ES2960835T3 - Moléculas de unión a antígeno y métodos de uso de las mismas - Google Patents

Moléculas de unión a antígeno y métodos de uso de las mismas Download PDF

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Abstract

Moléculas de unión a antígeno aisladas que se unen específicamente a una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500). Las moléculas de unión a antígeno se pueden usar en los métodos proporcionados en el presente documento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Moléculas de unión a antígeno y métodos de uso de las mismas
Lista de secuencias
Campo de la invención
Esta divulgación se relaciona con moléculas de unión a antígeno, tales como anticuerpos, que se unen específicamente a la secuencia GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden estas secuencias y células que presentan tales moléculas, polinucleótidos que codifican tales moléculas de unión a antígeno, así como formas humanizadas de moléculas de unión a antígeno; también se divulgan métodos para utilizar las moléculas de unión a antígeno.
Antecedentes de la invención
Las moléculas de unión a antígeno, incluyendo los anticuerpos, se utilizan en inmunoterapia y aplicaciones basadas en fase sólida, tales como biosensores, cromatografía de afinidad e inmunoensayos. Estos anticuerpos y moléculas de unión a antígeno adquieren su utilidad en virtud de su capacidad para unirse específicamente a sus objetivos.
Las secuencias enlazadoras, que a menudo se basan en péptidos cuando se emplean en aplicaciones biotecnológicas y bioterapéuticas, pueden servir para una variedad de aplicaciones científicamente relevantes. Por ejemplo, un enlazador se puede utilizar simplemente como una fracción espaciadora para impartir una propiedad estructural y/o funcional deseada a una molécula más grande. En otro ejemplo, un enlazador puede impartir pocas o ninguna propiedad estructural o funcional a una molécula más grande, pero puede utilizarse simplemente como una característica distintiva(por ejemplo,un "marcador1' o "biomarcador" o "etiqueta"), identificando de forma única una molécula más grande. En otro ejemplo más, se puede utilizar un enlazador para impartir una característica reconocible que puede servir como sitio de unión para un anticuerpo dirigido contra una molécula más grande que comprende la secuencia enlazadora.
Cuando se utiliza una secuencia enlazadora como característica distintiva, detectable o identificable de una molécula más grande, un anticuerpo que se une específicamente a la secuencia enlazadora, excluyendo otras secuencias presentes en la molécula más grande, el anticuerpo puede servir como agente de detección. Dichos anticuerpos se pueden marcar con una fracción que es detectable bajo ciertas condiciones. Las aplicaciones adicionales para dicho anticuerpo incluyen la purificación y el aislamiento de una molécula que comprende el enlazador, la caracterización de una molécula en un entorno particular, el enriquecimiento de la concentración de una población de moléculas que comprenden y/o presentan el enlazador y también aplicaciones terapéuticas.
En 1993, Whitlowet al.divulgó un péptido enlazador sintético que comprende la secuencia de aminoácidos GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) (Whitlowet al.,(1993)Prot. Eng.6(8):989-95). El péptido divulgado se estudió como componente de un scFv y se diseñó para eliminar un sitio proteolítico identificado en un péptido enlazador anterior. Whitlowet al.llegó a la conclusión de que este péptido enlazador sintético de nuevo diseño era más estable a la proteólisisin vitrocuando se comparó con el péptido enlazador anterior en el que se basaba su secuencia, y también mostró menos agregación en comparación con el mismo enlazador anterior. Whitlowet al.no divulgó ninguna molécula de unión a antígeno dirigida a su péptido enlazador de segunda generación. El documento US 2004/0009166 A1 divulga polipéptidos de unión a antígeno de cadena sencilla con modificaciones específicas de lado. Yanget al.describe una estrategia general para crear anticuerpos de cadena sencilla monoPEGilados personalizados(Protein Eng.16 (2003), 761-770). Zhenget al.se relaciona con el uso de proteína L marcada con biotina en la detección de la expresión de CAR en linfocitos transducidos mediante citometría de flujo(J. TransL Med.
10 (2012), 1-6).
En el presente documento se divulgan moléculas de unión a antígeno, incluyendo anticuerpos, que se unen específicamente a la secuencia GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y subsecuencias de la misma, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden estas secuencias y células que presentan tales moléculas. También se proporcionan formas humanizadas de moléculas de unión a antígeno. También se divulgan sus aplicaciones y usos.
Resumen de la invención
La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.
Se proporciona una molécula de unión a antígeno aislada que se une específicamente a una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y KPGSG (SEQ ID NO: 500). En diversas realizaciones, la molécula de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un scFv, un Fab, un Fab', un Fv, un F(ab')<2>, un dAb, un anticuerpo no humano (por ejemplo, de conejo) un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo IgE, un anticuerpo IgD, un anticuerpo IgM, un anticuerpo IgG1, un anticuerpo IgG1 que tiene al menos una mutación en la región bisagra, un anticuerpo IgG2, un anticuerpo IgG2 que tiene al menos una mutación en la región bisagra, un anticuerpo IgG3, un anticuerpo IgG1 que tiene al menos una mutación en la región bisagra, un anticuerpo IgG4, un anticuerpo IgG4 que tiene al menos una mutación en la región bisagra, un anticuerpo que comprende al menos un aminoácido no natural y cualquier combinación de los mismos. En una realización específica, la molécula de unión a antígeno comprende un anticuerpo.
En diversas realizaciones, la molécula de unión a antígeno comprende una cadena pesada (HC) y, en algunas realizaciones, la HC comprende una secuencia de región variable (VH) de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 5 y 17. En otras realizaciones, la región variable (VH) comprende uno o más de (a) una CDR1, (b) una CDR2 y (c) una CDR3. En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 7 y 19; en otras realizaciones, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 8 y 20, y aún otras realizaciones, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR3 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 9 y 21. En diversas realizaciones, una molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada, una CDR2 de cadena pesada y una CDR3 de cadena pesada, comprendiendo cada CDR una secuencia de aminoácidos que se muestra en las FIGURAS 6 y 8, y en realizaciones adicionales, una molécula de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de VH que es al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 % o aproximadamente 100 % idéntica a una VH de una molécula de unión a antígeno proporcionada en el presente documento,por ejemplo,en el Listado de Secuencias adjunto y en las FIGURAS 6 y 8.
En diversas realizaciones, la molécula de unión a antígeno comprende una cadena ligera (LC) y, en algunas realizaciones, la LC comprende una secuencia de región variable (VL) de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 11 y 23. En otras realizaciones, la región variable (VL) comprende uno o más de (a) una CDR1, (b) una CDR2 y (c) una CDR3. En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 13 y 25; en otras realizaciones, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR2 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 14 y 26, y aún otras realizaciones, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR3 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 15 y 27. En diversas realizaciones, una molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena ligera, una CDR2 de cadena ligera y una CDR3 de cadena ligera, comprendiendo cada CDR una secuencia de aminoácidos que se muestra en las FIGURAS 6 y 8, y en realizaciones adicionales, una molécula de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de VL que es al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 % o aproximadamente 100 % idéntica a una VL de una molécula de unión a antígeno proporcionada en el presente documento,por ejemplo,en el Listado de Secuencias adjunto y en las FIGURAS 6 y 8.
En una realización específica, la molécula de unión a antígeno comprende: (a) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; y (b) una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 En una realización específica adicional, la molécula de unión a antígeno comprende: (a) una región VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; (b) una región VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8; (c) una región VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9; (d) una región VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13; (e) una región VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14; y (f) una región VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15
En una realización específica, la molécula de unión a antígeno comprende: (a) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17; y (b) una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23 En una realización específica adicional, la molécula de unión a antígeno comprende: (a) una región VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19; (b) una región VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20; (c) una región VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21; (d) una región VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25; (e) una región VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26; y (f) una región VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27
En algunas realizaciones, una molécula de unión a antígeno proporcionada en el presente documento comprende además un marcador detectable, que puede seleccionarse del grupo que consiste en un marcador fluorescente, un compuesto fotocrómico, un marcador fluorescente proteináceo, un marcador magnético, un radiomarcador y un hapteno. En una realización específica, el marcador detectable comprende un marcador fluorescente y se selecciona del grupo que consiste en un colorante Atto, un colorante Alexafluor, puntos cuánticos, Hidroxicumarina, Aminocouramina, Metoxicurmarina, Azul Cascada, Azul Pacífico, Naranja Pacífico, Amarillo Lucifer, NBD, R-ficoeritrina (PE), conjugados de PE-Cy5, conjugados de PE-Cy7, Rojo 613, PerCP, TruRojo, FluorX, Fluoresceína, BODIPY-FL, Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, TRITC, X-Rodamina, Lisamina Rodamina B, Rojo Texas, Aloficocianina(ApC), ApC-Cy7 conjugados, Indo-1, Fluo-3, Fluo-4, DCFH, DHR, SNARF, GFP (mutación<y>66H), GFP (mutación Y66f ), Eb FP, EBFP2, Azurite, GFPuv, T-Sapphire, Cerulean, mCFP, mTurquesa2, ECFP, CyPet, GFP (mutación Y66W), mKeima-Rojo, TagCFP, AmCyan1, mTFP1, GFP (mutación S65A), Midorishi Cyan, GFP de tipo silvestre, GFP (mutación S65C), TurboGFP, TagGFP, GFP (mutación S65L), Esmeralda, GFP (mutación S65T), Eg Fp, Verde Azami, ZsVerde1, TagYFP, EYFP, Topaz, Venus, mCitrine, YPet, TurboYFP, ZsAmarillo1, Naranja Kutilizabira, mNaranja, Aloficocianina (APC), mKO, TurboRFP, tdTomate, TagRFP, DsRojo monómero, DsRojo2 ("RFP"), mFresa, TurboFP602, AsRojo2, mRFP1, J-Rojo, R-ficoeritrina (RPE), B -ficoeritrina (BPE), mCereza, HcRed1, Katusha, P3, Clorofila de Peridinina (PerCP), mKate (TagFP635), TurboFP635, mCiruela y mFrambuesa.
También se proporcionan composiciones que comprenden las moléculas de unión a antígeno, los polinucleótidos que codifican la cadena pesada de las moléculas de unión a antígeno y los polinucleótidos que codifican la cadena ligera de las moléculas de unión a antígeno. Los vectores que comprenden los polinucleótidos y las células que comprenden dichos vectores forman aspectos adicionales de la divulgación. En diversas realizaciones, una célula puede seleccionarse del grupo que consiste en una célula CHO, una célula Sp2/0, una célula de conejo diferente de células de mamífero, células de levadura o células bacterianas, tales como una célula deE. coli.También se proporcionan métodos para fabricar una molécula de unión a antígeno divulgada en el presente documento, que pueden comprender la incubación de la célula en condiciones adecuadas.
En otro aspecto, se proporciona un método para administrar una dosis de un medicamento a un sujeto, comprendiendo la dosis un número preseleccionado de células que presentan una molécula terapéutica que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (<s>E<q>ID<n>O: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500). En una realización, el método comprende (a) proporcionar una muestra de volumen conocido que comprende una población que comprende un número conocido de células, la población que se sabe o se sospecha que expresa una molécula terapéutica que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500); (b) proporcionar una alícuota de la muestra que comprende una población de células que presenta una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada; (c) proporcionar una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a la secuencia de aminoácidos seleccionada y comprende un marcador detectable; (d) poner en contacto la alícuota de (b) con la molécula de unión al antígeno de (c) en condiciones que permitan la formación de un complejo de unión que comprende una célula presente en la muestra y la molécula de unión al antígeno; (e) determinar la fracción de células presentes en un complejo de unión de (d) en la alícuota; (f) determinar la concentración de células que presentan una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada en la muestra, con base en la fracción de células determinada en (e); (g) determinar el volumen de la muestra que comprende el número seleccionado de células; y (h) administrar el volumen de la muestra determinado en (g) al sujeto.
En algunas realizaciones, (a) la molécula terapéutica es un CAR; y (b) la célula es una célula inmunitaria seleccionada del grupo que consiste en células T CD8+, células T CD4+, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), células NK, células que expresan TCR, células dendríticas y células NK-T. En realizaciones específicas, CAR comprende una molécula, o un fragmento de la misma, seleccionada del grupo que consiste en CD2, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8|3, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (cadena alpha asociada al complejo receptor de antígeno de células b ), CD79B (cadena beta asociada al complejo receptor de antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (Táctil), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador inducible de células T (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando de CD83, un receptor Fc gamma, una molécula de MHC de clase 1, una molécula de MHC de clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína de inmunoglobulina, un receptor de citoquinas, una integrina, receptores activadores de células NK, un receptor de tipo Toll y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la célula inmunitaria es una célula T, que se puede desecharin vitrooin vivo,y puede ser de sangre, tejido extraído, tejido cultivadoex-vivo,y medios de cultivo celular. Una célula T puede ser una célula T autóloga o una célula T alogénica. En algunas realizaciones, la dosis comprende 0.5 x 106 células por kilogramo del sujeto, 1.0 x 106 células por kilogramo del sujeto, 2.0 x 106 células por kilogramo del sujeto, 3.0 x 106 células por kilogramo del sujeto, 4.0 x 106 células por kilogramo del sujeto, o 5.0 x 106 células por kilogramo del sujeto. En una realización específica, la dosis comprende 1.0 x 106 células por kg. En otras realizaciones, el marcador detectable se selecciona del grupo que consiste en un marcador fluorescente, un compuesto fotocrómico, un marcador fluorescente proteináceo, un marcador magnético, un radiomarcador y un hapteno. Cuando el marcador detectable es un marcador fluorescente, el marcado fluorescente se puede seleccionar del grupo que consiste en un colorante Atto, un colorante Alexafluor, puntos cuánticos, Hidroxicumarina, Aminocouramina, Metoxicurmarina, Azul Cascada, Azul Pacífico, Naranja Pacífico, Amarillo Lucifer, NBD, R-ficoeritrina (PE), conjugados de PE-Cy5, conjugados de PE-Cy7, Rojo 613, PerCP, TruRojo, FluorX, Fluoresceína, BODIPY-FL, Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, TRITC, X-Rodamina, Lisamina Rocamina B, Rojo Texas, Aloficocianina (APC), APC-Cy7 conjugados, Indo-1, Fluo-3, Fluo-4, DCFH, DHR, SNARF, GFP (mutación Y66H), GFP (mutación Y66F), EBFP, EBFP2, Azurite, GFPuv, T-Sapphire, Cerulean, mCFP, mTurquesa2, ECFP, CyPet, GFP (mutación Y66W), mKeima-Rojo, TagCFP, AmCyan1, mTFP1, GFP (mutación S65A), Midorishi Cyan, GFP de tipo silvestre, GFP (mutación S65C), TurboGFP, TagGFP, GFP (mutación S65L), Esmeralda, GFP (mutación S65T), Eg FP, Verde Azami, ZsVerde1, TagYFP, EYFP, Topaz, Venus, mCitrine, YPet, TurboYFP, ZsAmarillo1, Naranja Kutilizabira, mNaranja, Aloficocianina (APC), mKO, TurboRFP, tdTomate, TagRFP, monómero DsRojo, DsRojo2 ("RFP"), mFresa, TurboFP602, AsRojo2, mRFP1, J-Rojo, R ficoeritrina (RPE), B-ficoeritrina (BPE), mCereza, HcRojo1, Katusha, P3, Clorofila de Peridinina (PerCP), mKate (TagFP635), TurboFP635, mCiruela y mFrambuesa. En aún otras realizaciones, la molécula de unión a antígeno es una molécula de unión a antígeno humanizada.
En otro aspecto, se proporciona un método para activar una célula inmunitaria que expresa una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500). En una realización, el método comprende (a) proporcionar una muestra que comprende una célula inmunitaria que se sabe o se sospecha que expresa una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500); y (b) poner en contacto una molécula de unión a antígeno con la muestra, en condiciones que permitan la formación de un complejo de unión que comprende la molécula de unión a antígeno y dos moléculas que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada, en donde las moléculas que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas se disponen en dos células inmunitarias diferentes.
En algunas realizaciones, la célula inmunitaria seleccionada del grupo que consiste en células T CD8+, células T CD4+, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), células NK, células que expresan TCR, células dendríticas y células NK-T En realizaciones específicas, la molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500) es un CAR. En realizaciones adicionales, el CAR comprende una molécula, o un fragmento de la misma, seleccionada del grupo que consiste en CD2, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8p, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11C (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1 ), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (cadena alpha asociada al complejo receptor de antígeno de células B), CD79B (cadena beta asociada al complejo receptor de antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (Táctil), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A(KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK- p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador inducible de células T (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando de CD83, un receptor Fe gamma, una molécula de MHC de clase 1, una molécula de MHC de clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína de inmunoglobulina, un receptor de citoquinas, una integrina, receptores activadores de células NK, un receptor de tipo Toll y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la célula inmunitaria es una célula T, que se puede desechar in vitro o in vivo, y puede ser de sangre, tejido extraído, tejido cultivado ex vivo, y medios de cultivo celular. Una célula T puede ser una célula T autóloga o una célula T alogénica. En aún otras realizaciones, la molécula de unión a antígeno es una molécula de unión a antígeno humanizada.
En otro aspecto, se proporciona un método para determinar el número de células que presentan una molécula en una muestra en el que la molécula comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500). En una realización, el método comprende (a) proporcionar una muestra que comprende células que se sabe o se sospecha que presentan una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500); (b) poner en contacto la muestra de (a) con una molécula de unión al antígeno que se une específicamente a la secuencia de aminoácidos seleccionada y comprende un marcador detectable, en condiciones que permitan la formación de un complejo de unión que comprende una célula presente en la muestra y la molécula de unión al antígeno; y (c) determinar el número de células presentes en un complejo de unión de (b) en la muestra.
En algunas realizaciones, la molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2) y GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500) es un CAR. En realizaciones específicas, CAR comprende una molécula, o un fragmento de la misma, seleccionado del grupo que consiste en CD2, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8|3, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (cadena alpha asociada al complejo receptor de antígeno de células B), CD79B (cadena alpha asociada al complejo receptor de antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (Táctil), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B2 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), linfocitos T inducibles coestimulador (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando de CD83, un receptor Fe gamma, una molécula de MHC de clase 1, una molécula de MHC de clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína de inmunoglobulina, un receptor de citoquinas, una integrina, activadores de receptores de células NK, un receptor de tipo Toll y combinaciones de los mismos. En otras realizaciones, las células son células inmunitarias seleccionadas del grupo que consiste en células T CD8+, células T CD4+, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), células NK, células que expresan TCR, células dendríticas y células NK-T. En algunas realizaciones, las células son células T, que se pueden desecharin vitrooin vivo,y puede ser de sangre, tejido extraído, tejido cultivadoex-vivo,y medios de cultivo celular. Las células T pueden ser células T autólogas o células T alogénicas. En aún otras realizaciones, la molécula de unión a antígeno es una molécula de unión a antígeno humanizada.
En otro aspecto, se proporciona un método para aislar una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2) , GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500). La molécula puede comprender el aminoácido seleccionado en el extremo N-terminal, el extremo C-terminal, entre dominios, en bucles o en cualquier parte de la molécula que pueda alterar o no la estructura. En una realización, el método comprende (a) proporcionar una muestra que se sabe o se sospecha que comprende una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500); (b) proporcionar una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a la secuencia de aminoácidos seleccionada, opcionalmente que comprende un marcador detectable; (c) poner en contacto la muestra con la molécula de unión al antígeno, en condiciones que permitan la formación de un complejo de unión que comprende una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada y la molécula de unión al antígeno; y (d) separar cualquier molécula que no sea parte de un complejo de unión de los complejos de unión formados; y (e) separar un complejo de unión formado en: (1) una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada, y (2) una molécula de unión a antígeno.
En algunas realizaciones, la molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3) , SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500) es un CAR. En realizaciones específicas, CAR comprende una molécula, o un fragmento de la misma, seleccionada del grupo que consiste en CD2, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8|3, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (cadena alpha asociada al complejo receptor de antígeno de células B), CD79B (cadena beta asociada al complejo receptor de antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (Táctil), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A(KIR2DL1), CD158B2 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador de células T inducible (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando CD83, receptor Fe gamma, Molécula MHC de clase 1, molécula de MHC de clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína de inmunoglobulina, un receptor de citoquinas, una integrina, receptores activadores de células NK, un receptor de tipo Toll y combinaciones de los mismos. En otras realizaciones, la molécula de unión a antígeno se dispone sobre una superficie seleccionada del grupo que consiste en una perla de agarosa, una perla magnética, una placa con pocillos de plástico, una placa con pocillos de vidrio, una placa con pocillos de cerámica y una bolsa de cultivo celular. En otras realizaciones, el marcador detectable se selecciona del grupo que consiste en un marcador fluorescente, un compuesto fotocrómico, un marcador fluorescente proteináceo, un marcador magnético, un radiomarcador y un hapteno. Cuando el marcador detectable es un marcador fluorescente, el marcador fluorescente se puede seleccionar del grupo que consiste en un colorante Atto, un colorante Alexafluor, puntos cuánticos, Hidroxicumarina, Aminocouramina, Metoxicurmarina, Azul cascada, Azul Pacífico, Naranja Pacífico, Amarillo Lucifer, NBD, R-ficoeritrina (PE), conjugados PE-Cy5, conjugados PE-Cy7, rojo 613, PerCP, TruRojo, FluorX, fluoresceína, BODIPY-FL, Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, TRITC, X-Rodamina, Lisamina Rocamina B, Rojo Texas, Aloficocianina (APC), APC-Cy7 conjugados, Indo -1, fluo-3, Fluo-4, DCFH, DHR, SNARF, GFP (mutación Y66<h>), GFP (mutación Y66F), EBFP, EBFP2, Azurite, GFPuv, T-Sapphire, Cerulean, mCFP, mTurquesa2, ECFP, CyPet, GFP (mutación Y66W), mKeima-Rojo, TagCFP, AmCyan1, mTFP1, GFP (mutación S65A), Midorishi Cyan, GFP de tipo silvestre, GFP (s 65C) mutación), TurboGFP, TagGFP, GFP (mutación S65L), Esmeralda, GFP (mutación S65T), Eg Fp, Verde Azami, ZsVerde1, TagYFP, EYFP, Topaz, Venus, mCitrine, YPet, TurboYFP, ZsAmarillo1, Naranja Kutilizabira, mNaranja, Aloficocianina (APC), mKO, TurboRFP, tdTomate, TagRFP, DsRojo monómero, DsRojo2 ("RFP"), mFresa, TurboFP602, AsRojo2, mRFP1, J-Rojo, R-ficoeritrina (RPE), B ficoeritrina (BPE), mCereza, HcRojo1, Katusha, P3, clorofila de peridinina (PerCP), mKate (TagFP635), TurboFP635, mCiruela y mFrambuesa. En aún otras realizaciones, la molécula de unión a antígeno es una molécula de unión a antígeno humanizada.
En otro aspecto, se proporciona un método para determinar la presencia o ausencia de una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500). En realizaciones, el método comprende (a) proporcionar una muestra que se sabe o se sospecha que comprende una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500); (b) proporcionar una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a la secuencia de aminoácidos seleccionada, comprendiendo además la proteína de unión a antígeno un marcador detectable; (c) poner en contacto la muestra con la molécula de unión a antígeno en condiciones que permitan la formación de un complejo de unión; (d) separar cualquier molécula que no sea parte de un complejo de unión de complejos de unión formados; y (e) detectar la presencia o ausencia de un complejo de unión.
En realizaciones, la molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (S<e>Q ID NO: 500) es un C<a r>. En realizaciones adicionales, CAR comprende una molécula, o un fragmento de la misma, seleccionada del grupo que consiste en CD2, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8(3, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEA<c>A<m>3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), C<d>79A (cadena alpha asociada al complejo receptor de antígeno de células B), CD79B (cadena beta asociada al complejo receptor de antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (Táctil), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B2 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador de células T inducible (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando de CD83, receptor Fe gamma, molécula MHC de clase 1, molécula de<m>H<c>de clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína de inmunoglobulina, un receptor de citoquinas, una integrina, receptores activadores de células NK, un receptor de tipo Toll y combinaciones de los mismos. En otras realizaciones, la molécula de unión a antígeno se dispone sobre una superficie seleccionada del grupo que consiste en una perla de agarosa, una perla magnética, una placa con pocillos de plástico, una placa con pocillos de vidrio, una placa con pocillos de cerámica y una bolsa de cultivo celular. En otras realizaciones, el marcador detectable se selecciona del grupo que consiste en un marcador fluorescente, un compuesto fotocrómico, un marcador fluorescente proteináceo, un marcador magnético, un radiomarcador y un hapteno. Cuando el marcador detectable es un marcador fluorescente, el marcador fluorescente se puede seleccionar del grupo que consiste en un colorante Atto, un colorante Alexafluor, puntos cuánticos, Hidroxicumarina, Aminocouramina, Metoxicurmarina, Azul Cascada, Azul Pacífico, Naranja Pacífico, Amarillo Lucifer, NBD, R-ficoeritrina (PE), conjugados PE-Cy5, conjugados PE-Cy7, rojo 613, PerCP, TruRojo, FluorX, Fluoresceína, BODIPY-FL, Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, TRITC, X-Rodamina, Lisamina Rocamina B, Rojo Texas, Aloficocianina (APC), APC-Cy7 conjugados, Indo -1, Fluo-3, Fluo-4, DCFH, DHR, SNARF, GFP (mutación Y66H), GFP (mutación Y66F), EBFP, EBFP2, Azurite, GFPuv, T-Sapphire, Cerulean, mCFP, mTurquesa2, ECFP, CyPet, GFP (mutación Y66W), mKeima-Rojo, TagCFP, AmCyan1, mTFP1, GFP (mutación S65A), Midorishi Cyan, GFP de tipo silvestre, GFP (mutación S65C), TurboGFP, TagGFP, GFP (mutación S65L), Esmeralda, GFP (mutación S65T), e Gf P, Verde Azami, ZsVerde1, TagYFP, EYFP, Topaz, Venus, mCitrine, YPet, TurboYFP, ZsAmarillo1, Naranja Kutilizabira, mNaranja, Aloficocianina (APC), mKO, TurboRFP, tdTomate, TagRFP, DsRojo monómero, DsRojo2 ("RFP"), mFresa, TurboFP602, AsRojo2, mRFP1, J-Rojo, R-ficoeritrina (RPE), B ficoeritrina (BPE), mCereza, HcRojo1, Katusha, P3, clorofila de peridinina (PerCP), mKate (TagFP635), TurboFP635, mCiruela y mFrambuesa. En aún otras realizaciones, la molécula de unión a antígeno es una molécula de unión a antígeno humanizada.
También se proporciona un método para aumentar la concentración de células que presentan una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500). En algunas realizaciones, el método comprende (a) proporcionar una muestra que comprende células que se sabe o se sospecha que comprenden una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2) , GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500); (b) proporcionar una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a la secuencia de aminoácidos seleccionada y opcionalmente comprende un marcador detectable; (c) poner en contacto la muestra con la molécula de unión al antígeno en condiciones que permitan la formación de un complejo de unión que comprende una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada y la molécula de unión al antígeno; (d) eliminar cualquier componente que no forme parte de un complejo de unión; y (e) repetir los pasos (a)-(d) un número deseado de veces.
En realizaciones, (a) la molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500) es un CAR; y (b) las células son células inmunitarias seleccionadas del grupo que consiste en células T CD8+, células T CD4+, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), células NK, células que expresan TCR, células dendríticas y células NK-T. En realizaciones adicionales, CAR comprende una molécula, o un fragmento de la misma, seleccionado del grupo que consiste en CD2, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CDp, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (cadena alpha asociada al complejo receptor de antígeno de células B), CD79B (cadena beta asociada al complejo receptor de antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (Táctil), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B2 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador de células T inducible (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando de CD83, receptor de Fe gamma, molécula de MHC de clase 1, molécula de MHC de clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína de inmunoglobulina, un receptor de citoquinas, una integrina, receptores de células NK activadoras, un receptor de tipo Toll y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, las células son células T, que se pueden desecharin vitrooin vivo,y puede ser de sangre, tejido extraído, tejido cultivadoex-vivo,y medios de cultivo celular. Las células T pueden ser células T autólogas o células T alogénicas. En aún otras realizaciones, la molécula de unión a antígeno es una molécula de unión a antígeno humanizada.
En otro aspecto adicional, se proporciona un método para reducir una población de células (por ejemplo, células inmunitarias) que presenta una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3) , SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500). En realizaciones, el método comprende (a) proporcionar una población de células inmunitarias que se agotarán, en el que se sabe o se sospecha que las células inmunitarias expresan una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y K<p>G<s>G (SEQ ID N<o>: 500); y (b) poner en contacto las células inmunitarias con una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a (a) la molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada, y (b) una molécula activadora presentada en la superficie de esa célula inmunitaria que no comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada, en condiciones que permitan la formación de un complejo de unión temático que comprende la molécula que comprende la molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada, la molécula activadora y la molécula de unión al antígeno.
En realizaciones específicas, la molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500) es un CAR. En realizaciones adicionales, CAR comprende una molécula, o un fragmento de la misma, seleccionada del grupo que consiste en CD2, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8P, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (cadena alpha asociada al complejo receptor de antígeno de células B), CD79B (cadena beta asociada al complejo receptor de antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (Táctil), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B2 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador de células T inducible (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando CD83, receptor Fe gamma, molécula MHC clase 1, molécula MHC clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína de inmunoglobulina, un receptor de citocina, una integrina, receptores de células NK activantes, un receptor de tipo Toll y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la célula inmunitaria es una célula T, que se puede desecharin vitrooin vivo,y puede ser de sangre, tejido extraído, tejido cultivadoex-vivo,y medios de cultivo celular. Una célula T puede ser una célula T autóloga o una célula T alogénica. En aún otras realizaciones, la molécula de unión a antígeno es una molécula de unión a antígeno humanizada.
En un aspecto, la presente invención proporciona un método para monitorizar la distribuciónin vivode una población de células que presenta una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500). En algunas realizaciones, la población de células son células CAR. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para monitorizar la distribuciónin vivode una población de células que presenta una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500) que comprende proporcionar una molécula de unión a antígeno; y realizar una tomografía por emisión de positrones (PET). En algunas realizaciones, proporcionar la molécula de unión a antígeno estimula o agota las células T CAR in vivo. Cualquier referencia a métodos de tratamiento practicados en el cuerpo humano o animal debe interpretarse como compuestos o composiciones para uso en dichos tratamientos.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1A es un diagrama de cintas y la Figura 1B es un diagrama de relleno de espacios de una secuencia de scFv que comprende la secuencia enlazadora de la SEQ ID NO: 1; el enlazador se muestra en gris.
La Figura 2 es una serie de gráficos que muestran los resultados de experimentos de citometría de flujo realizados utilizando células que presentan un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende la secuencia enlazadora de la SEQ ID NO: 1; los resultados se generaron utilizando 1, 10 o 100 ng de un anticuerpo generado a partir de dos clones diferentes (clon 8, izquierda, y clon 16, derecha), y demuestran la unión específica de los anticuerpos al CAR expresado en las tres cantidades.
La Figura 3 es una serie de gráficos que muestran los resultados de los experimentos de citometría de flujo realizados utilizando células que presentan 5 CAR diferentes que comprenden la secuencia enlazadora de la SEQ ID NO: 1; y demostrar la unión específica de los anticuerpos a los CAR expresados.
La Figura 4 es una serie de fotografías que representan los resultados de estudios de inmunohistoquímica (IHC) realizados utilizando células que presentan un CAR; las cifras superiores demuestran la unión específica del anticuerpo Clon 8 y dirigido contra un CAR que comprende la secuencia enlazadora de la SEQ ID NO: 1 a células que presentan el CAR, mientras que las figuras inferiores demuestran la unión específica del anticuerpo Clon 16 y dirigido contra un CAR que comprende la secuencia enlazadora de la SEQ ID NO: 1 a las células que presentan el CAR.
La Figura 5 es un histograma que representa los resultados de los experimentos ELISA de mapeo de epítopos realizados en los anticuerpos Clon 8 y Clon 16; los resultados demuestran que, aunque todos los anticuerpos se unen al 18mer de longitud completa (SEQ ID NO: 1), el Clon 8 se une específicamente a la subsecuencia 10mer GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2) y el Clon 16 se une específicamente a la subsecuencia 8mer GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3). La Figura divulga las SEQ ID NOS 1,485-488, 1 y 489-491, respectivamente, en orden de aparición.
La Figura 6 es una serie de tablas que muestran las regiones CDR1, 2 y 3 de la cadena pesada (HC) y la cadena ligera (LC) de los anticuerpos secretados por los Clones 8 y 16; las CDR de cadena pesada y ligera se muestran para cada anticuerpo utilizando Kabat (SEQ iD NOS 492, 8, 9, 493, 20, 21, 13-15 y 25-27, respectivamente, en orden de aparición), Chothia (SEQ ID NOS 7-9, 19-21, 13-15 y 25-27, respectivamente, en orden de aparición) e IMGT (SEQ iD NOS 494, 8, 9, 495, 20, 21, 13-15 y 25-27, respectivamente, en orden de aparición) sistemas de numeración.
La Figura 7 es una tabla que muestra la secuencia de 18 mer GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) así como los epítopos en esta secuencia donde se unen los anticuerpos del clon 8 (GSGKPGSGEG; SEQ ID NO: 2 y SGKPGSGE; SEQ ID NO: 499) y donde se unen los anticuerpos del clon 16 (GKPGSGEG; SEQ ID NO: 3 y KPGSG; SEQ ID NO: 500).
La Figura 8 es una serie de tablas que muestran formas humanizadas de las moléculas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento.
La Figura 9 es un gráfico de barras que indica regiones de la SEQ ID NO: 1 donde se encontró que las moléculas de unión a antígeno descritas en el presente documento se unen a través del mapeo de epítopos por ELISA. Este ensayo reduce aún más los epítopos del anticuerpo enlazador del ELISA que se muestra en la Figura 5 utilizando una gama más estrecha de secuencias peptídicas que se centran en la región identificada en el experimento anterior.
La Figura 10 es el resultado de los gráficos de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) que muestran células CAR-T que se activaron negativa y positivamente utilizando las moléculas de unión a antígeno descritas en el presente documento.
La Figura 11 es una serie de gráficos de barras que muestran los resultados dein vitroestimulación de células CAR-T utilizando anticuerpos OKT3 y el anticuerpo antienlazador divulgado en el presente documento. Mientras que OKT3 activa todas las células T en una población determinada, el MAb antienlazador activa preferentemente y, por lo tanto, enriquece la población de células CAR-T a lo largo del tiempo, como se muestra utilizando un gradiente de proporciones de población CAR+ a CAR-.
Las Figuras 12A y 12B son una serie de gráficos de barras y gráficos que muestran los efectos de estimulaciónin vitrode células positivas para CAR-T; las figuras muestran que los anticuerpos OKT3 estimularon todas las células T, mientras que las moléculas de unión a antígeno divulgadas en el presente documento estimularon selectivamente sólo las células positivas para CAR-T.
La Figura 13 muestra la formación de imágenes FDG-PET de ratones NSG hembra inyectados previamente con células T CAR antes y después de la estimulación con antienlazador Clon 8 Mab.
Las Figuras 14A y 14B demuestran que el diacuerpo incubado con constructos CAR que comprenden el péptido GSTSGSGKPGSGEGSTKG conduce a un aumento de la muerte celular. Como se muestra en la Fig. 14A, a medida que aumenta la concentración de diacuerpo, se observa una intensidad de fluorescencia mediana mayor en el promedio de tres réplicas de constructos CAR que contienen el péptido específico. Cuando se incuban con el diacuerpo células transducidas con CAR o simuladas de control, no hay un aumento significativo en la cantidad de fluorescencia del colorante citotóxico. En la Fig. 14B, el porcentaje de células T CAR+ se mide en función del aumento de la concentración de diacuerpos.
Descripción detallada de la invención
La presente divulgación se refiere a moléculas de unión a antígeno, incluyendo los anticuerpos, que se unen específicamente a una fracción que comprende la secuencia GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), así como formas humanizadas de las moléculas de unión a antígeno, moléculas que comprenden la SEQ ID NO: 1,2, 3, 499 y/o 500, células que presentan tales moléculas, polinucleótidos que codifican las moléculas y vectores que comprenden los polinucleótidos; célulasin vitroque comprenden los polinucleótidos y los vectores también se divulgan.
Se proporcionan métodos para utilizar las moléculas de unión a antígeno divulgadas. Las moléculas de unión a antígeno, polinucleótidos, vectores, célulasin vitroy los métodos descritos en el presente documento se pueden utilizar en una variedad de aplicaciones,por ejemplo,como reactivos para detectar la presencia de moléculas que comprenden GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), y células que presentan dichas moléculas, cuantificando la cantidad de una molécula que comprende las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 499 y/o 500, moléculas y células que presentan tales moléculas, cribado de moléculas que comprenden las SEQ ID NOs: 1,2, 3, 499 y/o 500, y células que presentan dichas moléculas, moléculas purificadoras que comprenden las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 499 y/o 500, y células que presentan dichas moléculas, y estudios de biomarcadores centrados en moléculas que comprenden las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 499 y/o 500, y células que presentan dichas moléculas. También se proporcionan usos terapéuticos, por ejemplo, aplicaciones en las que la actividad biológica de una molécula que comprende las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 499 y/o 500, y las células que presentan dichas moléculas, se modula (mejora o reprime), así como estudios de intervalo de dosis relacionados con la terapéutica que comprenden las SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 499 y/o 500, y células que presentan dichas moléculas.
Las moléculas de unión a antígeno (anticuerpos) divulgadas en el presente documento se generaron a partir de hibridomas generados utilizando células B de origen de conejo, pero pueden humanizarse fácilmente utilizando métodos estándar conocidos por los expertos en la técnica, así como los descritos en el presente documento. En el presente documento se proporcionan formas humanizadas representativas de las moléculas de unión a antígeno divulgadas.
I. Definiciones
Con el fin de que la presente divulgación pueda entenderse más fácilmente, primero se definen ciertos términos. Tal como se utiliza en esta solicitud, excepto que se indique expresamente lo contrario en el presente documento, cada uno de los siguientes términos tendrá el significado que se establece a continuación. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la solicitud. Los encabezados proporcionados en el presente documento no son limitaciones de los diversos aspectos de la divulgación, cuyos aspectos pueden entenderse por referencia a la memoria descriptiva como un todo.
Se entiende que siempre que se describan aspectos en el presente documento con el lenguaje "que comprende", también se proporcionan aspectos análogos descritos en términos de "que consisten en" y/o "que consisten esencialmente en".
Las unidades, los prefijos y los símbolos utilizados en el presente documento se proporcionan utilizando su forma aceptada Systeme International de Unites (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que se refiere esta divulgación. Por ejemplo, Juo, The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, 2da ed., (2001), CRC Press; The Dictionary of Cell & Molecular Biology, 5ta ed., (2013), Academic Press; yThe Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Cammack et al. eds., 2da ed, (2006), Oxford University Press, proporciona a los expertos en la técnica un diccionario general para muchos de los términos utilizados en esta divulgación.
Como se utiliza en el presente documento, los veinte aminoácidos convencionales (por ejemplo, de origen natural) y sus abreviaturas siguen el uso convencional.Véase, por ejemplo,Immunology - A Synthesis (2a edición), Golub y Green, eds., Sinauer Assoc., Sunderland, Mass. (1991). Estereoisómeros(porejemplo,D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como alpha-, alpha-aminoácidos disustituidos, N-alquilaminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato, epsilon N,N,N-trimetillisina, e-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, sigma-N-metilarginina y otros amino similares ácidos e iminoácidos(por ejemplo,4-hidroxiprolina). En la notación polipeptídica utilizada en el presente documento, la dirección de la izquierda es la dirección amino terminal y la dirección de la derecha es la dirección carboxi terminal, de acuerdo con el uso y la convención estándar.
Tal como se usa en el presente documento, el término los términos "un" y "una" se utilizan por convención estándar y significan uno o más, a menos que el contexto dicte lo contrario.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "aproximadamente" se refiere a un valor o composición que se encuentra dentro de un intervalo de error aceptable para el valor o composición en particular según lo determinado por un experto en la técnica, que dependerá en parte de cómo el valor o la composición se mide o determina,es decir,las limitaciones del sistema de medida. Por ejemplo, "aproximadamente" o "que comprende esencialmente" puede significar dentro de una o más de una desviación estándar según la práctica en la técnica. Alternativamente, "aproximadamente" o "que comprende esencialmente" puede significar un intervalo de hasta 10 %(es decir,±10 %). Por ejemplo, aproximadamente 5 mg pueden incluir cualquier número entre 4.5 mg y 5.5 mg. Además, particularmente con respecto a sistemas o procesos biológicos, los términos pueden significar hasta un orden de magnitud o hasta 5 veces un valor. Cuando se proporcionan valores o composiciones particulares en la presente divulgación, a menos que se indique lo contrario, se debe suponer que el significado de "aproximadamente" o "que comprende esencialmente" está dentro de un intervalo de error aceptable para ese valor o composición en particular.
Tal como se describe en el presente documento, se debe entender que cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de relación o intervalo de números enteros incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo indicado y, cuando corresponda, fracciones de los mismos (tal como una décima y una centésima). de un número entero), a menos que se indique lo contrario.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "y/o" debe tomarse como una divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por lo tanto, el término "y/o" como se utiliza en una frase tal como "A y/o B" en el presente documento pretende incluir "A y B", "A o B", "A" (solo) y "B " (solo). Asimismo, el término "y/o" como se utiliza en una frase tal como "A, B y/o C" pretende abarcar cada uno de los siguientes aspectos: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).
Tal como se utiliza en el presente documento, el término el uso de la alternativa(por ejemplo,"o") debe entenderse que significa una, ambas o cualquier combinación de las alternativas.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "alogénico" se refiere a cualquier material derivado de un individuo que luego se introduce en otro individuo de la misma especie,por ejemplo,trasplante alogénico de células T.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" (Ab) incluye, sin limitación, una inmunoglobulina de glicoproteína que se une específicamente a un antígeno. En general, un anticuerpo puede comprender al menos dos cadenas pesadas (HC) y dos cadenas ligeras (LC) interconectadas por enlaces disulfuro, o una molécula de unión a antígeno de las mismas. Cada cadena HC comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios constantes, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena LC comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende un dominio constante, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL comprende tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los Abs pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, incluyendo diversas células del sistema inmunitario.(por ejemplo,células efectoras) y el primer componente del sistema del complemento clásico (C1q).
