ES2939635T3

ES2939635T3 - Métodos y composiciones para el trasplante de células madre

Info

Publication number: ES2939635T3
Application number: ES16828392T
Authority: ES
Inventors: Paul Finnegan; Claude Davis; Michael Ginsberg; Daniel Nolan
Original assignee: Angiocrine Bioscience Inc
Current assignee: Angiocrine Bioscience Inc
Priority date: 2015-07-20
Filing date: 2016-07-19
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2036-07-19
Also published as: JP7089282B2; RU2018105988A; EP3325612A1; KR20180048617A; WO2017015245A1; EP3325612B1; CA2993014A1; EP4202036A1; RU2757818C2; JP2018521074A; WO2017015245A8; US20230414671A1; SG10201913752PA; JP2022121446A; CN108350419A; FI3325612T3; RU2018105988A3; AU2016297523B2; JP7473984B2; AU2016297523A1

Abstract

La presente descripción se refiere al campo del trasplante de células madre o progenitoras hematopoyéticas. Más específicamente, se proporcionan métodos, composiciones y kits para mejorar la expansión y el injerto de células madre o progenitoras hematopoyéticas mediante el cultivo conjunto y la administración conjunta con células endoteliales. Los métodos, composiciones y kits son útiles para tratar diversos trastornos relacionados con deficiencias en la hematopoyesis provocadas por enfermedades o tratamientos mieloablativos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para el trasplante de células madre

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 62/194.460 presentada el 20 de julio de 2015.

Antecedentes

Campo

Las presentes enseñanzas se refieren a métodos y composiciones para una terapia de células madre mejorada, y en particular, a métodos y composiciones para facilitar la expansión y el injerto de células progenitoras y madre hematopoyéticas y la inmunorreconstitución del sistema hematopoyético de un receptor de trasplante de células madre.

Introducción

El trasplante de células progenitoras o madre hematopoyéticas (HSCT) es un componente crítico del tratamiento de una amplia gama de trastornos hematológicos. Generalmente, hay dos tipos de HSCT: trasplante autólogo y alogénico. El trasplante autólogo implica la infusión de las propias células de un receptor después del tratamiento mieloablativo. Los trasplantes de células autólogas minimizan el riesgo de enfermedad de injerto contra huésped (EICH) y dan como resultado complicaciones reducidas. El trasplante alogénico implica la infusión de células madre de donante, normalmente usando un donante que coincide con el CMH del receptor. Sin embargo, los trasplantes de donantes compatibles no relacionados (MUD) también están asociados con una reacción de injerto contra huésped más fuerte y, por tanto, dan como resultado tasas de mortalidad más altas.

Hay tres fuentes principales de células progenitoras y/o madre hematopoyéticas (HSPC): médula ósea, sangre periférica y sangre de cordón umbilical. La sangre de cordón umbilical (UCB) es una fuente alternativa práctica a otras fuentes de progenitores hematopoyéticos (por ejemplo, médula ósea y sangre periférica movilizada) para el trasplante de células madre hematopoyéticas alogénico relacionado y no relacionado. Sin embargo, desafortunadamente, aunque la sangre de cordón está disponible fácilmente y muestra una menor incidencia de enfermedad de injerto contra huésped, se caracteriza por un injerto retardado de células de múltiples linajes (por ejemplo, neutrófilos, plaquetas, eritrocitos), todas las cuales son importantes para una inmunorreconstitución exitosa y clínicamente significativa. Por consiguiente, si bien resulta muy prometedor el tratamiento de trastornos hematológicos con HSPC obtenidas a partir de sangre de cordón, la lenta tasa de recuperación hematopoyética sigue siendo el principal obstáculo, Laughlin, et al., N. Eng. J. Med. 351:22; 2265-2275 (2004), y la eficiencia del injerto todavía es significativamente más baja en comparación con HSC de médula ósea o sangre periférica. Rocha et al., N. Eng. J. Med. 351:22; 2276-2285 (2004).

Las células madre hematopoyéticas pueden expandirse en distintas composiciones de medios que comprenden una mezcla de citocinas. En la técnica se conocen técnicas de expansión de células madre, incluyendo, la patente estadounidense n.° 6.326.198, la patente estadounidense n.° 6.338.942; la patente estadounidense n.° 6.335.195. Kobayashi et al. y Butler et al. describieron recientemente la generación de un nicho vascular prohematopoyético generado a partir de células endoteliales (EC) humanas primarias mediante transducción con el gen E4ORF1 de adenovirus, que activa mínimamente la ruta de Akt/Mtor que conduce a la expresión de señales de supervivencia y proliferación prohematopoyéticas. Kobayashi et al., Nature Cell Biology 12, 1046-1056 (2010); Butler et al., Blood 120, 1344-1347 (2012). Los procedimientos de expansión de HSPC/EC típicos implican cocultivar HSPC en una monocapa de EC depositadas en un matraz de cultivo celular pequeño, usando razones de EC:HSPC iniciales de desde 6:1 hasta 3:1. Después de 24-48 horas, se retiran las HSPC y se depositan en una monocapa adicional de EC en un segundo matraz, y así sucesivamente hasta que se obtiene el número requerido de HSPC. Sin embargo, una importante desventaja de tales expansiones basadas en matraz es el alto número de eventos de apertura, hasta 1.800 ^{para un procedimiento típico, lo que puede aumentar drásticamente el riesgo de contaminación.}

Continúa la necesidad de métodos de cultivo in vitro y sistemas capaces de una amplificación clínicamente útil de HSPC CD34+ humanas, así como de otros elementos hematopoyéticos. Se necesita un sistema capaz de producir grandes cantidades de determinados elementos de médula para suministrar cantidades suficientes de estos elementos para su uso en tratamientos terapéuticos en seres humanos, por ejemplo, como trasplante de médula ósea, componentes sanguíneos transfusibles o terapia genética. Los métodos descritos en el presente documento satisfacen estas y otras necesidades.

Sumario de la invención

La presente divulgación aborda y resuelve con éxito esta antigua necesidad en la técnica, proporcionando niveles sin precedentes de expansión de HSPC al cocultivar HSPC con células endoteliales en biorreactores de sistema cerrado usando razones de EC/HSPC iniciales de al menos 25:1, 50:1, 100:1 o 500:1, y todavía más preferiblemente de hasta 1000:1, 2000:1 o 3000:1. Significativamente, la interacción entre las HSPC y las EC permanece inalterada durante la etapa de expansión, manteniendo de ese modo una comunicación intercelular continua entre las HSPC y las EC, potenciando la eficiencia y el rendimiento global de la expansión. Además, se reduce el número de eventos de apertura en comparación con entornos de cultivo celular abiertos, tales como matraces de cultivo, reduciendo de ese modo en gran medida el riesgo de contaminación.

Las HSPC expandidas según los métodos descritos en el presente documento tienen efectos farmacológicos beneficiosos, particularmente cuando se administran a un receptor de HSCT en combinación con las EC, en los que se mantiene una interacción continua entre las HSPC y las EC durante toda la expansión y administración. La existencia transitoria de estas células endoteliales alogénicas en circulación sanguínea y/o en tejido ofrece resultados in vivo beneficiosos en el HSCT, tales como el injerto potenciado de múltiples linajes y una mayor duración del injerto, así como un injerto inicial relativamente rápido, tal como se mide, por ejemplo, mediante el recuento de neutrófilos. Tal como se demuestra por primera vez en el presente documento, esto es cierto incluso si las células endoteliales se irradian antes del cocultivo con HSC y no pueden replicarse.

Por consiguiente, en un aspecto, se proporciona un método para producir una población de células progenitoras o madre hematopoyéticas (HSPC) y células endoteliales (EC), en el que el método comprende poner en contacto HSPC con células endoteliales (EC) de vena umbilical humanas modificadas por ingeniería E4ORF1+ en un biorreactor de sistema cerrado y cultivar las HSPC y las EC en el biorreactor en condiciones que permitan la expansión de las HSPC, en el que (a) las HSPC y las EC están presentes simultáneamente en el mismo medio durante todo el procedimiento de cultivo y (b) en ningún momento durante el procedimiento de cultivo las HSPC se retiran a partir del medio de expansión para poner en contacto las HSPC con EC adicionales, y (c) no hay ninguna etapa de purificación para retirar las EC a partir de las HSPC, de manera que se mantiene una interacción continua entre las HSPC y las EC, produciendo de ese modo una población de HSPC y EC de vena umbilical humanas modificadas por ingeniería E4ORF1+.

La presente divulgación se refiere a métodos de trasplante de células madre en un sujeto que lo necesita, que comprenden: (a) expandir células progenitoras o madre hematopoyéticas (HSPC) poniendo en contacto las HSPC con células endoteliales (EC) a una razón de EC/HSPC inicial durante un primer periodo de tiempo en condiciones que permitan la expansión de las HSPC, para producir una población de células expandidas que comprende HSPC y E_ca una razón de HSPC/EC expandidas; y (b) transfundir la población de células expandidas obtenida a partir de la etapa (a) en el sujeto; en los que se mantiene una interacción continua entre las HSPC y las EC durante todas las etapas de expansión y transfusión.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una composición que comprende una población de HSPC y EC de vena umbilical humanas modificadas por ingeniería E4ORF1+ para su uso en el trasplante de células madre en un sujeto que lo necesita, en la que la población de HSPC y EC de vena umbilical humanas modificadas por ingeniería E4ORF1+ se produce usando el método del primer aspecto.

En el presente documento también se dan a conocer composiciones que comprenden HSPC y EC para su uso en el trasplante de células madre en un sujeto que lo necesita, en las que el trasplante de células madre comprende los métodos descritos en el presente documento. Preferiblemente, las EC están en proximidad continua con las HSPC durante todas las etapas de expansión y transfusión, tal como se describe y se muestra en el presente documento. Todavía más preferiblemente, las EC están en contacto continuo con las HSPC durante al menos la etapa de expansión.

