ES2931037T3 - Herramienta eficiente de administración de genes con un amplio margen terapéutico - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a nuevas saponinas de acuerdo con la fórmula (I) que comprenden residuos de acetilo en dos de sus residuos de azúcar (donde al menos dos instancias de R1 y dos instancias de R2 representan Ac). Estas saponinas son capaces de mejorar la eficacia de la transfección en gran medida y muestran efectos secundarios citotóxicos más bajos en comparación con las saponinas conocidas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Herramienta eficiente de administración de genes con un amplio margen terapéutico
La presente invención se refiere a una saponina de acuerdo con el preámbulo de la reivindicación 1, a usos de dicha saponina de acuerdo con los preámbulos de las reivindicaciones 4 y 6, a una composición de transfección de acuerdo con el preámbulo de la reivindicación 8, a un método para una transfección in vitro de acuerdo con el preámbulo de la reivindicación 10, y a un método para aislar dicha saponina de acuerdo con el preámbulo de la reivindicación 15.
En las últimas décadas, la terapia génica se ha vuelto cada vez más importante. La terapia génica se aplica con el fin de curar enfermedades graves que de otro modo serían difíciles de tratar. Trastornos genéticos tales como la hemofilia A, la fibrosis quística o diferentes tipos de cáncer vienen siendo objeto de las nuevas terapias génicas desarrolladas. Hoy en día, existen varias técnicas para administrar material genético en una célula de mamífero. No obstante, las terapias génicas tienen que cumplir ciertas condiciones con el fin de poder aplicarse en la clínica. Aparentemente, uno de los requisitos más cruciales es una transferencia génica eficiente que no tenga, preferentemente, efectos secundarios tóxicos. Muchas terapias génicas establecidas anteriormente han fracasado en este sentido.
En el pasado se han descrito muchas saponinas. Como ejemplo, se hace referencia a Weng, Alexander, et al. "A simple method for isolation of Gypsophila saponins for the combined application of targeted toxins and saponins in tumor therapy". Planta medica 75 (13) (2009): 1421-1422; Weng, Alexander, et al. "A convenient method for saponin isolation in tumour therapy". Journal of Chromatography B 878 (7) (2010): 713-718; Weng, Alexander, et al. "The toxin component of targeted anti-tumor toxins determines their efficacy increase by saponins". Molecular oncology 6 (3) (2012): 323-332; y Weng, Alexander, et al. "Saponins modulate the intracellular trafficking of protein toxins". Journal of controlled release 164 (1) (2012): 74-86. También se ha descrito que una saponina específica (SO1861) puede mediar una administración intracelular mejorada de nanopartículas de péptidos y lípidos (Weng, Alexander, et al. "Improved intracellular delivery of peptide- and lipid-nanoplexes by natural glycosides". Journal of Controlled Release 206 (2015): 75-90).
Ciertas saponinas triterpenoides también pueden denominarse potenciadores de la transfección derivados de plantas, ya que son capaces de aumentar la cantidad de material genético administrado a un paciente de forma muy eficiente, especialmente cuando se coaplican con nanoplejos portadores de genes. La mejora de la transfección basada en las saponinas recibió el nombre de sapofección. Las saponinas particularmente eficientes son SO1861 (Sapofectosida) de Saponaria officinalis L. (Sama, Simko et al. "Sapofectosid - Ensuring nontoxic and effective DNA and r Na delivery", International Journal of Pharmaceutics 534 (2017): 195-205) y GE1741 (Gipsofilosida A) de Gypsophila elegans M. Bieb (Sama, Simko et al. "Plant derived triterpenes from Gypsophila elegans M.Bieb. enable non-toxic delivery of gene loaded nanoplexes", Journal of Biotechnology 284 (2018): 131-139).
GE1741 y sus usos también se describen en el documento WO 2019/011914 A1. Asimismo, Planta Medica Vol. 85(6) págs. 513-518 (01.04.2019) and the dissertation: "Untersuchung von Saponinen als neuartige Verstarker der Transfektion", Simko Sama, Freie Universitat Berlin (06.06.2018) desvelan saponinas gipsogeninas como agentes de transfección.
Los estudios in vitro e in vivo con transfecciones mediadas por saponinas mostraron un aumento masivo de ácidos nucleicos administrados sin efectos tóxicos. En un estudio realizado en ratones, se observó una disminución significativa del volumen tumoral, ya que el ADN administrado que codifica la proteína tóxica inactivadora del ribosoma Saporina se complejó en nanoplejos dirigidos y (Sama, Simko et al. "Targeted suicide gene transfections reveal promising results in nu/nu mice with aggressive neuroblastoma", Journal of Controlled Release, 275 (2018): 208-216.).
Saponinas adicionales se describen en las siguientes publicaciones:
• Thakur, Mayank, et al. "High-speed countercurrent chromatographic recovery and off-line electrospray ionization mass spectrometry profiling of bisdesmodic saponins from Saponaria officinalis possessing synergistic toxicity enhancing properties on targeted antitumor toxins". Journal of Chromatography B 955 (2014): 1-9;
• Jia, Zhonghua, Kazuo Koike, y Tamotsu Nikaido. "Major triterpenoid saponins from Saponaria officinalis". Journal of natural products 61 (11) (1998): 1368-1373;
• Haddad, Mohamed, et al. "New triterpene saponins from Acanthophyllum pachystegium". Helvetica chimica acta 87 (1) (2004): 73-81;
• Fu, Hongzheng et al. "Silenorubicosides A-D, Triterpenoid Saponins from Silene rubicunda". Journal of Natural Products 68 (5) (2005): 754-758;
• Moniuszko-Szajwaj, Barbara, et al. "Highly Polar Triterpenoid Saponins from the Roots of Saponaria officinalis L". Helvetica Chimica Acta 99 (5) (2016): 347-354;
• Fuchs, Hendrik, et al. "Glycosylated Triterpenoids as Endosomal Escape Enhancers in Targeted Tumor Therapies". Biomedicines 5 (2) (2017): 14.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un compuesto que sea capaz de administrar pequeños compuestos tales como péptidos y ácidos nucleicos a las células y que tenga incluso mejores propiedades con
respecto a la citotoxicidad que la saponina GE1741.