El término "anticuerpo" también abarca una inmunoglobulina intacta o una porción de unión a antígeno de la misma que compite con el anticuerpo intacto por la unión específica, a menos que se especifique lo contrario. Las porciones de unión a antígeno se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Las porciones de unión a antígeno incluyen, entre otros, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio (dAbs), fragmentos que incluyen regiones determinantes de la complementariedad (CDR), anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir la unión específica del antígeno al polipéptido.
El término "anticuerpo" incluye anticuerpos tanto naturales como no naturales (producidos de forma recombinante), anticuerpos humanos y no humanos, anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos multiespecíficos (incluyendo los anticuerpos biespecíficos), inmunoglobulinas, anticuerpos sintéticos, anticuerpos tetraméricos que comprenden dos cadenas y dos moléculas de cadena ligera, un monómero de cadena ligera de anticuerpo, un monómero de cadena pesada de anticuerpo, un dímero de cadena ligera de anticuerpo, un dímero de cadena pesada de anticuerpo, un par de cadena ligera de anticuerpo-cadena pesada de anticuerpo, intracuerpos(ver, por ejemplo,Stocks, (2004)Drug Discovery Today9(22):960-66), fusiones de anticuerpos (cuyo término abarca conjugados de anticuerpo-fármaco) y que a veces se denominan en el presente documento "conjugados de anticuerpo"), anticuerpos heteroconjugados, anticuerpos de dominio único, anticuerpos monovalentes, anticuerpos de cadena única o Fvs monocatenarios (scFv), anticuerpos camellizados, affycuerpos, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, Fvs enlazados por disulfuro (sdFv), anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anti-anti-Id anticuerpos), minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (a veces denominados "miméticos de anticuerpos") y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En ciertas realizaciones, los anticuerpos divulgados en el presente documento se refieren a poblaciones de anticuerpos policlonales.
Un anticuerpo no humano puede humanizarse utilizando métodos recombinantes para reducir su inmunogenicidad en humanos, como se divulga en el presente documento con respecto a los anticuerpos que se unen específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan tales moléculas. En el presente documento se proporcionan ejemplos de anticuerpos humanizados. Cuando no se indique expresamente, y a menos que el contexto indique lo contrario, el término "anticuerpo" también incluye un fragmento de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno de cualquiera de las inmunoglobulinas antes mencionadas, e incluye un fragmento monovalente y divalente o porción, y un anticuerpo monocatenario(es decir,un scFv).
En diversas realizaciones, un anticuerpo se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO. 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden estas secuencias y células que presentan tales moléculas. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a un CAR (o componente del mismo) que comprende las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 499 y/o 500, moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan tales moléculas; células que presentan las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 y/o 500 pueden ser, pero no necesariamente, una célula inmunitaria, tal como una célula T.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "antígeno" significa cualquier molécula que provoque una respuesta inmunitaria o que sea capaz de unirse a un anticuerpo u otra molécula de unión a antígeno. La respuesta inmunitaria puede implicar la producción de anticuerpos o la activación de células inmunológicamente competentes específicas, o ambas. Los expertos en la técnica comprenderán fácilmente que cualquier macromolécula, incluyendo prácticamente todas las proteínas o péptidos (incluyendo las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 y/o 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan tales moléculas), pueden servir como antígeno. En general, un antígeno puede expresarse endógenamente,es decirexpresado por ADN genómico, o puede expresarse recombinantemente, o puede sintetizarse químicamente. En una realización particular, un antígeno comprende la totalidad o una porción de GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden estas secuencias, que opcionalmente se conjuga con un adyuvante tal como hemocianina de lapa californiana (KLH).
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "molécula de unión a antígeno" significa una proteína que comprende una porción que se une a un antígeno o proteína objetivo y, opcionalmente, una porción de marco o armazón que permite que la porción de unión a antígeno adopte una conformación que promueve la unión de la molécula de unión al antígeno al antígeno. Los ejemplos de los tipos representativos de moléculas de unión a antígeno incluyen un scFv, un anticuerpo humano, de ratón o de conejo; un anticuerpo humanizado; un anticuerpo quimérico; un anticuerpo recombinante; un anticuerpo de cadena sencilla; un diacuerpo; un tricuerpo; un tetracuerpo; un fragmento Fab; un fragmento F(ab')2; un anticuerpo IgD; un anticuerpo IgE; un anticuerpo IgM; un anticuerpo IgG1; un anticuerpo IgG2; un anticuerpo IgG3; o un anticuerpo IgG4, y fragmentos del mismo.
Una molécula de unión a antígeno puede comprender, por ejemplo, un armazón proteico alternativo o un armazón artificial con regiones determinantes de complementariedad (CDR) injertadas o derivados de CDR. Dichos armazones incluyen, pero no se limitan a, armazones derivados de anticuerpos que comprenden mutaciones introducidas, por ejemplo, para estabilizar la estructura tridimensional de la molécula de unión al antígeno, así como armazones totalmente sintéticos que comprenden, por ejemplo, un polímero biocompatible.Véase, por ejemplo,Komdorfer et al., 2003,Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics,53(1):121-129 (2003); Roque et al.,Biotechnol. Prog.20:639-654 (2004). Además, se pueden utilizar miméticos de anticuerpos peptídicos ("PAM"), así como armazones basados en miméticos de anticuerpos que utilizan diversos componentes.(por ejemplo,fibronectina) tal como un armazón. Una molécula de unión a antígeno puede tener, por ejemplo, la estructura de una inmunoglobulina natural.
Una molécula de unión a antígeno puede tener uno o más sitios de unión. Si hay más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina humana natural normalmente tiene dos sitios de unión idénticos, mientras que un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene dos sitios de unión diferentes y es capaz de unirse específicamente a dos antígenos diferentes(porejemplo,las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 499 y/o 500 y una molécula activadora de la superficie celular).
En diversas realizaciones, una molécula de unión a antígeno es un anticuerpo o un fragmento del mismo, que incluye una o más de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) divulgadas en el presente documento y que se muestran en las FIGURAS 6 y 8, que se unen específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 499 y/o 500, y células que presentan dichas moléculas. En realizaciones adicionales, la molécula de unión a antígeno se une a un CAR que comprende las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 499 y/o 500, y puede expresarse en una célula inmunitaria, tal como una célula T.
El término "autólogo" se refiere a cualquier material derivado del mismo individuo al que se le va a volver a introducir más tarde. Por ejemplo, los métodos de terapia de células autólogas diseñadas (eACT™) descritos en el presente documento implican la recolección de linfocitos de un paciente, que luego se diseñan para expresar un constructo,por ejemplo,una un constructo CAR, y luego se vuelve a administrar al mismo paciente.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "afinidad de unión" significa la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de unión de una molécula(por ejemplo,una molécula de unión a antígeno, tal como un anticuerpo) y su compañero de unión(por ejemplo,un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal como se utiliza en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión(por ejemplo,anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y generalmente se puede representar mediante la constante de disociación (Kd). La afinidad se puede medir y/o expresar de varias maneras conocidas en la técnica, que incluyen, entre otras, la constante de disociación en equilibrio (Kd) y la constante de asociación en equilibrio (Ka). La Kd se calcula a partir del cociente de koff/kon, mientras que Ka se calcula a partir del cociente de kon/koff. kon se refiere a la constante de tasa de asociación de,por ejemplo,un anticuerpo contra un antígeno, y koff se refiere a la disociación de,por ejemplo,un anticuerpo contra un antígeno. La kon y la koff pueden determinarse mediante técnicas estándar conocidas por los expertos en la técnica, tal como BIAcore® o KinExA o resonancia de plasma de superficie.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "región determinante de la complementariedad" o "CDR" significa una secuencia de aminoácidos que contribuye a la especificidad y afinidad de unión al antígeno. Las regiones marco pueden ayudar a mantener la confirmación adecuada de las CDR para promover la unión entre la molécula de unión al antígeno y un antígeno. Hay tres CDR en cada una de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, que se denominan CDR1, CDR2 y CDR3, para cada una de las regiones variables. Los límites exactos de las CDR se han definido de manera diferente de acuerdo con los diferentes sistemas.
Comúnmente se utilizan varias definiciones de las CDR: Numeración Kabat, numeración Chothia, numeración AbM o numeración de contacto. La definición de AbM es un compromiso entre los sistemas Kabat y Chothia, y la utiliza el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular.
El sistema descrito por Kabat (Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) y (1991)) proporciona un sistema de numeración de residuos aplicable a cualquier región variable de un anticuerpo, y también proporciona límites de residuos precisos que definen las tres CDR.
Chothia and coworkers (Chothia y Lesk, (1987)J Mol. Biol.,196:901-917; y Chothiaet al.,(1989)Nature,342: 877 883) encontraron que ciertas subporciones dentro de las CDR de Kabat adoptan conformaciones de esqueleto peptídico casi idénticas, a pesar de tener una gran diversidad a nivel de secuencia de aminoácidos. Las CDR de Chothia tienen límites que se superponen con las CDR de Kabat. Otros límites que definen las CDR que se superponen con las CDR de Kabat han sido descritos por Padlan et al. ((1995)FASEB J,9:133-139) y MacCallumet al.((1996)JMol. Biol.,262(5):732-745). Aún otras definiciones de límites de CDR pueden no seguir estrictamente uno de los sistemas descritos, pero sin embargo se superpondrá con las CDR de Kabat, aunque pueden acortarse o alargarse a la luz de la predicción o los hallazgos experimentales de que determinados residuos o grupos de residuos o incluso las CDR completas no afectan significativamente la unión al antígeno. Los métodos utilizados en el presente documento pueden utilizar CDR definidas de acuerdo con cualquiera de estos sistemas, aunque las realizaciones ejemplares utilizanChotiaCDR definidas.
La Tabla A define CDR utilizando cada sistema de numeración. La definición de contacto se basa en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles.
Tabla A
El término "numeración de Kabat" y términos similares se reconocen en la técnica y se refieren a un sistema de numeración de residuos de aminoácidos en las regiones variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo, o una molécula de unión a antígeno del mismo. En ciertos aspectos, la CDR de un anticuerpo se puede determinar de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat(véase, por ejemplo,Kabatet al.en secuencias de Proteins of lmmunological Interest, 5ta Ed, NIH Publicación 91-3242, Bethesda MD 1991). Utilizando el sistema de numeración de Kabat, CDR dentro de una molécula de cadena pesada de anticuerpo están típicamente presentes en las posiciones de aminoácidos 31 a 35, que opcionalmente pueden incluir uno o dos aminoácidos adicionales, después de 35 (denominado en el esquema de numeración de Kabat como 35A y 35B) (CDR1), posiciones de aminoácidos 50 a 65 (CDR2) y posiciones de aminoácidos 95 a 102 (CDR3). Utilizando el sistema de numeración de Kabat, las CDR dentro de una molécula de cadena ligera de anticuerpo están típicamente presentes en las posiciones de aminoácidos 24 a 34 (CDR1), posiciones de aminoácidos 50 a 56 (CDR2) y posiciones de aminoácidos 89 a 97 (CDR3). En una realización específica, las CDR de los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden describir de acuerdo con el esquema de numeración de Kabat, aunque se pueden interpretar fácilmente en otros sistemas de numeración utilizando la Tabla A.
En ciertos aspectos, las CDR de un anticuerpo se pueden determinar de acuerdo con el esquema de numeración de Chothia, que se refiere a la ubicación de los bucles estructurales de inmunoglobulina(véase, por ejemplo,Chothia C y Lesk AM, (1987),J Mol Biol196: 901-917; Al-Lazikani bet al.,(1997)J Mol Biol273: 927-948; Chothia Cet al.,(1992)J Mol Biol227: 799-817; Tramontano Aet al.,(1990)J Mol Biol215(1): 175-82; y Patente de EE.UU. No. 7,709,226). Por lo general, cuando se utiliza la convención de numeración de Kabat, el bucle Chothia CDR-H1 está presente en los aminoácidos de cadena pesada 26 a 32, 33 o 34, el bucle Chothia CDR-H2 está presente en los aminoácidos de cadena pesada 52 a 56 y el bucle Chothia CDR-H3 está presente en los aminoácidos de cadena pesada 95 a 102, mientras que el bucle Chothia CDR-L1 está presente en los aminoácidos de cadena ligera 24 a 34, el bucle Chothia CDR-L2 está presente en los aminoácidos de cadena ligera 50 a 56, y el bucle Chothia CDR-L3 está presente en los aminoácidos de cadena ligera 89 a 97. El extremo del bucle Chothia CDR-HI cuando se numera utilizando la convención de numeración de Kabat varía entre H32 y H34 según la longitud del bucle (esto se debe a que el esquema de numeración de Kabat coloca las inserciones en h 35A y H35B; si no están presentes ni 35A ni 35B, el bucle termina en 32; si solo está presente 35A, el bucle termina en 33; si están presentes tanto 35A como 35B, el bucle termina en 34). Véase la Tabla A. En una realización específica, las CDR de los anticuerpos descritos en el presente documento se han determinado de acuerdo con el esquema de numeración de Chothia, como se muestra en las FIGURAS 6 y 8.
Como se utiliza en el presente documento, una "sustitución conservativa de aminoácidos" es aquella en la que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas(por ejemplo,lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas(por ejemplo,ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga(por ejemplo,glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares(por ejemplo,alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales ramificadas beta(por ejemplo,treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas(por ejemplo,tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). En ciertas realizaciones, uno o más residuos de aminoácidos dentro de una CDR o dentro de una región marco de un anticuerpo o molécula de unión a antígeno proporcionada en el presente documento (o un fragmento del mismo) puede reemplazarse con un residuo de aminoácido con una cadena lateral similar.
Las sustituciones conservativas de aminoácidos, que están abarcadas por la presente divulgación, pueden abarcar residuos de aminoácidos no naturales, que normalmente se incorporan mediante síntesis de péptidos químicos en lugar de mediante síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas invertidas o invertidas de fracciones de aminoácidos. Los residuos naturales se pueden dividir en clases con base en las propiedades comunes de la cadena lateral:
Hidrófoba: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
Hidrofílica neutral: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
Ácida; Asp, Glu;
Básica: His, Lys, Arg;
Residuos que influencian la orientación de cadena: Gly, Pro; Y
Aromática: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservadoras pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Dichos residuos sustituidos se pueden introducir, por ejemplo, en regiones de un anticuerpo humano que son homólogas con anticuerpos no humanos, o en las regiones no homólogas de la molécula. Las sustituciones conservativas de aminoácidos ejemplares se exponen en la Tabla B a continuación.
Tabla B
Residuos Originales Sustituciones Ejemplares Sustituciones Preferidas
Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "región constante" y "dominio constante" son intercambiables y tienen un significado común en la técnica. La región constante es una porción de anticuerpo,por ejemplo,una porción terminal carboxilo de una cadena ligera y/o pesada que no está directamente implicada en la unión de un anticuerpo a un antígeno pero que puede exhibir diversas funciones efectoras, tal como la interacción con el receptor de Fc La región constante de una molécula de inmunoglobulina generalmente tiene una secuencia de aminoácidos más conservada con respecto a un dominio variable de inmunoglobulina.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "competencia cruzada" significa la situación en la que la interacción entre un antígeno y una primera molécula de unión a antígeno o fragmento de unión del mismo bloquea, limita, inhibe o reduce de otro modo la capacidad de una molécula de unión a antígeno de referencia o fragmento de unión. del mismo para interactuar con el antígeno. La competencia cruzada puede ser completa,por ejemplo,la unión de la molécula de unión al antígeno bloquea completamente la capacidad de la molécula de unión de referencia para unirse al antígeno, o puede ser parcial,por ejemplo,la unión de la molécula de unión al antígeno reduce la capacidad de la molécula de unión de referencia para unirse al antígeno. En determinadas realizaciones, una molécula de unión a antígeno que compite de forma cruzada con una molécula de unión a antígeno de referencia se une al mismo epítopo o a un epítopo superpuesto que la molécula de unión a antígeno de referencia. En otras realizaciones, la molécula de unión a antígeno que compite de forma cruzada con una molécula de unión a antígeno de referencia se une a un epítopo diferente al de la molécula de unión a antígeno de referencia. Se pueden utilizar numerosos tipos de ensayos de unión competitiva para determinar si una molécula de unión a antígeno compite con otra, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecto en fase sólida (RIA); inmunoensayo enzimático directo o indirecto (EIA) en fase sólida; ensayo de competencia tipo intercalado (Stahliet al.,(1983)Method Enzymol9:242-53); biotina-avidina directa en fase sólida EIA (Kirklandet al.,(1986)J inmunol137:3614-19); ensayo marcado directo en fase sólida, ensayo intercalado marcado directo en fase sólida (Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); marcador directo en fase sólida RIA utilizando marcador I125 ((Morelet al.,(1988)Malee Immunol25:7-15); biotina-avidina directa en fase sólida EIA (Cheunget al.,(1990)Virology176:546-52); y marcado directo RIA (Moldenhaueret al.,(1990)Scand J Immunol32:77-82).
El término "derivado" se refiere a una molécula que incluye una modificación química distinta de una inserción, deleción o sustitución de aminoácidos (o ácidos nucleicos). En ciertas realizaciones, los derivados comprenden modificaciones covalentes que incluyen, pero no se limitan a, enlaces químicos con polímeros, lípidos u otros restos orgánicos o inorgánicos. En determinadas realizaciones, una molécula de unión a antígeno modificada químicamente (un derivado) puede tener una semivida en circulación mayor que una molécula de unión a antígeno que no está modificada químicamente. En algunas realizaciones, una molécula de unión a antígeno derivada se modifica covalentemente para incluir una o más uniones poliméricas solubles en agua, que incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol, polioxietilenglicol o polipropilenglicol.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "diacuerpo" o dAB significa anticuerpos bivalentes que comprenden dos cadenas polipeptídicas, en donde cada cadena polipeptídica comprende dominios VH y VL unidos por un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre dos dominios en la misma cadena, lo que permite cada dominio para emparejarse con un dominio complementario en otra cadena polipeptídica(véase, por ejemplo,Holligeret al.,(1993)Proc Natl Acad Sci EE. UU..90:6444-48, Poljaket al.,(1994)Structure2: 1121-23, y Perisicet al.,(1994)Strucure2(12): 1217-26). Si las dos cadenas polipeptídicas de un diacuerpo son idénticas, el diacuerpo resultante de su emparejamiento tendrá dos sitios de unión a antígeno idénticos. Las cadenas polipeptídicas que tienen diferentes secuencias se pueden utilizar para hacer un diacuerpo con dos sitios de unión a antígeno diferentes. De manera similar, los tricuerpos y tetracuerpos son anticuerpos que comprenden tres y cuatro cadenas polipeptídicas, respectivamente, y que forman tres y cuatro sitios de unión a antígeno, respectivamente, que pueden ser iguales o diferentes.
Tal como se utiliza en el presente documento, un "epítopo" es un término en la técnica y se refiere a una región localizada de un antígeno a la que se puede unir específicamente un anticuerpo. Un epítopo puede ser, por ejemplo, aminoácidos contiguos de un polipéptido (epítopo lineal o contiguo) o un epítopo puede, por ejemplo, provenir de dos o más regiones no contiguas de un polipéptido o polipéptidos (conformacionales, no lineales, discontinuos, o epítopo no contiguo). En determinadas realizaciones, el epítopo al que se une un anticuerpo puede determinarse mediante,por ejemplo,Espectroscopía de RMN, estudios de cristalografía de difracción de rayos X, ensayos ELISA, intercambio de hidrógeno/deuterio junto con espectrometría de masas(por ejemplo,cromatografía líquida, espectrometría de masas por electropulverización), ensayos de escaneo de oligopéptidos basados en arreglos y/o mapeo de mutagénesis(por ejemplo,mapeo de mutagénesis dirigida al sitio). Para la cristalografía de rayos X, la cristalización se puede lograr utilizando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica(por ejemplo,Giegeet al., (l994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr50 (Pt 4): 339-350; McPherson, (1990)Eur J Biochem189: 1-23; Chayen, (1997)Structure5: 1269-1274; McPherson, (1976)J Biol Chem251: 6300-6303). Los cristales de anticuerpo: antígeno se pueden estudiar utilizando técnicas de difracción de rayos X bien conocidas y se pueden refinar utilizando software de ordenador tal como X-PLOR (Yale University, 1992, distribuido por Molecular Simulations, Inc.;véase, por ejemplo, Meth Enzymol(1985) Vols. 114 y 115, eds. Wyckoffet al.),y BUSTER (Bricogne, (1993)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr49 (Pt 1): 37-60; Bricogne,(l997)Meth Enzymol276A: 361-423, ed. Carter; Roversiet al.,(2000)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr56(Pt 10): 1316-1323). Los estudios de mapeo de mutagénesis se pueden realizar utilizando cualquier método conocido por un experto en la técnica.Véase, por ejemplo,Champeet al.,(1995)J Biol Chem270: 1388-94 y Cunningham & Wells, (1989)Science244: 1081-85 para una descripción de técnicas de mutagénesis, incluyendo técnicas de mutagénesis de escaneo de alanina y arginina.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "fragmento Fab" significa un fragmento monovalente que tiene los dominios VL, VH, CL y CH; un "fragmento F(ab')<2>" es un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un "fragmento Fv" tiene los dominios VH y VL de un solo brazo de un anticuerpo; y un "fragmento dAb" tiene un dominio VH, un dominio VL o un fragmento de unión a antígeno de un dominio VH o VL.
Tal como se utiliza en el presente documento, los términos "se une inmunoespecíficamente", "reconoce inmunoespecíficamente", "se une específicamente" y "reconoce específicamente" son términos análogos y se utilizan indistintamente en el contexto de moléculas de unión a antígeno, y significa que una molécula dada se une preferentemente a un antígeno(por ejemplo,epítopo o inmunocomplejo) tal como lo entenderá un experto en la técnica. Por ejemplo, una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno puede unirse a otros péptidos o polipéptidos, pero con una afinidad comparativamente más baja según lo determinado por,por ejemplo,inmunoensayos, BIAcore®, instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Instruments, Boise, ID), u otros ensayos conocidos en la técnica. En una realización específica, las moléculas que se unen específicamente a un antígeno se unen al antígeno con una Ka que es al menos 2 log, 2,5 log, 3 log, 4 log o mayor que la Ka cuando las moléculas se unen a otro antígeno.
En otra realización, las moléculas que se unen específicamente a un antígeno(por ejemplo,GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas) se unen con una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 1 x 10'7 M. En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno se une específicamente a un antígeno(por ejemplo,las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 499 y/o 500, moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas) con "alta afinidad" cuando la Kd es de aproximadamente 1 x 10' 9 M a aproximadamente 5 x 10‘9 M. En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno se une específicamente a un antígeno(por ejemplo,las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 499 y/o 500, moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas) con "muy alta afinidad" cuando la Kd es 1 x 10‘1° M a aproximadamente 5 x 10‘1° M.
En otra realización más, las moléculas que se unen específicamente a un antígeno(porejemplo,las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 499 y/o 500, las moléculas que comprenden estas secuencias y las células 20 que presentan dichas moléculas) no reaccionan de forma cruzada con otras proteínas en condiciones de unión similares. En otra realización específica, las moléculas que se unen específicamente a un antígeno(por ejemplo,las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 499 y/o 500, las moléculas que comprenden estas secuencias y las células que presentan dichas moléculas) no reaccionan de forma cruzada con otras proteínas que no comprenden las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 499 y/o 500, moléculas que comprenden estas secuencias y células que presentan tales moléculas. En una realización específica, en el presente documento se proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 499 y/o 500, moléculas que comprenden estas secuencias y células que presentan dichas moléculas, con mayor afinidad que por otro antígeno no relacionado. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona una molécula de unión a antígeno(porejemplo,un anticuerpo) o un fragmento del mismo que se une a las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 499 y/o 500, moléculas que comprenden estas secuencias y células que presentan tales moléculas como moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan tales moléculas, con un 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o mayor afinidad que a otro antígeno no relacionado según lo medido por,por ejemplo,un radioinmunoensayo, resonancia de plasma de superficie o ensayo de exclusión cinética. En una realización específica, el grado de unión de una molécula de unión a antígeno, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 499 y/o 500, moléculas que comprenden estas secuencias y células que presentan tales moléculas, descritas en el presente documento en comparación con una proteína no relacionada que no comprende las SEQ ID NOs: 1, 2, 3,499 y/o 500, es inferior al 10 %, 15 % o 20 % de la unión del anticuerpo a la proteína del fragmento enlazador, medida por,por ejemplo,un radioinmunoensayo.
Como se utiliza en el presente documento, el término "cadena pesada" cuando se utiliza en referencia a un anticuerpo<puede referirse a cualquier tipo distinto, por ejemplo, alpha (a), delta (5), épsilon>(<e>),<gamma>(<y>)<y mu (|j), basados en>la secuencia de aminoácidos del dominio constante, que dan lugar a las clases IgA, IgD, IgE, IgG e IgM de anticuerpos, respectivamente, incluidas las subclases de IgG,por ejemplo,IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "inmunoglobulina" significa una molécula inmune de cualquiera de los isotipos comúnmente conocidos, incluyendo, pero sin limitarse a, IgA, IgA secretora, IgG e IgM. Las subclases de IgG también son bien conocidas por los especialistas en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas. Muchas de las moléculas descritas en el presente documento son inmunoglobulinas. Tal como se utiliza en el presente documento, "isotipo" significa la clase o subclase de anticuerpo(por ejemplo,IgM o IgG1) que está codificado por los genes de la región constante de la cadena pesada.
Una inmunoglobulina es una molécula tetramérica, normalmente compuesta por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 130 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alpha o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA o IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variable y constante están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, y la cadena pesada también incluye una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase en general, Berzofsky & Berkower, en Fundamental Immunology (Paul, (ed), Lippincott Williams & Wilkins (2012)). Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo de manera que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de unión primarios.
Las cadenas de inmunoglobulinas naturales exhiben la misma estructura general de regiones marco (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad o "CDR". Desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal, tanto la cadena ligera como la pesada comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio se puede realizar de acuerdo con las definiciones de Kabat(véase, por ejemplo,Kabatet al.en Seguences of Proteins of lmmunological Interest, 5.a Ed., NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991)) o Chothia (Chothia, utilizado en el presente documento,(véase, por ejemplo,Chothia y Lesk (1987),Jmol. Biol.196:901-917; Chothiaet al.,1989,Nature342:878-883 o Honegger & Pluckthun (2001),J Mol Biol309:657-670). Los sistemas de numeración Kabat, Chothia y Abm (Oxford Molecular) se describen más completamente en el presente documento.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término"célula in vitro" se refiere a cualquier célula que se cultivaex vivo.Una célulain vitropuede incluir una célula humana tal como una célula T o una célula dendrítica, o puede incluir CHO, sP2/0, conejo y otras células no humanas.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cadena ligera" cuando se utiliza en referencia a un anticuerpo<puede referirse a cualquier tipo distinto, por ejemplo, kappa>(<k>)<o lambda>(<á>)<con base en la secuencia de aminoácidos>de los dominios constantes. Las secuencias de aminoácidos de cadena ligera son conocidas en la técnica. En realizaciones específicas, la cadena ligera es una cadena ligera humana.
El término "neutralizante" se refiere a una molécula de unión a antígeno, scFv, anticuerpo, o un fragmento del mismo, que se une a un ligando(por ejemplo,una fracción que comprende las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 499 y/o 500) e impide o reduce el efecto biológico de ese ligando. En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno, scFv, anticuerpo o un fragmento del mismo bloquea directamente un sitio de unión en el ligando o altera de otro modo la capacidad del ligando para unirse por medios indirectos (tal como alteraciones estructurales o energéticas en el ligando). En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno, el scFv, el anticuerpo o un fragmento del mismo evita que la proteína a la que se une realice una función biológica.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "paciente" significa cualquier ser humano que está siendo tratado por una condición fisiológica anormal, tal como cáncer o se ha diagnosticado formalmente con un trastorno, aquellos sin trastornos formalmente reconocidos, aquellos que reciben atención médica, aquellos en riesgo de desarrollar los trastornos, etc. Los términos "sujeto" y "paciente" se utilizan indistintamente en el presente documento e incluyen tanto sujetos humanos como animales no humanos.
Tal como se utiliza en el presente documento, los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento y significan un compuesto, compuesto por residuos de aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. Un polipéptido, proteína o péptido debe contener al menos dos aminoácidos, pero no se impone ninguna limitación al número máximo de aminoácidos que pueden comprender la secuencia de aminoácidos de una proteína o péptido. Tal como se utiliza en el presente documento, el término se refiere a ambas cadenas, que también se denominan comúnmente péptidos, oligopéptidos y oligómeros, y cadenas más largas, que generalmente se denominan proteínas. Los "polipéptidos" incluyen, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. El término "polipéptido" incluye péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos o una combinación de los mismos.
En algunos aspectos, los polipéptidos y/o proteínas tienen deleciones, adiciones y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la molécula de unión a antígeno. Los fragmentos polipeptídicos útiles pueden incluir fragmentos inmunológicamente funcionales de moléculas de unión a antígeno, incluyendo, pero no limitado a, una o más regiones CDR, dominios variables de una cadena pesada y/o ligera, una porción de otras porciones de una cadena de anticuerpo, y similares. Las fracciones que se pueden sustituir por uno o más aminoácidos de una molécula de unión a antígeno incluyen,por ejemplo,formas D o L de aminoácidos, un aminoácido diferente del aminoácido que normalmente se encuentra en la misma posición de una molécula de unión a antígeno (en relación con las secuencias proporcionadas en las FIGURAS 6 y 8, y sus SEQ ID NOs enumeradas), deleciones, aminoácidos no naturales presentes y análogos químicos de aminoácidos.
Los análogos de péptidos se utilizan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a las del péptido molde y forman un aspecto de la presente divulgación. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denominan "miméticos de péptidos" o "péptidomiméticos".Véase, por ejemplo,Fauchere, (1986)Adv. Drug Res.(Testa, ed.) 15:29-69; Veber & Freidinger, (1985)TINS,p.392; y Evanset al.,(1987)J Med Chem,30:1229-39.
Los polipéptidos, péptidos, proteínas y moléculas análogas que comprenden las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 499 y/o 500, las moléculas que comprenden estas secuencias y las células que presentan tales moléculas están específicamente abarcadas por los términos.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "porcentaje de identidad" significa el porcentaje de residuos idénticos entre los aminoácidos o nucleótidos en las moléculas comparadas. Para estos cálculos, las brechas en las alineaciones (si las hay) deben abordarse mediante un modelo matemático o programa de ordenador en particular(es decir,un "algoritmo"). Los métodos que se pueden utilizar para calcular la identidad de los ácidos nucleicos o polipéptidos alineados incluyen los descritos en Computacional Biología Molecular, (Lesk, ed.), (1988) Nueva York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and GenomeProjects, (Smith, ed.), 1993, Nueva York: AcademicPress; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, (Griffin and Griffin, eds.), 1994, Nueva Jersey: Humana Press; von Heinje, (1987) Sequence Analysis in Molecular Biology, Nueva York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov and Devereux, eds.), 1991, Nueva York: M. Stockton Press; y Carillo et al., (1988)J AppliedMath.
48:1073.
Al calcular el porcentaje de identidad, las secuencias que se comparan se alinean de manera que se obtenga la mayor coincidencia entre las secuencias. El programa de ordenador utilizado para determinar el porcentaje de identidad puede ser,por ejemplo,MOE (Chemical Computing Group) o DNASTAR (University of Wisconsin, Madison, WI). El algoritmo informático GAP se puede utilizar para alinear los dos polipéptidos o polinucleótidos para los que se va a determinar el porcentaje de identidad de secuencia. Las secuencias se alinean para una coincidencia óptima de su aminoácido o nucleótido respectivo (el "intervalo coincidente", según lo determina el algoritmo). Una penalización por apertura de brecha (que se calcula como 3 veces la diagonal promedio, en donde la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se utiliza; la "diagonal" es la puntuación o el número asignado a cada coincidencia perfecta de aminoácidos por la matriz de comparación particular) y una penalización de extensión de brecha (que generalmente es 1/10 veces la penalización de apertura de brecha), así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62 se utilizan junto con el algoritmo. En ciertas realizaciones, también se utiliza una matriz de comparación estándar (véase,por ejemplo,Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., (1992)Frac. Natl. Acad Sci. EE.UU.89: 10915-10919 para la matriz de comparación BLOSUM 62) por el algoritmo.
Ciertos esquemas de alineamiento para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden dar como resultado la coincidencia de solo una región corta de las dos secuencias, y esta pequeña región alineada puede tener una identidad de secuencia muy alta, aunque no haya una relación significativa entre las dos secuencias de longitud completa. En consecuencia, el método de alineación seleccionado(por ejemplo,el programa GAP) se puede ajustar si se desea para dar como resultado una alineación que abarque al menos 50 aminoácidos contiguos del polipéptido objetivo.
Tal como se utiliza en el presente documento, los términos "anticuerpo de cadena única" y "fragmento de cadena única variable (scFv)" se utilizan indistintamente y significan una molécula de unión a antígeno en la que una región VL y VH se unen a través de un conector para formar una cadena de proteína continua en donde el enlazador es lo suficientemente largo como para permitir que la cadena de proteína se pliegue sobre sí misma y forme un sitio de unión al antígeno monovalente(véase, por ejemplo,Birdet al.,(1988)Science242:423-26 y Hustonet al.,(1988)Frac. Natl. Acad Sci. EE.UU.85:5879-83 (1988). FMC63 (Nicholsonet al.,(1997)mol. Immunol.34:(16-17) 1157-65) es un ejemplo específico de un scFv, y es específico para CD19.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva", "dosis efectiva", "cantidad efectiva" o "dosificación terapéuticamente efectiva" de un agente terapéutico,(porejemplo,una fracción que comprende las SEQ ID NOs: 1,2, 3, 499 y/o 500, moléculas que comprenden estas secuencias y células que presentan tales moléculas), es cualquier cantidad que, cuando se utiliza sola o en combinación con otro agente terapéutico, protege a un sujeto contra la aparición de una enfermedad o promueve regresión de la enfermedad evidenciada por una disminución en la severidad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los períodos libres de síntomas de la enfermedad, o una prevención del deterioro o discapacidad debido a la aflicción de la enfermedad. La capacidad de un agente terapéutico para promover la regresión de la enfermedad se puede evaluar utilizando una variedad de métodos conocidos por el médico experto, tal como en sujetos humanos durante ensayos clínicos, en sistemas de modelos animales que predicen la eficacia en humanos, o analizando la actividad del agente en ensayosin vitro
Los términos "transducción" y "transducido" se refieren al proceso mediante el cual se introduce ADN extraño en una célula a través de un vector viral.(véaseHartl y Jones (1997) Genetics: Principles and Analysis, 4ta ed, Jones & Bartlett). En algunas realizaciones, el vector es un vector retroviral, un vector de ADN, un vector de ARN, un vector adenoviral, un vector baculoviral, un vector viral de Epstein Barr, un vector papovaviral, un vector viral de vaccinia, un vector viral de herpes simplex, un adenovirus vector asociado, un vector lentiviral, o cualquier combinación de los mismos.
Tal como se utiliza en el presente documento, los términos "región variable" o "dominio variable" se utilizan indistintamente y significan una porción de un anticuerpo, generalmente una porción de una cadena ligera o pesada, típicamente el extremo amino-terminal del anticuerpo, y que comprende aproximadamente 100 -130 aminoácidos en la cadena pesada y aproximadamente 90 a 115 aminoácidos en la cadena ligera, que difieren ampliamente en secuencia entre anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de un anticuerpo particular para un antígeno particular. La variabilidad en la secuencia se concentra en aquellas regiones denominadas regiones determinantes de la complementariedad. (CDR) mientras que las regiones más altamente conservadas en el dominio variable se denominan regiones marco (FR). Las CDR de las cadenas ligera y pesada son las principales responsables de la interacción y especificidad del anticuerpo con el antígeno.
En determinadas realizaciones, la región variable de una molécula de unión a antígeno es una región variable humana. En realizaciones adicionales, la región variable comprende CDR de roedor, humano o murino y regiones marco (FR) humanas. En realizaciones adicionales, la región variable es una región variable de primate (por ejemplo, un primate no humano). En aún otras realizaciones, la región variable es una región variable de conejo. En otras realizaciones, la región variable comprende CDR humanas y no humanas (por ejemplo, conejo, murino, rata o primate no humano) regiones marco (FR). En otras realizaciones, la región variable comprende CDR no humanas(por ejemplo,conejo, murino, rata o primate no humano) y regiones marco humanas (FR).
Los términos "VH", "dominio VH" y "cadena VH" se usan indistintamente y significan la región variable de la cadena pesada de una molécula de unión a antígeno, anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
Los términos "VL", "dominio VL" y "cadena VL" se usan indistintamente y significan la región variable de cadena ligera de una molécula de unión a antígeno, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.
Diversos aspectos de la invención se describen con mayor detalle en las siguientes subsecciones.
II. Moléculas de unión a antígeno y polinucleótidos que codifican lo mismo
La presente divulgación está dirigida a moléculas de unión a antígeno, incluyendo los anticuerpos, que se unen específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden estas secuencias y células que presentan tales moléculas, y/o moléculas de unión a antígeno que compiten de manera cruzada con una o más moléculas de unión a antígeno descritas en el presente documento(es decir,uno o más de los descritos en las FIGURAS 6 y 8 y/o divulgados en el Listado de Secuencias adjunto). También se proporcionan polinucleótidos que codifican las moléculas de unión a antígeno y forman un aspecto de la presente divulgación.
Un anticuerpo o molécula de unión a antígeno codificada de la presente invención puede ser de cadena sencilla o de cadena doble. En algunas realizaciones, la molécula de unión al anticuerpo o al antígeno es de cadena sencilla. En determinadas realizaciones, la molécula de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en un scFv, un Fab, un Fab', un Fv, un F(ab')<2>, un dAb y cualquier combinación de los mismos. En una realización particular, la molécula de unión a anticuerpo o antígeno comprende un scFv.
En ciertas realizaciones, una molécula de unión a antígeno tal como un anticuerpo comprende una sola cadena, en donde la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera están conectadas por un enlazador (un scFv). En algunas realizaciones, la VH está ubicada en el extremo N del enlazador y la VL está ubicada en el extremo C del extremo del enlazador. En algunas realizaciones, el enlazador comprende al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 13, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 18, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 90 o al menos aproximadamente 100 aminoácidos. En algunas realizaciones, el enlazador comprende entre aproximadamente 8 aminoácidos y aproximadamente 18 aminoácidos.(por ejemplo,10 aminoácidos).
En algunas realizaciones, las moléculas de unión a antígeno de la presente invención se unen específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden estas secuencias y células que presentan tales moléculas. En ciertas realizaciones, una molécula de unión a antígeno de la presente divulgación se une específicamente a las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 499 y/o 500, así como las moléculas que comprenden estas secuencias y las células que las presentan, con una Kd inferior a 1 x 10-6 M, inferior a 1 x 10-7 M, inferior a 1 x 10-8 M, o menos de 1 x 10-9 M. En una realización particular, una molécula de unión a antígeno se une específicamente a las SEQ ID NOs: 1,2, 3, 499 y/o 500, así como moléculas que comprenden estas secuencias y células que presentan dichas moléculas, con una K<d>inferior a 1 x 10-7 M. En otra realización, una molécula de unión a antígeno se une específicamente a las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 499 y/o 500, así como moléculas que comprenden estas secuencias y células que presentan dichas moléculas, con una Kd de menos de 1 x 10-8 M. En algunas realizaciones, una molécula de unión a antígeno se une al scFv FMC63, así como moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan tales moléculas, con una K<d>de aproximadamente 1 x 10-7 M, aproximadamente 2 x 10-7 M, aproximadamente 3 x 10-7 M, aproximadamente 4 x 10-7 M, aproximadamente 5 x 10-7 M, aproximadamente 6 x 10-7 M, aproximadamente 7 x 10-7 M, aproximadamente 8 x 10-7 M, aproximadamente 9 x 10 7 M, aproximadamente 1 x 10-8 M, aproximadamente 2 x 10-8 M, aproximadamente 3 X 10-8 M, aproximadamente 4 X 10-8 M, aproximadamente 5 X 10-8 M, aproximadamente 6 X 10-8 M, aproximadamente 7 X 10-8 M, aproximadamente 8 x 10-8 M, aproximadamente 9 x 10-8 M, aproximadamente 1 x 10-9 M, aproximadamente 2 x 10-9 M, aproximadamente 3 x 10-9 M, aproximadamente 4 x 10-9 M, aproximadamente 5 x 10-9 M, aproximadamente 6 x 10-9 M, aproximadamente 7 x 10-9 M, aproximadamente 8 x 10-9 M, aproximadamente 9 x 10-9 M, aproximadamente 1 x 10-10 M, o aproximadamente 5 x 10-10 M. Kd puede calcularse utilizando metodologías estándar, como se describe en el presente documento.
