perlas de agarosa estreptavidina (Sigma, Israel) durante 2 horas. La elución de proteínas se realizó con tampón de lisis sin DTT durante 10 min a temperatura ambiente. La carga de muestras, la transferencia y la inmunotransferencia se realizaron como se describe anteriormente.

Resultados

VB-201 se une a MOSPD2 expresado en superficie

Anteriormente se demostró que VB-201 inhibe la migración de monocitosin vitroein vivo.Sin embargo, VB-221, un derivado de VB-201, no inhibió la señalización ni la migración inducida por quimiocinas en monocitos humanos. Usando VB-201 y VB-221 marcados, se precipitaron proteínas de monocitos humanos y se estudió su visualización diferencial por espectrometría de masas. Los resultados de la espectrometría de masas revelaron que MOSPD2 tiene una fuerte unión a VB-201 pero no a VB-221.

Para validar adicionalmente estos resultados, se emplearon VB-201 y VB-221 marcados en lisados celulares de monocitos CD14 humanos. Luego se exploraron las muestras con anti MOSPD2 y TLR2. Mientras que VB-201 y VB-221 precipitaron TLR2 con una intensidad comparable, VB-201 precipitó MOSPD2 notablemente más intensamente que VB-221 (FIG. 11). Estos resultados también indican que VB-201 se une a MOSPD2.

También se realizaron estudios para evaluar si VB-201 puede unirse a MOSPD2 en su forma nativa, cuando se expresa en la superficie celular. Por tanto, las células HEK293 se transfectaron con un plásmido que codifica MOSPD2 humana marcada con HA y luego se tiñeron con VB-201 o VB-221 marcado. La FIG. 12 muestra tinción intensa de VB-201 marcado en células que expresan MOSPD2 (HA positivo), mientras que sólo se detectó una tinción débil con VB-221 marcado. De manera conjunta, estos resultados muestran que VB-201 puede unirse a MOSPD2 humana expresada en la superficie celular.

EJEMPLO 8 (de REFERENCIA)

Generación de anticuerpos monoclonales de (Fab')2 anti-MOSPD2

Se obtuvieron anticuerpos monoclonales (mAb) de (Fab')<2>anti-MOSPD2 utilizando HuCAL PLATINUM® Platform (Bio-Rad AbD Serotec, GmnH) que contiene una selección de Fab humanos presentados en fagos.

Brevemente, se inmovilizó sobre un soporte sólido una proteína recombinante de la región extracelular de MOSPD2 fusionada a un Fc humano. La biblioteca HUCAL® presentada en partículas de fagos se incubó con el antígeno inmovilizado. Los anticuerpos no específicos se eliminaron mediante un lavado exhaustivo y los fagos de anticuerpos específicos se eluyeron añadiendo un agente reductor. El ADN del anticuerpo se aisló como un agrupamiento y se subclonó en un vector de expresión deE. colipara generar mAb de F(ab')<2>bivalentes. Se recogieron las colonias y se cultivaron en una placa de microtitulación. Los cultivos se lisaron para liberar las moléculas de anticuerpo y se analizaron para determinar la unión al antígeno específico mediante ELISA y FACS. Los anticuerpos singulares se expresaron y purificaron mediante cromatografía de afinidad de una etapa y luego se analizaron nuevamente mediante ELISA y FACS para determinar su especificidad.

La FIG. 13 enumera 17 clones de anticuerpos monoclonales de F(ab<')2>anti-MOSPD2 que se identificaron después de una selección primaria para determinar la unión a células que sobreexpresan MOSPD2. Un análisis adicional de los clones en cuanto a la unión de MOSPD2 con un ELISA identificó 12 clones que tenían valores superiores a 5 veces sobre el fondo (* en la FIG. 13).

EJEMPLO 9 (de REFERENCIA)

El mAb de F(ab')2 anti-MOSPD2 se une a MOSPD2 humana sobreexpresada en células

Se transfectaron células de melanoma A2058 con MOSPD2 humana etiquetada con HA para generar células que sobreexpresan MOSPD2.

