ES2960419T3 - Composiciones y métodos de tratamiento de cáncer con inmunoterapia anti-CD19 - Google Patents

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Rimas J Orentas
Boro Dropulic
Dimiter S Dimitrov
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Abstract

Se describen receptores de antígenos quiméricos que contienen dominios de unión al antígeno CD19 humano. También se describen ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células huésped, fragmentos de unión a antígeno y composiciones farmacéuticas relacionadas con los receptores de antígenos quiméricos. También se describen métodos para tratar o prevenir el cáncer en un sujeto y métodos para producir células T receptoras de antígenos quiméricos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos de tratamiento de cáncer con inmunoterapia anti-CD19
LISTADO DE SECUENCIAS
La presente solicitud contiene un Listado de secuencias que ha sido presentado electrónicamente en formato ASCII y se incorpora por este documento como referencia en su totalidad. La copia en ASCII, creada el 13 de septiembre de 2018, se llama Sequence Listing.txt y tiene 93,7 kilobytes de tamaño.
DECLARACIÓN REFERENTE A LA INVESTIGACIÓN O DESARROLLO PATROCINADOS POR EL GOBIERNO FEDERAL
La presente invención se creó en el marco de un Acuerdo de Investigación y Desarrollo Cooperativo con los Institutos Nacionales de Salud, una Agencia del Departamento de Salud y Servicios Humanos. El Gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre esta invención.
CAMPO DE LA DIVULGACIÓN
La presente solicitud se refiere al campo del cáncer, particularmente a dominios de unión al antígeno CD19 y a receptores de antígeno quimérico (CAR) que contienen dichos dominios de unión al antígeno CD19 y métodos de uso de los mismos.
ANTECEDENTES
El cáncer es una de las amenazas más mortales para la salud humana. Solo en los EE. UU., el cáncer afecta a casi 1,3 millones de pacientes nuevos cada año, y es la segunda causa de muerte después de la enfermedad cardiovascular, representando aproximadamente 1 de cada 4 muertes. Los tumores negros son responsables de la mayoría de las muertes. Aunque ha habido avances significativos en el tratamiento médico de ciertos cánceres, la tasa de supervivencia global a los 5 años para todos los cánceres ha mejorado solo en aproximadamente 10 % en los últimos 20 años. Los cánceres, o tumores malignos, metastatizan y crecen rápidamente de una forma incontrolada, dificultando extremadamente el tratamiento.
CD19 es un receptor de la glucoproteína de la superficie celular transmembranaria de 85-95 kDa. CD19 es un miembro de la superfamilia de proteínas de inmunoglobulina (Ig), y contiene dos dominios de tipo Ig extracelulares, una transmembrana y un dominio de señalización intracelular (Tedder TF, Isaacs, CM, 1989, J Immunol 143:712-171). CD19 modifica la señalización del receptor de linfocitos B, reduciendo el umbral de desencadenamiento para el receptor de linfocitos B para el antígeno (Carter, RH, y Fearon, DT, 1992, Science, 256:105-107) y se coordina con CD81 y CD21 para regular este complejo de señalización de linfocitos B esencial (Bradbury, LE, Kansas GS, Levy S, Evans RL, Tedder TF, 1992, J Immunol, 149:2841-50). Durante la ontogenia de linfocitos B, CD19 es capaz de señalizar en las etapas de pro-B, pre-pre-linfocito B, pre-B, linfocito B temprano independientes de receptor de antígeno, y está asociado con la familia de proteínas tirosina cinasas Src, está fosforilado por tirosina, que induce tanto la movilización de calcio intracelular como la señalización de fosfolípido de inositol (Uckun FM, Burkhardt AL, Jarvis L, Jun X, Stealy B, Dibirdik I, Myers DE, Tuel-Ahlgren L, Bolen JB, 1983, J Biol Chem 268:21172-84). El punto de relevancia clave para el tratamiento de tumores malignos de linfocitos B es que CD19 se expresa en un modo estrechamente regulado en linfocitos B normales, que está restringido a los precursores de linfocitos B tempranos en la etapa de reordenación génica de IgH, linfocitos B maduros, pero no se expresa en células madre hematopoyéticas, o células plasmáticas maduras (Anderson, KC, Bates, MP, Slaughenhout BL, Pinkus GS, Schlossman SF, Nadler LM, 1984, Blood 63:1424-1433).
El presente tratamiento de referencia para las leucemias de linaje B puede consistir en el tratamiento de inducción de remisión por altas dosis de quimioterapia o radiación, seguido por consolidación, y puede incluir trasplante de células madre y ciclos adicionales de quimioterapia según se necesite (véase internet en cancer.gov). La alta toxicidad asociada a estos tratamientos, así como el riesgo de complicaciones, tales como recaída, tumor maligno secundario o GVHD, motivan la búsqueda de mejores alternativas terapéuticas. La expresión de CD19 en tumores malignos de linfocitos B tanto en adultos como pediátricos (pre-B-ALL) ha conducido a una explotación de esta diana para terapia basada tanto en anticuerpos como en linfocitos T-receptores antígeno quimérico (CAR) (Kochenderfer JN, Wilson WH, Janik JE, Dudley ME, Stetler-Stevenson M, Feldman SA, Maric I, Raffeld M, Nathan DA, Lanier BJ, Morgan RA, Rosenberg SA, 2010, Blood 116:4099-102; Lee DW, Kochenderfer JN, Stetler-Stevenson M, Cui YK, Delbrook C, Feldman SA, Orentas R, Sabatino M, Shah NN, Steinberg SM, Stroncek D, Tschernia N, Yuan C, Zhang H, Zhang L,<Rosenberg SA, Wayne>A<s>,<Mackall>C<l>,<2015, Lancet 385:517-28).>
Se han desarrollado varios enfoques novedosos para tratar la leucemia y linfoma de linfocitos B, que incluyen anticuerpos biespecíficos que unen un motivo de unión anti-CD19 a un motivo de unión a linfocitos T (es decir, blinatumomab, Blincyto® indicado para el tratamiento de leucemia linfoblástica aguda (ALL) de precursores de linfocitos B recidivante o resistente negativa para el cromosoma Filadelfia. Hasta la fecha, muchos de los restos de unión para CD19 empleados en construcciones de CAR utilizan un dominio derivado de anticuerpos murinos. Varios de estos productos están siendo actualmente considerados para su autorización, incluyendo los desarrollados por Novartis y Kite Pharmaceuticals. En abril de 2017, Novartis anunció que CTL019 (tisagenlecleucel) recibió la designación de gran avance de la FDA para el tratamiento de pacientes adultos con DLBCL (linfoma difuso de linfocitos B grandes) resistente o recurrente (r/r) que fracasó a dos o más terapias previas, añadiendo esta designación a aquella para leucemia linfoblástica aguda (ALL) de linfocitos B r/r. Estas indicaciones se basaron en el estudio de fase II JULIET (NCT02445248) y el estudio ELIANA (NCT02435849), respectivamente. El ensayo JULIET mostró una tasa de respuesta global (ORR) del 45 %, con un 37 % de respuesta completa (CR) y un 8 % de respuesta parcial (PR) a los tres meses. En el estudio ELIANA, el 82 % de los pacientes infundidos con el producto alcanzaron CR o CR con recuperación de recuento incompleto, y la tasa de supervivencia sin recaída a los 6 meses fue del 60 %. Al producto de T-CAR de Kite Pharmaceuticals (KTE-C19, axicabtagene ciloleucel) se le concedió la designación de gran avance para linfoma difuso de linfocitos B grandes (DLBLC), linfoma folicular transformado (TFL) y linfoma primario mediastinal de linfocitos B (PMBCL). En el ensayo de fase II Kite ZUMA-3 de KTE-C19 en A<l>L r/r, se notificó una CR del 73 % (a los 2 meses o más). Toda la información es de comunicados de prensa de la empresa. Independientemente de que se utilicen terapias con anticuerpo o con T-CAR, todavía existe un número significativo de pacientes que no están siendo ayudados por estas terapias, y queda hueco considerable para enfoques terapéuticos mejorados.
Los receptores de antígeno quimérico (CAR) son moléculas híbridas que comprenden tres unidades esenciales: (1) un motivo de unión al antígeno extracelular, (2) motivos de enlace/transmembranarios, y (3) motivos de señalización de linfocitos T intracelulares (Long AH, Haso WM, Orentas RJ. Lessons learned from a highly-active CD22-specific chimeric antigen receptor. Oncoimmunology. 2013; 2 (4):e23621). El motivo de unión al antígeno de un CAR se fabrica comúnmente a semejanza de un fragmento variable de cadena sencilla (scFv), el dominio de unión mínimo de una molécula de inmunoglobulina (Ig). También se han manipulado motivos de unión al antígeno alternativos, tales como ligandos de receptor (es decir, se ha manipulado IL-13 para unirse al receptor de IL-13 expresado en tumor), receptores inmunitarios intactos, péptidos derivados de bibliotecas y moléculas efectoras innatas del sistema inmunitario (tales como NKG2D). También están en desarrollo dianas de células alternativas para la expresión de CAR (tales como linfocitos NK o T gamma-delta) (Brown CE et al., Clin Cancer Res. 2012;18(8):2199-209; Lehner M et al. PLoS One.
2012; 7 (2):e31210). Sigue existiendo un trabajo significativo por hacer con respecto a definir la población de linfocitos T más activa para transducir con vectores de CAR, determinar el cultivo óptimo y las técnicas de expansión, y definir los detalles moleculares de la estructura de proteínas CAR en sí mismas.
Los motivos de enlace de un CAR pueden ser un dominio estructural relativamente estable, tal como el dominio constante de IgG, o se pueden diseñar para ser un conector flexible extendido. Los motivos estructurales, tales como los derivados de dominios constantes de IgG, se pueden usar para extender el dominio de unión de ScFv lejos de la superficie de la membrana plasmática de linfocitos T. Esto puede ser importante para algunas dianas de tumor donde el dominio de unión está particularmente próximo a la membrana superficial de la célula tumoral (tal como para el disialogangliósido GD2; Orentas et al., observaciones no publicadas). Hasta la fecha, los motivos de señalización usados en CAR siempre incluyen la cadena CD3-Z debido a que este motivo de núcleo es la señal clave para la activación de linfocitos T. Los primeros CAR de segunda generación informados caracterizaron dominios de señalización de CD28 y la secuencia transmembranaria de CD28. Este motivo se usó en los CAR de tercera generación que contenían los motivos de señalización de CD137 (4-1BB) también (Zhao Y et al., J Immunol. 2009; 183 (9): 5563-74). Con la llegada de la nueva tecnología, la activación de linfocitos T con perlas unidas a anticuerpo anti-CD3 y anti-CD28, y la presencia de la "señal 2" canónica de CD28 ya no era requerida para ser codificada por el CAR en sí. Usando la activación de perlas, se encontró que los vectores de tercera generación no eran superiores a los vectores de segunda generación en ensayos in vitro, y no proporcionaban un claro beneficio con respecto a los vectores de segunda generación en modelos de ratón de leucemia (Haso W, Lee DW, Shah NN, Stetler-Stevenson M, Yuan CM, Pastan IH, Dimitrov DS, Morgan RA, FitzGerald DJ, Barrett DM, Wayne<a>S, Mackall CL, Orentas RJ. Anti-CD22-chimeric antigen receptors targeting B cell precursor acute lymphoblastic leukemia, Blood. 2013; 121 (7):1165-74; Kochenderfer JN et al. Blood 2012; 119 (12):2709-20). Esto es confirmado por el éxito clínico de los CAR específicos de CD19 que están en un CD28/CD3-Z de segunda generación (Lee DW et al. American Society of Hematology Annual Meeting. New Orleans, LA; 7-10 de diciembre de 2013) y un formato de señalización de CD137/CD3-Z (Porter DL et al. N Engl J Med. 2011; 365 (8): 725-33). Además de CD137, otros miembros de la superfamilia de los receptores del factor de necrosis tumoral tales como OX40 también son capaces de proporcionar importantes señales de persistencia en linfocitos T transducidos por CAR (Yvon E et al. Clin Cancer Res.
2009;15(18):5852-60). Son igualmente importantes las condiciones de cultivo en las que se cultivaron las poblaciones de linfocitos T-CAR, por ejemplo, la inclusión de las citocinas IL-2, IL-7 y/o IL-15 (Kaiser AD et al. Cancer Gene Ther.
2015; 22(2):72-78.
Los retos actuales en la adaptación más generalizada y eficaz de la terapia con CAR para el cáncer se refieren a una escasez de dianas convincentes. La creación de ligantes para los antígenos de superficie celular es ahora fácilmente lograble, pero sigue siendo un reto formidable descubrir un antígeno de superficie celular que sea específico para el tumor mientras que se ahorran tejidos normales. Una posible forma de infundir la mayor especificidad de célula diana por linfocitos T que expresan CAR es usar enfoques combinatorios de CAR. En un sistema, las unidades señal de CD3-Z y CD28 se dividen entre dos construcciones de CAR diferentes expresadas en la misma célula; en otro, dos CAR se expresan en el mismo linfocito T, pero uno tiene una afinidad más baja y así requiere que el CAR alternativo sea acoplado primero para la actividad completa del segundo (Lanitis E et al. Cancer Immunol Res. 2013;1 (1 ):43-53; Kloss CC et al. Nat Biotechnol. 2013;31(1):71-5). Un segundo reto para la generación de un único CAR basado en ScFv como agente inmunoterapéutico es la heterogeneidad de células tumorales. Al menos un grupo ha desarrollado una estrategia de CAR para glioblastoma, por lo que la población de células efectoras dirige múltiples antígenos (HER2, IL-13Ra, EphA2) al mismo tiempo con la esperanza de evitar el resultado de las poblaciones negativas para antígenos diana. (Hegde M et al. Mol Ther. 2013;21 (11):2087-101).
La inmunoterapia basada en linfocitos T se ha convertido en una nueva frontera en la biología sintética; se idean múltiples promotores y productos génicos para conducir estas células altamente potentes al microentorno del tumor, donde los linfocitos T pueden tanto evadir las señales reguladoras negativas como mediar en la eficaz destrucción tumoral. La eliminación de linfocitos T no deseados a través de la dimerización inducida por el fármaco de construcciones de caspasa 9 inducibles con dimerizadores basados en sustancias químicas, tales como AP1903, demuestra una forma en la que se puede iniciar farmacológicamente un cambio poderoso que pueda controlar las poblaciones de linfocitos T (Di Stasi A et al. N Engl J Med. 2011 ;365(18):1673-83). La creación de poblaciones de linfocitos T efectores que son inmunes a los efectos reguladores negativos del factor de crecimiento transformante-p por la expresión de un receptor señuelo adicional demuestra el grado al que los linfocitos T efectores se pueden manipular para actividad antitumoral óptima (Foster AE et al. J Immunother. 2008;31(5):500-5). Así, mientras que parece que los CAR pueden desencadenar la activación de linfocitos T de un modo similar a un receptor endógeno de linfocitos T, un impedimento importante a la aplicación clínica de esta tecnología hasta la fecha ha sido la expansión limitadain vivode linfocitos T con CAR+, la rápida desaparición de las células después de la infusión y la decepcionante actividad clínica. Esto puede ser debido en parte al origen murino de algunas de las secuencias de CAR empleadas.
El uso de blinotumomab (anticuerpo biespecífico anti-CD19 y anti-CD3) ha mostrado resultados impresionantes para pacientes gravemente enfermos que han recibido esta terapia. Sin embargo, la tasa de remisión duradera es inferior al 40 %, y en el mejor de los casos solo el 50 % de los respondedores pueden ser rescatados para trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) (véanse Gore et al., 2014, NCTO1471782 y Von Stackelberg, et al., 2014, NCT01471782, resumido en: Benjamin, J<e>, Stein AS, 2016, Therapeutic Advances in Hematology 7:142-156). El requisito de pacientes que han recibido o anticuerpo biespecífico o terapia con T-CAR para someterse posteriormente a HSCT para mantener respuestas duraderas sigue siendo un área de debate activo. Aunque se informa de altas respuestas para ensayos con T-CAR CD19, algunas incluso superiores al 90 %, si los ensayos se reformulan como ensayos "por intención de tratar", el número puede ser próximo al 70 % (Davis KL, Mackall CL, 2016, Blood Advances 1:265-268). Los mejores resultados a los 12 meses después del tratamiento con CAR19 informado muestran una RFS del 55 % y OS del 79 % en pacientes que fueron capaces de recibir el producto de linfocitos T en la Universidad de Pensilvania (Maude SL, Teachey DT, Rheingold SR, Shaw PA, Aplenc R, Barrett DM, Barker CS, Callahan C, Frey NV, Farzana N, Lacey SF, Zheng A, Levine B, Melenhorst JJ, Motley L, Prter DL, June CH, Grupp SA, 2016, J Clin Oncol 34, n.° 15_supl. (Mayo 2016) 3011-3011). El documento de patente WO 2009/091826 A2 describe composiciones y métodos relacionados con un receptor de antígeno quimérico específico de CD19.
Por consiguiente, existe una necesidad urgente y que se sentía desde hace tiempo en la técnica de descubrir novedosas composiciones y métodos para el tratamiento de B-ALL y otros tumores malignos de linfocitos B que expresan CD19 usando un enfoque que puede presentar efecto antitumoral específico y eficaz sin los inconvenientes mencionados anteriormente.
La presente invención trata estas necesidades proporcionando composiciones de CAR y métodos terapéuticos que se pueden usar para tratar cánceres y otras enfermedades y/o afecciones. En particular, la presente invención como se desvela y describe en el presente documento proporciona CAR que se pueden usar para el tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones asociadas a la expresión desregulada de CD19 y cuyos CAR contienen dominios de unión al antígeno CD19 que presentan una alta expresión superficial en linfocitos T transducidos, presentan un alto grado de citólisis de células que expresan CD19 y cuyos linfocitos T transducidos demuestran expansión y persistenciain vivo.
SUMARIO
Se desvelan en el presente documento novedosos anticuerpos anti-CD19 o dominios de unión al antígeno de los mismos y receptores de antígeno quimérico (CAR) que contienen dichos dominios de unión al antígeno CD19, así como células hospedadoras (por ejemplo, linfocitos T) que expresan los receptores, y moléculas del ácido nucleico que codifican los receptores. Los CAR presentan una alta expresión superficial en linfocitos T transducidos, con un alto grado de citólisis, y con expansión y persistencia de linfocitos T transducidosin vivo.También se desvelan métodos de uso de los CAR desvelados, células hospedadoras y moléculas del ácido nucleico, por ejemplo, para tratar un cáncer en un sujeto.
La presente invención se define por las reivindicaciones independientes. Las reivindicaciones dependientes representan otras realizaciones de la invención.
Según la invención, en el presente documento se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, 2, 24, 26, 28, 30, 32 o 34.
En otro aspecto más, en el presente documento se desvelan receptores de antígeno quimérico (CAR) codificados por cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas en el presente documento.
En una realización, la molécula del ácido nucleico que codifica los CAR desvelados puede estar contenida en un vector, opcionalmente en donde el vector se selecciona del grupo que consiste en un vector de ADN, un vector de ARN, un vector plasmídico, un vector de cósmido, un vector de virus del herpes, un vector de virus del sarampión, un vector de lentivirus, un vector adenovírico o un vector de retrovirus, o una combinación de los mismos, opcionalmente que comprende además un promotor, opcionalmente además en donde el promotor es un promotor inducible, un promotor específico de tejido, un promotor constitutivo, un promotor suicida o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización, también se proporcionan células hospedadoras que incluyen la molécula del ácido nucleico que codifica el CAR. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es un linfocito T, opcionalmente además en donde el linfocito T es un linfocito T CD8+, opcionalmente además en donde la célula es una célula humana.
En otra realización, se proporcionan métodos de preparación de linfocitos T que contienen CAR (en lo sucesivo ''linfocitos T-CAR"). Los métodos incluyen transducir un linfocito T con un vector o molécula del ácido nucleico que codifica un CAR desvelado que se une específicamente a CD19, creando así el linfocito T-CAR.
En otra realización más, se proporciona un método de generación de una población de células manipuladas por ARN que comprende introducir un ARN transcritoin vitroo ARN sintético de una molécula del ácido nucleico que codifica un CAR desvelado en una célula de un sujeto, generándose así una célula que expresa CAR.
En otra realización, se proporciona un método de inhibición, supresión o prevención de la inmunosupresión de una respuesta inmunitaria antitumoral o antineoplásica en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una composición que comprende un anticuerpo anti-CD19 aislado o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16. En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo inhibe la interacción entre una primera célula con un linfocito T, en donde la primera célula se selecciona del grupo que consiste en una célula tumoral que expresa CD19, un macrófago asociado a tumor y cualquier combinación de los mismos.
En otro aspecto más, una composición farmacéutica que comprende una cantidad antitumoral eficaz de una población de linfocitos T humanos, en donde la población de linfocitos T humanos comprende una secuencia del ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR), en donde el CAR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 o 34, y en donde los linfocitos T son linfocitos T de una que tiene cáncer.
En otro aspecto más, una composición farmacéutica que comprende una cantidad antitumoral eficaz de una población de linfocitos T, en donde la población de linfocitos T humanos comprende una secuencia del ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR), en donde el CAR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 o 34, en donde los linfocitos T son linfocitos T de un sujeto que tiene cáncer, en donde la composición farmacéutica es para su uso en un método de tratamiento de cáncer en dicho sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad antitumoral eficaz de la población de linfocitos T humanos.
En algunos aspectos, los linfocitos T son linfocitos T de un humano que tiene un cáncer hematológico, opcionalmente en donde el cáncer hematológico es leucemia o linfoma, opcionalmente además en donde la leucemia es leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfocítica aguda (ALL) o leucemia mielógena crónica (CML), opcionalmente en donde el linfoma es linfoma de células del manto, linfoma no hodgkiniano (NHL) o linfoma de Hodgkin.
En algunos aspectos, los linfocitos T son linfocitos T de un humano que tiene un cáncer hematológico, en donde el cáncer hematológico es mieloma múltiple.
En algunos aspectos, los linfocitos T son linfocitos T de un humano que tiene un carcinoma del adulto seleccionado del grupo que consiste en: un cáncer bucal y de faringe, un cáncer del aparato digestivo, un cáncer del aparato respiratorio, cánceres de huesos y articulaciones, un cáncer de tejido blando, un cáncer de piel, un cáncer del sistema nervioso central, un cáncer de mama, un cáncer genital, un cáncer urinario, un cáncer del ojo y la órbita, un cáncer endocrino y un cáncer cerebral.
En algunos aspectos, los linfocitos T son linfocitos T de un humano que tiene un cáncer que expresa CD19.
Se entenderá que los CAR, células hospedadoras, ácidos nucleicos y métodos son útiles más allá de los aspectos específicos y realizaciones que se describen con detalle en el presente documento. Las anteriores características y ventajas de la divulgación serán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, que continúa con referencia a las figuras adjuntas.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS
LaFIGURA1 representa un esquema de la estructura general de dominios de CAR con las novedosas secuencias del dominio de unión al antígeno CD19 extracelular. Un receptor de antígeno quimérico está compuesto por un dominio ScFv de unión a CD19 extracelular, un espaciador de CD8 y dominio transmembranario, un dominio coestimulante de CD137 de señalización intracelular y dominio de señalización de CD3 z.
LasFIGURAS 2A-2Hrepresentan secuencias del ácido nucleico y de aminoácidos de varios receptores de antígeno quimérico (CAR) que contienen novedosas secuencias de dominio de unión al antígeno CD19 extracelular humano. El esquema general para los CAR incluye, de extremo N a extremo C, un péptido señalizador, un fragmento variable monocatenario de ligante anti-CD19 (ScFv), un conector extracelular, un dominio transmembranario, un dominio de señalización de 4-1BB (CD137) y un dominio de señalización de CD3 zeta.
LaFIGURA 2Arepresenta un vector lentivírico que expresa la secuencia del ácido nucleico del CAR LTG2050 (19217 ScFv-CD8 TM-41BB-CD3 zeta) (SEQ ID NO: 19) y la secuencia de aminoácidos codificada (SEQ ID NO: 20).
LaFIGURA 2Brepresenta un vector lentivírico que expresa la secuencia del ácido nucleico del CAR LTG2065 (M19217-1 ScFv-CD8 TM-41BB-CD3 zeta) (SEQ ID NO: 21) y la secuencia de aminoácidos codificada (SEQ ID NO: 22).
LaFIGURA 2Crepresenta un vector lentivírico que expresa la secuencia del ácido nucleico del CAR LTG2066 (M19217-2 ScFv CD8 TM-41BB-CD3 zeta) (SEQ ID NO: 23) y la secuencia de aminoácidos codificada (SEQ ID NO: 24).
LaFIGURA 2Drepresenta un vector lentivírico que expresa la secuencia del ácido nucleico del CAR LTG2067 (M19217-7 ScFv CD8 TM-41BB-CD3 zeta) (SEQ ID NO: 25) y la secuencia de aminoácidos codificada (SEQ ID NO: 26).
LaFIGURA 2Erepresenta un vector lentivírico que expresa la secuencia del ácido nucleico del CAR LTG2068<(M19217-23 ScFv CD8 TM-41 BB-CD3 zeta)>(<s>E<q ID NO: 27) y la secuencia de aminoácidos codificada (SEQ>ID NO: 28).
LaFIGURA 2Frepresenta un vector lentivírico que expresa la secuencia del ácido nucleico del CAR LTG2069<(M19217-29 ScFv CD8 TM-41 BB-CD3 zeta)>(<s>E<q ID NO: 29) y la secuencia de aminoácidos codificada (SEQ>ID NO: 30).
LaFIGURA 2Grepresenta un vector lentivírico que expresa la secuencia del ácido nucleico del CAR<LTG2070 (M19217-38 ScFv CD8 TM-41BB-CD3 zeta)>(S<e>Q<ID NO: 31) y la secuencia de aminoácidos>codificada (SEQ ID NO: 32).
LaFIGURA 2Hrepresenta un vector lentivírico que expresa la secuencia del ácido nucleico del CAR LTG2071 (M19217-40 ScFv CD8 TM-41BB-CD3 zeta) (SEQ ID NO: 33) y la secuencia de aminoácidos codificada (SEQ ID NO: 34).
LaFIGURA 3representa la expresión superficial de CAR anti-CD19 en linfocitos T humanos primarios. Se generaron linfocitos T-CAR redirigidos al antígeno tumoral CD19 por el uso de dominios ScFv (como se enumera en cada panel) por transducción lentivírica con construcciones de expresión de CAR. La detección de T-CAR se realizó por citometría de flujo. Los linfocitos T se lavaron dos veces en tampón PBS-EDTA frío y se tiñeron con el péptido CD19-Fc, seguido por reactivo anti-Fc-AF647. Se adquirieron al menos 20.000 células para cada análisis. Las células se seleccionaron basándose en dispersión hacia adelante y dispersión lateral, discriminación de singletes y negatividad de 7AAD de manera que solo se analizaron células viables. Los datos se adquirieron en el citómetro de flujo MACSQuant 10 en el canal de APC. UTD, células de control negativo no transducidas. El marcador en cada panel identifica la población que expresa CAR, y se enumeran como porcentaje de linfocitos T transducidos totales analizados.
LaFIGURA 4representa linfocitos T-CAR anti-CD19 que incorporan ligantes de ScFv (LTG2050, 2065-2071) que median en la citólisis de tumores CD19-positivosin vitro.Se incubaron linfocitos T-CAR que expresan construcciones anti-CD19 con estirpes celulares CD19-positivas (Raji y Reh), o líneas CD19-negativas (K562 y 293T) que se transdujeron establemente con luciferasa de luciérnaga, en la relación entre efectoras y diana de 5, 10, 20 y 40 (eje x) durante la noche. Entonces, se evaluó la actividad citotóxica de T-CAR por medición de la actividad de luciferasa como se describe en Materiales y métodos. Cada barra es la media de 3 duplicados técnicos y las barras de error representan la DE. UTD - control negativo de linfocitos T no transducidos, 1538-LTG1538 FMC63 control positivo de CAR anti-CD19 murino.