En realizaciones específicas, una molécula de unión a antígeno de la presente divulgación es un anticuerpo identificado en el presente documento como Clon 8 o Clon 16 y cada uno comprende las siguientes secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera, codificantes, variables y CDR, tal como se proporciona y marca:
Clon 8 Secuencia de Codificación de VH ADN ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAG TGTCAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTG ACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCACCATCAGTAACCTTGCAATAATCTGG GTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATATATCGGAGACATTGATGGTCG T GGTG AC AT AT ACTGT GCG ACCT GGGCG A AAGGCC G ATTC ACC AT CT CC A A AAC CTCGACCACACTGGATCTGAGATTCACCAGCCCGACAACCGAGGACACGGCCA CCTACTTCTGTGCCGTAGATGGTGATGGTAGTGGTTGGGGTGACTTTAACTTTTG GGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 4)
Clon 8 VH AA (las CDR subrayadas)
METGLRWLLLVAVLKGVOCOSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFTISNLAIIWVR OAPGKGLEYIGDIDGRGDIYC ATWAKGRFTISKTSTTLDLRFTSPTTEDTATYFCAV DGDGSGWGDFNFWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 5)
Clon 8 HC AA (las CDR subrayadas)
METGLRWLLLYAVLKGVOCOSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFTISNLAIIWVR OAPGKGLEYIGDIDGRGDIYCATWAKGRFTISKTSTTLDLRFTSPTTEDTATYFCAY DGDGSGWGDFNFWGPGTLVTVSSGOPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGY LPEP VT VTWN S GTLTN G VRTFP S VRQ S S GL Y S LS S V V SVTSSSQPVT CNV AEEP ATNT KYDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVYVDVSQDDP EYQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKA LPAPIEKTISKARGQPLEPKYYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNG KAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKS ISRSPGK (SEQ TD NO: 6)
Clon 8 VH CDR1 AA
GFTISNL (SEQ ID NO: 7)
Clon 8 VH CDR2 AA
DIDGRGDIYCATWAK (SEQ TD NO: 8)
Clon 8 VH CDR3 AA
DGDGSGWGDFNF (SEQ ID NO: 9)
Clon 8 Secuencia de Codificación de VL ADN ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCA GGTGCCAGATGTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCT GTGGGAGGCACAGTCAGCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGCACTGC ATTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAG GGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGG GAC-ACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGGAGTGTGACGATGCTGCCACTTA CTACTGTCAACAGGGTTGGAGTACTGTGAATGTTGATAATGTTTTCGGCGGAGG GACCGAGGTGGTGGTCAGA (SEQ ID NO: 10)
Clon 8 VL AA (las CDR subrayadas)
MDTRAPTOLLGLLLLW LPGARCAYDMTOTPASVEVAVGGTVSIKCOASOSISTALA WYOOKPGOPPKLLIYRASTLASGVSSRFKGSGSGTOFTLTISGVECDDAATYYCOO GWSTVNVDNVFGGGTEVVVR (SEQ ID NO: 11)
Clon 8 LC AA (las CDR subrayadas) MDTRAPTOLLGLLLLWLPGARCAYDMTOTPASVEVAVGGTVSIKCOASOSISTALA WYOOKPGOPPKLLTYRASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISGVECDDAATYYCOO GWSTVNVDNVFGGGTEVVVRDPVAPTVLTFPPAADOVATGTVTTVCVANKYFPDV TVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGT TSW Q SFN R G D C (SEQ ID NO: 12)
Clon 8 VLCDR1 AA
QASQSISTALA (SEQ ID NO: 13)
Clon 8 VL CDR2 AA
RASTLAS (SEQ ID NO: 14)
Clon 8 VL CDR3 AA
QQGW STVN VDN V (SEQ ID NO: 15)
Clon 16 Secuencia de Codificación de AH ADN ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAG TGTCAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTG ACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATCCGACATCAGTAGCTACCACATGGGCTGG GTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGAATCATTGTTAGTAG TGGTAGCGCATACTACGCGACCTGGGCAAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGGA CCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACTCGGCC ACCTATTTCTGTGCCAGAAATCAATATAGTGGTTATGGCTTTAGCTTCTGGGGCC CAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 16)
Clon 16 VH AA (las CDR subrayadas) METGLRWLLLVAVLKGVOCOSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGSD1SSYHMGWV ROAPGKGLEYIGIIVSSGSAYYATWAKGRFTISRTSTTVDLKITSPTTEDSATYFCAR NOYSGYGFSFWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 17)
Clon 16 HC AA (las CDR subrayadas) METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGSDISSYHMGWV ROAPGKGLEYIGITVSSGSAYYATWAKGRFTISRTSTTVDLKITSPTTEDSATYFCAR NQYSGYGFSF W GP GTL VT V S S GQPK AP S VFPL APC C GDTP S S T VTLGCL YTCGYLPEP YTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSWSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVD KTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQ FTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPA PIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAE DNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRS PGK (SEQ ID NO: 18)
Clon 16 VH CDR1 AA
GSDISSY (SEQ ID NO: 19)
Clon 16 VH CDR2 AA
IIVSSGSAYYATWAK (SEQ ID NO: 20)
Clon 16 VH CDR3 AA
NQYSGYGFSF (SEQ ID NO: 21)
Clon 16 Secuencia de Codificación de VL ADN ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCA GGTGCCACATTTGCCGTCGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCAGTGTCTACAGCT GTAGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGTCCAGTCACAGTGTTTATTATGGC GACTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAGCTCCTGATC TACAGGGCATCCAATCTGGCATCTGGTGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGA TCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCC ACTTACTACTGTCTAGGCGGTTATGATGATGATGGTGAGACTGCTTTCGGCGGA
GGGACCGAGGTGGTGGTCAAA (SEQ ID NO: 22)
Clon 16 VL AA (las CDR subrayadas) MDTRAPTOLLGLLLLWLPGATFAVVLTOTPSPVSTAVGGTVTINCOSSHSVYYGD
WLAWYOOKPGOPPKLLIYRASNLASGVPSRFKGSGSGTOFTLTISGVOCDDAATYY
CLGGYDDDGETAFGGGTEVVVK (SEQ ID NO: 23)
Clon 16 LC AA (las CDR subrayadas)
MDTRAPTOLLGLLLLWLPG ATF A V VLT OTPSPVST A V GGT VTIN C O S SH S VYY GD
WLAWYOOKPGOPPKLLIYRASNLASGVPSRFKGSGSGTOFTLTISGVOCDDAATYY CLGGYDDDGETAF G G G TEV W K D P VAPT VLIFPP AADQ VAT GTVTIVC VANK YFP
DVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQ
GTTSVVQSFNRGDC (SEQ ID NO: 24)
Clon 16 VLCDR1 AA
QSSHSVYYGDWLA (SEQ ID NO: 25)
Clon 16 VLCDR2 AA
RASNLAS (SEQ ID NO: 26)
Clon 16 VL CDR3 AA
LGGYDDDGETA (SEQ ID NO: 27)
En una realización, las moléculas de unión a antígeno de la presente divulgación son anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En una realización, los anticuerpos de la presente divulgación comprenden al menos una CDR expuesta en las FIGURAS 6 y 8. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona hibridomas capaces de producir los anticuerpos descritos en el presente documento y métodos para producir anticuerpos a partir de hibridomas, tal como se describe en el presente documento y como se conoce en la técnica.
Los anticuerpos humanizados se describen en el presente documento y pueden prepararse mediante técnicas conocidas. En una realización, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende el dominio variable de un anticuerpo murino o de conejo (o todo o parte del sitio de unión al antígeno del mismo) y un dominio constante derivado de un anticuerpo humano. Alternativamente, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender un sitio de unión al antígeno de un anticuerpo monoclonal murino o de conejo y un fragmento de dominio variable (que carece del sitio de unión al antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales modificados incluyen aquellos descritos en Riechmannet al.,(1988)Nature332:323, Liuet al.,(1987)Frac. Nat. Acad Sci. EE. UU.84:3439, Larricket al.,(1989)Bio/Technology7:934, and Winteret al.,(1993)TIPS14:139. En una realización, el anticuerpo quimérico es un anticuerpo injertado con CDR. Las técnicas para humanizar anticuerpos se analizan en,por ejemplo,las Patentes de EE. UU. Nos. 5,869,619; 5,225,539; 5,821,337; 5,859,205; 6,881,557; Padlan et al., (1995)FASEB J9:133-39; Tamura et al., (2000)J Immunol.164:1432-41; Zhanget al.,(2005)Mol. Immunol.42(12):1445-1451; Hwanget al., Methods.(2005) 36(1):35-42; Dall' Acquaet al.,(2005)Methods36(1):43-60; y Clark, (2000)Immunology Today21(8):397-402.
Una molécula de unión a antígeno de la presente invención también puede ser un anticuerpo monoclonal completamente humano. Los anticuerpos monoclonales completamente humanos pueden generarse mediante cualquier número de técnicas con las que estarán familiarizados los expertos en la técnica. Dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, la transformación del virus de Epstein Barr (EBV) de células sanguíneas periféricas humanas.(por ejemplo,que contienen linfocitos B), inmunizacióin vitrode células B humanas, fusión de células de bazo de ratones transgénicos inmunizados que portan genes de inmunoglobulina humana insertados, aislamiento de bibliotecas de fagos de la región V de inmunoglobulina humana u otros procedimientos conocidos en la técnica y basados en la divulgación del presente documento.
Se han desarrollado procedimientos para generar anticuerpos monoclonales humanos en animales no humanos. Por ejemplo, se han preparado ratones en los que se han inactivado uno o más genes de inmunoglobulina endógena por diversos medios. Se han introducido genes de inmunoglobulina humana en los ratones para reemplazar los genes de ratón inactivados. En esta técnica, los elementos del locus de la cadena ligera y pesada humana se introducen en cepas de ratones derivadas de líneas de células madre embrionarias que contienen interrupciones específicas de los loci endógenos de cadena pesada y cadena ligera (véase también Bruggemannet al.,(1997)Curr. Opin. Biotechnol.
8:455-58).
Los ejemplos de técnicas para la producción y el uso de animales transgénicos para la producción de anticuerpos humanos o parcialmente humanos se describen en las patentes de EE. UU. Nos. 5,814,318, 5,569,825, and 5,545,806; Daviset al.,Antibody Engineering: Methods and Protocols, (Lo, ed) Humana Press, NJ, 191-200 (2003); Kellermannet al.,(2002)Curr Opin Biotechnol.13:593-97; Russelet al.,(2000)Infect Immun.68:1820-26; Galloet al.,(2000)Eur J Immun.30:534-40; Daviset al.,(1999)Cancer Metastasis Rev.18:421-25; Green, (1999)J Immunol Methods231: 11-23; Jakobovits, (1998)AdvancedDrug Delivery Reviews31:33-42; Greenet al.,(1998)J Exp Med.188:483-95; Jakobovits, (1998)Exp. Opin. Invest. Drugs.7:607-14; Tsudaet al.,(1997)Genomics,42:413-21; Mendezet al.,(1997)Nat. Genet.15:146-56; Jakobovits, (1994)Curr Biol.4:761-63; Arboneset al.,(1994)Immunity1:247-60; Greenet al.,(1994)Nat. Genet.7:13-21; Jakobovitset al.,(1993)Nature362:255-58; Jakobovitset al.,(1993)Proc Natl Acad Sci EE.UU.90:2551-55; Chenet al.,(1993)Intllmmunol5:647-656; Choiet al.,(1993)Nature Genetics4:117-23; Fishwildet al.,(1996)Nature Biotechnology14:845-51; Lonberget al.,(1994)Nature368: 856-59; Lonberg, (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Neuberger, (1996)Nature Biotech14:826; Tayloret al.,(1992)Nucleic Acids Research20:6287-95; Taylor et al., (1994)Intl Immunol6:579- 91; Tomizukaet al.,(1997)Nature Genetics16:133-43; Tomizukaet al.,(2000)Proc Nat AcadSci USA97:722-27; Tuaillonetal.,(l993)ProcNatAcadSci EE.UU.
90:3720-24; Tuaillonet al.,(1994)J Immunol152:2912-20.; Lonberget al.,(1994)Nature368:856; Tayloret al.,(1994)Intl Immunol6:579; Patente de EE. UU. No. 5,877,397; Bruggemannet al.,(1997)Curr. Opin. Biotechnol.8:455-58; Jakobovitset al.,(1995)Ann. NY. Acad Sci.764:525-35.
Un método adicional para obtener moléculas de unión a antígeno de la invención es mediante el uso de presentación en fagos, que está bien establecida para este fin.Véase, por ejemplo, Winter et al.,(1994)Ann. Rev. Inmunol.12:433-55; Burtonet al.,(1994)Adv. Immunol57:191-280. Se pueden crear bibliotecas combinatorias de genes de región variable de inmunoglobulina humana o murina en vectores de fagos que se pueden cribar para seleccionar fragmentos de Ig (Fab, Fv, sFv o multímeros de los mismos) que se unen al scFv FMC63, así como moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas.Véase,por ejemplo, la patente de EE. UU. No. 5,223,409; Huseet al.,(1989)Science246:1275-81; Sastry et al., (1989)Proc. Natl. Acad Sci. EE. UU.86:5728-32; Alting- Meeset al.,(1990)Strategies in Molecular Biology3:1-9; Kanget al.,(1991)Proc. Natl. Acad Sci. EE. UU88:4363-66; Hoogenboomet al.,(1992)Jmol. Biol.27:381-388; Schlebuschet al.,(1997)Hybridoma16:47-52 y las referencias allí citadas. Por ejemplo, una biblioteca que contiene una pluralidad de secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de regiones variables de Ig puede insertarse en el genoma de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fago lambda (11, vectores AImmunoZap™(H) y AlmmunoZap™(L) (Stratagene, La Jolla, Calif) también se puede usar en este enfoque) o una variante de la misma, en marco con la secuencia que codifica una proteína de la cubierta del fago.
Brevemente, el ARNm se aísla de una población de células B y se usa para crear bibliotecas de expresión de ADNc de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera en los vectores AlmmunoZap™(H) y 11, AlmmunoZap™(L) y similares. Estos vectores pueden examinarse individualmente o expresarse conjuntamente para formar fragmentos Fab o anticuerpos. Posteriormente, las placas positivas pueden convertirse en un plásmido no lítico que permite la expresión de alto nivel de fragmentos de anticuerpos monoclonales deE. coli.
En una realización, en una hibridoma, las regiones variables de un gen que expresa un anticuerpo monoclonal de interés se amplifican utilizando cebadores de nucleótidos. Estos cebadores pueden ser sintetizados por un experto en la técnica, o pueden adquirirse de fuentes comerciales, que también venden cebadores para regiones variables humanas y de ratón, incluyendo, entre otros, cebadores para las regiones V<h>, V<l>, C<h>y C<l>). Estos cebadores se pueden usar para amplificar regiones variables de cadena ligera o pesada, que luego se pueden insertar en vectores. Estos vectores pueden entonces introducirse enE. coli,sistemas basados en levaduras o mamíferos para la expresión. Usando estos métodos se pueden producir grandes cantidades de una proteína de cadena sencilla que contiene una fusión de los dominios Vh y Vl.
Una vez que las células que producen las moléculas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento se han obtenido utilizando cualquiera de las técnicas de inmunización y otras técnicas descritas anteriormente, los genes de anticuerpos específicos pueden clonarse aislando y amplificando su ADN o ARNm de acuerdo con procedimientos estándar como se describe en el presente documento. Los anticuerpos producidos a partir de ellos se pueden secuenciar y las CDR identificadas y el ADN que codifica las CDR se puede manipular como se ha descrito anteriormente para generar otros anticuerpos de acuerdo con la invención.
Los expertos en la técnica entenderán que algunas proteínas, tales como los anticuerpos, pueden experimentar una variedad de modificaciones postraduccionales. El tipo y el alcance de estas modificaciones a menudo dependen de la línea celular huésped utilizada para expresar la proteína, así como de las condiciones de cultivo. Dichas modificaciones pueden incluir variaciones en la glicosilación, oxidación de metionina, formación de dicetopiperizina, isomerización de aspartato y desamidación de asparagina. Una modificación frecuente es la pérdida de un residuo básico carboxiterminal (tal como la lisina o la arginina) debido a la acción de las carboxipeptidasas (como se describe en,por ejemplo,Harris, (1995)J Chromatog705:129-34).
Un método alternativo para la producción de un anticuerpo monoclonal murino es inyectar las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón singénico, por ejemplo, un ratón que ha sido tratado(por ejemplo,cebado con pristano) para promover la formación de líquido ascítico que contiene el anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar y purificar mediante una variedad de técnicas bien establecidas. Tales técnicas de aislamiento incluyen cromatografía de afinidad con Proteína-A Sepharose, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico (ver,por ejemplo,Baines y Thorpe, (1992) en Methods in Molecular Biology 10:79-104 (The Humana Press). Los anticuerpos monoclonales se pueden purificar por cromatografía de afinidad usando un ligando apropiado seleccionado con base en propiedades particulares del anticuerpo (por ejemplo, isotipo de cadena ligera o pesada, especificidad de unión, etc.). Los ejemplos de un ligando adecuado, inmovilizado sobre un soporte sólido, incluyen Proteína A, Proteína G, un anticuerpo anti-región constante (cadena ligera o cadena pesada) y un anticuerpo anti-idiotipo.
Aunque las moléculas de unión a antígeno descritas se produjeron en un sistema de conejo, los anticuerpos humanos, parcialmente humanos o humanizados pueden ser adecuados para muchas aplicaciones, particularmente aquellas que involucran la administración del anticuerpo a un sujeto humano, otros tipos de moléculas de unión a antígeno serán adecuados para ciertas aplicaciones. Dichos anticuerpos se pueden preparar como se describe en el presente documento y forman un aspecto de la presente divulgación.
La presente divulgación proporciona moléculas de unión a antígeno que se unen específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan tales moléculas. Las moléculas de unión a antígeno que compiten de forma cruzada con las moléculas de unión a antígeno descritas en el presente documento forman otro aspecto de la presente divulgación.
En ciertas realizaciones, la molécula de unión a antígeno compite de manera cruzada con un anticuerpo de referencia que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 5, 11, 17 y 23. En determinadas realizaciones, la molécula de unión a antígeno compite de manera cruzada con un anticuerpo de referencia, en el que el anticuerpo de referencia comprende una VH CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 o 19. En determinadas realizaciones, la molécula de unión a antígeno compite de manera cruzada con un anticuerpo de referencia, en el que el anticuerpo de referencia comprende una VH CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o 20. En determinadas realizaciones, la molécula de unión a antígeno compite de manera cruzada con un anticuerpo de referencia, en el que el anticuerpo de referencia comprende una VH<c>DR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 o 21.
En otras realizaciones, la molécula de unión a antígeno compite de manera cruzada con un anticuerpo de referencia, en el que el anticuerpo de referencia comprende una VL CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 o 25. En determinadas realizaciones, la molécula de unión a antígeno compite de manera cruzada con un anticuerpo de referencia, en el que el anticuerpo de referencia comprende una VL CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o 26. En determinadas realizaciones, la molécula de unión a antígeno compite de manera cruzada con un anticuerpo de referencia, en el que el anticuerpo de referencia comprende una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 o 27.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión a antígeno que se une específicamente a las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 499 y/o 500 se une al mismo o a un epítopo superpuesto como un anticuerpo de referencia divulgado en el presente documento(por ejemplo,las que comprenden secuencias presentadas en las FIGURAS 6 y 8). En determinadas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión a antígeno se une al mismo o un epítopo superpuesto que un anticuerpo de referencia.
Ila. Clon 8
En algunas realizaciones, una molécula de unión a antígeno o un anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una VH CDR1 que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos GFTISNL (SEQ ID NO: 7).
En algunas realizaciones, una molécula de unión a antígeno o un anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una VH CDR2 que comprende, consiste en o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos DIDGRGDNCATWAK (SEQ ID NO: 8).
En algunas realizaciones, una molécula de unión a antígeno o un anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una VH CDR3 que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos DGDGSGWGDFNF (SEQ ID NO: 9).
En algunas realizaciones, una molécula de unión a antígeno o un anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una cadena pesada VH que comprende: (a) una VH CDR1 que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos GFTISNL (SEQ ID NO: 7); y/o (b) una VH CDR2 que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia<de aminoácidos DIDGRGDIYCATWAK (SEQ ID>N<o>:<8); y/o (e) una VH CDR3 que comprende, consiste o consiste>esencialmente en la secuencia de aminoácidos DGDGSGWGDFNF (SEQ ID NO: 9).
En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno o el anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una VH CDR1, una VH CDR2 y una VH CDR3, en las que VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 comprenden la secuencia de aminoácidos de VH CDR1, VH CDR2, y secuencias VH CDR3 presentadas en las FIGURAS 6 y 8.
En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno o el anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de las FIGURAS 6 y 8(por ejemplo,(SEQ ID NO: 5)).
En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno o el anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende las regiones marco VH (FR) descritas en el presente documento. En realizaciones específicas, el anticuerpo o la molécula de unión a antígeno comprende las VH FR como se establece en las secuencias presentadas en las FIGURAS 6 y 8 o derivables de ellas.(por ejemplo,una, dos, tres o cuatro de las FR en una secuencia de las FIGURAS 6 u 8).
En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno o el anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una secuencia de cadena pesada divulgada en el presente documento(porejemplo,SEQ ID NO: 6 en la FIGURA 6). En una realización, el anticuerpo o la molécula de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5.
En diversas realizaciones, la región variable de cadena pesada es 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO:5.
En algunas realizaciones, una molécula de unión a antígeno o un anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una VL CDR1 que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos QASQSISTALA (SEQ ID NO: 13).
En algunas realizaciones, una molécula de unión a antígeno o un anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan tales moléculas, comprende una VL CDR2 que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos RASTLAS (SEQ ID NO: 14).
En algunas realizaciones, una molécula de unión a antígeno o un anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una VL CDR3 que comprende, consiste en o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos QQGWSTVNVDNV (SEQ ID NO: 15).
En algunas realizaciones, una molécula de unión a antígeno o un anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una cadena ligera VL que comprende: (a) una VL CDR1 que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos QASQSISTALA (SEQ ID NO: 13); y/o (b) una VL CDR2 que comprende, consiste en, o que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos RASTLAS (SEQ ID NO: 14); y/o (c) una VL CDR3 que comprende, que consiste o que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos QQGWSTVNVDNV (SEQ ID NO: 15).
En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno o el anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una VL CDR1, una VL CDR2 y<una VL CDR3, en las que VL>C<d>R1,<VL>C<d>R2<y VL CDR3 comprenden la secuencia de aminoácidos de VL CDR1, v>L CDR2, y secuencias VL CDR3 presentadas en las FIGURAS 6 y 8.
En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno o el anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la FIGURA 6 o la FIGURA 8(por ejemplo,SEQ ID NO: 11).
En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno o el anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende las regiones marco VL (FR) descritas en el presente documento. En realizaciones específicas, el anticuerpo o la molécula de unión a antígeno<comprende las>V<l FR como se establece en las secuencias presentadas en las FIGURAS 6 y 8 o derivables de ellas.>(por ejemplo,una, dos, tres o cuatro de las FR en una secuencia de la FIGURA 6 u 8).
En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno o el anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una secuencia de cadena ligera descrita en el presente documento(por ejemplo,SEQ ID NO: 12 en la FIGURA 6, o en la FIGURA 8). En una realización, el anticuerpo o molécula de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11.
En diversas realizaciones, la región variable de la cadena ligera es 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 11.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión a antígeno que se une específicamente al GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una, dos y/o tres secuencias VH CDR divulgadas en el presente documento. En ciertas realizaciones, la molécula de unión a anticuerpo o antígeno comprende una VH CDR1, una VH CDR2 y una VH CDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos de cualquier VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 divulgadas en el presente documento, respectivamente. En algunas realizaciones, la molécula de unión a anticuerpo o antígeno comprende una cualquiera, dos y/o tres secuencias VL CDR divulgadas en el presente documento. En ciertas realizaciones, la molécula de unión a anticuerpo o antígeno comprende una VL CDR1, una VL CDR2 y una VL CDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos de cualquier VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 divulgadas en el presente documento, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o la molécula de unión a antígeno que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan tales moléculas, comprende: (a) una región VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; (b) una región VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8; (c) una región VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9; (d) una región VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13; (e) una región VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14; y (f) una región VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15.
En una realización, el anticuerpo o la molécula de unión a antígeno que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas (SEQ ID NO: 1), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan esta secuencia, comprende: (a) una región VH CDR1; (b) una región VH<CDR2;(c) una región VH c>D<r>3;<(d) una región VL CDR1; (e) una región VL CDR2; y (f) una región>CD<r>3<de VL, en la que las>C<d>R<de VH y VL se muestran en las FIGURAS 6 y 8.>
En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión a antígeno que se une específicamente al GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan tales moléculas, comprende una secuencia de región variable de cadena pesada divulgadas en el presente documento(por ejemplo,en las FIGURAS 6 y 8) y una secuencia de región variable de cadena ligera divulgadas en el presente documento(por ejemplo,en las FIGURAS 6 y 8).
En una realización, la molécula de unión a antígeno o anticuerpo comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11. Las secuencias de nucleótidos que codifican la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera se proporcionan en la FIGURA 6.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión a antígeno que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una secuencia de cadena pesada divulgada en el presente documento(por ejemplo,en las FIGURAS 6 y 8) y una secuencia de cadena ligera divulgada en el presente documento(por ejemploen las FIGURAS 6 y 8).
En una realización, la molécula de unión a antígeno o anticuerpo comprende: (a) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; y (b) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12.
En una realización, la molécula de unión a antígeno o anticuerpo comprende: (a) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; y (b) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12.
Ilb. Clon 16
En algunas realizaciones, una molécula de unión a antígeno o un anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan tales moléculas, comprende una VH CDR1 que comprende, que consiste o que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos GSDISSY (SEQ ID NO: 19).
En algunas realizaciones, una molécula de unión a antígeno o un anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una VH CDR2 que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos IIVSSGSAYYATWAK (SEQ ID NO: 20).
En algunas realizaciones, una molécula de unión a antígeno o un anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan tales moléculas, comprende una VH CDR3 que comprende, que consiste en, o que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos NQYSGYGFSF (SEQ ID NO: 21).
En algunas realizaciones, una molécula de unión a antígeno o un anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una cadena pesada VH que comprende: (a) una VH CDR1 que comprende, que consiste o que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos GSDISSY (SEQ ID NO: 19); y/o (b) una VH CDR2 que comprende, que consiste en, o que consiste<esencialmente en la secuencia de aminoácidos IIVSSGSAYYATW AK>(S<e>Q<ID NO: 20); y/o (c) una VH CDR3 que>comprende, que consiste o que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos NQYSGYGFSF (SEQ ID NO: 21).
En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno o el anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una VH CDR1, una VH CDR2 y una VH CDR3, en las que VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 comprenden la secuencia de aminoácidos de VH CDR1, VH CDR2, y secuencias VH CDR3 presentadas en las FIGURAS 6 y 8.
En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno o el anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la FIGURA 6 u 8(por ejemplo,SEQ ID NO: 17).
En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno o el anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende las regiones marco VH (FR) descritas en el presente documento. En realizaciones específicas, el anticuerpo o la molécula de unión a antígeno<comprende las>V<h FR como se establece en las secuencias presentadas en la FIGURA 6 o derivables de ellas. (por>ejemplo,una, dos, tres o cuatro de las FR en una secuencia de la FIGURA 6 u 8(por ejemplo,SEQ ID NO: 17).
En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno o el anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una secuencia de cadena pesada divulgada en el presente documento(porejemplo,SEQ ID NO: 18 en la FIGURA 6). En una realización, la molécula de unión a anticuerpo o antígeno comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de<aminoácidos de la>S<e>Q<ID NO: 17.>
En diversas realizaciones, la región variable de cadena pesada es 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 17.
En algunas realizaciones, una molécula de unión a antígeno o un anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una VL CDR1 que comprende, que consiste en, o que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos QSSHSVYYGDWLA (SEQ ID NO: 25).
En algunas realizaciones, una molécula de unión a antígeno o un anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan tales moléculas, comprende una VL CDR2 que comprende, que consiste o que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos RASNLAS (SEQ ID NO: 26).
En algunas realizaciones, una molécula de unión a antígeno o un anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una VL CDR3 que comprende, que consiste en, o que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos LGGYDDDGETA (SEQ ID NO: 27).
En algunas realizaciones, una molécula de unión a antígeno o un anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una cadena ligera VL que comprende: (a) una VL CDR1 que comprende, que consiste o que consiste esencialmente en la secuencia de<aminoácidos QSSHSVYYGDWLA (SEQ ID NO: 25); y/o (b) una v>L<CDR2 que comprende, que consiste en, o que>consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos RASTLAS (SEQ ID NO: 26); y/o (c) una VL CDR3 que comprende, que consiste en, o que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos LGGYDDDGETA (SEQ ID NO: 27).
En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno o el anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3, en donde VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 comprenden la secuencia de aminoácidos de las secuencias VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 presentadas en la FIGURA 6 u 8.
En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno o el anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la FIGURA 6 o la FIGURA 8(por ejemplo,SEQ ID NO: 23).
En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno o el anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende las regiones marco VL (FR) descritas en el presente documento. En realizaciones específicas, el anticuerpo o la molécula de unión a antígeno comprende las VL FR de como se establece en las secuencias presentadas en las FIGURAS 6 y 8 o derivables de ellas.(por ejemplo,una, dos, tres o cuatro de las FR en una secuencia de la FIGURA 6 o la FIGURA 8).
En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno o el anticuerpo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una secuencia de cadena ligera descrita en el presente documento(por ejemplo,SEQ ID NO: 24 en la FIGURA 6, o en la FIGURA 8). En una realización, el anticuerpo o la molécula de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23.
En diversas realizaciones, la región variable de la cadena ligera es 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO:23.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión a antígeno que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), las moléculas que comprenden esta secuencia y las células que presentan dichas moléculas, comprende una, dos y/o tres secuencias VH CDR divulgadas en el presente documento. En ciertas realizaciones, la molécula de unión a anticuerpo o antígeno comprende una VH CDR1, una VH CDR2 y una VH CDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos de cualquier VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 divulgadas en el presente documento, respectivamente. En algunas realizaciones, la molécula de unión a anticuerpo o antígeno comprende una cualquiera, dos y/o tres secuencias VL CDR divulgadas en el presente documento. En ciertas realizaciones, la molécula de unión a anticuerpo o antígeno comprende una VL CDR1, una VL CDR2 y una VL CDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos de cualquier VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 divulgadas en el presente documento, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o la molécula de unión a antígeno que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan tales moléculas, comprende: (a) una región VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19; (b) una región VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20; (c) una región VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21; (d) una región VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25; (e) una región VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26; y (f) una región VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27.
En una realización, el anticuerpo o la molécula de unión a antígeno que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas (SEQ ID NO: 1), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan esta secuencia, comprende: (a) una región VH CDR1; (b) una región VH CDR2; (c) una región VH Cd R3; (d) una región VL CDR1; (e) una región VL CDR2; y (f) una región VL CDR3, en donde las CDR de VH y VL se muestran en las FIGURAS 6 y 8.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión a antígeno que se une específicamente al GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3),SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan tales moléculas, comprende una secuencia de región variable de cadena pesada divulgadas en el presente documento(por ejemplo,en las FIGURAS 6 y 8) y una secuencia de región variable de cadena ligera divulgadas en el presente documento(por ejemplo,en las FIGURAS 6 y 8).
En una realización, la molécula de unión a antígeno o anticuerpo comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23. Las secuencias de nucleótidos que codifican la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera se proporcionan en la FIGURA 6.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión a antígeno que se une específicamente al GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas, comprende una secuencia de cadena pesada divulgada en el presente documento(por ejemplo,en las FIGURAS 6 y 8) y una secuencia de cadena ligera divulgada en el presente documento(por ejemplo,en las FIGURAS 6 y 8).
En una realización, la molécula de unión a antígeno o anticuerpo comprende: (a) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18; y (b) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24.
En una realización, la molécula de unión a antígeno o anticuerpo comprende: (a) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18; y (b) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24.
III. Polinucleótidos que codifican anticuerpos y moléculas de unión a antígenos
La presente invención también está dirigida a polinucleótidos que codifican anticuerpos y moléculas de unión a antígeno que se unen específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden estas secuencias y células que presentan tales moléculas.
En algunas realizaciones, un polinucleótido de la presente invención codifica una molécula de unión a antígeno, en la que la molécula de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada que es al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que cosiste en la SEQ ID NO: 5 y 17.
En algunas realizaciones, un polinucleótido de la presente invención codifica una molécula de unión a antígeno, en la que la molécula de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos variable de cadena ligera que es al menos aproximadamente 75 %, menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:11 y 23.
En ciertas realizaciones, el polinucleótido comprende una secuencia codificante de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 4 y 16. En otra realización, el polinucleótido comprende una secuencia codificante de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 10 y 22.
Como apreciarán los expertos en la técnica, las variaciones de las secuencias de polinucleótidos divulgados son posibles indicios de la generación del código genético. Tales variantes de las secuencias de polinucleótidos divulgadas forman así un aspecto de la presente divulgación.
IV. Vectores, células y composiciones farmacéuticas
En ciertos aspectos, se proporcionan en el presente documento vectores que comprenden un polinucleótido de la presente invención. En algunas realizaciones, la presente invención está dirigida a un vector o un conjunto de vectores que comprenden un polinucleótido que codifica un anticuerpo o una molécula que se une a un antígeno que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500) y moléculas que comprenden estas secuencias y células que presentan tales moléculas, como se describe en el presente documento.
Cualquier vector conocido en la técnica puede ser adecuado para expresar los anticuerpos y las moléculas de unión a antígeno de la presente invención. En algunas realizaciones, el vector es un vector viral. En algunas realizaciones, el vector es un vector retroviral, un vector de ADN, un vector del virus de la leucemia murina, un vector SFG, un plásmido, un vector de ARN, un vector adenoviral, un vector baculoviral, un vector viral Epstein Barr, un vector papovaviral, un vector viral vaccinia, un vector viral herpes simplex, un vector asociado a adenovirus (AAV), un vector lentiviral, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos, en el presente documento se proporcionan células que comprenden un polinucleótido o un vector de la presente invención. En algunas realizaciones, la presente invención está dirigida a células, célulasin vitro,que comprenden un polinucleótido que codifica una molécula de unión a antígeno, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la presente invención está dirigida a células,por ejemplo,célulasin vitro,que comprende un polinucleótido que codifica un anticuerpo o una molécula de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (Se Q ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden estas secuencias y células que presentan tales moléculas, tal como se divulga en el presente documento.
Cualquier célula puede usarse como célula huésped para los polinucleótidos y vectores que codifican todos o un fragmento de los anticuerpos y moléculas de unión a antígeno de la presente invención. En algunas realizaciones, una célula huésped puede ser una célula procariota, una célula fúngica, una célula de levadura o células eucariotas superiores, tal como una célula de mamífero. Las células procarióticas adecuadas incluyen, sin limitación, eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo,Enterobacteriastales comoEscherichia, por ejemplo, E. coli; bacilostales comoB. subtilisyB. licheniformis; Pseudomonastales como Paeruginosa;yStreptomyces.En algunas realizaciones, una célula huésped es una célula de mamífero, tal como una célula humana. En algunas realizaciones, una célula huésped es una célula CHO y en otras realizaciones, una célula huésped es una sP2/0 u otra célula murina. Una célula huésped de la presente invención se puede obtener a través de cualquier fuente conocida en la técnica.
Otros aspectos de la presente invención están dirigidos a composiciones que comprenden un polinucleótido descrito en el presente documento, un vector descrito en el presente documento, un anticuerpo, una molécula de unión a antígeno descrita en el presente documento, y/o una célulain vitrodescrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la composición comprende un vehículo, diluyente, solubilizante, emulsionante, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición comprende un excipiente.
En una realización, la composición comprende un polinucleótido que codifica un anticuerpo o una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), y moléculas que comprenden estas secuencias y células que presentan tales moléculas. En otra realización, la composición comprende una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a la SEQ ID NO: 1,2, 3, 499 y/o 500, y moléculas que comprenden estas secuencias y células que presentan tales moléculas. En otra realización, la composición comprende una célulain vitroque comprende un polinucleótido que codifica un anticuerpo o una molécula de unión a antígeno del mismo codificada por un polinucleótido divulgado en el presente documento.
En algunas realizaciones, la composición comprende más de un anticuerpo diferente o molécula de unión a antígeno que se une específicamente a GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), y moléculas que comprenden estas secuencias y células que presentan tales moléculas. En algunas realizaciones, la composición incluye más de un anticuerpo o molécula de unión a antígeno que se une específicamente a las SEQ ID NOs: 1,2, 3, 499 y/o 500, y moléculas que comprenden estas secuencias y células que presentan tales moléculas, en donde los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno se unen a más de un epítopo. En algunas realizaciones, los anticuerpos o las moléculas de unión a antígeno no competirán entre sí para unirse a ese epítopo. En algunas realizaciones, dos o más de los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento se combinan en una composición farmacéutica. Preferiblemente, dicha composición será adecuada para la administración a un sujeto, incluyendo un ser humano.
V. Métodos ejemplares
La siguiente sección describe diversos ejemplos de métodos de uso de las moléculas de unión a antígeno divulgadas en el presente documento. Cualquiera de las moléculas de unión a antígeno, y fragmentos de las mismas, divulgadas en el presente documento (incluyendo las proporcionadas por las Figuras y el Listado de Secuencias adjunto) pueden emplearse en los métodos divulgados.
En algunos de los métodos divulgados pueden emplearse células T Dichos linfocitos T pueden provenir de cualquier fuente conocida en la técnica. Por ejemplo, las células T se pueden diferenciarin vitrode una población de células madre hematopoyéticas, o se pueden obtener células T de un sujeto. Las células T se pueden obtener de,por ejemplo,células mononucleares de sangre periférica (PBMC), médula ósea, tejido de nódulo linfático, sangre de cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. Además, las células T se pueden derivar de una o más líneas de células T disponibles en la técnica. Las células T también se pueden obtener a partir de una unidad de sangre extraída de un sujeto utilizando cualquier número de técnicas conocidas por el experto en la técnica, tal como la separación y/o aféresis FICOLL™. Métodos adicionales de aislamiento de células T para una terapia de células T se divulgan en documentos de EE. UU. Publicación de Patente No. 2013/0287748.
En diversas realizaciones, la molécula de unión a antígeno se une específicamente a una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) o una subsecuencia que comprende la secuencia de aminoácidos GSGKPGSGEG (SEQ ID<n>O: 2) o SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), moléculas que comprenden estas secuencias y células que presentan tales secuencias. En realizaciones adicionales, la molécula de unión a antígeno comprende uno o más de (a) una CDR1 de cadena ligera, (b) una CDR2 de cadena ligera, (c) una CDR3 cadena ligera, (d) una CDR1 de cadena pesada, (e) una CDR2 de cadena pesada, y (f) una CDR3 de cadena pesada. En realizaciones adicionales, la molécula de unión a antígeno comprende una c DR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9 o 21, o una CDR3 cadena ligera de la SEQ ID NO: 15 o 27, o ambas cadenas pesada y ligera. En otras realizaciones, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 o 19, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 o 20, o una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 o 25, o una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o 26. En diversas realizaciones, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada, una CDR2 de cadena pesada, una CDR3 de cadena pesada, una CDR1 de cadena ligera, una CDR2 de cadena ligera y una CDR3 cadena ligera, comprendiendo cada CDR una secuencia de aminoácidos que se muestra en la FIGURA 6.
En diversas realizaciones, una molécula de unión a antígeno comprende una cadena pesada (HC), y la HC puede comprender una secuencia de región variable (VH) de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 5. En diversas realizaciones, la cadena pesada comprende una CDR1 de cadena pesada, una CDR2 de cadena pesada y una CDR3 de cadena pesada, comprendiendo cada CDR una secuencia de aminoácidos que se muestra en las FIGURAS 6 y 8. Además, en algunas realizaciones, se puede emplear una molécula de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de VH que es al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 % o aproximadamente 100 % idéntica a una VH de una molécula de unión a antígeno de la reivindicación divulgada(por ejemplo,una molécula de unión a antígeno que comprende una secuencia de región variable (VH) que comprende la SEQ ID NO: 5).
En diversas realizaciones, una molécula de unión a antígeno comprende una cadena ligera (LC), y la LC puede comprender una secuencia de región variable (VL) de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 11. En diversas realizaciones, la cadena ligera comprende una CDR1 de cadena ligera, una CDR2 de cadena ligera y una CDR3 cadena ligera, comprendiendo cada CDR una secuencia de aminoácidos que se muestra en las FIGURAS 6 y 8. Además, en algunas realizaciones, se puede emplear una molécula de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de VL que es al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 % %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 % o aproximadamente 100 % idéntico a una VH de una molécula de unión a antígeno de la reivindicación divulgada en el presente documento(por ejemplo,moléculas de unión a antígeno que comprenden una secuencia de región variable (VL) que comprende la SEQ ID NO: 11).
En diversas realizaciones, la molécula de unión a antígeno puede unirse específicamente a una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) una subsecuencia que comprende la secuencia de aminoácidos GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3) o KPGSG (SEQ ID NO: 500). En realizaciones adicionales de los métodos divulgados, la molécula de unión a antígeno comprende uno o más de (a) una CDR1 de cadena ligera, (b) una CDR2 de cadena ligera, (c) una CDR3 cadena ligera, (d) una CDR1 de cadena pesada, (e) una CDR2 de cadena pesada y (f) una CDR3 de cadena pesada. En realizaciones adicionales de los métodos divulgados, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 21, una CDR3 cadena ligera de la SEQ ID NO: 27, o tanto la cadena pesada como la ligera. En otras realizaciones de los métodos divulgados, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 o una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20 o una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 o una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26.
En diversas realizaciones, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada, una CDR2 de cadena pesada, una CDR3 de cadena pesada, una CDR1 de cadena ligera, una CDR2 de cadena ligera y una CDR3 cadena ligera, comprendiendo cada<c>D<r>una secuencia de aminoácidos que se muestra en las FIGURAS 6 y 8
En diversas realizaciones de los métodos divulgados, una molécula de unión a antígeno comprende una cadena pesada (HC), y la HC puede comprender una secuencia de región variable (VH) de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 17. Con referencia a las Figuras, en diversas realizaciones de los métodos divulgados, la cadena pesada comprende una CDR1 de cadena pesada, una CDR2 de cadena pesada, y una CDR3 de cadena pesada, comprendiendo cada CDR una secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 6. Además, en realizaciones de los métodos divulgados, se puede emplear una molécula de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos VH que es al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, o aproximadamente 100%idéntica a una VH de una molécula de unión a antígeno de la reivindicación divulgada en el presente documento(por ejemplo,una molécula de unión a antígeno que comprende una secuencia de región variable (VH) que comprende la SEQ ID NO: 17).
En diversas realizaciones de los métodos divulgados, una molécula de unión a antígeno comprende una cadena ligera (LC), y la LC puede comprender una secuencia de región variable (LH) de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 23. Haciendo referencia a las Figuras, en diversas realizaciones de los métodos divulgados, la cadena ligera comprende una CDR1 de cadena ligera, una CDR2 de cadena ligera y una CDR3 cadena ligera, comprendiendo cada CDR una secuencia de aminoácidos que se muestra en las FIGURAS 6 y 8. Además, en realizaciones de los métodos divulgados, se puede emplear una molécula de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos VL que es al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 % o aproximadamente 100 % idéntica a una VH de una molécula de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación divulgada en la presente invención(porejemplo,una molécula de unión a antígeno que comprende una secuencia de región variable (VL) que comprende la SEQ ID NO: 23).
