ES2961674T3 - Microorganismos recombinantes que comprenden enzimas dependientes de NADPH y métodos de producción de los mismos - Google Patents

Microorganismos recombinantes que comprenden enzimas dependientes de NADPH y métodos de producción de los mismos Download PDF

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Abstract

La invención proporciona un microorganismo Clostridia carboxidotrófico recombinante con una mayor utilización general de NADPH en relación con un microorganismo original. Además, la invención proporciona un método para producir un microorganismo Clostridia carboxidotrófico recombinante que exhibe una mayor utilización de NADPH en relación con un microorganismo parental. En particular, la invención se refiere a aumentar la utilización general de NADPH en un microorganismo Clostridia carboxidotrófico recombinante para aumentar la producción de al menos un producto de fermentación por parte del microorganismo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Microorganismos recombinantes que comprenden enzimas dependientes de NADPH y métodos de producción de los mismos
Campo de la invención
La invención se refiere a métodos de selección de enzimas para optimizar la producción de compuestos deseables mediante fermentación. Más particularmente, pero no exclusivamente, la invención se refiere al equilibrio de cofactores en vías de fermentación y a la ingeniería metabólica.
Antecedentes
Los equivalentes reductores tales como la nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y el nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) son coenzimas importantes para reacciones enzimáticas redox tal como las reacciones de oxidoreducatasa y se encuentran en todas las células vivas. En general, se acepta que la reserva de NADPH sea considerablemente más pequeña que la reserva de NADH (G. N. Bennett & San, 2009). EnE. colicultivado con azúcar glucosa, la reserva de NADH es más de 20 veces mayor que la reserva de NADPH (BD Bennettet al.,2009). Esta baja disponibilidad de NADPH limita muchas reacciones biosintéticas y bioconversiones, especialmente en procesos de fermentación (R Poulsenet al.,2005). La preferencia de las enzimas por el NADPH puede limitar la producción de un producto deseado (G. N. Bennett & San, 2009). Esto es un problema a la hora de diseñar nuevas reacciones y vías en un microorganismo y es uno de los principales obstáculos para la generación de plataformas de producción eficiente de compuestos, incluidos los biocombustibles, productos químicos, aminoácidos o vitaminas (Chemler, Fowler, McHugh, & Koffas, 2010).
No obstante, la ingeniería metabólica se ha demostrado con éxito para la producción de una amplia gama de combustibles y productos químicos (Peralta-Yahya & Keasling, 2010) limitando, eludiendo o evitando reacciones dependientes de NADPH cuando sea posible. Como alternativa, se han utilizado transhidrogenasas consumidoras de energía que interconvierten entre reservas de NADH y NADPH. Otra estrategia para lograr una ingeniería metabólica exitosa es la eliminación de reacciones competitivas dependientes de NADPH. A pesar de estos avances, estas estrategias novedosas con frecuencia se aplican a expensas de los rendimientos de producción y/o las tasas de crecimiento (Auriol, Bestel-Corre, Claudio, Soucaille, & Meynial-Salles, 2011). Adicionalmente, solamente son posibles debido a un extenso trabajo de ingeniería con múltiples modificaciones (S. M Maet al.,2011). Por lo tanto, estos esfuerzos se han limitado únicamente a organismos genéticamente manejables tales comoEscherichia coliySaccharomyces cerevisiae(Peralta-Yahya & Keasling, 2010). Estos organismos están limitados ya que se alimentan únicamente de azúcar. En consecuencia, su uso comercial y su viabilidad adolecen de importantes inconvenientes relacionados con el uso de la tierra, la seguridad alimentaria, la volatilidad de la oferta y cuestiones medioambientales.
Los clostridios carboxidotróficos ofrecen una alternativa aE. coliy S.cerevisiaey pueden crecer a partir de gases residuales y gas de síntesis. Hay algunos ejemplos de clostridios carboxidotróficos recombinantes que tienen un número limitado de modificaciones (Schiel-Bengelsdorf & Durre, 2012). Todos los ejemplos conocidos utilizan reacciones dependientes de NADH.
Es un objeto de la presente invención proporcionar un proceso que supere o mejore una o más de las desventajas de la técnica anterior, o al menos proporcione al público una opción útil.
Sumario de la invención
En un primer aspecto, la invención proporciona un microorganismo clostridio carboxidotrófico recombinante que expresa al menos una enzima exógena dependiente de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH), en donde la enzima dependiente de NADPH es una hidrogenasa, una formiato deshidrogenasa, una metilen-THF-deshidrogenasa, una hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) reductasa, una 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa, una acetoacetil-CoA reductasa, una trans-2-enoil-CoA reductasa, una enzima codependiente de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH)/nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) o una isoforma bifurcadora de NADH/NADPH; además, en donde la utilización general de NADPH sobre NADH por parte del microorganismo aumenta en relación con el microorganismo precursor.
En un segundo aspecto, la invención proporciona el microorganismo recombinante del primer aspecto, en donde la hidrogenasa es una nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP) hidrogenasa exclusiva de Fe bifurcadora.
En un tercer aspecto, la invención proporciona el microorganismo recombinante del primer aspecto, en donde la formiato deshidrogenasa es una NADp formiato deshidrogenasa bifurcadora.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona el microorganismo recombinante del primer aspecto, en donde la acetoacetil-CoA reductasa esphaB(EC 1.1.1.36).
En un quinto aspecto, la invención proporciona el microorganismo recombinante del cuarto aspecto, en donde el microorganismo recombinante comprende además 3-hidroxibutiril-CoA deshidratasa exógena dependiente de NADHphaJ(EC 4.2.1.119).
En un sexto aspecto, la invención proporciona elClostridium autoethanogenumdel cuarto aspecto, en donde el microorganismo recombinante comprende además 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa exógena dependiente de NADHhbd(EC 1.1.1.157).
En un séptimo aspecto, la invención proporciona el microorganismo recombinante del primer aspecto, en donde la trans-2-enoil-CoA reductasa es una crotonil-CoA reductasa.
En un octavo aspecto, la invención proporciona el microorganismo recombinante del séptimo aspecto, en donde la crotonil-CoA reductasa esccr(EC 1.3.1.86) occrRs(EC 1.3.1.85).
En un noveno aspecto, la invención proporciona el microorganismo recombinante del octavo aspecto, en donde el microorganismo recombinante comprende además crotonil-CoA reductasa dependiente de NADH (EC 1.3.1.44) exógena.
En un décimo aspecto, la invención proporciona el microorganismo recombinante del primer aspecto, en donde el microorganismo recombinante tiene una producción aumentada de al menos un producto de fermentación con respecto al microorganismo precursor.
En un decimoprimer aspecto, la invención proporciona el microorganismo recombinante del primer aspecto, en donde la isoforma dependiente de NADH de la enzima dependiente de NADPH está atenuada o suprimida en comparación con un microorganismo precursor.
En un decimosegundo aspecto, la invención proporciona el microorganismo recombinante del primer aspecto, en donde el microorganismo recombinante se selecciona del grupo que consiste enClostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium ragsdahlei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium, formicoaceticum,yClostridium magnum.
En un decimotercer aspecto, la invención proporciona elClostridium autoethanogenumdel duodécimo primer aspecto, en donde elClostridium autoethanogenumes DSM23693.
En un decimocuarto aspecto, la invención proporciona el microorganismo recombinante del primer aspecto, en donde el microorganismo comprende una hidrogenasa exógena y una formiato deshidrogenasa exógena.
En un decimoquinto aspecto, la invención proporciona el microorganismo recombinante del decimocuarto aspecto, en donde la hidrogenasa es una NADP hidrogenasa exclusiva de Fe y la formiato deshidrogenasa es una NADP formiato deshidrogenasa bifurcadora.
En un decimosexto aspecto, la invención proporciona el microorganismo recombinante del decimoquinto aspecto, en donde la NADP hidrogenasa exclusiva de Fe y la NADP formiato deshidrogenasa forman un complejo.
T ambién se puede decir que la invención consiste en las partes, elementos y características mencionados o indicados en la especificación de la solicitud, individual o colectivamente, en cualquiera o todas las combinaciones de dos o más de dichas partes, elementos o características.
Breve descripción de los dibujos
A continuación, se describirán realizaciones de la invención, a modo de ejemplo solamente, haciendo referencia a los dibujos adjuntos en los que:
La figura 1 muestra los resultados de los ensayos enzimáticos para los pasos de la oxidorreductasa implicados en la vía de Wood Ljungdahl para determinar sus especificidades de cofactor;
la figura 2 muestra la diferencia entre la glucólisis (por ejemplo, enE. coli)y el crecimiento autótrofo a través de la vía de Wood-Ljungdahl en clostridios carboxidotróficos (por ejemplo,C. autoethanogenum)con respecto al uso de cofactor;
la figura 3 muestra la organización de los genes de formiato deshidrogenasa e hidrogenasa capaces de formar un complejo formiato-hidrógeno liasa;
la figura 4 muestra la distribución de los resultados de la expresión del gen mediante qRT-PCR, destacando las reacciones dependientes de NADPH altamente expresadas durante el crecimiento autótrofo;
la figura 5 muestra los resultados de ensayos enzimáticos con una alcohol deshidrogenasa secundaria deC. autoethanogenumy acetona como sustrato y NADPH o NADH como cofactor. La actividad solamente se midió con NADPH pero no con NADH, lo que demuestra que esta enzima es estrictamente dependiente de NADPH; y
la figura 6 muestra la conversión continua de acetona en isopropanol mediante una enzima alcohol deshidrogenasa secundaria dependiente de NADPH a altas velocidades. Se puede observar que la acetona se convierte en isopropanol poco después de su introducción en el biorreactor. Incluso a altas concentraciones de 20 g/l, el cultivo convirtió toda la acetona en isopropanol, lo que demuestra que la reserva de NADPH es suficiente para mantener esto incluso a una tasa elevada.
La figura 7 muestra la formación de productos impulsada por NADPH durante el crecimiento en CO a través de nuevos complejos de hidrogenasas NADP de Fe solamente bifurcadas con electrones/NADP formiato deshidrogenasa/formiato-hidrógeno liasa.
La figura 8 muestra la vía completa dependiente de NADPH para la biosíntesis de butanol. Cada paso está catalizado por una enzima codificada en el gen anotado en cursiva.
La figura 9 muestra un análisis de los niveles de NADPH y NADH deC. autoethanogenum.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Definiciones
La expresión "nicotinamida adenina dinucleótido" (NADH) puede referirse al par redox tanto de NAD+ (forma oxidada) como de NADH H+ (forma reducida).
La expresión "nicotinamida adenina dinucleótido fosfato" (NADPH) puede referirse al par redox tanto de NADP+ (forma oxidada) como de NADPH H+ (forma reducida).
Como se cita en el presente documento, una "enzima dependiente de NADPH" utiliza predominantemente (aunque no necesariamente exclusivamente) NADPH como cofactor para suministrar electrones a una reacción. De forma similar, una enzima dependiente de NADH utiliza predominantemente (aunque no necesariamente de manera exclusiva) NADH como cofactor para suministrar electrones a una reacción. Un experto en la materia también apreciará que algunas enzimas son capaces de utilizar NADPH y NADH y pueden denominarse enzimas dependientes de NAD(P)H bifuncionales.
Como se cita en el presente documento, la expresión "aumenta la utilización general de NADPH por el microorganismo", o similar, se refiere a un aumento en la cantidad de cofactor NADPH que se une a una enzima en un período de tiempo particular. El aumento puede ser de al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 50 % o al menos un 100 %. Este aumento se puede medir según el método utilizado en el ejemplo 3 o según otros métodos conocidos en la técnica, por ejemplo (S. Wang, Huang, Moll, & Thauer, 2010). La expresión también puede interpretarse en el sentido de que hay un aumento en el flujo de NADPH a través de una vía y el aumento es de los mismos cuantos descritos anteriormente. El flujo de NADPH se puede medir mediante el nivel de metabolitos y productos (metaboliómica) y/o experimentos de marcado como C13 (fluxómica).
Como se usa en el presente documento, "especificidad de cofactor" se refiere al grado de afinidad con el que un cofactor se une a una enzima durante una reacción. No debe entenderse que una enzima y un cofactor tienen especificidad absoluta, aunque este puede ser el caso, e incluye al menos una preferencia por la unión entre una enzima particular y un cofactor sobre otro cofactor.
Como se cita en el presente documento, una "isoforma" de una enzima es cualquiera de dos o más proteínas funcionalmente similares que pueden catalizar la misma reacción y tienen una secuencia de aminoácidos similar pero no idéntica.
Como se cita en el presente documento, una "enzima bifurcadora" es una enzima que puede utilizar múltiples cofactores, donde un cofactor tiene un potencial de reacción más bajo (tal como la ferredoxina) y el otro tiene un potencial de reacción más alto (tal como NADH o NADPH) en una reacción acoplada para catalizar una reacción que no podría catalizarse, o donde la reacción procedería a una velocidad más baja, solamente por el cofactor con mayor potencial de reacción (tal como NADH o NADPH). Una enzima bifurcadora puede utilizar múltiples cofactores para aumentar la velocidad de una reacción. La enzima bifurcadora puede ser un complejo, tal como el complejo de formiato hidrógeno liasa descrito en el presente documento.
La expresión "adaptado a" puede usarse en el presente documento para describir un microorganismo recombinante de la invención; por ejemplo, el microorganismo está "adaptado para" expresar una enzima particular. Cuando se usa en relación con la expresión de una enzima, la expresión no implica que la enzima se exprese continuamente, se pretende cubrir situaciones en las que la enzima puede expresarse y dicha expresión puede ser constitutiva o inducida.
Como se cita en el presente documento, un "caldo de fermentación" es un medio de cultivo que comprende al menos un medio nutritivo y células bacterianas.
Las expresiones "que aumenta la eficacia", "eficacia aumentada" y similares, cuando se utilizan en relación a un proceso de fermentación, incluyen, pero sin limitación, aumentar uno o más de la tasa de crecimiento de microorganismos que catalizan la fermentación, la tasa de crecimiento y/o producción del producto a concentraciones elevadas del producto, el volumen del producto deseado producido por volumen de sustrato consumido, la velocidad de producción o el nivel de producción del producto deseado, y la proporción relativa del producto deseado producido en comparación con otros subproductos de la fermentación.
La expresión "sustrato que comprende monóxido de carbono" y expresiones similares, incluyen cualquier sustrato en el que una o más cepas de bacterias disponen de monóxido de carbono para su crecimiento y/o fermentación, por ejemplo.
La expresión "sustrato gaseoso que comprende monóxido de carbono" y expresiones y términos similares incluyen cualquier gas que contenga un nivel de monóxido de carbono. El sustrato puede contener al menos aproximadamente un 20 % hasta aproximadamente un 100 % de CO en volumen, del 20 % al 70 % de CO en volumen, del 30 % al 60 % de CO en volumen, y del 40 % al 55 % de CO en volumen. El sustrato puede comprender aproximadamente un 25 %, o aproximadamente un 30 %, o aproximadamente un 35 %, o aproximadamente un 40 %, o aproximadamente un 45 %, o aproximadamente un 50 % de CO, o aproximadamente un 55 % de CO, o aproximadamente un 60 % de CO en volumen.
Si bien no es necesario que el sustrato contenga hidrógeno, la presencia de H<2>no debería ser perjudicial para la formación de producto. La presencia de hidrógeno puede dar como resultado una eficiencia de la producción de alcohol global mejorada. Por ejemplo, el sustrato puede comprender una relación de aproximadamente 2:1, 1:1 o 1:2 de H<2>:CO. El sustrato puede comprender aproximadamente el 30 % o menos de H<2>en volumen, 20 % o menos de H<2>en volumen, aproximadamente el 15 % o menos de H<2>en volumen o aproximadamente el 10 % o menos de H<2>en volumen. La corriente de sustrato puede comprender bajas concentraciones de H<2>, por ejemplo, menos de 5 %, o menos de 4 %, o menos de 3 %, o menos de 2 %, o menos de 1 %, o está sustancialmente exenta de hidrógeno. El sustrato también puede contener algo de CO<2>por ejemplo, tal como de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 80 % de CO<2>en volumen, o de un 1 % a aproximadamente un 30 % de CO<2>en volumen. El sustrato puede comprender menos de o igual a aproximadamente el 20 % de CO<2>en volumen. El sustrato puede comprender menos de o igual a aproximadamente el 15 % de CO<2>en volumen, menos de o igual a aproximadamente el 10 % de CO<2>en volumen, menos de o igual a aproximadamente el 5 % de CO<2>en volumen o sustancialmente nada de CO<2>.
