ES2938645T3

ES2938645T3 - Ensayos de tipo sándwich que utilizan partes de señal decreciente de la curva de respuesta de dosis para medir analitos, incluyendo analitos a concentración elevada

Info

Publication number: ES2938645T3
Application number: ES18825104T
Authority: ES
Inventors: Jian Yang; Huimiao Ren
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2017-06-28
Filing date: 2018-06-25
Publication date: 2023-04-13
Anticipated expiration: 2038-06-25
Also published as: EP3646009A1; AU2018292279B2; WO2019005694A1; KR20240059633A; AU2018292279A1; JP2023100697A; CN116626287A; CA3068038A1; CN111033237B; US20210405044A1; JP2020526742A; EP3646009B1; CN111033237A; EP4160210A1; JP7267211B2; EP3646009A4; KR102660904B1; KR20200019234A

Abstract

Los dispositivos, sistemas y métodos de ensayo de flujo lateral de tipo sándwich descritos en este documento miden la concentración de un analito de interés en una muestra y pueden determinar la concentración precisa del analito cuando está presente en concentraciones altas. Se genera una señal de máxima intensidad cuando la concentración del analito de interés en una muestra es cero. Para concentraciones bajas de analito, los ensayos de flujo lateral descritos aquí generan señales que son iguales o sustancialmente equivalentes a la señal de máxima intensidad. Las altas concentraciones del analito de interés generan señales que son menores que la señal de máxima intensidad. Los ensayos de flujo lateral de la presente descripción resuelven los inconvenientes asociados con el efecto de gancho de los ensayos de flujo lateral de tipo sándwich al eliminar la fase de la curva de respuesta a la dosis donde las señales aumentan. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Ensayos de tipo sándwich que utilizan partes de señal decreciente de la curva de respuesta de dosis para medir analitos, incluyendo analitos a concentración elevada

Campo

La presente divulgación se refiere en general a dispositivos de flujo lateral, sistemas de ensayo y métodos. Más particularmente, la presente divulgación se refiere a dispositivos de ensayo de flujo lateral para determinar la concentración de analito en una muestra, incluyendo cuando el analito de interés está presente en concentraciones elevadas.

Antecedentes

Los sistemas de inmunoensayo, incluyendo los ensayos de flujo lateral descritos en la presente memoria, proporcionan ensayos de diagnóstico fiables, económicos, portátiles, rápidos y sencillos. Los ensayos de flujo lateral pueden detectar de forma rápida y precisa, y en algunos casos cuantificar, la presencia o ausencia de un analista de interés en una muestra. De manera ventajosa, los ensayos de flujo lateral pueden ser mínimamente invasivos y se pueden usar como sistemas de ensayo en el punto de atención. Se han desarrollado ensayos de flujo lateral para detectar una amplia diversidad de analitos médicos o ambientales. En un ensayo de flujo lateral en formato de sándwich, se deposita un anticuerpo marcado contra a un analito de interés en una tira de ensayo o cerca de una zona de recepción de muestra. El anticuerpo marcado puede incluir, por ejemplo, una molécula de detector o "marcador" ligada al anticuerpo. Cuando la muestra se aplica a la tira de ensayo, el analito presente en la muestra se une al anticuerpo marcado, que fluye a lo largo de la tira de ensayo hasta una zona de captura, donde el anticuerpo inmovilizado contra el analito se une al complejo anticuerpo marcado-analito. El anticuerpo inmovilizado sobre la línea de captura puede ser diferente del anticuerpo marcado depositado en la zona de recepción de muestra o cerca de ella. Se detecta el complejo capturado y se determina la presencia de analito. En ausencia de analito, el anticuerpo marcado fluye a lo largo de la tira de ensayo pero pasa por la zona de captura. La ausencia de señal en la zona de captura indica la ausencia de analito. Sin embargo, el ensayo de flujo lateral en sándwich tiene muchas desventajas, incluyendo falsos negativos, resultados imprecisamente bajos y falta de resolución cuando el analito de interés está presente en la muestra en concentraciones elevadas.

El documento US 6924 153 B1 divulga ensayos de flujo lateral cuantitativos que incluyen un primer miembro de par de unión específica marcado complementario al analito, el documento US 7439079 B1 divulga dispositivos de ensayo de flujo lateral para detectar la presencia o cantidad de un analito en una muestra, el documento EP 0 987 551 A1 divulga métodos para analizar una muestra que tiene un analito que exhibe el efecto de gancho, el documento US 2009/180927 A1 divulga ensayos usados para detectar bajas concentraciones de analito en una muestra. Los documentos WO 2013/132338 A1, WO 2013/088429 A1 y US 2009/253219 A1 divulgan que los formatos de ensayo competitivos son bien conocidos.

Sumario

Por tanto, un aspecto de la presente divulgación es proporcionar ensayos de flujo lateral mejorados que miden con precisión la concentración de un analito de interés en una muestra, incluyendo cuando el analito está presente en la muestra en concentraciones elevadas.

La invención se define en las reivindicaciones independientes. Las reivindicaciones dependientes describen realizaciones preferidas.

Algunas realizaciones divulgadas en la presente memoria se refieren a una tira de ensayo que incluye una trayectoria de flujo configurada para recibir una muestra de fluido; una zona de recepción de muestra acoplada a la trayectoria de flujo; y una zona de captura. La zona de captura está acoplada a la trayectoria de flujo aguas abajo de la zona de recepción de muestra e incluye un agente de captura inmovilizado específico para el analito de interés, y la trayectoria de flujo comprende, antes de la aplicación de la muestra de fluido, un complejo configurado para fluir en la trayectoria de flujo hacia la zona de captura en presencia de la muestra de fluido. El complejo incluye un marcador, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une específicamente al analito de interés y el analito de interés. En algunos casos, la trayectoria de flujo está configurada para recibir una muestra de fluido que comprende un analito de interés no marcado, y el complejo no se une específicamente al analito de interés no marcado en la primera o la segunda fase. En algunos casos, el complejo está configurado para fluir con el analito de interés no marcado en la trayectoria de flujo hasta la zona de captura en la segunda fase. En algunos ejemplos, el complejo está configurado para competir con el analista de interés no marcado para unirse al agente de captura inmovilizado en la zona de captura en una tercera fase. En algunos casos, una señal óptica emitida por el complejo unido al agente de captura inmovilizado en la zona de captura disminuye a medida que aumenta la concentración de analito de interés no marcado en la muestra de fluido.

En algunos ejemplos, la trayectoria de flujo está configurada para recibir una muestra de fluido que incluye o no el analito de interés. El complejo se une específicamente a todo o sustancialmente todo el agente de captura inmovilizado en la zona de captura en la segunda fase cuando la muestra de fluido no incluye el analito de interés. En algunos casos, cuando la muestra de fluido no incluye el analito de interés, una señal óptica emitida desde el complejo unido en la zona de captura es una señal óptica máxima que se puede emitir desde la tira de ensayo. Cuando la muestra de fluido incluye un analito de interés, la señal óptica emitida desde el complejo unido en la zona de captura es menor que la señal óptica máxima.

En algunos casos, el agente de captura inmovilizado incluye un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente al analito de interés. El complejo se integra sobre la superficie de la tira de ensayo en una primera fase en algunos ejemplos. En algunos casos, el complejo se integra sobre la superficie de la tira de ensayo pulverizando una disolución que comprende el complejo sobre la superficie de la tira de ensayo y secando la disolución. La muestra de fluido puede incluir una muestra de sangre, plasma, orina, sudor o saliva. En un ejemplo no limitante, el analito de interés incluye la proteína C reactiva (PCR) y el complejo incluye un anticuerpo anti-PCR o un fragmento del mismo ligado a PCR.

Otras realizaciones divulgadas en la presente memoria se refieren a un sistema de ensayo de diagnóstico que incluye una tira de ensayo descrita con anterioridad; un lector que incluye una fuente de luz y un detector, y un analizador de datos. El analizador de datos emite una indicación de que no hay ningún analito de interés en la muestra de fluido cuando el lector detecta una señal óptica de la tira de ensayo que es una señal óptica máxima de una curva de respuesta de dosis de la tira de ensayo. En un ejemplo, el analizador de datos emite una indicación de que hay una concentración baja de analito de interés en la muestra de fluido cuando el lector detecta una señal óptica procedente de la tira de ensayo que está dentro de un 1 % de la señal óptica máxima. En otro ejemplo, el analizador de datos emite una indicación de que hay una baja concentración de analito de interés en la muestra de fluido cuando el lector detecta una señal óptica de la tira de ensayo que está dentro de un 5 % de la señal óptica máxima. En otro ejemplo adicional, el analizador de datos emite una indicación de que hay una baja concentración de analito de interés en la muestra de fluido cuando el lector detecta una señal óptica de la tira de ensayo que está dentro de un 10 % de la señal óptica máxima. En otro ejemplo, el analizador de datos emite una indicación de que hay una concentración elevada de analito de interés en la muestra de fluido cuando el lector detecta una señal óptica procedente de la tira de ensayo que es de un 90 % o menos de un 90 % de la señal óptica máxima. En otro ejemplo, el analizador de datos emite una indicación de la concentración de analito de interés en la muestra cuando el lector detecta una señal óptica procedente de la tira de ensayo que está por debajo de la señal óptica máxima.

Otras realizaciones divulgadas en el presente documento hacen referencia a un método para determinar la concentración de analito de interés en una muestra de fluido. El método incluye aplicar la muestra de fluido a una tira de ensayo descrita anteriormente cuando el complejo se acopla a la trayectoria de flujo y; desacoplar el complejo de la trayectoria de flujo; hacer fluir la muestra de fluido y el complejo en la trayectoria de flujo hasta la zona de captura; unir el complejo al agente de captura inmovilizado en la zona de captura; y detectar una señal de complejo ligado al agente de captura inmovilizado en la zona de captura. La señal detectada puede ser una señal óptica, una señal de fluorescencia o una señal magnética. En algunos casos, el desacoplamiento del complejo incluye disolver el complejo con la muestra de fluido. En algunos casos, la muestra de fluido incluye un analito de interés no marcado, y el complejo no se une específicamente al analito de interés sin marcar en la primera fase o segunda fase. En otro caso, la muestra de fluido incluye un analito de interés no marcado, y el complejo está configurado para competir con el analista de interés no marcado para unirse al agente de captura inmovilizado en la zona de captura en la tercera fase. En un ejemplo, la muestra de fluido no incluye el analito de interés, y la detección incluye la detección de una señal óptica máxima de una curva de respuesta de dosis de la tira de ensayo.

En algunos casos, el método incluye determinar que la concentración de analito en la muestra de fluido sea cero. En algunos casos, el método incluye además mostrar una indicación de que el analito de interés no está presente en la muestra de fluido.

En un ejemplo, la muestra de fluido incluye el analito de interés, y la detección incluye detectar una señal procedente de la tira de ensayo que es menor que una señal máxima de una curva de respuesta de dosis de la tira de ensayo. En algunos casos, el método incluye además determinar que la concentración de analito en la muestra de fluido es mayor que cero. En algunos casos, el método incluye además mostrar una indicación de que el analito de interés está presente en la muestra de fluido. En un ejemplo, el método incluye además determinar que la señal detectada está dentro de un 10 % de la señal óptica máxima; y mostrar una indicación de que el analito de interés está presente en la muestra de fluido a baja concentración. En otro ejemplo, el método incluye además determinar que la señal detectada es un 90 % o menos de un 90 % de la señal máxima; y mostrar una indicación de que el analito de interés está presente en la muestra de fluido en concentración elevada.

Los ejemplos adicionales divulgados en la presente memoria se refieren a un método de fabricación de una tira de ensayo que incluye el acoplamiento de una zona de recepción de muestra a una trayectoria de flujo configurada para recibir una muestra de fluido; acoplar la zona de captura a la trayectoria de flujo aguas abajo de la zona de recepción de muestra; y acoplar un complejo a la trayectoria de flujo. El complejo incluye un marcador; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un analito de interés; y el analito de interés. En algunos casos, el analito de interés incluye proteína C reactiva (PCR) y el anticuerpo incluye anticuerpo anti-PCR o un fragmento de anticuerpo anti-PCR. En un ejemplo, el analito de interés incluye aproximadamente 50 ng de PCR. En otro ejemplo, el analito de interés incluye aproximadamente 100 ng de PCR. En algunos casos, el método incluye además la inmovilización de un agente de captura específico del analito de interés en la zona de captura. En algunos ejemplos, acoplar el complejo a la trayectoria de flujo incluye formar un enlace entre el complejo y la trayectoria de flujo que se rompe en presencia de una muestra de fluido en la trayectoria de flujo. En un ejemplo, acoplar el complejo incluye pulverizar una disolución que incluye el complejo sobre una superficie de la zona de recepción de muestra. En otro ejemplo, acoplar el complejo incluye pulverizar una disolución que incluye el complejo sobre una superficie de la tira de ensayo entre la zona de recepción de muestra y la zona de captura. En otro ejemplo, acoplar el complejo incluye aplicar una disolución fluida que incluye el complejo sobre una superficie de la tira de ensayo; y secar la disolución de fluido. En otro ejemplo más, acoplar el complejo incluye integrar el complejo en una superficie de la tira de ensayo.

En algunos casos, el método incluye además proporcionar una disolución que incluye el complejo. En algunos casos, proporcionar la disolución incluye mezclar un primer líquido que incluye el marcador y el anticuerpo o fragmento de anticuerpo con un segundo líquido que incluye el analito de interés. En algunos ejemplos, proporcionar la disolución incluye además incubar la mezcla del primer líquido y el segundo líquido durante aproximadamente 30 minutos. En algunos ejemplos, acoplar el complejo a la trayectoria de flujo incluye pulverizar la disolución sobre una superficie de la tira de ensayo. Aún en otras realizaciones divulgadas en el presente documento se hace referencia a tiras de ensayo preparadas mediante los métodos descritos con anterioridad.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A y 1B ilustran un ensayo de flujo lateral de tipo sándwich a modo de ejemplo antes y después de aplicar una muestra de fluido en una zona de recepción de muestra.

La Figura 2 ilustra una curva de respuesta de dosis a modo de ejemplo para el ensayo de flujo lateral de las Figuras 1A y 1B.

Las Figuras 3A y 3B ilustran un ensayo de flujo lateral de tipo competitivo a modo de ejemplo antes y después de aplicar una muestra de fluido en una zona de recepción de muestra.

La Figura 4 ilustra una curva de respuesta de dosis a modo de ejemplo para un ensayo de flujo lateral competitivo de las Figuras 3A y 3B.

Las Figuras 5A y 5B ilustran un ensayo de flujo lateral a modo de ejemplo según la presente divulgación antes y después de aplicar una muestra de fluido en una zona de recepción de muestra.

La Figura 5C ilustra una curva de respuesta de dosis a modo de ejemplo para el ensayo de flujo lateral de las Figuras 5A y 5B.

