ES2961550T3 - Derivados de isoquinolina sustituidos como inmunomoduladores - Google Patents

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Abstract

La presente divulgación se refiere generalmente a compuestos útiles como inmunomoduladores. En el presente documento se proporcionan compuestos, composiciones que comprenden dichos compuestos y métodos para su uso. La divulgación se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un compuesto según la divulgación que son útiles para el tratamiento de diversas enfermedades, incluido el cáncer y las enfermedades infecciosas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Derivados de isoquinolina sustituidos como inmunomoduladores
La presente divulgación se refiere generalmente a compuestos útiles como inhibidores de las interacciones proteína/proteína de PD-1/PD-L1 y proteína/proteína de CD80/PD-L1. En el presente documento se proporcionan compuestos, composiciones que comprenden dichos compuestos y usos de los mismos. La divulgación se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un compuesto de acuerdo con la divulgación que son útiles para el tratamiento de diversas enfermedades, incluyendo cáncer y enfermedades infecciosas.
La muerte programada-1 (CD279) es un receptor en linfocitos T que se ha demostrado que suprime las señales de activación del receptor de linfocitos T cuando está unido por cualquiera de sus ligandos, ligando de muerte programada 1 (PD-L1, CD274, B7-H1) o PD-L2 (CD273, B7-DC) (Sharpeet al.,Nat. Imm. 2007). Cuando los linfocitos T que expresan PD-1, entran en contacto con células que expresan sus ligandos, las actividades funcionales en respuesta a estímulos antigénicos, incluyendo la proliferación, la secreción de citocinas y la actividad citolítica, se reducen. Las interacciones de PD-1/PD-Ligando regulan a la baja las respuestas inmunitarias durante la resolución de una infección 0 tumor, o durante el desarrollo de la auto-tolerancia (Keir Me, Butte MJ, Freeman GJ,et al.PD-1 and its Ligands in Tolerance and Immunity. Annu. Rev. Immunol. 2008; 26: Epub). La estimulación antigénica crónica, tal como la que se produce durante la enfermedad tumoral o infecciones crónicas, da como resultado linfocitos T que expresan niveles elevados de PD-1 y son disfuncionales con respecto a la actividad hacia el antígeno crónico (revisado en Kim y Ahmed, Curr Opin Imm, 2010), un proceso denominado "agotamiento de los linfocitos T". Los linfocitos B también muestran la supresión y el "agotamiento" de PD-1/PD-ligando.
También se ha demostrado que PD-L1 que interacciona con CD80 (Butte MJet al.,Immunity; 27:111-122 (2007)). Se ha demostrado que la interacción de PD-L1/CD80 sobre la expresión de las células inmunitarias es inhibitoria. Se ha demostrado que el bloqueo de esta interacción elimina esta interacción inhibidora (Paterson AM,et al.,J Immunol., 187:1097-1105 (2011); Yang J,et al.J Immunol. 1 de agosto; 187(3):1113-9 (2011)).
Se ha mostrado que el bloqueo de la interacción PD-1/PD-L1 usando anticuerpos contra PD-L1 restaura y aumenta la activación de linfocitos T en muchos sistemas. Los pacientes con cáncer avanzado se benefician de la terapia con un anticuerpo monoclonal contra PD-L1 (Brahmeret al.,New Engl J Med 2012). Los modelos animales preclínicos de tumores han demostrado que el bloqueo de la vía de PD-1/PD-L1 por los anticuerpos monoclonales puede potenciar la respuesta inmunitaria y dar como resultado la respuesta inmunitaria a varios tumores histológicamente distintos (Dong H, Chen L. B7-H1 Pathway and its Role in the Evasion of Tumor. J Mol Med. 2003; 81(5):281-287; Dong H, Strome SE, Salamoa DR,et al.Tumor-associated B7-H1 Promotes T-cell Apoptosis: A Potential Mechanism of Immune Evasion. Nat Med. 2002; 8(8):793-800).
La interferencia con la interacción PD-1/PD-L1 también ha mostrado una actividad de linfocitos T potenciada en sistemas de infección crónica. La infección crónica del virus de la coriomeningitis linfocítica crónica de ratones también muestra una mejor depuración del virus y una inmunidad restaurada con el bloqueo de PD-L1 (Barber DL, Wherry EJ, Masopust D,et al.Restoring Function in Exhausted CD8 T Cells During Chronic Viral Infection. Nature. 2006; 439(7077):682-687). Los ratones humanizados infectados con VIH-1 muestran una protección potenciada contra la viremia y el empobrecimiento vírico de linfocitos T CD4+ (Palmeret al.,J. Immunol 2013). El bloqueo de PD-1/PD-L1 a través de anticuerpos monoclonales contra PD-L1 puede restaurar la funcionalidad específica de antígenoin vitrocontra linfocitos T de pacientes con VIH (Day, Nature 2006; Petrovas, J. Exp. Med. 2006; Trautman, Nature Med. 2006; D'Souza, J.Immunol. 2007; Zhang, Blood 2007; Kaufmann, Nature Imm. 2007; Kasu, J. Immunol. 2010; Porichis, Blood 2011), pacientes con VHC [Golden-Mason, J. Virol. 2007; Jeung, J. Leuk. Biol. 2007; Urbani, J. Hepatol. 2008; Nakamoto, PLoSPath. 2009; Nakamoto, Gastroenterology 2008] o pacientes con HBV (Boni, J. Virol. 2007; Fisicaro, Gastro. 2010; Fisicaroet al.,Gastroenterology, 2012; Boniet al.,Gastro., 2012; Pennaet al.,JHep, 2012; Raziorrough, Hepatology 2009; Liang, World J Gastro. 2010; Zhang, Gastro. 2008).
También se ha demostrado que el bloqueo de la interacción PD-L1/CD80 estimula la inmunidad (Yang J.,et al.,J Immunol. 1 de agosto; 187(3):1113-9 (2011)). Se ha demostrado que la estimulación inmune resultante del bloqueo de la interacción PD-L1/CD80 se potencia a través del bloqueo combinado de otras interacciones PD-1/PD-L1 o PD-1/PD-L2.
Se supone que las alteraciones en los fenotipos de las células inmunitarias son un factor importante en el choque séptico (Hotchkiss,et al.,Nat Rev Immunol (2013)). Estos incluyen niveles incrementados de apoptosis de linfocitos T PD-1 y PD-L1 (Guignant, et al, Crit. Care (2011)). Los anticuerpos dirigidos a PD-L1 puede reducir el nivel de apoptosis de células inmunitarias (Zhang et al, Crit. Care (2011)). Adicionalmente, los ratones que carecen de expresión de PD-1 son más resistentes a los síntomas del choque séptico que los ratones de tipo silvestre (Yang J.,et al.J Immunol. 1 de agosto; 187(3):1113-9 (2011)). Los estudios han revelado que el bloqueo de las interacciones de los anticuerpos que usan PD-L1 puede suprimir las respuestas inmunitarias inapropiadas y mejorar los síntomas de la enfermedad.
Además de potenciar las respuestas inmunológicas a los antígenos crónicos, también se ha demostrado que el bloqueo de la ruta PD-1/PD-L1 potencia las respuestas a la vacunación, incluyendo la vacunación terapéutica en el contexto de la infección crónica (S. J. Ha, S. N. Mueller, E. J. Wherryet al.,"Enhancing Therapeutic Vaccination by Blocking PD-1-Mediated Inhibitory Signals During Chronic Infection", The Journal of Experimental Medicine, vol. 205, n.° 3, págs. 543-555, 2008.; A. C. Finnefrock, A. Tang, F. Liet al.,"PD-1 Blockade in Rhesus Macaques: Impact on Chronic Infection and Prophylactic Vaccination", The Journal of Immunology, vol. 182, n.°2, págs. 980-987, 2009; M. -Y. Song, S. -H. Park, H. J. Nam, D. -H. Choi e Y.-C. Sung, "Enhancement of Vaccine-Induced Primary and Memory CD8+ T-Cell Responses by Soluble PD-1", The Journal of Immunotherapy, vol. 34, n.° 3, págs. 297-306, 2011). La ruta PD-1 es una molécula inhibidora clave en el agotamiento de los linfocitos T que surge de la estimulación crónica del antígeno durante las infecciones crónicas y las enfermedades tumorales. Se ha demostrado que el bloqueo de la interacción PD-1/PD-L1 a través del direccionamiento a la proteína PD-L1 restaura las funciones inmunitarias de los linfocitos T específicos de antígenoin vitroein vivo,incluyendo respuestas potenciadas a la vacunación en el establecimiento de una infección tumoral o crónica. Por consiguiente, se desean agentes que bloqueen la interacción de PD-L1 con PD-1 o CD80.
Los documentos WO 2015/034820 y WO 2015/160641 describen compuestos que son útiles como inmunomoduladores.
Los solicitantes encontraron compuestos potentes que tienen actividad como inhibidores de la interacción de PD-L1 con PD-1 y CD80, y por lo tanto, pueden ser útiles para la administración terapéutica para aumentar la inmunidad en cáncer o infecciones, incluyendo la vacuna terapéutica. Estos compuestos se proporcionan para ser útiles como productos farmacéuticos con valores deseables de estabilidad, biodisponibilidad, índice terapéutico y toxicidad, que son importantes para su farmacabilidad.
La presente invención se refiere a compuestos de fórmula (I) como se define en las reivindicaciones adjuntas.
La presente divulgación también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente divulgación también proporciona un compuesto de fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con la actividad de PD-L1, incluyendo su interacción con otras proteínas tales como PD-1 y B7-1(CD80), en un paciente que no necesita.
La presente divulgación también proporciona procesos y productos intermedios para fabricar los compuestos de fórmula (I) y/o sales de los mismos.
La presente divulgación también proporciona un compuesto de fórmula (I) y/o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en terapia.
Los compuestos de fórmula (I) y las composiciones que comprenden los compuestos de fórmula (I) se pueden usar para tratar, prevenir o curar diversas enfermedades infecciosas y cáncer. Las composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos son útiles para tratar, prevenir o retrasar la progresión de enfermedades o trastornos en distintas áreas terapéuticas, tales como cáncer y enfermedades infecciosas.
Estas y otras características de la divulgación se expondrán de manera más extensa a medida que avanza la divulgación.
En un primer aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I):
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde
n es 1 o 2;
n' es 1 o 2; con la condición de que al menos uno de n y n' sea distinto de 2;
uno de X y X' se selecciona entre NH y NRx, y el otro se selecciona entre CH2 y CHRy;
Rx se selecciona entre -CH2CO2H, -CH2CO2alquilo C1-C3 y -CO2alquilo Ci-C3;
Ry se selecciona entre -CH2CO2H, -CH2CO2alquilo C1-C3, -CO2H y -CO2alquilo C1-C3;
R2 se selecciona entre hidrógeno, -OH,
y
en donde R4 se selecciona entre -CN, -CO2H y -CO2alquilo Ci-C3;
R3 se selecciona entre hidrógeno y halo; y
Ar se selecciona entre;
En una primera realización del primer aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde cada uno de n y n' es 1. En una segunda realización, X es NRx y X' es CH2.
En una tercera realización del primer aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde cada uno de n y n' es 1, X es CHRy y X' es NH.
En un segundo aspecto, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En un tercer aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso para potenciar, estimular, modular y/o aumentar la respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesite. Una primera realización del tercer aspecto comprende además la administración de un agente adicional antes de, después o simultáneamente con el compuesto de fórmula (I) o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una segunda realización del tercer aspecto, el agente adicional es un agente antimicrobiano, un agente antivírico, un agente que modifica la expresión génica, un agente citotóxico y/o un modificador de la respuesta inmunitaria.
En un cuarto aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable, para su uso en la inhibición del crecimiento, proliferación o metástasis de células cancerosas en un sujeto que lo necesita. En una primera realización del cuarto aspecto el cáncer se selecciona entre melanoma, carcinoma de células renales, cáncer de pulmón no microcítico escamoso (NSCLC), NSCLC no escamoso, cáncer colorrectal, cáncer de próstata resistente a la castración, cáncer de ovario, cáncer gástrico, carcinoma hepatocelular, carcinoma pancreático, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinomas del esófago, del tracto gastrointestinal y de mama, y neoplasia maligna hematológica.
En un quinto aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable, para su uso en el tratamiento de una enfermedad infecciosa en un sujeto que lo necesita. En una primera realización del quinto aspecto, la enfermedad infecciosa está causada por un virus. En una segunda realización del quinto aspecto, el virus se selecciona entre VIH, de la hepatitis A, de la hepatitis B, de la hepatitis C, de la hepatitis D, virus del herpes, papilomavirus y de la gripe.
En un sexto aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable, para su uso en el tratamiento de choque séptico en un sujeto que lo necesita.
En un séptimo aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable, para su uso en el bloqueo de la interacción de PD-L1 con PD-1 y/o CD80 en un sujeto.
Los expertos en la materia pueden entender más fácilmente las características y ventajas de la divulgación tras la lectura de la siguiente descripción detallada. Se apreciará que ciertas características de la divulgación que, por razones de claridad, se han descrito anteriormente y a continuación en el contexto de realizaciones separadas, también pueden combinarse para formar una única realización. Por el contrario, diversas características de la divulgación que, por razones de brevedad, se han descrito en el contexto de una única realización, se pueden combinar también para formar subcombinaciones de las mismas. Se pretende que las realizaciones identificadas en el presente documento como a modo de ejemplo o preferidas sean ilustrativas y no limitantes.
A menos que se indique específicamente otra cosa en el presente documento, las referencias hechas en singular también pueden incluir el plural. Por ejemplo, "un" y "una" se pueden referir a uno o a uno o más.
Como se usa en el presente documento, la expresión "compuesto o compuestos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos" se refiere a al menos un compuesto, al menos una sal de los compuestos o a una combinación de los mismos. Por ejemplo, los compuestos de fórmula (I) o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos incluyen un compuesto de fórmula (I); dos compuestos de fórmula (I); una sal de un compuesto de fórmula (I); un compuesto de fórmula (I) y una o más sales del compuesto de fórmula (I); y dos o más sales de un compuesto de fórmula (I).
A menos que se indique otra cosa, se supone que cualquier átomo con valencias no cubiertas tiene átomos de hidrógeno suficientes para satisfacer las valencias.
A lo largo de la memoria descriptiva, un experto en la materia puede elegir los grupos y los sus sustituyentes para proporcionar restos y compuestos estables.
A continuación se enumeran las definiciones de los diferentes términos usados para describir la presente divulgación. Estas definiciones se aplican a los términos que se usan a lo largo de la memoria descriptiva (a menos que estén limitados de otro modo en casos específicos), ya sea de manera individual o como parte de un grupo más grande. Las definiciones expuestas en el presente documento tienen prioridad sobre las definiciones expuestas en cualquier patente, solicitud de patente y/o publicación de solicitud de patente incorporada en el presente documento por referencia.
La expresión "alquilo C1-C3", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo obtenido a partir de un hidrocarburo saturado de cadena lineal o ramificada que contiene de uno a tres átomos de carbono.
Los términos "halo" y "halógeno", como se usan en el presente documento, se refieren a F, Cl, Br o I.
La expresión "farmacéuticamente aceptable" se emplea en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que son, dentro del alcance del buen criterio médico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.
Los compuestos de fórmula (I) pueden formar sales que también están dentro del alcance de la presente divulgación. A menos que se indique otra cosa, se entiende que la referencia a un compuesto de la invención incluye la referencia a una o más sales del mismo. El término "sal (o sales)" representa sales ácidas y/o básicas formadas con ácidos y bases inorgánicas y/u orgánicas. Además, el término "sal (o sales) pueden incluir zwitteriones (sales internas), por ejemplo, cuando un compuesto de fórmula (I) contiene tanto un resto básico, tal como una amina o una piridina o un anillo de imidazol, como un resto ácido, tal como un ácido carboxílico. Se prefieren las sales farmacéuticamente aceptables (es decir, no tóxicas, fisiológicamente aceptables), tales como, por ejemplo, sales de metal y amina aceptables en las que el catión no contribuye significativamente a la toxicidad o la actividad biológica de la sal. Sin embargo, pueden ser útiles otras sales, por ejemplo, en etapas de aislamiento o purificación, que pueden emplearse durante la preparación y, por lo tanto, se contemplan dentro del alcance de la divulgación. Se pueden formar sales de los compuestos de fórmula (I), por ejemplo, haciendo reaccionar un compuesto de fórmula (I) con una cantidad de ácido o base, tal como una cantidad equivalente, en un medio tal como uno en el que la sal precipita o en un medio acuoso seguido de liofilización.
Las sales de adición de ácidos a modo de ejemplo incluyen acetatos (tales como los formados con ácido acético o ácido trihaloacético, por ejemplo, ácido trifluoroacético), adipatos, alginatos, ascorbatos, aspartatos, benzoatos, bencenosulfonatos, bisulfatos, boratos, butiratos, citratos, alcanforatos, alcanforsulfonatos, ciclopentanopropionatos, digluconatos, dodecilsulfatos, etanosulfonatos, fumaratos, glucoheptanoatos, glicerofosfatos, hemisulfatos, heptanoatos, hexanoatos, clorhidratos (formados con ácido clorhídrico), bromhidratos (formados con hidrogenobromuro), yodhidratos, maleatos (formados con ácido maleico), 2-hidroxietanosulfonatos, lactatos, metanosulfonatos (formados con ácido metanosulfónico), 2-naftalenosulfonatos, nicotinatos, nitratos, oxalatos, pectinatos, persulfatos, 3-fenilpropionatos, fosfatos, picratos, pivalatos, propionatos, salicilatos, succinatos, sulfatos (tales como los formados con ácido sulfúrico), sulfonatos (tales como los mencionados en el presente documento), tartratos, tiocianatos, toluenosulfonatos tales como tosilatos, undecanoatos y similares.
