ES2948295T3 - Profundidad de enfoque extendida mejorada en muestras biológicas - Google Patents

Abstract

Un sistema y método para construir una imagen compuesta digital de una muestra biológica tridimensional. El sistema incluye un sistema óptico que captura imágenes de células y tejidos presentados en un portaobjetos de muestra. El sistema adquiere sistemáticamente una pila de imágenes en diferentes segmentos del portaobjetos. Para cada segmento, el sistema calcula dinámicamente un plano focal óptimo. Una vez que se determina un plano focal óptimo para cada una de las pilas de imágenes, el sistema genera una imagen compuesta copiando los objetos más nítidos de cada uno de los planos focales óptimos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Profundidad de enfoque extendida mejorada en muestras biológicas

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo del diagnóstico médico. Más particularmente, la presente invención se refiere a sistemas y a métodos mejorados para procesar imágenes de microscopio digital para facilitar la detección de células y tejidos cancerosos y precancerosos.

Antecedentes de la invención

Los patólogos normalmente utilizan microscopios de alta resolución para examinar muestras de tejido, por ejemplo, para identificar signos de cáncer o células precancerosas. Para hacer un diagnóstico preciso y correcto, el patólogo debe ver las características celulares y tisulares enfocadas bajo un microscopio de alta resolución. Sin embargo, los microscopios de alta resolución usados por los patólogos tienen limitaciones que dificultan el análisis de especímenes biológicos gruesos que tienen objetos de interés en diferentes planos.

Específicamente, la lente de un microscopio sólo puede enfocarse en un solo punto, y hay una distancia finita delante y detrás de este punto focal que puede considerarse nítida. Esta distancia finita se conoce como profundidad de campo. Como es bien sabido, los microscopios de alta resolución, tales como los que usan los patólogos, tienen una profundidad de campo limitada o estrecha. Como resultado, los objetos que aparecen fuera de una determinada profundidad de campo o plano focal del microscopio se ven borrosos y desenfocados, lo que obliga al patólogo a alterar el enfoque de manera manual y continua cuando observa una muestra gruesa. Esto limita la productividad del patólogo y también aumenta la probabilidad de que pase por alto una característica sutil que puede aparecer sólo en un plano focal estrecho.

Esta limitación es particularmente aguda en el análisis de especímenes de tejido grueso (por ejemplo, aquellos que son más gruesos que la profundidad de campo del objetivo de un microscopio) o especímenes de tejido irregular, ya que no pueden obtenerse imágenes de todo el espécimen en un solo plano focal. El carácter tridimensional de tales especímenes requiere un reenfoque constante para observar las células en diversos contornos de la muestra. Como resultado, el patólogo no ve toda la muestra enfocada, lo que limita la capacidad del patólogo para reconocer características de diagnóstico sutiles que se expanden en varios planos focales.

Por ejemplo, cuando se obtiene una biopsia con cepillo no laceracional de un tejido, se usa un cepillo que es lo suficientemente rígido como para penetrar en el tejido. En el procedimiento de obtención de un espécimen de tejido de grosor completo, se obtienen fragmentos de tejido además de células individuales y grupos de células y se transfieren a un portaobjetos de microscopio. La colección de especímenes tan gruesos se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 6.258.044.

Tales especímenes contienen células individuales, grupos de células y fragmentos de tejido, y son esencialmente un híbrido entre un frotis citológico y cortes histológicos. Tales especímenes pueden tener, por ejemplo, un grosor de 20 a 60 micrómetros. Sin embargo, la profundidad de campo de un microscopio típico de 20x con una NA (apertura numérica) de 0,75 puede ser de tan sólo 4 micrómetros. Por tanto, no pueden obtenerse imágenes fácilmente de tales especímenes y, como resultado, la microscopía convencional no presenta toda la información que un patólogo necesita para hacer un diagnóstico (por ejemplo, una imagen que está completamente enfocada).

La capacidad de ver fragmentos de tejido, además de células individuales, conferiría una ventaja a un patólogo para hacer un diagnóstico. Por ejemplo, el tejido intacto proporciona al patólogo información importante sobre la arquitectura de un tejido que no está disponible en los frotis citológicos. Este beneficio es especialmente crítico en la evaluación del tejido gastrointestinal, que es un tejido complejo que contiene diversos tipos de células incluyendo, por ejemplo, epitelio glandular, escamoso y cilíndrico.

Una solución al problema anterior se proporciona en la patente estadounidense n.° 8.199.997 (“la patente '997”). Esa patente da a conocer sistemas y métodos que componen una imagen bidimensional a partir de un espécimen tridimensional grueso. Esto permite que un patólogo capture la información disponible de un espécimen tridimensional sin los inconvenientes asociados con un microscopio convencional. Los sistemas y métodos dados a conocer en la patente '997 utilizan técnicas de procesamiento de profundidad de enfoque extendida (“EDF”). Tal como se describe en ese documento, con el procesamiento de EDF, un microscopio automatizado captura un conjunto de cortes de imagen tomados a intervalos regulares a lo largo del eje z (en la misma ubicación) y luego recupera de cada corte los píxeles que están enfocados para construir una sola imagen compuesta a partir de los píxeles enfocados.

Aunque la invención de la patente '997 representa una mejora significativa con respecto a las técnicas de microscopía convencionales, se necesitan mejoras adicionales en los sistemas de obtención de imágenes basados en EDF para obtener imágenes de especímenes biológicos gruesos y semitransparentes. En este sentido, los sistemas y métodos de EDF convencionales aportan nitidez a todos los elementos de la imagen, independientemente de su ubicación en un conjunto de imágenes. Estos sistemas y métodos pueden hacer esto recorriendo iterativamente una colección de imágenes e identificando las partes más nítidas de cada imagen. Luego se forma una imagen compuesta usando sólo los píxeles ubicados en las partes más nítidas de cada imagen en el conjunto de imágenes. Este procedimiento convencional funciona bien con objetos no transparentes u opacos, donde no es posible ver ningún objeto debajo de la superficie. Sin embargo, en objetos de imagen semitransparentes, tales como muestras de tejido, los objetos debajo de la superficie son visibles al microscopio, lo que introduce una complejidad adicional.

Específicamente, los sistemas y métodos de EDF convencionales enfocarían los objetos en la superficie y los que están debajo de la superficie, haciendo que parezca que tanto los objetos superiores como los inferiores están en el mismo plano focal y haciendo que los objetos parezcan más cerca entre sí de lo que realmente están. Tales artefactos de imagen no deseados pueden hacer que las células se vean hacinadas y, por tanto, no saludables, lo que podría cambiar significativamente el diagnóstico de la zona realizado por el patólogo y/o el sistema informático, por ejemplo, de benigno a displásico (es decir, precanceroso). En este sentido, el tejido sano parecerá tener una separación regular entre las células, mientras que en el tejido canceroso la separación entre las células es muy irregular, o las células no están uniformemente alineadas entre sí. EDF convencional también tiene una tendencia natural a diezmar la relación z entre objetos para mejorar el enfoque, mientras que sería deseable preservar la separación entre los núcleos y, por tanto, el verdadero diagnóstico.

Por consiguiente, se necesitan sistemas y métodos que creen una imagen compuesta a partir de una colección de imágenes mientras se preserva la relación espacial entre objetos en diferentes planos. Además, se necesitan sistemas y métodos que identifiquen el plano focal óptimo para una colección de imágenes.