La Figura 6A ilustra una curva de respuesta de dosis a modo de ejemplo para un ensayo de flujo lateral de tipo sándwich como el ilustrado en las Figuras 1A y 1B y una curva de respuesta de dosis a modo de ejemplo para un ensayo de flujo lateral según la presente divulgación, donde la concentración de analito se mide a lo largo del eje x en escala logarítmica.

La Figura 6B ilustra la curva de respuesta de dosis a modo de ejemplo de la Figura 6A para un ensayo de flujo lateral según la presente divulgación, donde la concentración de analito se mide a lo largo del eje x en una escala no logarítmica.

Las Figuras 7A y 7B ilustran una tabla de datos experimentales y un gráfico que representa los datos experimentales, respectivamente, que correlacionan la concentración de PCR medida mediante un ensayo de flujo lateral según una realización de la presente divulgación con la concentración de PCR determinada por ELISA.

Descripción detallada

Los dispositivos, sistemas y métodos descritos en la presente memoria determinan con precisión la cantidad de un analito de interés en una muestra, por ejemplo, una concentración de analito en una muestra de volumen conocido. De manera ventajosa, los dispositivos de flujo lateral, los sistemas de ensayo y los métodos según la presente divulgación determinan con precisión la cantidad de un analito de interés en situaciones en las que el analito de interés está presente en la muestra en una concentración elevada o "alta". Los ensayos de flujo lateral descritos en la presente memoria pueden generar una señal de máxima intensidad cuando la concentración de analito de interés en la muestra es nula. Las señales generadas por ensayos según la presente divulgación se describen en la presente memoria en el contexto de una señal óptica generada por marcadores de tipo reflectancia (tales como, pero sin limitación, marcadores de nanopartículas de oro). Aunque las realizaciones de la presente divulgación se describen en la presente memoria con referencia a una señal "óptica", se entiende que los ensayos descritos en la presente memoria pueden usar cualquier material apropiado para el marcador con el fin de generar una señal detectable, que incluye, entre otros, marcadores de perlas de látex de tipo fluorescencia que generan señales de fluorescencia y marcadores de nanopartículas magnéticas que generan señales que indican un cambio en los campos magnéticos asociados al ensayo. Para bajas concentraciones de analito, los ensayos de flujo lateral descritos en la presente memoria generan señales ópticas que son iguales o sustancialmente equivalentes a (dentro de un intervalo limitado de variación) la señal de máxima intensidad. Los ensayos de flujo lateral según la presente divulgación generan señales que son menores que la señal de intensidad máxima para concentraciones elevadas o “altas” del analito de interés.

Según la presente divulgación, un agente marcado que incluye un complejo de marcador-anticuerpo-analito se integra inicialmente en una superficie, por ejemplo en la almohadilla de conjugado, de una tira de ensayo de flujo lateral. El complejo de marcador-anticuerpo-analito se libera de la zona de marcador al aplicar la muestra de fluido a la tira de ensayo y viaja a la zona de captura de la tira de ensayo con la muestra de fluido y cualquier analito de interés en la muestra (en caso de estar presente). El complejo de marcador-anticuerpo-analito y el analito de interés en la muestra (en caso de estar presente) se unen al agente de captura en la zona de captura. El agente de captura se une completamente al complejo de marcador-anticuerpo-analito cuando no hay analito de interés en la muestra para competir con el complejo de marcador-anticuerpo-analito, generando una señal de máxima intensidad. Cuando el analito de interés está presente en la muestra en bajas concentraciones, el complejo de marcador-anticuerpo-analito compite con una cantidad relativamente baja de analito no marcado para unirse al agente de captura, lo que da como resultado una señal que es igual o sustancialmente equivalente a (dentro de un intervalo limitado de variación de) la señal de máxima intensidad. Cuando el analito de interés está presente en la muestra en concentraciones elevadas, el complejo de marcador-anticuerpo-analito compite con una cantidad relativamente elevada de analito no marcado para unirse al agente de captura, lo que da como resultado una señal que es menor que la señal de máxima intensidad.

Sin estar ligado a teoría particular alguna, la adición de analito marcado en la forma de complejo de marcadoranticuerpo-analito integrado en la zona de marcador enmascara la parte de la curva de respuesta de dosis de ensayo de flujo lateral de tipo sándwich en la que las señales aumentan (cuando las concentraciones de analito son bajas), generando de este modo una curva de respuesta de dosis mejorada que comienza con una señal de máxima intensidad a una concentración nula y, a continuación, permanece relativamente constante (analito en concentraciones bajas) o disminuye (analito en concentraciones elevadas). Los ensayos de flujo lateral de la presente descripción solucionan los inconvenientes asociados al efecto de gancho de los ensayos de flujo lateral de tipo sándwich al eliminar la fase de la curva de respuesta de dosis en la que las señales aumentan.

Las señales generadas por los ensayos de flujo lateral descritos en la presente memoria cuando el analito está en concentraciones elevadas incluyen muchas características ventajosas. En realizaciones a modo de ejemplo que generan señales ópticas, las señales que se generan cuando el analito está en concentración elevada son fácilmente detectables (por ejemplo, tienen una intensidad dentro de un intervalo de señales ópticas que los lectores convencionales normalmente pueden discernir y están bien separadas), no se superponen en la curva de respuesta de dosis con señales generadas a concentraciones nulas o bajas, y se pueden usar para calcular una lectura de concentración muy precisa a concentraciones elevadas e incluso muy elevadas. Las realizaciones de los ensayos de flujo lateral descritos en la presente memoria evitan la incertidumbre asociada a la correlación de una señal detectada particular con una cantidad de analito (especialmente analito en concentración elevadas), tal como la incertidumbre que acontece al leer ensayos de flujo lateral de tipo sándwich que generan una única señal óptica correspondiente a una concentración de analito tanto baja como elevada debido al efecto de gancho. Por el contrario, los ensayos de flujo lateral según la presente descripción generan una señal óptica que corresponde de forma clara e inequívoca a una concentración de analito nula o baja (señal óptica igual o sustancialmente equivalente a la señal de intensidad máxima) o una concentración de analito elevada (señal óptica menor que la señal de máxima intensidad). En algunos casos, las concentraciones bajas o nulas se pueden correlacionar directamente con un nivel de analito normal o "saludable" en el sujeto, y las concentraciones de analito elevadas se pueden correlacionar directamente con un nivel de analito no normal o "no saludable" en el sujeto.

Además, las realizaciones del ensayo de flujo lateral según la presente descripción se correlacionan fuertemente con los ensayos convencionales de oro actuales para determinar la cantidad de analito en una muestra, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). De manera ventajosa, se ha descubierto que la concentración de PCR determinada por medio de las realizaciones de los ensayos de flujo lateral descritos en la presente memoria está fuertemente correlacionada con la concentración de PCR determinada por ELISA. En un ejemplo de trabajo descrito a continuación, se obtuvo una correlación de un 93 % entre la concentración de CRP medida usando una realización de ensayos según la presente descripción y la concentración de PCR determinada por ELISA.

Las realizaciones del ensayo de flujo lateral descritas en la presente memoria son particularmente ventajosas en ensayos de diagnóstico para analitos de interés que están presentes de forma natural en bajas concentraciones en individuos sanos pero que alcanzan concentraciones elevadas en individuos con enfermedad o trastorno. Las señales ópticas con una variación relativamente pequeña de señal de intensidad máxima se generan en el intervalo de concentración de nula a baja, en el que el operador únicamente busca confirmar que el analito está presente en una concentración baja (indicador de niveles saludables) y no requiere especificidad o resolución de señales ópticas, al tiempo que se generan señales ópticas de alta resolución fácilmente detectables con una gran variación de señal de máxima intensidad cuando el operador busca confirmar que el analito está presente en concentración elevada (indicador de una condición anormal o de enfermedad) y en particular busca cuantificar el analito de interés siempre que se encuentre en concentraciones elevadas. La capacidad de identificar con precisión la concentración precisa de un analito de interés cuando se encuentra dentro de un intervalo de concentraciones elevadas también puede permitir al operador determinar la etapa o el transcurso de una enfermedad u otra afección en el sujeto, tal como una etapa leve o grave.

Diversos aspectos de los ensayos de flujo lateral proporcionan ventajas con respecto a los ensayos de flujo lateral existentes. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los ensayos de flujo lateral descritos en la presente memoria no requieren múltiples líneas de ensayo, sino que tienen la capacidad de determinar con precisión la concentración de analito y también determinar si el ensayo funcionó correctamente con el uso de una única línea de captura. Además, en algunas realizaciones, los ensayos de flujo lateral descritos en la presente memoria pueden determinar con precisión la concentración de analito elevada en una muestra sin necesidad de diluir primero la muestra. Además, en algunas realizaciones, se puede variar la cantidad de complejo marcador preformado-anticuerpo colocada en el ensayo de flujo lateral para satisfacer el requisito de diferentes intervalos de concentración de analito.

Diversos aspectos de los dispositivos, sistemas de ensayo y métodos se describen con más detalle a continuación haciendo referencia a los dibujos adjuntos. Sin embargo, la divulgación se puede llevar a cabo de muchas formas diferentes. En base a las consideraciones de la presente memoria, el experto en la técnica debe apreciar que el alcance de la divulgación pretende abarcar cualquier aspecto de los dispositivos, sistemas de ensayo y métodos divulgados en la presente memoria, tanto si se implementan de forma independiente como en combinación con cualquier otro aspecto de la presente divulgación. Por ejemplo, se puede implementar un dispositivo o se puede poner en práctica un método usando cualquier número de los aspectos establecidos en la presente memoria.

Aunque en la presente memoria se describen aspectos particulares, muchas variaciones y permutaciones de estos aspectos se encuentran dentro del alcance de la divulgación. Aunque se mencionan algunos beneficios y ventajas, no se pretende que el alcance de la divulgación se limite a beneficios, usos u objetivos particulares. Más bien, los aspectos de la divulgación pretenden resultar ampliamente aplicables a diferentes tecnologías de detección y configuraciones de dispositivo, algunas de las cuales se ilustran a modo de ejemplo en las figuras y en la siguiente descripción. La descripción detallada y los dibujos son meramente ilustrativos de la divulgación en lugar de limitantes, estando definido el alcance de la divulgación por las reivindicaciones adjuntas y equivalentes de las mismas.

Los dispositivos de flujo lateral descritos en la presente memoria son dispositivos analíticos utilizados en cromatografía de flujo lateral. Los ensayos de flujo lateral son ensayos que se pueden llevar a cabo en los dispositivos de flujo lateral descritos en la presente memoria. Se pueden implementar dispositivos de flujo lateral en una tira de ensayo, pero otras formas pueden resultar apropiadas. En el formato de tira ensayo, un fluido de muestra de ensayo, que se sospecha que contiene un analito, fluye (por ejemplo, por acción capilar) a través de la tira. La tira puede estar formada por materiales absorbentes tales como papel, nitrocelulosa y celulosa. El fluido de muestra se encuentra albergado en un depósito de muestra. El fluido de muestra puede fluir a lo largo de la tira hasta una zona de captura en la que el analito (en caso de estar presente) interactúa con un agente de captura para indicar la presencia, ausencia y/o cantidad de analito. El agente de captura puede incluir anticuerpos inmovilizados en la zona de captura.

Ensayos de flujo lateral de tipo sándwich y de tipo competitivo

Los ensayos de flujo lateral se pueden llevar a cabo en formato de sándwich o competitivo. Los ensayos en formato de sándwich y competitivo descritos en la presente memoria se describen en el contexto de marcadores de tipo reflectante (tales como marcadores de nanopartículas de oro) que generan una señal óptica, pero se entiende que los ensayos pueden incluir marcadores de perlas de látex configurados para generar señales de fluorescencia, marcadores de nanopartículas magnéticas configurados para generar señales magnéticas, o cualquier otro marcador configurado para generar una señal detectable. Los ensayos de flujo lateral de tipo sándwich incluyen un anticuerpo marcado depositado en un depósito de muestra sobre un sustrato sólido. Después de aplicar la muestra al depósito de muestra, el anticuerpo marcado se disuelve en la muestra, después de lo cual el anticuerpo reconoce y se une a un primer epítopo en el analito de la muestra, formando un complejo marcador-anticuerpo-analito. Este complejo fluye a lo largo del frente de líquido desde el depósito de muestra a través del sustrato sólido hasta una zona de captura (a veces denominada "línea de ensayo"), donde se encuentran los anticuerpos inmovilizados (en ocasiones denominados "agente de captura"). En algunos casos en los que el analito es un multímero o contiene múltiples epítopos idénticos en el mismo monómero, el anticuerpo marcado depositado en el depósito de muestra puede ser el mismo que el anticuerpo inmovilizado en la zona de captura. El anticuerpo inmovilizado reconoce y se une a un epítopo en el analito, capturando así el complejo marcador-anticuerpo-analito en la zona de captura. La presencia de un anticuerpo marcado en la zona de captura proporciona una señal óptica detectable en la zona de captura. En un ejemplo no limitante, se utilizan nanopartículas de oro para marcar los anticuerpos porque son relativamente económicas, estables y proporcionan indicaciones de color fácilmente observables basadas en las propiedades de resonancia de plasmones superficiales de las nanopartículas de oro. En algunos casos, esta señal proporciona información cualitativa, como si el analito estuviera o no presente en la muestra. En algunos casos, esta señal proporciona información cuantitativa, tal como una medición de la cantidad de analito en la muestra.

Las Figuras 1A y 1B ilustran un ejemplo de dispositivo 10 de flujo lateral de tipo sándwich. El dispositivo 10 de flujo lateral incluye un depósito de muestra 12, una zona de marcador 14, una zona de captura 16 y una línea de control 18. Las Figuras 1A y 1B ilustran el dispositivo 10 de flujo lateral antes y después de que se haya aplicado una muestra de fluido 24 al depósito de muestra 12. En el ejemplo ilustrado en las Figuras 1A y 1B, la muestra 24 incluye el analito de interés 26. La zona de marcador 14 que está en el depósito de muestra 12 o cerca del mismo incluye un agente marcado 28. En el presente dispositivo de flujo lateral de tipo sándwich a modo de ejemplo, el agente marcado 28 incluye un anticuerpo o fragmento de anticuerpo 30 unido a un marcador 32. Un agente de captura 34 está inmovilizado en la zona de captura 16. Un agente de control 35 está inmovilizado en la línea de control 18.

Cuando la muestra de fluido 24 se aplica al depósito de muestra 12, la muestra 24 disuelve el agente marcado 28, y el agente marcado 28 se une al analito 26, formando un complejo marcador-anticuerpo-analito 20. En consecuencia, en el dispositivo 10 de flujo lateral de tipo sándwich a modo de ejemplo, el complejo 20 marcador-anticuerpo-analito no se forma hasta que la muestra de fluido 24 que contiene el analito de interés 26 se aplica al dispositivo de flujo lateral. Además, en el dispositivo 10 de flujo lateral tipo sándwich a modo de ejemplo, el analito en el complejo 20 de marcador-anticuerpo-analito es el analito de la muestra de fluido 24. Como se muestra en la Figura 1B, este complejo 20 fluye a través de la tira de ensayo hacia la zona de captura 16, donde se une al agente de captura 34. El complejo 20 ahora unido (y específicamente, el marcador 32 de complejo 20 ahora unido) emite una señal óptica detectable en la zona de captura 16.