En realizaciones específicas de los métodos divulgados, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20, una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 21, una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27.
En realizaciones específicas de los métodos divulgados, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8, una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9, una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15.
En vista de la descripción anterior de moléculas de unión a antígeno que pueden emplearse en los métodos divulgados, ahora se discutirán con más detalle métodos representativos.
Va. Método de administración de una dosis de un medicamento a un sujeto
En un aspecto, un método para administrar una dosis de un medicamento a un sujeto, comprendiendo la dosis un número preseleccionado de células que presentan una molécula terapéutica que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGST<k>G (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO:500).
En realizaciones específicas, la dosis comprende 0.5 x 106 células por kilogramo del sujeto, 1.0 x 106 células por kilogramo del sujeto, 2.0 x 106 células por kilogramo del sujeto, 3.0 x 106 células por kilogramo del sujeto, 4.0 x 106 células por kilogramo del sujeto, o 5.0x 106 células por kilogramo del sujeto, aunque el método puede emplearse usando cualquier dosis. 1.0x 106 células por kilogramo del sujeto es una dosis preferida.
De acuerdo con la definición proporcionada en el presente documento, en diversas realizaciones, un sujeto es un sujeto humano o no humano. Cuando el sujeto es un ser humano, el sujeto puede ser, por ejemplo, cualquier ser humano que esté siendo tratado por una condición fisiológica anormal, tal como cáncer o que se haya diagnosticado formalmente con un trastorno, aquellos sin trastornos formalmente reconocidos, aquellos que reciben atención médica, aquellos en riesgo de desarrollar los trastornos, aquellos que están siendo estudiados para el presencia o ausencia de un trastorno, etc.
Inicialmente, se proporciona una muestra que comprende una población que comprende un número conocido de células, la población que se sabe o se sospecha que expresa una molécula terapéutica que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500).
En una realización, la secuencia de aminoácidos seleccionada comprende GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1); en otra realización, la secuencia de aminoácidos seleccionada comprende GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2); en otra realización, la secuencia de aminoácidos seleccionada comprende GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3); en otra realización, la secuencia de aminoácidos seleccionada comprende SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499); y en otra realización, la secuencia de aminoácidos seleccionada comprende KPGSG (SEQ ID NO: 500).
De acuerdo con la definición proporcionada en el presente documento, en diversas realizaciones, un sujeto es un sujeto humano o no humano. Cuando el sujeto es un humano, el sujeto puede ser,por ejemplo,cualquier ser humano que está siendo tratado por una condición fisiológica anormal, tal como el cáncer o ha sido diagnosticado formalmente con un trastorno, aquellos sin trastornos formalmente reconocidos, aquellos que reciben atención médica, aquellos en riesgo de desarrollar los trastornos, aquellos que están siendo estudiados por la presencia o ausencia de un trastorno, etc.
Inicialmente, una muestra de volumen conocido que comprende una población que comprende un número conocido de células, cuyas células se sabe o se sospecha que presentan una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 499 o 500). El número de células se puede determinar usando cualquier método conocido. En realizaciones preferidas, la población se determina contando las células en la muestra utilizando un aparato automatizado, tal como un clasificador de células.(por ejemplo,un FACS), sin embargo, también se pueden emplear métodos tradicionales de conteo de células no automatizados.
Las células del método pueden comprender cualquier tipo de célula, con las células inmunitarias siendo preferidos(por ejemplo,linfocitos B, monocitos, células dendríticas, células de Langerhans, queratinocitos, células endoteliales, astrocitos, fibroblastos y oligodendrocitos). Las células T (incluyendo las células T citotóxicas, T auxiliares y Treg) son especialmente preferidas. En realizaciones específicas, las células son células T, que se pueden obtener como se describe en el presente documento y mediante métodos conocidos en la técnica. Puede emplearse cualquier tipo de célula en el método, y la célula puede ser una célula humana o no humana (incluyendo tanto células procarióticas como eucarióticas). Los ejemplos de células incluyen, pero no se limitan a, células inmunitarias tales como células T, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), células NK, células que expresan TCR, células dendríticas y células NK-T. Una célula T puede ser autóloga, alogénica o heteróloga, o puede ser una célula Tin vivoo una célula Tin vitro,y puede ser una célula T CD4+ o una célula T CD8+. En realizaciones adicionales, las células son células T que presentan un CAR. Además, las células pueden eliminarse o aislarse de cualquier entorno capaz de mantener las células en una forma viable, tal como sangre, tejido o cualquier otra muestra obtenida de un sujeto, medios de cultivo celular, tejido cultivadoex-vivo,etc. La purificación en gradiente, la selección de cultivo celular y/o la clasificación celular pueden ser útiles para obtener células.
La molécula terapéutica expresada por la célula puede comprender cualquier molécula conocida o sospechosa de proporcionar un beneficio terapéutico a un sujeto al que se administra. Por tanto, una molécula terapéutica puede ser un péptido o polipéptido de cualquier estructura o diseño. Preferiblemente, la porción de la molécula terapéutica que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1,2, 3, 499 o 500) se expresa o elimina, al menos en parte, extracelularmente,es decir,hasta el punto de que puede ser reconocido por un compañero de interacción extracelular tal como las moléculas de unión a antígeno de la presente divulgación.
En realizaciones específicas, la molécula terapéutica es un CAR. Cuando la molécula terapéutica es un CAR puede comprender una molécula, o un fragmento de la misma, seleccionada del grupo que consiste en CD2, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8P, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11e (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (cadena alpha asociada al complejo receptor de antígeno de células B), CD79B (cadena beta asociada al complejo receptor de antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (Táctil), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1(KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador de células T inducible (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL),SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando de CD83, receptor de Fc gamma, molécula de MHC de clase 1, molécula de MHC de clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína de inmunoglobulina, un receptor de citoquinas, una integrina, receptores de células NK activadoras, un receptor de tipo Toll y combinaciones de los mismos.
A continuación, se proporciona una alícuota de la muestra que comprende una población de células que presenta una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada. La alícuota se puede obtener usando cualquier medio conveniente, tal como un clasificador de células, simplemente extrayendo el material de la muestra con una pipeta, etc.
Además, se proporciona una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a la secuencia de aminoácidos seleccionada y comprende un marcador detectable. La molécula de unión a antígeno es preferiblemente una molécula de unión a antígeno divulgada en el presente documento,por ejemplo,en las Figuras, el Listado de Secuencias o la presente divulgación. Puede emplearse cualquier marcador detectable en el método, y pueden seleccionarse marcadores adecuados utilizando un conjunto deseado de criterios. Los ejemplos de tipos de marcadores detectables incluyen un colorante fluorescente, que se puede seleccionar del grupo que consiste en un colorante Atto, un colorante Alexafluor, puntos cuánticos, Hidroxicumarina, Aminocumarina, Metoxicumarina, Azul Cascada, Azul Pacífico, Naranja Pacífico, Amarillo Lucifer, NBD, R ficoeritrina (PE), conjugados PE-Cy5, conjugados PE-Cy7, rojo 613, PerCP, TruRed, FluorX, Fluoresceína, BODIPY-FL, Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, TRITC, X-Rodamina, Lisamina Rodamina B, Rojo Texas, Aloficocianina (APC), conjugados APC-Cy7, Indo-1, Fluo-3, Fluo-4, DCFH, DHR, SNARF, GFP (mutación Y66H), GFP (mutación Y66<f>), EBFP, EBFP2, Azurite, GFPuv, T-Sapphire, Cerulean, mCFP, mTurquesa2, ECFP, CyPet, GFP (mutación Y66W), mKeima-Rojo, TagCFP, AmCyan1, mTFP1, GFP (mutación S65A), Midoriishi Cyan, g Fp de tipo silvestre, GFP (mutación S65C), TurboGFP, TagGFP, GFP (mutación S65L), Esmeralda, GFP (mutación S65T), EGFP, Verde Azami, ZsVerde1, TagYFP, EYFP.Topaz, Venus, mCitrine, YPet, TurboYFP, ZsAmarillo1, Naranja Kusabira, mNaranja, Aloficocianina (APC), mKO, TurboRFP, tdTomate, TagRFP, DsRojo monómero, DsRojo2 ("RFP"), mFresa, TurboFP602, AsRojo2, mRFP1, J-Rojo, R ficoeritrina (RPE), B-ficoeritrina (BPE), mCereza, HcRojo1, Katusha, P3, clorofila de peridinina (PerCP), mKate (TagFP635), TurboFP635, mCiruela y mFrambuesa. Otros tipos de marcadores detectables incluyen colorantes ópticos, que se describen en Johnson, Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling 11va Edición, Life Technologies, (2010), radiomarcadores(porejemplo.marcadores isotópicos tales como 3H, 11C,14C, 15N, 18F, 35S, 64CU, 90Y, 99Tc, 111In, 124I, 125I, 131I), compuestos fotocrómicos, marcadores magnéticos (por ejemplo, DYNABEADS), etc. Las estrategias para el marcado de proteínas se conocen en la técnica y pueden emplearse en el método divulgado.
El marcador se puede asociar con la molécula de unión al antígeno en cualquier posición de la molécula, aunque es preferible asociar el marcador con la molécula en una posición (o posiciones, si se emplean varios marcadores) en un punto tal que las propiedades de unión de la molécula no se modifican, a menos que se desee dicha actividad de unión modificada. Se puede emplear cualquier molécula de unión a antígeno que se una específicamente a la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500). En el presente documento se proporcionan ejemplos de moléculas de unión a antígeno adecuadas y componentes de las mismas.por ejemplo,en el Listado de Secuencias adjunto y en las FIGURAS 6 y 8. En realizaciones específicas del método divulgado, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20, una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 21, una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27. En otras realizaciones específicas de los métodos divulgados, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8, una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9, una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15.
La molécula de unión a antígeno se puede disponer sobre cualquier superficie, o sobre ninguna superficie. Por ejemplo, la molécula de unión a antígeno puede estar presente en un tampón y la molécula de unión a antígeno del tampón puede ponerse en contacto con la muestra. Alternativamente, la molécula de unión a antígeno se puede asociar con una superficie. Las superficies adecuadas incluyen perlas de agarosa, perlas magnéticas tales como DYNABEADS, o una placa de plástico, vidrio o cerámica, tal como una placa perforada, una bolsa tal como una bolsa de cultivo celular, etc. La superficie puede disponerse en otra estructura, tal como una columna.
A continuación, la alícuota de la muestra se pone en contacto con la molécula de unión al antígeno en condiciones que permitan la formación de un complejo de unión que comprende una célula presente en la muestra y la molécula de unión a antígeno. Así, el resultado de este paso del método es la formación de un complejo de unión en el que la molécula de unión a antígeno, a la que se asocia un marcador detectable, se une a la célula que expresa la molécula terapéutica, que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada.(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500). Por lo tanto, el propio complejo de unión es detectable. Las condiciones que permiten la formación de un complejo de unión dependerán de una variedad de factores, sin embargo, generalmente los tampones acuosos a pH fisiológico y fuerza iónica, tal como la solución salina tamponada con fosfato (PBS), favorecerán la formación de complejos de unión y se prefieren en el método divulgado.
Se determina la fracción de células presentes en un complejo de unión en la alícuota. Este cálculo se puede realizar comparando el número de células que llevan el marcador detectable con las que no, y se puede representar como porcentaje. Se puede determinar el número de células en los complejos de unión. El método específico empleado para determinar el número de células presentes en un complejo de unión dependerá de la naturaleza del marcador seleccionado. Por ejemplo, se puede emplear FACS cuando se selecciona un marcador fluorescente; cuando se selecciona un marcador de isótopo, se puede emplear espectrometría de masas, RMN u otra técnica; la clasificación de células magnéticas se puede emplear cuando se elige un marcador magnético; también se puede emplear la microscopía. Se conoce el número de células en la muestraab initioy así la fracción de células presentes en un complejo de unión puede determinarse fácilmente.
Continuando, se determina la concentración de células en la muestra inicial que expresan una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500); la determinación se basa en la fracción de células que se determina que están presentes en el complejo de unión y, por lo tanto, expresan la proteína terapéutica que lleva un marcador detectable.
Se conoce la fracción de células que presenta la proteína terapéutica y se conoce el volumen de la alícuota; por lo tanto, una simple comparación del número de células en la muestra de la que se tomó la alícuota que expresan la molécula terapéutica con el volumen de la muestra más grande proporciona la fracción de células en la muestra que contienen la molécula terapéutica en una molécula/volumen terapéutico base(es decir,la concentración de células portadoras de la molécula terapéutica en la muestra más grande).
El volumen de la muestra que comprende el número seleccionado de células se determina por extrapolación con base en la concentración de células portadoras de la molécula terapéutica presente en la muestra.
Finalmente, se administra al sujeto el volumen de muestra que comprende el número deseado de células. La administración puede comprender un aspecto de un régimen terapéutico basado en la molécula terapéutica presente en la muestra y expresada por las células de la muestra.
Aunque la administración se puede realizar una vez o más de una vez, una ventaja del método es que al administrar una dosis que comprende el número preseleccionado de células, el número de células se determinará con base en una eficacia conocida o esperada, se evita la administración innecesaria de células que presentan la molécula terapéutica;es decir,el sujeto recibe el número correcto de células para proporcionar un beneficio terapéutico deseado y no son demasiadas o muy pocas células.
Vb. Método de activación de células
Los métodos divulgados para activar una célula inmunitaria pueden emplearse en relación con cualquier célula inmunitaria que presente una molécula que comprenda una secuencia seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500). En el contexto de los métodos divulgados, las células T (inlcuyendo las células T citotóxicas, T auxiliares y Treg) que presentan tales moléculas son preferibles y se utilizarán para ejemplificar los métodos divulgados; sin embargo, otras células inmunitarias que presentan tales moléculas (por ejemplo, linfocitos tales como linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), linfocitos T citotóxicos, linfocitos infiltrantes de tumores, neutrófilos, basófilos o células T auxiliares, células Treg, células dendríticas, células B, células madre hematopoyéticas, macrófagos, monocitos, células de Langerhans, queratinocitos, células endoteliales, astrocitos, fibroblastos y oligodendrocitos y células NK) también pueden emplearse en los métodos divulgados.
La activación (cuyo término se usa indistintamente con el término "estimulación") de las células T depende de las señales transferidas a través del reconocimiento del receptor de células T específico de antígeno y los receptores accesorios en la célula T Por ejemplo, el agrupamiento de las proteínas CD3gamma, CD3delta, CD3epsilon y CD3zeta, además de asociarse con otros componentes del receptor de células T (TCR), induce la activación de las células T y las convierte en inmunocompetentes. Por lo tanto, "activación" o "estimulación", como se usa en el presente documento, se refiere a una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula con un ligando (que puede ser otra copia de la misma molécula,por ejemplo,CD3zeta asociándose con otra copia de CD3zeta), en el que la unión media en un evento de transducción de señal.
En una realización, las células T se activanin vitropor medio de una molécula de unión a antígeno proporcionada en el presente documento, y las células T activadas de acuerdo con los métodos de la presente divulgación pueden expandirse posteriormenteex-vivoy utilizado en una variedad de aplicaciones, incluyendo las divulgadas en el presente documento.
En otra realización, la activación se producein vivo,por medio de una molécula de unión a antígeno proporcionada en el presente documento, y las células T activadas de acuerdo con los métodos de la presente divulgación; la expansión se produce dentro del organismo en el que se disponen las células activadas. La activaciónin vivopuede formar parte de un régimen terapéutico, cuyos ejemplos se describen en el presente documento.
Antes de la activación, las células inmunitarias, como las células T, se obtienen de un sujeto(por ejemplo,un mamífero tal como un humano, perro, gato, ratón, rata, conejo o especies transgénicas de los mismos; las células derivadas de un sistema artificial tal como un organoide tímico artificial (ATO; véase, por ejemplo, Seet et al., Nature Methods 14(5):521 (2017)) también se pueden emplear en los métodos de activaciónin vivoein vitrodivulgados). Las células inmunitarias, incluyendo las células T, se pueden obtener de varias fuentes, como se describe en el presente documento, incluyendo las PBMC, la médula ósea, el tejido de los ganglios linfáticos, la sangre del cordón umbilical, el tejido del timo, el tejido de un sitio de infección, el tejido del bazo, los tumores o las líneas de células T. Las células T también se pueden obtener de un volumen de sangre recogido de un sujeto utilizando cualquier número de técnicas conocidas por el experto en la técnica, tal como la separación FICOLL. También se puede emplear la purificación en gradiente, la selección de cultivos celulares y/o la clasificación de células.
En vista de ello, se proporciona un método para activar una célula inmunitaria, tal como una célula T, que presenta una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500).
Inicialmente, se proporciona una muestra que comprende una célula inmunitaria que se sabe o se sospecha que presenta una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500). En realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos seleccionada es GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1); en otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos seleccionada es GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2); en otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos seleccionada es GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3); en otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos seleccionada es SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499); y en otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos seleccionada es KPGSG (SEQ ID NO: 500).
En realizaciones específicas, las células son células T, que se pueden obtener como se describe en el presente documento y mediante métodos conocidos en la técnica. La célula puede ser una célula humana o no humana. Las células T pueden ser autólogas, alogénicas o heterólogas. Cuando se emplea una célula T en los métodos descritos, la célula T puede ser una célula Tin vivoo una célula Tin vitro.Además, las células pueden eliminarse o aislarse de cualquier entorno capaz de mantener las células en una forma viable, tal como sangre, tejido o cualquier otra muestra obtenida de un sujeto, medios de cultivo celular, tejido cultivadoex-vivo,un tampón adecuado, etc.
En realizaciones específicas, la molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500) es un CAR. Cuando la molécula es un CAR puede comprender una molécula, o fragmento de la misma, seleccionada del grupo que consiste en CD2, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8p, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11e (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (cadena alpha asociada al complejo receptor de antígeno de células B), CD79B (cadena beta asociada al complejo receptor de antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (Táctil), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1(KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador de células T inducible (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando de CD83, un receptor Fe gamma, una molécula de MHC de clase 1, una molécula de MHC de clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína de inmunoglobulina, un receptor de citoquinas, una integrina, receptores de células NK activadoras, un receptor de tipo Toll y combinaciones de los mismos.
A continuación, una molécula de unión a antígeno se pone en contacto con la muestra, en condiciones que permitan la formación de un complejo de unión que comprende la molécula de unión a antígeno y dos moléculas que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada.(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500), en la que las moléculas que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada se disponen en dos células inmunitarias diferentes. El evento de unión tiene el efecto de acercar ambas células inmunitarias entre sí, con múltiples células que se agrupan juntas después de múltiples eventos de unión.
La molécula de unión a antígeno es preferiblemente una molécula de unión a antígeno (o un fragmento de la misma) divulgada en el presente documento,por ejemplo,en las Figuras, el Listado de Secuencias o la presente sección de la divulgación. Se puede emplear cualquier molécula de unión a antígeno que se una específicamente a la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3.499 o 500). En el presente documento se proporcionan múltiples ejemplos de moléculas de unión a antígeno adecuadas,por ejemplo,aquellos que tienen una o más de las CDR que se muestran en las FIGURAS 6 y 8. Las moléculas que comprenden las secuencias seleccionadas que están presentes en cada célula inmune de un complejo de unión pueden ser las mismas o pueden ser diferentes, siempre que sean reconocidas específicamente por la molécula de unión a antígeno.
En realizaciones específicas del método divulgado, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20, una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 21, una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27. En otras realizaciones específicas de los métodos divulgados, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8, una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9, una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15.
La molécula de unión a antígeno se puede disponer sobre cualquier superficie, o sobre ninguna superficie. por ejemplo, en aplicacionesin vivo,la molécula de unión a antígeno puede estar presente en un tampón y el contacto puede lograrse inyectando la molécula de unión a antígeno en el cuerpo de un sujeto, después de lo cual la activación ocurrirá cuando la molécula de unión a antígeno entre en contacto con una célula que presenta la molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500).
La cantidad precisa de molécula de unión a antígeno que logrará un nivel deseado de activación puede determinarse empíricamente y dependerá de diversos criterios específicos del sujeto. Para la activación in vivo, la cantidad de molécula de unión a antígeno puede ser, por ejemplo, 25 pg/kg/día, 20 pg/kg/día, 15 pg/kg/día, 10 pg/kg/día o 5 pg/kg/ día. La molécula de unión a antígeno se puede administrar a un sujeto durante un número deseado de días, por ejemplo, 5, 4, 3, 2 o 1 día. Se pueden usar otros anticuerpos activadores como guía al determinar cuánta molécula de unión a antígeno administrar a un sujeto. Por ejemplo, las experiencias clínicas con el anticuerpo activador anti CD3 OKT3 pueden ser ilustrativas y beneficiosas cuando se realiza el método divulgado.
Los expertos en la técnica reconocerán que un régimen terapéutico específico se puede adaptar a un sujeto dado, y las cantidades y condiciones de dosificación pueden depender de una variedad de factores normalmente considerados por los médicos. Ejemplos que se pueden considerar al determinar una dosis adecuada de molécula de unión a antígeno para una activaciónin vivoincluyen la salud general y la fuerza de un sujeto, el peso del sujeto, un grado general deseado de activación, la eficacia y eficaciain vivode las células que presentan la molécula que tiene la secuencia seleccionada.
En una activaciónin vitro,la molécula de unión a antígeno puede estar presente en un tampón y la molécula de unión a tampón-antígeno puede ponerse en contacto con la muestra. Como alternativa, en algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno se puede asociar con una superficie. Las superficies adecuadas incluyen perlas de agarosa, perlas magnéticas tales como DYNABEADS, o una placa de plástico, vidrio o cerámica, tal como una placa perforada, una bolsa tal como una bolsa de cultivo celular, etc. La superficie puede disponerse en otra estructura, tal como una columna
Las condiciones que permiten la formación de un complejo de unión dependerán de una variedad de factores, sin embargo, generalmente los tampones acuosos a pH fisiológico y fuerza iónica, tal como la solución salina tamponada con fosfato (PBS), favorecerán la formación de complejos de unión y se prefieren en el método divulgado.
En la práctica, cuando la unión de la molécula de unión a antígeno se une específicamente a las moléculas que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500), una molécula en cada una de dos células inmunitarias diferentes, las dos células se acercan una a la otra. Esta proximidad, o agrupación, tiene el efecto de activar las células inmunitarias.
Vc. Método para determinar el número de células que presentan una molécula de interés
Hay situaciones en las que puede ser deseable determinar el número de células presentes en una muestra que expresan una molécula de interés. Por ejemplo, puede ser deseable determinar el número de células inmunitarias presentes en la muestra obtenida de un sujeto que expresa una molécula de interés. O puede ser deseable determinar el número de células transfectadas y que expresan una molécula de interés, que puede usarse como medida del nivel de eficacia de la transfección. El método divulgado puede emplearse en estas y otras aplicaciones en las que es deseable determinar el número de células presentes en una muestra que expresan una molécula de interés.
Por lo tanto, se proporciona un método para determinar el número de células que presentan una molécula en una muestra en el que la molécula comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500).
En una realización, se proporciona una muestra que comprende células que se sabe o se sospecha que expresan una molécula de interés que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500).
En realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos seleccionada es GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1); en otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos seleccionada es GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2); en otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos seleccionada es GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3); en otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos seleccionada es SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499); en otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos seleccionada es KPGSG (SEQ ID NO: 500).
La célula puede ser de cualquier tipo, y puede ser humana o no humana.(por ejemplo,ratón, rata, conejo, hámster, etc.). En una realización preferida, la célula es una célula inmunitaria. Una célula inmunitaria del método puede ser cualquier tipo de célula inmunitaria(porejemplo,linfocitos B, monocitos, células dendríticas, células de Langerhans, queratinocitos, células endoteliales, astrocitos, fibroblastos y oligodendrocitos). Las células T (incluyendo las células T citotóxicas, T auxiliares y Treg) son especialmente preferidas. En realizaciones específicas, las células son células T, que se pueden obtener como se describe en el presente documento y mediante métodos conocidos en la técnica. Puede emplearse cualquier tipo de célula inmunitaria en esta realización del método divulgado. Los ejemplos de células incluyen, pero no se limitan a, células inmunitarias tales como células T, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), células NK, células que expresan TCR, células dendríticas y células NK-T. Las células T pueden ser autólogas, alogénicas o heterólogas. Las células T pueden ser células T CD4+ o células T CD8+. Cuando se emplea una célula T en los métodos divulgados, la célula T puede ser una célula Tin vivoo una célula Tin vitro.Además, las células pueden eliminarse o aislarse de cualquier entorno capaz de mantener las células en una forma viable, tal como sangre, tejido o cualquier otra muestra obtenida de un sujeto, medios de cultivo celular, tejido cultivadoex-vivo,un tampón adecuado, etc.
En realizaciones específicas, la molécula de interés es un CAR. Cuando la molécula es un CAR puede comprender una molécula, o fragmento de la misma, seleccionada del grupo que consiste en CD2, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8|3, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11e (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (c EAc Am 3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (receptor de antígeno de células B cadena alpha asociada al complejo), CD79B (cadena beta asociada al complejo del receptor de antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (Táctil), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1(KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador de células T inducible (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando de CD83, receptor Fe gamma, molécula MHC de clase 1, molécula de MHC de clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína de inmunoglobulina, un receptor de citoquinas, una integrina, receptores activadores de células NK, un receptor de tipo Toll y combinaciones de los mismos.
Luego, la muestra se pone en contacto con una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a la molécula de interés y comprende un marcador detectable, en condiciones que permiten la formación de un complejo de unión que comprende una célula presente en la muestra y la molécula de unión a antígeno. La molécula de unión a antígeno es preferiblemente una molécula de unión a antígeno (o un fragmento de la misma) divulgada en el presente documento,por ejemplo,en las Figuras, el Listado de Secuencias o la sección instantánea de la divulgación. Se puede emplear cualquier molécula de unión a antígeno que se una específicamente a la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500) en el método divulgado. En el presente documento se proporcionan múltiples ejemplos de moléculas de unión a antígeno adecuadas,por ejemplo,aquellos que tienen una o más de las CDR que se muestran en las FIGURAS 6 y 8.
Puede emplearse cualquier marcador detectable en el método, y pueden seleccionarse marcadores adecuados utilizando un conjunto deseado de criterios. Los ejemplos de tipos de marcadores detectables incluyen un colorante fluorescente, que se puede seleccionar del grupo que consiste en un colorante Atto, un colorante Alexafluor, puntos cuánticos, Hidroxicumarina, Aminocumarina, Metoxicumarina, Azul Cascada, Azul Pacífico, Naranja Pacífico, amarillo Lucifer, NBD, R-ficoeritrina (PE), conjugados PE Cy5, conjugados PE-Cy7, Red 613, PerCP, TruRed, FluorX, Fluoresceína, BODIPY-FL, Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, TRITC, X-Rodamina, Lisamina Rodamina B, Rojo Texas, Aloficocianina (APC), conjugados APC-Cy7, Indo-1, Fluo-3, Fluo-4, DCFH, DHR, SNARF, GFP (mutación Y66H), GFP (mutación Y66<f>), EBFP, EBFP2, Azurite, GFPuv, T-Sapphire, Cerulean, mCFP, mTurquesa2, ECFP, CyPet, GFP (mutación Y66W), mKeima-Rojo, TagCFP, AmCyan1, mTFP1, GFP (mutación S65A), Midoriishi Cyan, GFP de tipo silvestre, GFP (mutación S65C), TurboGFP, TagGFP, GFP (mutación S65L), Esmeralda, GFP (mutación S65T),<e>G<f>P, Verde Azami, ZsVerde1, TagYFP, EYFP, Topaz, Venus, mCitrine, YPet, TurboYFP, ZsAmarillo1, Naranja Kusabira, mNaranja, Aloficocianina (APC), mKO, TurboRFP, tdTomate, TagRFP, DsRojo monómero, DsRojo2 ("RFP"), mFresa, TurboFP602, AsRojo2, mRFP1, J-Rojo, R-ficoeritrina (RPE), B ficoeritrina (BPE), mCereza, HcRojo1, Katusha, P3, clorofila de peridinina (PerCP), mKate (TagFP635), TurboFP635, mCiruela y mFrambuesa. Otros tipos de marcadores detectables incluyen colorantes ópticos, que se describen en Johnson, Molecular Probes Handbook: A Guide to FluorescentProbes and Labeling Technigues, 11va Edición, Life Technologies, (2010), (2010), radiomarcadores(por ejemplo,marcadores isotópicos como 3H, 11C,14C, 15N, 18F, 35S, 64CU, 90Y, 99Tc, 111In, 124I, 125I, 131I), compuestos fotocrómicos, marcadores magnéticos (por ejemplo, DYNABEADS), etc. Las estrategias para el marcado de proteínas se conocen en la técnica y pueden emplearse en el método divulgado.
El marcador se puede asociar con la molécula de unión al antígeno en cualquier posición de la molécula, aunque es preferible asociar el marcador con la molécula en una posición (o posiciones, si se emplean varios marcadores) en un punto tal que las propiedades de unión de la molécula no se modifican (a menos que se desee dicha actividad de unión modificada). Cualquier molécula de unión a antígeno o fragmento de la misma que se una específicamente a la molécula de interés que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500) en el método divulgado.
En realizaciones específicas del método divulgado, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20, una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 21, una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27. En otras realizaciones específicas de los métodos divulgados, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8, una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9, una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15.
La molécula de unión a antígeno se puede disponer sobre cualquier superficie, o sobre ninguna superficie. Por ejemplo, la molécula de unión a antígeno puede estar presente en un tampón y la molécula de unión a antígeno del tampón puede ponerse en contacto con la muestra. Alternativamente, la molécula de unión a antígeno se puede asociar con una superficie. Las superficies adecuadas incluyen perlas de agarosa, perlas magnéticas tales como DYNABEADS, o una placa de plástico, vidrio o cerámica, tal como una placa perforada, una bolsa tal como una bolsa de cultivo celular, etc. La superficie puede disponerse en otra estructura, tal como una columna.
Las condiciones que permiten la formación de un complejo de unión dependerán de una variedad de factores, sin embargo, generalmente los tampones acuosos a pH fisiológico y fuerza iónica, tal como la solución salina tamponada con fosfato (PBS), favorecerán la formación de complejos de unión y se prefieren en el método divulgado.
A continuación, se determina el número de células presentes en un complejo de unión en la muestra. El método específico empleado para determinar el número de células presentes en un complejo de unión dependerá de la naturaleza del marcador seleccionado. Por ejemplo, se puede emplear FACS cuando se selecciona un marcador fluorescente; cuando se selecciona un marcador de isótopo, se puede emplear espectrometría de masas, RMN u otra técnica; la clasificación de células magnéticas se puede emplear cuando se elige un marcador magnético; también se puede emplear la microscopía. La salida de estos métodos de detección puede tener la forma de un número de células o la salida puede tener una forma que permita el cálculo del número de células con base en la salida.
Vd. Método de aislamiento de una molécula
Es de enorme valor tener la capacidad de separar poblaciones de diferentes moléculas, y en particular moléculas biológicamente relevantes, entre sí. Usando las moléculas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento, dicha separación puede lograrse y emplearse en una gama de aplicaciones biotecnológicas, biofarmacéuticas y terapéuticas.
En un aspecto de la presente divulgación, un método para aislar una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ<i>D NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO:
500).
En una realización, el método comprende proporcionar una muestra que se sabe o se sospecha que comprende una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500).
En realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos seleccionada es GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1); en otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos seleccionada es GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2); en otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos seleccionada es GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3); en otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos seleccionada es SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499); en otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos seleccionada es KPGSG (SEQ ID NO: 500).
En realizaciones específicas, la molécula de interés es un CAR. Cuando la molécula es un CAR, puede comprender una molécula, o un fragmento de la misma, seleccionada del grupo que consiste en CD2, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8P, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11e (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (complejo receptor de antígeno de células B -cadena alpha 20 asociada), CD79B (cadena beta asociada al complejo receptor de antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (Táctil), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1(KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador de células T inducible (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando de CD83, receptor Fe gamma, molécula MHC de clase 1, molécula de MHC de clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína de inmunoglobulina, un receptor de citoquina, una integrina, receptores activadores de células NK, un receptor de tipo Toll y combinaciones de los mismos.
Se proporciona una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2 o 3) y opcionalmente comprende un marcador detectable. Cuando se decide emplear un marcador detectable, se puede emplear cualquier marcador detectable en el método, como se describe en el presente documento, y se pueden seleccionar marcadores adecuados utilizando un conjunto deseado de criterios. Ejemplos de tipos de marcadores detectables incluyen marcadores fluorescentes(por ejemplo,fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metilcumarinas, pireno, verde malaquita, estilbeno, Amarillo lucifer, Azul Cascada, Rojo Texas, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Rojo 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Rojo 705, verde Oregón, los colorantes Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Azul Cascada, Amarillo Cascada y R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes), FITC, Rodamina y Rojo Texas (Pierce), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science)). Los colorantes ópticos adecuados, incluyendo los fluoróforos, se describen en Johnson, Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technigues, 11va Edición, Life Technologies, (2010), radiomarcadores(porejemplo,marcadores isotópicos tales como 3H, 11C,14C, 15N, 18F, 35S, 64CU, 90Y, 99Tc, 111In, 124I, 125I, 131I). También se pueden emplear compuestos fotocromáticos, una etiqueta Halo, colorantes Atto, colorantes Tracy, marcadores fluorescentes proteicas(por ejemplo,marcadores fluorescentes proteináceos también incluyen, pero no se limitan a, proteína fluorescente verde, incluyendo las especies Renilla, Ptilosarcus o Aequorea de GFP (Chalfie et al., (1994)Ciencia263:802-805), EGFP (Clon-tech Labs., lnc., número de acceso de Genbank U55762), proteína fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies, lnc; Stauber, (1998)Biotechniques24:462-471; Heim et al., (1996)Curr. Biol.6: 178-182), proteína fluorescente amarilla mejorada (Clontech Labs., lnc.), luciferasa (Ichiki et al., (1993)J Immunol.150:5408-5417), marcadores magnéticos (por ejemplo, DYNABEADS), etc. Las estrategias para el marcaje de proteínas son bien conocidas en la técnica y pueden emplearse en el método divulgado.
El marcador se puede asociar con la molécula de unión a antígeno en cualquier posición de la molécula, aunque es preferible asociar el marcador con la molécula en una posición (o posiciones, si se emplean múltiples marcadores) en un punto tal que las propiedades de unión de la molécula no se modifican (a menos que se desee dicha actividad de unión modificada). Se puede emplear cualquier molécula de unión a antígeno, o fragmento de la misma, que se une específicamente a la secuencia de aminoácidos seleccionada (es decir, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500), tal como los divulgados en el presente documento,por ejemplo,aquellos que tienen una o más de las CDR que se muestran en las FIGURAS 6 y 8.
En realizaciones específicas del método divulgado, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20, una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 21, una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27. En otras realizaciones específicas de los métodos divulgados, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8, una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9, una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15.
La molécula de unión a antígeno se puede disponer sobre cualquier superficie, o sobre ninguna superficie. Por ejemplo, la molécula de unión a antígeno puede estar presente en un tampón y la molécula de unión a antígeno del tampón puede ponerse en contacto con la muestra. Alternativamente, la molécula de unión a antígeno se puede asociar con una superficie. Las superficies adecuadas incluyen perlas de agarosa, perlas magnéticas tales como DYNABEADS, o una placa de plástico, vidrio o cerámica, tal como una placa perforada, una bolsa tal como una bolsa de cultivo celular, etc. La superficie puede disponerse en otra estructura, tal como una columna.
La muestra se pone en contacto con la molécula de unión a antígeno, en condiciones que permitan la formación de un complejo de unión que comprende una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada y la molécula de unión a antígeno. Las condiciones que permiten la formación de un complejo de unión dependerán de una variedad de factores, sin embargo, generalmente los tampones acuosos a pH fisiológico y fuerza iónica, tal como la solución salina tamponada con fosfato (PBS), favorecerán la formación de complejos de unión y se prefieren en el método divulgado. Dado que las partes componentes de un complejo de unión pueden disponerse sobre superficies como se describe en el presente documento, los complejos de unión formados también pueden disponerse sobre superficies.
En esta etapa, es posible que no se hayan formado complejos de unión, o se puede haber formado una pluralidad de complejos de unión que comprenden una o más moléculas de unión a antígeno unidas a una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3,499 o 500). Las moléculas no unidas que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada y/o las moléculas de unión a antígeno no unidas también pueden estar presentes en el entorno local de cualquier complejo de unión formado.
Cualquier molécula que no sea parte de un complejo de unión se separa luego de cualquier complejo de unión formado. El método de eliminación dependerá de la estructura y/o el entorno local de los complejos de unión. Por ejemplo, si la molécula de unión a antígeno se dispone en una perla, placa o bolsa, los componentes no unidos de la mezcla de reacción pueden eliminarse por lavado usando una solución que deje intactos los complejos de unión formados. Si se dispone un complejo de unión sobre una perla, la propia perla se puede situar en una columna u otra estructura y se puede utilizar el mismo enfoque.
La solución utilizada para inducir la formación de complejos de unión se puede utilizar, por ejemplo, como solución de lavado para eliminar los componentes no unidos. Puede usarse cualquier tampón o solución adecuada que no interrumpa los complejos de unión formados. Típicamente, los tampones que tienen altas concentraciones de sal, pH no fisiológico, que contienen caotropos o desnaturalizantes, se evitan preferiblemente cuando se realiza este paso del método.
Luego, un complejo de unión formado se separa en (a) una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500), y (b) una molécula de unión a antígeno. La separación se puede lograr usando metodologías estándar conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede lavar sobre los complejos una solución de pH y composición adecuados. Una solución que se emplea comúnmente para este propósito es glicina HCl 0.1 M, pH 2.5-3.0, y esta solución se puede emplear para lograr la separación. Otras soluciones que pueden emplearse incluyen ácido cítrico 100 mM, pH 3.0, trietilamina o trietanolamina 50-100 mM, pH 11.5; hidróxido de amonio 150 mM, pH 10.5; glicina^NaOH 0.1 M, pH 10.0; cloruro de litio 5 M, cloruro de magnesio o potasio 3.5 M, cloruro de potasio 3.0 M, yoduro de sodio o potasio 2.5 M, tiocianato de sodio 0.2-3.0 M, acetato de Tris 0.1 M con NaCl 2.0 M, pH 7.7; guanidina HCl 2-6 M, urea 2-8 M, tiocianato de amonio 1.0 M, desoxicolato de sodio al 1 %, SDS al 1 %; y dioxano al 10 % etilenglicol al 50 %, pH 8-11.5.
Después de la separación, si la molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO; 1, 2, 499 o 500) es de interés primario, puede recogerse; alternativamente, si la molécula de unión a antígeno es de interés principal, puede recogerse.
Ve. Método para determinar la presencia o ausencia de una molécula
Como se describe en el presente documento, a veces puede ser deseable aislar una molécula que comprenda una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2, 499 o 500. En otros casos, simplemente sabiendo si una molécula comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2, 499 o 500, está presente o ausente de una muestra es información suficiente. Por ejemplo, puede ser beneficioso saber que tal molécula se está expresando, independientemente del nivel de expresión. En otros casos, puede ser deseable saber si un proceso o paso de purificación diseñado para eliminar dicha molécula ha sido efectivo. Así, la determinación cualitativa de la presencia o ausencia de una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1,2, 499 o 500, puede ser útil en múltiples aplicaciones.
En vista de ello, se proporciona un método para determinar la presencia o ausencia en una muestra de una molécula que comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500), en una muestra.
En una realización, el método comprende proporcionar una muestra que se sabe o se sospecha que comprende una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500).
En realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos seleccionada es GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1); en otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos seleccionada es GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2); en otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos seleccionada es GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3); en otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos seleccionada es SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499); y en otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos seleccionada es KPGSG (SEQ ID NO: 500).
En realizaciones específicas, la molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1,2, 499 o 500) es un CAR. Cuando la molécula es un CAR, puede comprender una molécula, o un fragmento de la misma, seleccionada del grupo que consiste en CD2, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8P, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11e (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (cadena alpha asociada al complejo receptor de antígeno de células B), CD79B (cadena alpha asociada al complejo receptor de antígeno de células B) cadena), CD84 (SLAMF5), CD96 (Táctil), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), linfocitos T inducibles coestimulador (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando de CD83, un receptor Fe gamma, una molécula de MHC de clase 1, una molécula de MHC de clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína de inmunoglobulina, un receptor de citoquinas, una integrina, activadores de receptores de células NK, un receptor de tipo Toll y combinaciones de los mismos.
Se proporciona una molécula de unión a antígeno que comprende un marcador detectable, cuya molécula de unión a antígeno se une específicamente a la secuencia de aminoácidos seleccionada.(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 499 o 500). Los marcadores adecuados se pueden seleccionar utilizando un conjunto deseado de criterios. Ejemplos de tipos de marcadores detectables incluyen marcadores fluorescentes(por ejemplo,fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metilcumarinas, pireno, verde malaquita, estilbeno, Amarillo lucifer, Azul Cascada, Rojo Texas, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Rojo 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Rojo 705, verde Oregón, los colorantes Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Azul Cascada, Amarillo Cascada y R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes), FITC, Rodamina y Rojo Texas (Pierce), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science)). Los colorantes ópticos adecuados, incluyendo los fluoróforos, se describen en Johnson, Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Techniques, 11. Edición, Life Technologies, (2010), radiomarcadores(por ejemplo,marcadores isotópicos tales como 3H, 11C,14C, 15N, 18F, 35S, 64CU, 90Y, 99Tc, 111In, 124I, 125I, 131I). También se pueden emplear compuestos fotocromáticos, una etiqueta Halo, colorantes Atto, colorantes Tracy, marcadores fluorescentes proteicos(por ejemplo,marcadores fluorescentes proteináceos también incluyen, pero no se limitan a, proteína fluorescente verde, incluyendo una especie de GFP Renilla, Ptilosarcus o Aequorea (Chalfie et al., (1994)Ciencia263:802-805), EGFP (Clon-tech Labs., Inc., número de acceso de Genbank U55762), proteína fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc; Stauber, (1998)Biotechniques24:462-471; Heim et al., (1996)Curr. Biol.6: 178-182), proteína fluorescente amarilla mejorada (Clontech Labs., Inc.), luciferasa (Ichiki et al., (1993)J Immunol.150:5408-5417), marcadores magnéticos (por ejemplo, DYNABEADS), etc. Las estrategias para el marcaje de proteínas son bien conocidas en la técnica y pueden emplearse en el método divulgado.
