ES2939124T3 - Sistemas y procedimientos automatizados para preparar muestras biológicas para su examen - Google Patents
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Abstract
El aparato descrito en este documento presenta un brazo de sustrato y una pinza, una plataforma que tiene una superficie superior ubicada frente al sustrato cuando el brazo del sustrato está en una posición de procesamiento de muestras y presenta al menos un puerto de fluido ubicado en una superficie de la plataforma frente al sustrato y en al menos un puerto de vacío ubicado en la superficie de la plataforma frente al sustrato, y durante la operación, el aparato está configurado para (a) dispensar una primera cantidad de fluido desde al menos un puerto de fluido para llenar una separación entre el sustrato y la plataforma , (b) dispensar una cantidad adicional de fluido del al menos un puerto de fluido en la separación para desplazar una porción de la primera cantidad de fluido, y (c) retirar la porción de la primera cantidad de fluido de la separación a través del al menos un puerto de vacío. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Sistemas y procedimientos automatizados para preparar muestras biológicas para su examen
Antecedentes
Durante años, los auxiliares de laboratorio han usado tintes y colorantes tales como los usados en la tinción de Romanovski para preparar muestras biológicas para mejorar el contraste de una muestra durante su examen. Dicho examen utiliza típicamente un microscopio, otro dispositivo que capta imágenes de la muestra o, en otros casos, un examen visual sin ayuda. Se conocen varios sistemas y procedimientos diferentes para preparar una muestra para su examen. Por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 6.096.271; 7.318.913; y 5.419.279, y las solicitudes de patente de EE. UU. publicadas n.os 2008/0102006 y 2006/0073074 se refieren a máquinas y procedimientos para teñir un sustrato durante el procesamiento de muestras. Estas publicaciones proporcionan diversos detalles sobre la tinción y la preparación de muestras para su examen.
El documento WO 2012/064873 A1 divulga sistemas y procedimientos que permiten la preparación automatizada de muestras biológicas para su examen, en los que al menos una fase de fijación para fijar una muestra biológica a un sustrato tal como un portaobjetos de microscopio, una fase de tinción para teñir la muestra y una fase de enjuague para enjuagar la muestra está incluida. Una o más de las fases de fijación, tinción y enjuague incluyen uno o más ciclos de agitación para distribuir los reactivos de forma homogénea y uniforme en la muestra.
El documento WO 2007/137272 A2 divulga un dispositivo, procedimiento y sistema para preparar y clasificar muestras para su análisis microscópico.
El documento EP 0310 339 A2 divulga un procedimiento de procesamiento de tejidos o similares que implica la aplicación de líquidos al material montado en un soporte.
El documento US 6 168 948 B1 divulga un dispositivo y sistema de diagnóstico de ácido nucleico integrado miniaturizado que incluye una zona de extracción de ácido nucleico que incluye sitios de unión de ácido nucleico.
El documento US 6485 918 B1 divulga un procedimiento y aparato para incubar un reactivo líquido con puntos diana en un sustrato de micromatriz.
Sumario
La presente divulgación se refiere a sistemas y procedimientos automatizados para preparar muestras biológicas para su examen. Las muestras pueden incluir, por ejemplo, una muestra de sangre que contiene glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas, aplicada a un sustrato, por ejemplo, un portaobjetos de microscopio o un cubreobjetos. Se pueden usar diferentes modos de realización para preparar otras muestras biológicas a partir de muestras biológicas que incluyen médula ósea, orina, tejido vaginal, tejido epitelial, tumores, semen, saliva y otros líquidos corporales. Los aspectos adicionales de la divulgación incluyen sistemas y procedimientos para fijar, teñir, enjuagar y agitar las muestras. En general, los sistemas y procedimientos divulgados en el presente documento proporcionan un procesamiento de muestras rápido, eficaz y altamente uniforme usando cantidades mínimas de líquido. Los procedimientos incluyen una o más fases de fijación, tinción y enjuague, incluyendo una o múltiples fases de agitación durante o después de una o más de las fases de fijación, tinción y enjuague. Los sistemas se pueden implementar como un dispositivo autónomo o como un componente en un sistema mayor para preparar y examinar muestras biológicas.
En un primer aspecto, la divulgación cuenta con un aparato para el procesamiento automatizado de una muestra biológica en un sustrato para su examen, contando el aparato con una plataforma que tiene una superficie superior localizada opuesta al sustrato cuando el brazo del sustrato está en una posición de procesamiento de muestras e incluye al menos un puerto de líquido localizado en una superficie de la plataforma orientada hacia el sustrato y al menos un puerto de vacío localizado en la superficie de la plataforma orientada hacia el sustrato, la posición de procesamiento del sustrato, el sustrato y la superficie superior de la plataforma son sustancialmente paralelos y forman una separación, donde durante el funcionamiento, el aparato está configurado para hacer circular líquido entre el al menos un puerto de líquido y el al menos un puerto de vacío: (a) dosificando una primera cantidad de líquido desde el al menos un puerto de líquido para llenar la separación entre el sustrato y la plataforma; (b) dosificando una cantidad adicional de líquido desde el al menos un puerto de líquido hacia la separación para desplazar una parte de la primera cantidad de líquido; y (c) retirando la parte de la primera cantidad de líquido de la separación a través del al menos un puerto de vacío.
Durante el funcionamiento, el aparato está configurado para dosificar múltiples cantidades adicionales de líquido desde el al menos un puerto de líquido hacia la separación para desplazar partes de líquido de la separación, y retirar las partes desplazadas de líquido a través del al menos un puerto de vacío. El aparato está configurado para dosificar continuamente la cantidad adicional de líquido y para retirar la parte de la primera cantidad de líquido. El aparato está configurado para dosificar de forma alterna las múltiples cantidades adicionales de líquido y retirar las
partes desplazadas de líquido para generar un flujo pulsátil de líquido entre el al menos un puerto de líquido y el al menos un puerto de vacío.
Los modos de realización del aparato pueden incluir uno cualquiera o más de los siguientes rasgos característicos.
Las múltiples cantidades adicionales de líquido pueden incluir al menos 2 cantidades adicionales de líquido (por ejemplo, al menos 4 cantidades adicionales de líquido). El aparato se puede configurar para dosificar la cantidad adicional de líquido desde el al menos un puerto de líquido a una tasa de 20 microlitros por segundo o más. El aparato se puede configurar para dosificar la cantidad adicional de líquido desde el al menos un puerto de líquido a una tasa de 250 microlitros por segundo o menos. La plataforma se puede orientar de modo que el al menos un puerto de líquido esté inclinado hacia arriba en un ángulo de 3 grados o más (por ejemplo, 20 grados o más) en relación con el al menos un puerto de vacío.
El aparato puede incluir un puerto de succión localizado en el portador del sustrato, donde el puerto de succión se puede conectar a una fuente de succión para proporcionar succión al puerto de succión a través de un tubo de succión para fijar el sustrato al portador del sustrato. El al menos un puerto de líquido puede incluir un primer puerto de colorante, y el aparato puede incluir un primer depósito de colorante y un primer conducto de colorante conectado al primer puerto de colorante de modo que durante el funcionamiento, se puede dosificar líquido que incluye un primer colorante desde el primer depósito de colorante a través del primer puerto de colorante y hacia la separación. El al menos un puerto de líquido puede incluir un segundo puerto de colorante espaciado del primer puerto de colorante en la superficie de la plataforma, y el aparato puede incluir un segundo depósito de colorante y un segundo conducto de colorante conectado al segundo puerto de colorante de modo que durante el funcionamiento, el líquido que incluye un segundo colorante se puede dosificar desde el segundo depósito de colorante a través del segundo puerto de colorante y hacia la separación.
El al menos un puerto de líquido puede incluir un puerto de fijador, y el aparato puede incluir un depósito de fijador y un conducto de fijador conectado al puerto de fijador de modo que durante el funcionamiento, se puede dosificar líquido que incluye un fijador desde el depósito de fijador a través del puerto de fijador y hacia la separación. El al menos un puerto de líquido puede incluir un puerto de enjuague, y el aparato puede incluir un depósito de enjuague y un conducto de enjuague conectado al puerto de enjuague de modo que durante el funcionamiento, se puede dosificar líquido de enjuague desde el depósito de enjuague a través del puerto de enjuague y hacia la separación.
El aparato puede incluir un conducto de residuos y un recipiente de residuos conectado al al menos un puerto de vacío. Durante el funcionamiento, se puede establecer una vía de presión negativa entre el al menos un puerto de líquido y el al menos un puerto de vacío. El al menos un puerto de vacío puede incluir múltiples puertos de vacío.
El al menos un puerto de líquido puede incluir un primer puerto de colorante, un segundo puerto de colorante, un puerto de fijador y un puerto de enjuague, y durante el funcionamiento, el aparato se puede configurar para hacer circular un líquido que incluye un primer colorante, un líquido que incluye un segundo colorante, un líquido que incluye un fijador y un líquido de enjuague realizando las etapas (a), (b) y (c) para dosificar los líquidos desde el primer puerto de colorante, el segundo puerto de colorante, el puerto de fijador y el puerto de enjuague, respectivamente.
El aparato puede comprender además un brazo del sustrato que incluye un portador del sustrato, un accionador conectado al brazo del sustrato y configurado para mover el brazo del sustrato entre una posición abierta y una posición de procesamiento de muestras, y dos o más vástagos dispuestos en la superficie superior de la plataforma de modo que cuando el sustrato se pone en contacto con todos los vástagos en la posición de procesamiento del sustrato, el sustrato y la superficie superior de la plataforma son sustancialmente paralelos y forman la separación de al menos aproximadamente 50 micrómetros.
El aparato puede incluir un bloque de soporte que tiene un rebajo, donde la plataforma se sitúa dentro del rebajo del bloque de soporte, y el sustrato se eleva en relación con la superficie superior del bloque de soporte de modo que el líquido de la separación se pueda recoger dentro del rebajo.
El brazo del sustrato puede ser un primer brazo del sustrato y el portador del sustrato puede ser un primer portador del sustrato, y el aparato puede incluir un segundo brazo del sustrato que cuenta con un segundo portador del sustrato y un mecanismo de traslación configurado para trasladar el aparato entre al menos dos posiciones, donde en una primera de las posiciones, el primer portador del sustrato se sitúa para recuperar un sustrato de un transportador del sustrato, y en una segunda de las posiciones, el segundo portador del sustrato se sitúa para recuperar un sustrato del transportador del sustrato. El aparato puede incluir un sistema de control conectado al mecanismo de traslación, donde el sistema de control está configurado de modo que durante el funcionamiento del aparato, el sistema de control activa el mecanismo de traslación de modo que: cuando un sustrato se sujeta al segundo portador del sustrato y el segundo brazo del sustrato está en la posición abierta, en la posición de procesamiento de muestras o en una posición intermedia entre la posición abierta y la posición de procesamiento de muestras, el primer portador del sustrato se sitúa para recuperar un sustrato del transportador del sustrato; y cuando se sujeta un sustrato al primer portador del sustrato y el primer brazo del sustrato está en la posición
abierta, en la posición de procesamiento de muestras o en una posición intermedia entre la posición abierta y la posición de procesamiento de muestras, el segundo portador del sustrato se sitúa para recuperar un sustrato del transportador del sustrato.
Los modos de realización del aparato también pueden incluir cualquiera de los otros rasgos característicos o aspectos divulgados en el presente documento, incluyendo rasgos característicos y aspectos divulgados en relación con diferentes modos de realización, en cualquier combinación como sea apropiado.
En otro aspecto, la divulgación cuenta con un procedimiento de procesamiento de una muestra biológica en un sustrato para su examen de acuerdo con la reivindicación 14.
A menos que se establezca expresamente de otro modo, la presente divulgación cuenta con una serie de modos de realización con propósitos ilustrativos. Sin embargo, cabe destacar que los rasgos característicos, aspectos y etapas asociados con cada uno de estos modos de realización se pueden combinar con rasgos característicos, aspectos y etapas asociados con otros modos de realización. El alcance de la divulgación no está limitado a las combinaciones particulares de rasgos característicos, aspectos y etapas divulgados en relación con modos de realización específicos, sino que se ha de entender que dichos rasgos característicos, aspectos y etapas son aplicables más en general a toda la divulgación, y se pueden combinar como se desee en modos de realización específicos adicionales.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o pruebas de la presente invención, a continuación se describen procedimientos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Otros rasgos característicos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, y a partir de las reivindicaciones.
Descripción de los dibujos
La FIG. 1 es una vista en perspectiva de un modo de realización de un aparato para preparar muestras biológicas para su examen, con ambos portadores de muestras 20A y 20B en posición abierta.
La FIG. 2 es otra vista en perspectiva de una parte del aparato de la FIG. 1 (no se muestran los brazos del sustrato ni los portadores de muestras).
La FIG. 3A es otra vista en perspectiva del aparato de la FIG. 1, con el portador de muestras 20A en posición abierta y el portador de muestras 20B en posición cerrada (de procesamiento de muestras).
La FIG. 3B es una vista en 
perspectiva de un mecanismo de indexación del aparato de la FIG.1.
La FIG. 4 es una vista en perspectiva del aparato de la FIG. 1 que muestra conexiones entre el aparato y los depósitos de líquido por medio de múltiples conductos de líquido.
La FIG. 5 es una vista en perspectiva de un sistema de examen de muestras que incluye un transportador del sustrato automatizado y un modo de realización de un aparato de preparación de muestras como se describe en el presente documento.
La FIG. 6A es una vista en perspectiva ampliada de una parte del aparato de la FIG. 1 que muestra el portador de muestras 20B, la plataforma 60B y el bloque 80B en detalle.
La FIG. 6B es una vista en
perspectiva de un mecanismo de rótula del aparato de la FIG. 1.
La FIG. 6C es una vista en sección transversal del mecanismo de rótula de la FIG. 6B.
La FIG. 7A es un diagrama de flujo que muestra una serie de etapas para mover los brazos del sustrato desde una posición abierta hasta la posición cerrada (de procesamiento de muestras).
La FIG. 7B es un diagrama esquemático de un modo de realización de un aparato de preparación de muestras como se describe en el presente documento.
La FIG. 8A es un diagrama de flujo que muestra una serie alternativa de etapas para mover los brazos del sustrato desde una posición abierta hasta una posición de procesamiento de muestras.
La FIG. 8B es un diagrama esquemático de un aparato para preparar muestras biológicas para su examen que incluye dos accionadores.
La FIG. 9 es un diagrama de flujo que muestra una serie de etapas para aplicar fijador a una muestra.
La FIG. 10 es un diagrama de flujo que muestra una serie de etapas para aplicar colorante a una muestra.
La FIG. 11A es un diagrama de flujo que muestra una serie de etapas para retirar el exceso de líquido de un sustrato.
La FIG. 11B es un diagrama de flujo que muestra una serie alternativa de etapas para retirar el exceso de líquido
de un sustrato.
La FIG. 12 es un diagrama de flujo que muestra una serie de etapas para enjuagar una muestra.
La FIG. 13 es un diagrama de flujo que muestra una serie de etapas para agitar una muestra.
La FIG. 14 es un diagrama de flujo que muestra una serie de etapas para secar una muestra.
La FIG. 15 es una vista en perspectiva 
de un aparato de preparación de muestras como se usa en un sistema de examen de muestras más grande.
La FIG. 16 es un diagrama de flujo que muestra una serie de etapas para procesar una muestra montada en un sustrato.
La FIG. 17 es un gráfico que muestra el volumen de líquido consumido en función del tiempo en el diagrama de
flujo de la FIG. 16.
Las FIGS. 18A y 18B son vistas en perspectiva del aparato de la FIG. 1 que muestran la colocación de un sustrato
sobre un brazo del sustrato por un transportador del sustrato automatizado.
Los símbolos de referencia similares en los diversos dibujos indican elementos similares.
Descripción detallada
En el presente documento se divulgan procedimientos y sistemas para el procesamiento automatizado de muestras biológicas. Los procedimientos y sistemas de procesamiento automatizado de muestras descritos en el presente documento proporcionan ventajas sobre los procedimientos manuales y otros procedimientos automatizados de procesamiento, que incluyen una velocidad de procesamiento potenciada mientras se usan volúmenes mínimos
de reactivos y al mismo tiempo producen una preparación de muestra altamente uniforme que reduce significativamente la variabilidad asociada con la aplicación de colorantes, fijadores y otros reactivos en comparación con las muestras procesadas a mano o por otros sistemas.
Los procedimientos convencionales de procesamiento automatizado tienen típicamente un rendimiento de procesamiento relativamente alto mientras que al mismo tiempo consumen grandes volúmenes de líquidos de procesamiento, o tienen un rendimiento de procesamiento relativamente bajo mientras consumen volúmenes reducidos de líquidos. Sin embargo, para muchas aplicaciones, son deseables tanto el funcionamiento de alto rendimiento como el bajo consumo de líquidos. Manteniendo un alto rendimiento, las muestras se pueden procesar eficazmente para su posterior examen. Manteniendo bajo el consumo de líquidos, la cantidad de residuos del procesamiento se reduce junto con el volumen necesario de reactivos de procesamiento, manteniendo bajos los
costes de funcionamiento. Los sistemas y procedimientos divulgados en el presente documento permiten el procesamiento automatizado rápido de muestras (por ejemplo, más de 100 muestras por hora por una sola máquina) usando bajos volúmenes de líquidos de procesamiento (por ejemplo, menos de 1 ml de líquidos por muestra), mientras producen resultados altamente uniformes y repetibles.