Luego se probó la unión de los 12 clones de anticuerpos identificados en el Ejemplo 8 a MOSPD2 usando citometría de flujo con estas células. De manera específica, se incubaron 105 células con 2,5 |jg de mAb de F(ab<')2>a 4 °C durante 1 hora en 100 j l de tampón FACS (PBS SFT al 2 % azida sódica al 0,02 %). Luego se lavaron las células, se resuspendieron en tampón FACS y tiñeron durante 30 min a 4 °C con (Fab<')2>anti-IgG humana de cabra conjugado con Alexa-Fluor 647, F(ab<')2>1:200 (n.° de catálogo 109-606-097, Jackson Immunoresearch, PA). Las células se lavaron, se resuspendieron en tampón FACS y analizaron en un dispositivo FACS-Calibur.

Todos los clones tiñeron positivamente las células. En las FIG. 14A-14B se muestran tinciones representativas de 2 clones. Se usó como control negativo un clon que no se identificó como clon positivo con ELISA en el Ejemplo 8.

EJEMPLO 10

Definición de la especificidad y la localización de la expresión celular de MOSPD2

El análisis de diferentes subpoblaciones de células inmunitarias indicó que MOSPD2 se expresa predominantemente en monocitos CD14+ antes que en los linfocitos T y B (FIG. 15A). Para determinar el nivel de expresión del ARNm de MOSPD2, se extrajo el ARN de las células utilizando el kit RNeasy mini kit (Qiagen, ValenVBa, CA). Para la preparación de ADNc, se combinaron 2 jg de ARN con la mezcla de reacción qScript y la transcriptasa inversa qScript (Quanta Bioscience, Gaithersburg, MD). La reacción se colocó en un termociclador (BioRad, Hercules, CA) y se programó una ejecución de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones de PCR en tiempo real se realizaron en un sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems 7300 (Grand Island, NY) utilizando juegos de cebadores para MOSPD2 humana, 28S para normalizar los niveles de ARN (BIOSEARCH TECHNOLOGIES, Petaluma, CA), y mezcla maestra de PCR SYBR Green (Applied Biosystems), Warrington, R.U.).

Se predice que MOSPD2 es una proteína de la membrana plasmática con una región transmembrana y una cola intracelular de un resto de longitud. El fraccionamiento de compartimentos celulares, la tinción por inmunofluorescencia de monocitos humanos y la citometría de flujo en células HEK 293 transfectadas para sobreexpresar MOSPD2 marcada con HA (realizado de acuerdo con los métodos descritos anteriormente) revelaron que MOSPD2 es una proteína de la superficie celular que se expresa en la membrana plasmática de los monocitos humanos (FIG. 15B-15D, respectivamente).

EJEMPLO 11

MOSPD2 se expresa en monocitos infiltrados en tejidos inflamados

Se deshidrataron tejidos fijados con formalina, se incluyeron en parafina y cortaron con 4 jm . La inmunotinción se calibró completamente en un módulo de tinción Benchmark XT (Ventana Medical Systems). Después de que los cortes se desparafinaran y rehidrataran, se añadieron anti-CD163 (Cell Marque, Rocklin, EE. UU., MRQ-26) o anti-MOSPD2 diluidos a 1:80 y 1:100, respectivamente, y se dejaron en reposo durante 40 minutos. La tinción anti-CD163 se detectó utilizando el kit UltraView universal Alkaline Phosphatase red detection kit (Ventana Medical Systems, 760-501) y la tinción anti-MOSPD2 se detectó utilizando el kit UltraView universal DAB detection kit (Ventana Medical Systems, 760 500). Cuando se aplicó la doble tinción, primero se realizó la tinción con MOSPD2 seguida de la tinción con CD163. Los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina (Ventana Medical Systems). Una vez finalizada la ejecución en el teñidor automático, los portaobjetos se deshidrataron consecutivamente en etanol al 70 %, etanol al 95 % y etanol al 100 % durante 10 segundos cada uno. Antes de cubrirlos con el cubreobjetos, los cortes se aclararon en xileno durante 10 segundos y se montaron con Entellan. Los portaobjetos teñidos con MOSPD2 y CD163 se observaron utilizando un microscopio Olympus BX51. Se tomaron imágenes con una cámara de visión digital Nikon y el programa informático NIS Elements Imaging.

Como se muestra en las FIG. 16A-16C, MOSPD2 se expresa en monocitos infiltrados en una variedad de tejidos inflamados. La FIG. 16A muestra la tinción de la membrana sinovial de un paciente con artritis reumatoide para CD163, MOSPD2 o tanto CD163 como MOSPD2. La FIG. 16B muestra la tinción de tejido carotídeo ateroesclerótico para CD163, MOSPD2 o tanto CD163 como MOSPD2. La FIG. 16C muestra la tinción de tejido mamario de carcinoma ductal infiltrante para MOSPD2. Las flechas oscuras indican tinción positiva para células tumorales. Las flechas claras indican tinción de monocitos infiltrantes.

