ES2939384T3 - Método de síntesis de inmunoconjugados - Google Patents

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Michael N Alonso
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Richard P Laura
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Abstract

Un método para producir un inmunoconjugado, comprendiendo el método combinar uno o más compuestos de fórmula I y un anticuerpo de fórmula II, en el que la fórmula II es un anticuerpo con uno o más residuos de lisina, en una solución acuosa tamponada a un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 9 hasta que al menos el 33% en moles de uno o más compuestos de fórmula I se conjuga con el anticuerpo de fórmula II para proporcionar el inmunoconjugado de fórmula III, en el que Adj es un adyuvante, Z es -CH2-, -C(O) NH-, -C(O)O- o -C(O)-, L es un enlazador, E es un éster y r es el número medio de adyuvantes unidos al anticuerpo y es un número positivo hasta aproximadamente 8 , en una primera solución acuosa tamponada. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método de síntesis de inmunoconjugados
En el presente documento se incorpora mediante referencia en su totalidad un listado de secuencias de nudeótidos/aminoácidos legible por ordenador presentado simultáneamente con el mismo e identificado de la siguiente manera: un archivo de ASCII (texto) de 803 bytes llamado “SequenceListing.txt”, creado el 16 de abril de 2018.
Antecedentes de la invención
El cáncer sigue siendo una gran preocupación para la salud. Desafortunadamente, a menudo el sistema inmunitario no es capaz de controlar el crecimiento y la diseminación del cáncer porque el sistema inmunitario no puede reconocer las células cancerosas como diana. La inmunotolerancia puede superarse mediante la administración de neoantígenos a las células dendríticas a través de inmunocomplejos anticuerpo-tumor (Carmi et al., Nature, 521: 99-104 (2015)).
La administración simultánea de anticuerpos antitumorales y adyuvantes puede ser eficaz para tratar tumores y para ampliar las opciones de tratamiento para los pacientes con cáncer y otros sujetos. Un modo eficaz para administrar simultáneamente anticuerpos de unión a tumores e inmunoadyuvantes es mediante la conjugación de los anticuerpos y los adyuvantes para formar inmunoconjugados. Existen varios métodos que pueden usarse para producir tales inmunoconjugados.
En la patente estadounidense n.° 8.951.528 se describen ejemplos de métodos que pueden usarse para producir inmunoconjugados. Los métodos de síntesis descritos en ese documento presentan muchos inconvenientes. Los métodos de síntesis son ineficientes, ya que requieren varias etapas de síntesis complejas y cantidades sustanciales de grupo de unión y adyuvantes para crear los inmunoconjugados. Los métodos de síntesis también presentan rendimientos globales deficientes. Además, los métodos de síntesis producen productos que se agregan entre sí. Y lo que es más importante, los inmunoconjugados producidos mediante los métodos de síntesis son menos eficaces, por ejemplo, activan menos eficazmente las células mieloides para una concentración dada.
Otro método para preparar inmunoconjugados implica modificar un anticuerpo con un agente de reticulación de S-acetiltioacetato de N-succinimidilo (“SATA”). A continuación, el anticuerpo modificado con SATA puede conjugarse con un adyuvante modificado (por ejemplo, un adyuvante modificado con 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo [“SMCC”] que proporciona grupos maleimida reactivos con tiol) para formar los inmunoconjugados. Aunque este método proporciona inmunoconjugados deseables con rendimientos satisfactorios, este método presenta varios inconvenientes. El propio anticuerpo debe modificarse antes de que pueda conjugarse, por lo que se requiere al menos un procedimiento de conjugación de dos etapas. En el método de SATA, los grupos tiol deben añadirse a las cadenas laterales de lisina de los anticuerpos. La adición de los grupos tiol no sólo añade una etapa adicional, sino que también puede disminuir la estabilidad del inmunoconjugado y conducir a una agregación no deseable de los inmunoconjugados. Además, aparte de los inmunoconjugados deseados, este procedimiento de conjugación proporciona los “contaminantes” no deseados (1) anticuerpos modificados con SATA no unidos a un adyuvante y (2) adyuvantes modificados con SMCC no unidos a anticuerpos.
Por tanto, sigue existiendo la necesidad de nuevos métodos para preparar inmunoconjugados. La invención aborda esta y otras necesidades.
El documento WO 2015/103989 A1 se refiere a compuestos para inmunoterapia dirigida y al uso de los compuestos en el tratamiento de enfermedades tales como cáncer.
El documento WO 2015/103990 A1 se refiere a compuestos para inmunoterapia dirigida y al uso de los compuestos en el tratamiento de enfermedades tales como tumores que expresan EGFR.
El documento WO 2015/103987 A1 se refiere a compuestos para inmunoterapia dirigida y al uso de los compuestos en el tratamiento de enfermedades tales como tumores positivos para HER2.
Breve sumario de la invención
La invención proporciona un método para producir un inmunoconjugado de un adyuvante y un anticuerpo. El método comprende combinar uno o más compuestos de fórmula I
Figure imgf000003_0001
y un anticuerpo de fórmula II
Figure imgf000003_0002
en el que la fórmula II es un anticuerpo con residuo
Figure imgf000003_0003
que representa uno o mas residuos de lisina del anticuerpo, en una disolución acuosa tamponada a un pH de 7,5 a 9 hasta que al menos el 33% en mol del uno o más compuestos de fórmula I se conjuga con el anticuerpo de fórmula II para proporcionar el inmunoconjugado de fórmula III
Figure imgf000003_0004
en la que Ady es un adyuvante, Z es -CH2-, - C(O)NH-, -C(O)O- o -C(O)-, L es un grupo de unión, E es un éster, y r es el número promedio de adyuvantes unidos al anticuerpo y es un número positivo hasta aproximadamente 8, en una disolución acuosa tamponada.
Breve descripción de las varias vistas del/de los dibujo(s)
La figura 1A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB5 sintetizado usando el método de SATA.
La figura 1B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB5 sintetizado usando el método de éster.
La figura 2A muestra un análisis por cromatografía de exclusión molecular del inmunoconjugado BB5 sintetizado usando el método de SATA.
La figura 2B muestra un análisis por cromatografía de exclusión molecular del inmunoconjugado BB5 sintetizado usando el método de éster.
La figura 3 muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB1 sintetizado usando el método de éster.
La figura 4 muestra un análisis por cromatografía de exclusión molecular del inmunoconjugado BB1 sintetizado usando el método de éster.
La figura 5 muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB4 sintetizado usando el método de éster.
La figura 6 muestra un análisis por cromatografía de exclusión molecular del inmunoconjugado BB4 sintetizado usando el método de éster.
La figura 7 muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB2 sintetizado usando el método de éster.
La figura 8 muestra un análisis por cromatografía de exclusión molecular del inmunoconjugado BB2 sintetizado usando el método de éster.
La figura 9A muestra que BB5 y BB2 sintetizados usando el método de éster provocan la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por disminución de CD14 mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 9B muestra que BB5 y BB2 sintetizados usando el método de éster provocan la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por disminución de CD16 mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 9C muestra que BB5 y BB2 sintetizados usando el método de éster provocan la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por incremento de CD40 mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 9D muestra que BB5 y BB2 sintetizados usando el método de éster provocan la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por incremento de CD86 mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 9E muestra que BB5 y BB2 sintetizados usando el método de éster provocan la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por incremento de CD123 mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 9F muestra que BB5 y BB2 sintetizados usando el método de éster provocan la activación de mieloides tal como se indica mediante antígeno leucocitario humano-relacionado al antígeno D o “HLA-DR” mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 10A muestra que BB5 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por disminución de CD14 mientras que los inmunoconjugados IRM1 e IRM2 comparativos no lo hacen. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 10B muestra que BB5 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por disminución de CD16 mientras que los inmunoconjugados IRM1 e IRM2 comparativos no lo hacen. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 10C muestra que BB5 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por incremento de CD40 mientras que los inmunoconjugados IRM1 e IRM2 comparativos no lo hacen. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 10D muestra que BB5 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por incremento de CD86 mientras que los inmunoconjugados IRM1 e IRM2 comparativos no lo hacen. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 10E muestra que BB5 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por incremento de CD123 mientras que los inmunoconjugados IRM1 e IRM2 comparativos no lo hacen. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 10F muestra que BB5 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por incremento de HLA-DR mientras que los inmunoconjugados IRM1 e IRM2 comparativos no lo hacen. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 11A muestra que BB5 provoca la secreción de citocinas (IL-1P) mientras que los inmunoconjugados IRM1 e IRM2 comparativos no lo hacen. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control. La figura 11B muestra que BB5 provoca la secreción de citocinas (IL-6) mientras que los inmunoconjugados IRM1 e IRM2 comparativos no lo hacen. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control. La figura 11C muestra que BB5 provoca la secreción de citocinas (TNFa ) mientras que los inmunoconjugados IRM1 e IRM2 comparativos no lo hacen. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control. La figura 12A muestra un análisis por cromatografía de exclusión molecular del inmunoconjugado BB6 sintetizado usando el método de éster.
La figura 12B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB6 sintetizado usando el método de éster.
La figura 13A muestra un análisis por cromatografía de exclusión molecular del inmunoconjugado BB7 sintetizado usando el método de éster.
La figura 13B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB7 sintetizado usando el método de éster.
La figura 14A muestra un análisis por cromatografía de exclusión molecular del inmunoconjugado BB8 sintetizado usando el método de éster.
La figura 14B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB8 sintetizado usando el método de éster.
La figura 15A muestra un análisis por cromatografía de exclusión molecular del conjugado comparativo IRM1. La figura 15B muestra un análisis por cromatografía de exclusión molecular del conjugado comparativo IRM2. La figura 16A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del conjugado IRM1 tras una desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 16B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del conjugado BB5 tras una desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 17A muestra un análisis por cromatografía de exclusión molecular del inmunoconjugado BB9 sintetizado usando el método de éster.
La figura 17B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB9 sintetizado usando el método de éster.
La figura 18A muestra un análisis por cromatografía de exclusión molecular del inmunoconjugado BB10 sintetizado usando el método de éster.
La figura 18B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB10 sintetizado usando el método de éster.
La figura 19A muestra un análisis por cromatografía de exclusión molecular del inmunoconjugado BB11 sintetizado usando el método de éster.
La figura 19B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB11 sintetizado usando el método de éster.
La figura 20A muestra un análisis por cromatografía de exclusión molecular del inmunoconjugado BB12 sintetizado usando el método de éster.
La figura 20B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB12 sintetizado usando el método de éster.
La figura 21 muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB13 sintetizado usando el método de éster.
La figura 22 muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB14 sintetizado usando el método de éster.
La figura 23A muestra que BB1 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por disminución de CD14 mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 23B muestra que BB1 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por incremento de CD40 mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 23C muestra que BB1 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por incremento de CD86 mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 23D muestra que BB1 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por incremento de HLA-DR mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 24A muestra que BB4 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por disminución de CD14 mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 24B muestra que BB4 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por incremento de CD40 mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 24C muestra que BB4 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por incremento de CD86 mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 24D muestra que BB7 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por incremento de HLA-DR mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 25A muestra que BB7 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por disminución de CD14 mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 25B muestra que BB7 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por incremento de CD40 mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 25C muestra que BB7 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por incremento de CD86 mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 25D muestra que BB7 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por incremento de HLA-DR mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 26A muestra que BB9 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por disminución de CD14 mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 26B muestra que BB9 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por incremento de CD40 mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 26C muestra que BB9 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por incremento de CD86 mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 26D muestra que BB9 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por incremento de HLA-DR mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 27A muestra que BB10 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por disminución de CD14 mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 27B muestra que BB10 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por incremento de CD40 mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 27C muestra que BB10 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por incremento de CD86 mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 27D muestra que BB10 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante la regulación por incremento de HLA-DR mientras que el control no lo hace. CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado usado como control.
La figura 28 muestra la razón de fármaco con respecto a anticuerpo (“DAR”) de un inmunoconjugado sintetizado usando solución salina tamponada con citrato (pH 6,5) e incubado a 40°C, en función del tiempo.
La figura 29 muestra la DAR de un inmunoconjugado sintetizado usando solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) e incubado a 40°C, en función del tiempo.
La figura 30 muestra la DAR de un inmunoconjugado sintetizado usando solución salina tamponada con borato (pH 8,3) e incubado a 40°C, en función del tiempo.
La figura 31 muestra la concentración de ácido libre de un inmunoconjugado sintetizado usando solución salina tamponada con citrato (pH 6,5) e incubado a 40°C, en función del tiempo.
La figura 32 muestra la concentración de ácido libre de un inmunoconjugado sintetizado usando solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) e incubado a 40°C, en función del tiempo.
La figura 33 muestra la concentración de ácido libre de un inmunoconjugado sintetizado usando solución salina tamponada con borato (pH 8,3) e incubado a 40°C, en función del tiempo.
Descripción detallada de la invención
La invención proporciona un método para producir un inmunoconjugado de un adyuvante y un anticuerpo. El método comprende combinar uno o más compuestos de fórmula I
Figure imgf000007_0001
y un anticuerpo de fórmula II
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en el que la fórmula II es un anticuerpo con residuo
Figure imgf000007_0003
que representa uno o más residuos de lisina del anticuerpo, en una disolución acuosa tamponada a un pH de 7,5 a 9 hasta que al menos el 33% en mol del uno o más compuestos de fórmula I se conjuga con el anticuerpo de fórmula II para proporcionar el inmunoconjugado de fórmula III
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en la que Ady es un adyuvante, Z es -CH2-, - C(O)NH-, -C(O)O- o -C(O)-, L es un grupo de unión, E es un éster, y r es el número promedio de adyuvantes unidos al anticuerpo y es un número positivo hasta aproximadamente 8, en una disolución acuosa tamponada.
El método de producción de la invención proporciona una síntesis mejorada de inmunoconjugados, por ejemplo, al proporcionar un procedimiento sencillo de una sola etapa para la conjugación de anticuerpo-adyuvante. El método simplificado permite que el adyuvante modificado se conjugue directamente a la cadena lateral de lisina del anticuerpo. El método de producción de la invención puede aumentar significativamente el rendimiento del inmunoconjugado deseado (por ejemplo, rendimientos del 80% en comparación con rendimientos del 50%-60% o menos usando los métodos previos). El método de producción de la invención puede disminuir la cantidad de impurezas, lo que reduce la necesidad de etapas de purificación posteriores que reducen el rendimiento. El método de producción de la invención puede producir inmunoconjugados que tienen menos probabilidades de agregación y son más estables que los inmunoconjugados producidos usando los métodos previos. El método de producción de la invención puede permitir el uso de grupos de unión que conservan más actividad del adyuvante tras la conjugación. El método de la invención puede proporcionar un inmunoconjugado con una razón de fármaco (adyuvante) con respecto a anticuerpo (DAR) deseable.
La presente divulgación también proporciona inmunoconjugados particulares de un adyuvante y un anticuerpo, incluyendo los inmunoconjugados preparados según el método de producción de la invención, así como composiciones que comprenden tales inmunoconjugados. La presente divulgación proporciona además un inmunoconjugado según la presente divulgación para su uso en el tratamiento de cáncer.
Definiciones
Tal como se usa en el presente documento, el término “inmunoconjugado” se refiere a un anticuerpo que se une de manera covalente a un resto de adyuvante a través de un grupo de unión.
Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a un polipéptido que comprende una región de unión a antígeno (incluyendo las regiones determinantes de complementariedad (c Dr )) de un gen de inmunoglobulina o fragmentos del mismo que se une específicamente a y reconoce un antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como numerosos genes de región variable de inmunoglobulina.
Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) a modo de ejemplo comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena “ligera” (aproximadamente 25 kDa) y una cadena “pesada” (aproximadamente 50-70 kDa). El extremo N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos, principalmente responsable del reconocimiento de antígeno. Los términos cadena ligera variable (Vl) y cadena pesada variable (Vh) se refieren a esas cadenas ligeras y pesadas respectivamente. Las cadenas ligeras se clasifican o bien como kappa o bien como lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Los anticuerpos IgG son moléculas grandes de aproximadamente 150 kDa compuestas por cuatro cadenas peptídicas. Los anticuerpos IgG contienen dos cadenas pesadas de clase y idénticas de aproximadamente 50 kDa y dos cadenas ligeras idénticas de aproximadamente 25 kDa, por tanto una estructura cuaternaria tetramérica. Las dos cadenas pesadas están unidas entre sí y a una cadena ligera cada una mediante enlaces disulfuro. El tetrámero resultante tiene dos mitades idénticas, que juntas forman la forma similar a Y. Cada extremo de la bifurcación contiene un sitio de unión a antígeno idéntico. Hay cuatro subclases de IgG (IgG1, 2, 3 y 4) en seres humanos, denominadas en el orden de su abundancia en suero (siendo IgG1 la más abundante). Normalmente, la región de unión a antígeno de un anticuerpo será la más crítica en cuanto a especificidad y afinidad de unión.
Los anticuerpos existen, por ejemplo, como inmunoglobulinas intactas o como varios fragmentos bien caracterizados producidos mediante digestión con diversas peptidasas. Por tanto, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces disulfuro en la región bisagra para producir F(ab)'2, un dímero de Fab que por sí mismo es una cadena ligera unida a Vh-Ch1 mediante un enlace disulfuro. El F(ab)'2 puede reducirse en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región bisagra, convirtiendo de ese modo el dímero F(ab)'2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente Fab con parte de la región bisagra (véase Fundamental Immunology (Paul ed., 7e ed. 2012). Aunque diversos fragmentos de anticuerpo se definen en cuanto a la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que tales fragmentos pueden sintetizarse de novo o bien químicamente o bien mediante el uso de metodología de ADN recombinante. Por tanto, el término anticuerpo, tal como se usa en el presente documento, también incluye fragmentos de anticuerpo o bien producidos mediante la modificación de anticuerpos completos, o bien aquellos sintetizados de novo usando metodologías de ADN recombinante (por ejemplo, Fv de cadena sencilla), o bien aquellos identificados usando bibliotecas de presentación en fago (véase, por ejemplo, McCafferty, et al., Nature, 348: 552-554 (1990)).
El término “anticuerpo” se usa en el sentido más amplio y específicamente cubre anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad biológica deseada. “Fragmento de anticuerpo”, y todas las variantes gramaticales del mismo, tal como se usan en el presente documento, se definen como una porción de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de unión a antígeno o la región variable del anticuerpo intacto, en el que la porción está libre de los dominios de cadena pesada constantes (es decir, CH2, CH3 y CH4, dependiendo del isotipo del anticuerpo) de la región Fc del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 y Fv; diacuerpos; nanocuerpos de camélido (VHH); cualquier fragmento de anticuerpo que sea un polipéptido que tiene una estructura primaria que consiste en una secuencia ininterrumpida de residuos de aminoácido contiguos (denominado en el presente documento “fragmento de anticuerpo de cadena sencilla” o “polipéptido de cadena sencilla”), incluyendo sin limitación (1) moléculas de Fv de cadena sencilla (scFv); (2) polipéptidos de cadena sencilla que contienen sólo un dominio variable de cadena ligera, o un fragmento de los mismos que contiene las tres CDR del dominio variable de cadena ligera, sin un resto de cadena pesada asociado; (3) polipéptidos de cadena sencilla que contienen sólo una región variable de cadena pesada, o un fragmento de los mismos que contiene las tres CDR de la región variable de cadena pesada, sin un resto de cadena ligera asociado; (4) nanocuerpos que comprenden dominios únicos de Ig de especies no humanas u otros módulos de unión a dominio único específicos; y (5) estructuras multiespecíficas o multivalentes formadas a partir de fragmentos de anticuerpo. En un fragmento de anticuerpo que comprende una o más cadenas pesadas, la(s) cadena(s) pesada(s) puede(n) contener cualquier secuencia de dominio constante (por ejemplo, CH1 en el isotipo IgG) hallada en una región distinta de Fc de un anticuerpo intacto, y/o puede(n) contener cualquier secuencia de región bisagra hallada en un anticuerpo intacto, y/o puede(n) contener una secuencia de cremallera de leucinas fusionada con o situada en la secuencia de región bisagra o la secuencia de dominio constante de la(s) cadena(s) pesada(s).
Tal como se usa en el presente documento, el término “epítopo” significa cualquier determinante antigénico en un antígeno al que se une el sitio de unión a antígeno, también denominado parátopo, de un anticuerpo. Los determinantes epitópicos habitualmente consisten en agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y habitualmente presentan características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.
Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácido. Los términos también se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácido son un mimético químico artificial de un aminoácido que se produce de manera natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos que se producen de manera natural y polímeros de aminoácidos que no se producen de manera natural.
Tal como se usa en el presente documento, el término “adyuvante” se refiere a una sustancia capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto expuesto al adyuvante. El término “resto de adyuvante” se refiere a un adyuvante que se une de manera covalente a un anticuerpo tal como se describe en el presente documento. El resto de adyuvante puede provocar la respuesta inmunitaria mientras está unido al anticuerpo o después de la escisión (por ejemplo, escisión enzimática) a partir del anticuerpo tras la administración de un inmunoconjugado al sujeto.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “receptor de tipo Toll” y “TLR” se refieren a cualquier miembro de una familia de proteínas de mamífero altamente conservadas que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos y actúan como elementos de señalización clave en la inmunidad innata. Los polipéptidos TLR comparten una estructura característica que incluye un dominio extracelular que tiene repeticiones ricas en leucina, un dominio transmembrana y un dominio intracelular que está implicado en la señalización de TLR.
Los términos “receptor de tipo Toll 7” y “TLR7” se refieren a ácidos nucleicos o polipéptidos que comparten una identidad de secuencia de al menos el 70%; al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más con una secuencia de TLR7 disponible públicamente, por ejemplo, número de registro de GenBank AAZ99026 para el polipéptido TLR7 humano o número de registro de GenBank AAK62676 para el polipéptido TLR7 murino.
Los términos “receptor de tipo Toll 8” y “TLR8” se refieren a ácidos nucleicos o polipéptidos que comparten una identidad de secuencia de al menos el 70%; al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más con una secuencia de TLR7 disponible públicamente, por ejemplo, número de registro de GenBank AAZ95441 para el polipéptido TLR8 humano o número de registro de GenBank AAK62677 para el polipéptido TLR8 murino.
Un “agonista de TLR” es una sustancia que se une, directa o indirectamente, a un TLR (por ejemplo, TLR7 y/o TLR8) para inducir la señalización de t Lr . Cualquier diferencia detectable en la señalización de TLR puede indicar que un agonista estimula o activa un TLR. Las diferencias en la señalización pueden manifestarse, por ejemplo, como cambios en la expresión de genes diana, en la fosforilación de componentes de transducción de señales, en la localización intracelular de elementos posteriores tales como NK-k B, en la asociación de determinados componentes (tales como IRAK) con otras proteínas o estructuras intracelulares o en la actividad bioquímica de componentes tales como cinasas (tales como MAPK).
Tal como se usa en el presente documento, el término “aminoácido” se refiere a cualquier unidad monomérica que puede incorporarse en un péptido, un polipéptido o una proteína. Los aminoácidos incluyen a -aminoácidos que se producen de manera natural y sus estereoisómeros, así como aminoácidos no naturales (que no se producen de manera natural) y sus estereoisómeros. “Estereoisómeros” de un aminoácido dado se refieren a isómeros que tienen la misma fórmula molecular y los mismos enlaces intramoleculares pero disposiciones tridimensionales diferentes de enlaces y átomos (por ejemplo, un L-aminoácido y el D-aminoácido correspondiente).
Aminoácidos que se producen de manera natural son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, y-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los a -aminoácidos que se producen de manera natural incluyen, sin limitación, alanina (Ala), cisteína (Cys), ácido aspártico (Asp), ácido glutámico (Glu), fenilalanina (Phe), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (Ile), arginina (Arg), lisina (Lys), leucina (Leu), metionina (Met), asparagina (Asn), prolina (Pro), glutamina (Gln), serina (Ser), treonina (Thr), valina (Val), triptófano (Trp), tirosina (Tyr) y combinaciones de los mismos. Los estereoisómeros de a -aminoácidos que se producen de manera natural incluyen, sin limitación, D-alanina (D-Ala), D-cisteína (D-Cys), ácido D-aspártico (D-Asp), ácido D-glutámico (D-Glu), D-fenilalanina (D-Phe), D-histidina (D-His), D-isoleucina (D-Ile), D-arginina (D-Arg), D-lisina (D-Lys), D-leucina (D-Leu), D-metionina (D-Met), D-asparagina (D-Asn), D-prolina (D-Pro), D-glutamina (D-Gln), D-serina (D-Ser), D-treonina (D-Thr), D-valina (D-Val), D-triptófano (D-Trp), D-tirosina (D-Tyr) y combinaciones de los mismos.
Los aminoácidos no naturales (que no se producen de manera natural) incluyen, sin limitación, análogos de aminoácido, miméticos de aminoácido, aminoácidos sintéticos, glicinas N-sustituidas y W-metil-aminoácidos, o bien en la configuración L o bien en la configuración D, que funcionan de una manera similar a los aminoácidos que se producen de manera natural. Por ejemplo, “análogos de aminoácido” pueden ser aminoácidos no naturales que tienen la misma estructura química básica que los aminoácidos que se producen de manera natural (es decir, un carbono que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino), pero que tienen grupos de cadena lateral modificados o estructuras principales peptídicas modificadas, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina-metilsulfonio. “Miméticos de aminoácido” se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de manera similar a un aminoácido que se produce de manera natural. Los aminoácidos pueden denominarse en el presente documento o bien por los símbolos de tres letras habitualmente conocidos o bien por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB.
Tal como se usa en el presente documento, el término “alquilo” se refiere a un radical alifático saturado lineal o ramificado que tiene el número de átomos de carbono indicado. Alquilo puede incluir cualquier número de carbonos, tal como C1-2, C1-3, C1-4, C1-5, C1-6, C1-7, C1-8, C1-9, C1-10, C2-3, C2-4, C2-5, C2-6, C3-4, C3-5, C3-6, C4-5, C4-6 y C5-6. Por ejemplo, alquilo C1-6 incluye, pero no se limita a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, secbutilo, terc-butilo, pentilo, isopentilo, hexilo, etc. Alquilo también puede referirse a grupos alquilo que tienen hasta 30 átomos de carbono, tales como, pero sin limitarse a, heptilo, octilo, nonilo, decilo, etc. Los grupos alquilo pueden estar sustituidos o no sustituidos. Los grupos “alquilo sustituido” pueden estar sustituidos con uno o más grupos seleccionados de halo, hidroxilo, amino, oxo (=O), alquilamino, amido, acilo, nitro, ciano y alcoxilo. El término “alquileno” se refiere a un radical alquilo divalente.
Tal como se usa en el presente documento, el término “heteroalquilo” se refiere a un grupo alquilo tal como se describe en el presente documento, en el que uno o más átomos de carbono se reemplazan opcional e independientemente por un heteroátomo seleccionado de N, O y S. El término “heteroalquileno” se refiere a un radical heteroalquilo divalente.
Tal como se usa en el presente documento, el término “carboalquilo” se refiere a un conjunto de anillos saturado o parcialmente insaturado, monocíclico, bicíclico condensado o policíclico en puente que contiene desde 3 hasta 12 átomos de anillo, o el número de átomos indicado. Carboalquilo puede incluir cualquier número de carbonos, tal como C3-6, C4-6, C5-6, C3-8, C4-8, C5-8, C6-8, C3-9, C3-10, C3-11 y C3-12. Los anillos carbocíclicos monocíclicos saturados incluyen, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y ciclooctilo. Los anillos carbocíclicos bicíclicos y policíclicos saturados incluyen, por ejemplo, norbornano, [2.2.2] biciclooctano, decahidronaftaleno y adamantano. Los grupos carbocíclicos también pueden estar parcialmente insaturados, teniendo uno o más dobles o triples enlaces en el anillo. Los grupos carbocíclicos representativos que están parcialmente insaturados incluyen, pero no se limitan a, ciclobuteno, ciclopenteno, ciclohexeno, ciclohexadieno (isómeros 1,3 y 1,4), ciclohepteno, cicloheptadieno, cicloocteno, ciclooctadieno (isómeros 1,3, 1,4 y 1,5), norborneno y norbornadieno.
Los grupos carbocíclicos insaturados también incluyen grupos arilo. El término “arilo” se refiere a un sistema de anillos aromáticos que tiene cualquier número adecuado de átomos de anillo y cualquier número adecuado de anillos. Los grupos arilo pueden incluir cualquier número adecuado de átomos de anillo, tal como, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 átomos de anillo, así como desde 6 hasta 10, desde 6 hasta 12 o desde 6 hasta 14 miembros de anillo. Los grupos arilo pueden ser monocíclicos, condensarse para formar grupos bicíclicos o tricíclicos o unirse mediante un enlace para formar un grupo biarilo. Los grupos arilo representativos incluyen fenilo, naftilo y bifenilo. Otros grupos arilo incluyen bencilo, que tiene un grupo de unión metileno. Algunos grupos arilo tienen desde 6 hasta 12 miembros de anillo, tales como fenilo, naftilo o bifenilo. Otros grupos arilo tienen desde 6 hasta 10 miembros de anillo, tales como fenilo o naftilo.
