ES2959645T3

ES2959645T3 - Materiales y métodos para el tratamiento del cáncer

Info

Publication number: ES2959645T3
Application number: ES19812602T
Authority: ES
Inventors: Saad J Kenderian; Rosalie M Sterner; Michelle J Cox; Reona Sakemura
Original assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research
Current assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research
Priority date: 2018-06-01
Filing date: 2019-05-31
Publication date: 2024-02-27
Anticipated expiration: 2039-05-31
Also published as: EP3801563A4; MX2020013017A; CN112512533A; AU2019277660A1; EP3801563B1; BR112020024601A2; CA3101991A1; EP3801563A1; US20210214723A1; KR20210020946A; JP2021525519A; WO2019232370A1; JP7411578B2

Abstract

Este documento proporciona métodos y materiales involucrados en el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, se proporcionan células T receptoras de antígenos quiméricos que tienen niveles reducidos de GM-CSF. También se proporcionan métodos para preparar y usar células T receptoras de antígenos quiméricos que tienen niveles reducidos de GM-CSF. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCION

Materiales y métodos para el tratamiento del cáncer

ANTECEDENTES

1. Campo técnico

[0001]Este documento se relaciona con materiales involucrados en el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, este documento proporciona métodos para producir células T con receptor de antígeno quimérico que tienen niveles de expresión reducidos de una o más citocinas (por ejemplo, GM-CSF) y su uso en terapia celular adoptiva (por ejemplo, una terapia con células T con receptor de antígeno quimérico)paratratar un mamífero (por ejemplo, un ser humano) que tiene cáncer.

2. Información previa

[0002]Los resultados sin precedentes de ensayos fundamentales que evalúan la seguridad y eficacia de las células T del receptor de antígeno quimérico dirigido CD19 (CART19) han llevado a la reciente aprobación por parte de la FDA de CART19 (Tisagenlecleucel) para la leucemia linfoblástica aguda (LLA) refractaria recidivante y de CART19 (Axi-Cel) para el tratamiento del linfoma difuso de células B grandes (DLBCL). La aplicación de la terapia con células CART se asocia con toxicidades que resultan en síndrome de liberación de citocinas (SLC) y neurotoxicidad. Además, la eficacia de la terapia con células CART se limita a sólo un 40% de remisiones duraderas en el linfoma y un 50-60% de remisiones duraderas en la leucemia aguda.

[0003]El documento WO 2015/066262 divulga métodos para prevenir o reducir la toxicidad de la terapia celular adoptiva utilizando una población de células deficientes en la expresión o actividad de GM-CSF, receptor de GM-CSF o perforina.

[0004]El documento WO 2014/011984 describe el tratamiento del cáncer en un paciente mediante una terapia de primera línea que comprende administrar a un paciente una célula T genéticamente modificada que expresa un CAR en el que el CAR comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana, una región de señalización coestimuladora y un CD3. dominio de señalización zeta y monitorear los niveles de citocinas en el paciente después de la infusión de células T para determinar el tipo apropiado de terapia de segunda línea para el paciente como consecuencia de la presencia de células T con CAR en el paciente.

RESUMEN

[0005]La presente invención proporciona un método para producir una célula T receptora de antígeno quimérico que tiene un nivel reducido de polipéptidos del factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), comprendiendo el método:

introducir una construcción de ácido nucleico en una célula T ex vivo, en donde la construcción de ácido nucleico comprende: a) un ácido nucleico que codifica un ARN guía, en donde el ARN guía es complementario a un ARN mensajero de GM-CSF, b) un ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas, y c) un ácido nucleico que codifica el antígeno quimérico receptor, en donde el ácido nucleico que codifica el receptor de antígeno quimérico comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 2 y en donde el receptor de antígeno quimérico se dirige al antígeno asociado a tumor CD19.

[0006]En una forma de realización, el ARN guía comprende una secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 1.

[0007]En una forma de realización, la nucleasa Cas es la nucleasa Cas9.

[0008]En una forma de realización, la construcción de ácido nucleico es un vector viral. En una forma de realización, el vector viral es un vector lentiviral.

[0009]En una forma de realización, la etapa de introducción comprende la transducción.

[0010]En una forma de realización, las células T (CART) del receptor de antígeno quimérico (CAR) tienen un nivel de expresión reducido de polipéptidos GM-CSF. Por ejemplo, se puede diseñar una célula T (p. ej., un CART) para que tenga una expresión reducida del polipéptido GM-CSF (p. ej., para uso en terapia celular adoptiva). En algunos casos, se puede diseñar una célula T (por ejemplo, un CART) para eliminar (KO) un ácido nucleico que codifica un polipéptido g M-CSF para reducir la expresión del polipéptido GM-CSF en esa célula T. Se pueden administrar células T (por ejemplo, CART) que tienen un nivel reducido de polipéptidos GM-CSF (por ejemplo, en una terapia celular adoptiva) a un mamífero que tiene cáncer para tratar al mamífero.

[0011]Como se demuestra en este documento, los GM-CSF KO CART producen niveles reducidos de GM-CSF y continúan funcionando normalmente en modelos tantoin vitrocomoin vivo.También como se demuestra en este documento, los CART KO de GM-CSF pueden mejorar la función de las células CART y la actividad antitumoral. Por ejemplo, se puede observar una mayor proliferación de células CART y actividad antitumoral después del agotamiento de GM-CSF. La proliferación específica del antígeno CART19 en presencia de monocitos puede aumentarin vitrodespués del agotamiento del GM-CSF. En todos los xenoinjertos derivados de pacientes, las células CART19 pueden dar como resultado un control de la enfermedad más duradero cuando se combinan con lenzilumab, y las células GM-CSFW° CART19 pueden ser más efectivas para controlar la leucemia en xenoinjertos NALM6. En algunos casos, los CART KO de GM-CSF se pueden incorporar en terapias con células T adoptivas (por ejemplo, terapias con células CART), por ejemplo, para su uso en el tratamiento de mamíferos que tienen cáncer sin dar como resultado CRS y/o neurotoxicidad. Por ejemplo, los CART KO de GM-CSF se pueden incorporar en terapias de células T adoptivas (p. ej., terapias con células CART) para mejorar la ventana terapéutica después de la terapia con células CART. En algunos casos, se puede usar una única construcción tanto para introducir un CAR en una célula (por ejemplo, una célula T) como para reducir o eliminar la expresión de uno o más polipéptidos de citoquinas en esa misma célula.

[0012]La presente invención también proporciona una célula T receptora de antígeno quimérico que tiene un nivel reducido de polipéptidos del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde la célula T receptora de antígeno quimérico comprende un receptor de antígeno quimérico codificado por la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 2 y en la que el receptor de antígeno quimérico se dirige al antígeno asociado al tumor CD19.

[0013]En una forma de realización, el cáncer es un linfoma. En una forma de realización, el linfoma es un linfoma difuso de células B grandes.

[0014]En una forma de realización, el cáncer es una leucemia. En una forma de realización, la leucemia es una leucemia linfoblástica aguda.

[0015]La presente invención proporciona además un método para mejorar las funciones efectoras de células T de una célula T receptora de antígeno quimérico, comprendiendo el método:

introducir una construcción de ácido nucleico en una célula T ex vivo, en donde la construcción de ácido nucleico comprende: a) un ácido nucleico que codifica un ARN guía, en el que el ARN guía es complementario a un ARN mensajero de GM-CSF b) un ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas, y c) un ácido nucleico que codifica el receptor de antígeno quimérico, en el que el ácido nucleico que codifica el receptor de antígeno quimérico comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO:2 y en la que el receptor de antígeno quimérico se dirige al antígeno asociado al tumor CD19.

[0016]A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento para poner en práctica la invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados.

[0017]Los detalles de una o más formas de realización de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y en la descripción siguiente. Otras características, objetos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción, los dibujos y las reivindicaciones.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0018]

La Figura 1 contiene un esquema de un método ejemplar de uso de CRISPR para diseñar una celda de desactivación (KO) de GM-CSF. Se sintetizó ARN guía (GACCTGCCTACAGACCCGCC; SEQ ID NO:1) dirigido al exón 3 de GM-CSF (también conocido como factor 2 estimulante de colonias (CSF2)) y se clonó en un plásmido de lentivirus (LV). Este plásmido LV se usó para transducir células 293T y se recogieron partículas de lentivirus a las 24 horas y 48 horas y se concentraron. Para generar células CART inactivadas con GM-CSF, las células T se estimularon con perlas CD3/CD28 el día 0. El día 1, las células T se transdujeron con partículas de lentivirus CAR19 y simultáneamente con partículas de lentivirus CRISPR/Cas9 inactivadas con GM-CSF. Las células T se expandieron durante 8 días y luego se recogieron.

Las Figuras 2A y 2B muestran la transducción de CAR y la eficiencia de eliminación de GM-CSF. La Figura 2A contiene un gráfico que muestra que el lentivirus CRISPR/Cas9 con un ARN guía dirigido al exón 3 de GM-CSF dio como resultado una eficacia de eliminación del 24,1 %. Al final de la expansión, se recolectaron células CART, se aisló el ADN y se envió para secuenciarlo para compararlo con las secuencias de control. Esto arrojó una eficiencia de nocaut del 24,1%. La Figura 2B contiene un análisis de citometría de flujo que muestra que la eficiencia de transducción de CAR después de la transducción con lentivirus fue del 73%. El análisis de citometría de flujo se realizó el día 6 después de la transducción de lentivirus.

La Figura 3 muestra que las células GM-CSF KO CART19 producen menos GM-CSF en comparación con las células CART, y las células T de control knockout de g M-CSF producen menos cantidad de GM-CSF en comparación con las células T de control no transducidas (UTD). CART19, GM-CSF KO CART19, UTD o GM-CSF KO UTD se cocultivaron con la línea celular CD19 positiva NALM6 en una proporción de 1:5. 4 horas más tarde, las células se recogieron, permeabilizaron y fijaron; y se realizó tinción intracelular para citoquinas.

La Figura 4 muestra que las células GM-CSF KO CART19 se expanden con mayor fuerza en comparación con CART19. Después de transducir las células T con el virus, se siguió su cinética de expansión. GM-CSF KO se expande de manera más sólida en comparación con CART19 solo.

La Figura 5 muestra una secuencia de ácido nucleico ejemplar (SEQ ID NO:2) que codifica un CAR dirigido a CD19 (CAR19).

Las Figuras 6A-6D muestran que la neutralización de GM-CSFin vitromejora la proliferación de células CART en presencia de monocitos y no altera la función efectora de las células CART.

La Figura 6A contiene un gráfico que muestra que lenzilumab neutraliza el GM-CSF producido por células CARTin vitroen comparación con el tratamiento de control de isotipo analizado por multiplex después de 3 días de cultivo con CART19 en medio solo o CART19 cocultivo con NALM6, n=2 experimentos, 2 réplicas por experimento, experimento representativo representado, *** p<0,001 entre lenzilumab y el tratamiento de control de isotipo, prueba t, media±SEM. La Figura 6B contiene un gráfico que muestra que el tratamiento con anticuerpos neutralizantes GM-CSF no inhibió la capacidad de las células CART para proliferar según lo analizado mediante el ensayo de proliferación de citometría de flujo CSFE de células CD3 vivas, n = 2 experimentos, 2 réplicas por experimento, experimento representativo al punto temporal del día 3 representado, ns p>0,05 entre lenzilumab y el tratamiento de control de isotipo, prueba t, media±SEM. Solo: CART19 en medio solo, MOLM13: CART19+MOLM13, PMA/ION: CART19+5ng/mL PMA/0,1ug/mL ION, NALM6: CART19+NALM6. La Figura 6C contiene un gráfico que muestra que lenzilumab mejoró la proliferación de CART19 en comparación con el control de isotipo tratado con CART19 cuando se cocultivó con monocitos n = 3 réplicas biológicas a los 3 días, 2 réplicas por réplica biológica, **** p<0,0001, media±SEM. La Figura 6D contiene gráficos que muestran que el tratamiento con lenzilumab no inhibió la citotoxicidad de CART19 o células T no transducidas (UTD) cuando se cultivaron con NALM6, n=2 experimentos, 2 réplicas por experimento, se muestra el experimento representativo a las 48 horas, ns p>0,05 entre lenzilumab y tratamiento de control de isotipo, prueba t, media±SEM.

Las Figuras 7A-7E muestran que la neutralización de GM-CSFin vivomejora la actividad antitumoral de las células CART en modelos de xenoinjerto. La Figura 7A contiene un esquema experimental que muestra que a ratones NSG se les inyectó la línea celular CD19+ luciferasa+ NALM6 (1x106 células por ratón I.V). 4-6 días después, se tomaron imágenes de los ratones, se aleatorizaron y recibieron 1-1.5x106CART19 o un número equivalente de células totales de células UTD de control al día siguiente con lenzilumab o IgG de control (10 mg/kg, administrados IP diariamente durante 10 días, a partir del día de la inyección CART). Los ratones fueron seguidos con imágenes de bioluminiscencia en serie para evaluar la carga de la enfermedad a partir del día 7 después de la inyección de células CART y fueron seguidos para determinar la supervivencia general. El sangrado de la vena de la cola se realizó 7-8 días después de la inyección de células CART. La Figura 7B contiene un gráfico que muestra que lenzilumab neutraliza el GM-CSF sérico producido por CARTin vivoen comparación con el tratamiento de control de isotipo analizado con GM-CSF singleplex, n=2 experimentos, 7-8 ratones por grupo, experimento representativo, suero del día 8 posterior. Inyección de células CART/UTD, *** p<0,001 entre lenzilumab y el tratamiento de control de isotipo, prueba t, media±SEM. La Figura 7C contiene un gráfico que muestra que los CART tratados con lenzilumabin vivoson igualmente eficaces para controlar la carga tumoral en comparación con los CART tratados con control de isotipo en un modelo de xenoinjerto de LLA con recaída de carga tumoral alta, día 7 después de la inyección de CART, n=2 experimentos, 7-8 ratones por grupo, experimento representativo representado, *** p<0,001, * p<0,05, ns p>0,05, prueba t, media±SEM. La Figura 7D contiene un esquema experimental que muestra que a ratones NSG se les inyectaron blastos derivados de pacientes con LLA (1x106 células por ratón I.V). Los ratones se sangraron en serie y cuando las células CD19+ >1/uL, los ratones se aleatorizaron para recibir 5x106 CART19 (la eficiencia de transducción es de alrededor del 50%) o células UTD con lenzilumab o IgG de control (10 mg/kg, administrados IP diariamente durante 10 días), a partir del día de la inyección CART). Los ratones fueron seguidos con sangrado en serie de la vena de la cola para evaluar la carga de la enfermedad a partir del día 14 después de la inyección de células CART y fueron seguidos para determinar la supervivencia general. La Figura 7E contiene un gráfico que muestra que el tratamiento con lenzilumab con terapia CART da como resultado un control más sostenido de la carga tumoral a lo largo del tiempo en un modelo de xenoinjerto de leucemia linfoblástica aguda primaria (LLA) en comparación con el tratamiento de control de isotipo con terapia CART, 6 ratones por grupo, ** p <0,01, * p<0,05, ns p>0,05, prueba t, media±SEM.