En la siguiente descripción, se hace referencia al suministro y fermentación de un "sustrato gaseoso que contiene CO". No obstante, debe apreciarse que el sustrato gaseoso puede proporcionarse en formas alternativas. Por ejemplo, el sustrato gaseoso que contiene CO puede proporcionarse disuelto en un líquido. Esencialmente, un líquido se satura con un gas que contiene monóxido de carbono y después ese líquido se añade al biorreactor. Esto puede conseguirse usando metodología convencional. A modo de ejemplo, podría utilizarse un generador de dispersión de microburbujas (Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Número 3 / Octubre, 2002). A modo de ejemplo adicional, el sustrato gaseoso que contiene CO puede adsorberse sobre un soporte sólido. El uso de la expresión "sustrato que comprende CO" y similares abarca dichos métodos alternativos.
El sustrato gaseoso que contiene CO puede ser un gas de escape o un gas residual industriales. Los "gases de escape o residuales industriales" deben entenderse en sentido amplio para incluir todos los gases que comprendan CO producidos por un proceso industrial y los gases producidos como resultado de la fabricación de productos de metales ferrosos, fabricación de productos no ferrosos, procesos de refinamiento de petróleo, gasificación de carbón, gasificación de biomasa, producción de energía eléctrica, producción de negro de carbón y fabricación de coque. Se pueden proporcionar más ejemplos en otra parte del presente documento.
A menos que el contexto requiera otra cosa, las expresiones "fermentación", "proceso de fermentación" o "reacción de fermentación" y similares, como se usa en el presente documento, pretenden abarcar tanto la fase de crecimiento como la fase de biosíntesis de producto del proceso. Como se describirá más adelante en el presente documento, el biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento y un segundo reactor de fermentación. Por tanto, debe entenderse que la adición de metales o composiciones a una reacción de fermentación incluye la adición a uno o ambos de estos reactores.
El término "biorreactor" incluye un dispositivo de fermentación que consiste en uno o más recipientes y/o torres o tuberías, que incluye el reactor de tanque agitado de flujo continuo (CSTR, por sus siglas en inglés), un reactor de células inmovilizadas (ICR, por sus siglas en inglés), un reactor de lecho percolador (TBR, por sus siglas en inglés), una columna de burbujas, un fermentador de elevación de gases, un mezclador estático, u otro recipiente u otro dispositivo adecuado para el contacto gas-líquido. El biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento y un segundo reactor de fermentación. Por tanto, cuando se hace referencia a la adición de sustrato al biorreactor o a la reacción de fermentación, debe entenderse que incluye la adición a uno o ambos de estos reactores cuando sea necesario.
Como se cita en el presente documento, un "microorganismo lanzadera" es un microorganismo en el que se expresa una enzima metiltransferasa y es distinto del microorganismo de destino.
Como se cita en el presente documento, un "microorganismo de destino" es un microorganismo en el que los genes incluidos en una construcción/vector de expresión se expresan y es distinto del microorganismo lanzadera.
Los "ácidos nucleicos exógenos" son ácidos nucleicos que se originan fuera del microorganismo en el que se introducen. Los ácidos nucleicos exógenos pueden proceder de cualquier fuente apropiada, incluyendo, pero sin limitación, el microorganismo en el que se van a introducir (por ejemplo, un microorganismo precursor del que procede el microorganismo recombinante), cepas o especies de microorganismos que difieren del organismo al que se van a introducir, o pueden crearse de manera artificial o recombinante. En una realización, los ácidos nucleicos exógenos representan secuencias de ácidos nucleicos presentes naturalmente dentro del microorganismo en el que se van a introducir, y se introducen para aumentar la expresión de o sobreexpresar un gen particular (por ejemplo, aumentando el número de copias de la secuencia (por ejemplo, un gen), o introduciendo un promotor fuerte o constitutivo para aumentar la expresión). En otra realización, los ácidos nucleicos exógenos representan secuencias de ácidos nucleicos que no están presentes de forma natural dentro del microorganismo en el que se van a introducir y permiten la expresión de un producto que no está presente de forma natural dentro del microorganismo o una mayor expresión de un gen natural del microorganismo (por ejemplo en el caso de introducción de un elemento regulador tal como un promotor). El ácido nucleico exógeno puede adaptarse para integrarse en el genoma del microorganismo en el que se va a introducir o para permanecer en un estado extracromosómico.
"Exógeno" también puede utilizarse para referirse a proteínas. Esto se refiere a una proteína que no está presente o no es capaz de expresarse en un microorganismo precursor del que procede el microorganismo recombinante.
El término "endógeno" como se usa en el presente documento en relación con un microorganismo recombinante y un ácido nucleico se refiere a cualquier ácido nucleico que esté presente en un microorganismo precursor del cual procede el microorganismo recombinante. Cuando se usa para describir proteínas, "endógeno" debe considerarse que se refiere a cualquier proteína que esté presente o sea capaz de expresarse en un microorganismo precursor del cual procede el microorganismo recombinante.
Las "oxidorreductasas" (también conocidas como "deshidrogenasas" u "oxidasas") incluyen enzimas que catalizan la transferencia de electrones desde una molécula - el reductor, también llamado donante de electrones, a otra molécula - el oxidante, también llamado aceptor de electrones. Las oxidorreductasas se clasifican como EC 1 en la clasificación de enzimas con número EC. Este grupo de enzimas suele requerir cofactores tales como NADH, NADPH o ferredoxina.
Una "reacción" enzimática como se menciona en el presente documento es la conversión de una o más moléculas (sustratos) en otra o más moléculas (productos) catalizada por una enzima.
Debe apreciarse que la invención se puede poner en práctica usando ácidos nucleicos cuya secuencia varía de las secuencias ejemplificadas específicamente en el presente documento, siempre que realicen sustancialmente la misma función. Para las secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína o péptido, esto significa que la proteína o péptido codificado tiene sustancialmente la misma función. Para secuencias de ácido nucleico que representan secuencias promotoras, la secuencia variante tendrá la capacidad para promover la expresión de uno o más genes. Dichos ácidos nucleicos pueden denominarse en el presente documento "variantes funcionalmente equivalentes". A modo de ejemplo, las variantes funcionalmente equivalentes de un ácido nucleico incluyen variantes alélicas, fragmentos de un gen, genes que incluyen mutaciones (deleción, inserción, sustituciones de nucleótidos y similares) y/o polimorfismos y similares. Los genes homólogos de otros microorganismos también pueden considerarse ejemplos de variantes funcionalmente equivalentes de las secuencias ejemplificadas específicamente en el presente documento. Estos incluyen genes homólogos en especies tales comoClostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, C. Ijungdahliicuyos detalles están disponibles públicamente en sitios web tales como Genbank o NCBI. La expresión "variantes funcionalmente equivalentes" también debe considerarse que incluye ácidos nucleicos cuya secuencia varía como resultado de la optimización de codones para un organismo particular. A menos que el contexto requiera otra cosa, las "variantes funcionalmente equivalentes" de un ácido nucleico tendrán preferentemente al menos aproximadamente un 70 %, 72 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más de identidad de secuencia de ácido nucleico con respecto al ácido nucleico identificado.
También se debe apreciar que la invención se puede poner en práctica usando polipéptidos cuya secuencia varía de las secuencias de aminoácidos ejemplificadas específicamente en el presente documento. Estas variantes pueden denominarse en el presente documento "variantes funcionalmente equivalentes". A menos que el contexto requiera otra cosa, una variante funcionalmente equivalente de una proteína o un péptido incluye aquellas proteínas o péptidos que comparten al menos un 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 72 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más de identidad de aminoácidos con la proteína o péptido identificados y tiene sustancialmente la misma función que el péptido o proteína de interés. Dichas variantes incluyen en su alcance fragmentos de una proteína o péptido en donde el fragmento comprende una forma truncada del polipéptido en donde las eliminaciones pueden ser de 1 a 5, a 10, a 15, a 20, a 25 aminoácidos y puede extenderse desde el resto 1 al 25 en cualquier extremo del polipéptido, y en donde las eliminaciones pueden tener cualquier longitud dentro de la región; o pueden estar en una ubicación interna. También se debe considerar que las variantes funcionalmente equivalentes de los polipéptidos específicos del presente documento incluyen polipéptidos expresados por genes homólogos en otras especies de bacterias, por ejemplo como se ejemplifica en el párrafo anterior.
"Sustancialmente la misma función" como se usa en el presente documento pretende significar que el ácido nucleico o polipéptido es capaz de realizar la función del ácido nucleico o polipéptido del cual es una variante. Por ejemplo, una variante de una enzima podrá catalizar la misma reacción que esa enzima. No obstante, no debe entenderse que la variante tiene el mismo nivel de actividad que el polipéptido o ácido nucleico del que es variante.
Se puede evaluar si una variante funcionalmente equivalente tiene sustancialmente la misma función que el ácido nucleico o polipéptido del que es una variante usando métodos conocidos por un experto en la materia. No obstante, a modo de ejemplo, se describen ensayos para determinar actividad hidrogenasa, formiato deshidrogenasa o metilen-THF-deshidrogenasa en(Huang, Wang, Moll, & Thauer, 2012).
"Sobreexpresa", "sobreexpresión" y términos y expresiones similares cuando se usan en relación con la invención deben tomarse en sentido amplio para incluir cualquier aumento en la expresión de una o más proteínas (incluida la expresión de uno o más ácidos nucleicos que codifican las mismas) en comparación con el nivel de expresión de la proteína (incluidos los ácidos nucleicos) de un microorganismo precursor en las mismas condiciones. No debe entenderse que la proteína (o el ácido nucleico) se expresan en ningún nivel en particular.
"Expresión atenuada", como se menciona en el presente documento, se refiere a la expresión de un ácido nucleico o proteína que está disminuida con respecto a su expresión en un microorganismo precursor. La expresión atenuada puede incluir sustancialmente ninguna expresión (o una expresión sustancialmente "cero"). Esto se puede lograr mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que incluye, por ejemplo, silenciamiento de ARN, modificación del proceso de expresión (por ejemplo, alteración de la función promotora), alteración o modificación de una secuencia de ácido nucleico (incluyendo eliminación, adición y sustitución de uno o más nucleótidos), o eliminación completa o parcial del ácido nucleico que codifica la enzima del genoma. Cuando un gen deja de funcionar, puede denominarse en el presente documento "suprimido" o haber sido "suprimido" o términos similares.
Un "microorganismo parental" es un microorganismo usado para generar un microorganismo recombinante de la invención. El microorganismo precursor puede ser uno que se encuentra en la naturaleza (es decir, un microorganismo natural) o uno que se ha modificado previamente pero que no expresa o sobreexpresa una o más de las enzimas objeto de la presente invención. En consecuencia, los microorganismos recombinantes de la invención se modifican para que expresen o sobreexpresen una o más enzimas que no se expresaban o sobreexpresaban en el microorganismo precursor
El microorganismo puede seleccionarse del grupo de organismos acetogénicos carboxidotróficos que comprenden las especiesClostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Moorella thermoacetica, Sporomusa ovate, Butyribacterium methylotrophicum, Blautia producta, Eubacterium limosum, Thermoanaerobacter kiuvi.
Estos acetógenos carboxidotróficos se definen por su capacidad para utilizar y crecer de manera quimioautótrofa en fuentes gaseosas de un carbono (C1), tal como monóxido de carbono (CO) y dióxido de carbono (CO2), con monóxido de carbono (CO) y/o hidrógeno (H2) como fuente de energía en condiciones anaeróbicas formando acetil-CoA, acetato y otros productos. Comparten el mismo modo de fermentación, la vía de Wood-Ljungdahl o acetil-CoA reductora, y se definen por la presencia del conjunto de enzimas formado por monóxido de carbono deshidrogenasa (CODH, por sus siglas en inglés), hidrogenasa, formiato deshidrogenasa, formil-tetrahidrofolato sintetasa, metilen-tetrahidrofolato deshidrogenasa, formil-tetrahidrofolato ciclohidrolasa, metilen-tetrahidrofolato reductasa y monóxido de carbono deshidrogenasa/Acetil-CoA sintasa (CODH/ACS), cuya combinación es característica y exclusiva de este tipo de bacterias (Drake, Kusel, Matthies, Wood, & Ljungdahl, 2006). A diferencia del crecimiento quimioheterótrofo de bacterias fermentadoras de azúcar que convierten el sustrato en biomasa, metabolitos secundarios y piruvato a partir de los cuales se forman productos (ya sea a través de acetil-CoA o directamente), en los acetógenos el sustrato se canaliza directamente hacia acetil-CoA, a partir de la cual se forman biomasa y metabolitos secundarios.
El microorganismo puede seleccionarse de un grupo de clostridios carboxidotróficos que comprende las especiesClostridium autoethanogenum, C. ljungdahlii,y"C. ragsdalei"y aislados relacionados. Estos incluyen, pero sin limitación, las cepas deC. autoethanogenumJAI-1T (DSM10061) (Abrini, Naveau, Y Nyns, 1994),C. autoethanogenumLBS1560 (DSM19630) (documento W0/2009/064200),C. autoethanogenumLBS1561 (DSM23693), C.ljungdahliiPETCT (DSM13528 = ATCC 55383) (Tanner, Miller, y Yang, 1993),C. ljungdahliiERI-2 (ATCC 55380) (patente de los<Estados Unidos 5.593.886), C. ljungdahlii C-01>(A<t>CC<55988) (patente de los Estados Unidos 6.368.819), C.>ljungdahliiO-52 (ATCC 55989) (Patente de los Estados Unidos 6.368.819), o "C.ragsdaleiP11T" (ATCC BAA-622) (documento WO 2008/028055), y aislados relacionados tales como "C.coskatii"(patente de los Estados Unidos 2011/0229947),"Clostridium sp.MT351 "(Tyurin y Kiriukhin, 2012),"Clostridium sp.MT 653 "(Berzin, Kiriukhin, y Tiurin,<2012a), "Clostridium sp. MT683" (Berzin, 2012), "Clostridium sp.>M<t>962"<(Berzin, Kiriukhin, y Tyurin, 2013) "Clostridium>sp.MT 1121 " (Berzin, Kiriukhin, y Tyurin, 2012b),"Clostridium sp.MT1230" (Kiriukhin y Tyurin, 2013), o"Clostridium sp.MT1962" (Berzin, Tyurin, y Kiriukhin, 2013), y cepas mutantes de los mismos tales comoC. ljungdahliiOTA-1 (Tirado-Acevedo O. Production of Bioethanol from Synthesis Gas UsingClostridium ljungdahlii.PhD thesis, Universidad Estatal de Carolina del Norte, 2010) o"Clostridium sp.MT896 " (Berzin, Kiriukhin, y Tiurin, 2012c).
Estas cepas forman un subgrupo dentro del grupo I de ARNr de clostridios (Collinset al.,1994), que tiene al menos un 99 % de identidad en el nivel del gen ARNr 16S, aunque son especies distintas según lo determinado por experimentos de reasociación ADN-ADN y huellas de ADN (documento WO 2008/028055, patente de los Estados Unidos 2011 (0229947)).
Las cepas de este grupo se definen por características comunes, teniendo ambas un genotipo y un fenotipo similares, y todas comparten el mismo modo de conservación de energía y metabolismo fermentativo. Las cepas de este grupo carecen de citocromos y conservan energía a través de un complejo Rnf.
Todas las cepas de este grupo tienen un tamaño de genoma de alrededor de 4,2 Mpb (Kopkeet al.,2010) y una composición de GC de alrededor del 32 % mol (Abriniet al.,1994; Kopkeet al.,2010; Tanneret al.,1993) (documento WO 2008/028055; patente de los Estados Unidos 2011/0229947), y conservan operones genéticos clave esenciales que codifican enzimas de la vía de Wood-Ljungdahl (monóxido de carbono deshidrogenasa, formil-tetrahidrofolato sintetasa, metilen-tetrahidrofolato deshidrogenasa, formil-tetrahidrofolato ciclohidrolasa, metilen-tetrahidrofolato reductasa y monóxido de carbono deshidrogenasa/Acetil-CoA sintasa), hidrogenasa, formiato deshidrogenasa, complejo Rnf(rnfCDGEAB),piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, aldehído:ferredoxina oxidorreductasa (Kopkeet al.,2010, 2011). La organización y el número de genes de la ruta Wood-Ljungdahl, responsable de la absorción de gases, se ha descubierto que son los mismos en todas las especies, a pesar de las diferencias en las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos (Kopkeet al.,2011).