En realizaciones específicas del método divulgado, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20, una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 21, una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27. En otras realizaciones específicas de los métodos divulgados, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8, una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9, una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15.
El marcador se puede asociar con la molécula de unión al antígeno en cualquier posición de la molécula, aunque es preferible asociar el marcador con la molécula en una posición (o posiciones, si se emplean varios marcadores) en un punto tal que las propiedades de unión de la molécula no se modifican (a menos que se desee dicha actividad de unión modificada). Cualquier molécula de unión a antígeno que se une específicamente a una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500), tal como los divulgados en el presente documento,por ejemplo,aquellos que tienen una o más de las CDR que se muestran en las FIGURAS 6 y 8.
A continuación, la muestra se pone en contacto con la molécula de unión a antígeno en condiciones que permitan la formación de un complejo de unión que comprende una célula presente en la muestra y la molécula de unión a antígeno. La molécula de unión a antígeno se puede disponer sobre cualquier superficie, o sobre ninguna superficie. Por ejemplo, la molécula de unión a antígeno puede estar presente en un tampón y la molécula de unión a tampónantígeno puede ponerse en contacto con la muestra. Alternativamente, la molécula de unión a antígeno se puede asociar con una superficie. Las superficies adecuadas incluyen perlas de agarosa, perlas magnéticas tales como DYNABEADS, o una placa de plástico, vidrio o cerámica, tal como una placa perforada, una bolsa tal como una bolsa de cultivo celular, etc. La superficie puede disponerse en otra estructura, tal como una columna.
La muestra se pone en contacto con la molécula de unión a antígeno, en condiciones que permitan la formación de un complejo de unión que comprende una molécula que comprende la molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1,2, 3.499 o 500) y la molécula de unión a antígeno. Las condiciones que permiten la formación de un complejo de unión dependerán de una variedad de factores, sin embargo, generalmente los tampones acuosos a pH fisiológico y fuerza iónica, tal como la solución salina tamponada con fosfato (PBS), favorecerán la formación de complejos de unión y se prefieren en el método divulgado. Dado que las partes componentes de un complejo de unión pueden disponerse sobre superficies como se describe en el presente documento, los complejos de unión formados también pueden disponerse sobre superficies.
En esta etapa, es posible que no se hayan formado complejos de unión, o una pluralidad de complejos de unión que comprenden una o más moléculas de unión a antígeno unidas a una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 499 o 500) (o se pueden haber formado una o más moléculas que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada unida a una molécula de unión a antígeno). También pueden estar presentes moléculas no unidas que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1,2, 499 o 500) y/o moléculas de unión a antígeno no unidas en el entorno local de cualquier complejo de unión formado.
Cualquier molécula que no sea parte de un complejo de unión se separa luego de cualquier complejo de unión formado. El método de eliminación dependerá de la estructura y/o el entorno local de los complejos de unión. Por ejemplo, si la molécula de unión a antígeno se dispone en una perla, placa o bolsa, los componentes no unidos de la mezcla de reacción pueden eliminarse por lavado usando una solución que deje intactos los complejos de unión formados. Si se dispone un complejo de unión sobre una perla, la propia perla se puede situar en una columna u otra estructura y se puede utilizar el mismo enfoque.
La solución utilizada para inducir la formación de complejos de unión se puede utilizar, por ejemplo, como solución de lavado para eliminar los componentes no unidos. También se puede utilizar cualquier tampón o solución adecuada que no interrumpa los complejos de unión formados. Por lo general, los tampones que tienen altas concentraciones de sal, pH no fisiológico, que contienen caotropos o desnaturalizantes, deben evitarse al realizar este paso del método.
Por último, se detecta la presencia o ausencia de un complejo de unión, que comprenderá una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1,2, 499 o 500) y una molécula de unión a antígeno. El método específico empleado para detectar la presencia o ausencia de un complejo de unión dependerá de la naturaleza del marcador seleccionado. Por ejemplo, se puede emplear FACS cuando se selecciona un marcador fluorescente; cuando se selecciona un marcador de isótopo espectrometría de masas, RMN u otra técnica puede ser empleada; la clasificación de células magnéticas se puede emplear cuando se elige un marcador magnético; También se puede emplear la microscopía. El resultado final del método es una evaluación cualitativa de la presencia o ausencia de la molécula de unión al antígeno que comprende el marcador detectable y, por lo tanto, la presencia o ausencia de su compañero de unión, comprendiendo la molécula la secuencia de aminoácidos seleccionada.(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 499 o 500).
Como es el caso con todos los métodos divulgados, la molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 499 o 500) se puede desechar en cualquier entorno. En realizaciones preferidas, la molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 499 o 500) se expresa en la superficie de una célula. En esta realización, la célula puede ser de cualquier tipo y puede ser humana o no humana.(porejemplo,ratón, rata, conejo, hámster, etc.). En una realización preferida, la célula es una célula inmunitaria. Una célula inmunitaria del método puede ser cualquier tipo de célula inmunitaria(por ejemplo,linfocitos B, monocitos, células dendríticas, células de Langerhans, queratinocitos, células endoteliales, astrocitos, fibroblastos y oligodendrocitos). Las células T (incluyendo las células T citotóxicas, T auxiliares y Treg) son especialmente preferidas. En realizaciones específicas, las células son células T, que se pueden obtener como se describe en el presente documento y mediante métodos conocidos en la técnica. Puede emplearse cualquier tipo de célula inmunitaria en esta realización del método divulgado, y la célula puede ser una célula humana o no humana. Los ejemplos de células incluyen, pero no se limitan a, células inmunitarias tales como células T, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), células NK, células que expresan TCR, células dendríticas y células NK-T. Las células T pueden ser autólogas, alogénicas o heterólogas. En realizaciones adicionales, las células son células T que presentan un CAR. Las células T pueden ser células T CD4+ o células T CD8+. Cuando se emplea una célula T en los métodos divulgados, la célula T puede ser una célula Tin vivoo una célula Tin vitro.
En una realización adicional, la célula se puede desechar o aislar de cualquier entorno capaz de mantener la célula en una forma viable, tal como sangre, tejido o cualquier otra muestra obtenida de un sujeto, medios de cultivo celular, tejido cultivadoex-vivo,un tampón adecuado, etc.
Vf. Método para aumentar la concentración de una molécula
Muy a menudo, una molécula de interés está presente en una muestra en niveles inferiores a los deseados. Por ejemplo, cuando una célula se transfecta con un gen extraño, los niveles de expresión de las proteínas codificadas por el gen extraño son bajos. Lo mismo puede ser cierto para las moléculas secretadas por una célula; tales moléculas a menudo están presentes en cantidades bajas (pero aún pueden detectarse utilizando los métodos proporcionados en el presente documento, si la molécula comprende una de las secuencias de aminoácidos divulgadas de SEQ ID NO: 1,2 o 3). Una solución al problema de los bajos niveles de expresión es aumentar la concentración de la molécula de interés, que puede estar libre en solución o expresada en la superficie de una célula. La concentración de moléculas de interés expresadas intracelularmente también se puede mejorar, sin embargo, primero se deben lisar las células para liberar la molécula.
Para abordar este problema, un método para aumentar la concentración de células presenta una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500).
En una realización, el método comprende proporcionar una muestra que comprende células que se sabe o se sospecha que comprenden una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500).
En realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos seleccionada es GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1); en otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos seleccionada es GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2); en otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos seleccionada es GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3); en otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos seleccionada es SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499); en otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos seleccionada es KPGSG (SEQ ID NO: 500).
En realizaciones específicas, la molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1,2, 3, 499 o 500) es un CAR. Cuando la molécula es un CAR, puede comprender una molécula, o un fragmento de la misma, seleccionada del grupo que consiste en CD2, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8P, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (cadena alpha asociada al complejo receptor de antígeno de células B), CD79B (cadena alpha asociada al complejo receptor de antígeno de células B) cadena), CD84 (SLAMF5), CD96 (Táctil), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1(KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), CD357 (TNFRSF18), linfocitos T inducibles coestimulador (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando de CD83, un receptor Fe gamma, una molécula de MHC de clase 1, una molécula de MHC de clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína de inmunoglobulina, un receptor de citoquinas, una integrina, activadores de receptores de células NK, un receptor de tipo Toll y combinaciones de los mismos.
Se proporciona una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1,2, 3, 499 o 500) y opcionalmente comprende un marcador detectable. Cuando es preferible emplear un marcador detectable, se puede emplear cualquier marcador detectable en el método, como se describe en el presente documento, y los marcadores adecuados se pueden seleccionar utilizando un conjunto deseado de criterios. Los ejemplos de tipos de marcadores detectables incluyen marcadores fluorescentes(por ejemplo,fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metilcumarinas, pireno, verde malaquita, estilbeno, Amarillo Lucifer, Azul Cascada, Rojo Texas, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Rojo 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Rojo 705, verde Oregon, los colorantes Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Azul Cascada, Amarillo Cascada y R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes), FITC, Rodamina y Rojo Texas (Pierce), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science)). Los colorantes ópticos adecuados, incluyendo los fluoróforos, se describen en Johnson, Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Techniques, 11va Edición, Life Technologies, (2010), radiomarcadores(porejemplo,marcadores isotópicos tales como 3H, 11C,14C, 15N, 18F, 35S, 64CU, 90Y, 99Tc, 111In, 124I, 125I, 131I). También se pueden emplear compuestos fotocromáticos, una etiqueta Halo, colorantes Atto, colorantes Tracy, marcadores fluorescentes proteicos(por ejemplo,marcadores fluorescentes proteináceos también incluyen, pero no se limitan a, proteína fluorescente verde, incluyendo las especies Renilla, Ptilosarcus o Aequorea de GFP (Chalfie et al., (1994)Science263:802-805), EGFP (Clon-tech Labs., Inc., número de acceso de Genbank U55762), proteína fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc; Stauber, (1998)Biotechniques24:462-471; Heim et al., (1996)Curr. Biol.6: 178-182), proteína fluorescente amarilla mejorada (Clontech Labs., Inc.), luciferasa (Ichiki et al., (1993)J Immunol.150:5408-5417), marcadores magnéticos(por ejemplo,DYNABEADS), etc. Las estrategias para el marcaje de proteínas son bien conocidas en la técnica y pueden emplearse en el método divulgado.
El marcador se puede asociar con la molécula de unión a antígeno en cualquier posición de la molécula, aunque es preferible asociar el marcador con la molécula en una posición (o posiciones, si se emplean múltiples marcadores) en un punto tal que las propiedades de unión de la molécula no se modifican (a menos que se desee dicha actividad de unión modificada). Se puede emplear cualquier molécula de unión a antígeno que se une específicamente a la molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500; o una o más moléculas que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada unida a una molécula de unión a antígeno o fragmento de la misma), tal como las divulgadas en el presente documento,por ejemplo,aquellas que tienen una o más de las CDR que se muestran en las FIGURAS 6 y 8.
En realizaciones específicas de los métodos divulgados, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20, una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 21, una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27. En otras realizaciones específicas de los métodos divulgados, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8, una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9, una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15.
La molécula de unión a antígeno se puede disponer sobre cualquier superficie, o sobre ninguna superficie. Por ejemplo, la molécula de unión a antígeno puede estar presente en un tampón y la molécula de unión a antígeno del tampón puede ponerse en contacto con la muestra. Alternativamente, la molécula de unión a antígeno se puede asociar con una superficie. Las superficies adecuadas incluyen perlas de agarosa, perlas magnéticas tales como DYNABEADS, o una placa de plástico, vidrio o cerámica, tal como una placa perforada, una bolsa tal como una bolsa de cultivo celular, etc. La superficie puede disponerse en otra estructura, tal como una columna.
Una célula que expresa una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500) pueden ser de cualquier tipo, y pueden ser humanos o no humanos(por ejemplo,ratón, rata, conejo, hámster, etc.). En una realización preferida, la célula es una célula inmunitaria. Una célula inmunitaria del método puede ser cualquier tipo de célula inmunitaria(porejemplo,linfocitos B, monocitos, células dendríticas, células de Langerhans, queratinocitos, células endoteliales, astrocitos, fibroblastos y oligodendrocitos). Las células T (incluyendo las células T citotóxicas, T auxiliares y Treg) son especialmente preferidas. En realizaciones específicas, las células son células T, que se pueden obtener como se describe en el presente documento y mediante métodos conocidos en la técnica. Puede emplearse cualquier tipo de célula inmunitaria, y la célula puede ser una célula humana o no humana. Los ejemplos de células incluyen, pero no se limitan a, células inmunitarias tales como células T, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), células NK, células que expresan TCR, células dendríticas y células NK-T. Las células T pueden ser autólogas, alogénicas o heterólogas. En realizaciones adicionales, las células son células T que presentan un CAR. Las células T pueden ser células T CD4+ o células T CD8+. Cuando se emplea una célula T en los métodos divulgados, la célula T puede ser una célula T in vivo o una célula T in vitro. Además, las células pueden eliminarse o aislarse de cualquier entorno capaz de mantener las células en una forma viable, tal como sangre, tejido o cualquier otra muestra obtenida de un sujeto, medios de cultivo celular, tejido cultivadoex-vivo,un tampón adecuado, etc.
La muestra que comprende células se pone en contacto con la molécula de unión a antígeno, en condiciones que permitan la formación de un complejo de unión que comprende una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada.(es decir,SEQ ID NO: 1,2, 3, 499 o 500) y la molécula de unión a antígeno. Las condiciones que permiten la formación de un complejo de unión dependerán de una variedad de factores, sin embargo, generalmente los tampones acuosos a pH fisiológico y fuerza iónica, tal como la solución salina tamponada con fosfato (PBS), favorecerán la formación de complejos de unión y se prefieren en el método divulgado. Dado que las partes componentes de un complejo de unión pueden disponerse sobre superficies como se describe en el presente documento, los complejos de unión formados también pueden disponerse sobre superficies.
En esta etapa, es posible que no se hayan formado complejos de unión, o se puede haber formado una pluralidad de complejos de unión que comprenden una o más moléculas de unión a antígeno unidas a una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1,2, 3,499 o 500). También pueden estar presentes moléculas no unidas que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500) y/o moléculas de unión a antígeno no unidas en el entorno local de cualquier complejo de unión formado.
Cualquier molécula o célula que no forme parte de un complejo de unión se separa luego de cualquier complejo de unión formado. El método de eliminación dependerá de la estructura y/o el entorno local de los complejos de unión. Por ejemplo, si la molécula de unión a antígeno se dispone en una perla, placa o bolsa, los componentes no unidos de la mezcla de reacción pueden eliminarse por lavado usando una solución que deje intactos los complejos de unión formados. Si se dispone un complejo de unión sobre una perla, la propia perla se puede situar en una columna u otra estructura y se puede utilizar el mismo enfoque.
La solución utilizada para inducir la formación de complejos de unión se puede utilizar, por ejemplo, como solución de lavado para eliminar los componentes no unidos. También se puede utilizar cualquier tampón o solución adecuada que no interrumpa los complejos de unión formados. Por lo general, los tampones que tienen altas concentraciones de sal, pH no fisiológico, que contienen caotropos o desnaturalizantes, deben evitarse al realizar este paso del método.
En esta etapa del método, estará presente una población de células que presenta una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500). Si se empleó un marcador detectable, la concentración de las células se puede determinar fácilmente, de acuerdo con la naturaleza del marcador. Estarán ausentes células que no expresan la molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500) y, por lo tanto, la población (o concentración) de células que presentan una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500) se incrementará en comparación con los niveles anteriores a la realización del método.
Si la concentración de la molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500) no está en el nivel deseado, los pasos anteriores se pueden repetir el número de veces que se desee. En el contexto de este paso del método, un número deseado de veces también puede ser cero, si ya está presente la concentración deseada de células.
Vg. Método para agotar una población de células inmunitarias
Cuando un sujeto tiene una afección mediada por células inmunitarias, puede ser de gran importancia que la afección se controle de manera oportuna para evitar daños al sujeto. Por ejemplo, cuando un sujeto tiene una reacción autoinmune, puede ser deseable suprimir una respuesta mediada por células inmunitarias agotando una población de células inmunitarias, en un esfuerzo para prevenir el daño. En otro ejemplo, un sujeto que recibe inmunoterapia puede reaccionar demasiado fuerte a la terapia y estar en riesgo de daño; agotar la población de células inmunitarias administradas al sujeto puede ser un enfoque eficaz para mitigar la reacción del sujeto a la inmunoterapia. En vista de la necesidad de un método para controlar la respuesta mediada por células inmunitarias de un sujeto, se proporciona un método para agotar una población de células inmunitarias que presenta una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2) y GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), KPGSG (SEQ ID NO: 500). Se puede emplear una molécula de unión a antígeno que reconoce específicamente<GSTSGSGKPGSGEGSTKG>(S<e>Q<ID NO: 1) y más específicamente la subsecuencia GSGKPGSGEG (SEQ ID NO:>2), la subsecuencia GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), la subsecuencia SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), o la subsecuencia KPGSG (SEQ ID NO: 500) tal como las que se proporcionan en el presente documento,por ejemplo,aquellas que tienen una o más de las CDR mostradas en las FIGURAS 6 y 8, en el método divulgado.
En realizaciones específicas del método divulgado, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20, una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 21, una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27. En otras realizaciones específicas de los métodos divulgados, la molécula de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8, una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9, una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15.
En una realización, el método comprende proporcionar una población de células inmunitarias que se van a agotar, en el que se sabe o se sospecha que las células presentan una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499) y KPGSG (SEQ ID NO: 500).
En realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos seleccionada es GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1); en otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos seleccionada es GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2); en otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos seleccionada es GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), en otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos seleccionada es SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), en otras realizaciones la secuencia de aminoácidos seleccionada es KPGSG (SEQ ID NO: 500).
En realizaciones específicas, la molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1,2, 3, 499 o 500) es un CAR. Cuando la molécula es un CAR, puede comprender una molécula, o un fragmento de la misma, seleccionada del grupo que consiste en CD2, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8P, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11e (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e<(CEACAM5), c>D69<(CLEC2), CD79A (complejo receptor de antígeno de células B -cadena alpha asociada), CD79B>(cadena beta asociada al complejo del receptor de antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (Táctil), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador de células T inducible (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando de CD83, receptor Fe gamma, molécula MHC clase 1, molécula de MHC de clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína de inmunoglobulina, un receptor de citoquinas, una integrina, receptores activadores de células NK, un receptor de tipo Toll y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, puede ser beneficioso para matar las células que expresan una molécula, como un CAR. Como se describió anteriormente, en algunas realizaciones, una célula terapéutica, tal como una célula T CAR, puede usarse terapéuticamente y, posteriormente, debe agotarse en un paciente. En una realización, la presente invención proporciona un método para eliminar estas células T que comprende usar células T para matar otras células T que expresan un CAR. Una célula que presenta una molécula que comprende un epítopo específico reconocido por una molécula de unión a antígeno específica, tal como las divulgadas en el presente documento (es decir, Clon 8 y/o 16 antienlazador, y fragmentos del mismo) puede destruirse usando un diacuerpo, una molécula biespecífica que comprende un scFv de unión a CD3 humano unido a un scFv de unión a antígeno específico, tal como los compuestos por fragmentos del Clon 8 y/o 16, como se describe en el presente documento). En ciertas realizaciones, el diacuerpo se une a una célula que expresa una molécula que comprende GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500) y a una célula T humana para formar una sinapsis inmunológica y facilitar la muerte celular.
Una célula inmunitaria que presenta una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3,499 o 500) puede ser de cualquier tipo, y pueden ser humanos o no humanos(por ejemplo,ratón, rata, conejo, hámster, etc.). Una célula inmunitaria del método puede ser cualquier tipo de célula inmunitaria(por ejemplo,linfocitos B, monocitos, células dendríticas, células de Langerhans, queratinocitos, células endoteliales, astrocitos, fibroblastos y oligodendrocitos). Las células T (incluyendo las células T citotóxicas, T auxiliares y Treg) son especialmente preferidas. En realizaciones específicas, las células son células T, que se pueden obtener como se describe en el presente documento y mediante métodos conocidos en la técnica. Puede emplearse cualquier tipo de célula inmunitaria en esta realización del método divulgado, y la célula puede ser una célula humana o no humana. Los ejemplos de células incluyen, pero no se limitan a, células inmunitarias tales como células T, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), células NK, células que expresan TCR, células dendríticas y células NK-T. Las células T pueden ser autólogas, alogénicas o heterólogas. En realizaciones adicionales, las células son células T que presentan un CAR. Las células T pueden ser células T CD4+ o células T CD8+. Cuando se emplea una célula T en los métodos divulgados, la célula T puede ser una célula Tin vivoo una célula Tin vitro.Además, las células pueden eliminarse o aislarse de cualquier entorno capaz de mantener las células en una forma viable, tal como sangre, tejido o cualquier otra muestra obtenida de un sujeto, medios de cultivo celular, tejido cultivadoex-vivo,un tampón adecuado, etc. Como el método divulgado puede emplearse en entornos terapéuticos, en realizaciones preferidas la población de células inmunitarias se dispone en un sujeto, y más preferiblemente en un sujeto humano.
A continuación, las células inmunitarias se ponen en contacto con una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a (a) la molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2 o 3), y (b) una molécula activadora expresada en la superficie de una célula inmune que no expresa la molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada, bajo condiciones que permiten la formación de un complejo de unión ternario que comprende la molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1,2, 3, 499 o 500), la molécula activadora y la molécula de unión a antígeno. La molécula de unión a antígeno se puede disponer sobre cualquier superficie, o sobre ninguna superficie. Por ejemplo, la molécula de unión a antígeno (que también puede comprender la población de células inmunitarias que se va a agotar y/o puede estar presente en un tampón) y la molécula de unión al tampón-antígeno pueden ponerse en contacto con la muestra. Alternativamente, la molécula de unión a antígeno se puede asociar con una superficie. Las superficies adecuadas incluyen perlas de agarosa, perlas magnéticas tales como DYNABEADS, o una placa de plástico, vidrio o cerámica, tal como una placa perforada, una bolsa tal como una bolsa de cultivo celular, etc. La superficie puede disponerse en otra estructura, tal como una columna.
Las células inmunitarias se ponen en contacto con la molécula de unión a antígeno, en condiciones que permiten la formación de un complejo de unión ternario que comprende una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada.(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500), la molécula de unión a antígeno y una molécula activadora expresada en la superficie de una célula inmunitaria que no expresa la molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500). Las condiciones que permiten la formación de un complejo de unión dependerán de una variedad de factores, sin embargo, generalmente los tampones acuosos a pH fisiológico y fuerza iónica, tal como la solución salina tamponada con fosfato (PBS), favorecerán la formación de complejos de unión y se prefieren en el método divulgado. Dado que las partes componentes de un complejo de unión pueden disponerse sobre superficies como se describe en el presente documento, los complejos de unión formados también pueden disponerse sobre superficies.
En realizaciones preferidas, el contacto se realiza mediante la administración de la molécula de unión a antígeno directamente a un sujeto. En esta realización, el sujeto ya tendrá una población de células que se va a agotar, en donde las células expresan una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500). Por tanto, estas células, así como las células que presentan una molécula activadora, estarán presentes en el sujeto antes de la administración de la molécula de unión al antígeno al sujeto. El entorno de la sangre, la linfa y los tejidos humanos permitirá la formación de complejos de unión ternarios. La unión de la molécula de unión a antígeno con la molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500) sirve para "etiquetar" aquellas células que presentan la molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500)(es decir,las células que se van a agotar). Este evento de unión puede o no conducir al agotamiento por sí mismo. Sin embargo, cuando la molécula de unión al antígeno se une a la molécula activadora para formar el complejo de unión ternario, este evento de unión trae ambas células(es decir,la célula que expresa la molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500), y la célula que expresa la molécula activadora) juntas en proximidad. El resultado fisiológico del evento de unión es la destrucción de la célula que expresa la molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada.(es decir,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 499 o 500). Por lo tanto, con múltiples eventos de unión que ocurren en todo el sujeto, la población de células inmunitarias que llevan la molécula que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada(es decir,SEQ ID NO: 1,2, 3, 499 o 500) se agotan y el riesgo de daño al sujeto disminuye.
Vh. Método de monitorización de una molécula in vivo
La tomografía por emisión de positrones (PET) se utiliza a menudo en la investigación oncológica y en la atención al paciente. Para las lesiones ocupantes de espacio en la cabeza, el tórax, el abdomen y la pelvis, una de las aplicaciones mejor documentadas de la PET es la discriminación entre causas benignas y malignas. Particularmente, 18F-fluorodesoxiglucosa (FDG) se ha utilizado para generar imágenes de la distribución de la captación de glucosa en todas estas aplicaciones. Además, el desarrollo de otros radiotrazadores que visualizan diferentes aspectos del metabolismo y el crecimiento tumoral añaden una dimensión adicional de capacidades. Estos trazadores incluyen 11C-metionina para medir la incorporación de aminoácidos, 18F-timidina para medir la incorporación de nucleótidos (una medida de la proliferación celular), y 18F-fluoromisonidazol para medir la hipoxia tisular.
La presente invención proporciona el uso de moléculas de unión a antígeno en el análisis de PET para aumentar la especificidad de la captación de FDG. En particular, los métodos proporcionados en el presente documento pueden usarse para evaluar cambios temprano después del tratamiento con células CAR, además de monitorizar, detectar, estimular, activar o agotar las células T CAR. Específicamente, los métodos proporcionados en el presente documento pueden facilitar el uso de PET para escaneos de todo el cuerpo. Usando esta técnica para estadificar el cáncer, la enfermedad metastásica oculta en casi cualquier región del cuerpo puede detectarse potencialmente mediante una mayor acumulación de FDG.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un métodoin vivopara detectar una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, 2, 499 o 500. Por ejemplo, en particular, las moléculas de unión a antígeno pueden usarse para seguir o monitorizar la presencia o ausencia de una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1,2, 499 o 500 en un sujeto vivo. En algunas realizaciones, el sujeto vivo es un ser humano. En algunas realizaciones, la molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1,2, 499 o 500 se proporciona a un sujeto vivo y la presencia o ausencia de dicha molécula se determina utilizando una molécula de unión a antígeno proporcionada en el presente documento y una tomografía por emisión de positrones (PET).
En algunas realizaciones, las moléculas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento se pueden usar para controlar las células T CARin vivo.En algunas realizaciones, las moléculas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento se pueden usar para activar o estimular las células T CARin vivo.En algunas realizaciones, las moléculas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento se pueden usar para agotar las células T CARin vivo.En algunas realizaciones, las moléculas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento se pueden usar para controlar las células T CARin vivo.Específicamente, cuando se combinan con PET, las moléculas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos antienlazador) se pueden usar para monitorizar o seguir la distribución de células que expresan una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada (por ejemplo, SEQ ID NO: 1,2, 499 o 500)in vivo.La mención de una referencia en el presente documento no debe interpretarse como un reconocimiento de que dicha referencia es técnica anterior a la presente invención. En la medida en que cualquiera de las definiciones o términos proporcionados en las referencias difieran de los términos y la discusión proporcionada en el presente documento, prevalecerán los presentes términos y definiciones. La memoria descriptiva escrita anterior se considera suficiente para permitir que un experto en la técnica ponga en práctica la invención. La descripción anterior y los Ejemplos que siguen detallan ciertas realizaciones preferidas de la invención y describen el mejor modo contemplado por los inventores. Se apreciará, sin embargo, que no importa cuán detallado lo anterior pueda aparecer en el texto, la invención puede practicarse de muchas maneras y la invención debe interpretarse de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como una limitación adicional.
Ejemplo 1: Generación de moléculas de unión a antígeno
Se generaron anticuerpos monoclonales a través de la inmunización de conejos utilizando el péptido 18mer, GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), conjugado con la proteína transportadora KLH como inmunógeno. El título se determinó mediante el cribado de sueros policlonales mediante ELISA utilizando el péptido enlazador de longitud completa, GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), conjugado con ovoalbúmina. Se realizó un cribado secundario utilizando células T CAR analizadas mediante citometría de flujo (FIGURAS 2 y 3). Una vez que se alcanzó el título, se sacrificaron los conejos inmunizados y se derivaron monoclonales utilizando técnicas estándar de generación y subclonación de hibridomas. El cribado final de los subclones de hibridoma se realizó mediante rondas adicionales de citometría de flujo e inmunohistoquímica (IHC) de células T CAR en proliferación o sedimentos de células fijas derivadas de células T CAR, respectivamente. Las secuencias de los dos subclones finales seleccionados se determinaron mediante secuenciación estándar de Sanger de los subclones de hibridomas.
Ejemplo 2: Inmunohistoquímica (ihc)
Los anticuerpos candidatos se cribaron en cuanto a su utilidad en inmunohistoquímica (IHC; FIGURA 4). Para crear los sedimentos celulares fijados para la tinción IHC, se centrifugaron y lavaron con PBS, células T ~2e6 CAR. Las células se resuspendieron en PBS que contenía paraformaldehído (PFA) al 0.45 % y se incubaron en una plataforma de agitación durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, las células se lavaron una vez más con PBS y se resuspendieron en PBS con BSA al 5 %. Como se muestra en la Figura 4, las células transducidas con CAR fueron reconocidas positivamente por los ejemplos de anticuerpos antienlazador proporcionados en el presente documento.
Ejemplo 3: Mapeo de epítopos
Los anticuerpos(es decir,moléculas de unión a antígeno) se mapearon de epítopo a través de ELISA utilizando el péptido de longitud completa, GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), y variantes truncadas en el extremo N-terminal o C-terminal y que contenían una fracción de biotina en el extremo N-terminal o residuo de lisina con una fracción de biotina en el extremo C-terminal. Los anticuerpos fueron capturados en formato de placa de 96 pocillos utilizando placas prerecubiertas con Proteína G (Pierce). Las placas se lavaron 6x en tampón PBST seguido de incubación con péptidos objetivo. Se realizó un lavado 6x adicional con PBST y los anticuerpos se incubaron adicionalmente con estreptavidina-HRP. Después de un lavado final 6x en PBST, la señal se detectó y cuantificó mediante un kit de quimioluminiscencia mejorado (ECL, de GE Healthcare) y un lector de placas Varioskan Flash (Thermo Fisher). Los resultados del trabajo de mapeo de epítopos se muestran en las FIGURAS 5, 7 y 9.
Ejemplo 4: Generación de secuencias humanizadas a partir de anticuerpos de conejo clon 8-4 y clon 16-6
Se utilizó el software Molecular Operating Environment (MOE) desarrollado por Chemical Computing Group (CCG) para generar alineaciones entre los Clones 8-4 y 16-6 de anticuerpos de conejo y pares de cadenas ligeras y pesadas variables, VL y VH, respectivamente, a partir de dos bases de datos:
(1) La base de datos humana Abysis: una base de datos de aproximadamente 2000 pares de secuencias VL/VH humanas conocidas de IMGT-LigM DB; y
(2) Una base de datos de línea germinal humana: una base de datos de secuencias de línea germinal.
Los modelos humanizados muestran las mejores alineaciones de secuencias (identidad más alta con los dominios VL y VH) con menos brechas. Los 100 pares de anticuerpos principales de cada base de datos humana se exportaron y agruparon mediante kClust (Hauser, Mayer, & Soding, (2013)BMC Bioinformatics,248). A continuación, se presentan tablas para secuencias VL y VH para cada uno de los dos anticuerpos, 8-4 (Tablas 1-8) y 8-16 (Tablas 9-16), con secuencias de cada una de las dos bases de datos agrupadas al 90 % (Tablas 1, 2, 5, 6, 9, 10, 13, 14) y 95 % (Tablas 3, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 16). Los resultados se presentan en el presente y en la FIGURA 8.
Tabla 1. 8-4 secuencias humanizadas de VH -- IMGT-LigM DB (Abysis) agrupadas al 90 % (18 secuencias)
Tabla 2. 8-4 secuencias humanizadas de VL -- IMGT-LigM DB (Abysis) agrupadas al 90 % (39 secuencias)
Tabla 3. 8-4 secuencias humanizadas de VH -- IMGT-LigM DB (Abysis) agrupadas al 95 % (47 secuencias)
Tabla 4. 8-4 secuencias humanizadas de LC -- IMGT-LigM DB (Abysis) agrupadas al 95 % (99 secuencias).
Tabla 5. 8-4 secuencias humanizadas de VH -- base de datos de línea germinal agrupada al 90%(2 secuencias).
Tabla 6. 8-4 secuencias humanizadas de VL -- base de datos de línea germinal agrupada al 90 % (5 secuencias).
Tabla 7. 8-4 secuencias humanizadas de VH -- base de datos de línea germinal agrupada en 95 % (7 secuencias)
Tabla 8. 8-4 secuencias humanizadas de VL -- base de datos de línea germinal agrupada al 95 % (12 secuencias)
Tabla 9. 16-6 secuencias humanizadas de VH -- IMGT-LigM DB (Abysis) agrupadas al 90 % (41 secuencias).
Tabla 10. 16-6 secuencias humanizadas de VL -- IMGT-LigM DB (Abysis) agrupadas al 90 % (21 secuencias).
Tabla 11. 16-6 secuencias humanizadas de VH -- IMGT-LigM DB (Abysis) agrupadas al 95 % (81 secuencias).
Tabla 12. 16-6 secuencias humanizadas de VL -- IMGT-LigM DB (Abysis) agrupadas al 95 % (64 secuencias).
Tabla 13. 16-6 secuencias humanizadas de VH -- base de datos de línea germinal agrupada al 90 % (3 secuencias).
Tabla 14. 16-6 secuencias humanizadas de VL: base de datos de línea germinal agrupada al 90 % (1 secuencia).
Tabla 15. 16-6 secuencias humanizadas de VH -- base de datos de línea germinal agrupada al 95 % (10 secuencias).
Tabla 16. 16-6 secuencias humanizadas de VL -- base de datos de línea germinal agrupada al 95 % (7 secuencias).