La Figura 8 contiene un gráfico que muestra que los ratones tratados con lenzilumab+células CART tienen una supervivencia comparable en comparación con los ratones tratados con control de isotipo+células CART en un modelo de xenoinjerto de LLA con recaída de alta carga tumoral. n = 2 experimentos, 7-8 ratones por grupo, experimento representativo representado, **** p<0,0001, *** p<0,001, * p<0,05, rango logarítmico.

La Figura 9 contiene un gráfico que muestra una secuencia TIDE representativa para verificar la alteración del genoma en las células CART desactivadas CRISPR Cas9 de<g>M-CSF. n = 2 experimentos, experimento representativo representado.

Las Figuras 10A-10E muestran que las células CART inactivadas con GM-CSF CRISPR exhiben una expresión reducida de GM-CSF, niveles similares de citoquinas clave y una actividad antitumoral mejorada. La Figura 10A contiene gráficos que muestran que el CRISPR Cas9 GM-CSFW° CART exhibe una producción reducida de GM-CSF en comparación con el CART19 de tipo salvaje, pero la producción y desgranulación de otras citoquinas no son inhibidas por la alteración del gen g M-CSF, n=3 experimentos, 2 réplicas por experimento, *** p<0,001, * p<0,05, ns p>0,05 comparando GM-CSF k/o CART y CART, prueba t, media±SEM. La Figura 10B contiene un gráfico que muestra que GM-CSF k/o CART tiene GM-CSF humano en suero reducidoin vivoen comparación con el tratamiento con CART según lo analizado por multiplex, 5-6 ratones por grupo (4-6 en el momento del sangrado, 8 días después). Inyección CART), **** p<0,0001, *** p<0,001 entre células GM-CSF k/o CART y células CART de tipo salvaje, prueba t, media±SEM. La Figura 10C contiene un gráfico que muestra que GM-CSFk/o CART19in vivomejora la supervivencia general en comparación con CART19 de tipo salvaje en un modelo de xenoinjerto de LLA con recaída de alta carga tumoral, 5-6 ratones por grupo, ** p<0,01, rango logarítmico. Las Figuras 10D y 10E contienen mapas de calor que muestran citoquinas humanas (D) y de ratón (E) de suero múltiple, distintas del GM-CSF humano, no muestran diferencias estadísticas entre las células CART GM-CSF k/o y las células CART de tipo salvaje implica además que las citocinas críticas de las células T no se agotan negativamente al reducir la expresión de GM-CSF, 5-6 ratones por grupo (4-6 en el momento del sangrado), **** p<0,0001, prueba t.

La Figura 11 contiene un gráfico que muestra que las células CART inactivadas con GM-CSFin vivomuestran un control ligeramente mejorado de la carga tumoral en comparación con CART en un modelo de xenoinjerto de LLA con recaída de carga tumoral alta. Los días posteriores a la inyección de CART figuran en el eje x, 5-6 ratones por grupo (2 permanecieron en el grupo UTD el día 13), experimento representativo representado, **** p<0,0001, * p<0,05, ANOVA de 2 vías, media+SEM.

Las Figuras 12A-12D muestran el modelo de xenoinjerto derivado del paciente para neurotoxicidad y síndrome de liberación de citoquinas. La Figura 12A contiene un esquema experimental que muestra que los ratones recibieron 1-3x106 blastos primarios derivados de la sangre periférica de pacientes con LLA primaria. Se monitorizó el injerto de los ratones durante -10-13 semanas mediante sangrado de la vena de la cola. Cuando las células CD19+ en suero eran >106 células/uL, los ratones recibieron CART19 (2-5x106 células) y comenzaron la terapia con anticuerpos durante un total de 10 días, como se indica. Los ratones fueron pesados diariamente como medida de su bienestar. Se realizaron resonancias magnéticas de cerebro de ratón entre 5 y 6 días después de la inyección de CART19 y el sangrado de la vena de la cola para detectar citoquinas y un análisis de células T se realizó entre 4 y 11 días después de la inyección de CART19, 2 experimentos independientes. La Figura 12B contiene un gráfico que muestra que la combinación de neutralización de GM-CSF con CART19 es igualmente eficaz que los anticuerpos de control de isotipo combinados con CART19 para controlar la carga de células CD19+ de LLA, experimento representativo, 3 ratones por grupo, 11 días después de la inyección de CART19, * p< 0,05 entre neutralización de GM-CSF+CART19 y control de isotipo+CART19, prueba t, media±SEM. La Figura 12C contiene una imagen que muestra que la resonancia magnética cerebral con terapia CART19 muestra una mejora en T1, lo que sugiere una alteración de la barrera hematoencefálica del cerebro y un posible edema. 3 ratones por grupo, 5-6 días después de la inyección de CART19, imagen representativa. La Figura 12D contiene gráficos que muestran que los xenoinjertos de LLA primaria con carga tumoral elevada tratados con CART19 muestran infiltración de células CD3 humanas en el cerebro en comparación con controles PDX no tratados. 3 ratones por grupo, imagen representativa.

Las Figuras 13A-13D muestran que la neutralización de GM-CSFin vivomejora el síndrome de liberación de citocinas después de la terapia con CART19 en un modelo de xenoinjerto. La Figura 13A contiene un gráfico que muestra que el lenzilumab y el anticuerpo anti-GM-CSF de ratón previenen la pérdida de peso inducida por CRS en comparación con ratones tratados con CART19 y anticuerpos de control de isotipo, 3 ratones por grupo, anova de 2 vías, media±SEM. La Figura 13B contiene un gráfico que muestra que el GM-CSF humano se neutralizó en xenoinjertos derivados de pacientes tratados con lenzilumab y anticuerpo neutralizante de GM-CSF de ratón, 3 ratones por grupo, *** p<0,001, * p<0,05, prueba t, media±SEM. La Figura 13C contiene un mapa de calor que muestra que las citoquinas humanas (suero recolectado 11 días después de la inyección de CART19) exhiben un aumento en las citoquinas típicas de CRS después del tratamiento con CART19. La neutralización de GM-CSF da como resultado una disminución significativa de varias citocinas en comparación con los ratones tratados con CART19 y anticuerpos de control de isotipo, incluidas varias citocinas asociadas a mieloides, como se indica en el panel, 3 ratones por grupo, suero del día 11 después de la inyección de CART19, *** p< 0,001, ** p<0,01, * p<0,05, comparando ratones tratados con anticuerpo neutralizante GM-CSF y ratones tratados con control de isotipo que recibieron terapia con células CART, prueba t. La Figura 13D contiene un mapa de calor que muestra que las citocinas de ratón (suero recogido 11 días después de la inyección de CART19) presentan un aumento en las citocinas de ratón típicas de CRS después del tratamiento con CART19. La neutralización de GM-CSF da como resultado una disminución significativa de varias citocinas en comparación con los tratados con CART19 con anticuerpos de control, incluidas varias citocinas diferenciadoras mieloides, como se indica en el panel, 3 ratones por grupo, suero del día 11 después de la inyección de CART19, * p<0,05. comparación de ratones tratados con anticuerpo neutralizante GM-CSF y ratones tratados con control de isotipo que recibieron terapia con células CART, prueba t.

Las Figuras 14A-14D muestran que la neutralización de GM-CSFin vivomejora la neurotoxicidad después de la terapia con CART19 en un modelo de xenoinjerto. Las Figuras 14A y 14B muestran que la resonancia magnética con hiperintensidad T1 (mm cúbicos) mejorada con gadolinio mostró que la neutralización de GM-CSF ayudó a reducir la inflamación cerebral, la alteración de la barrera hematoencefálica y el posible edema en comparación con las imágenes representativas de control de isotipo (A), (B) 3 ratones por grupo, ** p<0,01, * p<0,05, ANOVA de 1 vía, media+DE. La Figura 14C contiene un gráfico que muestra que las células T CD3 humanas estaban presentes en el cerebro después del tratamiento con terapia CART19. La neutralización de GM-CSF dio como resultado una tendencia hacia una disminución de la infiltración de CD3 en el cerebro, según lo analizado mediante citometría de flujo en hemisferios cerebrales, 3 ratones por grupo, media±SEM. La Figura 14D contiene un gráfico que muestra que los macrófagos brillantes CD11b+ disminuyeron en los cerebros de ratones que recibieron neutralización de GM-CSF durante la terapia CART en comparación con el control de isotipo durante la terapia CART según lo analizado mediante citometría de flujo en hemisferios cerebrales, 3 ratones por grupo, media±SEM.

Las Figuras 15A-15B muestran una generación ejemplar de células GM-CSFk/o CART19. El esquema experimental representa el esquema. La Figura 15A muestra una secuencia de ARNg dirigida a la ubicación en CSF2 (GACCTGCCTACAGACCCGCC; SEQ ID NO:11) para la generación de GM-CSFk/o CART19. La Figura 15B muestra las secuencias de los cebadores (TGACTACAGAGAGGGCACAGA (SEQ ID NO:12) y TCACCTCTGACCTCATTAACC (SEQ ID NO:13)) y la secuencia de ARNg (GACCTGCCTACAGACCCGCC; SEQ ID NO:7) usadas para la generación de GM-CSf<w>° CART19. Para generar células GM-CSFk/o CART19, se clonó ARNg en un vector de lentivirus Cas9 bajo el control de un promotor U6 y se usó para7producción de lentivirus. Las células T derivadas de donantes normales se estimularon con perlas CD3/CD28 y se transdujeron dualmente con virus CAR19 y virus CRISPR/Cas9 24 horas después. La eliminación de las perlas magnéticas CD3/CD28 se realizó el día 6 y las células GM-CSFk/° CART19 o las células CART19 de control se criopreservaron el día 8.

La Figura 16 muestra un diagrama de flujo para los procedimientos utilizados en la secuenciación de ARN. Los datos de llamada de base binaria se convirtieron a fastq utilizando el software Illumina bcl2fastq. Las secuencias del adaptador se eliminaron usando Trimmomatic y se usó FastQC para verificar la calidad. Los últimos genomas de referencia humanos (GRCh38) y de ratón (GRCm38) se descargaron del NCBI. Los archivos de índice del genoma se generaron utilizando STAR30 y las lecturas finales emparejadas se asignaron al genoma para cada condición. Se usó HTSeq para generar recuentos de expresión para cada gen y DeSeq2 para calcular la expresión diferencial. La ontología genética se evaluó utilizando Enrichr.

Las Figuras 17A-17B muestran que los receptores de GM-CSF están regulados positivamente en las células T y en las células CART tras la estimulación. La Figura 17A muestra mediciones de CSF2RA (CD116) y CSF2RB (CD131) en células T versus células T en reposo (control negativo) durante el protocolo de expansión de células T de 8 días con perlas CD3/CD28. La expresión de CSF2RA y CSF2RB aumentó después de la estimulación inicial, alcanzó su punto máximo el día 3 y se redujo ligeramente después del desprendimiento el día 6. La Figura 17B muestra mediciones de CSF2RA (CD116) y CSF2RB (CD131) en células CART19 y UTD versus control durante la producción de CART de 8 días. La expresión disminuyó ligeramente el día 1 y alcanzó su punto máximo el día 3.

La Figura 18 muestra que la interacción de GM-CSF con el receptor CSF2 depende de la cadena beta (CSF2RB). La expresión de la proteína StatS fosforilada aumentó en presencia de bloqueo de Nalm6 y CSF2RA irradiado, pero disminuyó en presencia de bloqueo de GM-CSF y CSF2RB. FAS está aguas abajo de la vía del receptor CSF2 (ver, por ejemplo, Takesono et al., Journal of Cell Science 115:3039-3048 (2002)) y su expresión disminuye ligeramente en presencia de bloqueo de GM-CSF con Nalm6 irradiado pero no Bloqueo de CSF2RA o CSF2RB.

Las Figuras 19A-19C muestran diferencias de transcriptoma entre GM-CSFk/° CART19 y CART19 el día 8 de producción de CART. La Figura 19A muestra 236 genes que se expresaron de manera significativamente diferencial (valor de p ajustado de Benjamin-Hochberg <0,05). La Figura 19B muestra genes que estaban significativamente regulados negativamente en GM-CSFk/° CART19 frente a CART19. Un gráfico de volcán muestra un aumento en genes significativamente regulados a la baja entre GM-CSFk/° CART19 y CART19. La Figura 19C muestra que la desactivación de GM-CSF de CART19 normalizó la expresión génica.

Las Figuras 20A-20C muestran un método ejemplar para la edición precisa específica del gen CSF2 mediante CRISPR-Cas9. La Figura 20A muestra un sitio de corte esperado de CSF2 CRISPR ARNg 1 (SEQ ID NO:7) (3 pb aguas arriba de PAM) versus el sitio de corte real (6 pb aguas arriba de PAM) (panel superior). Una secuencia de referencia (SEQ ID NO:1), un esquema de deleción (SEQ ID NO:8) y un esquema de inserción (SEQ ID NO:9), y la frecuencia de deleción e inserción en la base 132074828 del cromosoma 5 en cada réplica biológica. También se muestra CART19 (panel inferior). La Figura 20B muestra recuentos de variantes de un solo nucleótido (SNV) y recuentos de inserción/deleción (indel) en las condiciones de desactivación de CRISPR en comparación con sus controles (células T y células CART19). La Figura 20C muestra una representación de las variantes totales encontradas en células editadas con CRISPR frente a su control respectivo (CART19 o células T). El único SNP en la intersección es la eliminación en el gen CSF2 (Figura 20A, panel inferior).

La Figura 21 contiene gráficos que muestran que el bloqueo de GM-CSF en presencia de macrófagos M2 mejora significativamente la expansión de CART19 tras la estimulación de CD19 en comparación con el tratamiento con control de isotipo. **p<0,005.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0019]La presente invención proporciona un método para producir una célula T receptora de antígeno quimérico que tiene un nivel de expresión reducido de uno o más polipéptidos de citocina GM-CSF, comprendiendo dicho método:

introducir una construcción de ácido nucleico en una célula T ex vivo, en donde la construcción de ácido nucleico comprende: a) un ácido nucleico que codifica un ARN guía, en donde el ARN guía es complementario a un ARN mensajero de GM-CSF, b) un ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas, y c) un ácido nucleico que codifica el receptor de antígeno quimérico, en donde el ácido nucleico que codifica el receptor de antígeno quimérico comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 2 y en la que el receptor de antígeno quimérico se dirige al antígeno asociado a tumor CD19.