Todas las cepas tienen una morfología y tamaño similares (las células en crecimiento logarítmico miden entre 0,5-0,7 x 3-5 |jm), son mesófilas (temperatura de crecimiento óptima entre 30-37 °C) y estrictamente anaerobias (Abriniet al.,1994; Tanneret al.,1993)(documento WO 2008/028055). Asimismo, todas ellas comparten los mismos rasgos filogenéticos principales, tales como el mismo intervalo de pH (pH 4-7,5, con un pH inicial óptimo de 5,5-6), un fuerte crecimiento autótrofo en gases que contienen CO con tasas de crecimiento similares y un perfil metabólico con etanol y ácido acético como principal producto final de la fermentación, formándose pequeñas cantidades de 2,3-butanodiol y ácido láctico en determinadas condiciones (Abriniet al.,1994; Kopkeet al.,2011; Tanneret al.,1993)(WO diferencia en la utilización del sustrato de varios azúcares (por ejemplo, ramnosa, arabinosa), ácidos (p. ej. gluconato, citrato), aminoácidos (por ejemplo, arginina, histidina) u otros sustratos (por ejemplo, betaína, butanol). Se descubrió que algunas de las especies eran auxótrofas a determinadas vitaminas (por ejemplo, tiamina, biotina) mientras que otras no lo eran. Se ha demostrado la reducción de ácidos carboxílicos en sus correspondientes alcoholes en una variedad de estos microorganismos (Perez, Richter, Loftus, y Angenent, 2012).
Por lo tanto, los rasgos no son específicos de un organismo comoC. autoethanogenumoC. ljungdahlii,sino rasgos generales para clostridios carboxidotróficos sintetizadores de etanol. De este modo, se puede anticipar que la invención funcionará en estas cepas, aunque puede haber diferencias en el rendimiento.
En determinadas realizaciones, el microorganismo precursor se selecciona del grupo que comprendeClostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahliiyClostridium ragsdalei.El grupo también comprendeClostridium coskatii.En una realización particular, el microorganismo precursor esClostridium autoethanogenumDSM23693.
Los términos "construcciones" o "vectores" de ácidos nucleicos y términos similares deben tomarse en sentido amplio para incluir cualquier ácido nucleico (incluidos ADN y ARN) adecuado para su uso como vehículo para transferir material genético a una célula. Se debe considerar que los términos incluyen plásmidos, virus (incluyendo bacteriófagos), cósmidos y cromosomas artificiales, por ejemplo, construcciones o vectores pueden incluir uno o más elementos reguladores, un origen de replicación, un sitio de clonación múltiple y/o un marcador seleccionable. Las construcciones o vectores pueden adaptarse para permitir la expresión de uno o más genes codificados por la construcción o vector. Las construcciones o vectores de ácidos nucleicos incluyen ácidos nucleicos desnudos así como ácidos nucleicos formulados con uno o más agentes para facilitar el suministro a una célula (por ejemplo, ácido nucleico conjugado con liposomas, un organismo en el que se encuentra el ácido nucleico).
Todos los ejemplos conocidos de clostridios carboxidotróficos que crecen en gases residuales y gas de síntesis utilizan reacciones dependientes de NADH. El par redox NADPH H+/NADP+ tiene un potencial redox más negativo que el par redox NADH+ H+/NAD+ (Auriolet al.,2011). En condicionesin vivoel potencial redox E' de la pareja NAD+/NADH es de aproximadamente -280 mV (Eo'= -320 mV), mientras que E' de la pareja NADP+/NADPH es de aproximadamente -360 mV (Eo'= -320 mV). Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que varias enzimas implicadas en el crecimiento autótrofo para la absorción y utilización de los gases CO, CO2y H2 (por ejemplo, las enzimas hidrogenasa y las enzimas de la vía Wood-Ljungdahl) muestran una clara tendencia hacia la utilización de NADPH sobre NADH. Esto contrasta completamente con, por ejemplo, la glucólisis del azúcar que utiliza bacterias comoE. colique sirve como modelo para la mayoría de los procesos bacterianos y tiene tendencia absoluta hacia NADH. Estas reacciones basadas enE. colino incluyen un paso de reacción dependiente de NADPH, pero sí incluyen varios pasos dependientes de NADH (glucosa 2 NAD+ 2 ADP 2 Pi -> 2 piruvato 2 NADH 2 H+ 2 ATP 2 H2O; figura 2).
Se ha demostrado que las reacciones dependientes de NADPH enE. coliagotan rápidamente la reserva de NADPH y provocan la inhibición del crecimiento y la muerte de las células. Esta falta de capacidad de NADPH enE. coliha dado lugar a estudios previos para intentar reducir la dependencia de NADPH y, por lo tanto, los estudios sugieren que aumentar la utilización de NADPH sería indeseable en las reacciones de fermentación. Por lo tanto, fue sorprendente para los presentes inventores descubrir que los clostridios carboxidotróficos a los que se hace referencia en el presente documento tienen una capacidad relativamente grande para que se produzcan reacciones dependientes de NADPH.
Los presentes inventores han demostrado la capacidad relativamente grande de la reserva de NADPH en microorganismos clostridios carboxidotróficos mediante un experimento que controla la conversión de acetona en un biorreactor mediante una enzima dependiente de NADPH (véase el ejemplo 3). En consecuencia, los presentes inventores han demostrado que el uso de NADPH sobre NADH sería favorable para impulsar reacciones enzimáticas en un proceso de fermentación.
Así, las estrategias existentes paraE. coli,utilizando reacciones dependientes de NADH y eludiendo las reacciones dependientes de NADPH (que dan como resultado una reducción en el rendimiento del producto y requieren modificaciones extensas) no son productivas en clostridios carboxidotróficos. La invención como se describe en el presente documento proporciona una estrategia para superar esto seleccionando preferentemente reacciones dependientes de NADPH en clostridios carboxidotróficos para lograr rendimientos máximos de producto mediante ingeniería metabólica. La capacidad y el potencial de las reacciones dependientes de NADPH se muestran en el ejemplo 3, así como la diferencia conE. colique utiliza azúcares. De manera similar, esta estrategia se puede aplicar a vías heterólogas para lograr el máximo rendimiento y flujo de producto.
De manera adicional, los presentes inventores han identificado que las reacciones dependientes de NADPH proliferan en microorganismos carboxidotróficos. Esto permite el desarrollo de técnicas de selección para identificar y caracterizar enzimas y genes que utilizan la reserva de NADPH. Los microorganismos recombinantes que pueden expresar o sobreexpresar enzimas seleccionadas según estas técnicas tienen utilidad para mejorar la eficiencia de los microorganismos carboxidotróficos y aumentar la producción de sus productos deseables.
A diferencia de lo que enseña la técnica anterior en relación con organismos que utilizan azúcar tales comoE. coli,los presentes inventores contemplan que las reacciones dependientes de NADPH no sean un cuello de botella indeseable cuando se consideran microorganismos carboxidotróficos. Los presentes inventores creen que, de hecho, las enzimas que utilizan NADPH son positivamente deseables ya que tienen una mayor actividad en su presencia en comparación con su actividad en presencia de NADH.
El descubrimiento de que las enzimas dependientes de NADPH pueden usarse para impulsar la producción de productos deseables ha dado lugar a que los inventores diseñen nuevos microorganismos recombinantes que pueden expresar o sobreexpresar estas enzimas. Estos microorganismos recombinantes permiten explorar nuevas vías y producir productos deseables. En realizaciones particulares, los microorganismos recombinantes son microorganismos carboxidotróficos. Mientras que anteriormente se pensaba que las enzimas dependientes de NADPH debían eludirse o evitarse, los presentes inventores han demostrado sorprendentemente que la utilización de estas enzimas en microorganismos carboxidotróficos no provoca una disminución en el crecimiento y/o la producción microbiana y que no es necesaria una ingeniería exhaustiva para evitar dichas enzimas.
De acuerdo con el primer aspecto de la invención, se proporciona un microorganismo clostridio carboxidotrófico recombinante que expresa al menos una enzima dependiente de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) exógena, en donde la enzima dependiente de NADPH es una hidrogenasa, una formiato deshidrogenasa, una metilen-THF-deshidrogenasa, una hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) reductasa, una 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa, una acetoacetil-CoA reductasa, una trans-2-enoil-CoA reductasa, una enzima codependiente de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH)/nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) o una isoforma bifurcadora de NADH/NADPH; además, en donde la utilización general de NADPH sobre NADH por parte del microorganismo aumenta en relación con el microorganismo precursor.
También se divulga un método para producir un microorganismo clostridio carboxidotrófico recombinante que presenta una mayor utilización de NADPH en relación con un microorganismo precursor, comprendiendo el método:
a. seleccionar una o más enzimas dependientes de NADPH exógenas y/o endógenas;
b. transformar un microorganismo precursor para producir un microorganismo recombinante que está adaptado para expresar la una o más enzimas exógenas y/o sobreexpresar la una o más enzimas endógenas.
La expresión o sobreexpresión de una cualquiera o más de las enzimas dependientes de NADPH en el microorganismo da como resultado un aumento general en la utilización de NADPH en relación con un microorganismo en el que una o más enzimas no se expresan o no se sobreexpresan.
La una o más enzimas pueden existir en isoformas dependientes de NADH y NADPH. El microorganismo recombinante puede adaptarse para expresar y/o sobreexpresar la isoforma dependiente de NADPH. Los métodos son de particular utilidad cuando la utilización de NADPH y NADH está en un intervalo similar, es decir, la actividad de la isoforma que utiliza el cofactor cuando se une a un cofactor NADH es similar a la actividad de una isoforma cuando se une a un cofactor NADPH.
Como referencia, la una o más enzimas dependientes de NADPH comprenden hidrogenasa (por ejemplo, que tiene una secuencia de aminoácidos según las SEQ. ID 6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32, YP_003781016, YP_003781017, YP_003778879, YP_003779640, YP_003779893, YP_003780193, o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de los mismos). La una o más enzimas dependientes de NADPH pueden comprender formiato deshidrogenasa (que tiene una secuencia de aminoácidos, por ejemplo, de AEI90721, AEI90723, AEI90725, YP_003779063, YP_003778871, YP_003780168, AEI90722, AEI90724, AEI90726, o una variante funcionalmente equivalente de una cualquiera de las mismas) o metilen-THF-deshidrogenasa (que tiene una secuencia de aminoácidos, por ejemplo, de AEI90753, YP_003781891, AEI90771 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas).
En realizaciones particulares de la invención, existe una selección de reacciones dependientes de NADPH y NADH. La invención proporciona un microorganismo recombinante que utiliza preferentemente las isoformas dependientes de NADPH en comparación con las isoformas dependientes de NADH como una forma de aumentar la utilización general de NADPH con respecto a la utilización de NADPH en un microorganismo precursor. Los ejemplos de dichas vías y reacciones de oxidorreductasas incluyen:
■ Vía del mevalonato para la producción de isoprenoides:
o Hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) reductasa (SM Maet al.,2011):
■ Enzima dependiente de NADPH (EC 1.1.1.34; GO:0004420; p.ej,Saccharomyces cerevisiae:DAA09822.1; BK006946.2:115734. 118898) y
■ Enzima dependiente de NADH (EC 1.1.1.88; GO:0042282; p.ej,Pseudomonas mevalonii:P13702.1)
■ Vía butanol/PHB (Bond-Watts, Bellerose, y Chang, 2011):
o 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa/acetoacetil-CoA reductasa/3-hidroxibutiril-CoA hidratasa:
■PhaBdependiente de NADPH (EC:1.1.1.36; GO:0018454; p.ej., deRalstonia eutropha:YP_725942.1, GeneID:4249784) y
■PhaJdependiente de NADPH (EC 4.2.1.119; por ejemplo, deAeromonas punctata:BAA21816.1) ■Hbddependiente de NADH (EC 1.1.1.157; GO:0008691; por ejemplo, deC. acetobutylicum:NP_349314.1, GeneID:1118891)
o Crotonil-CoA reductasa/crotonil-CoA carboxilasa-reductasa/trans-2-enoil-CoA reductasa/butiril-CoA deshidrogenasa (Huet al.,2012):
■Ccrdependiente de NADPH (EC 1.3.1.86; por ejemplo, deStreptomyces collinus)occrRs(EC 1.3.1.85; por ejemplo, deRhodobacter sphaeroides:
YP_354044.1, Gene ID: 3720751)
■Terdependiente de NADH (EC 1.3.1.44; GO:0050343; por ejemplo deTreponema denticola)
■ Complejo NADH/ferredoxina bifurcadorabcd-etfAB(EC 1.3.8.1; GO:0004085; por ejemplo, de C.acetobutylicum:NP_349317.1; GeneID:1118894) (Liet al.,2008) o
■Terbifuncional dependiente de NADH/NADPH (EC 1.3.1.44; GO:0050343; por ejemplo deEuglena gracilis:AY741582.1) (Hoffmeister, Piotrowski, Nowitzki, y Martin, 2005)
Para la mayoría de las reacciones de oxidorreductasas que implican deshidrogenasas (por ejemplo, alcohol deshidrogenasas para etanol o butanol, o diol deshidrogenasas para butanodiol) y oxidasas, está disponible una selección de enzimas dependientes de NADH o NADPH y las enzimas correspondientes se pueden identificar utilizando bases de datos tal como la base de datos de enzimas de Braunschweig BRENDA. (http://www.brendaenzymes.info/) (Scheeret al.,2011).
El microorganismo puede adaptarse para expresar y/o sobreexpresar una isoforma dependiente de NADPH mientras que la expresión de una isoforma dependiente de NADH correspondiente no se modifica, disminuye o presenta un aumento comparativamente menor en comparación con el cambio en la expresión de la isoforma dependiente de NADPH. De esta manera, la utilización general de NADPH aumenta en relación con un microorganismo precursor.
En una realización particular, la invención proporciona un microorganismo recombinante con expresión atenuada o nula de una o más enzimas dependientes de NADH. En una realización particular, la expresión de la una o más isoformas dependientes de NADH se ha atenuado o suprimido en comparación con un microorganismo precursor. La atenuación/supresión se puede lograr modificando un ácido nucleico que codifica una o más enzimas dependientes de NADH o reemplazando uno o más ácidos nucleicos que codifican una isoforma dependiente de NADH con uno o más ácidos nucleicos que codifican una isoforma dependiente de NADPH. La atenuación o supresión de la enzima se puede lograr mediante la transformación de un microorganismo precursor para conseguir los microorganismos de la invención usando cualquier número de técnicas de transformación y de ácidos nucleicos recombinantes conocido. Los métodos en particular que pueden lograr atenuación o supresión de acetógenos carboxidotróficos se describen en Leang, Ueki, & Lovley, 2011 y se describen técnicas adicionales, por ejemplo, en Sambrook et al, ("Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). A modo de ejemplo general, en el caso de introducir una mutación en un gen, o de alterar o suprimir de otro modo un gen, se puede diseñar una construcción o vector de ácido nucleico apropiados para integrarse en el genoma del microorganismo precursor para alterar el gen. Dichas construcciones incluirán normalmente secuencias (brazos) de ácidos nucleicos homólogas a una región dentro del o flanqueantes al gen que se va a alterar, que permiten que se produzca una recombinación homóloga y la introducción de una mutación, la escisión de una región de ácido nucleico del gen, o la sustitución de una región del gen con un ácido nucleico de contraste. Si bien se prefiere que los brazos de las construcciones tengan un 100 % de complementariedad con la región del genoma a la que están dirigidos, esto no es necesario, siempre que la secuencia sea suficientemente complementaria para permitir la recombinación dirigida con la región genética de interés. Normalmente, los brazos tendrán un nivel de homología que permitiría la hibridación con una región diana en condiciones rigurosas, como se define en Sambrook et al 1989. Los expertos apreciarán secuencias de ácidos nucleicos suficientes para permitir la recombinación homóloga dirigida y la integración de un ácido nucleico exógeno en el genoma de un microorganismo precursor teniendo en cuenta la información de secuencia disponible para las enzimas implicadas en la invención como se describe en el presente documento.