LaFIGURA 5representa la producción de linfocitos T-CAR específicos de CD19 de altos niveles de citocinas cuando se cocultivan con la línea de leucemia CD19-positiva (gris oscuro), o los linfocitos T se incubaron solos (gris). El ensayo se llevó a cabo durante la noche en la relación E:T de 10:1, a continuación se analizaron los sobrenadantes para concentraciones de citocina por ELISA. N=2 duplicados técnicos /- DE. Controles negativos: UT- linfocitos T no transducidos, 1538-FMC63 linfocitos T transducidos con control positivo CD19 murino. Los números de LTG de cada LV usado para transducir los linfocitos T humanos se enumeran en el eje x.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Definiciones
Como se usa en el presente documento, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" se refieren a tanto el singular así como el plural, a menos que el contexto indique claramente de otro modo. Por ejemplo, el término "un antígeno" incluye un único antígeno o múltiples antígenos y se puede considerar equivalente a la expresión "al menos un antígeno". Como se usa en el presente documento, el término "comprende" significa "incluye". Así, "que comprende un antígeno" significa "que incluye un antígeno" sin excluir otros elementos. La expresión "y/o" significa "y" u "o". Se debe entender además que todos y cada uno de los tamaños de base o tamaños de aminoácido, y todos los valores de peso molecular o masa molecular, dados para ácidos nucleicos o polipéptidos, son aproximados, y se proporcionan para fines descriptivos, a menos que se indique lo contrario. Aunque se pueden usar muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación se describen métodos y materiales adecuados particulares. En caso de conflicto, controlará la presente memoria descriptiva, que incluye explicaciones de términos. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos solo y no pretenden ser limitantes. Para facilitar la revisión de las diversas realizaciones, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos:
El término "aproximadamente", cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal, y similares, pretende englobar variaciones de .+-0,20 % o en algunos casos .+-0,10 %, o en algunos casos .+-0,5 %, o en algunos casos .+-0,1 %, o en algunos casos .+-0,01 % del valor especificado, y que dichas variaciones son apropiadas para realizar los métodos desvelados.
A menos que se indique lo contrario, los términos técnicos en el presente documento se usan según el uso convencional. Las definiciones de términos comunes en la biología molecular se pueden encontrar en Benjamin Lewin, Genes VII, publicado por Oxford University Press, 1999; Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994; y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995; y otras referencias similares.
La presente divulgación proporciona anticuerpos contra CD19 o fragmentos de los mismos, así como receptores de antígeno quimérico (CAR) que tienen dichos dominios de unión al antígeno CD19. La potenciación de la actividad funcional del CAR se refiere directamente a la potenciación de la actividad funcional del linfocito T que expresa CAR. Como resultado de una o más de estas modificaciones, los CAR presentan tanto un alto grado de citólisis inducida por citocina como expresión de la superficie celular en linfocitos T transducidos, junto con un elevado nivel de expansión de linfocitos Tin vivodel linfocito T que expresa CAR transducido.
La única capacidad para combinar restos funcionales derivados de diferentes dominios de proteína ha sido una característica innovadora clave de receptores de antígeno quimérico (CAR). La elección de cada uno de estos dominios de proteína es una característica de diseño clave, ya que es la forma en la que se combinan específicamente. Cada dominio de diseño es un componente esencial que se puede usar a través de diferentes plataformas de CAR para manipular la función de los linfocitos. Por ejemplo, la elección del dominio de unión extracelular puede hacer que un CAR por lo demás ineficaz sea eficaz.
Los componentes de la región estructural invariable de las secuencias de proteínas derivadas de inmunoglobulina usados para crear el dominio de unión al antígeno extracelular de un CAR pueden o ser completamente neutros, o se pueden autoasociar y conducir el linfocito T a un estado de agotamiento metabólico, que hace así que el linfocito T terapéutico que expresa ese CAR sea mucho menos eficaz. Esto ocurre independientemente de la función de unión al antígeno de este dominio de CAR. Además, la elección del (de los) dominio(s) de señalización intracelular también puede gobernar la actividad y la durabilidad de la población de linfocitos terapéuticos usados para inmunoterapia. Aunque la capacidad de unir antígeno-diana y la capacidad de transmitir una señal de activación al linfocito T mediante estos dominios extracelulares e intracelulares, respectivamente, son aspectos importantes del diseño de CAR, lo que también ha llegado a ser evidente es que la elección de la fuente de los fragmentos de unión al antígeno extracelular puede tener un efecto significativo sobre la eficacia del CAR y, por lo tanto, tener una función definitoria para la función y utilidad clínica del CAR.
Sorprendente e inesperadamente, se ha descubierto ahora que el uso de un dominio de unión al antígeno completamente humano en un CAR, en vez de usar fragmentos de unión al antígeno derivados de ratón que son propensos a inducir una respuesta inmunitaria anti-ratón y eliminación de T-CAR en un hospedador (véase el ensayo clínico patrocinado por UPenn que usa la secuencia de ScFv de SS1 derivada de ratón, NCT02159716), también puede determinar la actividad funcional de un linfocito T que expresa CAR.
En vista de este descubrimiento, se ha desarrollado una serie de ligantes de CD19 a partir de una biblioteca de expresión de scFv humano. Es menos probable que estos CAR CD19 completamente humanos induzcan una respuesta alérgica o de rechazo por el paciente ya que ya no son de origen murino (véase Maus MV, Haas AR, Beatty GL, Albeda SM, Levine BL, Liu X, Zhao Y, Kalos M, June CH, 2013, Cancer Immunology Research, 1:26-31). Por lo tanto, cuando estos CAR "completamente humanos" se expresan en linfocitos T y luego se infunden en pacientes, es probable que sean más terapéuticamente eficaces. Estos ligantes de CAR derivados de secuencias humanas se pueden usar para el tratamiento de cáncer humano, leucemias y linfomas que expresan el antígeno CD19, que incluyen, pero no se limitan a, B-ALL, DLBCL, FL.
Los CAR desvelados en el presente documento se expresan a un alto nivel en una célula. Una célula que expresa el CAR tiene una alta tasa de proliferaciónin vivo,produce grandes cantidades de citocinas y tiene una alta actividad citotóxica contra una célula que tiene, sobre su superficie, un antígeno CD19 al que se une un CAR. El uso de un dominio de unión al antígeno CD19 extracelular humano da como resultado la generación de un CAR que funciona mejorin vivo,mientras que se evita la inducción de inmunidad anti-CAR en la respuesta inmunitaria del hospedador y la destrucción de la población de linfocitos T-CAR. Los CAR que expresan todo el dominio de unión al antígeno ScFv de CD19 extracelular humano presentan actividades/propiedades superiores que incluyen i) prevención de la escasa persistencia y función de T-CAR como se observa con secuencias de unión derivadas de ratón; ii) ausencia de administración regional (es decir, intrapleural) del CAR para ser eficaz; y iii) capacidad para generar diseños de linfocitos T-CAR basados tanto en ligantes con alta y baja afinidad por CD19. Esta última propiedad permite a los investigadores ajustar mejor la eficacia frente a la toxicidad, y/o especificidad por tejido del producto de T-CAR, puesto que los ligantes de afinidad más baja pueden tener mayor especificidad por tumores frente a tejidos normales debido a la mayor expresión de CD19 en tumores que en tejido normal, que puede prevenir la toxicidad tumoral inespecífica y la destrucción de células por vecindad.
Lo que sigue es una descripción detallada de los CAR que incluyen una descripción de su dominio de unión al antígeno CD19 extracelular, el dominio transmembranario y el dominio intracelular, junto con la descripción adicional de los CAR, anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos, conjugados, nucleótidos, expresión, vectores y células hospedadoras, composiciones para su uso en métodos de tratamiento, composiciones y kits que emplean los CAR desvelados.
A. Receptores de antígeno quimérico (CAR)
Los CAR desvelados en el presente documento comprenden al menos un dominio de unión al antígeno CD19 capaz de unirse a CD19, al menos un dominio transmembranario y al menos un dominio intracelular.
Un receptor de antígeno quimérico (CAR) es una proteína o polipéptido híbrido construido artificialmente que contiene los dominios de unión al antígeno de un anticuerpo (por ejemplo, fragmento de la cadena variable sencilla (ScFv)) enlazados con dominios de señalización de linfocitos T por el dominio transmembranario. Las características de los CAR incluyen su capacidad para redirigir la especificidad por linfocito T y reactividad hacia una diana seleccionada en un modo no restringido por MHC, y explotar las propiedades de unión al antígeno de anticuerpos monoclonales. El reconocimiento del antígeno no restringido por MHC da a los linfocitos T que expresan CAR la capacidad de reconocer antígeno independiente del procesamiento de antígenos, derivando así un mayor mecanismo de escape tumoral. Además, cuando se expresa en linfocitos T, los CAR no dimerizan ventajosamente con cadenas alfa y beta de receptor de linfocitos T (TCR) endógeno.
Como se desvela en el presente documento, los dominios de señalización intracelulares de linfocitos T de los CAR pueden incluir, por ejemplo, un dominio de señalización de receptores de linfocitos T, un dominio de señalización coestimulante de linfocitos T, o ambos. El dominio de señalización de receptores de linfocitos T se refiere a una porción del CAR que comprende el dominio intracelular de un receptor de linfocitos T, tal como, por ejemplo, y no a modo de limitación, la porción intracelular de la proteína CD3 zeta. El dominio de señalización coestimulante se refiere a una porción del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimulante, que es una molécula de la superficie celular distinta de un receptor de antígeno o sus ligandos que se requiere para una respuesta eficiente de linfocitos al antígeno.
1. Dominio extracelular
En un aspecto, el CAR comprende un elemento específico de unión a diana denominado de otro modo un dominio o resto de unión al antígeno. La elección del dominio depende del tipo y número de ligandos que definen la superficie de una célula diana. Por ejemplo, el dominio de unión al antígeno se puede elegir para reconocer un ligando que actúa como marcador de la superficie celular sobre células diana asociadas a un estado de enfermedad particular. Así, los ejemplos de marcadores de la superficie celular que pueden actuar de ligandos para el dominio de unión al antígeno en el CAR incluyen los asociados a infecciones víricas, bacterianas y parasíticas, enfermedad autoinmunitaria y células cancerosas.
En un aspecto, el CAR se puede manipular para dirigir un antígeno de tumor de interés por medio de la manipulación de un dominio de unión al antígeno deseado que se une específicamente a un antígeno sobre una célula tumoral. Los antígenos de tumor son proteínas que se producen por células tumorales que provocan una respuesta inmunitaria, particularmente respuestas inmunitarias de linfocitos T. La selección del dominio de unión al antígeno dependerá del tipo particular de cáncer que se va a tratar. Los antígenos de tumor incluyen, por ejemplo, un antígeno asociado a glioma, antígeno carcinoembrionario (CEA), .beta.-gonadotropina coriónica humana, alfafetoproteína (AFP), AFP reactiva con lectina, tiroglobulina, RAGE-1, MN-CA IX, telomerasa transcriptasa inversa humana, RU1, RU2 (AS), carboxilesterasa intestinal, mut hsp70-2, M-CSF, prostasa, antígeno prostático específico (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, prosteína, PSMA, Her2/neu, survivina y telomerasa, antígeno 1 de tumor de carcinoma de próstata (PCTA-1), M<a>G<e>, ELF2M, elastasa de neutrófilos, efrina B2, CD22, factor de crecimiento de insulina (IGF)-I, IGF-II, receptor de IGF-I y CD19. Los antígenos de tumor en el presente documento se desvelan simplemente incluidos a modo de ejemplo. La lista no pretende ser excluyente y ejemplos adicionales serán rápidamente evidentes para los expertos en la técnica.
En un aspecto, el antígeno de tumor comprende uno o más epítopes antigénicos de cáncer asociados a un tumor maligno. Los tumores malignos expresan varias proteínas que pueden servir de antígenos diana para un ataque inmunitario. Estas moléculas incluyen, pero no se limitan a, antígenos específicos de tejido tales como MART-1, tirosinasa y GP 100 en melanoma y fosfatasa ácida prostática (PAP) y antígeno específico de próstata (PSA) en cáncer de próstata. Otras moléculas diana pertenecen al grupo de las moléculas relacionadas con la transformación tales como el oncogén HER-2/Neu/ErbB-2. Otro grupo más de antígenos diana son los antígenos oncofetales tales como el antígeno carcinoembrionario (CEA). En el linfoma de linfocitos B, la inmunoglobulina de iditiopo específico de tumor constituye verdaderamente un antígeno de inmunoglobulina específico de tumor que es único para el tumor individual. Los antígenos de diferenciación de linfocitos B tales como CD19, CD20, CD22, BCMA, ROR1 y CD37 son otros candidatos para antígenos diana en el linfoma de linfocitos B. Algunos de estos antígenos (CEA, HER-2, CD19, CD20, idiotipo) se han usado como dianas para la inmunoterapia pasiva con anticuerpos monoclonales con éxito limitado.
En un aspecto, el antígeno de tumor es CD19 y los tumores asociados a la expresión de CD19 comprenden mesotelioma de pulmón, cánceres de ovario y pancreáticos que expresan altos niveles de la proteína CD19 extracelular, o cualquier combinación de los mismos.
El tipo de antígeno de tumor también puede ser un antígeno específico de tumor (TSA) o un antígeno asociado a tumor (TAA). Un TSA es único para las células tumorales y no ocurre en otras células en el cuerpo. Un TAA no es único para una célula tumoral y en su lugar también se expresa en una célula normal en condiciones que dejan de inducir un estado de tolerancia inmunológica al antígeno. La expresión del antígeno sobre el tumor puede ocurrir en condiciones que permiten que el sistema inmunitario responda al antígeno. Los TAA pueden ser antígenos que se expresan en células normales durante el desarrollo fetal cuando el sistema inmunitario es inmaduro e incapaz de responder o pueden ser antígenos que normalmente están presentes en niveles extremadamente bajos en células normales pero que se expresan a niveles mucho más altos en células tumorales.
Los ejemplos no limitantes de TSA o TAA incluyen los siguientes: Antígenos de diferenciación tales como MART-1/MelanA (MART-I), gp100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2 y antígenos multi-linaje específicos de tumor tales como MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; antígenos embrionarios expresados en exceso tales como CEA; oncogenes expresados en exceso y genes supresores de tumores mutados tales como p53, Ras, HER-2/neu; antígenos de tumor únicos resultantes de translocaciones cromosómicas; tales como BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MIL-RAR; y antígenos víricos, tales como los antígenos del virus de Epstein Barr EBVA y los antígenos del virus del papiloma humano (VPH) E6 y E7. Otros antígenos grandes basados en proteína incluyen TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17,1, NuMa, K-ras, beta-catenina, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alfa-fetoproteína, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27,29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90\proteína de unión a Mac-2\proteína asociada a ciclofilina C, TAAL6, TAG72, TLP y TPS.
En un aspecto, la porción del dominio de unión al antígeno del CAR se dirige a un antígeno que incluye, pero no se limita a, CD19, CD20, CD22, ROR1, CD33, CD38, CD123, CD138, BCMA, c-Met, PSMA, glicolípido F77, EGFRvIII, GD-2, FGFR4, TSLPR, NY-ESO-1 TCR, MAGE A3 TCR y similares.
En el CAR, la porción del dominio de unión al antígeno del CAR se dirige al antígeno CD19 extracelular.
En un aspecto, la molécula de ácido nucleico aislada que codifica el dominio de unión al antígeno VH-2 de CD19 extracelular comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno VH-2 de CD19 extracelular codificado comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada que codifica el dominio de unión al antígeno VH-4 de CD19 extracelular comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3. En una realización, el dominio de unión al antígeno VH-4 de CD19 extracelular codificado comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada que codifica el dominio de unión al antígeno ScFv 9 de CD19 extracelular comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5. En una realización, el dominio de unión al antígeno ScFv 9 de CD19 extracelular codificado comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada que codifica el dominio de unión al antígeno ScFv 10 de CD19 extracelular comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7. En una realización, el dominio de unión al antígeno ScFv 10 de CD19 extracelular codificado comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada que codifica el dominio de unión al antígeno ScFv 12 de CD19 extracelular comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9. En una realización, el dominio de unión al antígeno ScFv 12 de CD19 extracelular codificado comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.
En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada que codifica el dominio de unión al antígeno ScFv 15 de CD19 extracelular comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 11. En una realización, el dominio de unión al antígeno ScFv 15 de CD19 extracelular codificado comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada que codifica el dominio de unión al antígeno ScFv 15 de CD19 extracelular comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 13. En una realización, el dominio de unión al antígeno ScFv 15 de CD19 extracelular codificado comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.
En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada que codifica el dominio de unión al antígeno ScFv 15 de CD19 extracelular comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 15. En una realización, el dominio de unión al antígeno ScFv 15 de CD19 extracelular codificado comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
En las diversas realizaciones de los CAR específicos de CD19 desvelados en el presente documento, el esquema general se expone en la Figura 1 e incluye, e extremo N a extremo C, una señal o péptido conductor, ScFv anti-CD19, conector extracelular, transmembrana de CD8, 4-1BB, CD3 zeta, en donde el texto en negrita representa los sitios de clonación para los dominios de conexión.
En una realización, la secuencia del ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 19, y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos como se exponen en SEQ ID NO: 20 [secuencia de aminoácidos de LTG 2050 LP-M19217-CD8 TM-41BB-CD3 zeta (como se representa en la Figura 2A)].
En una realización, la secuencia del ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 19, y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos como se exponen en SEQ ID NO: 20 [secuencia de aminoácidos de LTG 2050 LP-M19217-CD8 TM-41BB-CD3 zeta (como se representa en la Figura 2A)].
En otra realización, la secuencia del ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 21, y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos como se exponen en SEQ ID NO: 22 [secuencia de aminoácidos de LTG 2065 LP-M19217-1-CD8 TM-41BB-CD3 zeta (como se representa en la Figura 2B)].
En otra realización, la secuencia del ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 21, y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos como se exponen en SEQ ID NO: 22 [secuencia de aminoácidos de LTG 2065 LP-M19217-1-CD8 TM-41 BB-CD3 zeta (como se representa en la Figura 2B)].
En otra realización, la secuencia del ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 23, y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos como se exponen en SEQ ID NO: 24 [secuencia de aminoácidos del CAR LTG 2066 LP-M19217-2-CD8 TM-41BB-CD3 zeta CAR (como se representa en la Figura 2C)].
En otra realización, la secuencia del ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 23, y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos como se exponen en SEQ ID NO: 24 [secuencia de aminoácidos del CAR LTG 2066 LP-M19217-2-CD8 TM-41BB-CD3 zeta (como se representa en la Figura 2C)].
En otra realización más, la secuencia del ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 25, y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos como se exponen en SEQ ID NO: 26 [secuencia de aminoácidos de LTG2067 LP-M19217-7-CD8 TM-41BB-CD3 zeta (como se representa en la Figura 2D)].
En otra realización más, la secuencia del ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 25, y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos como se exponen en SEQ ID NO: 26 [secuencia de aminoácidos de LTG2067 LP-M19217-7-CD8 TM-41BB-CD3 (como se representa en la Figura 2D)].
En otra realización más, la secuencia del ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 27, y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos como se exponen en SEQ ID NO: 28 [secuencia de aminoácidos de LTG2068 LP-M19217-23-CD8 TM-41 BB-CD3 zeta (como se representa en la Figura 2E)].
En otra realización más, la secuencia del ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 27, y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos como se exponen en SEQ ID NO: 28 [secuencia de aminoácidos de LTG2068 LP-M19217-23-CD8 TM-41 BB-CD3 zeta (como se representa en la Figura 2E)].
En otra realización más, la secuencia del ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 29, y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos como se exponen en SEQ ID NO: 30 [secuencia de aminoácidos de LTG2069 LP-M19217-29-CD8 TM-41 BB-CD3 zeta (como se representa en la Figura 2F)].
En otra realización más, la secuencia del ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 29, y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos como se exponen en SEQ ID NO: 30 [secuencia de aminoácidos LTG2069 LP-M19217-29-CD8 TM-41 BB-CD3 zeta (como se representa en la Figura 2F)].
En otra realización más, la secuencia del ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 31, y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos como se exponen en SEQ ID NO: 32 [secuencia de aminoácidos de LTG2070 LP-M19217-38-CD8 TM-41 BB-CD3 zeta (como se representa en la Figura 2G)].
En otra realización más, la secuencia del ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 31, y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos como se exponen en SEQ ID NO: 32 [secuencia de aminoácidos de LTG2070 LP-M19217-38-CD8 TM-41 BB-CD3 zeta (como se representa en la Figura 2 G)].
En otra realización más, la secuencia del ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 33, y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos como se exponen en SEQ ID NO: 34 [secuencia de aminoácidos de LTG2071 LP-M19217-40-CD8 TM-41 BB-CD3 zeta (como se representa en la Figura 2H)].
En otra realización más, la secuencia del ácido nucleico que codifica un CAR comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 33, y codifica el CAR que comprende la secuencia de aminoácidos como se exponen en SEQ ID NO: 34 [secuencia de aminoácidos de LTG2071 LP-M19217-40-CD8 TM-41 BB-CD3 zeta (como se representa en la Figura 2H)].
La expresión superficial de CAR anti-CD19 que incorporan secuencias variables de fragmentos monocatenarios (ScFv) reactivas con el antígeno CD19 se muestra en el Ejemplo 2 abajo y se resume en la Tabla 2. Se determinó el nivel de expresión para cada CAR que contiene ScFv o VH por análisis de citometría de flujo de linfocitos T transducidos por LV de donantes sanos usando un péptido CD19-Fc recombinante, seguido por fragmento Fc F(ab')2 anti-humano conjugado con AF647, y detectado en el canal de APC (véase la Figura 3). Las construcciones de CAR anti-CD19 basadas en ScFv LTG2050, LTG2065-LTG2071 se expresaron altamente en linfocitos T primarios humanos (como se indica por la población seleccionada) en comparación con controles de linfocitos T no transducidos (población de células no seleccionada). Se muestran resultados representativos de un donante.
Como se muestra en el Ejemplo 2 y la Figura 4, la elevada actividad citolítica de los CAR CD19 se demostró cuando vectores lentivíricos (LV) que expresan los siguientes CAR se crearon y probaron para actividad antileucémica. Cada CAR experimental contiene el motivo de señalización de 4-1BB/CD3-cadena zeta y el motivo/dominio de unión anti-CD19 específico indicado en el presente documento. Se usaron líneas diana de leucemia con expresión superficial de CD19 variable: Raji y Reh; y CD19 negativa K562 y 293T. Las construcciones de CAR anti-CD19 basadas en ScFv LTG2050 y LTG2065-2071 fueron capaces de lisar eficientemente líneas de tumor CD19-alto Raji y Reh, mientras que no tuvieron actividad lítica no específica contra K562 o 293T (véase la Figura 4). Estos resultados demuestran la eficiencia y especificidad de las construcciones de CAR generadas.
Entonces se evaluó la capacidad de linfocitos T-CAR anti-CD19 para la secreción de citocinas. Se coincubaron células tumorales con linfocitos T-CAR o linfocitos T de control en la relación entre efectoras y diana de 10:1 durante la noche, y se analizaron los sobrenadantes de cultivo por ELISA para IFN gamma, TNF alfa e IL-2 (véase la Figura 5). Cabe<señalar que las células que expresan>T-<c>A<r LTG2065, LTG2066, LTG2067, LTG2068, LTG2069, LTG2070 y>LTG2071 elaboraron altos niveles de IFN gamma, TNF alfa e IL-2, mientras que el control negativo (no traducido, UN) no dio inducción apreciable de citocinas. Sorprendentemente, el CAR de CD19 LTG2050 dio niveles significativamente más bajos de citocinas inducidas contra las líneas tumorales probadas. El CAR que se probó como control positivo, LTG1538, que expresó el ligante de CD19 FMC63 murino (SEQ ID NO: 47), tuvo menor actividad que todos los ligantes probados, excepto LTG2050. La alta función citolítica in vitro de LTG2050, que tuvo baja capacidad de producción de citocinas, sugiere que se necesitan probar múltiples puntos finales funcionales de T-CAR construcción por construcción. Además, la superioridad de los ligantes de CD19 humanos de LTG2065-2071 con respecto a scFv de FMC63 murino se demostró claramente en los ensayos de producción de citocinas.
Sin pretender limitar a mecanismo de acción particular alguno, se cree que los posibles motivos para la potenciada función terapéutica asociada a los CAR a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, y no a modo de limitación, a) movimiento lateral mejorado dentro de la membrana plasmática que permite la transducción de señales más eficiente, b) localización superior dentro de los microdominios de la membrana plasmática, tales como balsas lipídicas, y mayor capacidad para interaccionar con las cascadas de señalización transmembranaria asociadas a la activación de linfocitos T, c) localización superior dentro de la membrana plasmática por movimiento preferencial lejos de interacciones amortiguadoras o moduladoras por disminución, tales como menos proximidad a o interacción con fosfatasas, tales como CD45, y d) ensamblaje superior en los complejos de señalización de receptores de linfocitos T (es decir, las sinapsis inmunitarias), o cualquier combinación de los mismos.
Aunque la divulgación se ha ilustrado con dominios de unión al antígeno ScFv de CD19 humanos extracelulares a modo de ejemplo, se pueden usar otras variantes de nucleótidos y/o aminoácidos dentro de los dominios de unión al antígeno ScFv variables de CD19 para derivar dominios de unión de solo cadena pesada, o subconjuntos de los mismos, y así comprender los dominios de unión al antígeno CD19 para su uso en los CAR descritos en el presente documento. En una realización, la otra variante de nucleótidos y/o aminoácidos dentro de los dominios de unión al antígeno ScFv variables de CD19 incluyen, por ejemplo, la variante que contiene los dominios de unión al antígeno<ScFv variables de CD19 marcada como f>M<c>63 (<s>E<q ID NO: 46 y SEQ ID NO: 47 (secuencia de nucleótidos y>secuencia de aminoácidos, respectivamente) (véase el Ejemplo 1).
Dependiendo del antígeno deseado para ser elegido como diana, el CAR se puede manipular adicionalmente para incluir el dominio de unión al antígeno apropiado que es específico para el antígeno diana deseado. Por ejemplo, si CD19 es el antígeno deseado que se va a elegir como diana, se puede usar un anticuerpo para CD19 como la incorporación del dominio de unión al antígeno en el CAR.
En una realización a modo de ejemplo, la porción del dominio de unión al antígeno del CAR se dirige adicionalmente a CD33. Preferentemente, el dominio de unión al antígeno en el CAR es ScFV anti-CD33, en donde la secuencia del ácido nucleico del ScFV anti-CD33 comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 48. En una realización, ScFV anti-CD33 comprende la secuencia del ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49. En otra realización, la porción de ScFV anti-CD33 del CAR comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 49.
En una realización a modo de ejemplo, la porción del dominio de unión al antígeno del CAR se dirige adicionalmente a mesotelina. Preferentemente, el dominio de unión al antígeno en el CAR es ScFV anti-mesotelina, en donde la secuencia del ácido nucleico del ScFV anti-mesotelina comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 50. En una realización, la ScFV anti-mesotelina comprende la secuencia del ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51. En otra realización, la porción de ScFV anti-mesotelina del CAR comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 51.
En un aspecto, se desvela un CAR capaz de unirse a un no TSA o no TAA que incluye, por ejemplo y no a modo de limitación, un antígeno derivado de Retroviridae (por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana tal como VIH-1 y VIH-LP), Picornaviridae (por ejemplo, virus de la poliomielitis, virus de la hepatitis A, enterovirus, coxsackievirus humano, rinovirus y ecovirus), virus de la rubeola, coronavirus, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia, virus del ébola, virus paragripal, virus de las paperas, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial, virus de la gripe, virus de la hepatitis B, parvovirus, Adenoviridae, Herpesviridae [por ejemplo, virus del herpes simple (VHS) de tipo 1 y tipo 2, virus de la varicela zóster, citomegalovirus (CMV) y virus del herpes], Poxviridae (por ejemplo, virus de la viruela, virus de la variolovacuna y poxvirus), o virus de la hepatitis C, o cualquier combinación de los mismos.