El agente marcado 28 que no se unió a ningún analito 26 pasa a través de la zona de captura 16 (no habiendo analito 26 para unirse al agente de captura 34 en la zona de captura 16) y continúa fluyendo hacia abajo por el dispositivo 10 de flujo lateral. En los ensayos de flujo lateral que incluyen la línea de control 18, tal como el que se ilustra en la presente memoria, el agente 35 de control depositado captura el agente 28 marcado que no se unió al analito 26 y pasó a través de la zona de captura 16 a la línea de control 18. En algunas realizaciones, el agente de control 35 captura el agente marcado 28 en la región Fc del anticuerpo. En algunas realizaciones, el agente de control 35 captura el agente marcado 28 en la región Fab del anticuerpo. Este agente marcado 28 unido a la línea de control 18 emite una señal óptica detectable que se puede medir y usar para indicar que el ensayo funcionó según lo previsto (por ejemplo, la muestra 24 fluyó desde el depósito de muestra 12 y a través de la zona de captura 16 según lo previsto durante el funcionamiento normal del ensayo de flujo lateral). Una desventaja del dispositivo 10 de flujo lateral de tipo sándwich a modo de ejemplo es que la intensidad de la señal generada en la línea de control 18 depende de la intensidad de señal generada en la zona de captura 16 (porque el agente de control 35 en la línea de control 18 captura el agente marcado 28 que no se unió al analito 26 en la zona de captura 16 y luego pasó a la línea de control 18). Por ejemplo, si una cantidad relativamente grande de analito 26 se une a la zona de captura 16, una cantidad relativamente pequeña de analito 26 pasará a través de la zona de captura 16 y estará disponible para unirse al agente de control 35 en la línea de control 18, dando como resultado una señal de intensidad relativamente más débil en la línea de control 18.

Los ensayos de flujo lateral pueden proporcionar información cualitativa, tal como información sobre la presencia o ausencia de analito de interés en la muestra. Por ejemplo, la detección de cualquier señal óptica medible en la zona de captura 16 puede indicar que el analito de interés está presente en la muestra (en alguna cantidad desconocida). La ausencia de cualquier señal óptica medible en la zona de captura puede indicar que el analito de interés no está presente en la muestra o está presente por debajo del límite de detección. Por ejemplo, si la muestra 24 no contiene ningún analito de interés 26 (no ilustrado), la muestra 24 aún disolvería el agente marcado 28 y el agente marcado 28 aún fluiría hasta la zona de captura 16. No obstante, el agente marcado 28 no se une al agente de captura 34 en la zona de captura 16. En lugar de ello, fluiría a través de la zona de captura 16, a través de la línea de control 18 y, en algunos casos, a una zona de absorción opcional. Parte del agente marcado 28 se uniría al agente de control 35 depositado en la línea de control 18 y emitiría una señal óptica detectable. En estas circunstancias, la ausencia de una señal óptica medible que emana de la zona de captura 16 es un indicativo de que el analito de interés no está presente en la muestra 24, y la presencia de una señal óptica medible que emana de la línea de control 18 es un indicativo de que la muestra 24 viajó desde la zona de recepción de muestra 12, a través de la zona de captura 16, y hasta la línea de captura 18, según lo previsto durante el funcionamiento normal del ensayo de flujo lateral.

Algunos dispositivos de flujo lateral pueden proporcionar información cuantitativa, tal como una medición de la cantidad de analito de interés en la muestra. La medición cuantitativa obtenida a partir del dispositivo de flujo lateral puede ser una concentración de analito que está presente en un volumen dado de muestra. La Figura 2 ilustra un ejemplo de medición cuantitativa obtenida a partir del ensayo de flujo lateral de tipo sándwich ilustrado en las Figuras 1A y 1B. La Figura 2 es una curva de respuesta de dosis que ilustra gráficamente la relación entre intensidad de una señal detectada en la zona de captura (medida a lo largo del eje y) y concentración de analito en la muestra (medida a lo largo del eje x). Las señales a modo de ejemplo incluyen señales ópticas, señales de fluorescencia y señales magnéticas.

Como se muestra en el primer punto de datos a concentración cero en la Figura 2, si la muestra no contiene ningún analito de interés, la concentración de analito en la muestra es nula y ningún analito se une al agente marcado para formar el complejo marcador-anticuerpo-analito. En esta situación, no hay complejos que fluyan hacia la zona de captura y se unan al anticuerpo de captura. De este modo, no se observa ninguna señal óptica detectable en la zona de captura y la magnitud de la señal es cero.

Se detecta una señal a medida que la concentración de analito en la muestra aumenta desde la concentración nula. Como demuestran los puntos de datos en la Fase A, la señal aumenta con el aumento de concentración de analito en la muestra. Esto ocurre porque a medida que aumenta la concentración de analito, aumenta la formación de complejo marcador-anticuerpo-analito. El agente de captura inmovilizado en la zona de captura se une al número creciente de complejos que fluyen hacia la zona de captura, lo que da como resultado un aumento de la señal detectada en la zona de captura. En la Fase A, la señal continúa aumentando a medida que aumenta la concentración de analito en la muestra.

En algunos casos, si la muestra tiene una concentración de analito que excede la cantidad de agente marcado disponible para unirse al analito, hay un exceso de analito. En estas circunstancias, el exceso de analito que no se une al agente marcado compite con el complejo marcador-anticuerpo-analito para unirse al agente de captura en la zona de captura. El agente de captura de la zona de captura se une al analito no marcado (en otras palabras, el analito no unido a un agente marcado) y al complejo marcador-anticuerpo-analito. Sin embargo, el analito no marcado que se une al agente de captura no emite una señal detectable. A medida que aumenta la concentración de analito en la muestra en la Fase B, aumenta la cantidad de analito no marcado que se une al agente de captura (en lugar del complejo marcador-anticuerpo-analito que emite una señal detectable). Cuántos más y más analitos no marcados se unen al agente de captura en lugar de hacerlo al complejo marcador-anticuerpo-analito, la señal detectada en la zona de captura disminuye, como se muestra por medio de los puntos de datos en la Fase B.

Este fenómeno en el que la señal detectada aumenta durante la Fase A y la señal detectada disminuye en la Fase B se denomina "efecto de gancho". A medida que aumenta la concentración de analito en la Fase A, se une más analito al agente marcado, lo que aumenta la intensidad de señal. En un punto "Conc^sat” el agente marcado está saturado con el analito de la muestra (por ejemplo, la cantidad disponible de agente marcado se ha unido en su totalidad o casi en su totalidad al analito de la muestra), y la señal detectada ha alcanzado un valor máximo Señal^max. A medida que la concentración de analito en la muestra continúa aumentando en la Fase B, hay una disminución de la señal detectada a medida que el exceso de analito por encima del punto de saturación de agente marcado compite con el analitoagente marcado para unirse al agente de captura.

El efecto de gancho, también denominado "efecto prozona", afecta negativamente a los ensayos de flujo lateral, especialmente en situaciones en las que el analito de interés está presente en la muestra a una concentración en la Fase B. El efecto de gancho puede generar resultados de ensayo inexactos. Por ejemplo, el efecto de gancho puede generar falsos negativos o resultados bajos imprecisos. Específicamente, se producen resultados inexactos cuando la muestra contiene niveles elevados de analito que superan la concentración de agente marcado depositado en la tira de ensayo. En este escenario, cuando la muestra se coloca en la tira de ensayo, el agente marcado se satura y no todo el analito queda marcado. El analito no marcado fluye a través del ensayo y se une a la zona de captura, compitiendo con el complejo marcado y reduciendo, de este modo, la señal detectable. De este modo, el dispositivo (o el operador del dispositivo) no puede distinguir si la señal óptica corresponde a una concentración baja o elevada, ya que la única señal detectada corresponde a una concentración tanto baja como elevada. Si los niveles de analito son suficientemente elevados, entonces el analito supera por completo al complejo marcado y no se aprecia señal alguna en la zona de captura, lo que da como resultado un resultado falso negativo.

Los resultados de ensayo inexactos también pueden ser consecuencia de ensayos de flujo lateral de tipo competitivo. A diferencia de los ensayos de flujo lateral de tipo sándwich, en un ensayo de flujo lateral de tipo competitivo, el analito de interés no marcado procedente de una muestra compite con el analito de interés marcado para unirse a un agente de captura en la zona de captura. Las Figuras 3A y 3B ilustran un ejemplo de ensayo 22 de flujo lateral de tipo competitivo. El dispositivo 22 de flujo lateral incluye un depósito de muestra 12, una zona de marcador 14 y una zona de captura 16. Las Figuras 3A y 3B ilustran el dispositivo 22 de flujo lateral antes y después de aplicar una muestra de fluido 24 al depósito de muestra 12. En el ejemplo ilustrado en las Figuras 3A y 3^b, la muestra de fluido 24 incluye el analito de interés 26. La zona de marcador 14 que en el depósito de muestra 12 o cerca del mismo incluye un agente marcado 29. En el presente ejemplo de dispositivo de flujo lateral de tipo competitivo, el agente marcado 29 incluye un analito de interés 26 unido a un marcador 32. El agente de captura 34 está inmovilizado en la zona de captura 16.

La muestra 24 que incluye el analito no marcado 26 se aplica al depósito de muestra 12. La muestra 24 disuelve el agente marcado 29. El analito no marcado 26 de la muestra 24 y el agente marcado 29 fluyen juntos a la zona de captura 16, donde tanto el analito no marcado 26 de la muestra 24 como el agente marcado 29 se unen al agente de captura 34 inmovilizado en la zona de captura 16. Como se muestra en la Figura 3B, el agente marcado y el analito no marcado 26 compiten entre sí para unirse a una cantidad fija de agente de captura 34. El agente 29 marcado unido al agente de captura 34 (y específicamente, el marcador 32 del agente marcado 29) emite una señal óptica detectable, mientras que el analito no marcado 26 que se originó a partir de la muestra 24 y unido al agente de captura 34 no emite una señal óptica detectable.

La detección de la señal óptica de la zona de captura 16 puede proporcionar información cualitativa o cuantitativa sobre el analito de interés 26. En caso de que la muestra de fluido 24 no incluya ningún analito 26 (no ilustrado), la muestra 24 aún disolvería el agente marcado 29 y éste fluiría a la zona de captura 16. El agente de captura 34 de la zona de captura 16 se une al agente marcado 29 (que no compite con ningún analito no marcado de la muestra), dando como resultado una señal óptica de intensidad máxima o casi máxima. En caso de que la muestra 24 incluya el analito 26 en una concentración baja o muy baja, también es posible detectar una señal óptica de intensidad máxima o casi máxima. Esto se debe a que la proporción de analito no marcado 26 ligado al agente de captura 34 con respecto a agente marcado 29 ligado al agente de captura 34 será baja. De este modo, puede resultar difícil determinar si la señal óptica detectada a intensidad máxima se debe correlacionar con una concentración nula o baja de analito 26 en la muestra 24.

A medida que aumenta la concentración de analito no marcado 26 en la muestra 24, disminuye la señal óptica detectada emitida desde la zona de captura 16. Esto se debe a que la competencia por el agente de captura 34 aumenta al aumentar la concentración de analito en la muestra, y la proporción de analito no marcado 26 ligado al agente de captura 34 con respecto a agente marcado 29 ligado al agente de captura 34 aumenta de forma progresiva. Sin embargo, si el analito está presente en la muestra en concentraciones altas o muy altas, la señal óptica detectada en la zona de captura 16 disminuye rápidamente hasta señales de baja magnitud. Esta rápida disminución de la intensidad de señal óptica a medida que aumenta la concentración de analito en la muestra hasta concentraciones altas y muy altas hace que resulte difícil, si no imposible, determinar con precisión la concentración de analito y, en algunos casos, hace que el dispositivo no funcione en absoluto para determinar la concentración de analito. Los dispositivos de flujo lateral de tipo competitivo, como el ilustrado en las Figuras 3A y 3B, son prácticamente incapaces de determinar con precisión la concentración precisa de analito de interés cuando el analito de interés está presente en concentraciones elevadas (por ejemplo, cuando la proporción de analito no marcado analito con respecto a agente marcado es elevada). La Figura 4 ilustra una curva de respuesta de dosis generada en un dispositivo de flujo lateral de tipo competitivo a modo de ejemplo como el descrito anteriormente con referencia a las Figuras 3A y 3B. Como se muestra en la Figura 4, la curva de respuesta de dosis de un ensayo de flujo lateral de tipo competitivo muestra una fuerte disminución de señal en las concentraciones de analito que oscilan entre 1 y 20 pg/ml. Debido a la fuerte disminución de la curva, la resolución es deficiente, lo que reduce la exactitud en la determinación de cantidades de analito a concentraciones elevadas y, en algunos casos, hace que resulte poco práctico o prácticamente imposible determinar, con cierto grado de exactitud, la cantidad de analito presente en la muestra a concentración elevada.

Ejemplos de dispositivos de flujo lateral que cuantifican con exactitud un analito presente en una muestra a concentraciones elevadas

Los ensayos de flujo lateral, sistemas de ensayo y métodos descritos en la presente memoria abordan estos y otros inconvenientes de los ensayos de flujo lateral de tipo sándwich y de tipo competitivo, como los ilustrados en las Figuras 2A, 2B, 3A y 3B. Las Figuras 5A y 5B ilustran un ejemplo de ensayo 100 de flujo lateral que puede medir con precisión una cantidad de analito de interés que está presente en una muestra en concentraciones elevadas. La Figura 5C es un ejemplo de curva de respuesta de dosis que ilustra gráficamente la señal óptica medida del ensayo 100 de flujo lateral y, específicamente, la relación entre la magnitud de señal óptica detectada en la zona de captura (medida a lo largo del eje y) y la concentración de analito en la muestra aplicada al ensayo (medido a lo largo del eje x). Se entiende que, aunque los ensayos según la presente divulgación se describen en el contexto de marcadores de tipo reflectante que generan señales ópticas, los ensayos según la presente divulgación pueden incluir marcadores de cualquier material adecuado que estén configurados para generar señales de fluorescencia, señales magnéticas, o cualquier otra señal detectable.