Otro problema con los sistemas de EDF convencionales es que el aumento cambia a medida que el objetivo del microscopio se mueve hacia arriba y hacia abajo entre los planos focales. En particular, cuando se mueve el objetivo, aparecerán nuevos objetos enfocados, mientras que otros objetos se volverán menos enfocados. Al mismo tiempo, esos objetos menos enfocados también se vuelven más pequeños debido a los cambios de aumento. Como resultado, los bordes de la imagen se mueven a medida que cambia el enfoque y, por consiguiente, la imagen se reduce, lo que podría hacer que el algoritmo reconozca cada borde en movimiento como un borde independiente en cada plano focal. Esto puede dar como resultado que el sistema divida un solo borde en una “escalera” de múltiples bordes adyacentes en la imagen de EDF compuesta. En tales circunstancias, los bordes falsos “en movimiento” pueden sobrecargar a la propia imagen e introducir artefactos de escalera en las imágenes de EDF compuestas. Por ejemplo, estos artefactos pueden aparecer como escamas blancas en la imagen compuesta.

En los sistemas de EDF, a menudo es ventajoso obtener una pila de imágenes a lo largo de un eje z con grandes pasos entre imágenes (por ejemplo, para aumentar la velocidad en el procedimiento de obtención de imágenes). Este tamaño de paso puede estar cerca de la profundidad de campo del sistema. Por tanto, se necesitan sistemas y métodos que preserven los bordes de los objetos, pero que permitan grandes pasos entre las imágenes.

Además, se necesitan sistemas y métodos que aprovechen la valiosa información de diagnóstico contenida únicamente en una muestra de biopsia con cepillo. A modo de ejemplo, un gran número de pacientes en los Estados Unidos y en todo el mundo se someten a procedimientos de endoscopia, mediante los cuales un médico observa secciones del tracto gastrointestinal superior, el conducto biliar u otras zonas del cuerpo usando un endoscopio. En tales procedimientos, un médico puede realizar biopsias con fórceps y/o biopsias con cepillo para recuperar muestras de tejido para análisis de laboratorio.

Durante un procedimiento de biopsia con fórceps, se extirpan pequeños cortes de tejido de zonas enfocadas del esófago a intervalos determinados. En un laboratorio, los segmentos de tejido extirpados se cortan con un micrótomo en láminas planas para que los analice un patólogo. Como tal, un patólogo que revisa estas muestras de tejido convencionales analiza cortes de tejido sustancialmente planos donde es necesario un reenfoque mínimo. Por otro lado, durante un procedimiento de biopsia con cepillo, se usa un instrumento de biopsia con cepillo que tiene cerdas rígidas para barrer una amplia zona de tejido y obtener una muestra de tejido de grosor completo de la amplia zona de tejido. El cepillo de biopsia extrae pequeños segmentos de tejido que se transfieren a un portaobjetos de espécimen sustancialmente intacto. Dado que estos segmentos de tejido no se cortan (tal como se describe anteriormente con respecto a las biopsias con fórceps), se mantiene la arquitectura natural del tejido. Significativamente, esto preserva la vista frontal del tejido para la observación por parte de un patólogo y/o el análisis por un sistema informático (a diferencia de las preparaciones tisulares histológicas convencionales donde la vista frontal se destruye debido al corte del tejido).

La vista frontal del tejido confiere valiosa información de diagnóstico. Por ejemplo, las células del tracto gastrointestinal están organizadas en una estructura reticular que forma un “panal de abeja”. Esta arquitectura tisular hexagonal es típica de las células glandulares del cuerpo, tales como las vías biliares, el colon, la mama, etc., y de las regiones de transición donde se encuentran los tejidos escamosos y glandulares, tales como las células esofágicas o endocervicales.

En tejido sano, pueden observarse núcleos uniformemente espaciados que forman la apariencia de panal de abeja. Sin embargo, en la displasia temprana, los núcleos individuales pueden agrandarse ligeramente y aumenta la razón citoplásmica nuclear normal. Cuando ocurre esto, los núcleos vecinos crecen más cerca unos de otros y comienzan a hacinarse. Además, en lugar de empaquetarse en un panal de abeja organizado, los núcleos se desorganizan y las relaciones de las células entre sí se vuelven desordenadas por naturaleza. Por tanto, la presencia o ausencia de una estructura alveolar y el grado de hacinamiento y desorganización son características diagnósticas importantes para detectar la enfermedad en etapa temprana y discernir entre estados displásicos y benignos.

Aunque las biopsias con cepillo pueden obtener fragmentos de tejido que retienen la vista frontal del tejido y retienen el panal de abeja para la observación clínica, las células constituyentes que forman el panal de abeja a menudo se ubican en planos focales diferentes y, como tal, un patólogo no puede observar el panal de abeja enfocado. Más bien, se requiere que el patólogo vea una o más células a una primera distancia focal de forma aislada, luego vea una o más células a una segunda distancia focal de forma aislada, y así sucesivamente. Este procedimiento manual no sólo es tedioso, sino que además no es fiable. En este sentido, el patólogo debe recordar la relación y la distancia entre las células en las diferentes distancias focales y luego ensamblar mentalmente toda la información que ha observado. A modo de analogía, en lugar de ver una imagen de un bosque, el patólogo se ve obligado a mirar árboles individuales y tratar de construir en su mente una imagen del bosque.

Las técnicas de EDF conocidas no han dado como resultado una imagen adecuada del panal de abeja, ya que no preservan la relación espacial entre las células en muestras gruesas y semitransparentes. Como resultado, no se obtienen imágenes del panal de abeja con claridad y su regularidad y posible anomalía es más difícil de evaluar. En los sistemas de EDF convencionales, todos los núcleos aparecerán en el mismo plano, lo que hará que el panal de abeja parezca más hacinado, dando al patólogo la falsa impresión de que las células se están volviendo displásicas. El documento US2009046909A1 se refiere a un método y a un sistema para construir una imagen digital de un espécimen biológico tridimensional que muestra información importante para el diagnóstico sustancialmente con exclusión de información sin importancia. El sistema reduce las características de un espécimen celular que no son importantes para el diagnóstico y mejora las que sí lo son. El sistema selecciona el píxel más nítido para cada ubicación de píxel entre una pila de cortes de imagen y lo copia en una imagen compuesta. Heechul Han et al. “Virtual out of focus with single image to enhanced 3D perception” (3DTV Conference: The True Vision - Capture Transmission And Display Of 3D Video (3DTV-CON), 2011, IEEE, 16 de mayo de 2011 (16-05-2011), páginas 1-4) se refiere a un método para mejorar el desenfoque virtual con imágenes individuales para proporcionar una percepción 3D mejorada. Más específicamente, el color, el contraste y los detalles de un objeto enfocado se acentúan, mientras que los de un fondo se atenúan en función del mapa de profundidad estimado con un método de segmentación y detección de rostros para mejorar la percepción 3D. Teniendo en cuenta la percepción humana y una imagen real desenfocada tomada con una lente de gran apertura, Heechul Han et al. sugieren una gradación de límites para el mapa de profundidad estimado para manejar los errores de difuminado. Para hacer un fondo difuminado, Heechul Han et al. realizan una pirámide de Gauss modificada mediante la ampliación y combinación de todas las imágenes. El documento US2004/076315A1 se refiere a un método que incluye recibir una serie de secciones ópticas de diferentes partes de un embrión a lo largo del tiempo a lo largo de un eje Z a través de microscopía de contraste de interferencia diferencial. El método también incluye delinear un perímetro del número de partes del embrión dentro del número de secciones ópticas. Además, el método incluye generar una imagen facetada tridimensional del número de partes en función del perímetro delineado. El método incluye reconstruir, por separado, una imagen en cuatro dimensiones de un crecimiento de las diferentes partes del embrión a lo largo del tiempo basándose en la imagen facetada tridimensional del número de partes. Shain William J et al. “Extended depth-of-field microscopy with a high-speed deformable mirror” (Progress In Biomedical Optics And Imaging, SPIE-Sociedad Internacional de Ingeniería Óptica, Bellingham, WA, EE.UU., vol. 10073, 21 de febrero de 2017, páginas 100730E-100730E) se refiere a un complemento de microscopía de fluorescencia de campo amplio que proporciona una profundidad de campo extendida (EDOF) rápida y eficiente en cuanto a luz usando un espejo deformable con una frecuencia de actualización de 20 kHz. Las contribuciones fuera de foco en las imágenes de EDOF sin procesar se suprimen con un algoritmo de deconvolución derivado directamente de la función de transferencia óptica 3D del microscopio.