La enzima puede presentar dependencia de múltiples cofactores. Dichas enzimas pueden comprender una enzima de NADH/ferredoxina bifurcadora o una enzima de NADH/NADPH codependiente. La enzima puede existir en una isoforma de NADH/NADPH bifurcadora y una isoforma de NADH/ferredoxina bifurcadora y el microorganismo está adaptado para expresar y/o sobreexpresar la isoforma dependiente de NADH/NADPH. La isoforma dependiente de Na Dh /NADPH puede ser ter (EC 1.3.1.44; GO:0050343; deEuglena gracilis:AY741582.1 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas). La isoforma dependiente de NADH/Fd puede ser el complejobcd-etfABde NADH/ferredoxina bifurcador (EC 1.3.8.1; GO:0004085; por ejemplo, deC. acetobutylicum:n P_349317.1; GeneID:1118894 o una variante funcionalmente equivalente del mismo).
En una realización particular de la invención, el microorganismo presenta una mayor eficiencia durante una reacción de fermentación en comparación con un microorganismo precursor. Los microorganismos implicados en la producción de productos de fermentación utilizan NADPH como cofactor para impulsar las reacciones implicadas en el crecimiento y la producción de productos de fermentación. Si dichos microorganismos expresan enzimas con una alta afinidad por los cofactores NADPH en comparación con los cofactores NADH, existe la posibilidad de que su eficiencia (véase la definición anterior) aumente si hay un aumento en la utilización de NADPH.
Las enzimas de la invención están implicadas en las rutas biosintéticas para producir varios productos. La vía puede ser la vía del mevalonato o la vía de síntesis de butanol.
La especificidad de cofactor de la una o más enzimas dependientes de NADPH se puede modificar para aumentar su especificidad para el cofactor NADPH en relación con su especificidad para el cofactor NADH.
También se divulga un método para aumentar la eficacia de un microorganismo carboxidotrófico aumentando la especificidad para el cofactor NADPH de una enzima oxidorreductasa en relación con la especificidad para el cofactor NADH de la enzima.
La especificidad para el cofactor de las enzimas oxidorreductasa se puede modificar de NADH a NADPH (o viceversa) modificando la secuencia de aminoácidos, particularmente en una región de la enzima que contribuye o que forma parte de los correspondientes compartimentos de unión a NADH y NADPH. El compartimento de unión a NADH/NADPH puede modificarse de otras formas conocidas en la técnica.
La modificación de la secuencia de aminoácidos puede comprender la adición, eliminación y/o sustitución de uno o más restos de aminoácidos, o una o más modificaciones que pueden ser fácilmente conocidas en la técnica. La modificación se puede producir en cualquier región de una enzima, tal como el compartimento de unión a NADH.
La modificación de la secuencia de aminoácidos puede comprender la modificación de uno o más restos de aminoácido en particular en el compartimento de unión a NADH como, por ejemplo, de un resto de ácido glutámico para la enzima butiril-CoA deshidrogenasa. El resto de ácido glutámico puede ser Glu75 enbedde C.acetobutylicumy/o Glu80 enT. denticola.Se conocen en la técnica modificaciones para lograr la especificidad de cofactor deseada, por ejemplo, se pueden utilizar las modificaciones descritas en Hu et al (2012).
Los presentes inventores prevén que la modificación de la especificidad de cofactor se pueda lograr mediante el análisis estructural de la crotonil-CoA reductasa/trans-2-enoil-CoA reductasa/butiril-CoA deshidrogenasa mencionada anteriormente de diversas especies y la conservación de Glu (Glu75 en bed de C.acetobutylicumy Glu80 enT. denticola)que desempeña un papel importante en la discriminación de NADH contra NADPH. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se cree que esto ocurre gracias a la enzima que reconoce el 2'-OH de la adenina ribosa de NADH. En las enzimas dependientes de NADPH, este resto se modifica (Huet al.,2012).
Los expertos en la materia conocerán los métodos para lograr la modificación de la especificidad de cofactor. No obstante, a modo de ejemplo, se pueden utilizar los métodos usados en los siguientes ejemplos que se relacionan con el cambio de la especificidad de cofactor para diversas enzimas oxidorreductasa:
• 1,3-propanodiol oxidorreductasa (C. Ma, Zhang, Dai, y Xiu, 2010)
• p-hidroxibenzoato hidroxilasa (Eppink, Overkamp, Schreuder y Van Berkel, 1999)
• 17p-hidroxiesteroide deshidrogenasa (McKeeveret al.,2002)
• Cetol-ácido reductoisomerasa (Rane y Calvo, 1997)
Nueva enzima bifurcadora
La bifurcación de electrones es un mecanismo recientemente descubierto de acoplamiento de reacciones redox endergónicas a exergónicas en el citoplasma de bacterias anaerobias y arqueas. Hasta ahora, solamente se han identificado unos pocos complejos enzimáticos bifurcadores de electrones y se han caracterizado 4 (Herrmann, Jayamani, Mai, & Buckel, 2008; Huanget al.,2012; Liet al.,2008; Schuchmann y Mueller, 2012; Schut y Adams, 2009; G. Wang y Wang, 1984). En 2008 se descubrió que en clostridios que forman ácido butírico la reducción exergónica de crotonil-CoA (Eo'= -10 mV) con NADH (Eo'= -320 MV) se combina con la reducción endergónica de ferredoxina (Eo'= -400 mV) con NADH y que la reacción acoplada está catalizada por el complejo citoplasmático de butiril-CoA deshidrogenasa-flavoproteína de transferencia de electrones Bcd-EtfAB (Herrmann, Jayamani, Mai, & Buckel, 2008; Liet al.,2008). Se sugiere que este proceso esté basado en flavinas: NADH reduce una flavina unida a una proteína a la hidroquinona, que posteriormente se reoxida mediante crotonil-CoA al radical semiquinona que tiene un potencial redox suficientemente negativo para reducir la ferredoxina (Fd). Hasta ahora, se han identificado pocos complejos enzimáticos bifurcadores de electrones y se han caracterizado 4 (Herrmannet al.,2008; Huanget al.,2012; Liet al.,2008; Schuchmann y Mueller, 2012; Schut y Adams, 2009; G. Wang y Wang, 1984). Además del complejo Bcd-EtfAB de la reacción 1, el complejo MvhADG-HdrABC de arqueas metanogénicas que cataliza la reacción 2, el complejo NfnAB de bacterias y arqueas que catalizan la reacción 3 y el complejo HydABC de bacterias que catalizan la reacción 4.
(1) 2NADH Fd<ox>+ crotonil-CoA -> 2 NAD+ Fd<red2->+ butiril-CoA
AG°'= -44 kJ/mol*
(2) 2H<2>+ CoM-S-S-CoB Fd<ox>-> CoM-SH CoB-SH Fd<red2'>+ 2H<+>
AG<0>'= -50 kJ/mol*
(3) NADH Fd<red2->+ 2N ADP<+>+ H<+>^ NAD<+>+ Fd<ox>+ 2NADPH
AG<°>'= - 16 kJ/mol*
(4) NADH Fd<red2->+ 3H<+>^ NAD<+>+ Fd<ox>+ 2 H<2>
AG<o>'= 21 kJ/mol*
*En condiciones estándar (concentraciones 1 M de sustratos y productos; presión parcial de gases = 1 bar; pH = 7) usando un Eo' de -400 mV
Todos estos complejos dependen de NADH, entre ellos dos, una hidrogenasa heteromérica exclusiva de Fe que acopla reversiblemente la reducción endergónica de ferredoxina con H<2>con la reducción exergónica de NAD con H<2>(Schuchmann y Müller, 2012; Schut y Adams, 2009). Los presentes inventores han identificado por primera vez una enzima bifurcadora dependiente de NADPH (reacción 5), una nueva [FeFe]-hidrogenasa bifurcadora de electrones que es específica de NADP en lugar de NAD.
(5) NADPH Fd<red2->+ 3H<+>^ NADP<+>+ Fd<ox>+ 2H<2>
AG<o>'= 21 kJ/mol*
*En condiciones estándar (concentraciones 1 M de sustratos y productos; presión parcial de gases = 1 bar; pH =7)usando un Eo' de -400 mV
Sin pretender quedar ligados a esta teoría, el papel de este complejo, además de la de hidrogenasa, es actuar como formiato:hidrógeno liasa. En esta función, representa una válvula de desbordamiento de electrones para la formación de productos impulsados por NADPH mediante la formación de H.<2>y formiato por reducción de protones y CO<2>, respectivamente, cuando el potencial redox intracelular de la pareja Fd<ox>/Fd<red2->y de la pareja NADP+/NADPH disminuye demasiado debido a la sobrerreducción de CO.
En condicionesin vivoel potencial redox E' de la pareja NAD+/NADH es de aproximadamente -280 mV (Eo'= -320 mV), y el E' de la pareja NADP+/NADPH es de aproximadamente -360 mV (Eo'= -320 mV). El potencial redox E' de la pareja Fdox/Fdred2- es -400 mV (Eo' de la ferredoxina deC. pasturianum),que es considerablemente menor. Por tanto, este proceso de bifurcación proporciona ventajas como velocidades de reacción más rápidas.
En condicionesin vivo,se predice que el potencial redox de la ferredoxina estará cercano a -500 mV, NADP con un potencial redox cercano a -370 mV y NAD con un potencial redox cercano a -280 mV. La diferencia de potencial redox entre la pareja Fd<ox>/Fd<red2->y de la pareja NAD<+>/NADH de aproximadamente 200 mV es lo suficientemente grande como para acoplarse con la fosforilación del transporte de electrones mediada por el complejo Rnf asociado a la membrana y una F<o>F<1>ATP sintasa. Se predice que la reducción de NAD<+>con ferredoxina es el principal sitio de acoplamiento en el metabolismo energético deC. autoethanogenumque crece en CO. NAD<+>se regenera continuamente a través de la reacción catalizada por Nfn que produce NADPH que luego puede impulsar la formación de producto (figura 7).
Los presentes inventores han identificado una nueva [FeFe]-hidrogenasa bifurcadora de electrones que es específica de NADP en lugar de NAD. Los presentes inventores también han identificado que una formiato deshidrogenasa expresada enC. autoethanogenumpuede utilizar tanto ferredoxina como NADPH en lugar de únicamente NADPH (denominada en el presente documento formiato deshidrogenasa bifurcadora).
Las nuevas funciones de estas enzimas se desconocían previamente y son las primeras enzimas NADP hidrogenasa exclusiva de Fe bifurcadora y NADP formiato deshidrogenasa bifurcadora dependientes de NADPH que se identifican. Estudios adicionales realizados por los presentes inventores han indicado que la NADP hidrogenasa exclusiva de Fe y la NADP formiato deshidrogenasa forman un complejo enzimático, denominado en el presente documento complejo formiato-hidrógeno liasa. Este complejo también puede tener utilidad en la producción de microorganismos recombinantes para lograr dependencia de múltiples cofactores.
En consecuencia, se proporciona el uso de un microorganismo recombinante, un polipéptido, o un polinucleótido que expresan o codifican dicha enzima con el fin de utilizar múltiples cofactores (por ejemplo, ferredoxina y NADPH) en una reacción. El polipéptido puede comprender una NADP formiato deshidrogenasa bifurcadora según AEI90721, YP_003778871, AEI90722, o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las mismas.
La NADP hidrogenasa exclusiva de Fe bifurcadora puede seleccionarse del grupo que consiste en la SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:26 e YP_003778879, y una variante funcionalmente equivalente de una cualquiera o más de las mismas.
El complejo formiato-hidrógeno liasa bifurcador puede estar codificado por las SEQ ID NO: 65 a 67 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas.
El polinucleótido que codifica una NADP hidrogenasa exclusiva de Fe bifurcadora, NADP formiato deshidrogenasa o complejo formiato-hidrógeno liasa, puede comprender uno o más polinucleótidos seleccionados del grupo que consiste en HQ876015, CLJU_c06990, AEI90722, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:25, CLJU_c07070, SEQ ID NO: 67 a 69 y una variante funcionalmente equivalente de una cualquiera o más de las mismas.
Los presentes inventores encontraron la proteína que codifica los genes para la NADP formiato deshidrogenasa bifurcadora y la NADP hidrogenasa exclusiva de Fe bifurcadora en un solo complejo génico, junto con genes para una flavoproteína hierro-azufre con un sitio de unión a NADP, proteínas hierro-azufre (FeS) y una formiato deshidrogenasa que contiene selenocisteína y molibdopterina (figura 3). Los presentes inventores proponen que estos genes codifican un complejo funcional al que se hará referencia en el presente documento como formiato hidrógeno liasa (véase el ejemplo 1). La flavoproteína hierro-azufre, las proteínas de hierro-azufre (FeS) y las proteínas accesorias de formiato y molibdeno que componen el complejo génico están codificadas por los polipéptidos como se muestra en la tabla 1 a continuación:
Tabla 1: Secuencias del grupo completo del complejo formiato-hidrógeno liasa deC. autoethanogenum:SEQ ID NO:
. l n hlii:E ID N :r l i:E ID N : 7.
También se divulga un microorganismo carboxidotrófico recombinante que expresa la nueva NADP hidrogenasa exclusiva de Fe bifurcadora, NADP formiato deshidrogenasa bifurcadora y/o una formiato-hidrógeno liasa, cuando se utiliza con el fin de utilizar múltiples cofactores en una reacción. Preferentemente, los múltiples cofactores comprenden ferredoxina y NADPH.
También se divulga un método para aumentar la eficiencia de la fermentación de un sustrato que contiene CO mediante el uso de un microorganismo carboxidotrófico recombinante que expresa una hidrogenasa bifurcadora como se describe anteriormente. La eficiencia aumenta debido a que la enzima bifurcadora utiliza tanto ferredoxina como NADPH en lugar de únicamente NADPH. El potencial redox más negativo de la ferredoxina en comparación con el de NADPH proporciona un mayor potencial energético a la reacción, aumentando así la velocidad de reacción y el<rendimiento del sustrato de>C<o>.
Adicionalmente, los presentes inventores han identificado una nueva enzima Nfn en especies de clostridios carboxidotróficos que incluyen C.autoethanogenum, C. Ijungdahlii y C. ragsdalei.Esta enzima Nfn es capaz de reducir el NADP<+>a NADPH H<+>para reponer la reserva a expensas de NADH H<+>(o viceversa) (reacción 2):
(2) Fd<red2->+ NADH 2 NADP<+>+ H<+>^ Fd<ox>+ NAD<+>+ 2 NADPH
Esta enzima se ha descrito hasta ahora solamente para un organismo, C.kluyveri(S. Wanget al.,2010), donde está compuesto por dos subunidades NfnA y NfnB que forman un complejo. Los presentes inventores identificaron actividad en células deC. autoethanogenume identificaron el gen correspondiente (ejemplo 4). Esta es la primera vez que se identifica un solo gen Nfn y la primera enzima Nfn identificada en organismos carboxidotróficos. Al tener una sola subunidad, en lugar de un complejo de dos subunidades, tiene ventajas, incluso en la producción y modificación de la enzima.
Sin pretender quedar ligados a esta teoría, los presentes inventores creen que los dos nuevos complejos NADP hidrogenasas exclusivas de Fe bifurcadoras de electrones/NADP formiato deshidrogenasa/formiato-hidrógeno liasa y el complejo Nfn desempeñan un papel crucial en la conservación de energía y en la formación de producto reducido a partir de CO, que está impulsada por NADPH junto con la descrita monóxido de carbono deshidrogenasa (CODH) dependiente de ferredoxina, el complejo F<0>F<1>Rnf (Kopkeet al.,2010; Tremblay, Zhang, Dar, Leang, & Lovley, 2012) de las reacciones 7-9 (figura 7).