Sistemas y procedimientos de preparación de muestras biológicas
Antes de examinar las muestras, se preparan en una serie de etapas para potenciar el aspecto visual de determinados rasgos característicos en las muestras. En la FIG. 1 se ilustra un modo de realización de un aparato
o máquina 1 para preparar una muestra biológica para su examen o formación de imágenes en un sustrato 2 tal como un portaobjetos de microscopio, cubreobjetos u otra superficie transparente. La máquina 1 se puede incorporar a un sistema global para preparar y analizar muestras que comprenden líquidos corporales u otras muestras biológicas que contienen células, tal como el sistema 2000 mostrado en la FIG. 15 y descrito a continuación. La máquina 1 en general puede incluir, o formar parte de, un sistema que cuenta con una primera estación que obtiene una muestra, una segunda estación que aplica la muestra a un sustrato, tercera y cuarta
estaciones para fijar y teñir la muestra, respectivamente, una quinta estación que seca la muestra, una sexta estación que toma imágenes de la muestra y una séptima estación para analizar las imágenes y los datos obtenidos de la muestra. Determinados modos de realización de la máquina 1 son compatibles con el sistema 2000; algunos modos de realización de la máquina 1 se pueden usar en otros sistemas de preparación de muestras y/o como dispositivos autónomos.
La máquina 1 puede incluir o conectarse a un sistema de control 5 como se muestra en la FIG. 4, que proporciona otra vista en perspectiva de la máquina 1. El sistema de control 5 puede incluir uno o más ordenadores, conteniendo cada uno una unidad central de procesamiento que puede ejecutar instrucciones de programa informático almacenado en medios legibles por ordenador tales como un disco duro, unidad óptica o memoria. Adicionalmente, el sistema de control 5 puede incluir circuitos eléctricos para ejecutar las instrucciones de programa informático. El sistema de control 5 puede incluir una interfaz de usuario para recibir comandos del usuario para controlar el funcionamiento de la máquina 1. Los programas informáticos almacenados en o proporcionados al ordenador puede incluir programas que controlan el funcionamiento de los componentes de la máquina 1 durante el procesamiento de muestras, tales como las bombas de líquidos y el vacío. Por ejemplo, los programas informáticos pueden incluir instrucciones para ordenar a la máquina 1 que aplique diversos fijadores, colorantes y enjuagues a la muestra, y que realice varias etapas de agitación durante el procesamiento de muestras.
Además, el programa informático puede incluir configuraciones predeterminadas, y la interfaz de usuario puede contener rasgos característicos de personalización para proporcionar al usuario la capacidad de cambiar estas configuraciones predeterminadas. Por ejemplo, la interfaz de usuario puede contener rasgos característicos de personalización para permitir que un usuario personalice la velocidad, la frecuencia o el orden de las fases de fijación, tinción y enjuague, así como los parámetros de agitación (que se describen además a continuación). El sistema de control 5 también se puede comunicar por medio de un protocolo de red (tal como Appletalk®, IPX o TCP/IP). Por ejemplo, el protocolo de red puede usar cables (tales como cables de par trenzado) y/o una conexión inalámbrica tal como WiFi. El sistema de control puede estar conectado a un sistema de información del laboratorio usando el protocolo de red. El sistema de información del laboratorio puede contener un servidor y/o una base de datos para almacenar información relacionada con las muestras procesadas en la máquina 1. Por ejemplo, la base de datos puede contener una tabla que proporciona información sobre la persona o la fuente de la muestra (por ejemplo, nombre, fecha de nacimiento (FN), dirección, hora en que se tomó la muestra, sexo, etc.), información relacionada con el procesamiento de la muestra (procesada en fecha ##/##/####, número de muestra #, etc.), una copia de cualquier imagen adquirida de la muestra y copias de cualquier resultado obtenido al analizar las imágenes.
En referencia a la FIG. 1, la máquina 1 puede incluir soportes 110A y 110B para asegurar el dispositivo a una localización dentro de un sistema o a una estación de trabajo del laboratorio. La máquina 1 también incluye uno o más brazos del sustrato 10A y 10B, cada uno conectado por su base a un accionador 30A y 30B. Los extremos opuestos de los brazos del sustrato 10A y 10B incluyen portadores del sustrato 20A y 20B para recibir y sostener sustratos durante el procesamiento de muestras. Cada portador del sustrato 20A y 20B recibe y sostiene un sustrato 2 mientras la máquina 1 completa todas las etapas de procesamiento de muestras (descritas a continuación). El sustrato puede ser o incluir un portaobjetos de microscopio, un cubreobjetos u otro material transparente adecuado para sostener una muestra durante el procesamiento de muestras y su examen microscópico después del procesamiento de muestras. El modo de realización de la FIG. 1 representa un portaobjetos de microscopio de vidrio, sustrato 2, que incluye una muestra biológica 3. Usando puertos de succión, los portadores del sustrato 20A, 20B pueden sostener el sustrato 2 en los brazos del sustrato 10A, 10B durante el procesamiento de muestras. Un tubo de succión 23 proporciona succión a los portadores del sustrato 20A y 20B a través de los puertos de succión 21A y 21B, y 22A y 22B (cabe señalar que los puertos 21A y 22A están situados detrás del portaobjetos 2 en la FIG. 1, y se muestran en líneas discontinuas).
El modo de realización de la máquina 1 mostrada en las FIGS. 1-3 es una máquina de doble sustrato, que puede sostener y procesar un sustrato en cada uno de los brazos del sustrato 10A y 10B. Otros modos de realización proporcionan el procesamiento de un solo sustrato o tres o más sustratos, secuencial o simultáneamente. Además, mientras que los modos de realización representados en las FIGS. 1-6 usan succión para sujetar los sustratos 2 a los brazos del sustrato 10A y 10B, otros modos de realización alternativos pueden usar diversos tipos de pinzas, lengüetas o imanes (si el sustrato está magnetizado) para sujetar un sustrato 2 a un brazo del sustrato 10A durante el procesamiento de muestras.
En los modos de realización mostrados en las FIGS. 5 y 18A-B, la máquina 1 recibe un sustrato 2 que lleva una muestra 3 de un transportador del sustrato automatizado 120 o manualmente de una persona. Como ejemplo, el transportador del sustrato 120 puede ser un dispositivo que transporta un sustrato entre estaciones (por ejemplo, de la estación 121 a la estación 122 a la estación 123, a la estación 124 y a la estación 125). En la FIG. 5 se muestra un sistema que tiene una primera estación lectora de etiquetas 121, una estación de aplicación 122, una estación de tinción 123 que incluye la máquina 1, una cámara o estación de formación de imágenes 124 y una segunda estación lectora de etiquetas 125. La primera estación lectora de etiquetas 121 está configurada para leer información del sustrato 2 tal como un código de barras y/o información de "huellas" que se usa para identificar el sustrato 2 particular y la muestra 3 en el mismo. La segunda estación lectora de etiquetas 125 funciona de la misma
manera, y la información que lee se usa para verificar que la muestra 3 de la que se obtienen imágenes en la estación 124 es la misma que el sustrato que se procesó.
El transportador del sustrato 120 puede incluir un portador 127 para sostener el sustrato 2 y circuitos de registro o programa informático para posibilitar que el transportador 120 determine si el sustrato 2 está montado en el transportador 120. En un modo de realización, el transportador del sustrato 120 puede incluir un cilindro hidráulico para mover el sustrato 2 desde una primera estación 121 hasta una segunda estación 122. Después del procesamiento de la muestra, el transportador del sustrato 120 puede retirar el sustrato procesado de la estación de tinción 123 y transportar el sustrato 2 a otra estación para el examen del sustrato, tal como un microscopio o la estación 124. De forma alternativa, una persona puede retirar manualmente un sustrato de la máquina 1 después del procesamiento de la muestra.
Los brazos del sustrato 10A y 10B pueden girar alrededor de un eje para posibilitar que el sustrato se mueva de una posición abierta para cargar, a una posición de procesamiento de muestras, y de vuelta a la posición abierta para descargar después del procesamiento de muestras. En la FIG. 7A se muestra un diagrama de flujo 500 que incluye una serie de etapas para mover los brazos del sustrato desde una posición abierta hasta una posición de procesamiento. El diagrama de flujo 500 se describe además a continuación con referencia a la FIG. 7B, que muestra un diagrama esquemático de la máquina 1.
Cabe señalar que la máquina 1 de la FIG. 1 está configurada para aceptar y examinar dos sustratos. En el siguiente análisis y figuras se puede hacer referencia a un solo conjunto de componentes de la máquina 1 (por ejemplo, portador del sustrato 20A, accionador 30A, brazo del sustrato 10A, etc.). Sin embargo, se ha de entender que las mismas etapas, rasgos característicos y atributos que se divulgan en relación con un conjunto de componentes también se pueden aplicar al otro conjunto de componentes de la máquina 1 (por ejemplo, portador del sustrato 20B, accionador 30B, brazo del sustrato 10B, etc.). Por tanto, si bien el análisis en el presente documento se centra solo en un conjunto de componentes por claridad y brevedad, se entiende que las máquinas para el examen de muestras tales como la máquina 1 pueden incluir dos o más de dos conjuntos de componentes, teniendo cada conjunto algunos o todos los rasgos característicos analizados en el presente documento.
Volviendo a las FIGS. 7A y 7B, en una primera etapa 502 del diagrama de flujo 500, el transportador del sustrato 120 coloca un sustrato 2 en contacto con un portador del sustrato 20A. En la etapa 504, el sustrato 2 se sitúa sobre el portador del sustrato en una posición de "muestra arriba" o "abierta". Seguidamente, en la etapa 506, el accionador 30A gira el brazo de sustrato 10A aproximadamente 180° (véase la FIG. 7B) para situar el sustrato 2 en una posición de "muestra abajo" o "procesamiento de muestras" o "cerrada" (etapa 508), directamente encima de la plataforma 60A, de modo que el sustrato 2 está en una posición de procesamiento en la etapa 510.
A continuación, en la etapa 512, la máquina 1 tiñe la muestra 3 situada en el sustrato 2 dirigiendo los líquidos adecuados que incluyen colorantes, líquidos de lavado y fijadores, para que se bombeen desde los depósitos 210A, 211A, 212A y 213A y entren en contacto con la muestra 3 a través de los puertos 42A, 43A, 44A y 45A. El exceso de líquidos se retira de la muestra 3 por bombeo de vacío a través de los puertos 40A y 41A, y se recoge en los colectores de residuos 230 y 231.
En la etapa 514, después de la tinción de la muestra 3, el accionador 30A gira el brazo de sustrato 10 aproximadamente 180° (invirtiendo la rotación de la etapa 506) para devolver el sustrato a la posición de "muestra arriba". Finalmente, en la etapa 516, el transportador del sustrato 120 retira el sustrato procesado del portador del sustrato 20A. También se pueden usar otras posiciones abiertas o de "muestra arriba", siempre que un operario o un transportador de sustrato automatizado puedan cargar y descargar sustratos de la máquina 1. Por ejemplo, la posición de muestra arriba se puede girar 100° o más (por ejemplo, 120° o más, 130° o más, 140° o más) desde la posición de procesamiento de muestras. En algunos modos de realización, la posición de muestra arriba se puede girar menos de 100° (por ejemplo, menos de 90°, menos de 80°, menos de 70°) desde la posición de procesamiento de muestras, siempre que un operario o un transportador del sustrato puedan cargar y descargar sustratos de la máquina 1.
Los accionadores 30A y/o 30B pueden incluir un motor eléctrico, un sistema neumático, sistemas magnéticos u otro equipo (por ejemplo, un engranaje helicoidal) para mover el brazo 10A y/o 10B. Cuando los brazos del sustrato 10A y 10B están en posición abierta como se representa en la FIG. 1, los portadores 20A y 20B pueden recibir cada uno un sustrato 2. Una vez cargados sobre un portador del sustrato 20A o 20B, a continuación los accionadores 30A y/o 30B giran los brazos 10A y/o 10B, y por tanto el sustrato 2, desde la posición abierta ("muestra arriba") hasta una posición de procesamiento ("muestra abajo", como se muestra para el brazo 10B en la FIG. 3A) para la aplicación de soluciones de fijador, colorante y enjuague, incluyendo etapas de agitación, y de vuelta a una posición abierta para descargar después del procesamiento.
Con referencia a la FIG. 3A, el accionador 30B ha girado el brazo del sustrato 10B desde la posición abierta representada en la FIG. 1 hasta una posición "cerrada" o de procesamiento. En la FIG. 3A se muestra que el sustrato 2 en el brazo del sustrato 10B se ha volteado y girado aproximadamente 180° desde su posición de carga mostrada en la FIG. 1 hasta una posición orientada hacia abajo donde la muestra 3 en el sustrato 2 está
sustancialmente paralela a la superficie de la plataforma 60B. Como se analiza en relación con la FIG. 7A anterior, mientras el sustrato 2 se sitúa próximo a la plataforma 60B en la posición de procesamiento de muestras mostrada, la máquina 1 aplica diversos fijadores, colorantes y enjuagues a la muestra 3 en el sustrato 2 a través de varias fases de procesamiento, que se describirán con mayor detalle a continuación. Para retirar el sustrato 2 de la posición de procesamiento, el accionador 30B gira el brazo del sustrato 10B de vuelta a la posición abierta mostrada en la FIG. 1 (ambos brazos) y en la FIG. 3A (donde solo el brazo 10A está en la posición abierta).
En determinados modos de realización, el sistema de control 5 puede detectar la posición de los brazos utilizando uno o más sensores 105A y 105B para detectar los brazos indicadores 101A y 101B (como se muestra en las FIGS. 1 y 3). Los sensores 105A y 105B pueden ser sensores de proximidad, por ejemplo, sensores fotoeléctricos, que utilizan, por ejemplo, luz infrarroja o diversas otras tecnologías (láser, detectores de movimiento, etc.) para detectar la presencia o ausencia de los brazos. Por ejemplo, los sensores de proximidad 105A o 105B pueden tener un campo de detección, y los sensores pueden determinar si un brazo del sustrato (por ejemplo, el brazo 10A y/o 10B) o un portador del sustrato (por ejemplo, el portador 20A y/o 20B) están dentro del campo de detección o no. El sistema de control 5 puede recibir información de los sensores para determinar la posición de los brazos del sustrato 10. Por ejemplo, cuando el brazo del sustrato 10B (no mostrado en la FIG. 3A) se gira a una posición de procesamiento, el sensor de proximidad 105B en el extremo proximal del brazo indicador 101B detecta el portador del sustrato diana 20B y notifica al sistema de control 5 que el brazo del sustrato 10B está girado a una posición de procesamiento de muestras. En esta posición, el sensor de proximidad 105B en el extremo distal del brazo indicador 101B no enviará una señal al sistema de control 5, porque el sensor no detecta ninguna diana (por ejemplo, un brazo del sustrato o un portador del sustrato).
Cuando el brazo del sustrato 10B gira a una posición abierta (como se muestra en la FIG. 1), el sensor de proximidad 105B en el extremo distal del brazo indicador 101B detecta el portador del sustrato diana 20B y notifica al sistema de control 5 que el brazo del sustrato 10B está girado a una posición abierta. Dicho de otra manera, cuando el brazo de sustrato 10B ha girado alejándose del sensor 105B, los sensores envían una señal de "no presente" al sistema de control 5. Cuando el brazo 10B se gira hacia la posición abierta, el brazo 10B está más cerca del sensor 105B, y el sensor puede enviar una señal de "presente" al sistema de control 5. En configuraciones alternativas, el sensor puede estar montado en el sustrato 10B y puede detectar la presencia del brazo indicador 101B. En algunos modos de realización, el sistema de control 5 se puede usar para calibrar la posición de los accionadores 30A y 30B en posiciones conocidas abierta y de procesamiento de muestras, y/o para supervisar activamente el movimiento y la posición de los brazos del sustrato 10A y 10B en base a las señales de control y/o la retroalimentación recibida de los accionadores 30A y 30B.
La estructura y el eje de rotación de los brazos del sustrato 10A y 10B de la FIG. 1 se pueden variar en otros modos de realización de la invención. En la FIG. 8A se muestra un diagrama de flujo 600 que incluye una serie alternativa de etapas para mover los brazos del sustrato desde una posición abierta hasta una posición de procesamiento. El diagrama de flujo 600 se describe además a continuación con referencia a la FIG. 8B, que muestra un diagrama esquemático de la máquina 1.