Un carboalquilo “divalente” se refiere a un grupo carbocíclico que tiene dos puntos de unión para unir de manera covalente dos restos en una molécula o un material. Los carboalquilos pueden estar sustituidos o no sustituidos. Los grupos “carboalquilo sustituido” pueden estar sustituidos con uno o más grupos seleccionados de halo, hidroxilo, amino, alquilamino, amido, acilo, nitro, ciano y alcoxilo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “heterociclo” se refiere a grupos heterocicloalquilo y grupos heteroarilo. “Heteroarilo”, por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un conjunto de anillos aromáticos monocíclico o bicíclico o tricíclico condensado que contiene desde 5 hasta 16 átomos de anillo, en los que desde 1 hasta 5 de los átomos de anillo son un heteroátomo tal como N, O o S. También pueden ser útiles heteroátomos adicionales, incluyendo, pero sin limitarse a, B, Al, Si y P. Los heteroátomos pueden oxidarse para formar restos tales como, pero sin limitarse a, -S(O)- y -S(O)2-. Los grupos heteroarilo pueden incluir cualquier número de átomos de anillo, tal como de 3 a 6, de 4 a 6, de 5 a 6, de 3 a 8, de 4 a 8, de 5 a 8, de 6 a 8, de 3 a 9, de 3 a 10, de 3 a 11 o de 3 a 12 miembros de anillo. Puede incluirse cualquier número adecuado de heteroátomos en los grupos heteroarilo, tal como 1, 2, 3, 4 ó 5, o de 1 a 2, de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 3, de 2 a 4, de 2 a 5, de 3 a 4 o de 3 a 5. El grupo heteroarilo puede incluir grupos tales como pirrol, piridina, imidazol, pirazol, triazol, tetrazol, pirazina, pirimidina, piridazina, triazina (isómeros 1,2,3, 1,2,4 y 1,3,5), tiofeno, furano, tiazol, isotiazol, oxazol e isoxazol. Los grupos heteroarilo también pueden condensarse con sistemas de anillos aromáticos, tales como un anillo de fenilo, para formar miembros incluyendo, pero sin limitarse a, benzopirroles tales como indol e isoindol, benzopiridinas tales como quinolina e isoquinolina, benzopirazina (quinoxalina), benzopirimidina (quinazolina), benzopiridazinas tales como ftalazina y cinolina, benzotiofeno y benzofurano. Otros grupos heteroarilo incluyen anillos de heteroarilo unidos mediante un enlace, tales como bipiridina. Los grupos heteroarilo pueden estar sustituidos o no sustituidos. Los grupos “heteroarilo sustituido” pueden estar sustituidos con uno o más grupos seleccionados de halo, hidroxilo, amino, oxo (=O), alquilamino, amido, acilo, nitro, ciano y alcoxilo.
Los grupos heteroarilo pueden unirse a través de cualquier posición en el anillo. Por ejemplo, pirrol incluye 1-, 2-y 3-pirrol, piridina incluye 2-, 3- y 4-piridina, imidazol incluye 1-, 2-, 4- y 5-imidazol, pirazol incluye 1-, 3-, 4- y 5-pirazol, triazol incluye 1-, 4- y 5-triazol, tetrazol incluye 1- y 5-tetrazol, pirimidina incluye 2-, 4-, 5- y 6-pirimidina, piridazina incluye 3- y 4-piridazina, 1,2,3-triazina incluye 4- y 5-triazina, 1,2,4-triazina incluye 3-, 5- y 6-triazina, 1,3,5-triazina incluye 2-triazina, tiofeno incluye 2- y 3-tiofeno, furano incluye 2- y 3-furano, tiazol incluye 2-, 4- y 5-tiazol, isotiazol incluye 3-, 4- y 5-isotiazol, oxazol incluye 2-, 4- y 5-oxazol, isoxazol incluye 3-, 4- y 5-isoxazol, indol incluye 1-, 2- y 3-indol, isoindol incluye 1- y 2-isoindol, quinolina incluye 2-, 3- y 4-quinolina, isoquinolina incluye 1-, 3- y 4-isoquinolina, quinazolina incluye 2- y 4-quinazolina, cinolina incluye 3- y 4-cinolina, benzotiofeno incluye 2- y 3-benzotiofeno, y benzofurano incluye 2- y 3-benzofurano.
“Heterocicloalquilo”, por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un sistema de anillos saturado que tiene desde 3 hasta 12 miembros de anillo y desde 1 hasta 4 heteroátomos de N, O y S. También pueden ser útiles heteroátomos adicionales, incluyendo, pero sin limitarse a, B, Al, Si y P. Los heteroátomos pueden oxidarse para formar restos tales como, pero sin limitarse a, -S(O)- y -S(O)2-. Los grupos heterocicloalquilo pueden incluir cualquier número de átomos de anillo, tal como de 3 a 6, de 4 a 6, de 5 a 6, de 3 a 8, de 4 a 8, de 5 a 8, de 6 a 8, de 3 a 9, de 3 a 10, de 3 a 11 o de 3 a 12 miembros de anillo. Puede incluirse cualquier número adecuado de heteroátomos en los grupos heterocicloalquilo, tal como 1, 2, 3 ó 4, o de 1 a 2, de 1 a 3, de 1 a 4, de 2 a 3, de 2 a 4 o de 3 a 4. El grupo heterocicloalquilo puede incluir grupos tales como aziridina, azetidina, pirrolidina, piperidina, azepano, azocano, quinuclidina, pirazolidina, imidazolidina, piperazina (isómeros 1,2-, 1,3-y 1,4), oxirano, oxetano, tetrahidrofurano, oxano (tetrahidropirano), oxepano, tiirano, tietano, tiolano (tetrahidrotiofeno), tiano (tetrahidrotiopirano), oxazolidina, isoxazolidina, tiazolidina, isotiazolidina, dioxolano, ditiolano, morfolina, tiomorfolina, dioxano o ditiano. Los grupos heterocicloalquilo también pueden condensarse con sistemas de anillos aromáticos o no aromáticos para formar miembros incluyendo, pero sin limitarse a, indolina. Los grupos heterocicloalquilo pueden estar sustituidos o no sustituidos. Los grupos “heterocicloalquilo sustituido” pueden estar sustituidos con uno o más grupos seleccionados de halo, hidroxilo, amino, oxo (=O), alquilamino, amido, acilo, nitro, ciano y alcoxilo.
Los grupos heterocicloalquilo pueden unirse a través de cualquier posición en el anillo. Por ejemplo, aziridina puede ser 1- o 2-aziridina, azetidina puede ser 1- o 2- azetidina, pirrolidina puede ser 1-, 2- o 3-pirrolidina, piperidina puede ser 1-, 2-, 3- o 4-piperidina, pirazolidina puede ser 1-, 2-, 3-, o 4-pirazolidina, imidazolidina puede ser 1-, 2-, 3- o 4-imidazolidina, piperazina puede ser 1-, 2-, 3- o 4-piperazina, tetrahidrofurano puede ser 1-o 2-tetrahidrofurano, oxazolidina puede ser 2-, 3-, 4- o 5-oxazolidina, isoxazolidina puede ser 2-, 3-, 4- o 5-isoxazolidina, tiazolidina puede ser 2-, 3-, 4- o 5-tiazolidina, isotiazolidina puede ser 2-, 3-, 4- o 5- isotiazolidina, y morfolina puede ser 2-, 3- o 4-morfolina.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “halo” y “halógeno”, por sí mismos o como parte de otro sustituyente, se refieren a un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “carbonilo”, por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a -C(O)-, es decir, un átomo de carbono unido mediante doble enlace a oxígeno y unido a otros dos grupos en el resto que tiene el carbonilo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “amino” se refiere a un resto -NR3 , en el que cada grupo R es H o alquilo. Un resto amino puede ionizarse para formar el catión amonio correspondiente.
Tal como se usa en el presente documento, el término “hidroxilo” se refiere al resto -OH.
Tal como se usa en el presente documento, el término “ciano” se refiere a un átomo de carbono unido mediante triple enlace a un átomo de nitrógeno (es decir, el resto -CeN).
Tal como se usa en el presente documento, el término “carboxilo” se refiere al resto -C(O)OH. Un resto carboxilo puede ionizarse para formar el anión carboxilato correspondiente.
Tal como se usa en el presente documento, el término “amido” se refiere a un resto -NRC(O)R o -C(O)NR2 , en el que cada grupo R es H o alquilo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “nitro” se refiere al resto -NO2.
Tal como se usa en el presente documento, el término “oxo” se refiere a un átomo de oxígeno que está unido mediante doble enlace a un compuesto (es decir, O=).
Tal como se usa en el presente documento, el símbolo
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define la ubicación en la que está unida la estructura designada (por ejemplo, designa la ubicación del enlace realizado entre el adyuvante y Z, Z y el grupo de unión (“L”) o el grupo de unión y el éster (“E”).
Tal como se usa en el presente documento, cuando el término “opcionalmente presente” se usa para referirse a una estructura química (por ejemplo, “R”), si esa estructura química no está presente, el enlace originalmente realizado a la estructura química se realiza directamente al átomo adyacente.
Tal como se usa en el presente documento, el término “grupo de unión” se refiere a un grupo funcional que une de manera covalente dos o más restos en un compuesto o material. Por ejemplo, el resto de unión puede servir para unir de manera covalente un resto de adyuvante a un anticuerpo en un inmunoconjugado.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “tratar”, “tratamiento” y “que trata” se refieren a cualquier indicio de éxito en el tratamiento o la mejora de una lesión, una patología, una afección o un síntoma (por ejemplo, deterioro cognitivo), incluyendo cualquier parámetro objetivo o subjetivo tal como alivio; remisión; disminución de síntomas o hacer que el síntoma, la lesión, la patología o la afección sea más tolerable para el paciente; reducción de la velocidad de progresión de síntomas; disminución de la frecuencia o duración del síntoma o la afección; o, en algunas situaciones, prevención de la aparición del síntoma. El tratamiento o la mejora de síntomas puede basarse en cualquier parámetro objetivo o subjetivo; incluyendo, por ejemplo, el resultado de un examen físico.
Los términos “cáncer”, “neoplasia” y “tumor” se usan en el presente documento para referirse a células que presentan un crecimiento autónomo no regulado, de manera que presentan un fenotipo de crecimiento aberrante caracterizado por una pérdida significativa del control sobre la proliferación celular. Las células de interés para la detección, el análisis y/o el tratamiento en la presente divulgación incluyen células cancerosas (por ejemplo, células cancerosas de un individuo con cáncer), células cancerosas malignas, células cancerosas premetastásicas, células cancerosas metastásicas y células cancerosas no metastásicas. Se conocen cánceres de prácticamente todos los tejidos. La expresión “carga del cáncer” se refiere a la cantidad de células cancerosas o al volumen del cáncer en un sujeto. Por consiguiente, reducir la carga del cáncer se refiere a reducir el número de células cancerosas o el volumen del cáncer en un sujeto. El término “célula cancerosa”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier célula que es una célula cancerosa (por ejemplo, de cualquiera de los cánceres para los que puede tratarse un individuo, por ejemplo, aislada de un individuo que tiene cáncer) o que se deriva de una célula cancerosa, por ejemplo, un clon de una célula cancerosa. Por ejemplo, una célula cancerosa puede proceder de una línea de células cancerosas establecida, puede ser una célula primaria aislada de un individuo con cáncer, puede ser una célula de progenie de una célula primaria aislada de un individuo con cáncer, y similares. En algunos casos, el término también puede referirse a una porción de una célula cancerosa, tal como una porción subcelular, una porción de membrana celular o un lisado celular de una célula cancerosa. Los expertos en la técnica conocen muchos tipos de cánceres, incluyendo tumores sólidos tales como carcinomas, sarcomas, glioblastomas, melanomas, linfomas, mielomas, etc., y cánceres circulantes tales como leucemias.
Tal como se usa en el presente documento, “cáncer” incluye cualquier forma de cáncer, incluyendo, pero sin limitarse a, cánceres de tumores sólidos (por ejemplo, de pulmón, de próstata, de mama, de vejiga, de colon, de ovario, de páncreas, de riñón, de hígado, glioblastoma, meduloblastoma, leiomiosarcoma, carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello, melanomas y neuroendocrino) y cánceres líquidos (por ejemplo, cánceres hematológicos); carcinomas; tumores de tejidos blandos; sarcomas; teratomas; melanomas; leucemias; linfomas; y cánceres cerebrales, incluyendo enfermedad residual mínima, e incluyendo tumores tanto primarios como metastásicos. Cualquier cáncer es un cáncer adecuado para su tratamiento mediante los métodos y las composiciones objeto.
Los carcinomas son neoplasias malignas que se originan en los tejidos epiteliales. Las células epiteliales cubren la superficie externa del cuerpo, revisten las cavidades internas y forman el revestimiento de los tejidos glandulares. Los ejemplos de carcinomas incluyen, pero no se limitan a, adenocarcinoma (cáncer que comienza en células glandulares (secretoras)), por ejemplo, los cánceres de mama, páncreas, pulmón, próstata y colon pueden ser adenocarcinomas; carcinoma adrenocortical; carcinoma hepatocelular; carcinoma de células renales; carcinoma de ovario; carcinoma in situ; carcinoma ductal; carcinoma de mama; carcinoma de células basales; carcinoma de células escamosas; carcinoma de células transicionales; carcinoma de colon; carcinoma nasofaríngeo; carcinoma quístico multilocular de células renales; carcinoma de células en avena; carcinoma macrocítico de pulmón; carcinoma microcítico de pulmón; carcinoma no microcítico de pulmón; y similares. Los carcinomas pueden encontrarse en la próstata, el páncreas, el colon, el cerebro (habitualmente como metástasis secundarias), el pulmón, la mama y la piel.
Los tumores de tejidos blandos son un grupo muy diverso de tumores raros que se derivan del tejido conjuntivo. Los ejemplos de tumores de tejidos blandos incluyen, pero no se limitan a, sarcoma alveolar de partes blandas; histiocitoma fibroso angiomatoide; fibroma condromixoide; condrosarcoma esquelético; condrosarcoma mixoide extraesquelético; sarcoma de células claras; tumor desmoplásico de células redondas pequeñas; dermatofibrosarcoma protuberante; tumor del estroma endometrial; sarcoma de Ewing; fibromatosis (desmoide); fibrosarcoma infantil; tumor del estroma gastrointestinal; tumor óseo de células gigantes; tumor tenosinovial de células gigantes; tumor miofibroblástico inflamatorio; leiomioma uterino; leiomiosarcoma; lipoblastoma; lipoma típico; lipoma pleomórfico o de células fusiformes; lipoma atípico; lipoma condroide; liposarcoma bien diferenciado; liposarcoma mixoide/de células redondas; liposarcoma pleomórfico; histiocitoma fibroso maligno mixoide; histiocitoma fibroso maligno de alto grado; mixofibrosarcoma; tumor maligno de la vaina de nervios periféricos; mesotelioma; neuroblastoma; osteocondroma; osteosarcoma; tumor neuroectodérmico primitivo; rabdomiosarcoma alveolar; rabdomiosarcoma embrionario; schwannoma benigno o maligno; sarcoma sinovial; tumor de Evan; fascitis nodular; fibromatosis de tipo desmoide; tumor fibroso solitario; dermatofibrosarcoma protuberante (DFSP); angiosarcoma; hemangioendotelioma epitelioide; tumor tenosinovial de células gigantes (TGCT); sinovitis vellonodular pigmentada (PVNS); displasia fibrosa; mixofibrosarcoma; fibrosarcoma; sarcoma sinovial; tumor maligno de la vaina de nervios periféricos; neurofibroma; y adenoma pleomórfico de tejidos blandos; y neoplasias derivadas de fibroblastos, miofibroblastos, histiocitos, células vasculares/células endoteliales y células de la vaina de nervios.
Un sarcoma es un tipo raro de cáncer que surge en células de origen mesenquimatoso, por ejemplo, en el hueso o en los tejidos blandos del cuerpo, incluyendo cartílago, grasa, músculo, vasos sanguíneos, tejido fibroso u otro tejido conjuntivo o de sostén. Diferentes tipos de sarcoma se basan en dónde se forma el cáncer. Por ejemplo, el osteosarcoma se forma en el hueso, el liposarcoma se forma en la grasa y el rabdomiosarcoma se forma en el músculo. Los ejemplos de sarcomas incluyen, pero no se limitan a, tumor de Askin; sarcoma botrioides; condrosarcoma; sarcoma de Ewing; hemangioendotelioma maligno; schwannoma maligno; osteosarcoma; y sarcomas de tejidos blandos (por ejemplo, sarcoma alveolar de partes blandas; angiosarcoma; cistosarcoma filoides, dermatofibrosarcoma protuberante (DFSP); tumor desmoide; tumor desmoplásico de células redondas pequeñas; sarcoma epitelioide; condrosarcoma extraesquelético; osteosarcoma extraesquelético; fibrosarcoma; tumor del estroma gastrointestinal (GIST); hemangiopericitoma; hemangiosarcoma (más habitualmente denominado “angiosarcoma”); sarcoma de Kaposi; leiomiosarcoma; liposarcoma; linfangiosarcoma; tumor maligno de la vaina de nervios periféricos (MPNST); neurofibrosarcoma; sarcoma sinovial; y sarcoma pleomórfico no diferenciado).
Un teratoma es un tipo de tumor de células germinales que puede contener varios tipos de tejido diferentes (por ejemplo, puede incluir tejidos derivados de todas y/o cada una de las tres capas germinales: endodermo, mesodermo y ectodermo), incluyendo, por ejemplo, cabello, músculo y hueso. Los teratomas se producen con la mayor frecuencia en los ovarios en mujeres, en los testículos en los hombres y en el coxis en los niños.
El melanoma es una forma de cáncer que comienza en los melanocitos (células que producen el pigmento melanina). Puede comenzar en un lunar (melanoma cutáneo), pero también puede comenzar en otros tejidos pigmentados, tales como en el ojo o en los intestinos.
Las leucemias son cánceres que comienzan en el tejido que forma la sangre, tal como la médula ósea, y provoca la producción de un gran número de células sanguíneas anómalas y su entrada al torrente circulatorio. Por ejemplo, las leucemias pueden originarse en células derivadas de médula ósea que normalmente maduran en el torrente circulatorio. Las leucemias se nombran por cómo de rápido se desarrolla y avanza la enfermedad (por ejemplo, aguda frente a crónica) y por el tipo de leucocito que se ve afectado (por ejemplo, mieloide frente a linfoide). Las leucemias mieloides también se denominan leucemias mielógenas o mieloblásticas. Las leucemias linfoides también se denominan leucemias linfoblásticas o linfocíticas. Las células de leucemia linfoide pueden acumularse en los ganglios linfáticos, que pueden inflamarse. Los ejemplos de leucemias incluyen, pero no se limitan a, leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfoblástica aguda (LlA), leucemia mieloide crónica (LMC) y leucemia linfocítica crónica (LLC).
Los linfomas son cánceres que comienzan en las células del sistema inmunitario. Por ejemplo, los linfomas pueden originarse en células derivadas de médula ósea que normalmente maduran en el sistema linfático. Hay dos categorías básicas de linfomas. Una clase es el linfoma de Hodgkin (LH), que se caracteriza por la presencia de un tipo de célula denominada célula de Reed-Sternberg. Actualmente hay 6 tipos de LH reconocidos. Los ejemplos de linfomas de Hodgkin incluyen: linfoma de Hodgkin clásico (LHC) con esclerosis nodular, LHC de celularidad mixta, LHC con agotamiento de linfocitos, LHC rico en linfocitos y LH con predominio linfocítico nodular.
La otra categoría de linfoma son los linfomas no Hodgkin (LNH), que incluye un grupo grande y diverso de cánceres de las células del sistema inmunitario. Los linfomas no Hodgkin pueden dividirse a su vez en cánceres que tienen un transcurso indolente (crecimiento lento) y aquellos que tienen un transcurso agresivo (crecimiento rápido). Actualmente hay 61 tipos de LNH reconocidos. Los ejemplos de linfomas no Hodgkin incluyen, pero no se limitan a, linfomas relacionados con el SIDA, linfoma anaplásico de células grandes, linfoma angioinmunoblástico, linfoma blástico de célula NK, linfoma de Burkitt, linfoma de tipo Burkitt (linfoma de células pequeñas no escindidas), leucemia linfocítica crónica/linfoma linfocítico pequeño, linfoma cutáneo de células T, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de células T de tipo enteropatía, linfoma folicular, linfomas hepatoesplénicos de células T gamma-delta, leucemias de células T, linfoma linfoblástico, linfoma de células del manto, linfoma de la zona marginal, linfoma nasal de células T, linfoma pediátrico, linfomas periféricos de células T, linfoma primario del sistema nervioso central, linfomas transformados, linfomas de células T relacionados con el tratamiento y macroglobulinemia de Waldenstrom.
Los cánceres cerebrales incluyen cualquier cáncer de los tejidos cerebrales. Los ejemplos de cánceres cerebrales incluyen, pero no se limitan a, gliomas (por ejemplo, glioblastomas, astrocitomas, oligodendrogliomas, ependimomas, y similares), meningiomas, adenomas hipofisarios y schwannomas vestibulares, tumores neuroectodérmicos primitivos (meduloblastomas).
La “patología” del cáncer incluye todos los fenómenos que comprometen el bienestar del paciente. Esta incluye, sin limitación, crecimiento celular anómalo o incontrolable, metástasis, interferencia con el funcionamiento normal de las células vecinas, liberación de citocinas u otros productos secretores a niveles anómalos, supresión o agravamiento de la respuesta inflamatoria o inmunológica, neoplasia, preneoplasia maligna, neoplasia maligna e invasión de tejidos u órganos circundantes o distantes, tales como los ganglios linfáticos.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “recidiva del cáncer” y “recidiva del tumor”, y variantes gramaticales de los mismos, se refieren al crecimiento adicional de células neoplásicas o cancerosas después del diagnóstico del cáncer. Particularmente, la recidiva puede producirse cuando se produce un crecimiento de células cancerosas adicional en el tejido canceroso. De manera similar, la “diseminación del tumor” se produce cuando las células de un tumor se diseminan a tejidos y órganos locales o distantes. Por tanto, diseminación del tumor abarca metástasis tumoral. La “invasión del tumor” se produce cuando el crecimiento del tumor se disemina localmente comprometiendo la función de los tejidos implicados mediante la compresión, destrucción o prevención de la función normal del órgano.
Tal como se usa en el presente documento, el término “metástasis” se refiere al crecimiento de un tumor canceroso en un órgano o una parte del cuerpo, que no está conectado directamente al órgano del tumor canceroso original. Se entenderá que la metástasis incluye micrometástasis, que es la presencia de una cantidad indetectable de células cancerosas en un órgano o una parte del cuerpo que no está directamente conectado al órgano del tumor canceroso original. La metástasis también puede definirse como varias etapas de un proceso, tales como la salida de las células cancerosas a partir de un sitio tumoral original y la migración y/o invasión de las células cancerosas a otras partes del cuerpo.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “cantidad eficaz” y “cantidad terapéuticamente eficaz” se refieren a una dosis de una sustancia tal como un inmunoconjugado que produce los efectos terapéuticos para los que se administra. La dosis exacta dependerá del propósito del tratamiento, y podrá determinarla un experto en la técnica usando técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vol. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11a edición, 2006, Brunton, Ed., McGraw-Hill; y Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, 2005, Hendrickson, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).
Tal como se usa en el presente documento, los términos “receptor”, “individuo”, “sujeto”, “huésped” y “paciente” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a cualquier sujeto mamífero para el que se desea el diagnóstico, el tratamiento o la terapia (por ejemplo, seres humanos). “Mamífero” para los propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja y animales de zoológico, de deportes o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, ovejas, cabras, cerdos, camellos, etc. En determinadas realizaciones, el mamífero es un ser humano.
El término “adyuvante sinérgico” o “combinación sinérgica” en el contexto de esta invención incluye la combinación de dos inmunomoduladores tales como un agonista de receptor, una citocina, un polipéptido adyuvante, que en combinación provocan un efecto sinérgico sobre la inmunidad en comparación con cualquiera administrado solo. Particularmente, esta solicitud da a conocer inmunoconjugados que comprenden combinaciones sinérgicas que comprenden un adyuvante que es un agonista de TLR y un anticuerpo. Tras su administración, estas combinaciones sinérgicas provocan juntas un mayor efecto sobre la inmunidad, por ejemplo, en comparación con cuando el anticuerpo o el adyuvante se administra en ausencia del otro resto. Además, puede administrarse una cantidad disminuida del inmunoconjugado (tal como se mide mediante el número de anticuerpos o el número de adyuvantes totales administrados como parte del inmunoconjugado) en comparación con cuando se administra solo o bien el anticuerpo o bien el adyuvante.
Tal como se usa en el presente documento, el término “administrar” se refiere a la administración parenteral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intralesional, intranasal o subcutánea, a la administración oral, a la administración como supositorio, al contacto tópico, a la administración intratecal o a la implantación de un dispositivo de liberación lenta, por ejemplo, una mini bomba osmótica, al sujeto.
Los inmunoconjugados tal como se describen en el presente documento pueden proporcionar una respuesta de activación inesperadamente aumentada de una célula presentadora de antígeno (“APC”). Esta activación aumentada puede detectarse in vitro o in vivo. En algunos casos, la activación de APC aumentada puede detectarse en forma de un tiempo reducido para lograr un nivel especificado de activación de APC. Por ejemplo, en un ensayo in vitro, el % de activación de APC puede lograrse a una dosis equivalente con un inmunoconjugado dentro del 1%, el 10%, el 20%, el 30%, el 40% o el 50% del tiempo requerido para recibir el mismo porcentaje o similar de activación de APC con una mezcla de anticuerpo y agonista de TLR no conjugados. En algunos casos, un inmunoconjugado puede activar las APC (por ejemplo, células dendríticas y/o células NK) en una cantidad reducida de tiempo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una mezcla de anticuerpo y agonista de TLR puede activar las APC (por ejemplo, células dendríticas y/o células NK) y/o inducir la diferenciación de células dendríticas después de la incubación con la mezcla durante 2, 3, 4, 5, 1-5, 2-5, 3-5 ó 4-7 días; mientras que, en cambio, los inmunoconjugados descritos en el presente documento pueden activar y/o inducir la diferenciación en el plazo de 4 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas ó 1 día. Alternativamente, la activación de APC aumentada puede detectarse en forma de una concentración reducida de inmunoconjugado requerida para lograr una cantidad (por ejemplo, porcentaje de APC), un nivel (por ejemplo, tal como se mide mediante un nivel de regulación por incremento de un marcador adecuado) o una velocidad (por ejemplo, tal como se detecta mediante un tiempo de incubación requerido para la activación) de activación de APC.
Los términos “aproximadamente” y “alrededor de”, tal como se usan en el presente documento para modificar un valor numérico, indican un intervalo cerrado que rodea a ese valor explícito. Si “X” fuera el valor, “aproximadamente X” o “alrededor de X” indicaría un valor de desde 0,9X hasta 1,1X, por ejemplo, desde 0,95X hasta 1,05X o desde 0,99X hasta 1,01X. Cualquier referencia a “aproximadamente X” o “alrededor de X” indica específicamente al menos los valores X, 0,95X, 0,96X, 0,97X, 0,98X, 0,99X, 1,01X, 1,02X, 1,03X, 1,04X y 1,05X. Por tanto, se pretende que “aproximadamente X” y “alrededor de X” enseñen y proporcionen un respaldo de descripción escrito para una limitación de reivindicación de, por ejemplo, “0,98X”.
Adyuvante
El adyuvante puede ser cualquier adyuvante adecuado. En algunas realizaciones, el adyuvante es un compuesto que provoca una respuesta inmunitaria. En algunas realizaciones, el resto de adyuvante es un agonista de receptor de reconocimiento de patrones (“PRR”). Puede instalarse cualquier adyuvante capaz de activar un PRR en los inmunoconjugados de la invención. Tal como se usa en el presente documento, los términos “receptor de reconocimiento de patrones” y “PRR” se refieren a cualquier miembro de una clase de proteínas conservadas de mamífero que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (“PAMP”) o patrones moleculares asociados a daño (“DAMP”), y actúan como elementos de señalización clave en la inmunidad innata. Los PRR se dividen en PRR unidos a membrana, PRR citoplásmicos y PRR secretados. Los ejemplos de PRR unidos a membrana incluyen receptores de tipo Toll (“TLR”) y receptores de lectina de tipo C (“CLR”). Los ejemplos de PRR citoplásmicos incluyen receptores de tipo NOD (“NLR”) y receptores de tipo Rig-I (“RLR”). En algunas realizaciones, el inmunoconjugado puede tener más de un resto de adyuvante de PRR distinto.
En determinadas realizaciones, el resto de adyuvante en un inmunoconjugado de la invención es un agonista de TLR. Los agonistas de TLR adecuados incluyen TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11 o cualquier combinación de los mismos (por ejemplo, agonistas de TLR7/8). Puede instalarse cualquier adyuvante capaz de activar un TLR en los inmunoconjugados de la invención. Los TLR son proteínas transmembrana de tipo I que son responsables de iniciar respuestas inmunitarias innatas en vertebrados. Los TLR reconocen una variedad de patrones moleculares asociados a patógenos de bacterias, virus y hongos y actúan como primera línea de defensa contra los patógenos invasores. Los TLR provocan respuestas biológicas coincidentes pero distintas debido a las diferencias en la expresión celular y en las rutas de señalización que inician. Una vez activados (por ejemplo, mediante un estímulo natural o un agonista de TLR sintético), los TLR inician una cascada de transducción de señales que conduce a la activación de NF-k B a través del gen de respuesta primaria de diferenciación mieloide 88 (MyD88) de proteína adaptadora y al reclutamiento de la cinasa asociada al receptor de IL-1 (IRAK). A continuación, la fosforilación de IRAK conduce al reclutamiento del factor 6 asociado al receptor de TNF (TRAF6), lo que da como resultado la fosforilación del inhibidor de NF-k B, I-k B. Como resultado, NF-k B entra en el núcleo celular e inicia la transcripción de genes cuyos promotores contienen sitios de unión a NF-k B, tales como citocinas. Los modos adicionales de regulación para la señalización de TLR incluyen la inducción de TRAF6 dependiente de adaptador con dominio TIR inductor del interferón-p (TRIF) y la activación de rutas independientes de MyD88 a través de TRIF y TRAF3, lo que conduce a la fosforilación del factor 3 de respuesta a interferón (IRF3). De manera similar, la ruta dependiente de MyD88 también activa varios miembros de la familia de IRF, incluyendo IRF5 e IRF7, mientras que la ruta dependiente de TRIF también activa la ruta de NF-k B.
Los ejemplos de agonistas de TLR3 incluyen poliinosina-ácido policitidílico (poli (I:C)), ácido poliadenílicopoliuridílico (poli (A:U) y poli(I)-poli(C12U).
