ES2947987A1 - METHOD AND KIT FOR THE QUANTITATIVE ASSESSMENT OF TELOMERASE ACTIVITY (Machine-translation by Google Translate, not legally binding) - Google Patents
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Abstract
Description
DESCRIPCIÓNDESCRIPTION
MÉTODO Y KIT PARA LA VALORACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD DE METHOD AND KIT FOR THE QUANTITATIVE VALUATION OF THE ACTIVITY OF
TELOMERASATELOMERASE
SECTOR DE LA TÉCNICATECHNIQUE SECTOR
La invención se encuadra en el sector de la detección y análisis de la actividad enzimática, en concreto de la determinación cuantitativa de la actividad telomerasa sin utilizar la técnica de la PCR.The invention falls within the sector of the detection and analysis of enzymatic activity, specifically the quantitative determination of telomerase activity without using the PCR technique.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓNBACKGROUND OF THE INVENTION
La telomerasa es una enzima que presenta gran importancia en medicina ya que la pérdida de su actividad está asociada a la senescencia celular, afectando con ello la capacidad replicativa, y el acortamiento de los telómeros. Además, sirve para detectar distintos tipos de cáncer, de ahí el interés por encontrar un método cuantitativo de valoración que permita detectar su actividad enzimática con facilidad.Telomerase is an enzyme that is of great importance in medicine since the loss of its activity is associated with cellular senescence, thereby affecting the replicative capacity, and the shortening of telomeres. Furthermore, it is used to detect different types of cancer, hence the interest in finding a quantitative assessment method that allows its enzymatic activity to be easily detected.
La función de la telomerasa consiste en el alargamiento de los extremos de la cadena monocatenaria de los telómeros por adición de la secuencia TTAGGG de nucleótidos.The function of telomerase consists of elongating the ends of the single-stranded chain of telomeres by adding the TTAGGG nucleotide sequence.
La estructura del ADN telomérico (ADNt) consta de una porción bicatenaria formada por las hebras G y C y una estructura monocatenaria formada por la hebra G, además de un conjunto de proteínas con las que forman el complejo multiproteico especializado denominado shelterina/telosoma.The structure of telomeric DNA (tDNA) consists of a double-stranded portion formed by the G and C strands and a single-stranded structure formed by the G strand, in addition to a set of proteins with which they form the specialized multiprotein complex called shelterin/telosome.
La actividad telomerásica es un marcador de la capacidad de proliferación de las células que se manifiesta en órganos reproductivos, en tejidos embrionarios y en células tumorales.Telomerase activity is a marker of the proliferation capacity of cells that manifests itself in reproductive organs, embryonic tissues and tumor cells.
Existen varios métodos para valorar esta enzima, la mayoría de ellos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con distintas modificaciones.There are several methods to assess this enzyme, most of them based on the polymerase chain reaction (PCR) with different modifications.
Los métodos más comunes son los TRAP (protocolos de amplificación repetida telomérica) descritos por Kim (Kim, NW. et al. (1994). Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cáncer, Science 266(5193): 2011-2015) y Piatyszek (Piatyszek, MA. et al. (1995). Detection of telomerase activity in human cells and tumors by a telomeric repeat amplification protocol (TRAP). Methods in Cell Science 17: 1-15) basados en la técnica de PCR. El método TRAP permite detectar la presencia de actividad de telomerasa en extractos celulares utilizando cebadores de regiones teloméricas. El protocolo incluye la incubación de los extractos con un cebador con secuencias similares a las de los telómeros, desoxirribonucleótidos trifosfato (d-NTPs) de adenina, timina, guanina y citosina, T4 gene 32 protein, Taq ADN-polimerasa termoestable, y [a -32P] d-CTP y [a -32P] d-TTP. Posteriormente, se somete la reacción a una amplificación por PCR mediante la adición de un segundo cebador y la aplicación de ciclos con alternancia de temperaturas. El resultado de la PCR se somete a electroforesis en gel de agarosa y los telómeros se detectan por tinción del gel.The most common methods are TRAP (repeat amplification protocols). telomeric) described by Kim (Kim, NW. et al. (1994). Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer, Science 266(5193): 2011-2015) and Piatyszek (Piatyszek, MA. et al. ( 1995). Detection of telomerase activity in human cells and tumors by a telomeric repeat amplification protocol (TRAP). Methods in Cell Science 17: 1-15) based on the PCR technique. The TRAP method allows detecting the presence of telomerase activity in cell extracts using primers from telomeric regions. The protocol includes incubation of the extracts with a primer with sequences similar to those of telomeres, deoxyribonucleotide triphosphates (d-NTPs) of adenine, thymine, guanine and cytosine, T4 gene 32 protein, thermostable Taq DNA polymerase, and [a -32P] d-CTP and [a -32P] d-TTP. Subsequently, the reaction is subjected to PCR amplification by adding a second primer and applying cycles with alternating temperatures. The PCR result is subjected to agarose gel electrophoresis and telomeres are detected by gel staining.
Sobre este método se han descrito modificaciones como la de Taga S. et al. ((1999) Pronostic Impact of Telomerase Activity in Non-Small Cell Lung Cancers. Annals of Surgery 230(5): 715-720)) que utilizan el mismo cebador directo pero distinto cebador inverso y alguno de los nucleótidos marcado con fósforo 32 (32P). Posteriormente, someten el producto de la PCR a electroforesis en gel del 10% de poliacrilamida e identifican los telómeros por autorradiografía considerando, como telomerasa activa, la que presenta en la electroforesis una banda de ADN de 6 bp.Modifications of this method have been described such as that of Taga S. et al. ((1999) Prognostic Impact of Telomerase Activity in Non-Small Cell Lung Cancers. Annals of Surgery 230(5): 715-720)) that use the same forward primer but a different reverse primer and some of the nucleotides labeled with phosphorus 32 ( 32P). Subsequently, they subject the PCR product to electrophoresis in a 10% polyacrylamide gel and identify the telomeres by autoradiography, considering, as active telomerase, the one that presents a 6 bp DNA band in the electrophoresis.