En otro aspecto, se desvela un CAR capaz de unirse a un antígeno derivado de una cepa bacteriana de Staphylococci, Streptococcus, Escherichia coli, Pseudomonas o Salmonella. Particularmente, se proporciona un CAR capaz de unirse a un antígeno derivado de una bacteria infecciosa, por ejemplo, Helicobacter pyloris, Legionella pneumophilia, una cepa bacteriana de Mycobacteria sps. (por ejemplo, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii o M. gordonea), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitides, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes, Streptococcus de grupo A, Streptococcus de grupo B (Streptococcus agalactiae), Streptococcus pneumoniae, o Clostridium tetani, o una combinación de los mismos.
2. Dominio transmembranario
Con respecto al dominio transmembranario, el CAR comprende uno o más dominios transmembranarios fusionados con el dominio de unión al antígeno CD19 extracelular del CAR.
El dominio transmembranario se puede obtener o de una fuente natural o de una sintética. Donde la fuente es natural, el dominio se puede obtener de cualquier proteína unida a membrana o transmembranaria.
Las regiones transmembranarias de uso particular en los CAR descritos en el presente documento (es decir, comprenden al menos la(s) región(s) transmembranaria(s) de) la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, mesotelina, CD33, CD37, CD64, CD80, CD83, CD86, CD134, CD137, CD154, TNFRSF16 o TNFRSF19. Alternativamente, el dominio transmembranario puede ser sintético, en cuyo caso comprenderá restos predominantemente hidrófobos tales como leucina y valina. Preferentemente se encontrará un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada extremo de un dominio transmembranario sintético. Opcionalmente, un conector oligo- o polipeptídico corto, preferentemente entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, puede formar el enlace entre el dominio transmembranario y el dominio de señalización citoplásmico del CAR. Un doblete de glicina-serina proporciona un conector particularmente adecuado.
En una realización, el dominio transmembranario que está asociado naturalmente con uno de los dominios en el CAR se usa además de los dominios transmembranarios descritos arriba.
En algunos casos, el dominio transmembranario se puede seleccionar o por sustitución de aminoácidos para evitar la unión de dichos dominios a los dominios transmembranarios de las mismas proteínas de la membrana de superficie o diferentes para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor.
En una realización, el dominio transmembranario en el CAR es el dominio transmembranario de CD8. En una realización, el dominio transmembranario de CD8 comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 35. En una realización, el dominio transmembranario de CD8 comprende la secuencia del ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36. En otra realización, el dominio transmembranario de CD8 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
En una realización, el dominio transmembranario codificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones), pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, o una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
En algunos casos, el dominio transmembranario del CAR comprende el dominio bisagra de CD8 alfa. En una realización, el dominio bisagra de CD8 comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 37. En una realización, el dominio bisagra de CD8 comprende la secuencia del ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38. En otra realización, el dominio bisagra de CD8 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, o una secuencia con 95-99 % de identidad con la misma.
En una realización, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada, en donde el dominio de conector codificado deriva del dominio extracelular de CD8, y se une al dominio de CD8 transmembranario, el dominio de CD28 transmembranario, o una combinación de los mismos.
3. Dominio espaciador
En el CAR, se puede disponer un dominio espaciador entre el dominio extracelular y el dominio transmembranario, o entre el dominio intracelular y el dominio transmembranario. El dominio espaciador significa cualquier oligopéptido o polipéptido que sirve para enlazar el dominio transmembranario con el dominio extracelular y/o el dominio transmembranario con el dominio intracelular. El dominio espaciador comprende hasta 300 aminoácidos, preferentemente 10 a 100 aminoácidos, y lo más preferentemente 25 a 50 aminoácidos.
En varios aspectos, el conector puede incluir un elemento espaciador, que, cuando está presente, aumenta el tamaño del conector de forma que aumenta la distancia entre la molécula efectora o el marcador detectable y el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno. El experto en la técnica conoce espaciadores a modo de ejemplo, e incluyen los enumerados en las patentes de EE. UU. n.27.964.566, 7.498.298, 6.884.869, 6.323.315, 6.239.104, 6.034.065, 5.780.588, 5.665.860, 5.663.149, 5.635.483, 5.599.902, 5.554.725, 5.530.097, 5.521.284, 5.504.191, 5.410.024, 5.138.036, 5.076.973, 4.986.988, 4.978.744, 4.879.278, 4.816.444 y 4.486.414, así como las publicaciones de patente de EE. UU. n.° 20110212088 y 20110070248.
El dominio espaciador tiene preferentemente una secuencia que promueve la unión de un CAR con un antígeno y potencia la señalización en una célula. Los ejemplos de un aminoácido que se espera que promueva la unión incluyen cisteína, un aminoácido cargado, y serina y treonina en un posible sitio de glucosilación, y estos aminoácidos se pueden usar como un aminoácido que constituye el dominio espaciador.
Como dominio espaciador, se puede usar todo o una parte de los números de aminoácidos 137-206 (SEQ ID NO: 39) que es una región bisagra de CD8.alfa. (NCBI RefSeq: NP.sub.--001759,3), números de aminoácidos 135 a 195 de CD8.beta. (GenBank: AAA35664.1), números de aminoácidos 315 a 396 de CD4 (NCBI RefSeq: NP.sub.— 000607.1), o números de aminoácidos 137 a 152 de CD28 (NCBI RefSeq: NP.sub.—006130.1). Por tanto, como dominio espaciador, se puede usar una parte de una región constante de una cadena H o cadena L de anticuerpo. Además, el dominio espaciador puede ser una secuencia artificialmente sintetizada.
Además, en el CAR, una secuencia de péptidos señal se puede unir al extremo N. La secuencia de péptidos señal existe en el extremo N de muchas proteínas secretoras y proteínas de membrana, y tiene una longitud de 15 a 30 aminoácidos. Puesto que muchas de las moléculas de proteínas mencionadas anteriormente como dominio intracelular tienen secuencias de péptidos señal, los péptidos señal se pueden usar como péptido señal para el CAR. En una realización, el péptido señal comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 18.
4. Dominio intracelular
El dominio citoplásmico o de otro modo el dominio de señalización intracelular del CAR es responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria en la que el CAR se ha dispuesto. El término "función efectora" se refiere a una función especializada de una célula. La función efectora de un linfocito T, por ejemplo, puede ser actividad citolítica o actividad auxiliar que incluye la secreción de citocinas. Así el término "dominio de señalización intracelular" se refiere a la porción de una proteína que transduce la señal de función efectora y dirige la célula para que realice una función especializada. Aunque normalmente se puede emplear todo el dominio de señalización intracelular, en muchos casos no es necesario usar toda la cadena. Hasta el punto que se use una porción truncada del dominio de señalización intracelular, dicha porción truncada se puede usar en lugar de la cadena intacta, en tanto que transduzca la señal de la función efectora. El término dominio de señalización intracelular pretende incluir cualquier porción truncada del dominio de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de función efectora.
Los ejemplos preferidos de dominios de señalización intracelular para su uso en el CAR incluyen las secuencias citoplásmicas del receptor de linfocitos T (TCR) y los correceptores que actúan en concierto para iniciar la transducción de señales tras el acoplamiento del receptor de antígeno, así como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional.
Se conoce que las señales generadas a través del TCR solo son insuficientes para la activación completa del linfocito T y que también se requiere una señal secundaria o coestimulante. Así, se puede decir que la activación de linfocitos T está mediada por dos clases distintas de secuencia de señalización citoplásmica: las que inician la activación dependiente de antígeno mediante el TCR (secuencias de señalización citoplásmica primaria) y las que actúan en un modo independiente de antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimulante (secuencias de señalización citoplásmica secundaria).
Las secuencias de señalización citoplásmica primaria regulan la activación primaria del complejo de TCR o en una forma estimulante, o en una forma inhibidora. Las secuencias de señalización citoplásmica primaria que actúan en un modo estimulante pueden contener señalización motivos que se conocen como motivos de activación de inmunorreceptores basados en tirosina o ITAM.
Los ejemplos de ITAM que contienen secuencias de señalización citoplásmica primaria que son de uso particular en los CAR desvelados en el presente documento incluyen los derivados de TCR zeta (CD3 Zeta), FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. Los ejemplos no limitantes específicos de ITAM incluyen péptidos que tienen secuencias de números de aminoácidos 51 a 164 de CD3.zeta. (NCBI RefSeq: NP.sub.—932170.1), números de aminoácidos 45 a 86 de Fc.épsilon.RI.gamma. (NCBI RefSeq: NP.sub.--004097.1), números de aminoácidos 201 a 244 de Fc.épsilon.RI.beta. (NCBI RefSeq: NP.sub.--000130.1), números de aminoácidos 139 a 182 de CD3.gamma. (NCBI RefSeq: NP.sub.--000064.1), números de aminoácidos 128 a 171 de CD3.delta. (NCBI RefSeq: NP.sub.--000723.1), números de aminoácidos 153 a 207 de CD3.épsilon. (NCBI RefSeq: NP.sub.--000724.1), números de aminoácidos 402 a 495 de CD5 (NCBI RefSeq: NP.sub.--055022.2), números de aminoácidos 707 a 847 de 0022 (NCBI RefSeq: NP.sub.--001762.2), números de aminoácidos 166 a 226 de CD79a (NCBI RefSeq: NP.sub.--001774.1), números de aminoácidos 182 a 229 de CD79b (NCBI RefSeq: NP.sub.--000617.1) y números de aminoácidos 177 a 252 de CD66d (NCBI RefSeq: NP.sub.--001806.2), y sus variantes que tienen la misma función que tienen estos péptidos. El número de aminoácidos basado en la información de secuencias de aminoácidos de NCBI RefSeq ID o GenBank descrito en el presente documento se numera basándose en la longitud completa del precursor (que comprende una secuencia de péptidos señal etc.) de cada proteína. En una realización, la de molécula señalización citoplásmica en el CAR comprende una secuencia de señalización citoplásmica derivada de CD3 zeta.
En una realización preferida, el dominio intracelular del CAR se puede diseñar para comprender el dominio de señalización CD3-zeta por sí mismo o combinado con cualquier otro dominio(s) citoplásmico(s) deseado(s) útiles en el contexto del CAR. Por ejemplo, el dominio intracelular del CAR puede comprender una porción de cadena zeta de CD3 y una región de señalización coestimulante. La región de señalización coestimulante se refiere a una porción del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimulante. Una molécula coestimulante es una molécula de la superficie celular distinta de un receptor de antígeno o sus ligandos que se requiere para una respuesta de linfocitos eficiente a un antígeno. Los ejemplos de dichas moléculas coestimulantes incluyen CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 asociado a la función de linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, y un ligando que se une específicamente a CD83, y similares. Los ejemplos no limitantes específicos de dichas moléculas coestimulantes incluyen péptidos que tienen secuencias de números de aminoácidos 236 a 351 de CD2 (NCBI RefSeq: NP.sub.--001758.2), números de aminoácidos 421 a 458 de CD4 (NCBI RefSeq: NP.sub.--000607.1), números de aminoácidos 402 a 495 de CD5 (NCBI RefSeq: NP.sub.--055022.2), números de aminoácidos 207 a 235 de CD8.alfa. (NCBI RefSeq: NP.sub.--001759,3), números de aminoácidos 196 a 210 de CD83 (GenBank: AAA35664.1), números de aminoácidos 181 a 220 de CD28 (NCBI RefSeq: NP.sub.--006130.1), números de aminoácidos 214 a 255 de CD137 (4-1BB, NCBI RefSeq: NP.sub.--001552.2), números de aminoácidos 241 a 277 de CD134 (OX40, NCBI RefSeq: NP.sub.--003318.1), y números de aminoácidos 166 a 199 de ICOS (NCBI RefSeq: NP.sub.--036224.1), y sus variantes que tienen la misma función que tienen estos péptidos. Así, mientras que la divulgación en el presente documento se ejemplifica principalmente con 4-1BB como el elemento de señalización coestimulante, otros elementos coestimulantes están dentro del alcance de la divulgación.
Las secuencias de señalización citoplásmica dentro de la porción de señalización citoplásmica del CAR se pueden unir a entre sí en un orden aleatorio o especificado. Opcionalmente, un conector oligo- o polipeptídico corto, preferentemente entre 2 y 10 aminoácidos en longitud, puede formar el enlace. Un doblete de glicina-serina proporciona un conector particularmente adecuado.
En una realización, el dominio intracelular se diseña para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD28. En otra realización, el dominio intracelular se diseña para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de 4-1BB. En otra realización más, el dominio intracelular se diseña para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD28 y 4-1BB.
En una realización, el dominio intracelular en el CAR se diseña para comprender el dominio de señalización de 4-1 BB y el dominio de señalización de CD3-zeta, en donde el dominio de señalización de 4-1 BB comprende la secuencia del ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 40 y el dominio de señalización de CD3-zeta comprende la secuencia del ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 42 y en la secuencia del ácido nucleico de variante expuesta en SEQ ID NO: 44. En una realización, el dominio intracelular en el CAR se diseña para comprender el dominio de señalización de 4-1BB y el dominio de señalización de CD3-zeta, en donde el dominio de señalización de 4-1 BB comprende la secuencia del ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 40, y el dominio de señalización de CD3-zeta comprende la secuencia del ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 42, o en otra realización, la secuencia del ácido nucleico de variante de CD3-zeta expuesta en SEQ ID NO: 44.
En una realización, el dominio intracelular en el CAR se diseña para comprender el dominio de señalización de 4-1 BB y el dominio de señalización de CD3-zeta, en donde el dominio de señalización de 4-1 BB comprende la secuencia del ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 y el dominio de señalización de CD3-zeta comprende la secuencia del ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, o en otra realización, el ácido nucleico de variante de CD3-zeta que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45.
En una realización, el dominio intracelular en el CAR se diseña para comprender el dominio de señalización de 4-1 BB y el dominio de señalización de CD3-zeta, en donde el dominio de señalización de 4-1 BB comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 41 y el dominio de señalización de CD3-zeta comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 43 y la secuencia de aminoácidos de variante expuesta en SEQ ID NO: 45.
5. Descripción adicional de CAR
También se desvelan en el presente documento porciones funcionales de los CAR desveladas en el presente documento. El término "porción funcional" cuando se usa en referencia a un CAR se refiere a cualquier parte o fragmento de uno o más de los CAR desvelados en el presente documento, parte o fragmento que retiene la actividad biológica del CAR del que es una parte (el CAR parental). Las porciones funcionales engloban, por ejemplo, las partes de un CAR que retienen la capacidad de reconocer células diana, o detectar, tratar o prevenir una enfermedad, hasta un grado similar, el mismo grado, o a un grado más alto, que el CAR parental. En referencia al CAR parental, la porción funcional puede comprender, por ejemplo, aproximadamente 10 %, 25 %, 30 %, 50 %, 68 %, 80 %, 90 %, 95 %, o más, del CAR parental.
La porción funcional puede comprender aminoácidos adicionales en el extremo amino o carboxi de la porción, o en ambos extremos, aminoácidos adicionales que no se encuentran en la secuencia de aminoácidos del CAR parental. Deseablemente, los aminoácidos adicionales no interfieren con la función biológica de la porción funcional, por ejemplo, reconocen células diana, detectan cáncer, tratan o previenen cáncer, etc. Más deseablemente, los aminoácidos adicionales potencian la actividad biológica, en comparación con la actividad biológica del CAR parental.
En el alcance de la divulgación se incluyen variantes funcionales de los CAR desvelados en el presente documento. El término "variante funcional" como se usa en el presente documento se refiere a un CAR, polipéptido, o proteína que tiene identidad o similitud de secuencia sustancial o significativa con un CAR parental, variante funcional que retiene la actividad biológica del CAR del que es una variante. Las variantes funcionales engloban, por ejemplo, las variantes del CAR descritas en el presente documento (el CAR parental) que retienen la capacidad de reconocer células diana hasta un grado similar, el mismo grado, o a un grado más alto, que el CAR parental. En referencia al CAR parental, la variante funcional puede ser, por ejemplo, al menos aproximadamente 30 %, 50 %, 75 %, 80 %, 90 %, 98 % o más idéntica en secuencia de aminoácidos al CAR parental.
Una variante funcional puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del CAR parental con al menos una sustitución de aminoácidos conservativa. Alternativamente o además, las variantes funcionales pueden comprender la secuencia de aminoácidos del CAR parental con al menos una sustitución no conservativa de aminoácidos. En este caso, es preferible que la sustitución no conservativa de aminoácidos no interfiera o inhiba la actividad biológica de la variante funcional. La sustitución no conservativa de aminoácidos puede potenciar la actividad biológica de la variante funcional, de forma que la actividad biológica de la variante funcional aumente en comparación con el CAR parental.
Las sustituciones de aminoácidos de los CAR son preferentemente sustituciones conservativas de aminoácidos. Se conocen en la técnica las sustituciones conservativas de aminoácidos, e incluyen sustituciones de aminoácidos en las que un aminoácido que tiene ciertas propiedades químicas y/o físicas se intercambia por otro aminoácido que tiene las mismas propiedades químicas o físicas, o similares. Por ejemplo, la sustitución conservativa de aminoácidos puede ser un aminoácido ácido/polar negativamente cargado sustituido por otro aminoácido ácido/polar negativamente cargado (por ejemplo, Asp o Glu), un aminoácido con una cadena lateral no polar sustituida por otro aminoácido con una cadena lateral no polar (por ejemplo, Ala, Gly, Val, He, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Cys, Val, etc.), un aminoácido básico/polar positivamente cargado sustituido por otro aminoácido básico/polar positivamente cargado (por ejemplo Lys, His, Arg, etc.), un aminoácido sin carga con una cadena lateral polar sustituido por otro aminoácido sin carga con una cadena lateral polar (por ejemplo, Asn, Gin, Ser, Thr, Tyr, etc.), un aminoácido con una cadena lateral betaramificada sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral beta-ramificada (por ejemplo, He, Thr y Val), un aminoácido con una cadena lateral aromática sustituida por otro aminoácido con un cadena lateral aromática (por ejemplo, His, Phe, Trp y Tyr), etc.
El CAR puede consistir esencialmente en la secuencia o secuencias de aminoácidos especificadas descritas en el presente documento, de forma que otros componentes, por ejemplo, otros aminoácidos, no cambien materialmente la actividad biológica de la variante funcional.
Los CAR (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales) pueden ser de cualquier longitud, es decir, pueden comprender cualquier número de aminoácidos, a condición de que los CAR (o porciones funcionales o variantes funcionales de los mismos) retengan su actividad biológica, por ejemplo, la capacidad de unirse específicamente a antígeno, detectar células enfermas en un mamífero, o tratar o prevenir la enfermedad en un mamífero, etc. Por ejemplo, el CAR puede tener aproximadamente 50 a aproximadamente 5000 aminoácidos de longitud, tal como 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más aminoácidos de longitud.
Los CAR (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales) pueden comprender aminoácidos sintéticos en lugar de uno o más aminoácidos que existen de forma natural. Dichos aminoácidos sintéticos se conocen en la técnica, e incluyen, por ejemplo, ácido aminociclohexanocarboxílico, norleucina, ácido -amino-n-decanoico, homoserina, S-acetilaminometil-cisteína, trans-3- y trans-4-hidroxiprolina, 4-aminofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, 4-clorofenilalanina,<4-carboxifenilalanina,>p<-fenilserina>p<-hidroxifenilalanina, fenilglicina, a-naftilalanina, ciclohexilalanina, ciclohexilglicina,>ácido indolin-2-carboxílico, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico, ácido aminomalónico, monoamida de ácido aminomalónico, N'-bencil-N'-metil-lisina, N',N'-dibencil-lisina, 6-hidroxilisina, ornitina, ácido -aminociclopentanocarboxílico, ácido a-aminociclohexanocarboxílico, ácido a-aminocicloheptanocarboxílico, ácido a-<(2-amino-2-norbornano)-carboxílico, ácido>Y<-diaminobutírico, ácido>p<-diaminopropiónico, homofenilalanina y a-terc->butilglicina.
Los CAR (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales) pueden estar glucosilados, amidados, carboxilados, fosforilados, esterificados, N-acilados, ciclados por, por ejemplo, un puente disulfuro, o se convierten en una sal de adición de ácido y/u opcionalmente se dimerizan o polimerizan, o conjugan.
Los CAR (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos) se pueden obtener por métodos conocidos en la técnica. Los CAR se pueden preparar por cualquier método adecuado de preparación de polipéptidos o proteínas. Los métodos adecuados de síntesisde novode los polipéptidos y proteínas se describen en referencias, tales como Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2000; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2001; y la patente de EE. UU. 5.449.752. Por tanto, los polipéptidos y proteínas se pueden producir recombinantemente usando los ácidos nucleicos descritos en el presente documento usando métodos recombinantes convencionales. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994. Además, algunos de los CAR (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos) se pueden aislar y/o purificar de una fuente, tal como una planta, una bacteria, un insecto, un mamífero, por ejemplo, una rata, un humano, etc. Los métodos de aislamiento y purificación se conocen bien en la técnica. Alternativamente, los CAR descritos en el presente documento (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos) se pueden sintetizar comercialmente por empresas. A este respecto, los CAR pueden ser sintéticos, recombinantes, aislados y/o purificados.
B. Anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno
Un aspecto desvela además un CAR, un linfocito T que expresa un CAR, un anticuerpo, o dominio de unión al antígeno, o porción del mismo, que se une específicamente a uno o más de los antígenos desvelados en el presente documento. Como se usa en el presente documento, un "linfocito T que expresa un CAR", o un "linfocito T con CAR" significa un linfocito T que expresa un CAR, y tiene especificidad por antígenos determinada por, por ejemplo, el dominio de direccionamiento derivado de anticuerpo del CAR.
Como se usa en el presente documento, un "dominio de unión al antígeno" puede incluir un anticuerpo y fragmentos de unión al antígeno del mismo. El término "anticuerpo" se usa en el presente documento en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpo, que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de unión al antígeno de los mismos, mientras presenten la actividad de unión al antígeno deseada. Los ejemplos no limitantes de anticuerpos incluyen, por ejemplo, inmunoglobulinas intactas y variantes y fragmentos de las mismas conocidas en la técnica que retienen afinidad de unión por el antígeno.
Un "anticuerpo monoclonal" es un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que existen de forma natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un sitio antigénico único. El adjetivo "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo, como que se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no se debe interpretar como que requiera la producción del anticuerpo por cualquier método particular. En algunos ejemplos, un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo producido por un único clon de linfocitos B o por una célula en la que se han transfectado el ácido nucleico que codifica las regiones variables ligeras y pesadas del anticuerpo de un único anticuerpo (o un fragmento de unión al antígeno del mismo), o una progenie del mismo. En algunos ejemplos, los anticuerpos monoclonales se aíslan de un sujeto. Los anticuerpos monoclonales pueden tener sustituciones conservativas de aminoácidos que no tienen sustancialmente efecto sobre la unión al antígeno u otras funciones de inmunoglobulina. Se conocen métodos de producción de anticuerpos monoclonales a modo de ejemplo, por ejemplo, véase Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Publications, New York (2013).
Normalmente, una inmunoglobulina tiene cadenas pesadas (H) y cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Los genes de inmunoglobulina incluyen los genes de la región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como la infinidad de genes del dominio variable de inmunoglobulina. Existen dos tipos de cadena ligera, lambda (A) y kappa (k). Existen cinco clases principales de cadena pesada (o isotipos) que determinan la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE.
Cada cadena pesada y ligera contiene una región constante (o dominio constante) y una región variable (o dominio variable; véase, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). En varias realizaciones, las regiones variables de la cadena pesada y ligera se combinan con se unen específicamente con el antígeno. En realizaciones adicionales, solo se requiere la región variable de la cadena pesada. Por ejemplo, los anticuerpos de camélido que existen de forma natural que consisten en una cadena pesada solo son funcionales y estables en ausencia de cadena ligera (véase, por ejemplo, Hamers-Casterman et al., Nature, 363:446-448, 1993; Sheriff et al., Nat. Struct. Biol., 3:733-736, 1996). Las referencias a "VH" o "VH" se refieren a la región variable de una cadena pesada del anticuerpo, que incluye la de un fragmento de unión al antígeno, tal como Fv, ScFv, dsFv o Fab. Las referencias a "VL" o "VL" se refieren al dominio variable de una cadena ligera del anticuerpo, que incluye la de un Fv, ScFv, dsFv o Fab.
Las regiones variables de la cadena ligera y pesada contienen una "región estructural" interrumpida por tres regiones hipervariables, también denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR" (véase, por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de las regiones estructurales de diferentes cadenas ligeras o pesadas están relativamente conservadas dentro de una especie. La región estructural de un anticuerpo, que es las regiones estructurales combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para situar y alinear las CDR en el espacio tridimensional.
Las CDR son responsables principalmente de la unión a un epítope de un antígeno. Los límites de la secuencia de aminoácidos de una CDR dada se pueden determinar fácilmente usando cualquiera de varios esquemas bien conocidos, que incluyen los descritos por Kabat et al. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991; esquema de numeración de "Kabat"), Al-Lazikani et al., (JMB 273,927-948, 1997; esquema de numeración de "Chothia") y Lefranc et al. ("IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains", Dev. Comp. Immunol., 27:55-77, 2003; esquema de numeración de "IMGT"). Las CDR de cada cadena se denominan normalmente CDR1, CDR2 y CDR3 (de extremo N a extremo C), y también se identifican normalmente por la cadena en la que se sitúa la CDR particular. Así, una CDR3 VH es la CDR3 del dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo en que se encuentra, mientras que una CDR1 VL es la CDR1 del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en que se encuentra. Las CDR de cadena ligera se denominan algunas veces LCDR1, LCDR2 y LCDR3. Las CDR de cadena pesada se denominan algunas veces LCDR1, LCDR2 y LCDR3.
Un "fragmento de unión al antígeno" es una porción de un anticuerpo de longitud completa que retiene la capacidad de reconocer específicamente el antígeno relacionado, así como diversas combinaciones de dichas porciones. Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión al antígeno incluyen Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, ScFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos de unión al antígeno o producidos por la modificación de anticuerpos completos o los sintetizados de novo usando metodologías de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Kontermann y Dubel (Ed), Antibody Engineering, Vols. 1-2, 2a Ed., Springer Press, 2010).
Un anticuerpo monocatenario (ScFv) es una molécula genéticamente manipulada que contiene los dominios VH y VL de uno o más anticuerpo(s) enlazados por un conector polipeptídico adecuado como una molécula de cadena sencilla genéticamente fusionada (véase, por ejemplo, Bird et al., Science, 242:423426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85:58795883, 1988; Ahmad et al., Clin. Dev. Immunol., 2012, doi:10.1155/2012/980250; Marbry, IDrugs, 13:543-549, 2010). La orientación intramolecular de VH-dominio y VL-dominio en un ScFv normalmente no es decisiva para ScFv. Así, se pueden usar ScFv con ambas disposiciones posibles (VH-dominio-dominio de conector-VL-dominio; VL-dominio-dominio de conector-VH-dominio).
En un dsFv, las cadenas variables de la cadena pesada y ligera han sido mutadas para introducir un enlace disulfuro para estabilizar la asociación de las cadenas. También se incluyen diacuerpos, que son bivalentes, anticuerpos biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una única cadena de polipéptidos, pero que usan un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dominios en la misma cadena, forzando así a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión al antígeno (véase, por ejemplo, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:64446448, 1993; Poljak et al., Structure, 2:1121 1123, 1994).
Los anticuerpos también incluyen formas genéticamente manipuladas tales como anticuerpos quiméricos (tales como anticuerpos murinos humanizados) y anticuerpos heteroconjugados (tales como anticuerpos biespecíficos). Véanse, por tanto, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3a Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997.