Los ejemplos de agonistas de TLR4 incluyen lipopolisacárido (LPS) y monofosforil lípido A (MPLA).
Un ejemplo de un agonista de TLR5 es la flagelina.
Los ejemplos de agonistas de TLR9 incluyen oligodesoxinucleótidos CpG (CpG ODN) monocatenarios. Se han identificado tres clases principales de CpG ODN estimuladores basándose en las características estructurales y la actividad sobre células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas, en particular células B y células dendríticas plasmocitoides (pDC). Estas tres clases son la clase A (tipo D), la clase B (tipo K) y la clase C.
Los ejemplos de agonistas de receptores de tipo Nod (NLR) incluyen derivado acilado de iE-DAP, D-gamma-GlumDAP, L-Ala-gamma-D-Glu-mDAP, muramil dipéptido con una cadena de ácido graso C18, muramil dipéptido, muramil tripéptido y muramil dipéptido N-glicosilado.
Los ejemplos de agonistas de receptores de tipo RIG-I (RLR) incluyen 5'ppp-dsrna (5'-pppGCAUGCGACCUCUGUUUGA-3' (SEQ ID NO: 1): 3'-CGUACGCUGGAGACAAACU-5' (SEQ ID NO: 2) y ácido poli(desoxiadenílico-desoxitimidílico) (poli(dA:dT)).
También pueden reconocerse compuestos inmunoestimuladores adicionales, tales como ADN citosólico y ácidos nucleicos bacterianos únicos denominados dinucleótidos cíclicos, mediante un estimulador de genes de interferón (“STING”), que puede actuar como sensor de ADN citosólico. ADU-S100 puede ser un agonista de STING. Los ejemplos no limitativos de agonistas de STING incluyen: [G(2',5')pA(2',5')p] cíclico (2'2'-cGAMP), [G(2',5')pA(3',5')p] cíclico (2'3'-cGAMP), [G(3',5')pA(3',5')p] cíclico (3'3'-cgAm P), di-adenilato monofosfato cíclico (c-di-AMP), 2',5'-3',5'-c-diAMP (2'3'-c-di-AMP), di-guanilato monofosfato cíclico (c-di-GMP), 2',5'-3',5'-c-diGMP (2'3'-c-di-GMP), di-inosina monofosfato cíclico (c-di-IMP), di-uridina monofosfato cíclico (c-di-UMP), KIN700, KIN1148, KIN600, KIN500, KIN100, KIN101, KIN400, KIN2000 o SB-9200, que pueden reconocerse.
Puede instalarse cualquier adyuvante capaz de activar TLR7 y/o TLR8 en los inmunoconjugados de la invención. Se describen ejemplos de agonistas de TLR7 y agonistas de TLR8, por ejemplo, por Vacchelli, et al.
(Oncolmmunology, 2: 8, e25238, DOI: 10.4161/onci.25238 (2013)) y Carson et al. (publicación de solicitud de patente estadounidense 2013/0165455). TLR7 y TLR8 se expresan ambos en monocitos y células dendríticas. En seres humanos, TLR7 también se expresa en células dendríticas plasmocitoides (pDC) y células B. TLR8 se expresa principalmente en células de origen mieloide, es decir, monocitos, granulocitos y células dendríticas mieloides. TLR7 y TLR8 son capaces de detectar la presencia de ARN monocatenario “extraño” dentro de una célula, como medio para responder a la invasión viral. El tratamiento de células que expresan TLR8 con agonistas de TLR8 puede dar como resultado la producción de altos niveles de IL-12, IFN-y, IL-1, TNF-a , IL-6 y otras citocinas inflamatorias. De manera similar, la estimulación de células que expresan TLR7, tales como pDC, con agonistas de TLR7 puede dar como resultado la producción de altos niveles de IFN-a y otras citocinas inflamatorias. La activación de TLR7/TLR8 y la producción de citocinas resultante pueden activar las células dendríticas y otras células presentadoras de antígeno, impulsando diversos mecanismos de respuesta inmunitaria innata y adquirida, lo que conduce a la destrucción tumoral.
Los ejemplos de agonistas de TLR7, TLR8 o TLR7/8 incluyen, pero no se limitan a, Gardiquimod (1-(4-amino-2-etil-aminometilimidazo[4,5-c]quinolin-1-il)-2-metilpropan-2-ol), Imiquimod (R837) (agonista de TLR7), loxoribina (agonista de TLR7), IRM1 (1-(2-amino-2-metilpropil)-2-(etoximetil)-1H-imidazo-[4,5-c]quinolin-4-amina), IRM2 (2-metil-1-[2-(3-piridin-3-ilpropoxi)etil]-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina) (agonista de TLR8), IRM3 (n-(2-[2-[4-amino-2-(2-metoxietil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]etoxi]etil)-N-metilciclohexanocarboxamida) (agonista de TLR8), CL097 (2-(etoximetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina) (agonista de TLR7/8), c L307 (agonista de TLR7), CL264 (agonista de TLR7), Resiquimod (agonista de TLR7/8), 3M-052/MEDI9197 (agonista de TLR7/8), SD-101 (N-[(4S)-2,5-dioxo-4-imidazolidinil]-urea) (agonista de TLR7/8), Motolimod (2-amino-N,N-dipropil-8-[4-(pirrolidin-1-carbonil)fenil]-3H-1-benzazepin-4-carboxamida) (agonista de TLR8), CL075 (3M002, 2-propiltiazolo[4,5-c]quinolin-4-amina) (agonista de TLR7/8) y TL8-506 (éster 2-amino-8-(3-cianofenil)etílico del ácido 3H-1-benzazepin-4-carboxílico) (agonista de TLR8).
Los ejemplos de agonistas de TLR2 incluyen, pero no se limitan a, un agente que comprende N-a -palmitoil-S-[2,3-bis(palmitoiloxi)-(2RS)-propil]-L-cisteína, palmitoil-Cys((RS)-2,3-di(palmitoiloxi)-propilo) (“Pam3Cys”), por ejemplo, Pam3Cys, Pam3Cys-Ser-(Lys)4 (también conocido como “Pam3Cys-SKKKK” y “Pam3CSK4”), triacil lípido A (“OM-174”), ácido lipoteicoico (“LTA”), peptidoglicano y CL419 (S-(2,3-bis(palmitoiloxi)-(2RS)propil)-(R)-cisteinil espermina).
Un ejemplo de un agonista de TLR2/6 es Pam2CSK4 (S-[2,3-bis(palmitoiloxi)-(2RS)-propil]-[R]-cisteinil-[S]-seril-[S]-lisil-[S]-lisil-[S]-lisil-[S]-lisina x 3 CF3COOH).
Los ejemplos de agonistas de TLR2/7 incluyen CL572 (S-(2-miristoiloxietil)-(R)-cisteinil 4-((6-amino-2-(butilamino)-8-hidroxi-9H-purin-9-il)metil)anilina), CL413 (S-(2,3-bis(palmitoiloxi)-(2RS)propil)-(R)-cisteinil-(S)-seril-(S)-lisil-(S)-lisil-(S)-lisil-(S)-lisil 4-((6-amino-2-(butilamino)-8-hidroxi-9H-purin-9-il)metil)anilina) y CL401 (S-(2,3-bis(palmitoiloxi)-(2RS)propil)-(R)-cisteinil 4-((6-amino-2(butilamino)-8-hidroxi-9H-purin-9-il)metil)anilina).
En algunas realizaciones, el adyuvante (“Ady”) tiene la fórmula:
Figure imgf000017_0001
en la que cada J es independientemente hidrógeno, OR4 o R4; cada R4 es independientemente hidrógeno o un grupo alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo o heteroarilalquilo que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono; Q está presente opcionalmente y es un grupo alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo o heteroarilalquilo y que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono; y la línea a trazos ”) representa el punto de unión del adyuvante. En determinadas realizaciones, Q está presente. En determinadas realizaciones, el adyuvante (“Ady”) tiene la fórmula:
Figure imgf000018_0001
en la que cada R4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno o grupo alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo y heteroarilalquilo que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono y la línea a trazos ”) representa el punto de unión del adyuvante.
En algunas realizaciones, el adyuvante (“Ady”) tiene la fórmula:
Figure imgf000018_0002
en la que J es hidrógeno, OR4 o R4; cada R4 es independientemente hidrógeno o grupo alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo y heteroarilalquilo que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono; Q se selecciona del grupo que consiste en alquilo, o grupo heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo y heteroarilalquilo que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono; y la línea a trazos representa el punto de unión del adyuvante. En determinadas realizaciones, el adyuvante (“Ady”) tiene la fórmula:
Figure imgf000019_0001
en la que cada R4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno o grupo alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo y heteroarilalquilo que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono y la línea a trazos representa el punto de unión del adyuvante.
En algunas realizaciones, el adyuvante (“Ady”) tiene la fórmula:
Figure imgf000019_0002
en la que cada R4 es independientemente hidrógeno o grupo alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo o heteroarilalquilo que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono; Q es grupo alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo o heteroarilalquilo que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono; y la línea a trazos (“■'' ”) representa el punto de unión del adyuvante.
En algunas realizaciones, el adyuvante (“Ady”) tiene la fórmula:
Figure imgf000019_0003
Figure imgf000020_0001
en la que cada J es independientemente hidrógeno, OR4 o R4; cada R4 es independientemente hidrógeno o un grupo alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo o heteroarilalquilo que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono; cada U es independientemente CH o N en la que al menos una U es N; cada subíndice t es independientemente un número entero de desde 1 hasta 3 (es decir, 1, 2 ó 3); Q está presente opcionalmente y es un grupo alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo o heteroarilalquilo que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono; y la línea a trazos representa el punto de unión del adyuvante. En determinadas realizaciones, Q está presente. En determinadas realizaciones, el adyuvante (“Ady”) tiene la fórmula:
Figure imgf000020_0002
en la que R4 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno o grupo alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo y heteroarilalquilo que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono; Q es un grupo alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo o heteroarilalquilo que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono; y la línea a trazos representa el punto de unión del adyuvante.
En algunas realizaciones, el adyuvante (“Ady”) tiene la fórmula:
Figure imgf000020_0003
en la que J es hidrógeno, OR4 o R4; cada R4 es independientemente hidrógeno o un grupo alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo o heteroarilalquilo que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono; R3 es hidrógeno o un grupo alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo o heteroarilalquilo que comprende desde 1 hasta 10 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10) unidades de carbono; Q es un grupo alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo o heteroarilalquilo que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono; y la línea a trazos ”) representa el punto de unión del adyuvante. En determinadas realizaciones, el adyuvante (“Ady”) tiene la fórmula:
Figure imgf000021_0001
en la que J es hidrógeno, OR4 o R4; cada R4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno o grupo alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo y heteroarilalquilo que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono; U es CH o N; V es Chh, O o NH; cada subíndice t es independientemente un número entero de desde 1 hasta 3 (es decir, 1, 2 ó 3); y la línea a trazos (“ ✓ '*’”) representa el punto de unión del adyuvante.
En algunas realizaciones, el adyuvante (“Ady”) tiene la fórmula:
Figure imgf000021_0002
en la que R1 se selecciona de H y alquilo C1-4; R3 se selecciona de alquilo C1-6 y heteroalquilo de 2 a 6 miembros, cada uno de los cuales está sustituido opcionalmente con uno o más miembros seleccionados del grupo que consiste en halo, hidroxilo, amino, oxo (=O), alquilamino, amido, acilo, nitro, ciano y alcoxilo; X se selecciona de O y CH2; cada Y es independientemente CHR2, en el que R2 se selecciona de H, OH y NH2, el subíndice n es un número entero de desde 1 hasta 12 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12); y la línea a trazos ”) representa el punto de unión del adyuvante. Alternativamente, R1 y el átomo de nitrógeno al que está unido pueden formar un resto de unión que comprende un heterociclo de 5 a 8 miembros. En algunas realizaciones, el subíndice n es un número entero de desde 1 hasta 6 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6). En determinadas realizaciones, el subíndice n es un número entero de desde 1 hasta 3 (es decir, 1, 2 ó 3).
En algunas realizaciones, el adyuvante (“Ady”) tiene la fórmula:
Figure imgf000022_0001
en la que W se selecciona del grupo que consiste en O y CH2 ; R1 se selecciona de H y alquilo C1-4; cada Y es independientemente CHR2, en el que R2 se selecciona de H, OH y NH2; el subíndice n es un número entero de desde 1 hasta 12 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12); y la línea a trazos representa el punto de unión del adyuvante. Alternativamente, R1 y el átomo de nitrógeno al que está unido pueden formar un resto de unión que comprende un heterociclo de 5 a 8 miembros. En algunas realizaciones, el subíndice n es un número entero de desde 1 hasta 6 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6). En determinadas realizaciones, el subíndice n es un número entero de desde 1 hasta 3 (es decir, 1,2 ó 3).
En algunas realizaciones, el adyuvante (“Ady”) tiene la fórmula:
Figure imgf000022_0002
en la que W se selecciona del grupo que consiste en O y CH2 ; R1 se selecciona de H y alquilo C1-4; cada Y es independientemente CHR2, en el que R2 se selecciona de H, OH y NH2; el subíndice nr" es un número entero de desde 1 hasta 12 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12); y la línea a trazos ”) representa el punto de unión del adyuvante. Alternativamente, R1 y el átomo de nitrógeno al que está unido pueden formar un resto de unión que comprende un heterociclo de 5 a 8 miembros. En algunas realizaciones, el subíndice n es un número entero de desde 1 hasta 6 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6). En determinadas realizaciones, el subíndice n es un número entero de desde 1 hasta 3 (es decir, 1,2 ó 3).
En algunas realizaciones, el adyuvante (“Ady”) tiene la fórmula:
Figure imgf000022_0003
en la que W se selecciona del grupo que consiste en O y CH2; X se selecciona de O y CH2; cada Y es independientemente CHR2, en el que R2 se selecciona de H, OH y NH2; el subíndice n es un número entero de desde 1 hasta 12 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12); y la línea a trazos representa el punto de unión del adyuvante. En algunas realizaciones, el subíndice n es un número entero de desde 1 hasta 6 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6). En determinadas realizaciones, el subíndice n es un número entero de desde 1 hasta 3 (es decir, 1,2 ó 3).
En algunas realizaciones, el adyuvante (“Ady”) tiene la fórmula:
Figure imgf000023_0001
en la que R1 se selecciona de H y alquilo C1-4; R2 se selecciona de H, OH y NH2; y la línea a trazos representa el punto de unión del adyuvante.
En algunas realizaciones, el adyuvante (“Ady”) tiene la fórmula:
Figure imgf000023_0002
en la que R1 se selecciona de H y alquilo C1-4; R2 se selecciona de H, OH y NH2; y la línea a trazos representa el punto de unión del adyuvante.
En determinadas realizaciones, el adyuvante (“Ady”) es:
Figure imgf000023_0003
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
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en los que la línea a trazos (“ ' ' ”) representa el punto de unión del adyuvante.
En algunas realizaciones, el adyuvante no es un fluoróforo. En algunas realizaciones, el adyuvante no es un compuesto de radiodiagnóstico. En algunas realizaciones, el adyuvante no es un compuesto radioterapéutico. En algunas realizaciones, el adyuvante no es un inhibidor de tubulina. En algunas realizaciones, el adyuvante no es un agente de reticulación/alquilación de ADN. En algunas realizaciones, el adyuvante no es un inhibidor de topoisomerasa.
Anticuerpo
El anticuerpo en el inmunoconjugado puede ser cualquier anticuerpo adecuado. El anticuerpo en los inmunoconjugados es normalmente un anticuerpo alogénico. Los términos “anticuerpo alogénico” o “aloanticuerpo” se refieren a un anticuerpo que no procede del individuo en cuestión (por ejemplo, un individuo con un tumor y que busca tratamiento), sino que procede de la misma especie o procede de una especie diferente, pero que se ha modificado por ingeniería para reducir, mitigar o evitar su reconocimiento como xenoanticuerpo (por ejemplo, no propio). Por ejemplo, el “anticuerpo alogénico” puede ser un anticuerpo humanizado. Un experto en la técnica sabe cómo modificar por ingeniería un anticuerpo no humano para evitar el reconocimiento como xenoanticuerpo. A menos que se indique específicamente lo contrario, “anticuerpo” y “anticuerpo alogénico” tal como se usan en el presente documento se refieren a inmunoglobulina G (IgG) o inmunoglobulina A (IgA).
Si una célula cancerosa de un individuo humano se pone en contacto con un anticuerpo que no se generó por esa misma persona (por ejemplo, el anticuerpo se generó por un segundo individuo humano, el anticuerpo se generó por otra especie tal como un ratón, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado que se generó por otra especie, etc.), entonces se considera que el anticuerpo es alogénico (en relación con el primer individuo). Se considera que un anticuerpo monoclonal de ratón humanizado que reconoce un antígeno humano (por ejemplo, un antígeno específico de cáncer, un antígeno que está enriquecido en y/o sobre células cancerosas, etc.) es un “aloanticuerpo” (un anticuerpo alogénico).
El anticuerpo puede ser un anticuerpo IgG alogénico policlonal. El anticuerpo puede estar presente en una mezcla de anticuerpos IgG policlonales con una pluralidad de especificidades de unión. Los anticuerpos de la mezcla pueden unirse específicamente a moléculas diana diferentes, y los anticuerpos de la mezcla pueden unirse específicamente a epítopos diferentes de la misma molécula diana. Por tanto, una mezcla de anticuerpos puede incluir más de un inmunoconjugado de la invención (por ejemplo, los restos de adyuvante pueden unirse de manera covalente a anticuerpos de una mezcla, por ejemplo, una mezcla de anticuerpos IgG policlonales, dando como resultado una mezcla de conjugados anticuerpo-adyuvante de la invención). Una mezcla de anticuerpos puede agruparse a partir de 2 o más individuos (por ejemplo, 3 o más individuos, 4 o más individuos, 5 o más individuos, 6 o más individuos, 7 o más individuos, 8 o más individuos, 9 o más individuos, 10 o más individuos, etc.). En algunas realizaciones, se usa suero agrupado como fuente de aloanticuerpo, en las que el suero puede proceder de cualquier número de individuos, ninguno de los cuales es el primer individuo (por ejemplo, el suero puede agruparse a partir de 2 o más individuos, 3 o más individuos, 4 o más individuos, 5 o más individuos, 6 o más individuos, 7 o más individuos, 8 o más individuos, 9 o más individuos, 10 o más individuos, etc.). Los anticuerpos pueden aislarse o purificarse a partir de suero antes de su uso. La purificación puede llevarse a cabo antes o después de agrupar los anticuerpos a partir de individuos diferentes.
En algunas realizaciones en las que los anticuerpos en los inmunoconjugados comprenden IgG a partir de suero, los antígenos diana para algunos (por ejemplo, más del 0% pero menos del 50%), la mitad, la mayoría (más del 50% pero menos del 100%) o incluso la totalidad de los anticuerpos (es decir, IgG a partir del suero) serán desconocidos. Sin embargo, hay muchas posibilidades de que al menos un anticuerpo en la mezcla reconocerá el antígeno diana de interés porque una mezcla de este tipo contiene una amplia variedad de anticuerpos específicos para una amplia variedad de antígenos diana.
En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgA alogénico policlonal. El anticuerpo puede estar presente en una mezcla de anticuerpos IgA policlonales con una pluralidad de especificidades de unión. Los anticuerpos de la mezcla pueden unirse específicamente a moléculas diana diferentes, y los anticuerpos de la mezcla pueden unirse específicamente a epítopos diferentes de la misma molécula diana. Por tanto, una mezcla de anticuerpos puede incluir más de un inmunoconjugado de la invención (por ejemplo, los restos de adyuvante pueden unirse de manera covalente a anticuerpos de una mezcla, por ejemplo, una mezcla de anticuerpos IgA policlonales, dando como resultado una mezcla de conjugados anticuerpo-adyuvante de la invención). Una mezcla de anticuerpos puede agruparse a partir de 2 o más individuos (por ejemplo, 3 o más individuos, 4 o más individuos, 5 o más individuos, 6 o más individuos, 7 o más individuos, 8 o más individuos, 9 o más individuos, 10 o más individuos, etc.). En algunas realizaciones, se usa suero agrupado como fuente de aloanticuerpo, en las que el suero puede proceder de cualquier número de individuos, ninguno de los cuales es el primer individuo (por ejemplo, el suero puede agruparse a partir de 2 o más individuos, 3 o más individuos, 4 o más individuos, 5 o más individuos, 6 o más individuos, 7 o más individuos, 8 o más individuos, 9 o más individuos, 10 o más individuos, etc.). Los anticuerpos pueden aislarse o purificarse a partir de suero antes de su uso. La purificación puede llevarse a cabo antes o después de agrupar los anticuerpos a partir de individuos diferentes.
En algunas realizaciones en las que los anticuerpos en los inmunoconjugados comprenden IgA a partir de suero, los antígenos diana para algunos (por ejemplo, más del 0% pero menos del 50%), la mitad, la mayoría (más del 50% pero menos del 100%) o incluso la totalidad de los anticuerpos (es decir, IgA a partir del suero) serán desconocidos. Sin embargo, hay muchas posibilidades de que al menos un anticuerpo en la mezcla reconocerá el antígeno diana de interés porque una mezcla de este tipo contiene una amplia variedad de anticuerpos específicos para una amplia variedad de antígenos diana.
En algunas realizaciones, el anticuerpo en los inmunoconjugados incluye inmunoglobulina intravenosa (IVIG) y/o anticuerpos a partir de (por ejemplo, enriquecidos a partir de, purificados a partir de, por ejemplo, purificados por afinidad a partir de) IVIG. La I VI G es un hemoderivado que contiene IgG (inmunoglobulina G) agrupado a partir del plasma (por ejemplo, en algunas realizaciones sin ninguna otra proteína) a partir de muchos (por ejemplo, algunas veces más de 1.000 a 60.000) donantes de sangre normales y sanos. La IVIG está disponible comercialmente. La IVIG contiene un alto porcentaje de IVIG monomérica humana nativa y tiene un bajo contenido en IgA. Cuando se administra por vía intravenosa, la IVIG mejora varios estados de enfermedad. Por tanto, la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA) de los Estados Unidos ha aprobado el uso de IVIG para varias enfermedades, incluyendo: (1) enfermedad de Kawasaki; (2) trombocitopenia inmunomediada; (3) inmunodeficiencias primarias; (4) trasplante de células madre hematopoyéticas (para aquellos mayores de 20 años); (5) leucemia linfocítica crónica de células B; y (6) infección pediátrica por VIH tipo 1. En 2004, la FDA aprobó el protocolo para IVIG del Cedars-Sinai para receptores de trasplante de riñón de modo que tales receptores pudieran aceptar un riñón de donante vivo a partir de cualquier donante sano, independientemente del tipo de sangre (incompatible ABO) o la histocompatibilidad. Estos y otros aspectos de IVIG se describen, por ejemplo, en las publicaciones de solicitud de patente estadounidense 2010/0150942; 2004/0101909; 2013/0177574; 2013/0108619; y 2013/0011388.
En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de una subclase definida (por ejemplo, IgG1, IgG2 , IgG3, IgG4 , IgA1 o IgA2). Si se usan combinaciones de anticuerpos, los anticuerpos pueden ser de la misma subclase o de subclases diferentes. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser anticuerpos IgG1. Los expertos en la técnica pueden obtener diversas combinaciones de subclases diferentes, en proporciones relativas diferentes. En algunas realizaciones, una subclase específica, o una combinación específica de subclases diferentes, puede ser particularmente eficaz en el tratamiento de cáncer o en la reducción del tamaño tumoral. Por consiguiente, algunas realizaciones de la invención proporcionan inmunoconjugados en los que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal está humanizado.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un antígeno de una célula cancerosa. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a un antígeno diana que está presente en una cantidad de al menos 10; 100; 1.000; 10.000; 100.000; 1.000.000; 2,5 * 106; 5 * 106; ó 1 * 107 copias o más en la superficie de una célula cancerosa.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un antígeno en una célula cancerosa o inmunitaria a una afinidad mayor que un antígeno correspondiente en una célula no cancerosa. Por ejemplo, el anticuerpo puede reconocer preferentemente un antígeno que contiene un polimorfismo que se encuentra en una célula cancerosa o inmunitaria en comparación con el reconocimiento de un antígeno de tipo natural correspondiente en la célula no cancerosa o no inmunitaria. En algunos casos, el anticuerpo se une a una célula cancerosa o inmunitaria con una avidez mayor que una célula no cancerosa o no inmunitaria. Por ejemplo, la célula cancerosa o inmunitaria puede expresar una mayor densidad de un antígeno, por lo que proporciona una unión de mayor afinidad de un anticuerpo multivalente a la célula cancerosa o inmunitaria.
En algunas realizaciones, el anticuerpo no se une significativamente a antígenos no cancerígenos (por ejemplo, el anticuerpo se une a uno o más antígenos no cancerígenos con una afinidad al menos 10; 100; 1.000; 10.000; 100.000; ó 1.000.000 veces menor (mayor Kd) que el antígeno cancerígeno diana). En algunas realizaciones, el antígeno cancerígeno diana al que se une el anticuerpo está enriquecido en la célula cancerosa. Por ejemplo, el antígeno cancerígeno diana puede estar presente en la superficie de la célula cancerosa a un nivel que es al menos 2, 5, 10, 100, 1.000, 10.000, 100.000 ó 1.000.000 veces mayor que una célula no cancerosa correspondiente. En algunas realizaciones, la célula no cancerosa correspondiente es una célula del mismo tejido u origen que no es hiperproliferativa ni por lo demás cancerosa. En general, un anticuerpo IgG objeto que se une específicamente a un antígeno (un antígeno diana) de una célula cancerosa se une preferentemente a ese antígeno particular en relación con otros antígenos disponibles. Sin embargo, no es necesario que el antígeno diana sea específico de la célula cancerosa, ni siquiera que esté enriquecido en células cancerosas en relación con otras células (por ejemplo, el antígeno diana puede expresarse por otras células). Por tanto, en la expresión “un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de una célula cancerosa”, el término “específicamente” se refiere a la especificidad del anticuerpo y no a la singularidad del antígeno en ese tipo de célula particular.
Región Fc modificada
En algunas realizaciones, los anticuerpos en los inmunoconjugados contienen una región Fc modificada, en los que la modificación modula la unión de la región Fc a uno o más receptores de Fc.
Los términos “receptor de Fc” o “FcR” se refieren a un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. Hay tres clases principales de receptores de Fc: FcyR que se une a IgG, FcaR que se une a IgA y FceR que se une a IgE. La familia de FcyR incluye varios miembros, tales como FcyI (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16A) y FcyRIIIB (CD16B). Los receptores de Fcy difieren en su afinidad por IgG y también presentan afinidades diferentes por las subclases de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4).
En algunas realizaciones, los anticuerpos en los inmunoconjugados (por ejemplo, anticuerpos conjugados con un agonista de TLR tal como un agonista de TLR7/8 a través de un grupo de unión) contienen una o más modificaciones (por ejemplo, inserción, deleción y/o sustitución de aminoácido) en la región Fc, lo que da como resultado una unión modulada (por ejemplo, unión aumentada o unión disminuida) a uno o más receptores de Fc (por ejemplo, FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a) y/o FcyRIIIB (CD16b)) en comparación con el anticuerpo nativo que carece de la mutación en la región Fc. En algunas realizaciones, los anticuerpos en los inmunoconjugados contienen una o más modificaciones (por ejemplo, inserción, deleción y/o sustitución de aminoácido) en la región Fc, lo que reduce la unión de la región Fc del anticuerpo a FcyRIIB. En algunas realizaciones, los anticuerpos en los inmunoconjugados contienen una o más modificaciones (por ejemplo, inserción, deleción y/o sustitución de aminoácido) en la región Fc del anticuerpo, lo que reduce la unión del anticuerpo a FcyRIIB al tiempo que mantiene la misma unión o presenta una unión aumentada a FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32A) y/o FcRyIIIA (CD16a) en comparación con el anticuerpo nativo que carece de la mutación en la región Fc. En algunas realizaciones, los anticuerpos en los inmunoconjugados contienen una o más modificaciones en la región Fc que aumentan la unión de la región Fc del anticuerpo a FcyRIIB.
En algunas realizaciones, la unión modulada se proporciona mediante mutaciones en la región Fc del anticuerpo en relación con la región Fc nativa del anticuerpo. Las mutaciones pueden estar en un dominio CH2, un dominio CH3 o una combinación de los mismos. Una “región Fc nativa” es sinónimo con una “región Fc de tipo natural” y comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc hallada en la naturaleza o idéntica a la secuencia de aminoácidos de la región Fc hallada en el anticuerpo nativo (por ejemplo, rituximab). Las regiones Fc humanas de secuencia nativa incluyen una región Fc de IgG1 humana de secuencia nativa; una región Fc de IgG2 humana de secuencia nativa; una región Fc de IgG3 humana de secuencia nativa; y una región Fc de IgG4 humana de secuencia nativa, así como variantes que se producen de manera natural de las mismas. La Fc de secuencia nativa incluye los diversos alotipos de Fc (véase, por ejemplo, Jefferis et al., mAbs, 1(4): 332-338 (2009)).
En algunas realizaciones, las mutaciones en la región Fc que dan como resultado una unión modulada a uno o más receptores de Fc pueden incluir una o más de las siguientes mutaciones: SD (S239D), SDIE (S239D/I332E), SE (S267E), SELF (S267E/L328F), SDIE (S239D/I332E), SDIEAL (S239D/I332E/A330L), GA (G236A), ALIE (A330L/I332E), GASDALIE (G236A/S239D/A330L/I332E), V9 (G237D/P238D/P271G/A330R) y V11 (G237D/P238D/H268D/P271G/A330R) y/o una o más mutaciones en los siguientes aminoácidos: E233, G237, P238, H268, P271, L328 y A330. Se describen modificaciones de región Fc adicionales para modular la unión a receptores de Fc, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente estadounidense 2016/0145350 y las patentes estadounidenses 7.416.726 y 5.624.821.