[0020]En algunos casos, se puede diseñar una célula T (p. ej., CART) para eliminar (KO) un ácido nucleico que codifica un polipéptido GM-CSF para reducir la expresión del polipéptido GM-CSF en esa célula T (p. ej., en comparación con una célula T que no está diseñado para eliminar un ácido nucleico que codifica un polipéptido GM-CSF). Una célula T que está diseñada para KO de un ácido nucleico que codifica un polipéptido GM-CSF también puede denominarse en el presente documento célula T GM-CSF KO. En algunos casos, los CART se pueden utilizar para modular las células mieloides. En algunos casos, los CART se pueden utilizar para agotar las células mieloides. En algunos casos, los CART se pueden utilizar para mejorar la eficacia de las células T (p. ej., CART).

[0021]Una célula T (por ejemplo, un CART) preparada mediante el método de la presente invención se puede diseñar para que tenga un nivel de expresión reducido de un polipéptido GM-CSF y, opcionalmente, también un polipéptido de interleucina 6 (IL-6), un G-CSF, un polipéptido de interferón gamma (IFN-g), un polipéptido de IL-1B, un polipéptido de IL-10, un polipéptido de proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1), una monocina inducida por un polipéptido gamma (MIG), una proteína inflamatoria de macrófagos (MIP)) polipéptido (por ejemplo, un polipéptido MIP-1p), un polipéptido del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), un polipéptido IL-2, un polipéptido de perforina, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, se puede diseñar una célula T para que tenga un nivel de expresión reducido de polipéptidos tanto de GM-CSF como de IL-6.

[0022]El término "nivel reducido" como se usa en el presente documento con respecto a un nivel de expresión de una citocina (por ejemplo, GM-CSF) se refiere a cualquier nivel que sea inferior a un nivel de expresión de referencia de esa citocina (por ejemplo, GM-CSF). El término "nivel de referencia" como se usa en el presente documento con respecto a una citoquina (por ejemplo, GM-CSF) se refiere al nivel de esa citoquina (por ejemplo, GM-CSF) normalmente observado en una muestra (por ejemplo, una muestra de control) de uno o más mamíferos (por ejemplo, humanos) no diseñados para tener un nivel de expresión reducido de esa citocina (por ejemplo, polipéptidos GM-CSF) como se describe en el presente documento. Las muestras de control pueden incluir células T que son células T de tipo salvaje (p. ej., células T que no son células T GM-CSF KO). En algunos casos, un nivel de expresión reducido de un polipéptido de citoquina (por ejemplo, un polipéptido GM-CSF) puede ser un nivel indetectable de esa citoquina (por ejemplo, GM-CSF). En algunos casos, un nivel de expresión reducido de polipéptidos GM-CSF puede ser un nivel eliminado de GM-CSF.

[0023]En algunos casos, una célula T que tiene (por ejemplo, diseñada para tener) un nivel de expresión reducido de uno o más polipéptidos de citoquinas tales como una célula T GM-CSF KO puede mantener funciones normales de las células T tales como la degranulación de células T y liberación de citocinas (p. ej., en comparación con un CART que no está diseñado para tener un nivel de expresión reducido de esa citocina (p. ej., polipéptidos GM-CSF) como se describe en el presente documento).

[0024]En algunos casos, una célula T que tiene (por ejemplo, diseñada para tener) un nivel reducido de polipéptidos GM-CSF (por ejemplo, una célula T GM-CS<f>KO) puede tener una función CART mejorada tal como actividad antitumoral, proliferación, destrucción celular, producción de citoquinas, susceptibilidad al agotamiento, funciones efectoras específicas de antígeno, persistencia y diferenciación (p. ej., en comparación con un CART que no está diseñado para tener un nivel reducido de polipéptidos GM-CSF como se describe en el presente documento).

[0025]En algunos casos, una célula T que tiene (p. ej., diseñada para tener) un nivel reducido de polipéptidos GM-CSF (p. ej., una célula T GM-CSF KOT) puede tener una expansión de células T mejorada (p. ej., en comparación con un CART que no está diseñado para tener un nivel reducido de polipéptidos GM-CSF como se describe en el presente documento).

[0026]Una célula T que tiene (por ejemplo, diseñada para tener) un nivel de expresión reducido de una o más citoquinas (por ejemplo, un polipéptido GM-CSF) tal como una célula T GM-CSF KO puede ser cualquier célula T apropiada. Una célula T puede ser una célula T ingenua. Ejemplos de células T que pueden diseñarse para tener un nivel de expresión reducido de una o más citocinas como se describe en el presente documento incluyen células T citotóxicas (por ejemplo, CTL CD4+ y/o CTL CD8+). Por ejemplo, una célula T que puede diseñarse para que tenga un nivel reducido de polipéptidos GM-CSF como se describe en el presente documento puede ser un CART. En algunos casos, se pueden obtener una o más células T de un mamífero (por ejemplo, un mamífero que tiene cáncer). Por ejemplo, las células T se pueden obtener de un mamífero para tratarlo como se describe en el presente documento.

[0027]Una célula T que tiene (p. ej., diseñada para tener) un nivel de expresión reducido de uno o más polipéptidos de citoquinas (p. ej., un polipéptido GM-CSF) tal como una célula T GM-CSF Ko se puede generar usando cualquier método apropiado. En algunos casos, se puede diseñar una célula T (por ejemplo, CART) para eliminar un ácido nucleico que codifica un polipéptido GM-CSF para reducir la expresión del polipéptido GM-CSF en esa célula T.

[0028]En algunos casos, cuando una célula T (p. ej., CART) se diseña para eliminar un ácido nucleico que codifica una citocina (p. ej., un polipéptido GM-CSF) para reducir la expresión de ese polipéptido de citoquina en esa célula T, se puede utilizar cualquier método apropiado. utilizado para KO un ácido nucleico que codifica esa citocina. Ejemplos de técnicas que pueden usarse para eliminar una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de citocina (por ejemplo, un polipéptido GM-CSF) incluyen edición de genes, recombinación homóloga, unión de extremos no homólogos y unión de extremos por microhomología. Por ejemplo, se puede utilizar la edición de genes (por ejemplo, con nucleasas diseñadas) para eliminar un ácido nucleico que codifica un polipéptido GM-CSF. Las nucleasas útiles para la edición del genoma incluyen nucleasas asociadas a CRISPR (Cas), nucleasas con dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALE) y endonucleasas homing (HE; también denominadas meganucleasas).

[0029]En algunos casos, se puede utilizar un sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR)/Cas (p. ej., se puede introducir en una o más células T) para KO un ácido nucleico que codifica un polipéptido de citocina (p. ej., un polipéptido GM-CSF) (véanse, por ejemplo, la Figura 1 y el Ejemplo 1). Un sistema CRISPR/Cas utilizado para KO un ácido nucleico que codifica un polipéptido de citocina (por ejemplo, un polipéptido GM-CSF) puede incluir cualquier ARN guía apropiado (ARNg). En algunos casos, un ARNg puede ser complementario de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de GM-CSF (por ejemplo, un ARNm de GM-CSF). Ejemplos de ARNg que son específicos de un ácido nucleico que codifica un polipéptido GM-CSF incluyen GACCTG<c>C<t>A<c>AGACCCGCC (S<e>Q ID NO:1), GCAGTGCTGCTTGTAGTGGC (SEQ ID NO: 10), TCAGGAGAGCCGGGCCTCC (SEQ ID NO:3), CAGCAGCAGTGTCTCTACTC (SEQ ID NO: 4), CTCAGAAATGTTTGACCTCC (SEQ ID NO:5) y GGCCGGTCTCACTCCTGGAC (SEQ ID NO:6). En algunos casos, un componente de ARNg de un sistema CRISPR/Cas diseñado para KO un ácido nucleico que codifica un polipéptido GM-CSF puede incluir la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO:1.

[0030]Un sistema CRISPR/Cas utilizado para eliminar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de citocina (p. ej., un polipéptido GM-CSF) puede incluir cualquier nucleasa Cas apropiada. Ejemplos de nucleasas Cas incluyen Cas1, Cas2, Cas3, Cas9, Cas10 y Cpf1. En algunos casos, un componente Cas de un sistema CRISPR/Cas diseñado para KO un ácido nucleico que codifica un polipéptido de citocina (por ejemplo, un polipéptido GM-CSF) puede ser una nucleasa Cas9. Por ejemplo, la nucleasa Cas9 de un sistema CRISPR/Cas9 descrito en el presente documento puede ser un lentiCRISPRv2 (ver, por ejemplo, Shalem et al., 2014 Science 343:84-87; y Sanjana et al., 2014 Nature methods 11: 783 784).

[0031]Los componentes de un sistema CRISPR/Cas (p. ej., un ARNg y una nucleasa Cas) utilizados para eliminar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de citocina (p. ej., un polipéptido GM-CSF) se pueden introducir en una o más células T (p. ej., CART). en cualquier formato apropiado. En algunos casos, un componente de un sistema CRISPR/Cas se puede introducir en una o más células T como un ácido nucleico que codifica un ARNg y/o un ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica al menos un ARNg (p. ej., una secuencia de ARNg específica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido GM-CSF) y un ácido nucleico que codifica al menos una nucleasa Cas (p. ej., una nucleasa Cas9) se pueden introducir en uno o más células T. En algunos casos, un componente de un sistema CRISPR/Cas se puede introducir en una o más células T como un ARNg y/o como una nucleasa Cas. Por ejemplo, al menos un ARNg (por ejemplo, una secuencia de ARNg específica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido GM-CSF) y al menos una nucleasa Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas9) se pueden introducir en una o más células T.

[0032]Los componentes de un sistema CRISPR/Cas (p. ej., un ARNg y una nucleasa Cas) se introducen en una o más células T como una construcción de ácido nucleico que codifica los componentes (p. ej., ácido nucleico que codifica un ARNg y ácido nucleico que codifica un ARNg). Nucleasa cas), por ejemplo, una construcción de expresión. Un ácido nucleico que codifica al menos un ARNg y un ácido nucleico que codifica al menos una nucleasa Cas pueden estar en construcciones de ácido nucleico separadas o en la misma construcción de ácido nucleico. En algunos casos, un ácido nucleico que codifica al menos un ARNg y un ácido nucleico que codifica al menos una nucleasa Cas pueden estar en una única construcción de ácido nucleico. Una construcción de ácido nucleico puede ser cualquier tipo apropiado de construcción de ácido nucleico. Ejemplos de construcciones de ácido nucleico que pueden usarse para expresar al menos un ARNg y/o al menos una nucleasa Cas incluyen plásmidos de expresión y vectores virales (por ejemplo, vectores lentivirales). En los casos en los que un ácido nucleico que codifica al menos un ARNg y un ácido nucleico que codifica al menos una nucleasa Cas están en construcciones de ácido nucleico separadas, las construcciones de ácido nucleico pueden ser el mismo tipo de construcción o diferentes tipos de construcciones. En algunos casos, un ácido nucleico que codifica al menos una secuencia de ARNg específica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de citocina (por ejemplo, un polipéptido GM-CSF) y un ácido nucleico que codifica al menos una nucleasa Cas pueden estar en un único vector lentiviral. Por ejemplo, un vector lentiviral que codifica al menos una secuencia de ARNg específica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de citocina (por ejemplo, polipéptido GM-CSF), que codifica al menos un ARNg que incluye la secuencia expuesta en SEQ ID NO:1, y que codifica en Se puede usar al menos una nucleasa Cas9 en la ingenieríaex vivode células T para tener un nivel de expresión reducido de esa citocina (por ejemplo, un polipéptido GM-CSF).

[0033]En algunos casos, los componentes de un sistema CRISPR/Cas (por ejemplo, un ARNg y una nucleasa Cas) se pueden introducir directamente en una o más células T (por ejemplo, como un ARNg y/o como una nucleasa Cas). Se pueden introducir un ARNg y una nucleasa Cas en una o más células T por separado o juntas. En los casos en los que un ARNg y una nucleasa Cas se introducen juntos en una o más células T, el ARNg y la nucleasa Cas pueden estar en un complejo. Cuando un ARNg y una nucleasa Cas están en un complejo, el ARNg y la nucleasa Cas pueden unirse de forma covalente o no covalente. En algunos casos, un complejo que incluye un ARNg y una nucleasa Cas también puede incluir uno o más componentes adicionales. Ejemplos de complejos que pueden incluir componentes de un sistema CRISPR/Cas (por ejemplo, un ARNg y una nucleasa Cas) incluyen ribonucleoproteínas (RNP) y complejos efectores (por ejemplo, que contienen un ARN CRISPR (ARNcr) y una nucleasa Cas). Por ejemplo, en una RNP se pueden incluir al menos un ARNg y al menos una nucleasa Cas. En algunos casos, una RNP puede incluir ARNg y nucleasas Cas en una proporción de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 10:1 (por ejemplo, aproximadamente 1:1 a aproximadamente 10:1, aproximadamente 2:1 a aproximadamente 10:1, aproximadamente 3:1 a aproximadamente 10:1, aproximadamente 5:1 a aproximadamente 10:1, aproximadamente 8:1 a aproximadamente 10:1, aproximadamente 1:1 a aproximadamente 9:1, aproximadamente 1:1 a aproximadamente 7:1, aproximadamente 1:1 a aproximadamente 5:1, aproximadamente 1:1 a aproximadamente 4:1, aproximadamente 1:1 a aproximadamente 3:1, aproximadamente 1:1 a aproximadamente 2:1, aproximadamente 2:1 a aproximadamente 8:1, aproximadamente 3:1 a aproximadamente 6:1, aproximadamente 4:1 a aproximadamente 5:1, o aproximadamente 5:1 a aproximadamente 7:1). Por ejemplo, una RNP puede incluir ARNg y Cas nucleasas en una proporción de aproximadamente 1:1. Por ejemplo, una RNP puede incluir ARNg y Cas nucleasas en una proporción de aproximadamente 2:1. En algunos casos, una RNP que incluye al menos una secuencia de ARNg específica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido GM-CSF (p. ej., que codifica al menos un ARNg que incluye la secuencia expuesta en SEQ ID NO:1) y al menos una nucleasa Cas9 se puede utilizar en la ingenieríaex vivode células T para tener un nivel reducido de polipéptidos GM-CSF.