Los anticuerpos naturales que no existen de forma natural se pueden construir usando síntesis de péptidos en fase sólida, se pueden producir recombinantemente, o se pueden obtener, por ejemplo, por bibliotecas combinatorias de cribado que consisten en cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables como se describe por Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989). Estos y otros métodos de preparación, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, de CDR injertadas, monocatenarios y bifuncionales, se conocen bien por los expertos en la técnica (Winter y Harris, Immunol. Today 14:243-246 (1993); Ward et al., Nature 341:544-546 (1989); Harlow y Lane, arriba, 1988; Hilyard et al., Protein Engineering: A practical approach (IRL Press 1992); Borrabeck, Antibody Engineering, 2a ed. (Oxford University Press 1995)).
Un "anticuerpo que se une al mismo epítope" como anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competición en 50 % o más, y en cambio, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competición en 50 % o más. Se conocen ensayos de competición de anticuerpos, y en el presente documento se proporciona un ensayo de competición a modo de ejemplo.
Un anticuerpo "humanizado" o fragmento de unión al antígeno incluye una región estructural humana y una o más CDR de un anticuerpo no humano (tal como un ratón, rata, o sintético) o fragmento de unión al antígeno. El anticuerpo no humano o fragmento de unión al antígeno que proporciona las CDR se llama un "donante," y el anticuerpo humano o fragmento de unión al antígeno que proporciona la región estructural se llama un "aceptor". En una realización, todas las CDR son de la inmunoglobulina de donante en una inmunoglobulina humanizada. No necesitan estar presentes regiones constantes, pero si están, pueden ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de la inmunoglobulina humana, tales como al menos aproximadamente 85-90 %, tal como aproximadamente 95 % o más idénticas. Por tanto, todas las partes de un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antígeno, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente idénticas a partes correspondientes de secuencias naturales de anticuerpo humano.
Un "anticuerpo quimérico" es un anticuerpo que incluye secuencias derivadas de dos anticuerpos diferentes, que normalmente son de especies diferentes. En algunos ejemplos, un anticuerpo quimérico incluye una o más CDR y/o regiones estructurales de un anticuerpo humano y CDR y/o regiones estructurales de otro anticuerpo humano.
Un "anticuerpo completamente humano" o "anticuerpo humano" es un anticuerpo que incluye secuencias del (o derivadas del) genoma humano, y no incluye secuencia de otra especie. En algunas realizaciones, un anticuerpo humano incluye CDR, regiones estructurales y (si está presente) una región Fc de (o derivada del) genoma humano. Los anticuerpos humanos se pueden identificar y aislar usando tecnologías para crear anticuerpos basados en secuencias derivadas del genoma humano, por ejemplo, por presentación en fagos o usando animales transgénicos (véase, por ejemplo, Barbas et al. Phage display: A Laboratory Manual. 1a Ed. Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2004. Impreso; Lonberg, Nat. Biotech., 23: 1117-1125, 2005; Lonenberg, Curr. Opin. Immunol., 20:450-459, 2008).
Un anticuerpo puede tener uno o más sitios de unión. Si existe más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina que existe de forma natural tiene dos sitios de unión idénticos, un anticuerpo monocatenario o fragmento Fab tiene un sitio de unión, mientras que un anticuerpo biespecífico o bifuncional tiene dos sitios de unión diferentes.
Los métodos de ensayo de anticuerpos para la capacidad para unirse a cualquier porción funcional del CAR se conocen en la técnica e incluyen cualquier ensayo de unión anticuerpo-antígeno, tal como, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA), ELISA, transferencia Western, inmunoprecipitación y ensayos de inhibición competitiva (véase, por ejemplo, Janeway et al., abajo, publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2002/0197266 A1 y patente de e E. UU. n.° 7.338.929).
Por tanto, un CAR, un linfocito T que expresa un CAR, un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, se puede modificar para comprender un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante) y partículas de elementos (por ejemplo, partículas de oro).
C. Conjugados
Un CAR, un linfocito T que expresa un CAR, o anticuerpos monoclonales, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, específicos para uno o más de los antígenos desvelados en el presente documento, se puede conjugar con un agente, tal como una molécula efectora o marcador detectable, usando cualquier número de medios conocidos por los expertos en la técnica. Se pueden usar tanto medios de unión covalentes como no covalentes. Los conjugados incluyen, pero no se limitan a, moléculas en las que existe un enlace covalente de una molécula efectora o un marcador detectable para un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno que se une específicamente a uno o más de los antígenos desvelados en el presente documento. Un experto en la técnica apreciará que se pueden usar diversas moléculas efectoras y marcadores detectables, que incluyen (pero no se limitan a) agentes quimioterapéuticos, agentes antiangiogénicos, toxinas, agentes radiactivos tales como 125I, 32P- 14C, 3H y 35S y otros marcadores, restos diana y ligandos, etc.
La elección de una molécula efectora particular o marcador detectable depende de la molécula diana particular o célula, y el efecto biológico deseado. Así, por ejemplo, la molécula efectora puede ser una citotoxina que se usa para provocar la muerte de una célula diana particular (tal como una célula tumoral).
El procedimiento de fijación de una molécula efectora o marcador detectable a un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno varía según la estructura química del efector. Los polipéptidos contienen normalmente una variedad de grupos funcionales; tales como grupos ácido carboxílico (COOH), amina libre (-NH2) o sulfhidrilo (-SH), que están disponibles para la reacción con un grupo funcional adecuado en un anticuerpo para dar como resultado la unión de la molécula efectora o marcador detectable. Alternativamente, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se derivatiza para exponer o fijar grupos funcionales reactivos adicionales. La derivatización puede implicar la unión de cualquiera de varias moléculas conectoras conocidas tales como las disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, IL. El conector puede ser cualquier molécula usada para unir el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno a la molécula efectora o marcador detectable. El conector es capaz de formar enlaces covalentes con tanto el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno como con la molécula efectora o marcador detectable. Los expertos en la técnica conocen bien los conectores adecuados e incluyen, pero no se limitan a, conectores de carbono de cadena lineal o ramificada, conectores de carbono heterocíclicos, o conectores peptídicos. Donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno y la molécula efectora o marcador detectable sean polipéptidos, los conectores se pueden unir a los aminoácidos constituyentes mediante sus grupos laterales (tal como mediante un enlace disulfuro con cisteína) o con los grupos amino y carboxilo del carbono alfa de los aminoácidos terminales.
En varios aspectos, el conector puede incluir un elemento espaciador, que, cuando está presente, aumenta el tamaño del conector de forma que aumenta la distancia entre la molécula efectora o el marcador detectable y el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno. El experto en la técnica conoce espaciadores a modo de ejemplo, e incluyen los enumerados en las patentes de EE. UU. n.27.964.566, 7.498.298, 6.884.869, 6.323.315, 6.239.104, 6.034.065, 5.780.588, 5.665.860, 5.663.149, 5.635.483, 5.599.902, 5.554.725, 5.530.097, 5.521.284, 5.504.191, 5.410.024, 5.138.036, 5.076.973, 4.986.988, 4.978.744, 4.879.278, 4.816.444 y 4.486.414, así como las publicaciones de patente de EE. UU. n.220110212088 y 20110070248.
En algunos aspectos, el conector es escindible en condiciones intracelulares, de forma que la escisión del conector libera la molécula efectora o marcador detectable del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno en el entorno intracelular. En aún otros aspectos, el conector no es escindible y la molécula efectora o marcador detectable se libera, por ejemplo, por la degradación del anticuerpo. En algunos aspectos, el conector es escindible por un agente de escisión que está presente en el entorno intracelular (por ejemplo, dentro de un lisosoma o endosoma o caveola). El conector puede ser, por ejemplo, un conector peptídico que se escinde por una peptidasa intracelular o enzima proteasa, que incluye, pero no se limita a, una proteasa lisosómica o endosómica. En algunos aspectos, el conector peptídico tiene al menos dos aminoácidos de longitud o al menos tres aminoácidos de longitud. Sin embargo, el conector puede tener 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos de longitud, tal como 1-2, 1-3, 2-5, 3-10, 3 15, 1-5, 1-10, 1-15 aminoácidos de longitud. Las proteasas pueden incluir catepsinas B y D y plasmina, todas las cuales se conocen por hidrolizar los derivados de fármaco de dipéptido dando como resultado la liberación de fármaco activo dentro de células diana (véase, por ejemplo, Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Por ejemplo, se puede usar un conector peptídico que es escindible por la catepsina-B de proteasa dependiente de tiol (por ejemplo, un conector de fenilalanina-leucina o de glicina-fenilalanina-leucina-glicina). Otros ejemplos de dichos conectores se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 6.214.345. En un aspecto específico, el conector peptídico escindible por una proteasa intracelular es un conector de valina-citrulina o un conector de fenilalanina-lisina (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.214.345, que describe la síntesis de doxorubicina con el conector de valina-citrulina).
En otros aspectos, el conector escindible es sensible al pH, es decir, sensible a la hidrólisis a ciertos valores de pH. Normalmente, el conector sensible al pH es hidrolizable en condiciones ácidas. Por ejemplo, se puede usar un conector lábil a ácidos que es hidrolizable en el lisosoma (por ejemplo, una hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal o similares) (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.122.368; 5.824.805; 5.622.929; Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem.
264:14653-14661). Dichos conectores son relativamente estables en condiciones de pH neutro, tales como aquellas en la sangre, pero son inestables por debajo de pH 5,5 o 5,0, el pH aproximado del lisosoma. En ciertos aspectos, el conector hidrolizable es un conector de tioéter (tal como, por ejemplo, un tioéter fijado al agente terapéutico por un enlace acilhidrazona (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.622.929).
En otros aspectos, el conector es escindible en condiciones reductoras (por ejemplo, un conector de disulfuro). Se conocen en la técnica una variedad de conectores de disulfuro, que incluyen, por ejemplo, los que se pueden formar usando SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato) y SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)tolueno)-, SPDB y SMPT (véanse, por ejemplo, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., en Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987); Phillips et al., Cancer Res. 68:92809290, 2008). Véase también la patente de EE. UU. n.° 4.880.935).
En aún otros aspectos, el conector es un conector de malonato (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), un conector de maleimidobenzoílo (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304), o un análogo de 3'-N-amida (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12).
En aún otros aspectos, el conector no es escindible y la molécula efectora o el marcador detectable se libera por degradación del anticuerpo (véase la publicación de EE.UU. n.° 2005/0238649).
En varios aspectos, el conector es resistente a la escisión en un entorno extracelular. Por ejemplo, no más de aproximadamente 20 %, no más de aproximadamente 15 %, no más de aproximadamente 10 %, no más de aproximadamente 5 %, no más de aproximadamente 3 %, o no más de aproximadamente 1 % de los conectores, en una muestra de conjugado, se escinden cuando el conjugado está presente en un entorno extracelular (por ejemplo, en plasma). Si un conector es resistente o no a la escisión en un entorno extracelular se puede determinar, por ejemplo, incubando el conjugado que contiene el conector de interés con plasma durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, 2, 4, 8, 16 o 24 horas) y luego cuantificando la cantidad de molécula efectora libre o marcador detectable presente en el plasma. Una variedad de conectores a modo de ejemplo que se pueden usar en los conjugados se describe en el documento de patente WO 2004-010957, publicación de EE. UU. n.° 2006/0074008, publicación de EE. UU. n.220050238649 y publicación de EE. UU. n.22006/0024317.
En varios aspectos, se proporcionan conjugados de un CAR, un linfocito T que expresa un CAR, un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como una caliqueamicina, maitansinoides, dolastatinas, auristatinas, un tricoteceno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina.
Se conocen bien en la técnica los compuestos de maitansina adecuados para su uso como restos de toxina de maitansinoide, y se pueden aislar de fuentes naturales según métodos conocidos, producidos usando técnicas de ingeniería genética (véase Yu et al (2002) PNAS 99:7968-7973), o maitansinol y análogos de maitansinol preparados sintéticamente según métodos conocidos. Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan inhibiendo la polimerización de la tubulina. La maitansina se aisló por primera vez del arbusto de África oriental Maytenus serrata (patente de EE. UU. n.° 3.896.111). Posteriormente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres de maitansinol C-3 (patente de EE. UU. n.° 4.151.042). El maitansinol sintético y los derivados y análogos del mismo se desvelan, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.° 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; y 4.371.533. Los conjugados que contienen maitansinoides, métodos de preparación de los mismos, y su uso terapéutico, se desvelan, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.° 5.208.020; 5.416.064; 6.441.163 y la patente europea EP 0425235 B1.
Se pueden emplear toxinas adicionales con un CAR, un linfocito T que expresa un CAR, un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo. Las toxinas a modo de ejemplo incluyen exotoxina de Pseudomonas (PE), ricina, abrina, toxina diftérica y subunidades de la misma, ribotoxina, ribonucleasa, saporina y caliqueamicina, así como toxina botulínica A a F. Estas toxinas se conocen bien en la técnica y muchas están fácilmente disponibles de fuentes comerciales (por ejemplo, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). Las toxinas contempladas también incluyen variantes de las toxinas (véanse, por ejemplo, véanse, las patentes de EE. UU. n.° 5.079.163 y 4.689.401).
La saporina es una toxina derivada de Saponaria officinalis que altera la síntesis de proteínas inactivando la porción 60S del complejo ribosomal (Stirpe et al., Bio/Technoloogy, 10:405-412, 1992). Sin embargo, la toxina no tiene mecanismo para la entrada específica en las células y, por tanto, requiere conjugación con un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno que reconoce una proteína de la superficie celular que se internaliza para ser eficientemente absorbida por las células.
La toxina diftérica se aísla deCorynebacterium diphtheriae.Normalmente, la toxina diftérica para su uso en las inmunotoxinas se muta para reducir o eliminar la toxicidad no específica. Se conoce un mutante conocido como CRM107, que tiene actividad enzimática completa, pero toxicidad no específica notablemente reducida, desde los años 70 (Laird y Groman, J. Virol. 19:220, 1976), y se ha usado en ensayos clínicos humanos. Véase la patente de EE. UU. n.25.792.458 y la patente de EE. UU. n.25.208.021.
La ricina es la lectina RCA60 deRicinus communis(haba de ricino). Para ejemplos de ricina véase la patente de EE. UU. n.° 5.079.163 y la patente de EE. UU. n.° 4.689.401. La aglutinina de Ricinus communis (RCA) ocurre en dos formas designadas RCA60 y RCA120 según sus pesos moleculares de aproximadamente 65 y 120 kD, respectivamente (Nicholson & Blaustein, J. Biochim. Biophys. Acta 266:543, 1972). La cadena A es responsable de inactivar la síntesis de proteínas y destruir células. La cadena B une la ricina a los restos de galactosa de la superficie celular y facilita el transporte de la cadena A en el citosol (Olsnes et al., Nature 249:627-631, 1974 y patente de EE. UU. n.° 3.060.165).
También se han conjugado ribonucleasas con moléculas de direccionamiento para su uso como inmunotoxinas (véase Suzuki et al., Nat. Biotech. 17:265-70, 1999). Las ribotoxinas a modo de ejemplo tales como a-sarcina y restrictocina se tratan en, por ejemplo, Rathore et al., Gene 190:31-5, 1997; y Goyal y Batra, Biochem. 345 Pt 2:247-54, 2000. La caliqueamicinas se aislaron por primera vez de Micromonospora echinospora y son miembros de la familia de antibióticos antitumorales de enediína que provocan roturas de doble cadena en ADN que conducen a la apoptosis (véase, por ejemplo, Lee et al., J. Antibiot. 42:1070-87,1989). El fármaco es el resto tóxico de una inmunotoxina en ensayos clínicos (véase, por ejemplo, Gillespie et al., Ann. Oncol. 11:735-41,2000).
La abrina incluye lectinas tóxicas deAbrus precatorius.Los principios tóxicos, abrina a, b, c y d, tienen un peso molecular de desde aproximadamente 63 y 67 kD y están compuestos de dos cadenas de polipéptidos A y B enlazados por disulfuro. La cadena A inhibe la síntesis de proteínas; la cadena B (abrina-b) se une a restos de D-galactosa (véase Funatsu et al., Agr. Biol. Chem. 52:1095, 1988; y Olsnes, Methods Enzymol. 50:330-335, 1978).
Un CAR, un linfocito T que expresa un CAR, anticuerpos monoclonales, fragmentos de unión al antígeno de los mismos, específicos para uno o más de los antígenos desvelados en el presente documento, también se puede conjugar con un marcador detectable; por ejemplo, un marcador detectable capaz de detección por ELISA, espectrofotometría, citometría de flujo, microscopía o técnicas de diagnóstico por imágenes (tales como tomografía computerizada (TC), tomografía axial computerizada (TAC), imagen por resonancia magnética (IRM), imagen por resonancia magnética nuclear IRMN), tomografía por resonancia magnética (TMR), ultrasonidos, fibroendoscopia y examen laparoscópico). Los ejemplos no limitantes específicos de los marcadores detectables incluyen fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enlaces enzimáticos, isótopos radiactivos y metales o compuestos pesados (por ejemplo, nanocristales de óxido de hierro superparamagnético para la detección por IRM). Por ejemplo, marcadores detectables útiles incluyen compuestos fluorescentes, que incluyen fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1 -naptalenosulfonilo, ficoeritrina, fósforos de lantánidos y similares. También son de uso los marcadores bioluminiscentes, tales como luciferasa, proteína verde fluorescente (GFP), proteína amarilla fluorescente (YFP). Un CAR, un linfocito T que expresa un CAR, un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, también se puede conjugar con enzimas que son útiles para la detección, tales como peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa y similares. Cuando un CAR, un linfocito T que expresa un CAR, un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, se conjuga con una enzima detectable, se puede detectar añadiendo reactivos adicionales que la enzima usa para producir un producto de reacción que puede ser distinguido. Por ejemplo, cuando está presente el agente peroxidasa de rábano picante, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina conduce a un producto de reacción coloreado, que es visualmente detectable. Un CAR, un linfocito T que expresa un CAR, un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, también se puede conjugar con biotina, y se detecta mediante la medición indirecta de la unión de avidina o estreptavidina. Se debe observar que la avidina en sí se puede conjugar con una enzima o un marcador fluorescente.
Un CAR, un linfocito T que expresa un CAR, un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, se puede conjugar con un agente paramagnético, tal como gadolinio. Los agentes paramagnéticos tales como el óxido de hierro superparamagnético también son de uso como marcadores. Los anticuerpos también se pueden conjugar con lantánidos (tales como europio y disprosio) y manganeso. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno también se puede marcar con epítopes de polipéptido predeterminados reconocidos por un indicador secundario (tal como secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, marcadores de epítopes).
Un CAR, un linfocito T que expresa un CAR, un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, también se puede conjugar con un aminoácido radiomarcado. El radiomarcador se puede usar para tanto fines de diagnóstico como terapéuticos. Por ejemplo, el radiomarcador se puede usar para detectar uno o más de los antígenos desvelados en el presente documento y células que expresan antígeno por rayos X, espectros de emisión, u otras técnicas de diagnóstico. Además, el radiomarcador se puede usar terapéuticamente como una toxina para el tratamiento de tumores en un sujeto, por ejemplo, para el tratamiento de un neuroblastoma. Los ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes radioisótopos o radionucleótidos:<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In<125>1<131>1
Los expertos en la técnica conocen bien los medios de detección de dichos marcadores detectables. Así, por ejemplo, se pueden detectar radiomarcadores usando película fotográfica o contadores de centelleo, se pueden detectar marcadores fluorescentes usando un fotodetector para detectar iluminación emitida. Los marcadores enzimáticos se detectan normalmente proveyendo la enzima de un sustrato y detectando el producto de reacción producido por la acción de la enzima sobre el sustrato, y se detectan marcadores colorimétricos simplemente visualizando el marcador coloreado.
D. Nucleótidos, expresión, vectores y células hospedadoras
Se desvela además en el presente documento un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los CAR, un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, descrito en el presente documento (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos). Los ácidos nucleicos pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las secuencias líder, dominios transmembranarios y/o dominios de señalización intracelular de linfocitos T descritos en el presente documento.
En algunos aspectos, la secuencia de nucleótidos puede estar modificada en los codones. Sin desear quedar ligado a una teoría particular, se cree que la optimización de codones de la secuencia de nucleótidos aumenta la eficiencia de traducción de los transcritos de ARNm. La optimización de codones de la secuencia de nucleótidos puede implicar sustituir un codón nativo por otro codón que codifica el mismo aminoácido, pero puede ser traducido por ARNt que está más fácilmente disponible dentro de una célula, aumentando así la eficiencia de traducción. La optimización de la secuencia de nucleótidos también puede reducir las estructuras de ARNm secundario que interferirían con la traducción, aumentando así la eficiencia de traducción.
En un ejemplo, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos modificada en los codones que codifica el dominio de unión al antígeno del CAR.
"Ácido nucleico", como se usa en el presente documento, incluye "polinucleótido", "oligonucleótido" y "molécula de ácido nucleico" y, en general, significa un polímero de ADN o ARN, que puede ser monocatenario o bicatenario, sintetizado u obtenido (por ejemplo, aislado y/o purificado) de fuentes naturales, que puede contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados, y que puede contener un enlace internucleotídico natural, no natural o alterado, tal como un enlace fosforamidato o un enlace fosforotioato, en lugar del fosfodiéster encontrado entre los nucleótidos de un oligonucleótido sin modificar. En algunas realizaciones, el ácido nucleico no comprende ninguna inserción, deleción, inversión y/o sustitución. Sin embargo, puede ser adecuado en algunos casos, como se trata en el presente documento, que el ácido nucleico comprenda una o más inserciones, deleciones, inversiones y/o sustituciones.
Un ácido nucleico recombinante puede ser uno que tiene una secuencia que no existe de forma natural o tiene una secuencia que se prepara por una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de otro modo. Esta combinación artificial se realiza frecuentemente por síntesis química o, más comúnmente, por la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, por técnicas de ingeniería genética, tales como aquellos descritos en Sambrook et al., arriba. Los ácidos nucleicos se pueden construir basándose en síntesis química y/o reacciones de ligación enzimática usando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., arriba, y Ausubel et al., arriba. Por ejemplo, un ácido nucleico se puede sintetizar químicamente usando nucleótidos que existen de forma natural o nucleótidos diversamente modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado tras la hibridación (por ejemplo, derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina). Los ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden usar para generar los ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-sustituido adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, uno o más de los ácidos nucleicos se pueden comprar de empresas, tales como Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, EE. UU.).
También se desvela un ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento o una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento.
La secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas se puede hibridar en condiciones de alta rigurosidad. Por "condiciones de alta rigurosidad" se indica que la secuencia de nucleótidos se hibrida específicamente con una secuencia diana (la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento) en una cantidad que es detectablemente más fuerte que la hibridación no específica. Las condiciones de alta rigurosidad incluyen condiciones que distinguirían un polinucleótido con una secuencia complementaria exacta, o uno que contiene solo algunos desapareamientos dispersos de una secuencia aleatoria que resultó que tenía algunas regiones pequeñas (por ejemplo, 3-10 bases) que se correspondieron con la secuencia de nucleótidos. Dichas pequeñas regiones de complementariedad se funden más fácilmente que un complemento de longitud completa de 14-17 o más bases, y la hibridación de alta rigurosidad las hace fácilmente distinguibles. Las condiciones de rigurosidad relativamente alta incluirían, por ejemplo, condiciones de baja sal y/o alta temperatura, tales como las proporcionadas por aproximadamente NaCl 0,02-0,1 M o el equivalente, a temperaturas de aproximadamente 50 70 °C. Dichas condiciones de alta rigurosidad toleran poco, si algún, desapareamiento entre la secuencia de nucleótidos y el molde o la cadena diana, y son particularmente adecuadas para detectar la expresión de cualquiera de los CAR. En general, se aprecia que las condiciones se pueden volver más rigurosas mediante la adición de cantidades crecientes de formamida.
También se desvela un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 70 % o más, por ejemplo, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, o aproximadamente 99 % idéntica a cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento.
En una realización, los ácidos nucleicos se pueden incorporar en un vector de expresión recombinante. Para los fines en el presente documento, el término "vector de expresión recombinante" significa una construcción de oligonucleótido o polinucleótido genéticamente modificado que permite la expresión de un ARNm, proteína, polipéptido, o péptido por una célula hospedadora, cuando la construcción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARNm, proteína, polipéptido, o péptido, y el vector se pone en contacto con la célula en condiciones suficientes para que el ARNm, proteína, polipéptido, o péptido, se exprese dentro de la célula. Los vectores no existen de forma natural en conjunto.
Sin embargo, partes de los vectores pueden existir de forma natural. Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender cualquier tipo de nucleótidos, que incluyen, pero no se limitan a, ADN y ARN, que pueden ser monocatenarios o bicatenarios, sintetizados u obtenidos en parte de fuentes naturales, y que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados. Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender enlaces internucleotídicos que existen de forma natural o que no existen de forma natural, o ambos tipos de enlaces. Preferentemente, los enlaces nucleotídicos o internucleotídicos que no existen de forma natural o alterados no dificultan la transcripción o replicación del vector.
En una realización, el vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector adecuado de expresión recombinante, y se puede usar para transformar o transfectar cualquier célula hospedadora adecuada. Los vectores adecuados incluyen los diseñados para la propagación y expansión o para la expresión, o ambos, tales como plásmidos y virus. El vector se puede seleccionar del grupo que consiste en la serie pUC (Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, MD), la serie pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA), la serie pET (Novagen, Madison, WI), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y la serie pEX (Clontech, Palo Alto, CA).
También se pueden usar vectores de bacteriófago, tales como A
.iV
üTIO, AüTI 1, AZapII (Stratagene), EMBL4 y ANMI 149. Los ejemplos de vectores de expresión en planta incluyen pBIOl, pBI101.2, pBHOI.3, pBI121 y pBIN19 (Clontech). Los ejemplos de vectores de expresión en animal incluyen pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo (Clontech). El vector de expresión recombinante puede ser un vector vírico, por ejemplo, un vector retrovírico o un vector lentivírico. Un vector lentivírico es un vector derivado de al menos una porción de un genoma del lentivirus, que incluye especialmente un vector lentivírico autoinactivante como se proporciona en Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). Otros ejemplos de vectores de lentivirus que se pueden usar en la clínica incluyen, por ejemplo, y no a modo de limitación, la tecnología de administración génica LENTIVECTOR.RTM. de Oxford BioMedica plc, el sistema de vector LENTIMAX.TM. de Lentigen y similares. También están disponibles tipos no clínicos de vectores lentivíricos y serían conocidos por un experto en la técnica.
Se conocen en la técnica varias técnicas de transfección, en general (véase, por ejemplo, Graham et al., Virology, 52: 456-467 (1973); Sambrook et al., arriba; Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986); and Chu et al, Gene, 13: 97 (1981).
Los métodos de transfección incluyen coprecipitación con fosfato de calcio (véase, por ejemplo, Graham et al., arriba), microinyección directa en células cultivadas (véase, por ejemplo, Capecchi, Cell, 22: 479-488 (1980)), electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa et al., BioTechniques, 6: 742-751 (1988)), transferencia génica mediada por liposomas (véase, por ejemplo, Mannino et al., BioTechniques, 6: 682-690 (1988)), transducción mediada por lípidos (véase, por ejemplo, Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987)) y administración de ácido nucleico usando microproyectiles de alta velocidad (véase, por ejemplo, Klein et al, Nature, 327: 70-73 (1987)).
En una realización, los vectores de expresión recombinantes se pueden preparar usando técnicas de ADN recombinante convencionales descritas en, por ejemplo, Sambrook et al., arriba, y Ausubel et al., arriba. Las construcciones de vectores de expresión, que son circulares o lineales, se pueden preparar para contener un sistema de replicación funcional en una célula hospedadora procariota o eucariota. Los sistemas de replicación se pueden derivar, por ejemplo, de ColEl, plásmido 2 g, A, SV40, virus del papiloma bovino, y similares.
El vector de expresión recombinante puede comprender secuencias reguladoras, tales como inicio de la transcripción y traducción y codones de terminación, que son específicos del tipo de célula hospedadora (por ejemplo, bacteria, hongo, planta o animal) en que el vector se va a introducir, según convenga, y teniendo en consideración si el vector está basado en ADN o ARN. El vector de expresión recombinante puede comprender sitios de restricción para facilitar la clonación.