En algunas realizaciones, se modifica la región Fc de los anticuerpos de los inmunoconjugados para tener un patrón de glicosilación alterado de la región Fc en comparación con la región Fc no modificada nativa.
La inmunoglobulina humana está glicosilada en el residuo Asn297 en el dominio Cy2 de cada cadena pesada. Este oligosacárido unido a N está compuesto por un heptasacárido central, N-acetilglucosamina4manosa3 (GlcNAc4Man3). Se sabe que la eliminación del heptasacárido con endoglicosidasa o PNGasa F conduce a cambios conformacionales en la región Fc del anticuerpo, lo que puede reducir significativamente la afinidad de unión del anticuerpo a FcyR activante y conducir a una función efectora disminuida. A menudo, el heptasacárido central está decorado con galactosa, GlcNAc bisecante, fucosa o ácido siálico, lo que afecta de manera diferente a la unión de Fc a FcyR activante e inhibidor. Además, se ha demostrado que la sialilación a 2,6 potencia la actividad antiinflamatoria in vivo mientras que la desfucosilación conduce a una unión a FcyRIIIa mejorada y a un aumento de 10 veces en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y la fagocitosis dependiente de anticuerpos. Por tanto, pueden usarse patrones de glicosilación específicos para controlar las funciones efectoras inflamatorias.
En algunas realizaciones, la modificación para alterar el patrón de glicosilación es una mutación. Por ejemplo, una sustitución en Asn297. En algunas realizaciones, Asn297 se muta a glutamina (N297Q). Se describen métodos para controlar la respuesta inmunitaria con anticuerpos que modulan la señalización regulada por FcyR, por ejemplo, en la patente estadounidense 7.416.726, así como en las publicaciones de solicitud de patente estadounidense 2007/0014795 y 2008/0286819.
En algunas realizaciones, los anticuerpos de los inmunoconjugados se modifican para contener una región Fab modificada por ingeniería con un patrón de glicosilación que no se produce de manera natural. Por ejemplo, pueden diseñarse por ingeniería genética hibridomas que secretan AcM afucosilado, AcM desialilado o Fc desglicosilada con mutaciones específicas que permiten una unión a FcRyIIIa y una función efectora aumentadas. En algunas realizaciones, los anticuerpos de los inmunoconjugados se modifican por ingeniería para su afucosilación (por ejemplo, rituximab afucosilado, disponible de Invivogen, hcd20-mab13).
En algunas realizaciones, toda la región Fc de un anticuerpo en los inmunoconjugados se intercambia por una región Fc diferente, de modo que la región Fab del anticuerpo se conjuga con una región Fc no nativa. Por ejemplo, la región Fab de rituximab, que normalmente comprende una región Fc de IgG1, puede conjugarse con IgG2, IgG3, IgG4 o IgA, o la región Fab de nivolumab, que normalmente comprende una región Fc de IgG4, puede conjugarse con IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 o IgG2. En algunas realizaciones, el anticuerpo con Fc modificada con un dominio de Fc no nativo también comprende una o más modificaciones de aminoácido, tales como la mutación S228P dentro de la Fc de IgG4, que modulan la estabilidad del dominio de Fc descrito. En algunas realizaciones, el anticuerpo con Fc modificada con un dominio de Fc no nativo también comprende una o más modificaciones de aminoácido descritas en el presente documento que modulan la unión de Fc a FcR.
En algunas realizaciones, las modificaciones que modulan la unión de la región Fc a FcR no alteran la unión de la región Fab del anticuerpo a su antígeno en comparación con el anticuerpo no modificado nativo. En otras realizaciones, las modificaciones que modulan la unión de la región Fc a FcR también aumentan la unión de la región Fab del anticuerpo a su antígeno en comparación con el anticuerpo no modificado nativo.
Diana de anticuerpo
La diana de anticuerpo puede ser cualquier diana de anticuerpo adecuada. En algunas realizaciones, el anticuerpo es capaz de unirse a una o más dianas seleccionadas de (por ejemplo, se une específicamente a una diana seleccionada de) 5T4, ABL, ABCF1, ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRL1, ADORA2A, AFP, agrecano, AGR2, AICDA, AIF1, AIGI, AKAP1, AKAP2, ALCAM, ALK, AMH, AMHR2, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL3, ANGPTL4, ANPEP, APC, APOCl, AR, aromatasa, ASPH, ATX, AX1, AXL, AZGP1 (zinc-aglicoproteína), B7, B7.1, B7.2, B7-H1, B7-H3, B7-H4, B7-H6, BAD, BAFF, BAG1, BAI1, BCR, BCL2, BCL6, BCMA, BDNF, BLNK, BLR1 (MDR15), BIyS, BMP1, BMP2, BMP3B (GDFIO), BMP4, BMP6, BMP8, BMP10, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, BPAG1 (plectina), BRCA1, C19orflO (IL27w), C3, C4A, C5, C5R1, CA6, CA9, CANT1, CAPRINA-1, CASP1, CASP4, CAV1, CCBP2 (D6/JAB61), CCL1 (1-309), CCLI1 (eotaxina), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP-Id), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MIP-3b), CCL2 (MCP-1), MCAF, CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MEP-2), SLC, exodus-2, CCL22(MDC/STC-I), CCL23 (MPIF-I), CCL24 (MPIF-2/eotaxina-2), CCL25 (TECK), CCL26 (eotaxina-3), CCL27 (CTACK/ILC), CCL28, CCL3 (MIP-Ia), CCL4 (MIPIb), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCNA1, CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CCR1 (CKR1/HM145), CCR2 (mcp-IRB/RA), CCR3 (CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBR5/ChemR13), CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6), CCR7 (CKR7/EBI1), CCR8 o CDw198 (CMKBR8/TERI/CKR-L1), CCR9 (GPR-9-6), CCRL1 (VSHK1), CCRL2 (L-CCR), CD13, CD164, CD19, CDH6, CDIC, CD2, CD20, CD21, CD200, CD22, CD23, CD24, CD27, CD28, CD3, CD33, CD35, CD37, CD38, CD3E, CD3G, CD3Z, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD45RB, CD47, CD52, CD69, CD70, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CD8, CD80, CD81, CD83, CD86, CD125, CD137, CD147, CD179b, CD223, CD279, CD152, CD274, CDH6, CDH1 (E-cadherina), CDH10, CDH12, CDH13, CDH18, CDH19, CDH20, CDH3, CDH5, CDH6, CDH7, CDH8, CDH9, CDH17, CDK2, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK9, CDKN1A (p21Wap1/Cip1), CDKN1B (p27Kip1), CDKN1C, CDKN2A (p16INK4a), CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, CEA, CEACAM5, CEACAM6, CEBPB, CERI, CFC1B, CHGA, CHGB, quitinasa, CHST10, CIK, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, CLDN3, CLDN6, CLDN7 (claudina-7), CLDN18, CLEC5A, CLEC6A, CLEC11A, CLEC14A, CLN3, CLU (clusterina), CMKLR1, CMKOR1 (RDC1), CNR1, COL18A1, COLIA1, COL4A3, COL6A1, CR2, Cripto, CRP, CSF1 (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), CTAG1B (NY-ESO-1), CTLA4, CTL8, CTNNB1 (b-catenina), CTSB (catepsina B), CX3CL1 (SCYD1), CX3CR1 (V28), CXCL1 (GRO1), CXCL10 (IP-I0), CXCLI1 (1-TAC/IP-9), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL2 (GRO2), CXCL3 (GRO3), CXCL5 (ENA-78/LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR4, CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo), CYB5, CYC1, CYSLTR1, DAB2IP, DES, DKFZp451J0118, DLK1, DNCL1, DPP4, E2F1, Engel, Edge, Fennel, EFNA3, EFNB2, EGF, EGFR, ELAC2, ENG, Enola, ENO2, ENO3, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6, EFRINA-A1, EFRINA-A2, EFRINA-A3, EFRINA-A4, EFRINA-A5, EFRINA-A6, EFRINA-B1, EFRINA-B2, EFRINA-B3, EPHB4, EPG, ERBB2 (HER-2), ERBB3, ERBB4, EREG, ERK8, receptor de estrógenos, Earl, ESR2, F3 (TF), FADD, FAP, farnesiltransferasa, FasL, FASNf, FCER1A, FCER2, FCGR3A, FGF, FGF1 (aFGF), FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2 (bFGF), FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF8, FGF9, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FIGF (VEGFD), FIL1 (ÉPSILON), FBL1 (ZETA), FLJ12584, FLJ25530, FLRT1 (fibronectina), FLT1, FLT-3, FOLR1, FOS, FOSL1 (FRA-1), FR-alfa, FY (DARC), GABRP (GABAa), GAGEB1, GAGEC1, GALNAC4S-6ST, GATA3, GD2, GD3, GDF5, GFI1, GFRA1, GGT1, GM-CSF, GNAS1, GNRH1, GPC1, GPC3, GPNB, GPR2 (CCR10), GPR31, GPR44, GPR81 (FKSG80), GRCC10 (C10), GRP, GSN (gelsolina), GSTP1, GUCY2C, HAVCR1, HAVCR2, HDAC, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, Hedgehog, HER3, HGF, HIF1A, HIP1, histamina y receptores de histamina, HLA-A, HLA-DR, HLA-DRA, HLA-E, HM74, HMOXI, HSP90, HUMCYT2A, ICEBERG, ICOSL, ID2, IFN-a, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, EFNA6, BFNA7, IFNB1, IFNgamma, IFNW1, IGBP1, IGF1, IGFIR, IGF2, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP6, DL-1, ILIO, ILIORA, ILIORB, IL-1, IL1R1 (CD121a), ILlR2 (CD121b), IL-IRA, IL-2, IL2RA (CD25), IL2RB (CD122), IL2RG (CD132), IL-4, IL-4R (CD123), IL-5, IL5RA (CD125), IL3RB (CD131), IL-6, IL6RA, (CD126), IR6RB (CD130), IL-7, IL7RA (CD127), IL-8, CXCR1 (IL8RA), CXCR2, (IL8RB/CD128), IL-9, IL9R (CD129), IL-10, IL10RA (CD210), IL10RB (CDW210B), IL-11, IL11RA, IL-12, IL-12A, IL-12B, IL-12RB1, IL-12RB2, IL-13, IL13RA1, IL13RA2, IL14, IL15, IL15RA, IL16, IL17, IL17A, IL17B, IL17C, IL17R, IL18, IL18BP, IL18R1, IL18RAP, IL19, ILIA, ILIB, ILIF10, ILIF5, IL1F6, ILIF7, IL1F8, DL1F9, ILIHYI, ILIR1, IL1R2, ILIRAP, ILIRAPLI, ILIRAPL2, ILIRL1, IL1RL2, ILIRN, IL2, IL20, IL20RA, IL21R, IL22, IL22R, IL22RA2, IL23, DL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL30, IL3RA, IL4, 1L4, IL6ST (glicoproteína 130), ILK, INHA, INHBA, INSL3, INSL4, IRAK1, IRAK2, ITGA1, ITGA2, ITGA3, ITGA6 (integrina a6), ITGAV, ITGB3, ITGB4 (integrina p4), JAG1, JAK1, JAK3, JTB, JUN, K6HF, KAI1, KDR, KIT, KITLG, KLF5 (GC Box BP), KLF6, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, KRT1, KRT19 (queratina 19), KRT2A, KRTHB6 (queratina de tipo II específica del cabello), L1CAM, LAG3, LAMA5, LAMP1, LEp (leptina), antígeno Lewis Y (“LeY”), LILRB1, Lingo-p75, Lingo-Troy, LRRC15, LPS, LTA (TNF-b), LTB, LTB4R (GPR16), LTB4R2, LTBR, LY75, LYPD3, MACMARCKS, MAG u OMgp, MAGEA3, MAGEA6, MAP2K7 (c-Jun), MCP-1, MDK, MIB1, midkina, MIF, MISRII, MJP-2, MLSN, MK, MKI67 (Ki-67), MMP2, MMP9, MS4A1, MSMB, MT3 (metalotionectina-UI), mTOR, MTSS1, MUC1 (mucina), MUC16, MYC, MYD88, NCK2, NCR3LG1, neurocano, NFKBI, NFKB2, NGFB (NGF), NGFR, NgR-Lingo, NgRNogo66, (Nogo), NgR-p75, NgR-Troy, NMEI (NM23A), NOTCH, NOTCH1, NOTCH3, NOX5, NPPB, NROB1, NROB2, NRID1, NR1D2, NR1H2, NR1H3, NR1H4, NR112, NR113, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR2F6, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR4A3, NR5A1, NR5A2, NR6A1, NRP1, NRP2, NT5E, NTN4, NY-ESO1, ODZI, OPRDI, P2RX7, PAP, PART1, PATE, PAWR, P-cadherina, PCA3, PCD1, PD-L1, PCDGF, PCNA, PDGFA, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAMI, L1-CAM, pegasparaginasa, PF4 (CXCL4), PGF, PGR, fosfacano, PIAS2, PI3-cinasa, PIK3CG, PLAU (uPA), PLG, PLXDCI, PKC, PKC-beta, PPBP (CXCL7), PPID, PR1, PRAME, PRKCQ, PRKD1, PRL, PROC, PROK2, PSAP, PSCA, PSMA, PTAFR, PTEN, PTGS2 (COX-2), PTN, PVRIG, RAC2 (P21Rac2), RANK, ligando RANK, RARB, RGS1, RGS13, RGS3, RNFI1O (ZNF144), Ron, ROBO2, ROR1, RXR, S100A2, SCGB 1D2 (lipofilina B), SCGB2A1 (mamaglobina 2), SCGB2A2 (mamaglobina 1), SCYE1 (citocina activadora de monocitos endoteliales), SDF2, SERPINA1, SERPINA3, SERPINB5 (maspina), SERPINEI (PAI-I), SERPINFI, SHIP-1, SHIP-2, SHB1, SHB2, SHBG, SfcAZ, SLAMF7, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, SLC44A4, SLC34A2, SLIT2, SPP1, SPRR1B (Spr1), ST6GAL1, STAB1, STATE, STEAP, STEAP2, TB4R2, TBX21, TCP1O, TDGF1, TEK, TGFA, TGFB1, TGFB1I1, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, THIL, THBS1 (trombospondina-1), THBS2, THBS4, THPO, TIE (Tie-1), TIMP3, factor tisular, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TNF, TNF-a, TNFAIP2 (B94), TNFAIP3, TNFRSFI1A, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF21, TNFRSF5, TNFRSF6 (Fas), TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFSF10 (TRAIL), TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF12A, TNFRSF17, TNFSF11 (TRANCE), TNFSF12 (APO3L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFRSF14 (HVEM), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, TNFSF4 (ligando OX40), TNFSF5 (ligando CD40), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (ligando CD27), TNFSF8 (ligando CD30), TNFSF9 (ligando 4-1BB), TOLLIP, receptores de tipo Toll, TOP2A (topoisomerasa lia), TP53, TPM1, TPM2, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, TRKA, TREM1, TREM2, TROP2, TRPC6, TSLP, TWEAK, tirosinasa, uPAR, VEGF, VEGFB, VEGFC, versicano, VHL C5, VLA-4, WT1, Wnt-1, XCL1 (linfotactina), XCL2 (SCM-Ib), XCRI (GPR5/CCXCR1), YY1, ZFPM2, CLEC4C (BDCA-2, DLEC, CD303, CEA, CDH6, CLECSF7), CLEC4D (MCL, CLECSF8), CLEC4E (Mincle), CLEC6A (dectina-2), CLEC5A (MDL-1, CLECSF5), CLEC1B (CLEC-2), CLEC9A (DNGR-1), CLEC7A (dectina-1), CLEC11A, GFRA1, PDGFRa, SLAMF7, GP6 (GPVI), LILRA1 (CD85I), LILRA2 (CD85H, ILT1), LILRA4 (CD85G, ILT7), LILRA5 (CD85F, ILT11), LILRA6 (CD85b, ILT8), LILRB1, NCR1 (CD335, LY94, NKp46), NCR3 (CD335, LY94, NKp46), NCR3 (CD337, NKp30), OSCAR, TARM1, CD300C, CD300E, CD300LB (CD300B), CD300LD (CD300D), KIR2DL4 (CD158D), KIR2DS, KLRC2 (CD159C, NKG2C), KLRK1 (CD314, NKG2D), NCR2 (CD336, NKp44), P-cadherina, PILRB, SIGLEC1 (CD169, SN), SIGLEC5, SIGLEC6, SIGLEC7, SIGLEC8, SIGLEC9, SIGLEC10, SIGLEC11, SIGLEC12, SIGLEC14, SIGLEC15 (CD33L3), SIGLEC16, SIRPA, SIRPB1 (CD172B), TREM1 (CD354), TREM2 y KLRF1 (NKp80).
En determinadas realizaciones, el dominio de unión a antígeno se une a un antígeno seleccionado del grupo que consiste en CDH1, CD19, CD20, CD29, CD30, CD40, CD47, EpCAM, SLAMF7, PDGFRa, gp75, MSLN, CA6, CA9, caprina-1, CDH6, CEA, CTAG1B/NY-ESO-1, LAMP1, LeY, MAGEA3/A6, P-cadherina, BCMA, CD38, HLA-DR, ROR1, WT1, GFRA1, FR-alfa, L1-CAM, LRRC15, MUC1, MUC16, PSMA, SLC34A2, TROP2, GPC3, CCR8 y VEGF.
En algunas realizaciones, el anticuerpo es capaz de unirse a una o más dianas seleccionadas de (por ejemplo, se une específicamente a una diana seleccionada de): ATP5I (Q06185), OAT (P29758), AIFM1 (Q9Z0X1), AOFA (Q64133), MTDC (P18155), CMC1 (Q8BH59), PREP (Q8K411), YMEL1 (O88967), LPPRC (Q6PB66), LONM (Q8CGK3), ACON (Q99KI0), ODO1 (Q60597), IDHP (P54071), ALDH2 (P47738), ATPB (P56480), AATM (P05202), TMM93 (Q9CQW0), ERGI3 (Q9CQE7), RTN4 (Q99P72), CL041 (Q8BQR4), ERLN2 (Q8BFZ9), TERA (Q01853), DAD1 (P61804), CALX (P35564), CALU (O35887), VAPA (Q9WV55), MOGS (Q80UM7), GANAB (Q8BHN3), ERO1A (Q8R180), UGGG1 (Q6P5E4), P4HA1 (Q60715), HYEP (Q9D379), CALR (P14211), AT2A2 (055143), PDIA4 (P08003), PDIA1 (P09103), PDIA3 (P27773), PDIA6 (Q922R8), CLH (Q68FD5), PPIB (P24369), TCPG (P80318), MOT4 (P57787), NICA (P57716), BASI (P18572), VAPA (Q9WV55), ENV2 (P11370), VAT1 (Q62465), 4F2 (P10852), ENOA (P17182), ILK (O55222), GPNMB (Q99P91), ENV1 (P10404), ERO1A (Q8R180), CLH (Q68FD5), DSG1A (Q61495), AT1A1 (Q8VDN2), HYOU1 (Q9JKR6), TRAP1 (Q9CQN1), GRP75 (P38647), ENPL (P08113), CH60 (P63038) y CH10 (Q64433). En la lista anterior, entre paréntesis se muestran los números de registro.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un antígeno seleccionado de CDH1, CD19, CD20, CD29, CD30, CD47, CD179b, CAPRINA-1, EpCAM, MUC1, MUC16, EGFR, HER2 y gp75. En algunas realizaciones, el antígeno se selecciona de CD19, CD20, CD47, CD179b, CAPRINA-1, EpCAM, MUC1, MUC16, EGFR y HER2. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un antígeno seleccionado de CD20 y CAPRINA-1. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un antígeno seleccionado de EGFR y HER2. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une al antígeno HER2.
En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo anti-cofilina-1, un anticuerpo anti-APOA2 o un anticuerpo anti-COTL-1.
En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD19, anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-CD22, anticuerpo anti-CD24, anticuerpo anti-CD25, anticuerpo anti-CD30, anticuerpo anti-CD33, anticuerpo anti-CD38, anticuerpo anti-CD44, anticuerpo anti-CD47, anticuerpo anti-CD52, anticuerpo anti-CD56, anticuerpo anti-CD70, anticuerpo anti-CD96, anticuerpo anti-CD97, anticuerpo anti-CD99, anticuerpo anti-CD117, anticuerpo anti-CD123, anticuerpo anti-CD179b, anticuerpo anti-CD223, anticuerpo anti-CD279 (PD-1), anticuerpo anti-CD274 (PD-L1), anticuerpo anti-EpCam, anticuerpo anti-EGFR, anticuerpo anti-VEGF, anticuerpo anti-VEGFB, anticuerpo anti-VEGFC, anticuerpo anti-17-1A, anticuerpo anti-CTLA4, anticuerpo anti-HER2, anticuerpo anti-C-Met, anticuerpo anti-PTHR2, anticuerpo anti-HAVCR2 (TIM3), anticuerpo anti-CAPRINA-1, anticuerpo antidectina-2, anticuerpo anti-CLEC5A y anticuerpo anti-SIRPA. En algunas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-HER2 y un anticuerpo anti-EGFR.
Además de anticuerpos, pueden usarse armazones proteicos alternativos como parte de los inmunoconjugados. El término “armazón proteico alternativo” se refiere a una proteína o un péptido no derivado de inmunoglobulina. Tales proteínas y péptidos generalmente son susceptibles de modificarse por ingeniería y pueden diseñarse para conferir monoespecificidad contra un antígeno dado, biespecificidad o multiespecificidad. La modificación por ingeniería de un armazón proteico alternativo puede llevarse a cabo usando varios enfoques. Puede usarse un enfoque de injerto en bucle en el que se injertan secuencias de especificidad conocida en un bucle variable de un armazón. Pueden usarse aleatorización y mutagénesis de secuencia para desarrollar una biblioteca de mutantes, que pueden seleccionarse usando diversas plataformas de presentación (por ejemplo, presentación en fago) para identificar un novedoso ligador. También puede usarse mutagénesis específica de sitio como parte de un enfoque similar. Los armazones proteicos alternativos existen en una variedad de tamaños, que van desde péptidos pequeños con estructura secundaria mínima hasta proteínas grandes de tamaño similar a un anticuerpo de tamaño completo. Los ejemplos de armazones incluyen, pero no se limitan a, miniproteínas anudadas con cistina (también denominadas knotinas), miniproteínas anudadas con cistina cíclicas (también denominadas ciclotidas), avímeros, aficuerpos, el décimo dominio de tipo III de fibronectina humana, DARPin (repeticiones de anquirina diseñadas) y anticalinas (también denominadas lipocalinas). También pueden modificarse por ingeniería ligandos que se producen de manera natural con especificidad conocida para conferir una novedosa especificidad contra una diana dada. Los ejemplos de ligandos que se producen de manera natural que pueden modificarse por ingeniería incluyen el ligando EGF y el ligando VEGF. Las proteínas modificadas por ingeniería pueden producirse o bien como proteínas monoméricas o bien como multímeros, dependiendo de la estrategia de unión y las especificidades deseadas. Las estrategias de modificación por ingeniería de proteínas pueden usarse para fusionar armazones proteicos alternativos con dominios de Fc.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un receptor acoplado a FcRy. En algunas realizaciones, el receptor acoplado a FcRy se selecciona del grupo que consiste en GP6 (GPVI), LILRA1 (CD85I), LILRA2 (CD85H, ILT1), LILRA4 (CD85G, ILT7), LILRA5 (CD85F, ILT11), LILRA6 (CD85b, ILT8), LILRB1, NCR1 (CD335, LY94, NKp46), NCR3 (CD335, LY94, NKp46), NCR3 (CD337, NKp30), OSCAR y TARM1.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un receptor acoplado a DAP12. En algunas realizaciones, el receptor acoplado a DAP12 se selecciona del grupo que consiste en CD300C, CD300E, CD300LB (CD300B), CD300LD (CD300D), KIR2DL4 (CD158D), KIR2DS, KLRC2 (CD159C, NKG2C), KLRK1 (CD314, NKG2D), NCR2 (CD336, NKp44), PILRB, SIGLEC1 (CD169, SN), SIGLEC5, SIGLEC6, SIGLEC7, SIGLEC8, SIGLEC9, SIGLEC10, SIGLEC11, SIGLEC12, SIGLEC14, SIGLEC15 (CD33L3), SIGLEC16, SIRPB1 (CD172B), TREM1 (CD354) y TREM2.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un receptor que porta hemITAM. En algunas realizaciones, el receptor que porta hemITAM es KLRF1 (NKp80).
En algunas realizaciones, el anticuerpo es capaz de unirse a una o más dianas seleccionadas de CLEC4C (BDCA-2, DLEC, CD303, CLECSF7), CLEC4D (MCL, CLECSF8), CLEC4E (Mincle), CLEC6A (dectina-2), CLEC5A (MDL-1, CLECSF5), CLEC1B (CLEC-2), CLEC9A (DNGR-1) y CLEC7A (dectina-1). En algunas realizaciones, el anticuerpo es capaz de unirse a CLEC6A (dectina-2) o CLEC5A. En algunas realizaciones, el anticuerpo es capaz de unirse a CLEC6A (dectina-2).
En algunas realizaciones, el anticuerpo es capaz de unirse a una o más dianas seleccionadas de (por ejemplo, se une específicamente a una diana seleccionada de): ATP5I (Q06185), OAT (P29758), AIFM1 (Q9ZOX1), AOFA (Q64133), MTDC (P18155), CMC1 (Q8BH59), PREP (Q8K411), YMEL1 (O88967), LPPRC (Q6PB66), LONM (Q8CGK3), ACON (Q99KI0), ODO1 (Q60597), IDHP (P54071), ALDH2 (P47738), ATPB (P56480), AATM (P05202), TMM93 (Q9CQW0), ERGI3 (Q9CQE7), RTN4 (Q99P72), CL041 (Q8BQR4), ERLN2 (Q8BFZ9), TERA (Q01853), DAD1 (P61804), CALX (P35564), CALU (O35887), VAPA (Q9WV55), MOGS (Q80UM7), GANAB (Q8BHN3), ERO1A (Q8R180), UGGG1 (Q6P5E4), P4HA1 (Q60715), HYEP (Q9D379), CALR (P14211), AT2A2 (055143), PDIA4 (P08003), PDIA1 (P09103), PDIA3 (P27773), PDIA6 (Q922R8), CLH (Q68FD5), PPIB (P24369), TCPG (P80318), MOT4 (P57787), NICA (P57716), BASI (P18572), VAPA (Q9WV55), ENV2 (P11370), VAT1 (Q62465), 4F2 (P10852), ENOA (P17182), ILK (O55222), GPNMB (Q99P91), ENV1 (P10404), ERO1A (Q8R180), CLH (Q68FD5), DSG1A (Q61495), AT1A1 (Q8VDN2), HYOU1 (Q9JKR6), TRAP1 (Q9CQN1), GRP75 (P38647), ENPL (P08113), CH60 (P63038) y CH10 (Q64433). En la lista anterior, entre paréntesis se muestran los números de registro.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un antígeno seleccionado de CCR8, CDH1, CD19, CD20, CD29, CD30, CD38, CD40, CD47, EpCAM, MUC1, MUC16, EGFR, HER2, SLAMF7 y gp75. En algunas realizaciones, el antígeno se selecciona de CCR8, CD19, CD20, CD47, EpCAM, MUC1, MUC16, EGFR y HER2. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un antígeno seleccionado del antígeno Tn y el antígeno Thomsen-Friedenreich. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un antígeno seleccionado de EGFR, CCR8 y HER2. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une a HER2.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se selecciona de: abagovomab, abatacept (también denominado ORENCIA™), abciximab (también denominado REOPRO™, c7E3 Fab), adalimumab (también denominado HUMIRA™), adecatumumab, alemtuzumab (también denominado CAMPATH™, MabCampath o Campath-1H), altumomab, afelimomab, anatumomab mafenatox, anetumumab, anrukizumab, apolizumab, arcitumomab, aselizumab, atlizumab, atorolimumab, bapineuzumab, basiliximab (también denominado SIMULECT™), bavituximab, bectumomab (también denominado LYMPHOSCAN™), belimumab (también denominado LYMPHO-STAT-B™), bertilimumab, besilesomab, bevacizumab (también denominado AVASTIN™), biciromab brallobarbital, bivatuzumab mertansina, campath, canakinumab (también denominado ACZ885), cantuzumab mertansina, capromab (también denominado PROSTASCINT™), catumaxomab (también denominado REMOVAB™), cedelizumab (también denominado CIMZIA™), certolizumab pegol, cetuximab (también denominado ERBITUX™), clenoliximab, dacetuzumab, dacliximab, daclizumab (también denominado ZENAPAX™), denosumab (también denominado AMG 162), detumomab, dorlimomab aritox, dorlixizumab, duntumumab, durimulumab, durmulumab, ecromeximab, eculizumab (también denominado SOLIRIS™), edobacomab, edrecolomab (también denominado Mab17-1A, PANOREX™), efalizumab (también denominado RAPTIVA™), efungumab (también denominado MYCOGRAB™), elotuzumab, elsilimomab, enlimomab pegol, epitumomab cituxetano, efalizumab, epitumomab, epratuzumab, erlizumab, ertumaxomab (también denominado REXOMUN™), etanercept (también denominado ENBREL™), etaracizumab (también denominado etaratuzumab, VITa X iN™, ABEGRIN™), exbivirumab, fanolesomab (también denominado NEUTROSPEC™), faralimomab, felvizumab, fontolizumab (también denominado HUZAF™), galiximab, gantenerumab, gavilimomab (también denominado ABXCBL™), gemtuzumab ozogamicin (también denominado MYLOTARG™), golimumab (también denominado CNTO 148), gomiliximab, ibalizumab (también denominado TNX-355), ibritumomab tiuxetano (también denominado ZEVALIN™), igovomab, imciromab, infliximab (también denominado REMICADE™), inolimomab, inotuzumab ozogamicin, ipilimumab (también denominado MDX-010, MDX-101), iratumumab, keliximab, labetuzumab, lemalesomab, lebrilizumab, lerdelimumab, lexatumumab (también denominado HGS-ETR2, ETR2-ST01), lexitumumab, libivirumab, lintuzumab, lucatumumab, lumiliximab, mapatumumab (también denominado HGSETR1, TRM-1), maslimomab, matuzumab (también denominado EMD72000), mepolizumab (también denominado BOSATRIA™), metelimumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, morolimumab, motavizumab (también denominado NUMAX™), muromonab (también denominado OKT3), nacolomab tafenatox, naptumomab estafenatox, natalizumab (también denominado TYSABRI™, ANTEGREN™), nebacumab, nerelimomab, nimotuzumab (también denominado THERACIM hR3™, THERA-CIM-hR3™, THERALOC™), nofetumomab merpentano (también denominado VERLUMA™), obinutuzumab, ocrelizumab, odulimomab, ofatumumab, omalizumab (también denominado XOLAIR™), oregovomab (también denominado OVAREX™), otelixizumab, pagibaximab, palivizumab (también denominado SYNAGIS™), panitumumab (también denominado ABX-EGF, VECTIBIX™), pascolizumab, pemtumomab (también denominado THERAGYN™), pertuzumab (también denominado 2C4, OMNITARG™), pexelizumab, pintumomab, priliximab, pritumumab, ranibizumab (también denominado LUCENTIS™), raxibacumab, regavirumab, reslizumab, rituximab (también denominado RITUXAN™, MabTHERA™), rovelizumab, ruplizumab, satumomab, sevirumab, sibrotuzumab, siplizumab (también denominado MEDI-507), sontuzumab, stamulumab (también denominado MYO-029), sulesomab (también denominado LEUKOSCAN™), tacatuzumab tetraxetano, tadocizumab, talizumab, taplitumomab paptox, tefibazumab (también denominado AUREXIS™), telimomab aritox, teneliximab, teplizumab, ticilimumab, tocilizumab (también denominado ACTEMRA™), toralizumab, tositumomab, trastuzumab (también denominado HERCEPTIN™), tremelimumab (también denominado CP-675,206), tucotuzumab celmoleucina, tuvirumab, urtoxazumab, ustekinumab (también denominado CNTO 1275), vapaliximab, veltuzumab, vepalimomab, visilizumab (también denominado NUVION™), volociximab (también denominado M200), votumumab (también denominado HUMASPECT™), zalutumumab, zanolimumab (también denominado HuMAX-CD4), ziralimumab, zolimomab aritox, daratumumab, olaratumab, brentuximab vedotina, afibercept, abatacept, belatacept, afibercept, etanercept, romiplostim, SBT-040 (secuencias enumeradas en la publicación de solicitud de patente estadounidense 2017/0158772). En algunas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en olaratumab, obinutuzumab, trastuzumab, cetuximab, rituximab, pertuzumab, bevacizumab, daratumumab, etanercept, pembrolizumab, nivolumab, atezolizumab, ipilimumab, panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab, matuzumab y elotuzumab. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es trastuzumab.