En la etapa 602 del diagrama de flujo 600, el transportador del sustrato 120 coloca el sustrato 2 sobre el portador del sustrato 20A en una orientación de "muestra arriba". A continuación, en la etapa 604, un primer accionador 30A gira el sustrato 2 aproximadamente 180° en un plano perpendicular al plano de la FIG. 8B, de modo que el sustrato 2 permanece orientado en posición de "muestra arriba" encima de la plataforma 60A. En la etapa 606, un segundo accionador 35A recibe el sustrato 2 orientado en la posición de "muestra arriba". A continuación, en la etapa 608, el segundo accionador 35A (por ejemplo, situado entre el brazo del sustrato 10A y el portador del sustrato 20A) gira el sustrato 2 hacia una orientación de "muestra abajo". El segundo accionador 35A también puede mover el sustrato 2 hacia abajo hacia la plataforma 60A de modo que el sustrato 2 se ponga en contacto con los vástagos 70A y 70B.
Seguidamente, con el sustrato 2 en la posición de procesamiento en la etapa 610, la máquina 1 tiñe la muestra 3 en el sustrato 2 aplicando colorantes, fijadores y soluciones de lavado como se analiza anteriormente en relación con la etapa 512 del diagrama de flujo 500. Después de que se completa la tinción, el segundo accionador 35A gira el sustrato 2 de una orientación de "muestra abajo" a una orientación de "muestra arriba" (etapa 614), y a continuación el primer accionador 30A gira el sustrato 2 aproximadamente 180° (por ejemplo, en un plano perpendicular al plano de la FIG. 8B, invirtiendo la rotación aplicada en la etapa 606) de modo que el sustrato permanezca orientado en posición de "muestra arriba". Finalmente, en la etapa 618, el transportador del sustrato 120 retira el sustrato procesado del portador del sustrato 20A.
En general, la máquina 1 puede incluir una o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o más de cinco) plataformas 60A y 60B como se muestra en las FIGS. 1-3 para el procesamiento de muestras. Como se muestra en la FIG. 2, la plataforma 60A puede incluir lados laterales para soportar un lado superior de la plataforma. Se puede situar un escudo 100, mostrado en las FIGS. 1 y 3, entre las plataformas 60A y 60B para evitar que salpiquen líquidos entre las plataformas 60. En algunos modos de realización, el escudo 100 se puede formar a partir de un material transparente que bloquea los líquidos de una de las plataformas 60A y 60B para que no contaminen la otra plataforma. En determinados modos de realización, el escudo 100 se puede formar a partir de un material que es
translúcido u opaco. En las FIGS. 1 y 3, el escudo 100 se representa como formado a partir de un material transparente para permitir que otros componentes situados detrás del escudo 100 se muestren en la misma figura. El escudo 100 también se podría haber mostrado como formado a partir de un material opaco, en este caso partes de algunos componentes tales como la plataforma 60A y el bloque 80A se habrían ocultado.
En la FIG. 3B se muestra un mecanismo de indexación 50A que se puede usar para trasladar la máquina 1 para proporcionar sustratos 2 desde cada uno de los portadores del sustrato 20A, 20B hasta una posición para el procesamiento de muestras. El mecanismo de indexación 50A puede tener muchas formas, tales como dispositivos electromecánicos (por ejemplo, un conjunto de engranajes de piñón y cremallera accionado por un motor eléctrico), accionadores lineales (por ejemplo, accionadores neumáticos, accionadores hidráulicos o accionadores electromagnéticos). Aunque, en el modo de realización ilustrado, el mecanismo de indexación 50A traslada la máquina 1 linealmente entre dos posiciones, son posibles otras trayectorias de traslado basándose en el número de plataformas incluidas en la máquina 1, y en su configuración y disposición, tales como circular o semicircular (por ejemplo, una mesa de indexación que se puede mover en una trayectoria arqueada). Como se muestra, el mecanismo de indexación 50A puede incluir un engranaje de cremallera 50B sujeto a una base 50C de la máquina 1 y un engranaje de piñón 50D sujeto a un motor eléctrico 50E que está fijado a la base 50C. La máquina 1 se puede sujetar a la base 50C usando uno o más dispositivos deslizantes 50F de modo que la máquina 1 se puede mover suavemente cuando se traslada por el mecanismo de indexación 50A. Durante el uso, el mecanismo de indexación 50A puede mover la máquina 1 de modo que los múltiples portadores del sustrato 20A y/o 20B de la máquina 1 reciban un sustrato 2 desde un transportador del sustrato 120 (mostrado en la FIG. 5) de modo que una muestra dispuesta en el sustrato 2 se pueda preparar por la máquina 1, y también de modo que, una vez preparada, el portador del sustrato 20A y/o 20B pueda proporcionar el sustrato 2 que tiene una muestra preparada se pueda proporcionar al transportador del sustrato 120 para el procesamiento de la muestra.
Para máquinas que tienen dos plataformas 60A y 60B, como en el modo de realización ilustrado, los sustratos 2 se proporcionan típicamente hacia, y desde, el transportador del sustrato 120 de manera alterna. En algunos modos de realización, se proporciona un primer sustrato 2 desde el transportador del sustrato 120 hasta un primer portador del sustrato 20A, para procesarlo en una primera plataforma 60A, mientras la máquina 1 está en una primera posición. Mientras el primer sustrato 2 se procesa en la primera plataforma 60A, el mecanismo de indexación 50A puede trasladar la máquina 1 a una segunda posición de modo que un segundo portador del sustrato 20B pueda recibir un segundo sustrato, para procesarlo en la segunda plataforma 60B, desde el transportador del sustrato 120. Mientras el segundo sustrato se procesa en la segunda plataforma 60B, el mecanismo de indexación 50A puede trasladar la máquina 1 de vuelta a la primera posición de modo que el transportador del sustrato 120 pueda retirar el primer sustrato 2 del primer portador del sustrato 20A. Una vez que se retira el sustrato 2 de la primera plataforma portadora 20A, se puede proporcionar un sustrato siguiente a la primera plataforma portadora 20A. Este procedimiento para proporcionar sustratos a plataformas portadoras alternas se puede implementar para más de dos plataformas (por ejemplo, tres, cuatro, cinco o más de cinco), incrementando de este modo el rendimiento de muestras preparadas para su evaluación adicional.
Las plataformas 60A y 60B se forman típicamente de uno o más materiales que son relativamente inertes químicamente con respecto a los líquidos usados durante el procesamiento de muestras y proporcionan una tensión de superficie adecuada. Los materiales ejemplares que se pueden usar para formar las plataformas 60A y 60B incluyen termoplásticos tecnológicos, tales como polioximetileno (por ejemplo, Delrin® fabricado por DuPont), fluorocarburos de alto peso molecular, tales como politetrafluoroetileno (PTFe ) (por ejemplo, Teflon® fabricado por DuPont) y metales tales como aluminio, acero y titanio, siempre que se fabriquen y/o traten para proporcionar una tensión de superficie adecuada que actúe para ayudar a distribuir de forma uniforme y limitar los líquidos de procesamiento al espacio entre el sustrato 2 y las plataformas, y permitir un vaciamiento adecuado de los líquidos de procesamiento también. Por la selección de materiales adecuados, las plataformas también pueden reducir o minimizar de forma ventajosa la formación de burbujas o espacios dentro de los líquidos a medida que se distribuyen, y al mismo tiempo mantener una tensión de superficie suficiente de modo que se reduzca o elimine la fuga de líquido por la separación entre las plataformas y el sustrato 2.
En general, el área de superficie de las plataformas 60A y 60B se puede seleccionar como se desee para propósitos de manejo de sustrato y suministro de líquidos. Factores tales como el área de superficie de las plataformas 60A y 60B también pueden influir en el área de superficie seleccionada del sustrato 2. Por ejemplo, en algunos modos de realización, el área de superficie de la plataforma 60A (por ejemplo, el área de la superficie de la plataforma 60A que está orientada al sustrato 2) es ligeramente más pequeña que el área de la superficie del sustrato 2 que está orientada a la plataforma 60A. Manteniendo una relación de este tipo entre las áreas de las superficies orientadas de la plataforma 60A y el sustrato 2, se puede reducir o eliminar la fuga de líquido desde la región entre las superficies. Típicamente, por ejemplo, el área de la superficie del sustrato 60A que está orientada al sustrato 2 es más pequeña que el área de la superficie del sustrato 2 en un 2 % o más (por ejemplo, un 3 % o más, un 5 % o más, un 7 % o más, un 10 % o más, un 15 % o más, un 20 % o más, un 25 % o más, un 30 % o más).
Las plataformas 60A y 60B pueden estar sujetas a los bloques 80A y 80B, respectivamente. El bloque 80A incluye lados laterales 81A-84A que soportan un lado superior 85A como se muestra en la FIG. 2. Los bloques 80A y 80b pueden estar hechos de los mismos materiales o materiales similares a los usados para las plataformas, incluyendo
metales, cerámicas y/o plásticos. Por tanto, se pueden usar materiales tales como Delrin® para formar los bloques 80A y 80B, en particular en modos de realización que implementan la tinción de muestras de Romanovski. Otros materiales que se pueden usar en modos de realización incluyen metales y aluminio, acero o titanio recubiertos de politetrafluoroetileno de la marca Teflon®.
En algunos modos de realización, las plataformas 60A y/o 60B pueden estar elevadas como se muestra en las FIGS. 1-3. De forma alternativa, en determinados modos de realización, las plataformas 60A y/o 60B pueden estar enrasadas con la superficie superior de los bloques 80A y 80B, respectivamente. En todo caso, determinados rasgos característicos de la máquina 1, así como la tensión de superficie de los líquidos y la energía de superficie de la plataforma o el bloque evitan que el exceso de líquido se derrame por los bordes de las plataformas 60A/60B y/o de los bloques 80A/80B.
Como se muestra en las FIGS. 1 y 2, la plataforma 60A puede incluir los vástagos 70A-70D para proporcionar una separación entre la superficie de la plataforma 60A y el sustrato 2, y evitar que el sustrato 2 se ponga en contacto con la plataforma 60A. La plataforma 60B puede incluir un conjunto correspondiente de vástagos 71A-71D. Los vástagos pueden incluir separadores, pasadores, clavijas, varillas, esferas, paredes u otras estructuras que proporcionan separación entre la superficie de la plataforma 60A y/o 60B y el sustrato 2. Los vástagos 70A-70D y 71A-71D garantizan que las superficies de las plataformas 60A y 60B y el sustrato 2 permanecen sustancialmente paralelas cuando el sustrato 2 se pone en contacto con los vástagos. El beneficio de mantener estas dos superficies en paralelo es que el volumen contenido entre estas dos superficies queda por tanto definido y se puede controlar con precisión. Si las dos superficies no están sustancialmente paralelas, y el ángulo entre ellas cambia, a continuación el volumen entre ellas también cambia y no es fijo ni se controla con precisión. Además, es posible que los líquidos no se apliquen de forma uniforme a la muestra si dichas dos superficies no están sustancialmente paralelas.
Como se usa en el presente documento, la frase "sustancialmente paralelas" significa que dos superficies son exactamente paralelas o casi paralelas, de modo que las imperfecciones en la planitud de la superficie del sustrato 2 se reducen o eliminan cuando el sustrato 2 se pone en contacto con los vástagos. Por ejemplo, aunque se tiene mucho cuidado en la producción de sustratos, determinados sustratos pueden tener imperfecciones tales como esquinas torcidas y/o no coplanares. En los sistemas y procedimientos divulgados en el presente documento, el uso de vástagos ayuda a corregir estas imperfecciones mejorando la planitud de la superficie del sustrato 2 donde sea necesario, orientando el sustrato 2 en una relación sustancialmente paralela a las plataformas 60A y 60B en el procedimiento. La frase "sustancialmente paralelas" abarca situaciones en las que las dos superficies no son perfectamente planas, pero los vástagos son todos del mismo tamaño o altura, de modo que al menos los puntos de contacto de una superficie del sustrato con los vástagos están en el mismo plano.
En la FIG. 6A se muestra el sustrato 2 con la muestra 3 (muestra no mostrada), el portador del sustrato 20B, los bloques 80A, 80B, las plataformas 60A, 60B, los vástagos 70A-70D y 71A-71D y la separación 92 entre el sustrato 2 y la plataforma 60B. La separación 92 permite que los líquidos circulen entre la superficie de la plataforma 60B que contiene los puertos 40B-45B y el sustrato 2 que contiene la muestra 3. La distancia de separación necesaria para la fijación, tinción y enjuague óptimos de la muestra variará dependiendo del caudal de los líquidos dosificados desde los puertos 40B-45B (y/o los puertos 40A-45A), el diámetro de los puertos, la viscosidad de los líquidos aplicados durante el procesamiento y la cantidad de succión disponible para retirar líquidos del sustrato, la separación y la plataforma.
En algunos modos de realización, por ejemplo, los vástagos que proporcionan una separación 92 de aproximadamente 100-200 micrómetros entre la superficie de la plataforma 60B y el sustrato 2 posibilitan la fijación, tinción y enjuague de muestras que comprenden glóbulos sanguíneos en modos de realización que pueden dosificar líquidos con caudales que varían de 70 a 140 microlitros por segundo (por ejemplo, 90, 115 o 125 microlitros por segundo) desde los puertos 40B-45B que tienen un diámetro que varía de 500 a 1500 micrómetros. En general, el tamaño o la altura de separación 92 puede variar de aproximadamente 50 micrómetros a 1000 micrómetros para determinados modos de realización (por ejemplo, de aproximadamente 50 a 500 micrómetros, de aproximadamente 75 a 250 micrómetros, de aproximadamente 100 a 200 micrómetros), siempre que dichos modos de realización puedan superar la tensión de superficie de los líquidos en la separación mientras dosifican y retiran líquidos durante el procesamiento de muestras. Además, en determinados modos de realización, el diámetro de los puertos localizados en la plataforma 60A y/o 60B puede variar de aproximadamente 125 micrómetros a 5000 micrómetros.
En las FIGS. 6B y 6C se muestra un mecanismo de rótula 25 que se puede usar para alinear un portador del sustrato 20A para que esté paralelo a una plataforma 60A. El mecanismo de rótula 25 puede incluir un miembro esférico 25A que está rígidamente fijado al portador del sustrato 20A, un elemento de desviación 25B (por ejemplo, un resorte), un casquillo inferior 25c que está conectado rígidamente al brazo del sustrato 10A, un casquillo superior 25D, una tapa 25E que está fijada al casquillo inferior 25C (por ejemplo, usando elementos de sujeción) y un tornillo de fijación 25F. En algunos modos de realización, durante la fabricación y/o configuración de la máquina 1 y los portadores de sustrato 20A y/o 20B, el mecanismo de rótula 25 se puede ajustar para compensar cualquier desalineación que pueda estar presente debido a problemas de fabricación o acumulación de tolerancia.
Para ajustar el mecanismo de rótula 25, en algunos modos de realización, se afloja el tomillo de fijación 25F y se mueve el brazo del sustrato 10A a la posición cerrada. Puesto que el tornillo de fijación 25F está flojo, el portador del sustrato 20A, mientras porta un sustrato 2, se puede ubicar sustancialmente paralelo a la plataforma 60A mientras el sustrato 2 está situado a lo largo de los vástagos de contacto 70. De forma alternativa, en algunos modos de realización, el número de vástagos de la plataforma 60 se puede reducir o eliminar por completo; se puede usar temporalmente una cuña con un espesor correspondiente a la distancia de separación deseada durante la instalación o calibración de la máquina 1 junto con el mecanismo de rótula 25 para configurar la separación 92 a una distancia deseada para el procesamiento de muestras. Aunque el mecanismo de rótula 25 esté flojo, el elemento de desviación 25B aplica fuerza para mantener el portador del sustrato 20A semifijado al brazo del sustrato 10A de modo que se pueda mover independientemente, pero no esté tan flojo y ni tenga libertad para moverse tanto como para interferir o dañar otros componentes de la máquina 1. Una vez que el sustrato 2 esté presionado firmemente en posición cerrada para que el sustrato 2 esté sustancialmente paralelo a la plataforma 60A, se puede apretar el tornillo de fijación 25F para asegurar el mecanismo de rótula 25. Como se muestra, cuando se aprieta, el tornillo de fijación 25F aplica una fuerza descendente sobre el casquillo superior 25D y, por tanto, aplica una fuerza de fricción a la parte superior del miembro esférico 25A por medio del casquillo superior 25D. Puesto que el casquillo inferior 25C está fijado a la tapa 25E, la fuerza creada por el tornillo de fijación 25F también levanta el casquillo inferior 25C de modo que el casquillo inferior 25C aplica una fuerza de fricción al lado inferior del miembro esférico 25A para constreñir el miembro esférico 25A dentro de los casquillos superior e inferior 25C, 25D. Una vez constreñido el miembro esférico 25A, el portador del sustrato 20A queda fijado al brazo del sustrato 10A.
Típicamente, una vez que el portador del sustrato 20A se sitúa y constriñe con el tornillo de fijación 25F, no es necesario ajustar de nuevo el mecanismo de rótula 25 durante el uso normal. Sin embargo, si el portador del sustrato 20A se desalinea y, por lo tanto, el mecanismo de rótula 25 requiere ajuste (por ejemplo, debido a daños, reparación de la máquina, bajo rendimiento u otros motivos), se puede aflojar el tornillo de fijación 25F, se puede mover el portador del sustrato 20A a una posición cerrada para situarlo de modo que un sustrato portado por el portador del sustrato 20A esté sustancialmente paralelo a la plataforma 60A, y a continuación se puede apretar el tornillo de fijación 25F para asegurar el mecanismo de rótula 25.