Por consiguiente, se necesitan sistemas y métodos mejorados que puedan crear una vista enfocada de la estructura alveolar para el análisis por parte de un ordenador y/o un patólogo.

Sumario de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un sistema de EDF que genera una imagen compuesta enfocada de una muestra biológica mediante la cual los objetos de imagen importantes para el diagnóstico se presentan enfocados y los objetos subyacentes se desacentúan.

Otro objeto de la invención es determinar una pluralidad de planos focales óptimos para diferentes segmentos de la muestra biológica y obtener objetos de imagen a partir de la pluralidad de planos focales óptimos para generar una imagen compuesta digital.

Aún otro objeto de la invención es determinar si la distancia entre las células de un tejido se encuentra dentro de una distancia saludable predeterminada y, cuando se realiza tal determinación, desacentuar los objetos de imagen subyacentes a un plano ocupado por las células dentro de la distancia saludable predeterminada.

Otro objeto de la invención es generar una imagen frontal de un tejido en la que las células constituyentes que comprenden el tejido están ubicadas en planos diferentes.

La invención proporciona, según la reivindicación 1, un sistema (100) para generar una imagen digital compuesta de una muestra biológica que comprende:

un aparato informático (44) configurado para generar una imagen compuesta de la muestra biológica a partir de una pluralidad de imágenes de la muestra biológica, cada una de la pluralidad de imágenes tomada a lo largo de un único eje, en el que el ordenador:

(a) identifica un primer plano focal, en el que el primer plano focal comprende una primera distancia z, para una primera colección de objetos de imagen en una primera ubicación x-y de la muestra biológica, y

(b) identifica un segundo plano focal, en el que el segundo plano focal comprende una segunda distancia z, para una segunda colección de objetos de imagen en una segunda ubicación x-y de la muestra biológica, y

(c) identifica un primer plano focal óptimo y un segundo plano focal óptimo basándose en (a) y (b) respectivamente, y

(d) combina objetos de imagen del primer plano focal óptimo y objetos de imagen del segundo plano focal óptimo y genera la imagen digital compuesta, en el que el aparato informático (44) calcula un valor de nitidez para los objetos de imagen en el primer plano focal y calcula un valor de nitidez para los objetos de imagen en el segundo plano focal y genera un mapa bidimensional de un índice z de los objetos que tienen los valores de nitidez más altos, y en el que el aparato informático (44) identifica un primer plano focal óptimo y un segundo plano focal óptimo para la primera y segunda colección de objetos de imagen realizando una serie de dilataciones seguidas de una misma cantidad de erosiones en el mapa bidimensional del índice z de los objetos de imagen que tienen los valores de nitidez más altos en los planos focales primero y segundo en el que el número de dilataciones y erosiones es proporcional a la distancia entre los objetos celulares de interés en el tejido sano, para así identificar un primer y un segundo plano focal óptimo, y en el que los objetos de imagen ubicados en el primer plano focal óptimo se presentan enfocados y los objetos de imagen debajo del primer plano focal óptimo se desacentúan, y en el que los objetos de imagen ubicados en el segundo plano focal óptimo se presentan enfocados y los objetos de imagen debajo del segundo plano focal óptimo se desacentúan.

Breve descripción de los dibujos

Las características y ventajas de la presente divulgación se entenderán más completamente con referencia a la siguiente descripción detallada cuando se toma junto con las figuras adjuntas, en las que:

La figura 1 es una vista en sección transversal esquemática de una muestra de tejido representativa de la que se han obtenido imágenes usando un sistema de EDF convencional.

La figura 2 es una vista en sección transversal esquemática de una muestra de tejido representativa de la que se han obtenido imágenes usando una realización del sistema de EDF mejorado de la presente invención.

La figura 3 es un diagrama de bloques del sistema de EDF mejorado según una realización de la presente invención. La figura 4 es un diagrama de flujo de una realización del método de procesamiento de EDF mejorado según una realización de la presente invención.

La figura 5 es un diagrama que muestra elementos de imágenes representativas capturadas usando el sistema de EDF mejorado según una realización de la presente invención.

La figura 6 es un gráfico que representa un paso del método realizado por el sistema de EDF mejorado según una realización de la presente invención.

La figura 7 es un diagrama que representa otro paso del método realizado por el sistema de EDF mejorado según una realización de la presente invención.

La figura 8A es una vista en perspectiva lateral esquemática de un corte de tejido epitelial cilíndrico.

La figura 8B es una vista desde arriba esquemática del corte de tejido de la figura 8A, que muestra un patrón alveolar.

La figura 9 muestra una vista lateral esquemática de un corte de tejido epitelial cilíndrico donde las células constituyentes del corte de tejido ocupan planos diferentes.

La figura 10 muestra una vista lateral esquemática de un corte de tejido epitelial cilíndrico donde una serie de células ocupan un plano superior y una célula subyacente ocupa un plano inferior.

La figura 11 muestra una imagen compuesta de un espécimen de tejido obtenido sin el sistema de EDF mejorado según realizaciones de la invención.

La figura 12 muestra una imagen compuesta de un espécimen de tejido obtenido usando el sistema de EDF mejorado según una realización de la presente invención.

La figura 13 muestra representaciones comparativas esquemáticas de un área de espécimen con un “artefacto de escalera” y del mismo área de espécimen donde se elimina el artefacto según una realización de la presente invención.

Descripción detallada de la invención

A continuación se describirán realizaciones de la presente invención con referencia a las figuras de los dibujos identificadas anteriormente. Sin embargo, los dibujos y la descripción en el presente documento de la invención no pretenden limitar el alcance de la invención. Se entenderá que son posibles diversas modificaciones de la presente descripción de la invención. Además, pueden omitirse características descritas en el presente documento, pueden incluirse características adicionales y/o pueden combinarse características descritas en el presente documento de una manera diferente a las combinaciones específicas mencionadas en el presente documento.

Tal como se comentó anteriormente, los sistemas de EDF convencionales normalmente extraen a ciegas los píxeles más nítidos de cada plano focal al generar una imagen compuesta. Por tanto, cuando tales algoritmos se aplican a especímenes biológicos gruesos y semitransparentes, no necesariamente tienen en cuenta qué píxeles específicos pertenecen a qué objetos específicos y, por tanto, a veces no pueden preservar la disposición espacial de tales objetos. Por ejemplo, cuando múltiples objetos o células están situados en planos diferentes (pero se superponen entre sí), una imagen compuesta generada por los sistemas de EDF convencionales puede parecer que representa una sola célula, cuando en realidad había varias células apiladas una encima de la otra. Esto se debe a que la relación espacial entre los objetos en planos diferentes no siempre se preserva cuando se usa EDF convencional. Este problema puede cambiar significativamente el diagnóstico de la zona realizado por el patólogo y/o el sistema informático, por ejemplo, de benigno a displásico (es decir, precanceroso).

