ES2932772T3 - Nuevos péptidos grapados y utilizaciones de los mismos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a macrociclos peptidomiméticos que comprenden al menos un enlazador formador de macrociclos y una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en: i) una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90 %, o 95% de identidad de secuencia con una secuencia humana IRAK2 54-71 (SEQ ID N°1) y 100% de identidad con los aminoácidos en las posiciones 5-6, 9-11, 14-15 o ii) un aminoácido secuencia con al menos aproximadamente 50%, 60%, 70, 80%, 90% o 95% de identidad de secuencia con una secuencia humana IRAKM 66-83 (SEQ ID N°2) y 100% de identidad con los aminoácidos en las posiciones 5-6, 9-11, 13-14, en el que el macrociclo peptidomimético comprende una hélice a y al menos dos aminoácidos naturales o dos no naturales entrecruzados por un enlazador formador de macrociclo. También se refiere al método de preparación de dichos macrociclos peptidomiméticos y usos de los mismos, (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevos péptidos grapados y utilizaciones de los mismos

Dominio de la invención

La presente exposición proporciona nuevos macrociclos peptidomiméticos asimismo denominados péptidos grapados (“stapled”), derivados de IRAK e IRAKM (asimismo denominado IRAK3) y de la región de unión a proteína de IRAK4, y utilizaciones de los mismos, en particular la utilización de los mismos como inhibidores de rutas inflamatorias.

El término "IRAK" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cinasa asociada a receptor de interleucina, que se asocia a un receptor de interleucina (IL-R) tras la estimulación. Los genes de IRAK son parcialmente responsables de la regulación positiva inducida por interleucina del factor de transcripción NF-kappa B.

Antecedentes de la invención

La transducción de señales mediante los receptores de tipo Toll (TLR) es crucial para la defensa del huésped frente a muchos microorganismos patógenos y asimismo subyace a muchas enfermedades humanas, entre ellas algunos trastornos inflamatorios crónicos.

Los trastornos inflamatorios y las enfermedades autoinmunitarias son problemas importantes de salud pública que afectan a la vida de millones de personas en todo el mundo y que requieren intervenciones terapéuticas específicas. La ruta de señalización de los TLR se ha estudiado en trastornos infecciosos e inflamatorios, así como en el cáncer. La utilización como diana de dicha ruta de señalización podría ser relevante en enfermedades autoinmunitarias tales como la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple y la enfermedad de Crohn, así como en otras enfermedades comunes que están asociadas a la desregulación de las señales inflamatorias, tales como la diabetes de tipo 2 , las infecciones, la sepsis, el cáncer y las enfermedades cardiovasculares.

De esta manera, el mecanismo y la regulación de la señalización por los TLR resulta de interés considerable para el desarrollo de nuevas terapias antiinflamatorias específicas (O'Neill et al. Nat. Rev. Immunol. 2007).

La activación de los TLR induce una cascada de interacciones de transductor de señales posteriores que estimula el ensamblaje de un complejo multiproteico llamado "Myddosome", activa el factor nuclear-KB (NF-^kB) y conduce a la producción de citocinas proinflamatorias (TNFa, IL-1p, IL-6 , etc.). El Myddosome es una estructura oligomérica que contiene varias moléculas de MYD88, IRAK4 e IRAK2. (Lin et al., Nature 2010).

Actualmente, grandes grupos farmacéuticos se encuentran trabajando en el estudio de la inhibición de la actividad de la cinasa IRAK4. Algunos compuestos están en fase preclínica (Chaudhary et al., Journal of Medicinal Chemistry, 2015).

Sin embargo, aunque el bloqueo de la producción de citocinas proinflamatorias está bien reconocido como una meta terapéutica, actualmente no existe ningún fármaco en el mercado que inhiba dicha ruta mediante una estrategia de bloqueo de la producción de citocinas proinflamatorias (IL1 beta, TNF-alfa e IL6) cadena arriba de su secreción. Además, IRAK2 e IRAKM son pseudocinasas, y de esta manera, su actividad no puede ser inhibida mediante las estrategias habituales de inhibidor de cinasa. Zhou y colaboradores (Hao Zhou et al., The EMBO Journal (2013) 32, 583-596) han demostrado que IRAKM interactúa con Myd88-IRAK4, al igual que IRAK2.

Por lo tanto, existe una necesidad de nuevos compuestos que puedan inhibir la ruta de señalización de TLR de producción de las citocinas TNFa, IL-6 e IL1p.

Los inventores han diseñado péptidos macrocíclicos específicos, asimismo denominados péptidos grapa, que inhiban las interacciones entre IRAK2 e IRAK4 y, de esta manera, interfieran con el ensamblaje "Myddosome" y la producción cadena abajo de mediadores proinflamatorios.

La originalidad de la presente invención es que proporciona un tratamiento de enfermedades inflamatorias e infecciosas poco después de que ocurran en el cuerpo, actuando sobre una nueva diana, que actualmente no ha sido propuesta. En efecto, los únicos tratamientos anti-TNFa eficaces disponibles actualmente son anticuerpos monoclonales tales como adalimumab, infliximab o etanercept. Sin embargo, los anticuerpos requieren un procesamiento complejo y no permiten bloquear las rutas inflamatorias cadena arriba.

La inhibición de la interacción de IRAK-2 con IRAK-4 mediante los péptidos grapa es, por lo tanto, una opción alternativa estratégica.

Sumario de la divulgación y la invención

La presente invención se refiere a los objetos definidos en las reivindicaciones 1 a 16.

La presente divulgación se refiere a macrociclos peptidomiméticos específicos que derivan de IRAK2 e IRAKM y la región de unión a proteínas de IRAK4, que inhiben la ruta de inflamación activada mediante TLR e IL1R. La exposición se refiere, además, al método de preparación de los mismos, a una composición farmacéutica que contiene dichos macrociclos peptidomiméticos, y a las utilizaciones de los mismos, solos o en combinación con un compuesto adicional seleccionado de compuestos antiinflamatorios o de direccionamiento (“targeting”) celular, para la utilización en la prevención o el tratamiento de la inflamación, en particular trastornos inflamatorios agudos o crónicos.

Definiciones según la invención

Las expresiones "macrociclo peptidomimético", "polipéptido reticulado" y "péptido grapado" según la invención se refieren a un compuesto que comprende una pluralidad de residuos aminoácidos unidos mediante una pluralidad de enlaces peptídicos y por lo menos un conector formador de macrociclo, que forma un macrociclo entre un primer residuo (o análogo) aminoácido natural o no natural y un segundo residuo (o análogo) aminoácido natural o no natural dentro de la misma molécula.

Entre los macrociclos peptidomiméticos se incluyen formas de realización en las que el conector que forma el macrociclo conecta el carbono a del primer residuo (o análogo) aminoácido con el carbono a del segundo residuo (o análogo) aminoácido.

Un "polipéptido no reticulado correspondiente" o "péptido lineal" al que se hace referencia en el contexto de un macrociclo peptidomimético se entiende que se refiere a un polipéptido de la misma longitud que el macrociclo y que comprende los aminoácidos naturales equivalentes de la secuencia de tipo salvaje correspondiente del macrociclo.

Los términos "péptido" y "polipéptido" según la invención comprenden dos o más aminoácidos naturales o no naturales unidos mediante un enlace covalente (por ejemplo, un enlace amida). Los péptidos según la invención generalmente presentan una longitud comprendida entre 10 y 30 aminoácidos.

El término "aminoácido" según la invención se refiere a una molécula que contiene tanto un grupo amino como un grupo carboxilo. Entre los aminoácidos adecuados se incluyen, aunque sin limitación, tanto isómeros D como L de los aminoácidos naturales, así como aminoácidos no naturales preparados mediante síntesis orgánica u otras rutas metabólicas. El término aminoácido, tal como se utiliza en la presente memoria, incluye, aunque sin limitación, aaminoácidos, aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales y análogos de aminoácidos.

La expresión "aminoácido natural" según la invención se refiere a cualquiera de los veinte L-aminoácidos que se encuentran comúnmente en los péptidos sintetizados en la naturaleza, es decir, los L-isómeros de alanina (Ala o A), arginina (Arg o R), asparagina (Asn o N), ácido aspártico (Asp o D), cisteína (Cys o C), ácido glutámico (Glu o E), glutamina (Glu o Q), glicina (Gly o G), histidina (His o H), isoleucina (Ile o I), leucina (Leu o L), lisina (Lys o K), metionina (Met o M), fenilalanina (Phe o F), prolina (Pro o P), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), triptófano (Trp o W), tirosina (Tyr o Y) y valina (Val o V). En el caso de los aminoácidos naturales que son sensibles a la oxidación, el aminoácido en el peptidomimético se sustituye con una sustitución de aminoácido conservadora; por ejemplo, la metionina (M) se sustituye por norleucina (Nle), sin ningún impacto sobre su actividad biológica.

Las expresiones "análogo de aminoácido" y "aminoácido no natural" según la invención se refieren a una molécula que es estructuralmente similar a un aminoácido y que puede sustituirse por un aminoácido en la formación de un macrociclo peptidomimético. A título de ejemplo, la ornitina es un análogo de la lisina.

Entre los análogos de aminoácidos se incluyen, aunque sin limitación, compuestos que son estructuralmente idénticos a un aminoácido, tal como se define en la presente memoria, excepto por la inclusión de uno o más grupos metileno adicionales entre el grupo amino y el grupo carboxilo (por ejemplo, los a-amino p-carboxiácidos), o por la sustitución del grupo amino o carboxi por un grupo de reactividad similar (por ejemplo, la sustitución de la amina primaria por una amina secundaria o terciaria, o la sustitución del grupo carboxi por un éster).

La expresión "aminoácido no natural" según la invención se refiere a un aminoácido que no es uno de los veinte aminoácidos que se encuentran comúnmente en los péptidos sintetizados en la naturaleza, sino que, por el contrario, se genera mediante síntesis química o mediante modificación química de un aminoácido natural.

La expresión "no esencial" referida a un residuo aminoácido según la invención es un residuo que puede alterarse respecto a la secuencia de tipo salvaje de un polipéptido sin anular, o anular sustancialmente, su actividad biológica o bioquímica esencial (por ejemplo, la unión o activación de un receptor). El término "esencial" referido a un residuo aminoácido según la invención es un residuo que, en caso de estar alterado respecto a la secuencia de tipo salvaje del polipéptido, resulta en la anulación, o la anulación sustancial, de la actividad biológica o bioquímica esencial del polipéptido.

Una "sustitución de aminoácido conservadora" es una sustitución en la que el residuo aminoácido se sustituye por un residuo aminoácido que presenta una cadena lateral similar. Las familias de residuos aminoácidos que presentan cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Entre dichas familias se incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, K, R y H), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, D y E), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, G, N, Q, S, T, Y y C), cadenas laterales no polares (por ejemplo, A, V, L, I, P. F, M y W), cadenas laterales de ramificación beta (por ejemplo, T, V e I) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, Y, F, W y H). De esta manera, un residuo aminoácido no esencial predicho en un polipéptido, por ejemplo, se sustituye preferentemente por otro residuo aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Otros ejemplos de sustituciones aceptables son las sustituciones basadas en consideraciones isostéricas (por ejemplo, norleucina por metionina) u otras propiedades (por ejemplo, 2-tienilalanina por fenilalanina).