En general, los accionadores 30A y/o 30B se pueden configurar para ajustar la posición de los brazos del sustrato 10A y/o 10B para variar el grado de separación entre la superficie de las plataformas 60A y/o 60B y el sustrato 2. Variar esta separación proporciona mayor flexibilidad en los modos de realización que permiten ajustar los líquidos asignados a cada puerto, los caudales, la viscosidad de los líquidos y las fuerzas de vaciamiento desde las plataformas 60A y/o 60B. Por ejemplo, una separación 92 de 100 micrómetros puede proporcionar suficiente fijación, tinción y enjuague de la muestra cuando los líquidos aplicados desde la plataforma 60a se dosifican a un caudal de 70 microlitros por segundo desde los puertos 40A-45A que tienen diámetros del puerto que varían de 500 micrómetros a 1500 micrómetros. De forma alternativa, con una distancia de separación 92 entre la superficie de la plataforma 60A y el sustrato 2 de aproximadamente 200 micrómetros, se puede usar un caudal mayor para líquidos dosificados desde los puertos 40A-45A, tal como 115-140 microlitros por segundo, para el procesamiento de muestras.
Como se divulga anteriormente, la máquina 1 puede contener una serie de puertos y tubos para dispersar y retirar líquidos aplicados durante el procesamiento de muestras. El siguiente análisis describe diversos puertos, tubos y otros componentes asociados con la plataforma 60A, pero se aplican consideraciones similares a la plataforma 60B y sus componentes asociados. En la FIG. 2 se muestra una vista ampliada del aparato mostrado en la FIG. 1, y muestra en detalle los puertos 40A-45A de la plataforma 60A y los tubos 50A-55A conectados al bloque 80A. Los tubos 52A-55A distribuyen determinados líquidos incluyendo uno o más fijadores, colorantes y soluciones de enjuague a través de la plataforma, hacia la separación y sobre el sustrato.
En referencia a la FIG. 2, el lado superior de la plataforma 60A incluye seis puertos 40A-45A que están conectados a los tubos 50A-55A. Los líquidos se impulsan por una o más bombas a través de los tubos y puertos sobre el sustrato 2. Uno o más depósitos de líquido 210A-213A (tal como un primer depósito de colorante 211A, un segundo depósito de colorante 212a , un depósito de fijador 210A y un depósito de solución de enjuague 213A), por ejemplo, como se muestra en la FIG. 4, pueden dirigir líquido sobre la plataforma 60A y el sustrato 2. El diámetro de los puertos 40A-45A mostrados en las FIGS. 1-3 varía de aproximadamente 500 micrómetros a 1500 micrómetros, aunque el diámetro también puede ser más pequeño o más grande en determinados modos de realización. En algunos modos de realización, el diámetro de los puertos de vacío 40A y 41A es más del doble del diámetro de los puertos de líquido 42A-45A.
Cada uno de los puertos 40A-45A está típicamente dedicado a una fuente particular de líquido o vacío. De forma alternativa, se puede usar más de un puerto para cada fuente de líquido o vacío, o se pueden conectar múltiples tubos desde diversas fuentes de líquido y vacío a un solo puerto localizado en la plataforma 60A. Por ejemplo, en algunos modos de realización solo se puede usar un puerto en la plataforma 60A para la retirada de residuos, pero cuando se usan líquidos más viscosos, el puerto único puede no proporcionar suficiente succión para vaciar el líquido residual de la plataforma. Por tanto, puede ser deseable en determinados modos de realización proporcionar dos puertos de succión en diferentes posiciones de la plataforma (por ejemplo, un puerto de succión
en cada extremo de la plataforma) para retirar el exceso de líquidos colorante, fijador y de enjuague como se muestra con los puertos 40A y 41A en la FIG. 2. Destacando además la variabilidad de las configuraciones de líquido a puerto, en determinados modos de realización un único puerto de la plataforma 60A puede estar dedicado para un colorante particular, mientras que en otros modos de realización se usan múltiples puertos para aplicar colorantes durante el procesamiento de muestras. De hecho, se pueden usar diversas combinaciones relacionadas con el número de puertos, localizaciones de los puertos y líquidos asignados a cada puerto y tubo de líquido en diferentes modos de realización de la invención.
Los puertos 40A-45A pueden estar situados en general como se desee en la plataforma 60A para proporcionar suministro de líquidos al, y retirada de líquidos del, sustrato 2. Típicamente, cada uno de los puertos de líquido se sitúa en la plataforma 60A de modo que la abertura del puerto no se sitúe directamente contigua o debajo de la muestra 3 en el sustrato 2 cuando la muestra se somete a procesamiento. Con determinadas combinaciones de muestras y colorantes, por ejemplo, si los colorantes se dosifican desde un puerto localizado directamente contiguo o debajo de una parte de la muestra 3, se puede aplicar una cantidad mayor de colorante a las células en esa parte (en las proximidades del puerto) que a las células de otras partes de la muestra. Como resultado, las células que reciben la cantidad mayor de colorante pueden aparecer más oscuras en las imágenes de la muestra, y esta tinción no uniforme de las células de la muestra puede complicar la evaluación manual y automatizada de la muestra e introducir errores en las mediciones diagnósticas y en los resultados analíticos basados en las imágenes. Por tanto, los puertos de líquido que suministran colorante a la muestra 3 pueden estar espaciados a determinada distancia del área de un portaobjetos que contiene la muestra para mejorar los resultados de la tinción.
Además, el uso de pares de puertos, por ejemplo, múltiples pares de puertos, localizados opuestos entre sí, también puede mejorar la uniformidad de la tinción. Por ejemplo, en algunos modos de realización se usan dos puertos para suministrar colorante a la muestra 3. Los dos puertos pueden estar localizados en la plataforma 60A en posiciones espaciadas una determinada distancia (por ejemplo, están desplazadas) de los bordes de la muestra 3, y localizados opuestos entre sí en dirección paralela a los bordes cortos de la plataforma 60A. Cuando se dosifica colorante desde los dos puertos espaciados, se deposita una cantidad relativamente uniforme de colorante en las células en diferentes regiones de la muestra 3, y se observa una homogeneidad de tinción mejorada en las imágenes de la muestra.
De forma similar, mientras que los puertos 40A-45A pueden estar situados en general como se desee para retirar el exceso de líquidos de la superficie del sustrato 2 usando una o más fuentes de vacío, en algunos modos de realización los puertos que se usan para retirar líquidos están espaciados a una distancia de las posiciones en la plataforma 60A que están directamente debajo de las células dentro de la muestra 3 en el sustrato 2. Situar los puertos de retirada de residuos de esta manera (es decir, no directamente opuestos a una parte de la muestra 3) reduce las posibilidades de que cuando se accionen dichos puertos para vaciar líquidos del sustrato 2, las células de la muestra 3 se dañen involuntariamente o se arrastren hacia los puertos de retirada de líquidos. En determinados modos de realización, debido a la diferencia de longitud de los lados largo y corto de la plataforma 60A, los puertos de retirada de residuos están espaciados del borde del área de muestras y se disponen opuestos entre sí a lo largo de una dirección paralela a los bordes largos de la plataforma 60A.
Fases de fijación
Los tubos de líquido 52A-55A y 52B-55B pueden estar situados para suministrar fijador a las plataformas 60A y 60B, la separación 92, el sustrato 2 y la muestra 3 durante el procesamiento de muestras. Los fijadores que se pueden usar incluyen productos químicos usados para proteger muestras biológicas de la descomposición, y dichos fijadores pueden impedir que se produzcan reacciones bioquímicas en la muestra e incrementar la resistencia mecánica y la estabilidad de la muestra. Se pueden usar diversos fijadores, incluyendo, pero sin limitarse a, metanol, etanol, isopropanol, acetona, formaldehído, glutaraldehído, EDTA, tensioactivos, sales metálicas, iones metálicos, urea y compuestos amínicos.
En referencia a la FIG. 4, se pueden conectar uno o más tubos de líquido 52-55A a un puerto en el interior de la plataforma 60A y a un depósito de fijador 210A respectivo. Los tubos de líquido pueden incluir también una conexión a una bomba 200A y/o a una válvula que puede dirigir fijadores desde el depósito a través del tubo y de un puerto localizado en la plataforma, y sobre un sustrato y una muestra. Como ejemplo, la bomba 200A puede dirigir el fijador desde el depósito 210A a través del tubo 54A, a través del bloque 80A, por el puerto 44A, sobre la plataforma 60A, a la separación 92 entre la plataforma 60A y el sustrato 2, y sobre el sustrato 2 que contiene la muestra 3. Después de aplicar una cantidad específica de fijador al sustrato 2, un vacío u otra fuente de succión 220A y/o 221A puede vaciar el fijador residual de la plataforma 60A, la separación 92 y el sustrato 2 hacia el recipiente de residuos 230A y/o 231A por medio de uno o más de los puertos 40A y/o 41A a través de los tubos de residuos 50A y 51 A.
En la FIG. 9 se muestra un diagrama de flujo 700 que incluye una serie de etapas para aplicar fijador a una muestra. En la etapa 702, una bomba (por ejemplo, la bomba 200A) dirige el fijador (por ejemplo, metanol) desde un depósito (por ejemplo, el depósito 210A) hacia un tubo de fijador (por ejemplo, el tubo 54A). En la etapa 704, el fijador se dirige hacia el puerto 44A sujeto al bloque 80A. A continuación, en la etapa 706, el fijador se dirige fuera del puerto
44A de la plataforma 60A. En la etapa 708, el fijador se dirige fuera a través del puerto 44A y hacia la separación 92 entre el sustrato 2 y la plataforma 60A. Finalmente, en la etapa 710, se fija la muestra 3 en el sustrato 2 por la solución fijadora.
En algunos modos de realización, la bomba 200A dirige el metanol a través del tubo 54A y el puerto 44A, sobre la plataforma 60A y hacia la separación 92 a un caudal de 70 microlitros por segundo durante un período de cuatro segundos. Un vacío u otra fuente de succión 220A y/o 221A retira a continuación el metanol residual presente en la separación 92 y/o en la plataforma 60A y el sustrato 2 usando los puertos 40A y/o 41A y los tubos de residuos 50A y/o 51A (descritos además a continuación). Seguidamente, la bomba 200A puede dirigir de nuevo el metanol a través del tubo 54A y el puerto 44A, y sobre la plataforma 60A a un caudal de 70 microlitros por segundo durante un período de cuatro segundos, seguido de un segundo proceso de vaciamiento de líquidos. Este proceso de fijación y vaciamiento se puede repetir de nuevo, usando el mismo fijador o uno diferente, dependiendo del tipo de muestra biológica que requiera fijación. Además, la máquina 1 puede variar la frecuencia y los caudales para cada fase de fijación. También se pueden usar otros caudales suficientes para superar cualquier tensión de superficie en el líquido localizado en la separación 92 y fijar la muestra 3 para su procesamiento y evaluación adicional. Ajustando la frecuencia y/o el caudal de las fases de fijación, la máquina 1 puede lograr una fijación óptima para diversas muestras usando varios fijadores diferentes. Las instrucciones de la máquina para diferentes tipos de muestras pueden estar integradas o preprogramadas en la unidad de control 5 y seleccionarse por un operario del sistema como sea necesario.
En general, se puede aplicar una amplia variedad de fijadores a las muestras durante las fases de fijación. Por ejemplo, se puede usar metanol al 85 % como fijador. Para algunos colorantes se puede usar un fijador a base de alcohol etílico o formaldehído. Se divulgan formulaciones adicionales de fijador que se pueden usar para preparar la muestra, por ejemplo, en la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/505.011.
Fases de tinción
La máquina 1 también incluye tubos y puertos configurados para aplicar uno o más tintes o colorantes a una muestra fijada a un sustrato en una o más fases de tinción. La tinción de una muestra incrementa el contraste de la muestra cuando se observa o se obtienen imágenes a través de un microscopio u otro dispositivo de formación de imágenes. Se pueden usar colorantes de Romanovsky y/u otros tintes o colorantes, incluyendo hematoxilina y eosina, fluoresceína, colorantes de tiacina usando anticuerpos, sondas de ácido nucleico y/o sales e iones metálicos. Se divulgan formulaciones adicionales de colorante que se pueden usar para preparar la muestra, por ejemplo, en la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/505.011.
La FIG. 10 es un diagrama de flujo 800 que incluye una serie de etapas para aplicar colorante a una muestra. En la etapa 802, una bomba (por ejemplo, la bomba 201 A) dirige el tinte o el colorante desde un depósito (por ejemplo, el depósito 211A) a un tubo de colorante (por ejemplo, el tubo 52A). En la etapa 804, el colorante se dirige hacia un puerto (por ejemplo, el puerto 42A) sujeto al bloque 80A. A continuación, en la etapa 806, el colorante fluye fuera del puerto 42A de la plataforma 60A. En la etapa 808, el colorante fluye hacia la separación 92 entre el sustrato 2 y la plataforma 60A y, después de esto, en la etapa 810, tiñe la muestra 3 en el sustrato 2.
En algunos modos de realización, se pueden usar múltiples tubos y puertos para aplicar colorante a la muestra 3. Por ejemplo, una segunda bomba (por ejemplo, la bomba 202A) puede dirigir el colorante (por ejemplo, el mismo colorante o un colorante diferente del dosificado desde el depósito 211A) desde el depósito 212A a través del tubo 53A y el puerto 43A y sobre la plataforma 60A. En determinados modos de realización se pueden conectar dos o más tubos de líquido a un depósito de colorante o bomba y/o válvula compartidos usados para dirigir el colorante a través de los puertos y sobre la plataforma. En referencia de nuevo a la FIG. 2, el tubo 52A puede suministrar colorante rojo, tal como un tinte de fluoresceína, a la plataforma, el sustrato 3 y la muestra 2. El tubo 53A puede suministrar un colorante azul, tal como un tinte de tiacina. En las FIGS. 1-6, el número, localizaciones y tamaños de los puertos de la plataforma 60A se seleccionan para optimizar la aplicación de colorante a una muestra fijada al sustrato. Si se seleccionan otros colorantes, puede ser preferente un número, localizaciones y tamaños de puertos diferentes dependiendo de la viscosidad del colorante.
Cada uno de los puertos 40A-45A (y 40B-45B) puede incluir tanto un canal de entrada para recibir líquido como un canal de salida para emitir líquido. En algunos modos de realización, los canales de salida de los puertos del enjuague 45A, del fijador 44A y de tinción 42A-43A están en la superficie superior de la plataforma 60A, y los canales de entrada de los puertos de vacío 40A y 41A pueden estar en los extremos opuestos de la superficie superior de plataforma 60A. Los canales de entrada de los puertos de enjuague 45A, de fijador 44A y de tinción 42A-43A pueden estar situados en el mismo lado lateral del bloque 80A, y los canales de salida de los puertos de vacío 40A y 41A pueden estar situados en lados laterales opuestos del bloque 80A.
A modo de ejemplo y con referencia a las FIGS. 2 y 10, el sistema de control 5 da instrucciones a una bomba (por ejemplo, la bomba 201A) en la etapa 802 para que dirija un colorante (por ejemplo, un colorante que comprende tinte de fluoresceína) desde un depósito de colorante hacia el tubo de líquido 52a . En la etapa 804, el colorante entra en el puerto 42A desde el tubo de líquido. A continuación, en la etapa 806, el colorante sale del puerto 42A
a un caudal de 140 microlitros por segundo, durante un período de cinco segundos, y en la etapa 808, el colorante se deposita en la separación 92 entre la plataforma 60A y el sustrato 2 que contiene la muestra 3. En la etapa 810, la muestra 3 en el sustrato 2 se tiñe. Después de la tinción, un vacío u otra fuente de succión (por ejemplo, las bombas 220 y/o 221) puede vaciar el colorante residual presente en la separación 92, en la plataforma 60a y en el sustrato 3 usando los puertos 40A-41A y los tubos de residuos 50A-51A.
La máquina 1 se puede programar para repetir estas fases de tinción y vaciamiento después de un retraso (por ejemplo, un retraso de entre 3 segundos y 10 segundos, tal como un retraso de cinco segundos), después de la primera fase de tinción. Se pueden dar instrucciones a una segunda bomba 202A por el sistema de control 5 para que dirija el tinte de tiacina desde un depósito de colorante a través del tubo de líquido 53A, por el puerto 43A a un caudal de 140 microlitros por segundo y sobre la plataforma 60A durante un período de tiempo, por ejemplo, tres segundos. Un vacío u otra fuente de succión (por ejemplo, la bomba 220A y/o 221) puede vaciar a continuación el tinte de tiacina residual presente en la separación 92 y/o en la plataforma 60A y/o en el sustrato 2 usando los puertos 40A-41A y los tubos de residuos 50A-51A. Al igual que con las fases de fijación, la máquina 1 puede variar la frecuencia, los tiempos de retraso y los caudales para cada fase de tinción. El caudal puede variar, por ejemplo, de 70 a 140 microlitros por segundo, o puede ser más pequeño o mayor que los límites externos de este intervalo (por ejemplo, de 10 a 500 microlitros por segundo) siempre que el caudal sea suficiente para superar cualquier tensión de superficie presente en el líquido localizado en la separación 92 y de forma deseable teñir la muestra para la evaluación prevista.