Gelmini S. et al. ((1998). Rapid, quantitative nonisotopic assay for telomerase activity in human tumors. Clin. Chem. 44 (10) 2133-2138)) emplean la misma técnica que Taga S. et al., pero sin utilizar d-NTPs radiactivos ni electroforesis. Estos autores utilizan un blanco obtenido tras someter el extracto con RNasa para eliminar la telomerasa, con lo cual se inactiva, y un extracto sin desnaturalizar la enzima. Después someten la reacción a una PCR. A continuación, toman una cantidad del producto de la reacción, tanto del blanco como del problema, y lo diluyen con un tampón adecuado que contiene Pico Green, un colorante fluorescente cuando se une al ADN. La fluorescencia se mide a 480 nm de excitación y 520 nm de emisión, en el blanco y en el problema. La actividad de la enzima se calcula restando las unidades arbitrarias de fluorescencia (UAF) del problema y las del blanco y la cantidad de ADN se obtienen utilizando una curva patrón de ADN entre 0-100 μg/L. Gelmini S. et al. ((1998). Rapid, quantitative nonisotopic assay for telomerase activity in human tumors. Clin. Chem. 44 (10) 2133-2138)) use the same technique as Taga S. et al., but without using radioactive d-NTPs or electrophoresis. These authors use a blank obtained after subjecting the extract to RNase to eliminate telomerase, thereby inactivating it, and an extract without denaturing the enzyme. They then subject the reaction to PCR. Next, they take a quantity of the reaction product, both blank and test, and dilute it with an appropriate buffer containing Pico Green, a dye that fluoresces when bound to DNA. Fluorescence is measured at 480 nm excitation and 520 nm emission, in the blank and in the problem. The enzyme activity is calculated by subtracting the arbitrary fluorescence units (AFU) of the problem and those of the blank and the amount of DNA is obtained using a DNA standard curve between 0-100 μg/L.
Gollahona LS. y Holt SE. ((2000). Alternative methods of extracting telomerase activity from human tumor samples. Cancer Lett. 159(2): 141-149), para confirmar que la amplificación de la PCR se produce sobre el sustrato añadido para valorar la telomerasa, hacen una serie de reacciones previas consistentes en recuperar dicho producto mediante un método magnético, siendo este producto el que someten a PCR y luego a electroforesis y exposición a fosfoimagen.Gollahona LS. and Holt SE. ((2000). Alternative methods of extracting telomerase activity from human tumor samples. Cancer Lett. 159(2): 141-149), to confirm that PCR amplification occurs on the substrate added to assess telomerase, they make a series of previous reactions consisting of recovering said product using a magnetic method, this product being the one that is subjected to PCR and then to electrophoresis and exposure to phosphoimaging.
Casi todos los métodos conocidos necesitan de un paso de PCR, incluido el método realizado a través del Kit denominado TeloTAGGG™ Telomerase PCR ELISAPLUS, que es el más utilizado en la actualidad.Almost all known methods require a PCR step, including the method performed through the Kit called TeloTAGGG™ Telomerase PCR ELISAPLUS, which is the most used today.
La solicitud de patente WO0063429A2 se refiere a cebadores y sondas para amplificar y detectar el ARNm de la subunidad de la telomerasa catalíticamente activa humana (hTC). Aplicando técnicas de amplificación por PCR, hibridación in situ y mareaje de la proteína hTC específica, se detecta la presencia de telomerasa. Aunque se indica que la detección se puede realizar sin amplificar por PCR, el documento no recoge ejemplos que no requieran amplificación.Patent application WO0063429A2 relates to primers and probes for amplifying and detecting the mRNA of the human catalytically active telomerase (hTC) subunit. By applying PCR amplification techniques, in situ hybridization and labeling of the specific hTC protein, the presence of telomerase is detected. Although it is indicated that the detection can be carried out without amplification by PCR, the document does not include examples that do not require amplification.
El documento W02011106671A1 se refiere a un método para medir la actividad telomerasa, que comprende aislar la enzima telomerasa sobre un soporte sólido (por ejemplo, una placa de Petri) con un anticuerpo (Ac) antitelomerasa y medir el nivel de actividad de la enzima unida al soporte. El método comprende: un cebador adecuado como sustrato de la telomerasa, el complejo enzimático de la telomerasa activo y unido al soporte sólido mediante el Ac y d-NTPs marcados con fluorescencia o radioactividad, con los que realizar una reacción de extensión y detectar el producto de la extensión. La inmovilización de la enzima permite exponer la unidad catalítica al sustrato y facilita la reacción. La invención también incluye el método con PCR, que es el modo preferido para llevarla a cabo, como se puede comprobar en los ejemplos, para ello necesitan un segundo cebador con una secuencia adecuada y la presencia de ADN-polimerasa.Document W02011106671A1 relates to a method for measuring telomerase activity, which comprises isolating the telomerase enzyme on a solid support (for example, a Petri dish) with an anti-telomerase antibody (Ac) and measuring the level of activity of the bound enzyme to support. The method comprises: a suitable primer as a substrate for telomerase, the telomerase enzyme complex active and linked to the solid support by Ac and d-NTPs labeled with fluorescence or radioactivity, with which to carry out an extension reaction and detect the product of the extension. Immobilization of the enzyme allows the catalytic unit to be exposed to the substrate and facilitates the reaction. The invention also includes the PCR method, which is the preferred way to carry it out, as can be seen in the examples, for this they need a second primer with a suitable sequence and the presence of DNA polymerase.