La razón de EC/HSPC inicial puede ser de al menos aproximadamente 200:1. La razón de EC/HSPC inicial puede ser de al menos aproximadamente 300:1. La razón de EC/HSPC inicial puede ser de al menos aproximadamente 400:1. La razón de EC/HSPC inicial puede ser de al menos aproximadamente 500:1. La razón de EC/HSPC inicial puede ser de al menos aproximadamente 600:1. La razón de EC/HSPC inicial puede ser de al menos aproximadamente 700:1. La razón de EC/HSPC inicial puede ser de al menos aproximadamente 1000:1. La razón de EC/HSPC inicial puede ser de al menos aproximadamente 2000:1. La razón de EC/HSPC inicial puede ser de al menos aproximadamente 3000:1.

La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:10. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:1. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 9:1 a aproximadamente 2:1. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 3:1. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 7:1 a aproximadamente 4:1. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 5:1.

La presente divulgación también se refiere a kits o sistemas para aislar, expandir, conservar y administrar HSPC y células endoteliales según los métodos descritos en el presente documento.

Breve descripción de los dibujos

El experto en la técnica entenderá que los dibujos son sólo con propósitos de ilustración, y no se pretende que limiten el alcance de las presentes enseñanzas en modo alguno.

La figura 1 muestra imágenes de microscopía de fases del efecto de exposición a radiación sobre EC modificadas por ingeniería E4ORF1+. Las EC se recogieron en condiciones de cultivo convencionales y se transdujeron con E4ORF1. Luego, las células se dividieron dos matraces y se cultivaron adicionalmente hasta el 100% de confluencia. Un recipiente se dejó sin manipular (panel izquierdo) y el otro recipiente se irradió con 1500 cGy a partir de un irradiador de cesio (panel derecho). No hubo diferencias detectables entre los dos matraces mediante microscopía de fases.

La figura 2 muestra imágenes de microscopía de fases en serie de EC modificadas por ingeniería E4ORF1 irradiadas (fila inferior) y no irradiadas (fila superior) durante el periodo de una semana en cultivo. Se cultivaron dos matraces de células hasta la semiconfluencia, momento en el cual un matraz (paneles inferiores) se irradió con 1500 cGy usando un irradiador de cesio. Ambos matraces se cultivaron adicionalmente durante una semana y se generaron imágenes de microscopía de fases los días 1, 5 y 7 después de la irradiación.

La figura 3 muestra imágenes de microscopía de fases de HSPC en cocultivo con EC modificadas por ingeniería E4ORF1+ irradiadas (fila inferior) y no irradiadas (fila superior). Se cocultivaron HSPC (CD34+) purificadas a partir de sangre de cordón umbilical en placas de 6 pocillos con monocapas confluentes de EC E4ORF1 no irradiadas e irradiadas con 1500 cGy. Al final de la expansión y los pases en serie de las células de 11 días, se generaron imágenes de microscopía de fases tanto del pocillo de cultivo original (“pocillo madre”, columna izquierda) como de uno de los pocillos finales (“pocillo final”, columna derecha) generados mediante los pases en serie.

La figura 4 muestra datos de citometría de flujo de cocultivos de HSPC con EC modificadas por ingeniería E4ORF1 irradiadas (paneles inferiores) y no irradiadas (paneles superiores). Se cocultivaron HSPC (CD34+) purificadas a partir de sangre de cordón umbilical en placas de 6 pocillos con monocapas confluentes de EC E4ORF1 o bien irradiadas o bien no irradiadas. Al final de la expansión de 11 días, las células hematopoyéticas se analizaron mediante citometría de flujo. La columna izquierda muestra los resultados de células teñidas para la expresión de CD45 (un marcador de superficie de células pan-hematopoyéticas). El panel derecho muestra los resultados de células doblemente teñidas para la expresión de CD34 (un marcador positivo para HSPC) y CD38 (un marcador negativo para HSPC).

La figura 5 muestra imágenes de microscopía de fases representativas del cocultivo de HSPC-EC modificadas por ingeniería E4ORF1+ a corto (panel izquierdo) y largo (panel derecho) plazo y la atrición de EC resultante. Se cocultivaron HSPC (CD34+) purificadas a partir de sangre de cordón umbilical en una placa de 6 pocillos con monocapas confluentes de EC. A medida que se expande la población de HSPC, las células no adherentes se retiran suavemente y se colocan en una capa más grande y nueva de EC. El pocillo original, denominado “pocillo madre”, se realimenta con medios adicionales. Este procedimiento se repite aproximadamente cada 48 horas para todos los pocillos cocultivados. Durante los 7 días de cocultivo, las EC modificadas por ingeniería E4ORF1+ en el pocillo madre se agotan (panel derecho) en comparación con sólo 1 día de cocultivo de las mismas HSPC en expansión sembradas en EC E4ORF1 nuevas (panel izquierdo).

La figura 6 muestra la cuantificación de la expansión de células hematopoyéticas totales en un biorreactor con contacto continuo de EC modificadas por ingeniería E4ORF1+ y HSPC en comparación con la expansión con citocinas solas y con la expansión con contacto discontinuo de EC modificadas por ingeniería E4ORF1+ y HSPC. Se expandieron las HSPC (CD34+) purificadas a partir de sangre de cordón umbilical en un matraz con citocinas solas, en un matraz en monocapas de EC modificadas por ingeniería E4ORF1+ o en un biorreactor de fibras huecas precargado con EC modificadas por ingeniería E4ORF1+. La expansión con citocinas solas y la expansión en EC modificadas por ingeniería E4ORF1+ en un matraz requirieron una interrupción del procedimiento de cultivo para enjuagar y volver a sembrar las células durante la expansión. El recuento celular y la enumeración por citometría de flujo de la población de células CD45+ se realizaron el día 6 de cultivo.

La figura 7 representa la cuantificación de ensayos de formación de colonias de la expansión de HSPC en un biorreactor con contacto continuo de EC modificadas por ingeniería E4ORF1+ y HSPC en comparación con la expansión con citocinas solas y con la expansión con contacto discontinuo de EC modificadas por ingeniería E4ORF1+ y HSPC. La abreviatura “UFC” se refiere a unidades formadoras de colonias. Las frecuencias de colonias en múltiples campos de visión del microscopio se usaron para extrapolar el número de UFC en la población expandida total.

Descripción detallada

Definiciones

En referencia a la presente divulgación, los términos técnicos y científicos usados en las descripciones en el presente documento tendrán los significados que entiende habitualmente un experto habitual en la técnica, a menos que se definan específicamente de otro modo. Por consiguiente, se pretende que los siguientes términos tengan los siguientes significados:

“Alogénico” se refiere a derivado de, que se origina en, o que es miembro de, la misma especie, donde los miembros están genéticamente relacionados o genéticamente no relacionados pero son genéticamente similares. Un “trasplante alogénico” se refiere a la transferencia de células u órganos a partir de un donante a un receptor, donde el receptor es de la misma especie que el donante.

“Autólogo” se refiere a derivado de, o que se origina en, el mismo sujeto o paciente. Un “trasplante autólogo” se refiere a la recogida y al retrasplante de las propias células u órganos de un sujeto.

“Célula progenitora mieloide comprometida” o “célula progenitora mieloide” o “MP” se refiere a una célula progenitora multipotente o unipotente que puede desarrollarse en última instancia para dar cualquiera de las células terminalmente diferenciadas del linaje mieloide, pero que normalmente no se diferencia en células del linaje linfoide. Así, “célula progenitora mieloide” se refiere a cualquier célula progenitora en el linaje mieloide. Las células progenitoras comprometidas del linaje mieloide incluyen CMP, GMP y MEP oligopotentes tal como se definen en el presente documento, pero también abarcan células progenitoras de macrófagos, progenitoras de granulocitos, progenitoras megacariocitos y progenitoras eritroides unipotentes. Las diferentes poblaciones celulares de células progenitoras mieloides pueden distinguirse de otras células por su potencial de diferenciación y la presencia de un conjunto característico de marcadores celulares.

“Célula progenitora mieloide habitual” o “CMP” se refiere a una célula caracterizada por su capacidad para dar lugar a células progenitoras de granulocitos/monocitos (GMP) y células progenitoras megacariocitos/eritroides (MEP). Estas células progenitoras tienen una capacidad de autorrenovación limitada o nula, pero pueden dar lugar a células dendríticas mieloides, eritroides mieloides, eritroides, megacariocitos, granulocitos/macrófagos, granulocitos y macrófagos.

“Interacción continua” tal como se usa en el presente documento se refiere a al menos la proximidad continua de las HSPC a las EC durante una o más etapas de procedimiento descritas en el presente documento. “Proximidad” en este contexto se refiere a la presencia combinada de las HSPC y las EC en el mismo medio, por ejemplo un medio de cultivo celular, un medio de transfusión, o en cualquier medio usado durante cualquier etapa opcional entre las etapas de expansión y transfusión, tal como la recogida de la población de células expandidas o la preparación de una composición farmacéutica que comprende la población de células expandidas. Las HSPC y las EC pueden estar en proximidad continua durante las etapas de expansión y transfusión combinadas. Dicho de otro modo, las HSPC y las EC están presentes simultáneamente en el mismo medio durante toda la etapa de expansión y hasta que se completa la etapa de transfusión. Por ejemplo, en ningún momento durante la etapa de expansión se retiran las HSPC a partir del medio de expansión, por ejemplo, para poner en contacto las HSPC con EC adicionales. Además, los métodos descritos en el presente documento pueden no comprender ninguna etapa de purificación, mediante lo cual las células endoteliales se retiran a partir de la población de células expandidas que comprende las HSPC expandidas antes de la etapa de transfusión. “ Interacción continua” tal como se usa en el presente documento también puede referirse al contacto continuo entre las HSPC las EC durante una o más etapas de procedimiento descritas en el presente documento. Las HSPC y las EC pueden estar en contacto continuo durante la etapa de expansión. En este contexto, el término “contacto” entre las HSPC y las células endoteliales se refiere a una relación espacial en la que la distancia entre las HSPC y las EC puede ser < 500 |im. La distancia entre las HSPC y las EC puede ser < 400 |im. La distancia entre las HSPC y las EC puede ser < 300 |im. La distancia entre las HSPC y las EC puede ser < 200 |im. La distancia entre las HSPC y las EC puede ser menor que o igual a una dimensión interna del recipiente en el que se realiza la expansión.