Tabla 1. 8-4 secuencias humanizadas de VH -- IMGT-LigM DB (Abysis) agrupadas al 90 % (18 secuencias)
> 8_4_HC_humanizada 866
VQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTISNLAIIW VRQAPGKGLEW VADEDGRGDI YCATW AKGRFTISRDNSTLYLQM NSLRADDTAVYYCARDGDGSGW GDFNFW GQ GTLVTVSS (SEQ ID NO: 28)
> 8 4 H C_ humanizada_673
QSVVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTISNLAirW VRQAPGKGPEW VSDIDGRGDIY C ATW AKGRFTISRDN S SLYLQM NSLRTEDT AVYYC AKDGDGSGW GDFNFW GQGT M VTVSS (SEQ ID NO: 29)
>8_4_HC_humanizada_631
QSVEESGGRLVTPGATVKISCKVSGFTISNLAIIW VQQAPGKGLEW M GDIDGRGDIY C ATW AQGRVTIT AD S ST A YM ELNGLR Y ADT A VYYC ATDGDGSGW GDFNFW GQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 30)
>8_4_HC_humanizada_l 002
QSLEESGGGVVQPGKSLRLSCTASGFTISNLAIIW VRQAPGKGLESVADIDGRGDIY CATW ATGRFAISRDNSKLYLHM DNLRAEDTAVYYCARDGDGSGW GDFNFW GQG TTVIVSS (SEQ ID NO: 31)
>8_4_HC_humanizada_771
QSLEQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISNLAHW VRQAPGKGLEW VSDIDGRGDIY CATW AKGRFTISKSKNTLYLQM NSLRAEDTAVYYCAVDGDGSGW GDFNFW GQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 32)
> 8_4_HC_humanizada 849
QSVEESGGDLVKPGGSLRLSCAASGFTISNLAI1W IRQAPGKGLEW LSDIDGRGDIYC ATW AKGRFTISRDNASLNLQM NSLRAEDTAVYYCAVDGDGSGW GDFNFW GQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 33)
>8_4_11 C_humanizada_706 VLLLESGGGLAQPGGTLRLSCSASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEWVSDIDGRGDIY C ATW ARGRFIISRDNSTLYLQMNSLRAEDTA VYYC AKDGDGSGWGDFNFWGQGIL VTVSS (SEQ ID NO: 34)
>8_4_HC_humanizada_703 VQLVESGGTLVQPGGSLRLSCSASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEYVSDIDGRGDIY C ATW AKGRITISRDN STLSLQM STLRTEDT A VYY C VRDGDGSGW GDFNFW GQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 35)
>8_4_H C_humanizada_278 VQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCEASGFTISNLAIIWIRQAPGKGLEWVGDIDGRGDIY CATWAKGRFTISRDDSTLYLQVNSLKTEDSAVYYCTTDGDGSGWGDFNFWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 36)
>8_4_HC_humanizada_800 QSVLESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFTISNLAIIWIRQPPGKGLEWIGDIDGRGDIYCA TWAKSRLTISTSKNQFSLRLTSVTAADTAMYYCAVDGDGSGWGDFNFWGQGTLV SVSS (SEQ ID NO: 37)
>8_4HC_humanizada_809 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEWLSDIDGRGDIY CATWARGRFAISNARNSLYLQMNSLRDEDTAVYFCARDGDGSGWGDFNFWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 38)
>8_4_H C_humanizada_273 VQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQASGKGLEWIGDIDGRGDIY C ATW AKGRFTV SRSQN S VFLQMN SLETEDT A VYYC ARDGDGSGW GDFNFW GQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 39)
>8_4_HC_humanizada_716
Q S VLESGGGW VQPGRSLRLSC S ASGFTISNLAIIWVRQ APGKGLEWVSDIDGRGDIY CATWAKGRFTISRDNNSLYLQMNSLRPEDTALYYCAKDGDGSGWGDFNFWGQGV LVTVSS (SEQ ID NO: 40)
>8_4_HC_humanizada_202 VQLQESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEYVSDIDGRGDIY CATWAKGRFTISRDNSTLYLQMGSLRAEDMAVYYCAVDGDGSGWGDFNFWGQG TMVTVSS (SEQ ID NO: 41)
>8_4_H C_humanizada_21 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEFVSDIDGRGDIY CATWAKDRFTISRDNSTVYLQMDSLRTEDTAMYFCARDGDGSGWGDFNFWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 42)
>8_4_HC_humanizada_l 73 QSVEESGGRLVTPGGSLRLSCTATGFTISNLAIIWFRQAPGKGLEWVGDIDGRGDIY CATWAKGRFTISRDDNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDGDGSGWGDFNFWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 43)
>8_4_11 C_humanizada_23 QSVLESGGDLVQPGGSLRLSCEASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEWVSDIDGRGDIY C ATW AKGRFTISKSKHTLFLQMHSLRVEDTA VYYC AKDGDGSGWGDFNFWGQGT TVTVSS (SEQ ID NO: 44)
>8_4_11 C_humanizada_879 QSVEESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTISNLAIIWVRQ APGKGLEWVSDIDGRGDIY CATWAKGRFTISRDSSTLYLQMNNLRVEDTALYYCAHDGDGSGWGDFNFWGRGT QVTVSS (SEQ ID NO: 45)
Tabla 2. 8-4 secuencias humanizadas de VL — IMGT-LigM DB (Abysis) agrupadas al 90 % (39 secuencias)
>8_4_LC_humanizada_866 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKRLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 46)
>8_4_LC_humanizada_340 DIQMTQSPFSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGWSTVNYDNVFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 47)
> 84 LC humanizada_322 DIQLTQSPSFLSASVGDTVSITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKHLIYRASTLASGV PSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 48)
>8_4_LC_humanizada_305 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWFQQKPGKAPKSLIYRASTLASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVETK (SEQ ID NO: 49)
>8_4_LC_humanizada_303 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGWSTVNVDNVFGPGTKVDTK (SEQ ID NO: 50)
>8_4_LC_humanizada_291 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKGPKLLIYRASTLASGV PSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDLATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 51)
>8_4_LC_humanizada_217 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCQASQSISTALAWYQQKPGQPPKLLIYRASTLASG VPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQGWSTVNVDNYFGQGTKVEIK
(SEQ ID NO: 52)
>8 4 LC_humanizada_ 197 AYDMTQTPATLSLSPGERATLSCQASQSISTALAWYQQKPGQAPRLLIYRASTLASG IPARFSGSGSGTDFTLTIS SLEPEDF AVYYCQQGW STVNVDNVFGQGTEW VR (SEQ ID NO: 53)
>8_4_LC_humanizada_l 69 E1VLTQSPSFLSAFVGDR1T1TCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGV PSRFSGSGSGTEFTLTISGLQPEDFASYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 54)
>8 4 LC humanizada 17 DIQLTQSPSSLSAAVGDRVTIACQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VP SRF S GS GSGTDF TL SIS SLQPGDF AT Y Y C Q QGW S T VNVDN VF GGGTK V QMK
(SEQ ID NO: 55)
>8 4 LC humanizada 13 DIQMTQSPSSLSASVGDSVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTINGLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 56)
>8 4 LC humanizada 791
AYELTQTPLSSPVTLGQPASISCQASQS1STALAWLHQRPGQPPRLLIYRASTLASGV PDRfSGSGAGTAFTLKISRVEVEDVGIYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVElK (SEQ ID NO: 57)
>8_4_LC_humanizada_673 AYDMTQTPASVEVSPGERATLSCQASQSISTALAWYQHKPGQAPREL1YRASTLAS G1PARFSGSGSGTEFTLTISSVQSDDFAVYYCQQGWSTVNVDNVFGPGTKVD1K (SEQ ID NO: 58)
>8_4_LC_humanizada_678 AYELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWFQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPTDFATYFCQQGWSTVNVDNVFGQGTQVEVK (SEQ ID NO: 59)
>8_4_LC_humanizada_631 AYDMTQTPASVEVSVGDRVTITCQASQS1STALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLAS GVPSRFGGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO: 60)
>8_4_LC_humanizada_ 1002 AYELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLL1YRASTLASG VSSRFSGSGSGTDFTLT1SSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 61)
>8_4_LC_humanizada_775 AYELTQTPLSSPVTLGQPAS1SCQASQS1STALAWLQQRPGQPPRLLIYRASTLASGV PDRFSGSGARTDFTLN1SRVEAEDAGVYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 62)
>8_4_LC_humanizada_771 AYELTQSPATLSLSPGERATLSCQASQS1STALAWYQQKPGQAPRLL1HRASTLASG1 PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTRVEIK (SEQ ID NO: 63)
>8_4_LC_humanizada_ 188 DIQLTQSPSTLSASVGDRITITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGV PPRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVVVR (SEQ ID NO: 64)
>8_4_LC_humanizada_717 ELVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPNLLIYRASTLASG IPSRFSGSGSGTYFTLTINGLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVDIK (SEQ ID NO: 65)
>8_4_LC_humanizada_l 048 SYELTQTPPSVSVSPGQTARITCQASQSISTALAWYQQKPGQAPKVLIYRASTLASGI PERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 66)
>8_4_LC_humanizada_849 AYELTQSPLSLSVTPGQPASISCQASQSISTALAWYLQKPGQPPQLLIYRASTLASGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 67)
>8_4_LC_humanizada_l 016 DIELTQSPSSLSASIGDRVSITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATFYCQQGWSTVNVDNVFGGGTRVEIK (SEQ ID NO: 68)
>8 4 LC humanizada 978
EIVLTQSPSSLSASVGDRVT1TCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLL1YRASTLASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISNLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 69)
>8_4_LC_humanizada_706 DIQMTQYPSSLSASVGDRVTIACQASQSISTALAWYQQKPGKPPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQPEDVATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTRVEFK
(SEQ ID NO: 70)
>8_4_LC_humanizada_278 ELVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWCQQKPGKSPTLLIYRASTLASGV PSRFSGSGSGTGFTLTISGLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIR (SEQ ID NO: 71)
>8_4_LC_humanizada_ 129 EIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQHKPGKAPRLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVEVK
(SEQ ID NO: 72)
>8_4_LC_humanizada_l 133 AYDMTTQPPSVSVSPGQTASITCQASQSISTALAWYQQKPGQSPVLVIYRASTLASG
1PERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQQGWSTVNVDNVFGTGTEVVVR (SEQ ID NO: 73)
>8_4_LC_humanizada_881 AYDMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPNLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVQIK (SEQ ID NO: 74)
>8_4_LC_humanizada_882 AYDMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGFGTDFTFT1SSLQPEDSATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKLE1K (SEQ ID NO: 75)
>8_4_LC_humanizada_273 ELVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGEAPKLL1YRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQSEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 76)
>8_4_LC_humanizada_716 ELVMTQSPSSLSASEGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGRAPKLLIHRASTLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTISGLQSEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTTVDVK
(SEQ ID NO: 77)
>8_4_LC_humanizada_677 AYDMTQSPSFLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 78)
>8_4_LC_humanizada_l 92 AYDMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFTTYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVEFK
(SEQ ID NO: 79)
>8_4_LC_humanizada_802 AIRMTQSPSSFSASTGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 80)
>8 4 LC humanizada 54
AYGMTQSPDSLAVSLGERASINCQASQSISTALAWYQQKPGQPPKLLIYRASTLASG VPDRFSGGGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO: 81)
>8_4_LC_humanizada_l 73 AIQMTQSPFSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWFQQKPGKAPKSL1YRASTLASG VSSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTRLVVR
(SEQ ID NO: 82)
>8_4_LC_humanizada_224 AYDMTQTPASVSLSPGERATLSCQASQSiSTALAWYQQKPGQAPRLLlYRASTLAS G1PDRFRGSGSATDFTLT1SRLEPEDFAVYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTEVVVR (SEQ ID NO: 83)
>8_4_LC_humanizada_657 AYDMTQTPASVEVSVGDRVSITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLAS GVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPVDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGPGTTVDAK
(SEQ ID NO: 84)
Tabla 3. 8-4 secuencias humanizadas de VH -- IMGT-LigM DB (Abysis) agrupadas al 95 % (47 secuencias)
>cl|CABBAB ABA| 101117 >8_4_HC_humanizada_866 >8_4_HC_humanizada_340 >8_4_HC_humanizada_336 >8_4_HC _humanizada_332 >8_4_HC_humanizada_322 VQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEWVADIDGRGDT YCATWAKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDGDGSGWGDFNFWGQ GTLVTYSS (SEQ ID NO: 85)
>cl |KABB ABABA| 13(117 >8 4 HC humanizada 315 >8 4 HC humanizada 314 >8_4_HC_humanizada_305 >8_4_HC_humanizada_303 >8_4_HC_humanizada_296 VQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEWVADIDGRGDI YC A TW AKGRF TISRDN S TL YLQMN S LR AEDT A V YY C A VDGDG S G W GDFNF W GQ GTLVTVSS (SEQ ID NO: 86)
>cl|TABBABABA|8| 117 >8_4_HC_humanizada_217 >8_4_HC_humanizada_197 >8_4_HC_humanizada_678 >8_4_HC_humanizada_978 >8_4_HC_humanized_63 5 VQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEWVSDTDGRGDTY CATWAKGRFTISRDNASLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGDGSGWGDFNFWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 87)
>cl|WABBABABA|7|l 17 >8_4_HC_humanizada_169 >8_4_HC_humanizada_122
>8 4 HC_humanizada_676 >8 4 HC_humanizada_893 >8 4 HC_humanizada_57 VQLVESGGGLV QPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIW VRQAPGKGLEW VSD1DGRGDIY CATWAKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGDGSGWGDFNFWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 88)
>cl |ZABBABABA| 11117 >8 4_HC_humanizada_l 7 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQAPGRGLVWVSDIDGRGDIY CATWAKGRFTISRDNATLYLQMNNLRAEDTAVYYCARDGDGSGWGDFNFWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 89)
>cl|CEBBABABA| 11117 >8 4 HC humanizada 791 QSVLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEWVSDIDGRGDIY C ATW ARGRFTISRDN STL YLQMN SLR AEDT AIYYCAKDGDGS GWGDFNF WGRGT HVTVSS (SEQ ID NO: 90)
>cl|DEBBABABA| 11117 >8_4_HC_humanizada_673
QSVVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQAJPGKGPEWVSD1DGRGDIY CATWAKGRFTISRDNSSLYLQMNSLRTEDTAVYYCAKDGDGSGWGDFNFWGQGT MVTVSS (SEQ ID NO: 91)
>cl|GEBBABABA| 11117 >8_4_HC_humanizada_631 QSVEESGGRLVTPGATVKISCKVSGFTISNLAIIWVQQAPGKGLEWMGDIDGRGDIY CATWAQGRVT1TADSSTAYMELNGLRYADTAVYYCATDGDGSGWGDFNFWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 92)
>cl |HEBBABABA| 11117 >8 4 HC_humanizada_1002 QSLEESGGGVVQPGKSLRLSCTASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLESVADIDGRGDIY CATWATGRFAISRDNSKLYLHMDNLRAEDTAVYYCARDGDGSGWGDFNFWGQG TTV1VSS (SEQ ID NO: 93)
>cl |KEBB AB AB A| 11117 >8 4_HC_humanizada_775 QSLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQASGKGLEWVSDIDGRGDIY CATWAKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYSCAVDGDGSGWGDFNFWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 94)
>cl|LEBBABABA|2|l 17 >8_4_HC_humanizada_771 >8_4_HC_humanizada_772 QSLEQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEWVSDIDGRGDIY CATWAKGRFTISKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDGDGSGWGDFNFWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 95)
>clINEBBABABA| 11117 >8_4_HC_humanizada_l 88 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEWASDIDGRGDIY C ATW AKGRFTISRDS STL Y LQMN SLRTDDT A V Y Y C AADGDGSGW GDFNF W GQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 96)
>cl|PEBBABABA|9|l 17 >8_4_HC_humanizada_186 >8_4_HC_humanizada_292
>8 4 HC humanizada 283 >8 4 HC_humanizada_204 >8 4 HC_humanizada_201 VQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTISNLA1IWVRQAPGKGLEWVADIDGRGDI YCATWAKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGDGSGWGDFNFWGQ GTLVTVSS (SEQ ID NO: 97)
>cl | QEBB AB AB A| 11117 >8_4_HC_humanizada_717 QSVLESGGGWVQPGRSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEWVADIDGRGDI YCATWAKGRFTISRDNASLYLEMKSLRAEDTAIYYCARDGDGSGWGDFNFWGQG VLVTVSS (SEQ ID NO: 98)
>cl|REBBABABA|2|l 17 >8_4_HC_humanizada_l048 >8_4_HC_humanizada_675 QSVEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEWVSDIDGRGDIY CATWAKGRFTISRDNASLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGDGSGWGDFNFWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 99)
>cl|SEBBABABA|l|l 17 >8_4_HC_humanizada_849 QSVEESGGDLVKPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIWIRQAPGKGLEWLSDIDGRGDIYC ATWAKGRFTISRDNASLNLQMNSLRAEDTAVYYCAVDGDGSGWGDFNFWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 100)
>cl |TEBB AB AB A|31117 >8_4_HC_humanizada_l 016 >8_4_HC_humanizada_295 >8_4_HC_humanizada_319 VQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEWVADIDGRGDI Y C ATW AKGRFTISRDN STLYLQMN SLRAEDT A V Y Y CA VDGDGSGW GDFNF WGQ GTLVTVSS (SEQ ID NO: 101)
>cl|XEBBABABA|2|l 17 >8_4_HC_humanizada_868 >8_4_HC_humanizada_55 QQLQESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEYVSDIDGRGDIY CATWAKGRFTISRDNSTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVKDGDGSGWGDFNFWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 102)
>cl | YEBB AB AB A| 11117 >8_4_HC_humanizada_862
VRLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFT1SNLAIIWVRQAPGKGLEWVADIDGRGDI Y C ATW AKGRFTISRDNSTLHLQMN SLRAEDT A V Y Y C AKDGDG SG W GDFNF WGK GTTVTVSS (SEQ ID NO: 103)
>cl |ZEBBABABA111117 >8_4_HC _humanizada_715 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT1SNLA11WVRQAPGKGLEWVSDIDGRGDIY C ATW AKGRFTISRSKNTLYLQMN SLRAEDT AVYYCARDGDGSGW GDFNF WGQGT TVTVSS (SEQ ID NO: 104)
>cl|B!BBABABA] 11117 >8 4 HC_humanizada_706 VLLLESGGGLAQPGGTLRLSCSASGFTISNLAÜWVRQAPGKGLEWVSDIDGRGDIY CATWARGRFI1SRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGDGSGWGDFNFWGQGIL VTVSS (SEQ ID NO: 105)
>cl|CXBBABABA] 11117 >8_4_HC_humanizada_703 VQLVESGGTLVQPGGSLRLSCSASGFTISNLA11WVRQAPGKGLEYVSD1DGRGD1Y CATWAKGR1T1SRDNSTLSLQMSTLRTEDTAVYYCVRDGDGSGWGDFNFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 106)
>cl|FlBBABABA| 11117 >8_4_HC_humanizada_341 VQLVQSGGSLVQPGRSLRLSCAASGFTISNLA1IWVRQAPGKGLEWVAD1DGRGDIY CATWAKGRFTTSRDNSTLYLQMNSLRADDTAVYFCAVDGDGSGWGDFNFWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 107)
>cl|K!BBABABA] 1|'1T7 >8_4_HC_humanizada_301 VQLVESGGDLVQPGESLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEWVSD1DGRGDIY CATWAKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGDGSGWGDFNFWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 108)
>cl IQ1BBABABA| 1|'1T7 >8_4_HC_humanizada_278 VQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCEASGFTISNLAIIWIRQAPGKGLEWVGDIDGRGDIY CATWAKGRFTISRDDSTLYLQVNSLKTEDSAVYYCTTDGDGSGWGDFNFWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 109)
>cl|TIBBABABA] 11117 >8_4_HC_humanizada_129 MQLVESGGGLVQPGRSLRLSCVTSGFT1SNLA1IWVRQVPGKGLEWVSDIDGRGD1Y CATWAKGRFTISRDNTSLYLQMNSLRPEDTAVYYCAKDGDGSGWGDFNFWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 110)
>cl|XIBBABABA] 11117 >8_4_HC_humanizada_800 QSVLESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFTTSNLAIIWIRQPPGKGLEWIGDTDGRGDTYCA TWAKSRLTISTSKNQFSLRLTSVTAADTAMYYCAVDGDGSGWGDFNFWGQGTLV SVSS (SEQ TD NO: 111)
>cl|YIBBABABA|7|l 17 >8_4_HC_humanizada_l 133 >8_4_HC_humanizada_881 >8_4_HC_humanizada_677 >8_4_HC_humanizada_l 92 >8_4_HC_humanizada_65 QSVEESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEWVADIDGRGDIY CATWAKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGDGSGWGDFNFWGQGT TVTVSS (SEQ ID NO: 112)
>cl|FOBBABABA| 11117 >8_4_HC_humanizada_882 QSVEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQPPGKGLEWVGDIDGRGDIY C ATWAKGRFTISRSKSTVYLQMNSLKTEDT AVYYCT ADGDGSGW GDFNFW GQG MLVTVSS (SEQ ID NO: 113)
>cl|GOBBABABA| 11117 >8_4_HC_humanizada_660 QSVEESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLECVSDIDGRGDIYC ATWAKGRFTISRDNSTLYLQMTSLRAEDTAVYYCALDGDGSGWGDFNFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 114)
>cl|HOBBABABA|2|117 >8_4_HC_humanizada_1051 >8 4 HC_humanizada_1050 VQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT1SNLAIIWVRQAPGKGLEWVGD1DGRGD1 YCATWAKGRETISRSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTVDGDGSGWGDFNFWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 115)
>cl|MOBBABABA] 1111V >8_4_HC_humanizada_809 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEWLSD1DGRGDIY CATWARGRFA1SNARNSLYLQMNSLRDEDTAVYFCARDGDGSGWGDFNFWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 116)
>cl| VOBBABABA| 11117 >8 4 HC_humanizada_273 VQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT1SNLAI1WVRQASGKGLEW1GD1DGRGDIY C ATW AKGRFT V SRSQN S VFLQMN SLETEDTAVY Y C ARDGDGSGW GDFNF W GQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 117)
>cl|W OBBABABA|l|l 17 >8_4_HC_humanizada_716
QS VLESGGGW VQPGRSLRLSC S ASGFT1SNLA11W VRQ APGKGLE W VSD1DGRGD1Y CATWAKGRFTISRDNNSLYLQMNSLRPEDTALYYCAKDGDGSGWGDFNFWGQGV LVTVSS (SEQ ID NO: 118)
>cl|ZOBBABABA|l|l 17 >8_4_HC_humanizada_202 VQLQESGEGLVQPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIW VRQ APGKGLE Y VSDIDGRGDIY CATWAKGRFTISRDNSTLYLQMGSLRAEDMAVYYCAVDGDGSGWGDFNFWGQG TMVTVSS (SEQ ID NO: 119)
>cl|GUBBABABA| 11117 >8_4_HC_humanizada_54 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTISNLAI1WVRQPPGKGLEW VSDIDGRGDIY CATWAKGRFTISRENATLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDGDGSGWGDFNFWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 120)
>cl|HUBB ABABA| 1111'7 >8_4_HC_humanizada_21 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT1SNLAIIWVRQAPGKGLEFVSDIDGRGDIY CATWAKDRFT1SRDNSTVYLQMDSLRTEDTAMYFCARDGDGSGWGDFNFWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 121)
>cl|KUBBABABA| 11117 >8_4_HC_humanizada_788 QSVLESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTISNLAIIW VRQ APGKGLEW VSDIDGRGDIY CATWAKGRFTISRDNSTLFLQISSLRAEDTAVYYCAKDGDGSGWGDFNFWGPGTL VTVSS (SEQ ID NO: 122)
>cl|MUBBABABA) 11117 >8_4_HC_humanizada 762 VKLLESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTISNLAIIW VRQ APGKGLEWVADIDGRGDIY C ATW AKGRFTISRDNSTLYLQMNSLGAEDTAVYYC ARDGDGSGWGDFNFWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 123)
>cl|PUBBABABA|l |117 >8_4_HC_humanizada_l 73 QSVEESGGRLVTPGGSLRLSCTATGFTISNLAHWFRQAPGKGLEWVGDIDGRGDIY CATWAKGRFTISRDDNSLYLQMNSLKTEDTAVYYC ARDGDGSGWGDFNFWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 124)
>cl|RUBBABABA) 11117 >8 4 HC_humanizada_224
QSVEESGGGL VKPGGSLRLSC AASGFTISNLAIIW VRQ APGKGLEWVGDIDGRGDIY CATWAKGRFTISRSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCATDGDGSGWGDFNFWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 125)
>cl|VUBBABABA|l |117 >8 4 HC humanizada 672
QSW ESGGGLIQPGGSLRLSC AASGFTISNLAIIW VRQ APGKGLEWVSDIDGRGDIY C ATW AKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCALDGDGSGWGDFNFWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 126)
>cl|XUBBABABA| 11117 >8 4_HC humanizada 267
QSVEQSGGGLVQPGESLRLSCAGSGFT1SNLAIIWVRQAPGKGLEWVADIDGRGDIY CATWAKGRFTISRDNASLFLQMNSLRVEDTAVYYCARDGDGSGWGDFNFWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 127)
>cl| YUBB ABAB A| 11117 >8_4_HC humanizada_23 QSVLESGGDLVQPGGSLRLSCEASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEWVSDIDGRGDIY CATWAKGRFT1SKSKHTLFLQMHSLRVEDTAVYYCAKDGDGSGWGDFNFWGQGT TVTVSS (SEQ ID NO: 128)
>cl|ZUBBABABA) 11117 >8_4_HC_humanizada_657 QSVEESGGRLVTPGGSLRLSCAASGFT1SNLAI1WVRQAPGKGLEWVSDIDGRGDIY CATWAKGRFT1SRDNSSLYLQMNSLRTEDSALYYCAIDGDGSGWGDFNFWGQGSL VTVSS (SEQ ID NO: 129)
>cl|BACB ABABA| 1)117 >8_4_HC_humanizada_879 QSVEESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEWVSDIDGRGDIY CATWAKGRFTISRDSSTLYLQMNNLRVEDTALYYCAHDGDGSGWGDFNFWGRGT QVTVSS (SEQ ID NO: 130)
Tabla 4. 8-4 secuencias humanizadas de LC -- IMGT-LigM DB (Abysis) agrupadas al 95% (99 secuencias).
>cl|CACBABABA| 1)110 >8_4_LC_humanizada 866 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKRLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 131)
>cl |DACBAB AB A| 11110 >8 4 LC humanizada 340 DIQMTQSPFSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGWSTVNVDNVFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 132)
>cl|FACBABABA|l|l 10 >8 4 LC humanizada 336 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGV PSRFSGSGSGTDFTLT1SSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 133)
>cl|GACBABABA| 11110 >8 4 LC_humanizada_332 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLVYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 134)
>cl |HACBAB AB A| 11110 >8_4_LC_humanizada_322 DTQLTQSPSFLSASVGDTVSITCQASQSTSTALAWYQQKPGKAPKFTLIYRASTLASGV PSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 135)
>cl |KACB AB AB A| 11110 >8_4_LC_humanizada_315 DTQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGV PSRFSGSGSGTGFTLTTSSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 136)
>cl |L ACB ABAB A) 11110 >8_4_LC_humanizada_314 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPNLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 137)
>cl |MACB AB AB A 111110 >8 4 LC _humanizada_305
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWFQQKPGKAPKSLIYRASTLASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 138)
>cl|NACBABABA| 11110 >8_4_LC_humanizada_303 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPED1ATYYCQQGWSTVNVDNVFGPGTKVD1K (SEQ ID NO: 139)
>cl|PACBABABA| 11110 >8_4_LC_humanizada_296 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQS1STALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSTFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 140)
>cl|QACBABABA] 11110 >8_4_LC_humanizada_294 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQS1STALAWYQQKPGKAPKLL1YRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 141)
>cl|RACBABABA] 11110 >8_4_LC_humanizada_291 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKGPKLL1YRASTLASGV PSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDLATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVE1K (SEQ ID NO: 142)
>cl|SACBABABA| 11110 >8_4_LC_humanizada_284 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKSLIYRASTLASG VPSKFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTRLE1K (SEQ ID NO: 143)
>cl|TACBABABA] 11110 >8_4_LC_humanizada_217 D1VMTQSPDSLAVSLGERATINCQASQS1STALAWYQQKPGQPPKLL1YRASTLASG VPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVEIK
(SEQ ID NO: 144)
>cl|VACBABABA| 11110 >8_4_LC_humanizada_197 AYDMTQTPATLSLSPGERATLSCQASQSISTALAWYQQKPGQAPRLLIYRASTLASG
1PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTEVVVR (SEQ ID NO: 145)
>cl|WACBABABA| 11110 >8_4_LC_humanizada_169 EIVLTQSPSFLSAFVGDRTTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGV PSRFSGSGSGTEFTLTISGLQPEDFASYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 146)
>cl|XACBABABA|l |110 >8 4_LC jw m anizadaJ22 DVVMTQSPASLSASVGDRVTnCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSRTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGWSTVNVDNVFGPGTKVDIK (SEQ ID NO: 147)
>cl|YACBABABA| 11110 >8 4_LCJiumanizada 44 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKRLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 148)
>cl|ZACBABABA] 11110 >8 4 LC humanizada 17 DIQLTQSPSSLSAAVGDRVTIACQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLSISSLQPGDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVQMK
(SEQ ID NO: 149)
>cl|BECBABABA|l |110 >8 4 LC humanizada 13
DIQMTQSPSSLSASVGDSVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTINGLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 150)
>cl|CECBABABA|l|l 10 >8_4_LC_humanizada_791 AYELTQTPLSSPVTLGQPASISCQASQSISTALAWLHQRPGQPPRLLIYRASTLASGV PDRFSGSGAGTAFTLKISRVEVEDVGIYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 151)
>cl|DECBABABA) 11110 >8_4_LC_humanizada_673 AYDMTQTPASVEVSPGERATLSCQASQSISTALAWYQHKPGQAPRLLIYRASTLAS
G1PARFSGSGSGTEFTLTISSVQSDDFAVYYCQQGWSTVNVDNVFGPGTKVD1K (SEQ ID NO: 152)
>cl|FECBABABA|l|l 10 >8..4_LC_humanizada_678 AYELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWFQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPTDFATYFCQQGWSTVNVDNVFGQGTQVEVK (SEQ ID NO: 153)
>cl|GECBABABA| 11110 >8_4_LCJiumanizada_631 AYDMTQTPASVEVSVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLAS GVPSRFGGSGSGTDFTLT1SSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVE1K (SEQ ID NO: 154)
>cl|HECBABABA] 11110 >8_4_LC_humanizada_l 002 AYELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VSSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKLE1K (SEQ ID NO: 155)
>cl IKECBABABA| 11110 >8_4_LC_humanizada_775 AYELTQTPLSSPVTLGQPASISCQASQSISTALAWLQQRPGQPPRLLIYRASTLASGV PDRFSGSGARTDFTLN1SRVEAEDAGVYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKLE1K (SEQ ID NO: 156)
>cl|LECBABABA|2|l 10 >8_4_LC_humanizada_771 >8_4_LC_humanizada_772 AYELTQSPATLSLSPGERATLSCQASQSISTALAWYQQKPGQAPRLLIHRASTLASGI PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTRVEIK (SEQ ID NO: 157)
>cl|M ECBABABA|l|l 10 >8 4 LC humanizada_676 AYDMTQSPATLSLSPGERATLSCQASQSISTALAWYQQKPGQAPRLLIYRASTLASG IPARFSGSGSGTDFTLT1SSLEPEDFAVYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVE1K (SEQ ID NO: 158)
>cl|NECBABABA| 11110 >8 4_LC_humanizada_l 88 DIQLTQSPSTLSASVGDRITITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGV PPRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVVVR (SEQ ID NO: 159)
>cl|PECBABABA| 11110 >8_4_LC_humanizada_l86 DIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTEFTLT1SSLQPDDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVVVR (SEQ ID NO: 160)
>cl|QECBABABA| 11110 >8_4_LC_humanizada_717 ELVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPNLLIYRASTLASG IPSRFSGSGSGTYFTLTINGLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVDIK (SEQ ID NO: 161)
>cl|RECBABABA|l |110 >8_4_LC_humanizada_l 048
SYELTQTPPSVSVSPGQTARITCQASQSISTALAWYQQKPGQAPKVL1YRASTLASGI PERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 162)
>cl|SECBABABA) 1)110 >8_4_LC_humanizada_849 AYELTQSPLSLSVTPGQPASISCQASQSISTALAWYLQKPGQPPQLLIYRASTLASGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 163)
>cl|TECBABABA|l|l 10 >8_4_LC_humanizada_1016 DIELTQSPSSLSAS1GDRVSITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLL1YRASTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLT1SSLQPEDFATFYCQQGWSTVNVDNVFGGGTRVE1K (SEQ ID NO: 164)
>cl|VECBABABA) 11110 >8_4_LC_humanizada_978 EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQS1STALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISNLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 165)
>cl|W ECBABABA|l|l 10 >8_4_LC_humanizada_893 D1EMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKRLIQRASTLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYHCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVE1K (SEQ ID NO: 166)
>cl|XECBABABA) 11110 >8_4_LC_humanizada_868 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCQASQSISTALAWYQQKPGQPPKLLIYRASTLASG VPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKLE1K (SEQ ID NO: 167)
>cl|YECBABABA) 11110 >8 4_LC_humanizada_ 862 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQS1STALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 168)
>cl|ZECBABABA|l|l 10 >8_4_LC humanizada_715 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQS1STALAWYQQKPGKAPKFLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 169)
>cl|BICBABABA) 1)110 >8_4_LC_humanizada_706 DIQMTQYPSSLSASVGDRVTIACQASQSISTALAWYQQKPGKPPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQPEDVATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTRVEFK
(SEQ ID NO: 170)
>cl|CICBABABA|l|110 >8_4_LCJiumanizada_703 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCQASQSISTALAWYQQKAGQPPKLLIYRASTLASG VPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO: 171)
>cl|DICBABABA|l |110 >8_4_LC_humanizada_635 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKVPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 172)
>cl|FICBABABA|l|l 10 >8 4 LCJiumanizada 341 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 173)
>cl|GICBABABA|l |110 >8 4 LC humanizada 328
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGRGTKVE1K (SEQ ID NO: 174)
>cl|HICBABABA| 11110 >8 4 LC humanizada_324 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGNAPKSLIYRASTLASG VPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 175)
>cl|KICBABABA| 11110 >8_4_LC_humanizada_301 DIQMTQSPDSLAVSLGERATINCQASQSISTALAWYQQKPGQPPKLLIYRASTLASG VPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO: 176)
>cl|LICBABABA|l 1110 >8 4_LC_humanizada_295 DIQMTQSPSSLSASVGDRVT1TCQASQS1STALAWYQQKPGKAPKLL1YRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 177)
>cl|M ICBABABA|l|l 10 >8_4_LC_humanizada_292 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQS1STALAWYQQKPGKAPNLLIYRASTLASG VPSRFSGSVSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 178)
>cl|NICBABABA|l|l 10 >8_4_LC_humanizada_283 D1QLTQSPSSVSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 179)
>cl|PICBABABA] 11110 >8_4_LC_humanizada_282 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKLGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 180)
>cl|QICBABABA| 11110 >8_4_LC_humanizada_278 ELVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWCQQKPGKSPTLLIYRASTLASGV PSRFSGSGSGTGFTLTISGLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIR (SEQ ID NO: 181)
>cl|RICBABABA) 11110 >8_4_LC_humanizada_204 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNYFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 182)
>cl|SICBABABA|l|l 10 >8 4_LC_humanizada_201 DIRVTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVDIK (SEQ ID NO: 183)
>cl|TICBABABA|l |110 >8 4 LC humanizada 129 EIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQHKPGKAPRLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVEVK
(SEQ ID NO: 184)
>cl|VICBABABA|l|110>8_4_LC humanizada 108 DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLAS GVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO: 185)
>cl|W ICBABABA|l|110 >8_4_LC_humanizada_57
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKRLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 186)
>cl|XICBABABA| 11110 >8_4_LC_humanizada_800 AYELTQTPPSLSVTPGQPASISCQASQSISTALAWYLQKPGQPPQLLIYRASTLASGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 187)
>cl|YlCBABABA|l|110 >8_4_LC_humanizada_l 133 AYDMTTQPPSVSVSPGQTASITCQASQSISTALAWYQQKPGQSPVLVIYRASTLASG IPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQQGWSTVNVDNVFGTGTEVVVR
(SEQ ID NO: 188)
>cl|ZICBABABA] 111110 >8_4_LC_humanizada_621 AYELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQS1STALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 189)
>cl|COCBABABA| 11110 >8_4_LC_humanizada_881 AYDMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPNLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVQIK (SEQ ID NO: 190)
>cl|DOCBABABA| 11110 >8_4_LC_humanizada_55 AYDMTQTPASVEVSPGERATLSCQASQSISTALAWYQQKPGQAPRLLIYRASTLAS GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTEVVVR
(SEQ ID NO: 191)
>cl|FOCBABABA|l|110 >8_4_LC_humanizada_882 AYDMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGFGTDFTFTISSLQPEDSATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 192)
>cl|GOCBABABA] 11110 >8_4_LC_humanizada_660 AYVMTQSPATLSLSPGERATLSCQASQSISTALAWYQQRPGQAPRLL1YRASTLASG IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVE1K (SEQ ID NO: 193)
>cl|HOCBABABA| 11110 >8_4_LC_humanizada_1051 SYELTQTPPSVSVSPGQTARITCQASQSISTALAWYQQKPGQAPVLVIYRASTLASGI PERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCQQGWSTVNVDNVFGTGTKVTVL (SEQ ID NO: 194)
>cl|KOCBABABA| 11110 >8_4_LC_humanizada_l050 SYELTQTPPSVSVSPGQTARTTCQASQSISTALAWYQQKPGQAPVLVTYRASTLASGT PERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCQQGWSTVNVDNVFGTGTKVTVL (SEQ ID NO: 195)
>cl|LOCBABABA|l|l 10 >8 4 LC humanizada 860 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 196)
>cl|M OCBABABA|l|l 10 >8_4_LC_humanizada_809 DIQMTQSPSSVSASVRDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGPGTKVDIK (SEQ ID NO: 197)
>cl|NOCBABABA|l|l 10 >8_4_LC_humanizada_346
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNYDNVFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 198)
>cl|POCBABABA|l |110 >8_4_LC_humanizada_345 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPDDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 199)
>cl|QOCBABABA|l|l 10 >8_4_LC_humanizada_334 DIQMTQSPSFVSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNWGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 200)
>cl |ROCBABABA| 11110 >8_4_LC_humanizada_319 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG YPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNYDNYFGQGTKYEIK (SEQ ID NO: 201)
>cl|SOCBABABA) 1)110 >8 4 LC humanizada^ 08 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 202)
>cl|TOCBABABA) 11110 >8_4_LC_humanizada_281 DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVDIK (SEQ ID NO: 203)
>cl|VOCBABABA) 1)110 >8_4_LC_humanizada_273 ELVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGEAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQSEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 204)
>cl|WOCBABAB A| 1| 110 >8_4_LC_humanizada_716 ELVMTQSPSSLSASEGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGRAPKLLIFLRASTLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTISGLQSEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTTVDVK
(SEQ ID NO: 205)
>cl|XOCBABABA|l|l 10 >8_4_LC_humanizada_677 AYDMTQSPSFLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 206)
>cl|YOCBABABA) 1)110 >8_4_LC_humanizada_192 AYDMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFTTYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVEFK
(SEQ ID NO: 207)
>cl|ZOCBABABA) 11110 >8 4 LC humanizada 202 DIRMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKVPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGWSTVNVDNVFGPGTKVVVR
(SEQ ID NO: 208)
>cl |BUCB AB AB A| 11110 >8_4_LC_humanizada_802 AIRJV1TQSPSSFSASTGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 209)
>cl|CUCBABABA| 11110 >8 4 LC humanizada 347
DIQMTQSP S SLS AS VGDRVSITC Q ASQSISTAL AW Y QQKPGKAPKRLIYRASTL ASG VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 210)
>cl|DUCBABABA|l |110 >8_4_LC_humanizada_339 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGY PSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 211)
>cl|FUCBABABA|l |110 >8_4_LC_humanizada_l 68 DIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSTSTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTISGLQPEDFATYYCQQGWSTYNVDNVFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 212)
>cl|GUCBABABA] 11110 >8_4_LC_humanizada_54 AYGMTQSPDSLAVSLGERASINCQASQSISTALAWYQQKPGQPPKLLIYRASTLASG VPDRFSGGGSGTDFTLTTSSLQAEDVAVYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO: 213)
>cl|HUCBABABA) 11110 >8_4_LC_humanizada_21 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKVLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGPGTKVEVR (SEQ ID NO: 214)
>cl|KUCBABABA) 11110 >8_4_LC_humanizada_788 AYELTQTPLSSPVTLGQPASISCQASQSISTALAWLQQRPGQPPRLLIYRASTLASGV PDRFSGSGAGTDFTLK1SRVEAEDVGIYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 215)
>cl|LUCBABABA|l|l 10 >8 4 LC humanizada 675 AYDMTQSPSSLSASVGDRVT1TCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTITSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGPGTKLEIK (SEQ ID NO: 216)
>cl|MUCBABABA| 11110 >8 4 LC humanizada 762 AYELFQSPDSLAVSLGERAT1NCQASQSISTALAWYQQKPGQPPKLLIYRASTLASG VPDRF S GS GS GTDFTLTIS SLQ AED V A VY Y CQQGW S T VN VDN VF GGGTK VEIK
(SEQ ID NO: 217)
>cl|NUCBABABA) 11110 >8_4_LC_humanizada_818 AYDMTQTPSSVSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLAS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVE1K (SEQ ID NO: 218)
>cl |PUCBABABA| 11110 >8_4_LC_humanizada_173 AIQMTQSPFSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWFQQKPGKAPKSLIYRASTLASG VS SKF SGSGS GTDFTLTIS SLQPEDF AT Y Y CQQGW S T VNVDN VF GQGTRL V VR
(SEQ ID NO: 219)
>cl|QUCBABABA) 11110 >8_4_LC_humanizada_65 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGQGTKVEIK (SEQ TD NO: 220)
>cl|RUCBABABA! 11110 >8_4_LC_humanizada_224 AYDMTQTPASVSLSPGERATLSCQASQSISTALAWYQQKPGQAPRLLIYRASTLAS GIPDRFRGSGSATDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTEVVVR
(SEQ ID NO: 221)
>cl|SUCBABABA| 11110 >8 4 LC humanizada 230
AYDM TQTPASVSASVGDRVTITCQASQSISTALAW YQQKPGKAPKVLIYRASTLAS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISTLQPEDFATYYCQQGW STVNVDNVFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO: 222)
>cl|TU C B A B A B A |l|l 10 >8_4_LC_humanizada_880
AYDM TQSPSSLSASVGDRVNITCQASQSISTALAW YQQKPGKAPKLLIYRASTLAS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGW STVNVDNVFGPGTKVDIK
(SEQ ID NO: 223)
>cl|V U C B A B A B A |l|l 10 >8_4_LC_humanizada_672
AYDM TQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAW YQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGW STVNVDNVFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 224)
>cl|W U C B A B A B A |l|l 10 >8_4_LC_humanizada_299
DIQM TQSPSSVSASVGDRVTITCQASQSISTALAW YQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGW STVNVDNVFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 225)
>cl|XUCBABABA) 1)110 >8_4_LC_humanizada_267
AYDM TQSPSTLAASVGDRVTITCQASQSISTALAW YQQKPGKAPKLLIYRASTLAS GVPSRFSGSGSGTEFTLTIS SLQPDDF ATYY CQQGW ST VNVDNVF GQGTK VEVK
(SEQ ID NO: 226)
>cl|YUCBABABA) 1)110 >8_4_LC_humanizada_23 AYELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAW YQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGW STVNVDNVFGPGTKVDIK (SEQ ID NO: 227)
>cl|ZUCBABABA) 11110 >8 4 LC humanizada 657
AYDM TQTPASVEVSVGDRVSITCQASQSISTALAW YQQKPGKAPKLLIYRASTLAS GVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPVDFATYYCQQGW STVNVDNVFGPGTTVDAK
(SEQ ID NO: 228)
>cl|BADBABABA) 1)110 >8 4_LC_humanizada 879
AYDM TQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAW YQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGW STVNVDNVFGGGTKV'EIK (SEQ ID NO: 229)
Tabla 5. 8-4 secuencias humanizadas de VH — base de datos de línea germinal agrupada al 90% (2 secuencias)
>cl|CA BBA BABA |15|l 17 >8_4_HC_humanizada_356 >8_4_HC_humanizada_340
> 8 4 I IC_humanizada_335 > 8_4_HC_humanizada_303 > 8_4_HC_humanizada 287 VQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIW VRQAPGKGLEW VSDIDGRGDI YCATW AKGRFTISRDNSSLYLQM NSLRAEDTAVYYCARDGDGSGW GDFNFW GPG TLVTVSS (SEQ ID NO: 230)
>cl|LA BBA BA BA |85|l 17 >8_4_HC_humanizada_2049 >8 4 HC_humanizada_2033 >8_4_HC_humanizada_1360 >8_4_HC_humanizada_1344 >8_4_HC_humanizada_777 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT1SNLAIIW VRQAPGKGLEW VSDIDGRGD1Y CATW AKGRFTISRDNSTLYLQM NSLRAEDTAVYYCARDGDGSGW GDFNFW GPGT LVTVSS (SEQ ID NO: 231)
Tabla 6. 8-4 secuencias humanizadas de VL — base de datos de línea germinal agrupada al 90% (5 secuencias).
>cl|CACBABABA|76| 110 >8_4_LC_humanizada_356 >8_4_LC_humanizada_340 >8_4_LC_humanizada_335 >8_4_LC_humanizada_303 >8_4_LC_humanizada_287 AYDMTQSPSSLSASVGDRVT1TCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLL1YRASTLASG YPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVD1WFGGGTEVVVR (SEQ ID NO: 232)
>cl|LACBABABA|2| 110 >8_4_LC_humanizada_2049 >8_4_LC_humanizada_2033 AYDMTQSPDSLAVSLGERATINCQASQSISTALAWYQQKPGQPPKLLIYRASTLASG VPDRF S G S G S GTDF TLTIS SLQ AED V A VY Y CQQGW S TVNVDNVF G GGTE V V VR
(SEQ ID NO: 233)
>cl|NACBABABA|2| 110 >8_4_LC_humanizada_1360 >8_4_LC_humanizada_1344 AYDMTQTPLSLSVTPGQPASISCQASQS1STALAWYLQKPGQPPQLLIYRASTLASG VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTEVVVR
(SEQ TD NO: 234)
>cl|CECBABABA|5|l 10 >8_4_LC_humanizada_2207 >8_4_LC_humanizada_2206 >8_4_LC_humanizada_2197 >8_4_LC_humanizada_2208 >8_4_LC_humanizada_2192 AYDMTQSPAFLSVTPGEKVTITCQASQSISTALAWYQQKPDQAPKLLIKRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEAEDAATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTEVVVR
(SEQ ID NO: 235)
>cl|DICBABABA|15|l 10 >8_4_LC_humanizada_2263 >8_4_LC_humanizada_2262 >8_4_LC_humanizada_2258 >8_4_LC_humanizada_2257 >8_4_LC_humanizada_2256 AYDMTQSPASLAVSPGQRATITCQASQSISTALAWYQQKPGQPPKLLIYRASTLASG YP ARF S G S G S GTDF TL TINP VE ANDT ANY Y C QQGW S T VNVDNVF GGGTE V W R
(SEQ ID NO: 236)
Tabla 7. 8-4 secuencias humanizadas de VH — base de datos de línea germinal agrupada al 95% (7 secuencias)
>cl|CABBABABA|2|l 17 >8 4 HC humanizada 356 >8 4 HC humanizada 303 VQLVESRGVLVQPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEWVSDIDGRGDIY CATWAKGRFTISRDNSTLHLQMNSLRAEDTAVYYCKKDGDGSGWGDFNFWGPGT LVTVSS (SEQ ID NO: 237)
>cl|DABBABABA) 17| 117 >8 4 HC humanizada 340 >8 4 HC humanizada 335 >8_4_HC_humanizada_287 >8_4_HC_humanizada_282 >8_4_HC_humanizada_2207 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT1SNLAIIWVRQAPGKGLEWVSDIDGRGDIY CATWAKGRFTISRDNASLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGDGSGWGDFNFWGPGT LVTVSS (SEQ ID NO: 238)
>cl|LABBABABA|37|l 17 >8_4_HC_humanizada_2049 >8_4_HC_humanizada_2033 >8_4_HCJiumanizada_1360 >8_4_HC_humanizada_1344 >8_4_HC_humanizada_777 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEWVGDIDGRGDI Y C ATW AKGRFTISRSKNTLYLQMN SLKTEDT A V YY CTRDGDGSG W GDFNFW GPG TLVTVSS (SEQ ID NO: 239)
>cl|DEBBABABA|22|l 17 >8_4_HC_humanizada_2206 >8_4_HCJiumanizada_988
>8 4 HC humanizada 987 >8 4 HC humanizada 935 >8 4 HC humanizada 934 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEWVSDIDGRGDIY CATWAKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGDGSGWGDFNFWGPGT LVTVSS (SEQ ID NO: 240)
>cl |FEBBABABA) 16| 117 >8_4_HC_humanizada_2197 >8_4_HC humanizada_978 >8_4_HCJiumanizada_925 >8_4_HCJiumanizada óóO >8_4_HC_humanizada_395 VQLLESGGGLYQPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEWVSDIDGRGDIY CATWAKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGDGSGWGDFNFWGPGT LVTVSS (SEQ ID NO: 241)
>cl|HIBBABABA|3|F17 >8_4_HCJiumanizada_2257 >8_4_HCJiumanizada_349
>8 4 HC humanizada 296 VQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTISNLAIIWFRQAPGKGLEWVGDIDGRGDIY CATWAKGRFTISRSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRDGDGSGWGDFNFWGPGTL VTVSS (SEQ ID NO: 242)
>cl|LIBBABABA|3| 117 >8_4_HC_humanizada_2254 >8_4_HC humanizada_346
>8 4 HC_humanizada_293 VQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTISNLAIIWVRQAPGKGLEWVSDIDGRGDI YCATWAKGRFTISRDNSSLYLQMNSLRTEDTALYYCAKDGDGSGWGDFNFWGPG TLVTVSS (SEQ ID NO: 243)
Tabla 8.8-4 secuencias humanizadas de VL — base de datos de línea germinal agrupada al ?5 % (12 secuencias)
>cl|CACBABABA| 11110 >8_4_LC humanizada_356 AYDMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLAS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNYDNYFGGGTEVVVR
(SEQ ID NO: 244)
>cl|LACBABABA|2|110 >8_4_LC humanizada_2049 >8_4_LC humanizada_2033 AYDMTQSPDSLAVSLGERATINCQASQSISTALAWYQQKPGQPPKLLIYRASTLASG VPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTEVVVR
(SEQ ID NO: 245)
>cl|NACBABABA|2|l 10 >8 4 LC humamzada_1360 >8_4_LC humanizada_1344 AYDMTQTPLSLSVTPGQPASISCQASQSISTALAWYLQKPGQPPQLLIYRASTLASG VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTEVVVR
(SEQ ID NO: 246)
>cl|QACBABABA|l|110 >8_4_LC_humanizada_777 AYDMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGWSTVN\T)NVFGGGTEVVVR (SEQ ID NO: 247)
>cl|VACBABABA|l|l 10 >8_4_LC_humanizada_565 AYDMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKRLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTEVVVR
(SEQ ID NO: 248)
>cl|XACBABABA|2|l 10 >8_4_LC humanizada_247 >8_4_LC humanizada_231 AYDMTQSPSFLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTEVVVR
(SEQ ID NO: 249)
>cl|ZACBABABA|2| 110 >8_4_LC humanizada_141 >8_4_LC humanizada_125 AYDMTQSPSSFSASTGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTEVVVR
(SEQ ID NO: 250)
>cl|CECBABABA|l|l 10 >8 4 LC humanizada 2207 AYDMTQSPAFLSVTPGEKVTITCQASQSISTALAWYQQKPDQAPKLLIKRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTFT1SSLEAEDAATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTEVVVR (SEQ ID NO: 251)
>cl|GECBABABA| 11110 >8_4_LC_humanizada_988 AYDMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTEVVVR
(SEQ ID NO: 252)
>cl|PECBABABA) 11110 >8 4_LC_humanizada 670 AYDMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKVPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGWSTVNVDNWGGGTEVVVR
(SEQ ID NO: 253)
>cl|ZECBABABA|l |110 >8_4_LCJiumanizada_34 AYDMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISTALAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTEVVVR
(SEQ ID NO: 254)
>cl|DICBABABA|15|l 10 >8_4_LC humanizada_2263 >8_4_LC_humanizada_2262 >8_4_LC_humanizada_2258 >8_4_LC_humanizada_2257 >8_4_LC_humanizada_2256 AYDMTQSPASLAVSPGQRATITCQASQSISTALAWYQQKPGQPPKLLIYRASTLASG VPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQQGWSTVNVDNVFGGGTEVVVR
(SEQ ID NO: 255)
Tabla 9.16-6 secuencias humanizadas de VH -- IMGT-LigM DB (Abysis) agrupadas al 90% (41 secuencias).