La figura 1 demuestra el funcionamiento de los sistemas de EDF convencionales. El espécimen 1 es una muestra de tejido semitransparente que tiene una profundidad D y contiene objetos de interés (por ejemplo, células) 10, 20 y 30. Los objetos 30 están ubicados en un primer plano focal (más cercano a la parte superior del espécimen), los objetos 20 están ubicados en un segundo plano focal inferior y los objetos 10 están ubicados en un tercer plano focal que está debajo del segundo plano focal. Los objetos 20 ubicados en el segundo plano focal se superponen con los objetos 10 ubicados en el tercer plano focal. La salida de un sistema de EDF convencional se muestra en la imagen compuesta 5. Tal como puede observarse, los sistemas de EDF convencionales extraen a ciegas los píxeles correspondientes a los objetos más nítidos en cada plano focal al generar la imagen compuesta. El plano de EDF convencional 6 no tiene en cuenta ni preserva la relación espacial de los diversos objetos en el espécimen 1. Como resultado, los objetos 10 y 20 aparecen hacinados en la imagen compuesta 5, aunque, de hecho, están ubicados en planos diferentes. Estos objetos pueden aparecer incorrectamente como una sola célula o masa en la imagen compuesta 5, lo que podría dar como resultado un diagnóstico incorrecto por parte de un patólogo o un sistema informático. En este sentido, el patólogo puede interpretar como displásica la imagen compuesta 5, cuando simplemente incluye células sanas situadas en planos diferentes. Por tanto, sería deseable que un sistema de EDF pudiera proporcionar una imagen de EDF compuesta con los objetos 20 y 30 enfocados, pero los objetos 10 desenfocados.

El funcionamiento del sistema de EDF mejorado de la presente invención se demuestra con referencia a la figura 2, que muestra el mismo espécimen esquemático que en la figura 1. Específicamente, el espécimen 1 es una muestra de tejido semitransparente que tiene una profundidad D y contiene objetos de interés (por ejemplo, células) 10, 20 y 30. Los objetos 30 están ubicados en un primer plano focal (más cercano a la parte superior del espécimen), los objetos 20 están ubicados en un segundo plano focal (debajo de los objetos 30) y los objetos 10 están ubicados en un tercer plano focal (debajo de los objetos 20). Los objetos 20 se superponen a los objetos 10. Sin embargo, en lugar de copiar a ciegas los píxeles correspondientes a los objetos más nítidos en cada plano focal a la imagen compuesta 5, el sistema de EDF mejorado identifica el plano focal óptimo 7 en el espécimen 1. Como resultado, cuando se genera la imagen compuesta 5, los objetos 10 se desacentúan y se preserva la representación espacial de los objetos 10 con respecto a los objetos 20.

Recogida y preparación de muestras:

Aunque son aplicables a muchos campos, se ha encontrado que los sistemas y métodos de la presente invención son útiles en el análisis de muestras de tejido recogidas usando un instrumento de biopsia con cepillo, para otras preparaciones de frotis y para muestras histológicas tradicionales con imágenes a 40X con un objetivo de alta NA. Tal como se comentó anteriormente, cuando se obtiene una biopsia con cepillo de un tejido, se usa un cepillo que es lo suficientemente rígido como para penetrar en las diversas capas de tejido (por ejemplo, tejido epitelial). En el procedimiento de obtención de un espécimen de tejido de grosor completo, se recogen fragmentos de tejido además de células individuales y grupos de células.

Normalmente, en la preparación de un espécimen celular para patología, un médico transferirá y fijará células y/o el tejido a un portaobjetos de microscopio de vidrio. Luego, el portaobjetos se envía a un laboratorio para su posterior procesamiento y diagnóstico médico. El procesamiento adicional puede incluir teñir el portaobjetos para mejorar el contraste de la muestra (o las características específicas de una muestra) cuando se observa bajo un microscopio. Tales tinciones pueden incluir, por ejemplo, Feulgen, Papanicolaou, hematoxilina y eosina (H&E), azul alcián y tinciones de IHC. Un técnico de laboratorio también puede aplicar un cubreobjetos y una etiqueta al portaobjetos. Entre otras cosas, la etiqueta puede identificar el tipo de tinción aplicada a la muestra. Esta información puede estar representada en un código de barras o incrustada en un dispositivo de seguimiento electrónico (por ejemplo, RFID). Tal como se comenta además a continuación, en pasos de procesamiento posteriores, un sistema informático puede leer esta información para determinar el algoritmo de procesamiento óptimo para aplicar a una muestra en particular. En la presente invención, sin embargo, un portaobjetos se somete a un procesamiento adicional antes de ser examinado por un patólogo y/o un sistema informático. Específicamente, las imágenes de microscopio digital capturadas del espécimen celular se procesan adicionalmente mediante el sistema de EDF mejorado descrito en el presente documento, que produce una imagen digital mejorada que preserva objetos importantes para el diagnóstico y sus relaciones espaciales entre sí. Esto aumenta la precisión del sistema de análisis informático a medida que se reducen los artefactos y las imágenes falsas, y los objetos de interés importantes para el diagnóstico se presentan al ordenador enfocados.

En la figura 3 se muestra un diagrama de bloques del sistema de EDF mejorado 100 de la presente invención. El sistema 100 comprende un sistema óptico 40 para obtener una colección de imágenes de un portaobjetos. El sistema óptico 40 puede incluir un microscopio de alta potencia, una platina de posicionamiento de portaobjetos y una cámara. Un aparato informático 44 controla el movimiento de la platina en la dirección z para obtener un número suficiente de cortes de imágenes para componer una imagen de una posición x-y particular. El sistema 100 comprende además un dispositivo de almacenamiento 42 para almacenar la colección de imágenes. El dispositivo de almacenamiento 42 puede comprender un disco duro o SSD (unidades de estado sólido) u otro tipo de dispositivo de memoria de alta velocidad. El aparato informático 44 (o múltiples ordenadores trabajando juntos) procesa la colección de imágenes de pila z para generar la imagen compuesta mejorada que se comenta en el presente documento. El aparato informático 44 puede utilizar hardware de procesamiento de imágenes especializado (tal como una unidad de procesamiento gráfico o “GPU”) para aumentar la velocidad de procesamiento.

Los expertos en la técnica entenderán que el sistema óptico 40 puede configurarse para capturar y almacenar una imagen después de cada movimiento de la platina, o alternativamente puede configurarse para capturar imágenes de manera consecutiva y continua a intervalos de tiempo regulares mientras la platina se mueve a una velocidad constante. En realizaciones de la invención, este último método puede ser más rápido en la creación de pilas z. Sin embargo, se debe tener cuidado de añadir suficiente luz al sistema (por ejemplo, a través de un estroboscopio) para que el tiempo de integración de la captura de imágenes se mantenga al mínimo. En otras realizaciones de la invención, el sistema está configurado para realizar una compresión con pérdida o sin pérdida en las imágenes de pila z y mover la versión comprimida de las imágenes de pila z fuera de línea (por ejemplo, a través de Ethernet) para cálculos de EDF más intensivos. Esto se hace para que el procedimiento de captura de pilas z pueda producirse a la máxima velocidad (restringido por movimientos mecánicos), donde el procesamiento de EDF puede ser realizado, en paralelo, por múltiples ordenadores. Este desacoplamiento permite un rendimiento máximo con la máxima escalabilidad a un coste mínimo. Todos los movimientos mecánicos están aislados en la parte del escáner/imagen, mientras que la segunda parte es altamente escalable al añadir ordenadores adicionales según sea necesario para trabajar en las pilas z individuales en torniquete (“round-robín’’).

En el diagrama de flujo de la figura 4 se muestra una realización de los pasos de procesamiento realizados por un sistema de EDF mejorado.

Recogida de imágenes:

Tal como se muestra en el paso S1 de la figura 4, un sistema óptico obtiene una colección de cortes de imágenes, cada uno tomado a diferentes profundidades focales (o planos focales) a lo largo de un eje z (es decir, el eje del microscopio). La colección de imágenes se almacena preferiblemente en la memoria del ordenador donde la CPU tiene acceso directo a la memoria del ordenador para realizar las operaciones intensivas de EDF, o en otra realización, las imágenes de pila z pueden almacenarse en una placa de procesamiento o captura independiente que tiene un procesador de CPU, RISC, GPU o FPGA independiente que es capaz de realizar operaciones de EDF rápidas. Una vez que se completa EDF, la colección de imágenes se almacena en un dispositivo de almacenamiento de datos (figura 3, 42) para su recuperación por el aparato informático. El número de imágenes en la pila puede depender de varios factores, incluyendo el grosor de la muestra que se examina y la profundidad de campo del objetivo del microscopio. Generalmente, prefiere usarse un intervalo menor que la profundidad de campo del objetivo del microscopio para cumplir con los criterios de sobremuestreo. Esto garantiza una nitidez constante en todo el grosor del espécimen. Por ejemplo, suponiendo que una muestra tiene un grosor de 60 um y se toma una imagen a intervalos de profundidad focal de 4 um, pueden recogerse un total de 15 o más imágenes (o cortes).