El ensayo 100 de flujo lateral incluye una tira de ensayo 110 que tiene una zona 112 de recepción de muestra, una zona de marcador 114 y una zona de captura 116. Las Figuras 5A y 5B ilustran el dispositivo de flujo lateral 100 antes y después de que se haya aplicado una muestra de fluido 124 a un depósito de muestra 112. En el ejemplo ilustrado, la zona de marcador 114 está aguas abajo de la zona 112 de recepción de muestra a lo largo de una dirección de flujo de muestra 118 dentro de la tira de ensayo 110. En algunos casos, la zona 112 de recepción de muestra está ubicada dentro y/o es coextensiva con la zona de marcador 114. El agente de captura 134 está inmovilizado en la zona de captura 116.

El agente marcado 128 está integrado en la zona de marcador 114. En los dispositivos de flujo lateral según la presente divulgación, tales como el ejemplo no limitante comentado con referencia a las Figuras 5A y 5B, el agente marcado 128 incluye al menos tres componentes unidos para formar un complejo: un marcador (molécula de detector) 132, un analito de interés 126 y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo 130 específico para el analito de interés 126. El agente marcado 128 es un complejo marcador-anticuerpo-analito 128. En algunos casos, el agente marcado 128 se forma y se aplica a la tira de ensayo 110 antes usar la tira de ensayo 110 por parte del operador. Por ejemplo, el agente marcado 128 se puede integrar en la zona de marcador 114 durante la preparación de la tira de ensayo 110. En otro ejemplo, el agente marcado 128 se integra en la zona de marcador 114 después de la preparación pero antes de la aplicación de la muestra de fluido a la tira de ensayo 110. El agente marcado 128 se puede integrar en la tira de ensayo 110 de varias formas que se comentan con más detalle a continuación.

Por consiguiente, en realizaciones de dispositivo de flujo lateral de la presente divulgación, se forma un complejo 128 de marcador-anticuerpo-analito y se integra en la tira de ensayo 110 antes de aplicar a cualquier muestra de fluido 124 al dispositivo de flujo lateral. En un ejemplo no limitante, el complejo 128 de marcador-anticuerpo-analito se forma e integra en la almohadilla conjugada de la tira de ensayo 110 antes de aplicar cualquier muestra de fluido 124 al dispositivo de flujo lateral. Además, en realizaciones del dispositivo de flujo lateral de la presente divulgación, el analito del complejo 128 de marcador-anticuerpo-analito no es el analito de la muestra de fluido 124.

Para llevar a cabo un ensayo utilizando la tira de ensayo 110, se deposita una muestra 124 que puede incluir o no el analito de interés 126 en la zona 112 de recepción de muestra. En la realización ilustrada, donde la zona de marcador 114 está aguas abajo de la zona 112 de recepción de muestra, el analito de interés no marcado 126 de la muestra 124 fluye a continuación a la zona de marcador 114 y entra en contacto con el agente 128 marcado integrado. La muestra 124 disuelve el agente marcado 128. En un ejemplo no limitante, la muestra 124 disuelve el agente marcado 128. Los enlaces que mantienen el agente marcado 128 en la superficie de la tira de ensayo 110 en la zona de marcador 114 se liberan, de modo que el agente marcado 128 ya no se integra en la superficie de la tira de ensayo 110. A continuación, el agente marcado 128 migra con el analito no marcado 126 de la muestra 124 a lo largo del frente de fluido a la zona de captura 116. El agente de captura 134 de la zona de captura 116 se une al agente marcado 128 y al analito 126 (si lo hubiera) de la muestra 124. Dependiendo de la cantidad de analito no marcado 126 en la muestra 124, el agente marcado 128 y el analito no marcado 126 compiten entre sí para unirse al agente de captura 134 en la zona de captura.

En consecuencia, los dispositivos de flujo lateral según la presente divulgación tienen un agente marcado que incluye un complejo de marcador-anticuerpo-analito que está ligado a una zona de marcador del dispositivo de flujo lateral en una primera fase (por ejemplo, antes de la aplicación de la muestra de fluido al dispositivo de flujo lateral), y continuación migra a través de la tira de ensayo en una segunda fase posterior (por ejemplo, tras aplicación de la muestra de fluido a la zona de recepción de muestra). Los agentes marcados según la presente divulgación se pueden unir a agentes de captura en la zona de captura en una tercera fase (por ejemplo, después de que la muestra de fluido haya fluido a la zona de captura). De este modo, los agentes marcados descritos en la presente memoria se pueden ubicar inicialmente en una primera región (tal como una zona de marcador) del dispositivo de flujo lateral, luego (al entrar en contacto con un fluido), migrar con el fluido a otras regiones del dispositivo de flujo lateral aguas abajo de la primera región, y a continuación se pueden unir a los agentes de captura en la zona de captura.

Como se ha descrito anteriormente, la muestra de fluido 124 disuelve el agente marcado 128. En una implementación, el analito de interés 126 de la muestra 124 no interactúa o no lo hace sustancialmente, con el agente marcado 128 durante este proceso. Sin estar ligado a teoría particular alguna, en la presente implementación de los dispositivos de flujo lateral descritos en la presente memoria, el analito 126 de interés no marcado no se conjuga, se une ni se asocia al agente marcado 128, a medida que la muestra 124 fluye a través de la zona de marcador 114. Esto contrasta con el dispositivo de flujo lateral tipo sándwich comentado anteriormente con referencia a las Figuras 1A y 1B, donde el agente marcado 28 se une al analito 26 de interés no marcado a medida que la muestra 24 fluye a través de la zona de marcador 14. En otra implementación de los dispositivos de flujo lateral descritos en la presente memoria, el analito de interés 126 de la muestra 124 interactúa con el agente marcado 128 cuando la muestra de fluido 124 disuelve el agente marcado 128. Sin estar ligado a teoría particular alguna, en la presente implementación, el agente de captura 134 de la zona de captura 116 se puede unir a al menos algún complejo de marcador-anticuerpo-analito donde el analito del complejo es el analito de interés 126 introducido en el dispositivo a través de la muestra 124.

Cuando no hay ningún analito de interés 126 presente en la muestra 124 (no ilustrada), el agente marcado 128 satura el agente de captura 134 en la zona de captura 116 (por ejemplo, cada molécula de agente de captura 134 de la zona de captura 135 se une a un agente marcado 128 que fluye desde la zona de la marcador 114). El agente marcado 128 capturado en la zona de captura 116 emite una señal óptica detectable que es la señal de máxima intensidad que se puede obtener a partir del dispositivo de flujo lateral 100. La señal óptica detectada en la zona de captura 116 en un escenario en el que no hay analito de interés 126 en la muestra 124 se denomina en la presente memoria "señal de intensidad máxima ", porque cada agente de captura 134 disponible en la zona de captura 116 se ha unido a un agente marcado 128. En el ejemplo no limitante ilustrado en la Figura 5C, la señal de intensidad máxima que se obtiene cuando la concentración de analito de interés es cero es de aproximadamente 76 AU (unidades de intensidad de señal arbitraria).

Hay muchos métodos para determinar la señal de intensidad máxima del dispositivo 100 de flujo lateral. En un ejemplo no limitante, la señal de intensidad máxima que se puede obtener a partir de un dispositivo 100 de flujo lateral en particular se puede determinar empíricamente y almacenar en una mesa de búsqueda. En algunos casos, la señal de intensidad máxima se determina empíricamente sometiendo a ensayo dispositivos 100 de flujo lateral de características y construcción conocidas, por ejemplo, promediando la señal de intensidad máxima obtenida cuando se aplica una muestra que tiene una concentración nula o casi nula de analito de interés a dispositivos 100 de flujo lateral de especificaciones y construcción conocidas. En otro ejemplo no limitante, se puede determinar la señal de intensidad máxima que se puede obtener a partir de un dispositivo 100 de flujo lateral en particular usando cálculos teóricos, dadas las especificaciones y construcción conocidas del dispositivo 100 de flujo lateral (tal como, por ejemplo, la cantidad y características específicas del agente marcado 128 integrado en la zona de la marcador 114).

Además, se entenderá que aunque en la presente memoria se hace referencia a "señal de intensidad máxima ", las señales que están dentro de un intervalo particular de intensidad máxima esperada se pueden considerar sustancialmente equivalentes a la "señal de intensidad máxima ". Además, se comprende que "señal de intensidad máxima" puede hacer referencia a una señal óptica de intensidad máxima, señal de fluorescencia de intensidad máxima, señal magnética de intensidad máxima o cualquier otro tipo de señal que tiene lugar a intensidad máxima. A modo de ejemplo no limitante, una señal detectada que está dentro de un 1 % de la señal de intensidad máxima esperada se considera sustancialmente equivalente a la señal de intensidad máxima esperada. Si la señal de intensidad máxima es de 76 AU o aproximadamente, la señal detectada dentro de un intervalo de aproximadamente 75,24 AU a aproximadamente 76,76 AU se considera sustancialmente equivalente a la señal de intensidad máxima de 76 AU. A modo de otro ejemplo, en la realización no limitante descrita con referencia a las Figuras 5C, 6A y 6B, la señal detectada que está dentro de un 10 % de la señal de intensidad máxima esperada se considera sustancialmente equivalente a la señal de intensidad máxima esperada. De este modo, en el ejemplo ilustrado en la Figura 5C, donde la señal de intensidad máxima es de aproximadamente 76 AU, una señal detectada dentro del intervalo de aproximadamente 68,4 AU a aproximadamente 83,6 AU se considera sustancialmente equivalente a la señal de intensidad máxima de 76 AU. Estos ejemplos se proporcionan únicamente con fines ilustrativos, ya que se pueden aceptar otras variaciones. Por ejemplo, en un dispositivo de ensayo de flujo lateral según la presente divulgación, una señal detectada que esté dentro de cualquier intervalo apropiado de variación de señal de intensidad máxima esperada (tal como, entre otros, dentro de un 1,1 %, 1,2 %, 1,3 %, 1,4 % , 1,5 %, 2,0 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 %, 4,5 %, 5 %, 5,5 %, 6 %, 6,5 %, 7 %, 7,5 %, 8 %, 8,5 %, 9 %, 9,5 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 % de la señal de intensidad máxima esperada) se puede considerar sustancialmente equivalente a la señal de intensidad máxima esperada.

En un escenario como el ilustrado en las Figuras 5A y 5B donde el analito de interés 126 está presente en la muestra 124, el agente marcado 128 de la zona de marcador 114 y el analito 126 de la muestra fluyen a la zona de captura 116 donde compiten para unirse con el agente de captura 134. En un ejemplo, el analito de interés 126 está presente en la muestra 124 a concentración baja. Se puede considerar que un analito de interés 126 está presente en la muestra 124 a baja concentración cuando la señal óptica detectada en la zona de captura 116 es la misma, sustancialmente la misma y/o está dentro de un intervalo particular de variación de la señal de intensidad máxima. En un ejemplo no limitante, se considera que el analito de interés 126 está presente en la muestra a bajas concentraciones cuando la señal óptica detectada está dentro de un 5 % de 76 AU (o dentro de aproximadamente 72,2 AU a aproximadamente 79,8 AU). Las señales ópticas dentro de un 5 % de 76 AU se correlacionan con concentraciones del analito de interés entre 0 y aproximadamente 1 pg/ml, de modo que las concentraciones entre 0 y aproximadamente 1 pg/ml se consideran concentraciones bajas de analito de interés en el presente ejemplo. En el ejemplo no limitante ilustrado en la Figura 5C, se considera que el analito de interés 126 está presente en la muestra a bajas concentraciones cuando la señal óptica detectada está dentro de un 10 % de 76 AU (o dentro de aproximadamente 68,4 AU a aproximadamente 83,6 AU). Las señales ópticas dentro de un 10 % de 76 AU se correlacionan con concentraciones del analito de interés entre 0 y aproximadamente 10 pg/ml, de modo que las concentraciones entre 0 y aproximadamente 10 pg/ml se consideran concentraciones bajas de analito de interés en el presente ejemplo. En tales casos de baja concentración donde hay relativamente poco analito de interés 126 en la muestra 124, la proporción de analito de interés 126 de la muestra 124 que se une al agente de captura con respecto al agente marcado 128 que se une al agente de captura es baja. En tales casos de baja concentración, la señal óptica detectada en la zona de captura 116 será igual o ligeramente inferior a la señal de intensidad máxima que se habría detectado si no hubiera analito de interés 126 en la muestra 124.

A medida que la concentración de analito 126 en la muestra 124 aumenta de aproximadamente 1 pg/ml a 10 pg/ml y luego a 20 pg/ml y concentraciones mayores, más analito 126 está presente en la zona de captura 116 para competir con el agente marcado 128 para unirse al agente de captura 134. Esto tiene como resultado que menos agente marcado 128 se una a la zona de captura 134 a medida que aumenta la concentración de analito 126, y la señal óptica detectada en la zona de captura 116 disminuye.

Como se ilustra en la Figura 5C, la disminución de señal a medida que aumenta la concentración de analito de interés es ventajosamente gradual en realizaciones de dispositivos de flujo lateral según la presente divulgación. Como resultado de esta disminución gradual de la señal detectada, las realizaciones de dispositivos de flujo lateral descritas en la presente memoria permiten ventajosamente que un detector mida con precisión la señal con alta resolución y un analizador de datos determine, con alta precisión, la concentración de analito de interés cuando la concentración es elevada. Esto contrasta con los dispositivos de flujo lateral de tipo competitivo descritos anteriormente con referencia a las Figuras 3A, 3B y 4.

Además, la curva de respuesta de dosis de los dispositivos de flujo lateral según la presente divulgación comienza de manera ventajosa en una señal de intensidad máxima y luego disminuye a partir de esta señal de intensidad máxima. Esto significa que, de manera ventajosa, ninguna señal en la parte de la curva de respuesta de dosis donde la señal está disminuyendo tendrá una magnitud que sea igual a la señal de intensidad máxima. Además, debido a que, cuando la concentración de analito en la muestra es baja, la señal será la misma o efectivamente la misma que la señal de intensidad máxima (por ejemplo, se consideran sustancialmente equivalentes a las señales de intensidad máxima descritas anteriormente), hay una meseta de señales ópticas a un valor relativamente constante ("señal de intensidad máxima") para concentraciones de analito de cero a bajas (como se discute con detalle a continuación con referencia a ejemplos no limitantes). Esto significa que, de manera ventajosa, ninguna señal en la parte de la curva de respuesta de dosis donde la señal está disminuyendo tendrá una magnitud que sea aproximadamente la misma que la señal de intensidad máxima. De este modo se evitan los falsos negativos y las lecturas bajas imprecisas en las realizaciones de los dispositivos de flujo lateral descritos en la presente memoria. Esto contrasta con el dispositivo de flujo lateral de tipo sándwich analizado anteriormente con referencia a la Figura 1A, 1B y 2, en el que una alta concentración de analito en la muestra genera una señal que es igual o aproximadamente igual a la señal generada cuando la concentración de analito es baja.