Las sales básicas a modo de ejemplo incluyen sales de amonio, sales de metales alcalinos tales como sales de sodio, litio y potasio; sales de metales alcalinotérreos tales como sales de calcio y magnesio; sales de bario, cinc y aluminio; sales con bases orgánicas (por ejemplo, aminas orgánicas) tales como trialquilaminas tales como trietilamina, procaína, dibencilamina, N-bencil-p-fenetilamina, 1-efenamina, N,N'-dibenciletilen-diamina, deshidroabietilamina, N-etilpiperidina, bencilamina, diciclohexilamina o aminas farmacéuticamente aceptables similares y sales con aminoácidos tales como arginina, lisina y similares. Los grupos que contienen nitrógeno básico pueden cuaternizarse con agentes tales como haluros de alquilo inferior (por ejemplo, cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo), sulfatos de dialquilo (por ejemplo, sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo y diamilo), haluros de cadena larga (por ejemplo, cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo), haluros de aralquilo (por ejemplo, bromuros de bencilo y fenetilo) y otros. Las sales preferidas incluyen sales monoclorhidrato, hidrogenosulfato, metanosulfonato, fosfato o nitrato.
Se conocen bien en la técnica diversas formas de profármacos y se describen en:
a) The Practice of Medicinal Chemistry, Camille G. Wermuthet al.,cap. 31, (Academic Press, 1996);
b) Design of Prodrugs, editado por H. Bundgaard, (Elsevier, 1985);
c) A Textbook of Drug Design and Development, P. Krogsgaard-Larson y H. Bundgaard, eds. cap. 5, págs. 113 191 (Harwood Academic Publishers, 1991); y
d) Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism, Bernard Testa y Joachim M. Mayer, (Wiley-VCH, 2003).
Además, los compuestos de fórmula (I), después de su preparación, se pueden aislar y purificar para obtener una composición que contiene una cantidad en peso igual a o superior al 99 % de un compuesto de fórmula (I) ("sustancialmente puro"), que después se usa o se formula como se describe en el presente documento. Dichos compuestos de fórmula (I) "sustancialmente puros" se contemplan también en el presente documento como parte de la presente divulgación.
"Compuesto estable" y "estructura estable" pretenden indicar un compuesto que es suficientemente robusto para sobrevivir al aislamiento hasta un grado útil de pureza a partir de una mezcla de reacción, y a la formulación en un agente terapéutico eficaz. La presente divulgación pretende incluir los compuestos estables.
"Cantidad terapéuticamente eficaz" pretende incluir una cantidad de un compuesto de la presente divulgación solo o una cantidad de la combinación de compuestos reivindicados o una cantidad de un compuesto de la presente divulgación en combinación con otros principios activos eficaces para inhibir las interacciones PD-1/PD-L1 proteína/proteína y/o CD80/PD-L1 proteína/proteína o eficaces para tratar o prevenir cáncer o enfermedades infecciosas, tales como HIV o hepatitis B, hepatitis C y hepatitis D.
Como se usa en el presente documento, "tratar" o "tratamiento" cubre el tratamiento de una patología en un mamífero, en particular en un ser humano, e incluye: (a) prevenir la aparición de la patología en un mamífero, en particular, cuando dicho mamífero tiene predisposición a la patología pero aún no se ha diagnosticado que la tenga; (b) inhibir la patología, es decir, detener su desarrollo; y/o (c) aliviar la patología, es decir, provocar la regresión de la patología.
Los compuestos de la presente divulgación pretenden incluir todos los isótopos de los átomos que aparecen en los presentes compuestos. Los isótopos incluyen aquellos átomos que tienen el mismo número atómico pero diferentes números másicos. A modo de ejemplo general y sin limitación, los isótopos de hidrógeno incluyen deuterio (D) y tritio (T). Los isótopos de carbono incluyen 13C y 14C. Los compuestos de la divulgación marcados isotópicamente pueden prepararse generalmente mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia o mediante procesos análogos a aquellos descritos en el presente documento, usando un reactivo apropiado marcado isotópicamente en lugar de reactivo no marcado empleado de otro modo. Por ejemplo, metilo (-CH3) también incluye grupos metilo deuterados tales como -CD3.
Los compuestos según la fórmula (I) y/o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos se pueden administrar por cualquier medio adecuado para la afección a tratar, que puede depender de la necesidad de tratamiento específico de sitio o de la cantidad de compuesto de fórmula (I) a administrar. También se incluye dentro de esta divulgación una clase de composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula (I) y/o sales farmacéuticamente aceptables del mismo; y uno o más vehículos y/o diluyentes y/o adyuvantes (denominados en conjunto en el presente documento materiales "portadores") no tóxicos, farmacéuticamente aceptables y, si se desea, otros principios activos. Los compuestos de fórmula (I) se pueden administrar por cualquier vía adecuada, preferentemente en forma de una composición farmacéutica adaptada a dicha vía y en una dosis eficaz para el tratamiento pretendido. Los compuestos y composiciones de la presente descripción pueden, por ejemplo, administrarse por vía oral, mucosal, rectal o parenteral, que incluye la vía intravascular, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular e intraesternal, en formulaciones de unidades de dosificación que contienen portadores, adyuvantes y vehículos convencionales farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, el portador farmacéutico puede contener una mezcla de manitol o lactosa y celulosa microcristalina. La mezcla puede contener componentes adicionales tales como un agente lubricante, por ejemplo, estearato de magnesio y un agente disgregante tal como crospovidona. La mezcla portadora puede rellenarse en una cápsula de gelatina o comprimirse en forma de un comprimido. La composición farmacéutica se puede administrar en una forma de dosificación oral o una infusión, por ejemplo.
Para administración oral, la composición farmacéutica puede estar en forma de, por ejemplo, un comprimido, cápsula, cápsula líquida, suspensión o líquido. Preferentemente, la composición farmacéutica se fabrica en forma de una unidad de dosificación que contiene una cantidad particular del principio activo. Por ejemplo, se puede proporcionar la composición farmacéutica en forma de un comprimido o cápsula que comprende una cantidad de principio activo en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 1000 mg, preferentemente de aproximadamente 0,25 a 250 mg y, más preferentemente, de aproximadamente 0,5 a 100 mg. Una dosis diaria adecuada para un ser humano u otro mamífero puede variar mucho, dependiendo del estado del paciente y de otros factores, pero, se puede determinar usando métodos rutinarios.
Cualquier composición farmacéutica contemplada en el presente documento puede, por ejemplo, suministrarse por vía oral mediante cualquier preparación oral aceptable y adecuada. Las preparaciones orales a modo de ejemplo, incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, comprimidos, trociscos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas y oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras y blandas, cápsulas líquidas, jarabes y elixires. Las composiciones farmacéuticas destinadas a administración oral se pueden preparar según cualquier método conocido en la materia para la fabricación de composiciones farmacéuticas destinadas a administración oral. Para proporcionar preparaciones farmacéuticamente agradables al paladar, una composición farmacéutica según la divulgación puede contener al menos un agente seleccionado entre agentes edulcorantes, agentes saporíferos, agentes colorantes, emolientes, antioxidantes y agentes conservantes.
Un comprimido puede, por ejemplo, preparase mezclando al menos un compuesto de fórmula (I) y/o al menos una sal farmacéuticamente aceptable del mismo con al menos un excipiente no tóxico farmacéuticamente aceptable adecuado para la fabricación de comprimidos. Los excipientes a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como, por ejemplo, carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio y fosfato de sodio; agentes de granulación y desintegración, tales como, por ejemplo, celulosa microcristalina, croscarmelosa de sodio, almidón de maíz y ácido algínico; agentes aglutinantes, tales como, por ejemplo, almidón, gelatina, polivinilpirrolidona y goma arábiga; y agentes lubricantes, tales como, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico y talco. Además, un comprimido puede estar sin recubrir o recubierto mediante técnicas conocidas para enmascarar el mal sabor de un fármaco de sabor desagradable o retardar la desintegración y absorción del principio activo en el tracto gastrointestinal, manteniendo así los efectos del principio activo durante más tiempo. Los materiales enmascarantes del sabor solubles en agua a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, hidroxipropilmetilcelulosa e hidroxipropilcelulosa. Los materiales retardantes a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, etilcelulosa y acetato butirato de celulosa.
Las cápsulas de gelatina dura pueden, por ejemplo, prepararse mezclando al menos un compuesto de fórmula (I) y/o al menos una sal del mismo con al menos un diluyente sólido inerte, tal como, por ejemplo, carbonato de calcio; fosfato de calcio y caolín.
Las cápsulas de gelatina blanda pueden, por ejemplo, prepararse mezclando al menos un compuesto de fórmula (I) y/o al menos una sal farmacéuticamente aceptable del mismo con al menos un vehículo soluble en agua, tal como, por ejemplo, polietilenglicol; y al menos un medio oleoso, tal como, por ejemplo, aceite de cacahuete, parafina líquida y aceite de oliva.
Se puede preparar una suspensión acuosa, por ejemplo, mezclando al menos un compuesto de fórmula (I) y/o al menos una sal farmacéuticamente aceptable del mismo con al menos un excipiente adecuado para la fabricación de una suspensión acuosa. Los excipientes a modo de ejemplo adecuados para la fabricación de una suspensión acuosa incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, agentes de suspensión, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, ácido algínico, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma arábiga; agentes dispersantes o humectantes, tales como, por ejemplo, un fosfátido de origen natural, por ejemplo, lecitina; productos de condensación de óxido de alquileno con ácidos grasos, tales como, por ejemplo, estearato de polioxietileno; productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, tales como, por ejemplo, heptadecaetileno-oxicetanol; productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol, tales como, por ejemplo, monooleato de polioxietilen sorbitol; y productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, tales como, por ejemplo, monooleato de polietilensorbitano. Una suspensión acuosa también puede contener al menos un conservante, tales como, por ejemplo, etilo y p-hidroxibenzoato de n-propilo; al menos un agente colorante; al menos un agente saporífero; y/o al menos un agente edulcorante, que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, sacarosa, sacarina y aspartamo.
Las suspensiones oleosas pueden, por ejemplo, prepararse suspendiendo al menos un compuesto de fórmula (I) y/o al menos una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en un aceite vegetal, tal como, por ejemplo, aceite de cacahuete; aceite de oliva; aceite de sésamo; y aceite de coco; o en un aceite mineral, tal como, por ejemplo, parafina líquida. Una suspensión oleosa también puede contener al menos un agente espesante, tal como, por ejemplo, cera de abeja; parafina dura; y alcohol cetílico. Para proporcionar una suspensión oleosa de sabor agradable, se puede añadir al menos uno de los agentes edulcorantes descritos anteriormente en el presente documento y/o al menos un agente saporífero, a la suspensión oleosa. Una suspensión oleosa puede contener además al menos un conservante, que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, un antioxidante, tal como, por ejemplo, hidroxianisol butilado y alfatocoferol.
Los polvos y gránulos dispersables pueden, por ejemplo, prepararse mezclando al menos un compuesto de fórmula (I) y/o al menos una sal farmacéuticamente aceptable del mismo con al menos un agente dispersante y/o humectante; al menos un agente de suspensión; y/o al menos un conservante. Los agentes de dispersión, agentes humectantes y agentes de suspensión como se han definido anteriormente. Los conservantes a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, antioxidantes, por ejemplo, ácido ascórbico. Además, los polvos y gránulos dispersables también pueden contener al menos un excipiente, que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, agentes edulcorantes; agentes saporíferos; y agentes colorantes.
Una emulsión de al menos un compuesto de fórmula (I) y/o al menos una sal farmacéuticamente aceptable del mismo puede, por ejemplo, prepararse en forma de una emulsión de aceite en agua. La fase oleosa de las emulsiones que comprenden compuestos de fórmula (I) puede estar constituida a partir de ingredientes conocidos de una manera conocida. La fase oleosa puede proporcionarla, pero sin limitación, por ejemplo, un aceite vegetal, tal como, por ejemplo, aceite de oliva y aceite de cacahuete; un aceite mineral, tal como, por ejemplo, parafina líquida; y mezclas de los mismos. Si bien la fase puede comprender simplemente un emulsionante, puede comprender una mezcla de al menos un emulsionante con una grasa o un aceite o tanto con la grasa como con el aceite. Los agentes emulsionantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, fosfátidos de origen natural, por ejemplo, lecitina de semilla de soja; ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, tales como, por ejemplo, monooleato de sorbitano; y productos de condensación de ésteres parciales con óxido de etileno, tales como, por ejemplo, monooleato de polioxietilen sorbitano. Preferentemente, se incluye un emulsionante hidrófilo junto con un emulsionante lipófilo que actúa como estabilizante. También se prefiere incluir tanto un aceite como una grasa. Juntos, el o los emulsionantes con o sin estabilizante o estabilizantes conforman la denominada cera emulsionante, y la cera junto con el aceite y la grasa conforman la denominada base emulsionante de la pomada, que forma la fase oleosa dispersa de las formulaciones en crema. Una emulsión puede contener también un agente edulcorante, un agente saporífero, un conservante y/o un antioxidante. Los emulsionantes y estabilizadores de emulsión adecuados para su uso en la formulación de la presente divulgación incluyen Tween 60, Span 80, alcohol cetoestearílico, alcohol miristílico, monoestearato de glicerilo, laurilsulfato de sodio, diestearato de glicerilo solo o con una cera, u otros materiales bien conocidos en la materia.
Los compuestos de fórmula (I) y/o al menos una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos pueden, por ejemplo, administrarse también por vía intravenosa, subcutánea y/o intramuscular mediante cualquier forma inyectable farmacéuticamente aceptable y adecuada. Las formas inyectables a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, soluciones acuosas estériles que comprenden vehículos y disolventes aceptables, tales como, por ejemplo, agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico; microemulsiones estériles de aceite en agua; y suspensiones acuosas u oleaginosas.
Las formulaciones para administración parenteral pueden estar en forma de soluciones o suspensiones estériles para inyección, isotónicas, acuosas o no acuosas. Estas soluciones y suspensiones se pueden preparar a partir de polvos o gránulos estériles usando uno o más de los vehículos o diluyentes mencionados para su uso en las formulaciones para administración oral, o usando otros agentes de dispersión o humectantes y agentes de suspensión adecuados. Los compuestos se pueden disolver en agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, alcohol bencílico, cloruro de sodio, goma de tragacanto y/o diversos tampones. Otros adyuvantes y modos de administración se conocen bien y de manera extensa en la técnica farmacéutica. El principio activo también se puede administrar mediante inyección en forma de una composición con vehículos adecuados que incluyen solución salina, dextrosa o agua, o con ciclodextrina (es decir, Captisol), solubilización en codisolvente (es decir, propilenglicol) o solubilización micelar (es decir, Tween 80).
La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico y parenteralmente aceptable, por ejemplo en forma de una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están el agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico. Además, se usan de manera convencional aceites no volátiles, estériles, como disolvente o medio de suspensión. Para este fin se puede emplear cualquier aceite no volátil suave, que incluye mono y diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como el ácido oleico son útiles para la preparación de inyectables.
Una microemulsión de aceite en agua inyectable, estéril, se puede preparar, por ejemplo, 1) disolviendo al menos un compuesto de fórmula (I) en una fase oleosa, tal como, por ejemplo, una mezcla de aceite de soja y lecitina; 2) combinando la fórmula (I) que contiene la fase oleosa con una mezcla de agua y glicerol; y 3) procesando la combinación para formar una microemulsión.
Se puede preparar una suspensión acuosa u oleaginosa según los métodos actualmente conocidos en la materia. Por ejemplo, se puede preparar una solución o suspensión acuosa estéril con un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, tal como, por ejemplo, 1,3-butanodiol; y se puede preparar una suspensión oleaginosa estéril con un disolvente o medio de suspensión aceptable estéril, no tóxico, tal como, por ejemplo, aceites no volátiles estériles, por ejemplo, mono o diglicéridos sintéticos; y ácidos grasos, tales como, por ejemplo, ácido oleico.
Los portadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que se pueden usar en las composiciones farmacéuticas de esta divulgación incluyen, pero no se limitan a, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, sistemas autoemulsionantes de suministro de fármaco (SEDDS) tales como succinato de d-alfatocoferol polietilenglicol 1000, tensioactivos usados en formas de dosificación farmacéuticas tales como Tweens, aceite de ricino polietoxilado tal como tensioactivo CREMOPHOR (BASF), u otras matrices poliméricas de suministro similares, proteínas séricas, tales como seroalbúmina humana, sustancias tamponantes tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato de disodio, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y lanolina. Ciclodextrinas tales como alfa, beta y gamma-ciclodextrina o derivados modificados químicamente tales como hidroxialquilciclodextrinas, que incluyen 2 -y 3-hidroxipropil-ciclodextrinas, u otros derivados solubilizados, también se pueden usar de manera ventajosa para mejorar la liberación de los compuestos de las fórmulas descritas en el presente documento.
Los compuestos farmacéuticamente activos de esta divulgación pueden procesarse según los procedimientos convencionales de farmacia para producir agentes medicinales para su administración a pacientes, que incluyen seres humanos y otros mamíferos. Las composiciones farmacéuticas se pueden someter a las operaciones farmacéuticas convencionales tales como esterilización y/o pueden contener adyuvantes convencionales, tales como conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, tampones, etc. Los comprimidos y píldoras también se pueden preparar con recubrimientos entéricos. Dichas composiciones también pueden contener adyuvantes, tales como agentes humectantes, edulcorante, saporíferos y agentes perfumantes.
Las cantidades de compuestos que se administran y el régimen de dosificación para tratar una patología con los compuestos y/o composiciones de esta divulgación dependen de una diversidad de factores, que incluyen la edad, el peso, el sexo, la patología del sujeto, el tipo de enfermedad, la gravedad de la enfermedad, la vía y frecuencia de administración y el compuesto particular empleado. Por lo tanto, la pauta posológica puede variar ampliamente, pero se puede determinar con facilidad usando métodos convencionales. Una dosis diaria de aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg de peso corporal, preferentemente entre aproximadamente 0,0025 y aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal y lo más preferentemente entre aproximadamente 0,005 y 10 mg/kg de peso corporal, puede ser apropiada. La dosis diaria se puede administrar en de una a cuatro dosis por día. Otros programas de dosificación incluyen una dosis por semana y una dosis por ciclo de dos días.