La expresión "actividad biológica" comprende propiedades estructurales y funcionales de un macrociclo de la invención. La actividad biológica es, por ejemplo, estabilidad estructural, alfa-helicidad, afinidad para una diana, resistencia a la degradación proteolítica, penetrabilidad celular, estabilidad intracelular, estabilidad in vivo o cualquier combinación de ellas.

Los términos "i", "i+3", "i+4" y "i+7" según la invención se refieren a las posiciones de los aminoácidos dentro del péptido que se unen covalentemente entre sí al formarse la grapa. La posición "i" se refiere a la posición del aminoácido más próximo al extremo aminoterminal del péptido. La posición "i+3" se encuentra 3 aminoácidos cadena abajo (3 aminoácidos más hacia el extremo carboxiterminal) de la posición "i"; la posición "i+4" se encuentra 4 aminoácidos cadena abajo (4 aminoácidos más hacia el extremo carboxiterminal) de la posición "i" y la posición "i+7" se encuentra 7 aminoácidos cadena abajo de la posición "i". Tras la formación de la grapa, se forma un enlace covalente entre el aminoácido en la posición i y el aminoácido en la posición i+3, i+4 o i+7.

La expresión "estabilidad helicoidal" según la invención se refiere al mantenimiento de una estructura helicoidal por un macrociclo peptidomimético proporcionado en la presente memoria según medición mediante dicroísmo circular.

El término "alquileno" se refiere a un alquilo divalente (es decir, -R-).

El término "alquenilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo que es una cadena lineal o una cadena ramificada que presenta uno o más dobles enlaces carbono-carbono. La fracción alquenilo contiene el número indicado de átomos de carbono. Por ejemplo, C2-C10 indica que el grupo presenta entre 2 y 10 (ambos inclusive) átomos de carbono en él.

El término "alquinilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo que es una cadena lineal o una cadena ramificada que presenta uno o más triples enlaces carbono-carbono.

Divulgación detallada de la invención

Macrociclos peptidomiméticos (péptidos grapados)

Entre los péptidos grapados según la invención se incluyen un enlace covalente entre las cadenas laterales de dos aminoácidos en el péptido. Puede utilizarse el grapado de péptidos para restringir físicamente un péptido a una conformación específica (por ejemplo, para restringir físicamente un péptido en su estado a-helicoidal nativo). Ello puede, a su vez, potenciar las propiedades farmacológicas del péptido al ayudar a retener la estructura nativa necesaria para interactuar con moléculas diana, incrementando la penetración celular y/o protegiendo al péptido frente a la degradación proteolítica.

El diseño de los péptidos grapados según la invención se basa en la inhibición de la interacción del complejo Myd88/IRAK4/IRAK2. Dicho complejo de proteínas, una vez formado, induce la síntesis de varias citocinas proinflamatorias, incluyendo IL-1p, TNFa e IL-6 , mediante la activación de la ruta de NF-kB (figura 1). Un estudio cristalográfico y el cribado virtual de escaneo de alaninas del complejo Myd88/IRAK4/IRAK2 revela la presencia de una hélice a en IRAK2, que los presentes inventores han denominado IRAK2 54-71, que interactúa con la superficie de IRAK4. Esta interacción entre IRAK4 e IRAK2 resulta esencial para la actividad del complejo Myd88/IRAK4/IRAK2. La estrategia adoptada fue desarrollar péptidos grapados de dicha secuencia, con el fin de mimetizar la hélice a de IRAK2 y ver si estos péptidos podían sustituir a la proteína IRAK2 dentro del complejo, inhibiendo de esta manera su formación y la producción cadena abajo de citocinas proinflamatorias.

Un estudio más detallado en la literatura (Du et al., Cell Commun Signal. 2014) muestra que la proteína IRAKM (IRAK3) es una proteína natural que inhibe el complejo Myd88/IRAK4/IRAK2 mediante la sustitución de IRAK2. La falta de datos cristalográficos de IRAKM condujo a los presentes inventores a realizar alineaciones de secuencia entre IRAK2 e IRAKM con el fin de ver si dicha proteína presenta aminoácidos idénticos a los de la hélice a de IRAK2 54-71. Dicho estudio mostró que 50% de los aminoácidos estaban conservados dentro de dicha hélice a. Por lo tanto, los presentes inventores asimismo sintetizaron péptidos grapados de IRAKM, que denominaron IRAKM 66-83.

Las secuencias son las definidas a continuación:

IRAK254-71 : VSITRELLWWWGMRQATV (SEC ID n° 1)

IRAKM 66-83 : KSGTRELLWSWAQKNKTI (SEC ID n° 2)

Los aminoácidos en las posiciones 5-6, 9-11 y 13-15, preferentemente 14-15, de IRAK254-71 (SEC ID n° 1) y los aminoácidos en las posiciones 5-6, 9-11 y 13-15, preferentemente 13-14, de IRAKM 66-83 (SEC ID n° 2), respectivamente, resultan esenciales, lo que significa que una modificación de dichos aminoácidos tendrá un impacto sobre su funcionalidad o actividad y la estructura de hélice a. En consecuencia, se prepararon los péptidos grapados de diseño según la invención considerando el carácter crítico de la posición de los aminoácidos.

Tras establecer la estrategia sintética y las posiciones de grapado, se sintetizaron varios péptidos. Entre ellos, los presentes inventores seleccionaron seis péptidos para describir su actividad: dos secuencias lineales similares de la hélice a de IRAK2 e IRAKM, y cuatro péptidos grapa derivados a partir de dichas secuencias. Se sintetizó un péptido adicional para disponer de un péptido grapado de control negativo en ensayos biológicos. Dicho péptido, que los presentes inventores denominaron "Mock S", un péptido grapado aleatorio que no se corresponde a las secuencias de IRAK254-71 (SEC ID n° 1) e IRAKM 66-83 (SEC ID n°2).

Las secuencias se indican en la tabla 1, a continuación.

Tabla 1

La metionina "M" en la posición 13, que es sensible a la oxidación, se ha sustituido por una norleucina, "B", que es una sustitución de aminoácido conservadora.

En una forma de realización alternativa para SEC ID n° 12 a SEC ID n° 15, la lisina (K) puede sustituirse por ornitina y/o el ácido aspártico (D) puede sustituirse por ácido glutámico (E).

IRAK2 S1 asimismo se denomina IRAK2-JMV6645 en la presente invención.

IRAK2 S2 asimismo se denomina IRAK2-JMV6646 en la presente invención.

IRAKM S1 asimismo se denomina IRAKM-JMV6647 en la presente invención.

IRAKM S2 asimismo se denomina IRAKM-JMV6648 en la presente invención.

Los aminoácidos representados como "S5" son los aminoácidos alfa-Me olefina pentenilo S5-alanina conectados mediante un reticulador de solo carbonos entre i e i+4, que comprende un doble enlace.

"Ac" representa acetilo.

"B" representa el aminoácido norleucina.

Estos péptidos grapados asimismo están representados en las tablas 2a y 2b, a continuación:

Tabla 2a

Tabla 2b

El enlace covalente cadena lateral con cadena lateral ("grapado") dentro de pequeños segmentos de hélice a derivados de una proteína superan el carácter poco o nada helicoidal mostrado en solución por estos oligopéptidos al extraerlos de su contexto nativo. De esta manera, la incorporación de cadenas cortas de hidrocarburo como "grapas" se ha mostrado que potencia la helicidad, la resistencia a la proteólisis y la permeabilidad celular (Lau et al., Chem. Soc. Rev. 2015, 44, 91-102 ; Walensky y Bird, J. Med. Chem., 2014, 57, 6275-6288; Guerlavais y Sawyer, Annual reports in Med. Chem., 2014, 49, 331-345). A continuación, los macrociclos peptidomiméticos poseen propiedades farmacéuticas mejoradas respecto a los macrociclos peptidomiméticos o péptidos grapados no reticulados (por ejemplo, lineales) correspondientes. Entre dichas propiedades mejoradas se incluyen una biodisponibilidad y estabilidad (resistencia a la hidrólisis) in vivo mejoradas.

Al utilizar péptidos grapados para restringir físicamente un péptido en su estado de hélice a nativo, tal como según la invención, resulta deseable formar la grapa entre las posiciones i e i+3 del péptido o entre las posiciones i e i+4 del péptido o entre las posiciones i e i+7 del péptido. Lo anterior se debe a que, al formarse la hélice alfa, las cadenas laterales de aminoácidos en las posiciones i, i+3, i+4 e i+7 se encontrarán localizadas en la misma cara de la hélice.

Los ejemplos de péptidos grapados con una grapa entre las posiciones i e i+3, entre las posiciones i e i+4 y entre las posiciones i e i+7 están representados en la figura 2A.

Un primer objeto de la invención es un macrociclo peptidomimético que comprende por lo menos un reticulador formador de macrociclo y una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en:

(i) una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de por lo menos 65%, 70%, 80%, 90% o 95% respecto a la secuencia humana de IRAK254-71 (SEC ID n° 1) y una identidad de 100% respecto a los aminoácidos en las posiciones 5-6, 9-11, 13-15, preferentemente 14-15 o

(ii) una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de por lo menos 70%, 80%, 90% o 95% respecto a la secuencia humana de IRAKM 66-83 (SEC ID n° 2) y una identidad de 100% respecto a los aminoácidos en las posiciones 5-6, 9-11, 13-15, preferentemente 13-14,

en la que el macrociclo peptidomimético comprende una hélice a y por lo menos dos aminoácidos naturales o no naturales reticulados con un reticulador formador de macrociclo.

En una forma de realización particular, el macrociclo peptidomimético comprende por lo menos un reticulador formador de macrociclo y una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en:

(i) una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de por lo menos 65%, 70%, 80%, 90% o 95% respecto a la secuencia humana de IRAK254-71 (SEC ID n° 1) y una identidad de 100% respecto a los aminoácidos en las posiciones 5-7, 9-11 y 14-15, o

(ii) una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de por lo menos 70%, 80%, 90% o 95% respecto a la secuencia humana de IRAKM 66-83 (SEC ID n° 2) y una identidad de 100% respecto a los aminoácidos en las posiciones 5-7, 9-11, 13-15 y 13-14,

en la que el macrociclo peptidomimético comprende una hélice a y por lo menos dos aminoácidos naturales o no naturales reticulados con un reticulador formador de macrociclo.

La identidad de secuencia se calcula mediante alineación de secuencias según métodos conocidos de la técnica.