El intervalo de muestreo puede predeterminarse, por ejemplo, basándose en datos preestablecidos. Alternativamente, el sistema informático puede determinar dinámicamente el intervalo de muestreo, por ejemplo, midiendo el número de píxeles nítidos en cada plano focal y adaptando el procesamiento cuando se encuentran relativamente pocos píxeles nítidos. El algoritmo puede adaptarse terminando el escaneo z prematuramente o ampliando el escaneo z si aún se encuentran píxeles nítidos adicionales, o aumentando la distancia z entre planos focales si se encuentran píxeles nítidos mínimos. Cuantos menos pasos puedan tomarse, más rápido el sistema puede presentar la imagen de EDF final, pero esto debe equilibrarse con la pérdida de calidad de imagen que puede producirse si los pasos son demasiado grandes.

Procesamiento previo:

En una realización, las imágenes en la pila se convierten a escala de grises, tal como se muestra en el paso S2 de la figura 4. Se ha encontrado que al convertir cada imagen a escala de grises, la cantidad de datos de imagen y el procesamiento asociado se reducen significativamente sin sacrificar la precisión del diagnóstico. En este sentido, la conversión a escala de grises puede optimizarse para inmunotinciones específicas, por ejemplo, para H&E o azul alcián. Por ejemplo, la deconvolución de color puede usarse para mejorar las células inmunoteñidas y garantizar que los colores particulares permanezcan enfocados. En una realización, el sistema lee automáticamente la información relacionada con las tinciones aplicadas de los portaobjetos para determinar el algoritmo de procesamiento óptimo para aplicar a una muestra particular.

En otra realización, en lugar de convertir las imágenes recogidas a escala de grises, el sistema de EDF mejorado realiza el procesamiento de EDF directamente en las imágenes en color. Por ejemplo, el contraste de los bordes puede calcularse directamente a partir de las tres imágenes en color RGB como el máximo del contraste rojo, verde y azul.

En el paso S3, pueden inicializarse las diversas estructuras de datos que se requerirán para el procesamiento de imágenes. Estas pueden incluir una serie de matrices bidimensionales, incluyendo la matriz de nitidez máxima y la matriz de índice z, que se comentarán más adelante. Pueden usarse estructuras de datos alternativas conocidas por los expertos en la técnica, tales como colecciones, tablas u objetos de datos, en lugar de matrices de píxeles.

Localización de los objetos más nítidos en la colección de imágenes:

Con referencia a los pasos S4, S5 y S6 de la figura 4, el sistema de EDF mejorado recorre iterativamente la colección de imágenes tomadas desde diferentes distancias focales a lo largo de un eje z para identificar la ubicación de los objetos más nítidos en la colección de imágenes. Específicamente, comenzando en la parte superior (o inferior) de la pila de imágenes, el sistema se inicializa calculando la nitidez de los objetos en el primer plano de imagen. Los valores de nitidez calculados se almacenan en la matriz de nitidez máxima y la matriz de índice z se completa con el índice del plano de imagen inicial (por ejemplo, plano 1, que representa el plano más superior). Para todos los planos posteriores a lo largo del eje z, el sistema calcula la nitidez de cada píxel u objeto en ese plano y compara la nitidez de los objetos en el nuevo plano de imagen con los almacenados en la matriz de nitidez máxima. Si se encuentra un nuevo valor de nitidez máxima, el sistema almacena: (1) el nuevo valor de nitidez máxima en la matriz de nitidez máxima (en lugar del valor máximo anterior) y (2) su ubicación (es decir, el índice del corte de imagen en el que se encuentra) en la matriz de índice z.

Determinación del plano focal óptimo:

A continuación, el sistema de EDF mejorado calcula el plano focal óptimo para la muestra bajo revisión (paso S7). Tal como se comentó anteriormente, este paso garantiza que se mantenga la relación espacial entre los objetos de interés dentro de la muestra. Como resultado de obtener el plano focal óptimo y crear una imagen compuesta usando el plano focal óptimo derivado, los objetos superpuestos se presentan enfocados y los objetos subyacentes se mantienen desenfocados.

En una realización de la invención, el plano focal óptimo se determina calculando la distancia entre las células y determinando si las células están o no dentro de una distancia normal o sana entre sí (denominada “distancia h”, figura 2). En realizaciones de la invención, la distancia sana o “distancia h” es una distancia predeterminada entre bordes celulares o entre dos núcleos. Por ejemplo, en una realización de la invención, la distancia h se calcula midiendo la distancia entre los bordes de los núcleos de células vecinas, en otra realización la distancia h se calcula midiendo la distancia entre los centros de núcleos vecinos.

En el caso de que se determine que dos células están dentro de la distancia h, el sistema concluye que las dos células son del mismo tejido y, como tal, el plano ocupado por las células vecinas será el plano focal, y las células subyacentes permanecerán desenfocadas. Sin embargo, si la distancia entre dos células es mayor que la distancia h, el sistema desplazará el plano focal para permitir que ambas células no relacionadas se mantengan enfocadas. Por ejemplo, con referencia a la figura 2, el sistema determinó que la distancia entre los objetos 20 (por ejemplo, la distancia A) está dentro de la distancia h. Por tanto, el plano ocupado por los objetos 20 se selecciona como el plano focal óptimo para ese segmento de portaobjetos y los objetos 20 se presentan enfocados. Los objetos subyacentes 10, por otro lado, permanecen desenfocados. A la inversa, se determina que la distancia B entre el objeto 20' y el objeto 30' es mayor que la distancia h. Como resultado, el plano focal se desplaza (hacia la derecha en la orientación mostrada) al segmento de portaobjetos donde los objetos 30 se colocan dentro de la distancia h entre sí.

La distancia h puede medirse en unidades métricas lineales o en números de píxeles, según realizaciones de la invención.

Según la invención, el plano focal se determina realizando un “cierre” en la matriz de índice z. Un cierre es un conjunto de operaciones donde a un número predefinido de dilataciones en escala de grises le sigue un mismo número de erosiones en escala de grises. Por ejemplo, suponiendo una distancia h de cinco píxeles, el sistema utiliza un elemento de estructuración de cinco píxeles o realiza múltiples iteraciones para cubrir la distancia h. Por tanto, las dilataciones cubrirán completamente el espacio de la distancia h. Una vez que se llena el espacio y se fusionan los píxeles a ambos lados del espacio, las erosiones posteriores no tendrán ningún efecto. Sin embargo, si el espacio no se llena, las erosiones posteriores restablecerán los bordes a sus posiciones originales. Por tanto, el cierre puede llenar el espacio por completo (es decir, producir el mismo índice z) y, por tanto, no traer una imagen subyacente (por ejemplo, un núcleo celular) a la superficie si tal imagen existe entre el espacio. Sin embargo, si el cierre no llena el espacio, y hay uno o más núcleos debajo entre el espacio, llevará los núcleos hasta el tope de la superficie. Se entenderá que las erosiones y dilataciones pueden realizarse mediante cualquiera de las diversas técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, el algoritmo de dilatación/erosión de Gil-Kimmel (véase Gil, J. Y. y Kimmel, R., Efficient dilation, erosion, opening and closing algorithms. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence, 24(12), 1606-1617 (2002)).