Con fines terapéuticos, los compuestos activos de esta divulgación se combinan normalmente con uno o más adyuvantes apropiados para la vía de administración indicada. Si se administran por vía oral, los compuestos se pueden mezclar con lactosa, sacarosa, polvo de almidón, ésteres de celulosa de ácidos alcanoicos, ésteres alquílicos de celulosa, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio, óxido de magnesio, sales de sodio y calcio de ácidos fosfórico y sulfúrico, gelatina, goma arábiga, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, y/o alcohol polivinílico, y después comprimirse o encapsularse para una administración conveniente. Dichas cápsulas o comprimidos pueden contener una formulación de liberación controlada que se puede proporcionar en una dispersión del compuesto activo en hidroxipropilmetil celulosa.
Las composiciones farmacéuticas de esta divulgación comprenden al menos un compuesto de fórmula (I) y/o al menos una de sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y opcionalmente otro agente seleccionado de cualquier portador, adyuvante y vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones alternativas de esta divulgación comprenden un compuesto de fórmula (I) descrito en el presente documento, o un profármaco del mismo, y un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los compuestos de la divulgación inhiben la interacción PD-1/PD-L1 proteína/proteína en un bloqueo de PD-L1. El bloqueo de PD-L1 puede potenciar la respuesta inmunitaria a células cancerosas y las enfermedades infecciosas en mamíferos, incluyendo seres humanos.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere al tratamiento de un sujetoin vivoutilizando un compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo de tal manera que se inhiba el crecimiento de tumores cancerosos. Un compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo se puede usar solo, para inhibir el crecimiento de tumores cancerosos. Como alternativa, un compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo se puede usar junto con otros agentes inmunogénicos o tratamientos convencionales contra el cáncer, como se describe a continuación.
En una realización, la divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo para su uso en la inhibición de crecimiento de células tumorales en un sujeto.
En una realización, se proporciona un compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo para su uso en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de cánceres incluyen aquellos cuyo crecimiento se puede inhibir usando compuestos de la divulgación incluyen cánceres que responden habitualmente a inmunoterapia. Los ejemplos no limitantes de cánceres preferidos para tratamiento incluyen melanoma (por ejemplo, melanoma metastásico maligno), cáncer renal (por ejemplo., carcinoma de células claras), cáncer de próstata (por ejemplo., adenocarcinoma de próstata resistente a hormonas), cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón no microcítico).
Adicionalmente, la divulgación incluye neoplasias resistentes o recurrentes cuyo crecimiento se puede inhibir usando los compuestos de la divulgación.
Los ejemplos de otros cánceres que pueden tratarse usando los métodos de la divulgación incluyen cáncer de hueso, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la uretra, cáncer del pene, leucemias crónicas o agudas, incluyendo leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, tumores sólidos de la infancia, linfoma linfocítico, cáncer de la vejiga, cáncer del riñón o la uretra, carcinoma de la pelvis renal, neoplasia del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma hipofisario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de linfocitos T, cánceres inducidos ambientalmente incluyendo aquellos inducidos por amianto y combinaciones de dichos cánceres. La presente divulgación también es útil para el tratamiento de cánceres metastásicos, en especial cánceres metastásicos que expresan PD-L1 (Iwaiet al.(2005) Int. Immunol. 17: 133-144).
Opcionalmente, los compuestos de Fórmula (I) o sales de los mismos pueden combinarse con otro agente inmunogénico, tal como células cancerosas, antígenos tumorales purificados (incluyendo proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidratos), células y células transfectadas con genes que codifican citoquinas inmunoestimulantes (Heet al.(2004)J. Immunol.173:4919-28). Los ejemplos no limitantes de vacunas tumorales que se pueden usar incluyen péptidos de antígenos de melanoma, tales como péptidos de gp 100, antígenos MAGE, Trp-2, MART1 y/o tirosinasa, o células tumorales transfectadas para expresar la citocina GM-CSF. En los seres humanos, se ha demostrado que algunos tumores son inmunogénicos tales como los melanomas. Se anticipa que al elevar el umbral de activación de linfocitos T por bloqueo de PD-L1, se espera que las respuestas tumorales se activen en el hospedador.
El bloqueo PD-L1 puede combinarse con un protocolo de vacunación. Se han ideado muchas estrategias experimentales para la vacunación contra tumores (véase Rosenberg, S., 2000, "Development of Cancer Vaccines", ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D.
2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; véase también Restifo, N. y Sznol, M., "Cancer Vaccines", cap. 61, págs. 3023-3043 en DeVita, V.et al.(eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology. Quinta Edición). En una de estas estrategias, se prepara una vacuna usando células tumorales autólogas o alogénicas. Se ha demostrado que estas vacunas celulares son más eficaces cuando las células tumorales se someten a transducción para expresar GM-CSF. Se ha demostrado que el GM-CSF es un potente activador de la presentación de antígenos para la vacunación de tumores (Dranoffet al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 3539-43).
El estudio de la expresión génica y los patrones de expresión génica a gran escala en diversos tumores ha conducido a la definición de los denominados antígenos específicos de tumor (Rosenberg, S A (1999) Immunity 10: 281-7). En muchos casos, estos antígenos específicos de tumor son antígenos de diferenciación expresados en los tumores y en la célula de la que se originó el tumor, por ejemplo, antígenos de melanocitos gp100, antígenos MAGE y Trp-2. De forma más importante, se puede demostrar que muchos de estos antígenos son las dianas de linfocitos T específicos a tumor encontrados en el hospedador. El bloqueo de PD-L1 se puede usar junto con una colección de proteínas recombinantes y péptidos expresados en un tumor para generar una respuesta inmunitaria a estas proteínas. Estas proteínas son normalmente vistas por el sistema inmunitario como antígenos propios y por lo tanto, son tolerantes a ellos. El antígeno tumoral también puede incluir la proteína telomerasa, que se requiere para la síntesis de telómeros de cromosomas y que se expresa en más del 85 % de los cánceres humanos y en solo un número limitado de tejidos somáticos (Kim, Net al.(1994) Science 266: 2011-2013). (Estos tejidos somáticos pueden protegerse del ataque inmunitario por diversos medios). El antígeno tumoral también puede ser "neo-antígenos" expresados en células cancerosas debido a mutaciones somáticas que alteran la secuencia proteica o crean proteínas de fusión entre dos secuencias no relacionadas (es decir, bcr-abl en el cromosoma Filadelfia), o idiotipo de tumores de linfocitos B.
Otras vacunas de tumores pueden incluir las proteínas de virus implicados en cánceres humanos tales como virus del papiloma humano (HPV), virus de la hepatitis (VHB, VHD y VHC) y virus del herpes sarcoma de Kaposi (KHSV). Otra forma de antígeno específico de tumor que se puede usar junto con el bloqueo de PD-L1 se purifica proteínas de choque térmico (HSP) aisladas del tejido tumoral. Estas proteínas de choque térmico contienen fragmentos de proteínas de las células tumorales y estas HSP son altamente eficientes en la administración a las células que presentan antígeno para provocar la inmunidad tumoral (Suot, R y Srivastava, P (1995) Science 269:1585-1588; Tamura, Y.et al.(1997) Science 278:117-120).
Las células dendríticas (CD) son potentes células presentadoras de antígeno que pueden usarse para preparar respuestas específicas de antígeno. Las CD pueden producirseex vivoy cargarse con diversos antígenos proteicos y peptídicos, así como con extractos de células tumorales (Nestle, F.et al.(1998) Nature Medicine 4: 328-332). Las CD también pueden ser transducidas por medios genéticos para expresar también estos antígenos tumorales. Las CD también se han fusionado directamente a células tumorales con el propósito de inmunización (Kugler, A.et al.(2000) Nature Medicine 6:332-336). Como método de vacunación, la inmunización con DC puede combinarse eficazmente con el bloqueo de PD-L1 para activar respuestas antitumorales más potentes.
El bloqueo de PD-L1 también se puede combinar con tratamientos convencionales contra el cáncer. El bloqueo de PD-L1 puede combinarse eficazmente con regímenes quimioterapéuticos. En estos casos, puede ser posible reducir la dosis de reactivo quimioterapéutico administrado (Mokyr, M.et al.(1998) Cancer Research 58: 5301-5304). Un ejemplo de dicha combinación es un compuesto de esta divulgación en combinación con dacarbazina para el tratamiento de melanoma. Otro ejemplo de dicha combinación es un compuesto de esta divulgación en combinación con interleucina-2 (IL-2) para el tratamiento de melanoma. El fundamento científico detrás del uso combinado de bloqueo de PD-L1 y quimioterapia es que la muerte celular, que es una consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los compuestos quimioterapéuticos, debería dar lugar a niveles incrementados de antígeno tumoral en la ruta de presentación del antígeno. Otras terapias combinadas que pueden dar como resultado una sinergia con el bloqueo de PD-L1 a través de la muerte celular son la radiación, cirugía y privación de hormonas. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral en el hospedador. Los inhibidores de la angiogénesis también pueden combinarse con el bloqueo de PD-L1. La inhibición de la angiogénesis conduce a la muerte de células tumorales que pueden alimentar el antígeno tumoral en las rutas de presentación del antígeno hospedador.
Los compuestos de esta descripción también pueden usarse en combinación con compuestos biespecíficos que dirigen las células efectoras que expresan receptores Fc alfa o Fc gamma a células tumorales (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5.922.845 y 5.837.243). Se pueden usar compuestos biespecíficos para dirigir dos antígenos separados. Por ejemplo, se han usado compuestos biespecíficos del receptor anti-Fc/antígeno anti-tumor (por ejemplo, Her-2/neu) para dirigir macrófagos a sitios de tumor. Este direccionamiento puede activar más eficazmente las respuestas tumorales específicas. El brazo de linfocitos T de estas respuestas se vería aumentado por el uso del bloqueo de PD-L1. Como alternativa, el antígeno puede administrarse directamente a las DC mediante el uso de compuestos biespecíficos que se unen al antígeno tumoral y un marcador de superficie celular específico de células dendríticas.
Los tumores evaden la vigilancia inmunitaria del hospedador por una gran diversidad de mecanismos. Muchos de estos mecanismos pueden ser superados por la inactivación de proteínas que son expresadas por los tumores y que son inmunosupresoras. Estas incluyen, entre otras, TGF-beta (Kehrl, J.et al.(1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard, M. y O'Garra, A. (1992) Immunology Today 13: 198-200) y ligando Fas (Hahne, M.et al.(1996) Science 274: 1363-1365). Los inhibidores que se unen y bloquean cada una de estas entidades pueden usarse junto con los compuestos de esta divulgación para contrarrestar los efectos del agente inmunosupresor y favorecer las respuestas inmunitarias del tumor por parte del hospedador.
Los compuestos que activan la capacidad de respuesta inmunitaria del hospedador pueden usarse junto con bloqueo de PD-L1. Estos incluyen moléculas en la superficie de las células dendríticas que activan la función DC y la presentación del antígeno. Los compuestos anti-CD40 son capaces de sustituir eficazmente la actividad de los linfocitos T colaboradores (Ridge, J.et al.(1998) Nature 393: 474-478) y se puede utilizar junto con el bloqueo de PD-L1. (Ito, N.et al.(2000) Immunobiology 201 (5) 527-40). Los compuestos activadores de moléculas coestimuladoras de linfocitos T, como CTLA-4 (por ejemplo, patente de los Estados Unidos n.° 5.811.097), OX-40 (Weinberg, A.et al.(2000) Immunol 164: 2160-2169), 4-1BB (Melero, I.et al.(1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997) eICOS(Hutloff, A.et al.(1999) Nature 397: 262-266) también pueden proporcionar niveles aumentados de activación de linfocitos T.
El trasplante de médula ósea se utiliza actualmente para tratar una diversidad de tumores de origen hematopoyético. Mientras que la enfermedad del injerto contra hospedador es una consecuencia de este tratamiento, el beneficio terapéutico puede obtenerse a partir de respuestas de injerto frente a tumor. El bloqueo de PD-L1 se puede usar para aumentar la eficacia de los linfocitos T específicos de tumor injertados de donante.
Otros métodos de la divulgación se usan para tratar pacientes que han estado expuestos a toxinas o patógenos particulares. Por consiguiente, otro aspecto de la divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I) o sales del mismo para su uso en el tratamiento de una enfermedad infecciosa en un sujeto.
De manera similar a su aplicación a los tumores como se ha analizado anteriormente, el compuesto de Fórmula (I) o sales del mismo, se puede usar en solo, o como coadyuvante, en combinación con vacunas, para estimular la respuesta inmunitaria a patógenos, toxinas y auto-antígenos. Los ejemplos de agentes patógenos para los que este enfoque terapéutico puede ser particularmente útil, incluyen patógenos para los que actualmente no existe una vacuna eficaz, o patógenos para los cuales las vacunas convencionales son menos que completamente eficaces. Estos incluyen, pero sin limitación, VIH, Hepatitis (A, B, C o D), gripe, Herpes, Giardia, malaria,Leishmania, Staphylococcus aureus, Pseudomonas Aeruginosa.El bloqueo de PD-L1 es particularmente útil contra infecciones establecidas por agentes tales como VIH que presentan antígenos alterados durante el curso de las infecciones. Estos nuevos epítopos se reconocen como extraños en el momento de la administración, provocando así una fuerte respuesta de linfocitos T que no se ve atenuada por señales negativas a través de PD-1.
Algunos ejemplos de virus patógenos que causan infecciones tratables mediante métodos de la divulgación incluyen VIH, hepatitis (A, B, C, o D), herpes virus (por ejemplo, VVZ, HSV-1, HAV-6, HHv-7, HHV-8, HSV-2, CMV y virus de Epstein-Barr), adenovirus, virus de la gripe, flavivirus, ecovirus, rinovirus, virus coxsackie, cornovirus, virus sincitial respiratorio, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubeola, parvovirus, virus vaccinia, virus HTLV, virus del dengue, virus del papiloma, virus de molusco, poliovirus, virus de la rabia, virus JC y virus de la encefalitis arbovírica.
Algunos ejemplos de bacterias patógenas que causan infecciones tratables mediante procedimientos de la divulgación incluyen clamidia, bacterias rickettsiales, micobacterias, estafilococos, estreptococos, neumonococos, meningococos y conococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonela, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, carbunco, peste, leptospirosis y bacterias de la enfermedad de Lyme.
Algunos ejemplos de hongos patógenos que causan infecciones tratables mediante los procedimientos de la divulgación incluyen Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.),Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger,etc.),Genus Mucorales (mucor, absidia, rhizophus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitiseHistoplasma capsulatum.
Algunos ejemplos de parásitos patógenos que causan infecciones tratables mediante los procedimientos de la divulgación incluyenEntamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoebasp.,Giardia lambia, Cryptosporidiumsp.,Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondiyNippostrongylus brasiliensis.
En todos los métodos anteriores, el bloqueo de PD-L1 puede combinarse con otras formas de inmunoterapia tales como tratamiento con citocinas (por ejemplo, interferones, GM-CSF, G-CSF, IL-2) o terapia de anticuerpos biespecíficos, que proporciona una presentación de antígenos tumorales potenciada (véase, por ejemplo, Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123), vacunas o agentes que modifican la expresión génica.
Los compuestos de la presente divulgación pueden provocar y amplificar respuestas autoinmunitarias. En efecto, la inducción de respuestas antitumorales usando vacunas de células tumorales y péptidos revela que muchas respuestas antitumorales implican antirreactividades (despigmentación observada en el melanoma B 16 modificado con anti-CTLA-4+GM-CSF, en van Elsaset al.,citado anteriormente; despigmentación en ratones vacunados con Trp-2 (Overwijk, W.et al.(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2982-2987); prostatitis autoinmunitaria evocada por vacunas de células tumorales TRAMP (Hurwitz, A. (2000) citado anteriormente), la vacunación con antígenos de péptidos de melanoma y el vitíligo observado en ensayos clínicos en seres humanos (Rosenberg, S A y White, D E (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1): 81-4).
Por lo tanto, es posible considerar el uso del bloqueo anti-PD-L1 junto con diversas autoproteínas para diseñar protocolos de vacunación para generar eficazmente respuestas inmunitarias contra estas autoproteínas para el tratamiento de la enfermedad. Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer implica una acumulación inapropiada de péptido A.beta. en depósitos amiloides en el cerebro; las respuestas de anticuerpos contra el amiloide son capaces de eliminar estos depósitos amiloides (Schenket al.,(1999) Nature 400: 173-177).
Otras autoproteínas también pueden usarse como dianas tales como IgE para el tratamiento de alergia y asma, y TNF.alfa. para la artritis reumatoide. Finalmente, pueden inducirse respuestas de anticuerpos a diversas hormonas mediante el uso de un compuesto de Fórmula (I) o sales del mismo. Para la anticoncepción se pueden utilizar respuestas de anticuerpos neutralizantes a hormonas reproductivas. La respuesta de anticuerpos neutralizantes a hormonas y otros factores solubles que se requieren para el crecimiento de tumores particulares también pueden considerarse como posibles dianas de vacunación.
Pueden usarse métodos análogos como se ha descrito anteriormente para el uso del anticuerpo anti-PD-L1 para la inducción de respuestas terapéuticas autoinmunitarias para tratar pacientes que tienen una acumulación inapropiada de otros autoantígenos, tales como depósitos amiloides, incluyendo A-beta en la enfermedad de Alzheimer, citocinas tales como TNF-alfa e IgE.