De manera ventajosa, en realizaciones de dispositivos de flujo lateral descritos en la presente memoria, el agente marcado 128 se puede preformular para incluir una cantidad conocida de analito de interés antes de la deposición en la almohadilla de conjugado. En algunas realizaciones, el analito de interés de concentración conocida se incuba con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y moléculas de marcador en un recipiente de reacción que está separado de la tira de ensayo. Durante la incubación, el analito de interés se conjuga, se une o se asocia al anticuerpo y las moléculas de marcador para formar un agente marcado 128 como se ha descrito con anterioridad. Después de la incubación, el agente marcado 128 se añade directamente a una disolución a una concentración conocida precisa o se aísla para eliminar el exceso de PCR libre antes de pulverizarlo sobre la almohadilla de conjugado. La disolución que incluye el agente marcado 128 se aplica a la tira de ensayo, tal como en la zona de la marcador 114 descrita con anterioridad. Durante la deposición, el agente marcado 128 se integra en la superficie de la tira de ensayo. En un ejemplo no limitante, el agente marcado se integra en la almohadilla de conjugado de la tira de ensayo. De manera ventajosa, el agente marcado 128 puede permanecer unido física y químicamente estable en la superficie de la tira de ensayo hasta que un operador aplique una muestra de fluido a la tira de ensayo, después de lo cual el agente marcado 128 se despega de la tira de ensayo y fluye con la muestra de fluido como se ha descrito con anterioridad.

En algunas realizaciones, el agente marcado 128 se deposita en una cantidad que varía entre aproximadamente 0,1 20 pl/tira de ensayo. En algunas realizaciones, el agente marcado 128 se deposita en una cantidad de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 pl/tira de ensayo en la zona de marcador.

La disolución que incluye el agente marcado 128 se puede aplicar a la tira de ensayo de muchas maneras diferentes. En un ejemplo, la disolución se aplica a la zona de marcador 114 pulverizando la disolución con técnicas de chorro de aire. En otro ejemplo, la disolución que incluye el agente marcado 128 se deposita vertiendo la disolución, pulverizando la disolución, formulando la disolución en forma de polvo o gel que se coloca o frota sobre la tira de ensayo, o cualquier otro método adecuado para aplicar el agente marcado 128 aislado. En algunas realizaciones, después de la deposición, el agente marcado 128 se seca sobre la superficie de la tira de ensayo por medio de calentamiento o insuflado de aire sobre la almohadilla de conjugado. Otros mecanismos para secar el agente marcado 128 sobre la superficie de la tira de ensayo resultan apropiados. Por ejemplo, también se puede usar vacío o liofilización para secar el agente marcado 128 sobre la almohadilla de conjugado. En algunos casos, el agente marcado 128 aislado no se añade a la disolución antes de la deposición y, en su lugar, se aplica directamente a la tira de ensayo. El agente marcado 128 se puede aplicar directamente utilizando cualquier método adecuado, que incluye, entre otros, aplicar presión de compresión o vacío al agente marcado 128 sobre la superficie de la tira de ensayo y/o aplicar el agente marcado 128 en forma de partículas liofilizadas a la superficie de la tira de ensayo.

Las realizaciones del ensayo de flujo lateral ilustradas en las Figuras 5A y 5B no precisan incluir una línea o zona de control configurada para confirmar que la muestra aplicada a la zona 112 de recepción de muestra haya fluido a la zona de captura 116 según lo previsto. En condiciones de funcionamiento normales, siempre se emitirá alguna señal detectable desde la zona de captura 116 si la muestra ha fluido a la zona de captura 116. Este será el caso incluso si el analito de interés está presente en la muestra en concentraciones extremadamente bajas, porque los dispositivos de flujo lateral de la presente divulgación tienen una curva de respuesta de dosis que permanece en una señal de intensidad máxima o cerca de ella para concentraciones bajas. Por tanto, la ausencia de cualquier señal detectable en la zona de captura 116 después de que la muestra se haya aplicado a la zona 112 de recepción de muestra se puede usar como indicativo de que el ensayo de flujo lateral no funcionó según lo previsto (por ejemplo, la muestra no fluyó a la zona de captura 116 según lo previsto o, a modo de otro ejemplo, los agentes de captura 134 inmovilizados en la zona de captura son defectuosos o presentan fallo). Por consiguiente, otra ventaja de las realizaciones de dispositivos de flujo lateral según la presente divulgación es la capacidad de la zona de captura para funcionar como una línea de control, permitiendo así que se omita una línea de control separada de la tira de ensayo. Sin embargo, se entiende que se podría incluir una línea de control en las realizaciones de los dispositivos de flujo lateral descritos en la presente memoria para una diversidad de propósitos, que incluyen, entre otros, una línea de visualización, para normalizar el ruido o para detectar la interferencia de los analitos en el suero.

En algunos casos, los ensayos de flujo lateral según la presente divulgación incluyen una línea de control, tal como una línea de control similar a la línea de control 18 descrita anteriormente con referencia a las Figuras 1A y 1B. En una realización (no ilustrada), el ensayo de flujo lateral incluye una línea de control que incluye un reactivo de captura que emite una señal cuya intensidad es independiente de la intensidad de la señal generada por el agente marcado 128 en la zona de captura 116. En una implementación, el ensayo de flujo lateral incluye una pluralidad de zonas de captura (incluyendo al menos una zona de captura 116 configurada para capturar un agente marcado 128 según la presente divulgación), estando configurada cada zona de captura para indicar la presencia, ausencia y/o concentración de un analito de interés diferente, y una sola línea de control configurada para indicar que la muestra fluyó a través de la pluralidad de zonas de captura según lo previsto. En contraste con la línea de control 18 descrita anteriormente con referencia a las Figuras 1A y 1B, la intensidad de la señal que emana de la línea de control en la presente implementación puede no estar relacionada o depender de la intensidad de la señal que emana de cualquiera de las zonas de captura. Las realizaciones que incluyen una línea de control también pueden resultar ventajosas en los casos en que la zona de captura 116 emite una señal de intensidad relativamente débil cuando el analito de interés está presente en la muestra en una concentración extremadamente elevada. En tales casos, la señal que emana de la zona de captura 116 puede tener una intensidad insuficiente para confirmar que el ensayo funcionó según lo previsto (por ejemplo, que la muestra fluyó a través de la zona de captura 116 según lo previsto).

Además, los ensayos de multiplex que evalúan la presencia, ausencia y/o cantidad de una pluralidad de diferentes analitos de interés pueden incluir un ensayo de flujo lateral de acuerdo con la presente divulgación (como se ha descrito anteriormente con referencia a las Figuras 5A y 5B) sobre la misma tira de ensayo como uno o más ensayos de flujo lateral de tipo sándwich como se ha descrito anteriormente con referencia a la Figura 1A y 1B. En dichos ensayos de multiplex, aunque no se necesita una línea de control para el ensayo de flujo lateral de acuerdo con la presente divulgación, aún se puede incluir de manera ventajosa una línea de control en la tira de ensayo para confirmar que la muestra ha fluido a través de la zona de control asociada al ensayo de flujo lateral de tipo sándwich. Esta opción de incluir una línea de control para un ensayo y omitir una línea de control para un ensayo según la presente divulgación puede resultar particularmente beneficiosa en ensayos de multiplex donde hay un número limitado de líneas o zonas que se pueden colocar en la tira de ensayo.

Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran las características de los dispositivos de flujo lateral, sistemas de ensayo y métodos descritos en la presente memoria, y de ninguna manera pretenden limitar el alcance de la presente divulgación.

Ejemplo 1

Preparación de un ensayo de flujo lateral para cuantificar una concentración de proteína elevada

El siguiente ejemplo describe la preparación de un ensayo de flujo lateral para cuantificar un analito de interés como se describe en la presente memoria. En el presente ejemplo no limitante, el analito de interés es una proteína, proteína C reactiva (CRP), presente en una muestra de suero en concentración alta o elevada.

PCR es una proteína que se encuentra en el plasma sanguíneo. Los niveles de PCR aumentan en respuesta a la inflamación. PCR es, por tanto, un marcador de inflamación que se puede usar para detectar inflamación. Los niveles elevados de PCR en el suero de una persona se pueden correlacionar con inflamación, infección vírica y/o infección bacteriana. Los niveles normales de PCR en personas sanas oscilan entre aproximadamente 1 pg/ml y aproximadamente 10 pg/ml. Las concentraciones de PCR durante una inflamación moderada e infección vírica oscilan entre 10-40 pg/ml; durante inflamación activa e infección bacteriana de 40-200 pg/ml; y en infecciones bacterianas raves y casos de quemaduras superiores de 200 pg/ml. La medición y representación gráfica de los niveles de PCR pueden resultar útiles para determinar la evolución de la enfermedad o la eficacia de los tratamientos.

Se puede utilizar el ensayo preparado según el presente ejemplo no limitante para determinar la concentración precisa de PCR (el analito de interés) en una muestra de suero incluso cuando la concentración está por encima de los niveles normales de PCR en personas sanas (de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml). El ensayo incluye un agente marcado que incluye un complejo anticuerpo-marcador-PCR que evita diversos inconvenientes de los ensayos de flujo lateral de tipo sándwich, incluidos los inconvenientes asociados al efecto de gancho.

Para preparar el ensayo, se incubó el anticuerpo anti-proteína C reactiva (anti-PCR) con nanopartículas de oro para formar un anticuerpo anti-PCR marcado. El anticuerpo marcado se incubó con PCR para formar un complejo de anticuerpo marcado unido a PCR. El complejo se depositó en una cantidad de 1,8 pl/tira de ensayo sobre una almohadilla de conjugado (zona de marcador) mediante pulverización de una disolución que incluía el complejo con chorro de aire. La almohadilla de conjugado se calentó para secar el complejo en la almohadilla de conjugado.

Se consideró atentamente la cantidad de complejo anticuerpo-marcador-PCR depositada en la almohadilla de conjugado con el fin de garantizar una cantidad necesaria de complejo, con vistas a proporcionar un intervalo óptimo de señales ópticas en la zona de captura que permitiese al sistema de ensayo cuantificar niveles elevados de PCR. La deposición de una cantidad excesiva de complejo sobre la almohadilla de conjugado cambia la curva de respuesta de dosis, de modo que la concentración cuantificable de PCR es excesivamente alta (generando potencialmente señales ópticas para concentraciones muy altas de PCR (en caso de estar presente) pero sin generar señales ópticas para concentraciones de moderadas a elevadas). La deposición de una cantidad insuficiente de complejo sobre la almohadilla de conjugado cambia la curva de respuesta de dosis en la otra dirección, dando como resultado señales que pueden no permitir la cuantificación de concentraciones de PCR muy elevadas. La Tabla 1 muestra los resultados de los experimentos para determinar una cantidad óptima de complejo de anticuerpo-marcador-PCR para deposición sobre la almohadilla de conjugado. La cantidad de complejo marcador-anticuerpo-analito preformado depositada sobre la almohadilla de conjugado puede variar para adaptarse a los requisitos de diferentes intervalos de concentración de analito.

Tabla 1: Intensidad de la señal óptica para diversas cantidades de complejo anticuerpo-marcador-CRP en la almohadilla de conjugado

En el presente ejemplo, la cantidad óptima de complejo anticuerpo-marcador-PCR para añadir a la almohadilla de conjugado tiene como resultado 50 ng de PCR depositados sobre la almohadilla de conjugado, lo que corresponde a una señal de 70,06 AU. Con esta cantidad, la proporción de PCR no marcado en la muestra al complejo de anticuerpomarcador-PCR a medida que compiten para unirse al agente de captura en la zona de captura genera una fuerte señal óptica en un intervalo óptimo de concentraciones de PCR no marcada, lo que permite una adecuada la resolución de la señal y la cuantificación exacta de la concentración elevada de PCR en la muestra. De manera ventajosa, la deposición de 50 ng de PCR en la almohadilla de conjugado (mediante la deposición de una cantidad apropiada de complejo anticuerpo-marcador-PCR sobre la almohadilla de conjugado) tiene como resultado una proporción de PCR no marcada con respecto a agente marcado (complejo de anticuerpo-marcador-PCR) que estaría en la parte de la curva de respuesta de dosis de ensayo de tipo sándwich que tiene señales ópticas decrecientes (por ejemplo, en la Fase B de la Figura 2). Esta proporción de PCR no marcada con respecto a agente marcado (complejo de anticuerpomarcador-PCR) también permite que el ensayo de flujo lateral del presente ejemplo enmascare la parte de la curva de respuesta de dosis del ensayo de tipo sándwich que tiene señales ópticas crecientes (por ejemplo, en la Fase A de Figura 2). Sin estar ligado a teoría particular alguna, se cree que las realizaciones del ensayo de flujo lateral del presente ejemplo enmascaran de manera eficaz la parte creciente de señal óptica de un ensayo de flujo lateral de tipo sándwich añadiendo una cantidad optimizada de PCR (en el presente ejemplo, 50 ng) a la almohadilla de conjugado, utilizando únicamente partes de la curva de respuesta de dosis que exhiben una intensidad de señal decreciente (la parte de la curva que exhibe el "efecto de gancho") y, de este modo, evitando las desventajas descritas anteriormente con referencia a las Figuras 1A, 1B y 2.

En el presente ejemplo, el anticuerpo anti-PCR se depositó en la zona de captura en una cantidad de 2 mg/ml. Se depositó anticuerpo de cabra anti-ratón en una zona de control en una cantidad de 2 mg/ml.

Ejemplo 2

Cuantificación de proteína C reactiva de concentración elevada mediante ensayo de flujo lateral

Debido al efecto de gancho, los ensayos de flujo lateral de tipo sándwich, como los descritos anteriormente con referencia a las Figuras 1A y 1B, generalmente no resultan apropiados para cuantificar la concentración de PCR cuando está presente en niveles elevados en una muestra. Para determinar concentraciones elevadas, anteriormente se requerían diluciones en serie de la muestra, lo que daba como resultado un proceso ineficiente y laborioso. Sin embargo, utilizando dispositivos de flujo lateral, sistemas de ensayo y métodos descritos en la presente memoria, las concentraciones de PCR por encima de los niveles saludables se pueden cuantificar de manera precisa, fiable y rápida.