“Cultivar” se refiere a la propagación de células u organismos sobre o en medios de diversas clases. “Cocultivar” se refiere a la propagación de dos o más tipos distintos de células u organismos sobre o en medios de diversas clases, por ejemplo, pueden cocultivarse HSPC y células endoteliales.

El término “modificado por ingeniería” cuando se usa en relación con células en el presente documento se refiere a células que se han modificado por ingeniería por el ser humano para dar como resultado el fenotipo mencionado (por ejemplo, E4ORF1+), o para expresar un polipéptido o una molécula de ácido nucleico mencionados. No se pretende que el término “células modificadas por ingeniería” abarque células que se producen de manera natural, sino que, en su lugar, se pretende que abarque, por ejemplo, células que comprenden una molécula de ácido nucleico recombinante, o células que se han alterado artificialmente de otro modo (por ejemplo, mediante modificación genética), por ejemplo, de modo que expresen un polipéptido que de otro modo no expresarían, o de modo que expresen un polipéptido a niveles sustancialmente más altos que los observados en células endoteliales no modificadas por ingeniería.

“Expansión” en el contexto de células se refiere a un aumento en el número de un tipo celular, o tipos celulares, característicos a partir de una población inicial de células, que pueden ser idénticas o no. No es necesario que las células iniciales usadas para la expansión sean las mismas que las células generadas a partir de la expansión. Por ejemplo, las células expandidas pueden producirse mediante el crecimiento y la diferenciación de la población inicial de células. Quedan excluidos del término expansión los ensayos de dilución limitante usados para caracterizar el potencial de diferenciación de las células.

“Modificación genética” o “con genes modificados” se refiere a cualquier adición, deleción o alteración de los nucleótidos normales de una célula. Se pretende que los métodos dados a conocer en el presente documento abarquen cualquier método de modificación genética de transferencia de genes exógenos o extraños (o transferencia de secuencias de ácido nucleico) en HSPC o células endoteliales. El término “modificación genética” abarca el uso de un vehículo de administración de genes e incluye, pero no se limita a, transducción (transferencia mediada por virus de ácido nucleico a un receptor, ya sea in vivo o in vitro), transfección (captación de ácido nucleico aislado por parte de las células), transferencia mediada por liposomas y otros medios bien conocidos en la técnica.

“Enfermedad de injerto contra huésped” o “ICH” o “EICH” se refiere a una respuesta celular que se produce cuando los linfocitos de una clase de CMH diferente se introducen en un huésped, dando como resultado la reacción de los linfocitos contra el huésped.

“Células progenitoras de granulocitos/macrófagos” o “GMP” se refiere a una célula derivada de células progenitoras mieloides habituales y caracterizada por su capacidad para dar lugar a células granulocitos y macrófagos, pero que normalmente no da lugar a células eritroides o megacariocitos del linaje mieloide.

“Enfermedades hematopoyéticas” se refiere a cualquier trastorno sanguíneo incluyendo, pero sin limitarse a, neoplasia maligna hematopoyética, hemoglobinopatía e inmunodeficiencia.

“Célula progenitora o madre hematopoyética” o “HSPC” abarca HSC, tal como se definen en el presente documento, así como células progenitoras no autorrenovables multipotentes que pueden diferenciarse en última instancia en todos los tipos celulares del sistema hematopoyético, y células progenitoras oligopotentes y unipotentes que pueden diferenciarse en determinados tipos celulares del sistema hematopoyético. Las HSPC incluyen CMP, Mp , MEP y GMP, tal como se definen en el presente documento.

“Célula madre hematopoyética” o “HSC” se refiere a una célula pluripotente autorrenovable clonogénica que puede diferenciarse en última instancia en todos los tipos celulares del sistema hematopoyético, incluyendo células B, células T, células NK, células dendríticas linfoides, células dendríticas mieloides, granulocitos, macrófagos, megacariocitos y células eritroides. Al igual que con otras células del sistema hematopoyético, las HSC normalmente se definen por la presencia de un conjunto característico de marcadores celulares.

“Aislado” se refiere a un producto, un compuesto o una composición que se separa a partir de al menos otro producto, compuesto o composición con el que está asociado en su estado natural, ya sea en la naturaleza o tal como se prepara de manera sintética.

“Fenotipado de marcadores” se refiere a la identificación de marcadores o antígenos en células para determinar su fenotipo (por ejemplo, estado de diferenciación y/o tipo celular). Esto puede realizarse mediante inmunofenotipado, que usa anticuerpos que reconocen los antígenos presentes en una célula. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales, pero generalmente se eligen para tener una reactividad cruzada mínima con otros marcadores celulares. Debe entenderse que determinados marcadores de superficie celular o de diferenciación celular son únicos para la especie animal a partir de la cual se derivan las células, mientras que otros marcadores celulares será comunes entre especies. A estos marcadores que definen tipos celulares equivalentes entre especies se les da la misma identificación de marcador a pesar de que hay diferencias entre especies en cuanto a la estructura (por ejemplo, secuencia de aminoácidos). Los marcadores celulares incluyen moléculas de superficie celular, también denominadas en determinadas situaciones marcadores de diferenciación celular (CD), y marcadores de expresión génica. Los marcadores de expresión génica son aquellos conjuntos de genes expresados indicativos del tipo celular o del estado de diferenciación. En parte, el perfil de expresión génica reflejará los marcadores de superficie celular, aunque pueden incluir moléculas no de superficie celular.

“Célula progenitora megacariocito/eritroide” o “MEP” se refiere a una célula derivada de células progenitoras mieloides habituales y caracterizada por su capacidad para dar lugar a células eritroides y megacariocitos, pero que normalmente no da lugar a granulocitos, macrófagos o células dendríticas mieloides.

“Mieloablativo” o “mieloablación” se refiere a la alteración o destrucción del sistema hematopoyético, normalmente por la exposición a un agente citotóxico o radiación. La mieloablación abarca mieloablación completa provocada por altas dosis de agente citotóxico o irradiación corporal total que destruye el sistema hematopoyético. También incluye un estado mieloablativo menos completo provocado por acondicionamiento no mieloablativo. Por tanto, un acondicionamiento no mieloablativo es un tratamiento que no destruye por completo el sistema hematopoyético del sujeto.

“Autorrenovación” se refiere a la capacidad de una célula para dividirse y generar al menos una célula hija con características idénticas (por ejemplo, autorrenovación) a la célula original. La segunda célula hija puede comprometerse con una ruta de diferenciación particular. Por ejemplo, una célula madre hematopoyética autorrenovable se divide y forma una célula madre hija y otra célula hija comprometida con la diferenciación en la ruta mieloide o linfoide. Una célula progenitora comprometida normalmente ha perdido la capacidad de autorrenovación, y tras la división celular produce dos células hijas que presentan un fenotipo más diferenciado (es decir, restringido).

“Clasificación” en lo que respecta a las células se refiere a la separación de células basándose en las características físicas o la presencia de marcadores (tal como clasificación usando dispersión lateral (SSC) y dispersión directa (FSC), o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) usando anticuerpos marcados), o el análisis de células basándose en la presencia de marcadores celulares, por ejemplo, FACS sin clasificación.

“Célula madre” se refiere a células madre de diversos tipos celulares, tales como células madre musculares, epiteliales, neuronales y óseas. Más particularmente, la invención se refiere a HSPC.

“Sujeto” o “paciente” se usan de manera intercambiable y se refieren a, excepto donde se indique, mamíferos tales como seres humanos y primates no humanos, así como conejos, ratas, ratones, cabras, cerdos y otras especies de mamíferos.

“Población celular sustancialmente pura” se refiere a una población de células que tiene una característica de marcador celular específica y un potencial de diferenciación que es al menos aproximadamente el 50%, preferiblemente al menos aproximadamente el 75-80%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 85-90% y lo más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de las células que componen la población celular total. Por tanto, una “población celular sustancialmente pura” se refiere a una población de células que contienen menos de aproximadamente el 50%, preferiblemente menos de aproximadamente el 20-25%, más preferiblemente menos de aproximadamente el 10-15% y lo más preferiblemente menos de aproximadamente el 5% de células que no presentan una característica de marcador específica ni un potencial de diferenciación en las condiciones de ensayo designadas.

“Gen terapéutico” se refiere a la totalidad de un gen o sólo al fragmento funcionalmente activo del gen. El gen terapéutico puede compensar una deficiencia en un paciente que surge de un gen endógeno defectuoso o ausente. Además, un gen terapéutico puede ser uno que antagoniza la producción o función de un agente infeccioso, antagoniza procesos patológicos, mejora la constitución genética de un huésped, facilita el injerto, o la potencia terapéutica de una célula madre.

“Xenogénico” se refiere a derivado de, que se origina en, o que es miembro de, diferentes especies, por ejemplo, ser humano y roedor, ser humano y porcino, ser humano y chimpancé, etc. Un “trasplante xenogénico” se refiere a la transferencia de células u órganos desde un donante a un receptor en el que el receptor es de una especie diferente a la del donante.

Expansión de células progenitoras o madre hematopoyéticas

La presente divulgación describe métodos, composiciones y sistemas o kits para facilitar el injerto de HSPC. Se proporcionan métodos para potenciar el injerto de HSPC en un paciente que lo necesita, que comprenden cocultivar y coinfundir HSPC con EC mientras se mantiene una interacción continua entre las HSPC y las EC en todo momento. Tal como se demuestra por primera vez en el presente documento, mantener una interacción continua entre las HSPC y las EC durante todas las etapas de expansión y transfusión aumenta la eficiencia de la expansión y el injerto de las HSPC expandidas resultantes, mejorando de ese modo la velocidad y completitud de la inmunorreconstitución y, por tanto, la supervivencia de los pacientes del trasplante que reciben un injerto de HSPC. Las células madre hematopoyéticas son células madre pluripotentes que pueden autorrenovarse y se caracterizan por su capacidad para dar lugar, en condiciones permisivas, a todos los tipos celulares del sistema hematopoyético. La autorrenovación de HSC se refiere a la capacidad de una célula HSC para dividirse y producir al menos una célula hija con el mismo potencial de autorrenovación y diferenciación de una HSC; es decir, la división celular da lugar a HSC adicionales. La autorrenovación proporciona una fuente continua de células madre no diferenciadas para el reabastecimiento del sistema hematopoyético. Los fenotipos de marcador útiles para identificar las HSC serán aquellos habitualmente conocidos en la técnica. Para HSC humanas, los fenotipos de marcador celular incluyen preferiblemente CD34+ CD38- CD90(Thy1)+ Lin-. Para HSC de ratón, un fenotipo de marcador celular a modo de ejemplo es Sca-1+ CD90+ (véase, por ejemplo, Spangrude, G. J. et al., Science 1:661-673 (1988)) o c-kit+ ThylD Lin' Sca-1+ (véase, Uchida, N. et al., J. Clin. Invest. 101(5):961-966 (1998)). También pueden encontrar un uso ventajoso marcadores de HSC alternativos tales como aldehído deshidrogenasa (véase Storms et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 96:9118-23 (1999), AC133 (véase Yin et al., Blood 90:5002-12 (1997)) y CD150 (SLAM) (véase Kiel Cell 2005, 121(7) 1109-21).