El vector de expresión recombinante puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de células hospedadoras transformadas o transfectadas. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocidas, por ejemplo, resistencia a antibióticos, metales pesados, etc., complementación en un hospedador auxotrófico para proporcionar prototrofia, y similares. Los genes marcadores adecuados para los vectores de expresión inventivos incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a neomicina/G418, genes de resistencia a higromicina, genes de resistencia a histidinol, genes de resistencia a tetraciclina y genes de resistencia a ampicilina.
El vector de expresión recombinante puede comprender un promotor nativo o no nativo operativamente unido a la secuencia de nucleótidos que codifica el CAR (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales del mismo), o a la secuencia de nucleótidos que es complementaria a o que se hibrida con la secuencia de nucleótidos que codifica el CAR. La selección de promotores, por ejemplo, fuerte, débil, inducible, específico de tejido y específico del desarrollo, está dentro de la experiencia habitual del experto. Similarmente, la combinación de una secuencia de nucleótidos con un promotor también está dentro de la experiencia habitual del experto. El promotor puede ser un promotor no vírico o un promotor vírico, por ejemplo, un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de RSV, o un promotor encontrado en la repetición terminal larga de los virus de células madre murinas.
Los vectores de expresión recombinantes se pueden diseñar para o expresión transitoria, para expresión estable, o para ambas. Por tanto, los vectores de expresión recombinantes se pueden preparar para expresión constitutiva o para expresión inducible.
Además, los vectores de expresión recombinantes se pueden preparar para incluir un gen suicida. Como se usa en el presente documento, el término "gen suicida" se refiere a un gen que provoca que muera la célula que expresa el gen suicida. El gen suicida puede ser un gen que confiere sensibilidad a un agente, por ejemplo, un fármaco, sobre la célula en la que se expresa el gen, y provoca que muera la célula cuando la célula se pone en contacto con o se expone al agente. Se conocen en la técnica genes suicidas (véase, por ejemplo, Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, UK), Humana Press, 2004) e incluyen, por ejemplo, el virus del herpes simple (VHS) gen de timidina cinasa (TK), citosina desaminasa, purina nucleósido fosforilasa y nitroreductasa.
Una realización proporciona además una célula hospedadora que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinantes descritos en el presente documento. Como se usa en el presente documento, el término "célula hospedadora" se refiere a cualquier tipo de célula que pueda contener el vector de expresión recombinante. La célula hospedadora puede ser una célula eucariota, por ejemplo, planta, animal, hongos, o algas, o puede ser una célula procariota, por ejemplo, bacterias o protozoos. La célula hospedadora puede ser una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente de un organismo, por ejemplo, un humano. La célula hospedadora puede ser una célula adherente o una célula suspensa, es decir, una célula que crece en suspensión. Se conocen en la técnica células hospedadoras adecuadas e incluyen, por ejemplo, células DH5a de E. coli, células de ovario de hámster chino, células VERO de mono, células COS, células HEK293, y similares. Para los fines de amplificar o replicar el vector de expresión recombinante, la célula hospedadora puede ser una célula procariota, por ejemplo, una célula DH5a. Para los fines de producir un CAR recombinante, la célula hospedadora puede ser una célula de mamífero. La célula hospedadora puede ser una célula humana. Mientras que la célula hospedadora puede ser de cualquier tipo de célula, se puede originar a partir de cualquier tipo de tejido, y puede ser de cualquier etapa de desarrollo, la célula hospedadora puede ser un linfocito de sangre periférica (PBL) o una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC). La célula hospedadora puede ser un linfocito T.
Para los fines en el presente documento, el linfocito T puede ser cualquier linfocito T, tal como un linfocito T cultivado, por ejemplo, un linfocito T primario, o un linfocito T de una línea de linfocitos T cultivados, por ejemplo, Jurkat, SupTl, etc., o un linfocito T obtenido de un mamífero. Si se obtiene de un mamífero, el linfocito T se puede obtener de numerosas fuentes, que incluyen, pero no se limitan a, sangre, médula ósea, ganglio linfático, el timo, u otros tejidos o fluidos. Los linfocitos T también se pueden estar enriquecidos o purificados. El linfocito T puede ser un linfocito T humano. El linfocito T puede ser un linfocito T aislado de un ser humano. El linfocito T puede ser cualquier tipo de linfocito T y puede ser de cualquier etapa de desarrollo, que incluye, pero no se limita a, linfocitos T de doble positivo CD4+/CD8+, linfocitos T cooperadores CD4+, por ejemplo, células Th1 y Th2, linfocitos T CD8+ (por ejemplo, linfocitos T citotóxicos), células infiltrantes de tumor, linfocitos T de memoria, células madre de memoria, es decir, Tscm, linfocitos T intactos y similares. El linfocito T puede ser un linfocito T CD8+ o un linfocito T CD4+.
En una realización, los CAR como se describen en el presente documento se pueden usar en linfocitos no T adecuados. Dichas células son aquellas con una funciona inmunoefectora, tales como, por ejemplo, linfocitos NK y linfocitos de tipo T generados a partir de células madre pluripotentes.
También se proporciona por una realización una población de células que comprende al menos una célula hospedadora descrita en el presente documento. La población de células puede ser una población heterogénea que comprende la célula hospedadora que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinantes descritos, además de al menos otra célula, por ejemplo, una célula hospedadora (por ejemplo, un linfocito T), que no comprende ninguno de los vectores de expresión recombinantes, o una célula distinta de un linfocito T, por ejemplo, un linfocito B, un macrófago, un neutrófilo, un eritrocito, un hepatocito, una célula endotelial, una célula epitelial, una célula de músculo, una célula de cerebro, etc. Alternativamente, la población de células puede ser una población sustancialmente homogénea, en la que la población comprende principalmente células hospedadoras (por ejemplo, que consisten esencialmente en) que comprenden el vector de expresión recombinante. La población también puede ser una población clonal de células, en la que todas las células de la población son clones de una única célula hospedadora que comprende un vector de expresión recombinante, de forma que todas las células de la población comprendan el vector de expresión recombinante. En una realización, la población de células es una población clonal que comprende células hospedadoras que comprenden un vector de expresión recombinante como se describe en el presente documento.
Se pueden aislar y/o purificar los CAR (incluyendo porciones funcionales y variantes de los mismos), ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras (incluyendo poblaciones de los mismos) y anticuerpos (incluyendo porciones de unión al antígeno de los mismos). Por ejemplo, una preparación de célula hospedadora purificada (o aislada) es una en la que la célula hospedadora es más pura que las células en su entorno natural dentro del cuerpo. Dichas células hospedadoras se pueden producir, por ejemplo, por técnicas de purificación estándar. En algunas realizaciones, una preparación de una célula hospedadora se purifica de forma que la célula hospedadora represente al menos aproximadamente 50 %, por ejemplo, al menos aproximadamente 70 %, del contenido de células totales de la preparación. Por ejemplo, la pureza puede ser al menos aproximadamente 50 %, puede ser superior a aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 % o aproximadamente 80 %, o puede ser aproximadamente 100 %.
E. Métodos de tratamiento
Se contempla que los CAR desvelados en el presente documento se pueden usar en métodos de prevención o tratamiento de una enfermedad en un mamífero. A este respecto, se desvela una composición para su uso en el método de tratamiento o prevención de cáncer en un mamífero, que comprende administrar al mamífero los CAR, los ácidos nucleicos, los vectores de expresión recombinantes, las células hospedadoras, la población de células, los anticuerpos y/o las porciones de unión al antígeno de los mismos, y/o las composiciones farmacéuticas en una cantidad eficaz para tratar o prevenir cáncer en el mamífero.
Un aspecto comprende además linfoagotar el mamífero antes de administrar los CAR desvelados en el presente documento. Los ejemplos de linfoagotamiento incluyen, pero pueden no limitarse a, quimioterapia de lifoagotamiento no mieloablativa, quimioterapia de lifoagotamiento mieloablativa, irradiación de cuerpo entero, etc.
Para los fines de los métodos, en donde se administran células hospedadoras o poblaciones de células, las células pueden ser células que son alógenas o autólogas para el mamífero. Preferentemente, las células son autólogas para el mamífero. Como se usa en el presente documento, alógeno significa cualquier material derivado de un animal diferente de la misma especie que el individuo al que se introduce el material. Se dice que dos o más individuos son alógenos entre sí cuando los genes en uno o más loci no son idénticos. En algunas realizaciones, el material alógeno de los individuos de la misma especie puede ser suficientemente distinto genéticamente para interaccionar antigénicamente. Como se usa en el presente documento, "autólogo" significa cualquier material derivado del mismo individuo al que se va a reintroducir después en el mismo individuo.
El mamífero denominado en el presente documento puede ser cualquier mamífero. Como se usa en el presente documento, el término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero, que incluye, pero no se limita a, mamíferos del orden de los roedores, tales como ratones y hámsteres, y mamíferos del orden de los lagomorfos, tales como conejos. Los mamíferos pueden ser del orden carnívoros, que incluye felinos (gatos) y caninos (perros). Los mamíferos pueden ser del orden artiodáctilos, que incluye bovinos (vacas) y porcinos (cerdos) o del orden perisodáctilos, que incluye equinos (caballos). Los mamíferos pueden ser del orden primates, cébidos o simioides (monos) o del orden antropoides (seres humanos y monos superiores). Preferentemente, el mamífero es un ser humano.
Con respecto a los métodos, el cáncer puede ser cualquier cáncer, que incluye cualquiera de cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiosarcoma alveolar, cáncer de vejiga (por ejemplo, carcinoma de vejiga), cáncer de huesos, cáncer cerebral (por ejemplo, meduloblastoma), cáncer de mama, cáncer de ano, canal anal, o anorrectal, cáncer de ojo, cáncer del conducto biliar intrahepático, cáncer de las articulaciones, cáncer de cuello, vesícula biliar, o pleura, cáncer de nariz, fosa nasal, u oído medio, cáncer de la cavidad bucal, cáncer de vulva, leucemia linfocítica crónica, cáncer mieloide crónico, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer de cuello uterino, fibrosarcoma, tumor carcinoide gastrointestinal, cáncer de cabeza y cuello (por ejemplo, carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas), linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, cáncer de riñón, cáncer de laringe, leucemia, tumores líquidos, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (por ejemplo, carcinoma de pulmón no de células pequeñas y adenocarcinoma de pulmón), linfoma, mesotelioma, mastocitoma, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de nasofaringe, linfoma no hodgkiniano, leucemia linfocítica crónica-B, leucemia de células pilosas, leucemia linfocítica aguda (LLA) y linfoma de Burkitt, cáncer de ovario, cáncer pancreático, peritoneo, epiplón y cáncer de mesenterio, cáncer de faringe, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer renal, cáncer de piel, cáncer de intestino delgado, cáncer de tejido blando, tumores sólidos, sarcoma sinovial, cáncer gástrico, cáncer testicular, cáncer de tiroides y cáncer de uréter.
Los términos "tratar" y "prevenir", así como palabras que proceden de las mismas, como se usa en el presente documento, no implican necesariamente 100 % o tratamiento completo o prevención. Más bien, existen grados variables de tratamiento o prevención que un experto habitual en la técnica reconoce por tener un posible beneficio o efecto terapéutico. A este respecto, los métodos pueden proporcionar cualquier cantidad o cualquier nivel de tratamiento o prevención de cáncer en un mamífero.
Además, el tratamiento o la prevención proporcionados por el método pueden incluir tratamiento o prevención de una o más afecciones o síntomas de la enfermedad, por ejemplo, cáncer, que está tratándose o se previene. Por tanto, para los fines en el presente documento, la "prevención" puede englobar retrasar la aparición de la enfermedad, o un síntoma o afección de la misma.
Otro aspecto desvela un método de detección de la presencia de cáncer en un mamífero, que comprende: (a) poner en contacto una muestra que comprende una o más células del mamífero con los CAR, los ácidos nucleicos, los vectores de expresión recombinantes, las células hospedadoras, la población de células, los anticuerpos, y/o las porciones de unión al antígeno de los mismos, o las composiciones farmacéuticas, formando así un complejo, (b) y detectar el complejo, en donde la detección del complejo es indicativa de la presencia de cáncer en el mamífero.
La muestra se puede obtener por cualquier método adecuado, por ejemplo, biopsia o autopsia. Una biopsia es la retirada de tejido y/o células de un individuo. Dicha retirada puede ser para recoger tejido y/o células del individuo para realizar experimentación en el tejido y/o células retirados. Esta experimentación puede incluir experimentos para determinar si el individuo tiene y/o está padeciendo una cierta afección o estado de enfermedad. La afección o enfermedad pueden ser, por ejemplo, cáncer.
Con respecto a un aspecto del método de detección de la presencia de un trastorno proliferativo, por ejemplo, cáncer, en un mamífero, la muestra que comprende células del mamífero puede ser una muestra que comprende células completas, lisados de las mismas, o una fracción de los lisados de las células completas, por ejemplo, una fracción nuclear o citoplásmica, una fracción de proteína completa, o una fracción de ácido nucleico. Si la muestra comprende células completas, las células pueden ser cualquier célula de mamífero, por ejemplo, las células de cualquier órgano o tejido, que incluye glóbulos sanguíneos o células endoteliales.
La puesta en contacto puede tener lugarin vitrooin vivocon respecto al mamífero. Preferentemente, la puesta en contacto esin vitro.
Por tanto, la detección del complejo puede ocurrir mediante cualquier número de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los CAR desvelados en el presente documento, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, poblaciones de células, o anticuerpos, o porciones de unión al antígeno de los mismos, descritos en el presente documento, se pueden marcar con un marcador detectable tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante) y partículas de elementos (por ejemplo, partículas de oro), como se desvela arriba.
Se conocen en la técnica métodos de ensayo de un CAR para la capacidad para reconocer células diana y para especificidad por antígenos. Por ejemplo, Clay et al., J. Immunol, 163: 507-513 (1999), enseñan métodos de medición de la liberación de citocinas (por ejemplo, interferón-y, factor estimulante de colonias de granulocitos/monocitos (GM-CSF), factor de necrosis tumoral a (TNF-a) o interleucina 2 (IL-2)). Además, se puede evaluar la función del CAR por medición de la citotoxicidad celular, como se describe en Zhao et al, J. Immunol. 174: 4415-4423 (2005).
Otro aspecto desvela el uso de los CAR, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, poblaciones de células, anticuerpos, o porciones de unión al antígeno de los mismos, y/o composiciones farmacéuticas desveladas en el presente documento, para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo, por ejemplo, cáncer, en un mamífero. El cáncer puede ser cualquiera de los cánceres descritos en el presente documento.
Se puede usar cualquier método de administración para los agentes terapéuticos desvelados, que incluye administración local y sistémica. Por ejemplo, se puede usar administración tópica, oral, intravascular tal como intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, intradérmica, intratecal y subcutánea. El modo particular de administración y la pauta posológica se seleccionarán por el profesional clínico que atiende, teniendo en cuenta los datos del caso (por ejemplo, el sujeto, la enfermedad, el estado de enfermedad implicado, y si el tratamiento es profiláctico). En casos en los que se administre más de un agente o composición, se pueden usar una o más vías de administración; por ejemplo, un agente quimioterapéutico se puede administrar por vía oral y un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno o conjugado o composición se puede administrar por vía intravenosa. Los métodos de administración incluyen inyección para la que el CAR, linfocito T con CAR, conjugados, anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno, o composiciones se proporcionan en un vehículo farmacéuticamente aceptable no tóxico tal como agua, solución salina, disolución de Ringer, disolución de dextrosa, 5 % de albúmina de suero humano, aceites no volátiles, oleato de etilo, o liposomas. En algunos aspectos, se puede usar administración local de los compuestos desvelados, por ejemplo, aplicando el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno a una región de tejido de la que se ha retirado un tumor, o una región que se sospecha que está siendo propensa al desarrollo de un tumor. En algunos aspectos, puede ser beneficiosa la liberación intratumoral sostenida (o casi tumoral) de la preparación farmacéutica que incluye una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno. En otros ejemplos, el conjugado se aplica como un colirio por vía tópica a la córnea, o por vía intravítrea en el ojo.
Los agentes terapéuticos desvelados se pueden formular en forma farmacéutica unitaria adecuada para la administración individual de dosificaciones precisas. Además, los agentes terapéuticos desvelados se pueden administrar en una dosis única o en un programa de dosis múltiple. Un programa de dosis múltiple es uno en el que un ciclo primario de tratamiento puede ser con más de una dosis separada, por ejemplo 1 -10 dosis, seguido por otras dosis administradas en intervalos de tiempo posteriores según se necesite para mantener o reforzar la acción de las composiciones. El tratamiento puede implicar dosis diarias o de múltiples días del (de los) compuesto(s) durante un periodo de algunos días a meses, o incluso años. Así, la pauta de dosificación se determinará, por tanto, al menos en parte, basándose en las necesidades particulares del sujeto que se va a tratar y dependerá del criterio del médico que administra.
Las dosificaciones típicas de los anticuerpos o conjugados pueden variar desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 30 mg/kg, tal como desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 10 mg/kg.
En ejemplos particulares, el sujeto se administra con una composición terapéutica que incluye uno o más de los conjugados, anticuerpos, composiciones, CAR, linfocitos T con CAR o agentes adicionales, en un programa de administración de múltiples días, tal como al menos dos días consecutivos, 10 días consecutivos, etc., por ejemplo, durante un periodo de semanas, meses, o años. En un ejemplo, el sujeto se administra con los conjugados, anticuerpos, composiciones o agentes adicionales durante un periodo de al menos 30 días, tal como al menos 2 meses, al menos 4 meses, al menos 6 meses, al menos 12 meses, al menos 24 meses, o al menos 36 meses.
En algunos aspectos, los métodos desvelados incluyen proporcionar cirugía, radioterapia y/o agentes quimioterapéuticos al sujeto en combinación con un anticuerpo desvelado, fragmento de unión al antígeno, conjugado, CAR o linfocito T que expresa un CAR (por ejemplo, secuencialmente, sustancialmente simultáneamente, o simultáneamente). Los expertos en la técnica conocen los métodos y las dosificaciones terapéuticas de dichos agentes y tratamientos, y se pueden determinar por un profesional clínico experto. La preparación y los programas de administración del agente adicional se pueden usar según las instrucciones del fabricante o como se determina empíricamente por el médico habitual. La preparación y los programas de administración de tal quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service, (1992) Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md.
En algunos aspectos, la terapia de combinación puede incluir la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor del cáncer adicional a un sujeto. Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos adicionales que se pueden usar con la terapia de combinación incluyen agentes de unión a microtúbulos, intercaladores o reticulantes de ADN, inhibidores de la síntesis de ADN, inhibidores de la transcripción de ADN y ARN, anticuerpos, enzimas, inhibidores de enzimas, reguladores génicos e inhibidores de la angiogénesis. Estos agentes (que se administran a una cantidad terapéuticamente eficaz) y los tratamientos se pueden usar solos o en combinación. Por ejemplo, se puede administrar cualquier agente anticancerígeno o antiangiogénico adecuado en combinación con los CAR, linfocitos T con CAR, anticuerpos, fragmento de unión al antígeno, o conjugados desvelados en el presente documento. Los expertos en la técnica conocen los métodos y las dosificaciones terapéuticas de dichos agentes, y se pueden determinar por un profesional clínico experto.
Los agentes quimioterapéuticos adicionales incluyen, pero no se limitan a, agentes alquilantes, tales como mostazas nitrogenadas (por ejemplo, clorambucilo, clormetina, ciclofosfamida, ifosfamida y melfalán), nitrosoureas (por ejemplo, carmustina, fotemustina, lomustina y estreptozocina), compuestos de platino (por ejemplo, carboplatino, cisplatino, oxaliplatino y BBR3464), busulfán, dacarbazina, mecloretamina, procarbazina, temozolomida, tiotepa y uramustina; antimetabolitos, tales como ácido fólico (por ejemplo, metotrexato, pemetrexed y raltitrexed), purina (por ejemplo, cladribina, clofarabina, fludarabina, mercaptopurina y tioguanina), pirimidina (por ejemplo, capecitabina), citarabina, fluorouracilo y gemcitabina; alcaloides de las plantas, tales como Podophyllum (por ejemplo, etopósido y tenipósido), taxano (por ejemplo, docetaxel y paclitaxel), vinca (por ejemplo, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina); antibióticos citotóxicos/antitumorales, tales como miembros de la familia de las antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, idarubicina, mitoxantrona y valrubicina), bleomicina, rifampicina, hidroxiurea y mitomicina; inhibidores de la topoisomerasa, tales como topotecán e irinotecán; anticuerpos monoclonales, tales como alemtuzumab, bevacizumab, cetuximab, gemtuzumab, rituximab, panitumumab, pertuzumab y trastuzumab; fotosensibilizadores, tales como ácido aminolevulínico, metilaminolevulinato, porfimer sodio y verteporfina; y otros agentes, tales como alitretinoína, altretamina, amsacrina, anagrelida, trióxido de arsénico, asparaginasa, axitinib, bexaroteno, bevacizumab, bortezomib, celecoxib, denileukin diftitox, erlotinib, estramustina, gefitinib, hidroxicarbamida, imatinib, lapatinib, pazopanib, pentostatina, masoprocol, mitotano, pegaspargasa, tamoxifeno, sorafenib, sunitinib, vemurafinib, vandetanib y tretinoína. Los expertos en la técnica conocen la selección y las dosificaciones terapéuticas de dichos agentes, y se pueden determinar por un profesional clínico experto.
La terapia de combinación puede proporcionar sinergia y demuestra ser sinérgica, es decir, el efecto logrado cuando los principios activos usados juntos es mayor que la suma de los efectos que resulta de usar los compuestos por separado. Se puede obtener un efecto sinérgico cuando los principios activos son: (1) coformulados y administrados o suministrados simultáneamente en una formulación de dosificación unitaria combinada; (2) suministrados por alternancia o en paralelo como formulaciones separadas; o (3) por algún otro régimen. Cuando se suministran en alternancia, se puede obtener un efecto sinérgico cuando los compuestos se administran o suministran secuencialmente, por ejemplo, por diferentes inyecciones en jeringas separadas. En general, durante la alternancia, se administra secuencialmente una dosificación eficaz de cada principio activo, es decir, en serie, mientras que, en la terapia de combinación, se administran juntas dosificaciones eficaces de dos o más principios activos.
En un aspecto, se administra una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno que se une específicamente a uno o más de los antígenos desvelados en el presente documento o un conjugado del mismo a un sujeto que tiene un tumor tras el tratamiento contra el cáncer. Después de que haya transcurrido una cantidad suficiente de tiempo para permitir que el anticuerpo administrado o fragmento de unión al antígeno o conjugado forme un inmunocomplejo con el antígeno expresado sobre la célula cancerosa respectiva, se detecta el inmunocomplejo. La presencia (o ausencia) del inmunocomplejo indica la eficacia del tratamiento. Por ejemplo, un aumento en el inmunocomplejo en comparación con un control tomado antes del tratamiento indica que el tratamiento no es eficaz, mientras que una disminución en el inmunocomplejo en comparación con un control tomado antes del tratamiento indica que el tratamiento es eficaz.
F. Composiciones biofarmacéuticas
Se desvelan en el presente documento composiciones biofarmacéuticas o biológicas (en lo sucesivo, "composiciones") para su uso en terapia génica, inmunoterapia y/o terapia de células que incluyen uno o más de los CAR desvelados, o linfocitos T que expresan un CAR, anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno, conjugados, CAR, o linfocitos T que expresan un CAR que se unen específicamente a uno o más antígenos desvelados en el presente documento, en un vehículo (tal como un vehículo farmacéuticamente aceptable). Las composiciones se pueden preparar en formas farmacéuticas unitarias para administración a un sujeto. La cantidad y el momento exacto de la administración son a criterio del profesional clínico que trata para lograr el resultado deseado. Las composiciones se pueden formular para administración sistémica (tal como intravenosa) o local (tal como intratumoral). En un ejemplo, se formula un CAR desvelado, o linfocitos T que expresan un CAR, anticuerpo, fragmento de unión al antígeno, conjugado, para administración parenteral, tal como administración intravenosa. Las composiciones que incluyen un CAR, o linfocito T que expresa un CAR, un conjugado, anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, como se desvelan en el presente documento son de uso, por ejemplo, para el tratamiento y la detección de un tumor, por ejemplo, y no a modo de limitación, un neuroblastoma. En algunos ejemplos, las composiciones son útiles para el tratamiento o la detección de un carcinoma. Las composiciones que incluyen un CAR, o linfocito T que expresa un CAR, un conjugado, anticuerpo o fragmento de unión al antígeno como se desvela en el presente documento, también son de uso, por ejemplo, para la detección de angiogénesis patológica.
Las composiciones para administración pueden incluir una disolución del CAR, o linfocito T que expresa un CAR, conjugado, anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, disuelto en un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un vehículo acuoso. Se puede usar una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, solución salina tamponada y similares. Estas disoluciones son estériles y, en general, están libres de materia no deseable. Estas composiciones se pueden esterilizar por técnicas de esterilización convencionales, bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como ajuste de pH y agentes de tamponamiento, agentes de ajuste de la toxicidad, agentes adyuvantes, y similares, por ejemplo, acetato sódico, cloruro sódico, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentración de un CAR, o linfocito T que expresa un CAR, anticuerpo o fragmento de unión al antígeno o conjugado en estas formulaciones puede variar ampliamente, y se seleccionará principalmente basándose en los volúmenes de fluido, viscosidades, peso corporal y similares según el modo particular de administración seleccionado y las necesidades del sujeto. Se conocen métodos reales de preparación de dichas formas farmacéuticas para su uso en una terapia génica, inmunoterapia y/o terapia de células, o serán evidentes para los expertos en la técnica.
Una composición típica para administración intravenosa incluye aproximadamente 0,01 a aproximadamente 30 mg/kg de anticuerpo o fragmento de unión al antígeno o conjugado por sujeto por día (o la dosis correspondiente de un CAR, o linfocito T que expresa un CAR, conjugado que incluye el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno). Los métodos reales de preparación de las composiciones administrables serán conocidos o evidentes para los expertos en la técnica y se describen con más detalle en dichas publicaciones como Remington's Pharmaceutical Science, 19a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1995).
Un CAR, o linfocito T que expresa un CAR, anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno, o conjugados, se puede proporcionar en forma liofilizada y se rehidrata con agua estéril antes de la administración, aunque también se proporcionan en disoluciones estériles de concentración conocida. Los CAR, o linfocitos T que expresan un CAR, disolución de anticuerpo o fragmento de unión al antígeno o conjugado, se añaden entonces a una bolsa de infusión que contiene 0,9 % de cloruro sódico, USP, y en algunos casos se administra a una dosis de desde 0,5 hasta 15 mg/kg de peso corporal. Está disponible experiencia considerable en la técnica en la administración de anticuerpo o fragmento de unión al antígeno y fármacos conjugados; por ejemplo, se han comercializado fármacos de anticuerpo en EE. UU. desde la autorización de RITUXAN® en 1997. Se puede administrar un CAR, o linfocito T que expresa un CAR, anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno y conjugados del mismo por infusión lenta, en vez de en una inyección intravenosa lenta o inmediata. En un ejemplo, se administra una dosis de carga más alta, siendo administradas dosis de mantenimiento posteriores a un nivel más bajo. Por ejemplo, se puede infundir una dosis de carga inicial de 4 mg/kg de anticuerpo o fragmento de unión al antígeno (o la dosis correspondiente de un conjugado que incluye el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno) durante un periodo de unos 90 minutos, seguido por dosis semanales de mantenimiento durante 4-8 semanas de 2 mg/kg infundidas durante un periodo de 30 minutos si la dosis previa fue bien tolerada.