En el estado de la técnica hay algunos casos en los que sí se prescinde de la PCR. La solicitud de patente JP2012205568A describe un método en el que se combinan la reacción de la telomerasa y la reacción de degradación del ARN mediante ARNasa H. El método se basa en incubar el extracto que contiene la telomerasa que se quiere medir con un sustrato que consiste en un cebador con una secuencia adecuada, un ADN telomérico y d-NTPs de manera que la telomerasa expanda el sustrato. Para medir la extensión del sustrato adicionan ARNasa y un ARN marcado con una sustancia fluorescente y con una secuencia complementaria a la del ADN. El producto de la reacción se mide por fluorescencia.In the state of the art there are some cases in which PCR is dispensed with. The patent application JP2012205568A describes a method in which the telomerase reaction and the RNA degradation reaction using RNase H are combined. The method is based on incubating the extract containing the desired telomerase. measured with a substrate consisting of a primer with a suitable sequence, a telomeric DNA and d-NTPs so that telomerase expands the substrate. To measure the extension of the substrate, they add RNase and an RNA labeled with a fluorescent substance and with a sequence complementary to that of the DNA. The reaction product is measured by fluorescence.
US2005244907A1 describe un método para detectar la actividad de una enzima que se basa en incluir en liposomas sustratos capaces de producir una señal luminosa detectable; entre las enzimas cuya actividad se puede detectar, se incluye la telomerasa.US2005244907A1 describes a method to detect the activity of an enzyme that is based on including substrates in liposomes capable of producing a detectable light signal; Enzymes whose activity can be detected include telomerase.
En US2008153085A1 se describe un método de determinación de un analito en una muestra, entre ellos la telomerasa, basado en el uso de nanopartículas semiconductoras mediante la formación de sistemas híbridos que contienen agentes que reconocen, bien por inmovilización o por reacción, la cadena monocatenaria del ADN. En el caso de la telomerasa, las nanopartículas contienen un cebador. Cuando la telomerasa está presente en el extracto problema, y tras la adición de d-NTPs, el sustrato comienza a alargarse y el espectro cambia sus características, lo cual permite medir las concentraciones del producto de la reacción. La detección se basa en FRET (transferencia de energía mediante resonancia de fluorescencia) mediante la irradiación electromagnética del sistema para provocar la transferencia de energía de resonancia de las nanopartículas al aceptor, detectando así la señal.US2008153085A1 describes a method for determining an analyte in a sample, including telomerase, based on the use of semiconductor nanoparticles through the formation of hybrid systems that contain agents that recognize, either by immobilization or by reaction, the single-chain chain of the DNA. In the case of telomerase, the nanoparticles contain a primer. When telomerase is present in the test extract, and after the addition of d-NTPs, the substrate begins to elongate and the spectrum changes its characteristics, which allows measuring the concentrations of the reaction product. The detection is based on FRET (fluorescence resonance energy transfer) by electromagnetic irradiation of the system to cause the transfer of resonance energy from the nanoparticles to the acceptor, thus detecting the signal.
En US2010105048A1 se describe un método y una composición para detectar telomerasa en una muestra, en el que se utilizan nanocristales fluorescentes sin necesidad de realizar PCR. Los nanocristales tienen una alta intensidad de fluorescencia, son solubles en agua, tienen estabilidad física y química y tienen espectros que cambian según se una a su superficie uno u otro grupo funcional. En el caso de la telomerasa, el grupo con mareaje fluorescente son los d-NTPs, al menos uno, y la intensidad del espectro depende del número de grupos funcionales que se unan al sustrato.US2010105048A1 describes a method and a composition to detect telomerase in a sample, in which fluorescent nanocrystals are used without the need to perform PCR. Nanocrystals have a high fluorescence intensity, are soluble in water, have physical and chemical stability and have spectra that change depending on whether one or another functional group is attached to their surface. In the case of telomerase, the group with fluorescent labeling is the d-NTPs, at least one, and the intensity of the spectrum depends on the number of functional groups that bind to the substrate.
El interés por detectar la actividad telomerasa radica en su posible aplicación tanto en investigación básica como en investigación clínica. Los telómeros podrían mantener su longitud durante la división celular mediante la telomerasa, que está formada por proteínas y ARN. Esta enzima alargaría la hebra G del telómero y la DNA-polimerasa completaría la formación del ADNt alargando la hebra C, lo cual conduciría a mantener la longitud permitiendo que las células se pudieran dividir eternamente, evitando la senescencia, pero también permitiría que las células defectuosas o malignas viviesen eternamente propiciando deformaciones o cáncer. Esto significa que la actividad de la telomerasa debe estar altamente regulada. Por lo tanto, disponer de un método lo suficientemente adecuado, preciso, rápido y barato para medir la enzima podría servir para controlarla eficazmente.The interest in detecting telomerase activity lies in its possible application in both basic research and clinical research. Telomeres could maintain their length during cell division by telomerase, which is made up of proteins and RNA. This enzyme would lengthen the G strand of the telomere and DNA polymerase would complete the formation of tDNA by lengthening the C strand, which would lead to maintaining the length allowing cells to divide eternally, avoiding senescence, but would also allow defective cells to or malignant ones lived eternally, causing deformations or cancer. This means that telomerase activity must be highly regulated. Therefore, having a sufficiently suitable, precise, fast and cheap method to measure the enzyme could serve to control it effectively.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓNEXPLANATION OF THE INVENTION
Método y kit para la valoración cuantitativa de la actividad de telomerasa.Method and kit for the quantitative assessment of telomerase activity.
Para simplificar los procedimientos de valoración de la actividad telomerasa utilizados hasta ahora en el estado de la técnica, se ha desarrollado un método que no requiere ni la amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o de la ligasa (LCR) ni la utilización de recursos complejos y/o económicamente costosos.To simplify the procedures for assessing telomerase activity used until now in the state of the art, a method has been developed that does not require amplification by polymerase chain reaction (PCR) or ligase chain reaction (LCR) or use of complex and/or economically expensive resources.