Con el fin de determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos, se alinean las secuencias para una comparación óptima. Por ejemplo, pueden introducirse huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos para la alineación óptima con la secuencia de aminoácidos. A continuación, se comparan los residuos aminoácidos en las posiciones correspondientes de aminoácido. En el caso de que una posición en la primera secuencia esté ocupada por el mismo residuo aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia, las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias. Por lo tanto:% de identidad = (número de posiciones idénticas / número total de posiciones solapantes) X 100

En esta comparación, las secuencias pueden ser de la misma longitud o pueden ser de longitud diferente. La alineación óptima de secuencias para determinar una ventana de comparación puede llevarse a cabo mediante el algoritmo de homologías locales de Smith y Waterman (J. Theor. Biol., 1981), mediante el algoritmo de alineación de homologías de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol, 1972), mediante la búsqueda de similitudes mediante el método de Pearson y Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988), mediante implementaciones computarizadas de dichos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de Wisconsin Genetics Software versión 7.0, Genetic Computer Group, 575, Science Drive, Madison, Wisconsin) o, por ejemplo, mediante la utilización de software informático disponible para el público, tal como BLAST[2]. Al utilizar dicho software, preferentemente se utilizan los parámetros por defecto, por ejemplo, para la penalización por hueco o para la penalización por extensión. Se selecciona la alineación óptima (es decir, que resulta en el porcentaje más alto de identidad a lo largo de la ventana de comparación) generada mediante los diversos métodos.

En una forma de realización particular, el macrociclo peptidomimético comprende por lo menos un reticulador formador de macrociclo y una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 70% respecto a la secuencia humana IRAK254-71 (SEC ID n° 1) y 100% de identidad respecto a los aminoácidos en las posiciones 5-6, 9-11 y 14-15 o respecto a la secuencia humana IRAKM 66-83 (SEC ID n° 2) y 100% de identidad respecto a los aminoácidos en las posiciones 5-6, 9-11 y 13-15, preferentemente 13-14.

Las posiciones de los aminoácidos se determinan según la secuencia de referencia SEC ID.

En otra forma de realización particular, el macrociclo peptidomimético comprende por lo menos un reticulador formador de macrociclo y una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80% respecto a la secuencia humana IRAK254-71 (SEC ID n° 1) y 100% de identidad respecto a los aminoácidos en las posiciones 5-6, 9-11 y 14-15 o respecto a la secuencia humana IRAKM 66-83 (SEC ID n° 2) y 100% de identidad respecto a los aminoácidos en las posiciones 5-6, 9-11 y 13-15, preferentemente 13-14.

En otra forma de realización particular, el macrociclo peptidomimético comprende por lo menos un reticulador formador de macrociclo y una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a la secuencia humana IRAK254-71 (SEC ID n° 1) o respecto a la secuencia humana IRAKM 66­ 83 (SEC ID n°2) y 100% de identidad respecto a los aminoácidos en las posiciones 5-6, 9-11 y 13-15.

En una forma de realización particular y preferida, el macrociclo peptidomimético comprende por lo menos un reticulador formador de macrociclo y una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de entre lo menos 90% respecto a la secuencia humana IRAK254-71 (SEC ID n° 1) y 100% de identidad respecto a los aminoácidos en las posiciones 5-6, 9-11, 14-15 o respecto a la secuencia humana IRAKM 66-83 (SEC ID n°2) y 100% de identidad respecto a los aminoácidos en las posiciones 5-6, 9-11 y 13-14.

En una forma de realización particular y preferida, el macrociclo peptidomimético comprende por lo menos un reticulador formador de macrociclo y una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de entre 68% y 90% respecto a la secuencia humana IRAK254-71 (SEC ID n° 1) y 100% de identidad respecto a los aminoácidos en las posiciones 5-6, 9-11 y 14-15.

En una forma de realización particular y preferida, el macrociclo peptidomimético comprende por lo menos un reticulador formador de macrociclo y una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de entre 70% y 90% respecto a la secuencia humana IRAKM 66-83 (SEC ID n° 2) y 100% de identidad respecto a los aminoácidos en las posiciones 5-6, 9-11 y 13-14.

Los aminoácidos en las posiciones 5-6, 9-11, 13-15, preferentemente 14-15 de IRAK2 54-71 (SEC ID n° 1) y los aminoácidos en las posiciones 5-6, 9-11 y 13-14, respectivamente, de IRAKM 66-83 (SEC ID n°2) son aminoácidos esenciales para la actividad biológica del macrociclo peptidomimético tal como se ha definido anteriormente.

Los aminoácidos en las posiciones 5-7, 9-11 y 14-15 de IRAK2 54-71 (SEC ID n° 1) y los aminoácidos en las posiciones 5-7, 9-11 y 13-14, respectivamente, de IRAKM 66-83 (SEC ID n° 2) son aminoácidos esenciales para la actividad biológica del macrociclo peptidomimético tal como se ha definido anteriormente.

Pueden mencionarse varios tipos de péptidos grapa o reticuladores de macrociclo: (a) un puente lactama, (b) un puente hidrocarburo, (c) un clip ion metálico, (d) un sustituto de enlace de hidrógeno y (e) un puente heterociclo. Cualquiera de dichos tipos de grapa, u otros péptidos grapa conocidos de la técnica, puede utilizarse con cualquiera de los péptidos indicados en la presente memoria.

Pueden formarse puentes lactama entre residuos de ácido glutámico o aspártico y lisina (o su análogo ornitina) en un péptido. Los residuos de ácido glutámico o aspártico y de lisina pueden encontrarse presentes en la secuencia nativa del péptido. Alternativamente, pueden realizarse sustituciones de los aminoácidos ácido glutámico, ácido aspártico y/o lisina (o su análogo ornitina) en las posiciones deseadas del péptido o pueden introducirse en las posiciones deseadas durante la síntesis del péptido.

En una forma de realización particular, se forman puentes lactama mediante la utilización de los residuos de lisina y ácido aspártico.

En una forma de realización particular, la sustitución o sustituciones pueden comprender sustituciones con residuo de derivado de lisina en la posición i y una sustitución por derivado aspártico en la posición i+3, en la posición i+4 o en la posición i+7, preferentemente en la posición i+4.

Pueden formarse puentes de hidrocarburo (por ejemplo, puentes de olefina) entre dos residuos de alilglicina en un péptido. Pueden introducirse dos residuos de alilglicina en un péptido en las posiciones deseadas y después puede formarse el puente de hidrocarburo mediante la utilización de métodos estándares conocidos de la técnica. En el caso de que se utilicen residuos de alilglicina para la formación de puentes de hidrocarburo, las sustituciones preferentemente se llevan a cabo en las posiciones i e i+4 del péptido.

En otra forma de realización particular, asimismo pueden formarse puentes de hidrocarburo mediante la utilización de los derivados de alanina S5, R8 y/o R5, por ejemplo, "olefina S5-aminoácido" es (S)-a-(2'-pentenil)alanina, "olefina R8-aminoácido" es (R)-a-(2'-octenil)alanina y "olefina R5-aminoácido" es (R)-a-(2'-pentenil)alanina.

En una forma de realización particular, la sustitución o sustituciones pueden comprender sustituciones por residuos de derivado de alanina R5 en la posición i y una sustitución por derivado de alanina S5 en la posición i+3.

En otra forma de realización, la sustitución o sustituciones pueden comprender una sustitución por derivado de alanina R8 en la posición i y una sustitución por el derivado de alanina ^s 5 en una de las posiciones i+4 e i+7.

En un clip de ion metal, se forma un puente mediante enlaces de coordinación con un ion metal (por ejemplo, un ion de renio, rutenio o paladio).

En una sustitución de enlace de hidrógeno, se forma un puente de hidrocarburo entre el átomo de nitrógeno aminoterminal de un péptido y la cadena lateral de aminoácidos.

En una forma de realización particular de la invención, se utiliza un puente lactama o un puente de hidrocarburo como reticulador de macrociclo.

En una forma de realización preferida de la invención, el conector que forma un macrociclo comprende una cadena de hidrocarburo, saturada o insaturada, y opcionalmente sustituida.

La cadena de hidrocarburo puede contener entre 6 y 20 átomos de carbono, preferentemente entre 6 y 14 átomos de carbono.

En una forma de realización particular, un grupo -CH2- de la cadena de hidrocarburo tal como se ha definido anteriormente ha sido sustituida por una función amida: -NH-CO-.

En una forma de realización preferida, la cadena de hidrocarburo está insaturada, lo que significa que contiene un doble enlace.

En una forma de realización particular, la cadena de hidrocarburo puede estar sustituida. En particular, los compuestos dihidroxi pueden generarse a partir de la cadena con doble enlace y estos compuestos dihidroxi pueden someterse a una reacción de sustitución.

En una forma de realización particular, el conector que forma macrociclo comprende una cadena de hidrocarburo seleccionada de entre el grupo que consiste en alquileno, alquenileno, alquinileno y derivados de los mismos, preferentemente alquileno.

En una forma de realización particular, el conector que forma macrociclo comprende una cadena de hidrocarburo saturada o insaturada, especialmente saturada, en la que se ha sustituido un grupo -CH2- por una función amida, -NH-CO-.

En una forma de realización particular, el conector de macrociclo es un puente lactama, que consiste en una cadena de hidrocarburo tal como se ha definido anteriormente en la que un grupo -CH2- se ha sustituido por una función amida, -NH-CO-.

En algunas formas de realización, el conector o conectores formadores de macrociclo son un alquenilo de cadena lineal con 6 a 14 átomos de carbono. En algunas formas de realización, el conector o conectores formadores de macrociclo son un alquenilo de cadena lineal con 8 a 12 átomos de carbono, por ejemplo con 8, 9, 10, 11 o 12 átomos de carbono.

En una forma de realización particular, los dos aminoácidos naturales o no naturales reticulados con un conector que forma macrociclo están separados por como mínimo tres aminoácidos (i e i+3), cuatro aminoácidos (i e i+4) o siete aminoácidos (i e i+7), preferentemente por cuatro aminoácidos (i i+4).

Preferentemente se afirma que los dos aminoácidos naturales o no naturales reticulados con un conector que forma macrociclo se encuentran en las posiciones i e i+3, o en las posiciones i e i+4, o en las posiciones i e i+7, preferentemente en las posiciones i e i+4.

En una forma de realización particular, el conector que forma macrociclo conecta los aminoácidos en las posiciones 4 (i) y 8 (i+4) de la secuencia IRAK254-71 (SEC ID n° 1).

En otra forma de realización particular, el conector que forma macrociclo conecta los aminoácidos en las posiciones 4 (i) y 8 (i+4) de la secuencia IRAKM 66-83 (SEC ID n° 2).

En otra forma de realización particular, el conector que forma macrociclo conecta los aminoácidos en las posiciones 8 (i) y 12 (i+4) de la secuencia IRAK254-71 (SEC ID n° 1).

En otra forma de realización particular, el conector que forma macrociclo conecta los aminoácidos en las posiciones 8 (i) y 12 (i+4) de la secuencia IRAKM 66-83 (SEC ID n° 2).

Las secuencias de los péptidos grapados y las posiciones de los aminoácidos se representan en la figura 2B.

En una forma de realización particular, un macrociclo peptidomimético según la invención comprende por lo menos dos pares de aminoácidos naturales o no naturales cada uno de los cuales se retícula independientemente con un conector formador de macrociclo.