[0034]Los componentes de un sistema CRISPR/Cas (p. ej., un ARNg y una nucleasa Cas) usados para KO un ácido nucleico que codifica un polipéptido GM-CSF se pueden introducir en una o más células T (p. ej., CART) usando cualquier método apropiado. Un método para introducir componentes de un sistema CRISPR/Cas en una célula T puede ser un método físico. Un método para introducir componentes de un sistema CRISPR/Cas en una célula T puede ser un método químico. Un método para introducir componentes de un sistema CRISPR/Cas en una célula T puede ser un método basado en partículas. Ejemplos de métodos que se pueden usar para introducir componentes de un sistema CRISPR/Cas en una o más células T incluyen electroporación, transfección (por ejemplo, lipofección), transducción (por ejemplo, transducción mediada por vectores virales), microinyección, y nucleofección. En algunos casos, cuando los componentes de un sistema CRISPR/Cas se introducen en una o más células T como ácido nucleico que codifica los componentes, el ácido nucleico que codifica los componentes se puede transducir en una o más células T. Por ejemplo, un vector lentiviral que codifica al menos una secuencia de ARNg específica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido GM-CSF (por ejemplo, que codifica al menos un ARNg que incluye la secuencia expuesta en SEQ ID NO:1) y al menos una nucleasa Cas9 puede ser transducidas en células T (p. ej., células Tex vivo).En algunos casos, cuando los componentes de un sistema CRISPR/Cas se introducen directamente en una o más células T, los componentes se pueden electroporar en una o más células T. Por ejemplo, una RNP que incluye al menos una secuencia de ARNg específica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido g M-CSF (por ejemplo, que codifica al menos un ARNg que incluye la secuencia expuesta en SEQ ID NO:1) y al menos una Cas9 La nucleasa se puede electroporar en células T (p. ej., células Tex vivo).En algunos casos, los componentes de un sistema CRISPR/Cas se pueden introducirex vivoen una o más células T. Por ejemplo, la ingenieríaex vivode células T que tienen un nivel reducido de polipéptidos GM-CSF puede incluir la transducción de células T aisladas con un vector lentiviral que codifica componentes de un sistema CRISPR/Cas. Por ejemplo, la ingenieríaex vivode células T que tienen niveles reducidos de polipéptidos GM-CSF puede incluir electroporación de células T aisladas con un complejo que incluye componentes de un sistema CRISPR/Cas. En los casos en los que las células T se diseñanex vivopara que tengan un nivel reducido de polipéptidos GM-CSF, las células T se pueden obtener de cualquier fuente apropiada (p. ej., un mamífero tal como el mamífero que se va a tratar o un mamífero donante, o una célula línea).

[0035]En algunos casos, una célula T (p. ej., un CART) puede tratarse con uno o más inhibidores de la expresión del polipéptido GM-CSF o de la actividad del polipéptido GM-CSF para reducir la expresión del polipéptido GM-CSF en esa célula T (p. ej., en comparación con una célula T que no fue tratada con uno o más inhibidores de la expresión del polipéptido GM-CSF o de la actividad del polipéptido GM-CSF). Un inhibidor de la expresión del polipéptido<g>M-CSF o de la actividad del polipéptido GM-CSF puede ser cualquier inhibidor apropiado. Los ejemplos de inhibidores de la expresión del polipéptido GM-CSF o de la actividad del polipéptido GM-CSF incluyen moléculas de ácido nucleico diseñadas para inducir interferencia de ARN (p. ej., una molécula de ARNip o una molécula de ARNhc), moléculas antisentido, miARN, bloqueo de receptores y anticuerpos (p. ej., anticuerpos antagonistas y anticuerpos neutralizantes).

[0036] Una célula T que tiene (p. ej., diseñada para tener) un nivel de expresión reducido de una o más citoquinas (p. ej., una célula T GM-CSF KOT) puede expresar (p. ej., puede diseñarse para expresar) cualquier receptor de antígeno. En algunos casos, un receptor de antígeno puede ser un receptor de antígeno heterólogo. En algunos casos, un receptor de antígeno puede ser un CAR. En algunos casos, un receptor de antígeno puede ser un receptor de antígeno tumoral (por ejemplo, antígeno específico de tumor). Por ejemplo, se puede diseñar una célula T para que exprese un receptor de antígeno específico de tumor que se dirige a un antígeno específico de tumor (por ejemplo, un antígeno específico de tumor de superficie celular) expresado por una célula cancerosa en un mamífero que tiene cáncer. Ejemplos de antígenos que pueden ser reconocidos por un receptor de antígeno expresado en una célula T que tiene una expresión reducida de un polipéptido de citocina (por ejemplo, un polipéptido GM-CSF) como se describe en el presente documento incluyen grupo de diferenciación 19 (CD19), mucina 1 (MUC-1), receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER-2), receptor de estrógeno (ER), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), alfafetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionario (CEA), CA-125, antígeno de tumor epitelial (ETA), antígeno asociado al melanoma (MAGE), CD33, CD123, LLC-1, E-Cadherina, receptor de folato alfa, receptor de folato beta, IL13R, EGFRviii, CD22, CD20, cadena ligera kappa, cadena ligera lambda, desmopresina, CD44v, CD45, CD30, CD5, CD7, CD2, CD38, BCMA, CD138, FAP, CS-1 y Cmet. Por ejemplo, se puede diseñar una célula T que tenga un nivel reducido de polipéptidos GM-CSF para expresar un receptor de antígeno dirigido a CD19. En la Figura 5 se muestra una secuencia de ácido nucleico ejemplar que codifica un CAR dirigido a CD19 (CAR19).

[0037] Puede usarse cualquier método apropiado para expresar un receptor de antígeno en una célula T que tiene (por ejemplo, diseñada para tener) un nivel de expresión reducido de uno o más polipéptidos de citoquinas (por ejemplo, una célula T GM-CSF KO). Por ejemplo, se puede introducir un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno en una o más células T. En algunos casos, se puede utilizar la transducción viral para introducir un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno en una célula que no se divide. Se puede introducir un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno en una célula T usando cualquier método apropiado. En algunos casos, un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno puede introducirse en una célula T mediante transducción (por ejemplo, transducción viral usando un vector retroviral tal como un vector lentiviral) o transfección. En algunos casos, un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno se puede introducirex vivoen una o más células T. Por ejemplo, la ingenieríaex vivode células T que expresan un receptor de antígeno puede incluir la transducción de células T aisladas con un vector lentiviral que codifica un receptor de antígeno. En los casos en los que las células T se diseñanex vivopara expresar un receptor de antígeno, las células T se pueden obtener de cualquier fuente apropiada (p. ej., un mamífero tal como el mamífero que se va a tratar o un mamífero donante, o una línea celular).

[0038] En algunos casos, cuando una célula T que tiene (p. ej., diseñada para tener) un nivel de expresión reducido de uno o más polipéptidos de citoquinas (p. ej., una célula T GM-CSF KOT) también expresa (p. ej., está diseñada para expresar) un receptor de antígeno, esa célula T puede diseñarse para que tenga un nivel de expresión reducido de esa citoquina y diseñarse para expresar un receptor de antígeno usando cualquier método apropiado. En algunos casos, se puede diseñar una célula T para que tenga un nivel de expresión reducido de un polipéptido de citocina (por ejemplo, un polipéptido GM-CSF) en primer lugar y diseñar para que exprese un receptor de antígeno en segundo lugar, o viceversa. En algunos casos, se puede diseñar simultáneamente una célula T para que tenga un nivel de expresión reducido de uno o más polipéptidos de citoquinas (por ejemplo, un polipéptido GM-CSF) y para que exprese un receptor de antígeno. Por ejemplo, uno o más ácidos nucleicos usados para reducir la expresión de un polipéptido de citoquina tal como un polipéptido GM-CSF (por ejemplo, un vector lentiviral que codifica al menos una secuencia de ARNg específica de un ácido nucleico que codifica esa citoquina y al menos una nucleasa Cas9 o un ácido nucleico que codifica al menos un oligonucleótido que es complementario al ARNm de esa citocina) y uno o más ácidos nucleicos que codifican un receptor de antígeno (por ejemplo, un CAR) pueden introducirse simultáneamente en una o más células T. Uno o más ácidos nucleicos usados para reducir la expresión de un polipéptido de citocina (por ejemplo, un polipéptido GM-CSF) y uno o más ácidos nucleicos que codifican un receptor de antígeno pueden introducirse en una o más células T en construcciones de ácido nucleico separadas o en una sola. construcción de ácido nucleico. En algunos casos, se utilizan uno o más ácidos nucleicos para reducir la expresión de un polipéptido de citocina (por ejemplo, un polipéptido GM-CSF) y uno o más ácidos nucleicos que codifican un receptor de antígeno se pueden introducir en una o más células T en una única construcción de ácido nucleico. En algunos casos, uno o más ácidos nucleicos usados para reducir la expresión de un polipéptido de citocina (por ejemplo, un polipéptido GM-CSF) y uno o más ácidos nucleicos que codifican un receptor de antígeno se pueden introducir ex vivoenuna o más células T. En los casos en los que las células T se diseñanex vivopara tener niveles de expresión reducidos de uno o más polipéptidos de citoquinas (por ejemplo, un polipéptido GM-CSF) y para expresar un receptor de antígeno, las células T se pueden obtener de cualquier fuente apropiada (por ejemplo, un mamífero tal como el mamífero a tratar o un mamífero donante, o una línea celular).

[0039] En algunos casos, se puede estimular una célula T que tiene (por ejemplo, diseñada para tener) un nivel de expresión reducido de uno o más polipéptidos de citoquinas (por ejemplo, una célula T GM-CSF KO). Una célula T puede estimularse al mismo tiempo que se diseña para que tenga un nivel reducido de uno o más polipéptidos de citocina o independientemente de que se diseña para que tenga un nivel reducido de uno o más polipéptidos de citocina. Por ejemplo, se pueden estimular primero una o más células T que tienen un nivel reducido de polipéptidos de GM-CSF utilizados en una terapia celular adoptiva, y se pueden diseñar para que tengan un nivel de expresión reducido de polipéptidos de GM-CSF en segundo lugar, o viceversa. En algunos casos, se pueden estimular primero una o más células T que tienen un nivel de expresión reducido de un polipéptido de citocina (por ejemplo, un polipéptido GM-CSF) utilizadas en una terapia celular adoptiva, y se pueden diseñar para que tengan un nivel reducido de ese segundo polipéptido de citocina. Una célula T puede estimularse utilizando cualquier método apropiado. Por ejemplo, se puede estimular una célula T poniendo en contacto la célula T con uno o más polipéptidos CD. Ejemplos de polipéptidos<c>D que pueden usarse para estimular una célula T incluyen CD3, CD28, coestimulador de células T inducible (ICOS), CD137, CD2, OX40 y CD27. En algunos casos, se puede estimular una célula T con CD3 y CD28 antes de introducir componentes de un sistema CRISPR/Cas (p. ej., un ARNg y/o una nucleasa Cas) en la célula T para KO un ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos de citoquinas (por ejemplo, un polipéptido GM-CSF).

[0040]La presente invención también proporciona una célula T receptora de antígeno quimérico que tiene un nivel reducido de polipéptidos del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde la célula T receptora de antígeno quimérico comprende un receptor de antígeno quimérico codificado por la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 2 y en la que el receptor de antígeno quimérico se dirige al antígeno asociado al tumor CD19.

[0041]se pueden administrar una o más células T que tienen (por ejemplo, diseñadas para tener) un nivel de expresión reducido de un polipéptido de citocina (por ejemplo, células T g M-CSF KO) (por ejemplo, en una terapia celular adoptiva tal como un CART). terapia) a un mamífero (por ejemplo, un ser humano) que tiene cáncer. En algunos casos, la célula T receptora de antígeno quimérico utilizada en el tratamiento de un mamífero que tiene cáncer como se describe en el presente documento puede reducir el número de células cancerosas (por ejemplo, células cancerosas que expresan un antígeno tumoral) dentro del mamífero. En algunos casos, la célula T receptora de antígeno quimérico utilizada en el tratamiento de un mamífero que tiene cáncer como se describe en el presente documento puede reducir el tamaño de uno o más tumores (por ejemplo, tumores que expresan un antígeno tumoral) dentro de un mamífero.

[0042]En algunos casos, la administración de células T que tienen (por ejemplo, diseñadas para tener) un nivel de expresión reducido de un polipéptido de citocina (por ejemplo, una célula T GM-CSF KO) a un mamífero no da como resultado CRS. Por ejemplo, la administración de células T que tienen un nivel reducido de polipéptidos GM-CSF a un mamífero no da como resultado la liberación de citocinas asociadas con CRS (por ejemplo, citocinas críticas para CRS). Ejemplos de citoquinas asociadas con CRS incluyen IL-6, G-CSF, IFN-g, IL-1B, IL-10, MCP-1, MIG, MIP, MIP 1b, TNF-a, iL-2 y perforina.

[0043]En algunos casos, la administración de células T que tienen (por ejemplo, diseñadas para tener) un nivel de expresión reducido de un polipéptido de citocina (por ejemplo, una célula T GM-CSF KO) a un mamífero no produce neurotoxicidad. Por ejemplo, la administración de células T que tienen un nivel reducido de polipéptidos GM-CSF a un mamífero no da como resultado la diferenciación y/o activación de glóbulos blancos, cuya diferenciación y/o activación está asociada con neurotoxicidad. Ejemplos de glóbulos blancos, cuya diferenciación y/o activación está asociada con neurotoxicidad incluyen monocitos, macrófagos, células T, células dendríticas, microglía, astrocitos y neutrófilos.

[0044]Cualquier mamífero apropiado (por ejemplo, un ser humano) que tenga cáncer puede tratarse como se describe en el presente documento. Ejemplos de mamíferos que pueden tratarse como se describe en el presente documento incluyen humanos, primates (tales como monos), perros, gatos, caballos, vacas, cerdos, ovejas, ratones y ratas. Por ejemplo, un ser humano que tiene un cáncer puede tratarse con una o más células T que tengan (por ejemplo, diseñadas para tener) un niveldeexpresión reducido de un polipéptido GM-CSF en, por ejemplo, una terapia de células T adoptivas tal como una terapia con células CART como se describe en el presente documento.

[0045]Cuando se trata un mamífero (por ejemplo, un ser humano) que tiene un cáncer como se describe en el presente documento, el cáncer puede ser cualquier cáncer apropiado. En algunos casos, el cáncer puede ser un tumor sólido. En algunos casos, el cáncer puede ser un cáncer hematológico. En algunos casos, el cáncer puede ser un cáncer primario. En algunos casos, el cáncer puede ser un cáncer metastásico. En algunos casos, el cáncer puede ser un cáncer refractario. En algunos casos, el cáncer puede ser un cáncer recurrente. En algunos casos, el cáncer puede expresar un antígeno asociado al tumor (p. ej., una sustancia antigénica producida por una célula cancerosa). Los ejemplos de cánceres que pueden tratarse como se describe en el presente documento incluyen cánceres de células B (por ejemplo, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) y leucemias de células B), leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemia mieloide aguda (LMA), mieloma múltiple, cánceres de cabeza y cuello, sarcomas, cáncer de mama, neoplasias malignas gastrointestinales, cánceres de vejiga, cánceres uroteliales, cánceres de riñón, cánceres de pulmón, cánceres de próstata, cánceres de ovario, cánceres de cuello uterino, cánceres genitales (p. ej., cánceres genitales masculinos y cánceres genitales femeninos) y cánceres de huesos. Por ejemplo, una o más células T que tienen (por ejemplo, diseñadas para tener) una reducción Se pueden usar niveles de polipéptidos de GM-CSF (por ejemplo, células T KO de GM-CSF) en el tratamiento de un mamífero que tiene DLBCL. Por ejemplo, se pueden usar una o más células T que tienen (por ejemplo, diseñadas para tener) un nivel reducido de polipéptidos GM-CSF (por ejemplo, células T GM-CSF KO) en el tratamiento de un mamífero que tiene LLA.