Se pueden preparar formulaciones parenterales de liberación controlada como implantes, inyecciones aceitosas, o como sistemas en partículas. Para una amplia visión general de sistemas de administración de proteínas véase, Banga, A.J., Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA, (1995). Los sistemas en partículas incluyen microesferas, micropartículas, microcápsulas, nanocápsulas, nanoesferas y nanopartículas. Las microcápsulas contienen la proteína terapéutica, tal como una citotoxina o un fármaco, como un núcleo central. En las microesferas, el terapéutico se dispersa en toda la partícula. Partículas, microesferas y microcápsulas más pequeña de aproximadamente 1 pm, en general, se denominan nanopartículas, nanoesferas y nanocápsulas, respectivamente. Los capilares tienen un diámetro de aproximadamente 5 pm de manera que solo las nanopartículas se administran por vía intravenosa. Las micropartículas normalmente tienen alrededor de 100 pm de diámetro y se administran por vía subcutánea o por vía intramuscular. Véase, por ejemplo, Kreuter, J., Colloidal Drug Delivery Systems, J. Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, pp. 219-342 (1994); y Tice & Tabibi, Treatise on Controlled Drug Delivery, A. Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp. 315-339, (1992).
Se pueden usar polímeros para la liberación controlada de iones de los CAR, o linfocitos T que expresan un CAR, anticuerpo o fragmento de unión al antígeno o composiciones de conjugado desveladas en el presente documento.
Se conocen en la técnica diversas matrices poliméricas degradables y no degradables para su uso en la administración controlada de fármacos (Langer, Accounts Chem. Res. 26:537-542, 1993). Por ejemplo, el copolímero de bloque, poloxámero 407, existe como un líquido viscoso aún móvil a bajas temperaturas, pero forma un gel semisólido a temperatura corporal. Se ha mostrado que es un vehículo eficaz para la formulación y administración sostenida de interleucina-2 recombinante y ureasa (Johnston et al., Pharm. Res. 9:425-434, 1992; y Pec et al., J. Parent. Sci. Tech.
44(2):58-65, 1990). Alternativamente, se ha usado hidroxiapatita como un microvehículo para la liberación controlada de proteínas (Ijntema et al., Int. J. Pharm. 112:215-224, 1994). En otras realizaciones más, se usan liposomas para la liberación controlada, así como el direccionamiento de fármacos del fármaco encapsulado en lípidos (Betageri et al., Liposome Drug Delivery Systems, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA (1993)). Se conocen numerosos sistemas adicionales para la liberación controlada de proteínas terapéuticas (véase la pate de UU. n.2
5.254.342 y la patente de EE. UU. n.25.534.496).
G. Kits
En una realización, también se desvelan kits que emplean los CAR desvelados en el presente documento. Por ejemplo, kits para tratar un tumor en un sujeto, o preparar un linfocito T con CAR que expresa uno o más de los CAR desvelados en el presente documento. Los kits normalmente incluirán un anticuerpo desvelado, fragmento de unión al antígeno, conjugado, molécula de ácido nucleico, CAR o linfocito T que expresa un CAR como se desvela en el presente documento. Se pueden incluir en el kit más de uno de los anticuerpos desvelados, fragmentos de unión al antígeno, conjugados, moléculas de ácidos nucleicos, CAR o linfocitos T que expresan un CAR.
El kit puede incluir un recipiente y una etiqueta o prospecto sobre o asociado al recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden estar formados de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente normalmente contiene una composición que incluye uno o más de los anticuerpos desvelados, fragmentos de unión al antígeno, conjugados, moléculas de ácidos nucleicos, CAR o linfocitos T que expresan un CAR. En varios aspectos, el recipiente puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Una etiqueta o prospecto indica que la composición se usa para tratar la afección particular.
La etiqueta o prospecto incluirá normalmente además instrucciones para el uso de un anticuerpo desvelado, fragmentos de unión al antígeno, conjugados, moléculas de ácidos nucleicos, CAR o linfocitos T que expresan un CAR, por ejemplo, en un método de tratamiento o prevención de un tumor o de preparación de un linfocito T con CAR. El prospecto incluye normalmente instrucciones habitualmente incluidas en paquetes comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias referentes al uso de dichos productos terapéuticos. Los materiales didácticos pueden estar escritos, en una forma electrónica (tal como un disquete de ordenador o disco compacto), o pueden ser visuales (tales como archivos de vídeo). Los kits también pueden incluir componentes adicionales para facilitar la aplicación particular para la que se diseña el kit. Así, por ejemplo, el kit puede contener adicionalmente medios de detección de un marcador (tal como sustratos de enzima para marcas enzimáticas, conjuntos de filtros para detectar marcadores fluorescentes, marcadores secundarios apropiados tales como un anticuerpo secundario, o similares). Los kits pueden incluir adicionalmente tampones y otros reactivos rutinariamente usados para la práctica de un método particular. Dichos kits y contenidos apropiados se conocen bien por los expertos en la técnica.
EJEMPLOS
La presente invención se ilustra además por los siguientes ejemplos, que no se deben interpretar de ningún modo como limitaciones de imposición al alcance de la misma.
EJEMPLO 1
Aislamiento de anticuerpos específicos de CD19 de un fago completamente humano y biblioteca de ScFv presentada en levadura
MATERIALES Y MÉTODOS:
a) Producción de ScFv humano y anticuerpos específicos de CD19
2.
3. Se usó una biblioteca de presentación en fagos de ScFv humano intacto (fragmento variable de inmunoglobulina de cadena sencilla recombinante) (diversidad aproximada, 1010 especificidades únicas), construida a partir de linfocitos B de sangre periférica de 50 donantes sanos (Z. Y. Zhu y D. S. Dimitrov, datos no publicados) para la selección de ScFv para proteína CD19 humana recombinante (Miltenyi Biotec, no publicado). Se incubaron bibliotecas amplificadas de 10<12>ScFv presentados en fago con 5, 3 y 1 pg de CD19 recubierto en un volumen de 5x100 pl, distribuido igualmente en 5 pocillos de una placa de 96 pocillos durante 2 h a temperatura ambiente durante la primera, segunda y tercera rondas de bioinmunopurificación, respectivamente. Después de cada ronda de incubación, los pocillos se lavaron 5 veces para la primera ronda y 10 veces para las rondas posteriores con solución salina tamponada con fosfato que contenía 0,05 % de Tween 20 (PBST) para retirar fago no específicamente unido, el fago unido se mezcló con células competentes TG1 durante 1 hora a 37 °C, y el fago se amplificó a partir de las células infectadas y se usó en la siguiente ronda de bioinmunopurificación. Después de la tercera ronda de bioinmunopurificación, se seleccionaron aleatoriamente 380 clones de las células TG1 infectadas y cada uno se inoculó en 150 pl de medio 2YT que contenía 100 pg/ml de carbenicilina y 0,2 % de glucosa en placas de 96 pocillos usando el sistema de recogida de colonias automatizado BioRobotics BioPick (Genomic Solutions, Ann Arbor, MI). Después de que los cultivos bacterianos alcanzaran una densidad óptica a 600 nm (DO600) de 0,5, se añadieron fago auxiliar M13K07 a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 y kanamicina a 50 pg/ml (concentración final) al medio, y las placas se incubaron adicionalmente a 30 °C durante la noche en un agitador a 250 rpm. Los sobrenadantes de fago se mezclaron con 3 % de leche desnatada en PBS en una relación de volumen 4:1 y se usaron para el enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) para identificar clones de ScFv o VH que se presentan en fagos con elevada afinidad de unión a CD19. Los sobrenadantes se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente con CD19 humano recombinante recubierto a 50 ng por pocillo en placas de 96 pocillos y se lavaron cinco veces con PBST (después de la incubación durante la noche a 4 °C se bloqueó con 3 % de leche desnatada en PBS y se lavó tres veces con PBS que contenía 0,05 % de Tween 20.) El fago unido a CD19 se detectó usando anticuerpo anti-M13 de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante. Después de la incubación con el anticuerpo, el anticuerpo no específicamente unido se retiró lavando los pocillos, y se añadió el sustrato de 3,3,'5,5'-tetrametilbencidina (TMB), y se midió la absorbancia de la disolución a 450 nm (A450). Se seleccionaron los clones que se unieron a CD19 con A450 de >1,0 para caracterización adicional.
4.
b) Expresión y purificación de ScFv solubles seleccionados.
6.
7. Se secuenció el ADN de VH y VL de los clones seleccionados, y los ScFv codificados por clones con secuencias únicas se expresaron y purificaron como se describe a continuación. Los plásmidos extraídos de estos clones se usaron para la transformación de células HB2151. Se recogió una única colonia de la placa que contenía células recién transformadas, se inoculó en 200 ml de medio 2YT que contenía 100 pg/ml de ampicilina y 0,2 % de glucosa y se incubó a 37 °C con agitación a 250 rpm. Cuando la DO del cultivo a 600 nm alcanzó 0,90, se añadió isopropil-p-d-tiogalactopiranósido en una concentración final de 0,5 mM, y el cultivo se incubó adicionalmente durante la noche a 30 °C. El sedimento bacteriano se recogió después de la centrifugación a 8.000 x g durante 20 min y se resuspendió en tampón PBS que contenía 0,5 mU de polimixina B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Después de 30 min de incubación con rotación a 50 rpm a temperatura ambiente, el sedimento resuspendido se centrifugó a 25.000 x g durante 25 min a 4 °C, y el sobrenadante se usó para la purificación de ScFv usando la resina Ni-NTA siguiendo el protocolo del vendedor (Qiagen).
8.
c) Ensayo de unión de ELISA Se recubrió 50 pl de CD19 humano recombinante diluido en PBS a 2 ug/ml en una placa de 96 pocillos a 4 °C durante la noche. El ScFv purificado con las marcas His y Flag se diluyó sucesivamente y se añadió a los pocillos recubiertos con proteína diana. Después de lavar, se añadió un anticuerpo anti-Flag conjugado con HRP diluido 1:3000 durante 1 h a TA. Después de lavar, se añadió sustrato de 3,3,5,5'-tetrametilbencidina (TMB), se añadió H<2>SO<4>1 N para detener la reacción después de la incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos y se leyó la DO a 450 nm para cuantificar la capacidad relativa de ScFv para unir CD19.
10.
d) Presentación en levadura de biblioteca de scFv
12.
13. También se incorporó el mismo material de partida de ScFv que para la presentación en fagos en un sistema de presentación de ScFv de levadura. Para suplementar el análisis de scFv basado en fagos, también se cribaron bibliotecas de levadura que expresaban la biblioteca de scFv humana. Para enriquecer los scFv que se expresan en levadura que se unen a tanto CD19-Fc recombinante como a CD19 expresado sobre la superficie celular de las células CHOK1, se realizó inmunopurificación de células en CHOK1 transfectadas con células CD19. Para la primera ronda de inmunopurificación sobre la superficie celular, dos días antes de la inmunopurificación, las células CHOK1-CD19 se sembraron en placas de 6 pocillos y se cultivaron hasta el 50 % de confluencia en medio F12 K. Entonces se lavaron 2x 5 x 10<7>células de levadura con tampón PBSA y se resuspendieron en 3 ml de medio F12 K, y luego se añadió suavemente gota a gota a las células CHOK1-CD19. Después de balancear suavemente sobre hielo durante 2 horas, las células CHOK1-CD19 se lavaron entonces 3 veces con PBSA frío en hielo para retirar las células de levadura que no se unieron a CHOK1-CD19, y entonces se usó 0,05 % de tripsina-EDTA (Gibco) para disociar las células CHOK1-CD19 y células de levadura unidas de la placa. La mezcla de células que contenía tanto la levadura como las células CHOK1 se inoculó entonces en 10 ml de medio SDCAA y se amplificó durante la noche a 30 °C y luego se indujo en medio SGCAA a 30 °C durante 16 horas. Para la segunda ronda de inmunopurificación de células, se realizó un protocolo similar como antes, pero se usaron condiciones de lavado más rigurosas. Este método de inmunopurificación dio el ligante m9217. La caracterización adicional de este ligante, así como otros de la presentación en fagos, indicó que se requirió maduración por afinidad, ya que las características biológicas del CAR creadas a partir de estos resultados no eran todavía óptimas.
14.
Para aumentar la afinidad de m19217, se creó una biblioteca de scFv mutante m19217 de presentación en levadura usando PCR propensa a error para crear mutaciones puntuales aleatorias en secuencias de genes de scFv. Después de la electroporación, la biblioteca de mutantes resultante se cultivó entonces durante la noche a 30 °C durante 16 horas en medio SDCAA y luego se cambió a medio SGCAA a 30 °C durante otras 16 horas. La biblioteca de mutantes se clasificó entonces a través de MACS (columna inmunomagnética, Miltenyi Biotec) con CD19-Fc como antígeno de captura para reducir el tamaño de la biblioteca y para aumentar la población de mutantes que se podría unirse a CD19-Fc. Entonces se seleccionaron los ligantes más fuertes por tinción doble de los conjuntos con Antic-Myc-Alexa 488 y CD19-Fc/AntiHu-Fc y seleccionando los ligantes que tuvieron las mayores afinidades de unión, así como niveles de expresión de c-Myc. Este proceso se repitió entonces dos veces más, hasta que la citometría de flujo de partículas de levadura con antígeno fluorescentemente marcado dio afinidades de unión promedio de los conjuntos de mutantes que aumentaron con respecto a la construcción inicial. Se estimaron las afinidades de unión por citometría de flujo de conjuntos de levadura usando cantidades decrecientes de CD19 marcado. Este proceso produjo un aumento de CE50 (concentración eficaz para el 50 % de la unión de CD19 marcado en ScFv de presentación en levadura) para M19217 de 0,5 ug/ml a una afinidad de <0,01 ug/ml para los ligantes madurados por afinidad (M19217-1, 19217-2, M19217-7, M19217-23, M19217-29, M19217-38, M19217-40).
RESULTADOS:
Debido a los retos únicos de la estructura de CD19, los candidatos a presentación en fagos no dieron construcciones de CAR biológicamente funcionales y así la identificación de ScFv que produjo ligantes biológicamente activos se generaron por presentación en levadura. Basándose en el análisis de citometría de flujo de ScFv presentado en levadura, se identificaron ocho clones de ScFv específicos de CD19 humano recombinante y se marcaron como ligantes de ScFv anti-CD19 humano M19217 (LTG2050, clon fundador, CE50 de 0,5 ug/ml) y los siguientes ligantes madurados por afinidad (CE50 <0,01 ug/ml): M19217-1 (LTG2065), M19217-2 (LTG2066), M19217-7 (LTG2067), M19217-23 (LTG2068), M19217-29 (LTG2069), M19217-38 (LTG2070) y M19217-40 (LTG2071), respectivamente. La generación de receptores de antígeno quimérico que expresan ligantes anti-CD19 humanos LTG2050, LTG2065, LTG2066, LTG2067, LTG2068, LTG2069, LTG2070 y LTG2071 se expone brevemente en el Ejemplo 2, abajo.
EJEMPLO 2
CAR que expresan secuencias de unión completamente humanas anti-CD19.
CD19 de Homo sapiens (B4, CVID3, Leu-12) es una glucoproteína de la superficie celular bien investigada expresada en leucemias y linfomas de linfocitos B. Están siendo evaluados al menos dos conjugados de anticuerpo-fármaco (SGN-CD19A Denintuzumab Mafodotin (Seattle Genetics) y SAR3419 Coltuximab Ravtansine en ensayos clínicos de fase II. Un estudio de fase uno de SGN-19A mostró un 35 % de CRc en el grupo óptimo de tratamiento (Fathi AT, Borate U, DeAngelo DJ, O'Brien MM, Trippett T, Shah BD, Hale GA, Foran JM, Silverman LB, Tibes R, Cramer S, Pauly M, Kim S, Kostic A, Huang X, Pan Y, Chen R, 2015, Blood 126:1328). Sin embargo, debido a los decepcionantes resultados de la fase II para SAR3419, el desarrollo queda suspenso (Coiffer B, Thieblemont C, de Guibert S, Dupuis J, Ribrag V, Bouabdallah R, Morschhauser F, Navarro R, Le Gouill S, Haioun C, Houot R, Cassasnovas O, Holte H, Lamy T, Broussais F, Payrard S, Hatteville L, Tilly H, 2016, Bt J Haematolo 173:722-30). Se trató anteriormente el uso de un anticuerpo biespecífico anti-CD3/anti-CD19 (Blinotumomab). Dados los avances actuales con la terapia basada en linfocitos T con CAR CD19, el mejor enfoque es ciertamente la inmunoterapia basada en células y las construcciones de CAR presentadas aquí son un nuevo enfoque innovador para crear e implementar nuevos restos de unión a CD19 derivados de secuencias humanas.
Las novedosas construcciones de T-CAR anti-CD19 descritas aquí tienen altos niveles de expresión en la superficie celular en linfocitos T humanos primarios y específicas y potentes funciones citotóxicas y de citocina contra células tumorales CD19-positivas. Los CAR CD19 se diseñaron usando secuencias de unión a CD19 derivadas de candidatos a ScFv identificados por presentación en fagos, como en el Ejemplo 1, y para la caracterización se clonaron en vectores de expresión lentivíricos que contuvieron dominios estructurales y de señalización seleccionados bajo el control del promotor de EF1a y se probaronin vitropara la eficiencia de transducción, función de eliminación y producción de citocinas en tanto estirpes celulares modelo como linfocitos T humanos primarios. La Tabla 1 resume la nomenclatura usada. La construcción de CAR LTG n.° 1538 es el comparador relevante, ya que esta secuencia derivada de ratón es el actual ligante empleado en desarrollo comercial (véase KTE-C19, Kite Pharma y CTL019, Novartis).
Tabla 1 - Números de construcciones LTG y designaciones de ligantes de ScFv correspondientes usados en el diseño de CAR CD19 completamente humanos
MATERIALES Y MÉTODOS:
(a) Estirpes celulares
Se compraron estirpe celular de linfoma de Burkitt Raji y estirpe de leucemia mielógena crónica K562 de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA). Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 complementado con 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS, Hyclone, Logan, UT) y L-Glutamax 2 mM (Thermo Fisher Scientific, Grand Island, NY). Se compró la línea de riñón embrionario humano 293T de ATCC y se propagó en medio CD FortiCho (Gibco/Thermo Fisher Scientific, Grand Island, NY). Se generaron clones unicelulares de estirpes celulares que expresan luciferasa por transducción estable de líneas tumorales no mutantes con vector lentivírico que codifica luciferasa de luciérnaga (Lentigen Technology, Inc., Gaithersburg, MD), seguido de la clonación y selección de clones positivos para luciferasa.
(b) Creación de receptor de antígeno quimérico (CAR) - vectores de expresión
Se obtuvieron secuencias de dominios de unión al antígeno de CAR, ScFv, de fragmentos ScFv anti-CD19 humanos. Se generaron construcciones de T-CAR enlazando la secuencia del ligante en marco con dominios de enlace y transmembranarios de CD8a (secuencia de UniProt ID P01732, aa 138-206), y entonces con el dominio de señalización de 4-1BB (CD137, aa 214-255, UniProt secuencia ID Q07011) y el dominio de señalización de CD3 zeta (CD247, aa 52-163, ID de secuencia de ref.: NP_000725.1). Las secuencias de construcciones de CAR se clonaron en un esqueleto de plásmido lentivírico de tercera generación (Lentigen Technology Inc., Gaithersburg, MD). Se generaron sobrenadantes que contenían el vector lentivírico (LV) por transfección transitoria de células HEK 293T y el vector sedimentó por centrifugación de sobrenadantes que contenían vector lentivírico y se almacenó a -80 °C.
(c) Purificación y transducción de linfocitos T primarios
Se purificaron linfocitos T primarios humanos de voluntarios sanos de sangre completa o capas leucocíticas (comprados de proveedores comerciales con consentimiento por escrito del donante) usando selección por perlas inmunomagnéticas de células CD4+ y CD8+ según el protocolo del fabricante (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). Los linfocitos T se cultivaron en medio TexMACS complementado con 200 UI/ml de IL-2 a una densidad de 0,3 a 2 x 106 células/ml, se activaron con reactivo CD3/CD28 M<a>CS® GMP T Cell TransAct (Miltenyi Biotec) y se transdujeron en el día 2 con vectores lentivíricos que codificaban construcciones de CAR en presencia de 10 ug/ml de sulfato de protamina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante la noche, y los medios se cambiaron en el día 3. Los cultivos se propagaron en medio TexMACS complementado con 200 UI/ml de IL-2 hasta que se recogieron en el día 8-12.
(d) Ensayos de efectores inmunitarios (CTL y citocina)
Para determinar la citotoxicidad mediada por células (ensayo CTL), 5.000 células diana transducidas establemente con luciferasa de luciérnaga se combinaron con linfocitos T con CAR en diversas relaciones entre efectoras y diana y se incubaron durante la noche. Se añadió reactivo SteadyGlo (Promega, Madison WI) a cada pocillo y se cuantificó la luminiscencia resultante como recuentos por segundo (CPS de muestra). Se usaron pocillos de solo diana (CPS máx) y pocillos de solo diana más 1 % de Tween-20 (CPS mín) para determinar el intervalo del ensayo. Se calculó el porcentaje de lisis específica como: (1-(CPS de muestra - CPS mín)/(CPS máx - CPS mín)). Se retiraron los sobrenadantes de cocultivos en la relación E:T de 10:1 y se analizaron por ELISA (eBioscience, San Diego, CA) para concentración de IFNy, TNFa e IL-2.
(e) Análisis de citometría de flujo
Para la tinción de células, se recogió medio millón de linfocitos T-CAR transducidos de cultivo, se lavaron dos veces en tampón frío AutoMACS complementado con 0,5 % de albúmina de suero bovino (Miltenyi Biotec) y se detectó la expresión superficial de CAR por tinción con el péptido CD19-Fc (R&D, Mineápolis, MN), seguido por conjugado anti-Fc-AF647 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Se usaron células no transducidas como controles negativos. Se excluyeron las células muertas en todos los estudios por tinción con 7AAD (BD Biosciences, San Jose, CA). Las células se lavaron dos veces y se resuspendieron en 200 ul de tampón de tinción antes del análisis cuantitativo por citometría de flujo. El análisis de citometría de flujo se realizó en un analizador MACSQuant®10 (Miltenyi Biotec), y los gráficos de datos se generaron usando el software FlowJo (Ashland, OR).
RESULTADOS:
Para evaluar las novedosas secuencias de unión a ScFv completamente humano anti-CD19, las construcciones de CAR se diseñaron incorporando cada una de las secuencias de ScFv, Tabla 1, ScFv1 (M19217), ScFv2 (M19217-1), ScFv3 (M19217-2), ScFv4 (M19217-7), ScFv5 (M19217-23), ScFv6 (M19217-29), ScFv7 (M19217-38), ScFv8 (M19217-40), como un dominio de unión al antígeno de tumor. En cada diseño de CAR, el dominio que se dirige a tumor fue seguido por un conector y dominios transmembranarios derivados de la proteína CD8 humana, un dominio coestimulante de 4-1BB y un dominio de señalización de CD3 zeta (Tabla 2 abajo). La construcción de CAR que codifica la secuencia del ligante de FMC63 derivado de inmunoglobulina murina se usó como control positivo.
Tabla 2: Lista de construcciones de CAR que se diri en a CD19
Linfocitos T transducidos con receptores de antígeno quimérico anti-CD19 demuestran expresión superficial y actividad citolítica.
a) Expresión superficial de CAR anti-CD19
Para evaluar los novedosos CAR anti-CD19, se generaron vectores lentivíricos (LV) que codificaban construcciones de CAR bajo el control del promotor EF1a humano como se describe enMateriales y métodos.Entonces, linfocitos T primarios humanos derivados de donantes sanos se transdujeron con vectores lentivíricos que codificaban CAR. Las células no transducidas del mismo donante (NT) o células transducidas con GFP del mismo donante sirvieron de controles negativos. Los datos son representativos de los resultados de al menos 3 ensayos de diferentes donantes.
Los linfocitos T se activaron en el día de cultivo 0 con reactivo de linfocitos T TransAct (acoplamiento activo de antígenos CD3 y CD28, Miltenyi Biotec, Inc.) en presencia de IL-2 como se describe en Materiales y métodos. En el día de cultivo 8-10, la expresión de CAR anti-CD19 en la superficie de linfocitos T se detectó por péptido CD19-Fc seguido por anti-Fc-AF647 y se analizó por citometría de flujo. Las construcciones de CAR anti-CD19 seleccionaron cada expresión de CAR superficial demostrada. Usando linfocitos T no transducidos como control negativo (0 %), se observaron los siguientes niveles de expresión de CAR: LTG1538, 60 %; LTG2050, 46 %; LTG2065, 64 %; LTG2066, 21 %; LTG2067, 81 %; LTG2068, 54 %; LTG2069, 68 %; LTG2070, 47 %; LTG2071,21 %.
b) Ensayo citolítico y ensayo de citocinas de CAR anti-CD19
Para demostrar la función citolítica de los linfocitos T-CAR generados, se realizó un ensayo de destrucción basado en luciferasa combinando CAR-T con células Raji-luc CD19-positivas, células Reh-luc CD19-positivas, K562-luc CD19-negativas o células 293T-luc CD19-negativas en relaciones E:T de 40:1, 20: 1 o 10: 1 en ensayos de destrucción celular durante la noche como se describe enMateriales y métodos(Figura 4). Las construcciones seleccionadas (LTG2050, LTG2065-2071) mostraron destrucción tumoral específica de CD19 dependiente de la dosis. Entonces, los presentes inventores midieron la concentración de citocinas inflamatorias IFN-gamma, TNF-alfa e IL-2 secretadas por linfocitos T-CAR transducidos con construcciones de CAR19, cuando se expusieron a células tumorales de células CD19-positivas (Figura 5). Se incluyeron controles de linfocitos T-CAR solo para cada construcción, para probar niveles basales de producción de citocina. Los niveles de TNF-alfa, IFN-gamma e IL-2 fueron fuertemente inducidos por linfocitos T expuestos a células Raji CD19+. Además, ninguna de las construcciones demostró producción de citocinas por encima del nivel basal en ausencia de dianas de células tumorales. Por lo tanto, las construcciones de T-CAR LTG2050, LTG2065-2071 son específicas de líneas tumorales CD19+. Es interesante señalar que la construcción LTG2050, a pesar de ser eficiente en la destrucciónin vitrode estirpes celulares CD19-positivas, elaboró bajos niveles de IL-2 como se detecta por ELISA. Por lo tanto, el diseño de Ca r y la elección de ligantes no son triviales, ya que algunos ligantes son activos en un formato de IgG o ScFv soluble y susceptibles a la expresión sobre la superficie de linfocitos T en un formato de T-CAR, sin embargo, son ineficientes en la destrucción o producción de citocinas cuando se coincuban con tumores CD19-positivos. Los ligantes que no se expresaron sobre la superficie de linfocitos T en los vectores de expresión de CAR de los inventores, o que no mostraron una fuerte actividad lítica contra estirpes celulares CD19-positivas, no están incluidos en el presente documento, aunque muchos se descubrieron durante el cribado.
En resumen, se demostró la alta funcionalidad de novedosas construcciones de CAR anti-CD19 completamente humanas LTG2050, LTG2065, LTG2066, LTG2067, LTG2068, LTG2069, LTG2070 y LTG2071 (Tabla 1 abajo). Todas las construcciones de CAR, excepto LTG2050, fueron superiores al control positivo, FMC63 murino (LTG1538), y así se espera que tengan actividad terapéutica más potente.