Un aspecto de la presente invención se refiere a un método para la valoración cuantitativa de la actividad de telomerasa que incluye los siguientes pasos:One aspect of the present invention relates to a method for the quantitative assessment of telomerase activity that includes the following steps:
a) obtener extractos de las células que se quiere estudiar;a) obtain extracts of the cells you want to study;
b) desnaturalizar las proteínas de una parte alícuota del extracto obtenido en el paso a), que será usada como blanco;b) denature the proteins of an aliquot part of the extract obtained in step a), which will be used as a blank;
c) mezclar el extracto del paso a) con un tampón adecuado para que tenga lugar la reacción de telomerasa, el primer TS sustrato externo: 5'-TTAGGG TTAGGG TTAGGG-3’ (SEQ ID NO: 1) y el primer CX cebador: 5'-AATCCC AATCCC AATCCC-3’ (SEQ ID NO: 2), ADN polimerasa, MgCh, d-NTPs y un agente intercalante específico de ADN bicatenario;c) mix the extract from step a) with a suitable buffer for the telomerase reaction to take place, the first TS external substrate: 5'-TTAGGG TTAGGG TTAGGG-3' (SEQ ID NO: 1) and the first CX primer: 5'-AATCCC AATCCC AATCCC-3' (SEQ ID NO: 2), DNA polymerase, MgCh, d-NTPs and a double-stranded DNA-specific intercalating agent;
d) mezclar, por otro lado, la parte alícuota del extracto cuyas proteínas se han desnaturalizado en el paso b) con los mismos ingredientes que se añaden al extracto en el paso c);d) mix, on the other hand, the aliquot part of the extract whose proteins have been denatured in step b) with the same ingredients that are added to the extract in step c);
e) medir la fluorescencia que produce el agente intercalante incorporado al ADN bicatenario del paso c) y del paso d) en el tiempo cero (T=0) y a los 30 minutos (T=30) de iniciada la reacción;e) measure the fluorescence produced by the intercalating agent incorporated into the double-stranded DNA of step c) and step d) at time zero (T=0) and 30 minutes (T=30) after the reaction starts;
f) calcular la diferencia entre los valores de fluorescencia en T=30 y T=0 del extracto a analizar (paso c) y del blanco (paso d) en el que la ADN polimerasa no tiene por qué ser termoestable puesto que no es necesario aplicar altas temperaturas dado que para la valoración cuantitativa de la actividad telomerasa por este método no se requiere.f) calculate the difference between the fluorescence values at T=30 and T=0 of the extract analyze (step c) and the blank (step d) in which the DNA polymerase does not have to be thermostable since it is not necessary to apply high temperatures since it is not required for the quantitative assessment of telomerase activity by this method.
Las células de las que se obtiene el extracto del paso a) pueden pertenecer a cultivos celulares, tejidos u órganos que interese estudiar. Por otro lado, la desnaturalización de las proteínas se puede realizar mediante cualquier procedimiento, como pueden ser la aplicación de calor o la incubación del extracto con RNAsa en condiciones tales (por ejemplo, 20 minutos a temperatura ambiente) que se desnaturalice la telomerasa y todas las enzimas que posean ARN para ser activas.The cells from which the extract in step a) is obtained may belong to cell cultures, tissues or organs that are of interest to study. On the other hand, the denaturation of proteins can be carried out by any procedure, such as the application of heat or the incubation of the extract with RNase under conditions such (for example, 20 minutes at room temperature) that telomerase is denatured and all enzymes that have RNA to be active.
En esta memoria descriptiva, por blanco se entiende la parte de la muestra que no contiene el analito de interés (es decir, la telomerasa) pero que sí contiene todos los reactivos que se utilizan en el método para la valoración cuantitativa de la actividad telomerasa que se describe aquí y que, además, se somete a las mismas condiciones y al mismo procedimiento que los extractos que se quieren estudiar. Así mismo, en esta memoria descriptiva, por ADN polimerasas termoestables se entienden las ADN polimerasas que no se alteran fácilmente por la acción del calor, es decir, que no se alteran fácilmente ni por estar sometidas a temperaturas elevadas ni por estar sometidas a cambios frecuentes de temperatura. Por lo tanto, las ADN polimerasas que no requieren ser termoestables incluyen aquellas ADN polimerasas que pueden dejar de ser funcionales a altas temperaturas o bien funcionar idealmente de forma isotérmica, esto es, a temperatura constante.In this specification, blank means the part of the sample that does not contain the analyte of interest (i.e., telomerase) but does contain all the reagents used in the method for the quantitative assessment of telomerase activity that is described here and, in addition, is subject to the same conditions and the same procedure as the extracts that you want to study. Likewise, in this specification, thermostable DNA polymerases are understood to mean DNA polymerases that are not easily altered by the action of heat, that is, they are not easily altered either by being subjected to high temperatures or by being subjected to frequent changes. Of temperature. Therefore, DNA polymerases that do not need to be thermostable include those DNA polymerases that may cease to be functional at high temperatures or ideally function isothermally, that is, at a constant temperature.
El tampón del paso c) y del paso d) tiene, preferentemente, un pH igual a 8,3 y la reacción se realiza a una temperatura entre 25 y 350C, preferentemente, a 300C.The buffer of step c) and step d) preferably has a pH equal to 8.3 and the reaction is carried out at a temperature between 25 and 350C, preferably at 300C.
El agente intercalante específico de ADN bicatenario se puede seleccionar entre varios fluoróforos y, entre ellos, preferentemente, se selecciona SYBR-Green.The double-stranded DNA-specific intercalating agent can be selected from various fluorophores, and among them, SYBR-Green is preferably selected.
Por otro lado, la fluorescencia que produce el agente intercalante incorporado al ADN formado por la acción de la telomerasa durante la incubación puede medirse a distintos intervalos de tiempo, por ejemplo, cada 15 minutos durante 90 minutos. Con esto se consigue comprobar el buen funcionamiento de la enzima telomerasa. La medición de la actividad de telomerasa se puede realizar directamente con un espectrofluorímetro. On the other hand, the fluorescence produced by the intercalating agent incorporated into the DNA formed by the action of telomerase during incubation can be measured at different time intervals, for example, every 15 minutes for 90 minutes. With this, it is possible to verify the proper functioning of the telomerase enzyme. Measurement of telomerase activity can be performed directly with a spectrofluorimeter.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para valorar la actividad telomerasa de una muestra que incluye los primers definidos por SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 2.Another aspect of the invention refers to a kit for assessing the telomerase activity of a sample that includes the primers defined by SEQ ID NO:1 and SEQ ID NO: 2.