Los ensayos de flujo lateral preparados en el Ejemplo 1 se pusieron en contacto con una muestra que incluía diversas concentraciones de PCR, como se muestra en la última columna de la Tabla 2 siguiente. En el presente ejemplo, la cantidad de complejo anticuerpo-marcador-PCR añadida a la almohadilla de conjugado tuvo como resultado 100 ng de PCR depositados sobre la almohadilla de conjugado. Los ensayos de flujo lateral de tipo sándwich, tal como los descritos anteriormente con referencia a las Figuras 1A y 1B, se pusieron en contacto con muestras idénticas, como se muestra en la columna central de la Tabla 2. Como se ha descrito anteriormente, los ensayos de flujo lateral tipo sándwich a los que se hace referencia en la columna central únicamente incluyeron un anticuerpo marcado depositado sobre la almohadilla de conjugado (sin PCR depositada en la almohadilla de conjugado a través de un complejo anticuerpo-marca-PCR). Las muestras de fluido se prepararon añadiendo las cantidades de PCR que se muestran en la primera columna de la Tabla 2 en 30 pl de suero humano. La muestra se recibió en el ensayo de flujo lateral y, después de 15 segundos, se trató con 45 pl de tampón de HEPES. Después de diez minutos, se midió la señal óptica. Todas las muestras se analizaron por sextuplicado y los valores promedio se presentan en la Tabla 2. La Figura 6A ilustra las curvas de respuesta de dosis resultantes para el ensayo de flujo lateral con anticuerpo marcado depositado sobre la almohadilla de conjugado (línea continua con rombos) y el ensayo de flujo lateral con complejo anticuerpomarcador-PCR depositado sobre la almohadilla de conjugado (línea discontinua con cuadrados), en las que la concentración de analito se mide a lo largo del eje x en escala logarítmica. La Figura 6B ilustra la curva de respuesta de dosis a modo de ejemplo de la Figura 6A para el ensayo de flujo lateral con complejo anticuerpo-marcador-PCR, en la que la concentración de analito se mide a lo largo del eje x en una escala no logarítmica.

Tabla 2: Comparación del ensayo de flujo lateral de tipo sándwich tradicional y el ensayo de flujo lateral de la presente divulgación

La Figura 6A destaca diferencias significativas entre un ensayo de flujo lateral de tipo sándwich que incluye el efecto de gancho y los ensayos de flujo lateral según la presente divulgación. En el ensayo de flujo lateral de tipo sándwich que incluye el efecto de gancho, las concentraciones de PCR superiores a 10 pg/ml (1,00 en escala logarítmica) generan señales ópticas que tienen la misma intensidad que las concentraciones de PCR menores que 10 pg/ml. Por el contrario, el ensayo de flujo lateral según la presente divulgación permite determinar con precisión la concentración de PCR en concentraciones mayores que 10 pg/ml. Esto resulta particularmente ventajoso en el presente ejemplo en el que el analito de interés es PCR, que se eleva a concentraciones mayores que 10 pg/ml cuando están presentes condiciones de inflamación o enfermedad. Las realizaciones de los ensayos de flujo lateral descritos en la presente memoria permiten al usuario determinar con confianza que la concentración de PCR en el sujeto bajo ensayo está por encima de los niveles normales. Cuando se lleva a cabo un ensayo según la presente divulgación e indica una concentración de PCR mayor que los niveles saludables (por ejemplo, mayor que 10 pg/ml), esta información se puede correlacionar con una condición de inflamación, infección vírica y/o bacteriana.

Además, la capacidad de señalar con precisión la concentración precisa de PCR en el sujeto bajo ensayo puede permitir que el resultado de ensayo se correlacione con un tipo específico de condición de enfermedad. Por ejemplo, una concentración entre 10 pg/ml y 20 pg/ml se puede correlacionar con una inflamación leve, mientras que una concentración entre 40 pg/ml y 200 pg/ml se puede correlacionar con una infección bacteriana. Además, la capacidad para identificar con precisión la concentración precisa de PCR en el sujeto bajo ensayo puede permitir que el resultado de ensayo se correlacione con una etapa de la enfermedad. Por ejemplo, una concentración entre 40 pg/ml y 200 pg/ml se puede correlacionar con una infección bacteriana leve, mientras que una concentración mayor que 200 pg/ml se puede correlacionar con una infección bacteriana grave. Estos ejemplos son ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente divulgación.

Los dispositivos, sistemas y métodos de ensayo de flujo lateral divulgados en la presente memoria proporcionan ventajas adicionales. Por ejemplo, el ensayo de flujo lateral según la presente divulgación es capaz de cuantificar de forma fiable un analito en una muestra utilizando partes de la curva de respuesta de dosis que muestran el efecto de gancho. Como se ilustra en la Figura 6A, las concentraciones de PCR en niveles saludables o por debajo de ellos (aproximadamente 10 pg/ml o menos) tienen como resultado una señal que es o está dentro de un 10 % de una intensidad máxima de 76 AU (de 76,20 AU a 70,29 AU). De este modo, muestras de baja concentración generan una meseta de señales a valores relativamente constantes (en el presente caso, señales dentro de un 10 % de señal de intensidad máxima de 76 AU). En las realizaciones del ensayo de flujo lateral según la presente divulgación, esta superposición de señales ópticas para las concentraciones de PCR en concentraciones bajas no representa un inconveniente porque las concentraciones bajas de PCR siempre están presentes en sujetos sanos y no es necesario que el ensayo sea sensible a las concentraciones de PCR en niveles bajos.

En lugar de ello, el ensayo de flujo lateral de la presente divulgación es, de manera ventajosa, particularmente sensible al analito de interés presente en altas concentraciones. Las concentraciones elevadas de analito generan señales que no están en la meseta o cerca de ella, en este caso, señales que son menores que aproximadamente 70 AU. El ensayo de flujo lateral genera señales que disminuyen gradualmente cuando la concentración de PCR está por encima de los niveles saludables (mayor que 10 pg/ml), donde las señales son fácilmente detectables (intensidad de señal discernible y bien espaciadas) y no se superponen con otras señales en la curva de respuesta de dosis. Esto elimina la incertidumbre de determinar una cantidad de analito en una señal detectada particular, tal como en los ensayos de flujo lateral de tipo sándwich que generan un valor de señal que puede corresponder a más de una cantidad de analito debido al efecto de gancho. En tales circunstancias, el usuario no puede determinar si la concentración del analito es alta o baja, lo que genera incertidumbre con fines de diagnóstico. Por el contrario, el ensayo de flujo lateral según la presente divulgación genera una señal que corresponde, de manera clara y sin ambigüedades, a una concentración de analito nula o baja (señal en o sustancialmente equivalente a la señal de intensidad máxima) o una concentración elevada de analito (señal inferior a la señal de intensidad máxima), que posteriormente se puede correlacionar directamente con un nivel normal de analito (concentración de analito nula o baja) o un nivel de analito no normal (concentración de analito elevada).

Además, los dispositivos de flujo lateral descritos en la presente memoria cuantifican concentraciones elevadas de analito en una muestra en un ensayo individual, sin necesidad de diluir la muestra. Los ensayos tales como los descritos con referencia a las Figuras 1A, 1B, 3A y 3B, por el contrario, requieren la dilución de muestras que incluyen concentraciones elevadas de analito; de lo contrario, las señales de la parte de concentración elevada de la curva de respuesta de dosis resultan indistinguibles. El ensayo de flujo lateral de la presente divulgación es capaz de determinar incluso diferencias diminutas en la concentración elevada de analito, en base a una única señal obtenida en la zona de captura después de un ensayo.

Ejemplo 3

La concentración de PCR medida usando ensayos de flujo lateral según la presente divulgación está altamente correlacionada con los ensayos ELISA

Además, las realizaciones de ensayo de flujo lateral según la presente divulgación se correlacionan fuertemente con los ensayos convencionales de oro reales para determinar la cantidad de analito de una muestra, tal como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). De manera ventajosa, se ha descubierto que la concentración de PCR determinada por las realizaciones de los ensayos de flujo lateral descritos en la presente memoria se correlaciona fuertemente con la concentración de PCR determinada por ELISA. La Figura 7A es una tabla que resume la concentración de PCR en diversas muestras de suero medidas usando ensayos de flujo lateral según la presente divulgación y la concentración de PCR en las mismas muestras de suero medidas usando ELISA. La Figura 7B es un diagrama que correlaciona las concentraciones de PCR obtenidas según la presente divulgación y las concentraciones de PCR medidas por ELISA. Como se ilustra en la Figura 7B, se obtuvo una correlación de un 93 % entre la concentración de PCR medida utilizando realizaciones de ensayos según la presente descripción y la concentración de PCR determinada por ELISA.

Métodos de diagnóstico de una afección usando ensayos de flujo lateral según la presente divulgación

Algunas realizaciones proporcionadas en la presente memoria hacen referencia a métodos de uso de ensayos de flujo lateral para diagnosticar una afección médica. En algunas realizaciones, el método incluye proporcionar un ensayo de flujo lateral como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, el método incluye recibir una muestra en un depósito de muestra del ensayo de flujo lateral.

En algunas realizaciones, la muestra se obtiene a partir de una fuente, incluida una fuente ambiental o biológica. En algunas realizaciones, se sospecha que la muestra tiene un analito de interés. En algunas realizaciones, no se sospecha que la muestra tenga un analito de interés. En algunas realizaciones, se obtiene y analiza una muestra para verificar la ausencia o presencia de un analito. En algunas realizaciones, se obtiene una muestra y se analiza la cantidad de analito de la muestra. En algunas realizaciones, la cantidad de analito de la muestra es menor que un valor normal presente en sujetos sanos, igual o aproximadamente un valor normal presente en sujetos sanos, o por encima de un valor normal presente en sujetos sanos.

En algunas realizaciones, la recepción de la muestra en el depósito de muestra del ensayo de flujo lateral incluye poner en contacto una muestra con un ensayo de flujo lateral. La muestra puede entrar en contacto con un ensayo de flujo lateral introduciéndola en un depósito de muestra mediante aplicación externa, tal como con un cuentagotas u otro aplicador. En algunas realizaciones, el depósito de muestra se puede sumergir directamente en la muestra, tal como cuando se sumerge una tira de ensayo en un recipiente que contiene la muestra. En algunas realizaciones, la muestra se puede verter, gotear, pulverizar, colocar o poner en contacto de otro modo con el depósito de muestra.

En las realizaciones de la presente divulgación un agente marcado incluye un anticuerpo, un marcador y un analito de interés y se puede depositar sobre una almohadilla de conjugado (o zona de marcador) dentro o aguas abajo del depósito de muestra. El agente marcado se puede integrar en la almohadilla de conjugado mediante enlaces físicos o químicos. La muestra disuelve el agente marcado después de añadir la muestra al depósito de muestra, lo que libera los enlaces que sujetan el agente marcado a la almohadilla de conjugado. La muestra, incluido el analito (en caso de estar presente) y el agente marcado fluyen a lo largo del frente de fluido a través del ensayo de flujo lateral hasta la zona de captura. El agente de captura inmovilizado en la zona de captura se une al analito (en caso de estar presente) y al agente marcado. Cuando el agente marcado se une al agente de captura en la zona de captura, se detecta una señal procedente del marcador. La señal puede incluir una señal óptica como se describe en la presente memoria. Cuando hay bajas concentraciones de analito en la muestra (tal como niveles iguales o menores que los niveles saludables), se detecta una señal de máxima intensidad en la zona de captura. A concentraciones elevadas de analito (tal como niveles mayores que los valores saludables), la intensidad de la señal detectada disminuye en una cantidad proporcional a la cantidad de analito de la muestra. La señal detectada se compara con los valores de una curva de respuesta de dosis para el analito de interés y se determina la concentración del analito en la muestra.

En algunas realizaciones, el analito está presente en concentraciones elevadas. Las concentraciones elevadas de analito pueden hacer referencia a una concentración de analito que está por encima de los niveles saludables. De este modo, la concentración elevada de analito puede incluir una concentración de analito de un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 125 %, 150 %, 200 % o mayor que un nivel saludable. En algunas realizaciones, el analito de interés incluye proteína C reactiva (PCR), que está presente en el suero sanguíneo de individuos sanos en una cantidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 gg/ml. De este modo, las concentraciones elevadas de PCR en la muestra incluyen una cantidad de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 gg/ml o más. El nivel en el que el analito de interés se considera elevado puede diferir según el analito de interés específico.

En algunas realizaciones, tras la determinación de que el analito está presente en la muestra en concentraciones elevadas, se diagnostica una determinada enfermedad al sujeto. En algunas realizaciones, el diagnóstico de la infección tiene lugar cuando se determina que la concentración de PCR es 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 gg/ml o más. En algunas realizaciones, la determinación de que la concentración es mayor que 200 gg/ml, por ejemplo, 400-500 gg/ml, tiene como resultado un diagnóstico de infección bacteriana grave.

Ejemplos de sistemas de ensayo que incluyen ensayos de flujo lateral según la presente divulgación

Los sistemas de ensayo de flujo lateral descritos en la presente memoria pueden incluir un dispositivo de ensayo de flujo lateral (tal como, entre otros, una tira de ensayo), una carcasa que incluye un puerto configurado para recibir parte o la totalidad del dispositivo de ensayo, un lector que incluye una fuente de luz y un detector de luz, un analizador de datos y combinaciones de los mismos. La carcasa puede estar formada por uno cualquiera de una amplia diversidad de materiales, incluidos plástico, metal o materiales de composite. La carcasa forma un recinto protector para los componentes del sistema de ensayo de diagnóstico. El alojamiento también define un receptáculo que registra mecánicamente la tira de ensayo con respecto al lector. El receptáculo se puede diseñar para albergar uno cualquiera de una amplia diversidad de diferentes tipos de tiras de ensayo. En algunas realizaciones, la carcasa es un dispositivo portátil que permite la capacidad de llevar a cabo un ensayo de flujo lateral en una diversidad de entornos, incluso en el banco, en el campo, en el hogar o en una instalación para uso doméstico, comercial o aplicaciones ambientales.

El lector puede incluir uno o más componentes optoelectrónicos para inspeccionar ópticamente las áreas expuestas de la zona de captura de la tira de ensayo. En algunas implementaciones, el lector incluye al menos una fuente de luz y al menos un detector de luz. En algunas realizaciones, la fuente de luz puede incluir un diodo emisor de luz semiconductor y el detector de luz puede incluir un fotodiodo semiconductor. Dependiendo de la naturaleza del marcador que utilice la tira de ensayo, la fuente de luz puede estar diseñada para emitir luz dentro de un intervalo particular de longitud de onda o luz con una polarización particular. Por ejemplo, si el marcador es un marcador fluorescente, tal como un punto cuántico, la fuente de luz está diseñada para iluminar las áreas expuestas de la zona de captura de la tira de ensayo con luz en un intervalo de longitud de onda que induce la emisión fluorescente a partir del marcador. De manera similar, el detector de luz puede estar diseñado para capturar selectivamente la luz procedente de las áreas expuestas de la zona de captura. Por ejemplo, si el marcador es un marcador fluorescente, el detector de luz está diseñado para capturar selectivamente la luz dentro de un intervalo de longitud de onda de la luz fluorescente emitida por el marcador o con luz procedente de una polarización particular. Por otro lado, si el marcador es un marcador de tipo reflectante, el detector de luz está diseñado para capturar selectivamente la luz dentro de un intervalo de longitud de onda de la luz emitida por la fuente de luz. Para estos fines, el detector de luz puede incluir uno o más filtros ópticos que definen los intervalos de longitud de onda o ejes de polarización de la luz captada. Se puede analizar la señal del marcador mediante observación visual o un espectrofotómetro para detectar el color procedente de un sustrato cromogénico; un contador de radiación para detectar radiación, tal como un contador gamma para la detección de 125I; o un fluorómetro para detectar fluorescencia en presencia de luz de una determinada longitud de onda. Cuando se usa un ensayo ligado a enzimas, se puede realizar un análisis cuantitativo de la cantidad de analito de interés usando un espectrofotómetro. Los ensayos de flujo lateral descritos en la presente memoria se pueden automatizar o realizar de forma robótica, si se desea, y la señal procedente de múltiples muestras se puede detectar de forma simultánea. Además, se pueden detectar múltiples señales en un ensayo de tipo de multiplex, en el que se detecta, identifica o cuantifica más de un analito de interés.