Los colorantes ejemplares que se pueden aplicar a las muestras incluyen, pero no se limitan a: colorante de Wright-Giemsa, colorantes de Giemsa y colorantes de Romanovsky. También se pueden aplicar a las muestras otros agentes tales como reactivos inmunocitoquímicos u otros marcadores de componentes celulares específicos.
Retirada de líquido residual
Como se menciona anteriormente, un vacío u otra fuente de succión 220 y/o 221 puede vaciar el líquido residual del sustrato 2, la separación 92 y la plataforma 60A durante o entre las fases de fijación y tinción. En referencia a la FIG. 1, se pueden conectar uno o más tubos de residuos a los lados 82A y 84A del bloque 80A. Los tubos de residuos o de vacío 50A y 51A se usan para extraer líquido y pequeñas partículas de la plataforma 60A, la separación 92 y el sustrato 2 hacia un recipiente de residuos u otra localización separada de la máquina 1. Con referencia a la FIG. 2, los tubos de residuos 51A y 51B pueden estar conectados a fuentes de vacío 220 y 221 separadas, y a los recipientes de residuos 230 y 231, en los extremos distales de los tubos de residuos. De forma alternativa, se pueden conectar dos o más tubos de residuos a una única fuente de vacío y al mismo recipiente de residuos, como se muestra en la FIG. 4. Los tubos de residuos 50A y 50B se pueden extender a través de las válvulas de presión 90A y 90B, respectivamente.
Se puede conectar un vacío u otra fuente (por ejemplo, la bomba de vacío 220 y/o 221) para aplicar succión a uno o más de los tubos de residuos 50A, 50B, 51A y 51B para extraer líquido de las plataformas 60A y/o 60B, la separación 92 y el sustrato 2 hacia los recipientes de residuos 230 y 231. La fuerza de vacío aplicada dentro de los tubos de residuos puede ser equivalente a de 68,9 mbar negativos a 689 mbar negativos (una negativa a diez libras por pulgada cuadrada ["psi"] negativas) para proporcionar una succión suficiente para retirar líquidos cuando la separación entre el sustrato 2 y la plataforma es de entre 100 a 200 micrómetros. En general, como se usa en el presente documento, la presión "negativa" se refiere a una presión menor que la presión ambiental dentro de la máquina 1 o el entorno circundante de la máquina 1. Por ejemplo, en algunos modos de realización, el entorno circundante de la máquina 1 tiene una presión del aire ambiente de aproximadamente una atmósfera. Las presiones "negativas" se refieren a presiones que son menores que esta presión del aire ambiente (por ejemplo, una presión de 68,9 mbar negativos [una psi] aplicada a un líquido es una presión de 68,9 mbar [una psi] menos que la presión del aire ambiente ejercida sobre el líquido). Se pueden usar otros vacíos que varían de 6,9 mbar (0,1 psi) negativos a 695 mbar (14 psi) negativos (por ejemplo, 413 mbar [seis psi] negativos), o mayores, siempre que dichos vacíos sean suficientes para superar cualquier tensión de superficie del líquido presente en la separación y retirar todo el líquido residual de la separación y en el sustrato y la muestra. Además, inmediatamente antes de aplicar vacío para vaciar líquidos de la separación, el accionador 30A puede elevar el borde próximo del sustrato 2 a una distancia de 15-35 micrómetros desde la posición de procesamiento de muestras. Esta separación incrementada entre el sustrato 2 y la plataforma 60 puede mejorar el vaciamiento de cualquier líquido residual en la separación 92 durante una fase de vacío.
En algunos modos de realización, el sistema de control 5 está configurado para variar la frecuencia y el vacío aplicado para la retirada de líquido durante el procesamiento de muestras. La FIG. 11A incluye un diagrama de flujo 900 que cuenta con una serie de etapas para retirar el exceso de líquido de un sustrato. Después de una fase de fijación, por ejemplo, el sistema de control 5 puede abrir las válvulas de presión 90A y/o 90C en la etapa 902 y aplicar un vacío de 344 mbar (5 psi) negativos en los tubos de residuos (por ejemplo, los tubos de residuos 50A y 51A) durante un período de cinco segundos. Durante este período se retira el fijador (etapa 904) de la separación, sustrato y plataforma a través de los puertos 40A y 41A. El líquido circula a través de los tubos de residuos en la etapa 906, y se deposita en uno o más recipientes de residuos (por ejemplo, los recipientes 230 y/o 231) en la etapa 908. Una vez que acaba el período de vaciamiento, el sistema de control 5 puede dar instrucciones a una o
más de las válvulas de presión 90A, 90C para que cierren los tubos de residuos 50A y/o 51A en la etapa 910, evitando de este modo un vaciamiento adicional por el vacío 220-221. El sistema de control 5 puede ordenar a la máquina 1 que repita esta etapa de retirada de líquido después de cada fase de fijación.
La FIG. 11B incluye un diagrama de flujo 1000 que cuenta con una serie alternativa de etapas para retirar el exceso de líquido de un sustrato. El procedimiento en el diagrama de flujo 1000 no usa válvulas de presión para cerrar los tubos de residuos. En cambio, después de una fase de aplicación de líquido, la fuente de succión 220 y/o 221 se inicializan en la etapa 1002 y entran en un estado activo en la etapa 1004. La fuente de succión aplica un vacío de 206 mbar (3 psi) negativos en los tubos de residuos 50A y/o 51A durante un período de cuatro segundos para retirar el líquido de la separación 92, el sustrato 2 y la plataforma 60A a través de los puertos 40A y 41A en la etapa 1006. El líquido vaciado circula a través de los tubos de residuos 50A y/o 51A en la etapa 1008, y se deposita en uno o más recipientes de residuos 230, 231 en la etapa 1010. La máquina 1 puede repetir esta etapa de retirada de líquidos después de cada fase de aplicación de líquido. Variando la frecuencia y la presión aplicadas durante las etapas de retirada de líquidos, la máquina 1 puede lograr una fijación, tinción y enjuague óptimos de las muestras biológicas.
Las válvulas de presión 90A, 90B, 90C y 90D cierran los tubos de residuos 50A, 50B, 51A y 51B, como se muestra en la FIG. 1. Las válvulas de presión 90A-90D se pueden accionar mecánica, eléctrica, hidráulica o neumáticamente a través de accionadores contenidos dentro o fuera de las válvulas. Las válvulas de presión 90A-90D funcionan para impedir el flujo de líquido a través de los tubos de residuos 50A, 50B, 51A y 51B. Por ejemplo, cuando se cambia o vacía un recipiente de residuos 230 lleno de la máquina 1, puede ser deseable cerrar las válvulas de presión (90A-90D) para evitar fugas de líquidos residuales presentes en los tubos de residuos. Se pueden usar diferentes tipos de válvulas u otros mecanismos tales como pinzas o tapones con modos de realización de la máquina 1 para cerrar los tubos de residuos 50A, 50B, 51A y 51B.
Fases de enjuague
Las soluciones de enjuague se pueden aplicar durante el procesamiento de muestras con la máquina 1 en una o más fases de enjuague. Por ejemplo, puede ser deseable retirar los líquidos residuales y/o en exceso de la muestra 3 en el sustrato 2, la separación 92 y las plataformas 60A y/o 60B entre las fases de fijación, entre las fases de tinción y/o entre las fases de fijación y tinción. Las soluciones de enjuague compatibles con los presentes sistemas y procedimientos incluyen agua destilada; soluciones acuosas tamponadas; disolventes orgánicos; y mezclas de disolventes acuosos y orgánicos, con o sin tamponamiento. Se divulgan formulaciones adicionales para soluciones de enjuague que se pueden usar para preparar la muestra, por ejemplo, en la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/505.011.
La FIG. 12 incluye un diagrama de flujo 1100 que cuenta con una serie de etapas para enjuagar una muestra. En la etapa 1102, una bomba (por ejemplo, la bomba 203A) dirige solución de enjuague (por ejemplo, que comprende agua destilada) desde un depósito (por ejemplo, el depósito 213A) hacia un tubo de enjuague (por ejemplo, el tubo de enjuague 55A). En la etapa 1104, la solución de enjuague entra en el puerto 45A conectado al bloque 80A. En la etapa 1106, la solución de enjuague fluye sobre la plataforma 60A a través del canal de salida del puerto 45A, y en la etapa 1108, la solución de enjuague entra en la separación 92 entre el sustrato 2 y la plataforma 60A. En la etapa 1110 se realiza el enjuague de la muestra 3. Finalmente, en la etapa 1112, una fuente de vacío 220, 221 aplica succión a uno o más de los tubos de residuos 50A y 51A para retirar la solución de enjuague de la separación 92 y el sustrato 2; la solución de enjuague se transporta al recipiente de residuos 230 y/o 231.
En algunos modos de realización, el sistema de control 5 puede ordenar a la bomba 203A que aplique la solución de enjuague a un caudal, por ejemplo, de 70 microlitros por segundo durante un período, por ejemplo, de cinco segundos. Al igual que con las fases de fijación, el sistema de control 5 puede variar la duración y el caudal de cada fase de enjuague y el número de fases de enjuague. Además, el sistema de control 5 puede ajustar la colocación de una o más fases de enjuague durante el procesamiento de muestras. El sistema de control 5 puede, por ejemplo, ordenar que una fase de enjuague se produzca una vez, después de completar todas las fases de fijación, y que una segunda fase de enjuague se produzca una vez, después de completar todas las fases de tinción. De forma alternativa, se pueden intercalar fases de enjuague entre dos o más fases de fijación o entre dos o más fases de tinción.
Fases de agitación
El procesamiento de muestras en determinados modos de realización puede incluir una o más fases de agitación para dispersar líquidos fijadores, colorantes y/o de enjuague a lo largo de la separación 92, el sustrato 2 que contiene la muestra 3 y las plataformas 60A y/o 60B durante las fases de fijación, tinción y/o enjuague. La FIG. 13 incluye el diagrama de flujo 1200 con una serie de etapas para agitar una muestra. El accionador 30A y/o 30B, mostrado en la FIG. 3A, puede proporcionar un ajuste fino del movimiento para cambiar la posición del sustrato 2 en relación con la plataforma 60A y/o 60B.
El sistema de control 5 puede incluir programas informáticos y/o equipos informáticos para dar instrucciones al
accionador 30A y/o 30B para que inicie una fase de agitación. El accionador 30A y/o 30B se puede configurar para mover el brazo del sustrato 20A y/o 20B hacia arriba y hacia abajo tras un comando de inicio de agitación desde el sistema de control. La fase de agitación se puede repetir durante un número predeterminado de ciclos de agitación. El término "ciclo de agitación", como se usa en el presente documento, se refiere al movimiento desde una posición de partida en sentido ascendente, seguido de un movimiento en sentido descendente opuesto al sentido ascendente. En algunos modos de realización, uno o más ciclos de agitación devuelven el sustrato 2 a la posición de partida al final de cada ciclo, o al menos al final de algunos ciclos. En determinados modos de realización, el sustrato 2 no se devuelve a la posición de partida al final de algunos o todos los ciclos de agitación, pero cada ciclo todavía incluye un movimiento ascendente seguido de un movimiento descendente. El accionador 30A y/o 30B típicamente continúa moviendo el sustrato 2 en uno o más ciclos de agitación hasta que se envía un comando de parada al accionador desde el sistema de control 5. Una fase de agitación puede incrementar temporalmente el tamaño de la separación (distancia de separación) entre el sustrato 2 y la superficie de la plataforma 60A y/o 60B, y a continuación devolver el sustrato a la posición de procesamiento de muestras. Además, una fase de agitación puede incluir una serie de movimientos que desplazan el sustrato 2 entre una posición angular en relación con la superficie de la plataforma 60A y/o 60B y la posición de procesamiento de muestras. La tensión de superficie en los líquidos dosificados hacia la separación entre la plataforma y el sustrato 2 provoca una redistribución de las moléculas de líquido en el sustrato cuando el sustrato se mueve desde la posición de procesamiento de muestras durante la fase de agitación y puede mejorar de forma ventajosa la distribución de líquido a través de la muestra.
También se pueden usar otros procedimientos para mover el sustrato 2 en relación con las plataformas durante las fases de agitación. Por ejemplo, en algunos modos de realización, la posición de uno o más de los vástagos 70A-D y/o 71A-D (por ejemplo, la medida en que se prolongan los vástagos por encima de la superficie de las plataformas 60A y/o 60B) se puede ajustar rápidamente para agitar la muestra 3. En determinados modos de realización, la posición de las plataformas 60A y/o 60B se puede ajustar para provocar la agitación de la muestra 3. Por ejemplo, las plataformas 60A y/o 60B se pueden mover de forma alterna hacia arriba y hacia abajo (por ejemplo, correspondiente al sentido del movimiento del sustrato 2 descrito anteriormente) para provocar la agitación de la muestra 3.
En algunos modos de realización, la agitación de la muestra 3 se puede efectuar variando el grado en que el accionador 30A y/o 30B impulsa el sustrato 2 hacia los vástagos 70A-D y/o 71A-D cuando los brazos del sustrato están hechos de un material que se flexiona, como se analiza a continuación. Se pueden usar extensómetros para medir y ajustar la frecuencia de la agitación aplicada al sustrato 2 detectando la variación de la tensión en los brazos del sustrato en función del tiempo.
En referencia a la FIG. 13, en una primera etapa 1202 se inicia una fase de agitación. En la etapa 1204, el sistema de control 5 da instrucciones al accionador 30A para que comience un ciclo de agitación. En respuesta a esta instrucción, el accionador 30A gira el sustrato 2 hacia arriba en la etapa 1206, incrementando la distancia entre el sustrato 2 y la plataforma 60A. A continuación, en la etapa 1208, el accionador 30A gira el sustrato 2 hacia abajo hacia la plataforma 60A, reduciendo la distancia entre el sustrato y la plataforma 60A. En la etapa de decisión 1210, si la fase de agitación ha de continuar, el control se devuelve a la etapa 1204 y se produce de nuevo la rotación del sustrato 2 por el accionador 30A en otro ciclo de agitación. Si ha de terminar la fase de agitación, a continuación el control pasa de la etapa 1210 a la etapa 1212, donde el sustrato 2 vuelve a su posición inicial con la agitación completa.
La fase de agitación puede incluir uno o más ciclos de agitación aplicados a través del accionador 30A y/o 30B. Además, se pueden producir fases de agitación una o múltiples veces durante cada una de las fases de fijación, tinción y/o enjuague y con frecuencias variables entre cada una de las fases de fijación, tinción y/o enjuague. Por ejemplo, y en referencia a la FIG. 3A, el accionador 30A y/o 30B puede elevar verticalmente el borde próximo del sustrato 2 a una distancia de 35 micrómetros desde la posición de procesamiento de muestras y posteriormente devolver el sustrato 2 a la posición de procesamiento de muestras tres veces, una vez después de cada fase de fijación, tinción y enjuague. El accionador 30A y/o 30B puede completar cada ciclo de agitación en dos segundos (por ejemplo, un segundo para elevar verticalmente el borde próximo del sustrato 2 a una distancia de 35 micrómetros desde la posición de procesamiento de muestras y un segundo para devolver el sustrato a la posición de procesamiento de muestras). La máquina 1 puede llevar a cabo instrucciones para variar la frecuencia y la distancia de agitación para cada ciclo y/o fase de agitación. Por ejemplo, una fase de agitación puede incluir que el accionador 30A y/o 30B eleve verticalmente el borde próximo del sustrato 2 a una distancia de 5 micrómetros desde la posición de procesamiento de muestras y a continuación devuelva el sustrato a la posición de procesamiento de muestras, de 10 a 20 veces por segundo.
También se pueden usar combinaciones alternativas de distancias y frecuencias de agitación. Por ejemplo, en algunos modos de realización, la distancia de agitación es de 5 micrómetros o más (por ejemplo, 15 micrómetros o más, 25 micrómetros o más, 50 micrómetros o más, 100 micrómetros o más, 150 micrómetros o más, 200 micrómetros o más, 250 micrómetros o más, 300 micrómetros o más, 500 micrómetros o más, 700 micrómetros o más, 1 mm o más). Por ejemplo, en determinados modos de realización, la distancia de agitación está entre 35 micrómetros y 350 micrómetros.
En algunos modos de realización, la frecuencia del ciclo de agitación es un ciclo por segundo o más (por ejemplo, dos ciclos por segundo o más, tres ciclos por segundo o más, cuatro ciclos por segundo o más, cinco ciclos por segundo o más, siete ciclos por segundo o más, diez ciclos por segundo o más).
También se pueden usar técnicas de agitación adicionales. Por ejemplo, en algunos modos de realización, el portador del sustrato 20A y/o 20B puede incluir un accionador que gira el sustrato alrededor de un eje perpendicular al eje de rotación del accionador 30A y/o 30B representado en las FIGS. 1 y 3.