El kit también puede incluir ADN polimerasa, MgCL, d-NTPs y/o un colorante intercalante específico de ADN bicatenario. El colorante, preferentemente es un colorante fluorogénico y, más preferentemente, es SYBR-Green I. Por otro lado, la ADN polimerasa puede no ser termoestable, puesto que no va a tener que soportar temperaturas elevadas ni cambios cíclicos de temperatura.The kit may also include DNA polymerase, MgCL, d-NTPs and/or a double-stranded DNA-specific intercalating dye. The dye is preferably a fluorogenic dye and, more preferably, is SYBR-Green I. On the other hand, the DNA polymerase may not be thermostable, since it will not have to withstand elevated temperatures or cyclic temperature changes.
La invención también se refiere al uso del método y/o del kit descritos más arriba para estudiar la capacidad de proliferación de las células, para identificar fármacos y/o moléculas capaces de actuar como activadores o inhibidores de la actividad telomerásica, para estudiar terapias regenerativas frente al infarto de miocardio, identificar la proliferación tumoral asociada al cáncer, detectar el estado de malignidad de diferentes tipos de cáncer, detectar el grado de proliferación de células madre o estudiar la posibilidad del alargamiento de la vida.The invention also relates to the use of the method and/or kit described above to study the proliferation capacity of cells, to identify drugs and/or molecules capable of acting as activators or inhibitors of telomerase activity, to study regenerative therapies. against myocardial infarction, identify tumor proliferation associated with cancer, detect the malignancy status of different types of cancer, detect the degree of proliferation of stem cells or study the possibility of extending life.
Los ejemplos presentados en esta memoria avalan que el presente método de valoración de telomerasa es eficaz, sencillo, reproducible, y rápido.The examples presented in this report support that the present telomerase assessment method is effective, simple, reproducible, and fast.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOSBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, se acompaña como parte integrante de dicha descripción un juego de gráficas en dónde, con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:To complement the description that is being made and in order to help a better understanding of the characteristics of the invention, a set of graphs is attached as an integral part of said description in which, with an illustrative and non-limiting nature, the following has been represented. following:
Figura 1. Valoración de la presencia de ADN en extractos de hígado de rata. Figure 1. Assessment of the presence of DNA in rat liver extracts.
Figura 2. Efecto del tiempo sobre la actividad de telomerasa en hígado de rata. Figure 2. Effect of time on telomerase activity in rat liver.
Figura 3. Efecto de la concentración de extracto sobre la valoración de telomerasa en hígado de rata. Figure 3. Effect of extract concentration on telomerase titer in rat liver.
REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓNPREFERRED EMBODIMENT OF THE INVENTION
La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos, que no pretenden ser limitativos de su alcance.The present invention is illustrated by the following examples, which are not intended to be limiting of its scope.
Reactivos utilizados en los siguientes ejemplos:Reagents used in the following examples:
- Tampón de extracción de los tejidos (Tampón de lisis):- Tissue extraction buffer (lysis buffer):
10 mM de tampón Tris-HCl10 mM Tris-HCl buffer
1 mM MgCl21mM MgCl2
1 mM EGTA1mM EGTA
5 mM ditiotreitol5 mM dithiothreitol
0,1 mM de inhibidorde proteasas (Aprotinina) (Therm oFisher Scientific, MA, EEUU)0.1 mM protease inhibitor (Aprotinin) (Therm oFisher Scientific, MA, USA)
0,5 % Tritón X-1000.5% Triton X-100
Ajustar el tampón apH = 7,5Set the buffer to pH = 7.5
- Tampón para medida de telomerasa (10X):- Telomerase measurement buffer (10X):
El tampón concentrado 10veces se preparó con:The 10-fold concentrated buffer was prepared with:
- 200 mM Tris-HCl- 200mM Tris-HCl
- 15 mM MgCh- 15mM MgCh
- 630 mM KCI- 630mM KCI
- 10 mM EGTA- 10mM EGTA
Ajustar el pH a 8,3Adjust the pH to 8.3
- Reactivo Quantimix Easv:- Quantimix Easv Reagent:
Para facilitar el trabajo, en los siguientes ejemplos se utilizó el reactivo comercial denominado Quantimix Easy (Biotools, Madrid, España) que contiene un conjunto integrado por ADN-polimerasa, los cuatro d-NTPs (adenina, citosina, guanina y timina), MgChy SYBR™ Green I como agente intercalante específico de ADN bicatenario a la concentración óptima (4 mM final). Este reactivo es de más fácil manejo que el empleo por separado de d-NTPs, ADN-polimerasa y colorante SYBR-Green I, sin embargo, los siguientes ejemplos también se pueden realizar con una ADN polimerasa termoestable o no termoestable, puesto que no se van a alcanzar temperaturas superiores a los 300C. To facilitate the work, in the following examples the commercial reagent called Quantimix Easy (Biotools, Madrid, Spain) was used, which contains a set made up of DNA polymerase, the four d-NTPs (adenine, cytosine, guanine and thymine), MgChy SYBR™ Green I as a specific intercalating agent for double-stranded DNA at the optimal concentration (4 mM final). This reagent is easier to handle than the separate use of d-NTPs, DNA polymerase and SYBR-Green I dye, however, the following examples can also be carried out with a thermostable or non-thermostable DNA polymerase, since it is not They will reach temperatures above 300C.
- Prímers (sustrato v cebador):- Primers (substrate and primer):
- PrimerTS sustrato externo: (5'-TTAGGG TTAGGG TTAGGG-3’; SEQ ID NO:1), a concentración 0,1 μM en H2O Mili Q.- PrimerTS external substrate: (5'-TTAGGG TTAGGG TTAGGG-3'; SEQ ID NO:1), at 0.1 μM concentration in H 2 O Mili Q.