>cl|CABBABABA| 11115 >16_6_HC humanizada_586 VQLQESGGGVVQPGTSLRLSCVVSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWLA1IVSSGSA YYATWAKGRFTVSRSKSTLFLKMNSLRADDTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 256)
>cl|DABBABABA|2|l 15 >16_6_HC humanizada_411 >16_6_HC_humanizada_213 LQLQESGPRLVKPSETLSLTCTVSGSDISSYHMGWIRQPPGKGLEWIGIIVSSGSAYY ATWAKSRLTISTSKNQFSLRLSSVTAADSAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTLVTVS
S (SEQ ID NO: 257)
>cl|FABBABABA|l |115 >16_6_HC_humanizada_372 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEAVAIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDS STLFLQLNSLRVEDSGIYYC AKNQY SG Y GF SFW GQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 258)
>cl|GABBABABA|7|l 15 >16_6_HC_humanizada_1996 >16_6_HC_humanizada_230 >16_6_HC_humanizada_2056 >16_6_HC_humanizada_672 >16_6_HCJiumanizada_657 QSLEESGGRLVTPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVSIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 259)
>cl|HABBABABA|2|l 15 >16_6_HCJiumanizada l 907 >16_6_HC_humanizada_716 QSLLESGGGWVQPGRSLRLSCSASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVGIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDNN SLYLQMN SLRPEDTALYY C AKNQ YSGYGF SFW GQGVL VTVSS (SEQ ID NO: 260)
>cl|LABBABABA|3|l 15 >16_6_HCJiumanizada l 945 >16_6 HC_humanizada_l451 >16 6 HC humanizada 65
QSLEESGGGLVKPGESLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVGnVSSGSA YYATWAKGRFTISRDDSTVYLEMNSLKTEDTAVYYC ATNQ YSGY GF SFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 261)
>cl|NABBABABA|l|115 >16_6_HCJiumanizadal 004 QSLLESGPRLVKPSETLSLTCSVSGSDISSYHMGWVRQPPGQGLEWIGIIVSSGSAYY ATWARSRVSISTSQNQVSLKLTSVTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGILVTV SS (SEQ ID NO: 262)
>cl|PABBABABA|13|l 15 >16_6_HC_humanizada_1971 >16_6_HC_humanizada_305 >16 6 HCJiumanizada_1877 > 16_6_HC Jiumanizada_860 >16 6 HCJiumanizada_283 VQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWYAnVSSGSA YYATWAKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AKNQYSGYGF SFW GQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 263)
>cl|QABBABABA|22|l 15 >16_6_HC_humanizada_802 >16_6_HC_humanizada_587 >16_6_HC Jiumanizada l 012 >16_6_HC Jiumanizada_988 >16_6_HCJiumanizada_129 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVSIIVSSGSA YY ATW AKGRFTISRDNSTLYLQMN SLRAED T AVYYC ARNQ YSGY GF SFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 264)
>cl|RABBABABA|l|l 15 >16_6_HC_humanizada_609 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTTSGSDISSYHMGWVRQVPGKGLEWVSnVSSGSA YYATWAKGRFTISRDNSTSYLQMTSLTPEDTAVYYCAKNQYSGYGFSFWGQGTVV SVSS (SEQ ID NO: 265)
>cl|YABBABABA|4|l 15 >16_6_HC_humanizada_910 >16_6_HC humanizada_218 >16 6 HC Jiumanizada 912 > 16_6_HC Jiumanizada 917 VQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGSDISSYHMGWIRQPPGKGLEWIGIIVSSGSAYY ATWAKSRVTISTSKNQLSLKLTSVTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTTVTV SS (SEQ ID NO: 266)
>cl|GEBBABABA| 11115 >16 6 HC humanizada 136 VQLQQSGPGLVKTSETLPLTCTVSGSDISSYHMGWIRQPPGKGLEYIGIIVSSGSAYY ATWAKNRVTISTSKNQFSLKLSSVTAADTALYYCARNQYSGYGFSFWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 267)
>cl|KEBBABABA|l11 15 >16_6_HC_humanizada_109 VQLVESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGSDISSYHMGWIRQPPGKGLEYIGIIVSSGSAYY ATWAKSRLTMSVDTSNYQLKLSSVTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTTVT VSS (SEQ ID NO: 268)
>cl|LEBBABABA|l|l 15 >16_6_HC_humanizada_103 VQLQQSGPGLVKPSGTLSLTCDVSGSDISSYHMGWVRQPPGKGLEWIGIIVSSGSAY YATWAKSRVTISKSKNQFSLRLTSVTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 269)
>cl|NEBBABABA|6|115 >16 6 HC humanizada 902 >16 6 HC humanizada 1982 > 166 HC Jiumanizada 734 >16_6_HC Jiumanizada 920 >16_6_HC Jiumanizada 149 VQLVESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGSDISSYHMGWIRQPPGKGLEWIGIIVSSGSAYY ATWAKSRVTISTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 270)
>cl IPEBBABABA| 11115 > 16_6_HC_humanizada_851 VQLVQSGGGWQPGGSLRVSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWMAIIVSSGS AYYATWAKGRFTISRDNSTVSLQMSSLRAEDTAVYYCAKNQYSGYGFSFWGRGTL VTVSS (SEQ ID NO: 271)
>cl|SEBBABABA| 11115 >16 6 JIC_humanizada 926
VQLVESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGSDISSYHMGWIRQHSGKTLEWIGIIYSSGSAY YATWAESRVTISADTSKISLKLSSVTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTTVT VSS (SEQ ID NO: 272)
>cl|VEBBABABA|l|l 15 >16_6_HC_humanizada_904 VQLVESGPGLVKPSQTLSLTCNVSGSDISSYHMGWIRQSPGKGLEWTGITVSSGSAY YATWARSRYTISADTSKVSLELSPMTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTTVT VSS (SEQ ID NO: 273)
>cl|WEBBABABA|l |115 >16_6_HC_humanizada_903 VQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGSDISSYHMGWIRQPPGTGLEWIGIIVSSGSAYY ATWAKSRVTISGDTSKFSLMLRSVTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTMVT VSS (SEQ ID NO: 274)
>cl|YEBBABABA] 1|115 >16_6_HC_humanizada_946 VQLVESGGGLIKPGGSLRLSCEVPGSDISSYHMGWVRQGPGRGLEWVGIIVSSGSA YYATWARGRFTISRSKSTVYLEMNALKTEDTGIYYCVTNQYSGYGFSFWGQGTMV TVSS (SEQ ID NO: 275)
>cl(ZEBBABABA| 11115 > 16_6_HC_humanizada_882 QSLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQPPGKGLEWYGIIYSSGSA YYATWAKGRFTISRSKSTYYLQMNSLKTEDTAYYYCTANQYSGYGFSFWGQGML VTVSS (SEQ ID NO: 276)
>cl|CIBBABABA| 1|115 >16_6_HC_humanizada_2041 QSLVQSGTEVRKPGASVKYSCKASGSDISSYHMGWYRQAPGQGLEWMGIIVSSGS A YYATW AQGR VTM SDTSTTVYMELSSLTSEDT AI YY C ARNQ Y SGY GF SFW GPGTL VTVSS (SEQ ID NO: 277)
>cl|KIBB AB AB A| 11115 >16 6 HC humanizada 1944 QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGSDISSYHMGWVRQPPGKGLEWIGIIVSSGSAY YATWAKNRVTISTSKNQFSLRLNSVTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 278)
>cl|LIBBABABA|4|l 15 >16_6_HC_humanizada_1895 >16_6_HC_humanizada_1992 > 16_6_HC_humanizada_ 1995 > 16_6_HC_humanizada_ 1949 QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLVWVSI1VSSGSAY YATWAKGRFTISRDNATLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNQYSGYGFSFWGPGTLV TVSS (SEQ ID NO: 279)
>cl|SIBBABABA|2|l 15 >16_6_HC_humanizada_993 >16_6_HC_humanizada_994 VQLVESGGGLIQPGRPLRLSCSGSGSD1SSYHMGWVRQAPGKGLEWVGIIVSSGSA YYATW AKGRFTISRDDSVVHLQMNSLRSEDTAVYYCTRNQYSGYGFSFWGQGTM VTVSS (SEQ ID NO: 280)
>cl|TIBBABABA|2|l 15 >16_6_HC_humanizada_956 >16_6_HCJmmanizada_965 VQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGSDISSYHMGWIRQHPGKGLEWIGIIVSSGSAY YATWAESRLTISADTSNIQLRLSSVTAADTAVYFCARNQYSGYGFSFWGQGTTVTV SS (SEQ ID NO: 281)
>cl|WIBBABABA| 11'115 >16_6_HC_humanizada_278 VQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCEASGSDISSYHMGWIRQAPGKGLEWVG1IVSSGSA YYATW AKGRFTISRDDSTLYLQVNSLKTEDSAVYYCTTNQYSGYGFSFWGQGTLV TVSS (SEQ ID NO: 282)
>cl|GOBBABABA|l|l 15 >16_6_HC humanizada 1894 QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGSD1SSYHJV1GWVRQAPGKGLEWVSIIVSSGSAY YATWAKGRFTISRDNASLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNQYSGYGFSFFSDYWLVT VSS (SEQ ID NO: 283)
>cl|MOBBABABA|3|l 15 >16_6_HC humanizada_1917 >16_6_HC_humanizada_677 >16 6 HC humanizada 267
QSLEESGGGVVQPGRSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVAIIVSSGSA YYATWAKRRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 284)
>cl|POBBABABA|l |115 >16_6_HC humanizada_2038 QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVATTVSSGSAY Y ATWAKGRFTISRDNASL YLQMN SLR AEDT AVY Y C ARNQ YSG Y GF SFPT SG Y Y Y MDVS (SEQ ID NO: 285)
>cl|QOBBABABA|l|l 15 >16_6_HC_humanizada_23 QSLLESGGDLVQPGGSLRLSCEASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVSIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDKSTLFLQMHSLRVEDTAVYYCAKNQYSGYGFSFWGQGTT VTVSS (SEQ ID NO: 286)
>cl|VOBBABABA|l|l 15 >16_6_HC_humanizada_1013 VQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCEVSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVAIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRSNNTLYLQMNSLTAEDTALYFCARNQYSGYGFSFWGKGTTV TVSS (SEQ ID NO: 287)
>cl|YOBBABABA|l|l 15 >16_6_HC_humanizada_l 13 LQLQESGPGLVKPSQTLSLTCSVSGSDISSYHMGWIRQHPGKGLEWIGIIVSSGSAYY ATWAKSRITISTSKNQFSLKLTSVTAADTALYYCARNQYSGYGFSFWGRGTLVTVS
S (SEQ ID NO: 288)
>cl|HUBBABABA|l|l 15 >16_6_HC humanizada_12 VQLVQSGGGVVQPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVAIIVSSGS AYYATW AQGRVTISRDNSTVHLQITS LKSEDT A VYYC AKNQYSGY GFSF WGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 289)
>cl|LUBBABABA|l|l 15 >16 6 HC humanizada 273 VQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQASGKGLEWIG1IVSSGSA YYATWAKGRFTVSRSQNSVFLQMNSLETEDTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 290)
>cl|NUBBABABA) 11115 >16_6_HC_humanizada_879 QSLEESGGGLVQPGGSLRLSCTASGSD1SSYHJV1GWVRQAPGKGLEWVSIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDSSTLYLQMNNLRVEDTALYYCAHNQYSGYGFSFWGRGTQ VTVSS (SEQ ID NO: 291)
>cl|TUBBABABA| 11115 >16_6_HC humanizada_1934 QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVSIIVSSGSAY YATWAKGRFTISRDNASLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNQYSGYGFSFGIFDYWVT VSS (SEQ ID NO: 292)
>cl |VUBBABABA) 11115 >16 6 HC humanizada_200 VQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGSDISSYHMGW1RQPAGKGLEWIGIIVSSGSAYY ATWARSRVTMSMSKNHFSLKLRSVTAADTAVYFCARNQYSGYGFSFWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 293)
>cl|WUBBABABA| 11115 >16_6_HC_humanizada_1977 QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVA1IVSSGSAY YATWAKGRFTISRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNQYSGYGFSFTCPYFDYW VSS (SEQ ID NO: 294)
>cl|XUBBABABA|l|l 15 >16_6_HC humanizada_2027 QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVAIIVSSGSAY Y ATW AEGRFTISRDN STLYLQMY SLRTEDT AVY Y C ARNQ Y SGY GFSFY Y YGMGV WVSS (SEQ ID NO: 295)
>cl|YUBBABABA|l|l 15 >16 6 HC humanizada 1958
VHLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVAnVSSGSA Y Y AT W AEGRFTISRDN SKL YLQMN SLRAED S AT Y Y C ARNQ Y S G Y GF SFF GPP Y YY YYMS (SEQ1D NO: 296)
>cl|BACBABABA| 11115 >16_6_HC_humanizadaJ905 QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVSIIVSSGSAY YATWAKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTALYYCARNQYSGYGFSFVRGGYFYH MDS (SEQ ID NO: 297)
Tabla 10.16-6 secuencias humanizadas de VL — IMGT-LigM DB (Abysis) agrupadas al 90% (21 secuencias)
>cl |CACBABABA| 11110 > 16_6_LC humanizada_586 IVLTQTPSSLSASVGDRIT1TCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLAS GVPSRFSGSRSGTDFTFTISSLRPEDIATYYCLGGYDDDGETAFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 298)
>cl|DACBABABA|27|l 10 > 16_6_LCJiumanizada_41 I >16_6_LCJiumanizada_1004 >16_6_LC_humanizada_587 >16_6_LC Jmmanizada_305 >16_6_LCJiumanizada_988 IVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 299)
>cl|FACBABABA|15|l 10 >16_6_LCJiumanizada_372 >16_6_LCJiumanizada_1877 >16_6_LC_humanizada_1012 >16_6_LCJiumanizada_860 >16_6_LCJiumanizada_283 IQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKVEIK
(SEQ ID NO: 300)
>cl|GACBABABA|l|l 10 >16_6_LC_humanizada_1996 VVLTQTPSPVSTAVGGTVTLSCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGQAPRLL1YRASNL ASGPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCLGGYDDDGETAKGPGTEVVVK
(SEQ ID NO: 301)
>cl|HACBABABA|2|l 10 >16_6_LChumanizada_1907 >16_6_LCJiumanizada_716 LVMTQSPSSLSASEGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGRAPKLLIHRASNLA SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISGLQSEDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTTVDVK
(SEQ ID NO: 302)
>cl|LACBABABA|2|l 10 >16_6_LC_humanizada_1945 >16_6_LC_humanizada_1451 VELTQPPSPVSAAPGQKVTISCQSSHSVYYGDWLAWYQQLPGTAPKLLIYRASNLA SGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCLGGYDDDGETAFGGGTRLTVL
(SEQ ID NO: 303)
>cl|PACBABABA|10|l 10 >16_6_LC_humanizada_1971 >16_6_LCJiumanizada_2041 > 16_6_I ,C_humanizada_2038 >16_6_LC_humanizada_2008 >16_6_LCJiumanizada_1992 VVLTQTPSP VST AVGGTVTITCQ S SHS VYY GDWLAWY QQKPGK APKLLIYRASNL ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTEVVVK
(SEQ ID NO: 304)
>cl|QACBABABA|5|l 10 >16_6_LCJiumanizada_802 >16_6_LC_humanizada_609 >16_6_LCJiumanizada 851 >16_6 LC humanizada 908 > 16 6 LC humanizada 108 VVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNL ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO: 305)
>cl|CECBABABA|7|110 >16_6_LCJiumanizada_253 >16_6_LCJiumanizada !03 >16 6 LC humanizada 882 >16 6 LC humanizada 1982 >16 6 LC humanizada 734 IVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDSATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKVE1K (SEQ ID NO: 306)
>cl|KECBABABA|2|l 10 >16_6_LC_humanizada_109 >16_6_LC_humanizada_334 IQLTQSPSFVSASVGDRITITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLAS GVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 307)
>cl|RECBABABA|2|l 10 >16_6_LCJiumanizada_17 >16_6_LC_humanizada_21 IQLTQSPSSLSAAVGDRVTIACQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLSISSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTKVQMK
(SEQ ID NO: 308)
>cl|DICBABABA| 11110 >16_6_LC_humanizada_202 IRMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKVPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGGYDDDGETAFGPGTKVVVK
(SEQ ID NO: 309)
>cl|FICBABABA|14|l 10 >16_6_LC_humanizada_192 >16_6_LC_humanizada_956
> 16 6 LCJiumanizada 230 > 16 6 LC humanizada 880 > 16 6 LC humanizada 2056 VVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKVEIK
(SEQ ID NO: 310)
>cl|NICBABABA|2|l 10 >16_6_LCJiumanizada_1938 >16_6_LC_humanizada_762 VELTQ SPD SLA V SLGERATINCQ S SHS V Y Y GD WLA W Y QQKPGQPPKLL1YRASNL A SGVPDRFSGSGSGTDFTLT1SSLQAEDVAVYYCLGGYDDDGETAFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 311)
>cl|WICBABABA| 11110 >16 6 LC humanizada 278 LVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWCQQKPGKSPTLL1YRASNLA SGVPSRFSGSGSGTGFTLTISGLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTKVEIR
(SEQ ID NO: 312)
>cl|YICBABABA| 11110 >16_6_LC_humanizada_169 IVLTQSPSFLSAFVGDR1TITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLL1YRASNLAS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISGLQPEDFASYYCLGGYDDDGETAFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 313)
>cl|GOCBABABA) 11110 > 16_6_LC_humanizada_l 894 VVLTQTPSPVSTAVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYRQKPGKVPKLLIYRASNL ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYGLGGYDDDGETAFGGGTEVVVK
(SEQ ID NO: 314)
>cl|LOCBABABA) 11110 >16_6_LC_humanizada_657 VVLTQTPSPVSTSVGDRVSITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPVDFATYYCLGGYDDDGETAFGPGTTVDAK
(SEQ ID NO: 315)
>cl|YOCBABABA) 11110 > 16_6_LC_humanizada_l 13 IVLTQSPSSVSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQLKPGKAPKLL1NRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGPGTTVDIK
(SEQ ID NO: 316)
>cl|MUCBABABA|3| 110 >16_6_LC_humanizada_2032 >16_6_LC_humanizada_200 > 16_6_LC Jium anizadal 905 VVLTQTPSPVSTAVGGTGTINCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGQPPKLLIYRASNL ASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLGGYDDDGETAFGGGTKVVVK
(SEQ ID NO: 317)
>cl|RUCBABABA) 11110 >16_6_LC_humanizada 1995
VVLTQTPSPVSTAVGGTVTINCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGQPXKLLIYRASNL ASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLGGYDDDGETAFGQGTEVVVK
(SEQ ID NO: 318)
Tabla 11.16-6 secuencias humanizadas de VH -- IMGT-LigM DB (Abysis) agrupadas al 95% (81 secuencias).
>cl|CABBABABA| 11115 >16_6_HC_humanizada_586 VQLQESGGGVVQPGTSLRLSCVVSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWLAIIVSSGSA YYATWAKGRFTVSRSKSTLFLKMNSLRADDTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 319)
>cl|DABB ABAB A| 11115 >16 6_HC_humanizada_411 LQLQESGPRLVKPSETLSLTCTVSGSDISSYHMGWIRQSPGKGLEWIGIIVSSGSAYY ATWAKSRLTMSTSKNQFSLRLSSVTAADSAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 320)
>cl|FABB AB AB A| 11115 > 16 6 HC humanizada 372 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEAVAIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDSSTLFLQLNSLRVEDSGIYYCAKNQYSGYGFSFWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 321)
>cl|GABB AB AB A| 11115 >16_6_HC humanizada_1996 QSLEESGGRLVTPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVGIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRVEDTARYYCARNQYSGYGFSFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 322)
>cl|HABB AB AB A|2| 115 >16 6 HC hum anizada! 907 >16 6 HC humanizada 716 QSLLESGGGWVQPGRSLRLSCSASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVGIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDNNSLYLQMNSLRPEDTALYYCAKNQYSGYGFSFWGQGVL VTVSS (SEQ ID NO: 323)
>cl|LABBABABA|2| 115 >16 6 HC humanizada 1945 >16_6_HC_humanizada_1451 QSLEESGGGLVKPGESLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVGIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDDSTVYLEMNSLKTEDTAVYYCATNQYSGYGFSFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 324)
>cl|NABBABABA| 11115 >16_6_HC_humanizada_1004 QSLLESGPRLVKPSETLSLTCSVSGSDISSYHMGWVRQPPGQGLEWIGTTVSSGSAYY ATWARSRVSISTSQNQVSLKLTSVTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGILVTV SS (SEQ ID NO: 325)
>cl|PABBABABA| 11115 >16_6_HC humanizada l 971 VQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWLAIIVSSGSA YY ATW AKGRFTISRDN S SLYLQLS SLRNEDT A VYY C AKNQ YSGY GF SFW GPGTLV TVSS (SEQ TD NO: 326)
>cl|QABBABABA|2|115 >16 6 HC_humanizada_802 >16_6_HC_humanizada_988 VQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVSTIVSSGSA YY ATW AKGRFTISRDN A SLYLQIVÍN SLR AEDT A VY YC ARNQ Y S GY GF SFW GQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 327)
>cl |RABBABABA| 11115 > 16_6_HC_humanizada_609 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTTSGSDISSYHMGWVRQVPGKGLEWVSIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDNSTSYLQMTSLTPEDTAVYYCAKNQYSGYGFSFWGQGTVV SVSS (SEQ ID NO: 328)
>cl|SABBABABA|l|115 >16_6_HC_humanizada_587
VQLVESGGGLVKPGGSLRLSCVVSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWLSIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDNASLFLQMNSLRADDTALYFCARNQYSGYGFSFWGQGTLV TVSS (SEQ ID NO: 329)
>cl|TABBABABA|6|l 15 >16_6_HC_humanizada_305 >16_6_HCJiumanizada_283 >16 6 HC humanizadai_334 >16 6 HC humanizada 281 >16 6 HCJiumanizada 339 VQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVA1IVSSGSA YYATWAKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNQYSGYGFSFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 330)
>cl|VABBABABA|4|l 15 >16_6_HC_humanizada_1877 >16_6_HC_humanizada_860 >16_6_HC_humanizada_204 >16_6_HC_humanizada_818 VQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGSD1SSYHMGWVRQAPGKGLEWVA11VSSGSA YYATWAKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 331)
>cl|WABBABABA| 1| 115 >16_6_HC_humanizada_1012 VQLQEWGGGVVQPGRSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVAIIVSSGS AYYATWAKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 332)
>cl|YABBABABA|l|l 15 >16_6_HC_humanizada_910 VQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGSDISSYHMGWIRQPPGKGLEWIGIIVSSGSAYY ATWAQSRVLISTSKSQLSLKLTSVTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTTVTV SS (SEQ ID NO: 333)
>cl|CEBBABABA| 11115 >16_6_HC_humanizada_253 VQLVESGGGLVQPGRSLRLSCATSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVGIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDNASLYLQMSSLRAEDTALYYCAKNQYSGYGFSFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 334)
>cl|DEBBABABA) 11115 > 16_6_HC humanizada_218 VQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGSDISSYHMGWIRQPPGKGLEWIGIIVSSGSAYY ATWAKSRVTISTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTTVTV SS (SEQ ID NO: 335)
>cl|FEBBABABA| 11115 > 16_6_HC_humanizada_213 LQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGSDISSYHMGWIRQPPGKGLEWIGIIVSSGSAYY ATWAKSRVTISTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASNQYSGYGFSFWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 336)
>cl|GEBBABABA| 11115 >16_6_HC_humanizada_136 VQLQQSGPGLVKTSETLPLTCTVSGSDISSYHMGWIRQPPGKGLEYIGIIVSSGSAYY ATWAKNRVTISTSKNQFSLKLSSVTAADTALYYCARNQYSGYGFSFWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 337)
>cl|HEBBABABA|l|l 15 >16 6 HC humanizada 129 MQLVESGGGLVQPGRSLRLSCVTSGSDISSYHMGWVRQVPGKGLEWVGIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDNTSLYLQMNSLRPEDTAVYYCAKNQYSGYGFSFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 338)
>cl|KEBBABABA| 11115 >16_6_HC_humanizada_109 VQLVESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGSDISSYHMGWIRQPPGKGLEYIGITVSSGSAYY ATWAKSRLTMSVDTSNYQLKLSSVTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTTVT VSS (SEQ ID NO: 339)
>cl|LEBBABABA|l|ll5 >16_6J4CJium anizadaJ03 VQLQQSGPGLVKPSGTLSLTCDVSGSDISSYHMGWVRQPPGKGLEWIGIIVSSGSAY YATWAKSRVTISKSKNQFSLRLTSVTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 340)
>cl|MEBBABABA|l|l 15 >16 6 HC humanizada _954
VQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVAI1VSSGSA YYATWAKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNQYSGYGFSFWGQGTT VTVSS (SEQ ID NO: 341)
>cl|NEBBABABA| 11115 > 16_6_HC_humanizada_902 VQLVESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGSDISSYHJV1GWLRQPPGRGLEW1GIIVSSGSAY YATWAKSRVTLSTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTLV TVSS (SEQ ID NO: 342)
>cl|PEBBABABA| 11115 > 16_6_HC_humanizada_851 VQLVQSGGGVVQPGGSLRVSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWMAUVSSGS AYYATWAKGRFT1SRDNSTVSLQMSSLRAEDTAVYYCAKNQYSGYGFSFWGRGTL VTVSS (SEQ ID NO: 343)
>cl|REBBABABA|l|l 15 >16_6_HC humanizada_17
VQL VESGGGL V QPGGSLRLSC AASGSDIS S YHMGW VRQ APGRGLV W V SIIV S SGS A YYATWAKGRFTISRDNATLYLQMNNLRAEDTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 344)
>cl|SEBBABABA) 11115 >16_6_HC_humanizada_926 VQLVESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGSDISSYHMGWIRQHSGKTLEWIGIIVSSGSAY Y ATW AESRVTIS ADTSKISLKLS S VT AADT AVYY C ARNQY SGY GFSF W GQGTTVT VSS (SEQ ID NO: 345)
>cl |TEBB AB AB A| 11115 > 16_6_HC_humanizada_908
VQL VESGGGL VEPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWIRQAPGKGLEWLSIIVSSGSAY YATWAKGRFTISRDNASLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRNQYSGYGFSFWGQGTMV TVSS (SEQ ID NO: 346)
>cl|VEBBAJBABA|l|l 15 >16_6_HC_humanizada_904 VQLVESGPGLVKPSQTLSLTCNVSGSDISSYHMGWIRQSPGKGLEWIGIIVSSGSAY YATWARSRVTISADTSKVSLELSPMTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTTVT VSS (SEQ ID NO: 347)
>cl|WEBBABABA| 11115 >16_6_HC_humanizada_903 VQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGSDISSYHMGWIRQPPGTGLEWIGIIVSSGSAYY ATWAKSRVTISGDTSKFSLMLRSVTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTMVT VSS (SEQ ID NO: 348)
>cl |XEBB AB AB A| 1)115 >16_6_HC_humanizada_108
VQL VESGGGL VKPGGSLRLSCAASGSDISSYHTVIGWIRQAPGKGLEWVSIIVSSGS A YYATWAKGRFTISRDNASLFLQMNSLRAEDTAVYYCAKNQYSGYGFSFWGQGTLI TVSS (SEQ ID NO: 349)
>cl|YEBBABABA) 11115 >16_6_HC_humanizada_946 VQLVESGGGLIKPGGSLRLSCEVPGSDISSYHMGWVRQGPGRGLEWVGIIVSSGSA YYATWARGRFTISRSKSTVYLEMNALKTEDTGIYYCVTNQYSGYGFSFWGQGTMV TVSS (SEQ ID NO: 350)
>cl|ZEBBABABA|l|l 15 >16 6 HC humanizada 882 QSLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQPPGKGLEWVGIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRSKSTVYLQMNSLKTEDTAVYYCTANQYSGYGFSFWGQGML VTVSS (SEQ ID NO: 351)
>cl|BIBBABABA|l |115 >16_6_HCJiumanizada_186 VQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLESVAIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 352)
>cl|CIBBABABA|l |115 >16_6_HC_humanizada_2041
QSLVQ SGTEVRKPGAS VKV SCKASGSDIS S YHMGWVRQAPGQGLEWMGIIVSSGS AYYATWAQGRVTMSDTSTTVYMELSSLTSEDTA1YYCARNQYSGYGFSFWGPGTL VTVSS (SEQ ID NO: 353)
>cl|D!BBABABA| 11115 >16_6_HC_humanizada_202 VQLQESGEGLVQPGGSLRLSCAASGSDISSYFIMGWVRQAPGKGLEYVSIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDNSTLYLQMGSLRAEDMAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGT MVTVSS (SEQ ID NO: 354)
>cl|FIBBABABA|2|l 15 >16_6_HC_humanizada_192 >16_6_HCJiumanizada_880 QHLEESGGGVVQPGRSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVAIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTT VTVSS (SEQ ID NO: 355)
>cl|G!BBABABA|2|l 15 >16_6_HC_humanizada_1982 >16_6_HC_humanizada_734 QSLLESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGSD1SSYHMGW1RQPPGKGLEW1G11VSSGSAYY ATWAKSRVTMSTSKNHFSLRLSSVTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 356)
>cl|KlBBABABA| 11115 >16_6_HC_humanizada_1944 QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGSDISSYHMGWVRQPPGKGLEWIGI1VSSGSAY YATWAKNRVT1STSKNQFSLRLNSVTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 357)
>cl|L!BBABABA|l 1115 >16 6 HC_humanizada_1895 QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLVWVS11VSSGSAY YATWAKGRFTISRDNATLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNQYSGYGFSFWGKGTTV TVSS (SEQ ID NO: 358)
>cl|MlBBABABA| 11115 >16_6_HC_humanizada_65 QSLEESGGGLVQPGRSLRLSCAASGSD1SSYHMGWVRQAPGKGLEWVG11VSSGSA YYATWAKGRFTISRDNASLYLQMNSLRAEDTALYYCAKNQYSGYGFSFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 359)
>cl|NlBBABABA|2|l 15 > 16 6 HC_humanizada 1938 >16_6_HC_humanizada_762 VKLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVAnVSSGSA Y Y ATWAKGRFTISRDN STLYLQMN SLGAEDT AVY YC ARNQ YSGY GFSFW GQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 360)
>cl|Q!BBABABA|2|l 15 >16_6_HC_humanizada 2031 >16_6_HC_humanizada_621 VQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVSIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDNSTLYLQMNNLRAEDTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTL VTVLS (SEQ ID NO: 361)
>cl|SIBBABABA| 11115 >16 6 HC humanizada 993 VQLVESGGGLIQPGRPLRLSCSGSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVGIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDDSVVHLQMNSLKSEDTAVYYCTRNQYSGYGFSFWGQGTT VTVSS (SEQ ID NO: 362)
>cl|TIBBABABA|l|l 15 >16 6 HC humanizada 956 VQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGSDISSYH1VIGWFRQHPGKGLEWIGHVSSGSAY YATWAESRLTISEDTSNIQLRLTSVTAADTAVYFCARNQYSGYGFSFWGQGTTVTV SS (SEQ ID NO: 363)
>cl|VIBBABABA|l|l 15 >16 6 HC humanizada 920 VQLVESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGSDISSYHMGWIRQFPGKGLEWIGIIVSSGSAYY ATWAKSRFTISTSKNQFSLKVDSVTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTTVTV SS (SEQ ID NO: 364)
>cl|W IBBABABA|l|l 15 >16_6_HCjiumanizada_278
VQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCEASGSDISSYHMGW1RQAPGKGLEWVGIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDDSTLYLQVNSLKTEDSAVYYCTTNQYSGYGFSFWGQGTLV TVSS (SEQ ID NO: 365)
>cl|YlBBABABA|2|l 15 >16_6_HC_humanizada 169 > 16_6_HC hum anizadal 68 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVSIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDNSTLYLQMDSLRAEDTAIYYCAKNQYSGYGFSFWGQGTLV TVSS (SEQ ID NO: 366)
>cl|ZIBBABABA] 1|115 >16_6_HCJiumanizada_994 VQLVESGGGL1QPGRSLRLSCSGSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVGIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDDSVVYLQMNSLRSEDTAVYYCTRNQYSGYGFSFWGQGTM VTVSS (SEQ ID NO: 367)
>cl|BOBBABABA|2|l 15 >16_6_HC_humanizada_975 >16_6_HC_humanizada_978 VQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVG11VSSGSA YYATWAKGRFTISRDNASLYLEMNSLRAEDTALYFCARNQYSGYGFSFWGQGTM VTVSS (SEQ ID NO: 368)
>cl|DOBBABABA| 11115 > 16_6_HC_humanizada_230 QSLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVSIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNQYSGYGFSFWGQGTT VTVSS (SEQ ID NO: 369)
>cl|GOBBABABA| 11115 >16_6_HC_humanizada_l 894 QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVSIIVSSGSAY YATWAKGRFTISRDNASLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNQYSGYGFSFFSDYWLVT VSS (SEQ ID NO: 370)
>cl|HOBBABABA|2|l 15 >16_6_HC_humanizada_2056 >16_6_HC_humanizada_672 QSLVESGGGL1QPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVSIIVSSGSAY YATWAKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTLV TVSS (SEQ ID NO: 371)
>cl |LOBB ABABA| 1|115 >16_6_HC_humanizada_657 QSLEESGGRLVTPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVSIIVSSGSA Y Y ATW AKGRFTISRDN S SLYLQMNSLRTED S ALY Y C ALNQ Y SG YGF SF WGQGSLV TVSS (SEQ ID NO: 372)
>cl|MOBBABABA|2|l 15 >16 6 HC humanizada 1917 >16 6 HC humanizada 677 QSLEESGGGVVQPGRSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVAIIVSSGSA YYATWAKRRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 373)
>cl|POBBABABA|l|115 >16_6_HC humanizada_2038 QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVAIIVSSGSAY YATWAKGRFTISRDNASLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNQYSGYGFSFPTSGYYY MDVS (SEQ ID NO: 374)
>cl |QOBBABABA| 11H 5 >16 6 HCJiumanizada 23 QSLLESGGDLVQPGGSLRLSCEASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVSIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDKSTLFLQMHSLRVEDTAVYYCAKNQYSGYGFSFWGQGTT VTVSS (SEQ ID NO: 375)
>cl|ROBBABABA|l|l 15 >16 6_HCjiumanizada 21 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEFVSIIVSSGSA YYATWAKDRFTISRDNSTVYLQMDSLRTEDTAMYFCARNQYSGYGFSFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 376)
>cl|SOBBABABA|l|115 >16 6 HC humanizada 469
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVAIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDNTSLFLHMSSLRGEDTAIYYCARNQYSGYGFSFWGQGTLV TVSS (SEQ ID NO: 377)
>cl|TOBBABABA| 11115 >16_6_HC_humanizada_2008 QSLEESGGRLVTPGTSLRLSCAVSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVS1IVSSGSAY YATWAKGRFTISRDNSTVYLQMNSLRAEDTAVFYCARNQYSGYGFSFWGQGTLV TVSS (SEQ ID NO: 378)
>cl|VOBBABABA|l|l 15 >16_6_HC_humanizada_1013 VQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCEVSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVAIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRSNNTLYLQMNSLTAEDTALYFCARNQYSGYGFSFWGKGTTV TVSS (SEQ ID NO: 379)
>cl|XOBBABABA|l|l 15 >16_6_HC_humanizada_149 VQLVQSGPGLVKPSRTLSLTCTVSGSDISSYHMGW1RQPPGKGLEWIG1IVSSGSAY YATWAQNRLTISTSKNQFSLKLASVTAADTAVYFCARNQYSGYGFSFWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 380)
>cl |YOBBABABA) 11115 > 16_6_HC_humanizada_l 13 LQLQESGPGLVKPSQTLSLTC S V SG SDISS YHMGW1RQHPGKGLEWIGIIV S SGS AY Y ATWAKSRITISTSKNQFSLKLTSVTAADTALYYCARNQYSGYGFSFWGRGTLVTVS
S (SEQ ID NO: 381)
>cl|BUBBABABA) 1)115 >16_6_HC_humanizada_965 VQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGSDISSYHMGWIRQHPGKGLEWIGIIVSSGSAY YATWAKSRVTISADTSKISLKLSSVTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTTVT VSS (SEQ ID NO: 382)
>cl|CUBBABABA) 1)115 >16_6_HC humanizada_912 VQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGSDISSYHMGW1RQPPGKGLEWIGIIVSSGSAYY ATWAKSRVLISTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTTVTV SS (SEQ ID NO: 383)
>cl|HUBBABABA) 1)115 >16_6_HC_humanizada_12 VQLVQSGGGVVQPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVAIIVSSGS AYYATWAQGRVTISRDNSTVHLQITSLKSEDTAVYYCAKNQYSGYGFSFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 384)
>cl|KUBBABABA) 1)115 >16 6 HC_humanizada_924 VQLVESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGSDISSYHMGWFRQPPGKGLEWIGIIVSSGSAY YATWAKSRVTISTSKNQVSLKLSPVTGADTAVYFCARNQYSGYGFSFWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 385)
>cl|LUBBABABA| 11115 >16_6_HC humanizada_273 VQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQASGKGLEWIGIIVSSGSA YYATWAKGRFTVSRSQNSVFLQMNSLETEDTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 386)
>cl|MUBBABABA|l|l 15 >16 6 HC_humanizada_2032 QSLEESGGRLVTPGGSLRLSCAGSGSDISSYFÍMGWVRQAPGKGLEWVSUVSSGSA YYATWAEGRFTISRDNATLYLQMNSLRVEDTAVYYCATNQYSGYGFSFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 387)
>cl|NUBBABABA|l|115 >16 6 HC_humanizada_879 QSLEESGGGLVQPGGSLRLSCTASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVSTIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDSSTLYLQMNNLRVEDTALYYCAHNQYSGYGFSFWGRGTQ VTVSS (SEQ ID NO: 388)
>cl|PUBBABABA|l |115 >16_6_HC humanizada 267
QSLEQSGGGLVQPGESLRLSCAGSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVAIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRDNASLFLQMNSLRVEDTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 389)
>clIQUBBABABA| 11115 >16_6_HC_humanizada_1992 QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLVWVSIIVSSGSAY YATWAKGRFTISRDNATLYLQMNSLRVEDTAVYYCARNQYSGYGFSFWGPGTLV TVSS (SEQ ID NO: 390)
>cl [RUBBABABA| 11115 > 16_6_HC_humanizada_ 1995 QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVSIIVSSGSAY YATWAKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNQYSGYGFSFWGPGTLVT VSS (SEQ ID NO: 391)
>cl | SUBB AB AB A| 11115 >16_6_HC humanizada_917
VQLQESGPGL VKPSQTLSLTCT V SG SDISS YHMGWIRQPPGKGLEWIGIIV S SG S AY Y ATWARSRITISETSKNLSLKLTSVTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFWGQGTTVTVS
S (SEQ ID NO: 392)
>cl|TUBBABABA) 1)115 >16_6_HC_humanizada_1934 QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGSDISSYHJV1GWVRQAPGKGLEWVSIIVSSGSAY YATWAKGRFTISRDNASLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNQYSGYGFSFGIFDYWVT VSS (SEQ ID NO: 393)
>cl|VUBBABABA|l|l 15 >16_6_HC_humanizada_200
V QLQESGPGL VKP SETLSLT C S V SG SDIS S YHMGW IRQPAGKGLEW IGIIV S SGS A Y Y ATWARSRVTMSMSKNHFSLKLRSVTAADTAVYFCARNQYSGYGFSFWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 394)
>cl|WUBBABABA|l|l 15 >16_6_HC_humanizada_1977 QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGSDISS YHMGW VRQAPGKGLEWVAI1VSSGSAY YATWAKGRFTISRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNQYSGYGFSFTCPYFDYW VSS (SEQ ID NO: 395)
>cl|XUBB ABAB A) 1)115 >16_6_HC_humanizada_2027 QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVAIIVSSGSAY YATWAEGRFTISRDNSTLYLQMYSLRTEDTAVYYCARNQYSGYGFSFYYYGMGV WVSS (SEQ ID NO: 396)
>cl|YUBBABABA|l|l 15 >16_6_HC_humanizada_1958 VHLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVAnVSSGSA YYATWAEGRFTISRDNSKLYLQMNSLRAEDSATYYCARNQYSGYGFSFFGPPYYY YYMS (SEQ ID NO: 397)
>cl|ZUBBABABA|l|l 15 >16_6_HC humanizada 1949 QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEYVSIIVSSGSAY YATWAKGRFTISRDNSTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVKNQYSGYGFSFWGPGTLVT VSS (SEQ ID NO: 398)
>cl|BACBABABA|l|l 15 >16_6_HC_humanizada 1905 QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVSIIVSSGSAY YATWAKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTALYYCARNQYSGYGFSFVRGGYFYH MDS (SEQ ID NO: 399)
Tabla 12.16-6 secuencias humanizadas de VL -- IMGT-LigM DB (Abysis) agrupadas al 95 % (64 secuencias).