Por ejemplo, el péptido puede comprender una o más primeras sustituciones en una primera posición i, una primera posición i+3, una primera posición i+4 y/o una primera posición i+7, en el que la primera o primeras sustituciones permiten formar un enlace covalente entre el aminoácido en la primera posición i y el aminoácido en la primera posición i+3, en la primera posición i+4 o en la primera posición i+7, y una o más segundas sustituciones en una segunda posición i, una segunda posición i+3, una segunda posición i+4 y/o una segunda posición i+7, en el que la segunda o segundas sustituciones permiten la formación de un enlace covalente entre el aminoácido en la segunda posición i y el aminoácido en una segunda posición i+3, una segunda posición i+4 o una segunda posición i+7.

En dichas formas de realización, el conector o conectores que forman macrociclo comprenden un primer y un segundo conector formadores de macrociclo, en el que el primer conector que forma macrociclo conecta un primer y un segundo aminoácidos, en el que el segundo conector que forma macrociclo conecta un tercer y un cuarto aminoácido, en el que el primer aminoácido se encuentra cadena arriba del segundo aminoácido, el segundo aminoácido se encuentra cadena arriba del tercer aminoácido, y el tercer aminoácido se encuentra cadena arriba del cuarto aminoácido. El conector o conectores formadores de macrociclo pueden comprender unos primer y segundo conectores que forman macrociclo que están separados por 2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos. En algunas formas de realización, el conector o conectores que forman macrociclo comprenden un primer y un segundo conector que forman macrociclo y que están separados por 4 o 5 aminoácidos.

En una forma de realización preferida, un macrociclo peptidomimético según la invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en:

SEC ID n° 3 (IRAK2 S1-JMV6645): Ac-X-REL-X-WWWGBRQA-NH2

SEC ID n° 4 (IRAK2 S2-JMV6646): Ac-RREL-X-WWW-X-BRQA-NH2

SEC ID n° 5 (IRAKM S1-JMV6647): Ac-KSG-X-REL-X-WSWAQK-NH2

SEC ID n° 6 (IRAKM S2-JMV6648): Ac-RREL-X-WSW-X-QK-NH2

SEC ID n° 10 (IRAK2-JM6650): Ac-VSI-X-REL-X-WWWGBRQA- NH2

SEC ID n° 11 (IRAKM-JM6649): Ac-KSG-X-REL-X-WSWAQKNKTI-NH2, en el que los aminoácidos no naturales X presentan una terminación olefina y están reticulados por un conector que forma macrociclo, o

SEC ID n° 12 (IRAK2-JMV6651) : Ac-K-REL-D-WWWGBRQA-NH

SEC ID n° 13 (IRAK2-JMV6652) : Ac-VSI-K-REL-D-WWWGBRQATV-NH

SEC ID n° 14 (IRAKM-JMV6653) : Ac-KSG-K-REL-D-WSWAQK-NH

SEC ID n° 15 (IRAKM-JMV6654) : Ac-KSG-K-REL-D-WSWAQKNKTI-NH

en los que los aminoácidos naturales lisina (K) y ácido aspártico (D) están reticulados mediante un conector que forma macrociclo.

En una forma de realización alternativa de SEC ID n° 12 a SEC ID n° 15, la lisina (K) puede sustituirse por ornitina y/o el ácido aspártico (D) puede sustituirse por ácido glutámico (E).

En una forma de realización preferida, el aminoácido no natural X es (S)-2-(4-pentenil)alanina (representado por S5) o un derivado de la misma.

En otra forma de realización preferida, los aminoácidos naturales reticulados mediante un conector que forma macrociclo son los residuos de lisina y de ácido aspártico.

Pueden utilizarse las configuraciones preferidas siguientes para crear puentes de hidrocarburo en los péptidos mediante la utilización de los derivados de alanina S5, R8 y/o R5:

• en una primera forma de realización, la sustitución o sustituciones pueden comprender sustituciones con residuos derivados de alanina S5 en las posiciones i e i+4;

• en otra forma de realización, la sustitución o sustituciones pueden comprender una sustitución con el derivado de alanina R8 en la posición 8 y una sustitución con el derivado de alanina S5 en la posición i+7;

• en otra forma de realización, la sustitución o sustituciones pueden comprender una sustitución con el derivado de alanina R5 en la posición i y una sustitución con el derivado de alanina S5 en la posición i+3.

Dichas configuraciones están representadas en la figura 2A.

El aminoácido en la posición i preferentemente está unido mediante enlace covalente al aminoácido en la posición i+3, i+4 o i+7.

En una forma de realización preferida, la sustitución o sustituciones comprenden sustituciones con residuos de derivado de alanina S5 en las posiciones i e i+4.

En una forma de realización particular, los aminoácidos no naturales alfa-Me olefina pentenil S5-alanina (S5) están conectados mediante un reticulador de solo carbonos entre i e i+4 que comprende un doble enlace.

El macrociclo peptidomimético según la invención generalmente comprende entre 10 y 30 aminoácidos, preferentemente entre 10 y 20 aminoácidos.

Los péptidos grapados según la invención comprenden, además, variantes o análogos funcionalmente equivalentes de los péptidos de la presente invención. Lo anterior incluye péptidos que presentan péptidos con una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras, en comparación con las secuencias de los péptidos indicados en la presente memoria. La sustitución es preferentemente una sustitución conservadora, y no tiene un impacto negativo sobre las propiedades biológicas o estructurales del péptido. Las sustituciones de aminoácidos pueden estar basadas generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. De esta manera, los cambios conservadores de aminoácidos se refieren a un cambio de un aminoácido en una posición particular que puede ser del mismo tipo al originalmente presente, es decir, un aminoácido hidrófobo que se intercambia por un aminoácido hidrófobo, un aminoácido básico que se intercambia por un aminoácido básico, etc. Entre los ejemplos de sustituciones conservadores pueden incluirse, aunque sin limitación, la sustitución de residuos no polares (hidrófobos), tales como isoleucina, valina, leucina o metionina, por otro; la sustitución de un residuo polar (hidrófilo) por otro polar, tal como arginina por lisina o viceversa, glutamina por asparagina o viceversa, glicina por serina o viceversa; la sustitución de un residuo básico, tal como lisina, arginina o histidina, por otro básico; o la sustitución de un residuo ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico, por otro ácido; la sustitución de un aminoácido de cadena ramificada, tal como isoleucina, leucina o valina, por otro ramificado; la sustitución de un aminoácido aromático, tal como fenilalanina, tirosina o triptófano, por otro aromático.

Los ejemplos de dichos cambios conservadores son bien conocidos por el experto en la materia y se encuentran comprendidos dentro del alcance según la presente invención. Una sustitución conservadora puede incluir, además, la utilización de un residuo derivatizado químicamente en lugar de un residuo no derivatizado, con la condición de que el péptido resultante sea un equivalente biológicamente funcional de los péptidos de la invención.

Cualquiera de los péptidos grapados que se indica en la presente memoria asimismo puede incluir diversas modificaciones químicas. Por ejemplo, puede amidarse cualquiera de los péptidos en su extremo carboxiterminal. Alternativa o adicionalmente, puede acetilarse cualquiera de los péptidos en su extremo aminoterminal. Dichas modificaciones reducen la carga total del péptido, lo que puede incrementar la estabilidad debido a que la acetilación/amidación terminal genera un mimético más similar a la proteína nativa. Por lo tanto, dichas modificaciones pueden incrementar la actividad biológica del péptido. Pueden realizarse otras modificaciones en cualquiera de los péptidos indicados en la presente memoria. Por ejemplo, el péptido puede fosforilarse, glucosilarse, PEGilarse, lipidarse, funcionalizarse con una celulosa o con una celulosa modificada, o una combinación de los mismos.

En una forma de realización particular y preferida, los péptidos grapados de la invención se diseñan a partir de secuencias más similares a las secuencias nativas con el fin de obtener un mejor reconocimiento de la diana y una eficiencia de la inhibición mejorada.

Cualquiera de los péptidos indicados en la presente memoria puede comprender, además, un marcaje detectable. El marcaje detectable puede ser biotina, un marcaje magnético, un marcaje paramagnético, un marcaje radioactivo, un marcaje fluorescente, un marcaje radiodenso, un enzima y una combinación de los mismos.

En una forma de realización preferida, un macrociclo peptidomimético según la invención comprende, además, por lo menos un espaciador.

El espaciador puede encontrarse presente entre el péptido grapado y el péptido adicional para mejorar su direccionamiento o penetración celular.

Como "péptido adicional para mejorar el direccionamiento o penetración celular del péptido grapado", puede hacerse mención del péptido de penetración celular, tal como Tat, penetratina o Pep1.

En una forma de realización particular, un macrociclo peptidomimético según la invención comprende, además, por lo menos un péptido de penetración celular.

Método de preparación de macrociclos peptidomiméticos

Se conocen de la técnica diversos métodos para conseguir la formación de macrociclos peptidomiméticos. Por ejemplo, la preparación de macrociclos peptidomiméticos según la invención se describe en Yu et al. (Chem. Soc. Rev., 2015, 44, 91).

La síntesis de péptidos puede llevarse a cabo manualmente, utilizando condiciones de fase sólida, la amida Rink AmphiSpheres (Agilent) y reacciones de grupo protector Fmoc de la cadena principal. Para el acoplamiento de los aminoácidos protegidos con Fmoc naturales (Iris Biotech), se utilizaron los aminoácidos no naturales S5, R5 y R8 o los aminoácidos naturales Lys (K) y Asp (D), equivalentes de aminoácidos y una proporción molar específica de reactivos de acoplamiento. Los extremos N-terminales de los péptidos sintéticos se acetilaron, mientras que se aminaron los extremos C-terminales.

Una manera preferida de producir los precursores peptidomiméticos y macrociclos peptidomiméticos indicados en la presente memoria utiliza la síntesis peptídica en fase sólida (SPFS). El aminoácido C-terminal se unió a una resina de poliestireno reticulado mediante un enlace lábil a los ácidos con una molécula de conector. Dicha resina es insoluble en los solventes utilizados para la síntesis, haciendo que resulte relativamente simple y rápido eliminar mediante lavado el exceso de reactivos y productos secundarios. El extremo N-terminal se protege con el grupo Fmoc, que es estable en ácidos, aunque eliminable con bases. Los grupos funcionales de cadena lateral se protegen según resulte necesario con grupos lábiles a ácidos y estables frente a bases.

Tras la incorporación de los aminoácidos no naturales S5, R5 y R8 en los polipéptidos precursores, se hacen reaccionar las olefinas terminales con un catalizador de metátesis, conduciendo a la formación del macrociclo peptidomimético.

En dichas formas de realización, los reactivos de macrociclización o reactivos de formación de macrociclo son catalizadores de metátesis, incluyendo, aunque sin limitación, los catalizadores complejos de carbeno de metal de transición tardío estabilizados, tales como los catalizadores de carbeno de metal de transición de grupo VIII. Por ejemplo, dichos catalizadores son centros metálicos de Ru y Os con un estado de oxidación 2, un recuento de electrones de 16 y que están pentacoordinados. Se dan a conocer diversos catalizadores en Grubbs et al., Acc. Chem. Res. 1995, 28, 446-452; Yu et al., Nature 2011, 479, 88 y Peryshkov et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 20754.