[0046]Se puede utilizar cualquier método apropiado para identificar un mamífero que tenga cáncer. Por ejemplo, se pueden usar técnicas de formación de imágenes y técnicas de biopsia para identificar mamíferos (por ejemplo, humanos) que tienen cáncer.

[0047]Una vez identificado que tiene un cáncer (p. ej., DLBCL o LLA), a un mamífero se le pueden administrar una o más células T que tienen (p. ej., diseñadas para tener) un nivel de expresión reducido del polipéptido GM-CSF (p. ej., células T KO g M-CSF) descritas en el presente documento.

[0048]Por ejemplo, una o más células T que tienen (p. ej., diseñadas para tener) un nivel de expresión reducido del polipéptido GM-CSF (p. ej., células T KO GM-CSF) pueden usarse en una terapia de células T adoptivas (p. ej., una terapia con células CART) para tratar un mamífero que tiene cáncer. Por ejemplo, se pueden usar una o más células T que tienen un nivel reducido de polipéptidos GM-CSF en una terapia de células T adoptivas (por ejemplo, una terapia con células CART) dirigida a cualquier antígeno apropiado dentro de un mamífero (por ejemplo, un mamífero que tiene cáncer). En algunos casos, un antígeno puede ser un antígeno asociado a un tumor (por ejemplo, una sustancia antigénica producida por una célula cancerosa). Ejemplos de antígenos asociados a tumores que pueden ser dirigidos por una terapia de células T adoptivas incluyen CD19 (asociado con DLBCL, LLA y LLC),<a>F<p>(asociado con tumores de células germinales y/o carcinoma hepatocelular), CEA (asociado con cáncer de intestino, cáncer de pulmón y/o cáncer de mama), CA-125 (asociado con cáncer de ovario), MUC-1 (asociado con cáncer de mama), ETA (asociado con cáncer de mama), MAGE (asociado con melanoma maligno), CD33 (asociado con AML), CD123 (asociado con AML), LLC-1 (asociado con AML), E-Cadherina (asociado con tumores epiteliales), receptor de folato alfa (asociado con cánceres de ovario), receptor de folato feta (asociado con cánceres de ovario y AML), IL13R (asociado con cánceres de cerebro), EGFRviii (asociado con cánceres de cerebro), CD22 (asociado con cánceres de células B), CD20 (asociado con cánceres de células B), cadena ligera kappa (asociada con cánceres de células B), cadena ligera lambda (asociado con cánceres de células B), CD44v (asociado con AML), CD45 (asociado con cánceres hematológicos), CD30 (asociado con linfomas de Hodgkin y linfomas de células T), CD5 (asociado con linfomas de células T), CD7 (asociado con linfomas de células T), CD2 (asociado con linfomas de células T), CD38 (asociado con mielomas múltiples y AML), BCMA (asociado con mielomas múltiples), CD138 (asociado con mielomas múltiples y AML), FAP (asociado con tumores sólidos), CS-1 (asociado con mieloma múltiple) y c-Met (asociado con cáncer de mama). Por ejemplo, se pueden usar una o más células T que tienen un nivel reducido de polipéptidos GM-CSF en la terapia con células CART dirigida a CD19 (por ejemplo, terapia con células CART19) para tratar el cáncer.

[0049]En algunos casos, se pueden usar una o más células T que tienen (p. ej., diseñadas para tener) un nivel de expresión reducido del polipéptido GM-CSF (p. ej., células T KO GM-CSF) en una terapia de células T adoptiva (por ejemplo, una terapia celular CART) para tratar un mamífero que tiene una enfermedad o trastorno distinto del cáncer. Por ejemplo, se pueden usar una o más células T que tienen un nivel reducido de polipéptidos GM-CSF en una terapia de células T adoptivas (por ejemplo, una terapia con células CART) dirigida a cualquier antígeno asociado a la enfermedad apropiado (por ejemplo, una sustancia antigénica producida por una célula afectada por una enfermedad particular) dentro de un mamífero. Ejemplos de antígenos asociados a enfermedades a los que puede dirigirse una terapia con células T adoptivas incluyen la desmopresina (asociada con enfermedades autoinmunes de la piel).

[0050]En algunos casos, una o más células T que tienen (p. ej., diseñadas para tener) un nivel de expresión reducido del polipéptido GM-CSF (p. ej., células T KO GM-CSF) utilizadas en una terapia de células T adoptivas (p. ej., una terapia con células CART) se puede administrar a un mamífero que tiene un cáncer como una terapia de combinación con uno o más agentes adicionales usados para tratar un cáncer. Por ejemplo, una o más células T que tienen un nivel reducido de polipéptidos GM-CSF usados en una terapia celular adoptiva pueden administrarse a un mamífero en combinación con uno o más tratamientos anticancerígenos (por ejemplo, cirugía, radioterapia, quimioterapia (p. ej., agentes alquilantes como busulfán), terapias dirigidas (p. ej., agentes inhibidores de GM-CSF como lenzilumab), terapia hormonal, inhibidores de la angiogénesis, inmunosupresores (p. ej., agentes inhibidores de interleucina-6 tal como tocilizumab)) y/o uno o más tratamientos de CRS (por ejemplo, ruxolitinib e ibrutinib). En los casos en los que se usan una o más células T que tienen un nivel reducido de polipéptidos GM-CSF usados en una terapia celular adoptiva con agentes adicionales en el tratamiento de un cáncer, uno o más agentes adicionales se pueden administrar al mismo tiempo o de forma independiente. En algunos casos, se pueden administrar primero una o más células T que tienen un nivel reducido de polipéptidos GM-CSF usados en una terapia celular adoptiva, y uno o más agentes adicionales se pueden administrar en segundo lugar, o viceversa.

[0051]La invención se describirá con más detalle en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Generación de citoquinas en células CART deficientes para aumentar el índice terapéutico de la terapia con células CART

[0052]Este ejemplo describe el desarrollo de células CART19 inactivadas con GM-CSF (GM-CSF KO) y muestra que las células GM-CSF KO CART19 resultantes funcionan normalmente y tienen una expansión mejorada.

Diseño experimental:

[0053]Se utilizaron CAR19 en xenoinjertos de leucemia de células B. Estos plásmidos se usaron para el empaquetado y la producción de lentivirus como se describe en el presente documento. Como modelo de ratón, se emplearon dos modelos:

1. Modelos de xenoinjerto: a ratones NSG se les injertó por vía subcutánea la línea celular NALM6 positiva para CD19 y positiva para luciferasa. El injerto se confirmó mediante imágenes de bioluminiscencia. Los ratones fueron tratados con PBMC humanas por vía intravenosa y con inyección intratumoral de partículas de lentivirus. La generación de células CART se mide mediante citometría de flujo. Se evalúa el tráfico de CART a los sitios tumorales y se mide la respuesta antitumoral mediante imágenes de bioluminiscencia como medida de la carga de enfermedad.

2. Ratones con sistema inmunológico humanizado (HIS) del Laboratorio Jackson: a estos ratones se les inyectaron células CD34+ fetales cuando eran neonatos y, por lo tanto, desarrollaron hematopoyesis humana. Injertaremos a estos ratones la línea celular CD19+ NALM6, como se usó anteriormente. Del mismo modo, generaremos CART19in vivomediante la inyección intratumoral de partículas de lentivirus. A continuación, medirá la actividad de las células CART19 en la erradicación de NALM6 y la comparará con las células CART19 transducidas lentiviralmente generadas ex vivo (actualmente utilizadas en la clínica).

Materiales y Métodos:

Generación de plásmido CAR:

[0054]El clon anti-CD19 FMC63 se sintetizó do novo en una columna vertebral de CAR utilizando 41BB y CD3 zeta y luego se clonó en una columna vertebral de lentivirus de tercera generación.

[0055]Para generar las células CART19 de control, se seleccionaron negativamente células T de donantes normales usando el kit de células pan T y se expandieron ex vivo usando Dynabeads anti-CD3/CD28 (Invitrogen, agregado el primer día de cultivo). Las células T se transdujeron con sobrenadante lentiviral un día después de la estimulación con una multiplicidad de infección (MOI) de 3. Las Dynabeads anti-CD3/CD28 se retiraron el día 6 y las células T se cultivaron en medio de células T (medio X-vivo 15, suero humano 5%, penicilina, estreptomicina y glutamina) por hasta 15 días y, a continuación, criopreservado para futuros experimentos. Antes de todos los experimentos, las células T se descongelaron y se dejaron reposar durante la noche a 37°C.

Generación de células CART KO GM-CSF:

[0056]Se generaron células CART knockout para GM-CSF con un sistema CRISR-Cas9, utilizando dos metodologías:

1. Se generó ARNg y se clonó en un vector lentivirus que codifica Cas9 y el ARNg. Durante la expansión de las células T, las células T se transdujeron con este lentivirus el día 1, el mismo día y simultáneamente con partículas de lentivirus CAR19. Las células se expandieron durante un período de 8 días y luego se recolectaron células T, se aisló el ADN y se secuenció para evaluar la eficacia de la eliminación. Estas células fueron criopreservadas y utilizadas para futuros experimentosin vitrooin vivo.En la Figura 5 se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica.

2. Se generó ARNm a partir del ARNg y se utilizó para eliminar GM-CSF. Para hacerlo, se mezcló ARNg con RNP en una proporción de 1:1 y luego se sometieron a electroporación las células T el día 3 después de la estimulación con perlas CD3/CD28. Las células se expandieron durante un período de 8 días y, a continuación, se recolectaron células T, se aisló el ADN y se secuenció para evaluar la eficacia de la eliminación. Estas células fueron criopreservadas y utilizadas para futuros experimentosin vitrooin vivo.

Células

[0057]La línea celular NALM6 se obtuvo de la ATCC y se mantuvo en medio R10 (medio RPMI, suero fetal de ternera al 10 %, penicilina y estreptomicina). En algunos experimentos se utilizaron células NALM6 transducidas con células luciferasa-GFP bajo el control del promotor EF1a, como se indica. Se obtuvieron muestras de LLA humana primaria no identificadas del Biobanco de Mayo Clinic. Todas las muestras se obtuvieron después de un consentimiento informado por escrito. Para todos los estudios funcionales, las células se descongelaron al menos 12 horas antes del análisis y se dejaron reposar durante la noche a 37°C.

Análisis de citometría de flujo

[0058]Los anticuerpos antihumanos se adquirieron de BioLegend, eBioscience o BD Biosciences. Las células se aislaron de cultivosin vitroo de animales, se lavaron una vez en PBS suplementado con suero de ternera fetal al 2% y se tiñeron a 4°C después del bloqueo de los receptores Fc. Para la cuantificación del número de células, se utilizaron perlas Countbright (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). En todos los análisis, la población de interés se clasificó según el lado delantero versus características de dispersión lateral seguidas de activación singlete, y las células vivas se activaron utilizando Live Dead Aqua (Invitrogen). La expresión superficial de CAR anti-CD19 se detectó mediante tinción con un anticuerpo F(ab')2 anti-ratón de cabra conjugado con Alexa Fluor 647 de Jackson Immunoresearch.

Ensayos de función de células T:

Degranulación de células T y ensayos de citoquinas intracelulares:

[0059]Brevemente, las células T se incubaron con células diana en una proporción de 1:5. Después de teñir para expresión de CAR; Se añadieron CD107a, CD28, CD49d y monensina en el momento de la incubación. Después de 4 horas, las células se recogieron y se tiñeron para determinar la expresión de CAR, CD3 y tinción de Live Dead (Invitrogen). Las células se fijaron y permeabilizaron (kit de fijación y permeabilización celular FIX & PERM®, tecnologías Life) y luego se realizó la tinción con citoquinas intracelulares.

Ensayos de proliferación:

[0060]Las células T se lavaron y se resuspendieron a 1x107/ml en 100 pl de PBS y se marcaron con 100 pl de CFSE 2,5 mM (Life Technologies) durante 5 minutos a 37°C. A continuación, se detuvo la reacción con R10 frío y las células se lavaron tres veces. Los objetivos fueron irradiados a una dosis de 100 Gy. Las células T se incubaron en una proporción de 1:1 con células diana irradiadas durante 120 horas. A continuación, se recogieron las células, se tiñeron para CD3, CAR y Live Dead aqua (Invitrogen), y se agregaron perlas Countbright (Invitrogen) antes del análisis de citometría de flujo.

Ensayos de citotoxicidad:

[0061]Se utilizaron células NALM6-Luc o muestras de LLA primarias marcadas con CFSE (Invitrogen) para el ensayo de citotoxicidad. En resumen, las dianas se incubaron en las proporciones indicadas con células T efectoras durante 4, 16, 24, 48 y/o 72 horas. La muerte se calculó mediante imágenes de bioluminiscencia en una cámara Xenogen IVIS-200 Spectrum o mediante citometría de flujo. Para este último, se recogieron células; Se agregaron cuentas Countbright y 7-AAD (Invitrogen) antes del análisis. Las células diana vivas residuales fueron CFSE+ 7-AAD-.

Medición de citoquinas secretadas:

[0062]Las células efectoras y diana se incubaron en una proporción de 1:1 en medio de células T durante 24 o 72 horas como se indica. El sobrenadante se recogió y se analizó mediante una matriz Luminex de 30 plex según el protocolo del fabricante (Invitrogen).

Resultados

[0063]Las células GM-CSF KO CART se generaron con un sistema CRISR-Cas9. Durante la expansión de las células T, las células T se transdujeron (día 1) con lentivirus que codifican ARNg y Cas9 y lentivirus que codifican CAR19. Las células se expandieron durante un período de 8 días. Después de 8 días, se recolectaron células T, se aisló el ADN y se secuenció el ADN aislado para evaluar la eficacia de la eliminación. Véase, por ejemplo, la Figura 1. Las células T exhibieron una eficiencia de eliminación del 24,1% (Figura 2A) y la eficiencia de transducción de CAR fue del 73% (Figura 2B).

[0064]Para evaluar las funciones efectoras celulares de las células GM-CSF KO CART, se cocultivaron CART19, GM-CSF K<o>CART19, UTD o GM-CSF KO UTD con la línea celular CD19 positiva NALM6 en una proporción de 1:5. Después de 4 horas, las células se recogieron, permeabilizaron, fijaron y tiñeron para detectar citoquinas (Figura 3).

[0065]Para evaluar la proliferación de células GM-CSF KO CART, se siguió la cinética de expansión después de transducir las células T. Las células GM-CSF KO CART se expanden con mayor fuerza que las células transducidas con CART19 solo (Figura 4).

[0066]Estos resultados demuestran que los CART knockout para GM-CSF pueden mejorar la función de las células CART y la actividad antitumoral. Estos resultados también demuestran que el bloqueo de GM-CSF en combinación con CART19 no afecta las funciones efectoras de las células CART.