>cl|CACBABABA|11110 >16_6_LC_humanizada_586
IVLTQTPSSLSASVGDRITITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLAS GVPSRFSGSRSGTDFTFTISSLRPEDIATYYCLGGYDDDGETAFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 400)
>cl|DACBABABA| 11110 >16_6_LC_humanizada_411 IVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPNLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSATDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTRVEIK
(SEQ ID NO: 401)
>cl|FACBABABA| 11110 > 16_6_LC_humanizada_372 IQLTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKAGKAPTLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKVDIK
(SEQ ID NO: 402)
>cl|GACBABABA|l|l 10 >16_6_LC_humanizada_1996 VVLTQTPSPVSTAVGGTVTLSCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGQAPRLLIYRASNL ASG1PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCLGGYDDDGETAKGPGTEVVVK (SEQ ID NO: 403)
>cl|HACBABABA|2|l 10 >16_6_LCJiumanizada_1907 >16_6_LC_humanizada_716 LVMTQSPSSLSASEGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGRAPKLLIHRASNLA SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISGLQSEDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTTVDVK
(SEQ ID NO: 404)
>cl|LACBABABA|2|l 10 >16_6_LC humanizada 1945 >16_6_LCJiumanizada_1451 VELTQPPSPVSAAPGQKVTISCQSSHSVYYGDWLAWYQQLPGTAPKLLIYRASNLA SGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCLGGYDDDGETAFGGGTRLTVL
(SEQ ID NO: 405)
>cl|NACBABABA|2|l 10 >16_6_LC_humanizada_1004 >16_6_LC_humanizada_283 IQLTQSPSSVSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFALTISSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGQGTRLE1K (SEQ ID NO: 406)
>cl|PACBABABA|l|l 10 >16_6_LC_humanizada_1971 VVLTQTPSPVSTAVGGTVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKSGKAPKLLIYRASNL ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTEVVVK
(SEQ ID NO: 407)
>cl|QACBABABA| 11110 >16 6 LC humanizada<l>802 IRMTQSPSSFSASTGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO: 408)
>cl|RACBABABA|l|l 10 >16_6_LC humanizada 609 IRLTQSPSFLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISTLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO: 409)
>cl|SACBABABA|l |110 >16_6_LC_humanizada_587 VVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWFQQKPGKAPNLLIYRASNL ASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKVEIK
(SEQ TD NO: 410)
>cl|TACBABABA|l|l 10 >16_6_LC humanizada 305 TQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWFQQKPGKAPKSLIYRASNLAS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCLGGYDDDGETAFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 411)
>cl|VACBABABA|12|l 10 >16 6 LCJiumanizada 1877 >16 6 LCJiumanizada 860 >16 6 LC humanizada 213 >16 6 LC humanizada 902 >16 6 LC humanizada 334 IQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO: 412)
>cl|WACBABABA|2|l 10 >16_6_LC_humanizada_1012 >16_6_LC_humanizada_65 IQLTQ SPS TLS AS VGDR VT1TCQ S SHS V Y YGD WLAW YQQKPGKAPKLL1YRASNLA SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKLE1K (SEQ ID NO: 413)
>cl|XACBABABA|6|l 10 >16_6_LC_humanizada_988 > 16_6_LC_humanizada_910 >16_6_LC_humanizada_956 >16_6_LC_humanizada_2056 >16_6_LC_humanizada_672 IVLTQSPSSLSASVGDRVT1TCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLL1YRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLT1SSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 414)
>cl|CECBABABA|l|l 10 >16_6_LC humanizada 253 IVLTQSPSAMSASVGDRVT1TCQSSFISVYYGDWLAWFQQKPGKAPKLL1YRASNLA SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDSATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKVDIK
(SEQ ID NO: 415)
>cl |DECBABABA) 1)110 >16 6 LC humanizada 218 IVMTQSPSSLSASVGDRVT1TCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKVPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGGYDDDGETAFGPGTKVEIK
(SEQ ID NO: 416)
>cl|GECBABABA) 1)110 >16_6_LC_humanizada 136 VVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKVL1YRASNL ASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFASYYCLGGYDDDGETAFGPGTKVDIK
(SEQ ID NO: 417)
>cl|HECBABABA) 11110 >16_6_LC_humanizada_129 IVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQHKPGKAPRLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKVEVK
(SEQ ID NO: 418)
>cl |KECBABABA) 11110 >16_6_LC_humanizada_109 IQLTQSPSSVSASVGDTITITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLAS GVPSRFSGSRSGTDFTLT1SSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 419)
>cl|LECBABABA| 11110 >16_6_LC_humanizada_103 IVLTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGQAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTEFTLSINSLQPDDSATYFCLGGYDDDGETAFGQGTKVEIK
(SEQ ID NO: 420)
>cl|MECBABABA111110 >16_6_LC humanizada 954 IVLTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVP SRF S GSGSGTEFTLTIS SLQPDDF AT YY CLGGYDDDGET AF GQGTK AEIK
(SEQ ID NO: 421)
>cl|PECBABABA|3|110 >16_6_LC_humanizada_851 >16_6_LC humanizada_908
> 16 6 LCJiumanizada 912 VVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNL ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTKVE1K (SEQ ID NO: 422)
>cl|RECBABABA|l|l 10 >16_6_LCJiumanizada l 7 IQLTQSPSSLSAAVGDRVTIACQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLSISSLQPGDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTKVQMK
(SEQ ID NO: 423)
>cl|XECBABABA|2|l 10 >16_6_LCJiumanizada l 08 >16_6_LC_humanizada_946 IVLTQ SPS S VS AS VGDRVTIT CQ S SHS VYY GDWLAW Y QQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO: 424)
>cl |ZECBABABA| 11110 > 16_6_LC humanizada_882 VVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGFGTDFTFTISSLQPEDSATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 425)
>cl|BICBABABA] 11110 >16_6_LC_humanizada_l 86 IQLTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKVVVK
(SEQ ID NO: 426)
>cl|CICBABABA|l|l 10 >16_6_LC_humanizada_2041 VVLTQTPSPVSTAVGGTVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNL ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTEVVVK
(SEQ ID NO: 427)
>cl[DICBABABA] 11110 >16_6_LC_humanizada_202 1RMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKVPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGGYDDDGETAFGPGTKVVVK
(SEQ ID NO: 428)
>cl|FICBABABA| 11110 >16_6_LC_humanizada_192 VVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNL ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFTTYYCLGGYDDDGETAFGQGTKVEFK
(SEQ ID NO: 429)
>cl|GICBABABA|2|l 10 >16_6_LC_humanizada_1982 >16_6_LC_humanizada_734 VELTQSPSSVSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDSATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKVE1K (SEQ ID NO: 430)
>cl|KICBABABA|2|l 10 >16_6_LC_humanizada_1944 >16_6_LC_humanizada_1895 IELTQSPSTLSASVGDRV1ISCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLAS GVPSRFSGSGSGTEFSLTINSLQPDDFATYYCLGGYDDDGETAFGPGTKVDIK (SEQ ID NO: 431)
>cl|NICBABABA|2|l 10 >16_6_LC_humanizada_ 1938 >16_6_LC_humanizada 762 VELTQ SPD SLA V SLGER AT1NCQ S SHS VYY GDWLAW Y QQKPGQPPKLLIYRA SNL A SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLGGYDDDGETAFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO: 432)
>cl|QICBABABA|2|l 10 >16 6_LCJiumanizada 2031 >16 6 LCJiumanizada 621 VELTQSPSSLSASVGDRVT1TCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKVEIK
(SEQ ID NO: 433)
>cl|SICBABABA|4|l 10 >16_6_LCJiumanizada_993 >16_6_LCJiumanizada_880 >16_6_LC_humanizada_23 >16_6_LCJiumanizada_917 VVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGPGTKVDIK
(SEQ ID NO: 434)
>cl|VICBABABA| • 1110 > 16_6_LC_humanizada_920 IVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 435)
>cl|WICBABABA|l|l 10 >16_6_LC_humanizada_278
LVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWCQQKPGKSPTLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTGFTLTISGLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTKVEIR
(SEQ ID NO: 436)
>cl|YICBABABA) 11110 >16_6_LC humanizada_169 1VLTQSPSFLSAFVGDR1T1TCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLL1YRASNLAS GVPSRFSGSGSGTEFTLT1SGLQPEDFASYYCLGGYDDDGETAFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 437)
>cl|Z!CBABABA|l|l 10 >16_6_LC humanizada_994
IVLTQSPS SLS AS VGDRVTITC QS SHS V Y Y GDWL AW Y QQKPGK VPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKVEIK
(SEQ ID NO: 438)
>cl|BOCBABABA| 11110 >16_6_LC_humanizada_975 IVLTQSPSTQSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 439)
>cl|DOCBABABA| 11110 >16_6_LC_humanizada_230 VVLTQTPSPVSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKVLIYRASNL ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISTLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO: 440)
>cl|GOCBABABA|l|l 10 >16_6_LC_humanizada_1894 VVLTQTPSPVSTAVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYRQKPGKVPKLL1YRASNL ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYGLGGYDDDGETAFGGGTEVVVK
(SEQ ID NO: 441)
>cl|LOCBABABA|l|l 10 >16_6_LC humanizada_657 VVLTQTPSPVSTSVGDRVSITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPVDFATYYCLGGYDDDGETAFGPGTTVDAK
(SEQ ID NO: 442)
>cl|MOCBABABA|2| 110 >16_6_LC_humanizada_1917 >16_6_LCJiumanizada_677 VVLTQSPSFLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQ PEDFATYYCLGGYDDDGETAFGQGTRLE1K (SEQ ID NO: 443) >cl|POCBABABA|l|l 10 >16_6_LC_humanizada_2038 WLTQTPSPVSTAVGGRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNL ASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQDKPFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTEVVVK
(SEQ ID NO: 444)
>cl|ROCBABABA) 11110 > 16_6_LC_humanizada_21 IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKVLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGPGTKVEVK
(SEQ ID NO: 445)
>cl|SOCBABABA|l|l 10 >16_6_LC humanizada_469 IVLTQSPSLLSASIGDRVTIPCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLAS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTKVDIK (SEQ ID NO: 446)
>cl|TOCBABABA|l|110 >16 6 LCJiumanizada 2008 VVLTQTPSPVSTAVGGRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNL ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIGSLQPEDFAAYFCLGGYDDDGETAFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO: 447)
>cl|W OCBABABA|l|110 >16_6_LCJiumanizada_168
IVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLL1YRASNLA SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISGLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTKLE1K (SEQ ID NO: 448)
>cl[XOCBABABA) 1)110 >16_6_LC_humanizada_149 IVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKRLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISGLQPED1ATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKVE1K (SEQ ID NO: 449)
>cl|YOCBABABA|l|l 10 >16_6_LC_humanizada_l 13 IVLTQSPSSVSASVGDRVT1TCQSSHSVYYGDWLAWYQLKPGKAPKLL1NRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLT1SGLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGPGTTVDIK (SEQ ID NO: 450)
>cl|ZOCBABABA|4|l 10 >16_6_LC_humanizada_978 >16_6_LCJiumanizada_965 >16_6_LC_humanizada_924 >16_6_LC Jiumanizada_879
IVLTQ SP S SLS AS V GDR VT1T CQ S SHS V Y YGDW LAW Y QQKPGK APKLL1YRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 451)
>cl|GUCBABABA| 11110 >16 6 LC humanizada 818 VVLTQTPSSVSASVGDRVT1TCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLL1YRASNL ASGVPSRFSGSGSGTDFTLT1SSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKVE1K (SEQ ID NO: 452)
>cl|HUCBABABA|l|l 10 >16 6 LC humanizada_12 VVMTQSPSTVSASVGDRVTLTCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGQPPKLL1YRASNL ASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQADDFATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKVEIK
(SEQ ID NO: 453)
>cl|LUCBABABA|l|l 10 >16_6_LC_humanizada_273 LVMTQSPSSLSASVGDRVT1TCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGEAPKLL1YRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLT1SGLQSEDFATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 454)
>cl |MUCBABABA| 1)110 >16 6 LC humanizada 2032 VVLTQTPSPVSTAVGGTGPINCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGQPPKLL1YRASNLA SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLGGYDDDGETAFGGGTKLE1K (SEQ ID NO: 455)
>cl|PUCBABABA| 11110 >16_6_LCJiumanizada_267 VVLTQSPSTLAASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNL ASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCLGGYDDDGETAFGQGTKVEVK
(SEQ ID NO: 456)
>cl IQUCB AB AB A| 11110 >16_6_LC_humanizada_l 992 VVLTQTPSPVSTAVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNL A S GVP SRF SGSGSGTDFTLTIS SLQPEDF AT Y YCLGGYDDDGET AF GGGTE V W K
(SEQ ID NO: 457)
>cl|RUCBABABA) 1)110 >16 6 LC humanizada_l 995 VVLTQTPSPVSTAVGGTVTINCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGQPXKLLIYRASNL ASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLGGYDDDGETAFGQGTEVVVK
(SEQ ID NO: 458)
>cl|TUCBABABA|2| 110 >16_6_LC_humanizada_1934 >16_6_LC_humanizada_1977 VVLTQTPSPVSTAVGGTVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNL ASGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCLGGYDDDGETAFGGGTEVVVK
(SEQ ID NO: 459)
>cl|VUCBABABA|l 1110 > 16_6_LC humanizada_200
VVLTQTPSPVSTAVGERATINCQSSHSVYYGDWLAW YQQKPGQPPKLLIYRASNLA SGVPDRFSGTGSGTDFTLT1SSLQAEDVAVYYCLGGYDDDGETAFGGGTKVVVK (SEQ ID NO: 460)
>cl|XUCBABABA| 11110 >16_6_LC_humanizada_2027 VVLTQTPSPVSTAVGGTVT1TCQSSFLSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKRLIYRASNL ASGVPSRFSGSGSGTEFTLT1SSLQPEDFATYYXLGGYDDDGETAFGGGTEVVVK (SEQ ID NO: 461)
>cl|YUCBABABA|2|l 10 >16_6_LC_humanizada_1958 >16_6_LC_humanizada_1949 VVLTQTPSPVSTAVGGTVT1PCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNL ASGVPSRFSGSGSGTEFTLT1SSLQPDDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTEVVVK (SEQ ID NO: 462)
>cl|BADBABABA| 11110 >16_6_LC_humanizada_1905 VVLTQTPSPVSTAVGGTVT1NCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGQPPKLLIYRASNL ASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLGGYDDDGETAFGGGTEVVVK
(SEQ ID NO: 463)
Tabla 13.16-6 secuencias humanizadas de VH — base de datos de línea germinal agrupada al 90% (3 secuencias).
>cl|CABBABABA|43|l 15 >16_6_HC_humanizada_775 >16_6_HC_humanizada_722 >16 6 HCJiumanizada 563 >16 6 HCJiumanizada 139 >16 6 HCJiumanizada 988 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGW VRQAPGKGLEWVSIIVSSGSA YYATW AKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNQYSGYGFSFW GPGTL VTVSS (SEQ ID NO: 464)
>cl|DABBABABA|39|115 >16 6 1IC humanizada 724 >16 6 HCJiumanizada 565 >16_6_HCJiumanizada M l >16_6_HCJiumanizada_990 >16_6_HC_humanizada_985 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGW VRQAPGKGLEWVGIIVSSGSA YYATW AKGRFTISRSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTRNQYSGYGFSFW GPGTLV TVSS (SEQ ID NO: 465)
>cl|REBBABABA|18|l 15 >16_6_HC_humanizada 365 >16_6_HC_humanizada_364
> 16 6 HC_humanizadaJ363 > 16 6 H C humanizada 360 > 16 ó lIC humanizada 359 VQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGSDISSYHMGW1RQPPGKGLEWIGIIVSSGSAYY ATW AKSRVTISTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNQYSGYGFSFW GPGTLVTV SS (SEQ ID NO: 466)
Tabla 14.16-6 secuencias humanizadas de VL: base de datos de línea germinal agrupada al 90 % (1 secuencia)
>cl|CACBABABA] 1001110 >16_6_LC_humanizada_775 >16_6_LC_humanizada_724 >16_6_LCJiumanizada_722 >16_6_LC_humanizada_565 >16_6_LC_humanizada^563 VVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDW LAW YQQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTEVW K
(SEQ ID NO: 467)
Tabla 15.16-6 secuencias humanizadas de VH — base de datos de línea germinal agrupada al 95% (10 secuencias)
>cl|CABBABABA) 131115 > 16 6 HC humanizada_775 > 16_6_HC_humanizada_722 >16 6 HCJiumanizada 563 >16 6 HC humanizada 139 >16 6 HCJiumanizada 987 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEYVS1IVSSGSA YYATWAKGRFTISRDNSTLYLQMGSLRAEDMAVYYCARNQYSGYGFSFWGPGTL VTVSS (SEQ ID NO: 468)
>cl|DABBABABA|12|l 15 >16_6_HC humanizada_724 >16 6 HC humanizada 565 >16_6_HC Jiumanizada 141 >16_6_HCJiumanizada 989 > 16 6 HCJiumanizada 936 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVGIIVSSGSA Y Y AT W AKGRFT1SRSKN SLYLQMN SLKTEDTA V Y YC ARNQ Y SG YGF SFWGPGTLV TVSS (SEQ ID NO: 469)
>cl|MABBABABA[9|l 15 >16_6_HC Jiumanizada_990 >16_6_HC humanizada_937 >16_6_HCJiumanizada 672 >16_6_HC Jiumanizada_407 > 16_6_HC_humanizada_248 VQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGSD1SSYHMGWVRQASGKGLEWVG11VSSGSA YYATWAKGRFTISRSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRNQYSGYGFSFWGPGTLV TVSS (SEQ ID NO: 470)
>cl|NABBABABA|27|l 15 >16 6 HC Jiumanizada 988 >16 6 H C humanizada 935 >16 6 HCJiumanizada 670 >16 6 HC Jiumanizada 405 >16 6 HCJiumanizada 246 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVSIIVSSGSA YYATWAJKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNQYSGYGFSFWGPGTL VTVSS (SEQ ID NO: 471)
>cl|PABBABABA|9|l 15 >16 6 HCJiumanizada 985 >16_6_HCJiumanizada_932 >16_6_HCJiumanizada_667 >16_6_HC Jiumanizada_402 >16_6_HCJiumanizada_243 VQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGSD1SSYHJV1GWFRQAPGKGLEWVG11VSSGSA YYATWAKGRFTISRSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRNQYSGYGFSFWGPGTLV TVSS (SEQ ID NO: 472)
>cl|QABBABABA|9|l 15 >16 6 HC humanizada 973 >16 6 HC humanizada 920 >16_6_HC humanizada 655 >16_6_HC Jiumanizada 390 >16 6 HC Jiumanizada 231 VQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVGIIVSSGSA YYATWAKGRFTISRSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTNQYSGYGFSFWGPGTLV TVSS (SEQ ID NO: 473)
>cl|REBBABABA|12|l 15 >16_6_HCJiumanizada_365 >16_6_HCJiumanizada_364 >16_6_HCJiumanizada_363 >16_6_HC Jiumanizada_360 > 16_6_HC_humanizada_312 VQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGSDISSYHMGWIRQPPGKGLEWIGIIVSSGSAYY ATW AK SR VTISTSKNQFSLKL S S VT A ADT A VYYC ARNQ YSGY GF SF W GPGTLVTV SS (SEQ ID NO: 474)
>cl|WEBBABABA|3|l 15 >16_6_HCJiumanizada_359 >16_6_HC_humanizada_306
> 16_6_HC Jiumanizada_41 LQLQESGSGLVKPSQTLSLTCAVSGSDISSYHMGWIRQPPGKGLEWIGIIVSSGSAYY ATWAKSRVTISRSKNQFSLKLSSVT AADT AVYYC ARNQYSGYGFSFWGPGTLVTV SS (SEQ ID NO: 475)
>cl|XEBBABABA|3|T15 >16_6_HC humanizada_357 >16_6_HCJiumanizada_304 >16_6_HC Jiumanizada_39 VQLQESGPGLVKPPGTLSLTCAVSGSDTSSYHMGWVRQPPGKGLEWIGTTVSSGSAY YATWAKSRVTISKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYCCARNQYSGYGFSFWGPGTLVT VSS (SEQ TD NO: 476)
>cl |C IBB AB AB A131115 >16_6_HCJiumanizada_343 > 16_6_HC_humanizada_290
>16 6 HC humanizada 25
VQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGSDISSYHMGWVRQAPGKGLEWVA1IVSSGSA YYATW AKGRFTISRDNSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNQYSGYGFSFW GPGTL VTVSS (SEQ ID NO: 477)
Tabla 16. 16-6 secuencias humanizadas de VL — base de datos de línea germinal agrupada al 95% (7 secuencias)
>cl|CACBABABA|3|l 10 >16_6_LC_humanizada_775 >16_6_LC_humanizada_724
>16 6 LCJiumanizada 722 VVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLL1YRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTFT1SSLQPED1ATYYCLGGYDDDGETAFGGGTEVVVK (SEQ ID NO: 478)
>cl|GACBABABA|2|l 10 >16 6 LCJiumanizada 565 >16 6_LCJiumanizada 563 VVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKRLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTEVVVK
(SEQ ID NO: 479)
>cl|KACBABABA|2|l 10 >16 6 LC humanizada 141 >16 6_LC humanizada 139
V VLTQSP S SFS ASTGDRVTITC QS SHS VY Y GDWL AW YQQKPGK APKLLIYR ASNL A SGVPSRFSGSGSGTDFTLT1SCLQSEDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTEVVVK (SEQ ID NO: 480)
>cl|M ACBABABA|62|l 10 >16 6 LCJiumanizada 990 >16 6_LC humanizada 988 >16_6_LCJiumanizada_985 >16_6_LCJiumanizada_973 >16_6_LCJiumanizada_937 VVLTQSPSSVSASVGDRVT1TCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLL1YRASNL ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTEVVVK
(SEQ ID NO: 481)
>cl|W ACBABABA|6|l 10 >16_6_LCJiumanizada_672 >16_6_LCJiumanizada_670 >16_6_LCJiumanizada_667 >16_6_LCJiumanizada_655 >16_6_LC_humanizada_671 VVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDW LAW YQQKPGKVPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGGYDDDGETAFGGGTEVVVK
(SEQ ID NO: 482)
>cl|GECBABABA|6|l 10 >16_6_LC_humanizada_248 >16_6_LCJiumanizada_246 >16_6_LCJiumanizada_243 > 16_6_LC Jiumanizada_231 > 16_6_LC_humanizada_247 W LTQSPSFLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDW LAW YQQKPGKAPKLUYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTEVVVK
(SEQ ID NO: 483)
>cl|YTCBABABA|19|l 10 >16_6_LC_humanizada_47 >16_6_LC_humanizada_46 >16_6_LCJiumanizada_45 >16_6_LCJiumanizada_42 >1 ó_ó_LCJiumanizada_41 VVLTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSHSVYYGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLA SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCLGGYDDDGETAFGGGTEW YK
(SEQ TD NO: 484)
Ejemplo 5: Uso de un anticuerpo antienlazador para la purificación de macromoléculas y células
Las moléculas de unión a antígeno divulgadas en el presente documento son moléculas de unión a antígeno, tales como anticuerpos, que se unen específicamente a la secuencia GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), moléculas que comprenden estas secuencias y células que presentan tales moléculas, polinucleótidos que codifican tales moléculas de unión a antígeno, así como formas humanizadas de moléculas de unión a antígeno. Una molécula de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo) divulgada en el presente documento puede usarse para purificar una molécula, tal como macromolécula, polímero, célula, material, etc., que muestra un epítopo que es reconocido por las moléculas de unión a antígeno divulgadas en el presente documento (por ejemplo, GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500)).
En una realización, una molécula de unión a antígeno divulgada en el presente documento (por ejemplo, Clones 8 y/o 16 y fragmentos de los mismos) puede unirse a perlas, unirse o asociarse con una resina, que puede disponerse en una columna u otra estructura. Una muestra que comprende una molécula que comprende todo un fragmento de GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500) puede entonces ponerse en contacto con las perlas, la resina, etc., a las que se unió la molécula de unión a antígeno o con las que se asoció una molécula de unión a antígeno. Esto permite la formación de una asociación o complejo de unión que comprende la molécula de unión al antígeno y la molécula que comprende la totalidad o un fragmento de GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500). Luego, las perlas o la resina se pueden lavar con una solución adecuada, tal como una solución tampón (por ejemplo, PBS, HEPES, MOPS, Tris, Tricine, etc.) que tenga un pH seleccionado para mantener la estabilidad de la molécula que comprende todo o un fragmento de GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500). El lavado puede eliminar componentes no deseados y no unidos de la muestra. Después del paso de lavado, la molécula que comprende todo un fragmento de GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500) se puede eludir de las moléculas de unión al antígeno usando un tampón de elución y las condiciones seleccionadas para romper cualquier asociación o complejo de unión formado. Los ejemplos de tampones de elución adecuados incluyen la incubación con epítopos peptídicos en exceso molar,glicina 0.1 M, pH 2.5-3.0 y ácido cítrico 0.1 M, pH 3.0, trietilamina o trietanolamina 50-100 mM, pH 11.5, cloruro de magnesio 3.5-4.0 M, pH 7,0 en Tris 10 mM, guanidina 2-6 M y urea 2-8 M, o una solución tampón de alrededor de pH 7-8, incluyendo, entre otros, Tris 10 mM, HEPES o PBS 1X, que contienen el péptido libre GSTSGSGKPGSGEGSTKG y subsecuencias del mismo, en particular GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500). Durante el paso de elución, se eludieron moléculas, células y fracciones de interés que comprendían todos un fragmento de GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), y la pureza se puede comprobar posteriormente analizando una muestra en un gel de poliacrilamida SDS.
En otra realización, una molécula de unión a antígeno puede disponerse en solución con cualquier entidad molecular que muestre el epítopo y purificarse a partir de una población mixta de moléculas, células, etc. y eludirse de las perlas, la resina o el anticuerpo libre mediante lavado con 300- cloruro de sodio 500 mM o bajando el pH y neutralizando con Tris 1 M, para proteínas, o tampón de fosfato, o con tampón que contenga péptido libre, tal como GSTSGSGKPGSGEGSTKG y subsecuencias del mismo, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500). Posteriormente, la diálisis se puede utilizar para devolver los materiales a las condiciones de tampón deseadas.
En una realización específica, las células que muestran una molécula que comprende todo o un fragmento de GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500) se pueden incubar con perlas magnéticas(por ejemplo,DYNABEADS) con el que se ha asociado una molécula de unión a antígeno divulgada en el presente documento. Preferiblemente, la incubación se realiza en condiciones que permitan la formación de asociaciones/complejos de unión, tal como en condiciones fisiológicas, en presencia de un medio seleccionado para este fin(porejemplo,RPMI-1640).
Células unidas por las perlas (que presentarán moléculas que comprenden GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SE<q ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500)) luego se separan de las células que no muestran un molécula que>comprende GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500). En una realización, las perlas se pueden lavar con medios, tales como RPMI-1640 complementado con FBS al 10 %, en presencia de un imán.
Células seleccionadas,es decir,las que presentan moléculas que componen GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500) luego se puede separar de las perlas: Primero, las células seleccionadas se cultivan en medios. Después de hacer crecer las células durante 48 horas, las perlas magnéticas pueden separarse de las células en solución y descartarse, dejando una población pura de células que presentan la molécula deseada.
En una realización alternativa, las perlas no son magnéticas, y en esta realización, los pasos anteriores también pueden seguirse y adaptarse para mantener la integridad celular, pero también para permitir la separación de células unidas a perlas de células no unidas a perlas.
En una realización alternativa, una molécula de unión a antígeno divulgada en el presente documento(por ejemplo,Clones 8 y/o 16 y fragmentos de los mismos) se pueden marcar con His(es decir,marcada con una secuencia corta de polihistidina), lo que facilita la separación de las células utilizando una resina que comprende un ion de metal de transición tal como Ni2+, Co2+, Cu2+ o Zn2+, que están inmovilizados sobre la resina. Las moléculas de unión a antígeno pueden luego incubarse con células que se sabe o se sospecha que presentan una molécula que comprende GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500) en condiciones adecuadas para la formación de complejos que comprenden las células y las moléculas de unión al antígeno. Después de la incubación, las células se ponen en contacto con la resina, que se puede disponer en una estructura sólida tal como una placa con pocillos, una columna u otra estructura. Los complejos de molécula de unión a antígeno-célula se pueden separar luego entre sí lavando con imidazol, que tendrá una concentración más alta que cualquier imidazol incluido en cualquier solución utilizada en la formación de los complejos de unión. A continuación, las células eludidas pueden centrifugarse, lavarse en RPMI u otro medio adecuado y luego resuspenderse en el medio.
Ejemplo 6: Clasificación de células T positivas para CAR
Las PBMC se aislaron de leucopacos de donantes sanos (Hemacare™) usando centrifugación de densidad Ficoll-Paque según las instrucciones del fabricante. Las PBMC se estimularon usando OKT3 (50 ng/ml, Miltenyi Biotec™) en medio R10 IL-2 (300 UI/ml, Proleukin®, Prometheus® Therapeutics and Diagnostics). Dos días después de la estimulación, se generaron células T CAR a través de la transducción viral de estas células T humanas primarias activadas. La transducción se realizó usando un retro (vector pMSVG) o un lentivirus (vector pGAR) dependiendo del origen de los CAR usados en el cribado. La confirmación de la expresión del constructo CAR y la eficiencia de la transducción viral se determinó utilizando Proteína L conjugada con ficoeritrina (PE) o isotiocianato de fluoresceína (FITC).
Las células T CAR cultivadas se retiraron del cultivo, se lavaron con PBS y se incubaron con el anticuerpo antienlazador conjugado con PE durante 30 minutos en un tampón de tinción que comprendía PBS pH 7.4, albúmina sérica bovina al 0.2 % (p/v) y azida sódica al 0.09 %. Las células se lavaron dos veces en tampón de tinción, se resuspendieron y clasificaron con un clasificador de células BD Aria. Las células activadas negativa y positivamente se analizaron después de la clasificación para determinar su composición (FIGURA 10).
Ejemplo 7: Estimulación/activación de las células T positivas para car utilizando una molécula de unión a antígeno
Las células T a menudo se estimulan a través de sus receptores de células T (TCR) utilizando un anticuerpo anti-CD3, tal como el clon OKT3, un anticuerpo anti-CD3 de ratón, junto con un anticuerpo anti-CD28 para proporcionar una segunda señal o señal coestimuladora. Las células T CAR, al interactuar con el antígeno afín, pueden proporcionar ambas señales a través de su dominio intracelular CD3zeta y coestimulador, tal como CD28.
En consecuencia, también se proporciona un método para activar las células T positivas para CAR que presentan una molécula que comprende un epítopo específico reconocido por una molécula de unión a antígeno específica(por ejemplo,una molécula de unión a antígeno, tal como un anticuerpo que reconoce una molécula que comprende GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500)), tales como las divulgadas en el presente documento: Clon 8 y/o 16, y fragmentos del mismo). Este método se puede adaptar para cualquier anticuerpo que reconozca una proteína de interés en una célula T que contenga un dominio de activación, tal como un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500). La activación se puede lograr utilizando un anticuerpo unido a placa, unido a perlas, unido a polímero u otra forma de anticuerpo que reconozca específicamente un componente extracelular de CAR o una molécula similar.
En este ejemplo, se mostró que las células T CAR+ pueden estimularse selectivamentein vitrocon un anticuerpo antienlazador, tal como los que se proporcionan en el presente documento. A modo de comparación, los anticuerpos OKT3, que se utilizan comúnmente para activar las células Tin vitro (véase, por ejemplo, Landegren et al., (1984) Eur. J Immunol.14(4):325-28) para estimular todas las células T. Para la estimulación se pueden usar bolsas, matraces, placas u otros recipientes para el cultivo de células T o, como se describe en el presente documento, también se pueden usar placas con pocillos para la estimulación.
En un caso, las células T CAR se clasificaron, como se describe en el EJEMPLO 4 (FIGURA 10), y se mezclaron para formar poblaciones de células en porcentajes fijos de células positivas para CAR; luego se permitió que estas células se recuperaran de la clasificación durante 24 horas a 37°C en medio OpTmizer. Las placas tratadas con cultivo de tejidos de 12 pocilios se incubaron con OKT3 o con anticuerpo antienlazador a 1.5 |jg/ml en HBSS durante 2 horas a 37 °C y se lavaron tres veces con HBSS. Se agregaron 0.5e6 células T de poblaciones definidas en 2 ml de medio OpTmizer con IL-2 a las placas recubiertas previamente con anticuerpo y las células se incubaron durante hasta 1 semana a 37 °C y se tomaron muestras en diversos puntos de tiempo.
Las muestras se sometieron a análisis por citometría de flujo para verificar la presencia de CAR y diversos marcadores de activación, incluyendo CD25, CD69 y 4-1BB. Con el tiempo, se observó que los anticuerpos OKT3 estimulaban todas las células T y el porcentaje de células positivas para CAR no cambió. Por el contrario, cuando se incubaron con el anticuerpo antienlazador, las células T que eran positivas para CAR recibieron estimulación y proliferaron, convirtiéndose en un porcentaje mayor de la población (FIGURA 11). Además, se observó que OKT3 estimuló todas las células T según lo observado por los niveles de CD69 y 4-1BB en la superficie de las células T Por el contrario, la estimulación con el anticuerpo antienlazador estimuló selectivamente las células positivas para CAR (FIGURAS 12A y 12B).
Así, las células que presentan una molécula que comprende GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), se pueden estimular selectivamentein vitro.
Ejemplo 8: Estimulación/activación de las células T positivas para car utilizando una molécula de unión a antígenoin vivo
En este ejemplo, las células T CAR+ se estimularon selectivamentein vivocon un anticuerpo antienlazador, proporcionado en el presente documento. Se implantaron células MM1S en ratones hembra NSG. Para eliminar las células MM1S, las células T CAR que comprenden el péptido GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) se inyectaron el día 6. El día 13, se realizaron experimentos de tomografía por emisión de positrones con fludesoxiglucosa (FDG-PET) para evaluar el metabolismo inicial. Se inyectó el anticuerpo antienlazador del Clon 8 en cada ratón y el experimento FDG-PET se repitió después de 24 horas. Como se muestra en la Figura 13, se observó mejor un aumento en la señal de FDG-PET posterior al tratamiento con anticuerpos en las extremidades traseras, lo que sugiere estimulación de las células T CAR+in vivosensible a la inyección de antienlazador.
Ejemplo 9: Agotamiento de células que expresan moléculas que contienen péptidos específicos utilizando un diacuerpo
En este ejemplo, las células T CAR+ pueden eliminarse selectivamentein vitrocon un diacuerpo antienlazador/antihumano CD3, que comprende una fracción de unión antienlazador, tal como en el Clon 8 y 16. Células T transducidas con un CAR que contiene el epítopo específico GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) (CAR1), un CAR que no contiene el epítopo (CAR2), o no transducido (simulado) se cultivaron en fondo en U de 96 pocillos en medios OpTmizer con suplementos de células T, penicilina, estreptomicina, glutamina e IL-2. Cada pocillo contenía 20,000 células T. El diacuerpo se añadió a cada muestra de células T transducidas con CAR y Simulado a concentraciones de 1.28 pM a 100 nM. Después de 16 horas, las células se tiñeron con Live/Dead Violet (Molecular Probes) y proteína recombinante L/estreptavidina-PE para evaluar el número de células muertas y el porcentaje de células T CAR+ en función de la concentración del diacuerpo. Como se muestra en la Figura 14A, la cantidad de colorante que se une a las células con membranas rotas aumenta en las muestras CAR1, mientras que la expresión de un control CAR o no CAR no conduce a un aumento significativo en la fluorescencia del colorante (véase CAR2 y Simulado, respectivamente). Esto puede observarse además por una disminución en el porcentaje de células T CAR1 en comparación con las células T CAR2 (Figura 14B). Las células CAR1 comienzan con aproximadamente 40 % de positividad, pero se agotan hasta aproximadamente 10 % del total de células T en la concentración más alta del diacuerpo, mientras que las células T CAR2 permanecen en 20 % constante de CAR+. Así, las células que presentan una molécula que comprende GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1) y sus subsecuencias, particularmente GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 3), SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), y/o KPGSG (SEQ ID NO: 500), se pueden agotar selectivamentein vitrocon un diacuerpo específico para las células T y el péptido específico.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de unión a antígeno aislada que es capaz de unirse a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 2), y SGKPGSGE (SEQ ID NO: 499), en donde la molécula de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende
(a) una VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7;
(b) una VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8;
(c) una VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9; y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende
(d) una VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13;
(e) una VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14; y
(f) una VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15.
2. La molécula de unión a antígeno de la reivindicación 1, en la que la molécula de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un scFv, un Fab, un Fab', un Fv, un F(ab')2, un dAb, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo IgE, un anticuerpo IgD, un anticuerpo IgM, un anticuerpo IgG1, un anticuerpo IgG2, un anticuerpo IgG3 y un anticuerpo IgG4.
3. La molécula de unión a antígeno de la reivindicación 1 o 2, que comprende
(i) una secuencia de aminoácidos de VH que es al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a una VH de una molécula de unión a antígeno que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; y/o
(ii) una secuencia de aminoácidos de VL que es al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a una VL de una molécula de unión a antígeno que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11.
4. La molécula de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende
(a) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEQ ID NO: 6 o una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que es 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; y
(b) una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEQ ID NO: 12 o una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12.
5. La molécula de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la molécula de unión a antígeno comprende además un marcador detectable.
6. La molécula de unión a antígeno de la reivindicación 5, en la que el marcador detectable se selecciona del grupo que consiste en un marcador fluorescente, un compuesto fotocrómico, un marcador fluorescente proteináceo, un marcador magnético, un radiomarcador y un hapteno, más preferiblemente, en el que el marcador fluorescente se selecciona del grupo que consiste en un colorante Atto, un colorante Alexafluor, puntos cuánticos, Hidroxicumarina, Aminocouramina, Metoxicurmarina, Azul Cascada, Azul Pacífico, Naranja Pacífico, Amarillo Lucifer, NBD, R-ficoeritrina (PE), conjugados PE-Cy5, conjugados PE-Cy7, Rojo 613, PerCP, TruRojo, FluorX, Fluoresceína, BODIPY-FL, Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, TRITC, X-Rodamina, Lisamina Rocamina B, Rojo Texas, Aloficocianina (APC), conjugados APC-Cy7, Indo-1, Fluo-3, Fluo-4, DCFH, DHR, SNARF, GFP de tipo silvestre, mutación GFP Y66H, mutación GFP Y66F, EBFP, EBFP2, azurita, GFPuv, T -Zafiro, Cerulean, mCFP, mTurquesa2, ECFP, CyPet, mutación GFP Y66W, mKeima-Rojo, TagCFP, AmCyan1, mTFP1, mutación GFP S65A, Midorishi Cyan, GFP de tipo silvestre, mutación GFP S65C, TurboGFP, TagGFP, mutación GFP S65L, Esmeralda, mutación GFP S65T, EGFP, verde Azami, ZsVerde1, TagYFP, EYFP, Topaz, Venus, mCitrine, YPet, TurboYFP, ZsAmarillo1, Kusabira Naranja, mNaranja, mKO, TurboRFP, tdTomate, TagRFP DsRojo monómero, DsRojo2 ("RFP" ), mFresa, TurboFP602, AsRojo, mRFP1, J-Rojo, B-ficoeritrina (BPE), mCereza, HcRojo1, Katusha, P3, clorofila de peridinina (PerCP), mKate (TagFP635), TurboFP635, mCiruela y mFrambruesa.
7. Una composición que comprende la molécula de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
8. Un polinucleótido que codifica la molécula de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
9. Un vector que comprende un polinucleótido que codifica la molécula de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
10. Un conjunto de vectores que comprenden moléculas que comprenden las secuencias de polinucleótidos que codifican la molécula de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
11. Una composición que comprende un polinucleótido de la reivindicación 8 o un vector de la reivindicación 9.
12. Una célula que comprende el polinucleótido de la reivindicación 8 o el vector de la reivindicación 9.
13. La célula de la reivindicación 12, en la que la célula comprende una célula seleccionada del grupo que consiste en una célula CHO, una célula Sp2/0, una célula de conejo y una célulaE. coli.
14. Un método para fabricar una molécula de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende incubar la célula de la reivindicación 13 en condiciones adecuadas in vitro.
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