En algunas formas de realización, la etapa de contacto se lleva a cabo en un solvente seleccionado de entre el grupo que consiste en solvente prótico, solvente acuoso, solvente orgánico y mezclas de los mismos. Por ejemplo, el solvente puede seleccionarse de entre el grupo que consiste en H2O, THF, THF / H2O, tBuOH/H2O, DMF, DIEA, CH3CN o CH2CI2, CICH2CH2CI o una mezcla de los mismos. En una forma de realización particular se utiliza DMF. El péptido se purifica y se caracteriza mediante métodos estándares.

En una forma de realización particular, un método de preparación de un macrociclo peptidomimético según la invención comprende por lo menos las etapas siguientes:

(i) proporcionar una pluralidad de péptidos que comprende grupos de protección, en el que cada péptido se inmoviliza sobre un soporte sólido,

(ii) exponer un reactivo de desprotección a los péptidos inmovilizados para eliminar los grupos protectores de por lo menos una parte del péptido inmovilizado,

(iii) eliminar por lo menos una parte del reactivo de desprotección,

(iv) solubilizar los residuos aminoácidos protegidos en un solvente, preferentemente DMF,

(v) utilizar un reactivo de acoplamiento, preferentemente HATU,

(vi) utilizar un reactivo base, preferentemente DIEA,

(vii) exponer residuos aminoácidos protegidos y reactivo de acoplamiento a los péptidos inmovilizados de manera que por lo menos una parte de los residuos aminoácidos activados se una a los péptidos inmovilizados, formando residuos aminoácidos nuevamente enlazados, y

(viii) eliminar por lo menos una parte de los residuos aminoácidos activados que no se enlacen a los péptidos inmovilizados,

(ix) exponer el polipéptido lineal final a reactivo catalizador de Grubb para la reacción de metátesis, generando el macrociclo peptidomimético,

(x) exponer el macrociclo peptidomimético final a agentes de escisión para la desprotección final,

(xi) precipitación, purificación y liofilización del macrociclo peptidomimético final, para obtener preferentemente una pureza superior a 95%.

En el caso de una preparación de péptidos grapados con puentes lactama, la etapa (ix) de exponer el polipéptido lineal final a reactivo catalizador de Grubb para la reacción de metátesis, generando el macrociclo peptidomimético, se sustituye por a) la etapa (ix), de desprotección, seguido de b), la etapa (ix), de ciclización.

Composiciones y combinación

Otro objeto de la invención es una composición farmacéutica que comprende por lo menos un macrociclo peptidomimético tal como se ha definido anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender, además, un adyuvante o ingrediente adicional. El adyuvante o ingrediente adicional puede potenciar la actividad biológica de uno o más péptidos.

En una forma de realización particular, la composición farmacéutica comprende por lo menos un macrociclo peptidomimético y por lo menos un ingrediente adicional y/o activo seleccionado de entre el grupo que consiste en compuestos antiinflamatorios, compuestos antimetabolito, compuestos de direccionamiento celular, preferentemente compuestos de direccionamiento de macrófagos y/o compuestos constituyentes de liposomas, y mezclas de los mismos.

Como "compuestos antiinflamatorios" puede hacerse mención de los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) y de los glucocorticoides (fármacos antiinflamatorios esteroideos).

Como "compuestos antimetabolito" puede hacerse mención del metotrexato, utilizado en la poliartritis reumatoide. En una forma de realización particular, el macrociclo o macrociclos peptidomiméticos pueden proporcionarse en un liposoma o formulación lipídica.

La composición farmacéutica puede formularse para inyección (por ejemplo, una inyección intramuscular, subcutánea, intravenosa o intraperitoneal), la administración oral, la administración tópica, la administración transdérmica, la administración intranasal o la inhalación.

En una forma de realización preferida, la composición farmacéutica puede formularse para la inyección, en particular la inyección intravenosa.

Los portadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por el experto en la materia y entre ellos se incluyen, por ejemplo, solución salina estéril, lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrina, agar, pectina, aceites vegetales, agua desionizada y mezclas de los mismos.

La composición farmacéutica puede comprender uno o más estabilizadores. Por ejemplo, el estabilizador puede comprender un carbohidrato (por ejemplo, sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, dextrina, glucosa o una combinación de los mismos), una proteína, tal como albúmina o caseína, y/o un tampón (por ejemplo, un fosfato alcalino).

Otro objeto de la invención es una combinación que comprende un macrociclo peptidomimético tal como se ha definido anteriormente y por lo menos un ingrediente y/o activo adicional tal como se ha definido anteriormente. El macrociclo peptidomimético y el ingrediente adicional pueden prepararse para un uso simultáneo, secuencial o consecutivo.

El ingrediente y/o activo adicional se han definido anteriormente.

Los macrociclos peptidomiméticos proporcionados en la presente memoria incluyen, además, derivados farmacéuticamente aceptables o profármacos de los mismos.

Un "derivado farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquier sal, éster, sal de un éster, profármaco u otro derivado farmacéuticamente aceptable de un compuesto de la presente invención que, al administrarse en un receptor, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto de la presente invención.

Entre algunos derivados farmacéuticamente aceptables se incluyen un grupo químico que incrementa la solubilidad acuosa o transporte activo del macrociclo peptidomimético.

La preparación farmacéutica puede encontrarse preferentemente en forma de administración unitaria. La forma de administración unitaria puede ser un preparado envasado, que contiene cantidades discretas de preparado, tal como comprimidos envasados, cápsulas y polvos en viales o ampollas.

En el caso de que las composiciones de la presente invención comprendan una combinación de un macrociclo peptidomimético y uno o más agentes terapéuticos o profilácticos adicionales, tanto el compuesto como el agente adicional deben encontrarse presentes a niveles de dosis de entre aproximadamente 1% y 100%, y más preferentemente de entre aproximadamente 5% y 95%, de la dosis normalmente administrada en un régimen de monoterapia. En algunas formas de realización, los agentes adicionales se administran, como parte de un régimen de múltiples dosis, por separado de los compuestos de la presente invención. Alternativamente, dichos agentes son parte de una forma de administración única, mezclada con los compuestos de la presente invención en una única composición.

Entre las vías de administración adecuadas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la administración oral, intravenosa, rectal, mediante aerosol, parenteral, oftálmica, pulmonar, transmucosal, transdérmica, vaginal, ótica, nasal y tópica. Además, exclusivamente a título de ejemplo, la administración parenteral incluye la inyección intramuscular, subcutánea, intravenosa e intramedular, así como la inyección intratecal, intraventricular directa, intraperitoneal, intralinfática e intranasal. A título de ejemplo, el macrociclo peptidomimético se administra en un sistema de administración farmacológica dirigida, por ejemplo, en un liposoma, preferentemente un liposoma catiónico. En una forma de realización preferida, el macrociclo peptidomimético se administra en un liposoma asimilado en un sistema de fagocitos mononucleares (SFM) y se dirige a los tejidos u órganos inflamados.

En una forma de realización particular, la vía de administración adecuada incluye la administración intravenosa.

Usos

La presente invención se refiere, además, a un macrociclo peptidomimético tal como se ha indicado anteriormente, o una composición farmacéutica o una combinación según la invención, para la utilización como fármaco.

En una forma de realización particular, la invención se refiere a un macrociclo peptidomimético tal como se ha indicado anteriormente, o una composición farmacéutica o una combinación según la invención, para la utilización en la prevención o el tratamiento de la inflamación, en particular la inflamación aguda o crónica.

En una forma de realización preferida, la invención se refiere a un macrociclo peptidomimético tal como se ha indicado anteriormente, o una composición farmacéutica o una combinación según la invención, para la utilización en la prevención o el tratamiento de trastornos inflamatorios agudos y crónicos, incluyendo enfermedades infecciosas o autoinmunitarias, especialmente tuberculosis, sepsis, meningitis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn, diabetes de tipo 2, cáncer, enfermedades cardiovasculares, o enfermedades causadas por microorganismos patógenos, tales como bacterias, virus, parásitos u hongos.

Rutina de administración

Tal como se ilustra adicionalmente en los ejemplos, el macrociclo peptidomimético de la invención es eficiente e incluso posee una eficiencia específica según si su uso es bajo condiciones "simultáneas", "preventivas" o "curativas".

La expresión "condiciones simultáneas" se refiere a que el macrociclo peptidomimético de la invención resulta eficiente y todavía más eficiente durante la fase aguda o crónica de una inflamación. La fase aguda de una inflamación puede preverse mediante la detección de marcadores de inflamación y el macrociclo peptidomimético de la invención se utiliza ventajosamente durante la fase aguda de la inflamación o durante una inflamación crónica.

La expresión "condiciones preventivas" se refiere a que el macrociclo peptidomimético de la invención resulta eficiente y todavía más eficiente antes de la inflamación. La inflamación puede preverse mediante la detección de marcadores de inflamación y el macrociclo peptidomimético de la invención se utiliza ventajosamente antes de dicha fase aguda de inflamación, por ejemplo por lo menos 12 horas antes, preferentemente 8 horas antes, y en particular 4 horas antes de la inflamación.

La expresión "condiciones curativas" se refiere a que el macrociclo peptidomimético de la invención resulta eficiente y todavía más eficiente después del diagnóstico de la inflamación. La inflamación puede preverse mediante la detección de marcadores de inflamación y el macrociclo peptidomimético de la invención se utiliza ventajosamente antes de iniciarse la inflamación, por ejemplo por lo menos 4 horas después, en particular 8 horas después, e incluso 12 horas después de la inflamación.

Por lo tanto, otro objeto de la invención es un macrociclo peptidomimético de la invención, o una composición farmacéutica que lo contiene, o una combinación del macrociclo peptidomimético y un ingrediente y/o activo adicional seleccionado de entre el grupo que consiste en compuestos antiinflamatorios, compuestos de direccionamiento celular, preferentemente compuestos de direccionamiento de macrófagos, y/o compuestos constituyentes de los liposomas, y mezclas de los mismos, para la utilización en la prevención o el tratamiento de la inflamación, en particular la inflamación aguda o crónica, en el que el macrociclo peptidomimético se administra antes, durante y/o después del diagnóstico de un trastorno inflamatorio.

En una forma de realización particular, el macrociclo peptidomimético de tipo "IRAK2" de la invención, es decir, SEC ID n° 3 (IRAK2 S1 JMV6645), SEC ID n° 4 (IRAK2 S2 JMV6646) y SEC ID n°10 (IRAK2-JM6650), puede utilizarse ventajosamente bajo condiciones simultáneas y/o curativas.

En otra forma de realización particular, el macrociclo peptidomimético de tipo "IRAKM" de la invención, es decir, SEC ID n° 5 ((IRAKM S1 JMV6647), SEC ID n° 6 (IRAKM S2 JMV6648) y SEC ID n° 11 (IRAKM-JM6649) puede utilizarse ventajosamente bajo condiciones simultáneas y/o curativas.