Las HSC pueden obtenerse a partir de una variedad de fuentes, incluyendo médula ósea, sangre periférica, sangre de cordón y otras fuentes conocidas por albergar células progenitoras hematopoyéticas y mieloides, incluyendo hígado, particularmente hígado fetal. La sangre periférica y de cordón es una fuente rica de HSC. Las células se obtienen usando métodos conocidos y habitualmente puestos en práctica en la técnica. Por ejemplo, se describen métodos para preparar células de médula ósea en Sutherland et al., Bone Marrow Processing and Purging: A Practical Guide (Gee, A. P. ed.), CRC Press Inc. (1991)). Las HSC también pueden derivarse de fuentes de células madre primordiales tales como células madre embrionarias (Thomson et al., Science 282:1145 (1998)) y células germinales (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726 (1998)) usando técnicas de expansión y diferenciación apropiadas.

Las células HSC se derivan de cualquier especie animal con un sistema hematopoyético, tal como se describe de manera general en el presente documento. Preferiblemente, animales adecuados serán mamíferos, incluyendo, a modo de ejemplo y no de limitación, roedores, conejos, caninos, felinos, cerdos, caballos, vacas, primates (por ejemplo, ser humano), y similares.

En el presente documento se dan a conocer métodos de trasplante de células madre en un sujeto que lo necesita que comprenden: (a) expandir células progenitoras o madre hematopoyéticas (HSPC) poniendo en contacto las HSPC con células endoteliales (EC) a una razón de EC/HSPC inicial durante un primer periodo de tiempo en condiciones que permitan la expansión de las HSPC, para producir una población de células expandidas que comprende HSPC y EC a una razón de HSPC/EC expandidas; y (b) transfundir la población de células expandidas obtenida a partir de la etapa (a) en el sujeto; en los que se mantiene una interacción continua entre las HSPC y las EC durante todas las etapas de expansión y transfusión.

En el presente documento se dan a conocer composiciones que comprenden HSPC y EC para su uso en el trasplante de células madre en un sujeto que lo necesita, en las que el trasplante de células madre comprende: (a) expandir HSPC poniendo en contacto las HSPC con EC a una razón de EC/HSPC inicial durante un primer periodo de tiempo en condiciones que permitan la expansión de las HSPC, para producir una población de células expandidas que comprende HSPC y EC a una razón de HSPC/EC expandidas; y (b) transfundir la población de células expandidas obtenida a partir de la etapa (a) en el sujeto; en el que se mantiene una interacción continua entre las HSPC y las EC durante todas las etapas de expansión y transfusión.

Las HSPC pueden ser células madre hematopoyéticas. Las HSPC pueden ser alogénicas con respecto al sujeto. Las HSPC pueden ser HSPC de sangre de cordón umbilical. Las HSPC pueden ser autólogas con respecto al sujeto. Las HSPC pueden ser HSPC derivadas de médula ósea en estado estacionario con genes modificados.

Las células endoteliales pueden estar modificadas genéticamente. La región temprana 4 (E4) de adenovirus contiene al menos 6 marcos de lectura abiertos (E4ORF). Se ha demostrado que toda la región E4 regula la angiogénesis y fomenta la supervivencia, pero no la proliferación, de células endoteliales (véase, por ejemplo, Zhang et al. (2004), J. Biol. Chem. 279(12): 11760-66). El uso de toda la región E4, ya sea clínica o experimentalmente, para inducir la angiogénesis o para fomentar la supervivencia o proliferación de células endoteliales puede no ser deseable porque algunos de los E4ORF pueden presentar efectos perjudiciales. Por ejemplo, se sabe que el gen E4ORF6 induce apoptosis (Yamano et al. (1999) J. Virol. 73:10095-103). Además, los ^e4^oRF son inmunogénicos y, por tanto, la administración de todos los E4ORF a sujetos puede no ser deseable. Rafii et al. (documento WO2008089448) identificaron secuencias dentro de la región E4ORF que son útiles para inducir la angiogénesis y para fomentar la supervivencia y proliferación de células endoteliales.

Varios miembros de la familia E-veintiséis (ETS) de factores de transcripción (TF), incluyendo ETV2 (Lee et al., Cell stem cell, 2: 497-507 (2008); Sumanas et al., Blood, 111: 4500-4510 (2008)), FLU (Liu et al., Current Bio. 18: 1234 1240 (2008)) y ERG (McLaughlin et al., Blood, 98: 3332-3339 (2001)) se han implicado en la regulación de la angiogénesis y el desarrollo vascular (De Val et al., Dev Cell, 16: 180-195 (2009); Sato et al., Cell Struct Funct, 26: 19-24 (2001)). Estos TF regulan directamente la expresión de genes asociados con el desarrollo y la función de EC. Las EC adultas expresan de manera constitutiva varios factores de ETS, tales como FLU, ERG (isoformas 1 y 2), ETS1, ETS2, Elf1, Elk1, VEZF y ETV6, mientras que ETV2 se expresa de manera transitoria durante el desarrollo embrionario y está ausente en EC adultas (Kataoka et al., Blood, 118: 6975-6986 (2011); Lelievre et al., The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 33: 391-407 (2001)).

Las EC se modifican por ingeniería para expresar un polipéptido de E4ORF1 de adenovirus (es decir, son células endoteliales modificadas por ingeniería E4ORF1+). Las células endoteliales pueden modificarse por ingeniería para expresar uno o más factores de transcripción de la familia ETS, tales como los enumerados anteriormente (es decir, son células endoteliales modificadas por ingeniería ETS+). Las células endoteliales pueden modificarse por ingeniería para expresar el factor de transcripción de la familia ETS ETV2 (es decir, son células endoteliales modificadas por ingeniería ETV2+). Las EC pueden ser células endoteliales modificadas por ingeniería E4ORF1 ETV2+. Las EC pueden ser células endoteliales modificadas por ingeniería E4ORF1+ ETS+. Las EC también son E4ORF6+. Las EC pueden comprender una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para un factor de transcripción de la familia ETS. Las EC pueden comprender una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para polipéptido de ETV2. Las EC pueden comprender una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de E4ORF1 de adenovirus. Las EC pueden comprender una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido de E4ORF6 de adenovirus. La molécula de ácido nucleico puede estar en forma de un vector plasmídico. La molécula de ácido nucleico puede integrarse en el ADN genómico de las EC modificadas por ingeniería. Las EC pueden ser EC diferenciadas. Las EC pueden ser EC adultas. Las EC pueden no ser EC embrionarias. Las EC pueden ser EC humanas. Las EC pueden ser EC primarias. Las EC pueden ser EC de vena umbilical humanas (HUVEC).

La razón de EC/HSPC inicial puede ser de al menos aproximadamente 200:1. La razón de EC/HSPC inicial puede ser de al menos aproximadamente 300:1. La razón de EC/HSPC inicial puede ser de al menos aproximadamente 400:1. La razón de EC/HSPC inicial puede ser de al menos aproximadamente 500:1. La razón de EC/HSPC inicial puede ser de al menos aproximadamente 600:1. La razón de EC/HSPC inicial puede ser de al menos aproximadamente 700:1. La razón de EC/HSPC inicial puede ser de al menos aproximadamente 800:1. La razón de EC/HSPC inicial puede ser de al menos aproximadamente 900:1. La razón de EC/HSPC inicial puede ser de al menos aproximadamente 1000:1. La razón de EC/HSPC inicial puede ser de al menos aproximadamente 1100:1. La razón de EC/HSPC inicial puede ser de al menos aproximadamente 1200:1. La razón de EC/HSPC inicial puede ser de al menos aproximadamente 1300:1. La razón de EC/HSPC inicial puede ser de al menos aproximadamente 1400:1. La razón de EC/HSPC inicial puede ser de aproximadamente 1500:1. La razón de EC/HSPC inicial puede ser de aproximadamente 2000:1. La razón de EC/HSPC inicial puede ser de aproximadamente 3000:1.

El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 1 día a aproximadamente 24 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 1 día a aproximadamente 12 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 1 día. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 2 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 3 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 4 días.

El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 5 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 6 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 7 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 8 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 9 días.

El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 10 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 11 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 12 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 13 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 14 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 15 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 16 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 17 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 18 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 19 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 20 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 21 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 22 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 23 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 24 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 25 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 26 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 27 días. El primer periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 28 días.

La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:10. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 9:1 a aproximadamente 1:9. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 1:8. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 7:1 a aproximadamente 1:7. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 1:6. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 1:5. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 1:4. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1:3. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:2. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:1. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 9:1 a aproximadamente 2:1. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 3:1. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 7:1 a aproximadamente 4:1. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 5:1. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 10:1. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 9:1. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 8:1. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 7:1. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 6:1. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 5:1. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 4:1. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 3:1. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 2:1. La razón de HSPC/EC expandidas puede ser de aproximadamente 1:1.