Los compuestos de la presente divulgación se pueden usar para estimular respuestas inmunitarias específicas de antígeno por coadministración de un compuesto de Fórmula (I) o sales del mismo con un antígeno de interés (por ejemplo, una vacuna). Por consiguiente, en otro aspecto la divulgación proporciona (i) el antígeno; y (ii) un compuesto de fórmula (I) o sales del mismo para su uso en la potenciación de una respuesta inmunitaria al antígeno en un sujeto, de forma que se potencia una respuesta inmunitaria al antígeno en el sujeto. El antígeno puede ser, por ejemplo, un antígeno tumoral, un antígeno vírico, un antígeno bacteriano o un antígeno de un patógeno. Los ejemplos no limitativos de tales antígenos incluyen los analizados en las secciones anteriores, tales como los antígenos tumorales (o vacunas tumorales) analizados anteriormente, o antígenos de los virus, bacterias u otros patógenos descritos anteriormente.
Como se ha descrito anteriormente, los compuestos de la divulgación pueden coadministrarse con uno o más agentes terapéuticos, por ejemplo, un agente citotóxico, un agente radiotóxico o un agente inmunosupresor. Los compuestos de la divulgación pueden administrarse antes, después o simultáneamente con el otro agente terapéutico o pueden coadministrarse con otras terapias conocidas, por ejemplo, una terapia contra el cáncer, por ejemplo, radiación. Dichos agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes antineoplásicos tales como doxorrubicina (adriamicina), cisplatino bleomicina sulfato, carmustina, clorambucilo, descarbazina y ciclofosfamida hidroxiurea que, por sí solas, son solamente eficaces a niveles que son tóxicos o subtóxicos para un paciente. El cisplatino se administra por vía intravenosa como una dosis de 100 mg/dosis una vez cada cuatro semanas y la adriamicina se administra por vía intravenosa en forma de una dosis de 60-75 mg/ml una vez cada 21 días. La coadministración de un compuesto de Fórmula (I) o sales del mismo, con agentes quimioterapéuticos proporciona dos agentes anticancerosos que actúan a través de diferentes mecanismos que producen un efecto citotóxico a las células tumorales humanas. Dicha coadministración puede resolver problemas debidos al desarrollo de resistencia a fármacos o a un cambio en la antigenicidad de las células tumorales que las hará no reactivas con el anticuerpo.
Los compuestos descritos en el presente documento también se pueden usar en el tratamiento de la septicemia grave o el choque séptico.
También dentro del alcance de la presente divulgación se encuentran kits que comprenden un compuesto de Fórmula (I) o sales del mismo e instrucciones de uso. El kit puede contener además al menos un reactivo adicional. Los kits incluyen normalmente un texto informativo que indica el uso pretendido de los contenidos del kit. El término etiqueta incluye cualquier material escrito o grabado suministrado en o con el kit, o que de otro modo acompaña al kit.
Los anteriores otros agentes terapéuticos, cuando se emplean en combinación con los compuestos de la presente divulgación, se pueden usar, por ejemplo, en las cantidades indicadas en "Physicians' Desk Reference" (PDR) o como se determina de otro modo por un experto en la materia. En las realizaciones de la presente divulgación, dicho uno o más agentes terapéuticos diferentes pueden administrarse antes de, simultáneamente con o después de la administración de los compuestos de la invención.
Ejemplos
La invención se define además en los siguientes ejemplos. Debe entenderse que los ejemplos se dan a modo de ilustración solamente. Como resultado, la invención no está limitada por los ejemplos a modo de ilustración expuestos a continuación, sino que se define por las reivindicaciones adjuntas a la presente.
Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, los siguientes términos tienen los significados indicados: Me para metilo; TEA para trietilamina; Bu para butilo; THF para tetrahidrofurano; DIAD para azodicarboxilato de diisopropilo; Ph para fenilo; tBu o t-Bu para tere-butilo; DMF para N,N-dimetilformamida; TFA para ácido trifluoroacético; DCM para diclorometano; BOC o Boc para tere-butoxicarbonilo; DMSO para dimetilsulfóxido; EtOAc para acetato de etilo; h para horas; min para minutos; s para segundos; TA o ta o tA para temperatura ambiente; TR o tr o tR para tiempo de retención; TMS para trimetilsililo; MeOH para metanol; AcOH para ácido acético; NCS para N-clorosuccinimida; OAc para acetato; sat. o satd. para saturado; y evap. para evaporado.
En el esquema a continuación se muestra un método para la preparación del ejemplo de ref. 1001 y el ejemplo 1002.
Tanto 6,8-dimetoxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-carboxilato de tere-butilo como 1,2,3,4-tetrahidroisoquinoMn-6,8-diol se pueden preparar a partir de 2-(3,5-dimetoxifenil)etan-1-amina según el esquema mostrado a continuación:
Produeto intermedio:1,2,3,4-tetramdroisoquinolin-6,8-diol • HBr
Se recogió 6,8-dimetoxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina • HCl (1,0 g, 4,35 mmol) en bromuro de hidrógeno acuoso al 48 % (30 ml) y se agitó durante 16 h a 95 °C en un recipiente cerrado herméticamente. Después, la mezcla se enfrió y se concentró para producir el producto en bruto, 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-6,8-diol • HBr (1,07 g, 4,35 mmol, 100 % de rendimiento) en forma de un sólido de color naranja rojizo, que se usó directamente más adelante. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 59,72 (s, 1H), 9,25 (s a, 1H), 8,85 (s a, 2H), 6,23 (d,J= 2,1 Hz, 1H), 6,08 (d,J= 2,0 Hz, 1H), 3,95 (t,J= 4,6 Hz, 2H), 3,29 (d,J= 6,0 Hz, 2H), 2,83 (t,J= 6,1 Hz, 2H). LCMS: tR (tiempo de retención) = 0,53 min; LCMS (ESI) m/z calc. para C9Hi2NO2: 166,09, encontrado: 166,00 [M+H]+. Condiciones de LCMS: Waters Acquity UPLC B<e>H 1,7^m C18, 2,1 x 50 mm, donde la fase móvil A era agua al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05 %; la fase móvil B era acetonitrilo al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05 %, a una temperatura de 40 °C, a un gradiente del 2-98 % de B durante 1,5 minutos, a un caudal de 0,8 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm.
Produeto intermedio:2-(6,8-dihidroxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de tere-butilo
Se anadió 2-bromoacetato de tere-butilo (0,64 ml, 4,35 mmol) a una solución purgado con nitrógeno de 1,2,3,4tetrahidroisoquinolin-6,8-diol • HBr (1,07 g, 4,35 mmol) y trietilamina anhidra (1,82 ml, 13,05 mmol) en THF seco (70 ml) y la mezcla se agitó durante 3 h a 24 °C antes de diluirla con EtOAc, se lavó con agua y salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró. El residuo recogido en una pequeña cantidad de DCM se cargó después en una columna de gel de sílice RediSepRf de fase normal Teledyne<i>S<c>O 40 g, desechable, que se eluyó primero con 0 % de B a 0 % de B para 60 ml, seguido del 5 % de B al 100 % de B para 600 ml, donde el disolvente B = acetato de etilo y el disolvente A = hexanos. Después de la concentración del eluyente, se aisló el producto, 2-(6,8-dihidroxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de tere-butilo (0,94 g, 77% de rendimiento) en forma de una espuma de color blanco. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 56,09 (s a, 1H), 5,96 (s a, 1H), 3,51-3,35 (2m, 4H), 2,68-2,59 (m, 2H), 1,71 (s, 2H), 1,42 (s, 9H). LCMS: tR = 0,69 min; LCMS (ESI)m/zcalc. para C15H22NO4: 280,16, encontrado: 280,00 [M+H]+. Condiciones de L<c>MS: Waters Acquity UPLC<b>E<h>1,7^m C18, 2,1 * 50 mm, donde la fase móvil A era agua al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05 %; la fase móvil B era acetonitrilo al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05 %, a una temperatura de 40 °C, a un gradiente del 2-98 % de B durante 1,5 minutos, a un caudal de 0,8 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm.
Produeto intermedio:2-(6-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-8-hidroxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de tere-butilo
Se añadió diazen-1,2-dicarboxilato de diisopropilo (DIAD) (0,21 ml, 1,07 mmol) gota a gota a una solución de 2-(6,8-dihidroxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de tere-butilo (300 mg, 1,07 mmol), (3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilfenil)metanol (275 mg, 1,07 mmol) y trifenilfosfina (282 mg, 1,07 mmol) en THF seco (5 ml) a 0 °C. La solución de color amarillo resultante (en la adición de DIAD) se dejó calentar hasta ta, donde se agitó durante 16 h antes de concentrarla. El residuo se recogió en una pequeña cantidad de DCM y se cargó en una columna de gel de sílice RediSepRf de fase normal Teledyne ISCO 40 g, desechable, que se eluyó primero con 0 % de B a 0 % de B para 60 ml seguido de 0 % de B a 100 % de B para 600 ml, donde el disolvente B = acetato de etilo y el disolvente A = hexanos. Después de la concentración del eluyente, se aisló el producto, 2-(6-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-8-hidroxi-3,4-dihidro-isoquinolin-2(1H)-il)acetato de tere-butilo (112 mg, 20 % de rendimiento) en forma de una espuma de color amarillo claro. (La proporción del regioisómero, 2-(8-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-6-hidroxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de tere-butilo, al producto deseado en la muestra no se determinó.) LCMS: tR = 1,10 min; LCMS (ESI)m/zcalc. para C3iH36NO6: 518,26, encontrado: 518,25 [M+H]+. Condiciones de<l>C<m>S: Waters Acquity UPLC BEH 1,7 ^m C18, 2,1 x 50 mm, donde la fase móvil A era 100 % de agua con ácido trifluoroacético al 0,05 %; la fase móvil B era acetonitrilo al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05 %, a una temperatura de 40 °C, a un gradiente del 2-98 % de B durante 1,5 minutos, a un caudal de 0,8 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm.
Produeto intermedio:2-(8-((5-cianopiridin-3-il)metoxi)-6-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de tere-butilo • t Fa y el regioisómero 2-(6-((5-cianopiridin-3-il)metoxi)-8-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de tere-butilo • TFA
Se añadió carbonato de cesio (120 mg, 0,37 mmol) en una porción a una solución en agitación de 2-(6-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)-oxi)-8-hidroxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de tere-butilo preparada anteriormente (425 mg, 0,246 mmol) y 5-(clorometil)nicotinonitrilo (41 mg, 0,27 mmol) en DMF seca (2 ml). La suspensión se agitó a ta durante 16 h antes de eliminar el disolvente al vacío, y el residuo se repartió entre acetato de etilo y agua. La fase acuosa se separó y se extrajo una vez más con EtOAc. Los extractos orgánicos se combinaron y se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron para producir un residuo que después se diluyó con metanol (2 ml), se filtró a través de un filtro de jeringa de PVDF Whatman de 13 mm (45 ^M), se colocó en un vial para pHPLC (2 ml) y se purificó por HPLC preparativa de fase inversa un cuatro porciones (del 0 % de B al 100 % de B durante 25 min de gradiente a 40 ml/min) usando una columna Waters-SunFire (30 x 100 mm, S5), donde el disolvente B = 90 % de CH3CN-10 % de H2O-TFA al 0,1 % y el disolvente A = 5 % de c H3CN-95 % de H2O-TFA al 0,1 %. Después de una evaporación rápida al vacío de los tubos de ensayo, se aisló el producto, 2-(8-((5-cianopiridin-3-il)metoxi)-6-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de tere-butilo • t Fa y sus regioisómeros (56,3 mg, 0,075 mmol, 30,6 % de rendimiento) en forma de un sólido de color blanco. (No se determinó la proporción de los dos regioisómeros en la muestra) RMN 1H de la mezcla (500 MHz, CDCl3) 58,94-8,91 (2m, 2H), 8,17 y 8,09 (2m, 1H), 7,40-7,36 y 7,35-7,32 (2m, 1H), 7,27-7,26 (2m, 2H), 6,95-6,94 y 6,93-6,92 (2m, 1H), 6,85-6,84 y 6,84-6,83 (2m, 1H), 6,81-6,80 y 6,79-6,78 (2m, 1H), 6,60-6,59 y 6,54-6,53 (2m, 1H), 6,49 y 6,41-6,40 (2m, 1H), 5,16 y 5,15 (2s, 2H), 5,10 y 5,07 (2s, 2H), 4,33 (s, 4H), 4,03 y 4,00 (2s, 2H), 3,85 3,50 (m a, 3H), 3,40-3,00 (m a, 3H), 2,28 y 2,26 (2s, 3H), 1,52 y 1,49 (2s, 9H). LCMS: tR = 1,17 min; LCMS (ESI) m/z calc. para C38H40N3O6: 634,29, encontrado: 634,30 [M+H]+. Condiciones de lCm S: Waters Acquity UPLC BEH 1,7 ^m C18, 2,1 x 50 mm, donde la fase móvil A era 100 % de agua con ácido trifluoroacético al 0,05 %; la fase móvil B era acetonitrilo al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05 %, a una temperatura de 40 °C, a un gradiente del 2-98 % de B durante 1,5 minutos, a un caudal de 0,8 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm.
Ejemplo de ref. 1001:ácido 2-(8-((5-cianopiridin-3-il)metoxi)-6-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)-oxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acético • 2 TFA
Se añadió TFA (0,2 ml, 2,60 mmol) a una solución en agitación de 2-(8-((5-cianopiridin-3-il)metoxi)-6-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de tere-butilo preparada anteriormente (15 mg, 0,024 mmol) en DCM seco (1 ml). La mezcla se agitó a ta durante un total de 7 h antes de concentrarla y purificarla mediante LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 10-70 % de B durante 30 minutos, después una retención de 5 minutos al 100% de B; Caudal: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. Se aisló ácido 2-(8-((5-cianopiridin-3-il)metoxi)-6-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acético (3,5 mg, 18%) y su pureza estimada mediante análisis por LCMS fue del 96 %. RMN 1H (500 MHz, DMSo-d6) 58,94 (s a, 2h ), 8,31 (s a, 1H), 7,39 (s a, 1H), 7,31-7,09 (m, 2H), 6,90 (s a, 1H), 6,75 (s a, 2H), 6,61 (s a, 1H), 6,50 (s a, 1H), 5,23 (s a, 2H), 5,08 (s a, 2H), 4,28 (s a, 4H), 3,67 (s a, 2H), 2,93-2,52 (2m, 6H), 2,19 (s a, 3H); LCMS: tR = 1,04 min; LCMS (ESI)m/zcalc. para C34H32N3O6: 578,23, encontrado: 578,25 [M+H]+. Condiciones de lCm S: Waters Acquity UPLC BEH 1,7^m C18, 2,1 x 50 mm, donde la fase móvil A era agua al 100% con ácido trifluoroacético al 0,05%; la fase móvil B era acetonitrilo al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05 %, a una temperatura de 40 °C, a un gradiente del 2-98 % de B durante 1,5 minutos, a un caudal de 0,8 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm. Se usaron dos inyecciones de LC/MS analítica para determinar la pureza final. Condiciones de la inyección 1: Waters Acquity UPLC<b>E<h>1,7 ^m C18, 2,1 x 50 mm, donde la fase móvil A era 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; la fase móvil B era 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM, a una temperatura de 50 °C, a un gradiente de B al 0-100 % durante 3 minutos, con una retención de 0,75 minutos al 100 % de B, a un caudal de 1,0 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm. Condiciones de la inyección 2: Waters Acquity UPLC BEH 1,7 ^m C18, 2,1 x 50 mm, donde la fase móvil A era 5:95 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; la fase móvil B era 95:5 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %, a una temperatura de 50 °C, a un gradiente de B al 0-100% durante 3 minutos, con una retención de 0,75 minutos en B al 100 %, a un caudal de 1,0 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm.
Condición del análisis 1: Tiempo de retención = 1,796 min; ESI-MS (+)m/z= 578,0 (M+H)+.
Condición del análisis 2: Tiempo de retención = 1,747 min; ESI-MS (+)m/z= 578,0 (m h)+.
Ejemplo 1002:ácido 2-(6-((5-cianopiridin-3-il)metoxi)-8-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]-dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-3,4-dihidroiso-quinolin-2(1H)-il)acético • 2 TFA
El ácido 2-(6-((5-cianopiridin-3-il)metoxi)-8-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acético (3,9 mg, 20 %) se aisló también de la mezcla de reacción anterior del ejemplo 1001. La pureza estimada mediante análisis L<c>M<s>fue del 96 %. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 58,97 (dd,J= 14,7, 1,8 Hz, 2H), 8,37 (s, 1H), 7,39 (d,J= 7,7 Hz, 1H), 7,24 (s, 1H), 7,17 (d,J= 7,3 Hz, 1H), 6,92 (d,J= 8,1 Hz, 1H), 6,81-6,73 (m, 2H), 6,69 (d,J= 2,2 Hz, 1H), 6,48 (d,J= 1,8 Hz, 1H), 5,22 (s, 2H), 5,13 (s, 2H), 4,29 (s, 4H), 3,65 (s, 2H), 2,87-2,78 (m, 4H), 2,55 (s, 2H), 2,22 (s, 3H); LCMS: tR = 1,02; LCMS (ESI) m/z calc. para C34H32N3O6: 578,23, encontrado: 578,25 [m H]+. Condiciones de lCm S: Waters Acquity UPLC Be H 1,7^m C18, 2,1 * 50 mm, donde la fase móvil A era agua al 100% con ácido trifluoroacético al 0,05%; la fase móvil B era acetonitrilo al 100% con ácido trifluoroacético al 0,05 %, a una temperatura de 40 °C, a un gradiente del 2-98 % de B durante 1,5 minutos, a un caudal de 0,8 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm. Se usaron dos inyecciones de LC/MS analítica para determinar la pureza final. Condiciones de la inyección 1: Waters Acquity UPLC BEH 1,7 ^m C18, 2,1 * 50 mm, donde la fase móvil A era 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico al 10 mM; la fase móvil B era 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM, a una temperatura de 50 °C, a un gradiente de B al 0-100 % durante 3 minutos, con una retención de 0,75 minutos al 100 % de B, a un caudal de 1,0 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm. Condiciones de la inyección 2: Waters Acquity UPLC BEH 1,7 ^m C18, 2,1 * 50 mm, donde la fase móvil A era 5:95 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; la fase móvil B era 95:5 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %, a una temperatura de 50 °C, a un gradiente de B al 0-100 % durante 3 minutos, con una retención de 0,75 minutos en B al 100 %, a un caudal de 1,0 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm. Condición del análisis 1: Tiempo de retención = 1,743 min; ESI-MS (+)m/z= 578,0 (M+H)+.