Por tanto, en la realización a modo de ejemplo mostrado en la figura 2, la distancia B entre la célula 20' y 30' es mayor que la distancia h. Como tal, aunque las dilataciones extenderán la imagen de la célula 20' en todas las direcciones y también extenderán la imagen de la célula 30' en todas las direcciones, el espacio entre las células respectivas no se llenará. Como resultado, después de que se hayan realizado las erosiones, los bordes originales de las células 20' y 30' se restablecerán y el plano ocupado por las células 20 no se fusionará con el plano ocupado por las células 30. En cambio, el plano focal se desplaza efectivamente desde el plano ocupado por las células 20 hasta el plano ocupado por las células 30. A la inversa, debido a que la distancia entre las células 20 está dentro de la distancia h, las dilataciones realizadas en las células 20 tendrán el efecto de llenar los espacios entre las respectivas células 20, que no se invertirán por las erosiones posteriores. Por tanto, el plano ocupado por las células 20 se determinará como el plano focal y, por consiguiente, las células 20 se presentarán enfocadas, mientras que las células 10 debajo de los espacios entre las células 20 se presentarán desenfocadas. Esto garantiza que se preserve la relación espacial entre las células 20 y las células 10 situadas debajo.

En una realización, se usa un núcleo plano de 5x5 aproximadamente circular para las erosiones y dilataciones. En otra realización, se usa un núcleo gaussiano en escala de grises, tal como el que se enseña en la referencia de Gil-Kimmel citada anteriormente. El número de erosiones y dilataciones se selecciona para presentar los objetos superpuestos enfocados y mantener los objetos subyacentes desenfocados. Debido a que la determinación de un plano focal óptimo se realiza en respuesta a las distancias entre los objetos, el plano focal óptimo puede variar a medida que el sistema se mueve a lo largo de la distancia de un espécimen, concentrándose más en la capa superior de núcleos donde los núcleos son más visibles, y tiene las características más nítidas (la luz se difracta menos cerca de la superficie del medio semitransparente) pero aún es capaz de traer núcleos más profundos a la superficie.

El resultado del procedimiento de dilatación/erosión comentado anteriormente se ilustra adicionalmente en las figuras 5 y 6. En la figura 5, se muestra una pila de imágenes 15, con la imagen I10 colocada en la parte superior de la pila de imágenes. Las imágenes I5 e I1 incluyen diversos objetos que están enfocados en cada uno de estos planos de imagen. Los objetos 20 superponen a los objetos 10 en el eje z. En la figura 6 se muestra una porción de una matriz de índice z representativa 11 generada a partir de la pila de imágenes 15. Tal como puede observarse, la matriz de índice z contiene la ubicación (es decir, el número de plano de imagen) de los píxeles correspondientes a los objetos más nítidos en la pila de imágenes 15 (figura 5). Específicamente, la ubicación de los objetos 20 se indica con un “5” y la ubicación de los objetos 10 se indica con un “1”. Si la imagen compuesta final fuera a compilarse a partir de la matriz de índice z 11 en la figura 6 (es decir, como en EDF convencional), los objetos 10 y 20 aparecerían como un solo objeto (es decir, los objetos 10 se hacinarían sobre los objetos 20). Tal como se comentó anteriormente, esto podría dar como resultado un diagnóstico erróneo. Por tanto, la relación espacial en la imagen compuesta debe preservarse para representar con precisión el espécimen y realizar un diagnóstico correcto. La figura 7 representa la matriz de índice z representativa de la figura 6 después de que se hayan realizado una serie de dilataciones y erosiones. Específicamente, los objetos ubicados en la Imagen I1 se han desacentuado con éxito y se ha mantenido la relación espacial de los objetos. Tal como puede observarse, sólo los objetos 20, indicados con un “5”, permanecen en el índice 12. Por tanto, cuando se compila la imagen compuesta final, los píxeles que de otro modo se habrían recuperado de la Imagen I1 se recuperan de la imagen I5.

En una realización, el número de dilataciones o erosiones es igual a la distancia h entre núcleos en el tejido sano. Tal como se indicó anteriormente, el sistema de EDF mejorado desacentuará o no enfocará los objetos inferiores si la distancia entre los núcleos de la capa superior es menor que la distancia h. Por otro lado, si la distancia es mayor que la distancia h, puede suponerse que los dos núcleos no son del mismo tejido y, por tanto, pueden enfocar cualquier objeto de nivel inferior de manera segura sin introducir el efecto de hacinamiento comentado anteriormente. Por ejemplo, la distancia h podría ser de 5 píxeles o 18 micrómetros.

Se ha encontrado que este procedimiento localiza efectivamente el plano focal óptimo para una colección de imágenes y elimina el efecto de hacinamiento indeseable. El sistema descrito en el presente documento puede usarse para encontrar el plano focal óptimo para las estructuras celulares de interés, tales como núcleos celulares. Sin embargo, el sistema puede adaptarse para enfocarse en otras estructuras de interés, en particular bolsas de moco citoplásmico en células caliciformes y/o límites celulares para mejorar la detección de disposiciones alveolares de células.

Se ha encontrado que, para encontrar áreas de moco grandes y brillantes, el sistema puede realizar dilataciones y erosiones con núcleos de mayor tamaño, tales como aquellos en el intervalo de 10x10 a 20x20 (dependiendo de la resolución de la imagen). Este procedimiento produce una matriz de índice z para objetos grandes, brillantes y de alto contraste, tales como las regiones de mucina que se encuentran en las células caliciformes. Para encontrar los límites de las células, el algoritmo realiza una operación morfológica para resaltar las líneas oscuras finas (erosión por un elemento estructurante de anillo seguida de dilatación por un elemento estructurante macizo del mismo tamaño). Esto produce una matriz de índice z para líneas oscuras finas, tales como escamas de pescado, en la superficie apical de la célula. Las tres matrices de índice z pueden usarse para crear tres imágenes de EDF independientes, lo que permite al usuario ver diferentes estructuras celulares de interés en planos focales diferentes. Alternativamente, las tres matrices de índice z pueden combinarse tomando el índice z con nitidez máxima y luego suavizando con un núcleo gaussiano de 5x5.

Generación de imagen compuesta y procesamiento posterior:

Tal como se muestra en el paso S8, el sistema genera a continuación la imagen compuesta basándose en la matriz de índice z (que ahora contiene la ubicación de los píxeles óptimos que se incluirán en la imagen compuesta) y la colección original de imágenes. También debe entenderse que pueden obtenerse múltiples pilas de imágenes para un único portaobjetos, analizarse por separado (tal como se comenta a continuación) y unirse las imágenes compuestas resultantes para formar una única imagen compuesta. O bien, puede obtenerse una sola pila de imágenes y enviarse a múltiples algoritmos, buscando cada algoritmo características específicas y generando cada algoritmo una imagen compuesta única. Por ejemplo, un usuario puede seleccionar una imagen compuesta óptima para células caliciformes, otra imagen compuesta para células displásicas y otra imagen compuesta para patrones alveolares.

Opcionalmente pueden realizarse diversas operaciones de procesamiento posterior (paso S9) en la imagen compuesta. En una realización, el procesamiento posterior incluye una corrección de nitidez, que hace que los bordes de un objeto parezcan más pronunciados y ayuda en el diagnóstico. En una realización, la corrección de nitidez comprende el enmascaramiento de desenfoque, que se sabe que hace que los bordes sean nítidos sin aumentar el ruido. En general, el enmascaramiento de desenfoque usa una imagen negativa difuminada (por ejemplo, un desenfoque gaussiano) para crear una máscara de la imagen original para identificar zonas de alta y baja frecuencia. Luego, la máscara se combina con la imagen original, creando una imagen que es más nítida que la imagen original. Otros pasos de procesamiento posterior incluyen el filtro guiado, la dilatación XYZ, la eliminación de neblina y la interpolación Z, tal como se comenta a continuación.