Inhibidor de puntos de control
Se contempla cualquier inhibidor de puntos de control inmunitario adecuado para su uso con los inmunoconjugados dados a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario. En otra realización, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la interacción entre una o más proteínas de puntos de control inmunitario y sus ligandos. También pueden usarse ácidos nucleicos inhibidores que disminuyen la expresión y/o actividad de moléculas de puntos de control inmunitario en los métodos dados a conocer en el presente documento.
La mayoría de los anticuerpos de puntos de control se diseñan sin una función efectora, ya que no están intentando destruir las células, sino más bien bloquear la señalización. Los inmunoconjugados de la invención puede devolver la “funcionalidad efectora” necesaria para activar la inmunidad mieloide. Por tanto, para la mayoría de los inhibidores de anticuerpos de puntos de control, este descubrimiento será crítico.
En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es antígeno de linfocitos T citotóxicos 4 (CTLA4, también conocido como CD152), inmunorreceptor de células T con dominios de Ig y de ITIM (TIGIT), proteína relacionada con TNFR inducida por glucocorticoides (GITR, también conocida como TNFRSF18), proteína coestimulatora de células T inducible (ICOS, también conocida como CD278), CD96, proteína relacionada con el receptor del virus de la poliomielitis 2 (PVRL2, también conocida como CD112R), proteína de muerte celular programada 1 (PD-1, también conocida como CD279), ligando 1 de proteína de muerte celular programada (PD-L1, también conocido como B7-H3 y CD274), ligando 2 de proteína de muerte celular programada (PD-L2, también conocido como B7-DC y CD273), gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3, también conocido como CD223), B7-H4, receptor de inmunoglobulina destructor (KIR), miembro 4 de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNFRSF4, también conocido como OX40 y CD134) y su ligando OX40L (CD252), indoleamina 2,3-dioxigenasa 1 (IDO-1), indoleamina 2,3-dioxigenasa 2 (IDO-2), molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario 1 (CEACAM1), atenuador de linfocitos B y T (BTLA, también conocido como CD272), proteína de membrana de células T 3 (TIM3), receptor de adenosina A2A (A2Ar) y supresor de Ig del dominio V de la activación de células T (proteína VISTA). En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un inhibidor de CTLA4, PD-1 o PD-L1.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se selecciona de ipilimumab (también denominado YERVOY™), pembrolizumab (también denominado k Ey TRUDA™), nivolumab (también denominado OPDIVO™), atezolizumab (también denominado TECENTRIG™), avelumab (también denominado BAVENCIO™) y durvalumab (también denominado IMFINZI™). En algunas realizaciones, el anticuerpo se selecciona de ipilimumab (también denominado YERVOY™), pembrolizumab (también denominado KEYTRUDA™), nivolumab (también denominado OPDIVO™) y atezolizumab (también denominado TECENTRIG™).
En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un inhibidor de CTLA4. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo contra CTLA4. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra CTLA4. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra CTLA4. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como CTLA4.
En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un inhibidor de PD-1. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo contra PD-1. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra PD-1. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra PD-1. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como PD-1.
En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un inhibidor de PD-L1. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo contra PD-L1. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra PD-L1. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra PD-L1. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como PD-L1. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la interacción entre PD-1 y PD-L1.
En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un inhibidor de PD-L2. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo contra PD-L2. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra PD-L2. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra PD-L2. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como PD-L2. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la interacción entre PD-1 y PD-L2.
En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un inhibidor de LAG-3. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo contra LAG-3. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra LAG-3. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra LAG-3. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como LAG-3.
En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un inhibidor de B7-H4. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo contra B7-H4. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra B7-H4. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra B7-H4. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como B7-H4.
En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un inhibidor de KIR. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo contra KIR. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra KIR. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra KIR. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como KIR.
En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un inhibidor de TNFRSF4. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo contra TNFRSF4. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra TNFRSF4. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra TNFRSF4. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como TNFRSF4.
En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un inhibidor de OX40L. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo contra OX40L. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra OX40L. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra OX40L. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como OX40L. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la interacción entre TNFRSF4 y OX40L.
En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un inhibidor de IDO-1. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo contra IDO-1. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra IDO-1. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra IDO-1. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como IDO-1.
En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un inhibidor de IDO-2. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo contra IDO-2. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra IDO-2. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra IDO-2. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como IDO-2.
En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un inhibidor de CEACAM1. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo contra CEACAM1. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra CEACAM1. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra CEACAM1. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como CEACAM1.
En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un inhibidor de BTLA. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo contra BTLA. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra BTLA. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra BTLA. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como BTLA.
En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un inhibidor de TIM3. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo contra TIM3. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra TIM3. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra TIM3. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como TIM3.
En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un inhibidor de A2Ar. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo contra A2Ar. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra A2Ar. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra A2Ar. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como A2Ar.
En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un inhibidor de proteína VISTA. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo contra proteína VISTA. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra proteína VISTA. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra proteína VISTA. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como proteína VISTA.
Biosimilar
Los inmunoconjugados de la invención serán eficaces con constructos de anticuerpo que sean muy similares, o biosimilares, a los constructos de anticuerpo disponibles comercialmente o “innovadores”.
Razón DAR
Los inmunoconjugados de la invención pueden proporcionar cualquier razón DAR adecuada y deseable.
Los inmunoconjugados mostrados con razones DAR variables fueron todos ellos eficaces para activar células mieloides y provocar la secreción de citocinas. Los datos indican que los inmunoconjugados con razones DAR variables fueron todos ellos superiores para provocar la activación de APC, ya que CD40, CD86 y HLA-DR se expresaron a mayores niveles en APC estimuladas con inmunoconjugados en comparación con aquellas estimuladas con el anticuerpo solo. Los inmunoconjugados con DAR variables indujeron constantemente la regulación por disminución de CD14 y CD16 y aumentaron la expresión de CD123, en comparación con el anticuerpo solo. A partir de estos estudios, se espera que todas las razones DAR sean eficaces para provocar la activación de células mieloides.
Modificación del isotipo
La actividad de los inmunoconjugados de la invención puede modularse y, a menudo, mejorarse para la aplicación deseada mediante la modificación del isotipo.
Aproximadamente el 30% de la IgG humana está glicosilada dentro de la región Fab, y el anticuerpo en los inmunoconjugados de la invención puede contener una región Fab modificada por ingeniería con un patrón de glicosilación que no se produce de manera natural. Por ejemplo, pueden diseñarse por ingeniería genética hibridomas que secretan AcM afucosilado, AcM desialilado o Fc desglicosilada con mutaciones específicas que permiten una unión a FcRyNIa y una función efectora aumentadas.
Los anticuerpos para formar inmunoconjugados pueden contener residuos de cisteína modificados por ingeniería (es decir, que no se producen de manera natural) caracterizados por una reactividad alterada (por ejemplo, potenciada) frente a los reactivos usados para unir de manera covalente los restos de adyuvante a los anticuerpos. En determinadas realizaciones, un residuo de cisteína modificado por ingeniería tendrá un índice de reactividad de tiol en el intervalo de 0,6 a 1,0. En muchos casos, el anticuerpo modificado por ingeniería será más reactivo que el anticuerpo original.
En general, los residuos modificados por ingeniería son residuos de cisteína “libres” que no forman parte de los enlaces disulfuro. El término “índice de reactividad de tiol” es una caracterización cuantitativa de la reactividad de aminoácidos de cisteína libres. Tal como se usa en el presente documento, el término “índice de reactividad de tiol” se refiere al porcentaje de un aminoácido de cisteína libre en un anticuerpo modificado por ingeniería que reacciona con un reactante reactivo con tiol, convertido a un valor máximo de 1. Por ejemplo, un residuo de cisteína en un anticuerpo modificado por ingeniería que reacciona al 100% de rendimiento con un reactante reactivo con tiol, tal como una maleimida, para formar un anticuerpo modificado tiene un índice de reactividad de tiol de 1,0. Otro residuo de cisteína modificado por ingeniería en el mismo anticuerpo original o uno diferente que reacciona al 80% de rendimiento con un reactante reactivo con tiol tiene un índice de reactividad de tiol de 0,8. La determinación del índice de reactividad de tiol de un residuo de cisteína particular puede llevarse a cabo mediante ensayo ELISA, espectroscopía de masas, cromatografía de líquidos, autorradiografía u otras pruebas analíticas cuantitativas.
Los residuos de cisteína modificados por ingeniería pueden ubicarse en las cadenas pesadas del anticuerpo o en las cadenas ligeras del anticuerpo. En determinadas realizaciones, los residuos de cisteína modificados por ingeniería se ubican en la región Fc de las cadenas pesadas. Por ejemplo, los residuos de aminoácido en las posiciones L-15, L-43, L-110, L-144, L-168 en las cadenas ligeras de un anticuerpo o H-40, H-88, H-119, H-121, H-122, H-175 y H-179 en las cadenas pesadas de un anticuerpo pueden reemplazarse por residuos de cisteína. También pueden reemplazarse por residuos de cisteína intervalos de aproximadamente 5 residuos de aminoácido a cada lado de estas posiciones, es decir, de L-10 a L-20; de L-38 a L-48; de L-105 a L-115; de L-139 a L-149; de L-163 a L-173; de H-35 a H-45; de H-83 a H-93; de H-114 a H-127; y de H-170 a H-184, así como los intervalos en la región Fc seleccionados de: de H-268 a H-291; de H-319 a H-344; de H-370 a H-380; y de H-395 a H-405, para proporcionar anticuerpos modificados por ingeniería con cisteína útiles para formar inmunoconjugados. Se describen otros anticuerpos modificados por ingeniería, por ejemplo, en las patentes estadounidenses 7.855.275, 8.309.300 y 9.000.130.
Además de anticuerpos, pueden usarse armazones proteicos alternativos como parte de los inmunoconjugados. El término “armazón proteico alternativo” se refiere a una proteína o un péptido no derivado de inmunoglobulina. Tales proteínas y péptidos generalmente son susceptibles de modificarse por ingeniería y pueden diseñarse para conferir monoespecificidad contra un antígeno dado, biespecificidad o multiespecificidad. La modificación por ingeniería de un armazón proteico alternativo puede llevarse a cabo usando varios enfoques. Puede usarse un enfoque de injerto en bucle en el que se injertan secuencias de especificidad conocida en un bucle variable de un armazón. Pueden usarse aleatorización y mutagénesis de secuencia para desarrollar una biblioteca de mutantes, que pueden seleccionarse usando diversas plataformas de presentación (por ejemplo, presentación en fago) para identificar un novedoso ligador. También puede usarse mutagénesis específica de sitio como parte de un enfoque similar. Los armazones proteicos alternativos existen en una variedad de tamaños, que van desde péptidos pequeños con estructura secundaria mínima hasta proteínas grandes de tamaño similar a un anticuerpo de tamaño completo. Los ejemplos de armazones incluyen, pero no se limitan a, miniproteínas anudadas con cistina (también denominadas knotinas), miniproteínas anudadas con cistina cíclicas (también denominadas ciclotidas), avímeros, aficuerpos, el décimo dominio de tipo III de fibronectina humana, DARPin (repeticiones de anquirina diseñadas) y anticalinas (también denominadas lipocalinas). También pueden modificarse por ingeniería ligandos que se producen de manera natural con especificidad conocida para conferir una novedosa especificidad contra una diana dada. Los ejemplos de ligandos que se producen de manera natural que pueden modificarse por ingeniería incluyen el ligando EGF y el ligando VEGF. Las proteínas modificadas por ingeniería pueden producirse o bien como proteínas monoméricas o bien como multímeros, dependiendo de la estrategia de unión y las especificidades deseadas. Las estrategias de modificación por ingeniería de proteínas pueden usarse para fusionar armazones proteicos alternativos con dominios de Fc.
Grupo de unión
Puede usarse cualquier grupo de unión adecuado en el contexto de la invención siempre que ese grupo de unión pueda unirse al anticuerpo a través de un éster. Por ejemplo, el grupo de unión (“L”) puede tener la siguiente fórmula
Figure imgf000036_0001
en la que R está presente opcionalmente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo o heteroarilo lineal o ramificada, cíclica o abierta, saturada o insaturada que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono, y a es un número entero de desde 1 hasta 40. En algunas realizaciones, a es un número entero de desde 1 hasta 20. En algunas realizaciones, a es un número entero de desde 1 hasta 10. En algunas realizaciones, a es un número entero de desde 1 hasta 5. En algunas realizaciones, a es un número entero de desde 1 hasta 3. En determinadas realizaciones, R está presente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo o heteroarilo lineal o ramificada, cíclica o abierta, saturada o insaturada que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono.
El grupo de unión (“L”) puede tener la siguiente fórmula
Figure imgf000036_0002
L2
en la que a es un número entero de desde 1 hasta 40. En algunas realizaciones, a es un número entero de desde 1 hasta 20. En algunas realizaciones, a es un número entero de desde 1 hasta 10. En algunas realizaciones, a es un número entero de desde 1 hasta 5. En algunas realizaciones, a es un número entero de desde 1 hasta 3.
El grupo de unión (“L”) también puede tener la siguiente fórmula
Figure imgf000036_0003
en la que R está presente opcionalmente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo o heteroarilo lineal o ramificada, cíclica o abierta, saturada o insaturada que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono, cada A se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, y c es un número entero de desde 1 hasta 20. En algunas realizaciones, c es un número entero de desde 1 hasta 10. En algunas realizaciones, c es un número entero de desde 1 hasta 5. En algunas realizaciones, c es un número entero de desde 1 hasta 2. En determinadas realizaciones, R está presente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo o heteroarilo lineal o ramificada, cíclica o abierta, saturada o insaturada que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono.
El grupo de unión (“L”) también puede tener la siguiente fórmula
Figure imgf000037_0001
en la que R está presente opcionalmente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo o heteroarilo lineal o ramificada, cíclica o abierta, saturada o insaturada que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono, y c es un número entero de desde 1 hasta 20. En algunas realizaciones, c es un número entero de desde 1 hasta 10. En algunas realizaciones, c es un número entero de desde 1 hasta 5. En determinadas realizaciones, R está presente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo o heteroarilo lineal o ramificada, cíclica o abierta, saturada o insaturada que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono.
El grupo de unión (“L”) también puede tener la siguiente fórmula
Figure imgf000037_0002
en la que R está presente opcionalmente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo o heteroarilo lineal o ramificada, cíclica o abierta, saturada o insaturada que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono. En determinadas realizaciones, R está presente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo o heteroarilo lineal o ramificada, cíclica o abierta, saturada o insaturada que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono.
El grupo de unión (“L”) también puede tener la siguiente fórmula
Figure imgf000037_0003
L6
en la que R está presente opcionalmente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo o heteroarilo lineal o ramificada, cíclica o abierta, saturada o insaturada que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono. En determinadas realizaciones, R está presente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo o heteroarilo lineal o ramificada, cíclica o abierta, saturada o insaturada que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono.
El grupo de unión (“L”) también puede tener la siguiente fórmula
O
'a ra n ^ <
H
L7
en la que R está presente opcionalmente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo o heteroarilo lineal o ramificada, cíclica o abierta, saturada o insaturada que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono. En determinadas realizaciones, R está presente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo o heteroarilo lineal o ramificada, cíclica o abierta, saturada o insaturada que comprende desde 1 hasta 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono.
Los grupos de unión L1-L7 pueden usarse bilateralmente, lo que significa que el grupo de unión puede unirse al éster en cualquier extremo, designado por la línea ondulada
Éster en el método de conjugación
Tal como se comentó previamente, hay muchas maneras de formar un inmunoconjugado. Cada uno de los métodos de la técnica anterior presenta algunos inconvenientes. El presente método incluye un procedimiento de una sola etapa que conjuga un adyuvante, modificado para incluir un grupo de unión, con la cadena lateral de lisina de un anticuerpo (compuesto de fórmula II). Este procedimiento es posible mediante el uso de un éster. El éster puede ser cualquier éster adecuado capaz de conjugarse con un residuo de lisina de un anticuerpo.
Por ejemplo, el éster de fórmula I puede ser un éster de N-hidroxisuccinimida (“NHS”) de la fórmula:
Figure imgf000038_0001
en la que la línea ondulada
Figure imgf000038_0002
representa el punto de unión al grupo de unión (“L”).
El éster de fórmula I también puede ser un éster de sulfo-N-hidroxisuccinimida de la fórmula:
Figure imgf000038_0003
en la que M es cualquier catión y la línea ondulada representa el punto de unión al grupo de unión (“L”). Por ejemplo, el contraión del catión (“M”) puede ser un protón, amonio, una amina cuaternaria, un catión de un metal alcalino, un catión de un metal alcalinotérreo, un catión de un metal de transición, un catión de un metal de tierras raras, un catión de un elemento del grupo principal o una combinación de los mismos.
El éster de fórmula I también puede ser un éster de fenol de la fórmula:
Figure imgf000038_0004
en la que cada R2 se selecciona independientemente de hidrógeno, yodo, bromo, cloro o flúor y la línea ondulada representa el punto de unión al grupo de unión (“L”).
El éster de fórmula I también puede ser un éster de fenol de la fórmula:
Figure imgf000038_0005
(tetrafluorofenilo) o
Figure imgf000039_0001
(pentafluorofenilo), en la que la línea ondulada
Figure imgf000039_0002
representa el punto de unión al grupo de unión (“L”). Usar un tetrafluorofenilo (“TFP”) o pentafluorofenilo (“PFP”) es especialmente eficaz en los métodos de la invención.
La invención proporciona un método para producir un inmunoconjugado, comprendiendo el método combinar uno o más compuestos de fórmula I:
Figure imgf000039_0003
y un anticuerpo de fórmula II:
Figure imgf000039_0004
en el que la fórmula II es un anticuerpo con residuo
Figure imgf000039_0005
que representa uno o más residuos de lisina del anticuerpo, en una disolución acuosa tamponada a un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 9 hasta que al menos el 33% en mol del uno o más compuestos de fórmula I se conjuga con el anticuerpo de fórmula II para proporcionar el inmunoconjugado de fórmula III:
Figure imgf000039_0006
en la que
Ady es un adyuvante,
Z es -CH2-, -C(O)NH-, -C(O)O- o -C(O)-,
L es un grupo de unión,
E es un éster, y
r es el número promedio de adyuvantes unidos al anticuerpo y es un número positivo hasta aproximadamente 8,
en una primera disolución acuosa tamponada. En determinadas realizaciones, Z es -CH2- o -C(O)-.
El método comprende combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II hasta que al menos aproximadamente el 33% en mol (por ejemplo, al menos aproximadamente el 35% en mol, al menos aproximadamente el 36% en mol, al menos aproximadamente el 37% en mol, al menos aproximadamente el 38% en mol, al menos aproximadamente el 39% en mol, al menos aproximadamente el 40% en mol, al menos aproximadamente el 41% en mol, al menos aproximadamente el 42% en mol, al menos aproximadamente el 43% en mol, al menos aproximadamente el 44% en mol, al menos aproximadamente el 45% en mol, al menos aproximadamente el 46% en mol, al menos aproximadamente el 47% en mol, al menos aproximadamente el 48% en mol, al menos aproximadamente el 49% en mol o al menos aproximadamente el 50% en mol) del uno o más compuestos de fórmula I se conjuga con el anticuerpo de fórmula II para proporcionar el inmunoconjugado de fórmula III. En determinadas realizaciones, el método comprende combinar el uno o más compuestos de fórmula 1 y el anticuerpo de fórmula II en la disolución acuosa hasta que al menos el 40% en mol del uno o más compuestos de fórmula I se conjuga con el anticuerpo de fórmula II para proporcionar el inmunoconjugado de fórmula III. En otras realizaciones, el método comprende combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II en la disolución acuosa hasta que al menos el 50% en mol del uno o más compuestos de fórmula I se conjuga con el anticuerpo de fórmula II para proporcionar el inmunoconjugado de fórmula III.
En algunas realizaciones, el método comprende combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II durante un periodo de al menos aproximadamente 1 hora (por ejemplo, al menos aproximadamente 2 horas, al menos aproximadamente 3 horas, al menos aproximadamente 4 horas, al menos aproximadamente 5 hora, al menos aproximadamente 6 horas, al menos aproximadamente 8 horas, al menos aproximadamente 10 horas, al menos aproximadamente 12 horas, al menos aproximadamente 16 horas, al menos aproximadamente 20 horas, al menos aproximadamente 24 horas o al menos aproximadamente 48 horas). Alternativamente, o además, el método comprende combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II durante un periodo de no más de aproximadamente 48 horas (por ejemplo, no más de aproximadamente 36 horas, no más de aproximadamente 30 horas, no más de aproximadamente 24 horas, no más de aproximadamente 21 horas, no más de aproximadamente 18 horas, no más de aproximadamente 15 horas o no más de aproximadamente 12 horas). Por tanto, el método puede comprender combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II durante un periodo delimitado por cualesquiera dos de los puntos de extremo anteriormente mencionados. Por ejemplo, el método puede comprender combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II durante un periodo de desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 48 horas, desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 36 horas, desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 30 horas, desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 24 horas, desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 21 horas, desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 18 horas, desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 15 horas, desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 12 horas, desde aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 24 horas, desde aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 15 horas, desde aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 12 horas, desde aproximadamente 3 horas hasta aproximadamente 24 horas, desde aproximadamente 3 horas hasta aproximadamente 12 horas, desde aproximadamente 4 horas hasta aproximadamente 24 horas, desde aproximadamente 5 horas hasta aproximadamente 15 horas, desde aproximadamente 6 horas hasta aproximadamente 48 horas, desde aproximadamente 6 horas hasta aproximadamente 36 horas, desde aproximadamente 6 horas hasta aproximadamente 30 horas, desde aproximadamente 6 horas hasta aproximadamente 24 horas, desde aproximadamente 6 horas hasta aproximadamente 21 horas, desde aproximadamente 6 horas hasta aproximadamente 18 horas, desde aproximadamente 6 horas hasta aproximadamente 15 horas o desde aproximadamente 6 horas hasta aproximadamente 12 horas.
La cantidad del uno o más compuestos de fórmula I conjugados con el uno o más residuos de lisina del anticuerpo para formar el inmunoconjugado de fórmula III puede evaluarse mediante cualquier medio conocido por un experto en la técnica. En algunas realizaciones, el inmunoconjugado de fórmula III se analiza mediante CL/EM para determinar la cantidad del uno o más compuestos de fórmula I conjugados con el uno o más residuos de lisina del anticuerpo. En algunas realizaciones, el inmunoconjugado de fórmula III se somete a intercambio de tampón a PBS (pH 7,2) usando una columna SEPHADEX™-G25 para eliminar el exceso de impurezas de peso molecular pequeño, y la razón de fármaco con respecto a anticuerpo (“DAR”) se midió a 40°C, en función del tiempo. Sin desear estar vinculado a una teoría particular, se cree que una vez que la DAR alcanza una meseta para el inmunoconjugado de fórmula III incubado a 40°C, la DAR resultante puede considerarse como la cantidad del uno o más compuestos de fórmula I conjugados al uno o más residuos de lisina del anticuerpo.
La variable “r” se refiere al número promedio de adyuvantes unidos al anticuerpo. Por consiguiente, la variable “r” puede usarse como medio para describir la razón de fármaco con respecto a anticuerpo. Generalmente, r es un número positivo hasta aproximadamente 8 (por ejemplo, aproximadamente 0,5, aproximadamente 1, aproximadamente 1,5, aproximadamente 2, aproximadamente 2,5, aproximadamente 3, aproximadamente 3,5, aproximadamente 4, aproximadamente 4,5, aproximadamente 5, aproximadamente 5,5, aproximadamente 6, aproximadamente 6,5, aproximadamente 7, aproximadamente 7,5 o aproximadamente 8). Tal como se usa en el presente documento, un inmunoconjugado con un valor de r de aproximadamente 0 a aproximadamente 1 se refiere a una mezcla de inmunoconjugados que comprende una cantidad de anticuerpo no conjugado, de manera que la razón de fármaco con respecto a anticuerpo (“DAR”) promedio, o r, es desde un número positivo hasta aproximadamente 1. En algunas realizaciones, r es el número promedio de adyuvantes unidos al anticuerpo y es un número positivo hasta aproximadamente 4. En determinadas realizaciones, r es el número promedio de adyuvantes unidos al anticuerpo y es desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 4.
La razón de fármaco con respecto a anticuerpo deseable puede determinarse por un experto en la técnica dependiendo del efecto deseado del tratamiento. Por ejemplo, puede desearse una razón de fármaco con respecto a anticuerpo de más de 1,2. En una realización, puede desearse una razón de fármaco con respecto a anticuerpo de más de 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3,0, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 ó 9,0. En otra realización, puede ser deseable una razón de fármaco con respecto a anticuerpo de menos de 10,0, 9,0, 8,0, 7,0, 6,0, 5,0, 4,0, 3,8, 3,6, 3,4, 3,2, 3,0, 2,8, 2,6, 2,4, 2,2, 2,0, 1,8, 1,6, 1,4, 1,2, 0,8, 0,6, 0,4 ó 0,2. La razón de fármaco con respecto a anticuerpo puede evaluarse mediante cualquier medio conocido por un experto en la técnica.
El método para producir un inmunoconjugado de fórmula III comprende combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II en una disolución acuosa alcalina (es decir, con un pH de más de 7). El método para producir un inmunoconjugado de fórmula III comprende combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II en una disolución acuosa que está tamponada a un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 9, por ejemplo, de aproximadamente 7,6 a aproximadamente 9, de aproximadamente 7,7 a aproximadamente 9, de aproximadamente 7,8 a aproximadamente 9, de aproximadamente 7,9 a aproximadamente 9, de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 9, de aproximadamente 8 a aproximadamente 8,9, de aproximadamente 8 a aproximadamente 8,8, de aproximadamente 8 a aproximadamente 8,7, de aproximadamente 8 a aproximadamente 8,6, de aproximadamente 8,1 a aproximadamente 8,6, de aproximadamente 8,2 a aproximadamente 8,6, de aproximadamente 8,2 a aproximadamente 8,5 o de aproximadamente 8,2 a aproximadamente 8,4. Por consiguiente, el método para producir un inmunoconjugado de fórmula III comprende combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II en una disolución acuosa que está tamponada a un pH de aproximadamente 7,5, aproximadamente 7,6, aproximadamente 7,7, aproximadamente 7,8, aproximadamente 7,9, aproximadamente 8, aproximadamente 8,1, aproximadamente 8,2, aproximadamente 8,3, aproximadamente 8,4, aproximadamente 8,5, aproximadamente 8,6, aproximadamente 8,7, aproximadamente 8,8, aproximadamente 8,9 o aproximadamente 9. En realizaciones preferidas, el método para producir un inmunoconjugado de fórmula III comprende combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II en una disolución acuosa que está tamponada a un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 8,3.