Las HSPC pueden expandirse en de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 30.000 veces durante la etapa de expansión. Las HSPC pueden expandirse en de aproximadamente 1.000 veces a aproximadamente 10.000 veces durante la etapa de expansión. Las HSPC pueden expandirse en aproximadamente 1.000 veces durante la etapa de expansión. Las HSPC pueden expandirse en aproximadamente 2.000 veces durante la etapa de expansión. Las HSPC pueden expandirse en aproximadamente 3.000 veces durante la etapa de expansión. Las HSPC pueden expandirse en aproximadamente 3.500 veces durante la etapa de expansión. Las HSPC pueden expandirse en aproximadamente 4.000 veces durante la etapa de expansión. Las HSPC pueden expandirse en aproximadamente 5.000 veces durante la etapa de expansión. Las HSPC pueden expandirse en aproximadamente 6.000 veces durante la etapa de expansión. Las HSPC pueden expandirse en aproximadamente 7.000 veces durante la etapa de expansión. Las HSPC pueden expandirse en aproximadamente 8.000 veces durante la etapa de expansión. Las HSPC pueden expandirse en aproximadamente 9.000 veces durante la etapa de expansión. Las HSPC pueden expandirse en aproximadamente 10.000 veces durante la etapa de expansión.

La interacción continua entre las HSPC y las EC puede comprender el contacto continuo entre las HSPC y las EC durante la etapa de expansión, y la proximidad continua de las HSPC y las EC durante las etapas de expansión y transfusión combinadas. Los métodos descritos en el presente documento pueden comprender además recoger la población de células expandidas y preparar una composición farmacéutica que comprende la población de células expandidas para su uso en la etapa de transfusión. La interacción continua entre las HSPc y las EC puede comprender la proximidad continua de las HSPC y las EC durante las etapas de expansión, recogida, preparación de composición farmacéutica y transfusión combinadas. Los métodos descritos en el presente documento pueden no comprender una etapa de purificación mediante la cual las células endoteliales se separan a partir de las HSPC expandidas antes de la transfusión. Puede no haber ninguna interacción o alteración humana de la expansión durante el primer periodo de tiempo. Pueden añadirse citocinas complementarias durante el primer periodo de tiempo. Pueden añadirse 50 ng/ml de trombopoyetina (TPO), ligando de Flt3 (tirosina cinasa relacionada con FMS 3) y factor de células madre (SCF) durante el primer periodo de tiempo. La etapa de expansión puede comprender no más de seis eventos de apertura.

Antes de la expansión, las HSPC y las EC pueden someterse a selección y purificación, que pueden incluir métodos de selección tanto positiva como negativa, para obtener una población sustancialmente pura de células. Puede usarse clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), también denominada citometría de flujo, para clasificar y analizar diferentes poblaciones celulares. Las células que tienen los marcadores celulares específicos de poblaciones de HSPC o EC se etiquetan con un anticuerpo, o normalmente una mezcla de anticuerpos, que se unen a marcadores celulares. Cada anticuerpo dirigido a un marcador diferente se conjuga con una molécula detectable, particularmente un colorante fluorescente que puede distinguirse de otros colorantes fluorescentes acoplados a otros anticuerpos. Se hace pasar una corriente de células etiquetadas o “teñidas” a través de una fuente de luz que excita el fluorocromo y se detecta el espectro de emisión de las células para determinar la presencia de un anticuerpo marcado particular. Mediante la detección concurrente de diferentes fluorocromos, también denominada en la técnica clasificación celular por fluorescencia multicolor, las células que presentan conjuntos diferentes de marcadores celulares pueden identificarse y aislarse a partir de otras células en la población. Otros parámetros de FACS, incluyendo, a modo de ejemplo y no de limitación, dispersión lateral (SSC), dispersión directa (FSC) y tinción con colorante vital (por ejemplo, con yoduro de propidio), permiten la selección de células basándose en el tamaño y la viabilidad. Se describen la clasificación por FACS y el análisis de las HSPC en, entre otros, las patentes estadounidenses n.os 5.137.809, 5.750.397, 5.840.580; 6.465.249; Manz, M.G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11872-11877 (2002); y Akashi, K. et al., Nature 404(6774):193-197 (2000)). Se describen pautas generales sobre la clasificación celular activada por fluorescencia en, por ejemplo, Shapiro, H.M., Practical Flow Cytometry, 4a ed., Wiley-Liss (2003) y Ormerod, M.G., Flow Cytometry: A Practical Approach, 3a ed., Oxford University Press (2000).

Debe entenderse que la purificación de células también incluye combinaciones de los métodos descritos en el presente documento. Una combinación típica puede comprender un procedimiento inicial que es eficaz para retirar la mayor parte de células y material celular no deseados, por ejemplo, leucaféresis. Una segunda etapa puede incluir el aislamiento de células que expresan un marcador común a una o más de las poblaciones de células progenitoras mediante inmunoadsorción sobre anticuerpos unidos a un sustrato. Por ejemplo, las perlas magnéticas que contienen anticuerpos anti-CD34 pueden unirse a, y capturar, células HSC, CMP y GMP que habitualmente expresan el antígeno CD34. Puede usarse una etapa adicional que proporciona una mayor resolución de los diferentes tipos celulares, tal como clasificación por FACS con anticuerpos contra un conjunto de marcadores celulares específicos, para obtener poblaciones sustancialmente puras de las células deseadas. Otra combinación puede implicar una separación inicial usando perlas magnéticas unidas con anticuerpos anti-CD34 seguido de una ronda adicional de purificación con FACS.

Los expertos en la técnica conocen bien lugares para lograr la expansión, e incluyen, por ejemplo, entornos de cultivo celular abiertos, tales como matraces de cultivo, y entornos de cultivo celular cerrados, tales como biorreactores de bolsa de ondas de sistema cerrado con o sin modificación para la adhesión de células y minibiorreactores de sistema cerrado, por ejemplo minibiorreactores que comprenden fibras huecas u otros sistemas o recubrimientos que permiten la adhesión de células si se desea. El lugar puede ser el sistema de expansión celular Quantum® (Terumo BCT, Lakewood, CO).

La cantidad de las células necesaria para lograr un efecto terapéutico se determinará empíricamente según procedimientos convencionales para el propósito particular. Generalmente, para administrar células con propósitos terapéuticos, las células se administran a una dosis farmacológicamente eficaz. Por “cantidad farmacológicamente eficaz” o “dosis farmacológicamente eficaz” se entiende una cantidad suficiente para producir el efecto fisiológico deseado o una cantidad que puede lograr el resultado deseado, particularmente para el injerto o la supervivencia de un sujeto. El beneficio terapéutico también incluye detener o ralentizar la progresión de la enfermedad o el trastorno subyacente, independientemente de si se consigue una mejora. Dosis farmacológicamente eficaz, tal como se definió anteriormente, también se aplicará a compuestos terapéuticos usados en combinación con las células, tal como se describe adicionalmente a continuación.

El injerto de trasplante de células madre hematopoyéticas puede variar ampliamente en función de la edad, el peso y el estado de salud del paciente, la naturaleza y la gravedad de la indicación. Los intervalos de dosificación adecuados para las HSPC varían según estas consideraciones. Un injerto puede contener de aproximadamente

1 x 106 a aproximadamente 1,0 x 108 HSPC/kg de sujeto. La población de células expandidas puede comprender de aproximadamente 1,0 x 106 a aproximadamente 1,0 x 108 HSPC/kg de sujeto. La población de células expandidas puede comprender aproximadamente 1,0 x 106 HSPC/kg de sujeto. La población de células expandidas puede comprender aproximadamente 2,0 x 106 HSPC/kg de sujeto. La población de células expandidas puede comprender aproximadamente 3,0 x 106 HSPC/kg de sujeto. La población de células expandidas aproximadamente 4,0 x 106 HSPC/kg de sujeto. La población de células expandidas aproximadamente 5,0 x 106 HSPC/kg de sujeto. La población de células expandidas comprende aproximadamente

^{6.0 x}106 sujeto. La población de células expandidas puede comprender aproximadamente

^{7.0 x}106 sujeto. La población de células expandidas puede comprender aproximadamente

^{8.0 x}106 sujeto. La población de células expandidas puede comprender aproximadamente

^{9.0 x}106 sujeto. La población de células expandidas puede comprender aproximadamente

^{1.0 x}107

sujeto. La población de células expandidas puede comprender aproximadamente 2,0 x 107 HSPC/kg de sujeto. La población de células expandidas puede comprender aproximadamente 3,0 x 107 HSPC/kg de sujeto. La población de células expandidas puede comprender aproximadamente 4,0 x 107 HSPC/kg de sujeto. La población de células expandidas puede comprender aproximadamente 5,0 x 107 HSPC/kg de sujeto. La población de células expandidas puede comprender aproximadamente 6,0 x 107 HSPC/kg de sujeto. La población de células expandidas puede comprender aproximadamente 7,0 x 107 HSPC/kg de sujeto. La población de células expandidas puede comprender aproximadamente 8,0 x 107 HSPC/kg de sujeto. La población de células expandidas puede comprender aproximadamente 9,0 x 107 HSPC/kg de sujeto. La población de células expandidas puede comprender aproximadamente 1,0 x 108 HSPC/kg de sujeto.

Una unidad de sangre de cordón es la sangre recogida a partir de una placenta y un cordón umbilical individuales. El número de células nucleadas en una unidad de sangre de cordón varía. Además, el número de células nucleadas en una unidad de sangre de cordón puede ser menor después de la congelación y descongelación. Por tanto, a la hora de administrar HSPC, resulta instructivo comprobar si el recuento de células nucleadas se midió antes o después de descongelar la unidad.

El trasplante de células a un paciente se logra mediante métodos generalmente usados en la técnica. El método de administración preferido es infusión intravenosa. Tal como se describió anteriormente, el número de células transfundidas tendrán en cuenta factores tales como el sexo, la edad, el peso, los tipos de enfermedad o trastorno, el estadio del trastorno, el porcentaje de las células deseadas en la población celular (por ejemplo, la pureza de la población celular) y el número de células necesarias para producir un beneficio terapéutico.

Las células pueden administrarse en una infusión, o a través de infusiones sucesivas a lo largo de un periodo de tiempo definido suficiente para generar un efecto terapéutico. Pueden infundirse diferentes poblaciones de células cuando el tratamiento implica infusiones sucesivas. Puede usarse un portador farmacéuticamente aceptable, tal como se describe adicionalmente a continuación, para la infusión de las células en el paciente. Estos comprenderán normalmente, por ejemplo, solución salina tamponada (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato) o medio de cultivo celular basal no complementado, o un medio tal como se conoce en la técnica.