Análisis de la estructura alveolar

Tal como se describió, la recogida de tejido por biopsia con cepillo permite la recogida de fragmentos de tejido que mantienen intacta la vista frontal del tejido. Es decir, las muestras de histología convencional se cortan y se presentan como cortes de tejido a un patólogo y, como tal, el patólogo nunca observa la vista frontal del tejido. El aspecto alveolar frontal del tejido proporciona información clínica importante que sólo está disponible con la recogida por biopsia con cepillo. Las realizaciones del sistema de EDF mejorado permiten la observación y el análisis de la estructura alveolar de un tejido como conjunto, incluso cuando las células constituyentes que forman el panal de abeja pueden ocupar varios planos focales.

La figura 8A muestra una vista esquemática de un fragmento de tejido epitelial glandular 48. Tal como se muestra, el tejido está formado por células cilíndricas (por ejemplo, 50) empaquetadas juntas a lo largo. Los núcleos 52 de las células están ubicados en un segmento inferior de las células 50. Las células 50 están ubicadas en una membrana basal 53. Las superficies apicales de las células forman la superficie del tejido. Cuando se observa bajo un microscopio con el foco al nivel de los núcleos, los núcleos aparecen en un patrón hexagonal. Cuando el foco está en la parte superior, las membranas celulares forman un patrón hexagonal de “escamas de pescado”. Cuando el foco está entre la superficie superior y los núcleos, las regiones claras de mucina de las células caliciformes pueden observarse con mayor claridad. La mayor parte de la observación del patólogo se centra al nivel de los núcleos, aunque las vistas a nivel de mucina y escamas de pescado también se utilizan para ayudar al patólogo en el diagnóstico.

La figura 8B muestra una vista desde arriba del fragmento de tejido de la figura 8A con el nivel de enfoque en los núcleos de las células. Puede observarse un patrón regular de núcleos celulares (es decir, “el panal de abeja”). Sin embargo, en las preparaciones tridimensionales de tejido para biopsia con cepillo, las células que forman el panal de abeja pueden estar ubicadas en planos focales diferentes. En este sentido, sería imposible ver el panal de abeja enfocado sin crear una imagen compuesta de él.

Por ejemplo, con referencia a la figura 9, las células nucleares 54 y 60 se muestran en un primer plano focal P1, las células nucleares 56 se muestran en un plano focal diferente P2 y los núcleos de las células 58 se muestran en un plano focal diferente P3. Cuando el objetivo del microscopio se ajusta para ver las células nucleares 58 enfocadas, los núcleos de las células 54, 60 y 56 estarán desenfocados. Cuando los núcleos de las células 56 están enfocados, entonces los núcleos de las células 58 y las células 54 estarán desenfocados. En este sentido, un patólogo que utilice un microscopio manual no podrá ver enfocado todo el patrón alveolar. Los sistemas de EDF anteriores no abordan adecuadamente este problema porque llevarán todos los núcleos celulares a la superficie de manera no discriminatoria. Como tal, los núcleos situados debajo asociados con células o tejidos que pueden estar debajo del panal de abeja pueden incluirse en la imagen compuesta, lo que puede dar como resultado un artefacto en la imagen.

El sistema de la invención, por otro lado, cambia dinámicamente el plano focal para capturar el mejor plano focal para cada segmento del espécimen y, como resultado, la estructura alveolar se refleja enfocada incluso si sus células constituyentes están ubicadas en múltiples planos focales. Además, las células que no están asociadas con el panal de abeja permanecerán desenfocadas.

Por ejemplo, todavía con referencia a la figura 9, el sistema de EDF de la invención seleccionará dinámicamente P1 como el plano focal óptimo para la sección E del espécimen, seleccionará P2 como el plano focal óptimo para la sección F del espécimen, seleccionará P3 como el plano focal óptimo para la sección G del espécimen y seleccionará P1 como el plano focal óptimo para la sección H del espécimen. Además, tal como se indicó, el sistema de EDF de la invención crea una imagen compuesta que desacentúa las características ubicadas debajo del plano focal óptimo calculado. Por tanto, cuando se determina un plano focal óptimo en función de la proximidad de una serie de células superiores, las células que pueden estar directamente debajo de las células superiores permanecerán desenfocadas, preservando así la razón espacial entre las células superiores y las células inferiores. Por ejemplo, en la figura 10 se muestra una serie de células 62 con sus respectivos núcleos ocupando el plano focal P4. Se muestra una célula 64 debajo de las células 62. Sin embargo, en la realización mostrada, la distancia entre las células 62 está dentro de la distancia h y, como tal, el sistema determina que el plano focal P4 es el plano focal óptimo. Como resultado, la célula 64 subyacente permanecerá desenfocada. Significativamente, las características asociadas con la célula 64 no saldrán a la superficie.

Un ordenador que analice una imagen compuesta resultante será más preciso y sensible porque cada una de las células en el panal de abeja se presentará enfocada y las células subyacentes no provocarán artefactos en la imagen. De manera similar, en lugar de analizar las células y el grupo de células de manera aislada, la imagen compuesta proporciona al patólogo una vista gestáltica del panal de abeja. Esto permite al patólogo analizar células y grupos de células en el contexto de otras células y grupos de células.

La figura 11 es una imagen compuesta de un espécimen de tejido obtenido sin el sistema de EDF mejorado. Tal como puede observarse, grandes porciones de la imagen están difuminadas y desenfocadas. En particular, no puede observarse la estructura alveolar en su conjunto.

La figura 12 es una imagen compuesta de un espécimen de tejido obtenido usando el sistema de EDF mejorado de la presente invención. En esta imagen, la estructura alveolar está enfocada. Como tal, el panal de abeja puede observarse y analizarse más fácilmente por parte de un patólogo.

Significativamente, dado que el sistema de EDF mejorado genera imágenes de todo el panal de abeja, un sistema informático puede realizar un análisis morfológico para identificar anomalías en la muestra. Por ejemplo, se ha encontrado que los núcleos celulares pueden distinguirse del citoplasma. Una vez que se han aislado los núcleos, puede medirse la distancia entre los núcleos (la distancia h). Luego, el sistema informático puede evaluar si el panal de abeja es normal o anómalo, por ejemplo, calculando la media y la desviación estándar de las distancias h con respecto a los vecinos más cercanos de un núcleo, y luego calculando la proporción de núcleos con distancias h fuera del intervalo encontrado en tejido regular hexagonal no displásico. Además, la disposición hexagonal puede visualizarse y evaluarse con el plano focal al nivel de los límites celulares en lugar de al nivel de los núcleos, donde la imagen adquiere un aspecto hexagonal regular de “escamas de pescado”, sin núcleos distintos, tal como se muestra en la figura 11.

Filtro guiado

Es ventajoso preservar los bordes de los tejidos y las estructuras celulares presentes en el espécimen. Sin embargo, las técnicas de promediado convencionales u otras técnicas de suavizado no discriminatorias son incapaces de distinguir los bordes. Por tanto, en las realizaciones de la invención se utiliza un filtro guiado novedoso para realizar un suavizado preciso que preserva los bordes sin desplazar la ubicación xy de los contornos pronunciados en la matriz de índice z, que son especialmente agudos con especímenes gruesos. Con cualquier objetivo que use una lente de aumento, el aumento cambia a medida que se aleja del plano focal. En cada movimiento en z, el objeto de la imagen se reduce, lo que hace que los bordes falsos se muevan por consiguiente. Usando un filtro guiado, se acentúa dónde está el borde verdadero, anulando así el efecto del borde falso. El filtro guiado puede aplicarse en imágenes en escala de grises o en color. El uso novedoso del filtro guiado en esta aplicación suaviza la matriz de índice z, que contiene la ubicación z de los píxeles más nítidos. Esto elimina dinámicamente el ruido del índice z y es preferible a otras técnicas de suavizado.