El anticuerpo de fórmula II y el uno o más compuestos de fórmula I se combinan en cualquier tampón de disolución acuosa adecuado, de manera que la disolución acuosa tiene un pH alcalino. Una lista a modo de ejemplo de tampones de disolución acuosa o primera disolución acuosa tamponada adecuados es solución salina tamponada con TES, solución salina tamponada con HEPES, solución salina tamponada con DIPSO, solución salina tamponada con MOBS, solución salina tamponada con acetamidoglicina, solución salina tamponada con TAPSO, solución salina tamponada con TEA tamponada con fosfato, solución salina tamponada con POPSO, solución salina tamponada con HEPPSO, solución salina tamponada con EPS, solución salina tamponada con HEPPS, solución salina tamponada con tricina, solución salina tamponada con glicinamida, solución salina tamponada con glicilglicina, solución salina tamponada con HEPBS, solución salina tamponada con bicina, solución salina tamponada con TAPS, solución salina tamponada con AMPB, solución salina tamponada con fosfato, solución salina tamponada con borato y tampona solución salina con tris. En realizaciones preferidas, el tampón de disolución acuosa o la primera disolución acuosa tamponada es solución salina tamponada con borato. En otra realización preferida, el tampón de disolución acuosa o la primera disolución acuosa tamponada es solución salina tamponada con fosfato.
El método para producir un inmunoconjugado de fórmula III comprende combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II en una disolución acuosa a cualquier temperatura adecuada. En algunas realizaciones, el método para producir un inmunoconjugado de fórmula III comprende combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II en una disolución acuosa a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 50°C, por ejemplo, de aproximadamente 0°C a aproximadamente 45°C, de aproximadamente 0°C a aproximadamente 40°C, de aproximadamente 5°C a aproximadamente 40°C, de aproximadamente 10°C a aproximadamente 40°C, de aproximadamente 15°C a aproximadamente 40°C, de aproximadamente 20°C a aproximadamente 40°C, de aproximadamente 25°C a aproximadamente 40°C o de aproximadamente 25°C a aproximadamente 35°C. Por consiguiente, el método para producir un inmunoconjugado de fórmula III comprende combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II en una disolución acuosa a una temperatura de aproximadamente 1°C, aproximadamente 2°C, aproximadamente 3°C, aproximadamente 4°C, aproximadamente 5°C, aproximadamente 6°C, aproximadamente 7°C, aproximadamente 8°C, aproximadamente 9°C, aproximadamente 10°C, aproximadamente 11°C 12°C, aproximadamente 13°C, aproximadamente 14°C, aproximadamente 15°C 16°C, aproximadamente 17°C, aproximadamente 18°C, aproximadamente 19°C 20°C, aproximadamente 21°C, aproximadamente 22°C, aproximadamente 23°C 24°C, aproximadamente 25°C, aproximadamente 26°C, aproximadamente 27°C 28°C, aproximadamente 29°C, aproximadamente 30°C, aproximadamente 31°C 32°C, aproximadamente 33°C, aproximadamente 34°C, aproximadamente 35°C 36°C, aproximadamente 37°C, aproximadamente 38°C, aproximadamente 39°C 40°C, aproximadamente 41°C, aproximadamente 42°C, aproximadamente 43°C
Figure imgf000042_0001
44°C, aproximadamente 45°C, aproximadamente 46°C, aproximadamente 47°C
aproximadamente 48°C, aproximadamente 49°C o aproximadamente 50°C. En realizaciones preferidas, e método para producir un inmunoconjugado de fórmu a III comprende combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II en una disolución acuosa a una temperatura de aproximadamente 30°C.
En algunas realizaciones, la invención proporciona el inmunoconjugado de fórmula III en una primera disolución acuosa tamponada. Normalmente, la primera disolución acuosa tamponada es la misma que la disolución acuosa en la que se combinan el anticuerpo de fórmula II y el uno o más compuestos de fórmula I. Sin embargo, un experto habitual en la técnica entenderá que el pH, la temperatura y la composición química de la primera disolución acuosa tamponada pueden cambiar ligeramente en relación con la disolución acuosa debido a la combinación del anticuerpo de fórmula II y el uno o más compuestos de fórmula I para formar el inmunoconjugado de fórmula III.
Sin desear estar vinculado a una teoría particular, las técnicas convencionales para conjugar un resto químico con un anticuerpo usando un éster tal como NHS, TFP o PFP dan como resultado más de aproximadamente el 5% de conjugación con un aminoácido de tirosina del anticuerpo. A diferencia del enlace amida formado tras la conjugación con residuos de aminoácido de lisina, el enlace éster formado tras la conjugación con tirosina es inestable. Por consiguiente, la conjugación con tirosina da como resultado una estabilidad disminuida, una menor DAR para un número dado de equivalentes del uno o más compuestos de fórmula I e impurezas aumentadas (por ejemplo, el ácido formado tras la hidrólisis del éster conjugado con tirosina). Los métodos de la invención reducen la cantidad de conjugación con tirosina inicial, mejorando de ese modo la estabilidad del inmunoconjugado, la DAR para un número dado de equivalentes del uno o más compuestos de fórmula I y reduciendo las impurezas, lo que facilita el aislamiento del inmunoconjugado.
Por consiguiente, en algunas realizaciones, los métodos de la invención proporcionan una reducción de más del 5% de la conjugación con tirosina del uno o más compuestos de fórmula I con el anticuerpo de fórmula II en la primera disolución acuosa tamponada en relación con la conjugación con tirosina del uno o más compuestos de fórmula I con el anticuerpo de fórmula II en la primera disolución acuosa tamponada preparada al combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II en una disolución acuosa tamponada a un pH de menos de 7,5 usando solución salina tamponada con fosfato, en los que todas las condiciones de reacción son idénticas excepto por el tampón. En otra realización, los métodos de la invención proporcionan una reducción de más del 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65% o el 70% de la conjugación con tirosina del uno o más compuestos de fórmula I con el anticuerpo de fórmula II en la primera disolución acuosa tamponada en relación con la conjugación con tirosina del uno o más compuestos de fórmula I con el anticuerpo de fórmula II en la primera disolución acuosa tamponada preparada al combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II en una disolución acuosa tamponada a un pH de menos de 7,5 usando solución salina tamponada con fosfato, en los que todas las condiciones de reacción son idénticas excepto por el tampón. El nivel de conjugación con tirosina puede evaluarse mediante cualquier medio conocido por un experto en la técnica o descrito en el presente documento.
Puede combinarse cualquier número adecuado de equivalentes del uno o más compuestos de fórmula I con el anticuerpo de fórmula II para lograr la razón de fármaco con respecto a anticuerpo deseable, siempre que al menos el 33% en mol del uno o más compuestos de fórmula I se conjugue con el anticuerpo de fórmula II para proporcionar el inmunoconjugado de fórmula III. Por consiguiente, pueden combinarse aproximadamente 0,1 equivalentes o más del uno o más compuestos de fórmula I con el anticuerpo de fórmula II, por ejemplo, aproximadamente 0,5 equivalentes o más, aproximadamente 1 equivalente o más, aproximadamente 1.5 equivalentes o más, aproximadamente 2 equivalentes o más, aproximadamente 2,5 equivalentes o más, aproximadamente 3 equivalentes o más, aproximadamente 3,5 equivalentes o más, aproximadamente 4 equivalentes o más, aproximadamente 4,5 equivalentes o más, aproximadamente 5 equivalentes o más, aproximadamente 5,5 equivalentes o más, aproximadamente 6 equivalentes o más, aproximadamente 6.5 equivalentes o más, aproximadamente 7 equivalentes o más, aproximadamente 7,5 equivalentes o más, aproximadamente 8 equivalentes o más, aproximadamente 8,5 equivalentes o más, aproximadamente 9 equivalentes o más, aproximadamente 9,5 equivalentes o más, aproximadamente 10 equivalentes o más, aproximadamente 11 equivalentes o más, aproximadamente 12 equivalentes o más, aproximadamente 13 equivalentes o más, aproximadamente 14 equivalentes o más, aproximadamente 15 equivalentes o más, aproximadamente 16 equivalentes o más, aproximadamente 17 equivalentes o más, aproximadamente 18 equivalentes o más, aproximadamente 19 equivalentes o más o aproximadamente 20 equivalentes o más. Alternativamente, o además, pueden combinarse aproximadamente 50 equivalentes o menos del uno o más compuestos de fórmula I con el anticuerpo de fórmula II, por ejemplo, aproximadamente 45 equivalentes o menos, aproximadamente 40 equivalentes o menos, aproximadamente 35 equivalentes o menos, aproximadamente 30 equivalentes o menos, aproximadamente 25 equivalentes o menos, aproximadamente 20 equivalentes o menos, aproximadamente 18 equivalentes o menos, aproximadamente 16 equivalentes o menos, aproximadamente 14 equivalentes o menos, aproximadamente 12 equivalentes o menos, aproximadamente 10 equivalentes o menos, aproximadamente 8 equivalentes o menos, aproximadamente 6 equivalentes o menos o aproximadamente 4 equivalentes o menos. Por tanto, el número de equivalentes del uno o más compuestos de fórmula I combinados con el anticuerpo de fórmula II puede estar delimitado por cualesquiera dos de los puntos de extremo anteriormente mencionados. Por ejemplo, el número de equivalentes del uno o más compuestos de fórmula I combinados con el anticuerpo de fórmula II puede ser de desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 50, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 40, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 30, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20, desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 50, desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 40, desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 30, desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 20, desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 50, desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 40, desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 30, desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 20, desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 50, desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 40, desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 30, desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 20, desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 30, desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 20, desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 40, desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 20, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 20, desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 50, desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 30, desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 20, desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 16, desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 12, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 4, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 6, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 8, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 12, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 16, desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 4, desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 6, desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 8 o desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 12.
En algunas realizaciones, los métodos de la invención proporcionan un aumento de más del 5% en el rendimiento del inmunoconjugado de fórmula III en comparación con los métodos de conjugación de la técnica anterior (por ejemplo, el método de SATA). En otra realización, los métodos de la invención proporcionan un aumento de más del 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65% o el 70% en el rendimiento del inmunoconjugado de fórmula III en comparación con los métodos de conjugación de la técnica anterior (por ejemplo, el método de SATA o el método de síntesis de '528). El rendimiento puede evaluarse mediante cualquier medio conocido por un experto en la técnica.
En algunas realizaciones, los métodos de la invención proporcionan una reducción de más del 5% de impurezas detectables antes de la purificación en comparación con los métodos de conjugación de la técnica anterior (por ejemplo, el método de SATA). En otra realización, los métodos de la invención proporcionan una disminución de más del 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65% o el 70% de impurezas detectables antes de la purificación en comparación con los métodos de conjugación de la técnica anterior (por ejemplo, el método de SATA o el método de síntesis de '528). El nivel de impurezas detectables puede evaluarse mediante cualquier medio conocido por un experto en la técnica. Las impurezas pueden incluir, por ejemplo, grupos tiol libres, anticuerpo no conjugado, adyuvante no conjugado, ácido formado tras la hidrólisis de sitios de conjugación no deseados y moléculas de grupos de unión.
En algunas realizaciones, los métodos de la invención proporcionan una reducción de más del 5% en la agregación antes de la purificación en comparación con los métodos de conjugación de la técnica anterior (por ejemplo, los métodos de síntesis de '528). En otra realización, los métodos de la invención proporcionan una disminución de más del 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65% o el 70% en la agregación antes de la purificación en comparación con los métodos de conjugación de la técnica anterior (por ejemplo, los métodos de síntesis de '528). El nivel de agregación puede evaluarse mediante cualquier medio conocido por un experto en la técnica.
En algunas realizaciones, los métodos de la invención proporcionan una reducción de más del 5% en la agregación antes de la purificación en comparación con los métodos de conjugación de la técnica anterior (por ejemplo, el método de SATA). En otra realización, los métodos de la invención proporcionan una disminución de más del 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65% o el 70% en la agregación antes de la purificación en comparación con los métodos de conjugación de la técnica anterior (por ejemplo, el método de SATA). El nivel de agregación puede evaluarse mediante cualquier medio conocido por un experto en la técnica.
En algunas realizaciones, los métodos de la invención proporcionan un aumento de más del 5% en el rendimiento del inmunoconjugado de fórmula III en comparación con el método de conjugación de combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II en una disolución acuosa tamponada a un pH de menos de 7,5 usando solución salina tamponada con fosfato, en los que todas las condiciones de reacción son idénticas excepto por el tampón. En otra realización, los métodos de la invención proporcionan un aumento de más del 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65% o el 70% en el rendimiento del inmunoconjugado de fórmula III en comparación con el método de conjugación de combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II en una disolución acuosa tamponada a un pH de menos de 7,5 usando solución salina tamponada con fosfato, en los que todas las condiciones de reacción son idénticas excepto por el tampón. El rendimiento puede evaluarse mediante cualquier medio conocido por un experto en la técnica.
En algunas realizaciones, los métodos de la invención proporcionan una reducción de más del 5% de impurezas detectables en el inmunoconjugado de fórmula III en la primera disolución acuosa tamponada en relación con un inmunoconjugado de fórmula III en una primera disolución acuosa tamponada preparada al combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II en una disolución acuosa tamponada a un pH de menos de 7,5 usando solución salina tamponada con fosfato, en los que todas las condiciones de reacción son idénticas excepto por el tampón. En otra realización, los métodos de la invención proporcionan una reducción de más del 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65% o el 70% de impurezas detectables en el inmunoconjugado de fórmula III en la primera disolución acuosa tamponada en relación con un inmunoconjugado de fórmula III en una primera disolución acuosa tamponada preparada al combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II en una disolución acuosa tamponada a un pH de menos de 7,5 usando solución salina tamponada con fosfato, en los que todas las condiciones de reacción son idénticas excepto por el tampón. El nivel de impurezas detectables puede evaluarse mediante cualquier medio conocido por un experto en la técnica. Las impurezas pueden incluir, por ejemplo, grupos tiol libres, anticuerpo no conjugado, adyuvante no conjugado, ácido formado tras la hidrólisis de sitios de conjugación no deseados y moléculas de grupos de unión.
En algunas realizaciones, los métodos de la invención proporcionan una razón de fármaco con respecto a anticuerpo mejorada antes de la purificación para un número dado de equivalentes del resto adyuvante/grupo de unión en comparación con el método de conjugación de combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II en una disolución acuosa tamponada a un pH de menos de 7,5 usando solución salina tamponada con fosfato, en los que todas las condiciones de reacción son idénticas excepto por el tampón. En algunas realizaciones, se conjuga al menos aproximadamente el 33% del uno o más compuestos de fórmula I con un residuo de lisina del anticuerpo, por ejemplo, al menos aproximadamente el 35%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 45% o al menos aproximadamente el 50%. Por consiguiente, la DAR del inmunoconjugado de fórmula III en la primera disolución acuosa tamponada será al menos aproximadamente el 33% del número de equivalentes del uno o más compuestos de fórmula I, por ejemplo, al menos aproximadamente el 35%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 45% o al menos aproximadamente el 50%.
En una realización, los métodos de la invención proporcionan una reducción de más del 5% en la agregación antes de la purificación en comparación con el método de conjugación de combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II en una disolución acuosa tamponada a un pH de menos de 7,5 usando solución salina tamponada con fosfato, en los que todas las condiciones de reacción son idénticas excepto por el tampón. En otra realización, los métodos de la invención proporcionan una disminución de más del 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65% o el 70% en la agregación antes de la purificación en comparación con el método de conjugación de combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II en una disolución acuosa tamponada a un pH de menos de 7,5 usando solución salina tamponada con fosfato, en los que todas las condiciones de reacción son idénticas excepto por el tampón. El nivel de agregación puede evaluarse mediante cualquier medio conocido por un experto en la técnica.
Tal como se usa en el presente documento, el término “agregación” puede referirse a la formación de grandes agrupaciones enmarañadas de inmunoconjugados o anticuerpos desnaturalizados (es decir, agregados). Por ejemplo, los agregados pueden ser anticuerpos desnaturalizados formados a partir de la desorganización de los enlaces disulfuro.
En algunas realizaciones, el método comprende además purificar el inmunoconjugado de fórmula III en la primera disolución acuosa tamponada y/o la segunda disolución acuosa tamponada. La purificación del inmunoconjugado de fórmula III en la primera disolución acuosa tamponada y/o la segunda disolución acuosa tamponada puede producirse mediante cualquier medio adecuado. Por ejemplo, el inmunoconjugado de fórmula III en la primera disolución acuosa tamponada y/o la segunda disolución acuosa tamponada puede purificarse mediante cromatografía en columna (por ejemplo, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de interacción hidrófoba o cromatografía de modo mixto), centrifugación, filtración o cristalización.
En algunas realizaciones, el método para producir un inmunoconjugado de fórmula III comprende almacenar el inmunoconjugado de fórmula III a un pH menor que el pH al que se sintetizó el inmunoconjugado. Sin desear estar vinculado a una teoría particular, se cree que el inmunoconjugado es más estable en disoluciones acuosas neutras (es decir, un pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5) y/o ácidas (es decir, un pH de menos de 7). Por consiguiente, el inmunoconjugado de fórmula III puede someterse a intercambio de tampón a una segunda disolución acuosa tamponada que está tamponada a un pH de aproximadamente 7,5 o menos, por ejemplo, aproximadamente 7,4 o menos, aproximadamente 7,3 o menos, aproximadamente 7,2 o menos, aproximadamente 7,1 o menos, aproximadamente 7 o menos, aproximadamente 6,9 o menos, aproximadamente 6,8 o menos, aproximadamente 6,7 o menos, aproximadamente 6,6 o menos, aproximadamente 6,5 o menos, aproximadamente 6,4 o menos, aproximadamente 6,3 o menos, aproximadamente 6,2 o menos, aproximadamente 6,1 o menos o aproximadamente 6 o menos. En determinadas realizaciones, el inmunoconjugado de fórmula III se sintetiza en una primera disolución acuosa tamponada alcalina y se almacena en una segunda disolución acuosa tamponada ácida.
En algunas realizaciones, el método comprende además (iii) realizar un intercambio de tampón en la primera disolución acuosa tamponada del inmunoconjugado de fórmula III para proporcionar una segunda disolución acuosa tamponada que está tamponada a un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 7,5. En determinadas realizaciones, el método comprende además (iii) realizar un intercambio de tampón en la primera disolución acuosa tamponada del inmunoconjugado de fórmula III para proporcionar una segunda disolución acuosa tamponada que está tamponada a un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 7,5. En realizaciones preferidas, el método comprende además (iii) realizar un intercambio de tampón en la primera disolución acuosa tamponada del inmunoconjugado de fórmula III para proporcionar una segunda disolución acuosa tamponada que está tamponada a un pH de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,4.
El inmunoconjugado de fórmula III puede someterse a intercambio de tampón a cualquier tampón de segunda disolución acuosa adecuado. En algunas realizaciones, el tampón de segunda disolución acuosa son disoluciones acuosas neutras (es decir, un pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5) o ácidas (es decir, un pH de menos de 7). Una lista a modo de ejemplo de tampones de segunda de disolución acuosa adecuados es solución salina tamponada con MOPS, solución salina tamponada con cloruro de colamina, solución salina tamponada con MOPSO, solución salina tamponada con ACES, solución salina tamponada con PIPES, solución salina tamponada con bis-tris propano, solución salina tamponada con ACES, solución salina tamponada con ADA, solución salina tamponada con bis-tris metano, solución salina tamponada con MES, solución salina tamponada con fosfato, solución salina tamponada con citrato y solución salina tamponada con BES. En realizaciones preferidas, la segunda disolución acuosa se tampona con solución salina tamponada con fosfato.
Formulación y administración de inmunoconjugado
La presente divulgación proporciona una composición que comprende el inmunoconjugado tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la composición comprende además uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, los inmunoconjugados tal como se describen en el presente documento pueden formularse para administración parenteral, tal como administración intravenosa (i.v.) o administración a una cavidad o luz corporal de un órgano. Alternativamente, los inmunoconjugados pueden inyectarse por vía intratumoral. Las formulaciones para inyección comprenderán habitualmente una disolución del inmunoconjugado disuelto en un portador farmacéuticamente aceptable. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran el agua y la solución de Ringer, un cloruro de sodio isotónico. Además, convencionalmente pueden emplearse aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este propósito, puede emplearse cualquier aceite fijo insípido incluyendo monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, del mismo modo pueden usarse ácidos grasos tales como el ácido oleico en la preparación de inyectables. Estas disoluciones son estériles y generalmente están libres de materia no deseable. Estas formulaciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las formulaciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de tamponamiento y ajuste del pH, agentes de ajuste de la toxicidad, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentración del inmunoconjugado en estas formulaciones puede variar ampliamente, y se seleccionará principalmente basándose en los volúmenes de líquido, las viscosidades, el peso corporal, y similares, según el modo de administración particular seleccionado y las necesidades del paciente. En determinadas realizaciones, la concentración de un inmunoconjugado en una formulación de disolución para inyección oscilará entre aproximadamente el 0,1% (p/p) y aproximadamente el 10% (p/p).
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un inmunoconjugado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o la composición para su uso en el tratamiento de cáncer. El uso incluye comprender la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inmunoconjugado una composición tal como se describió anteriormente a un sujeto que lo necesita. Por ejemplo, el uso puede incluir administrar el inmunoconjugado para proporcionar una dosis de desde aproximadamente 100 ng/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg al sujeto. La dosis de inmunoconjugado puede oscilar entre aproximadamente 10 |ig/kg y aproximadamente 5 mg/kg o entre aproximadamente 100 |ag/kg y aproximadamente 1 mg/kg. La dosis de inmunoconjugado puede ser de aproximadamente 100, 200, 300, 400 ó 500 |ag/kg. La dosis de inmunoconjugado puede ser de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 mg/kg. La dosis de inmunoconjugado también puede encontrarse fuera de estos intervalos, dependiendo del conjugado particular así como del tipo y la gravedad del cáncer que esté tratándose. La frecuencia de administración puede oscilar entre una dosis única y múltiples dosis a la semana, o con más frecuencia. En algunas realizaciones, el inmunoconjugado se administra desde aproximadamente una vez al mes hasta aproximadamente cinco veces a la semana. En algunas realizaciones, el inmunoconjugado se administra una vez a la semana.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención pero, por supuesto, no deben interpretarse como limitativos de su alcance en modo alguno.
Ejemplo 1. Síntesis de un adyuvante de TLR7/TLR8
Se utilizaron las siguientes etapas para preparar un adyuvante de TLR7/TLR8 adecuado para su conjugación con un anticuerpo para formar un inmunoconjugado de la invención.
Esquema 1
Figure imgf000046_0001
Se añadió lentamente ácido nítrico helado (0°C) (70%, 160 ml) al quinolin-2,4-diol I (100 g, 621 mmol) en 600 ml de ácido acético glacial y se agitó en un baño de hielo. Se retiró la mezcla del baño de hielo y luego se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Luego se enfrió la mezcla hasta 0°C. Se añadió lentamente un litro de agua a la mezcla para precipitar un sólido amarillo. Se agitó vigorosamente la mezcla durante 15 minutos y luego se filtró. Se resuspendió el sólido en 1 l de agua, se agitó vigorosamente durante 15 minutos y se filtró de nuevo. Se resuspendió de nuevo el sólido en 1 l de agua mientras se añadía lentamente NaHCO3 sólido para llevar el pH a más de 6 y luego se filtró durante la noche. Se resuspendió el sólido en 750 ml de etil éter y se agitó vigorosamente para crear una suspensión fina. Se filtró la suspensión, se resuspendió de nuevo el sólido en 750 ml de etil éter, se agitó vigorosamente para crear una suspensión fina y se filtró bajo succión durante la noche. El procedimiento produjo 112 g de II (88%) de un sólido amarillo.
Esquema 2
Figure imgf000046_0002
Se añadió lentamente trietilamina (60 ml, 44 g, 0,44 mol, 3 eq.) a 300 ml de POCb a temperatura ambiente. Se calentó la mezcla hasta 90°C. Se añadió lentamente nitro-diol 11 (30 g, 145 mmol, 1 eq.) a la mezcla en porciones de 1 g a lo largo de 30 minutos. Luego se calentó la mezcla a 90°C durante 45 minutos. Luego se enfrió la mezcla hasta 0°C y se añadió hielo y agua fría a la mezcla con agitación vigorosa hasta que alcanzó un volumen total de 1,2 l. Se agitó vigorosamente la mezcla y luego se decantó las aguas madre líquidas y se añadió 1 l de agua al sólido oscuro restante. Se rascaron las paredes del matraz para retirar el sólido pegajoso y crear una suspensión, y luego se filtró. Se resuspendió el sólido en un litro de agua y luego se añadió lentamente NaHCO3 sólido hasta que el pH fue de más de 6. Se retiró por filtración el sólido y luego se disolvió en 500 ml de EtOAc. Se filtró el sólido en bruto para retirar las impurezas insolubles. Se lavó el filtrado con NaHCO3 saturado, agua y salmuera, y luego se separó. Se secó la fase orgánica con Na2SO4, se filtró y se concentró a vacío. Se trituró el sólido de color marrón que se formó con 500 ml de dietil éter/hexanos 1:1 y se filtró. Se usó el sólido de color bronceado III (22 g, 30 mmol, 62%) como tal en la siguiente reacción.
Figure imgf000047_0001
Se añadió N O 26H2O (0,35 g, 1,5 mmol, 0,05 eq.) a una disolución de compuesto de nitro-didoro III (22 g, 30 mmol, 1 eq.) en 600 ml de metanol y 60 ml de agua a 0°C. Se añadieron gránulos de borohidruro de sodio (75 mmol, 2,5 eq.) y se agitó la reacción durante 1 hora a 0°C y luego se calentó hasta temperatura ambiente con agitación durante 1 hora adicional. Se añadió ácido acético glacial en partes para neutralizar cualquier NaBH4 sin reaccionar hasta que se obtuvo un pH de aproximadamente 5. Se filtró la disolución de color negro a través de un lecho de Celite para retirar el material insoluble de color negro. Se eliminó el disolvente a vacío. Se trituró el sólido de color marrón oscuro con éter y luego se filtró para obtener un sólido de color bronceado IV (13,3 g, 62 mmol, 69%) que se usó en la siguiente reacción.
Esquema 4
Figure imgf000047_0002
Se añadió una disolución de N-Boc-1,4-diaminobutano (12,8 g, 1,1 eq.) en 60 ml de DMF a una disolución de compuesto de amino-dicloro IV (13,3 g, 62 mmol, 1 eq.) y K2CO3 sólido (17 g, 124 mmol, 2 eq.) en 250 ml de DMF a 0°C a lo largo de 30 minutos. Luego se calentó la reacción hasta temperatura ambiente y se agitó durante 30 minutos adicionales. Se añadió agua (800 ml) a la mezcla y se agitó. Se eliminó por vertido el sobrenadante y se disolvió el sólido húmedo en 500 ml de acetato de etilo. Se lavó la disolución con 500 ml de salmuera, se separó, se secó con Na2SO4, se filtró y se concentró a vacío. Se trituró el sólido de color marrón con 400 ml de dietil éter y se filtró para obtener un sólido amarillo V (14 g, 38 mmol, 62%) que se usó como tal en la siguiente reacción.
Esquema 5
Figure imgf000047_0003
A una disolución de compuesto de amino V (14 g, 38 mmol, 1 eq.) en 250 ml de DMF que contenía K2CO3 (13,8 g, 76 mmol, 2 eq.) y con agitación a 50°C se le añadió cloruro de valeroílo puro (5,5 ml, 5,5 g, 42 mmol, 1,2 eq). Se agitó la mezcla durante 10 minutos a 50°C, luego se añadió otra adición de cloruro de valeroílo (2,8 ml, 2,8 g, 21 mmol, 0,6 eq.). Después de la agitación durante 20 minutos adicionales a 50°C, se añadió hielo y luego agua hasta un volumen final de 1 l. Se agitó vigorosamente la mezcla hasta que se formó un sobrenadante transparente. Se eliminó por vertido el sobrenadante y se disolvió el sólido en bruto en 400 ml de acetato de etilo y se filtró a través de un lecho de Celite. Se lavó el filtrado con 400 ml de agua, 400 ml de salmuera, se separó, luego se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró. Se trituró el sólido con éter, se filtró y secó bajo succión. Se usó el sólido de color marrón VI obtenido (11,4 g, 25 mmol, 70%) como tal en la siguiente reacción.
E squ em a 6
Figure imgf000048_0001
Se calentó una mezcla de amida VI (10,5 g, 23,3 mmol, 1 eq.) y ácido 2-nitrobenzoico (3,0 g, 18,7 mmol. 0,8 eq.) y tamices moleculares en forma de polvo (4Á, 10 g) en tolueno a 120°C durante 4 horas. Se enfrió la reacción hasta temperatura ambiente y se eliminó el disolvente. En un vaso de precipitados de 1 l, la mezcla se suspendió jarabe en 400 ml de acetato de etilo y se filtró a través de Celite. Al filtrado, se le añadieron 400 ml de agua y 20 ml de NaHCO3 acuoso saturado y luego se agitó vigorosamente durante 15 minutos. Se transfirió la mezcla a un embudo de separación y se retiró la fase acuosa. Se lavó la fase orgánica con salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró y se concentró. Se trituró el producto en bruto con 100 ml de dietil éter/acetato de etilo (3:1), se filtró y se secó a vacío. Se usó el sólido de color bronceado VII resultante (6,4 gramos, 64%) como tal en la siguiente reacción.