SECUENCIAS DE LA DIVULGACIÓN
Las secuencias nucleicas y de aminoácidos enumeradas a continuación se muestran usando abreviaturas de letras estándar para bases de nucleótidos, y código de tres letras para aminoácidos, como se define en el artículo 37 del C.F.R. 1.822. Solo se muestra una cadena de cada secuencia del ácido nucleico, pero la cadena complementaria se entiende como incluida por cualquier referencia en la cadena presentada. En el listado de secuencias adjunto:
SEQ ID NO: 1secuencia de nucleótidos del dominio de unión a ScFv1 reactivo con CD19 (LTG2050)
GAGGT CCAGCT GGT ACAGT CT GGAGCT GAGGT GAAGAAGCCT GGGGCC T CAGT G AAGGT CT CCTGCAAGGCTT CT GGAT ACACCTT CACCAGCT ACT A T AT GCACTGGGT GCGACAGGCCCCT GGACAAGGGCTT GAGT GGAT GGG AAT AAT CAACCCT AGT GGTGGT AGCACAAGCT ACGCACAGAAGTT CCAG GGCAGAGT CACCAT GACCAGGGACACGT CCACGAGCACAGT CT ACAT G GAGCT GAGCAGCCT GAGAT CT GAGGACACGGCCGT GT ATT ACT GT GCG AGAT CGGAT CGGGGAATT ACCGCCACGGACGCTTTT GAT AT CTGGGGCC AAGGGACAATGGT CACCGT CT CTT CAGGAGGT GGCGGGT CT GGT GGAG GCGGT AGCGGT GGT GGCGGAT CCCAGT CT GT GCT GACT CAGCCACCCT CGGT GT CAGT GGCCCCAGGGCAGACGGCCAAGATT ACCT GT GGGGGAA GT GACATT GGAAAT AAAAAT GT CCACT GGT ACCAGCAGAAGCCAGGCCA GGCCCCT GT CCT GGT CGT CT AT GAT GATT ACGACCGGCCCT CAGGGAT C CCT GAGCGATT CT CT GGCT CCAACT CT GGGGACGCGGCCACCCT GACG AT CAGCACGGT CGAAGT CGGGGAT GAGGCCGACT ATTT CT GT CAGGT GT GGGACAGT AGT GGT GAT CCTT ATTGGGT GTT CGGCGGAGGGACCCAGC T CACCGTTTT AGGT
SEQ ID NO: 2secuencia de aminoácidos del dominio de unión a ScFv1 reactivo con CD19 (LTG2050)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMG IINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSD RGITATDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSV APGQTAKITCGGSDIGNKNVHWYQQKPGQAPVLWYDDYDRPSGIPERFS GSNSGDAATLTISTVEVGDEADYFCQVWDSSGDPYWVFGGGTQLTVLG
SEQ ID NO: 3secuencia de nucleótidos del dominio de unión a ScFv2 reactivo con CD19 (LTG2065) GAGGT CCAGCT GGT ACAGT CT GGAGCT GAGGT GAAGAAGCCT GGGGCC
T CAGT G AAGGT CT CCTGCAAGGCTT CTGGAT ACACCTT CACCAGCT ACT A T AT GCACTGGGT GCGACAGGCCCCT GGACAAGGGCTT GAGT GGAT GGG ATT AAT CAACCCT AGT GGTGGT AGCACAAGCT ACGCACAGAAGTT CCAG GGCAGAGT CACCAT GACCAGGGACACGT CCACGAGCACAGT CT ACAT G GAGCT GAGCAGCCT GAGAT CT GAGGACACGGCCGT GT ATT ACT GT GCG AGAT CGGAT CGGGGAATT ACCGCCACGGACGCTTTT GAT AT CTGGGGCC AAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGCGGAGGAGGCTCCGGGGGAG GAGGTTCCGGGGGCGGGGGTTCCCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCT
CGGT GT CAGT GGCCCCAGGGCGGAT GGCCAAGATT ACCT GT GGGGGAA GTGACATTGGAAATAAAAATGTCCACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCA GGCCCCT GT CCT GGTT GT CT AT GAT GATT ACGACCGGCCCT CAGGGAT C CCT GAGCGATT CT CT GGCT CCAACT CT GGGGACGCGGCCACCCT GACG AT CAGCACGGT CGAAGT CGGGGAT GAGGCCGACT ATTT CT GT CAGGT GT GGGACGGT AGTGGT GAT CCTT ATTGGAT GTTCGGCGGAGGGACCCAGC T CACCGTTTT AGGT
SEQ ID NO: 4secuencia de aminoácidos del dominio de unión a ScFv2 reactivo con CD19 (LTG2065)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMG LINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSD RGITATDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSV APGRMAKITCGGSDIGNKNVHWYQQKPGQAPVLWYDDYDRPSGIPERFS GSNSGDAATLTISTVEVGDEADYFCQVWDGSGDPYWMFGGGTQLTVLG
SEQ ID NO: 5secuencia de nucleótidos del dominio de unión a ScFv3 reactivo con CD19 (LTG2066)
GAGGT CCAGCT GGT ACAGT CT GGAGCT GAGGT GAAGAAGCCT GGGGCC T CAGT GAAGGT CT CCT GCAAGGCTT CCGGAT ACACCTT CACCAGCT ACT ACAT GCACT GGGT GCGACAGGCCCCTGGACAAGGGTTT GAGT GGATGG GATT AAT CAACCCT AGTGGT AGT AGCACAAGCT ACGCACAGAAGTT CCA GGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTCTACAT GGAGCT GAGCAACCT GAGAT CT GAGGACACGGCCGT GT ATT ACT GTGC GAGAT CGGAT CGGGGAATT ACCGCCACGGACGCTTTT GAT AT CT GGGGC CAAGGGACAATGGT CACCGT CT CTT CAGGCGGAGGAGGCT CCGGGGGA GGAGGTT CCGGGGGCGGGGGTT CCCAGT CT GT GCT GACT CAGCCACCC TCGGTGCCAGTGGCCCCAGGGCAGACGGCCAAGATTATCTGTGGGGGA AGT GACATTGGAAAT AAAAAT GT CCACTGGT ACCAGCAGAAGCCAGGCC AGGCCCCT GT CCT GGT CGT CT AT GAT GACT ACGACCGGCCCT CAGGGAT CCCT GAGCGATT CT CT GGCT CCAACT CT GGGGACGCGGCCACCCT GAC GAT CAGCACGGTT GAAGT CGGGGAT GAGGCCGACT ATTT CT GT CAGGT G T GGGACGGT AGTGGT GAT CCTT ATTGGGT GTT CGGCGGAGGGACCCAG CT CACCGT CTT AGGT
SEQ ID NO: 6secuencia de aminoácidos del dominio de unión a ScFv3 reactivo con CD19 (LTG2066)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGFEWMG LINPSGSSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSNLRSEDTAVYYCARSD RGITATDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVPV APGQTAKIICGGSDIGNKNVHWYQQKPGQAPVLVVYDDYDRPSGIPERFSG SNSGDAATLTISTVEVGDEADYFCQVWDGSGDPYWVFGGGTQLTVLG
SEQ ID NO: 7secuencia de nucleótidos del dominio de unión a ScFv4 reactivo con CD19 (LTG2067)
GAGGT CCAGCTGGT ACAGT CT GGAGCT GAGGT GAACAAGCCT GGT GCC T CAGT GAAGGT CT CCTGCAAGGCTT CT GGAT ACACCTT CACCAGCT ACT AT AT GCACT GGGT GCGACAGGCCCCT GGACAAGGGCTT GAGT GGAT GG GAAT GAT CAACCCT AGT GGTGGT AGCACAAGCT ACGCACAGAAGTT CCA GGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTCTACAT
GGAGCT GAGCAGCCT GAGAT CT GAGGACACGGCCGT GT ATT ACT GTGC
GAGAT CGGAT CGGGGAATT ACCT CCACGGACGCTTTT GAT AT CT GGGGC CAAGGGACAATGGT CACCGT CT CTT CAGGCGGAGGAGGCT CCGGGGGA GGAGGTT CCGGGGGCGGGGGTT CCCAGT CT GT GCT GACT CAGCCACCC T CGGT GT CATT GGCCCCAGGGCAGACGGCCAAGATT ACCT GT GGGGGA AGT GACATTGGAAAT AAAAAT GT CCACTGGT ACCAGCAGAAGCCAGGCC AGGCCCCT GT CCT AGT CGT CT AT GAT GATT ACAACCGGCCCT CAGGGAT CCCT GAGCGATT CT CT GGCT CCAACT CT GGGGACT CAGCCACCCT GACG AT CAGCACGGT CGAAGT CGGGGAT GAGGCCGACT ATTT CT GT CAGGT GT GGGACGGT AGTGGT GAT CCTT ATTGGGT GTT CGGCGGAGGGACCCAGC T CACCGTTTT AGGT
SEQ ID NO: 8secuencia de aminoácidos del dominio de unión a ScFv4 reactivo con CD19 (LTG2067)
EVQLVQSGAEVNKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHVWRQAPGQGLEWMG MINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSD RGITSTDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSL APGQTAKITCGGSDIGNKNVHWYQQKPGQAPVLWYDDYNRPSGIPERFS GSNSGDSATLTISTVEVGDEADYFCQVWDGSGDPYVWFGGGTQLTVLG
SEQ ID NO: 9secuencia de nucleótidos del dominio de unión a ScFv5 reactivo con CD19 (LTG2068)
GAGGT CCAGCT GGT ACAGT CT GGAGCT GAGGT GAAGAAGCCT GGGGCC T CAGT GAAGGT CT CCT GCAAGGCAT CTGGAT ACACCTT CACCGGCT ACT AT AT GCACT GGGT GCGGCAGGCCCCTGGACAAGGGCTT GAGT GGAT AG GATT AAT CAACCCT AGT GGTGGT AGCACAAGCT ACGAACAGAAGTT CCA GGGCAGAGT CGCCAT GACCAGGGACACGT CAACGAGCACAGT CT ACAT GGAGCT GAGCAGCCT GAGAT CT GAGGACACGGCCGT GT ATT ACT GTGC GAGAT CGGAT CGGGGAATT ACCGCCACGGACGCTTTT GAT AT CT GGGGC CAAGGGACAATGGT CACCGT CT CTT CAGGCGGAGGAGGCT CCGGGGGA GGAGGTT CCGGGGGCGGGGGTT CCCAGT CT GT GCT GACT CAGCCACCC T CGGT GT CAGT GGCCCCAGGGCAGACGGCCAAGATT ACCT GT GGGGGA AGT GACATTGGAGAT AAAAAT GT CCACT GGT ACCAGCAGAAGCCAGGCC AGGCCCCT GT CCT GGT CGT CT AT GAT GATT ACGACCGGCCCT CAGGGAT CCCT GAGCGATT CT CT GGCT CCAACT CTGGGGACGCGGCCACCCT GAC GAT CAGCACGGT CGAAGT CGGGGAT GAGGCCGACT ATTT CT GT CAGGT GTGGGACGGT ATT GGT GAT CCCT ATT GGGT GTT CGGCGGAGGGACCCA GCT CACCGTTTT AGGT
SEQ ID NO: 10secuencia de aminoácidos del dominio de unión a ScFv5 reactivo con CD19 (LTG2068)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWIGL INPSGGSTSYEQKFQGRVAMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSDR GITATDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSVA PGQTAKITCGGSDIGDKNVHWYQQKPGQAPVLWYDDYDRPSGIPERFSG SNSGDAATLTISTVEVGDEADYFCQVWDGIGDPYWVFGGGTQLTVLG
SEQ ID NO: 11secuencia de nucleótidos del dominio de unión a ScFv6 reactivo con CD19 (LTG2069) GAGGT CCAGCT AGT ACAGT CT GGAGCT GAGGT GAAGAAGCCTGGGGCC
T CAGT G AAGGT CT CCTGCAAGGCTT CT GGAT ACACCTT CACCAGCT ACT A T AT GCACTGGGT GCGACAGGCCCCT GGACAAGGGCTT GAGT GGAT GGG AAT G AT C AACCCT AGTGGTGGT AG C AC AAGC T AC G C AC AG AAGTT C C AG GGCAGAGT CACCAT GACCAGGGACACGT CCACGAGCACAGT CT ACAT G GAGCT GAGCAGCCT GAGAT CT GAGGACACGGCCGT GT ATT ACT GT GCG AGAT CGGAT CGGGGAATT ACCGCCACGGACGCTTTT GAT AT CTGGGGCC AAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGCGGAGGAGGCTCCGGGGGAG GAGGTTCCGGGGGCGGGGGTTCCCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCT CGGT GT CAGT GGCCCCAGGGCAGACGGCCAAGATT ACCT GT GGGGGAA GT GACATT GGAAAT AAAAAT GCCCACT GGT ACCAGCAGAAGCCAGGCCA GGCCCCT GT CCT GGT CGT CT AT GAT GATT ACGACCGGCCCT CAGGGAT C T CT GAGCGATT CT CT GGCT CCAACT CT GGGGACGCGGCCACCCT GACG AT CAGCACGGT CGAAGT CGGGGAT GAGGCCGACT ATTT CT GT CAGGT GT GGGACGGT AGT GGT GAT CCTTTTT GGGT GTT CGGCGGAGGGACCCAGC T CACCGTTTT AGGT
SEQ ID NO: 12secuencia de aminoácidos del dominio de unión a ScFv6 reactivo con CD19 (LTG2069)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHW VRQAPGQGLEWMG MINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSD RGITATDAFDIW GQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSV APGQTAKITCGGSDIGNKNAHW YQQKPGQAPVLW YDDYDRPSGISERFS GSNSGDAATLTISTVEVGDEADYFCQVWDGSGDPFWVFGGGTQLTVLG
SEQ ID NO: 13secuencia de nucleótidos del dominio de unión a ScFv7 reactivo con CD19 (LTG2070)
GAGGT CCAGCTGGT ACAGT CT GGAGCT GAGGT GAAGAGGCCTGGGGCC T CAGT G AAGGT CT CCTGCAAGGCTT CT GGAT ACACCTT CACCAGCT ACT A T AT GCACTGGGT GCGACAGGCCCCT GGACGAGGGCTT GAGT GGAT GGG ATT AAT CAACCCT AGT GGTGGT AGCACAAGCT ACGCACAGGAGTT CCAG GGCAGAGT CACCAT GACCAGGGACAT GT CCACGAGCACAGT CT ACAT G GAGCT GAGCAGCCT GAGAT CT GAGGACACGGCCGT GT ATT ACT GT GCG AGAT CGGAT CGGGGAATT AGCGCCACGGACGCTTTT GAT AT CT GGGGCC AAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGCGGAGGAGGCTCCGGGGGAG GAGGTTCCGGGGGCGGGGGTTCCCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCT CGGT GT CAGT GGCCCCAGGGCAGATGGCCAAGATT ACCT GT GGGGGAA GT GACATT GGAAAT AAAAAT GT CCACT GGT ACCAGCAGAAGCCAGGCCA GGCCCCT GT CCT GGT CGT CT AT GAT GATT ACAACCGGCCCT CAGGGAT C CCT GAGCGATT CT CT GGCT CCAACT CT GGGGACGCGGCCACCCT GACG AT CAGCACGGT CGAAGT CGGGGAT GAGGCCGACT ATTT CT GT CAGGT AT GGGACGGT AGTGGT GAT CCTT ATTGGGT GTT CGGCGGAGGGACCCAGC T CACCG ATTT AGGT
SEQ ID NO: 14secuencia de aminoácidos del dominio de unión a ScFv7 reactivo con CD19 (LTG2070)
EVQLVQSGAEVKRPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHVWRQAPGRGLEWMG LINPSGGSTSYAQEFQGRVTMTRDMSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSD RGISATDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSV APGQMAKITCGGSDIGNKNVHW YQQKPGQAPVLW YDDYNRPSGIPERFS GSNSGDAATLTISTVEVGDEADYFCQVWDGSGDPYVWFGGGTQLTDLG
SEQ ID NO: 15secuencia de nucleótidos del dominio de unión a ScFv8 reactivo con CD19 (LTG2071) GAGGT CCAGCTGGT ACAGT CT GGAGCT GAGGT GAAGAGGCCTGGGGCC T CAGT G AAGGT CT CCTGCAAGGCTT CT GGAT ACACCTT CACCAGCT ACT A T AT GCACTGGGT GCGACAGGCCCCT GGACAAGGGCTT GT GT GGAT GGG ATT AAT CAACCCT AGT GGT GGCAGCACAAGCT ACGCACAGAAGTT CCAG GGCAGAGT CACCAT GACCAGGGACACGT CCACGAGCACAGT CT ACAT G GAGCT GAGCAGCCT GAGAT CT GAGGACACGGCCGT GT ATT ACT GT GCG AGAT CGGAT CGGGGAATT ACCGCCACGGACGCTTTT GAT AT CTGGGGCC AAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGCGGAGGAGGCTCCGGGGGAG GAGGTTCCGGGGGCGGGGGTTCCCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCT CGGT CT CAGTGGCCCCAGGGCAGACGGCCAAGACT ACCT GT GGGGGAA GT GACATT GGAAAT AAAAAT GT CCACT GGT ACCAGCAGAAGCCAGGCCA GGCCCCT GT CCT GGT CGT CT AT GAT GATT ACGACCGGCCCT CAGGGAT C CCT GAGCGATT CT CT GGCT CCAACT CT GGGGACGCGGCCACCCT GACG AT CAGCACGGT CGAAGT CGGGGAT GAGGCCGACT AT GT CT GT C AGGT G TGGGACGGTAGTGGTGATCCTTATTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCCAG CT CACCGTTTT AGGT
SEQ ID NO: 16secuencia de aminoácidos del dominio de unión a ScFv8 reactivo con CD19 (LTG2071)
EVQLVQSGAEVKRPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHVWRQAPGQGLVWMG LINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSD RGITATDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSV APGQTAKTTCGGSDIGNKNVHWYQQKPGQAPVLWYDDYDRPSGIPERFS GSNSGDAATLTISTVEVGDEADYVCQVWDGSGDPYVWFGGGTQLTVLG
SEQ ID NO: 17secuencia de nucleótidos de la secuencia líder/ señalizadora de péptidos (LP) atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgaactgccgcatccggcgtttctgctgattccg
SEQ ID NO: 18secuencia de aminoácidos de la secuencia líder/ señalizadora de péptidos (LP) MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
SEQ ID NO: 19secuencia de nucleótidos de LTG2050_(LP-M19217-CD8 TM-41BB-CD3 zeta)
AT GCTT CT CCT GGT CACCT CCCTGCT CCT CT GCGAACTGCCT CACCCT G CCTT CCTT CT GATT CCT GAGGT CCAGCT GGT ACAGT CT GGAGCT GAGGT GAAGAAGCCT GGGGCCT CAGT GAAGGT CT CCT GCAAGGCTT CT GGAT AC ACCTT CACCAGCT ACT AT AT GCACT GGGTGCGACAGGCCCCT GGACAAG GGCTT GAGT GGAT GGGAAT AAT CAACCCT AGT GGT GGT AGCACAAGCT A CGCACAGAAGTT CCAGGGCAGAGT CACCAT GACCAGGGACACGT CCAC GAGCACAGT CT ACAT GGAGCT GAGCAGCCT GAGAT CT GAGGACACGGC CGT GT ATT ACT GT GCGAGAT CGGATCGGGGAATT ACCGCCACGGACGCT TTT GAT AT CT GGGGCCAAGGGACAAT GGT CACCGT CT CTT CAGGAGGT G GCGGGT CT GGT GGAGGCGGT AGCGGT GGT GGCGGAT CCCAGT CT GT G CT GACT CAGCCACCCT CGGT GT CAGT GGCCCCAGGGCAGACGGCCAAG ATT ACCT GTGGGGGAAGT GACATT GGAAAT AAAAAT GT CCACTGGT ACCA GCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCT GT CCT GGT CGT CT AT GAT GATT ACGAC CGGCCCT CAGGGAT CCCT GAGCGATT CT CT GGCT CCAACT CT GGGGAC GCGGCCACCCT GACGAT CAGCACGGT CGAAGT CGGGGAT GAGGCCGAC T ATTT CT GT CAGGT GT GGGACAGT AGT GGT GAT CCTT ATT GGGT GTT CG GCGGAGGGACCCAGCT CACCGTTTT AGGT GCGGCCGCAACT ACCACCC CT GCCCCT CGGCCGCCGACT CCGGCCCCAACCAT CGCAAGCCAACCCC T CTCCTT GCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGT GGAGCCGT GC AT ACCCGGGGGCT GGACTTT GCCTGCGAT AT CT ACATTT GGGCCCCGCT GGCCGGCACTTGCGGCGT GCT CCT GCT GTCGCT GGT CAT CACCCTTT AC T GCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCT GCTTT ACAT CTT CAAGCAGCCGTT CA T GCGGCCCGT GCAGACGACT CAGGAAGAGGACGGATGCT CGT GCAGAT T CCCT GAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACT GCGCGT CAAGTT CT CAC GGT CCGCCGACGCCCCCGCAT AT CAACAGGGCCAGAAT CAGCT CT ACA ACGAGCT GAACCT GGGAAGGAGAGAGGAGT ACGACGT GCT GGACAAGC GACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAAC CCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAG CCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTC ACGACGGGCT GT ACCAGGGACT GAGCACCGCCACT AAGGAT ACCT ACG AT GCCTT GCAT AT GCAAGCACT CCCACCCCGG
SEQ ID NO: 20secuencia de aminoácidos de LTG2050_(LP-M19217-CD8 TM-41BB-CD3 zeta)
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTS YYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVY MELSSLRSEDTAVYYCARSDRGITATDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGG GSGGGGSQSVLTQPPSVSVAPGQTAKITCGGSDIGNKNVHWYQQKPGQA PVLWYDDYDRPSGIPERFSGSNSGDAATLTISTVEVGDEADYFCQVWDSS GDPYWVFGGGTQLTVLGAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAA GGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPF MRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYN ELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 21secuencia de nucleótidos de LTG2065 (LP-M19217-1-CD8 TM-41BB-CD3 zeta) AT GCTGCT GCT GGT GACCAGCCT GCT GCT GT GCGAACTGCCGCAT CCG GCGTTT CT GCT GATT CCGGAGGT CCAGCT GGT ACAGT CTGGAGCT GAGG T GAAGAAGCCT GGGGCCT CAGT GAAGGT CTCCTGCAAGGCTT CT GGAT A CACCTT CACCAGCT ACT AT AT GCACT GGGT GCGACAGGCCCCT GGACAA GGGCTT GAGT GGAT GGGATT AAT CAACCCT AGT GGTGGT AGCACAAGCT ACGCACAGAAGTT CCAGGGCAGAGT CACCAT GACCAGGG ACACGT CCA CGAGCACAGT CT ACAT GGAGCT GAGCAGCCT GAGAT CT GAGGACACGG CCGT GT ATT ACT GTGCGAGAT CGGAT CGGGGAATT ACCGCCACGGACG CTTTT GAT AT CTGGGGCCAAGGGACAAT GGT CACCGT CT CTT CAGGCGG AGGAGGCTCCGGGGGAGGAGGTTCCGGGGGCGGGGGTTCCCAGTCTG T GCT GACT CAGCCACCCT CGGT GT CAGTGGCCCCAGGGCGGAT GGCCA AGATT ACCT GT GGGGGAAGT GACATT GGAAAT AAAAAT GT CCACT GGT AT CAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCT GT CCT GGTT GTCTAT GAT GATT ACG ACCGGCCCT CAGGGAT CCCT GAGCGATT CT CTGGCT CCAACT CTGGGG ACGCGGCCACCCT GACGAT CAGCACGGT CGAAGT CGGGGAT GAGGCCG ACT ATTT CT GT CAGGT GTGGGACGGT AGT GGT GAT CCTT ATT GGAT GTT C GGCGGAGGGACCCAGCTCACCGTTTTAGGTGCGGCCGCAACTACCACC CCT GCCCCT CGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCAT CGCAAGCCAACCC CT CT CCTT GCGCCCCGAAGCTT GCCGCCCGGCCGCGGGT GGAGCCGT G CAT ACCCGGGGGCTGGACTTT GCCT GCGAT AT CT ACATTT GGGCCCCGC T GGCCGGCACTT GCGGCGT GCT CCTGCTGT CGCT GGT CAT CACCCTTT A CT GCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCT GCTTT ACAT CTT CAAGCAGCCGTT C AT GCGGCCCGT GCAGACGACT CAGGAAGAGGACGGAT GCT CGTGCAGA TT CCCT GAGGAGGAAGAGGGGGGAT GCGAACT GCGCGT CAAGTT CT CA CGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTAC AACGAGCT GAACCT GGGAAGGAGAGAGGAGT ACGACGT GCTGGACAAG CGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAA CCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAA GCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGT CACGACGGGCT GT ACCAGGGACT GAGCACCGCCACT AAGGAT ACCT AC GAT GCCTT GCAT AT GCAAGCACT CCCACCCCGG
SEQ ID NO: 22secuencia de aminoácidos de LTG2065_(LP-M19217-1-CD8 TM-41BB-CD3 zeta)
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTS YYMHW VRQAPGQGLEWMGLINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVY MELSSLRSEDTAVYYCARSDRGITATDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGG GSGGGGSQSVLTQPPSVSVAPGRMAKITCGGSDIGNKNVHWYQQKPGQA PVLW YDDYDRPSGIPERFSGSNSGDAATLTISTVEVGDEADYFCQVW DGS GDPYWMFGGGTQLTVLGAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAA GGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPF MRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYN ELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 23secuencia de nucleótidos de LTG2066 _(LP-M19217-2-CD8 TM-41 BB-CD3 zeta) AT GCTGCT GCT GGT GACCAGCCT GCT GCT GT GCGAACTGCCGCAT CCG GCGTTT CT GCT GATTCCGGAGGT CCAGCT GGT ACAGT CTGGAGCT GAGG T GAAGAAGCCT GGGGCCT CAGT GAAGGT CT CCT GCAAGGCTT CCGGAT A CACCTT CACCAGCT ACT ACAT GCACTGGGT GCGACAGGCCCCT GGACAA GGGTTT GAGTGGAT GGGATT AAT CAACCCT AGT GGTAGT AGCACAAGCT ACGCACAGAAGTT CCAGGGCAGAGT CACCAT GACCAGGGACACGT CCA CGAGCACAGT CT ACAT GGAGCT GAGCAACCT GAGAT CT GAGGACACGG CCGT GT ATT ACT GT GCGAGAT CGGAT CGGGGAATT ACCGCCACGGACG CTTTT GAT AT CTGGGGCC AAGGGACAAT GGT CACCGT CT CTT CAGGCGG AGGAGGCTCCGGGGGAGGAGGTTCCGGGGGCGGGGGTTCCCAGTCTG T GCT GACT CAGCCACCCT CGGTGCCAGT GGCCCCAGGGCAGACGGCCA AGATT AT CT GT GGGGGAAGT GACATT GGAAAT AAAAAT GT CCACTGGT AC CAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCT GT CCT GGT CGTCT AT GAT GACT AC GACCGGCCCT CAGGGAT CCCT GAGCGATT CT CT GGCT CCAACT CT GGG GACGCGGCCACCCT GACGAT CAGCACGGTT GAAGT CGGGGAT GAGGCC GACT ATTT CT GT CAGGT GT GGGACGGT AGTGGT GAT CCTT ATT GGGT GT TCGGCGGAGGGACCCAGCTCACCGTCTTAGGTGCGGCCGCAACTACCA CCCCT GCCCCT CGGCCGCCGACT CCGGCCCCAACCAT CGCAAGCCAAC CCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCC GTGCAT ACCCGGGGGCT GGACTTT GCCT GCGAT AT CT ACATTT GGGCCC CGCTGGCCGGCACTTGCGGCGT GCT CCT GCT GT CGCT GGT CAT CACCC TTT ACT GCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCT GCTTT ACATCTT CAAGCAGCC GTT CATGCGGCCCGT GCAGACGACT CAGGAAGAGGACGGAT GCT CGT G CAGATT CCCT GAGGAGGAAGAGGGGGG AT GCGAACTGCGCGT CAAGTT CT CACGGT CCGCCGACGCCCCCGCAT AT CAACAGGGCCAGAAT CAGCT CT ACAACGAGCT GAACCT GGGAAGGAGAGAGGAGT ACGACGTGCTGGA CAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGA AAAACCCT CAGGAAGGACT GT ACAACGAACT CCAG AAAGACAAGAT GGC GGAAGCCT ACT CAGAAAT CGGGAT GAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAA GGGT CACGACGGGCT GT ACCAGGGACT GAGCACCGCCACT AAGGAT AC CT ACG AT GCCTT GCAT AT GCAAGC ACT CCCACCCCGG
SEQ ID NO: 24secuencia de aminoácidos de LTG2066 _(LP-M19217-2-CD8 TM-41BB-CD3 zeta)
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTS YYMHWVRQAPGQGFEWMGLINPSGSSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVY MELSNLRSEDTAVYYCARSDRGITATDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGG GSGGGGSQSVLTQPPSVPVAPGQTAKIICGGSDIGNKNVHWYQQKPGQAP VLWYDDYDRPSGIPERFSGSNSGDAATLTISTVEVGDEADYFCQVWDGSG DPYWVFGGGTQLTVLGAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAG GAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFM RPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNEL
NLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEI GMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 25secuencia de nucleótidos de LTG2067_(LP-M19217-7-CD8 TM-41 BB-CD3 zeta) AT GCTGCT GCT GGT GACCAGCCT GCT GCT GT GCGAACTGCCGCAT CCG GCGTTT CT GCT GATT CCGGAGGT CCAGCT GGT ACAGT CTGGAGCT GAG GT GAACAAGCCT GGTGCCT CAGT GAAGGT CT CCT GCAAGGCTT CT GGAT ACACCTT CACCAGCT ACT AT AT GCACT GGGT GCGACAGGCCCCT GGACA AGGGCTT GAGT GGATGGGAAT GAT CAACCCT AGT GGTGGT AGCACAAG CT ACGCACAGAAGTT CCAGGGCAGAGT CACCAT GACCAGGGACACGT C CACGAGCACAGT CT ACAT GGAGCT GAGCAGCCT GAGAT CT GAGGACAC GGCCGT GT ATT ACT GT GCGAGATCGGAT CGGGGAATT ACCTCCACGGA CGCTTTT GAT AT CT GGGGCCAAGGGACAAT GGT CACCGT CT CTT CAGGC GGAGGAGGCT CCGGGGGAGGAGGTT CCGGGGGCGGGGGTT CCCAGT C TGTGCT G ACT CAGCCACCCT CGGT GT CATT GGCCCCAGGGCAGACGGC CAAGATT ACCT GT GGGGGAAGT GACATTGGAAAT AAAAAT GT CCACT GG T ACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCT GT CCT AGTCGT CT AT GAT GATT ACAACCGGCCCT CAGGGAT CCCT GAGCGATT CT CTGGCT CCAACT CTGG GGACT CAGCCACCCT G ACGAT CAGCACGGT CGAAGT CGGGGAT G AGGC CGACT ATTT CT GT CAGGT GT GGGACGGT AGT GGT GAT CCTT ATT GGGT G TT CGGCGGAGGGACCCAGCT CACCGTTTT AGGT GCGGCCGCAACT ACC ACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAA CCCCT CT CCTT GCGCCCCGAAGCTT GCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGC CGTGCAT ACCCGGGGGCT GGACTTTGCCT GCGAT AT CT ACATTT GGGCC CCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACC CTTT ACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCT GCTTT ACAT CTT CAAGCAGC CGTT CATGCGGCCCGT GCAGACGACT CAGGAAGAGGACGGAT GCT CGT GCAGATT CCCT GAGGAGGAAGAGGGGGGAT GCGAACT GCGCGT CAAGT TCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGC T CT ACAACGAGCT GAACCT GGGAAGGAGAGAGGAGT ACGACGT GCT GG ACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGG AAAAACCCT CAGG AAGG ACT GT ACAACG AACT C CAGAAAG AC AAG AT GG CGGAAGCCT ACT CAGAAAT CGGGAT GAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGA AAGGGT CACGACGGGCT GT ACCAGGGACT GAGCACCGCCACT AAGGAT ACCT ACGATGCCTT GCAT AT GCAAGCACT CCCACCCCGG