- Primer CX cebador: (5'-AATCCC AATCCC AATCCC-3’; SEQ ID NO:2), a concentración 0,1 μM en H2O Mili Q.- First CX primer: (5'-AATCCC AATCCC AATCCC-3'; SEQ ID NO:2), at 0.1 μM concentration in H 2 O Mili Q.
- Colorante para identificar al DNA en el extracto- Dye to identify the DNA in the extract
- DAPI (Sigma, Darmstadt, Alemania)- DAPI (Sigma, Darmstadt, Germany)
Ejemplo 1. Preparación de extractos procedentes de tejidosExample 1. Preparation of extracts from tissues
Los órganos a ensayar, procedentes de ratas Wistar hembras (Animalario de la Facultad de Farmacia, UCM, Madrid. N0 de registro: ES280790000086) de 1 mes de edad, y de vaca, recogidos en el matadero de Madrid, se congelaron en nitrógeno líquido inmediatamente después de obtenerlos y se mantuvieron en congelador a -80ºC hasta su uso. El almacenaje de todos estos órganos se hizo en recipientes estériles.The organs to be tested, from 1-month-old female Wistar rats (Animalario de la Faculty of Pharmacy, UCM, Madrid. Registration number: ES280790000086), and cows, collected at the Madrid slaughterhouse, were frozen in liquid nitrogen. immediately after obtaining them and they were kept in a freezer at -80ºC until use. The storage of all these organs was done in sterile containers.
En el momento de su uso se siguieron los siguientes pasos:At the time of use, the following steps were followed:
- Sacar los órganos del congelador, pesarlos y dejarlos descongelar sobre hielo. - Adicionar 10 veces su peso de tampón de extracción y 5 Ul de inhibidor de RNasa por cada 500 μL de extracto, para proteger a la telomerasa.- Remove the organs from the freezer, weigh them and let them thaw on ice. - Add 10 times its weight of extraction buffer and 5 Ul of RNase inhibitor per 500 μL of extract, to protect telomerase.
- Disgregar el órgano dentro de hielo con ULTRA-TURRAX®, 3 veces, agitando cada vez durante 3 segundos.- Disintegrate the organ into ice with ULTRA-TURRAX®, 3 times, shaking each time for 3 seconds.
- Mantener 30 min sobre hielo, agitando de vez en cuando en agitador magnético. - Centrifugar el lisado a 16.000 x g durante 20 min a 4°C.- Keep for 30 min on ice, shaking occasionally on a magnetic stirrer. - Centrifuge the lysate at 16,000 x g for 20 min at 4°C.
- Recoger el sobrenadante en tubos estériles evitando contaminación con el pellet. - Mantener el sobrenadante en hielo durante su uso.- Collect the supernatant in sterile tubes avoiding contamination with the pellet. - Keep the supernatant on ice during use.
- Usar el sobrenadante para medir la telomerasa.- Use the supernatant to measure telomerase.
- Si los extractos no se usan en el momento, congelarlos rápidamente con nitrógeno líquido, y guardarlos en congelador a -80ºC hasta su uso.- If the extracts are not used at the moment, freeze them quickly with liquid nitrogen, and store them in a freezer at -80ºC until use.
- Realizar bajo condiciones estériles tanto la obtención del extracto como el almacenamiento de las muestras.- Carry out both the obtaining of the extract and the storage of the samples under sterile conditions.
- Cuantificar el contenido de proteínas presentes en el extracto por el método de Lowry (Lowry, OH et al. (1951) Protein measurement with the Folin Phenol Reagent. J. Biol. - Quantify the protein content present in the extract using the Lowry method (Lowry, OH et al. (1951) Protein measurement with the Folin Phenol Reagent. J. Biol.
Chem. 193(1): 265-275) antes de realizar la medida de la actividad de telomerasa. Chem. 193(1): 265-275) before measuring telomerase activity.
Ejemplo 1.1. Desnaturalización del extracto para su utilización como blanco Se calentó el extracto 10 min a 90ºC y se centrifugó 10 min a 15500 g para eliminar las proteínas precipitadas por el calor. Example 1.1. Denaturation of the extract for use as blank The extract was heated for 10 min at 90ºC and centrifuged for 10 min at 15,500 g to eliminate proteins precipitated by heat.
Ejemplo 2. Valoración de la telomerasaExample 2. Telomerase assessment
Se muestran dos ejemplos de las mediciones para valorar la actividad de telomerasa, uno con el extracto sin desnaturalizar y el otro con el extracto desnaturalizado.Two examples of measurements to assess telomerase activity are shown, one with the undenatured extract and the other with the denatured extract.
Ejemplo 2.1. Preparación de la reacción con el sustrato sin desnaturalizar.Example 2.1. Preparation of the reaction with the undenatured substrate.
En un volumen final de 50 μl, se mezclaron, por este orden:In a final volume of 50 μl, the following were mixed, in this order:
x μL H20 Mili-Q® estéril hasta completar 50 μL totales de reacción;x μL sterile H20 Mili-Q® until completing 50 μL total reaction;
5 μL de 10 mM tampón Tris-HCl pH = 8,3 (10X);5 μL of 10 mM Tris-HCl buffer pH = 8.3 (10X);
2 μL de primer de sustrato 0,1 μM (SEQ ID NO:1);2 μL of 0.1 μM substrate primer (SEQ ID NO:1);
2 μL de primer de cebador 0,1 μM (SEQ ID NO:2);2 μL of 0.1 μM primer primer (SEQ ID NO:2);
2 μL de Quantimix Easy;2 μL of Quantimix Easy;
x μL de extracto sin desnaturalizar obtenido según se describe en el ejemplo 1, que contenía 30-50 μg de proteína;x μL of undenatured extract obtained as described in example 1, containing 30-50 μg of protein;
Inmediatamente después de preparar la mezcla, se leyó la fluorescencia a 485 nm excitación (exc) y 550 nm emisión (emis), con una ganancia de 1000. Para ello se utilizó un espectrofluorímetro (FLUOstar Omega, BMG Labtech, Ortenberg, Alemania) Este será el tiempo cero (T=0) de la reacción.Immediately after preparing the mixture, the fluorescence was read at 485 nm excitation (exc) and 550 nm emission (emis), with a gain of 1000. For this, a spectrofluorimeter (FLUOstar Omega, BMG Labtech, Ortenberg, Germany) was used. It will be time zero (T=0) of the reaction.