Condición del análisis 2: Tiempo de retención = 1,704 min; ESI-MS (+)m/z= 578,0 (m h )+.
Ejemplo de ref. 1003:ácido 2-(6-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-8-hidroxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acético
La pureza estimada mediante análisis LCMS fue del 96 %. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 57,40-7,35 (m, 1H), 7,24 (s, 1H), 7,16 (s, 1H), 6,92 (d,J= 8,1 Hz, 1H), 6,81-6,73 (m, 2H), 6,34 (s, 1H), 6,15 (s, 1H), 5,05 (s, 2H), 4,29 (s, 4H), 3,58 (s, 2H), 3,15-3,09 (m, 1H), 2,78-2,70 (serie de m, 5H), 2,20 (s, 3H). Se usaron dos inyecciones de LC/MS analítica para determinar la pureza final. Condiciones de la inyección 1: Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100% de B durante 3 minutos, después una retención de 0,75 minutos al 100 % de B; Caudal: 1,0 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Condiciones de la inyección 2: Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100 % de B durante 3 minutos, después una retención de 0,75 minutos al 100 % de B; Caudal: 1,0 ml/min; Detección: UV a 220 nm.
Condición del análisis 1: Tiempo de retención = 1,466 min; ESI-MS (+)m/z= 462,2 (M+H)+.
Condición del análisis 2: Tiempo de retención = 1,519 min; ESI-MS (+)m/z= 462,2 (m h )+.
A continuación se muestra un método para la preparación del ejemplo de ref. 1004 y el ejemplo de ref. 1005.
Producto intermedio: 7-hidroxi-3,4-dihidroisoquinolin-2,3(1H)-dicarboxilato de (R)-2-terc-butil 3-metilo
Se recogió ácido (R)-2-(terc-butoxicarbonil)-7-hidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico (650 mg, 2,22 mmol) en MeOH (4 ml) y se añadió gota a gota (diazometil)trimetilsilano 2 M en éter (1,1 ml, 2,22 mmol). La mezcla de reacción se agitó a ta durante 30 min antes de añadir otros 0,7 ml de (diazometil)trimetilsilano 2 M en éter para asegurar la compleción. La mezcla se dejó en agitación durante 1 h más antes de inactivarla con AcOH (0,1 ml) y concentrarla. El residuo se recogió en DCM y se lavó con solución semisaturada de NaHCO3, se secó sobre MgSO4 y se concentró para producir el producto (630 mg, 92 %). Una porción del producto se purificó de nuevo mediante LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: xBridge C18, 19 * 200 mm, partículas de 5 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 25-65 % de B durante 15 minutos, después una retención de 5 minutos al 100 % de B; Caudal: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 18,4 mg, y su pureza estimada mediante análisis LCMS fue del 100 %. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 57,06-6,93 (m, 1H), 6,62-6,50 (m, 2H), 4,89-4,58 (2m, 1H), 4,55 4,40 (m, 1H), 4,38-4,21 (m, 1H), 3,58 y 3,54 (2s, 3H), 3,11-2,86 (2m, 2H), 1,46 y 1,38 (2s, 9H). Se usaron dos inyecciones de LC/MS analítica para determinar la pureza final. Condiciones de la inyección 1: Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100 % de B durante 3 minutos, después una retención de 0,75 minutos al 100 % de B; Caudal: 1,0 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Condiciones de la inyección 2: Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1%; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100 % de B durante 3 minutos, después una retención de 0,75 minutos al 100 % de B; Caudal: 1,0 ml/min; Detección: UV a 220 nm.
Condición del análisis 1: Tiempo de retención = 1,575 min; ESI-MS (+) m/z = 330,0 (M+Na)+.
Condición del análisis 2: Tiempo de retención = 1,569 min; ESI-MS (+)m/z= 330,0 (M+Na)+.
Producto intermedio:7-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2,3(1H)-dicarboxilato de (R)-2-terc-butil 3-metilo
Se añadió diazen-1,2-dicarboxilato de diisopropilo (DIAD) (0,53 ml, 2,70 mmol) a una solución purgada con nitrógeno de 7-hidroxi-3,4-dihidroisoquinolin-2,3(1H)-dicarboxilato de (R)-2-terc-butil 3-metilo (755 mg, 2,46 mmol), (3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilfenil)metanol (630 mg, 2,46 mmol) y trifenilfosfina (709 mg, 2,70 mmol) en THF (2,5 ml) y la mezcla resultante se agitó durante 18 h a 24 °C antes de que se añadieran más trifenilfosfina (355 mg) y DIAD (0,37 ml) para asegurar que se completara la reacción. Después de agitar durante 16 h más a ta, la mezcla se concentró y el residuo en bruto se recogió en una pequeña cantidad de DCM y después se cargó en una columna de gel de sílice RediSepRf de fase normal Teledyne ISCO 40 g, desechable, que se eluyó con 5 % de B a 85 % de B para 1500 ml, donde el disolvente B = acetato de etilo y el disolvente A = hexanos. Después de la concentración del eluyente, se aisló el producto (245 mg, 18 %) y el material de partida recuperado (280 mg). Una porción del producto se purificó de nuevo mediante LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 * 200 mm, partículas de 5 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 30-100 % de B durante 20 minutos, después una retención de 5 minutos al 100% de B; Caudal: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 21,8 mg, y su pureza estimada mediante análisis L<c>M<s>fue del 100 %. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 57,40 (d,J= 7,3 Hz, 1H), 7,24 (t,J= 7,7 Hz, 1H), 7,16 (d,J= 6,6 Hz, 1H), 7,13-7,11 (m, 1H), 7,00-6,93 (2m, 1H), 6,92 (d,J= 8,1 Hz, 1H), 6,90 6,86 (m, 1H), 6,78 (d,J= 2,2 Hz, 1H), 6,75 (dd, J=8,1,2,2 Hz, 1H), 5,08 (s a, 2H), 4,93 y 4,66 (2m, 1H), 4,63-4,49 (m, 1H), 4,47-4,33 (m, 1H), 4,28 (s, 4H), 3,58 y 3,55 (2s, 3H), 3,47-3,37 (m, 1H), 3,16-2,93 (m, 2H), 2,19 (s, 3H), 1,46 y 1,38 (2s, 9H). Se usaron dos inyecciones de lC/MS analítica para determinar la pureza final. Condiciones de la inyección 1: Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100 % de B durante 3 minutos, después una retención de 0,75 minutos al 100 % de B; Caudal: 1,0 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Condiciones de la inyección 2: Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100 % de B durante 3 minutos, después una retención de 0,75 minutos al 100 % de B; Caudal: 1,0 ml/min; Detección: UV a 220 nm.
Condición del análisis 1: Tiempo de retención = 2,613 min; ESI-MS (+) m/z = 568,1 (M+Na)+.
Condición del análisis 2: Tiempo de retención = 2,597 min; ESI-MS (+)m/z= 568,1 (M+Na)+.
Producto intermedio:ácido (R)-2-(terc-butoxicarbonil)-7-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico
Se añadió hidróxido de litio monohidrato (17,3 mg, 0,41 mmol) a una solución de 7-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)-oxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2,3(1H)-dicarboxilato de (R)-2-terc-butil 3-metilo (75 mg, 0,14 mmol) en THF (2,5 ml) y agua (1 ml). La mezcla se agitó durante 36 h a 24 °C, antes de acidificarla con HCl 1 N (pH = 4) y diluir en EtOAc. La fase orgánica se separó, se lavó con salmuera y se secó sobre MgSO4 para producir el producto (70 mg, 96 %). El producto en bruto se volvió a purificar mediante LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 * 200 mm, partículas de 5 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 40-80 % de B durante 15 minutos, después una retención de 5 minutos al 100 % de B; Caudal: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 6,0 mg, y su pureza estimada mediante análisis LCMS fue del 92 %. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 5 7,40 (d,J= 7,3 Hz, 1H), 7,24 (s, 1H), 7,16 (d,J= 6,6 Hz, 1H), 7,13-7,07 (m, 1H), 6,97-6,91 (2m, 1H), 6,93-6,91 (m, 1H), 6,88-6,83 (m, 1H), 6,78 (d,J= 2,2 Hz, 1H), 6,77-6,73 (m, 1H), 5,08 (s, 2H), 4,83-4,35 (serie de m, 3H), 3,19-2,92 (m, 2H), 2,19 (s, 3H), 1,46-1,40 (2s, 9H). Se usaron dos inyecciones de LC/MS analítica para determinar la pureza final. Condiciones de la inyección 1: Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100 % de B durante 3 minutos, después una retención de 0,75 minutos al 100 % de B; Caudal: 1,0 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Condiciones de la inyección 2: Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100 % de B durante 3 minutos, después una retención de 0,75 minutos al 100 % de B; Caudal: 1,0 ml/min; Detección: UV a 220 nm.
Condición del análisis 1: Tiempo de retención = 1,971 min; ESI-MS (+)m/z= 530,1 (M+H)+.
Condición del análisis 2: Tiempo de retención = 3,235 min; ESI-MS (+)m/z= 530,1 (m h )+.
Ejemplo de ref. 1004:ácido (R)-7-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-1,2,3,4tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico
Se recogió ácido (R)-2-(terc-butoxicarbonil)-7-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico (66 mg, 0,12 mmol) en HCl 4 N en dioxano (5 ml) y se agitó durante 2 h a 24 °C. La mitad de la solución (2,5 ml) se eliminó de la mezcla de reacción y se neutralizó parcialmente con solución 1 N de NaOH, se filtró para eliminar el precipitado que se formó y se purificó mediante LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 ^m; Fase móvil A: 5:95 de metanol:agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol:agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 50-100 % de B durante 20 minutos, después una retención de 5 minutos al 100% de B; Caudal: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 5,4 mg (rendimiento del 20 %) y su pureza estimada mediante análisis por LCMS fue del 100 %. Se usaron dos inyecciones de LC/MS analítica para determinar la pureza final. Condiciones de la inyección 1: Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100 % de B durante 3 minutos, después una retención de 0,75 minutos al 100 % de B; Caudal: 1,0 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Condiciones de la inyección 2: Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1%; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100 % de B durante 3 minutos, después una retención de 0,75 minutos al 100 % de B; Caudal: 1,0 ml/min; Detección: UV a 220 nm.
Condición del análisis 1: Tiempo de retención = 1,582 min; ESI-MS (+) m/z = 432,0 (M+H)+.
Condición del análisis 2: Tiempo de retención = 1,675 min; ESI-MS (+)m/z= 432,0 (m h )+.
Producto intermedio:ácido (S)-2-(terc-butoxicarbonil)-7-hidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico
Se añadió BOC-anhídrido (1,20 ml, 5,18 mmol) a una solución de ácido (S)-7-hidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico (1,0 g, 5,18 mmol) y trietilamina (0,72 ml, 5,18 mmol) en dioxano (40 ml) y la mezcla se agitó durante 48 h a ta antes de diluirla con EtOAc y se lavó con solución 0,1 N de HCl, salmuera, se secó sobre Na2SO4 y se concentró para producir el producto (590 mg, 39%). LCMS: tR = 0,91 min; LCMS (ESl)m/zcalc. para C i5H2oNO5: 294,14, encontrado: 238,00 [M+H-tBu]+. Condiciones de LCMS: Waters Acquity UPLC B<e>H 1,7^m C18, 2,1 x 50 mm, donde la fase móvil A era agua al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05 %; la fase móvil B era acetonitrilo al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05 %, a una temperatura de 40 °C, a un gradiente del 2-98 % de B durante 1,5 minutos, a un caudal de 0,8 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm.
Producto intermedio:(S)-7-hidroxi-3,4-dihidroisoquinolin-2,3(1H)-dicarboxilato de 2-(terc-butil) 3-metilo
Se obtuvo (S)-7-hidroxi-3,4-dihidroisoquinolin-2,3(1H)-dicarboxilato de 2-(terc-butil) 3-metilo (313 mg, 50,5 %) a partir de ácido (S)-2-(terc-butoxicarbonil)-7-hidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico usando el procedimiento descrito para 7-hidroxi-3,4-dihidroisoquinolin-2,3(1H)-dicarboxilato de (R)-2-terc-butil 3-metilo. Una porción del producto se purificó de nuevo mediante LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: Waters Xbridge C-18, 19 x 200 mm, partículas de 5 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 25-65% de B durante 15 minutos, después una retención de 5 minutos al 100 % de B; Caudal: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 57,03 6,93 (m, 1H), 6,64-6,51 (2m, 2H), 4,94-4,58 (2m, 1H), 4,54-4,41 (m, 1H), 4,36-4,24 (m, 1H), 3,58 y 3,54 (2s, 3H), 3,09 2,87 (m, 2H), 1,46 y 1,38 (2s, 9H). El rendimiento del producto fue de 16,6 mg, y su pureza estimada mediante análisis LCMS fue del 100 %. Se usaron dos inyecciones de LC/MS analítica para determinar la pureza final. Condiciones de la inyección 1: Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100 % de B durante 3 minutos, después una retención de 0,75 minutos al 100 % de B; Caudal: 1,0 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Condiciones de la inyección 2: Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100 % de B durante 3 minutos, después una retención de 0,75 minutos al 100 % de B; Caudal: 1,0 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Condición del análisis 1: Tiempo de retención = 1,560 min; ESI-MS (+) m/z = 330,0 (M+Na)+. Condición del análisis 2: Tiempo de retención = 1,665 min; ESI-MS (+)m/z= 330,0 (M+Na)+.
Producto intermedio:3-metil-7-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2,3(1H)-dicarboxilato de (S)-2-terc-butilo
Se obtuvo 3-metil-7-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2,3(1H)-dicarboxilato (S)-2-terc-butilo (390 mg, 75 %) a partir de (S)-7-hidroxi-3,4-dihidroisoquinolin-2,3(1H)-dicarboxilato de 2-(terc-butil) 3-metilo y (3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilfenil)-metanol usando el procedimiento descrito para 7-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2,3(1H)-dicarboxilato de (R)-2-terc-butil 3-metilo. Una porción del producto se purificó de nuevo mediante LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 * 200 mm, partículas de 5 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 60 100 % de B durante 15 minutos, después una retención de 5 minutos al 100 % de B; Caudal: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 10,1 mg, y su pureza estimada mediante análisis LCMS fue del 97%. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 57,41 (d,J= 7,0 Hz, 1H), 7,24 (t,J= 7,5 Hz, 1H), 7,19-7,09 (m, 2H), 7,03-6,84 (m, 3H), 6,81 6,72 (m, 2H), 5,09 (s a, 2H), 4,97-4,64 (2m, 1H), 4,63-4,50 (m, 1H), 4,49-4,35 (m, 1H), 4,29 y 4,28 (2s, 4H), 3,59 y 3,55 (2s, 3H), 3,15-2,94 (2m, 2H), 2,21 y 2,20 (2s, 3H), 1,47 y 1,38 (2s, 9H). Se usaron dos inyecciones de LC/MS analítica para determinar la pureza final. Condiciones de la inyección 1: Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100% de B durante 3 minutos, después una retención de 0,75 minutos al 100% de B; Caudal: 1,0 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Condiciones de la inyección 2: Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100 % de B durante 3 minutos, después una retención de 0,75 minutos al 100 % de B; Caudal: 1,0 ml/min; Detección: UV a 220 nm.
Condición del análisis 1: Tiempo de retención = 2,601 min; ESI-MS (+)m/z= 568,1 (M+Na)+.
Condición del análisis 2: Tiempo de retención = 2,663 min; ESI-MS (+)m/z= 546,0 (<m>+H)+.
Producto intermedio:ácido (S)-2-(terc-butoxicarbonil)-7-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico
Se obtuvo ácido (S)-2-(terc-butoxicarbonil)-7-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico (67 mg, 69%) a partir de 7-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-3,4-dihidro-isoquinolin-2,3(1H)-dicarboxilato de (S)-2-terc-butil 3-metilo usando el procedimiento descrito para el ácido (R)-2-(terc-butoxicarbonil)-7-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]-dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico. Una porción del producto se purificó de nuevo mediante LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 * 200 mm, partículas de 5 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 40-80 % de B durante 15 minutos, después una retención de 5 minutos al 100 % de B; Caudal: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 13,7 mg, y su pureza estimada mediante análisis LCMS fue del 98%. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 57,41 (d,J= 7,3 Hz, 1H), 7,23 (t,J= 7,7 Hz, 1H), 7,15 (d,J= 6,6 Hz, 1H), 7,06 (t,J= 8,1 Hz, 1H), 6,93-6,86 (2m, 2H), 6,83-6,81 (m, 1H), 6,78 (d,J= 2,2 Hz, 1H), 6,76 (dd, J=8,3, 2,0 Hz, 1H), 5,07 (s, 2H), 4,76-4,36 (serie de m, 2H), 3,20-3,04 (m, 2H), 2,99-2,82 (m, 1H), 2,19 (s, 3H), 1,45-1,40 (2s, 9H). Se usaron dos inyecciones de LC/MS analítica para determinar la pureza final. Condiciones de la inyección 1: Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100 % de B durante 3 minutos, después una retención de 0,75 minutos al 100 % de B; Caudal: 1,0 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Condiciones de la inyección 2: Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1%; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100 % de B durante 3 minutos, después una retención de 0,75 minutos al 100 % de B; Caudal: 1,0 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Condición del análisis 1: Tiempo de retención = 1,932 min; ESI-MS (+)m/z= 530,1 (M+H)+. Condición del análisis 2: Tiempo de retención = 2,416 min; ESI-MS (+)m/z= 546,0 (M+Na)+.