Figuras

Figura 1: esquema de la ruta de los TRL.

Figura 2A: representaciones de macrociclos peptidomiméticos o péptidos grapados.

Figura 2B: representaciones de las secuencias de los péptidos grapados y posiciones de aminoácidos.

Figura 3: inhibición del estrés del retículo endoplasmático (RE) por el péptido grapado IRAK2 S1.

La figura 3A representa la cinética de expresión de los ARN de IRAK2 e IRAK1 después del tratamiento con tunicamicina.

La figura 3B representa la expresión de genes clave de estrés del RE.

La figura 3C representa el efecto de respuesta a la dosis de péptido IRAK2-S1 sobre la inhibición de la expresión génica de estrés del RE.

La figura 3D representa la especificidad del péptido IRAK2-S1.

Figura 4: inhibición de la inducción de la IL-1p producida por monocitos durante la diferenciación macrófaga, por el péptido grapado IRAK2-S1.

La figura 4A representa el nivel de expresión del ARN de IL-1p producido por los monocitos.

La figura 4B representa el nivel de proteínas IL-1p en el sobrenadante.

Figura 5: inhibición de la inducción por LPS de las citocinas proinflamatorias por los péptidos grapados IRAK2-S1 e IRAKM-S1.

Figura 6 : representa tres condiciones diferentes de estimulación con LPS: una condición en la que la estimulación con LPS de los monocitos y la adición de péptidos grapados se llevan a cabo a la vez (condición simultánea: A); una en que se añaden los péptidos grapados 6 horas antes (condición preventiva: B) o una en que se añaden 6 horas después de la estimulación con LPS (condición curativa: C).

Figura 7: representa la inhibición de IL-6 y la expresión TNFa tras la condición de estimulación con LPS de los monocitos con la adición de péptidos grapados a la vez (condición simultánea: 7A), 6 horas antes (condición preventiva: 7B) o después (condición curativa: 7C) de la estimulación con LPS.

Figura 8: evaluación de la eficacia de los péptidos grapados IRAK2-JMV6649 e IRAKM-JMV6650 sobre la condición "Simultánea".

Figura 9: evaluación de la eficacia de los nuevos péptidos grapados IRAK2-JMV6649 e IRAKM-JMV6650 sobre la condición "Preventiva" (9A) y la condición "Curativa" (9B).

Los ejemplos no limitativos a continuación se proporcionan con el fin de ilustrar adicionalmente la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: preparación y caracterización de los péptidos grapados IRAK2 e IRAKM.

1.1 Síntesis de péptidos grapados con puentes de hidrocarburo.

La síntesis de los péptidos grapados IRAK2 e IRAKM se lleva a cabo manualmente mediante la metodología de SPPS. La escala de la síntesis es de 0.1 mmol, con una resina de amida Rink Amphisphere 40-RAM cargada a 0.4 mmol/g y se utilizó un exceso de 5 equivalentes para los aminoácidos protegidos. Todos los aminoácidos protegidos, así como el agente de acoplamiento hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N-tetrametiluronio (HATU), se solubilizaron previamente en DMF para preparar soluciones madre de una concentración de 0.5 M. La resina se hinchó inicialmente en 6 ml de DMF durante 15 minutos bajo agitación con vórtex. Tras eliminar el DMF mediante filtración, se llevó a cabo la desprotección del grupo Fmoc mediante la adición de solución de piperidina al 20% /DMF (6 ml) bajo agitación con vórtex durante 1 minuto. La operación anterior se llevó a cabo dos veces. La resina se lavó 3 veces con DMF.

Se añadieron sucesivamente el aminoácido deseado (1 ml, 0.5 mmoles), N,N-diisopropiletilamina (DIEA) (0.164 ml, 1 mmol) y agente de acoplamiento de HATU (1 ml, 0.5 mmoles) y se sometieron a agitación durante 5 minutos bajo agitación con vórtex. Dicha operación se llevó a cabo dos veces con un lavado con DMF entre los dos acoplamientos. Con respecto al aminoácido S5 ((S)-a-(2'-pentenil)alanina), se llevó a cabo un acoplamiento simple con un tiempo de agitación de 1 hora. Dicha desprotección del Fmoc y el acoplamiento de los aminoácidos se repitieron hasta obtener la secuencia lineal esperada. Una vez se ha sintetizado el péptido lineal, se inicia una reacción de metátesis mediante la utilización del catalizador de Grubbs de primera generación (0.04 mmoles) en DCE (6 ml) bajo agitación con vórtex durante 2 horas. Dicha reacción se llevó a cabo dos veces con un lavado de DCM entre cada reacción de metátesis.

Una vez el péptido ha sido grapado, se lleva a cabo la desprotección del grupo Fmoc terminal y se lleva a cabo una reacción de acetilación con una solución de anhídrido acético en presencia de DIEA en DMF (1/1/8) durante 10 minutos. El corte final del péptido se llevó a cabo en la presencia de una solución (10 ml) de ácido trifluoroacético, triisopropilsilano y agua (95/2.5/2.5). Después de la filtración, se concentró la solución y se añadió a éter dietílico. Se centrifugó el precipitado y se decantaron los licores madre. Lo anterior se llevó a cabo dos veces. Se introdujo el precipitado en agua y se liofilizó, obteniendo el péptido completamente desprotegido. Una vez liofilizado, el péptido se purificó en HPLC de fase inversa preparativa bajo eluciones con acetonitrilo/agua en presencia de TFA al 0.1%. De esta manera se obtuvo el péptido grapado con una pureza preferentemente superior a 95%.

1.2 Síntesis de péptidos grapados con puentes lactama.

La síntesis de los péptidos lactama IRAK2 e IRAKM se llevó a cabo manualmente mediante la metodología de SPPS. La escala de la síntesis es de 0.1 mmol, con una resina de amida Rink Amphisphere 40-RAM cargada a 0.4 mmol/g y se utilizó un exceso de 5 equivalentes para los aminoácidos protegidos. Todos los aminoácidos protegidos, así como el agente de acoplamiento hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HATU), se solubilizaron previamente en DMF para preparar soluciones madre de una concentración de 0.5 M. La resina se hinchó inicialmente en 6 ml de DMF durante 15 minutos bajo agitación con vórtex. Tras eliminar el DMF mediante filtración, se llevó a cabo la desprotección del grupo Fmoc mediante la adición de solución de piperidina al 20% /DMF (6 ml) bajo agitación con vórtex durante 1 minuto. Lo anterior se llevó a cabo dos veces. La resina se lavó 3 veces con DMF.

Se añadieron sucesivamente el aminoácido deseado (1 ml, 0.5 mmoles), N,N-diisopropiletilamina (DIEA) (0.164 ml, 1 mmol) y agente de acoplamiento HATU (1 ml, 0.5 mmoles) y se sometieron a agitación durante 5 minutos bajo agitación con vórtex. Dicha operación se llevó a cabo dos veces con un lavado con DMF entre los dos acoplamientos. Con respecto al aminoácido fmoc-L-Lys(alloc)-OH y Fmoc-L-Asp(Oall)-OH, se llevó a cabo un acoplamiento simple durante un tiempo de agitación de 1 hora. Dicha desprotección del Fmoc y el acoplamiento de los aminoácidos se repitieron hasta obtener la secuencia lineal esperada. Una vez se había sintetizado el péptido, se inició una desprotección de alloc y alilo mediante la utilización de tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) (0.04 mmoles) con fenilsilano (2 mmoles) en DCM (6 ml) bajo agitación con vórtex durante 30 minutos. Dicha reacción se llevó a cabo dos veces con un lavado de DCM entre cada reacción de desprotección. Después de la desprotección, se produjo la lactama con N,N-diisopropiletilamina (DIEA) (0.100 ml, 0.6 mmoles) y agente de acoplamiento HATU (0.6 ml, 0.3 mmoles).

Una vez el péptido es una lactama, se lleva a cabo la desprotección del grupo Fmoc terminal y se lleva a cabo una reacción de acetilación con una solución de anhídrido acético en presencia de DIEA en DMF (1/1/8) durante 10 minutos. El corte final del péptido se llevó a cabo en la presencia de una solución (10 ml) de ácido trifluoroacético, triisopropilsilano y agua (95/2.5/2.5). Después de la filtración, se concentró la solución y se añadió a éter dietílico. Se centrifugó el precipitado y se decantaron los licores madre. Lo anterior se llevó a cabo dos veces. Se introdujo el precipitado en agua y se liofilizó, obteniendo el péptido completamente desprotegido. Una vez liofilizado, el péptido se purificó en HPLC de fase inversa preparativa bajo eluciones con acetonitrilo/agua en presencia de TFA al 0.1%. De esta manera se obtuvo el péptido grapado con una pureza preferentemente superior a 95%.

1.3 Caracterización

La purificación de los compuestos reticulados se consiguió mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) (PLC2250 Gilson) en una columna C18 de fase inversa (Waters), proporcionando los compuestos puros.

Se confirmó la composición química de los productos purificados mediante espectrometría de masas CL/EM (Micromass ZQ conectado con el sistema de HPLC Waters 2790) y análisis de aminoácidos (cromatografía líquida de alto rendimiento Beckman System Gold).

Se presentan los resultados en la tabla 3, a continuación:

Tabla 3

Ejemplo 2: evaluación de la especificidad y de la eficiencia de los péptidos grapados sobre la diana IRAK2 2.1 Activación del estrés del retículo endoplasmático (estrés del ER)

En la célula, la mayoría de las proteínas secretadas y membranales se sintetiza en el retículo endoplasmático, en el que se pliegan y ensamblan antes de ser transportadas. Bajo determinadas condiciones, las proteínas de conformación anómala se acumulan en el retículo endoplasmático (ER), induciendo estrés (estrés del ER) y la UPR (respuesta de proteínas no plegadas). El estrés del RE asimismo contribuye a la respuesta inflamatoria mediante la activación del factor de transcripción NF-KB y la transcripción de los genes de inflamación (citocinas proinflamatorias) de maneras diferentes. La respuesta UPR incluye la activación de la transcripción de genes diana y la inhibición profunda de la traducción, lo que incrementa las capacidades de pliegue y degradación y limita la llegada de nuevas proteínas al retículo endoplasmático. Los estudios muestran que la molécula IRAK2 es tanto esencial para la inducción del estrés del retículo endoplasmático (Benosmab et al., PLoS One 2013) como de la respuesta antiviral mediada por TLR (receptor de tipo Toll) fase tardía, mediante la interacción directa con IRAK4, sustituyendo a IRAK1 (Kawagoe et al., Nature Immunol. 2008).

Con el fin de evaluar la especificidad del reconocimiento de los péptidos grapados IRAK2, los presentes inventores indujeron estrés del ER en la línea celular monocítica humana THP-1 mediante tratamiento con tunicamicina (0.1 ^g/ml) durante 8 y 24 h.