EJEMPLO 12

MOSPD2 no afecta a la activación inducida por IFN gamma ni a la activación mediada por PKC

El direccionamiento a MOSPD2 no comprometió las funciones biológicas de los monocitos distintas de la migración. Se transdujeron células de la línea monocítica U937 con control sh-lenti o partículas víricas de sh-lenti MOSPD2 como se describió anteriormente y se trataron con IFN gamma o con PMA. El análisis de transferencia de Western de las células tratadas mostró que el silenciamiento de MOSPD2 no alteró la fosforilación de los marcadores de señalización aguas abajo mediante IFN-gamma o PMA (FIG. 17A y 17B, respectivamente). Estos resultados sugieren que MOSPD2 propicia específicamente la migración de monocitos.

EJEMPLO 13 (de REFERENCIA)

Mapeo epitópico de anticuerpos anti-MOSPD2

Para determinar el epítopo o los epítopos a los que los anticuerpos anti-MOSPD2 pueden unirse específicamente en MOSPD2 humana, se miden las afinidades de unión a varios fragmentos de MOSPD2 humana, como se describe en el presente documento, capturando fragmentos de MOSPD2 biotinilados en el extremo aminoterminal mediante una estreptavidina (SA) preinmovilizada en un chip de SA y midiendo la cinética de unión de los anticuerpos anti-MOSPD2 titulados en toda la superficie de MOSPD2 (el sistema BIAcore®3000™ sistema de resonancia de plasmón superficial (SPR, del ingléssurface plasmon resonance),Biacore, Inc., Piscataway NJ). Los ensayos BIAcore se realizan en tampón de ejecución HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, polisorbato P20 al 0,005 % v/v). Las superficies de MOSPD2 se preparan diluyendo MOSPD2 biotinilada en el extremo N a una concentración inferior a 0,001 mg/ml en tampón HBS-EP e inyectándola a través del chip sensor de SA utilizando tiempos de contacto variables. Para los estudios cinéticos de alta resolución se utilizan superficies de baja capacidad, correspondientes a niveles de captura <50 unidades de respuesta (UR), mientras que las superficies de alta capacidad (alrededor de 800 UR de MOSPD2 capturada) se utilizan para estudios de concentración, cribado y determinaciones de afinidad en solución.

Los datos cinéticos se obtienen diluyendo el anticuerpo Fab de G1 en serie en incrementos de dos o tres veces hasta concentraciones que abarcan 1 pM-0,1 nM (con el objetivo de 0,1-10 veces la Kd estimada). Normalmente, las muestras se inyectan durante 1 minuto a 100 pl/min y se permiten tiempos de disociación de al menos 10 minutos. Después de cada ciclo de unión, las superficies se regeneran con NaOH 25 mM en etanol al 25 % v/v, que se tolera durante cientos de ciclos. Una serie de titulación completa (normalmente generada por duplicado) se ajusta globalmente a un modelo de unión de Langmuir 1:1 mediante el programa BIAevaluation. Esto arroja un par único de constantes cinéticas de asociación y disociación (respectivamente, Kon y Koff) para cada interacción de unión, cuya relación da la constante de disociación de equilibrio (Ko=Koff/Kon).

Los anticuerpos anti-MOSPD2 pueden unirse específicamente a una o más de las siguientes regiones de aminoácidos de MOSPD2 humana, numerados de acuerdo con la SEQ ID NO:1 (restos de aminoácidos 1-518): 508-517, 501-514, 233-241, 509-517, 212-221, 13-24, 505-517, 505-514, 89-100, 506-517, 233-245, 504-514, 128-136, 218-226, 15-24, 83-96, 42-50, 462-474, 340-351, 504-517, 462-470, 327-337, 21-32, 217-226, 510-517, 178-190, 497-509, 504-516, 64-77, 504-515, 147-159, 503-315, 88-97, 208-218, 178-191,502-515, 503-516, 497-505, 500-509, 189-202, 189-197, 505-516, 1-63, 82-239, 93-234, 327-445, 327-431 y 497-517.