Ejemplo 2: el agotamiento de GM-CSF durante la terapia CART reduce el síndrome de liberación de atocinas y la neurotoxicidad y puede mejorar la función de las células CART

[0067]Este ejemplo investiga el agotamiento del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y las células mieloides como una estrategia potencial para controlar las toxicidades asociadas a las células CART. Se descubrió que el bloqueo de GM-CSF con un anticuerpo neutralizante no inhibe la función CARTin vitrooin vivo.La proliferación de células CART mejoróin vitroy las células CART dieron como resultado un control más eficiente de la leucemia en xenoinjertos derivados de pacientes después del agotamiento de GM-CSF. Además, en un modelo de xenoinjerto de leucemia linfoblástica aguda primaria de CRS y NT, el bloqueo de GM-CSF dieron como resultado una reducción de la infiltración de células mieloides y células T en el cerebro y mejoraron el desarrollo de CRS y NT. Finalmente, se generaron células CART eliminadas por GM-CSF mediante la interrupción CRISPR/cas9 de GM-CSF durante la fabricación de células CART. Las células GM-CSFW° CART continuaron funcionando normalmente y dieron como resultado una actividad antitumoral mejoradain vivo.Estos demuestran que la neutralización de GM-CSF puede anular la neurotoxicidad y el CRS, y también puede mejorar las funciones de las células CART.

Materiales y métodos

Líneas celulares y células primarias.

[0068]NALM6 y MOLM13 se adquirieron en ATCC, Manassas, VA, EE. UU., se transdujeron con un lentivirus luciferasa-ZsGreen (addgene) y se clasificaron hasta obtener una pureza del 100 %. Las células recubiertas se cultivaron en R10 (RPMI, 10 % FCS v/v, 1 % pen strep v/v). Las células primarias se obtuvieron del biobanco de Mayo Clinic para pacientes con leucemia aguda según un protocolo aprobado por una junta de revisión institucional. El uso de ADN recombinante en laboratorio fue aprobado por el Comité Institucional de Bioseguridad (IBC).

Células Tprimarias y células CART

[0069]Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de conos de aféresis de sangre de donantes no identificados usando un protocolo FICOLL (véase, por ejemplo,Dietzet al., 2006 Transfusion 46:2083-2089). Las células T se separaron con perlas magnéticas de selección negativa (tecnologías Stemcell) y los monocitos se seleccionaron positivamente usando perlas magnéticas CD14+ (tecnologías Stemcell). Las células primarias se cultivaron en medio X-Vivo 15 con suero humano al 5%, penicilina, estreptomicina y glutamax. Se generaron células CART dirigidas a CD19 mediante la transducción lentiviral de células T de donantes normales como se describe a continuación. Las construcciones CAR19 de segunda generación se sintetizarondo novo(IDT) y se clonaron en un lentivirus de tercera generación bajo el control del promotor EF-1a. El fragmento variable de cadena sencilla dirigido a CD19 se derivó del clon FMC63. Para estos experimentos se sintetizó y utilizó una construcción CAR coestimulada con 41BB (FMC63-41BBz) de segunda generación. Se generaron partículas de lentivirus mediante la transfección transitoria de plásmido en células productoras de virus 293T, en presencia de lipofectamina 3000, VSV-G y plásmidos empaquetadores. Las células T aisladas de donantes normales se estimularon utilizando perlas estimulantes de CD3/CD28 (StemCell) en una proporción de 1:3 y luego se transdujeron con partículas de lentivirus 24 horas después de la estimulación con una multiplicidad de infección de 3,0. La eliminación de las perlas magnéticas se realizó el día 6 y las células CART se recolectaron y criopreservaron el día 8 para experimentos futuros. Las células CART se descongelaron y se dejaron reposar en medio de células T 12 horas antes de su uso en experimentos.

Generación de células GM-CSFk/o CART:

[0070]Se seleccionó un ARN guía (ARNg) dirigido al exón 3 del GM-CSF humano mediante la detección de ARNg que previamente se había informado que tenían alta eficiencia para el GM-CSF humano.25 Este ARNg se ordenó en una construcción de lentivirus de tercera generación CAS9 (lentiCRISPRv2), controlada bajo un Promotor de U6 (GenScript, Township, Nueva Jersey, EE. UU.). Las partículas lentivirales que codifican esta construcción se produjeron como se describió anteriormente. Las células T se transdujeron dualmente con lentivirus CAR19 y GM-CSFgRNAlentiCRISPRv2, 24 horas después de la estimulación con perlas CD3/CD28. A continuación, se continuó la expansión de las células CAR-T como se describe anteriormente. Para analizar la eficacia de apuntar a GM-CSF, se extrajo ADN genómico de las células GM-CSFk/o CART19 utilizando el mini kit PureLink Genomic DNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). El ADN de interés se amplificó por PCR utilizando Choice Taq Blue Mastermix (Thomas Scientific, Minneapolis, MN, EE. UU.) y se extrajo en gel utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen, Germantown, MD, EE. UU.) para determinar la edición. Se enviaron amplicones de PCR para la secuenciación Eurofins (Louisville, KY, EE. UU.) y la frecuencia de modificación de los alelos se calculó utilizando el software TIDE (Tracking of Indels by Decomposition) disponible en tide.nki.nl. La Figura 15 describe la secuencia de ARNg, las secuencias del cebador y el esquema para la generación del esquema GM-CSFk/o CART19.

Anticuerpos neutralizantes de GM-CSF y controles de isotipo

[0071]Lenzilumab (Humanigen, Brisbane, CA) es un anticuerpo humanizado que neutraliza el GM-CSF humano. Para experimentosin vitro,se utilizó lenzilumab o control de isotipo 10 ug/ml. Para experimentosin vivo,se inyectaron 10 mg/kg de lenzilumab o control de isotipo, y el esquema, vía y frecuencia se indican en el esquema experimental individual. En algunos experimentos, también se usó anticuerpo neutralizante anti-GM-CSF de ratón (10 mg/kg), como se indica en el esquema experimental.

Experimentos funcionales de células T

[0072]Los ensayos de citoquinas se realizaron 24 o 72 horas después de un cocultivo de células CART con sus objetivos en una proporción de 1:1 como se indica. Se realizó GM-CSF singleplex humano (Millipore), multiplex humano de 30 plex (Millipore) o multiplex de ratón de 30 plex (Millipore) en el sobrenadante recogido de estos experimentos, como se indica.

Esto se analizó mediante un ensayo de perlas de citometría de flujo o Luminex. Se realizaron análisis de citocinas intracelulares y ensayos de desgranulación de células T después de la incubación de células CART con dianas en una proporción de 1:5 durante 4 horas a 37 °C, en presencia de monensina, hCD49d y hCD28. Después de 4 horas, se recogieron las células y se realizó una tinción intracelular después de la tinción de la superficie, seguida de fijación y permealización (kit de fijación y permeabilización celular FIX & PERM, Life Technologies). Para los ensayos de proliferación, se cocultivaron células efectoras marcadas con CFSE (Life Technologies) (CART19) y células diana irradiadas a 1:1. En algunos experimentos con monocitos CD14+ se agregaron al cocultivo en una proporción de 1:1:1 como se indica. Las células se cocultivaron durante 3-5 días, como se indica en el experimento específico y luego se recogieron las células y se realizó la tinción de la superficie con anti-hCD3 y agua viva/muerta. Se utilizó PMA/ionomicina como estimulante positivo no específico de células T, en diferentes concentraciones como se indica en los experimentos específicos. Para los ensayos de destrucción, se incubaron las células CD19+Luciferase+ LLANALM6 o las células CD19-Luciferase+ MOLM13 de control en las proporciones indicadas con células T efectoras durante 24 o 48 horas, como se indica en el experimento específico. La muerte se calculó mediante imágenes de bioluminiscencia en una cámara Xenogen IVIS-200 Spectrum (PerkinElmer, Hopkinton, MA, EE. UU.) como una medida de células vivas residuales. Las muestras se trataron con 1 pl de D-luciferina (3o ug/ml) por 100 pl de volumen de muestra, 10 minutos antes de la obtención de imágenes.

Citometría de flujo multiparamétrica

[0073]Los anticuerpos antihumanos se adquirieron de Biolegend, eBioscience o BD Biosciences. Las células se aislaron de cultivosin vitroo de sangre periférica de animales (después de la lisis de ACK), se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato suplementada con suero fetal de ternera al 2% y se tiñeron a 4 °C. Para la cuantificación del número de células, se utilizaron perlas Countbright (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). En todos los análisis, la población de interés se identificó en función de las características de dispersión directa versus lateral, seguida de una ignición singlete, y las células vivas se seleccionaron utilizando Live Dead Aqua (Invitrogen). La expresión superficial de CAR se detectó mediante tinción con un anticuerpo F(ab')2 anti-ratón de cabra. La citometría de flujo se realizó en un analizador Canto II de cuatro láseres (BD Biosciences). Todos los análisis se realizaron con FlowJo X10.0.7r2.

Modelos de ratones xenogénicos

[0074]Se criaron y cuidaron ratones NOD-SCID-IL2rY-/- (NSG) machos y hembras de 8 a 12 semanas de edad dentro del Departamento de Medicina Comparada de la Clínica Mayo según un protocolo de cría aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC). Los ratones se mantuvieron en espacios de barrera para animales aprobados por el Comité de Bioseguridad institucional para experimentos de nivel BSL2+.

Xenoinjertos de línea celular NALM6

[0075]La línea celular CD19+, luciferasa+ LLA NALM6 se utilizó para establecer xenoinjertos LLA. Estos experimentos de xenoinjerto fueron aprobados mediante un protocolo IACUC diferente. En este documento, se inyectaron 1x106 células por vía intravenosa mediante una inyección en la vena de la cola. Después de la inyección, los ratones se sometieron a imágenes bioluminiscentes utilizando una cámara Xenogen IVIS-200 Spectrum seis días después, para confirmar el injerto. Las imágenes se realizaron después de la inyección intraperitoneal de 10 pl/g de D-luciferina (15 mg/ml). A continuación, los ratones fueron aleatorizados en función de sus imágenes bioluminiscentes para recibir diferentes tratamientos como se describe en los experimentos específicos. Por lo general, se inyectan células CART 1-2x106 o células UTD y las dosis exactas se enumeran en los detalles experimentales específicos. Se realizaron imágenes semanales para evaluar y seguir la carga de enfermedad. El sangrado de la vena de la cola se realizó entre 7 y 10 días después de la inyección de células CART para evaluar la expansión de las células T y según fuera necesario a continuación. Se lisó sangre periférica de ratón usando tampón de lisis ACK (Thermofisher) y luego se usó para estudios de citometría de flujo. Las imágenes bioluminiscentes se adquirieron con una cámara Xenogen IVIS-200 Spectrum (PerkinElmer, Hopkinton, MA, EE. UU.) y se analizaron con Living Image versión 4.4 (Caliper LifeSciences, PerkinElmer). Para los ratones tratados con anticuerpos, la terapia con anticuerpos (10 mg/kg de lenzilumab o control de isotipo) se inició IP, durante un total de 10 días.

Xenoinjertos LLA derivados del paciente primario

[0076]Para establecer xenoinjertos primarios de LLA, los ratones NSG primero recibieron 30 mg/kg de busulfán IP. Al día siguiente, a los ratones se les inyectaron 2x106 blastos primarios derivados de la sangre periférica de pacientes con LLA refractaria recidivante. Se monitorizó el injerto de los ratones durante 4 a 6 semanas y cuando se observaron consistentemente células CD19+ en la sangre (>1 célula/ml), se aleatorizaron para recibir diferentes tratamientos de CART19 o UTD (1x106 células) con o sin terapia con anticuerpos (10 mg/kg de lenzilumab o IP de control de isotipo durante un total de 10 días, a partir del día en que recibieron la terapia con células CART). Los ratones fueron monitoreados periódicamente para detectar carga leucémica mediante sangrado de la vena de la cola.

Xenoinjertos LLA derivados del paciente primario para CRS/NT

[0077]De manera similar a los experimentos anteriores, a los ratones se les inyectó IP 30 mg/kg de busulfano. Al día siguiente, recibieron 1-2x106 blastos primarios derivados de la sangre periférica de pacientes con LLA refractaria recidivante. Se monitorizó el injerto de los ratones durante 4 a 6 semanas y cuando el nivel de células CD19+ era alto (>10 células/pl), recibieron CART19 (2-53106 células) y comenzaron la terapia con anticuerpos durante un total de 10 días, como se indica en los detalles. del experimento específico. Los ratones fueron pesados diariamente como medida de su bienestar. Brian MRI de los ratones se realizó 5-6 días después de la inyección de CART y el sangrado de la vena de la cola se realizó 4-11 días después de la inyección de CART. Las imágenes de resonancia magnética cerebral se analizaron utilizando Azalyze.

Adquisición de resonancia magnética

[0078]Se utilizó un sistema de resonancia magnética para animales pequeños de calibre vertical Bruker Avance II 7 Tesla (Bruker Biospin) para la adquisición de imágenes para evaluar la permeabilidad vascular del sistema nervioso central (SNC). La anestesia por inhalación se indujo y mantuvo mediante isoflurano del 3 al 4%. La frecuencia respiratoria se monitorizó durante las sesiones de adquisición utilizando un sistema de monitoreo de signos vitales compatible con MRI (Modelo 1030; SA Instruments, Stony Brook, NY). A los ratones se les administró una inyección IP de gadolinio utilizando una dosis basada en el peso de 100 mg/kg, y después de un retraso estándar de 15 minutos, se utilizó una secuencia de eco de espín ponderada en T1 de adquisición de volumen (tiempo de repetición = 150 ms, tiempo de eco = 8 ms, campo de visión: 32 mm x 19,2 mm x 19,2 mm, matriz: 160 x 96 x 96; número de promedios = 1) para obtener imágenes ponderadas en T1. Los cambios en la resonancia magnética potenciada con gadolinio fueron indicativos de alteración de la barrera hematoencefálica. El análisis volumétrico se realizó utilizando el paquete de software Analyze desarrollado por Biomedical Imaging Resource de Mayo Clinic.

RNA-Seq en tejido cerebral de ratón

[0079]El ARN se aisló utilizando el kit miRNeasy Micro (Qiagen, Gaithersburg, MD, EE. UU.) y se trató con RNase-Free DNase Set (Qiagen, Gaithersburg, MD, EE. UU.). RNA-seq se realizó en un Illumina HTSeq 4000 (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) por Genome Analysis Core de Mayo Clinic. Los datos de llamada de base binaria se convirtieron a fastq utilizando el software Illumina bcl2fastq. Las secuencias del adaptador se eliminaron usando Trimmomatic y se usó FastQC para verificar la calidad. Los últimos genomas de referencia humanos (GRCh38) y de ratón (GRCm38) se descargaron del NCBI. Los archivos de índice del genoma se generaron utilizando STAR y las lecturas finales emparejadas se asignaron al genoma para cada condición. Se usó HTSeq31 para generar recuentos de expresión para cada gen y DeSeq2 para calcular la expresión diferencial. La ontología genética se evaluó utilizando Enrichr. La Figura 16 resume los pasos detallados anteriormente. Los datos de secuenciación de ARN están disponibles en Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE121591.