Se cultivaron las células THP-1 (300,000 células/pocillo) en RPMI1640 complementado con suero de feto bovino al 10%, penicilina/estreptomicina al 1% y L-glutamina. Las células se trataron con 0.1 ^g/ml de tunicamicina durante 30 min, durante 8 o 24 h. El péptido se solubilizó en DMSO al 4% y se utilizó a concentraciones comprendidas entre 1 y 20 ^M. Se extrajeron los ARN celulares totales con el kit miRNeasy (Qiagen); se midieron los niveles de expresión de los genes mediante RT-qPCR con la tecnología de ensayos Taqman (lifetechnology).

Los presentes inventores han mostrado que IRAK2 es la cinasa principal expresada a las 8 h, en comparación con ^IRAK1 ^{(figura 3A). La medición de la expresión de los genes de} C^hoP, ^{BIP y GRP94 validó la activación del estrés} del ER a las 8 h, tal como se esperaba de acuerdo con la literatura (figura 3B). En el presente estudio se sometieron a ensayo los péptidos IRAK2 Li, IRAKM Li, IRAK2 S1, IRAK2 S2 (Li: péptido lineal y S1 y S2: péptidos grapados). El tratamiento simultáneo de los monocitos con el péptido grapado IRAK2 S1 y tunicamicina bloqueó de una manera dependiente de la dosis la expresión de CHOP, GRP94 y BlP, sugiriendo una inhibición del estrés del ER (figura 3C). Dicha inhibición era específica ya que, con una concentración de péptido grapado de 20 ^M. El péptido grapado de control (Mock S) no presentó ningún efecto (figura 3D). Los resultados de los presentes inventores sugieren que el ^{péptido grapado IRAK2-S1 interactúa específicamente con IRAK4 e inhibe su efecto activador del estrés del e} R.

2.2 Inducción de la diferenciación de los macrófagos

La estimulación de los monocitos THP-1 por PMA (forbol-12-miristato-13-acetato) induce su diferenciación en macrófagos. Lo anterior está asociado a una inducción de la expresión de determinados TLR (2 y 4), miembros de la familia IRAK, la activación de la ruta de NF-kB y la secreción de la citocina proinflamatoria IL-1p. Mediante la utilización de ARN de interferencia contra IRAK1, IRAK2 and IRAK4, el trabajo anterior ha mostrado la reducción de la expresión de IL-1p, tanto al nivel del ARNm como de proteína (Tiwari et al., Journal of Immunology 2011).

Los presentes inventores estimularon los monocitos THP-1 con 0.1 pg/ml de PMA durante 48 h para inducir la diferenciación en macrófagos y los trataron con 20 pM de péptido grapado (IRAK2-S1 o Mock-S).

Se cultivaron las células THP1 (300,000 células/pocillo) en RPMI1640 complementado con suero de feto bovino al 10%, penicilina/estreptomicina al 1% y L-glutamina. Las células se trataron con 0.1 pg/ml de PMA durante 48 h. Los péptidos se solubilizaron en DMSo al 4% y se utilizaron a una concentración de 20 pM. Los péptidos se añadieron junto con el PMA. Se extrajo el ARN total de las células mediante el kit miRNeasy (Qiagen), y se midió el nivel de expresión de IL-1p mediante tecnología de RT-qPCR con ensayos Taqman (lifetechnology).

Tras la extracción de los ARN, los presentes inventores cuantificaron mediante RT-qPCR el nivel de expresión del ARN de IL-1p (figura 4A). Mediante la utilización del método ELISA, se midió la secreción de citocinas en el sobrenadante de las THP-1 tratadas (figura 4B). El péptido IRAK2-S1 fue capaz de bloquear la expresión y la producción de IL-1p a una concentración de 20 pM. A dicha concentración, el péptido aparentemente no presenta ningún efecto sobre la viabilidad y la morfología de las células.

2.3 Inducción de la respuesta a endotoxina

La inflamación es un estado fisiológico complejo que adoptan principalmente las células inmunitarias innatas en respuesta a la infección y/o el daño a los tejidos. Existen adaptaciones para regular una sobreinflamación y funcionan como protección del huésped frente a los choques de endotoxina. Uno de los ejemplos clásicos de dicho mecanismo de protección es la tolerancia a endotoxinas. Es un fenómeno por el que las células u organismos expuestos a concentraciones bajas de endotoxinas (LPS) entran en un estado de hiporrespuesta transitoria en el que son incapaces de responder a nuevas estimulaciones por endotoxinas; en otras palabras, desarrollan un tipo de "tolerancia" a las endotoxinas. Este fenómeno se ha observado tanto in vitro en monocitos y macrófagos como in vivo en modelos animales, así como en el ser humano (Biswas SKet al., Trends in Immunology, 2009). Bajo condiciones de tolerancia, IRAK-M (o IRAK-2) se sobreexpresa en los monocitos (Escoll et al., BBRC, 2003) y regula negativamente la activación de MyD88 dependiente de receptores de tipo Toll (TLR2, TLR4, TLR7/8 y TLR9). La hiporrespuesta en el modelo de THP-1 in vitro de tolerancia a LPS se caracteriza por una expresión reducida de TNFa e IL-6 tras dos estimulaciones consecutivas de LPS, una primera dosis a concentraciones bajas, seguido de una dosis fuerte 18 horas después. Los péptidos grapados imitan la acción del inhibidor natural del Myddosoma, IRAK-M, la exposición de los monocitos ^t HP1 a péptido grapado IRAK-2 se espera que reproduzca las condiciones de tolerancia a LPS.

Se cultivaron células THP1 (300000 células/pocillo) en RPMI1640 complementado con suero de feto bovino al 10%, penicilina/estreptomicina al 1% y L-glutamina. Las células se trataron con 0.1 pg/ml de LPS durante 6 h para TNFa, y durante 24 h para IL-6 e IL-1p. Los péptidos se solubilizaron en DMSO al 4% y se utilizaron a 5 y 20 pM. Los péptidos se añadieron al mismo tiempo que el LPS. La determinación de las citocinas en los sobrenadantes de cultivo se llevó a cabo con los kits de ELISA específicos (eBioscience).

La figura 5 muestra los ensayos ELISA de las citocinas proinflamatorias IL-1p, TNFa e IL-6 secretadas por las células THP1 tras la estimulación con LPS (0.1 pg/ml). El tratamiento de las células con el péptido grapado IRAK2-S1 redujo la expresión de las 3 citocinas de una manera dependiente de la dosis (figura 5A). El tratamiento de las THP-1 con el péptido grapado IRAKM-S1 con una homología de secuencia de 50% respecto a IRAK2-S1 produjo una acción similar de inhibición de la expresión de las 3 citocinas (figura 5B).

Dichos estudios funcionales diferentes muestran que los péptidos grapados según la invención son moduladores de la ruta de TLR mediante inhibición del complejo MyD88/IRAK4/IRAK2, conduciendo a una producción reducida de las citocinas proinflamatorias TNFa, IL-6 e IL-1b.

Ejemplo 3: evaluación de la eficacia de los péptidos grapados IRAK2-S1 e IRAK-M-S1 bajo tres condiciones diferentes: tratamiento simultáneo, curativo o preventivo.

Los ejemplos anteriores muestran que los péptidos grapados imitan la acción del inhibidor de Myddosome natural IRAK-M1. En efecto, se ha probado que la exposición de los monocitos THP1 a los péptidos grapados IRAK2-S1 e IRAKM-S1 seis horas después de la estimulación con LPS reproduce las condiciones de tolerancia a LPS, es decir, la inhibición de la producción de las citocinas IL-6 y TNF-a. El presente ejemplo estudia si las diferentes condiciones experimentales con capaces de mostrar una eficacia mejor. Se compararon tres condiciones diferentes de estimulación con LPS: una condición en la que la estimulación con LPS de los monocitos y la adición de péptidos grapados se llevaron a cabo al mismo tiempo (condición simultánea: A); una condición en la que los péptidos grapados se añadieron 6 horas antes (condición preventiva: B) o una en que se añadieron 6 horas después de la estimulación con LPS (condición curativa: C) (figura 6).

Para todas las condiciones sometidas a ensayo, los monocitos THP-1 se cultivaron (300,000 células/pocillo) en RPMI con suero de feto bovino al 10%, penicilina/estreptomicina al 1% y L-glutamina. Las THP-1 se trataron con 0.1 |jg/ml de LPS durante 24 horas; los péptidos grapados IRAK2-S1 e IRAKM-S1 se utilizaron a concentraciones de entre 1 y 20 jM y se añadieron simultáneamente en la condición A, 6 horas antes del LPS en la condición B y 6 horas después del LPS en la condición C. La cuantificación de las citocinas en los sobrenadantes de cultivo se llevó a cabo con ELISA específicos de IL-6 y TNFa (eBioscience).

Los resultados se representan en la figura 7 y se dan a conocer a continuación:

• Condición "simultánea" (7A): se observó inhibición de la respuesta a dosis en la expresión de TNFa e IL-6 con los dos péptidos sometidos a ensayo. Los péptidos IRAK2-S1 e IRAKM-S1 inhibieron significativamente la secreción de las citocinas TNFa e IL-6 a las concentraciones de 10 y 20 jM , con un efecto mayor para IRAKM-S1 a 20 jM , con una inhibición de hasta 95% y 90% de la expresión de TNFa e IL-6 , respectivamente. Sin embargo, a dicha concentración, el control de péptido Mock-S indujo una inhibición no específica de TNFa e IL-6 de entre 15% y 20% (figura 7A). IRAKM-S1 aparentemente es más eficiente que IRAK2-S1 en la reducción de la producción de citocinas proinflamatorias por los monocitos.

• Condición "preventiva" (7B): Se observó una inhibición de la respuesta a dosis del nivel de expresión de TNFa e IL-6 para IRAKM-S1, que inhibió significativamente la secreción de TNFa (95%) e IL-6 (90%) a una concentración de 20 jM . A esta concentración, IRAK2-S1 inhibió la expresión de TNFa e IL-6 en solo 15% a 20%. No se observó ninguna inhibición de la expresión de las citocinas a 10 jM para IRAK2-S1 (figura 7B). Al contrario que IRAK2-S1, el péptido grapado IRAKM-S1 mostró un efecto de prevención de la expresión de las citocinas proinflamatorias en monocitos THP-1 tras el acoplamiento de TLR4.

• Condición "curativa" (7C): Se observó una inhibición de la respuesta a dosis del nivel de expresión de TNFa para IRAK2-S1, que inhibió significativamente la secreción de TNFa hasta 30% y 70% a 10 y 20 jM , respectivamente. A 20 jM , IRAKM-S1 inhibió la expresión de TNFa en solo 15% a 20%. No se observó ninguna inhibición de la expresión de las citocinas a 10 jM para IRAKM-S1 (figura 7C). Finalmente, no se observó ningún efecto sobre el nivel de expresión de IL-6 para esta condición para ambos péptidos grapados (figura 7C). Al contrario que IRAKM-S1, el péptido grapado IRAK2-S1 mostró un efecto curativo de la expresión de TNFa en monocitos THP-1 tras el acoplamiento de TLR4.