(7) CO H<2>O Fd<ox>^ CO<2>+ Fd<red2->+ 2 H<+>
(8) Fd<red2->+ NAD<+>+ H<+>^ .Fd<ox>+ NADH A<j>H+
(9) A<|j>H++ 0,5 ADP 0,5 Pi ^ 0,5 ATP 0,5 H<2>O
La ferredoxina funcionain vivoa un potencial redox más negativo que -400 mV, NADP con un potencial redox cercano a -360 mV y NAD con un potencial redox cercano a -280 mV. La diferencia de potencial redox entre la pareja Fd<ox>/Fd<red2->y de la pareja NAD+/NADH de aproximadamente 120 mV es lo suficientemente grande como para acoplarse con la fosforilación del transporte de electrones mediada por el complejo Rnf asociado a la membrana (reacción 8) y una FoF1 ATP sintasa (reacción 9). El NAD+ se regenera continuamente mediante la reacción 6 catalizada por el complejo Nfn que produce NADPH y mediante otras reacciones dependientes de NADH. A continuación, el NADPH se puede utilizar para impulsar la formación de producto junto con otras reacciones dependientes de NADPH identificadas (figura 7).
Debido al potencial redox altamente negativo del CO (- 520 mV), es probable que reduzca excesivamente la ferredoxina y el NADP cuando estos portadores de electrones no se puedan volver a oxidar con la suficiente rapidez. Una forma de aumentar la velocidad de reoxidación de ferredoxina y NADPH es aumentar la velocidad de formación de producto reducido seleccionando reacciones dependientes de NADPH.
Los resultados de la tabla 2 a continuación muestran que los microorganismos carboxidotróficos que expresan la enzima Nfn tienen la capacidad de convertir NADH en NADPH para su uso por enzimas dependientes de NADPH.
Tabla 2
Los presentes inventores descubrieron que la enzima Nfn se remonta a un único gen/proteína (SEQ. ID NO 1 y 2 respectivamente enC. autoethanogenum),no dos como enC. kluyveri.Un gen similar que codifica esta enzima también está presente enC. Ijungdahlii(YP_003781852.1; CLJU_c37240) (donde está anotada como glutamato sintasa) yC. ragsdaIei(SEQID NO: 3 y 4).
Los presentes inventores prevén que el aumento de la expresión del gen Nfn, o una variante funcional del mismo, en un microorganismo recombinante permitirá un aumento en la eficiencia de las enzimas dependientes de NADPH y dará lugar a una mayor producción de producto a partir de una reacción de fermentación.
En consecuencia, se divulga un método para aumentar la eficiencia de producción de un microorganismo expresando o sobreexpresando un complejo enzimático Nfn.
También se divulga el uso de un microorganismo recombinante para convertir NADH en NADPH aumentando el tamaño de la reserva de NADPH, en donde el microorganismo recombinante está adaptado para expresar y/o sobreexpresar una única enzima Nfn. La enzima Nfn puede comprender la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO 2, 4, YP_003781852.1, CLJU_c37240 o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las mismas con al menos un 76 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia. La enzima Nfn convierte NADH en NADPH, por lo tanto, cuando se expresa en presencia de enzimas dependientes de NADH y NADPH, la eficiencia de la enzima aumenta, lo que da lugar a una velocidad de reacción más rápida y una velocidad de regeneración de NADPH más rápida.
En una realización particular, el microorganismo comprende un microorganismo clostridio carboxidotrófico. En una realización adicional, el microorganismo se selecciona del grupo de clostridios carboxidotróficos que comprende las especiesClostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium ragsdalei.
También se divulga el uso de un polipéptido para convertir NADH en NADPH, en donde el polipéptido comprende una única enzima Nfn según las s Eq ID NO: 2, 4, YP_003781852.1, CLJU_c37240, o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las mismas. También se proporciona el uso de un polinucleótido para convertir NADH en NADPH, en donde el polinucleótido codifica una única enzima Nfn, comprendiendo el polinucleótido las SEQ ID NO: 1, 3, la secuencia que codifica CLJU_c37240 o YP_003781852.1, o una variante funcionalmente equivalente de las mismas con al menos un 83 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia.
Se divulga un polinucleótido según las SEQ ID NO. 1 o 3.
También se divulga un polipéptido según las SEQ ID NO: 2 o 4. También se divulga un vector y/o un microorganismo recombinante que comprende un nuevo polinucleótido de Nfn y/o un polinucleótido que codifica un nuevo polipéptido de Nfn.
La presente invención prevé la optimización de reacciones dependientes de NADH. En este caso, la correspondiente hidrogenasa dependiente de NADPH, formiato deshidrogenasa y/o metilen-THF-deshidrogenasa podrían sustituirse por las correspondientes enzimas dependientes de NADH, por ejemplo deMoorella thermoaceticaoA. woodii.Esto optimizaría el flujo a través de vías diseñadas y optimizadas para NADH. Esto tendría una utilidad particular cuando no esté disponible ninguna enzima dependiente de NADPH o no pueda modificarse por ingeniería eficazmente un organismo recombinante que comprenda una enzima dependiente de NADPH.
Para aumentar la expresión de una enzima en particular, se aumenta la expresión del ácido nucleico que codifica esa enzima. A continuación se describen métodos para aumentar la expresión de un ácido nucleico que codifica la enzima deseable. Los expertos pueden apreciar fácilmente otras técnicas de uso.
La presente invención puede comprender ácidos nucleicos que codifican proteínas y péptidos a los que se hace referencia en el presente documento o puede utilizar ácidos nucleicos que codifican proteínas y péptidos de uso en la invención. Un ácido nucleico puede ser una construcción o vector de ácido nucleico. La construcción o vector de ácido nucleico puede ser una construcción o vector de expresión, sin embargo se prevén otras construcciones y vectores como los utilizados para la clonación. La construcción o vector de expresión puede ser un plásmido.
Se apreciará que una construcción/vector de expresión puede contener cualquier número de elementos reguladores además del promotor así como genes adicionales adecuados para la expresión de proteínas adicionales si se desea. La construcción/vector de expresión puede incluir un promotor. La construcción/vector de expresión puede incluir dos o más promotores. La construcción/vector de expresión puede incluir un promotor para cada gen que se va a expresar. La construcción/vector de expresión puede incluir uno o más sitios de unión ribosómica, preferentemente un sitio de unión ribosómica para cada gen que se va a expresar.
Los expertos en la materia apreciarán que las secuencias de ácido nucleico y las secuencias de construcción/vector descritas en el presente documento pueden contener nucleótidos enlazadores convencionales tales como los necesarios para los sitios de unión a ribosomas y/o sitios de restricción. Dichas secuencias enlazadoras no deben interpretarse como necesarias y no proporcionan una limitación sobre las secuencias definidas.
Los ácidos nucleicos y las construcciones de ácidos nucleicos, incluyendo construcciones/vectores de expresión pueden construirse usando cualquier número de técnicas convencionales en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse síntesis química o técnicas recombinantes. Tales técnicas se describen, por ejemplo, en Sambrook et al (Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Se describen técnicas ilustrativas adicionales en la sección de ejemplos a continuación. Esencialmente, los genes individuales y los elementos reguladores podrán unirse operativamente entre sí de manera que los genes puedan expresarse para formar las proteínas deseadas. Los expertos en la materia apreciarán los vectores adecuados para su uso en la invención. No obstante, a modo de ejemplo, los siguientes vectores pueden ser adecuados: vectores pMTL80000, pIMP1, pJIR750, y los plásmidos ejemplificados en la sección de ejemplos a continuación.
Debe apreciarse que los ácidos nucleicos pueden estar en cualquier forma apropiada, incluyendo ARN, ADN o ADNc.
Se divulgan organismos hospedadores, particularmente microorganismos, incluyendo virus, bacterias y levaduras, que comprenden uno cualquiera o más de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento.
Método para producir un microorganismos recombinantes
El uno o más ácidos nucleicos exógenos pueden suministrarse a un microorganismo precursor como ácidos nucleicos desnudos o pueden formularse con uno o más agentes para facilitar el proceso de transformación (por ejemplo, ácido nucleico conjugado con liposomas, un organismo en el que se encuentra el ácido nucleico). El uno o más ácidos nucleicos pueden ser ADN, ARN o combinaciones de los mismos, según sea apropiado. Pueden utilizarse inhibidores de restricción; véase, por ejemplo Murray, N.E.et al.(2000) Microbial. Molec. Biol. Rev. 64, 412.)
Los microorganismos de la presente invención se pueden preparar a partir de un microorganismo precursor y uno o más ácidos nucleicos exógenos usando cualquier número de técnicas conocidas en la técnica para producir microorganismos recombinantes. Tan solo a modo de ejemplo, la transformación (incluyendo transducción o transfección) puede lograrse mediante electroporación, ultrasonido, transformación mediada por polietilenglicol, competencia química o natural, transformación de protoplastos, inducción o conjugación de profagos. Las técnicas de transformación adecuadas se describen, por ejemplo, en, Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Labrotary Press, Cold Spring Harbour, 1989.
La electroporación se ha descrito para varios acetógenos carboxidotróficos comoC. Ijungdahlii(Kopkeet al.2010, Poc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 107: 13087-92; (Leanget al.,2011) PCT/NZ2011/000203; documento WO2012/053905),C. autoethanogenum(PCT/NZ2011/000203; documento WO2012/053905),Acetobacterium woodii(Straetzet al.,1994, Appl. Environ. Microbiol. 60:1033-37) oMoorella thermoacetica(Kitaet al.,2012 ) y es un método convencional utilizado en muchos clostridios tales como C.acetobutylicum(Mermelsteinet al.,1992, Biotechnology, 10, 190-195),C. cellulolyticum(Jennertet al.,2000, Microbiology, 146: 3071-3080) oC. thermocellum(Tyurinet al.,2004, Appl. Environ. Microbiol. 70: 883-890). La inducción de profagos también se ha demostrado para acetógenos carboxidotróficos en caso deC. scatologenes(Prasanna Tamarapu Parthasarathy, 2010, Development of a Genetic Modification System inClostridium scatologenesATCC 25775 for Generation of Mutants, Proyecto de Maestría de la Universidad Western Kentucky), mientras que la conjugación se ha descrito como el método de elección para muchos clostridios, incluidosClostridium difficile(Herbertet al., 2003,FEMS Microbiol. Lett. 229: 103-110) oC. acetobuylicum(Williamset al.,1990, J. Gen. Microbiol. 136: 819-826) y podría usarse de manera similar para acetógenos carboxidotróficos.
Debido a los sistemas de restricción que están activos en el microorganismo a transformar, puede ser necesario metilar el ácido nucleico que se va a introducir en el microorganismo. Esto se puede realizar utilizando una variedad de técnicas, incluidas las que se describen a continuación y se ejemplifican con mayor detalle en la sección de Ejemplos en el presente documento a continuación.
A modo de ejemplo, se puede producir un microorganismo recombinante de la invención mediante un método que comprende los siguientes pasos:
a. introducción en un microorganismo lanzadera de (i) una construcción/vector de expresión como se describe en el presente documento y (ii) una construcción/vector de metilación que comprende un gen de metiltransferasa;
b. expresión del gen de la metiltransferasa;
c. aislamiento de uno o más construcciones/vectores del microorganismo lanzadera; y,
d. introducción del uno o más construcciones/vectores en un microorganismo de destino.
El gen de la metiltransferasa del paso B puede expresarse de forma constitutiva. Puede inducirse la expresión del gen de la metiltransferasa del paso B.
El microorganismo lanzadera es un microorganismo, preferentemente un microorganismo de restricción negativa, que facilita la metilación de las secuencias de ácidos nucleicos que componen el constructo/vector de expresión. El microorganismo lanzadera puede ser unE. coli, Bacillus subtilis o Lactococcus lactisde restricción negativa.
La construcción/vector de metilación comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una metiltransferasa.
Una vez que la construcción/vector de expresión y la construcción/vector de metilación se introducen en el microorganismo lanzadera, se induce el gen de la metiltransferasa presente en la construcción/vector de metilación. La inducción puede ser por cualquier sistema promotor adecuado, por ejemplo, la construcción/vector de metilación puede comprender un promotor lac inducible y se induce mediante la adición de lactosa o un análogo de la misma, más preferentemente isopropil-p-D-tio-galactósido (IPTG). Otros promotores adecuados incluyen el sistema ara, tet o T7. El promotor de la construcción/vector de metilación puede ser un promotor constitutivo.
La construcción/vector de metilación puede tener un origen de replicación específico para la identidad del microorganismo lanzadera, de modo que cualquier gen presente en la construcción/vector de metilación se exprese en el microorganismo lanzadera. Preferentemente, la construcción/vector de expresión tiene un origen de replicación específico para la identidad del microorganismo de destino, de modo que cualquier gen presente en la construcción/vector de expresión se expresa en el microorganismo de destino.
La expresión de la enzima metiltransferasa da como resultado la metilación de los genes presentes en la construcción/vector de expresión. La construcción/vector de expresión puede entonces aislarse del microorganismo lanzadera según uno cualquiera de varios métodos conocidos. Tan solo a modo de ejemplo, se puede usar la metodología descrita en la sección de ejemplos que se describe en el presente documento a continuación para aislar la construcción/vector de expresión.
Ambos construcciones/vectores pueden aislarse al mismo tiempo.
La construcción/vector de expresión se puede introducir en el microorganismo de destino usando cualquier número de métodos conocidos. No obstante, a modo de ejemplo, se puede utilizar la metodología descrita en la sección de ejemplos en el presente documento a continuación. Dado que la construcción/vector de expresión está metilado, las secuencias de ácido nucleico presentes en la construcción/vector de expresión pueden incorporarse al microorganismo de destino y expresarse con éxito.
Se prevé que un gen de metiltransferasa pueda introducirse en un microorganismo lanzadera y sobreexpresarse. De este modo, la enzima metiltransferasa resultante puede recolectarse usando métodos conocidos y usarsein vitropara metilar un plásmido de expresión. La construcción/vector de expresión puede introducirse después en el microorganismo de destino para la expresión. El gen de la metiltransferasa puede introducirse en el genoma del microorganismo lanzadera seguido de la introducción de la construcción/vector de expresión en el microorganismo lanzadera, del aislamiento de una o más construcciones/vectores del microorganismo lanzadera y luego la introducción de la construcción/vector de expresión en el microorganismo de destino.
Se prevé que la construcción/vector de expresión y la construcción/vector de metilación como se definen anteriormente puedan combinarse para proporcionar una composición de materia. Dicha composición tiene una utilidad particular para eludir los mecanismos de barrera de restricción para producir los microorganismos recombinantes de la invención.
La construcción/vector de expresión y/o la construcción/vector de metilación pueden ser plásmidos.
Los expertos en la materia apreciarán varias metiltransferasas adecuadas de uso en la producción de los microorganismos de la invención. No obstante, a modo de ejemplo se pueden utilizar la metiltransferasa del fago OT1 deBacillus subtilisy la metiltransferasa descrita en los ejemplos en el presente documento a continuación. En el documento WO/2012/053905 se ha descrito una metiltransferasa de referencia.
Pueden usarse varias construcciones/vectores adaptados para permitir la expresión de un gen de metiltransferasa para generar la construcción/vector de metilación. No obstante, a modo de ejemplo, se puede utilizar el plásmido descrito en la sección de ejemplos en el presente documento a continuación.
Métodos de producción
El sustrato gaseoso fermentado por el microorganismo puede ser un sustrato gaseoso que contenga CO. El sustrato gaseoso puede ser un gas residual que contiene CO obtenido como un subproducto de un proceso industrial, o de alguna otra fuente tal como gases de escape de automóviles. El proceso industrial puede seleccionarse del grupo que consiste en la fabricación de productos de metales ferrosos, tales como un molino de acero, fabricación de productos no ferrosos, procesos de refinamiento de petróleo, gasificación de carbón, producción de energía eléctrica, producción de negro de carbón, producción de amoniaco, producción de metanol y fabricación de coque. En este punto, el gas que contiene CO puede capturarse del proceso industrial antes de emitirse a la atmósfera, usando cualquier método conveniente. El CO puede ser un componente del gas de síntesis (gas que comprende monóxido de carbono e hidrógeno). El CO producido en los procesos industriales normalmente se quema para producir CO<2>y por tanto la invención tiene una utilidad particular para reducir las emisiones de gases de efecto invernadero y CO<2>y la producción de biocombustible. Dependiendo de la composición del sustrato gaseoso que contiene CO, también puede ser deseable tratarlo para eliminar cualquier impureza no deseada, tal como partículas de polvo antes de introducirlo en la fermentación. Por ejemplo, el sustrato gaseoso puede filtrarse o lavarse usando métodos conocidos.