El ensayo de multiplex puede incluir, por ejemplo, un ensayo diferencial vírico. Por ejemplo, el ensayo de flujo lateral de multiplex como se describe en la presente memoria puede detectar si una o varias proteínas víricas están presentes en la muestra de un sujeto que padece una infección vírica o sospechoso de padecer una infección vírica (por ejemplo, que presenta síntomas similares a los de gripe). En algunas realizaciones, el ensayo de flujo lateral de multiplex para este propósito es capaz de detectar concentraciones elevadas de PCR y concentraciones bajas de TRAIL e IP-10.

El analizador de datos procesa las mediciones de señal que obtiene el lector. En general, el analizador de datos se puede implementar en cualquier entorno informático o de procesado, incluso en circuitos electrónicos digitales o en hardware, firmware o software informático. En algunas realizaciones, el analizador de datos incluye un procesador (por ejemplo, un microcontrolador, un microprocesador o ASIC) y un convertidor de analógico a digital. El analizador de datos se puede incorporar dentro de la carcasa del sistema de ensayo de diagnóstico. En otras realizaciones, el analizador de datos está ubicado en un dispositivo separado, tal como un ordenador, que se puede comunicar con el sistema de ensayo de diagnóstico a través de una conexión por cable o inalámbrica. El analizador de datos también puede incluir circuitos para la transferencia de resultados a través de una conexión inalámbrica a una fuente externa para el análisis de datos o revisión de resultados.

En general, el indicador de resultados puede incluir uno cualquiera de una amplia diversidad de mecanismos diferentes para indicar uno o más resultados de un ensayo. En algunas implementaciones, el indicador de resultados incluye una o más luces (por ejemplo, diodos emisores de luz) que se activan para indicar, por ejemplo, la finalización del ensayo. En otras implementaciones, el indicador de resultados incluye una pantalla alfanumérica (por ejemplo, una matriz de diodos emisores de luz de dos o tres caracteres) para presentar los resultados de ensayo.

Los sistemas de ensayo descritos en la presente memoria pueden incluir una fuente de alimentación que suministre energía a los componentes activos del sistema de ensayo de diagnóstico, incluyendo el lector, el analizador de datos y el indicador de resultados. La fuente de alimentación se puede implementar, por ejemplo, mediante una batería reemplazable o una batería recargable. En otras realizaciones, el sistema de ensayo de diagnóstico puede estar alimentado por un dispositivo anfitrión externo (por ejemplo, un ordenador conectado por cable USB).

Características de los dispositivos de flujo lateral a modo de ejemplo

Los dispositivos de flujo lateral descritos en la presente memoria pueden incluir un depósito de muestra (también denominado zona de recepción de muestra) donde se introduce una muestra de fluido en una tira ensayo, tal como, entre otros, una tira de ensayo inmunocromatográfica presente en un dispositivo de flujo lateral. En un ejemplo, la muestra se puede introducir en el depósito de muestra mediante una aplicación externa, tal como con un cuentagotas u otro aplicador. La muestra se puede verter o expresar sobre el depósito de muestra. En otro ejemplo, el depósito de muestra se puede sumergir directamente en la muestra, tal como cuando se sumerge una tira de ensayo en un recipiente que contiene la muestra.

Los dispositivos de flujo lateral descritos en la presente memoria pueden incluir un soporte o sustrato sólido. Los soportes sólidos apropiados incluyen, entre otros, nitrocelulosa, las paredes de los pocillos de una bandeja de reacción, placas de pocillos múltiples, tubos de ensayo, perlas de poliestireno, perlas magnéticas, membranas y micropartículas (tal como partículas de látex). Se puede usar cualquier material poroso adecuado con suficiente porosidad para permitir el acceso de los agentes marcados y una afinidad superficial adecuada para inmovilizar los agentes de captura en los dispositivos de flujo lateral descritos en la presente memoria. Por ejemplo, la estructura porosa de nitrocelulosa tiene excelentes cualidades de absorción y adsorción para una amplia diversidad de reactivos, por ejemplo, agentes de captura. El nailon posee características similares y también resulta apropiado. Las estructuras microporosas son útiles, al igual que los materiales con estructura de gel en estado hidratado.

Otros ejemplos de soportes sólidos útiles incluyen: carbohidratos poliméricos naturales y sus derivados modificados sintéticamente, reticulados o sustituidos, tales como agar, agarosa, ácido algínico reticulado, gomas de guar sustituidas y reticuladas, ésteres de celulosa, especialmente con ácido nítrico y ácidos carboxílicos, ésteres de celulosa mixtos y éteres de celulosa; polímeros naturales que contienen nitrógeno, tales como proteínas y derivados, incluidas gelatinas reticuladas o modificadas; polímeros de hidrocarburo naturales, tales como látex y caucho; polímeros sintéticos que se pueden preparar con estructuras porosas adecuadas, tales como polímeros vinílicos, incluidos polietileno, polipropileno, poliestireno, poli(cloruro de vinilo), poli(acetato de vinilo) y sus derivados parcialmente hidrolizados, poliacrilamidas, polimetacrilatos, copolímeros y terpolímeros de los policondensados anteriores, tales como poliésteres, poliamidas, y otros polímeros, como poliuretanos o poliepóxidos; materiales inorgánicos porosos tales como sulfatos o carbonatos de metales alcalinotérreos y magnesio, incluidos sulfato de bario, sulfato de calcio, carbonato de calcio, silicatos de metales alcalinos y alcalinotérreos, aluminio y magnesio; y óxidos o hidratos de aluminio o silicio, tales como arcillas, alúmina, talco, caolín, zeolita, gel de sílice o vidrio (estos materiales se pueden usar como filtros con los materiales poliméricos anteriores); y mezclas o copolímeros de las clases anteriores, tales como copolímeros de injerto obtenidos mediante polimerización inicial de polímeros sintéticos sobre un polímero natural preexistente.

Los dispositivos de flujo lateral descritos en la presente memoria pueden incluir soportes sólidos porosos, tales como nitrocelulosa, en forma de láminas o tiras. El espesor de dichas láminas o tiras puede variar dentro de amplios límites, por ejemplo, de aproximadamente 0,01 a 0,5 mm, de aproximadamente 0,02 a 0,45 mm, de aproximadamente 0,05 a 0,3 mm, de aproximadamente 0,075 a 0,25 mm, de aproximadamente 0,1 a 0,2 mm, o de aproximadamente 0,11 a 0,15 mm. El tamaño de poro de dichas láminas o tiras puede variar de manera similar dentro de amplios límites, por ejemplo, de aproximadamente 0,025 a 15 micrómetros, o más específicamente de aproximadamente 0,1 a 3 micrómetros; sin embargo, no se pretende que el tamaño de poro sea un factor limitante en la elección del soporte sólido. El caudal de soporte sólido, cuando corresponda, también puede variar dentro de amplios límites, por ejemplo, de aproximadamente 12,5 a 90 s/cm (es decir, de 50 a 300 s/4 cm), de aproximadamente 22,5 a 62,5 s/cm (es decir, 90 a 250 s/4 cm), de aproximadamente 25 a 62,5 s/cm (es decir, de 100 a 250 s/4 cm), de aproximadamente 37,5 a 62,5 s/cm (es decir, de 150 a 250 s/4 cm), o de aproximadamente 50 a 62,5 s/cm (es decir, de 200 a 250 s/4 cm). En realizaciones específicas de los dispositivos descritos en la presente memoria, el caudal es de aproximadamente 35 s/cm (es decir, 140 s/4 cm). En otras realizaciones específicas de los dispositivos descritos en la presente memoria, el caudal es de aproximadamente 37,5 s/cm (es decir, 150 s/4 cm).

La superficie de soporte sólido se puede activar mediante procesos químicos que provocan la unión covalente de un agente (por ejemplo, un reactivo de captura) al soporte. Como se describe a continuación, el soporte sólido puede incluir una almohadilla de conjugado. Se pueden usar muchos otros métodos adecuados para inmovilizar el agente (por ejemplo, un reactivo de captura) en el soporte sólido que incluyen, entre otros, interacciones iónicas, interacciones hidrófobas, interacciones covalentes y similares.

Salvo que esté físicamente limitado, el soporte sólido se puede usar en cualquier forma adecuada, tal como películas, láminas, tiras o placas, o se puede revestir, unir o laminar con soportes inertes apropiados, tales como papel, vidrio, películas plásticas o materiales textiles.

Los dispositivos de flujo lateral descritos en la presente memoria pueden incluir una almohadilla de conjugado, tal como una membrana u otro tipo de material que incluya un reactivo de captura. La almohadilla de conjugado puede ser acetato de celulosa, nitrato de celulosa, poliamida, policarbonato, fibra de vidrio, membrana, polietersulfona, celulosa regenerada (RC), politetrafluoretileno (PTFE), poliéster (por ejemplo, poli(tereftalato de etileno), policarbonato (por ejemplo, 4,4-hidroxi-difenil-2,2'-propano), óxido de aluminio, éster de celulosa mixta (por ejemplo, mezcla de acetato de celulosa y nitrato de celulosa), nailon (por ejemplo, poliamida, hexametilendiamina y nailon 66), polipropileno, PVDF, polietileno de alta densidad (HDPE) agente de nucleación de "dibenzoato de aluminio" (DBS) (por ejemplo, DBS de 80 u 0,024 HDPE (Porex)) y HDPE.

Los dispositivos de flujo lateral descritos en la presente memoria son altamente sensibles al analito de interés que está presente en la muestra en concentraciones elevadas. Como se ha descrito anteriormente, hay concentraciones elevadas cuando el analito de interés no marcado de la muestra está presente en una cantidad suficiente para competir con un compuesto marcado para unirse a un agente de captura en la zona de captura, lo que tiene como resultado una señal detectada en una parte de pendiente negativa de la curva de respuesta de dosis (por ejemplo, en la parte de "efecto de gancho" de la curva de respuesta de dosis de un ensayo de flujo lateral de tipo sándwich convencional o una parte de pendiente negativa de la curva de respuesta de dosis según los ensayos de flujo lateral de la presente divulgación). "Sensibilidad" se refiere a la proporción de positivos reales que se identifican correctamente como tales (por ejemplo, el porcentaje de sujetos infectados, latentes o sintomáticos que se identifican correctamente como portadores de afección). La sensibilidad se puede calcular como el número de verdaderos positivos dividido entre la suma del número de verdaderos positivos y el número de falsos negativos.

Los dispositivos de flujo lateral descritos en la presente memoria pueden medir con precisión un analito de interés en muchos tipos diferentes de muestra. Las muestras pueden incluir una muestra de ensayo o cultivo obtenido a partir de cualquier fuente, así como muestras biológicas y ambientales. Las muestras biológicas se pueden obtener a partir de animales (incluidas personas) y abarcan fluidos, sólidos, tejidos y gases. Las muestras biológicas incluyen orina, saliva y productos sanguíneos, tales como plasma, suero y similares. Sin embargo, dichos ejemplos no se deben interpretar como limitantes de los tipos de muestra aplicables a la presente divulgación.

En algunas realizaciones, la muestra es una muestra ambiental para detectar un analito en el ambiente. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra biológica procedente de un sujeto. En algunas realizaciones, la muestra biológica puede incluir sangre periférica, suero, plasma, ascitis, orina, líquido cefalorraquídeo (LCR), esputo, saliva, médula ósea, líquido sinovial, humor acuoso, líquido amniótico, cerumen, leche materna, líquido de lavado broncoalveolar, semen (incluyendo líquido prostático), líquido de Cowper o líquido preeyaculatorio, eyaculación femenina, sudor, materia fecal, cabello, lágrimas, líquido de quistes, líquido pleural y peritoneal, líquido pericárdico, linfa, quimo, quilo, bilis, líquido intersticial, menstruación, pus, sebo, vómito, secreciones vaginales, secreción de la mucosa, agua de las heces, jugo pancreático, líquidos de lavado de las cavidades sinusales, aspirados broncopulmonares u otros líquidos de lavado.

Como se usa en la presente memoria, "analito" generalmente se refiere a una sustancia objeto de detección. Por ejemplo, los analitos pueden incluir sustancias antigénicas, haptenos, anticuerpos y combinaciones de los mismos. Los analitos incluyen, entre otros, toxinas, compuestos orgánicos, proteínas, péptidos, microorganismos, aminoácidos, ácidos nucleicos, hormonas, esteroides, vitaminas, fármacos (incluidos los administrados con fines terapéuticos y los administrados con fines ilícitos), intermediarios o subproductos de fármacos, bacterias, partículas víricas y metabolitos o anticuerpos de cualquiera de las sustancias anteriores. Los ejemplos específicos de algunos analitos incluyen ferritina; creatinina quinasa MB (CK-MB); gonadotropina coriónica humana (hCG); digoxina; fenitoína; fenobarbitol; carbamazepina; vancomicina; gentamicina; teofilina; ácido valproico; quinidina; hormona luteinizante (LH); hormona estimulante de folículo (FSH); estradiol, progesterona; proteína C reactiva (PCR); lipocalinas; anticuerpos IgE; citoquinas; ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL); microglobulina de vitamina B2; proteína 10 inducida por interferón gamma (IP-10); hemoglobina glicosilada (Gly Hb); cortisol; digitoxina; N-acetilprocainamida (NAPA); procainamida; anticuerpos contra la rubéola, tales como rubéola-IgG y rubéola IgM; anticuerpos contra toxoplasmosis, tales como toxoplasmosis IgG (Toxo-IgG) y toxoplasmosis IgM (Toxo-IgM); testosterona; salicilatos; acetaminofeno; antígeno de superficie de virus de hepatitis B (HBsAg); anticuerpos contra antígeno central de hepatitis B, tales como el antígeno central anti-hepatitis B IgG e IgM (Anti-HBC); virus de la inmunodeficiencia humana 1 y 2 (VIH 1 y 2); virus de leucemia de células T humanas 1 y 2 (HTLV); antígeno e de hepatitis B (HBeAg); anticuerpos contra antígeno e de hepatitis B (Anti-HBe); virus de gripe; hormona estimulante de tiroides (TSH); tiroxina (T4); triyodotironina total (Total T3); triyodotironina libre (T3 libre); antígeno carcinoembrionario (CEA); lipoproteínas, colesterol y triglicéridos; y alfa fetoproteína (AFP). Los fármacos de sustancias de abuso y controladas incluyen, pero sin limitación, anfetamina; metanfetamina; barbituratos, tales como amobarbital, secobarbital, pentobarbital, fenobarbital y barbital; benzodiacepinas, tales como librium y valium; canabinoides, tales como hachís y marihuana; cocaína; fentanilo; LSD; metacualona; opiáceos, tales como heroína, morfina, codeína, hidromorfona, hidrocodona, metadona, oxicodona, oximorfona y opio; fenciclidina; y propoxieno. Se pueden incluir analitos adicionales para fines de sustancias biológicas o ambientales de interés.