Estadísticas

[0080]Prism Graph Pad y Microsoft Excel utilizados para analizar datos. Las concentraciones altas de citoquinas en el mapa de calor se normalizaron a "1" y las concentraciones bajas se normalizaron a "0" mediante Prism. Pruebas estadísticas descritas en las leyendas de las figuras.

Resultados

La neutralización de GM-CSF in vitro mejora la proliferación de células CAR-T en presencia de monocitos y no altera la función efectora de las células CAR-T.

[0081]Si se va a utilizar la neutralización de GM-CSF después de la terapia con células CAR-T como estrategia para prevenir CRS y NT, no debe inhibir la eficacia de las células CAR-T. Por lo tanto, nuestros experimentos iniciales tenían como objetivo investigar el impacto de la neutralización de GM-CSF en las funciones efectoras de las células CAR-T. En este documento, las células CART19 se cultivaron conjuntamente con o sin la línea celular NALM6 CD19+LLA en presencia de lenzilumab (anticuerpo neutralizante GM-CSF) o un control de isotipo (IgG). Establecimos que lenzilumab, pero no el anticuerpo de control IgG, fue capaz de neutralizar completamente GM-CSF (Figura 6A) pero no inhibió la proliferación específica del antígeno de células CAR-T (Figura 6B). Cuando las células CART19 se cultivaron conjuntamente con la línea celular CD19+ NALM6 en presencia de monocitos, lenzilumab en combinación con CART19 demostró un aumento exponencial en la proliferación de CART19 específica del antígeno en comparación con CART19 más IgG de control de isotipo (P <0,0001, Figura 6C). Para investigar la citotoxicidad específica de CART, se cultivaron células T CART19 o UTD de control con la línea celular luciferasa+CD19+ NALM6 y se trataron con un anticuerpo de control de isotipo o un anticuerpo neutralizante GM-CSF (Figura 1D). El tratamiento con anticuerpos neutralizantes GM-CSF no inhibió la capacidad de las células CAR-T para destruir las células diana NALM6 (Figura 6D). En general, estos resultados indican que lenzilumab no inhibe la función de las células CAR-Tin vitroy mejora la proliferación de las células CART19 en presencia de monocitos, lo que sugiere que la neutralización de GM-CSF puede mejorar la eficacia mediada por las células CAR-T.

La neutralización de GM-CSF in vivo mejora la actividad antitumoral de las células CAR-T en modelos de xenoinjerto.

[0082]Para confirmar que el agotamiento de GM-CSF no inhibe las funciones efectoras de CART19, investigamos el papel de la neutralización de GM-CSF con lenzilumab en la actividad antitumoral de CART19 en modelos de xenoinjerto. En primer lugar, se utilizó un modelo de recaída destinado a investigar enérgicamente si la actividad antitumoral de las células CART19 se vio afectada por la neutralización de GM-CSF. A los ratones NSG se les inyectaron células NALM6 luciferasa+ 13106 y luego se les tomaron imágenes 6 días después, lo que dio tiempo suficiente para que los ratones alcanzaran cargas tumorales muy altas. Los ratones fueron asignados al azar para recibir una única inyección de células CART19 o UTD y 10 días de anticuerpo de control de isotipo o lenzilumab (Figura 7A). El ensayo de GM-CSF en suero recolectado 8 días después de la inyección de CART19 reveló que lenzilumab neutraliza con éxito GM-CSF en el contexto de la terapia con CART19 (Figura 7B). Las imágenes de bioluminiscencia una semana después de la inyección de CART19 mostraron que CART19 en combinación con lenzilumab controlaba eficazmente la leucemia en este modelo de recaída de alta carga tumoral y significativamente mejor que las células UTD de control (Figura 7C). El tratamiento con CART19 en combinación con lenzilumab dio como resultado una potente actividad antitumoral y una mejor supervivencia general, similar a CART19 con anticuerpo de control a pesar de la neutralización de los niveles de GM-CSF, lo que indica que GM-CSF no afecta la actividad de las células CAR-T in vivo ("Figura 8). En segundo lugar, estos experimentos se realizaron en un modelo de xenoinjerto derivado de un paciente con LLA primaria, en presencia de PBMC humanas, ya que representa un modelo heterogéneo más relevante. Después de condicionar la quimioterapia con busulfán, a los ratones se les inyectaron blastos derivados de pacientes con LLA recidivante. Se monitoreó el injerto de los ratones durante varias semanas a través de sangrados seriados en la vena de la cola y cuando los blastos de CD19+ en la sangre eran >1/mL, los ratones fueron aleatorizados para recibir tratamiento con CART19 o UTD en combinación con PBMC con lenzilumab más un anti-GM-de ratón. Anticuerpo de neutralización del LCR o anticuerpos IgG de control de isotipo a partir del día de la inyección de CART 19 durante 10 días (Figura 7D). En este modelo de xenoinjerto primario de LLA, la neutralización de GM-CSF en combinación con la terapia CART19 dio como resultado una mejora significativa en el control de la enfermedad leucémica sostenida en el tiempo durante más de 35 días después de la administración de CART19 en comparación con CART19 más control de isotipo (Figura 7E). Esto sugiere que la neutralización de GM-CSF puede desempeñar un papel en la reducción de las recaídas y el aumento de respuestas completas duraderas después de la terapia con células CART19.

Las células CAR-T knockout para GM-CSF CRISPR exhiben una expresión reducida de GM-CSF, niveles similares de citoquinas clave y una actividad antitumoral mejorada.

[0083]Para excluir con confianza cualquier papel crítico del GM-CSF en la función de las células CAR-T, interrumpimos el gen GM-CSF durante la fabricación de las células CAR-T utilizando un ARNg que, según se ha informado, produce una alta eficiencia, clonado en una columna vertebral de lentivirus CRISPR. Usando este ARNg, logramos alrededor del 60% de eficiencia de eliminación en células CART19 (Figura 9). Cuando las células CAR-T se estimularon con la línea celular CD19+ NALM6, las células GM-CSFk/o CAR-T produjeron estadísticamente significativamente menos GM-CSF en comparación con CART19 con un locus GM-CSF de tipo salvaje ("células CART19 de tipo salvaje"). La desactivación de GM-CSF en células CAR-T no afectó la producción de otras citocinas clave de células T, incluida la desgranulación específica del antígeno de células T de IFN-<y>, IL-2 o CAR-T (CD107a) (Figura 10A), pero sí mostró una expresión reducida. de GM-CSF (Figura 10B). Para confirmar que las células GM-CSFk/o CAR-T continúan exhibiendo funciones normales, probamos su eficaciain vivoen el modelo de xenoinjerto recurrente de LLA con alta carga tumoral (como se describe en la Figura 7A). En este modelo de xenoinjerto, la utilización de GM-CSFk/o CART19 en lugar de CART19 de tipo salvaje redujo notablemente los niveles séricos de GM-CSF humano 7 días después del tratamiento con CART19 (Figura 10b ). Los datos de imágenes de bioluminiscencia implicaron que las células GM-CSFk/o CART19 muestran un control leucémico mejorado en comparación con CART19 en este modelo (Figura 11). Es importante destacar que las células GM-CSFk/o CART19 demostraron una mejora significativa en la supervivencia general en comparación con las células CART19 de tipo salvaje (Figura 10C). Aparte de GM-CSF, no se detectaron alteraciones estadísticamente significativas en las citoquinas humanas (Figura 10D) o de ratón (Figura 10E). En conjunto, estos resultados confirman las Figuras 6 y 7, lo que indica que el agotamiento de GM-CSF no altera las citoquinas que son críticas para las funciones de eficacia de CAR-T. Además, los resultados de la Figura 10 indican que GM-CSFk/o CART puede representar una opción terapéutica para el control de GM-CSF "integrado" como una modificación durante la fabricación de células CAR-T.

Modelo de xenoinjerto derivado del paciente para neurotoxicidad y síndrome de liberación de citoquinas

[0084]En este modelo, a ratones NSG condicionados se les injertaron blastos de LLA primarios y se les monitorizó el injerto durante varias semanas hasta que desarrollaron una alta carga de enfermedad (Figura 12A). Cuando el nivel de blastos CD19+ en la sangre periférica era >10/ml, los ratones se aleatorizaron para recibir diferentes tratamientos como se indica (Figura 12A). El tratamiento con CART19 (con anticuerpos IgG de control o con anticuerpos neutralizantes de GM-CSF) erradicó con éxito la enfermedad (Fig. 12B). Entre 4 y 6 días después del tratamiento con CART19, los ratones comenzaron a desarrollar debilidad motora, cuerpos encorvados y pérdida progresiva de peso; síntomas compatibles con CRS y NT. Esto se asoció con una elevación de citoquinas séricas clave entre 4 y 11 días después de la inyección de CART19, similar a lo que se observa en el SRC humano después de la terapia con células CAR-T (incluyendo GM-CSF, TNF-a, IFN-<y>, IL-10, IL-12, IL-13, IL-2, IL-3, IP-10, MDC, MCP-1, MIP-1a, MIP-1P humanos e IL-6, GM-CSF, IL-4, IL-9, IP-10, MCP-1 y MIG de ratón). Estos ratones tratados con CART19 también desarrollaron NT como lo indican los análisis de resonancia magnética cerebral que revelan un aumento anormal de T1, lo que sugiere una alteración de la barrera hematoencefálica y posiblemente edema cerebral (Figura 12D), junto con un análisis de citometría de flujo de los cerebros recolectados que revela una infiltración de células CART19 humanas (Figura 12E). Además, los análisis de secuencia de ARN de secciones cerebrales extraídas de ratones que desarrollaron estos signos de NT mostraron una regulación positiva significativa de los genes que regulan el receptor de células T, los receptores de citoquinas, la activación inmune de las células T, el tráfico de células T y la diferenciación de células T y células mieloides (Tabla 1).

Tabla 1. Tabla de vías canónicas alteradas en cerebros de xenoinjertos derivados de pacientes después del tratamiento con células CART19.

La neutralización de GM-CSF in vivo mejora el síndrome de liberación de citocinas y la neurotoxicidad después de la terapia con CART19 en un modelo de xenoinjerto.

[0085]Utilizando el modelo derivado de pacientes con xenoinjerto para NT y CRS que se muestra en la Figura 4A, investigamos el efecto de la neutralización de GM-CSF sobre las toxicidades de CART19. Para descartar el efecto cofundador del GM-CSF de ratón, los ratones recibieron células CART19 en combinación con 10 días de terapia con anticuerpos GM-CSF (10 mg/kg de lenzilumab y 10 mg/kg de anticuerpo neutralizante anti-GM-CSF de ratón) o anticuerpos de control de isotipo. La terapia con anticuerpos neutralizantes GM-CSF evitó la pérdida de peso inducida por CRS después de la terapia con CART19 (Figura 13A). El análisis de citocinas 11 días después de la terapia con células CART19 mostró que el anticuerpo neutralizó el GM-CSF humano (Figura 13B). Además, la neutralización de GM-CSF resultó en una reducción significativa de varios humanos (IP-10, IL-3, IL-2, IL-IRa, IL-12p40, VEGF, GM-CSF) (Figura 5C) y ratón (MIG, MCP-1, KC, IP-10) (Figura 13D) citocinas. La proteína inducida por interferón gamma (IP-10, CXCL10) es producida por monocitos, entre otros tipos de células, y sirve como quimioatrayente para numerosos tipos de células, incluidos monocitos, macrófagos y células T. IL-3 juega un papel en la diferenciación de progenitores mieloides. IL-2 es una citoquina clave de las células T. El antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-IRa) inhibe la IL-1. (La IL-1 es producida por macrófagos y es una familia de citoquinas inflamatorias críticas). IL-12p40 es una subunidad de IL-12, que es producida por macrófagos entre otros tipos de células y puede estimular la diferenciación Th1. El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) estimula la formación de vasos sanguíneos. La monocina inducida por interferón gamma (MIG, CXCL9) es un atrayente de quimioterapia de células T. La proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1, CCL2) atrae monocitos, células T y células dendríticas. KC (CXCL1) es producida por macrófagos entre otros tipos de células y atrae células mieloides como los neutrófilos. También hubo una tendencia a la reducción de varias otras citocinas humanas y de ratón después de la neutralización del GM-CSF. Esto sugiere que GM-CSF desempeña un papel en la actividad posterior de varias citoquinas que son fundamentales en la cascada que resulta en CRS y NT.

[0086]Las resonancias magnéticas cerebrales 5 días después del tratamiento con CAR19 mostraron que la neutralización de GM-CSF redujo la mejora de T1 como medida de inflamación cerebral, alteración de la barrera hematoencefálica y posiblemente edema, en comparación con CART19 más anticuerpos de control. Las imágenes de resonancia magnética después de la neutralización de GM-CSF (con lenzilumab y anticuerpo GM-CSF anti-ratón) fueron similares a las exploraciones iniciales previas al tratamiento, lo que sugiere que la neutralización de GM-CSF ayudó efectivamente a anular la NT asociada con la terapia CART19 (Figura 14A, B). Utilizando blastos de LLA humana y CART19 humano en este modelo de xenoinjerto derivado de paciente, la neutralización de GM-CSF después de CART19 redujo la neuroinflamación en un 59 % en comparación con CART19 más controles de isotipo (Figura 14B). Este es un hallazgo importante y la primera vez que se demuestrain vivoque la NT causada por CART19 puede anularse eficazmente. Las células T CD3 humanas estaban presentes en el cerebro después de la terapia con CART19, según lo analizado mediante citometría de flujo, y con la neutralización de GM-CSF, hubo una tendencia hacia la reducción de las células T CD3 cerebrales (Figura 14C). Finalmente, se observó una tendencia en la reducción de macrófagos brillantes CD11b+ en los cerebros de ratones que recibieron neutralización de GM-CSF durante la terapia con células CAR-T en comparación con el control de isotipo durante la terapia con CAR-T (Figura 14D), lo que implica que la neutralización de GM-CSF ayuda a reducir macrófagos dentro del cerebro.

Ejemplo 3: Interacción de GM-CSF con receptores de GM-CSF

Materiales y métodos

Análisis del receptor de GM-CSF (CSF2R)

[0087]Expansión de células T. Se estimularon células T aisladas con perlas CD3/CD28. La expresión de los receptores C<s>F2 CSF2RA (CD116) y CSF2RB (CD131) se midió mediante citometría de flujo los días 0, 1, 3, 6 y 8. Se utilizaron células T en reposo como control negativo.

[0088]Producción de CART. Se produjo CART19 y se expresó la expresión de CSF2RA (CD116) y CSF2RB (CD131) se midió por citometría de flujo los días 0, 1, 3 y 6. Se usaron células T en reposo como control negativo y la línea celular Nalm6 se usó como control positivo.