Algoritmo de dilatación XYZ

Un posible efecto no deseado de obtener múltiples imágenes desde diversas distancias focales es la aparición de bordes de artefactos que pueden surgir con cada punto focal. Es decir, con la adquisición de cada corte de imagen de EDF, los píxeles desenfocados adyacentes al borde verdadero pueden presentarse como un borde “falso”. Cuando se genera una sucesión de tales bordes de artefactos, pueden tomar el aspecto de una escalera (es decir, un efecto de escalera). Por ejemplo, la figura 13 (imagen de “ANTES”) muestra una serie de bordes 66 de artefactos que forman una presentación similar a una escalera en una imagen compuesta. Esto puede distorsionar la muestra y oscurecer las características celulares o tisulares útiles importantes para el diagnóstico.

En realizaciones de la invención, este problema de escalonamiento se aborda mediante un algoritmo de procesamiento posterior de índice z que está diseñado para eliminar los bordes de artefactos en escalera provocados por la selección de píxeles desenfocados cuando se realizan los pasos del algoritmo de EDF tal como se describieron. Esto se logra suprimiendo múltiples bordes adyacentes y preservando sólo el borde más intenso. En una realización de la invención, esto se logra realizando la dilatación con “arrastre” de los valores z. Con este fin, el sistema está configurado para determinar un borde y ejecutar una rutina o un algoritmo que coloca la intensidad del borde en los 8 bits superiores de una imagen de 16 bits y el índice z del mejor enfoque en los 8 bits inferiores. Durante la dilatación (por ejemplo, dilatación 12x12), los valores z en los 8 bits inferiores se llevan junto con el contraste de borde correspondiente en los 8 bits superiores, como efecto secundario del algoritmo de dilatación. Como resultado, los bordes adyacentes más débiles con índices z erróneos se reemplazan por los bordes más intensos con mejores índices z. A continuación, se actualiza la imagen de índice z de mejor enfoque usando los 8 bits inferiores de la imagen dilatada.

Por tanto, la figura 13 (imagen de “ANTES”) muestra una imagen compuesta que se procesó con un sistema de EDF que no incluía la característica de “arrastre” tal como se describió. Tal como se muestra, varios bordes falsos 66 están presentes en el borde del tejido. En la imagen de “DESPUÉS”, por otro lado, se muestra el mismo espécimen después de haber sido procesado usando el algoritmo de “arrastre” tal como se describió. Tal como se muestra, los artefactos de escalera se han eliminado y está presente un borde verdadero nítido 68.

Eliminación de neblina

Las imágenes de microscopio incluyen normalmente neblina provocada por luz dispersada no enfocada. La eliminación de neblina puede realizarse estimando la neblina de la imagen y restando la neblina de las imágenes originales para producir imágenes más claras en las que la información de diagnóstico sea más visible. En una realización, el sistema estima la neblina erosionando una imagen R, G, B con un núcleo plano de 5x5 aproximadamente circular, tomando el valor mínimo de la erosión, realizando un filtrado de imagen guiado para suavizar la neblina y recortando el contraste de la neblina eliminado hasta un valor máximo de 32 niveles de gris (en una escala de 256).

Interpolación Z

En el sistema de EDF descrito, puede haber un gran salto en los valores de índice z de un nivel de enfoque al siguiente, cuando en realidad, el nivel de enfoque cambia suavemente. Tal discrepancia puede dar como resultado artefactos de imagen. Para abordar este problema, el sistema de EDF puede configurarse para realizar una rutina de interpolación Z de procesamiento posterior para eliminar tales artefactos. En esta realización, el sistema determina el tamaño del paso de enfoque del microscopio, que puede ser tan grande como la profundidad de campo del microscopio, por ejemplo, hasta 4 micrómetros para una lente de objetivo de 20x. El algoritmo de interpolación Z amplía la matriz de índice z para aumentar el contraste antes de realizar el filtrado guiado de la matriz de índice z. Esto produce índices z suavizados. Luego, el algoritmo interpola la intensidad de la imagen usando los dos mejores niveles de enfoque vecinos, logrando así una imagen uniforme.

Tal como se comentó anteriormente, tanto en los sistemas de EDF telecéntricos como en los no telecéntricos, un solo borde puede aparecer como múltiples bordes en la imagen de EDF compuesta. Se ha encontrado que este problema puede abordarse mediante uno o más de los pasos de procesamiento anteriores. En realizaciones alternativas, el orden de los pasos puede alterarse, por ejemplo, aplicando la dilatación XYZ antes del filtrado guiado.

Si bien esta invención se ha descrito junto con las realizaciones destacadas anteriormente, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Por consiguiente, se pretende que las realizaciones a modo de ejemplo de la invención, tal como se expuso anteriormente, sean ilustrativas, no limitativas.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un sistema (100) para generar una imagen digital compuesta de una muestra biológica que comprende:

un aparato informático (44) configurado para generar una imagen compuesta de la muestra biológica a partir de una pluralidad de imágenes de la muestra biológica, cada una de la pluralidad de imágenes tomada a lo largo de un único eje, en el que el ordenador:

(a) identifica un primer plano focal, en el que el primer plano focal comprende una primera distancia z, para una primera colección de objetos de imagen en una primera ubicación x-y de la muestra biológica, y

(b) identifica un segundo plano focal, en el que el segundo plano focal comprende una segunda distancia z, para una segunda colección de objetos de imagen en una segunda ubicación x-y de la muestra biológica, y (c) identifica un primer plano focal óptimo y un segundo plano focal óptimo basándose en (a) y (b) respectivamente, y

(d) combina objetos de imagen del primer plano focal óptimo y objetos de imagen del segundo plano focal óptimo y genera la imagen digital compuesta, en el que el aparato informático (44) calcula un valor de nitidez para los objetos de imagen en el primer plano focal y calcula un valor de nitidez para los objetos de imagen en el segundo plano focal y genera un mapa bidimensional de un índice z de los objetos que tienen los valores de nitidez más altos, y

en el que el aparato informático (44) identifica un primer plano focal óptimo y un segundo plano focal óptimo para la primera y segunda colección de objetos de imagen realizando una serie de dilataciones seguidas de una misma cantidad de erosiones en el mapa bidimensional del índice z de los objetos de imagen que tienen los valores de nitidez más altos en los planos focales primero y segundo en el que el número de dilataciones y erosiones es proporcional a la distancia entre los objetos celulares de interés en el tejido sano, para así identificar un primer y un segundo plano focal óptimo, y en el que los objetos de imagen ubicados en el primer plano focal óptimo se presentan enfocados y los objetos de imagen debajo del primer plano focal óptimo se desacentúan, y en el que los objetos de imagen ubicados en el segundo plano focal óptimo se presentan enfocados y los objetos de imagen debajo del segundo plano focal óptimo se desacentúan.

2. El sistema según la reivindicación 1, en el que una o más de las imágenes de la pluralidad de imágenes son imágenes en color y el aparato informático (44) convierte una o más imágenes en color de la pluralidad de imágenes a escala de grises antes de identificar el plano focal óptimo para la pluralidad de imágenes.

3. El sistema según la reivindicación 1, en el que la imagen compuesta incluye una estructura alveolar de la muestra biológica.

4. El sistema según la reivindicación 3, en el que la estructura alveolar está sustancialmente enfocada.

5. El sistema según la reivindicación 1, que comprende además un microscopio y una cámara.

6. El sistema según la reivindicación 5, que comprende además una platina de microscopio.

7. El sistema según la reivindicación 1, en el que los objetos celulares de interés son estructuras celulares.

8. El sistema según la reivindicación 1, en el que los objetos celulares de interés son núcleos celulares.

9. El sistema según la reivindicación 1, en el que los objetos celulares de interés son bolsas de moco citoplásmico en células caliciformes.