EJEMPLO 14 (de REFERENCIA)

Anticuerpos anti-MOSPD2 adicionales

Se generan anticuerpos anti-MOSPD2 adicionales que reconocen uno o más epítopos de MOSPD2, siguiendo la metodología descrita en el Ejemplo 5 (anticuerpos policlonales) o el Ejemplo 8 (anticuerpos monoclonales).

Brevemente, se fusionan con un Fc humano porciones de MOSPD2 identificadas en el Ejemplo 14 como epítopos de MOSPD2 y se inmovilizan sobre un soporte sólido. Una biblioteca HUCAL® (HuCAL PLATINO® Platform; Bio-Rad AbD Serotec, GmnH) presentada en partículas de fagos se incuba con el antígeno inmovilizado. Los anticuerpos no específicos se eliminan mediante un lavado exhaustivo y los fagos de anticuerpos específicos se eluyen añadiendo un agente reductor. El ADN del anticuerpo se aísla como un agrupamiento y se subclonó en un vector de expresión deE. colipara generar mAb de F(ab')<2>bivalentes. Se recogen las colonias y se cultivan en una placa de microtitulación. Los cultivos se lisan para liberar las moléculas de anticuerpo y se analizan para determinar la unión al antígeno específico mediante ELISA y FACS. Los anticuerpos singulares se expresan y purifican mediante cromatografía de afinidad de una etapa y luego se analizan nuevamente mediante ELISA y FACS para determinar su especificidad.

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor de la Proteína 2 que contiene el dominio de esperma móvil (MOSPD2) para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno inflamatorio, en donde el inhibidor es un agente de silenciamiento de ARN, en donde el agente de silenciamiento de ARN inhibe o silencia específicamente la expresión de MOSPD2.

2. El inhibidor para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agente de silenciamiento de ARN es capaz de inducir interferencia por ARN.

3. El inhibidor para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agente de silenciamiento de ARN es un ARN horquillado corto (ARNhc).

4. El inhibidor para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agente de silenciamiento de ARN es un ARN de antisentido.

5. Un inhibidor de la Proteína 2 que contiene el dominio de esperma móvil (MOSPD2) para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno inflamatorio, en donde el inhibidor es ADN, en donde el ADN hibrida con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido MOSPD2.

6. El inhibidor para el uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el inhibidor es un ADN de antisentido, un ADN señuelo, un ADN bicatenario, un ADN monocatenario, un ADN formando complejo, un ADN encapsulado, un ADN vírico, un ADN plasmídico o un sistema de edición génica.

7. El inhibidor para el uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el sistema de edición génica es un sistema CRISPR-CAS9.

8. El inhibidor para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la enfermedad o trastorno inflamatorio es una enfermedad o trastorno inflamatorio idiopático, una enfermedad o trastorno inflamatorio crónico, una enfermedad o trastorno inflamatorio agudo, una enfermedad o trastorno autoinmunitario, una enfermedad o trastorno infeccioso, una enfermedad o trastorno inflamatorio maligno, una enfermedad o trastorno inflamatorio relacionado con trasplante, una enfermedad o trastorno inflamatorio degenerativo, una enfermedad o trastorno asociado con una hipersensibilidad, una enfermedad o trastorno inflamatorio cardiovascular, una enfermedad o trastorno inflamatorio cerebrovascular, una enfermedad o trastorno vascular periférico, una enfermedad o trastorno inflamatorio glandular, una enfermedad o trastorno inflamatorio gastrointestinal, una enfermedad o trastorno inflamatorio cutáneo, una enfermedad o trastorno inflamatorio hepático, una enfermedad o trastorno inflamatorio neurológico, una enfermedad o trastorno inflamatorio osteomuscular, una enfermedad o trastorno inflamatorio renal, una enfermedad o trastorno inflamatorio reproductivo, una enfermedad o trastorno inflamatorio sistémico, una enfermedad o trastorno inflamatorio del tejido conjuntivo, necrosis, una enfermedad o trastorno inflamatorio relacionado con implante, un proceso inflamatorio de envejecimiento, una enfermedad o trastorno de inmunodeficiencia o una enfermedad o trastorno inflamatorio pulmonar.