Se incubó la mezcla a 30ºC y, nuevamente, se leyó la fluorescencia a 485 nm de excitación y 550 nm de emisión, con una ganancia de 1000, a los 30 minutos de la reacción (T=30).The mixture was incubated at 30ºC and, again, the fluorescence was read at 485 nm of excitation and 550 nm of emission, with a gain of 1000, 30 minutes after the reaction (T=30).
La diferencia entre la fluorescencia después del tiempo de incubación (T = 30 min) y la fluorescencia inicial (T = 0 min) es la fluorescencia debida a la actividad de la enzima en el extracto sin desnaturalizar, que se expresa en UAF/Tiempo/concentración de proteínas. The difference between the fluorescence after the incubation time (T = 30 min) and the initial fluorescence (T = 0 min) is the fluorescence due to the enzyme activity in the undenatured extract, which is expressed in UAF/Time/ protein concentration.
Ejemplo 2.2. Preparación de la reacción correspondiente al extracto desnaturalizado.Example 2.2. Preparation of the reaction corresponding to the denatured extract.
Se realizó exactamente como en el ejemplo 2.1, pero utilizando el extracto desnaturalizado, tal y como se describe en el ejemplo 1.1. T =0 ,T =30 min.It was carried out exactly as in example 2.1, but using the denatured extract, as described in example 1.1. T =0,T =30 min.
Este experimento se realizó para comprobar si la valoración de la telomerasa realizada en el ejemplo 2.1. había sido correcta o había habido algún artefacto. Si la valoración es correcta los valores de actividad con el extracto desnaturalizado deben dar tendente a cero.This experiment was carried out to check whether the telomerase assay carried out in example 2.1. had been correct or had there been some artifact. If the assessment is correct, the activity values with the denatured extract should tend towards zero.
Ejemplo 2.3. Medida de la actividad de telomerasaExample 2.3. Measurement of telomerase activity
La actividad de telomerasa se calculó midiendo la diferencia entre UAF (T=30) y UAF (T=0) del extracto a analizar (como se describe en el ejemplo 2.1) y del blanco (como se describe en el ejemplo 2.2). El resultado son las señales de fluorescencia debidas a la cantidad de ADN formado por la reacción durante 30 min. La actividad de la enzima se mide en UAF/tiempo/proteínas.Telomerase activity was calculated by measuring the difference between UAF (T=30) and UAF (T=0) of the extract to be analyzed (as described in example 2.1) and the blank (as described in example 2.2). The result is the fluorescence signals due to the amount of DNA formed by the reaction during 30 min. Enzyme activity is measured in UAF/time/protein.
En concreto, los cálculos de la actividad que se realizaron fueron:Specifically, the activity calculations that were carried out were:
- Calcular las UAF (T=30) - UAF (T=0) del problema = A (ejemplo 2.1.)- Calculate the UAF (T=30) - UAF (T=0) of the problem = A (example 2.1.)
- Calcular las UAF (T=30) - UAF (T=0) del blanco = B (ejemplo 2.2)- Calculate the UAF (T=30) - UAF (T=0) of the target = B (example 2.2)
La medida de la actividad de telomerasa se obtuvo como:The measurement of telomerase activity was obtained as:
(A-B) = UAF/Tiempo/cantidad de proteínas(A-B) = UAF/Time/amount of proteins
Ejemplo 3. Estudio de la actividad de telomerasa en diferentes tejidosExample 3. Study of telomerase activity in different tissues
Se testaron varios tejidos para la valoración de la actividad de telomerasa. Se evaluó en corazón e hígado de rata de un mes de edad, y en médula ósea de vaca. Los resultados se indican en la Tabla 1.Several tissues were tested for the assessment of telomerase activity. It was evaluated in the heart and liver of one-month-old rats, and in cow bone marrow. The results are indicated in Table 1.
Tabla 1. Actividad de telomerasa en diferentes tejidos Table 1. Telomerase activity in different tissues.
La medida se realizó con una ganancia de 1000. La actividad se expresa en UAF/ 30 min/mg de proteínas. Los resultados de estos datos son la media de dos experimentos diferentes, cada uno de ellos realizados por triplicado.The measurement was carried out with a gain of 1000. The activity is expressed in UAF/ 30 min/mg protein. The results of these data are the average of two different experiments, each performed in triplicate.
Ejemplo 4. Medida de la actividad de telom erasa en presencia y ausencia de primers Example 4. Measurement of telom erase activity in the presence and absence of primers
Para demostrar que funciona el primerTS sustrato externo (SEQ ID NO:1) utilizado en la valoración de telomerasa, se realizó la medida de la enzima telomerasa en ausencia y en presencia de los primers específicos que sirven como sustrato externo (SEQ ID NO:1) y cebador (SEQ ID NO:2). Los resultados obtenidos en hígado se indican en la Tabla 2.To demonstrate that the first external substrate TS (SEQ ID NO:1) used in the telomerase assay works, the measurement of the telomerase enzyme was carried out in the absence and in the presence of the specific primers that serve as external substrate (SEQ ID NO: 1) and primer (SEQ ID NO:2). The results obtained in liver are indicated in Table 2.
Tabla 2. Actividad de telomerasa sin los primers y con los primers en hígado de rataTable 2. Telomerase activity without the primers and with the primers in rat liver.