De forma alternativa, la plataforma 60A y/o 60B puede estar equipada con un regulador de vástagos para elevar o bajar el uno o más vástagos 70A-D y/o 71A-D durante las fases de fijación, tinción y enjuague. Para implementar el regulador de vástagos, la plataforma 60A y/o 60B puede incluir vástagos que están sujetos a una placa interna en la plataforma. La altura de la placa se puede variar usando un accionador interno, variando por tanto la altura de los vástagos. De forma alternativa, la posición de los vástagos 70A-D y 71A-D en relación con el sustrato 2 se puede cambiar dando instrucciones al accionador para que mueva la plataforma 60A y/o 60B, o el bloque 80A y/o 80B, cambiando de este modo la distancia de separación durante la fase de agitación. El sistema de control 5 puede ajustar la frecuencia de los ciclos de líquidos, y los parámetros y la frecuencia del caudal, la altura de los vástagos, la distancia de separación y la agitación para procesar muestras más eficazmente, usando significativamente menos volúmenes de líquido durante el procedimiento de preparación de muestras en comparación con las técnicas convencionales de tinción y preparación.
En algunos modos de realización, los brazos del sustrato pueden estar hechos de un material que se flexiona de modo que si un sustrato en la posición de procesamiento de muestras descansa solo contra dos vástagos que se extienden desde la plataforma, un accionador u otro elemento de fuerza motriz puede girar el portaobjetos más hacia la superficie de la plataforma hasta que el portaobjetos descanse contra los cuatro vástagos. Variar la posición del sustrato entre estas dos posiciones puede lograr una agitación suficiente durante el procesamiento de muestras. Los brazos del sustrato pueden incluir extensómetros para supervisar la tensión en el brazo del sustrato, y se pueden usar para informar al sistema de control 5 de la posición del sustrato en relación con los vástagos de la plataforma. Además, el sistema de control puede incluir información correspondiente a las imperfecciones del espesor del sustrato, que los sistemas de control pueden tener en cuenta cuando colocan el sustrato en la posición de procesamiento de muestras o durante las fases de agitación.
En determinados modos de realización, algunas o todas las etapas de agitación divulgadas en el presente documento se pueden realizar sin mover el sustrato 2 en relación con la plataforma 60A/60B y/o los vástagos 70A-D/71A-D. Es decir, el líquido que se ha introducido entre la muestra en el sustrato 2 y la plataforma se puede agitar o refrescar sin mover el sustrato ni la plataforma, por ejemplo, cuando la plataforma y el sustrato se mantienen paralelos, o aproximadamente paralelos entre sí. En algunos modos de realización, para garantizar que el líquido nuevo entre en contacto con el mayor número posible de células de muestra en el sustrato, el líquido se puede agitar o refrescar usando las bombas divulgadas en el presente documento (por ejemplo, las bombas 200A/B y/o 201A/B y/o 202A/B y/o 203A/B) para introducir líquido en el hueco entre el sustrato 2 y la plataforma 60A/60B en la posición cerrada, y a continuación una vez que se ha llenado el hueco, para introducir un pequeño volumen adicional de líquido, por ejemplo, el mismo volumen o uno menor que el volumen introducido originalmente, en el hueco desde uno o más puertos de entrada o de suministro de líquidos en un extremo de la plataforma 60A/B, de modo que una parte o todo el líquido original se expulse del hueco y nuevo líquido tome su lugar en el hueco. Este procedimiento se puede repetir múltiples veces (por ejemplo, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o más de 5 veces).
En determinados modos de realización, las muestras se pueden preparar con un flujo continuo o pulsátil de líquido a lo largo de la muestra (por ejemplo, en el sustrato 2) y la plataforma, y/o con ciclos de flujo repetidos de líquido que se mueven a lo largo de la muestra y la plataforma, en lugar de agitar el líquido que ya se ha dosificado en el hueco o separación entre el sustrato y la plataforma. Por ejemplo, se puede dosificar líquido en el hueco o separación a través de uno o más puertos de entrada o de suministro de líquidos localizados en un extremo de la plataforma. Simultáneamente o poco después de esto, se puede aplicar vacío a uno o más puertos de vacío (por ejemplo, los puertos 220 y/o 221) o a una tolva de vacío localizada en el extremo opuesto (en comparación con el/los puerto(s) de entrada) y/o en los lados de la plataforma 60A/B). La acción de dosificación y aspiración simultánea crea un flujo de líquido continuo o pulsátil (rítmico o no rítmico) a lo largo del área de muestra del sustrato y la plataforma. Con un equilibrio apropiado de un caudal de dosificación de líquido y una tasa de extracción de líquido desde una fuente de vacío, el flujo de líquido se puede controlar o variar para lograr una fijación, tinción y/o enjuague deseados de la muestra.
Los caudales de dosificación para las diversas implementaciones pueden variar de aproximadamente 20 a aproximadamente 250 microlitros por segundo, y el vacío puede variar de una presión negativa de aproximadamente 68,9 mbar (una psi) a aproximadamente 689 mbar (diez psi). Las etapas de dosificación de líquido y extracción de líquido se pueden intercalar para crear ciclos de flujo sucesivos (por ejemplo, 2 ciclos, 3 ciclos, 4 ciclos, 5 ciclos o más de 5 ciclos), comprendiendo cada uno una etapa de dosificación y extracción de líquido, para fijar, teñir o enjuagar la muestra. En cualquiera de los modos de realización divulgados en el presente documento, incluyendo las implementaciones anteriores, la plataforma 60A/B puede tener una ligera pendiente
descendente desde el extremo de entrada de dosificación de líquidos hasta el/los puerto(s) de vacío localizado(s) en el extremo opuesto de la plataforma de modo que la fuerza gravitatoria ayude al flujo de líquido a lo largo de la plataforma. La pendiente puede ser un ángulo que varía de aproximadamente 2, 3, 4 o 5 grados o más a aproximadamente 45 grados o más, por ejemplo, aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o 45 grados.
Fases de secado
En determinados modos de realización, el sistema de control 5 puede secar la muestra usando un secador 4 sujeto a la máquina 1. La FIG. 14 incluye un diagrama de flujo 1300 que cuenta con una serie de etapas para secar una muestra. Después de la etapa inicial 1302 en la que se verifica que se ha completado la tinción y otras fases (por ejemplo, una o más fases de enjuague), en la etapa 1304 el secador 4 dirige un flujo de aire a través de la muestra. El procedimiento de secado continúa en la etapa 1306, hasta que se recibe una señal desde la unidad de control para detener el secado. Cuando se recibe la señal, el secador detiene el flujo de aire a través de la muestra y la fase de secado termina en la etapa 1308.
En general, la máquina 1 se puede controlar para variar la temperatura del aire, el caudal, la duración del flujo de aire aplicado y la(s) fase(s) durante el procesamiento de muestras para secar la muestra 3. Por ejemplo, después de completar una fase de tinción, el secador 4 puede dirigir un flujo de aire a aproximadamente 48,9 °C (120 °F) a un caudal de 10 litros por minuto durante un período de 7 segundos a lo largo de la muestra. También se pueden usar otras temperaturas del aire (por ejemplo, una temperatura ambiente de hasta 148,9 °C [300 °F]), caudales de aire (por ejemplo, de un litro por minuto a 100 litros por minuto) y períodos de flujo de aire (por ejemplo, de unos pocos segundos a varios minutos).
Sistemas de examen de muestras
Las máquinas y aparatos automatizados de preparación de muestras divulgados en el presente documento, incluyendo la máquina 1, en general se pueden usar con y/o incorporar a sistemas de examen de muestras más grandes, tales como los descritos en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2009/0269799. Por ejemplo, la FIG. 15 muestra un diagrama esquemático que ilustra un posible modo de realización de un sistema de examen de muestras 2000. El sistema 2000 incluye una plataforma 2100, un dispositivo receptor de luz 2200, un ordenador 2300, un aplicador 2400, un dispositivo de circulación de gas 2500, una fuente de luz 2600, un dosificador 2800, un dispositivo de descarga 2900, una etiquetadora de portaobjetos 3000 y un lector de etiquetas de portaobjetos 3100. Se puede configurar un impulsor 2110 para recibir uno o más portaobjetos u otros sustratos 2700. El impulsor 2110 se puede sujetar a una superficie, tal como la superficie superior 2101, de la plataforma. El impulsor 2110 puede adoptar la forma de una cinta, y el sistema puede usar un brazo mecánico, gravedad, magnetismo, sistemas hidráulicos, engranajes u otras técnicas de locomoción para mover muestras montadas en un sustrato a lo largo de la superficie 2101 de la plataforma.
La plataforma 2100 también puede incluir un alimentador 2102 y un recolector 2106 para alimentar y recoger respectivamente sustratos 2700 (por ejemplo, portaobjetos) desde o hacia una pila o estante. El alimentador 2102 puede estar equipado con un mecanismo de propulsión de alimentador 2103 (tal como ruedas de goma) para empujar las muestras sobre el impulsor 2110. De forma alternativa, se podría usar un brazo mecánico para agarrar los sustratos 2700 y colocar los sustratos directamente en el impulsor. Se pueden usar mecanismos alternativos para propulsar los sustratos por el alimentador 2102, tales como imanes o sistemas hidráulicos. El alimentador puede incluir un sensor para determinar cuántos portaobjetos están presentes. El sensor podría medir el peso de los sustratos 2700, por ejemplo, para determinar cuántos sustratos están presentes. El recolector 2106 también puede incluir un sensor para determinar cuántos sustratos están presentes. El sensor se puede configurar para informar al ordenador 2300 de cuándo se ha analizado un número preestablecido de muestras, y/o puede informar permanentemente al ordenador de la recepción de una muestra montada en un sustrato.
El dispositivo receptor de luz 2200 puede ser un microscopio (tal como un microscopio de campo claro), una cámara de vídeo, una cámara fotográfica u otro dispositivo óptico que recibe luz. Los modos de realización que incluyen un microscopio de campo claro estándar también pueden incluir una platina automatizada (por ejemplo, un transportador del sustrato 2201) y un enfoque automatizado. En algunos modos de realización, un microscopio puede estar sujeto a una platina motorizada y a un accesorio de motor de enfoque. El microscopio puede tener una portaobjetivos motorizado para permitir la selección de objetivos con diferentes aumentos bajo el control del ordenador 2300. Se puede usar una rueda de filtros para posibilitar que el ordenador 2300 seleccione automáticamente filtros de color de banda estrecha en la trayectoria de la luz. Los filtros se pueden sustituir por iluminación LED, y el uso de LED puede reducir el tiempo de adquisición de imágenes en comparación con el tiempo necesario para la rotación de la rueda de filtros.
Por ejemplo, se puede usar una cámara FireWire® (IEEE1394 bus serie de alto rendimiento) de 1600 x 1200 píxeles para adquirir las imágenes de banda estrecha.
En algunos modos de realización, el dispositivo receptor de luz 2200 recibe luz reflejada desde el sustrato 2700 y almacena una o más imágenes formadas por la luz reflejada. De forma alternativa, o además, en algunos modos
de realización, la emisión fluorescente de la muestra en el sustrato se puede detectar por el dispositivo receptor de luz 2200.
En determinados modos de realización, el dispositivo receptor de luz 2200 está configurado para obtener imágenes de transmisión de muestras en sustratos. Por ejemplo, la fuente de emisión de luz 2600 se puede situar debajo de la plataforma y puede dirigir la luz de modo que pase a través de la plataforma 2100 y el sustrato 2700 al dispositivo receptor de luz 2200.
El dispositivo receptor de luz 2200 y cualquiera de los demás componentes mostrados en la FIG. 15 se pueden interconectar al ordenador 2300 a través de enlaces (2011-2014), que pueden proporcionar energía al componente, proporcionar instrucciones desde el ordenador 2300 al componente y/o permitir que el componente envíe información al ordenador 2300. Los enlaces 2011-2014 pueden ser enlaces cableados o enlaces inalámbricos.
El dispositivo receptor de luz 2200 puede tener capacidad de movimiento axial X, Y y Z (en otros modos de realización, una platina motorizada o un transportador del sustrato 2201 pueden proporcionar movimiento X, Y y Z). El dispositivo receptor de luz 2200 puede incluir accionadores de giro, inclinación y/o locomoción para posibilitar que el ordenador 2300 sitúe el dispositivo receptor de luz 2200 en una posición apropiada. El dispositivo receptor de luz 2200 puede incluir un objetivo 2210 que enfoca la luz incidente.
El dispositivo receptor de luz 2200 se puede seleccionar para captar imágenes en blanco y negro y/o en color. En algunos modos de realización, se pueden usar dos o más dispositivos receptores de luz para dividir el tiempo de procesamiento asociado con la captación de las imágenes. Por ejemplo, una estación de formación de imágenes de bajo aumento puede ir seguida de una estación de formación de imágenes de alto aumento. De forma similar, en algunos modos de realización, el sistema 2000, la plataforma 2100, el ordenador 2300 y/o el dispositivo receptor de luz 2200 pueden ordenar al transportador del sustrato 2201 que mueva el sustrato 2700 para garantizar la captación y almacenamiento de una o más imágenes de todas, o de la mayoría de, las células en el sustrato o en una parte específica del sustrato.
El ordenador 2300 puede ser un ordenador portátil, un servidor, una estación de trabajo o cualquier otro tipo de dispositivo informático. El ordenador puede incluir un procesador, una pantalla 2320, una interfaz 2310 y una memoria interna y/o una unidad de disco. El ordenador 2300 también puede incluir un programa informático almacenado en la memoria o en medios tangibles legibles por ordenador, tales como una unidad óptica. El programa informático puede incluir instrucciones para provocar que el ordenador haga funcionar el dispositivo receptor de luz 2200, el aplicador 2400, el dispositivo de circulación de gas 2500, la plataforma 2100, el impulsor 2110, la fuente de luz 2600, los dosificadores 2450 y/o 2800, la máquina de preparación de muestras 1 o cualquier componente dentro de, o conectado a, uno de estos componentes. De forma similar, el ordenador está dispuesto para recibir información de cualquiera de estos componentes.
Por ejemplo, el programa informático puede controlar la tasa de dispersión de sustratos desde el alimentador 2102, y el alimentador 2102 puede informar al ordenador sobre el número de sustratos presentes. Además, el ordenador 2300 también puede ser responsable de realizar el análisis de las imágenes captadas por el dispositivo receptor de luz 2200. A través del procedimiento de análisis se puede disponer y controlar el ordenador para calcular el número de un tipo específico de células en un volumen particular de sangre, por ejemplo, para hemogramas, cifras de glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas, y se podrían calcular otros componentes medidos y derivados del hemograma completo tales como: contenido de hemoglobina, morfología de los glóbulos rojos o fórmula leucocitaria. El programa informático de análisis de imágenes puede analizar cada campo individual y sumar las cifras totales de glóbulos rojos y blancos. Para calcular las cifras totales por microlitro en una muestra de sangre de un paciente, el número contado en el portaobjetos se puede multiplicar por la proporción de dilución y el volumen de la submuestra. Los resultados de las cifras, las mediciones morfológicas y las imágenes de glóbulos rojos y glóbulos blancos del portaobjetos se pueden mostrar en la pantalla 2320.
En algunos modos de realización, el ordenador 2300 está configurado para presentar datos numéricos, histogramas de poblaciones celulares, diagramas de dispersión y evaluaciones directas de la morfología celular usando imágenes de los glóbulos sanguíneos presentadas en la pantalla. La capacidad de presentar la morfología celular proporciona a los usuarios del sistema 2000 la capacidad de establecer rápidamente la presencia o ausencia de anomalías en la morfología celular que pueden justificar la preparación de un portaobjetos adicional para su revisión manual por un técnico experimentado u otro profesional. El programa informático también puede proporcionar al ordenador instrucciones para presentar imágenes 2331 recibidas desde el dispositivo receptor de luz o puede provocar que la pantalla 2330 muestre los resultados 2332 (quizá en una tabla o gráfico, por ejemplo) de un análisis de las imágenes. De forma similar, el ordenador 2300 se puede controlar para enumerar el número de células de un tipo específico en un volumen de sangre particular o enumerar el número de células dañadas, células cancerosas o células lisadas en un volumen de sangre particular. El programa informático posibilita que el ordenador realice el procedimiento de análisis. El ordenador puede usar uno o más aumentos durante el análisis.
Aunque se muestra como un componente, el ordenador 2300 puede incluir múltiples ordenadores; se puede usar un primer ordenador para controlar los componentes del sistema 2000, y se puede usar un segundo ordenador
para procesar las imágenes del dispositivo receptor de luz 2200. Los diversos ordenadores se pueden vincular entre sí para permitir que los ordenadores compartan información. El ordenador 2300 también se puede conectar a una red o sistema de información del laboratorio para permitir que el ordenador envíe y reciba información de otros ordenadores.
En determinados modos de realización, el aplicador 2400 puede incluir una jeringa, una pipeta manual o accionada por motor, o una bomba controlada por motor sujeta a través de un tubo a una punta de pipeta. El aplicador 2400 aplica una muestra al sustrato 2700 de manera controlada. Se divulgan rasgos característicos, atributos y procedimientos ejemplares de uso del aplicador 2400, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2009/0269799. La muestra puede incluir uno o más componentes sanguíneos, células, tejidos u otros componentes biológicos.