Se apreciará que para que se produzca el crecimiento de las bacterias y la producción de productos, además del gas sustrato que contiene CO, será necesario suministrar al biorreactor un medio nutritivo líquido adecuado.
La fermentación puede producirse en un medio de cultivo acuoso. En particular, la fermentación del sustrato puede tener lugar en un biorreactor.
El sustrato y el medio pueden suministrarse al biorreactor de forma continua, alimentada o alimentada discontinua. Un medio nutritivo contendrá vitaminas y minerales suficientes para permitir el crecimiento del microorganismo utilizado. En la técnica se conocen medios anaeróbicos adecuados para la fermentación usando CO. Por ejemplo, los medios adecuados se describen en Biebel (2001). Los medios pueden ser como se describe en la sección de ejemplos del presente documento a continuación.
Es deseable que la fermentación se realice en condiciones de fermentación apropiadas para que se produzca la producción del producto del biocombustible. Las condiciones de reacción que deben considerarse incluyen presión, temperatura, caudal de gas, caudal de líquido, pH de los medios, potencial redox de los medios, velocidad de agitación (en caso de utilizar un reactor de tanque agitado de flujo continuo), nivel de inóculo, concentraciones máximas de sustrato gaseoso para garantizar que el CO en la fase líquida no se vuelve limitante y concentraciones máximas del producto para evitar la inhibición del producto.
Adicionalmente, con frecuencia es deseable aumentar la concentración de CO de una corriente de sustrato (o presión parcial de CO en un sustrato gaseoso) y así aumentar la eficiencia de las reacciones de fermentación donde el CO es un sustrato. El funcionamiento a presiones aumentadas permite un aumento significativo en la tasa de transferencia de CO desde la fase gaseosa a la fase líquida, donde el microorganismo puede absorberlo como fuente de carbono para la producción de fermentación. Esto a su vez significa que el tiempo de retención (definido como el volumen de líquido en el biorreactor dividido entre el caudal de gas de entrada) puede reducirse cuando los biorreactores se mantienen a presión elevada en lugar de a presión atmosférica. Las condiciones óptimas de reacción dependerán en parte del microorganismo en particular de la invención utilizado. No obstante, en general, se prefiere que la fermentación se realice a una presión superior a la presión ambiente. También, dado que una tasa de conversión de CO es en parte una función del tiempo de retención del sustrato, y que a su vez conseguir el tiempo de retención deseado dictamina el volumen necesario de un biorreactor, el uso de sistemas presurizados puede reducir en gran medida el volumen necesario del biorreactor y en consecuencia, el coste de capital del equipo de fermentación. Según los ejemplos dados en la patente de los Estados Unidos n.° 5.593.886, el volumen del reactor puede reducirse en proporción lineal a los aumentos en la presión de funcionamiento del reactor, es decir, los biorreactores que funcionan a 10 atmósferas de presión solamente necesitan tener un volumen de una décima parte del volumen de los que funcionan a 1 atmósfera de presión.
A modo de ejemplo, se han descrito los beneficios de llevar a cabo una fermentación de gas a etanol a presiones elevadas. Por ejemplo, el documento WO 02/08438 describe fermentaciones de gas a etanol realizadas a presiones de 0,20 MPa (30 psig) y 0,51 MPa (75 psig), proporcionando productividades de etanol de 150 g/l/día y 369 g/l/día, respectivamente. No obstante, se descubrió que fermentaciones de ejemplo realizadas utilizando medios similares y composiciones de gas de entrada a presión atmosférica producían entre 10 y 20 veces menos etanol por litro por día.
También es deseable que la tasa de introducción del sustrato gaseoso que contiene CO sea tal que garantice que la concentración de CO en la fase líquida no se vuelva limitante. Esto se debe a que una consecuencia de las condiciones limitadas por CO puede ser que el cultivo consuma uno o más productos.
La composición de las corrientes de gas utilizadas para suministrar a una reacción de fermentación, puede tener un impacto significativo sobre la eficiencia y/o los costes de esa reacción. Por ejemplo, el O2 puede reducir la eficiencia de un proceso de fermentación anaeróbico. El procesamiento de gases no deseados o innecesarios en las fases de un proceso de fermentación antes o después de la fermentación, puede aumentar la carga en dichas fases (por ejemplo, cuando la corriente de gas se comprime antes de entrar en un biorreactor, se puede usar energía innecesaria para comprimir gases que no son necesarios en la fermentación). En consecuencia, puede ser deseable tratar las corrientes de sustrato, particularmente corrientes de sustrato procedentes de fuentes industriales, para retirar componentes no deseados y aumentar la concentración de componentes deseables.
Un cultivo de una bacteria de la invención puede mantenerse en un medio de cultivo acuoso. Preferentemente el medio de cultivo acuoso es un medio de crecimiento microbiano anaeróbico mínimo. Los medios adecuados son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos números 5.173.429 y 5.593.886 y en el documento WO 02/08438, y como se describe en la sección de ejemplos en el presente documento a continuación.
También, si el pH del caldo se ajustó como se describió anteriormente para potenciar la adsorción de ácido acético al carbón activado, el pH debe reajustarse a un pH similar al del caldo en el biorreactor de fermentación, antes de volver a introducirlo al biorreactor.
Ejemplos
Ejemplo 1
Se analizaron los cinco pasos de enzimas oxidorreductasas de la vía Wood-Ljungdahl para determinar su actividad en presencia de diferentes sustratos. Estas enzimas pueden utilizar cofactores para impulsar la reacción. Las enzimas participan en el crecimiento autótrofo, incluida la absorción y utilización de los gases C<o>, CO<2>y H<2>.
Las enzimas analizadas y sus actividades se detallan en la figura 1. Todos los ensayos realizados se analizaron usando un tinte redox sintético como control, viológeno de metilo (MV) o viológeno de bencilo (BV). Se analizaron los co-factores ferredoxina (Fd), NADH y NADPH o una combinación de los mismos. Los ensayos enzimáticos se realizaron utilizando extractos brutos de una ronda del reactor normal que crecía autotróficamente en CO e hidrógeno.
Fermentación
Se realizaron fermentaciones conC. autoethanogenumDSM23693 en biorreactores de 1,5 l a 37 °C y gas de acería que contenía CO como única fuente de energía y carbono, como se describe a continuación. Se utilizó un medio definido que contenía por litro: MgCl, CaC<b>(0,5 mM), KCl (2 mM), H<3>PO<4>(5 mM), Fe (100<j>M), Ni, Zn (5<j>M), Mn, B, W, Mo, Se (2 j M) para el crecimiento del cultivo. El medio se transfirió al biorreactor y se esterilizó en autoclave a 121 °C durante 45 minutos. Después de esterilizar en autoclave, el medio se complementó con tiamina, pantotenato (0,05 mg), biotina (0,02 mg) y se redujo con cisteína-HCl 3 mM. Para lograr anaerobicidad, el vaso del reactor se roció con nitrógeno a través de un filtro de 0,2 jm . Antes de la inoculación, el gas se cambió a gas de acería que contenía CO, suministrando continuamente al reactor. La composición del gas de alimentación fue 2 % de H<2>42 % de CO 20 % de CO<2>36 % de N<2>. El pH del cultivo se mantuvo entre 5 y 5,2.
Recogida de células
En el momento de recoger las células, el consumo de gas fue de 5 moles de CO l<-1>día<-1>y 10 milimoles de H<2>l<-1>día<-1>, con los siguientes metabolitos producidos: 14 g l<-1>día<-1>de acetato y 19,5 g l<-1>día<-1>de etanol. El pH del cultivo se ajustó a pH 6 con K<2>CO<3>y el reactor se enfrió en baño de agua helada. Se recogieron ~1,2 l de cultivo en hielo. El cultivo se dividió en 2x botellas de centrífuga de 1 l (este y todos los pasos posteriores se llevaron a cabo en una cámara anaeróbica para asegurar condiciones anóxicas para evitar la inactivación de las enzimas) y las células se sedimentaron a 5000 rpm durante 10 min. Se decantó el sobrenadante y se eliminó el líquido residual. Cada sedimento se resuspendió en ~30 ml de K PO<4>50 mM pH 7,0 con DTT 10 mM. Las resuspensiones se transfirieron a tubos Falcon de 50 ml pesados previamente y las células se resuspendieron a velocidad máxima (5000g) durante 15 min. Los tubos se retiraron de la cámara anaeróbica e inmediatamente se congelaron en N<2>líquido antes de analizarlos.
Preparación de extractos celulares brutos y ensayos enzimáticos
Las células se recogieron de un reactor continuo en condiciones anóxicas. Se interrumpieron por tres pases a través de una prensa francesa como lo describe (Huanget al.,2012).
Excepto cuando se indique, todos los ensayos se realizaron a 37 °C en cubetas anaeróbicas de 1,5 ml cerradas con un tapón de goma llenas con 0,8 ml de mezcla de reacción y 0,7 ml de N.<2>o H<2>o CO a 1,2 x 10<5>Pa como lo describe (Huanget al.,2012).
La CO deshidrogenasa, formiato deshidrogenasa, metilen-THF deshidrogenasa y metilen-THF reductasa se analizaron como lo describe (Huanget al.,2012).
La CO deshidrogenasa se midió usando una mezcla de ensayo que contenía Tris/HCl 100 mM (pH 7,5), DTT 2 mM y ferredoxina aproximadamente 30 pM y/o NAD<+>1 mM o NADP<+>1 mM. La fase gaseosa fue un 100 % de CO.
La actividad hidrogenasa se midió como se describe, con la adición de la medición de la reducción de ferredoxina dependiente de NADP<+>con H<2>. La mezcla de reacción se complementó con ferredoxina (30 pM) y NADP 1 mM. La fase gaseosa fue un 100 % de H<2>. Después del inicio de la reacción con la enzima ferredoxina se siguió la reducción a 430 nm (£<áox-red>“ 13,1 mm<-1>cm<-1>).
La actividad formiato-hidrógeno liasa se midió en un frasco de suero anaeróbico de 5 ml cerrado con un tapón de goma lleno con 0,8 ml de mezcla de reacción y 4,2 ml de N2 a 1,2 x 10<5>Pa. La mezcla de reacción contenía Tris-HCl 100 mM, pH 7,5 y formiato 20 mM. Después de iniciar la reacción mediante la adición de enzima, se monitorizó la producción de H<2>mediante cromatografía de gases. Se midió la actividad formiato-hidrógeno liasa para determinar la reducción de CO<2>con H<2>a formiato con una mezcla de ensayo que contenía fosfato de potasio 100 mM, DTT 2 mM y [<14>C]K<2>CO<s>30 mM (24.000 dpm/pmol). La fase gaseosa fue un 100 % de H<2>. Las botellas de suero se agitaron continuamente a 200 rpm para asegurar el equilibrio de la fase gaseosa con la fase líquida. Después inicio de la reacción con la enzima, se extrajeron muestras líquidas de 100 pl cada 1,5 min y se añadieron a un microtubo de sellado seguro de 1,5 ml que contenía 100 pl de ácido acético 150 mM para detener la reacción por acidificación. Después la mezcla de 200 pl se incubó a 40 °C durante 10 min con agitación a 1.400 rpm en un termomezclador para eliminar todo el<14>CO<2>dejando el<14>C-formiato formado. Posteriormente, se añadieron 100 pl de la mezcla a 5 ml de líquido de centelleo Quicksave A (Zinsser Analytic, Frankfurt, Alemania) y se analizó para<14>C radiactividad en un contador de centelleo líquido Beckman LS6500 (Fullerton, CA).
La medición de la formiato deshidrogenasa se realizó con mezclas de ensayo que contenían Tris/HCl 100 mM (pH 7.5) o fosfato de potasio 100 mM, DTT 2 mM, formiato 20 mM y, donde se precise ferredoxina 25 pM, NADP+ 1 mM, NAD+ 1 mM y/o viológeno de metilo 10 mM. La fase gaseosa fue 100 % de N<2>.
Se midió la metilen-H<4>F deshidrogenasa usando una mezcla de ensayo que contenía MOPS/KOH 100 mM (pH 6,5), 2-mercaptoetanol 50 mM, tetrahidrofolato 0,4 mM, formaldehído 10 mM y NADP<+>0,5 mM o NAD<+>0,5 mM. La fase gaseosa fue 100 % de N<2>.
La metilen-H4F reductasa se analizó en las siguientes condiciones. Las mezclas de ensayo contenían Tris/HCl 100 mM (pH 7,5), ascorbato 20 mM, FAD 10 pM, viológeno de bencilo 20 mM y metil-H4F 1 mM. Antes del inicio de la reacción con la enzima, el viológeno de bencilo se redujo a un AA555 de 0,3 con ditionito de sodio.
Se analizó la aldehído:ferredoxina oxidorreductasa usando una mezcla que contenía Tris/HCl 100 mM (pH 7,5), DTT 2 mM, acetaldehído 1,1 mM y ferredoxina aproximadamente 25 pM. La fase gaseosa fue 100 % de N2.
Se midió la acetaldehído deshidrogenasa acetilante de CoA usando una mezcla que contenía Tris/HCl 100 mM (pH 7.5) , DTT 2 mM, acetaldehído 1,1 mM, coenzima A 1 mM y NADP+ 1 mM o NAD+ 1 mM. La fase gaseosa fue 100 % de N2.
Las alcohol y butanodiol deshidrogenasas se midieron en un ensayo con fosfato de potasio 100 mM (pH 6), DTT 2 mM, acetaldehído o acetoína 1,1 mM respectivamente y NADPH 1 mM o NADH 1 mM. La fase gaseosa fue 100 % de N2.
La ferredoxina se purificó a partir deC. pasteurianumcomo lo describe Schonheit, Wascher, & Thauer, 1978).
Resultados
Hidrogenasa: Esta enzima es importante para la absorción de hidrógeno como fuente de energía y es esencial para el crecimiento de microorganismos carboxidotróficos en CO.<2>. Esta enzima también es capaz de desprender hidrógeno y puede actuar junto con una formiato deshidrogenasa como formiato hidrógeno liasa.
En el genoma deC. autoethanogenumestán presentes siete genes de hidrogenasa (6 hidrogenasas exclusivas de Fe y una hidrogenasa de NiFe; SEQ. ID 5-20). Los homólogos de cinco de estos genes están presentes en el genoma deC. ljungdahlii(Kopkeet al.,2010) (YP_003781016/CLJU_c26060; YP_003781017/CLJU_c26070; CLJU_c07070/YP_003778879; CLJU_c14700/YP_003779640; CLJU_c17280/YP_003779893; CLJU_c20290/YP_003780193) y también podría identificarse en el genoma deC. ragsdalei(SEQ ID NO 21-32) (tabla 3).
Tabla 3
Usando cofactores únicos, se observó actividad con NADPH (0,2 U/mg), mientras que se observó una actividad nula o mucho menor con NADH (0,05 U/mg) o ferredoxina (<0,01 U/mg). Esto demuestra que la hidrogenasa es específica para NADPH.
La mayor actividad se encontró utilizando una combinación de cofactores. Con NADPH en presencia de ferredoxina se midieron 0,68 U/mg. Por el contrario, no se observó actividad medible con NADH (<0,01 U/mg), confirmando nuevamente la alta especificidad de esta enzima por NADPH. Estos datos indican que está presente una hidrogenasa bifurcadora como enThermotoga marítima(Schut y Adams, 2009) oAcetobaterium woodii(Schuchmann y Mueller, 2012) oMoorella thermoacetica(Huanget al.,2012). No obstante, en estos otros organismos, la enzima es dependiente de NADH. Por tanto, esta es la primera hidrogenasa bifurcadora dependiente de NADPH descubierta.
Formiato deshidrogenasa: Esta enzima cataliza la reducción de CO2 para formarlo en la rama de metilo de la vía Wood-Ljungdahl y es esencial para el crecimiento autótrofo en CO o CO.<2>y H<2>por acetógenos.
Tres genes codifican las seleno y no seleno formiato deshidrogenasas y están presentes en los genomas deC. autoethanogenum(AEI90721, AEI90723, AEI90725; HQ876015, HQ876017, HQ876019),C. ljungdahlii(YP_003779063, YP_003778871, YP_003780168; CLJU_c08930, CLJU_c06990, CLJU_c20040) yC. ragsdalei(AEI90722, AEI90724, AEI90726; HQ876016, HQ876018, HQ876020) (Kopkeet al.,2010, 2011).