Los dispositivos de flujo lateral descritos en la presente memoria pueden incluir un marcador. Las marcadores pueden adoptar muchas formas diferentes, incluida una molécula o composición ligada o capaz de unirse a un analito, análogo de analito, reactivo de detector o pareja de unión que sea susceptible de detección por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Los ejemplos de marcadores incluyen enzimas, partículas de oro coloidal (también denominadas nanopartículas de oro), partículas de látex coloreadas, isótopos radiactivos, cofactores, ligandos, agentes quimioluminiscentes o fluorescentes, partículas de plata adsorbidas en proteína, partículas de hierro adsorbidas en proteína, partículas de cobre adsorbidas en proteína, partículas de selenio adsorbidas en proteína, partículas de azufre adsorbidas en proteína, partículas de telurio adsorbidas en proteína, partículas de carbono adsorbidas en proteína y sacos de tinte acoplados a proteína. La unión de un compuesto (por ejemplo, un reactivo detector) a un marcador se puede realizar a través de enlaces covalentes, procesos de adsorción, enlaces hidrófobos y/o electrostáticos, tales como en quelatos y similares, o combinaciones de estos enlaces e interacciones y/o puede implicar un grupo de enlace.

La expresión "pareja de unión específica (o pareja de unión)" hace referencia a un miembro de un par de moléculas que interactúa por medio de interacciones no covalentes específicas que dependen de las estructuras tridimensionales de las moléculas implicadas. Los pares típicos de parejas de unión específicas incluyen antígeno/anticuerpo, hapteno/anticuerpo, hormona/receptor, hebra de ácido nucleico/hebra de ácido nucleico complementaria, sustrato/enzima, inhibidor/enzima, carbohidrato/lectina, biotina/(estrepto)avidina, receptor/ligandos y virus/receptor celular, o diversas combinaciones de los mismos.

Tal como se usan en la presente memoria, los términos "inmunoglobulina" o "anticuerpo" hacen referencia a proteínas que se unen a un antígeno específico. Las inmunoglobulinas incluyen, pero sin limitación, anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos y humanizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 e incluyen inmunoglobulinas de las siguientes clases: IgG, IgA, IgM, IgD, IbE e inmunoglobulinas segregadas (sIg). Las inmunoglobulinas generalmente comprenden dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras. No obstante, los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" también abarcan anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos de cadena doble.

Los dispositivos de flujo lateral descritos en la presente memoria incluyen un agente marcado. En algunos casos, el agente marcado incluye un agente de detección que es capaz de unirse a un analito. El agente marcado puede ser específico para un analito. En algunas realizaciones, el agente marcado puede ser un anticuerpo o fragmento del mismo que se ha conjugado, unido o asociado a un agente de detección. En las realizaciones de los ensayos de flujo lateral según la presente divulgación, el agente marcado puede ser un anticuerpo o fragmento del mismo que se ha conjugado, unido o asociado a un agente de detección y un analito de interés, formando un complejo de marcadoranticuerpo-analito.

Los dispositivos de flujo lateral según la presente divulgación incluyen un agente de captura. El agente de captura incluye un agente inmovilizado que es capaz de unirse a un analito, incluido un analito libre (no marcado) y/o un analito marcado. El agente de captura incluye una pareja de unión específica no marcada que es específica para (i) un analito de interés marcado, (ii) un analito marcado o un analito no marcado, como en un ensayo competitivo, o para (iii) una pareja de unión específica auxiliar, que es en sí misma específica para el analito, tal como en un ensayo indirecto. Como se usa en la presente memoria, una "pareja de unión específica auxiliar" es una pareja de unión específica que se une a la pareja de unión específica de un analito. Por ejemplo, la pareja de unión específica auxiliar puede incluir un anticuerpo específico para otro anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo antihumano de cabra. Los dispositivos de flujo lateral descritos en la presente memoria pueden incluir un "área de captura" que es una región del dispositivo de flujo lateral donde se inmoviliza el reactivo de captura. Los dispositivos de flujo lateral descritos en la presente memoria pueden incluir más de un área de captura, por ejemplo, un "área de captura primaria", un "área de captura secundaria" y similares. En algunos casos, se inmoviliza un reactivo de captura diferente en las áreas de captura primaria, secundaria y/u otras. Múltiples áreas de captura pueden tener cualquier orientación entre sí sobre el sustrato de flujo lateral; por ejemplo, un área de captura primaria puede ser distal o proximal a un área de captura secundaria (u otra) a lo largo de la trayectoria de flujo de fluido y viceversa. Alternativamente, el área de captura primaria y el área de captura secundaria (u otra) se pueden alinear a lo largo de un eje perpendicular a la trayectoria del flujo de fluido de manera que el fluido entre en contacto con las áreas de captura al mismo tiempo o aproximadamente al mismo tiempo.

Los dispositivos de flujo lateral según la presente divulgación incluyen agentes de captura que están inmovilizados de manera que el movimiento del agente de captura quede restringido durante el funcionamiento normal del dispositivo de flujo lateral. Por ejemplo, el movimiento del agente de captura inmovilizado queda restringido antes y después de aplicar la muestra de fluido al dispositivo de flujo lateral. La inmovilización de los agentes de captura se puede lograr por medios físicos tales como barreras, interacciones electrostáticas, enlaces de hidrógeno, bioafinidad, interacciones covalentes o combinaciones de los mismos.

Los dispositivos de flujo lateral según la presente divulgación pueden incluir ensayos de multiplex. Los ensayos de multiplex incluyen ensayos en los que se pueden detectar, identificar y, en algunos casos, cuantificar múltiples analitos diferentes de interés. Por ejemplo, en un dispositivo de ensayo de multiplex, pueden estar presentes áreas de captura primaria, secundaria o más, cada una específica para el analito de interés de una pluralidad de analitos de interés.

Los dispositivos de flujo lateral según la presente descripción pueden detectar, identificar y, en algunos casos, cuantificar una sustancia biológica. La sustancia biológica incluye compuestos químicos o bioquímicos producidos por un organismo vivo que puede incluir una estirpe celular procariota, una estirpe celular eucariota, una estirpe celular de mamífero, una estirpe celular microbiana, una estirpe celular de insecto, una estirpe celular vegetal, una estirpe celular mixta, una estirpe celular natural o una estirpe celular sintéticamente diseñada. Una sustancia biológica puede incluir macromoléculas grandes tales como proteínas, polisacáridos, lípidos y ácidos nucleicos, así como moléculas pequeñas tales como metabolitos primarios, metabolitos secundarios y productos naturales.

Se debe entender que la descripción, los ejemplos específicos y los datos, si bien indican realizaciones a modo de ejemplo, se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden limitar las diversas realizaciones de la presente divulgación. Diversos cambios y modificaciones dentro de la presente divulgación resultarán evidentes para el experto en la materia a partir de la descripción y los datos contenidos en la presente memoria y, por tanto, se consideran parte de las diversas realizaciones de la presente divulgación.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una tira de ensayo que comprende:

una trayectoria de flujo configurada para recibir una muestra de fluido;

una zona de recepción de muestra acoplada a la trayectoria de flujo;

una zona de captura acoplada a la trayectoria de flujo aguas abajo de la zona de recepción de muestra y que comprende un agente de captura inmovilizado específico para un analito de interés;

en la que la trayectoria de flujo comprende, antes de la aplicación de la muestra de fluido, un complejo configurado para fluir en la trayectoria de flujo hacia la zona de captura en presencia de la muestra de fluido, comprendiendo el complejo

un marcador,

un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une específicamente al analito de interés, y

el analito de interés.

2. La tira de ensayo de la reivindicación 1, en la que la trayectoria de flujo está configurada para recibir una muestra de fluido que comprende un analito de interés no marcado, y en la que el complejo no se une específicamente al analito de interés no marcado.

3. La tira de ensayo de la reivindicación 2, en la que el complejo está configurado para fluir con el analito de interés no marcado en la trayectoria de flujo hacia la zona de captura.

4. La tira de ensayo de la reivindicación 3, en la que el complejo está configurado para competir con el analito de interés no marcado para unirse al agente de captura inmovilizado en la zona de captura.

5. La tira de ensayo de la reivindicación 4, en la que una señal óptica emitida por el complejo unido al agente de captura inmovilizado en la zona de captura disminuye a medida que aumenta la concentración de analito de interés no marcado en la muestra de fluido.

6. La tira de ensayo de la reivindicación 1, en la que la trayectoria de flujo está configurada para recibir una muestra de fluido que comprende o no el analito de interés, y en la que el complejo se une específicamente a todo o sustancialmente todo el agente de captura inmovilizado en la zona de captura cuando la muestra de fluido no comprende el analito de interés.

7. La tira de ensayo de la reivindicación 6, en la que, cuando la muestra de fluido no comprende el analito de interés, una señal óptica emitida desde el complejo unido en la zona de captura es una señal óptica máxima que se puede emitir desde la tira de ensayo, o en la que, cuando la muestra de fluido comprende el analito de interés, una señal óptica emitida desde el complejo unido en la zona de captura es menor que la señal óptica máxima.

8. La tira de ensayo de la reivindicación 1, en la que el agente de captura inmovilizado comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une específicamente al analito de interés.

9. La tira de ensayo de la reivindicación 1, en la que el complejo se integra en la superficie de la tira de ensayo, o en la que el complejo se integra en la superficie de la tira de ensayo pulverizando una disolución que comprende el complejo sobre la superficie de la tira de ensayo y secando la disolución.

10. La tira de ensayo de la reivindicación 1, en la que la muestra de fluido está seleccionada entre el grupo que consiste en una muestra de sangre, plasma, orina, sudor o saliva.

11. La tira de ensayo de la reivindicación 1, en la que el analito de interés comprende proteína C reactiva (PCR) y el complejo comprende un anticuerpo anti-PCR o un fragmento del mismo unido a PCR.

12. Un sistema de ensayo de diagnóstico que comprende:

la tira de ensayo de la reivindicación 1;

un lector que comprende una fuente de luz y un detector; y

un analizador de datos, en el que el analizador de datos emite una indicación de que no hay ningún analito de interés en la muestra de fluido cuando el lector detecta una señal óptica de la tira de ensayo que es una señal óptica máxima de una curva de respuesta de dosis de la tira de ensayo.

13. El sistema de ensayo de diagnóstico de la reivindicación 12, en el que el analizador de datos emite una indicación de que hay una baja concentración de analito de interés en la muestra de fluido cuando el lector detecta una señal óptica procedente de la tira de ensayo que está dentro de un 1 % de la señal óptica máxima: en el que el analizador de datos emite una indicación de que hay una baja concentración de analito de interés en la muestra de fluido cuando el lector detecta una señal óptica procedente de la tira de ensayo que está dentro de un 5 % de la señal óptica máxima: en el que el analizador de datos emite una indicación de que hay una baja concentración de analito de interés en la muestra de fluido cuando el lector detecta una señal óptica de la tira de ensayo que está dentro de un 10 % de la señal óptica máxima; o en el que el analizador de datos emite una indicación de que hay una alta concentración de analito de interés en la muestra de fluido cuando el lector detecta una señal óptica de la tira de ensayo que es de un 90 % o menos de un 90 % de la señal óptica máxima.

14. El sistema de ensayo de diagnóstico de la reivindicación 12, en el que el analizador de datos emite una indicación de la concentración de analito de interés en la muestra cuando el lector detecta una señal óptica procedente de la tira de ensayo que está por debajo de la señal óptica máxima.

15. Un método para determinar una concentración de analito de interés en una muestra de fluido utilizando una tira de ensayo, comprendiendo la tira de ensayo una trayectoria de flujo configurada para recibir una muestra de fluido, una zona de recepción de muestra acoplada a la trayectoria de flujo, una zona de captura acoplada a la trayectoria de flujo aguas abajo de la zona de recepción de muestra y que comprende un agente de captura inmovilizado específico para un analito de interés, y en el que la trayectoria de flujo comprende un complejo configurado para fluir en la trayectoria de flujo hasta la zona de captura en presencia de la muestra de fluido, comprendiendo el complejo un marcador, un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo que se une específicamente al analito de interés y al analito de interés, comprendiendo el método:

aplicar la muestra de fluido a la tira de ensayo cuando el complejo está acoplado a la trayectoria de flujo; desacoplar el complejo de la trayectoria de flujo; hacer fluir la muestra de fluido y el complejo en la trayectoria de flujo a la zona de captura;

unir el complejo al agente de captura inmovilizado en la zona de captura; detectar una señal procedente del complejo unido al agente de captura inmovilizado en la zona de captura.

16. El método de la reivindicación 15, en el que la señal detectada es una señal óptica, una señal de fluorescencia o una señal magnética.

17. El método de la reivindicación 15, en el que desacoplar el complejo comprende disolver el complejo con la muestra de fluido.

18. El método de la reivindicación 15, en el que la muestra de fluido comprende un analito de interés no marcado, y en el que el complejo no se une específicamente al analito de interés no marcado; en el que la muestra de fluido comprende un analito de interés no marcado, y en el que el complejo está configurado para competir con el analito de interés no marcado para unirse al agente de captura inmovilizado en la zona de captura; o en el que la muestra de fluido no comprende el analito de interés, y en el que la detección comprende detectar una señal máxima de una curva de respuesta de dosis de la tira de ensayo.

19. El método de la reivindicación 15, que comprende además determinar que la concentración de analito en la muestra de fluido es nula.

20. El método de la reivindicación 19, que comprende además mostrar una indicación de que el analito de interés no está presente en la muestra de fluido.

21. El método de la reivindicación 15, en el que la muestra de fluido comprende el analito de interés, y en el que la detección comprende detectar una señal procedente de la tira de ensayo que es menor que la señal máxima de una curva de respuesta de dosis de la tira de ensayo.

22. El método de la reivindicación 21, que comprende además determinar que la concentración de analito en la muestra de fluido es mayor que cero y mostrar una indicación de que el analito de interés está presente en la muestra de fluido.

23. El método de la reivindicación 21, que comprende además:

determinar que la señal detectada está dentro de un 10 % de la señal óptica máxima; y

mostrar una indicación de que el analito de interés está presente en la muestra de fluido a baja concentración.

24. El método de la reivindicación 21, que comprende además:

determinar que la señal detectada es un 90 % o menos de un 90 % de la señal máxima; y

mostrar una indicación de que el analito de interés está presente en la muestra de fluido en alta concentración.