Una vez que se ha aplicado la muestra al sustrato 2700, se procesa la muestra aplicada usando la máquina 1. La máquina 1 funciona como se describe en el presente documento para aplicar uno o más colorantes, fijadores y/u otras soluciones a la muestra en el sustrato.
En algunos modos de realización, el sistema 2000 se puede configurar para lograr una superposición mínima entre las células depositadas en el sustrato 2700 ubicando filas de células que no se tocan desde la punta del aplicador 2400. El incremento de la viscosidad del líquido diluido o el tipo o la cantidad de diluyente pueden afectar a la anchura de las posiciones de asentamiento final de los flujos de muestras desde el aplicador. Seleccionando una distancia entre filas para permitir la variación típica en las muestras de sangre, se pueden contar todas las células en todas las muestras.
El dispositivo de movimiento de gas 2500, que puede ser un dispositivo separado como se muestra en la FIG. 15, o puede estar incorporado a la máquina 1 como se analiza previamente, puede incluir un ventilador y/o puede incluir otros dispositivos de movimiento de gas tales como un compresor o un fuelle, por ejemplo. El dispositivo de movimiento de gas 2500 puede estar conectado directamente al ordenador 2300 o puede estar conectado a través de otro componente tal como la plataforma 2100 o el aplicador 2400. El dispositivo de movimiento de gas empuja el gas (en algunos casos, aire atmosférico) a través del sustrato para controlar la tasa a la que se secan las sustancias en el sustrato. Mover demasiado aire demasiado rápido (es decir, una velocidad del ventilador demasiado alta) a través del sustrato puede provocar que las células de la muestra estallen debido al secado rápido, y escaso aire demasiado lento (es decir, una velocidad del ventilador demasiado baja) a través del sustrato puede provocar que las células se sequen demasiado lentamente y parezcan encoger.
El ordenador 2300 puede seleccionar y controlar la cantidad de aire que se mueve a través del sustrato en un período de tiempo (es decir, los pies cúbicos o centímetros cúbicos de aire por segundo) basándose en la distancia del dispositivo de movimiento de gas con respecto al sustrato, el tipo de líquido que se analiza, la anchura de los flujos, la temperatura del gas (por ejemplo, aire) y el espesor promedio de los flujos. El dispositivo de movimiento de gas 2500 se puede situar de modo que el dispositivo dirija el gas de modo que el gas alcance el sustrato en un ángulo de 30°-60° (por ejemplo, 45°) durante un período de aproximadamente 15 a 20 segundos. En algunos modos de realización, el ordenador 2300 puede controlar la configuración de humedad y temperatura en las proximidades del sistema para permitir que el proceso de secado se produzca sin el uso de un dispositivo de movimiento de gas 2500.
El dispositivo de emisión de luz 2600, y los diversos componentes del mismo, se describen a modo de ejemplo en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2009/0269799. Se pueden generar diversas longitudes de onda de luz por el dispositivo de emisión de luz 2600 y detectarse por el dispositivo receptor de luz 2200. Por ejemplo, longitudes de onda tales como 415 nm son útiles para obtener una imagen solo de la hemoglobina para evaluar la morfología y el contenido de hemoglobina de los glóbulos rojos. La luz emitida a 600 nm puede ser útil para proporcionar imágenes de alto contraste de las plaquetas y los núcleos. Se pueden elegir otras longitudes de onda para distinguir mejor los colores de basófilos, monocitos, linfocitos (todos con tonos de azul), eosinófilos (rojo) y neutrófilos (color neutro).
Ejemplos
La divulgación se describe además por los siguientes ejemplos, que no están destinados a limitar el alcance de la invención enumerada en las reivindicaciones.
Ejemplo 1
La FIG. 16 es un diagrama de flujo 1400 que muestra una serie de etapas ejemplares para procesar una muestra montada en un sustrato. Las etapas del diagrama de flujo 1400 se pueden usar para preparar una muestra biológica para su examen. Aunque la descripción de este procedimiento se refiere a veces a etapas específicas que tienen intervalos específicos, y/o divulga etapas que se producen en una secuencia específica, esta descripción está prevista únicamente como un ejemplo no limitante. Con referencia a la FIG. 16, la máquina 1 está conectada a un sistema de control 5 para ordenar el funcionamiento de diversos componentes de la máquina durante las etapas
de procesamiento. En una etapa de iniciación de la muestra, una muestra biológica 3 que incluye glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas de una alícuota de sangre se aplica a un sustrato 2 que consiste en un portaobjetos de microscopio de vidrio. Esto se puede realizar usando una estación diferente, tal como una o más de las estaciones descritas en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2008/0102006 en tramitación conjunta. En una etapa de posicionamiento 1402, el sustrato 2 que contiene la muestra 3 se carga sobre el portador del sustrato 20A del brazo del sustrato 10A como se muestra en la FIG. 1. El sistema de control 5 da instrucciones a la fuente de succión 222 (etapa 1404) para vaciar el aire del portador del sustrato 20A. La succión aplicada a través de los puertos de succión 21 y 22 (etapa 1406) adhiere el sustrato 2 al portador del sustrato 20A durante el procesamiento de muestras. El sistema de control 5 da instrucciones (etapa 1408) al accionador 30A para que gire el sustrato 3 desde una posición abierta mostrada en la FIG. 1 hasta una posición de procesamiento de muestras mostrada en la FIG. 3A. En la posición de procesamiento de muestras, la muestra 3 está orientada hacia la superficie de la plataforma 60A mientras el sustrato 2 descansa contra los vástagos 70A-D mostrados en la FIG.
2. Los vástagos evitan que el sustrato 2 entre en contacto con la superficie de la plataforma 60A. En este procedimiento de ejemplo, la separación 92 entre la superficie del sustrato 2 que contiene la muestra y la superficie de la plataforma 60A es de aproximadamente 100 micrómetros.
Durante la fase de fijación (etapa 1412, véase también la FIG. 10), una bomba aplica fijador a la muestra 3 en la etapa 1414. La bomba 200A conectada al tubo de líquido 54A mostrada en la FIG. 2 propulsa el fijador que comprende metanol desde un depósito de fijador 210 a través del tubo 54A, por el puerto 44A, sobre la plataforma 60A, sobre el sustrato 2 que contiene la muestra 3 y hacia la separación 92 entre la plataforma 60A y el sustrato 2. La bomba 200A propulsa metanol desde el puerto 44A a un caudal de 70 microlitros por segundo durante un período T1 de dos segundos, dirigiendo de este modo un total de 140 microlitros de metanol, V1, sobre el sustrato 2 que contiene la muestra 3.
A continuación, en una primera etapa de agitación 1416, el sistema de control 5 agita el sustrato ordenando al accionador 30A (etapa 1418) que eleve verticalmente el borde próximo del sustrato 2 a una distancia de 35 micrómetros desde la posición de procesamiento de muestras y devuelva el sustrato a su posición de procesamiento de muestras. La máquina 1 repite esta etapa de agitación cuatro veces más. La máquina 1 completa los cinco movimientos de agitación en aproximadamente diez segundos, T2, como se muestra en la FIG. 17. Después de la agitación, el sistema de control inicia una etapa de vacío o vaciamiento 1420. Se aplica una fuerza de vacío de 344 mbar (cinco psi) negativos durante un segundo y medio, T3, vaciando cualquier metanol residual (etapa 1422) presente en la separación, en la plataforma o en el sustrato por medio de los puertos 40A y 41 A y los tubos de residuos 50A y 51A. El metanol vaciado se recoge en un recipiente de residuos 230 y/o 231.
Después de la fase de fijación, el sistema de control 5 inicia (etapa 1424) una primera fase de tinción. Al hacerlo, el sistema de control 5 ordena a la máquina 1 que tiña la muestra (etapa 1426). En referencia a la FIG. 2 y al diagrama de flujo de la FIG. 11, la bomba 201 conectada al tubo de líquido 52A propulsa tinte de fluoresceína desde un depósito de colorante 211A por el puerto 42A, sobre la plataforma 60A, sobre el sustrato 2 que contiene la muestra 3, y hacia la separación 92 entre la plataforma 60A y el sustrato 2. La bomba 201 dosifica tinte de fluoresceína a través del puerto 42A a un caudal de 70 microlitros por segundo durante un período de dos segundos, T4, dirigiendo de este modo 140 microlitros de tinte, V2, sobre el sustrato.
Después de aplicar tinte de fluoresceína a la muestra 3, la máquina 1 realiza una segunda etapa de agitación 1428 ordenando al accionador 30A que eleve verticalmente, en la etapa 1430, el borde próximo del sustrato 2 a una distancia de 35 micrómetros desde la posición de procesamiento de muestras y a continuación devuelva el sustrato a su posición de procesamiento de muestras. El sistema de control 5 provoca que la máquina 1 repita esta etapa de agitación dos veces más y complete las tres agitaciones durante un período de aproximadamente seis segundos, T5, como se muestra en la FIG. 17.
A continuación, se inicia una segunda fase de vacío o vaciamiento en la etapa 1432. Se aplica un vacío de 344 mbar (cinco psi) negativos durante tres segundos, T6, en la etapa 1434 para vaciar cualquier tinte de fluoresceína residual presente en la separación 92 o en la plataforma y el sustrato por medio de los puertos 40A y/o 41A y los tubos de residuos 50A y 51A. El tinte de fluoresceína vaciado se recoge en un recipiente de residuos 230A y/o 231A.
Después de teñir la muestra con tinte de fluoresceína, la máquina 1 inicia una segunda fase de tinción en la etapa 1436 usando tinte de tiacina. La bomba 202 conectada al tubo de líquido 53A propulsa el tinte de tiacina desde un depósito de colorante a través del puerto 43A, sobre la plataforma 60A, sobre el sustrato 2 y hacia la separación 92 entre la plataforma 60A y el sustrato 2 (etapa 1438). La máquina 1 dosifica tinte de tiacina a través del puerto 43 A a un caudal de 70 microlitros por segundo durante un período de dos segundos, T7, dirigiendo de este modo un total de 140 microlitros de tiacina, V3, sobre el sustrato.
Después de aplicar colorante a la muestra 3, la máquina 1 inicia una tercera fase de agitación en la etapa 1440 ordenando al accionador 30A que eleve el borde próximo del sustrato 2 (etapa 1442) a una distancia de 35 micrómetros desde la posición de procesamiento de muestras y a continuación devuelva el sustrato que contiene la muestra 3 a su posición de procesamiento de muestras. La máquina 1 repite esta etapa de agitación tres veces
más. La máquina completa los cuatro movimientos de agitación durante un período de aproximadamente ocho segundos, T8.
Se inicia a continuación una tercera etapa de vacío o vaciamiento 1444. Se aplica un vacío de 344 mbar (cinco psi) negativos durante dos segundos, T9, para vaciar el tinte de tiacina residual en la etapa 1446 presente en la separación o en la plataforma 60A y en el sustrato 2 por medio de los puertos 40A y/o 41A y los tubos de residuos 50A y/o 51A, después de la agitación. El tinte de tiacina vaciado se recoge en un recipiente de residuos 230A y/o 231A.
La máquina 1 realiza a continuación dos secuencias de las fases de enjuague-agitación-vacío. La primera secuencia de fases se inicia en la etapa 1448 cuando el sistema de control 5 da instrucciones a la máquina 1 para que inicie una primera fase de enjuague. Un depósito 213A que contiene solución de enjuague de agua destilada está conectado a una bomba 203 y al tubo de líquido 55A. La bomba 203 dirige agua destilada a través del tubo de lavado 55A que alimenta al puerto 45A, hacia la separación 92 y sobre la plataforma 60A y el sustrato 2 para enjuagar la muestra 3 en la etapa 1450. De forma alternativa, en algunos modos de realización, el líquido de lavado se dirige a través de dos o más de los puertos de líquido 42A a 45A. La bomba 203 dirige agua destilada por los puertos 45A a un caudal de 70 microlitros por segundo durante dos segundos, T10, dirigiendo de este modo un total de 140 microlitros, V4, de agua sobre el sustrato que contiene la muestra.
A continuación, el sistema de control 5 inicia una cuarta fase de agitación en la etapa 1452, ordenando al accionador 30A (etapa 1454) que eleve verticalmente el borde próximo del sustrato 2 a una distancia de 35 micrómetros desde la posición de procesamiento de muestras y devuelva el sustrato a su posición de procesamiento de muestras. El sistema de control 5 puede ordenar a la máquina 1 que repita esta fase de agitación, y completar las dos agitaciones en aproximadamente cuatro segundos, T11.
A continuación, se inicia una fase de vacío o vaciamiento en la etapa 1456. Un vacío de 344 mbar (cinco psi) aplicado durante cinco segundos y medio, T12, en la etapa 1458, vacía el agua destilada residual presente en la separación 92 o en la plataforma 60A y el sustrato 2 por medio de los puertos 40A y/o 41A y los tubos de residuos 50A y/o 51A después de la agitación.
Después de esto, en la etapa 1460, el sistema de control 5 ordena a la máquina 1 que comience la segunda secuencia de fases de enjuague-agitación-vacío iniciando una segunda fase de enjuague. Una segunda fase de enjuague (etapas 1460, 1462), una quinta fase de agitación (etapas 1464, 1466) y una quinta fase de vacío (etapas 1468, 1470) se realizan de la misma manera que se divulga anteriormente para la primera fase de enjuagueagitación-vacío. Durante la segunda fase de enjuague-agitación-vacío, la cantidad de líquido de lavado, V5, y los tiempos de procesamiento T13, T14 y T15 son en general los mismos que en la primera secuencia de fases de enjuague-agitación-vacío.
Después de que la muestra se ha fijado, teñido con colorantes de fluoresceína y tiacina, y enjuagado, la máquina 1 inicia una fase de secado en la etapa 1472. El secador 4 dirige un flujo de aire de aproximadamente 120° a un caudal de 10 litros por minuto (etapa 1474) durante un período de ocho segundos, T16, a lo largo de la muestra.
Después de completar estas etapas, el sustrato 2 se devuelve a su posición original en la etapa 1476. En esta etapa, el accionador 30A gira el sustrato 2 desde la posición de procesamiento de muestras hasta la posición abierta como se representa en la FIG. 1. A continuación se puede retirar el sustrato 2 por un transportador del sustrato, y se puede cargar un nuevo sustrato para procesar una nueva muestra.
Ejemplo 2
Las etapas de procesamiento descritas anteriormente para el ejemplo 1 se pueden ajustar en otros modos de realización de la invención como sigue. Además, las formulaciones de solución de fijador, colorantes y enjuague divulgadas en la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/505.011 se pueden usar en las siguientes etapas de procesamiento de ejemplo.
Durante una primera fase de fijación (etapa 1412, véase también la FIG. 10), una bomba aplica una solución fijadora a la muestra 3 en la etapa 1414. La bomba 200A conectada al tubo de líquido 54A mostrada en la FIG. 2 propulsa una solución fijadora que comprende metanol desde un depósito de fijador 210 a través del tubo 54A, por el puerto 44A, sobre la plataforma 60A, sobre el sustrato 2 y hacia la separación 92 entre la plataforma 60A y el sustrato 2. La bomba 200A propulsa la solución fijadora desde el puerto 44A a un caudal de 115 microlitros por segundo durante un período T1 de dos segundos, dirigiendo de este modo un total de 230 microlitros de la solución fijadora, V1, sobre el sustrato 2.
A continuación, en una primera etapa de agitación 1416, el sistema de control 5 agita el sustrato ordenando al accionador 30A (etapa 1418) que eleve verticalmente el borde próximo del sustrato 2 a una distancia de 35 micrómetros desde la posición de procesamiento de muestras y devuelva la muestra a su posición de procesamiento de muestras. La máquina 1 repite esta etapa de agitación cinco veces más. La máquina 1 completa
los seis movimientos de agitación en aproximadamente 12 segundos. Después de la agitación, el sistema de control inicia una etapa de vacío 1420. Se aplica una fuerza de vacío de 413 mbar (seis psi) negativos durante un segundo y medio, T3, vaciando cualquier solución fijadora residual (etapa 1422) presente en la separación, en la plataforma o en el sustrato por medio de los puertos 40A y 41A y los tubos de residuos 50A y 51A. La solución fijadora vaciada se recoge en un recipiente de residuos 230 y/o 231.
Después de esto, en una segunda fase de fijación que incluye una segunda etapa de agitación, se repiten las etapas anteriores de la primera fase de fijación y la primera etapa de agitación.
Después de las fases de fijación, el sistema de control 5 inicia (etapa 1424) una primera fase de tinción. Al hacerlo, el sistema de control 5 ordena a la máquina 1 que tiña la muestra (etapa 1426). En referencia a la FIG. 2 y al diagrama de flujo de la FIG. 11, la bomba 201 conectada al tubo de líquido 52A propulsa una primera solución de colorante que comprende eosina Y desde un depósito de colorante 211A por el puerto 42A, sobre la plataforma 60A, sobre el sustrato 2 que incluye la muestra 3, y hacia la separación 92 entre la plataforma 60A y el sustrato 2. La bomba 201 dosifica la primera solución de colorante a través del puerto 42A a un caudal de 115 microlitros por segundo durante un período de dos segundos, T4, dirigiendo de este modo 230 microlitros de la primera solución de colorante, V2, sobre el sustrato.