Se eligió utilizar el hígado por ser el tejido que presentó mayor actividad de telomerasa. Las condiciones de la medida de telomerasa fueron las mismas que las indicadas en el Ejemplo 2.1. con la diferencia de que la falta de primers fue sustituida por H20 MiliQ estéril. La cantidad de extracto utilizada fue de 15 μL con un contenido total de proteínas de 50 μg/15 μL. En la Tabla 2 se aportan los resultados de la medida de telomerasa a tres tiempos 14, 30 y 60 min. Los datos se expresan en UAF/Tiempo/mg de proteínas. Los datos están hechos por triplicado. Las significaciones estadísticas se han hecho mediante el programa de SigmaPlot. Los valores son estadísticamente significativos desde p<0,05.The liver was chosen to be used because it was the tissue that presented the highest telomerase activity. The conditions of the telomerase measurement were the same as those indicated in Example 2.1. with the difference that the lack of primers was replaced by sterile H20 MiliQ. The amount of extract used was 15 μL with a total protein content of 50 μg/15 μL. Table 2 shows the results of the telomerase measurement at three times: 14, 30 and 60 min. Data are expressed in UAF/Time/mg of protein. The data are done in triplicate. The statistical significances have been made using the SigmaPlot program. The values are statistically significant from p<0.05.
El incremento de ADN en ausencia de primers mediado por la telomerasa podría explicarse porque los extractos de tejidos contienen ADN y, por lo tanto, también ADNt, que es el sustrato de la telomerasa, la cual podría generar alargamiento de estos telómeros. De todas formas, puede observarse que las actividades con primers son mayores que en las reacciones que no contienen primers, siendo los resultados estadísticamente significativos, por lo que se concluye que se ha formado ADNt a partir del sustrato externo (SEQ ID NO: 1). The increase in DNA in the absence of primers mediated by telomerase could be explained because tissue extracts contain DNA and, therefore, also tDNA, which is the substrate of telomerase, which could generate lengthening of these telomeres. In any case, it can be observed that the activities with primers are greater than in the reactions that do not contain primers, the results being statistically significant, so it is concluded that tDNA has been formed from the external substrate (SEQ ID NO: 1) .
Ejemplo 5. Presencia de ADN en el extracto de hígado de rataExample 5. Presence of DNA in the rat liver extract
Para demostrar que el extracto de hígado utilizado poseía ADN se valoró la presencia de ADN en dichos extractos. Los resultados se presentan en la Tabla 3 y en la Figura 1. Los ensayos se realizaron por triplicado.To demonstrate that the liver extract used had DNA, the presence of DNA in said extracts was assessed. The results are presented in Table 3 and Figure 1. The tests were performed in triplicate.
Tabla 3. Valoración de ADN en extracto de hígado de rata Table 3. DNA assessment in rat liver extract
Se preparó una curva con distintas concentraciones de extracto de hígado de rata y se adicionaron 2 μL de DAPI (20 μg/mL), se completó el volumen hasta 50 μL con H20 MiliQ estéril y se midió la fluorescencia a 360 nm excitación y 460 nm emisión, con una ganancia de 1000. El DAPI es un marcador fluorescente, que se une fuertemente a regiones de ADN ricas en adenina y timina.A curve was prepared with different concentrations of rat liver extract and 2 μL of DAPI (20 μg/mL) was added, the volume was completed to 50 μL with sterile H20 MiliQ and the fluorescence was measured at 360 nm excitation and 460 nm. emission, with a gain of 1000. DAPI is a fluorescent marker, which binds strongly to regions of DNA rich in adenine and thymine.
Ejemplo 6. Efecto del tiempo sobre la actividad de telomerasa en hígado de rata Se analizó el efecto del tiempo sobre la medida de la telomerasa en muestras de hígado de rata. Los datos se muestran en la Tabla 4 y en la Figura 2; se expresan en UAF/Tiempo/mg de proteínas frente al tiempo en minutos (min). Se hicieron tres experimentos, cada uno por triplicado. Example 6. Effect of time on telomerase activity in rat liver The effect of time on the measurement of telomerase in rat liver samples was analyzed. The data are shown in Table 4 and Figure 2; They are expressed in UAF/Time/mg of proteins versus time in minutes (min). Three experiments were done, each in triplicate.
Tabla 4. Efecto del tiempo sobre la valoración de telomerasa en hígado de rata Table 4. Effect of time on telomerase assessment in rat liver.
Se comprobó que la telomerasa de hígado de rata presenta un comportamiento lineal frente al tiempo de incubación (ver Figura 2).It was proven that rat liver telomerase presents a linear behavior versus incubation time (see Figure 2).
Ejemplo 7. Efecto de la concentración del extracto de hígado de rata sobre la actividad de telomerasaExample 7. Effect of the concentration of rat liver extract on telomerase activity
Se valoró el efecto de la concentración de extracto de hígado de rata sobre la actividad de telomerasa. Los resultados se presentan en la Tabla 5 y e n l a Figura 3.The effect of the concentration of rat liver extract on telomerase activity was assessed. The results are presented in Table 5 and Figure 3.
El experimento se realizó con un extracto cuya concentración de proteínas fue de 1,5 μg de proteína/μL de extracto; se utilizaron diferentes cantidades de extracto (X μL): 15, 20, 25 y 30 p L y la actividad se valoró en UAF/40 minutos/X μL (Figura 3).The experiment was carried out with an extract whose protein concentration was 1.5 μg of protein/μL of extract; Different amounts of extract (X μL) were used: 15, 20, 25 and 30 p L and the activity was assessed in UAF/40 minutes/X μL (Figure 3).
Tabla 5. Efecto de la concentración de extracto sobre la valoración de telomerasa de hígadoderata. Table 5. Effect of extract concentration on liverderata telomerase titration.
Como se puede comprobar, la actividad de telomerasa es proporcional a la concentración de extracto de hígado de rata, lo que significa que es proporcional a la concentración de enzima (Figura 3). As can be seen, telomerase activity is proportional to the concentration of rat liver extract, which means that it is proportional to the enzyme concentration (Figure 3).
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2023
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