Esquema 7
Figure imgf000048_0002
Se añadieron 2,4-dimetoxibencilamina pura (12,8 ml, 11,5 g, 69 mmol, 4,7 eq.) y K2CO3 granular (4,1 g, 30 mmol, 2 eq.) a la cloroquinolina sólida VII (6,4 g, 14,8 mmol, 1 eq.). Se calentó la mezcla hasta 100°C durante 3 horas. Se enfrió la mezcla y se repartió entre agua y acetato de etilo (400 ml cada uno) en un vaso de precipitados. Se añadió lentamente ácido acético (7 ml) y se agitó vigorosamente la mezcla durante 15 minutos. Se midió que el pH de la fase acuosa era aproximadamente 5. Se separaron las fases, y se lavó la fase orgánica con agua, salmuera, se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró para dar un jarabe. Se colocó el jarabe en un baño de hielo y se añadieron lentamente 60 ml de HCl concentrado. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos, luego se calentó hasta reflujo durante 3 horas. Se enfrió la disolución en un baño de hielo y luego se diluyó con 300 ml de agua. Se agitó la disolución en un baño de hielo mientras se añadía lentamente NaOH sólido (29 g, 725 mmol) hasta que se logró un pH básico. Se calentó la disolución hasta temperatura ambiente y se agitó vigorosamente. Se añadió NaCl sólido hasta que se logró una disolución saturada. Se lavó esta fase acuosa 3 veces con 400 ml de isopropanol al 10%/diclorometano. Se secaron las fases orgánicas combinadas con Na2SO4, se filtraron y se concentraron. Se filtró el jarabe de color marrón resultante a través de un tapón de sílice de 30 g con acetato de etilo. Se eluyó el tapón con acetato de etilo hasta que se retiraron las impurezas menos polares, luego con metanol al 10%/diclorometano hasta que se eluyó completamente el producto.
Después de la concentración, se obtuvo un sólido de color marrón VIII (3,7 gramos, 12 mmol, 80% para dos etapas). Este material tenía una pureza de más del 90-95% mediante CL/EM.
Ejemplo 2. Síntesis de inmunoconjugado BB5 con un éster de tetrafluorofenilo (“TFP”)
Se preparó una disolución madre 20 mM de adyuvante activado con TFP XI según los esquemas 8, 9 y 10. Esquema 8
Figure imgf000049_0001
Este ejemplo proporciona pautas sobre la síntesis de un inmunoconjugado usando el método de éster de TFP. Se disolvió el compuesto VIII (311 mg, 1 mmol) en 10 ml de dimetilformamida (DMF) y luego se añadieron 2 equivalentes molares de diisopropiletilamina (DIPEA). Se disolvió un grupo de unión SMCC (1,5 mmol) en 10 ml de diclorometano y se añadió en una porción a VIII. Se agitó la reacción durante la noche a 20°C y se concentró hasta sequedad a través de evaporación rotativa. Se purificó el producto en bruto IX sobre un gel de sílice usando un sistema de cromatografía ultrarrápida de Buchi cargado con un cartucho desechable de 12 g y se eluyó con un gradiente del 0-10% de metanol a lo largo de 15 minutos. Se combinaron las fracciones puras y se evaporaron hasta sequedad para proporcionar 160 mg de un sólido de color amarillo pálido IX.
Esquema 9
Figure imgf000049_0002
Se disolvió el compuesto IX (0,1 mmol, 53 mg) en 10 ml de diclorometano y luego se añadieron 2 equivalentes de ácido tioacético de una sola vez. Se concentró la mezcla hasta sequedad a vacío y se lavó el residuo tres veces con 5 ml de dietil éter.
Esquema 10
Figure imgf000049_0003
Se disolvió el compuesto X (6,2 mg, 0,01 mmol) en 2 ml de THF y luego se añadieron 5 mg de tetrafluorofenol. Luego se añadieron 5 mg de diciclohexilcarbodiimida (DCC). Se agitó la mezcla durante la noche a temperatura ambiente y luego se concentró hasta sequedad a vacío. Se purificó el producto en bruto XI a través de cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (columna preempaquetada de 4 gramos) y se eluyó con el 0-10% de MeOH en diclorometano. Se combinaron las fracciones puras y se evaporaron para proporcionar 3,6 mg de XI puro (confirmado mediante CL/EM). Luego se usó el éster de TFP X i en la etapa de conjugación con el anticuerpo a continuación.
Esquema 11
Figure imgf000050_0001
igG
Se sometió a intercambio de tampón un anticuerpo IgG1 (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituximab) a PBS a un pH de 7,2 y se diluyó hasta 10 mg/ml (66 |iM). Se añadió el adyuvante activado con TFP, XI, a DMSO y se añadieron 6 equivalentes molares (en relación con IgG) a 1 ml de la disolución de anticuerpo (10 mg) en una porción. Se invirtió la mezcla varias veces para mezclarla y se incubó durante la noche a 20°C. Se purificó el inmunoconjugado resultante (“BB5”) a través de intercambio de tampón a PBS (pH 7,2) usando una columna de cromatografía de exclusión molecular PD10 (SEPHADEX™-G25). Se agruparon las fracciones puras y se determinó la concentración midiendo la absorbancia a 280 nm en un espectrofotómetro Nanodrop. El rendimiento fue de 8 miligramos o de aproximadamente el 80% basándose en la proteína recuperada. Se esterilizó por filtración el producto de inmunoconjugado a través de un filtro de jeringa de 2 |im y se almacenó a 4°C hasta que fuera necesario.
La caracterización de la DAR del inmunoconjugado resultante se realizó a través de análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (“CL/EM”) en un sistema de UPLC (Waters Acquity) equipado con un detector de espectrómetro de masas-QToF Xevo XS. El análisis se realizó a través de la inyección de 5 |ig del inmunoconjugado en una columna BEH200 C4 (2,1 mm de diámetro x 50 mm de longitud) eluida con un gradiente del 10-90% de acetonitrilo:agua a lo largo de 4 minutos.
El análisis indicó que los inmunoconjugados sintetizados a través del método de TFP demostraban una DAR mayor que el inmunoconjugado sintetizado usando el método de SATA. Además, el método de TFP produjo inmunoconjugados con cantidades reducidas de anticuerpo no conjugado (sólo aproximadamente el 5%) en comparación con el método de síntesis de SATA (aproximadamente el 20%) (compárense las figuras 1A y 1B). El análisis por cromatografía de exclusión molecular (“SEC”) de BB5 se realizó para determinar la pureza monomérica. El análisis se realizó en una columna BEH200 SEC eluida con PBS (pH 7,2) y a 0,2 ml/min. El inmunoconjugado BB5 sintetizado usando el método de éster activado con TFP contenía menos del 2% de agregado de alto peso molecular (figura 2B) en comparación con más del 8% de agregado observado cuando se usó el método de SATA (figura 2A).
Ejemplo 3. Síntesis de inmunoconjugado BB1 con un éster de pentafluorofenilo (“PFP”)
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Este ejemplo proporciona pautas sobre la síntesis de un inmunoconjugado usando el método de éster de PFP. La modificación con éster del adyuvante y la conjugación del adyuvante modificado con el anticuerpo se muestran anteriormente en el esquema 12. Se disolvió ciclohexano-trans-1,4-dicarboxilato (1 g) en 10 ml de dimetilformamida (“DMF”) y se añadió hexafluorofosfato de 3-óxido de 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio) (“HATU”) (1 mmol) seguido de 1 ml de W-etil-W-(propan-2-il)propan-2-amina (“DIPEA”). Se añadió el compuesto 1 (311 mg) y se agitó la mezcla durante la noche a 20°C. Se diluyó la mezcla de reacción con 50 ml de diclorometano (“DCM”) y se lavó con 20 ml de HCl 1 N. Se evaporó la fase de DCM hasta sequedad y se purificó el producto sobre gel de sílice eluida con el 0-10% de MeOH en DCM que contenía ácido acético al 1%. Se concentraron las fracciones puras para proporcionar 220 mg de ácido purificado II. Se disolvió el compuesto II (100 mg) en THF y se añadieron 100 mg de HATU seguido de 200 p.l de DIPEA. Se añadieron dos equivalentes de carboxilato de amino-PEG2-terc-butilo y se agitó durante una hora a 20°C. Se concentró la mezcla hasta sequedad y se añadieron 10 mililitros de HCl 4 N en dioxano. Se concentró la mezcla hasta sequedad y se purificó el producto en bruto III mediante HPLC preparativa para proporcionar 40 mg de compuesto III.
Se convirtió el compuesto III en el éster de PFP IV tal como se describe a continuación. Se añadió el compuesto III (35 mg) a 50 mg de PFP en 5 ml de THF y se añadieron 5 ml de DMF seguido de 20 mg de DCC. Se añadió DMAP (2-3 mg) y se agitó la disolución durante la noche a 20°C. Se concentró la reacción y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (eluida con el 0-10% de MeOH) para proporcionar 17 mg de éster de PFP IV después de la liofilización a partir de acetonitrilo:agua 1:2.
Se añadió el éster de PFP IV (6 eq. molares en relación con IgG) a 20 mg de un anticuerpo IgG (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituximab) (10 mg/ml en PBS) y se incubó a 37°C durante la noche. Se sometió a intercambio de tampón el inmunoconjugado resultante BB1 a PBS (pH 7,2) para retirar el exceso de reactivo de peso molecular pequeño y se determinó la concentración en el dispositivo Nanodrop. El rendimiento fue de 15 mg de inmunoconjugado (rendimiento del 75%). Se almacenó el producto a 4°C. Se determinó una DAR de 2,2 a través de análisis por CL/EM. Además de la DAR deseable y un alto rendimiento, el producto también tenía pocas impurezas tal como se determinó mediante análisis por SEC (véanse las figuras 3 y 4).
Ejemplo 4. Síntesis de inmunoconjugado BB4 con un éster de NHS
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La modificación con éster del adyuvante y la conjugación del adyuvante modificado con el anticuerpo se muestran anteriormente en el esquema 13. Se disolvió el compuesto VII (150 mg) en 20 ml de tetrahidrofurano (“THF”) y se añadieron 10 ml de bicarbonato de sodio saturado acuoso. Luego, se añadieron 50 mg de anhídrido succínico en una porción y se agitó la mezcla durante una hora a temperatura ambiente. Se añadieron lentamente veinte mililitros de HCl 1 N y se extrajo la mezcla con 2 * 50 ml de diclorometano. Se evaporaron los extractos orgánicos combinados hasta sequedad. Se purificó el producto en bruto (Suc-VII) en una columna de gel de sílice de 4 gramos eluida con el 0-15% de MeOH (ácido acético al 1%) a lo largo de 15 minutos. Se combinaron las fracciones puras y se evaporaron para proporcionar 190 mg de VII-Suc puro.
Se disolvió el compuesto VII-Suc (150 mg) en 10 ml de DMF y se añadió 1 equivalente de HATU seguido de 2 equivalentes de DIPEA. Se añadieron 1,5 equivalentes de glicina-OtBu y se agitó durante la noche. Se evaporó la DMF y se trató el residuo con 5 ml de HCl 1 N en dioxano durante 30 minutos. Se evaporó el disolvente y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida el Gly-Suc-VII en bruto en una columna de gel de sílice de 4 gramos eluida con el 0-10% de MeOH a lo largo de 10 minutos. La evaporación de las fracciones puras proporcionó 110 mg de Gly-Suc-VII; se disolvió el material puro en DMF y se repitió el procedimiento anterior para proporcionar 60 mg de Gly2-Suc-VII puro.
Se disolvió el Gly2-Suc-VII puro (30 mg) en 5 ml de DMF y se añadieron 1,5 equivalentes de NHS seguido de 5 ml de THF. Se añadió DCC (1,5 equivalentes) y se agitó la mezcla durante la noche a temperatura ambiente. Se evaporó el disolvente y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida el éster de NHS en bruto sobre un gel de sílice eluido con el 0-10% de MeOH en DCM a lo largo de 10 minutos. Se combinaron las fracciones puras (determinadas mediante CCF) y se evaporaron para proporcionar 1 mg de NHS-Gly2-Suc-VII puro después de la liofilización a partir de acetonitrilo:agua.
Se disolvió el éster de NHS puro en DMSO para preparar una disolución 20 mM y se añadieron 6 eq. a 2 ml de un anticuerpo IgG (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituximab) (10 mg/ml en PBS). Se incubó la reacción de conjugación a temperatura ambiente durante la noche y se sometió a intercambio de tampón a PBS nuevo para retirar el exceso de adyuvante. Se esterilizó por filtración el inmunoconjugado BB4 purificado y se almacenó a 4°C. El rendimiento fue de aproximadamente 16 mg. Además de tener un alto rendimiento, el análisis por CL/EM mostró altos niveles de pureza, bajos niveles de agregación y una razón DAR deseable (véanse las figuras 5 y 6).
Ejemplo 5. Síntesis de inmunoconjugado BB2 con un éster de TFP
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Este ejemplo proporciona pautas sobre la síntesis de un inmunoconjugado con un grupo de unión diferente usando el método de éster de TFP. La modificación con éster del adyuvante y la conjugación del adyuvante modificado con el anticuerpo se muestran anteriormente en el esquema 14. Se disolvió el compuesto VII (311 mg, 1 mmol) en 10 ml de DMF y luego se añadieron 0,3 ml de DIPEA. Se disolvió el NHS-PEG5-ácido (1,2 equivalentes) en 5 ml de diclorometano y se añadió al compuesto VII en una porción. Se agitó la mezcla durante la noche a temperatura ambiente y luego se concentró hasta sequedad. Se purificó el residuo en bruto a través de cromatografía de gel de sílice en una columna de 4 gramos eluida con el 0-10% de MeOH en DCM que contenía ácido acético al 1% a lo largo de 10 minutos para proporcionar 260 mg (rendimiento del 57%) de PEGS-VII después de la concentración de las fracciones puras.
Se disolvió PEG5-VII (50 mg) en 10 ml de DMF y se añadieron 1,5 eq. de TFP seguido de 1,2 eq. de DCC y 5 mg de DMAP. Se agitó la reacción durante la noche, se concentró hasta sequedad y se purificó en una columna de gel de sílice de 4 gramos eluida con el 0-10% de MeOH en DCM para proporcionar 35 mg de TFP-PEG5-VII puro después de la liofilización a partir de acetonitrilo:agua 1:2.
Se disolvió el éster de TFP (TFP-PEG5-VII) en DMSO para preparar una disolución madre 20 mM y se añadió a 20 mg de un anticuerpo IgG (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituximab) en PBS a 10 mg/ml. Se permitió que la reacción de conjugación avanzara durante la noche a temperatura ambiente. Se sometió a intercambio de tampón el inmunoconjugado resultante (GE, columna de desalación PD10) a PBS a pH 7,4. Se esterilizó por filtración el inmunoconjugado purificado usando un filtro de jeringa de 2 ^m y se almacenó a 4°C. El análisis por CL/EM confirmó que el procedimiento proporcionó una DAR de 2,9 adyuvantes por anticuerpo (véase la figura 7). El análisis por SEC indicó cantidades mínimas de agregado (es decir, menos del 2%) (véase la figura 8).
Ejemplo 6. Síntesis de otro adyuvante de TLR7/TLR8
Este ejemplo proporciona pautas sobre cómo sintetizar otro adyuvante de TLR7/8. Se sintetizó el compuesto XIV partiendo del compuesto VI del esquema 6 del ejemplo 1.
Esquema 15
Figure imgf000053_0002
Se disolvió el compuesto VI (2 g) en tolueno con ácido acético seco al 20% y se calentó hasta 75°C durante la noche. Se eliminó el disolvente a vacío para proporcionar 2 gramos de compuesto XI en bruto. Se usó el compuesto XI sin purificación adicional. Se disolvió el compuesto XI (2 g) en 20 ml de DMF y se añadieron lentamente 1,2 equivalentes de NaH (dispersión al 50%) y se agitó la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se añadió yoduro de metilo (2 equivalentes) en una porción y se agitó la mezcla de reacción durante la noche a temperatura ambiente. Se concentró la reacción hasta sequedad y se purificó el producto a través de cromatografía ultrarrápida. Se eluyó el producto con un gradiente del 0-10% de MeOH en diclorometano a lo largo de 15 min. Se combinaron las fracciones puras y se concentraron para producir 1 g de compuesto XII (rendimiento del 50% para 2 etapas).
Esquema 16
Figure imgf000054_0001
Se disolvió el compuesto XII (10 g) en 10 ml de dimetoxibencilamina (“DMBA”) pura y se calentó hasta 120°C durante 3 horas. Se enfrió la mezcla de reacción y se diluyó con 100 ml de acetato de etilo. Se lavó la disolución resultante dos veces con ácido cítrico al 10% en agua y una vez con agua para eliminar el exceso de DMBA. Se secó la fase orgánica sobre MgSO4 y se concentró a vacío para proporcionar el compuesto XIII en bruto como un aceite de color marrón. Se disolvió el derivado de Dm B en bruto, compuesto XIII, en diclorometano y se añadieron 2 ml de HCl 4 N en dioxano. Después de 2 horas, se concentró la mezcla de reacción hasta sequedad y se disolvió la sal de HCl del compuesto XIV en bruto en 3 ml de metanol. Se añadió lentamente etil éter (20 ml) con agitación a la disolución en bruto y se formó un precipitado de color blanco. Se filtró la reacción y se lavó el producto sólido de color blanco dos veces con 10 ml de etil éter y se secó a vacío para proporcionar 4 gramos del compuesto de sal de HCl XIV. El análisis por CL/EM confirmó el peso molecular correcto (M/z = 326,5) y una pureza de más del 95%.
Ejemplo 7. Síntesis de inmunoconjugado BB6 con un éster de TFP
Esquema 17
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Este ejemplo proporciona pautas sobre la síntesis de un inmunoconjugado que contiene un grupo de unión de aril-amina terciaria usando el método de éster de TFP. Se disolvió el compuesto XIV (300 mg) del ejemplo 6 en THF (10 ml) y se añadieron 1,2 eq. de NaH (dispersión al 50%). Se agitó la mezcla durante 15 minutos y se añadieron 2 equivalentes de ácido 4-bromometilfenilacético. Se agitó la reacción durante la noche a temperatura ambiente y se concentró hasta sequedad. Se añadió un ml de ácido acético y se purificó el producto mediante HPLC preparativa en una columna C-18 eluida con un gradiente del 10-90% de acetonitrilo en agua (TFA al 0,1%) a lo largo de 20 minutos para proporcionar 165 mg del compuesto de ácido fenilacético XV purificado. Se disolvió el compuesto XV (50 mg) en diclorometano/dimetilformamida (5 ml, 1:1) y se añadieron 2 equivalentes de TFP seguido de 1,5 equivalentes de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (“EDCI”). Se agitó la reacción durante la noche a temperatura ambiente y se purificó el producto a través de cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice de 4 gramos eluida con el 0-10% de isopropanol a lo largo de 10 minutos. Se concentraron las fracciones puras y se liofilizaron a partir de acetonitrilo al 30%:agua para proporcionar 21 mg del compuesto de éster de TFP purificado XVI como un sólido de color amarillo pálido. El peso molecular y la pureza se confirmaron mediante CL/EM (m/z = 621,7).
Conjugación con el anticuerpo: se disolvió el éster de TFP XVI en DMSO seco para preparar una disolución madre 20 mM y se añadieron 6 equivalentes molares (en relación con el anticuerpo) a 20 mg de anticuerpo IgG (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituximab) (10 mg/ml en PBS). Se incubó la reacción de conjugación a 4°C durante la noche. Se sometió a intercambio de tampón el inmunoconjugado resultante, BB6, a PBS (pH 7,2) para retirar el exceso de reactivos de peso molecular pequeño. La concentración final se determinó midiendo el anticuerpo a 280 nm en el espectrofotómetro Nanodrop 1000. El rendimiento fue de 15 mg de BB6 o del 75% basándose en la proteína recuperada. Tal como se observa en la figura 12A, se observó un agregado mínimo (menos del 1%) tal como se detectó mediante análisis por SEC. Tal como se observa en la figura 12B, el producto tenía una razón DAR de 2,8 tal como se determinó a través de análisis por CL/EM. Se filtró el inmunoconjugado BB6 purificado a través de un filtro estéril de 2 |iM y se almacenó a -20°C.
Ejemplo 8. Síntesis de inmunoconjugado BB7 con un éster de TFP
Esquema 18
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Este ejemplo proporciona pautas sobre la síntesis de un inmunoconjugado que contiene un grupo de unión de alquil-amina terciaria usando el método de éster de TFP. Se disolvió el compuesto XIV (200 mg) en metanol (20 ml) y se añadieron 3 equivalentes de heptanoato de 1 -formil-7-terc-butilo seguido de 1,1 equivalentes de NaCNBH4. Se agitó la mezcla durante 1,5 horas a temperatura ambiente y se concentró hasta sequedad. Se añadió TFA (5 ml) y se agitó la mezcla durante la noche a temperatura ambiente. Se evaporó el TFA a vacío y se purificó el producto en bruto mediante HPLC preparativa en una columna C-18. Se eluyó el producto con un gradiente del 10-90% de acetonitrilo en agua (TfA al 0,1%) a lo largo de 20 minutos para proporcionar 110 mg del compuesto de ácido XVII purificado (que se confirmó mediante CL/EM).
Se disolvió el compuesto XVII (50 mg) en diclorometano/dimetilformamida (5 ml, 1:1) y se añadieron 2 equivalentes de TFP seguido de 1,5 equivalentes de EDCI. Se agitó la reacción durante la noche a temperatura ambiente. Se purificó el producto de éster de TFP XVIII en bruto a través de cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice de 4 gramos eluida con el 0-10% de isopropanol a lo largo de 10 minutos. Se concentraron las fracciones puras y se liofilizó el residuo a partir de acetonitrilo al 30%:agua para proporcionar 14 mg del compuesto de éster de TFP purificado XVIII como un sólido de color blanco. El peso molecular y la pureza se confirmaron mediante CL/EM (m/z =601,7).
Conjugación con el anticuerpo: se disolvió éster de TFP XVIII en DMSO seco para preparar una disolución madre 20 mM y se añadieron 8 equivalentes molares (en relación con el anticuerpo) a 20 mg de un anticuerpo IgG (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituximab) (10 mg/ml en PBS). Se incubó la reacción de conjugación a 4°C durante la noche. Se sometió a intercambio de tampón el inmunoconjugado BB7 resultante a PBS (pH 7,2) para retirar el exceso de reactivos de peso molecular pequeño. La concentración final se determinó midiendo los anticuerpos a 280 nm en el espectrofotómetro Nanodrop 1000. El rendimiento fue de 16 mg de inmunoconjugado BB7 (80%).
Tal como se observa en la figura 13A, se observó un agregado mínimo (menos del 1%) tal como se detectó mediante análisis por SEC. Tal como se observa en la figura 13B, el producto tenía una razón DAR de 2,5 tal como se determinó a través de análisis por CL/EM. Se filtró el BB7 purificado a través de un filtro estéril de 2 |iM y se almacenó a -20°C.
Ejemplo 9. Síntesis de inmunoconjugado BB8 con un éster de TFP
Esquema 19
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Este ejemplo proporciona pautas sobre la síntesis de un inmunoconjugado que contiene un grupo de unión de PEG-amina terciaria usando el método de TFP. Se disolvió el compuesto XIV (200 mg) en metanol (20 ml) y se añadieron 3 eq. De aldehído XIX seguido de 1,1 equivalentes de NaCNBH4. Se agitó la mezcla durante 3 horas a temperatura ambiente y se concentró hasta sequedad. Se añadió ácido trifluoroacético (TFA, 10 ml) y se agitó la reacción durante 2 horas a temperatura ambiente. Se evaporó el TFA a vacío y se purificó el producto en bruto mediante HPLC preparativa en una columna C-18. Se eluyó el producto con un gradiente del 10-90% de acetonitrilo en agua (TFA al 0,1%) a lo largo de 20 minutos para proporcionar 85 mg de ácido XX purificado después de la liofilización de las fracciones puras combinadas (confirmado mediante CL/EM).
Se disolvió el compuesto XX (80 mg) en diclorometano/dimetilformamida (5 ml, 1:1) y se añadieron 2 equivalentes de TFP seguido de 1,2 equivalentes de EDCI. Se agitó la reacción durante la noche a temperatura ambiente. Se purificó el producto de éster de TFP XXI en bruto a través de cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice de 4 gramos eluida con el 0-10% de isopropanol a lo largo de 10 minutos. Se concentraron las fracciones puras y se liofilizó el residuo a partir de acetonitrilo al 30%:agua para proporcionar 45 mg de éster de TFP del compuesto XXI purificado como un sólido de color beis. El peso molecular y la pureza se confirmaron mediante CL/EM (m/z = 647,7).
Conjugación con el anticuerpo: se disolvió el éster de TFP del compuesto XXI en DMSO seco para preparar una disolución madre 20 mM y se añadieron 8 equivalentes molares (en relación con el anticuerpo) a un anticuerpo IgG1 (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituximab) (10 mg/ml en PBS). Se incubó la reacción de conjugación a 4°C durante la noche. Se sometió a intercambio de tampón el inmunoconjugado BB8 resultante a PBS (pH 7,2) para retirar el exceso de reactivos de peso molecular pequeño. La concentración final se determinó midiendo los anticuerpos a 280 nm en el espectrofotómetro Nanodrop 1000. El rendimiento fue de 15 mg de inmunoconjugado BB8 (75%) que se almacenó a 4°C hasta su uso.
Tal como se observa en la figura 14a, se observó un agregado mínimo (menos del 1%) tal como se detectó mediante análisis por SEC. Tal como se observa en la figura 14B, el producto tenía una razón DAR de 2,2 tal como se determinó a través de análisis por CL/EM. Se filtró el inmunoconjugado BB8 purificado a través de un filtro estéril de 2 |iM y se almacenó a -20°C.
E squ em a 20
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Este ejemplo proporciona pautas sobre la síntesis de un inmunoconjugado con un grupo de unión diferente usando el método de éster de TFP. Se disolvió el compuesto VII (311 mg, 1 mmol) en 10 ml de DMF y se añadieron 0,3 ml de DIPEA. En un recipiente independiente, se disolvieron 1,2 equivalentes de ácido 7-metoxi-7-oxoheptanoico en 5 ml de DMF y se añadieron 1,5 equivalentes de DIPEA seguido de HATU (1,2 equivalentes). Se añadió la mezcla a VII y se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se concentró la mezcla de reacción hasta sequedad a vacío y se disolvió el residuo en 10 ml de tetrahidrofurano:agua (1:1). Se añadió un ml de hidróxido de litio 2 M en agua y se agitó la reacción durante 2 horas a temperatura ambiente. Se eliminó el THF a través de evaporación rotativa y se acidificó la disolución acuosa mediante la adición de 10 ml de ácido clorhídrico 1 M. Se extrajo la disolución acuosa 2 veces con diclorometano (20 ml) y se combinó la fase orgánica y se secó sobre sulfato de magnesio. Se filtró la disolución y se concentró el filtrado hasta sequedad. Se purificó el producto 22 en bruto a través de cromatografía de gel de sílice en una columna de 4 gramos eluida con el 0-10% de isopropanol en DCM (con ácido acético al 1%) a lo largo de 10 minutos. Se combinaron las fracciones puras y se concentraron para proporcionar 220 mg de 22 puro como un sólido de color amarillo pálido.
Se disolvió el compuesto 22 (50 mg) en diclorometano/dimetilformamida (5 ml, 1:1) y se añadieron 2 equivalentes de TFP seguido de 1,5 equivalentes de EDCI. Se agitó la reacción durante la noche a 22°C y se concentró la reacción en bruto hasta sequedad. Se purificó el producto a través de cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice de 4 gramos eluida con el 0-10% de isopropanol a lo largo de 10 minutos. Se concentraron las fracciones puras y se liofilizó el residuo a partir de acetonitrilo al 30% en agua para proporcionar 21 mg de éster de TFP 23 purificado como un sólido de color amarillo pálido. El peso molecular y la pureza se confirmaron mediante CL/EM.
Conjugación con el anticuerpo: se disolvió el éster de TFP 23 en DMSO seco para preparar una disolución madre 20 mM y se añadieron 6 equivalentes molares (en relación con el anticuerpo) a 20 mg de un anticuerpo IgG (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituximab) (10 mg/ml en PBS). Se incubó la reacción de conjugación a 4°C durante la noche. Se sometió a intercambio de tampón el inmunoconjugado BB9 resultante a PBS (pH 7,2) para retirar el exceso de impurezas de peso molecular pequeño. La concentración final se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm en un espectrofotómetro THEr Mo SCIENTIFIC™ NANODROP™ 1000. El rendimiento fue de 14 mg de BB9 o del 70% basándose en la proteína recuperada. Se detectó un agregado mínimo (menos del 1%) mediante análisis por SEC (véase la figura 17a) y se determinó una DAR de 2,8 a través de análisis por CL/EM (véase la figura 17B). Se filtró el inmunoconjugado purificado a través de un filtro estéril de 2 ^M y se almacenó a -20°C.
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E sq u e m a 21
Figure imgf000058_0001
Este ejemplo proporciona pautas sobre la síntesis de un inmunoconjugado con un grupo de unión diferente usando el método de éster de TFP. Se disolvió el compuesto VII (150 mg) en 20 ml de Th F y se añadieron 10 ml de bicarbonato de sodio saturado acuoso. Se añadió anhídrido succínico (50 mg) en una porción y se agitó la mezcla durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadieron lentamente 20 ml de HCl 1 N y se extrajo la mezcla 2 veces con 50 ml de diclorometano y se evaporaron los extractos orgánicos combinados hasta sequedad. Se purificó el producto 24 en bruto en una columna de gel de sílice de 4 gramos eluida con el 0-15% de MeOH (ácido acético al 1%) a lo largo de 15 minutos. Se combinaron las fracciones puras y se evaporaron para proporcionar 180 mg de 24 puro.
Se disolvieron ciento cincuenta mg de 24 en DMF (10 ml) y se añadieron 1 equivalente de HATU seguido de 2 equivalentes de DIPEA. Se añadieron 1,5 eq. De glicina-OtBu y se agitó durante la noche. Se evaporó la DMF y se trató el residuo con 5 ml de HCl 1 N en dioxano durante 30 minutos con agitación. Se evaporó el disolvente y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida el residuo en bruto en una columna de gel de sílice de 4 gramos eluida con el 0-10% de isopropanol a lo largo de 15 minutos. La evaporación de las fracciones puras proporcionó 110 mg de 25 puro.