Después de aplicar una primera solución de colorante a la muestra 3, la máquina 1 realiza una segunda etapa de agitación 1428 ordenando al accionador 30A que eleve verticalmente, en la etapa 1430, el borde próximo del sustrato 2 a una distancia de 35 micrómetros desde la posición de procesamiento de muestras y a continuación devuelva la muestra a su posición de procesamiento de muestras. El sistema de control 5 provoca que la máquina 1 repita esta etapa de agitación dos veces más y complete las tres agitaciones durante un período de aproximadamente seis segundos, T5, como se muestra en la FIG. 17.
Seguidamente, se inicia una segunda fase de vacío en la etapa 1432. Se aplica un vacío de 344 mbar (cinco psi) negativos durante tres segundos, T6, en la etapa 1434 para vaciar cualquier primera solución de colorante residual presente en la separación 92 o en la plataforma y el sustrato por medio de los puertos 40A y/o 41A y los tubos de residuos 50A y 51A. La primera solución de colorante vaciada se recoge en un recipiente de residuos 230A y/o 231A.
Después de teñir la muestra con la primera solución de colorante que incluye eosina Y, la máquina 1 inicia una segunda fase de tinción en la etapa 1436 usando una segunda solución de colorante que incluye azur B y azul de metileno. La bomba 202 conectada al tubo de líquido 53A propulsa la segunda solución de colorante desde un depósito de colorante a través del puerto 43A, sobre la plataforma 60A, sobre el sustrato 2, y hacia la separación 92 entre la plataforma 60A y el sustrato 2 (etapa 1438). La máquina 1 dosifica la segunda solución de colorante a través del puerto 43A a un caudal de 115 microlitros por segundo durante un período de dos segundos, T7, dirigiendo de este modo un total de 230 microlitros de la segunda solución de colorante, V3, sobre el sustrato.
Después de aplicar el colorante a la muestra 3, la máquina 1 inicia una tercera fase de agitación en la etapa 1440 ordenando al accionador 30A que eleve el borde próximo del sustrato 2 (etapa 1442) a una distancia de 35 micrómetros desde la posición de procesamiento de muestras y a continuación devuelva la muestra 3 a su posición de procesamiento de muestras. La máquina 1 repite esta etapa de agitación dos veces más. La máquina completa los tres movimientos de agitación durante un período de aproximadamente seis segundos, T8.
A continuación se inicia una tercera etapa de vacío 1444. Se aplica un vacío de 413 mbar (seis psi) negativos durante dos segundos, T9, para vaciar la segunda solución de colorante residual en la etapa 1446 presente en la separación o en la plataforma 60A y el sustrato 2 por medio de los puertos 40A y/o 41A y los tubos de residuos 50A y/o 51A, después de la agitación. La segunda solución de colorante vaciada se recoge en un recipiente de residuos 230A y/o 231 A.
La máquina 1 realiza a continuación dos secuencias de las fases de enjuague-agitación-vacío. La primera secuencia de fases se inicia en la etapa 1448 cuando el sistema de control 5 da instrucciones a la máquina 1 para que inicie una primera fase de enjuague. Un depósito 213A que contiene una solución de enjuague está conectado a una bomba 203 y al tubo de líquido 55A. La bomba 203 dirige la solución de enjuague a través del tubo de lavado 55A que alimenta al puerto 45A, hacia la separación 92 y sobre la plataforma 60a y el sustrato 2 para enjuagar la muestra 3 en la etapa 1450. De forma alternativa, en algunos modos de realización, la solución de enjuague se dirige a través de dos o más de los puertos de líquido 42A a 45A. La bomba 203 dirige la solución de enjuague por los puertos 45A a un caudal de 115 microlitros por segundo durante dos segundos, T10, dirigiendo de este modo un total de 230 microlitros, V4, de agua sobre el sustrato.
Seguidamente, el sistema de control 5 inicia una cuarta fase de agitación en la etapa 1452, ordenando al accionador 30A (etapa 1454) que eleve verticalmente el borde próximo del sustrato 2 a una distancia de 35 micrómetros desde la posición de procesamiento de muestras y devuelva la muestra a su posición de procesamiento de muestras. El sistema de control 5 a continuación ordena a la máquina 1 que repita esta fase de agitación tres veces más y complete las cuatro agitaciones en aproximadamente ocho segundos, T11.
A continuación, se inicia una fase de vacío en la etapa 1456. Un vacío de 344 mbar (cinco psi) aplicado durante cinco segundos y medio, T12, en la etapa 1458, vacía la solución de enjuague residual presente en la separación 92 o en la plataforma 60A y el sustrato 2 por medio de los puertos 40A y/o 41A y los tubos de residuos 50A y/o 51A después de la agitación.
Después de esto, en la etapa 1460, el sistema de control 5 ordena a la máquina 1 que comience la segunda secuencia de fases de enjuague-agitación-vacío iniciando una segunda fase de enjuague. Una segunda fase de enjuague (etapas 1460, 1462), una quinta fase de agitación que comprende seis agitaciones completadas en aproximadamente 12 segundos y una quinta fase de vacío (etapas 1468, 1470) se realizan de la misma manera que se divulga anteriormente para la primera fase de enjuague-agitación-vacío. Durante la segunda fase de enjuague-agitación-vacío, la cantidad de solución de enjuague, V5, y los tiempos de procesamiento T13, T14 y T15 son en general los mismos que en la primera secuencia de fases de enjuague-agitación-vacío. Además, inmediatamente antes de la fase de vacío, el accionador 30A eleva el borde próximo del sustrato 2 a una distancia de 15-35 micrómetros desde la posición de procesamiento de muestras. Esta separación incrementada entre el sustrato 2 y la plataforma 60 mejora el vaciamiento de cualquier líquido residual en la separación 92 durante la fase final de vacío.
Después de que la muestra se ha fijado, teñido con una primera solución de colorante que contiene eosina Y y una segunda solución de tinción que contiene Azure B y azul de metileno, y se enjuaga, la máquina 1 inicia una fase de secado en la etapa 1472. El secador 4 dirige un flujo de aire de aproximadamente 120° a un caudal de 10 litros por minuto (etapa 1474) durante un período de ocho segundos, T16, a través de la muestra.
Después de completar estas etapas, el sustrato 2 se devuelve a su posición original en la etapa 1476. En esta etapa, el accionador 30A gira el sustrato 2 desde la posición de procesamiento de muestras hasta la posición abierta como se representa en la FIG. 7. A continuación se puede retirar el sustrato 2 por un transportador del sustrato, y se puede cargar un nuevo sustrato para procesar una nueva muestra.
Como se ilustra en las etapas de procesamiento de muestras de ejemplo descritas anteriormente, los sistemas y procedimientos divulgados en el presente documento proporcionan un procesamiento de muestras más eficaz consumiendo menos reactivos en comparación con los procedimientos convencionales de procesamiento de muestras incluyendo las técnicas automatizadas y manuales de preparación de muestras. En referencia al ejemplo 2, la máquina 1 consumió menos de un mililitro y medio de reactivos para fijar, teñir y enjuagar la muestra durante las etapas de procesamiento ejemplares (por ejemplo, 460 microlitros de solución fijadora 230 microlitros de primera solución de colorante 230 microlitros de segunda solución de colorante 460 microlitros de solución de enjuague = 1380 microlitros de reactivos). En algunos modos de realización se pueden usar más o menos de 1380 microlitros de líquidos durante el procesamiento de muestras. Por ejemplo, la cantidad de líquido usada en el procesamiento de una muestra puede ser de aproximadamente 1150 microlitros (por ejemplo, eliminando una de las fases de enjuague) o menos de 1000 microlitros (por ejemplo, eliminando además una de las fases de fijación).
Con respecto a la FIG. 17, para el ejemplo 1, la máquina 1 consumió menos de un mililitro de reactivos para fijar, teñir y enjuagar la muestra durante las etapas de procesamiento ejemplares (por ejemplo, 140 microlitros de fijador de metanol 140 microlitros de tinte de fluoresceína 140 microlitros de tinte de tiacina 280 microlitros de solución de enjuague = 700 microlitros de reactivos). En algunos modos de realización se puede usar más o menos de 700 microlitros de líquidos durante el procesamiento de muestras. Por ejemplo, la cantidad de líquido usada en el procesamiento de una muestra puede ser de aproximadamente 560 microlitros (por ejemplo, eliminando una de las fases de enjuague).
En general, el volumen total de líquidos consumido puede ser de 500 microlitros o más (por ejemplo, 520 microlitros o más, 540 microlitros o más, 560 microlitros o más, 580 microlitros o más, 600 microlitros o más, 650 microlitros o más, 700 microlitros o más, 750 microlitros o más) y/o 2 ml o menos (por ejemplo, 1,5 ml o menos, 1,4 ml o menos, 1,3 ml o menos, 1,2 ml o menos, 1,1 ml o menos, 1,0 ml o menos, 900 microlitros o menos).
En referencia a la FIG. 17 y el ejemplo 1, el procedimiento de preparación de la muestra se completa en algo más de un minuto (por ejemplo, 13,5 segundos transcurridos durante la fase de fijación 11 segundos transcurridos durante la fase de tinte de fluoresceína 12 segundos transcurridos durante la fase de tinte de tiacina 23 segundos transcurridos durante las fases de enjuague 8 segundos transcurridos durante la fase de secado = 67,5 segundos de tiempo total transcurrido). En determinados modos de realización, la preparación de muestras se puede completar en más, como en el ejemplo 2, o en menos de 67,5 segundos. Por ejemplo, el procesamiento de muestras se puede completar en 180 segundos o menos (por ejemplo, 150 segundos o menos, 120 segundos o menos, 90 segundos o menos, 80 segundos o menos, 70 segundos o menos, 60 segundos o menos, 50 segundos o menos, o 40 segundos o menos).
Además, mientras el procedimiento ejemplar anterior describe el tiempo de procesamiento para una sola muestra, los sistemas y procedimientos para procesar múltiples sustratos (por ejemplo, la máquina 1 de la FIG. 1, configurada para procesar dos sustratos, y/o sistemas configurados para procesar tres o más sustratos) pueden
procesar más de 100 muestras por hora (por ejemplo, entre 60 muestras y 120 muestras por hora). El uso de los sistemas y procedimientos divulgados en el presente documento en entornos de laboratorio puede dar como resultado un rendimiento más rápido por muestra, mientras que el consumo de líquidos (por ejemplo, líquidos fijadores, colorantes y de enjuague) se reduce en comparación con los sistemas automatizados convencionales y las técnicas manuales de preparación de muestras.
Otros modos de realización
Se ha de entender que si bien la invención se ha descrito junto con la descripción detallada, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la divulgación, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
Claims (14)
1. Un aparato para el procesamiento automatizado de una muestra biológica (3) en un sustrato (2) para su examen, comprendiendo el aparato
una plataforma (60A, 60B) que tiene una superficie superior localizada opuesta al sustrato (2) en una posición de procesamiento de muestras y que comprende al menos un puerto de líquido (42A-45A) localizado en una superficie de la plataforma (60A, 60B) orientada hacia el sustrato (2) y al menos un puerto de vacío (40A, 40B, 41A) localizado en la superficie de la plataforma (60A, 60B) orientada hacia el sustrato (2); en la que
en la posición de procesamiento del sustrato (2), el sustrato (2) y la superficie superior de la plataforma (60A, 60B) son sustancialmente paralelos y forman una separación,
en el que durante el funcionamiento, el aparato está configurado para hacer circular líquido entre el al menos un puerto de líquido (42A-45A) y el al menos un puerto de vacío (40A, 40B, 41A):
(a) dosificando una primera cantidad de líquido desde el al menos un puerto de líquido (42A-45A) para llenar la separación entre el sustrato (2) y la plataforma (60A, 60B);
(b) dosificando una cantidad adicional de líquido desde el al menos un puerto de líquido (42A-45A) hacia la separación para desplazar una parte de la primera cantidad de líquido; y
(c) retirando la parte de la primera cantidad de líquido de la separación a través del al menos un puerto de vacío (40A, 40B, 41A); y
en el que el aparato está configurado además para dosificar múltiples cantidades adicionales de líquido desde el al menos un puerto de líquido (42A-45A) hacia la separación para desplazar partes de líquido de la separación y retirar las partes desplazadas de líquido a través del al menos un puerto de vacío (40A, 40B, 41A), en el que el aparato está configurado además para dosificar continuamente la cantidad adicional de líquido y para retirar la parte de la primera cantidad de líquido o en el que el aparato está configurado además para dosificar de forma alterna las múltiples cantidades adicionales de líquido y retirar las partes desplazadas de líquido para generar un flujo pulsátil de líquido entre el al menos un puerto de líquido (42A-45A) y el al menos un puerto de vacío (40A, 40B, 41A).
2. El aparato de la reivindicación 1, en el que las múltiples cantidades adicionales de líquido comprenden al menos 4 cantidades adicionales de líquido.
3. El aparato de la reivindicación 1, en el que el aparato está configurado para dosificar la cantidad adicional de líquido desde el al menos un puerto de líquido (42A-45A) a una tasa de 20 microlitros por segundo o más.
4. El aparato de la reivindicación 1, en el que la plataforma (60A, 60B) está orientada de modo que el al menos un puerto de líquido (42A-45A) esté inclinado hacia arriba en un ángulo de 3 grados o más en relación con el al menos un puerto de vacío (40A, 40B, 41A).
5. El aparato de la reivindicación 1, en el que el al menos un puerto de líquido (42A-45A) comprende un primer puerto de colorante, y en el que el aparato comprende además un primer depósito de colorante (211A) y un primer conducto de colorante conectado al primer puerto de colorante de modo que durante el funcionamiento, se puede dosificar líquido que comprende un primer colorante desde el primer depósito de colorante (211 A) a través del primer puerto de colorante y hacia la separación.
6. El aparato de la reivindicación 5, en el que el al menos un puerto de líquido (42A-45A) comprende un segundo puerto de colorante espaciado del primer puerto de colorante en la superficie de la plataforma (60A, 60B), y en el que el aparato comprende además un segundo depósito de colorante (212A) y un segundo conducto de colorante conectado al segundo puerto de colorante de modo que durante el funcionamiento, el líquido que comprende un segundo colorante se puede dosificar desde el segundo depósito de colorante (212 A) a través del segundo puerto de colorante y hacia la separación.
7. El aparato de la reivindicación 1, en el que el al menos un puerto de líquido (42A-45A) comprende un puerto de fijador, y en el que el aparato comprende además un depósito de fijador (210) y un conducto de fijador conectado al puerto de fijador de modo que durante el funcionamiento, se puede dosificar líquido que comprende un fijador desde el depósito de fijador (210) a través del puerto de fijador y hacia la separación.
8. El aparato de la reivindicación 1, en el que el al menos un puerto de líquido (42A-45A) comprende un puerto de enjuague, y en el que el aparato comprende además un depósito de enjuague y un conducto de enjuague conectado al puerto de enjuague de modo que durante el funcionamiento, se puede dosificar líquido de enjuague desde el depósito de enjuague a través del puerto de enjuague y hacia la separación.
9. El aparato de la reivindicación 1, que comprende además un conducto de residuos y un recipiente de residuos conectado al menos un puerto de vacío (40A, 40B, 41A).
10. El aparato de la reivindicación 1, en el que durante el funcionamiento se establece una vía de presión negativa entre el al menos un puerto de líquido (42A-45A) y el al menos un puerto de vacío (40A, 40B, 41A).
11. El aparato de la reivindicación 1, en el que el al menos un puerto de vacío (40A, 40B, 41A) comprende múltiples puertos de vacío (40A, 40B, 41A).
12. El aparato de la reivindicación 1, en el que el al menos un puerto de líquido (42A-45A) comprende un primer puerto de colorante, un segundo puerto de colorante, un puerto de fijador y un puerto de enjuague, y en el que durante el funcionamiento, el aparato está configurado para hacer circular un líquido que comprende un primer colorante, un líquido que comprende un segundo colorante, un líquido que comprende un fijador y un líquido de enjuague realizando las etapas (a), (b) y (c) para dosificar los líquidos desde el primer puerto de colorante, el segundo puerto de colorante, el puerto de fijador y el puerto de enjuague, respectivamente.
13. El aparato de la reivindicación 1, en el que el aparato comprende:
un brazo del sustrato que incluye un portador del sustrato;
un accionador conectado al brazo del sustrato y configurado para mover el brazo del sustrato entre una posición abierta y una posición de procesamiento de muestras; y
dos o más vástagos (70A, 70B) dispuestos en la superficie superior de la plataforma (60A, 60B) de modo que cuando el sustrato (2) se pone en contacto con todos los vástagos (70A, 70B) en la posición de procesamiento del sustrato (2), el sustrato (2) y la superficie superior de la plataforma (60A, 60B) están sustancialmente paralelos y forman la separación de al menos aproximadamente 50 micrómetros.
14. Un procedimiento de procesamiento de una muestra biológica (3) en un sustrato (2) para su examen, comprendiendo el procedimiento procesar una muestra biológica (3) en un sustrato (2) con un aparato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
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