Ejemplo de ref. 1005:ácido (S)-7-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico
Se obtuvo ácido (S)-7-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico (4,3 mg, 10,6%) a partir de ácido (S)-2-(ferc-butoxicarbonil)-7-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico usando el procedimiento descrito para ácido (R)-7-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico, Ejemplo 1004. El material en bruto se purificó mediante L<c>/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 25-65 % de B durante 13 minutos, después una retención de 3 minutos al 100 % de B; Caudal: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 4,3 mg, y su pureza estimada mediante análisis LCMS fue del 96 %. RMN 1H (sal de HCl, 400 MHz, DMSO-d6) 5 10,01-9,44 (m, 2H), 7,41 (d,J= 6,5 Hz, 1H), 7,27-7,19 (m, 2H), 7,19-7,15 (m, 1H), 7,02-6,97 (2m, 2H), 6,93 (d,J= 8,3 Hz, 1H), 6,78 (d,J= 2,0 Hz, 1H), 6,75 (2m, 1H), 5,11 (s, 2H), 4,36 (dd, J=11,2, 4,9 Hz, 1H), 4,29 (s, 4H), 3,77-3,64 (m, 2H), 3,63-3,56 (m, 1H), 3,49 (dd, J=11,8, 4,8 Hz, 1H), 3,25 (dd, J=16,8, 5,0 Hz, 1H), 3,08-3,01 (m, 1H), 2,19 (s, 3H). Se usaron dos inyecciones de L<c>/MS analítica para determinar la pureza final. Condiciones de la inyección 1: Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100 % de B durante 3 minutos, después una retención de 0,75 minutos al 100% de B; Caudal: 1,0 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Condiciones de la inyección 2: Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100 % de B durante 3 minutos, después una retención de 0,75 minutos al 100 % de B; Caudal: 1,0 ml/min; Detección: UV a 220 nm.
Condición del análisis 1: Tiempo de retención = 1,706 min; ESI-MS (+)m/z= 432,0 (M+H)+.
Condición del análisis 2: Tiempo de retención = 1,696 min; ESI-MS (+)m/z= 432,0 (m h )+.
En el esquema siguiente se muestra un método para la preparación del ejemplo 1006:
Producto intermedio:6,8-dimetoxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-carboxilato de terc-butilo
A una suspensión fría (0 °C) de 6,8-dimetoxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina • HCl (1,0 g, 4,35 mmol) y trietilamina (1,214 ml, 8,71 mmol) en t Hf seco (25 ml) se le añadió en una porción dicarbonato de di-terc-butilo (0,950 g, 4,35 mmol). La mezcla se agitó durante 16 h antes de diluirla con acetato de etilo y se lavó con agua y salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró. El producto en bruto se recogió en una pequeña cantidad de diclorometano y se cargó en una columna RediSepRf de fase normal Teledyne ISCO 40 g, desechable, que se eluyó primero con 0 % de B a 0 % de B para 100 ml, seguido de 0 % de B a 35 % de B para 700 ml, donde el disolvente B = acetato de etilo y el disolvente A = hexanos. Después de la concentración del eluyente, se aisló el producto deseado, 6,8-dimetoxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-carboxilato de terc-butilo (1,29 g, 4,39 mmol, 101 % de rendimiento) en forma de un cristal de color amarillo dorado. RMN 1H (500 MHz, CDCls) 56,33 (d,J= 1,8 Hz, 1H), 6,28 (s, 1H), 4,43 (s a, 2H), 3,86-3,76 (m, 6H), 3,63 (s a, 2H), 2,79 (s a, 2H), 1,51 (s, 9H). LCMS: tR = 1,30 min; LCMS (ESI) m/z calc. para C16H24NO4: 294,17, encontrado: 238,00 [M+H-tBu]+ y 279,05 [M+H-tBu+MeCN]+. Condiciones de lCm S: Waters Acquity UPLC BEH 1,7 ^m C18, 2,1 x 50 mm, donde la fase móvil A era 100 % de agua con ácido trifluoroacético al 0,05 %; la fase móvil B era acetonitrilo al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05 %, a una temperatura de 40 °C, a un gradiente del 2-98 % de B durante 1,5 minutos, a un caudal de 0,8 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm.
Producto intermedio:5-cloro-6,8-dimetoxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-carboxilato de terc-butilo
A una solución de 6,8-dimetoxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-carboxilato de terc-butilo (25 mg, 0,085 mmol) en DMF (0,75 ml) a ta se le añadió NCS en una porción (12,52 mg, 0,094 mmol). Después de 15 min, la mezcla se calentó a 60 °C, donde se agitó durante 16 h. Después de refrigerara ta, el disolvente se eliminó al vacío. Las dos reacciones se realizaron en tándem. Los residuos combinados se recogieron después en DCM, se lavaron con solución sat. de NaHCO3 (pH = 9) y salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron. El producto en bruto se recogió en una pequeña cantidad de DCM y se cargó en una columna de gel de sílice RediSepRf de fase normal Teledyne ISCO 12 g, desechable, que se eluyó primero con 0 % de B a 0 % de B para 30 ml seguido de 0 % de B a 50 % de B para 240 ml, donde disolvente B = acetato de etilo y disolvente A = hexanos. Después de la concentración del eluyente, se aisló el producto deseado, 5-cloro-6,8-dimetoxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-carboxilato de tere-butilo (35,0 mg, 0,100 mmol, 117 % de rendimiento) en forma de un aceite incoloro que solidificó después de un periodo de reposo. RMN 1H (500 MHz, CDCla) 56,42 (s, 1H), 4,43 (s a, 2H), 3,92 (s, 3H), 3,85 (s, 3H), 3,64 (t,J= 5,9 Hz, 2H), 2,84 (t,J= 5,3 Hz, 2H), 1,50 (s, 9H). LCMS: tR = 1,38 min; LCMS (ESI)m/zcalc. para C16H23ClNO4: 328,13, encontrado: 313,05 [M+H-Me]+. Condiciones de LCMS: Waters Acquity Up Lc BEH 1,7^m C18, 2,1 x 50 mm, donde la fase móvil A era agua al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05 %; la fase móvil B era acetonitrilo al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05%, a una temperatura de 40 °C, a un gradiente del 2-98% de B durante 1,5 minutos, a un caudal de 0,8 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm.
Produeto intermedio:5-cloro-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-6,8-diol • HBr
Se obtuvo 5-cloro-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-6,8-diol • HBr (0,46 g, 108%) a partir de 5-cloro-6,8-dimetoxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-carboxilato de tere-butilo usando el procedimiento descrito para 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-6,8-diol • HBr. LCMS: tR = 0,69 min; LCMS (ESI)m/zcalc. para C i0HnClNO2: 200,05, encontrado: 200,15 [M+H]+. Condiciones de LCMS: Waters Acquity UPLC B<e>H 1,7^m C18, 2,1 x 50 mm, donde la fase móvil A era agua al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05 %; la fase móvil B era acetonitrilo al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05 %, a una temperatura de 40 °C, a un gradiente del 2-98 % de B durante 1,5 minutos, a un caudal de 0,8 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm. Una porción del producto se purificó de nuevo mediante LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 ^m; Fase móvil A: 5:95 de metanol:agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol:agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 10 40 % de B durante 20 minutos, después una retención de 3 minutos al 100 % de B; Caudal: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 3,1 mg, y su pureza estimada mediante análisis LCMS fue del 100%. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 56,37 (s, 1H), 3,62-3,16 (m, 1H), 3,00-2,82 (m, 2H), 2,57-2,52 (m, 2H), 1,91 (s, 2H). Se usó L<c>/MS analítica para determinar la pureza final. Condiciones de la inyección 1: Columna: Waters XBridge C18, 2,1 mm x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de metanol:agua con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol:agua con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: de B al 0 % a B al 100 % durante 3,5 min, después una retención de 0,5 min en B al 100 %; Caudal: 0,5 ml/min; Detección: MS y UV (220 nm). Condición del análisis 1: Tiempo de retención = 0,497 min; ESI-MS (+)m/z= 200,0 (M+H)+.
Produeto intermedio:2-(5-cloro-6,8-dihidroxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de tere-butilo
Se obtuvo 2-(5-cloro-6,8-dihidroxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de tere-butilo (76,6 mg, 68,5 %) a partir de 5-cloro-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-6,8-diol • HBr usando el procedimiento descrito para 2-(6,8-dihidroxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de tere-butilo. LCMS: tR = 1,06 min; LCMS (ESI)m/zcalc. para C15H21CIn 04: 314,12, encontrado: 314,12 [M+H]+. Condiciones de LCMS: Waters Acquity UPLC B<e>H 1,7^m C18, 2,1 x 50 mm, donde la fase móvil A era agua al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05 %; la fase móvil B era acetonitrilo al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05 %, a una temperatura de 40 °C, a un gradiente del 2-98 % de B durante 1,5 minutos, a un caudal de 0,8 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm. Una porción del producto se purificó de nuevo mediante LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 20-60 % de B durante 15 minutos, después una retención de 5 minutos al 100 % de B; Caudal: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 8,3 mg, y su pureza estimada mediante análisis LCMS fue del 100%. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 56,39 (s, 1H), 3,46 (s, 2H), 2,79-2,72 (m, 2H), 2,69-2,61 (m, 2H), 2,55 (s a, 2H), 1,44 (s, 9H). Se usaron dos inyecciones de LC/MS analítica para determinar la pureza final. Condiciones de la inyección 1: Columna: Waters XBridge C18, 2,1 mm x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: de B al 0 % a B al 100 % durante 3 min, después una retención de 0,75 min en B al 100 %; Caudal: 1 ml/min; Detección: MS y UV (220 nm). Condiciones de la inyección 2: Columna: Waters XBridge C18, 2,1 mm x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Temperatura: 50 °C; Gradiente: de B al 0 % a B al 100 % durante 3 min, después una retención de 0,75 min en B al 100 %; Caudal: 1 ml/min; Detección: MS y UV (220 nm).
Condición del análisis 1: Tiempo de retención = 1,547 min; ESI-MS (+)m/z= 314,0 (M+H)+.
Condición del análisis 2: Tiempo de retención = 1,037 min; ESI-MS (+)m/z= 314,1 (<m>+<h>)+.
Producto intermedio:(R)-1-(3-((3'-(hidroximetil)-2,2'-dimetil-[1,1'-bifenil]-3-il)oxi)-propil)pirrolidin-3-ol
Se añadió catalizador XPHOS de segunda generación (52,2 mg, 0,066 mmol) en una porción a una mezcla desgasificada en argón de (R)-1-(3-(3-bromo-2-metilfenoxi)-propil)pirrolidin-3-ol (500 mg, 1,59 mmol), (2-metil-3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil)metanol (329 mg, 1,33 mmol) y fosfato potásico (704 mg, 3,32 mmol) en THF (6 ml) y agua (3 ml) en un tubo de presión de paredes gruesas, a ta. El tubo se cerró herméticamente y la mezcla resultante se agitó a ta durante 48 h antes de diluirla con EtOAc y agua, se agitó y la fase orgánica se separó. La fase acuosa se extrajo una vez más con acetato de etilo antes de combinar los extractos orgánicos y lavarlos con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron para producir un residuo que se recogió en una pequeña cantidad de DCM y se cargó en una columna de gel de sílice RediSepRf de fase normal Teledyne ISCO 40 g, desechable, que se eluyó primero con 0 % de B a 0 % de B para 60 ml seguido de 0 % de B a 100 % de B para 600 ml, donde el disolvente B = metanol y el disolvente A = DCM. Después de la concentración del eluyente, se aisló el producto, (R)-1-(3-((3'-(hidroximetil)-2,2'-dimetil-[1,1'-bifenil]-3-il)oxi)propil)pirrolidin-3-ol (443.6 mg, 94% de rendimiento) en forma de una espuma de color blanco. LCMS: tR = 0,89 min; LCMS (ESI)m/zcalc. para C22H30NO3: 356,22, encontrado: 356,15 [M+H]+. Condiciones de LCMS: Waters Acquity UPLC Be H 1,7 ^m C18, 2,1 x 50 mm, donde la fase móvil A era 100 % de agua con ácido trifluoroacético al 0,05 %; la fase móvil B era acetonitrilo al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05 %, a una temperatura de 40 °C, a un gradiente del 2-98 % de B durante 1,5 minutos, a un caudal de 0,8 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm. Una porción de este producto se purificó de nuevo mediante LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 15-55 % de B durante 20 minutos, después una retención de 5 minutos al 100% de B; Caudal: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 11,0 mg, y su pureza estimada mediante análisis LCMS fue del 97 %. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 57,40 (d,J= 7,7 Hz, 1H), 7,26-7,14 (m, 2H), 6,95 (d,J= 7,7 Hz, 2H), 6,66 (d,J= 7,7 Hz, 1H), 4,56 (s, 2H), 4,28 (s a, 1H), 4,08 (c,J= 6,6 Hz, 2H), 2,98-2,59 (serie de m, 3H), 2,11-1,96 (m, 3H), 1,93 (s, 3H), 1,92-1,91 (m, 1H), 1,85 (s, 3H), 1,68 (s a, 1H). Se usaron dos inyecciones de LC/MS analítica para determinar la pureza final. Condiciones de la inyección 1: Columna: Waters XBridge C18, 2,1 mm x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: de B al 0 % a B al 100 % durante 3 min, después una retención de 0,75 min en B al 100 %; Caudal: 1 ml/min; Detección: MS y UV (220 nm). Condiciones de la inyección 2: Columna: Waters XBridge C18, 2,1 mm x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Temperatura: 50 °C; Gradiente: de B al 0 % a B al 100 % durante 3 min, después una retención de 0,75 min en B al 100 %; Caudal: 1 ml/min; Detección: MS y UV (220 nm).
Condición del análisis 1: Tiempo de retención = 1,244 min; ESI-MS (+)m/z= 356,2 (M+H)+.
Condición del análisis 2: Tiempo de retención = 1,286 min; ESI-MS (+)m/z= 356,2 (<m>+<h>)+.
Producto intermedio:(R)-2-(5-cloro-8-hidroxi-6-((3'-(3-(3-hidroxipirrolidin-1-il)propoxi)-2,2'-dimetil-[1,1'-bifenil]-3-il)metoxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(IH)-il)acetato de terc-butilo
Se añadió diazen-1,2-dicarboxilato de (E)-diisopropilo (0,104 ml, 0,526 mmol) gota a gota a una solución de 2-(5-cloro-6,8-dihidroxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato deterc-butilo(150 mg, 0,478 mmol), (R)-1-(3-((3'-(hidroximetil)-2,2'-dimetil-[1,1'-bifenil]-3-il)oxi)propil)-pirrolidin-3-ol (170 mg, 0,478 mmol) y trifenilfosfina (138 mg, 5,26 mmol) en THF seco (3 ml) a 0 °C. La solución de color amarillo resultante (con adición de DIAD) se dejó calentar hasta ta, donde se agitó durante 16 h antes de concentrarla. La mezcla se diluyó con EtOAc y agua, se agitó, y la fase acuosa se separó. La fase acuosa se extrajo una vez más con acetato de etilo antes de combinar los extractos orgánicos y lavarlos con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron para producir un aceite viscoso de color naranja amarillento. Este material se recogió en MeOH (6 ml), se filtró a través de un filtro de jeringa de PVDF Whatman de 13 mm (45 mM), se colocó en tres viales para pHPLC (2 ml) y se sometió a pHPLC en seis porciones (10 % de B a 100 % de B durante un gradiente de 20 min a 40 ml/min) usando una columna Waters Sunfire OBD (30 x 100 mm, 5 u), donde el disolvente B = 95%de CH3CN-5%de H2O-NH4OAc 10 mM y A = 5 % de CH3CN-95%de H2O-NH4OAc 10 mM. Después de una evaporación rápida al vacío de los tubos de ensayo, se aisló el producto, (R)-2-(5-cloro-8-hidroxi-6-((3'-(3-(3-hidroxipirrolidin-1-il)propoxi)-2,2'-dimetil-[1,1'-bifenil]-3-il)metoxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de terc-butilo (113,5 mg, 36,5% de rendimiento) en forma de un sólido de color amarillo. Lc MS: tR = 1,21 min; LCMS (ESI)m/zcalc. para C37H4sClN2O6: 651,32, encontrado: 651,35 [M+H]+. Condiciones de LCMS: Waters Acquity UpLC BEH 1,7pm C18, 2,1 x 50 mm, donde la fase móvil A era agua al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05 %; la fase móvil B era acetonitrilo al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05 %, a una temperatura de 40 °C, a un gradiente del 2-98 % de B durante 1,5 minutos, a un caudal de 0,8 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm. Una porción del producto se purificó de nuevo mediante LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 45-85 % de B durante 15 minutos, después una retención de 5 minutos al 100 % de B; Caudal: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. Este producto aislado requirió una segunda purificación mediante LC/MS preparativa usando las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 55-100 % de B durante 15 minutos, después una retención de 5 minutos al 100 % de B; Caudal: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 1,3 mg, y su pureza estimada mediante análisis LCMS fue del 100 %. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 57,47 (d,J= 7,0 Hz, 1H), 7,31-7,24 (m, 1H), 7,23-7,17 (m, 1H), 7,06 (d,J= 7,3 Hz, 1H), 6,96 (d,J= 8,1 Hz, 1H), 6,67 (d,J= 7,3 Hz, 1H), 6,61 (s, 1H), 5,13 (s, 2H), 4,25-4,15 (m, 1H), 4,07 (d,J= 6,6 Hz, 2H), 3,89 (s, 2H), 3,52 (s, 2H), 2,82-2,76 (m, 2H), 2,74-2,66 (m, 3H), 2,62-2,56 (m, 3H), 2,48-2,42 (m, 1H), 2,34 (dd, J=9,5, 3,7 Hz, 1H), 2,02 (s a, 3H), 1,99-1,96 (m, 1H), 1,94-1,91 (m, 2H), 1,90 (s, 3H), 1,85 (s, 3H), 1,60-1,51 (m, 1H), 1,48-1,41 (m, 9H). Se usaron dos inyecciones de LC/MS analítica para determinar la pureza final. Condiciones de la inyección 1: Columna: Waters XBridge C18, 2,1 mm x 50 mm, partículas de 1,7 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: de B al 0 % a B al 100 % durante 3 min, después una retención de 0,75 min en B al 100 %; Caudal: 1 ml/min; Detección: MS y UV (220 nm). Condiciones de la inyección 2: Columna: Waters XBridge C18, 2,1 mm x 50 mm, partículas de 1,7 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Temperatura: 50 °C; Gradiente: de B al 0 % a B al 100 % durante 3 min, después una retención de 0,75 min en B al 100 %; Caudal: 1 ml/min; Detección: MS y UV (220 nm). Condición del análisis 1: Tiempo de retención = 2,135 min; ESI-MS (+)m/z= 651,1 (M+H)+. Condición del análisis 2: Tiempo de retención = 1,648 min; ESI-MS (+)m/z= 651,2 (M+H)+.