9. El inhibidor para el uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la enfermedad o trastorno inflamatorio cardiovascular es una enfermedad o trastorno oclusivo, ateroesclerosis, una enfermedad valvular cardíaca, estenosis, reestenosis, estenosis en endoprótesis vascular, infarto de miocardio, arteriopatía coronaria, síndromes coronarios agudos, insuficiencia cardíaca congestiva, angina de pecho, isquemia miocárdica, trombosis, granulomatosis de Wegener, arteritis de Takayasu, síndrome de Kawasaki, enfermedad o trastorno autoinmunitario anti-factor VIII, vasculitis necrotizante de vasos pequeños, poliangitis microscópica, síndrome de Churg y Strauss, glomerulonefritis necrosante focal pauci-inmunitaria, glomerulonefritis con semilunas, síndrome antifosfolipídico, insuficiencia cardíaca inducida por anticuerpos, púrpura trombocitopénica, anemia hemolítica autoinmunitaria, autoinmunidad cardíaca, enfermedad o trastorno de Chagas o autoinmunidad anti-linfocitos T auxiliares.

10. El inhibidor para el uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la enfermedad o trastorno inflamatorio cerebrovascular es accidente cerebrovascular, inflamación cerebrovascular, hemorragia cerebral o insuficiencia arterial vertebral.

11. El inhibidor para el uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la enfermedad o trastorno vascular periférico es gangrena, vasculopatía diabética, enfermedad isquémica del intestino, trombosis, retinopatía diabética o nefropatía diabética.

12. El inhibidor para el uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la enfermedad o trastorno autoinmunitario es artritis reumatoide crónica, artritis reumatoide juvenil, lupus eritematoso sistémico, esclerodermia, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, panarteritis nudosa, polimiositis/dermatomiositis, síndrome de Sjogren, enfermedad de Bechet, diabetes autoinmunitaria, enfermedad de Hashimoto, psoriasis, mixedema primario, anemia perniciosa, miastenia grave, hepatitis activa crónica, anemia hemolítica autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica idiopática, uveítis, vasculitis o trombocitopenia inducida por heparina.

13. El inhibidor para el uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la enfermedad o trastorno inflamatorio del tejido conjuntivo es distrofia muscular de Duchenne, tendinitis, condritis, artritis, artritis reumatoide o artrosis.

14. El inhibidor para el uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la enfermedad o trastorno inflamatorio glandular es una enfermedad o trastorno pancreático, diabetes de tipo I, enfermedad o trastorno de la tiroides, enfermedad o trastorno de Graves, tiroiditis, tiroiditis autoinmunitaria espontánea, tiroiditis de Hashimoto, mixedema idiopático, autoinmunidad ovárica, infertilidad autoinmunitaria anti-espermatozoides, prostatitis autoinmunitaria o síndrome poliglandular autoinmunitario de tipo I.

15. El inhibidor para el uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la enfermedad o trastorno inflamatorio gastrointestinal es colitis, ileítis, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal crónica, síndrome inflamatorio del intestino, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad celíaca, colitis ulcerosa, una úlcera, una úlcera de la piel, una úlcera de decúbito, una úlcera gástrica, una úlcera péptica, una úlcera bucal, una úlcera nasofaríngea, una úlcera esofágica, una úlcera duodenal o una úlcera gastrointestinal.

16. El inhibidor para el uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la enfermedad o trastorno inflamatorio hepático es hepatitis autoinmunitaria, cirrosis hepática o cirrosis biliar.

17. El inhibidor para el uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la enfermedad o trastorno inflamatorio neurológico es esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, miastenia grave, neuropatía motora, síndrome de Guillain-Barre, neuropatía autoinmunitaria, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, enfermedad o trastorno neurológico paraneoplásico, atrofia cerebelosa paraneoplásica, síndrome de la persona rígida no paraneoplásico, atrofia cerebelosa progresiva, encefalitis de Rasmussen, esclerosis lateral amiotrófica, corea de Sydeham, síndrome de Gilles de la Tourette, poliendocrinopatía autoinmunitaria, neuropatía disinmunitaria, neuromiotonía adquirida, artrogriposis múltiple, enfermedad de Huntington, demencia asociada al SIDA, accidente cerebrovascular, una enfermedad o trastorno inflamatorio de la retina, una enfermedad o trastorno inflamatorio ocular, neuritis óptica, encefalopatía espongiforme, migraña, cefalea, cefalea en racimos o síndrome del hombre rígido.

18. El inhibidor para el uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la enfermedad o trastorno inflamatorio pulmonar es asma, enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, sarcoidosis o bronquitis.

19. El inhibidor para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la enfermedad o trastorno inflamatorio es fibrosis, esteatohepatitis, esteatohepatitis no alcohólica (ENA), glomerulonefritis o glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GFS).