SEQ ID NO: 26secuencia de aminoácidos de LTG2067 _(LP-M19217-7-CD8 TM-41BB-CD3 zeta)
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVQSGAEVNKPGASVKVSCKASGYTFTS YYMHWVRQAPGQGLEWMGMINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVY MELSSLRSEDTAVYYCARSDRGITSTDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGG GSGGGGSQSVLTQPPSVSLAPGQTAKITCGGSDIGNKNVHWYQQKPGQAP VLWYDDYNRPSGIPERFSGSNSGDSATLTISTVEVGDEADYFCQVWDGSG DPYWVFGGGTQLTVLGAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAG GAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFM RPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNEL
NLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEI GMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 27secuencia de nucleótidos de LTG2068_(LP-M19217-23-CD8 TM-41BB-CD3 zeta) AT GCTGCT GCT GGT GACCAGCCT GCT GCT GT GCGAACTGCCGCAT CCG GCGTTT CT GCT GATTCCGGAGGT CCAGCT GGT ACAGT CTGGAGCT GAGG TGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCATCTGGATA CACCTT CACCGGCT ACT AT AT GCACT GGGT GCGGCAGGCCCCT GGACAA GGGCTT GAGT GGAT AGGATT AAT CAACCCT AGT GGTGGT AGCACAAGCT ACGAACAGAAGTT CCAGGGCAGAGT CGCCAT GACCAGGGACACGT CAA CGAGCACAGT CT ACAT GGAGCT GAGCAGCCT GAGAT CT GAGGACACGG CCGT GT ATT ACT GT GCGAGAT CGGAT CGGGGAATT ACCGCCACGGACG CTTTT GAT AT CTGGGGCCAAGGGACAAT GGT CACCGT CT CTT CAGGCGG AGGAGGCTCCGGGGGAGGAGGTTCCGGGGGCGGGGGTTCCCAGTCTG T GCT GACT CAGCCACCCT CGGT GT CAGT GGCCCCAGGGCAGACGGCCA AGATT ACCT GT GGGGGAAGT GACATTGGAGAT AAAAAT GT CCACT GGT A CCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCT GT CCTGGT CGT CT AT GAT GATT AC GACCGGCCCT CAGGGAT CCCT GAGCGATT CT CT GGCT CCAACT CT GGG GACGCGGCCACCCTGACGATCAGCACGGTCGAAGTCGGGGATGAGGCC GACT ATTT CT GT CAGGT GT GGGACGGT ATT GGT GATCCCT ATT GGGT GTT CGGCGGAGGGACCCAGCT CACCGTTTT AGGTGCGGCCGCAACT ACCAC CCCT GCCCCT CGGCCGCCGACT CCGGCCCCAACCAT CGCAAGCCAACC CCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGT GCAT ACCCGGGGGCTGGACTTT GCCTGCGAT AT CT ACATTT GGGCCCCG CT GGCCGGCACTT GCGGCGT GCT CCTGCT GT CGCT GGT CAT CACCCTTT ACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCT GCTTT ACAT CTT CAAGCAGCCGTT CAT GCGGCCCGTGCAGACGACT CAGGAAGAGGACGGAT GCT CGT GCAG ATT CCCT GAGGAGGAAGAGGGGGG AT GCGAACT GCGCGT CAAGTT CT C ACGGT CCGCCGACGCCCCCGCAT AT CAACAGGGCCAGAAT CAGCT CT A CAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAA GCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAA ACCCT CAGGAAGGACT GT ACAACGAACT CCAGAAAGACAAGAT GGCGGA AGCCT ACT CAGAAAT CGGGAT GAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGG T CACGACGGGCT GT ACCAGGGACT GAGCACCGCCACT AAGGAT ACCT A CGAT GCCTT GCAT ATGCAAGCACT CCCACCCCGG
SEQ ID NO: 28secuencia de aminoácidos de LTG2068 _(LP-M19217-23-CD8 TM-41BB-CD3 zeta)
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTG YYMHVWRQAPGQGLEWIGLINPSGGSTSYEQKFQGRVAMTRDTSTSTVYM ELSSLRSEDTAVYYCARSDRGITATDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGG SGGGGSQSVLTQPPSVSVAPGQTAKITCGGSDIGDKNVHWYQQKPGQAPV LVVYDDYDRPSGIPERFSGSNSGDAATLTISTVEVGDEADYFCQVWDGIGD PYWVFGGGTQLTVLGAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGG AVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMR
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SEQ ID NO: 29secuencia de nucleótidos de LTG2069_(LP-M19217-29-CD8 TM-41BB-CD3 zeta) AT GCTGCT GCT GGT GACCAGCCT GCT GCT GT GCGAACTGCCGCAT CCG GCGTTT CT GCT GATTCCGGAGGT CCAGCT AGT ACAGT CTGGAGCT GAGG T GAAGAAGCCT GGGGCCT CAGT GAAGGT CTCCTGCAAGGCTT CT GGAT A CACCTT CACCAGCT ACT AT AT GCACT GGGT GCGACAGGCCCCT GGACAA GGGCTT GAGT GGAT GGGAAT GAT CAACCCT AGT GGT GGT AGCACAAGCT ACGCACAGAAGTT CCAGGGCAGAGT CACCAT GACCAGGGACACGT CCA CGAGCACAGT CT ACAT GGAGCT GAGCAGCCT GAGAT CT GAGGACACGG CCGT GT ATT ACT GT GCGAGAT CGGAT CGGGGAATT ACCGCCACGGACG CTTTT GAT AT CTGGGGCCAAGGGACAAT GGT CACCGT CT CTT CAGGCGG AGGAGGCTCCGGGGGAGGAGGTTCCGGGGGCGGGGGTTCCCAGTCTG T GCT GACT CAGCCACCCT CGGT GT CAGT GGCCCCAGGGCAGACGGCCA AGATT ACCT GT GGGGGAAGT GACATT GGAAAT AAAAAT GCCCACTGGT A CCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCT GT CCTGGT CGT CT AT GAT GATT AC GACCGGCCCT CAGGGAT CT CT GAGCGATT CT CT GGCT CCAACT CT GGG GACGCGGCCACCCTGACGATCAGCACGGTCGAAGTCGGGGATGAGGCC GACT ATTT CT GT CAGGT GT GGGACGGT AGT GGT GATCCTTTTT GGGT GTT CGGCGGAGGGACCCAGCTCACCGTTTTAGGTGCGGCCGCAACTACCAC CCCT GCCCCT CGGCCGCCGACT CCGGCCCCAACCAT CGCAAGCCAACC CCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGT GCAT ACCCGGGGGCTGGACTTT GCCTGCGAT AT CT ACATTT GGGCCCCG CT GGCCGGCACTT GCGGCGT GCT CCTGCT GT CGCT GGT CAT CACCCTTT ACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTT CAT GCGGCCCGTGCAGACGACT CAGGAAGAGGACGGAT GCT CGT GCAG ATT CCCT GAGGAGGAAGAGGGGGGAT GCGAACT GCGCGT CAAGTT CT C ACGGT CCGCCGACGCCCCCGCAT AT CAACAGGGCCAGAAT CAGCT CT A CAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAA GCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAA ACCCT CAGGAAGGACT GT ACAACGAACT CCAGAAAGACAAGAT GGCGGA AGCCT ACT CAGAAAT CGGGAT GAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGG T CACGACGGGCT GT ACCAGGGACT GAGCACCGCCACT AAGGAT ACCT A CGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
SEQ ID NO: 30secuencia de aminoácidos de LTG2069 _(LP-M19217-29-CD8 TM-41BB-CD3 zeta)
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTS YYMHWVRQAPGQGLEWMGMINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVY MELSSLRSEDTAVYYCARSDRGITATDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGG GSGGGGSQSVLTQPPSVSVAPGQTAKITCGGSDIGNKNAHWYQQKPGQA PVLW YDDYDRPSGISERFSGSNSGDAATLTISTVEVGDEADYFCQVW DGS GDPFWVFGGGTQLTVLGAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAA GGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPF
MRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYN ELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 31secuencia de nucleótidos de LTG2070_(LP-M19217-38-CD8 TM-41BB-CD3 zeta) AT GCTGCT GCT GGT GACCAGCCT GCT GCT GT GCGAACTGCCGCAT CCG GCGTTT CT GCT GATTCCGGAGGT CCAGCT GGT ACAGT CTGGAGCT GAGG T GAAGAGGCCT GGGGCCT CAGT GAAGGT CT CCT GCAAGGCTT CT GGAT A CACCTT CACCAGCT ACT AT AT GCACT GGGT GCGACAGGCCCCT GGACGA GGGCTT GAGT GGAT GGGATT AAT CAACCCT AGT GGTGGT AGCACAAGCT ACGCACAGGAGTT CCAGGGCAGAGT CACCAT GACCAGGGACAT GT CCA CGAGCACAGT CT ACAT GGAGCT GAGCAGCCT GAGAT CT GAGGACACGG CCGTGTATTACTGTGCGAGATCGGATCGGGGAATTAGCGCCACGGACG CTTTT GAT AT CTGGGGCCAAGGGACAAT GGT CACCGT CT CTT CAGGCGG AGGAGGCTCCGGGGGAGGAGGTTCCGGGGGCGGGGGTTCCCAGTCTG T GCT GACT CAGCCACCCT CGGT GT CAGT GGCCCCAGGGCAGAT GGCCA AGATT ACCT GT GGGGGAAGT GACATT GGAAAT AAAAAT GT CCACT GGTA CCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCT GT CCTGGT CGT CT AT GAT GATT AC AACCGGCCCT CAGGGAT CCCT GAGCGATT CT CTGGCT CCAACT CT GGG GACGCGGCCACCCTGACGATCAGCACGGTCGAAGTCGGGGATGAGGCC GACT ATTT CT GT CAGGT AT GGGACGGT AGT GGT GAT CCTT ATT GGGT GTT CGGCGGAGGGACCCAGCTCACCGATTTAGGTGCGGCCGCAACTACCAC CCCT GCCCCT CGGCCGCCGACT CCGGCCCCAACCAT CGCAAGCCAACC CCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGT GCAT ACCCGGGGGCTGGACTTT GCCTGCGAT AT CT ACATTT GGGCCCCG CT GGCCGGCACTT GCGGCGT GCT CCTGCT GT CGCT GGT CAT CACCCTTT ACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCT GCTTT ACAT CTT CAAGCAGCCGTT CAT GCGGCCCGTGCAGACGACT CAGGAAGAGGACGGAT GCT CGT GCAG ATT CCCT GAGGAGGAAGAGGGGGG AT GCGAACT GCGCGT CAAGTT CT C ACGGT CCGCCGACGCCCCCGCAT AT CAACAGGGCCAGAAT CAGCT CT A CAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAA GCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAA ACCCT CAGGAAGGACT GT ACAACGAACT CCAGAAAGACAAGAT GGCGGA AGCCT ACT CAGAAAT CGGGAT GAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGG T CACGACGGGCT GT ACCAGGGACT GAGCACCGCCACT AAGGAT ACCT A CGAT GCCTT GCAT ATGCAAGCACT CCCACCCCGG
SEQ ID NO: 32secuencia de aminoácidos de LTG2070 _(LP-M19217-38-CD8 TM-41BB-CD3 zeta)
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVQSGAEVKRPGASVKVSCKASGYTFTS YYMHWVRQAPGRGLEWMGLINPSGGSTSYAQEFQGRVTMTRDMSTSTVY MELSSLRSEDTAVYYCARSDRGISATDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGG GSGGGGSQSVLTQPPSVSVAPGQMAKITCGGSDIGNKNVHWYQQKPGQA PVLWYDDYNRPSGIPERFSGSNSGDAATLTISTVEVGDEADYFCQVWDGS GDPYWVFGGGTQLTDLGAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAA GGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPF
MRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYN ELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 33secuencia de nucleótidos de LTG2071_(LP-M19217-40-CD8 TM-41BB-CD3 zeta) AT GCTGCT GCT GGT GACCAGCCT GCT GCT GT GCGAACTGCCGCAT CCG
GCGTTT CT GCT GATTCCGGAGGT CCAGCT GGT ACAGT CTGGAGCT GAGG T GAAGAGGCCT GGGGCCT CAGT GAAGGT CT CCT GCAAGGCTT CT GGAT A CACCTT CACCAGCT ACT AT AT GCACT GGGT GCGACAGGCCCCT GGACAA GGGCTT GT GT GGAT GGGATT AAT CAACCCT AGT GGTGGCAGCACAAGCT ACGCACAGAAGTT CCAGGGCAGAGT CACCAT GACCAGGGACACGT CCA CGAGCACAGT CT ACAT GGAGCT GAGCAGCCT GAGAT CT GAGGACACGG CCGT GT ATT ACT GT GCGAGAT CGGAT CGGGGAATT ACCGCCACGGACG CTTTT GAT AT CTGGGGCCAAGGGACAAT GGT CACCGT CT CTT CAGGCGG AGGAGGCTCCGGGGGAGGAGGTTCCGGGGGCGGGGGTTCCCAGTCTG T GCT GACT CAGCCACCCT CGGT CT CAGT GGCCCCAGGGCAGACGGCCA AGACT ACCT GTGGGGGAAGT GACATT GGAAAT AAAAAT GT CCACTGGT A CCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCT GT CCTGGT CGT CT AT GAT GATT AC GACCGGCCCT CAGGGAT CCCT GAGCGATT CT CT GGCT CCAACT CT GGG GACGCGGCCACCCTGACGATCAGCACGGTCGAAGTCGGGGATGAGGCC GACT AT GT CT GT CAGGT GT GGGACGGT AGTGGT GAT CCTT ATTGGGT GT T CGGCGGAGGGACCCAGCT CACCGTTTT AGGT GCGGCCGCAACT ACCA CCCCT GCCCCT CGGCCGCCGACT CCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAAC CCCT CT CCTT GCGCCCCGAAGCTT GCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCC GTGCAT ACCCGGGGGCT GGACTTT GCCT GCGAT AT CT ACATTT GGGCCC CGCTGGCCGGCACTTGCGGCGT GCT CCT GCT GT CGCT GGT CAT CACCC TTT ACT GCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTT ACAT CTT CAAGCAGCC GTT CAT GCGGCCCGT GCAGACGACT CAGGAAGAGGACGGAT GCT CGT G CAGATT CCCT GAGGAGGAAGAGGGGGGAT GCGAACTGCGCGT CAAGTT CT CACGGT CCGCCGACGCCCCCGCAT AT CAACAGGGCCAGAAT CAGCT CT ACAACGAGCT GAACCT GGGAAGGAGAGAGGAGT ACGACGTGCTGGA CAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGA AAAACCCT CAGGAAGGACT GT ACAACGAACT CCAG AAAGACAAGAT GGC GGAAGCCT ACT CAGAAAT CGGGAT GAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAA GGGT CACGACGGGCT GT ACCAGGGACT GAGCACCGCCACT AAGGAT AC CT ACG AT GCCTT GCAT AT GCAAGC ACT CCCACCCCGG
SEQ ID NO: 34secuencia de aminoácidos de LTG2071 _(LP-M19217-40-CD8 TM-41BB-CD3 zeta)
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVQSGAEVKRPGASVKVSCKASGYTFTS YYMHWVRQAPGQGLVWMGLINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVY MELSSLRSEDTAVYYCARSDRGITATDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGG GSGGGGSQSVLTQPPSVSVAPGQTAKTTCGGSDIGNKNVHWYQQKPGQA PVLWYDDYDRPSGIPERFSGSNSGDAATLTISTVEVGDEADYVCQVWDGS GDPYWVFGGGTQLTVLGAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAA
GGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPF MRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYN ELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 35secuencia de nucleótidos del dominio transmembranario de CD8 de ADN
atttgggccccgctggccggcacttgcggcgtgctcctgctgtcgctggtcatcaccctt
tactgc
SEQ ID NO: 36secuencia de aminoácidos del dominio transmembranario de CD8IWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
SEQ ID NO: 37secuencia de nucleótidos del dominio bisagra de CD8 de ADN
actaccacccctgcccctcggccgccgactccggccccaaccatcgcaagccaacccctc
tccttgcgccccgaagcttgccgcccggccgcgggtggagccgtgcatacccgggggctg
gactttgcctgcgatatctac
SEQ ID NO: 38secuencia de aminoácidos del dominio bisagra de CD8 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYSEQ ID NO: 39secuencia de aminoácidos de los números de aminoácido 137 a 206 de la región de bisagra y transmembranaria de CD8.alfa. (NCBI RefSeq: NP.sub.—001759.3) TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLA GTCGVLLLSLVITLYCSEQ ID NO: 40secuencia de nucleótidos del dominio de señalización de ADN de 4-1BB aagaggggccggaagaagctgctttacatcttcaagcagccgttcatgcggcccgtgcag acgactcaggaagaggacggatgctcgtgcagattccctgaggaggaagaggggggatgc
gaactg
SEQ ID NO: 41secuencia de aminoácidos del dominio de señalización de 4-1BB KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELSEQ ID NO: 42secuencia de nucleótidos del dominio de señalización intracelular de CD3-zeta cgcgtcaagttctcacggtccgccgacgcccccgcatatcaacagggccagaatcagctc tacaacgagctgaacctgggaaggagagaggagtacgacgtgctggacaagcgacgcgga cgcgacccggagatgggggggaaaccacggcggaaaaaccctcaggaaggactgtacaac gaactccagaaagacaagatggcggaagcctactcagaaatcgggatgaagggagagcgg aggaggggaaagggtcacgacgggctgtaccagggactgagcaccgccactaaggatacc tacgatgccttgcatatgcaagcactcccaccccgg
SEQ ID NO: 43secuencia de aminoácidos de CD3-zeta RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKP RRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKD TYDALHMQALPPRSEQ ID NO: 44secuencia de nucleótidos del dominio de señalización intracelular de variante de CD3-zeta cgcgtcaagttctcacggtccgccgacgcccccgcatataaacagggccagaatcagctc tacaacgagctgaacctgggaaggagagaggagtacgacgtgctggacaagcgacgcgga cgcgacccggagatgggggggaaaccacggcggaaaaaccctcaggaaggactgtacaac gaactccagaaagacaagatggcggaagcctactcagaaatcgggatgaagggagagcgg aggaggggaaagggtcacgacgggctgtaccagggactgagcaccgccactaaggatacc tacgatgccttgcatatgcaagcactcccaccccgg
SEQ ID NO: 45secuencia de aminoácidos de la variante del dominio de señalización de CD3-zeta RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKP RRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKD TYDALHMQALPPRSEQ ID NO: 46secuencia de nucleótidos de ScFv CD19 (FMC63)
gacattcagatgactcagaccacctcttccttgtccgcgtcactgggagacagagtgaccat
ctcgtgtcgcgcaagccaggatatctccaagtacctgaactggtaccaacagaagcccga
cgggactgtgaagctgctgatctaccacacctcacgcctgcacagcggagtgccaagcag
attctccggctccggctcgggaaccgattactcgcttaccattagcaacctcgagcagga
ggacatcgctacctacttctgccagcaaggaaataccctgccctacaccttcggcggagg
aaccaaattggaaatcaccggcggaggaggctccgggggaggaggttccgggggcggggg
ttccgaagtgaagctccaggagtccggccccggcctggtggcgccgtcgcaatcactctc
tgtgacctgtaccgtgtcgggagtgtccctgcctgattacggcgtgagctggattcggca
gccgccgcggaagggcctggaatggctgggtgtcatctggggatccgagactacctacta
caactcggccctgaagtcccgcctgactatcatcaaagacaactcgaagtcccaggtctt
tctgaagatgaactccctgcaaactgacgacaccgccatctattactgtgctaagcacta
ctactacggtggaagctatgctatggactactgggggcaaggcacttcggtgactgtgtc
aagc
SEQ ID NO: 47secuencia de aminoácidos de ScFv CD19 (FMC63)
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTS RLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKL EITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDY GVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNS LQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO: 48secuencia de nucleótidos de ScFv anti-CD33 (LTG1936)
CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTG AGGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATTCAGTTTTCCCACCTACTGGATCGGCTGGG TGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTGGTG ACTCTGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGA CAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACAC CGCCATGTATTACTGTGCGAGACTAGTTGGAGATGGCTACAATACGGGGGCTTTT GATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGAGGTGGCGGGTCT GGTGGTGGCGGTAGCGGTGGTGGCGGATCCGATATTGTGATGACCCACACTCCA CTCTCTCTGTCCGTCACCCCTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAAGTCTAGTCA GAGCCTCCTGCATAGTAATGGAAAGACCTATTTGTATTGGTACCTGCAGAAGCCA GGCCAGCCTCCACAGCTCCTGATCTATGGAGCTTCCAACCGGTTCTCTGGAGTGC CAGACAGGTTCAGTGGCAGCGGGTCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCC GGGT GGAGGCT GAGGATGTT GGGGTTT ATT ACT GC AT GC AAAGT AT AC AGCTTCC TATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA
SEQ ID NO: 49secuencia de aminoácidos de ScFv anti-CD33 (LTG1936)
QVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGFSFPTYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDS DTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARLVGDGYNTGAFDIW GQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTHTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHS NGKTYLYWYLQKPGQPPQLLIYGASNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVG VYY CMQSIQLPITF GQGTRLEIK
SEQ ID NO: 50secuencia de nucleótidos de ScFv anti-mesotelina (LTG1904)GAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTG AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGG TCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATA GTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAG ACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACA CGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATTTATCGTCAGTGGCTGGACCCTTTAACTA CTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGAGGTGGCGGGTCTGGTGG AGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGATCCTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTG TCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGA AGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTC ATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCA GCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAGGATGAGG
CTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATCTGGTATTCGGCGG AGGCACCCAGCTGACCGTCCTCGGT
SEQ ID NO: 51secuencia de aminoácidos de ScFv anti-mesotelina (LTG1904)
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNS GSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDLSSVAGPFNYWG QGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYAS WY QQKP GQ AP VLVIY GKNNRP SGIPDRFSGSSS GNT ASLTIT GAQ AEDE AD YY CN S R D S S GNHL VF GGGT QLTVLG

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 o 34.
2. Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 o 34.
3. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.
4. El vector de la reivindicación 3, en donde el vector se selecciona del grupo que consiste en un vector de ADN, un vector de ARN, un vector plasmídico, un vector de cósmido, un vector de virus del herpes, un vector de virus del sarampión, un vector de lentivirus, un vector adenovírico o un vector de retrovirus, o una combinación de los mismos.
5. El vector de la reivindicación 3 o la reivindicación 4, que comprende además un promotor, opcionalmente en donde el promotor es un promotor inducible, un promotor constitutivo, un promotor específico de tejido, un promotor suicida o cualquier combinación de los mismos.
6. Una célula que comprende el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, opcionalmente en donde la célula es un linfocito T, opcionalmente en donde el linfocito T es un linfocito T CD8+, opcionalmente en donde la célula es una célula humana.
7. Un método de preparación de una célula que comprende transducir un linfocito T con un vector de la reivindicación 3.
8. Un método de generación de una población de células manipuladas con ARN que comprende introducir un ARN transcrito o ARN sintético in vitro en una célula, donde el ARN comprende una molécula del ácido nucleico de la reivindicación 1.
9. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad antitumoral eficaz de una población de linfocitos T humanos, en donde la población de linfocitos T humanos comprende una secuencia del ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR), en donde el CAR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 o 34, y en donde los linfocitos T son linfocitos T de un humano que tiene un cáncer.
10. Una composición farmacéutica que comprende una población de linfocitos T, en donde la población de linfocitos T humanos comprende una secuencia del ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR), en donde el CAR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 o 34, en donde los linfocitos T son linfocitos T de un sujeto que tiene cáncer, en donde la composición farmacéutica es para su uso en un método de tratamiento del cáncer en dicho sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz antitumoral de la población de linfocitos T humanos.
11. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 10, en donde el cáncer es un cáncer hematológico.
12. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 11, en donde el cáncer hematológico es leucemia o linfoma, opcionalmente en donde la leucemia es leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfocítica aguda (ALL) o leucemia mielógena crónica (CML), opcionalmente en donde el linfoma es linfoma de células del manto, linfoma no hodgkiniano o linfoma de Hodgkin.
13. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 11, en donde el cáncer hematológico es mieloma múltiple.
14. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 10, en donde el cáncer humano es un carcinoma del adulto seleccionado del grupo que consiste en: un cáncer bucal y de faringe, un cáncer del aparato digestivo, un cáncer del aparato respiratorio, cánceres de huesos y articulaciones, un cáncer de tejido blando, un cáncer de piel, un cáncer del sistema nervioso central, un cáncer de mama, un cáncer genital, un cáncer urinario, un cáncer del ojo y la órbita, un cáncer endocrino y un cáncer cerebral.
15. La composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10-14, en donde el cáncer es un cáncer que expresa CD19.
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