Estos resultados demuestran que IRAKM-S1 es más eficiente bajo las condiciones simultánea y preventiva que bajo la condición curativa. IRAK2-S1 es más eficiente bajo las condiciones simultánea y curativa que bajo la condición preventiva. El experto en la materia será capaz de adaptar la rutina de administración de dichos péptidos grapados, considerando la condición y/o el trastorno que debe tratarse, y basándose en la eficiencia y el comportamiento de cada péptido grapado.

Ejemplo 4: evaluación de los nuevos péptidos grapados IRAKM-JMV6649 e IRAK2-JMV6650

Se evaluó la eficacia in vitro de los nuevos péptidos grapados IRAKM-JMV6649 e IRAK2-JMV6650 en la imitación de las secuencias naturales de IRAK254-71 e IRAKM 66-83 y se comparó con IRAK2-S1 e IRAK-M-S1 bajo tres condiciones diferentes: tratamiento simultáneo, curativo y preventivo.

Para todas las condiciones sometidas a ensayo, los monocitos THP-1 se cultivaron (300,000 células/pocillo) en RPMI con suero de feto bovino al 10%, penicilina/estreptomicina al 1% y L-glutamina. Las THP-1 se trataron con 0.1 jg/m l de LPS durante 24 horas, los péptidos grapados IRAK2-S1, IRAK2-JMV6650, IRAKM-S1 e IRAKM-JMV6649 a concentraciones de entre 10 y 20 jM y se añadieron a la vez en la condición "simultánea", 6 horas antes del LPS en la condición "preventiva" y 6 horas después del LPS en la condición "curativa". Mediante la utilización de ELISA (eBioscience), se llevó a cabo la cuantificación de IL-6 y TNFa en sobrenadantes de cultivo de monocitos.

Los resultados para la condición "simultánea" se presentan en la figura 8 y se dan a conocer a continuación:

Condición "simultánea": a 20 jM , IRAKM-JMV6649 redujo en más de 70% la secreción de IL-6 en comparación con el péptido IRAKM-S1, aunque no mostró ningún efecto inhibitorio aditivo de la expresión de TNFa (figura 8A). No se observó una mayor eficacia del péptido IRAK2 con la modificación JMV6650 (figura 8B).

Los resultados para las condiciones "preventiva" y "curativa" se presentan en la figura 9 y se dan a conocer posteriormente:

Condición "preventiva": el péptido IRAKM-JMV6649 induce una mayor inhibición de la expresión de IL-6 que el péptido IRAKM-S1, con una inhibición adicional de 60% a 10 pM y de 90% a 20 pM. La inhibición de la expresión de TNFa es superior con el péptido modificado IRAKM-JMV6649, alcanzado el 20% a 10 pM. (Figura 9a ). No se observó una mayor eficacia del péptido IRAK2 con la modificación JMV6650 (datos no representados).

Condición "curativa": Los nuevos péptidos no mostraron ninguna inhibición adicional significativa de la expresión de las citocinas. Aunque |Ra K2-JMV6650 tendió a reducir la producción de TNFa más eficientemente que IRAK2-S1, el efecto no era significativo y actúa igual que IRAK2-S1 a 20 pM sobre la expresión de IL-6. IRAKM-JMV6649 presenta una tendencia a incrementar la inhibición de la expresión de TNFa e IL-6 a 20 pM en comparación con IRAKM-S1, pero nuevamente el efecto no era significativo (figura 9B).

Estos resultados demuestran que las modificaciones químicas de la secuencia peptídica de IRAKM proporcionan un beneficio para la inhibición de la expresión de IL-6 por los monocitos bajo las condiciones de tratamiento "simultánea" y "preventiva". Por el contrario, las realizadas en la secuencia del péptido IRAK2 no produjeron ningún beneficio significativo en ninguna de las condiciones de tratamiento sometidas a ensayo.

Todos estos resultados prueban que los péptidos grapados según la invención son eficientes, aunque con especificidades de comportamiento: algunos de ellos resultan más eficientes en la condición preventiva (antes del diagnóstico de una inflamación); algunos resultan más eficientes en la condición simultánea (durante la inflamación) y algunos resultan más eficientes en la condición curativa (después del diagnóstico de una inflamación). Los péptidos grapados IRAK2-JMV6650 e IRAKM-JMV6649 son tan eficientes como IRAK2-S1 o IRAKM-S1, mostrando que las modificaciones en sus extremos Ac y NH2 para imitar las secuencias naturales de IRAK254-71 e IRAKM 66-83 no tienen un impacto sobre su eficiencia.

Sumario

La presente invención se refiere a macrociclos peptidomiméticos con 10 a 30 aminoácidos que comprenden por lo menos un conector formador de macrociclo y una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en:

(i) una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de por lo menos 65%, 70%, 80%, 90% o 95% respecto a la secuencia humana de IRAK254-71 (SEC ID n° 1) y una identidad de 100% respecto a los aminoácidos en las posiciones 5-6, 9-11, 14-15, o

(ii) una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de por lo menos 70%, 80%, 90% o 95% respecto a la secuencia humana de IRAKM 66-83 (SEC ID n° 2) y una identidad de 100% respecto a los aminoácidos en las posiciones 5-6, 9-11, 13-15 y 13-14,

en los que el macrociclo peptidomimético comprende una hélice a y por lo menos dos aminoácidos naturales o no naturales reticulados por un conector que forma macrociclo en las posiciones i e i+3, o en las posiciones i e i+4, o en las posiciones i e i+7, y en los que el porcentaje de identidad se calcula de la manera siguiente: (número de posiciones idénticas/número total de posiciones solapantes) x 100. Se refiere, además, a una composición farmacéutica y utilizaciones de la misma, en particular como inhibidores de las rutas inflamatorias.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Macrociclo peptidomimético de 10 a 30 aminoácidos que comprende por lo menos un conector que forma macrociclo y una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en:

(i) una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de por lo menos 65%, 70%, 80%, 90% o 95% respecto a una secuencia humana IRAK2 54-71 (SEC ID n° 1) y una identidad de 100% con los aminoácidos en las posiciones 5-6, 9-11, 14-15, o

(ii) una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de por lo menos 70%, 80%, 90% o 95% respecto a una secuencia humana IRAKM 66-83 (SEC ID n° 2) y una identidad de 100% con los aminoácidos en las posiciones 5-6, 9-11, 13-14,

en el que el macrociclo peptidomimético comprende una hélice a y por lo menos dos aminoácidos naturales 0 no naturales reticulados por un conector que forma macrociclo en las posiciones i e i+3, o las posiciones 1 e i+4 o las posiciones i e i+7,

en el que el porcentaje de identidad se calcula como sigue: número de posiciones idénticas/número total de posiciones que se solapan x 100.

2. Macrociclo peptidomimético según la reivindicación 1, en el que el conector que forma macrociclo comprende una cadena de hidrocarburo, saturada o insaturada, y opcionalmente sustituida.

3. Macrociclo peptidomimético según la reivindicación 2, en el que el conector que forma macrociclo comprende una cadena de hidrocarburo seleccionada de entre el grupo que consiste en alquileno, alquenileno, alquinileno y derivados de los mismos, preferentemente alquileno.

4. Macrociclo peptidomimético según la reivindicación 2, en el que un grupo -CH2- de dicha cadena de hidrocarburo ha sido sustituido por una función amida -NH-CO-.

5. Macrociclo peptidomimético según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los dos aminoácidos naturales o no naturales reticulados por un conector que forma macrociclo están en las posiciones i e i+4.

6. Macrociclo peptidomimético según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en

SEC ID n° 3 (IRAK2 S1): Ac-X-REL-X-WWWGBRQA-NH2

SEC ID n° 4 (IRAK2 S2): Ac-RREL-X-WWW-X-BRQA-NH2

SEC ID n° 5 (IRAKM S1): Ac-KSG-X-REL-X-WSWAQK-NH

SEC ID n° 6 (IRAKM S2): Ac-RREL-X-WSW-X-QK-NH2

SEC ID n° 10 (IRAK2-JMV6650) Ac-VSI-X-REL-X-WWWGBRQATV- NH2

SEC ID n° 11 (IRAKM-JMV6649) Ac-KSG-X-REL-X-WSWAQKNKTI-NH

en el que los aminoácidos no naturales X están terminados por olefinas y reticulados por un conector que forma macrociclo, o

SEC ID n° 12 (IRAK2-JMV6651): Ac-K-REL-D-WWWGBRQA-NH

SEC ID n° 13 (IRAK2-JMV6652): Ac-VSI-K-REL-D-WWWGBRQATV-NH

SEC ID n° 14 (IRAKM-JMV6653): Ac-KSG-K-REL- D-WSWAQK-NH2

SEC ID n° 15 (IRAKM-JMV6654): Ac-KSG-K-REL- D-WSWAQKNKTI-NH2

en el que los aminoácidos naturales lisina (K) y ácido aspártico (D) están reticulados mediante un conector que forma macrociclo.

7. Macrociclo peptidomimético según la reivindicación 6 , en el que el aminoácido no natural X es (S)-2-(4'-pentenil)alanina o un derivado de la misma.

8. Macrociclo peptidomimético según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además por lo menos un espaciador.

9. Macrociclo peptidomimético según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además por lo menos un péptido de penetración celular.

10. Composición farmacéutica que comprende por lo menos un macrociclo peptidomimético como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y por lo menos un portador farmacéuticamente aceptable.

11. Composición farmacéutica según la reivindicación 10, que comprende por lo menos un ingrediente y/o activo adicional seleccionado de entre el grupo que consiste en compuestos antiinflamatorios, compuestos de direccionamiento celular, preferentemente compuestos de direccionamiento de macrófagos y/o compuestos constituyentes de liposomas, y mezclas de los mismos.

12. Combinación que comprende un macrociclo peptidomimético como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y por lo menos un ingrediente y/o activo adicional como se define en la reivindicación 11.

13. Macrociclo peptidomimético según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o composición farmacéutica según la reivindicación 10 u 11, o combinación según la reivindicación 12, para la utilización como un fármaco.

14. Macrociclo peptidomimético según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o composición farmacéutica según la reivindicación 10 u 11, o combinación según la reivindicación 12, para la utilización en la prevención o el tratamiento de la inflamación, en particular la inflamación aguda o crónica.

15. Macrociclo peptidomimético según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o composición farmacéutica según la reivindicación 10 u 11, o combinación según la reivindicación 12, para la utilización en la prevención o el tratamiento de trastornos inflamatorios agudos y crónicos que incluyen enfermedades infecciosas o autoinmunitarias, especialmente tuberculosis, sepsis, meningitis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn, diabetes de tipo 2, cáncer, enfermedades cardiovasculares, o una enfermedad causada por microorganismos patógenos, tales como bacterias, virus, parásitos u hongos.

16. Macrociclo peptidomimético según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o composición farmacéutica según la reivindicación 10 u 11, o combinación según la reivindicación 12, para la utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el/la que el macrociclo peptidomimético se administra antes, durante y/o después del diagnóstico de un trastorno inflamatorio.