Los métodos de trasplante de células madre hematopoyéticas descritos en el presente documento pueden usarse para el tratamiento de diversos trastornos. En algunas realizaciones, el trastorno se refiere a deficiencias en la hematopoyesis provocada por enfermedad o tratamientos mieloablativos. En algunas realizaciones, el trastorno es una enfermedad hematopoyética. En algunas realizaciones, el trastorno es un trastorno que requiere trasplante de células madre hematopoyéticas de médula ósea. En algunas realizaciones, el trastorno es una inmunodeficiencia infecciosa o genética. En algunas realizaciones, el trastorno es una inmunodeficiencia infecciosa. En algunas realizaciones, el trastorno es VIH. En algunas realizaciones, el trastorno es una inmunodeficiencia genética. En algunas realizaciones, el trastorno es una enfermedad hematológica, incluyendo enfermedades infecciosas/enfermedades genéticas que afectan a las células T (por ejemplo, VIH, SCID, respectivamente) y enfermedades genéticas que afectan a los eritrocitos (hemoglobinopatías). En algunas realizaciones, el trastorno es una anemia. En algunas realizaciones, el trastorno es anemia de Fanconi. En algunas realizaciones, el trastorno es una neoplasia maligna hematopoyética. Tal como se usa en el presente documento, “tratamiento” se refiere a tratamiento terapéutico o profiláctico, o una medida supresora para la enfermedad, el trastorno o la afección indeseable. Tratamiento abarca la administración de las células del sujeto en una forma apropiada antes de la aparición de síntomas de la enfermedad y/o después de manifestaciones clínicas, u otras manifestaciones de la enfermedad o afección para reducir la gravedad de la enfermedad, detener la progresión de la enfermedad o eliminar la enfermedad. Prevención de la enfermedad incluye prolongar o retardar la aparición de síntomas del trastorno o la enfermedad, preferiblemente en un sujeto con una susceptibilidad aumentada al trastorno. El sujeto puede ser un ser humano.

La divulgación proporciona además métodos potenciados de HSCT en el campo del trasplante de órganos sólidos, células o tejidos. A modo de ejemplo, pero no como una limitación, la divulgación proporciona además HSPC expandidas con células endoteliales para su uso en el trasplante de corazón, pulmón, hígado, riñón, células de islotes, piel, órganos endocrinos o páncreas.

El recuento de plaquetas en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 20.000/|il en de aproximadamente 15 días a aproximadamente 35 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento de plaquetas en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 20.000/|il en de aproximadamente 20 días a aproximadamente 30 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento de plaquetas en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 20.000/|il en aproximadamente 20 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento de plaquetas en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 20.000/|il en aproximadamente 21 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento de plaquetas en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 20.000/|il en aproximadamente 22 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento de plaquetas en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 20.000/|il en aproximadamente 23 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento de plaquetas en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 20.000/|il en aproximadamente 24 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento de plaquetas en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 20.000/|il en aproximadamente 25 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento de plaquetas en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 20.000/|il en aproximadamente 26 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento de plaquetas en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 20.000/|il en aproximadamente 27 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento de plaquetas en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 20.000/|il en aproximadamente 28 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento de plaquetas en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 20.000/|il en aproximadamente 29 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento de plaquetas en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 20.000/|il en aproximadamente 30 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto.

El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 100/|il en de aproximadamente 5 días a aproximadamente 20 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 100/|il en aproximadamente 5 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 100/|il en aproximadamente 6 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 100/|il en aproximadamente 7 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 100/|il en aproximadamente 8 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 100/|il en aproximadamente 9 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 100/|il en aproximadamente 10 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 100/|il en aproximadamente 11 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 100/|il en aproximadamente 12 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 100/|il en aproximadamente 13 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 100/|il en aproximadamente 14 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 100/|il en aproximadamente 15 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 100/|il en aproximadamente 16 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 100/|il en aproximadamente 17 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 100/|il en aproximadamente 18 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 100/|il en aproximadamente 19 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 100/|il en aproximadamente 20 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto.

El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en de aproximadamente 10 días a aproximadamente 25 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 10 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 11 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 12 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 13 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 14 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 15 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 16 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 17 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 18 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 19 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 20 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 21 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 22 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 23 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 24 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 25 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto.

El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|iL en aproximadamente 100 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 200 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 300 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 400 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 500 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 600 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 700 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 800 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 900 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto. El recuento absoluto de neutrófilos en la sangre circulante del sujeto puede ser de al menos aproximadamente 500/|il en aproximadamente 1.000 días después de transfundir la población de células expandidas en el sujeto.

Tratamientos auxiliares que no forman parte de la invención

Pueden usarse una variedad de tratamientos auxiliares con los métodos descritos en el presente documento. Los tratamientos auxiliares pueden incluir, entre otros, agentes antifúngicos, agentes antibacterianos y agentes antivirales.

El agente administrado de manera auxiliar puede ser un agente antifúngico. Las infecciones fúngicas son un problema significativo en pacientes que se han sometido a terapia y HSCT mieloablativos. Los receptores con injerto retardado y los pacientes que desarrollan EICH normalmente tienen un alto riesgo de infecciones fúngicas. Los tipos de infecciones fúngicas son variados, e incluyen, entre otros, candidiasis (por ejemplo, con Candida krusei, Candida glabrata, Candida albicans, Candida tropicalis), aspergilosis (por ejemplo, con Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus), mucormicosis (por ejemplo, con Rhizobium arrhizus, Absidia corymbifera, Rhizomucor pusillus), criptococosis, Histoplasma capsulatum y Coccidioides immitis.

Los agentes antifúngicos para la administración auxiliar serán generalmente un agente antifúngico sistémico. Un agente antifúngico útil de este tipo es la anfotericina B de la familia de antibióticos polieno macrólidos. La anfotericina B está disponible en diversas formulaciones, incluyendo como complejo con desoxicolato; en una suspensión coloidal con sulfato de colestearilo; y encapsulada en liposomas preparados de lecitina de soja, colesterol y diestearoilfosfatidilglicerol, en la técnica se conocen otras formulaciones.

Otro agente antifúngico es la flucitosina, una pirimidina fluorada. La desaminación de la flucitosina por el hongo genera 5-flurouracilo, un antimetabolito e inhibidor de la síntesis de ADN. La flucitosina se usa normalmente para infecciones de criptococos y candiadosis. Aunque se usa sola, la flucitosina se usa generalmente en combinación con anfotericina B.

Los imidazoles y triazoles representan una amplia clase de agentes antifúngicos a base de azol. Se cree que los imidazoles y triazoles inhiben la esterol-14-a-desmetilasa, dando como resultado una biosíntesis deficiente de ergosterol y una interrupción de las actividades basadas en la membrana celular, tales como el transporte de electrones. Los agentes antifúngicos a base de azol son eficaces contra determinados tipos de candiadosis, tales como Candida albicans, Candida glabrata y Candida neoformans. Los agentes antifúngicos de azol adecuados para la administración sistémica incluyen, entre otros, ketoconazol, itraconazol, fluconazol, econazol, voriconazol y terconazol.

Además de infecciones fúngicas, un paciente con neutropenia es susceptible a infección con una variedad de patógenos bacterianos. Los pacientes que se someten a regímenes y HSCT mieloablativos presentan altas tasas de infección bacteriana con bacterias tanto Gram positivas (por ejemplo, Streptococcus y Staphylococcus aureus) como Gram negativas (por ejemplo, E. coli y Pseudomonas aeruginosa). La septicemia es una ocurrencia común. Además, el injerto retardado y el restablecimiento deficiente de las respuestas inmunitarias contra bacterias encapsuladas, tales como Streptococcus pneumoniae o Haemophilus influenza, aumentan la tasa de morbilidad para receptores de trasplante con EICH.

La terapia antibacteriana auxiliar puede usar cualquier antibiótico conocido adecuado para el patógeno bacteriano particular. Estos incluyen tanto antibióticos de amplio espectro como compuestos antibacterianos más dirigidos. Diversas clases de agentes antibacterianos adecuados con las células mieloides expandidas incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, quinolonas y fluoroquinolonas, antibióticos p-lactámicos, aminoglicósidos, tetraciclinas, macrólidos y diversos congéneres de los mismos. Los compuestos de quinolona a modo de ejemplo incluyen ciprofloxacina, ofloxacina, esparfloxacina, lomefloxacina y moxifloxacina. Los antibióticos p-lactámicos a modo de ejemplo incluyen penicilinas (por ejemplo, penicilina G, penicilina V), ampicilina, carbenicilina, meticilina, carbapenémicos y cefalosporinas (por ejemplo, cefalotina, cefamandol, cefaclor, cefonicid, cefotetán, cefatoxima, ceftazidima, ceftizoxima, cefepima). Los aminoglicósidos a modo de ejemplo incluyen neomicina, estreptomicina, kanamicina, gentamicina, tobramicina, amikacina y netilmicina. Los macrólidos a modo de ejemplo incluyen eritromicina, claritromicina, azitromicina y solitromicina. Otros antibióticos resultarán evidentes para el experto en la técnica.

Las infecciones virales también son problemáticas en pacientes sometidos a mieloablación y HSCT mieloablativos. Generalmente, el riesgo aumentado de infección viral resulta de la inmunidad mediada por células deteriorada provocada por la terapia mieloablativa. Muchas de estas infecciones surgen a partir de la reactivación de virus latente existente en un paciente seropositivo o en las células de un donante seropositivo. Los virus habitualmente encontrados incluyen, entre otros, citomegalovirus, virus del herpes simple, virus varicela-zóster, virus del herpes 6, virus de Epstein Barr, adenovirus, y similares. Como agente auxiliar a las infusiones de células, los compuestos antivirales seleccionados son aquellos apropiados para los virus encontrados por el paciente. Los compuestos antivirales útiles incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, aciclovir, cidofovir, ganciclovir, idoxuridina, penciclovir, valganciclovir, valaciclovir, vidarabina, amantadina, rimantadina, zanamivir, fomivirsén, imiquimod y ribavirina. Los productos terapéuticos dirigidos contra retrovirus incluyen, entre otros, inhibidores de transcriptasa inversa de nucleósidos (por ejemplo, zidovudina, didanosina, estavudina, zalcitabina, lamividudina), inhibidores de transcriptasa inversa no de nucleósidos (por ejemplo, nevirapina, efavirenz, delvirudina) e inhibidores de proteasa (por ejemplo, saquinivir, indinavir, ritonavir, nelfinavir, amprenavir y lopinavir).