Producto intermedio:(R)-2-(5-cloro-8-((5-cianopiridin-3-il)metoxi)-6-((3'-(3-(3-hidroxipirrolidin-1-il)propoxi)-2,2'-dimetil-[1,1'-bifenil]-3-il)metoxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de terc-butilo
Se añadió carbonato de cesio (4,6 mg, 0,014 mmol) en una porción a una solución en agitación de (R)-2-(5-cloro-8-hidroxi-6-((3'-(3-(3-hidroxipirrolidin-1-il)propoxi)-2,2'-dimetil-[1,1'-bifenil]-3-il)metoxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de tere-butilo (18 mg, 0,014 mmol) y 5-(clorometil)nicotinonitrilo (2,2 mg, 0,014 mmol) en DMF seca (0,5 ml). La suspensión se agitó a ta durante 16 h antes de añadir más carbonato de cesio (4,6 mg, 0,14 mmol) y 5-(clorometil)nicotinonitrilo (2,2 mg, 0,014 mmol). La mezcla se agitó durante 48 h más antes de eliminar el disolvente al vacío para producir un aceite de color caramelo. LCMS: tR = 1,29 min; LCMS (ESI)m/zcalc. para C44H52ClN4O6: 767,36, encontrado: 767,45 [M+H]+. Condiciones de LCMS: Waters Acquity U<p>L<c>BEH 1,7 ^m C18, 2,1 x 50 mm, donde la fase móvil A era 100 % de agua con ácido trifluoroacético al 0,05 %; la fase móvil B era acetonitrilo al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05 %, a una temperatura de 40 °C, a un gradiente del 2-98 % de B durante 1,5 minutos, a un caudal de 0,8 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm. El material en bruto se purificó mediante LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 42-82 % de B durante 23 minutos, después una retención de 5 minutos al 100 % de B; Caudal: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 6,9 mg, y su pureza estimada mediante análisis LCMS fue del 94 %. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 58,99 (d,J= 1,8 Hz, 1H), 8,94 (d,J= 1,8 Hz, 1H), 8,34 (s, 1H), 7,49 (d,J= 7,7 Hz, 1H), 7,27 (t,J= 7,5 Hz, 1H), 7,23-7,18 (m, 1H), 7,07 (d,J= 7,0 Hz, 1H), 6,99-6,94 (m, 2H), 6,68 (d,J= 7,7 Hz, 1H), 5,30 (s, 2H), 5,24 (s, 2H), 4,20 (s a, 1H), 4,12-4,01 (m, 2H), 3,61 (s, 2H), 2,84-2,76 (m, 2H), 2,75-2,70 (m, 3H), 2,60 2,55 (m, 5H), 2,47-2,42 (m, 1H), 2,34 (dd, J=9,5, 3,7 Hz, 1H), 2,05 (s, 3H), 2,02-1,95 (m, 1H), 1,91 (t,J= 6,8 Hz, 2H), 1,84 (s, 3H), 1,60-1,50 (m, 1H), 1,42 (s, 9H). Se usaron dos inyecciones de LC/MS analítica para determinar la pureza final. Condiciones de la inyección 1: Columna: Waters XBridge C18, 2,1 mm x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Temperatura: 50 °C; Gradiente: de B al 0% a B al 100% durante 3 min, después una retención de 0,75 min en B al 100 %; Caudal: 1 ml/min; Detección: MS y UV (220 nm). Condiciones de la inyección 2: Columna: Waters XBridge C18, 2,1 mm x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: de B al 0 % a B al 100 % durante 3 min, después una retención de 0,75 min en B al 100 %; Caudal: 1 ml/min; Detección: MS y UV (220 nm).
Condición del análisis 1: Tiempo de retención = 1,714 min; ESI-MS (+)m/z= 767,1 (M+H)+.
Condición del análisis 2: Tiempo de retención = 2,348 min; ESI-MS (+)m/z= 767,1 (m h )+.
Ejemplo 1006:ácido (R)-2-(5-cloro-8-((5-cianopiridin-3-il)metoxi)-6-((3'-(3-(3-hidroxipirrolidin-1-il)propoxi)-2,2'-dimetil-[1,1'-bifenil]-3-il)metoxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acético
Se añadió TFA (0,1 ml, 1,30 mmol) a una solución en agitación de (R)-2-(5-cloro-8-((5-cianopiridin-3-il)metoxi)-6-((3'-(3-(3-hidroxipirrolidin-1-il)propoxi)-2,2'-dimetil-[1,1'-bifenil]-3-il)metoxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de terebutilo (29,2 mg, 0,038 mmol) en DCM seco (1 ml). La mezcla se agitó a ta durante un total de 16 h antes de concentrarla y purificarla mediante LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 15-55 % de B durante 20 minutos, después una retención de 5 minutos al 100% de B; Caudal: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. Se aisló ácido (R)-2-(5-cloro-8-((5-cianopiridin-3-il)metoxi)-6-((3'-(3-(3-hidroxipirrolidin-1-il)propoxi)-2,2'-dimetil-[1,1'-bifenil]-3-il)metoxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acético (0,5 mg, 1,4% de rendimiento, 74% de pureza). Se usaron dos inyecciones de LC/MS analítica para determinar la pureza final. Condiciones de la inyección 1: Waters Acquity UPLC BEH 1,7 ^m C18, 2,1 x 50 mm, donde la fase móvil A era 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; la fase móvil B era 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM, a una temperatura de 50 °C, a un gradiente de B al 0-100 % durante 3 minutos, con una retención de 0,75 minutos al 100 % de B, a un caudal de 1,0 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm. Condiciones de la inyección 2: Waters Acquity UPLC BEH 1,7 ^m C18, 2,1 * 50 mm, donde la fase móvil A era 5:95 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; la fase móvil B era 95:5 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %, a una temperatura de 50 °C, a un gradiente de B al 0-100 % durante 3 minutos, con una retención de 0,75 minutos en B al 100 %, a un caudal de 1,0 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm. Condición del análisis 1: Tiempo de retención = 1,387 min; ESI-MS (+) m/z = 711,1 (M+H)+.
Condición del análisis 2: Tiempo de retención = 1,535 min; ESI-MS (+)m/z= 711,1 (m h )+.
En el esquema siguiente se muestra una preparación alternativa del ejemplo 1006:
Producto intermedio:2-(6-((3-bromo-2-metilbencil)oxi)-5-cloro-8-hidroxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato deterc-butilo
Una solución de DIAD (0,35 ml, 1,75 mmol) en THF seco (0,65 ml) se añadió en porciones (0,1 ml) a una solución de (3-bromo-2-metilfenil)metanol (320,0 mg, 1,59 mmol), 2-(5-cloro-6,8-dihidroxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de terc-butilo (500,0 mg, 1,59 mmol) y trifenilfosfina (460,0 mg, 1,75 mmol) en THF seco (15 ml) a 0 °C. La solución de color amarillo resultante se dejó calentar hasta temperatura ambiente, donde se agitó durante 16 h antes de concentrarla. El residuo se recogió en una pequeña cantidad de DCM y se cargó en una columna de gel de sílice RediSepRf de fase normal Teledyne ISCO 40 g, desechable, que se eluyó primero con hexanos para 60 ml, seguido de 0-50 % de B para 800 m, donde el disolvente B = acetato de etilo y el disolvente A = hexanos. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga para formar el producto, 2-(6-((3-bromo-2-metilbencil)oxi)-5-cloro-8-hidroxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de tere-butilo (703,0 mg, 89 %) en forma de un sólido de color amarillo que se almacenó en un congelador. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 5 8,36 (s, 1H), 7,59 (dd, J=13,9, 8,1 Hz, 1H), 7,44 (d,J= 7,7 Hz, 1H), 7,23-7,08 (m, 1H), 6,54 (s, 1H), 6,12 (s, 1H), 5,19 5,05 (m, 2H), 4,53 (s, 1H), 3,61 (t,J= 7,5 Hz, 1H), 3,54 (s, 1H), 3,38 (s, 1H), 2,94 (t,J= 7,7 Hz, 1H), 2,86-2,78 (m, 1H), 2,71 (s a, 1H), 2,36 (d,J= 9,2 Hz, 3H), 1,44-1,37 (m, 9H). LCMS: tR = 1,54 min; LCMS (ESI)m/zcalc. para C23H28BrClNO4: 496.09, encontrado: 496,15 y 498,15 [M+H]+. Condiciones de LCMS: Vol. de inyección = 3 pl; Gradiente = 2-98 % de B; Tiempo de gradiente = 1,5 min; Caudal = 0,8 ml/min; Longitud de onda = 220 nm; Fase móvil A = 0:100 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,05 %; Fase móvil B = 100:0 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,05 %; Columna = Waters Aquity BEH C18, 2,1 x 50 mm, 1,7 pm; Temperatura del horno = 40 °C.
Produeto intermedio:2-(6-((3-bromo-2-metilbencil)oxi)-5-cloro-8-((5-cianopiridin-3-il)-metoxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de tere-butilo
Se añadió carbonato de cesio (328 mg, 1,01 mmol) en una porción a una solución de 2-(6-((3-bromo-2-metilbencil)oxi)-5-cloro-8-hidroxi-3,4-dihidro-isoquinolin-2(1H)-il)acetato de tere-butilo (500 mg, 1,01 mmol) y 5-(clorometil)nicotinonitrilo (154 mg, 1,01 mmol) en DMF seca (10 ml) a ta. La mezcla se agitó durante 3 h a 50 °C. Después de refrigerar a temperatura ambiente, el disolvente se eliminó al vacío. El residuo en bruto después se diluyó con acetato de etilo y agua, y la fase acuosa se separó y se extrajo una vez más con acetato de etilo. Los extractos orgánicos se combinaron, se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron. El residuo en bruto se recogió en una pequeña cantidad de diclorometano y se trituró con éter dietílico, acetato de etilo y hexanos para producir el compuesto del título, 2-(6-((3-bromo-2-metilbencil)oxi)-5-cloro-8-((5-cianopiridin-3-il)metoxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de tere-butilo (170,0 mg, 28 %) en forma de un sólido de color amarillo claro después de filtración por succión. LCMS: tR = 1,21 min; LCMS (ESI)m/zcalc. para C30H33BrClN3O4: 612,13, encontrado: 612,00 y 613,95 [M+H]+. Condiciones de LCMS: Vol. de inyección = 3 pl; Gradiente = 2-98 % de B; Tiempo de gradiente = 1,5 min; Caudal = 0,8 ml/min; Longitud de onda = 220 nm; Fase móvil A = 0:100 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,05 %; Fase móvil B = 100:0 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,05 %; Columna = Waters Aquity BEH C18, 2,1 x 50 mm, 1,7 pm; Temperatura del horno = 40 °C.
Produeto intermedio:ácido 2-(6-((3-bromo-2-metilbencil)oxi)-5-cloro-8-((5-cianopiridin-3-il)metoxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acético
Se añadió TFA (0,5 ml, 6,5 mmol) a una solución en agitación de 2-(6-((3-bromo-2-metilbencil)oxi)-5-cloro-8-((5-cianopiridin-3-il)metoxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de tere-butilo (170 mg, 0,28 mmol) en DCM seco (2,5 ml) a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno. La mezcla se agitó durante 16 h a temperatura ambiente antes de concentrarla al vacío para producir un aceite incoloro que se trituró con diclorometano y éter dietílico para proporcionar el compuesto del título, ácido 2-(6-((3-bromo-2-metilbencil)oxi)-5-cloro-8-((5-cianopiridin-3-il)metoxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acético, 2 TFA (180,2 mg, 83 %) en forma de un sólido de color blanco después de filtración por succión. RMN 1H (500 MHz, METANOL-d4) 58,96-8,91 (m, 2H), 8,30 (s, 1H), 7,59 (d,J= 8,0 Hz, 1H), 7,44 (d,J= 7,7 Hz, 1H), 7,11 (t,J= 7,7 Hz, 1H), 6,98 (s, 1H), 5,37 (s, 2H), 5,29 (s, 2H), 4,59-4,40 (m, 2H), 4,30 (s, 2H), 3,70 (s a, 2H), 3,23 (t a,J =5,9 Hz, 2H), 2,49 (s, 3H). LCMS: tR = 1,08 min; LCMS (ESI)m/zcalc. para C26H25BrCINsO: 556,07, encontrado: 555,90 y 557,90 [M+H]+. Condiciones de LCMS: Vol. de inyección = 3 pl; Gradiente = 2-98%de B; Tiempo de gradiente = 1,5 min; Caudal = 0,8 ml/min; Longitud de onda = 220 nm; Fase móvil A = 0:100 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,05 %; Fase móvil B = 100:0 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,05 %; Columna = Waters Aquity BEH C18, 2,1 x 50 mm, 1,7 pm; Temperatura del horno = 40 °C.
Ejemplo 1006:ácido (R)-2-(5-cloro-8-((5-cianopiridin-3-il)metoxi)-6-((3'-(3-(3-hidroxipirrolidin-1-il)propoxi)-2,2'-dimetil-[1,1'-bifenil]-3-il)metoxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acético
Se añadió precatalizador XPHOS de segunda generación (4,2 mg, 5,39 pmol) en una porción a una mezcla desgasificada en argón de (R)-1-(3-(2-metil-3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenoxi)propil)pirrolidin-3-ol (46,7 mg, 0,13 mmol), ácido 2-(6-((3-bromo-2-metilbencil)oxi)-5-cloro-8-((5-cianopiridin-3-il)metoxi)-3,4-dihidroisoquino-lin-2(1H)-il)acético (60,0 mg, 0,11 mmol), fosfato potásico (80,0 mg, 0,38 mmol) en THF (1 ml) y agua (0,5 ml) en un vial de presión de 1 dram a temperatura ambiente. El vial se cerró herméticamente y la suspensión resultante se agitó a 40 °C durante 16 h. Se añadieron más (R)-1-(3-(2-metil-3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenoxi)propil)pirrolidin-3-ol (46,7 mg, 0,13 mmol), precatalizador XPHOS de segunda generación (4,2 mg, 5,39 pmol) y THF (1 ml) en atmósfera de argón. El vial de presión se volvió a cerrar herméticamente y se calentó a 65 °C durante 16 h antes de enfriar la mezcla de reacción a temperatura ambiente. La mezcla se repartió entre acetato de etilo y tampón de pH = 5. La capa acuosa se separó y se extrajo una vez más con acetato de etilo. Los extractos orgánicos se concentraron usando una corriente de nitrógeno. El residuo se recogió en DMF (se añadieron algo de THF y metanol), se filtró a través de un filtro de jeringa y se purificó por LCMS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Gradiente: 13-53 % de B durante 25 min, después una retención de 4 min al 100 % de B; Caudal: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto (sólido de color blanco) fue de 8,4 mg (10,8 %) y su pureza estimada mediante análisis LCMS fue del 98 %. Se usaron dos inyecciones de LCMS analítica para determinar la pureza final. Condiciones de la inyección 1: Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, 1,7 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100 % de B durante 3 min, después una retención de 0,75 min al 100 % de B; Caudal: 1,0 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Resultados de la inyección 1: Pureza: 98,5 %; Masa observada: 711,3; Tiempo de retención: 1,46 min. Condiciones de la inyección 2: Columna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, 1,7 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100% de B durante 3 min, después una retención de 0,75 minutos al 100% de B; Caudal: 1,0 ml/min; Detección: UV a 220 nm. Resultados de la inyección 2: Pureza: 99,0 %; Masa observada: 711,2; Tiempo de retención: 1,45 min.
Ejemplo 1007:ácido (R)-2-(5-cloro-6-((3'-(3-(3-hidroxipirrolidin-1-il)propoxi)-2,2'-dimetil-[1,1'-bifenil]-3-il)metoxi)-8-((5-(metoxicarbonil)piridin-3-il)metoxi)-3,4-dihidro-isoquinolin-2(1H)-il)acético
Se añadió HCl 4 N frío (0 °C), en dioxanos (0,1 ml, 1,30 mmol), en una porción, a (R)-2-(5-cloro-8-((5-cianopiridin-3-il)metoxi)-6-((3'-(3-(3-hidroxi-pirrolidin-1-il)propoxi)-2,2'-dimetil-[1,1'-bifenil]-3-il)metoxi)-3,4-dihidroisoquino-lin-2(1H)-il)acetato de tere-butilo (15 mg, 0,020 mmol) en un vial de 1 dram. Después de 5 min, se añadió MeoH seco (0,15 ml). La mezcla se agitó a ta durante un total de 4 h antes de basificarla con solución saturada de NaHCO3. La mezcla se diluyó con acetato de etilo y el pH se ajustó con HCl 1 N hasta que se alcanzó pH = 5. La fase acuosa se separó y se extrajo dos veces más con acetato de etilo. El extracto orgánico combinado se lavó después con salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró y se evaporó. El residuo se recogió en MeOH, se filtró a través de un filtro de jeringa de nailon y se purificó mediante LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Gradiente: 5-65% de B durante 20 minutos, después una retención de 5 minutos al 100% de B; Caudal: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. Se aisló ácido (R)-2-(5-cloro-6-((3'-(3-(3-hidroxipirrolidin-1 -il)propoxi)-2,2'-dimetil-[1,1'-bifenil]-3-il)metoxi)-8-((5-(metoxicarbonil)piridin-3-il)metoxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acético (0,4 mg, 1,9 % de rendimiento, 100 % de pureza). Se usaron dos inyecciones de LC/MS analítica para determinar la pureza final. Condiciones de la inyección 1: Waters Acquity UPLC BEH 1,7 ^m C18, 2,1 x 50 mm, donde la fase móvil A era 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico al 10 mM; la fase móvil B era 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM, a una temperatura de 50 °C, a un gradiente de B al 0-100 % durante 3 minutos, con una retención de 0,75 minutos al 100 % de B, a un caudal de 1,0 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm. Condiciones de la inyección 2: Waters Acquity UPLC BEH 1,7 ^m C18, 2,1 x 50 mm, donde la fase móvil A era 5:95 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; la fase móvil B era 95:5 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %, a una temperatura de 50 °C, a un gradiente de B al 0-100 % durante 3 minutos, con una retención de 0,75 minutos en B al 100 %, a un caudal de 1,0 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm. Condición del análisis 2: Tiempo de retención = 1,336 min; ESI-MS (+)m/z= 373,0 (M+2H)2+/2+.