Usando solo un cofactor, se detectó una especificidad por NADPH en lugar de NAD: 0,2 U/mg sobre muy poco 0,03 U/mg.
Sin embargo, se detectó una actividad significativamente mayor utilizando una combinación de dos cofactores: con NADPH y ferredoxina se detectó 1,10 U/mg, pero solamente 0,07 con NADH en lugar de NADPH. Esto indicó la presencia de una NADP formiato deshidrogenasa bifurcadora, una enzima que nunca antes se había descrito.
Formiato-hidrógeno liasa: Usando H<2>se detectó una alta actividad de 2,4 U/mg, lo que indica que la NADP formiato deshidrogenasa bifurcadora puede formar un complejo formiato-hidrógeno con la hidrogenasa NADPH bifurcadora.
Los genes que codifican proteínas para la NADP formiato deshidrogenasa bifurcadora (AEI90721, HQ876015; YP_003778871, CLJU_c08930; AEI90722, HQ876016) y para la NADP hidrogenasa exclusiva de Fe bifurcadora (SEQ ID NO 9-10; CLJU_c07070, YP_003778879; SEQ ID No 25-26) se encontraron en un complejo génico, junto con genes para una flavoproteína hierro-azufre con un sitio de unión a NADP, proteínas hierro-azufre (FeS) y una formiato deshidrogenasa que contiene selenocisteína y molibdopterina (figura 3). La formación de complejos funcionales se refleja en el descubrimiento de que los genes de ambas enzimas se encuentran uno al lado del otro en el genoma y podrían formar una unidad de transcripción.
Una formiato-hidrógeno liasa que actúa en esta dirección desde CO<2>y H<2>a formiato no se ha descrito con anterioridad y es nueva para los clostridios carboxidotróficos (figura 1). También se ha demostrado la reversibilidad de esta reacción, liberando hidrógeno y CO<2>del formiato. El uso de esta enzima permite la captura de CO<2>en forma de formiato utilizando hidrógeno, que se puede liberar después nuevamente. Con una enzima purificada, se ha medido una actividad formiato hidrógeno liasa de 41 U/mg para la formación de formiato a partir de CO<2>+H<2>y de 40 U/mg para la formación de hidrógeno a partir de formiato (tabla 4).
T
Con respecto a la tabla 4, la purificación del complejo formiato hidrógeno liasa deC. autoethanogenum serealizó en condiciones estrictamente anóxicas a temperatura ambiente. Se utilizó un Tris-HCl anóxico 50 mM (pH 7,6) que contenía DTT 2 mM, FAD 5 pM y FMN 5 pM (tampón A) durante todo el proceso. El sobrenadante de 150.000 xg que contiene la fracción citoplasmática con aproximadamente 47 mg de proteína ml<-1>se fraccionó con sulfato de amonio. La fracción entre 40 y 55 % de saturación de sulfato de amonio se recogió mediante centrifugación a 30.000 xg y a 4 °C durante 30 min. El precipitado se disolvió en 7 ml de tampón A que contenía sulfato de amonio 0,8 M. Después de eliminar las proteínas no disueltas mediante centrifugación, el sobrenadante se cargó en una columna de alto rendimiento de fenil Sepharose(2,6 cm por 12 cm) equilibrada con tampón A que contenía sulfato de amonio 0,8 M. La proteína se eluyó con un gradiente gradual de sulfato de amonio (0,80, 0,64, 0,48, 0,32, 0,16 y 0 M; 100 ml cada uno en tampón A) a un caudal de 5 ml min.<-1>. La actividad hidrogenasa se eluyó en un pico con sulfato de amonio 0,48 M. Las fracciones agrupadas se concentraron y desalinizaron con una celda Amicon con una membrana de corte de 50 kDa. A continuación, se aplicó el concentrado sobre una columna de alto rendimiento de Q Sepharose (1,6 cm por 13 cm) equilibrada con tampón A. Luego se lavó la columna con 90 ml de tampón A. La proteína se eluyó con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 1 M a un caudal de 5 ml min<-1>. La actividad hidrogenasa se recuperó en un único pico eluyendo NaCl aproximadamente 0,4 M. La fracción se concentró, se desaló con un filtro Amicon de corte de 50 kDa y luego se almacenó a -20 °C en tampón A en una atmósfera de 95 % de N<2>/5 % de H<2>hasta su uso.
Las actividades se midieron a 37 °C en fosfato de potasio 100 mM al pH indicado. Cuando se siguió la formación de H<2>a partir de formiato (actividad formiato hidrógeno liasa), las mezclas de ensayo contenían Tris-HCl 100 mM (pH 7,5) (tabla 1) o fosfato de potasio 100 mM (pH como se indica) (tabla 3), TDT 2 mM y formiato de sodio 20 mM. La fase gaseosa fue 100 % de N<2>. Los frascos de suero se agitaron de manera continua a 200 rpm para garantizar la transferencia de H<2>de la fase líquida a la fase gaseosa. Se extrajeron muestras de gas (0,2 ml) cada 1 min y se cuantificó el H<2>mediante cromatografía de gases. Cuando se midió la reducción de CO<2>con H<2>a formiato, las mezclas de ensayo contenían fosfato de potasio 100 mM (pH final como se indica), DTT 2 mM y [<14>C]K<2>CO<3>30 mM (24.000 dpm/pmol). La fase gaseosa fue un 100 % de H<2>. Las botellas de suero se agitaron continuamente a 200 rpm para asegurar el equilibrio de la fase gaseosa con la fase líquida. Después inicio de la reacción con la enzima, se extrajeron muestras líquidas de 100 pl cada 1,5 min y se añadieron a un microtubo de sellado seguro de 1,5 ml que contenía 100 pl de ácido acético 150 mM para detener la reacción por acidificación. Después se incubó la mezcla de 200 pl a 40 °C durante 10 min con agitación a 1400 rpm en un Thermomixer (tipo 5436, Eppendorf, Alemania) para eliminar todo el<14>CO<2>dejando el<14>C-formiato formado. Posteriormente, se añadieron 100 pl de la mezcla a 5 ml de líquido de centelleo Quicksave A (Zinsser Analytic, Frankfurt, Alemania) y se analizó para determinar la radiactividad<de 14C en un contador de centelleo líquido Beckman LS6500 (Fullerton,>C<a>,<EE. UU.). Cuando se siguió la reducción de CO2 con ferredoxina reducida y n>A<d>PH<para formar formiato, las mezclas de ensayo contenían fosfato de potasio>100 mM (final como se indica), DTT 2 mM, [<14>C]K<2>CO<3>30 mM (24.000 dpm/pmol), NADPH 1 mM y un sistema regenerador de ferredoxina reducida (piruvato 10 mM, tiamina pirofosfato 0,1 mM, coenzima-A 1 mM ferredoxina deC. pasteurianum25 pM, 1 U de piruvato: ferredoxina oxidorreductasa y 5 U de fosfotransacetilasa). La fase gaseosa fue 100 % de N<2>. Las botellas de suero se agitaron continuamente a 200 rpm para asegurar el equilibrio de la fase gaseosa con la fase líquida. Después inicio de la reacción con la enzima, se extrajeron alícuotas de 100 pl de líquido cada 1,5 minutos y se analizaron en busca de formiato. Cuando se siguió la reducción de CO<2>con ferredoxina reducida y NADPH para formar formiato, las mezclas de ensayo contenían fosfato de potasio 100 mM (final como se indica), DTT 2 mM, [<14>C]K<2>CO<3>30 mM (24.000 dpm/|jmol), NADPH 1 mM y un sistema regenerador de ferredoxina reducida (piruvato 10 mM, tiamina pirofosfato 0,1 mM, coenzima-A 1 mM ferredoxina deC. pasteurianum25 jM , 1 U de piruvato: ferredoxina oxidorreductasa y 5 U de fosfotransacetilasa). La fase gaseosa fue 100 % de N<2>. Las botellas de suero se agitaron continuamente a 200 rpm para asegurar el equilibrio de la fase gaseosa con la fase líquida. Después inicio de la reacción con la enzima, Se extrajeron alícuotas de 100 j l de líquido cada 1,5 minutos y se analizaron para determinar el formiato como se describe anteriormente. Se utilizó ferredoxina (Fd) purificada deC. pasteurianumDSM 525 preparada según Schonheit et al (Rapid procedure for purification of ferredoxin from clostridia using polyethyleneimine. FEBS Lett. 1978, 89:219-222). Una unidad (U) equivale a 2 jm ol de electrones transferidos por minuto.
Metilen-THF-deshidrogenasa: Esta enzima cataliza la reacción de 5,10-metilentetrahidrofolato a 5,10-meteniltetrahidrofolato y es esencial para el crecimiento autótrofo. Es parte de la vía Wood-Ljungdahl y se encontró que es claramente específica para NADPH (1,12 U/mg con NADPH, pero no hay actividad detectable con NADH o ferredoxina).
Esta enzima y el gen correspondiente se han sido identificado enC. autoethanogenum(AEI90753; HQ876031, GI:338225353),C. ljungdahlii(YP_003781891;CLJU_c37630) yC. ragsdalei(AEI90771; HQ876032, GI:338225372) como metilentetrahidrofolato deshidrogenasa/formiltetrahidrofolato ciclohidrolasa bifuncional.
Se demostró previamente que esta enzima era dependiente de NADPH enMoorella thermoacetica,mientras que las otras reacciones son dependientes de NADH o ferredoxina en este organismo (Huanget al.,2012).
No se pudo detectar ninguna actividad medible en los ensayosin vitropara la metilen-THF reductasa con cualquiera de los cofactores (solamente con un tinte sintético). No obstante, los presentes inventores consideran que este resultado puede explicarse porque la enzima requiere un sitio de acoplamiento desconocido como enzima adicional como se ha propuesto para otras enzimas tales comoC. ljungdahliioA. woodii(Kopkeet al.,2010; Poehleinet al.,2012). Este mecanismo de acoplamiento puede depender de NADPH. Se descubrió que la reacción de la CO deshidrogenasa depende de la ferredoxina, como se informó anteriormente para esta clase de enzimas.
De las cinco reacciones de oxidorreductasas analizadas de la vía de Wood-Ljungdahl en clostridios carboxidotróficosClostridium autoethanogenum,sorprendentemente, no se encontró ninguna dependiente de NADH, más bien se descubrió que la mayoría era dependiente de NADPH. Esto se diferencia por completo con, por ejemplo, la glucólisis del azúcar que utiliza bacterias comoE. coli(figura 2). Así, las estrategias existentes paraE. coli,utilizando reacciones dependientes de NADH y eludiendo las reacciones dependientes de NADPH (que dan como resultado una reducción en el rendimiento del producto y requieren modificaciones extensas) no son productivas en clostridios carboxidotróficos. La invención como se describe en el presente documento proporciona una estrategia para superar esto seleccionando preferentemente reacciones dependientes de NADPH en clostridios carboxidotróficos para lograr rendimientos máximos de producto mediante ingeniería metabólica. La capacidad y el potencial de las reacciones dependientes de NADPH se muestran en el ejemplo 3, así como la diferencia conE. colique utiliza azúcares. De manera similar, esta estrategia se puede aplicar a vías heterólogas para lograr el máximo rendimiento y flujo de producto.
Ejemplo 2
La expresión relativa de más de 200 genes deC. autoethanogenumse analizó mediante PCR cuantitativa en tiempo real para determinar los genes con mayor expresión.
Fermentación
Se realizaron fermentaciones conC. autoethanogenumDSM23693 en biorreactores de 1,5 l a 37 °C y gas de acería que contenía CO como única fuente de energía y carbono, como se describe a continuación. Se utilizó un medio definido que contenía por litro: MgCl, CaCh (0,5 mM), KCl (2 mM), H<3>PO<4>(5 mM), Fe (100 jM ), Ni, Zn (5 jM ), Mn, B, W, Mo, Se (2 jM ) para el crecimiento del cultivo. El medio se transfirió al biorreactor y se esterilizó en autoclave a 121 °C durante 45 minutos. Después de esterilizar en autoclave, el medio se complementó con tiamina, pantotenato (0,05 mg), biotina (0,02 mg) y se redujo con cisteína-HCl 3 mM. Para lograr anaerobicidad, el vaso del reactor se roció con nitrógeno a través de un filtro de 0,2 jm . Antes de la inoculación, el gas se cambió a gas de acería que contenía CO, suministrando continuamente al reactor. El flujo de gas se fijó inicialmente en 80 ml/min, aumentando a 200 ml/min durante la fase exponencial media, mientras que la agitación se incrementó de 200 rpm a 350. Se añadió Na<2>S en el biorreactor a 0,25 ml/h. Una vez que la DO600 alcanzó 0,5, el biorreactor se cambió a un modo continuo a una velocidad de 1,0 ml/min (tasa de dilución 0,96 d<' 1>). Se tomaron muestras de medios para medir la biomasa y los metabolitos y se realizó periódicamente un análisis del espacio de cabeza del gas entrante y saliente.
qRT-PCR
Se realizó un estudio qRT-PCR con más de 200 genes utilizando cebadores apropiados. Se tomaron muestras de un proceso típico de fermentación discontinua alimentada de 1,5 litros como se describe anteriormente durante todo el período de crecimiento (4 días). Las muestras se recogieron por centrifugación (6.000 x g, 5 min, 4 °C) y el sedimento celular se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C hasta su uso. El ARN se aisló descongelando el sedimento celular en hielo y suspendiéndolo en 100 pl de solución de lisozima (50.000 U de lisozima, 0,5 pl de SDS<al 10 %, Tris-HCl 10 mM,>ED<t>A<0,1 mM; pH 8). Después de 5 min, se añadieron 350 pl de tampón de lisis (que>contenía 10 pl de 2-mercaptoetanol). La suspensión celular se rompió mecánicamente pasándola cinco veces a través de una aguja de calibre 18-21. Luego se aisló el ARN utilizando el mini kit PureLink™ RNA (Invitrogen, Carlsbad, CA 92008, EE. UU.) y se eluyó en 100 pl de agua exenta de RNasa. El ARN se comprobó mediante PCR y electroforesis en gel, se cuantificó mediante espectrofotometría y se trató con DNasa I (Roche) si era necesario. El paso de transcripción inversa se realizó utilizando el kit de transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA 92008, EE. UU.). Las reacciones de RT-PCR se realizaron en el sistema de detección de PCR en tiempo real de un solo color MyiQ (Bio-Rad Labratories, Hercules, CA 94547, EE. UU.) en un volumen de reacción de 15 pl con 25 ng de plantilla<de ADNc, 67 nM de cada cebador y 1x iQ SYBR Green Supermix (BioRad Labratories, Hercules, CA 94547, e>E.<UU.).>Se utilizaron guanilato cinasa (GnK) y formiato tetrahidrofolato ligasa (FoT4L) como gen constitutivo y se incluyeron controles sin plantilla. Las condiciones de reacción fueron 95 °C durante 3 min, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 15 s, 55 °C durante15 s y 72 °C durante 30s. Se realizó un análisis de la curva de fusión inmediatamente después de completar la qRTPCR (38 ciclos de 58 °C a 95 °C a 1 °C/s), para la detección de dimerización del cebador u otros artefactos de amplificación. Los datos sobre el nivel de expresión se calcularon en forma de valores de ciclo umbral (Ct, por sus siglas en inglés) basados en el método de ajuste de curva sustraída del valor inicial de PCR calculado por el programa informático Biorad iQ52.0. Los valores brutos de Ct se analizaron adicionalmente utilizando la herramienta de programa informático de expresión relativa (REST<©>) 2008 V2.0.7.