Los agentes antifúngicos, antibacterianos y antivirales pueden usarse como profilaxis para reducir la aparición de la infección, o tras la aparición de la enfermedad. La profilaxis se indica particularmente para infecciones fúngicas habituales en pacientes inmunodeprimidos y para infecciones virales en pacientes seropositivos o donantes de trasplante seropositivos. Por consiguiente, para los fines terapéuticos, pueden incluirse combinaciones de HSPC, células MP y los compuestos antifúngicos, antibacterianos o antivirales.

El agente administrado de manera auxiliare puede ser una citocina o un factor de crecimiento que potencia la diferenciación y movilización de células mieloides terminalmente diferenciadas, particularmente granulocitos, macrófagos, megacariocitos y células eritroides. Para potenciar el desarrollo de granulocitos, pueden usarse las citocinas C-CSF y GM-CSF. G-CSF es eficaz para acelerar el injerto y la producción de neutrófilos en HSCT. La citocina o el factor de crecimiento puede ser trombopoyetina. La administración de TPO potencia el injerto de células progenitoras trasplantadas y fomenta el desarrollo de megacariocitos y plaquetas (Fox, N et al., J. Clin. Invest.

110:389-394 (2002); Akahori, H. et al., Stem Cells 14(6):678-689 (1996)).

Pueden usarse una variedad de vehículos y excipientes y vías de administración para la terapia auxiliar, tal como resultará evidente para el experto en la técnica. Se enseña una tecnología de formulación representativa en, entre otros, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995) y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a ed, Kibbe, A.H. ed., Washington DC, American Pharmaceutical Association (2000).

Las composiciones farmacéuticas comprenderán generalmente un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad farmacológicamente eficaz de los compuestos, o una mezcla de los mismos, o sales adecuadas de los mismos. La composición farmacéutica puede formularse como polvos, gránulos, disoluciones, suspensiones, aerosoles, sólidos, píldoras, comprimidos, cápsulas, geles, cremas tópicas, supositorios, parches transdérmicos y otras formulaciones conocidas en la técnica.

Tal como se usa en el presente documento, “portador farmacéuticamente aceptable” comprende cualquiera de los portadores farmacéuticamente aceptados convencionales conocidos por los expertos habituales en la técnica para la formulación de composiciones farmacéuticas. Por tanto, los compuestos, por sí mismos, tal como estando presentes como sales farmacéuticamente aceptables, o como conjugados, pueden prepararse como formulaciones en diluyentes farmacéuticamente aceptables; por ejemplo, solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS), etanol acuoso, o disoluciones de glucosa, manitol, dextrano, propilenglicol, aceites (por ejemplo, aceites vegetales, aceites animales, aceites sintéticos, etc.), celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa, hidroxilpropilmetilcelulosa, estearato de magnesio, fosfato de calcio, gelatina, polisorbato 80 o similares, o como formulaciones sólidas en excipientes apropiados.

Las composiciones farmacéuticas a menudo comprenderán además uno o más tampones (por ejemplo, solución salina tamponada neutra o solución salina tamponada con fosfato), hidratos de carbono (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio, hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado, etc.), bacteriostáticos, agentes quelantes tales como EDTA o glutatión, solutos que hacen que la formulación sea isotónica, hipotónica o débilmente hipertónica con la sangre de un receptor, agentes de suspensión, agentes espesantes, conservantes, agentes aromatizantes, agentes edulcorantes y compuestos colorantes, según sea apropiado.

Si bien puede emplearse en las composiciones cualquier portador adecuado conocido por los expertos habituales en la técnica, el tipo de portador variará normalmente dependiendo del modo de administración. Las composiciones terapéuticas pueden formularse para cualquier modo de administración apropiado, incluyendo, por ejemplo, administración oral, nasal, a través de la mucosa, rectal, vaginal, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea e intramuscular.

Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden presentarse en envases de dosis unitaria o de múltiples dosis, tales como ampollas o viales sellados. Tales envases se sellan normalmente de tal manera que conserven la esterilidad y estabilidad de la formulación hasta su uso. En general, las formulaciones pueden almacenarse como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos oleaginosos o acuosos, tal como se indicó anteriormente. Alternativamente, una composición farmacéutica puede almacenarse en condiciones liofilizadas que sólo requieren la adición de un portador líquido estéril inmediatamente antes de su uso.

La cantidad administrada al huésped variará dependiendo de lo que se esté administrando, el propósito de la administración, tal como profilaxis o terapia, el estado del huésped, el modo de administración, el número de administraciones, el intervalo entre administraciones, y similares. Estos pueden determinarse empíricamente por los expertos en la técnica y pueden ajustarse según el grado de respuesta terapéutica. Los factores a considerar para determinar una dosis apropiada incluyen, pero no se limitan a, tamaño y peso del sujeto, edad y sexo del sujeto, gravedad de los síntomas, estadio de la enfermedad, método de administración de los agentes, semivida de los agentes y eficacia de los agentes. El estadio de la enfermedad a considerar incluye si la enfermedad es aguda o crónica, está en fase recidivante o remitente, y la progresión de la enfermedad.

La determinación de las dosificaciones y los momentos de administración para una cantidad terapéuticamente eficaz se encuentran bien dentro de la habilidad del experto habitual en la técnica. Por ejemplo, puede estimarse una dosis eficaz inicial a partir de cultivo celular u otros ensayos in vitro. Luego puede formularse una dosis en modelos animales para generar una concentración circulante o concentración tisular, incluyendo la de la CI⁵⁰tal como se determina mediante ensayos de cultivo celular.

Kits que forman parte de la invención

Los métodos descritos en el presente documento pueden facilitarse mediante un kit para potenciar el injerto de HSPC. Los kits pueden contener células incluyendo, pero sin limitarse a, HSPC, EC, incluyendo células expandidas y/o aisladas, y/o compuestos terapéuticos auxiliares, medios para aislar o expandir las HSPC y las EC, medios para administrar las células a un paciente, o cualquier combinación de los mismos. Los kits pueden comprender opcionalmente cualquiera o la totalidad de un portador farmacéuticamente aceptable, un portador fisiológicamente aceptable, instrucciones para su uso, un envase, un recipiente para la administración, anticuerpos, o cualquier combinación de los mismos. Al kit le acompaña normalmente una etiqueta, e incluye cualquier material escrito o grabado, que puede estar en formato electrónico o legible por ordenador (por ejemplo, disco, disco óptico, chip de memoria o cinta) que proporciona instrucciones u otra información para el uso del contenido del kit.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, biología molecular, cultivo celular, inmunología y similares, que se encuentran dentro de la habilidad de un experto en la técnica. Estas técnicas se dan a conocer completamente en la bibliografía actual, y se hace referencia específicamente a Sambrook, Fritsch and Maniatis eds., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1989); la serie Methods of Enzymology (Academic Press, Inc.); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., eds., (1987).

Ejemplos

Los aspectos de las presentes enseñanzas pueden entenderse adicionalmente a la luz de los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitativos del alcance de las presentes enseñanzas en modo alguno.

Ejemplo 1: Expansión de HSPC con EC no irradiadas

Las EC modificadas por ingeniería E4ORF1+ no irradiadas tienen la capacidad proliferativa para su paso en divisiones 1:4 aproximadamente 15-20 veces en cultivo basado en matraz tradicional. En este método, las EC modificadas por ingeniería E4ORF1+ no irradiadas pueden expandirse hasta cantidades suficientes en recipientes de cultivo de superficie plana hasta la confluencia. La cantidad de células sembradas dependerá de la cantidad de material de partida y la duración de la expansión. Por ejemplo, una expansión de 10 días puede requerir el equivalente de 3 placas de 6 pocillos (cada uno de aproximadamente 35 mm de diámetro). Las EC E4ORF1+ se cultivan en medio de crecimiento completo hasta la confluencia en estos pocillos. En la confluencia, el medio se convierte en medio de acondicionamiento. Después de 24 horas en medio de acondicionamiento, las células CD34+ purificadas, por ejemplo a partir de sangre de cordón umbilical (UCB), pueden sembrarse con citocinas en los pocillos sembrados previamente con EC E4ORF1+, que consisten en 50 ng/ml de cada uno de trombopoyetina (TPO), ligando de tirosina cinasa relacionada con Fms 3 (Flt-3L) y factor de células madre (SCF). Después de dos días, se recoge el medio, se sedimentan las células y se resuspenden en medio que contiene citocinas nuevo y se dispersan en dos pocillos adicionales que se han acondicionado previamente como el primero. El primer pocillo, denominado “pocillo madre” o “matraz madre”, también se realimenta con medio que contiene citocinas adicional. Este procedimiento se repite cada dos días hasta el día 10. En este punto, todos los pocillos contienen HSPC y EC E4ORF1+ expandidas. En algunos casos, puede utilizarse un biorreactor, tal como un biorreactor de fibras huecas. Las fibras huecas pueden prepararse, recubrirse, acondicionarse (por ejemplo, según las instrucciones del fabricante) y sembrarse con aproximadamente 5*10⁷EC E4ORF1+ en medio de crecimiento completo. El biorreactor “alimenta” las células y puede permitir la expansión durante 6 días. En este punto, con el biorreactor cercano a la confluencia, se reemplaza el medio por medio de acondicionamiento sin citocinas para desplazar el suero (por ejemplo, suero bovino fetal (FBS)), que de otro modo podría impulsar la diferenciación prematura de las HSPC. Después de 24 horas, las EC E4ORF1+ están listas para aceptar las HSPC. Las muestras de UCB pueden almacenarse congeladas como producto agotado en glóbulos rojos (RBC) en dimetilsulfóxido (DMSO). Este material celular se lava antes de la purificación de una población CD34+ primitiva y la expansión. Con el fin de lograr esto, la muestra se descongela en un baño de perlas a 37°C. Tras la inspección visual para detectar el hielo restante, la unidad se suelda en condiciones estériles a las partes fluídicas de un dispositivo Miltenyi Prodigy o un sistema similar. Las células se incuban en este momento con ADNasa, ya que el contenido de ácido nucleico de cualquier célula no viable después de la descongelación puede dar como resultado la formación de grumos y viscosidad. El dispositivo Miltenyi Prodigy, o un dispositivo comparable, puede lavar las células para retirar el crioconservante y agotar adicionalmente la muestra de RBC. Mientras aún están en el dispositivo Miltenyi Prodigy, las células se incuban con microperlas CD34 para purificar las HSPC. Finalmente, se realizan etapas de lavado. Luego se inyectan las células CD34+ unidas a microperlas en un dispositivo Miltenyi CliniMacs o dispositivo similar para la purificación magnética de las células CD34⁺marcadas. Se espera una recuperación del 50-70% de las células CD34⁺disponibles.