Condición del análisis 1: Tiempo de retención = 1,868 min; ESI-MS (+)m/z= 372,3 (m 2h )2+/2+.
Ejemplo 1008:(R)-5-(((5-cloro-6-((3'-(3-(3-hidroxipirrolidin-1-il)propoxi)-2,2'-dimetil-[1,1'-bifenil]-3-il)metoxi)-2-(2-metoxi-2-oxoetil)-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-8-il)oxi)metil)nicotinato de metilo
También se aisló (R)-5-(((5-cloro-6-((3'-(3-(3-hidroxipirrolidin-1-il)propoxi)-2,2'-dimetil-[1,1'-bifenil]-3-il)-metoxi)-2-(2-metoxi-2-oxoetil)-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-8-il)oxi)metil)-nicotinato de metilo (0,5 mg, 2,2 % de rendimiento, 96,0 % de pureza) de la mezcla de reacción del ejemplo 1007. Se usaron dos inyecciones de LC/MS analítica para determinar la pureza final. Condiciones de la inyección 1: Waters Acquity UPLC BEH 1,7 ^m C18, 2,1 x 50 mm, donde la fase móvil A era 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico al 10 mM; la fase móvil B era 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM, a una temperatura de 50 °C, a un gradiente de B al 0-100 % durante 3 minutos, con una retención de 0,75 minutos al 100 % de B, a un caudal de 1,0 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm. Condiciones de la inyección 2: Waters Acquity UPLC BEH 1,7 ^m C18, 2,1 x 50 mm, donde la fase móvil A era 5:95 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; la fase móvil B era 95:5 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %, a una temperatura de 50 °C, a un gradiente de B al 0-100 % durante 3 minutos, con una retención de 0,75 minutos en B al 100 %, a un caudal de 1,0 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm. Condición del análisis 2: Tiempo de retención = 1,484 min; ESI-MS (+)m/z= 758,0 (M+H)+.
Condición del análisis 1: Tiempo de retención = 2,142 min; ESI-MS (+)m/z= 758,1 (m h )+.
Producto intermedio:2-(5-cloro-6,8-dihidroxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de metilo
Se obtuvo 2-(5-cloro-6,8-dihidroxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de metilo (102,0 mg, 53 %) a partir de 5-cloro-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-6,8-diol • HBr y 2-bromoacetato de metilo usando el procedimiento descrito para 2-(5-cloro-6,8-dihidroxi-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de terc-butilo. RMN 1H (500 MHz, CDCl3) 5 6,29-6,27 (m, 1H), 3,77 (s, 3H), 3,59 (s, 2H), 3,49-3,39 (m, 2H), 2,88-2,77 (m, 2H). LCMS: tR = 0,44 min; LCMS (ESI)m/zcalc. para CisHi5ClNO4:212,01,encontrado: 272,15 [M+H]+. Condiciones de L<c>MS: Waters Acquity UPLC BEH 1,7 ^m C18, 2,1 x 50 mm, donde la fase móvil A era 100 % de agua con ácido trifluoroacético al 0,05 %; la fase móvil B era acetonitrilo al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05 %, a una temperatura de 40 °C, a un gradiente del 2-98 % de B durante 1,5 minutos, a un caudal de 0,8 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm.
Producto intermedio:(R)-2-(5-cloro-8-hidroxi-6-((3'-(3-(3-hidroxipirrolidin-1-il)propoxi)-2,2'-dimetil-[1,1'-bifenil]-3-il)metoxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de metilo
Se obtuvo (R)-2-(5-cloro-8-hidroxi-6-((3'-(3-(3-hidroxipirrolidin-1-il)propoxi)-2,2'-dimetil-[1,1'-bifenil]-3-il)metoxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de metilo (49 mg, 26%) a partir de (R)-1-(3-((3'-(hidroximetil)-2,2'-dimetil-[1,1'-bifenil]-3-il)oxi)-propil)pirrolidin-3-ol y 2-(5-cloro-6,8-dihidroxi-3,4-dihidroiso-quinolin-2(1H)-il)acetato de metilo usando el procedimiento descrito para (R)-2-(5-cloro-8-hidroxi-6-((3'-(3-(3-hidroxipirrolidin-1-il)propoxi)-2,2'-dimetil-[1,1'-bifenil]-3-il)metoxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de terc-butilo. LCMS: tR = 1,13 min; LCMS (ESI) m/z calc. para C34H42ClN2O6: 609,28, encontrado: 609,25 [M+H]+. Condiciones de LCMS: Waters Acquity UPLC BEH 1,7 ^m C18, 2,1 x 50 mm, donde la fase móvil A era 100 % de agua con ácido trifluoroacético al 0,05 %; la fase móvil B era acetonitrilo al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05 %, a una temperatura de 40 °C, a un gradiente del 2-98 % de B durante 1,5 minutos, a un caudal de 0,8 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm.
Ejemplo 1009:ácido (R)-2-(5-cloro-8-hidroxi-6-((3'-(3-(3-hidroxipirrolidin-1-il)propoxi)-2,2'-dimetil-[1,1'-bifenil]-3-il)metoxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acético
Se añadió hidróxido de litio monohidrato (8,3 mg, 0,197 mmol) en una porción a una solución en agitación de 2-(5-cloro-8-hidroxi-6-((3'-(3-(3-hidroxipirrolidin-1-il)propoxi)-2,2'-dimetil-[1,1'-bifenil]-3-il)metoxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acetato de (R)-metilo (30 mg, 0,039 mmol) en THF (0,5 ml), MeOH (0,1 ml) y agua (0,1 ml). La mezcla se agitó a ta durante 16 h antes de eliminar los disolventes orgánicos con una corriente de nitrógeno. El residuo se recogió en EtOAc y se neutralizó con HCl 1 N (0,33 ml) y tampón de pH = 5 (3 ml). La capa acuosa se separó, se extrajo de nuevo con EtOAc y el extracto orgánico combinado se secó sobre MgSo4, se filtró y se concentró para producir el producto en bruto en forma de un sólido de color naranja parduzco (25 mg). LCMS: tR = 1,10 min; LCMS (ESI)m/zcalc. para C33H4oClN2O6: 595,26, encontrado: 595,25 [M+H]+. Condiciones de LCMS: Waters Acquity UPLC Be H 1,7^m C18, 2,1 x 50 mm, donde la fase móvil A era agua al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05 %; la fase móvil B era acetonitrilo al 100 % con ácido trifluoroacético al 0,05 %, a una temperatura de 40 °C, a un gradiente del 2-98 % de B durante 1,5 minutos, a un caudal de 0,8 ml/minuto, a una longitud de onda UV de 220 nm. Una porción de este producto en bruto se purificó por LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 10-50 % de B durante 20 minutos, después una retención de 5 minutos al 100% de B; Caudal: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 1,4 mg, y su pureza estimada mediante análisis LCMS fue del 94 %. Se usaron dos inyecciones de LC/MS analítica para determinar la pureza final. Condiciones de la inyección 1: Columna: Waters XBridge C18, 2,1 mm x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Temperatura: 50 °C; Gradiente: de B al 0% a B al 100% durante 3 min, después una retención de 0,75 min en B al 100 %; Caudal: 1 ml/min; Detección: MS y UV (220 nm). Condiciones de la inyección 2: Columna: Waters XBridge C18, 2,1 mm x 50 mm, partículas de 1,7 ^m; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: de B al 0 % a B al 100 % durante 3 min, después una retención de 0,75 min en B al 100 %; Caudal: 1 ml/min; Detección: MS y UV (220 nm). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6/D2O) 57,33 (d, J=7,3 Hz, 1H), 7,12 (t,J= 7,5 Hz, 1H), 7,08-7,02 (m, 1H), 6,91 (d,J= 8,1 Hz, 1H), 6,81 (d,J= 8,1 Hz, 1H), 6,53 (d,J= 7,3 Hz, 1H), 6,47 (s, 1H), 4,98 (s, 2H), 4,10-4,01 (m, 1H), 3,92 (c,J= 6,2 Hz, 3H), 3,75 (s, 2H), 3,42 (s, 3H), 2,68 (d,J= 5,9 Hz, 3H), 2,63-2,54 (m, 5H), 2,52 2,41 (m, 5H), 2,21 (dd, J=9,7, 3,5 Hz, 2H), 1,90-1,84 (m, 6H), 1,80-1,74 (m, 10H), 1,70 (s, 6H), 1,46-1,36 (m, 2H).
Condición del análisis 1: Tiempo de retención = 1,419 min; ESI-MS (+)m/z= 595,1 (M+H)+.
Condición del análisis 2: Tiempo de retención = 1,292 min; ESI-MS (+)m/z= 595,1 (<m>+<h>)+.
ENSAYO BIOLÓGICO
La capacidad de los compuestos de Fórmula (I) de unirse a PD-L1 se investigó usando un ensayo de unión de fluorescencia en tiempo resuelto homogéneo (HTRF) de PD-1/PD-L1.
Ensayo de unión de fluorescencia en tiempo resuelto homogéneo (HTRF).
La interacción de PD-1 y PD-L1 se puede evaluar usando preparaciones solubles purificadas de los dominios extracelulares de las dos proteínas. Los dominios extracelulares de la proteína PD-1 y PD-L1 se expresaron como proteínas de fusión con etiquetas de detección, para PD-1, la etiqueta era la porción Fc de la inmunoglobulina (PD-1-Ig) y para PD-L1 era el motivo de 6 histidinas (PD-L1-His). Todos los estudios de unión se realizaron en un tampón de ensayo de HTRF que consistía en dPBS suplementado con albúmina de suero bovino al 0,1 % (con) y Tween-20 al 0,05 % (v/v). Para el ensayo de unión de h/PD-L1-His, los inhibidores se preincubaron con PD-L1-His (final 10 nM) durante 15 min en 4 pl de tampón de ensayo, seguido de la adición de PD-1-Ig (final 20 nM) en 1 pl de tampón de ensayo y una incubación adicional durante 15 min. La detección de HTRF se realizó usando anti-Ig marcado con cripato de europio (final 1 nM) y anti-His marcado con aloficocianina (APC) (final 20 nM). Los anticuerpos se diluyeron en tampón de detección de HTRF y se dispensaron 5 pl por encima de la reacción de unión. La mezcla de reacción se dejó equilibrar durante 60 minutos y se obtuvo la señal resultante (relación 665 nm/620 nm) usando un fluorómetro EnVision. Se establecieron ensayos de unión adicionales entre las proteínas humanas PD-1-Ig/PD-L2-His (20 y 2 nM, respectivamente) y CD80-His/PD-L1-Ig (100 y 10 nM, respectivamente).
Proteínas recombinantes: El PD-1 humano (25-167) con un dominio Fc humano C-terminal de la etiqueta epitópica de inmunoglobulina G (Ig) [hPD-1 (25-167)-3S-IG] y el PD-L1 humano (18-239) con una etiqueta epitópica His C-terminal [hPD-L1(18-239)-TVMV-His] se expresó en células HEK293T y se purificó secuencialmente mediante cromatografía de afinidad con Proteína A y cromatografía de exclusión por tamaño. El PD-L2-His humano y el CD80-His se obtuvieron a través de fuentes comerciales.
Secuencia de PD-1 -Ig humano recombinante
hPDl(25-167)-3S-IG
1 LDSPDRPWNP PTFSPALLW TEGDNATFTC SFSNTSESFVLHWYRM5PENEl QTDKLñAFPE DKSQPGQDCR FRVTQLPNGR DFHMSWRAR RUDSGTYLCG 101 AISLAPKAÜI KEí>L,RAEL,RV TERRAEVPTA HPSPSPRPAG QFQGSPGGGG 151 3REFK3SDKT KTSFFSFAFE LLOGSSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW 5!Q1 VDVSHPDPEV KFNWYVDGVE VHHAKTKPRE EQYHSTYRW SVLTVLHQDW 251 LWGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAK&QP ñEPQVYTLPP SRDELTKNCV SOI SLTCLVKGFY PSDIAVEWE5 NGQFENNYKTTPPVLDSDGE P P L YSKXiTVDS51 KSRMQQGBVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK
(SEQ ID NO: 1)
Secuencia de PD-L1-His humano recombinante
1AFTVTVPKDIi YWEYGSNMTr E I C X F P V E K £LÜLAALIVYW EMEDICJIIQF 51 VHGEEDLKVQH 5 S Y R Q R A R LI.KDQIiSLGNA ALQITDVKLQ DAGVYRCMI3l í l ' .YGGADYKRIT WVNAPYNKI ITQ¡RTT,WDFV TSEHPTTCQñ EGYPKAEVTtf
151 TSSDHQVLSG KTTTTNSXRE EKLFTFVTSTL RINTTTNEIF YCTFRRLDPE
Ü U IENHTAELVIP ELPLAHPPNE RTGSSETVRt UGHHHHHH
(SEQ ID NO:2<)>
La tabla a continuación enumera los valores de CI50 para los ejemplos representativos de la presente divulgación medidos en el ensayo de unión de fluorescencia en tiempo resuelto homogéneo (HTRF) de PD-1/PD-L1. Los intervalos son los siguientes: A = 0,002 - 0,015 pM; B = 0,016 - 0,050 pM; C = 0,051 - 1,50 pM; D = 1,51 -10 pM.
Los compuestos de fórmula (I) poseen actividad como inhibidores de la interacción PD-1/PD-L1 y, por lo tanto, pueden usarse en el tratamiento de enfermedades o deficiencias asociadas con la interacción PD-1/PD-L1. A través de la inhibición de la interacción PD-1/PD-L1, los compuestos de la presente divulgación pueden emplearse para tratar enfermedades infecciosas, tales como VIH, Hepatitis A, B, C, o D y cáncer.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de fórmula (I)
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde n es 1 o 2; n' es 1 o 2; con la condición de que al menos uno de n y n' sea distinto de 2; uno de X y X' se selecciona entre NH y NRx, y el otro se selecciona entre CH2 y CHRy; Rx se selecciona entre -CH2CO2H, -CH2CO2alquilo C1-C3 y -CO2alquilo C1-C3; Ry se selecciona entre -CH2CO2H, -CH2CO2alquilo C1-C3, -CO2H y -CO2alquilo C1-C3; R2 se selecciona entre hidrógeno, -OH, y
    en donde R45se selecciona entre -CN, -CO2H y -CO2alquilo Ci-C3; R3 se selecciona entre hidrógeno y halo; y Ar se selecciona entre;
  2. 2. Un compuesto de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde cada uno de n y n' es 1.
  3. 3. Un compuesto de la reivindicación 2 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde X es NRx y X' es CH2.
  4. 4. Un compuesto de la reivindicación 2 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde X es CHRy y X' es NH.
  5. 5. Un compuesto según la reivindicación 1 que se selecciona entre ácido 2-(8-((5-cianopiridin-3-il)metoxi)-6-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-2-metilbencil)-oxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acético; ácido 2-(6-((5-cianopiridin-3-il)metoxi)-8-((3-(2,3-dihidrobenzo[b][1,4]-dioxin-6-il)-2-metilbencil)oxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acético; y ácido (R)-2-(5-cloro-8-((5-cianopiridin-3-il)metoxi)-6-((3'-(3-(3-hidroxipirrolidin-1-il)propoxi)-2,2'-dimetil-[1,1'-bifenil]3-il)metoxi)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)acético; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  6. 6. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  7. 7. Un compuesto de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso para potenciar, estimular, modular y/o aumentar la respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesite.
  8. 8. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso según la reivindicación 7 que comprende además administrar un agente adicional antes de, después o simultáneamente con el compuesto de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  9. 9. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso según la reivindicación 8 en donde el agente adicional es un agente antimicrobiano, un agente antivírico, un agente citotóxico, un agente modulador de la expresión génica y/o un modificador de la respuesta inmunitaria.
  10. 10. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso para inhibir el crecimiento, proliferación o metástasis de células cancerosas en un sujeto que lo necesita.
  11. 11. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso según la reivindicación 10 en donde el cáncer se selecciona entre melanoma, carcinoma de células renales, cáncer de pulmón no microcítico escamoso (NSCLC), NSCLC no escamoso, cáncer colorrectal, cáncer de próstata resistente a la castración, cáncer de ovario, cáncer gástrico, carcinoma hepatocelular, carcinoma pancreático, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinomas del esófago, del tracto gastrointestinal y de mama, y neoplasia maligna hematológica.
  12. 12. Un compuesto según la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso para tratar una enfermedad infecciosa en un sujeto que lo necesita.
  13. 13. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso según la reivindicación 12 en donde la enfermedad infecciosa está causada por un virus.
  14. 14. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso según la reivindicación 13 en donde el virus se selecciona entre VIH, de la hepatitis A, de la hepatitis B, de la hepatitis C, de la hepatitis D, virus del herpes, papilomavirus y de la gripe.
  15. 15. Un compuesto según la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso para tratar el choque séptico en un sujeto que lo necesita.
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