Transferencia Western

[0089]Se cocultivaron células CART19/UTD y células Nalm6 irradiadas en una proporción de 1:1. Se añadieron anticuerpos a las células en una dosis de 10 mg/ml. Las condiciones de cultivo fueron UTD, CART19, CART19 bloqueo de GM-Cs F, CART19 bloqueo de CSF2RA y CART19 bloqueo de CSF2RB. Estas condiciones se probaron con un control de medios versus estimulación con Nalm6.

[0090]Después de cultivar las células con anticuerpos durante 24 horas, se aislaron CART19 utilizando microperlas. La pureza de CART19 (98-100%) se verificó mediante citometría de flujo. Las células se recogieron haciendo girar un sedimento celular y se aislaron polipéptidos de las células para su uso en transferencia Western.

Resultados

[0091]Los receptores de GM-CSF estaban regulados positivamente en las células T y en las células CART tras la estimulación. Se midieron los niveles de los receptores de GM-CSF CSF2RA (CD116) y c Sf2RB (CD131) en células T y se compararon con los niveles de CSF2RA (CD116) y CSF2RB (CD131) en células T en reposo (control negativo) durante un protocolo de expansión de células T de 8 días. La expresión de CSF2RA y CSF2RB aumentó después de la estimulación inicial, alcanzó su punto máximo el día 3 y se redujo ligeramente después del desprendimiento el día 6 (Figura 17A). También se midieron los niveles de CSF2RA (CD116) y CSF2RB (CD131) en células CART19 y UTD y se compararon con los niveles de CSF2RA (CD116) y CSF2RB (CD131) en células de control durante una producción de CART de 8 días. La expresión disminuye ligeramente el día 1 pero alcanza su punto máximo el día 3 (Figura 17B).

[0092] La interacción GM-CSF con el receptor CSF2 depende de la cadena beta (CSF2RB). La expresión de la proteína Stat5 fosforilada y Jak2 fosforilada aumentó en presencia de bloqueo de Nalm6 y CSF2RA irradiado, pero disminuyó en presencia de bloqueo de GM-CSF y CSF2RB (Figura 18). FAS está aguas abajo de la vía del receptor CSF2 y su expresión disminuye ligeramente en presencia de bloqueo de GM-CSF con Nalm6 pero no en presencia de CSF2RA o en presencia de bloqueo de CSF2RB (Figura 18).

[0093] Estos resultados demuestran que CSF2R puede expresarse en células T activadas y células CART. Estos resultados también demuestran que la neutralización de GM-CSF puede inhibir p-STATS. Se observó una inhibición similar cuando se bloqueó el receptor beta de GM-CSF, lo que sugiere que la señalización está impulsada por la interacción entre GM-CSF y el receptor beta de GM-CSF en las células CART activadas.

Ejemplo 4: Transcripción de células GM-CSF y CART19

Materiales y métodos

ARN-Seq

[0094] Aislamiento de ARN y ARN-Seq. Se aisló ARN total de tres réplicas biológicas (donantes normales 105, 115 y 116) para células T no transducidas, CART19 y GM-CSFk/o CART19 utilizando el kit miRNeasy Micro (QIAGEN) y se trató con el conjunto de ADNasa libre de ARNasa (QIAGEN). La secuenciación de ARN de extremos emparejados se realizó en un Illumina HTSeq 4000 por el Genome Analysis Core de Mayo Clinic.

[0095] Calidad. Los datos de llamada de base binaria se convirtieron a fastq utilizando el software Illumina bcl2fastq. Las secuencias del adaptador se eliminaron usando Trimmomatic. Se utilizó FastQC para comprobar la calidad.

[0096] Alineación. El último genoma humano de referencia se descargó del NCBI (HG38). Los archivos de índice del genoma se generaron utilizando STAR y las lecturas finales emparejadas se asignaron al genoma para cada condición.

[0097] Expresión diferencial. Se usó HTSeq para generar recuentos de expresión para cada gen y DeSeq2 para calcular la expresión diferencial. Se filtraron las condiciones con menos de 10 transcripciones en total. Se calculó un valor de p ajustado entre GM-CSFk/o CART19 y CART19 utilizando el método de Benjamini-Hochberg.

Resultados

[0098] Se utilizó ARN-Seq para identificar diferencias en el transcriptoma entre células GM-CSFk/o CART19 y células CART19 en el día 8 de producción de CART. Se identificaron 236 genes que se expresan de manera significativamente diferencial con un valor de p ajustado por BenjaminiHochberg <0,05 (Figura 19A). Se identificaron tres patrones distintos de expresión génica: genes que estaban regulados positivamente en células GM-CSFk/o CART19 en comparación con células CART19 y células UTD (Figura 19A, arriba); genes que estaban regulados negativamente en células GM-CSFk/o CART19 en comparación con células CART19 y células UTD (Figura 19A, centro); y genes que se normalizaron al nivel en células UTD en células GM-CSFk/o CART19 en comparación con células CART19 (Figura 19A, abajo). Entre los genes del perfil medio se encuentra FAS, que forma parte de la vía Tec Kinase y es responsable de inducir la apoptosis. También se identificaron genes que estaban significativamente regulados negativamente en células GM-CSFk/o CART19 en comparación con células CART19 (Figura 19B). En particular, la desactivación de GM-CSF en células CART19 normalizó la expresión génica diferencial observada en las células CART19 (Figura 19C). El análisis de componentes principales muestra que el patrón general de expresión genética de las células GM-CSFk/o CART19 se parece más a las células UTD que a las células CART19.

[0099] Estos resultados demuestran que las células GM-CSFk/o pueden tener un patrón de expresión génica distinto con un aumento de genes regulados negativamente en las células<g>M-CSFw° CART19.

Ejemplo 5: Edición de GM-CSF mediante CRISPR-Cas9

Materiales y métodos

Secuenciación del exoma completo (WES)

[0100] Procesamiento de muestras. Se aisló ADN de tres réplicas biológicas de cada una de las células T no transducidas, células T GM-CSFk/°, células CART19 y células GM-C<s>Fw° CART19 utilizando el mini kit PureLink Genomic DNA. El ADN extraído se envió al Centro de Análisis del Genoma del Centro Médico del Genoma de Mayo Clinic para WES. Las muestras se secuenciaron en un Illumina HiSeq 4000.

[0101]Análisis primario. El Core realizó el análisis primario mediante la conversión de los datos de llamada de base binaria a fastq utilizando el software Illumina bcl2fastq.

[0102]Análisis secundario. Los archivos fastq se alinearon con el genoma humano de referencia HG38 utilizando el alineador BWA-Mem. El análisis secundario fue realizado por la División de Informática y Estadística Biomédica utilizando el Kit de herramientas de análisis del genoma (GATK) para llamar variantes y generar datos VCF sin procesar.

[0103]Candidatos fuera del objetivo. Se utilizó código personalizado SAS 9.4 para encontrar diferencias en la edición entre las muestras. En primer lugar, se investigó la edición específica en el gen diana CSF2. A continuación, se compararon las variantes encontradas en las condiciones GM-CSFk/o pero no en sus controles (células T no transducidas y CART19), excluyendo las variantes que eran inherentes al genoma del individuo (presentes en las células T no transducidas). A continuación, se cruzaron estas listas y las ediciones CRISPR/Cas9 candidatas se clasificaron como solo células T, solo CART19 o tanto células T como CART19. Se excluyeron las frecuencias de alelos alternativos de <10 %, los SNP con una profundidad de lectura de <10 y las muestras que no pasaron el filtro de calidad (análisis VQSQRT). Esto se representó usando el paquete VennDiagram en R.

[0104]Predicciones fuera de objetivo. Se utilizaron tres herramientas diferentes de predicción de edición fuera del objetivo: Cas-OFFinder, CRISTA y CCTop. Las 15.632 predicciones generadas por Cas-OFFinder (configuración de secuencia de consulta: < 6 discrepancias, tamaño de protuberancia de ADN/ARN < 2) incluyó todas las predicciones generadas por CRISTA o CCTop. Como tal, sólo se utilizaron para el análisis las predicciones de Cas-OFFinder. Las ediciones candidatas de CRISPR/Cas9 se compararon con las predicciones fuera de objetivo de CAS-OFFinder haciendo coincidir la posición de la variante y el cromosoma.

[0105]Prevalencia genómica. La lista de candidatos editada por CRISPR/Cas9 se comparó con datos de ARN-Seq generados previamente en las mismas réplicas biológicas. La lista de candidatos también se filtró por prevalencia genómica según lo definido por el Proyecto 1000 Genomas (la frecuencia de alelos <1% se consideró rara).

[0106]Evaluación de la hipótesis. El número de variantes de un solo nucleótido (sustituciones) o indeles (inserciones o eliminaciones) en células T no transducidas se comparó con células T inactivadas, el número en células CART19 se comparó con células CART19 inactivadas y el número en todos los controles se comparó con todas las células inactivadas. Las diferencias en las variantes de un solo nucleótido y los indeles se representaron mediante un gráfico de violín utilizando GraphPad Prism versión 8.1.1 para Windows. Debido a que las muestras son dependientes, se utilizó la prueba de rangos con signo de Wilcoxon.

Resultados

[0107]Se utilizó WES para identificar ubicaciones precisas de edición del gen CSF2 mediante CRISPR-Cas9. Se esperaba que un ARNg 1 CRISPR de CSF2 (SEQ ID NO:7) tuviera un sitio de corte 3 pb aguas arriba del sitio PAM (Figura 20A, panel superior). Se determinó que el sitio de corte real estaba 6 pb aguas arriba del sitio PAM y podría dar como resultado inserciones y eliminaciones en la base 132074828 del esquema del cromosoma 5 (Figura 20A, panel inferior). La diferencia en el sitio de corte de Cas9 puede deberse al sitio PAM adyacente en la cadena inversa. La frecuencia de inserciones y eliminaciones en cada réplica biológica de CART19 se muestra en la Figura 20A, panel inferior.

[0108]Se identificaron los recuentos de variantes de un solo nucleótido (SNV) y los recuentos de inserción/deleción (indel) en las condiciones de desactivación de CRISPR en comparación con sus controles (células T y células CART19) (Figura 20B). No se encontraron diferencias significativas entre los grupos (prueba de rangos con signos de Wilcoxon, valor de p = 0,16).

[0109]También se identificó una representación de las variantes totales encontradas en las células editadas con CRISPR versus su respectivo control (CART19 o células T). Los SNP se filtraron previamente para determinar la prevalencia genómica en la población (menos del 1% en el Proyecto 1000 Genomas) y la presencia en las tres réplicas biológicas. El 0,004% (4) de los SNP se encontraron en células CART19 únicamente, el 0,006% (5) de los<s>N<p>se encontraron solo en células T, el 0,0001% (1) de los SNP se encontró tanto en células CART19 como en células T, y el 99% (12,439) de los SNP se filtraron (Figura 20C). El SNP presente tanto en células T como en células CART19 (en la intersección de la Figura 20C) se identificó como la deleción en el gen CSF2 que se muestra en el panel inferior de la Figura 20A.

[0110]Estos resultados demuestran que la única edición que coincidió con las predicciones fuera de objetivo de CasOFFinder fue la edición de CSF2, y que la interrupción de GM-CSF en células CART19 mediante CRISPR/Cas9 es un método seguro para eliminar GM-CSF.

Materiales y métodos

[0111]Se aislaron PBMC y los monocitos se separaron con el kit de aislamiento de monocitos clásico (Miltenyi Biotec). A continuación, los monocitos se diferenciaron en macrófagos M1 o macrófagos M2 con el kit de diferenciación de macrófagos CellXVivo Human M1 o M2 (R&D Systems).

[0112]Se cultivaron conjuntamente células CART19, Nalm6 y macrófagos M1 o macrófagos M2 en una proporción de 1:1:1. Las células se recogieron el día 3 y se tiñeron para CD3 y Live Dead aqua (Invitrogen). Se agregaron perlas Countbright (Invitrogen) antes del análisis de citometría de flujo para una cuantificación absoluta.

Resultados

[0113]La neutralización de GM-CSF en presencia de macrófagos M1 no alteró estadísticamente de manera significativa la expansión de CART19 tras la estimulación de CD19; sin embargo, hubo una tendencia hacia una mayor proliferación de células CAR-T con neutralización de GM-CSF. El bloqueo de GM-CSF mejoró estadísticamente de manera significativa la expansión de CART19 tras la estimulación de CD19 en presencia de macrófagos M2 (Figura 21).

OTRAS FORMAS DE REALIZACIÓN

[0114]Debe entenderse que si bien la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención, que está definido por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una célula T receptora de antígeno quimérico que tiene un nivel reducido de polipéptidos del factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), comprendiendo dicho método:

introducir una construcción de ácido nucleico en una célula T ex vivo, en donde dicho ácido nucleico la construcción comprende: a) un ácido nucleico que codifica un ARN guía, en el que dicho ARN guía es complementario a un ARN mensajero de GM-CSF; b) un ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas, y c) un ácido nucleico que codifica dicho receptor de antígeno quimérico, en donde el ácido nucleico que codifica el receptor de antígeno quimérico comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 2 y en donde el receptor de antígeno quimérico se dirige al antígeno CD19 asociado al tumor.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho ARN guía comprende una secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO:1.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicha nucleasa Cas es la nucleasa Cas9.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha construcción de ácido nucleico es un vector viral.

5. El método de la reivindicación 4, en el que dicho vector viral es un vector lentiviral.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha etapa de introducción comprende transducción.

7. Una célula T receptora de antígeno quimérico que tiene un nivel reducido de polipéptidos del factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde la célula T receptora de antígeno quimérico comprende un receptor de antígeno quimérico codificado por la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO: 2 y en donde el receptor de antígeno quimérico se dirige al antígeno asociado al tumor CD19.

8. La célula T receptora de antígeno quimérico para uso según la reivindicación 7, en la que dicho cáncer es un linfoma.

9. La célula T receptora de antígeno quimérico para uso según la reivindicación 8, en la que dicho linfoma es un linfoma difuso de células B grandes.

10. La célula T receptora de antígeno quimérico para uso según la reivindicación 7, en la que dicho cáncer es una leucemia.

11. La célula T receptora de antígeno quimérico para uso según la reivindicación 10, en la que dicha leucemia es una leucemia linfoblástica aguda.

12. Un método para mejorar las funciones efectoras de células T de una célula T receptora de antígeno quimérico, comprendiendo dicho método:

introducir una construcción de ácido nucleico en una célula T ex vivo, en donde dicha construcción de ácido nucleico comprende: a) un ácido nucleico que codifica un ARN guía, en el que dicho ARN guía es complementario a un ARN mensajero de GM-CSF; b) un ácido nucleico que codifica una nucleasa Cas, y c) un ácido nucleico que codifica dicho receptor de antígeno quimérico,

en donde el ácido nucleico que codifica el receptor de antígeno quimérico comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO:2 y en donde el receptor de antígeno quimérico se dirige al antígeno CD19 asociado al tumor.