Resultados
Cuando crecen de forma autótrofa, los microorganismos carboxidotróficos absorben gases que sirven como fuente de carbono y energía. La figura 4 muestra la expresión relativa de genes expresados enC. autoethanogenum.Las tres enzimas identificadas estaban implicadas en el crecimiento autótrofo y la absorción de gases y los presentes inventores descubrieron que se encontraban entre los genes más expresados en el microorganismo. Como se muestra en el ejemplo 1, se descubrió que estas mismas enzimas presentaban una utilización alta o exclusiva de NADPH en comparación con NADH. La expresión de enzimas dependientes de NADH estaba en un nivel mucho más bajo. Debido a que se ha descubierto que las enzimas que codifican estos genes son dependientes de NADPH, esto indica que la reserva de NADPH es extremadamente importante (a diferencia de los organismos que utilizan azúcar comoE. coli)y que las reacciones dependientes de NADPH no son un cuello de botella. Para diseñar vías en una célula de clostridio carboxidotrófico, esta es una gran ventaja, ya que es posible seleccionar reacciones dependientes de NADPH, y no es necesario evitarlas ni eludirlas. De manera adicional, la reserva de NADPH es más grande para que el rendimiento no disminuya y no sea necesaria una ingeniería exhaustiva.
Ejemplo 3
La alcohol deshidrogenasa (ADH) primaria-secundaria es una enzima estrictamente dependiente de NADPH que convierte la acetona en isopropanol. Su actividad se demuestra mediante ensayos enzimáticos con extracto bruto preparado a partir de caldo de fermentación que contiene acetona y 0,2 mM de NADH o NADPH (Ismaiel, Zhu, Colby, y Chen, 1993)
Se realizó un estudio de reactor conC. autoethanogenumpara demostrar la conversión eficaz de acetona a isopropanol dependiente de NADPH a altas tasas. En modo continuo con producción estable de biomasa y metabolitos, se añadió acetona tanto al biorreactor como al medio de alimentación. Se introdujo acetona en el reactor hasta cierto nivel, que luego se obtuvo mediante alimentación continua. Inicialmente, se añadió 1 g/l de acetona, una vez estabilizadas las concentraciones de metabolitos, la concentración se aumentó a 5 g/l, 15 g/l, y en un segundo experimento a 20 g/l.
Materiales y métodos
Análisis de metabolitos
Se realizó un análisis por HPLC de acetona, isopropanol y otros metabolitos utilizando un sistema de HPLC 1100 Series de Agilent, equipado con un RID (detector de índice de refracción, por sus siglas en inglés) que funcionó a 35 °C y una columna de ácido orgánico Aminex IOA-2000 (150 x 6,5 mm, tamaño de partícula 5 pm) conservada a 60 °C. Se utilizó agua ligeramente acidificada (H<2>SO<4>0,005 M) como fase móvil con un caudal de 0,7 ml/min. Para eliminar proteínas y otros restos celulares, se mezclaron muestras de 400 pl con 100 pl de ácido 5-sulfosalicílico al 2 % (p/v) y se centrifugaron a 14.000 x g durante 3 min para separar los restos precipitados. A continuación, se inyectaron 10 pl del sobrenadante en la HPLC para su análisis.
Se realizó el análisis GC de acetona, isopropanol y otros metabolitos utilizando un GC con espacio de cabeza Agilent 6890N equipado con una fibra Supelco PDMS 100 de 1 cm, una columna Alltech EC-1000 (30 m x 0,25 mm x 0,25 pm) y un detector de ionización de llama (FID, por sus siglas en inglés). Se transfirieron muestras de 5 ml a un tubo Hungate, se calentó a 40 °C en un baño de agua y se expuso a la fibra durante exactamente 5 min. El inyector se mantuvo a 250 °C y se utilizó helio con un flujo constante de 1 ml/min como gas portador. El programa de la estufa fue 40 °C durante 5 min, seguido de un aumento de 10 °C/min hasta 200 °C. Luego, la temperatura se aumentó adicionalmente a 220 °C con una velocidad de 50 °C/min, seguido de un mantenimiento de esta temperatura durante 5 minutos, antes de que la temperatura se redujera a 40 °C con una velocidad de 50 °C/min y un mantenimiento final de 1 minuto. El FID se mantuvo a 250 °C con 40 ml/min de hidrógeno, 450 ml/min de aire y 15 ml/min de nitrógeno como gas de reposición.
Análisis del espacio de cabeza
Las mediciones se realizaron en un micro GC Varian CP-4900 con dos canales instalados. El canal 1 era un columna de tamiz molecular de 10 m que funcionaba a 70 °C, 200 kPa de argón y un tiempo de retroenjuagado de 4,2 s, mientras que el canal 2 era un columna PPQ de 10 m que funcionaba a 90 °C, 150 kPa de helio y sin retroenjuagado. La temperatura del inyector para ambos canales fue de 70 °C. Los tiempos de análisis se establecieron en 120 s, pero todos los picos de interés normalmente eluían antes de los 100 s.
Recogida de células
Se transfirieron lentamente células de un biorreactor de 1,5 l, que utilizaban CO y H2 que tenían una densidad óptica (DO) de 4 y que producían etanol, acetato y 2,3-butanodiol mediante tubos a un frasco de 2 litros cerrada con un tapón de goma y lleno principalmente con N2. La sobrepresión se liberó mediante una aguja a través del tapón. Los frascos se mantuvieron a una temperatura inferior a 0 °C y la transferencia del cultivo se realizó lentamente para enfriar el cultivo a 0 °C lo más rápido posible después de la transferencia. Cuando terminó la transferencia, el frasco se colocó en una tienda anaeróbica. Los tubos se centrifugaron, a continuación se decantó el sobrenadante y el líquido restante se eliminó con papel de filtro. El sedimento se suspendió en fosfato potásico anaeróbico 50 mM, pH 7, que contenía ditiotreitol 10 mM. Se combinó, centrifugó, secó, pesó y almacenó en hielo seco la suspensión de varios frascos.
Ensayos enzimáticos
Los ensayos enzimáticos se realizaron según los métodos descritos en Huang (Huanget al.,2012) e Ismaiel (Ismaielet al.,1993).
Resultados
Se demostró que la reducción de acetona a isopropanol es una función de una enzima alcohol deshidrogenasa secundaria estrictamente dependiente de NADPH, como se muestra en la figura 5. La actividad solamente se midió con NADPH pero no con NADH, lo que demuestra que esta enzima depende estrictamente de NADPH.
Para demostrar la capacidad de la reserva de NADPH durante el crecimiento autótrofo en CO, se introdujo acetona de manera continua en un reactor de crecimiento con acetona. Se descubrió que la acetona se convertía eficientemente en isopropanol a través de esta enzima alcohol deshidrogenasa secundaria dependiente de NADPH a altas velocidades. La figura 6 muestra que la acetona se convierte en isopropanol poco después de la introducción en el biorreactor. Incluso a altas concentraciones de 20 g/l, el cultivo convirtió toda la acetona en isopropanol, lo que demuestra que la reserva de NADPH es suficiente para mantener esto incluso a una tasa elevada.
Este experimento demuestra la capacidad que tienen los microorganismos clostridios carboxidotróficos para impulsar reacciones sostenidas dependientes de NADPH. EnE. coli,la capacidad de NADPH es considerablemente menor, como se muestra en estudios con furfural (E N Milleret al.,2009; Elliot N Milleret al.,2009).
Ejemplo 4
Existen varias vías que ofrecen la opción entre las enzimas dependientes de NADH y NADPH, por ejemplo, la vía del butanol. La mayoría de los esfuerzos de ingeniería hasta ahora se han centrado en utilizar reacciones dependientes de NADH evitando al mismo tiempo reacciones dependientes de NADPH. Esto limita la elección de vías y descuida la fuerza impulsora adicional proporcionada por NADPH.
Se diseña una nueva vía completamente dependiente de NADPH para la biosíntesis de butanol y consiste en una tiolasa (EC 2.3.1.9;btkB,p.ej., deRalstonia eutropha:YP_725948.1, GeneID:4248815;phaA,p.ej., deRalstonia eutropha:YP_725941.1, Gene ID: 4249783), una R-3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa dependiente de NADPH (EC:1.1.1.36;phaBGO:0018454; p.ej., deRalstonia eutropha:YP_725942.1, GeneID:4249784) y 3-hidroxibutiril-CoA deshidratasa (EC 4.2.1.119;phaJpor ejemplo, deAeromonas punctata:BAA21816.1), una crotonil-CoA carboxilasa/reductasa dependiente de NADPH (EC 1.3.1.86;ccrpor ejemplo, deStreptomyces collinus;EC 1.3.1.85;ccrRs,por ejemplo, deRhodobacter sphaeroides:YP_354044.1, Gene ID: 3720751) y etilmalonil-CoA descarboxilasa dependiente de NADPH (EC 4.1.1.41; por ejemplo, deMus musculus:NP_001103665.1, GeneID:52665) a butiril-CoA, que luego se puede convertir en butanol directamente a través de aldehído/alcohol deshidrogenasas o mediante butirato a través de fosfotranscetilasa y butirato cinasa, aldehído ferredoxina oxidorreductasa y alcohol deshidrogenasa, una butiril-CoA reductasa dependiente de NADPH (EC 1.1.2.10;bldpor ejemplo, deClostridium saccharoperbutylacetonicmN1-4: AGF59413.1, GeneID: Cspa_c56880) y aldehído reductasa (EC 1.1.1.1;adhApor ejemplo, deSynechocystissp. PCC 6803: NP_443028.1, GeneID:951896) (figura 7).
Dos moléculas de acetil-CoA se convierten en crotonil-CoA mediante tres enzimas codificadas porphaABJdeRalstonia eutropha.Dos acetil-CoA se condensan en acetoacetil-CoA mediante la tiolasa, seguido de la reducción a R-3 hidroxibutiril-CoA mediante la R-3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa específica de NADPH. Después, la R-3-hidroxibutiril-CoA se convierte en crotonil-CoA mediante la R-3-hidroxibutiril-CoA deshidratasa.
La combinación crotonil-CoA carboxilasa/reductasa deRhodobacter sphaeroides(Erbet al.,2007) y etilmalonil-CoA descarboxilasa deMus musculus(ratón) (Linsteret al.,2011) cataliza primero la condensación de crotonil-CoA con dióxido de carbono para formar etilmalonil-CoA con consumo de NADPH, seguido de descarboxilación de etilmalonil-CoA a butiril-CoA.
La butiril-CoA reductasa deClostridium saccharoperbutylacetonicumNI-4 escinde el resto CoA de butiril-CoA para formar butiraldehído. Se supone que la enzima depende de NADPH ya que un homólogo deClostridium beijerinkiiNRRL B592 es más activo con NADPH (Yan y Chen, 1990).
La aldehído reductasa de la cianobacteriaSynechocystissp. PCC 6803 tiene una fuerte preferencia por la reducción de NADPH de longitud de cadena media y aldehídos aromáticos a alcoholes (Vidalet al.,2009). La preferencia por la reducción de butiraldehído a butanol con respecto a la oxidación del butanol es de 251:1 a favor de la reducción.
Ejemplo 5
En células deE. colicultivadas con azúcar glucosa, se ha demostrado que la reserva de NADH es más de 20 veces mayor que la reserva de NADPH (BD Bennettet al.,2009), lo que limita muchas reacciones biosintéticas y bioconversiones, especialmente en procesos de fermentación (R Poulsenet al.,2005). Las reservas de NADPH y NADH se midieron en bacterias del géneroClostridiumacetogénicas carboxidotróficas.
Se tomaron y analizaron muestras procedentes de una fermentación continua conClostridium autoethanogenumcomo se describe en el ejemplo 2. Se sedimentaron rápidamente muestras de cultivo de 5 ml mediante centrifugación (13000 rpm a -10 °C durante 5 minutos), se eliminaron los sobrenadantes, los sedimentos celulares se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y luego se almacenaron a -80 °C hasta su análisis. Los análisis de metabolitos se realizaron en sedimentos microbianos como se describe en (BD Bennettet al.,2009; Yang et al, Clostridium thermocellum ATCC27405 transcriptomic, metabolomic and proteomic profiles after ethanol stress. BMC Genomics 2012, 13:336; Marcellin E, Quantitative analysis of intracellular sugar phosphates and sugar nucleotides in encapsulated streptococci using HPAEC-PAD, Biotechnol J 2009, 4, 58-63.
A diferencia deE. coli,se descubrió que en C.autoethanogenumla reserva de NADPH era más grande que la reserva de NADH (fig. 77), con una proporción de 2,2:1 de NADPH+H+ y NADP a NADH+H+ y NADH, respectivamente 36,8:1 NADPH+H+ a NADH+H+ demostrando la fuerza impulsora del NADPH en clostridios carboxidotróficos acetogénicos con CO como sustrato.
Párrafos legales estándar
La invención se ha descrito en el presente documento, con referencia a determinadas realizaciones preferidas, para permitir al lector llevar a la práctica la invención sin excesiva experimentación. No obstante, un experto en la materia reconocerá fácilmente que muchos de los componentes y parámetros pueden variarse o modificarse hasta cierto punto o sustituirse por equivalentes conocidos. Se proporcionan títulos, encabezados o similares para mejorar la comprensión del lector de este documento y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente invención.
La referencia a cualquier aplicación, patente y publicación en esta memoria descriptiva no es, y no debe tomarse como, un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que constituyen un estado de la técnica válido o forman parte del conocimiento general común en cualquier país.
A lo largo de esta memoria descriptiva y de cualquiera de las siguientes reivindicaciones, a menos que el contexto requiera otra cosa, las palabras "comprender", "que comprende" y similares, deben interpretarse en un sentido inclusivo en lugar de exclusivo, es decir, en el sentido de "que incluye, pero sin limitación".
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Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un microorganismo clostridio carboxidotrófico recombinante que expresa al menos una enzima dependiente de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) exógena,
en donde la enzima dependiente de NADPH es una hidrogenasa, una formiato deshidrogenasa, una metilen-THF-deshidrogenasa, una hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) reductasa, una 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa, una acetoacetil-CoA reductasa, una trans-2-enoil-CoA reductasa, una enzima codependiente de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH)/nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) o una isoforma bifurcadora de NADH/NADPH;
además, en donde la utilización general de NADPH sobre NADH por parte del microorganismo aumenta en relación con el microorganismo precursor.
2. El microorganismo recombinante de la reivindicación 1, en donde la hidrogenasa es una nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP) hidrogenasa exclusiva de Fe bifurcadora.
3. El microorganismo recombinante de la reivindicación 1, en donde la formiato deshidrogenasa es una NADP formiato deshidrogenasa bifurcadora.
4. El microorganismo recombinante de la reivindicación 1, en donde la acetoacetil-CoA reductasa esphaB(EC 1.1.1.36).
5. El microorganismo recombinante de la reivindicación 4, en donde el microorganismo recombinante comprende además 3-hidroxibutiril-CoA deshidratasa exógena dependiente de NADHphaJ(EC 4.2.1.119).
6. El microorganismo recombinante de la reivindicación 4, en donde el microorganismo recombinante comprende además 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa exógena dependiente de NADHhbd(EC 1.1.1.157).
7. El microorganismo recombinante de la reivindicación 1, en donde la trans-2-enoil-CoA reductasa es una crotonil-CoA reductasa.
8. El microorganismo recombinante de la reivindicación 7, en donde la crotonil-CoA reductasa esccr(EC 1.3.1.86) occrRs(EC 1.3.1.85).
9. El microorganismo recombinante de la reivindicación 8, en donde el microorganismo recombinante comprende además crotonil-CoA reductasa dependiente de NADH (EC 1.3.1.44) exógena.
10. El microorganismo recombinante de la reivindicación 1, en donde el microorganismo recombinante tiene una producción aumentada de al menos un producto de fermentación con respecto al microorganismo precursor.
11. El microorganismo recombinante de la reivindicación 1, en donde la isoforma dependiente de NADH de la enzima dependiente de NADPH está atenuada o suprimida en comparación con un microorganismo precursor.
12. El microorganismo recombinante de la reivindicación 1, en donde el microorganismo recombinante se selecciona del grupo que consiste enClostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium ragsdahlei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium, formicoaceticum,yClostridium magnum.
13. ElClostridium autoethanogenumde la reivindicación 12, en donde elClostridium autoethanogenumes DSM23693.
14. El microorganismo recombinante de la reivindicación 1, en donde el microorganismo comprende una hidrogenasa exógena y una formiato deshidrogenasa exógena.
15. El microorganismo recombinante de la reivindicación 14, en donde la hidrogenasa es una NADP hidrogenasa exclusiva de Fe y la formiato deshidrogenasa es una NADP formiato deshidrogenasa bifurcadora.
16. El microorganismo recombinante de la reivindicación 15, en donde la NADP hidrogenasa exclusiva de Fe y la NADP formiato deshidrogenasa forman un complejo.
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