Luego se inyecta la fracción CD34+ purificada en un total de 200 ml de medio de expansión de HSPC complementado con citocinas, SCF, TPO y Flt3L a 50 ng/ml cada uno. Luego se introduce este medio en el biorreactor en la misma cámara interior que las EC modificadas por ingeniería E4ORF1+ (día 0 de la expansión). Durante toda la expansión, el medio de expansión de HSPC (sin citocinas) se suministra de manera continua a través de la cámara exterior a una velocidad de aproximadamente 0,4 ml/min para el intercambio de metabolitos y circula a una velocidad de aproximadamente 30 ml/min en un buble de recirculación, que incluye un módulo de intercambio de gases suministrado con el 90% de N², el 5% de O²y el 5% de CO^2.Además, el día 2 y el día 4 de la expansión, se añade a la cámara interior un bolo de 200 ml de medio de expansión de HSPC complementado con citocinas, SCF, TPO y Flt3L a 50 ng/ml cada uno. Se detiene la expansión después del día 6 de la expansión, punto en el que se recoge todo el material celular.

Ejemplo 2: Expansión de HSPC con EC irradiadas

Las EC modificadas por ingeniería E4ORF1+ son totalmente competentes para expandir las HSPC después de recibir un estímulo de inactivación mitótica, tal como radiación o mitomicina C. Para utilizar las células después de la inactivación mitótica, el estímulo de inactivación mitótica se administra cuando las células se encuentran en su recipiente de cultivo final en la confluencia y se les permiten 24 horas de recuperación en medio completo antes del cambio al medio de acondicionamiento. Para el uso de células mitóticamente inactivadas en biorreactores, las EC modificadas por ingeniería E4ORF1+, o EC modificadas por ingeniería ETV2+E4ORF1+, o EC modificadas por ingeniería E4ORF1+ E4ORF6+, se hacen crecer hasta que hay aproximadamente 1000 millones de células. Las células pueden crioconservarse después del tratamiento con el estímulo de inactivación mitótica. Luego se inyecta toda la muestra de EC mitóticamente inactivadas en el biorreactor y se permite su adhesión durante 24 horas. El acondicionamiento del medio continúa durante 24 horas adicionales. Luego se introducen las células CD34+, a partir de UCB, por ejemplo, en el mismo compartimento del biorreactor que las EC modificadas por ingeniería E4ORF1 complementado con citocinas (50 ng/ml de TPO, Flt-3L, SCF). A partir de este punto, las células no se disocian entre sí. Los días 2 y 4, se suministra un bolo de 200 ml de medio complementado con citocinas. Las condiciones de recogida y todas las demás condiciones son las mismas que en el ejemplo 1.

Ejemplo 3: Ensayos de UFC

Las unidades formadoras de colonias o “UFC” son un medio para determinar la troncalidad (“stemness") de las células en un modelo in vitro. Se siembran un número conocido de células en un matraz de cultivo recubierto con metilcelulosa con un medio definido (es decir, Methocult). Después de dos semanas, se forman colonias que tienen morfologías definidas por presuntas células madre. Estas colonias pueden cuantificarse y pueden usarse para proporcionar una determinación de las HSPC dentro de una población dada. Las tasas de expansión de las HSPC fueron más altas en el biorreactor, seguido de la expansión basada en matraz con las EC E4ORF1+, y las expansiones con citocinas solas proporcionaron la cantidad más baja de expansión de HSPC (véase la figura 7). Ejemplo 4: Citometría de flujo

Se analizaron todas las células hematopoyéticas, ya sean de sangre de cordón umbilical recién aislada (sin manipular), de células expandidas con citocinas solas durante 6 días, de células expandidas en EC E4ORF1+ en un matraz durante 6 días, o de células expandidas en EC E4ORF1+ en un biorreactor de fibras huecas durante 6 días, a través de citometría de flujo. Las poblaciones de células se tiñeron para CD34, CD45 y CD38, simultáneamente. Cada parámetro pudo distinguirse a través de los fluoróforos únicos conjugados con los anticuerpos específicos de esos antígenos de superficie celular. Las células CD45- se identificaron como las EC modificadas por ingeniería E4ORF1+. CD45 es un marcador pan-hematopoyético. Las células CD45+ CD34+ comprenden una población más primitiva de HSPC dentro de la población CD45+ total, en comparación con las células CD45+ CD34-. Las células CD45+ CD34+ CD38- comprenden una población de HSPC incluso más primitiva. Las tasas de expansión de estas poblaciones primitivas fueron consistentemente más altas en el biorreactor, seguido de la expansión basada en matraz con las EC modificadas por ingeniería E4ORF1+, y el tratamiento con citocinas solas proporcionó la cantidad más baja de expansión.

Ejemplo 4: Trasplante de HSPC expandidas

Las HSPC expandidas mediante el contacto continuo con EC modificadas por ingeniería E4ORF1+ pueden producir un producto que puede injertarse superior, por ejemplo, en comparación con las HSPC obtenidas a través de expansiones en las que las interacciones se ven interrumpidas por los pases en serie y la resiembra de las HSPC. Al eliminar esta interrupción, las HSPC expandidas en esta novedosa manera pueden conducir a un injerto más rápido de los linajes linfoide, mieloide y eritroide, lo que da como resultado que sus recuentos en sangre respectivos regresen más rápido después de la mieloablación. Esto también debe mejorar el injerto a largo plazo, ya que se plantea la hipótesis de que el uso de EC modificadas por ingeniería E4ORF1+ para la expansión conserva las células madre en repoblación a largo plazo. La expansión mediante el contacto continuo con EC modificadas por ingeniería E4ORF1+ también puede dar como resultado la generación de suficiente material de HSPC para que un adulto reciba un injerto de una única unidad de UCB a partir de un único donante, o incluso múltiples transfusiones del injerto en un único adulto, o para múltiples transfusiones a partir de un único donante de UCB en múltiples adultos. El injerto rápido esperado también puede dar como resultado una gama de otros beneficios, incluyendo posible reducción de las estancias hospitalarias, menores tasas de EICH de todos los estadios, disminución de los niveles de recidiva, disminución de la mortalidad relacionada con el trasplante (TRM), disminución del riesgo de infección, reducción de los incidentes por fallo de injerto, capacidad de usar donaciones más pequeñas de sangre de cordón que de otro modo serían inutilizables, mayor acceso a las donaciones de UCB para sangre de cordón de tipo HLA raro, reducción global en el coste del tratamiento, mayor esperanza de vida para los receptores del trasplante y/o aumento de la calidad de vida de los receptores del trasplante.

Las descripciones anteriores de realizaciones específicas de la presente invención se han presentado con propósitos de ilustración y descripción. No se pretende que sean exhaustivas ni que limiten la invención a las formas precisas dadas a conocer, y obviamente son posibles muchas modificaciones y variaciones a la luz de las enseñanzas anteriores. Las realizaciones se eligieron y describieron con el fin de explicar mejor los principios de la invención y su aplicación práctica, para permitir de ese modo que otros expertos en la técnica utilicen mejor la invención y diversas realizaciones con diversas modificaciones según se adapten al uso particular contemplado.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una población de células progenitoras o madre hematopoyéticas (HSPC) y células endoteliales (EC), en el que el método comprende poner en contacto HSPC con células endoteliales (EC) de vena umbilical humanas modificadas por ingeniería E4ORF1+ en un biorreactor de sistema cerrado y cultivar las HSPC y las EC en el biorreactor en condiciones que permitan la expansión de las HSPC, en el que (a) las HSPC y las EC están presentes simultáneamente en el mismo medio durante todo el procedimiento de cultivo y (b) en ningún momento durante el procedimiento de cultivo las HSPC se retiran a partir del medio de expansión para poner en contacto las HSPC con EC adicionales, y (c) no hay ninguna etapa de purificación para retirar las EC a partir de las HSPC, de manera que se mantiene una interacción continua entre las HSPC y las EC, produciendo de ese modo una población de HSPC y EC de vena umbilical humanas modificadas por ingeniería E4ORF1+.

2. El método según la reivindicación 1, en el que el biorreactor de sistema cerrado comprende fibras huecas.

3. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que las EC son EC modificadas por ingeniería E4ORF1+ ETV2+.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que las HSPC proceden de médula ósea, sangre periférica o sangre de cordón.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que las HSPC tienen genes modificados.

6. Una composición que comprende una población de HSPC y EC de vena umbilical humanas modificadas por ingeniería E4ORF1+ para su uso en el trasplante de células madre en un sujeto que lo necesita, en la que la población de HSPC y EC de vena umbilical humanas modificadas por ingeniería E4ORF1+ se produce usando el método según cualquier reivindicación anterior.

7. La composición para su uso según la reivindicación 6, en la que el sujeto tiene una deficiencia en hematopoyesis provocada por un tratamiento mieloablativo, o un trastorno seleccionado de: una enfermedad hematológica, un trastorno que requiere trasplante de células madre hematopoyéticas de médula ósea, una inmunodeficiencia infecciosa, una enfermedad infecciosa que afecta a las células T, VIH, una inmunodeficiencia genética, inmunodeficiencia combinada grave, una enfermedad genética que afecta a los eritrocitos, una anemia y anemia de Fanconi.

8. La composición para su uso según la reivindicación 6, en la que las HSPC son alogénicas con respecto al sujeto.

9. La composición para su uso según la reivindicación 6, en la que las HSPC son autólogas con respecto al sujeto.