Se disolvió el compuesto 25 (50 mg) en 10 ml de DMF y se añadieron 1,5 eq. De TFP seguido de 1,2 eq. De DCC y 2 mg de d Ma P. Se agitó la reacción durante la noche, se concentró hasta sequedad y se purificó sobre gel de sílice (columna de 4 g) eluida con el 0-10% de IPA en DCM para proporcionar 32 mg de éster de TFP puro, compuesto 26, después de la liofilización a partir de acetonitrilo:agua 1:3.
Conjugación con el anticuerpo: se disolvió el éster de TFP, compuesto 26, en DMSO seco para preparar una disolución madre 20 mM y se añadieron 5 equivalentes molares (en relación con el anticuerpo) a 20 mg de anticuerpo a 10 mg/ml en PBS. Se incubó la reacción de conjugación a 4°C durante 6 horas. Se sometió a intercambio de tampón el inmunoconjugado BB10 resultante a PBS (pH 7,4) para retirar el exceso de impurezas de peso molecular pequeño. La concentración de proteína final se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm en un espectrofotómetro NANODROP™ 1000. El rendimiento fue de 15 mg (75% basándose en la proteína recuperada). El análisis por SEC detectó un agregado mínimo de menos del 1% (véase la figura 18a) y se determinó que la DAR era de 2,8 adyuvantes por anticuerpo a través de análisis por c L/EM (véase la figura 18B). Se filtró el inmunoconjugado purificado a través de un filtro estéril de 2 ^M y se almacenó a -20°C hasta que fuera necesario.
e m p o . n e s s e n m u n o co n u g a o con un s e r e
E squ em a 22
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Este ejemplo proporciona pautas sobre la síntesis de un inmunoconjugado con un grupo de unión diferente usando el método de TFP. Se disolvió el compuesto VII (155 mg, 0,5 mmol) en 10 ml de DMF y se añadieron 0,2 ml de DIPEA. En un recipiente independiente, se disolvieron 1,2 equivalentes de éster monometílico PEG2-dicarboxilato en 5 ml de DMF y se añadieron 2 equivalentes de DIPEA seguido de HATU (1,2 equivalentes). Se añadió la mezcla a VII y se agitó 1 hora a temperatura ambiente. Se concentró la reacción hasta sequedad a vacío y se disolvió el residuo en THF (5 ml). Se añadió un mismo volumen de agua seguido de 2 ml de LiOH acuoso 1 M. Se agitó la mezcla durante la noche y luego se añadieron 10 ml de HCl 1 N. Se extrajo la mezcla acidificada 2 veces con diclorometano, se secó sobre sulfato de sodio, se concentró hasta sequedad y se purificó a través de cromatografía de gel de sílice. Se eluyó el producto con el 0-10% de metanol a lo largo de 10 minutos. Se combinaron las fracciones puras y se concentraron para proporcionar 110 mg de compuesto 27 puro como un sólido de color amarillo pálido.
Se disolvió El compuesto 27 (50 mg) en diclorometano/dimetilformamida (5 ml, 1:1) y se añadieron 2 equivalentes de TFP seguido de 1,5 equivalentes de EDCI. Se agitó la reacción durante la noche a temperatura ambiental y se concentró la reacción hasta sequedad. Se purificó el éster de TFP 28 en bruto a través de cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice de 4 gramos eluida con el 0-10% de isopropanol a lo largo de 10 minutos. Se concentraron las fracciones puras y se liofilizó el residuo a partir de acetonitrilo al 30% en agua para proporcionar 41 mg de éster de TFP 23 purificado como un sólido de color blanco. El peso molecular y la pureza se confirmaron mediante CL/EM.
Conjugación con el anticuerpo: se disolvió el éster de TFP 28 en DMSO seco para preparar una disolución madre 20 mM y se añadieron 8 equivalentes molares (en relación con el anticuerpo) a 20 ml de un anticuerpo IgG (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituximab) (10 mg/ml en PBS). Se incubó la reacción de conjugación a 4°C durante la noche. Se sometió a intercambio de tampón el inmunoconjugado BB11 resultante a PBS (pH 7,2) para retirar el exceso de impurezas de peso molecular pequeño. La concentración final se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm en un espectrofotómetro Thermo Nanodrop 1000. El rendimiento fue de 16 mg de inmunoconjugado BB11 conjugado o del 70% basándose en la proteína recuperada. Se detectó un agregado mínimo (menos del 1%) mediante análisis por SEC (véase la figura 19a) y se determinó una DAR de 2,3 a través de análisis por CL/EM (véase la figura 19B). Se filtró el inmunoconjugado purificado a través de un filtro estéril de 2 |aM y se almacenó a -20°C.
Ejemplo 13. Síntesis de otro adyuvante de TLR7/8
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Este ejemplo proporciona pautas sobre la síntesis de otro agonista de TLR. El compuesto 29 es un análogo del compuesto VII que contiene una cadena lateral de piperazina para la unión del grupo de unión. Se sintetizó usando métodos previamente descritos para la síntesis del compuesto VII excepto que el análogo de piperazina protegida con Boc se sustituyó por el Boc-diaminobutano usado en la etapa 3 de la síntesis. La ruta de síntesis general para el compuesto 29 se destaca en el esquema 23. La adición de la cadena lateral de piperazina permite la síntesis de inmunoconjugados que previamente eran inaccesibles debido a su inestabilidad. Los análogos de compuesto VII similares que contienen grupos de unión de succinato son propensos a la ciclización tras la activación con TFP, y la piperazina impide la ciclización. Además, el grupo amino terciario dentro del resto de piperazina mantiene una carga positiva después de la unión y conjugación del grupo de unión. Las cargas positivas en esta ubicación son importantes para una potencia de t Lr8 mejorada. Posteriormente se usó el compuesto 29 para sintetizar inmunoconjugados tal como se describe a continuación en los ejemplos 14-16.
Ejemplo 14. Síntesis de inmunoconjugado BB12 con un éster de TFP
Esquema 24
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Este ejemplo proporciona pautas sobre la síntesis de un inmunoconjugado con un grupo de unión diferente usando el método de éster de TFP. Se disolvió el compuesto 29 (100 mg) en 10 ml de THF y se añadieron 2 ml de bicarbonato de sodio saturado acuoso seguido de 10 ml de agua. Se añadió anhídrido succínico (50 mg) en una porción y se agitó la mezcla a temperatura ambiente. Después de una hora, se añadieron lentamente 20 ml de HCl 1 N y se extrajo la mezcla de reacción 2 veces con 50 ml de diclorometano (“DCM”). Se evaporaron los extractos orgánicos combinados hasta sequedad. Se purificó el producto 30 en bruto en una columna de gel de sílice de 4 gramos eluida con el 0-15% de isopropanol en DCM (ácido acético al 1%) a lo largo de 15 minutos. Se combinaron las fracciones puras y se evaporaron hasta sequedad para proporcionar 80 mg de ácido 30 puro.
Se disolvió el compuesto 30 (50 mg) en diclorometano/dimetilformamida (5 ml, 1:1) y se añadieron 2 equivalentes de TFP seguido de 1,5 equivalentes de EDCI. Se agitó la reacción durante la noche a temperatura ambiental y se concentró la reacción hasta sequedad. Se purificó el éster de TFP 31 en bruto a través de cromatografía ultrarrápida y se eluyó con el 0-10% de isopropanol a lo largo de 10 minutos. Se concentraron las fracciones puras y se liofilizó el residuo a partir de acetonitrilo al 30% en agua para proporcionar 41 mg de éster de TFP 31 purificado como un sólido de color blanco. El peso molecular y la pureza se confirmaron mediante CL/EM.
Se conjugó el éster de TFP 31 con un anticuerpo IgG1 (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituximab) tal como se describió previamente para BB10 para proporcionar BB12. Los análisis por SEC y por CL/EM de BB12 confirmaron el peso molecular, una alta pureza monomérica con menos del 2% de agregado y una DAR de 1,7 (véanse las figuras 20a-B).
Ejemplo 15. Síntesis de inmunoconjugados BB13 y BB14 con un éster de TFP
Esquema 25
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Este ejemplo proporciona pautas sobre la síntesis de inmunoconjugados con grupos de unión diferentes usando el método de éster de TFP. Se acopló el compuesto 30 (esquema 25) a grupos de unión de polietilenglicol (PEG) que contenían 2 u 8 unidades de PEG con el fin de aumentar la distancia entre el adyuvante y el anticuerpo. La unión de las extensiones de grupo de unión de PEG se realizó usando protocolos previamente descritos para la unión de grupos de unión y la activación con TFP. Brevemente, se disolvieron 100 mg de compuesto 30 en 10 ml de DMF y se añadieron 0,2 ml de DIPEA seguido de HATU (1,2 equivalentes). Después de 1 hora, se añadió el grupo de unión de amino-PEG apropiado (n = 2 u 8) y se agitó 2 horas adicionales a temperatura ambiente. Se concentró la mezcla de reacción hasta sequedad a vacío y se purificó el residuo a través de HPLC preparativa en una columna C-18 eluida con el 10-90% de acetonitrilo en agua a lo largo de 30 minutos. Se combinaron las fracciones puras y se liofilizaron para proporcionar 65 mg y 45 mg de los productos intermedios 31 ó 32 como una sustancia vítrea transparente.
Se convirtieron los compuestos 31 y 32 en los ésteres de TFP 33 y 34 correspondientes usando protocolos previamente descritos. Brevemente, se disolvió el ácido libre 31 ó 32 (50 mg) en diclorometano/dimetilformamida (5 ml, 1:1) y se añadieron 2 equivalentes de TFP seguido de 1,5 equivalentes de EDCI. Se agitó la mezcla durante la noche a temperatura ambiente y se concentró hasta sequedad para proporcionar los ésteres de TFP 33 y 34 en bruto. Se purificaron los ésteres de TFP en bruto a través de cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice y se eluyeron con el 0-10% de isopropanol a lo largo de 10 minutos. Se concentraron las fracciones puras y se liofilizó el residuo a partir de acetonitrilo al 30% en agua para proporcionar los ésteres de TFP 33 y 34 purificados como sólidos transparentes. El peso molecular y la pureza de los compuestos puros se confirmaron mediante CL/EM.
Conjugación con el anticuerpo: se conjugaron los ésteres de TFP 33 y 34 con un anticuerpo IgG1 (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituximab) usando protocolos previamente descritos. Se disolvieron los ésteres de TFP en DMSO seco para preparar una disolución madre 20 mM y se añadieron 8 equivalentes molares (en relación con el anticuerpo) a 20 mg del anticuerpo IgG a 10 mg/ml en PBS. Se incubó la reacción de conjugación a 4°C durante 12 horas. Se sometieron a intercambio de tampón los inmunoconjugados BB13 y BB14 resultantes a PBS (pH 7,4) para retirar el exceso de impurezas de peso molecular pequeño. La concentración de proteína final se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm en un espectrofotómetro NANODROP™ 1000. Los rendimientos fueron del 75% basándose en la proteína recuperada. El análisis por SEC detectó que estaba presente un agregado mínimo y se determinaron DAR de 1,0 y 1,7 adyuvantes por anticuerpo a través de análisis por CL/EM (véanse la figura 21 para BB13 y la figura 22 para BB14). Se filtraron los inmunoconjugados purificados a través de un filtro estéril de 0,2 ^M y se almacenaron a -20°C hasta que fueran necesarios.
Ejemplo 16. Evaluación de la actividad in vitro de BB1, BB2, BB4, BB5, BB7, BB9 y BB10
Aislamiento de células presentadoras de antígeno humanas. Se seleccionaron negativamente células presentadoras de antígeno (APC) humanas a partir de células mononucleares de sangre periférica humanas obtenidas de donantes de sangre sanos (Centro de sangre Stanford) mediante centrifugación por gradiente de densidad usando un cóctel de enriquecimiento de monocitos humanos RosetteSep (Stem Cell Technologies) que contenía anticuerpos monoclonales contra CD14, CD16, CD40, CD86, CD123 y HLA-DR. Posteriormente se purificaron las APC inmaduras hasta una pureza >97% a través de selección negativa usando un kit de enriquecimiento de monocitos humanos EasySep sin agotamiento de CD16 que contenía anticuerpos monoclonales contra CD14, CD16, CD40, CD86, CD123 y HLA-DR.
Preparación de células tumorales. Se resuspendieron las células tumorales en PBS con suero bovino fetal (FBS) al 0,1% a de 1 a 10 * 106 células/ml. Posteriormente se incubaron las células con CFSE 2 |iM para producir una concentración final de 1 |iM. Se finalizó la reacción después de 2 minutos mediante la adición de 10 ml de medio completo con FBS al 10% y se lavó una vez con medio completo. Las células o bien se fijaron en paraformaldehído al 2% y se lavaron tres veces con PBS o bien se dejaron sin fijar antes de la congelación de las células en el 10% de DMSO, el 20% de FBS y el 70% de medio.
Cocultivos de APC-tumor. Se incubaron 2 * 105 APC con o sin 6,5 x 105 células tumorales marcadas con CFSE alogénicas en placas de 96 pocillos (Corning) que contenían medio IMDM (Gibco) complementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 |ig/ml, L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales y, cuando se indica, diversas concentraciones de anticuerpo anti-CD20 no conjugado, BB1, BB2, BB4, BB5, BB7, BB9 o BB10 preparados según los ejemplos anteriores. Se analizaron las células y los sobrenadantes libres de células después de 18 horas a través de citometría de flujo o ELISA.
Los resultados de este ensayo se muestran en las figuras 9a-9F para BB2 y BB5. Específicamente, los gráficos muestran que BB2 y BB5 preparados según los esquemas 11 y 14 provocan la activación de mieloides, mientras que el anticuerpo anti-CD20 no conjugado de control no lo hace. Además, las figuras 23a-D muestran que BB1 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante CD14, CD20, CD86 y HLA-DR, mientras que el control no lo hace. Las figuras 24a-D muestran que BB4 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante CD14, CD20, CD86 y HLA-DR, mientras que el control no lo hace. Las figuras 25a-D muestran que BB7 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante CD14, CD20, CD86 y HLA-DR, mientras que el control no lo hace. Las figuras 26a-D muestran que BB9 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante CD14, CD20, CD86 y HLA-DR, mientras que el control no lo hace. Las figuras 27a-D muestran que BB10 provoca la activación de mieloides tal como se indica mediante CD14, CD20, CD86 y HLA-DR, mientras que el control no lo hace.
Ejemplo 17. Comparación de BB5 con el conjugado IRM1 comparativo y el conjugado IRM2 comparativo Este ejemplo muestra que los inmunoconjugados producidos mediante las realizaciones de la invención son superiores a los inmunoconjugados producidos mediante los métodos de síntesis de '528. Se sintetizó BB5 según el esquema 11. Se prepararon los conjugados IRM1 e IRM2 comparativos usando los adyuvantes descritos en la patente '528 como adyuvantes IRM1 e IRM2. Específicamente, se conjugaron IRM1 e IRM2 con un anticuerpo IgG (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituximab) con un grupo de unión de amida.
Se analizaron BB5 y los conjugados IRM1 e IRM2 comparativos usando el ensayo del ejemplo 4. Los resultados se muestran en las figuras 10a-10F y 11 a-11C. Específicamente, las figuras 10a-10F muestran que BB5 preparado según el esquema 11 provoca la activación de mieloides, mientras que los conjugados IRM1 e IRM2 comparativos y el anticuerpo anti-CD20 no conjugado de control no lo hacen. Además, las figuras 11 a-11C muestran que BB5 preparado según el esquema 11 provoca la secreción de citocinas, mientras que los conjugados IRM1 e |Rm2 comparativos y el anticuerpo anti-CD20 no conjugado de control no lo hacen.
Los conjugados IRM1 e IRM2 comparativos tenían una agregación excesiva tal como se determinó mediante CL/EM. Las figuras 15a-C muestran los resultados de cromatografía de exclusión molecular tras la filtración con un filtro de 0,2 |iM. El conjugado IRM1 comparativo tenía el 4% de agregación y se indicó por el primer pico a 4,5 min (véase la figura 15a). ei conjugado IRM2 comparativo tenía el 9,5% de agregación y se indicó por el primer pico a 4,5 min (véase la figura 15b ). En cambio, BB5 tenía una pequeña cantidad de agregación (véase la figura 15C). Esta diferencia se debe en parte al producto intermedio tiolado que tienen IRM1 e IRM2 que no está presente ni es necesario en los métodos de la invención.
Las figuras 16a y 16b ilustran adicionalmente las ventajas de los métodos de la invención. Compárese la figura 16a, que muestra el conjugado IRM1 comparativo tras una desglicosilación durante la noche con PNGasa F y analizado a través de CL/EM, con la figura 16B, que muestra BB5 tras el mismo tratamiento.
También se sometieron a prueba BB5 y los conjugados IRM1 e IRM2 comparativos para determinar la estabilidad en almacenamiento. Después de la síntesis, se almacenaron los conjugados en tubos cónicos de 15 ml durante varias horas. Después del almacenamiento, el tubo que contenía el conjugado IRM2 comparativo tenía un agregado sólido de color blanco grande en el fondo del tubo. Los tubos que contenían BB5 y conjugado IRM1 comparativo contenían únicamente líquido transparente y no tenían ningún sedimento.
Ejemplo 18. Inmunoconjugados adicionales
Se prepararon los siguientes inmunoconjugados según los métodos de la invención. Los inmunoconjugados se sometieron a prueba según el ejemplo 16 y se halló que todos ellos provocaban la activación de mieloides.
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Este ejemplo proporciona pautas sobre la síntesis de un inmunoconjugado con una disolución acuosa tamponada a un pH de 8,3. Se sometió a intercambio de tampón un anticuerpo IgG (específicamente, el anticuerpo anti-HER2 trastuzumab) (10 mg/ml en PBS) a solución salina tamponada con borato (“BBS”) pH 8,3 (ácido bórico 50 mM pH 8,3, NaCl 125 mM) para proporcionar el anticuerpo IgG (específicamente, el anticuerpo anti-HER2 trastuzumab) como 10 mg/ml en BBS.
Se disolvió el compuesto 27 (50 mg) en diclorometano/dimetilformamida (5 ml, 1:1) y se añadieron 2 equivalentes de N-hidroxisuccinimida (“NHS”) seguido de 1,5 equivalentes de EDCI. Se agitó la reacción durante la noche a temperatura ambiental y se concentró la reacción hasta sequedad. Se purificó el éster 35 en bruto a través de cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice de 4 gramos eluida con el 0-10% de isopropanol a lo largo de 10 minutos. Se concentraron las fracciones puras y se liofilizó el residuo a partir de acetonitrilo al 30% en agua para proporcionar 41 mg de éster 35 purificado. El peso molecular y la pureza se confirmaron mediante CL/EM.
Conjugación con el anticuerpo: se disolvió el éster 35 en DMSO seco para preparar una disolución madre 20 mM y se añadieron 4, 8 ó 12 equivalentes molares (en relación con el anticuerpo) a 20 ml de un anticuerpo IgG (el anticuerpo anti-HER2 trastuzumab) (10 mg/ml en BBS). Se incubó la reacción de conjugación a 4°C o 30°C durante la noche (de aproximadamente 6 a aproximadamente 15 horas). Se sometió a intercambio de tampón el inmunoconjugado BB11 resultante a PBS (pH 7,2) usando una columna Sephadex-G25 para retirar el exceso de impurezas de peso molecular pequeño. La concentración final se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm en un espectrofotómetro NAnOd Ro P™ 1000. Se detectó un agregado mínimo (menos del 1%) mediante análisis por SEC y se determinó la DAR a través de análisis por CL/EM. Se filtró el inmunoconjugado purificado a través de un filtro estéril de 2 ^M y se almacenó a 4°C.
Ejemplo 20. Síntesis de inmunoconjugados en función del pH
Este ejemplo demuestra la eficiencia de conversión de inmunoconjugados sintetizados a un pH de 6,5 (solución salina tamponada con citrato “CBS”), 7,4 (solución salina tamponada con fosfato “PBS”) y 8,3 (solución salina tamponada con borato “BBS”). Los inmunoconjugados se prepararon según el procedimiento expuesto en el ejemplo 19, usando 8 y 12 equivalentes molares (en relación con el anticuerpo) del éster de TFP o de NHS, CBS, PBS y BBS como tampón para el anticuerpo y a una temperatura de 4°C o 30°C.
Se sometieron a intercambio de tampón los inmunoconjugados resultantes a PBS (pH 7,2) usando una columna Sephadex-G25 para retirar el exceso de impurezas de peso molecular pequeño, y se midió la DAR a 40°C, en función del tiempo. Los resultados para los tampones c Bs , PBS y BBS se exponen en la figura 28, la figura 29 y la figura 30, respectivamente.
Tal como se demuestra mediante las figuras 28-30, los inmunoconjugados sintetizados usando BBS (pH 8,3) dieron como resultado mayores razones DAR a todas las temperaturas y todos los equivalentes del éster, en comparación con los inmunoconjugados sintetizados usando CBS (pH 6,5) o PBS (pH 7,4). Estos resultados muestran que el tampón BBS (pH 8,3) produce una mayor eficiencia de conjugación con el anticuerpo que CBS (pH 6,5) y PBS (pH 7,4). Además, las figuras 28-30 muestran que, después de la incubación a 40°C durante 48 horas, los inmunoconjugados sintetizados usando BBS (pH 8,3) mantuvieron mayores razones DAR a todas las temperaturas y todos los equivalentes del éster, en comparación con los inmunoconjugados sintetizados usando CBS (pH 6,5) o PBS (pH 7,4). Estos resultados muestran que el tampón BBS (pH 8,3) produce un mayor porcentaje de adyuvantes conjugados con lisina, tal como se demuestra por la mayor DAR después de 48 horas. Se cree que los adyuvantes conjugados con tirosina (es decir, conjugación lábil a la hidrólisis) se hidrolizan lentamente durante la incubación para producir una DAR correspondiente únicamente a los inmunoconjugados conjugados con lisina. La figura 30 también demuestra que la conjugación usando BBS (pH 8,3) dio como resultado al menos el 33% de inmunoconjugados conjugados con lisina para todas las condiciones excepto para 8 equivalentes del éster y 4°C, tal como se demuestra por la DAR después de 48 horas de incubación a 40°C. Sin embargo, las figuras 28 y 29 dieron como resultado menos del 33% de inmunoconjugados conjugados con lisina para todas las condiciones, tal como se demuestra por la DAR después de 48 horas de incubación a 40°C. Además, la figura 30 muestra que la conjugación a 30°C es más eficiente que la conjugación a 4°C, tal como se demuestra por una mayor DAR en todos los puntos de tiempo.
Ejemplo 21. Síntesis de inmunoconjugados en función del pH
Este ejemplo demuestra la estabilidad de inmunoconjugados sintetizados a un pH de 6,5 (solución salina tamponada con citrato “CBS”), 7,4 (solución salina tamponada con fosfato “PBS”) y 8,3 (solución salina tamponada con borato “BBS”). Los inmunoconjugados se prepararon según el procedimiento expuesto en el ejemplo 19, usando 4, 8 y 12 equivalentes molares (en relación con el anticuerpo) del éster de TFP o de NHS, CBS, PBS y BBS como tampón para el anticuerpo y a una temperatura de 4°C o 30°C.
Se sometieron a intercambio de tampón los inmunoconjugados resultantes a PBS (pH 7,2) usando una columna Sephadex-G25 para retirar el exceso de impurezas de peso molecular pequeño, y se midió la concentración de ácido libre (formado a partir de la hidrólisis del grupo de unión/adyuvante a partir del anticuerpo) a 40°C, en función del tiempo. Los resultados para los tampones CBS, PBS y BBS se exponen en la figura 31, la figura 32 y la figura 33, respectivamente.
Tal como se demuestra mediante las figuras 31-33, los inmunoconjugados sintetizados usando BBS (pH 8,3) dieron como resultado concentraciones de ácido libre a todas las temperaturas y todos los equivalentes del éster, en comparación con los inmunoconjugados sintetizados usando CBS (pH 6,5) o PBS (pH 7,4). Estos resultados muestran que el tampón BBS (pH 8,3) produce menos adyuvantes conjugados con tirosina (es decir, conjugación lábil a la hidrólisis) que CBS (pH 6,5) y PBS (pH 7,4). Además, la figura 33 muestra que la conjugación a 30°C es más eficiente para formar inmunoconjugados conjugados con lisina que la conjugación a 4°C, tal como se demuestra por una mayor DAR en todos los puntos de tiempo.
Debe interpretarse que el uso de los términos “un” y “uno/a” y “el/la” y “al menos uno” y referentes similares en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) cubre tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto. Debe interpretarse que el uso del término “al menos uno” seguido de una lista de uno o más elementos (por ejemplo, “al menos uno de A y B”) significa un elemento seleccionado de los elementos enumerados (A o B) o cualquier combinación de dos o más de los elementos enumerados (A y B), a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto. Debe interpretarse que los términos “que comprende”, “que tiene”, “que incluye” y “que contiene” son términos abiertos (es decir, que significan “incluyendo, pero sin limitarse a”,) a menos que se indique lo contrario. Se pretende que la recitación de intervalos de valores en el presente documento simplemente sirva como método abreviado para referirse individualmente a cada valor independiente que se encuentra dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, y cada valor independiente se incorpora en la memoria descriptiva como si se recitara individualmente en el presente documento. Todos los métodos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente de otro modo por el contexto. Se pretende que el uso de cualquiera y la totalidad de los ejemplos, o el lenguaje a modo de ejemplo (por ejemplo, “tal como”) proporcionado en el presente documento, simplemente ilumine mejor la invención y no suponga una limitación sobre el alcance de la invención a menos que se reivindique lo contrario. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva debe interpretarse como una indicación de que cualquier elemento no reivindicado sea esencial para la práctica de la invención.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Método para producir un inmunoconjugado, comprendiendo el método combinar uno o más compuestos de fórmula I:
Figure imgf000067_0001
y un anticuerpo de fórmula II:
Figure imgf000067_0002
en el que la fórmula II es un anticuerpo con residuo
Figure imgf000067_0003
que representa uno o más residuos de lisina del anticuerpo,
en una disolución acuosa tamponada a un pH de 7,5 a 9 hasta que al menos el 33% en mol del uno o más compuestos de fórmula I se conjuga con el anticuerpo de fórmula II para proporcionar el inmunoconjugado de fórmula III:
Figure imgf000067_0004
en la que
Ady es un adyuvante,
Z es -CH2-, -C(O)NH-, -C(O)O- o -C(O)-,
L es un grupo de unión,
E es un éster, y
r es el número promedio de adyuvantes unidos al anticuerpo y es un número positivo hasta 8,
en una primera disolución acuosa tamponada.
2. Método según la reivindicación 1, en el que la disolución acuosa está tamponada a un pH de 8 a 9, preferiblemente la disolución acuosa está tamponada a un pH de 8 a 8,6, o más preferiblemente la disolución acuosa está tamponada a un pH de 8 a 8,3.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la disolución acuosa se tampona con solución salina tamponada con borato.
4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la disolución acuosa está a una temperatura de 0°C a 50°C, preferiblemente la disolución acuosa está a una temperatura de 25°C a 35°C, o más preferiblemente la disolución acuosa está a una temperatura de 30°C.
5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el método comprende además realizar un intercambio de tampón en la primera disolución acuosa tamponada del inmunoconjugado de fórmula III para proporcionar una segunda disolución acuosa tamponada que está tamponada a un pH de 6 a 7,5, preferiblemente la segunda disolución acuosa tamponada está tamponada a un pH de 7 a 7,5, o más preferiblemente la segunda disolución acuosa tamponada está tamponada a un pH de 7,2 a 7,4.
6. Método según la reivindicación 5, en el que la segunda disolución acuosa tamponada se tampona con solución salina tamponada con fosfato.
7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el éster es un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) de la fórmula:
Figure imgf000068_0001
en la que la línea ondulada (“ j^ ”) representa el punto de unión al grupo de unión (“L”).
8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el éster es un éster de sulfo-N-hidroxisuccinimida de la fórmula:
Figure imgf000068_0002
en la que M es cualquier catión y la línea ondulada representa el punto de unión al grupo de unión (“L”).
9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el éster es un éster de fenol de la fórmula:
Figure imgf000068_0003
en la que cada R2 se selecciona independientemente de hidrógeno, yodo, bromo, cloro o flúor y la línea ondulada representa el punto de unión al grupo de unión (“L”).
10. Método según la reivindicación 9, en el que el éster es un éster de fenol de la fórmula:
Figure imgf000069_0001
en la que la línea ondulada representa el punto de unión al grupo de unión (“L”).
11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el adyuvante es un agonista de TLR, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en un agonista de TLR2, un agonista de TLR3, un agonista de TLR4, un agonista de TLR7, un agonista de TLR8, un agonista de TLR7/TLR8 y un agonista de TLR9, o más preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en un agonista de TLR7, un agonista de TLR8 y un agonista de TLR7/TLR8.
12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el anticuerpo se une a un antígeno de una célula cancerosa, preferiblemente el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, o más preferiblemente el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-HER2, un anticuerpo anti-PDL1, un anticuerpo anti-CEA y un anticuerpo anti-EGFR.
13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que comprende combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II en la disolución acuosa hasta que al menos el 40% en mol o preferiblemente hasta que al menos el 50% en mol del uno o más compuestos de fórmula I se conjuga con el anticuerpo de fórmula II para proporcionar el inmunoconjugado de fórmula III.
14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que el método da como resultado una reducción de más del 5%, preferiblemente una reducción de más del 15% o más preferiblemente una reducción de más del 25% de impurezas detectables en el inmunoconjugado de fórmula III en la primera disolución acuosa tamponada en relación con un inmunoconjugado de fórmula III en una primera disolución acuosa tamponada preparada al combinar el uno o más compuestos de fórmula I y el anticuerpo de fórmula II en una disolución acuosa tamponada a un pH de menos de 7,5 usando solución salina tamponada con fosfato, en el que todas las condiciones de reacción son idénticas excepto por el tampón.
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