Este objetivo se logra proporcionando una saponina correspondiente a la fórmula (I):
En este contexto, R1, es independiente de otros residuos R1 en la misma molécula, H o un residuo de acetilo, con la condición de que al menos dos residuos R1 sean residuos de acetilo; y R2, es independiente de otros residuos R2 en la misma molécula, H o un residuo de acetilo, con la condición de que al menos dos residuos R2 sean residuos de acetilo.
La saponina tiene una estructura de núcleo de saponina común y no comprende ningún enlace inusual. Más bien, difiere de otras saponinas solo en sus residuos de azúcar y/o sus residuos de acetilo.
Para una mejor identificación de los residuos de azúcar individuales en la fórmula (I), éstos están marcados con una abreviatura correspondiente en la representación anterior de la fórmula (I). De este modo, las abreviaturas tienen el siguiente significado:
Un compuesto de acuerdo con la fórmula (I) mostró una eficiencia de transfección comparable a la eficiencia de transfección de GE1741. No obstante, la citotoxicidad del compuesto de acuerdo con la fórmula (I) fue significativamente menor que la citotoxicidad de GE1741. Para ser más precisos, el compuesto de acuerdo con la fórmula (1) no mostró ningún efecto citotóxico significativo incluso a concentraciones tan altas como 24 ^g/ml. A tal concentración, GE1741 ya presentaba efectos citotóxicos. Se trata de un resultado totalmente inesperado y sorprendente, ya que no cabría esperar unas propiedades citotóxicas tan significativamente inferiores de una saponina. Debido al elevado número de saponinas ya existentes, los inventores no podían esperar que los compuestos aquí reivindicados mostraran una citotoxicidad tan baja. Hay que tener en cuenta que las saponinas no se pueden
sintetizar y, por lo general, no se pueden adquirir simplemente de un proveedor de productos químicos. Más bien, hay que aislarlas de plantas o partes de plantas. Esto hace que sea particularmente difícil investigar las propiedades de las saponinas.
Los inventores descubrieron sorprendentemente que las saponinas de acuerdo con la fórmula general (I) pueden aislarse de Agrostemma githago L. (el neguillón común) y muestran una inesperada baja citotoxicidad con una eficiencia de transfección comparable a la de otras saponinas. No se ha descrito antes que tales saponinas puedan ser extraídas de Agrostemma githago L.
En una realización, todos los azúcares están presentes en su forma estereoisomérica D.
En una realización, la saponina está presente en una forma estereoisomérica de acuerdo con la fórmula general (II):
En una realización, la saponina lleva exactamente cuatro grupos acetilo, es decir, dos de los residuos R1 son residuos de acetilo, en donde el residuo R1 restante es un hidrógeno, y dos de los residuos R2 son residuos de acetilo, en donde el residuo R2 restante es un hidrógeno en cada caso.
En una realización, en cada caso un residuo de acetilo se une a los átomos de oxígeno en posición C3 y C4 del residuo de quinovosa correspondiente y a los átomos de oxígeno en posición C4 y C6 del residuo de glucosa correspondiente, dando como resultado una saponina de fórmula (III). Esta saponina también puede denominarse AG1856. AG1856 posee una cadena de azúcar Xyl-GlcA-Gal, conectada a través de GlcA con el átomo C-3 de un ácido quiláico/gipsogenina. AG1856 presenta un motivo estructural conocido de saponinas de la técnica anterior como GE1741, a saber, un residuo de quinovosa doble acetilado conectado a un residuo de fucosa que, a su vez, está directamente conectado (mediante un puente de éster) a la cadena C-28 del ácido quiláico/gipsogenina. Mientras que en el caso de GE1741 una cadena de azúcar lineal está conectada al residuo de fucosa, AG1856 porta un residuo de ramnosa ramificado que lleva un residuo de xilosa y un residuo de glucosa acetilada.
En una realización, la saponina de la realización anterior está presente en una forma estereoisomérica de acuerdo con la fórmula general (IV):
En una realización, los tres residuos R1 son residuos de acetilo, dando como resultado una saponina de fórmula (V):
En una realización, los cuatro residuos R2 son residuos de acetilo, dando como resultado una saponina de fórmula (VI):
En una realización, todos los residuos R1 y todos los residuos R2 son residuos de acetilo.
En un aspecto, la presente invención también se refiere al uso de una saponina de acuerdo con las explicaciones anteriores en la administración in vitro de un ácido nucleico, un lípido, un péptido y/o una proteína a una célula. De este modo, la administración in vitro de ácido nucleico es un uso particularmente apropiado de la saponina. Los ácidos nucleicos apropiados a administrar son ADN, tal como ADN plasmídico o ADN minicircular, y a Rn , tal como ARN pequeño de interferencia (ARNpi). El ácido nucleico u otra molécula a administrar puede estar presente en forma de nanoplejo. Los nanoplejos están generalmente formados por péptidos o lípidos capaces de unirse a la pequeña molécula a administrar. Por tanto, un nanoplejo de administración de ácido nucleico comprende un vehículo lipídico o no lipídico al que se une un ácido nucleico. Los nanoplejos también pueden denominarse nanopartículas. En una realización, el ácido nucleico a administrar es un ADN minicircular. En una realización, la molécula a administrar es una partícula de ADN minicircular peptídico.
En una realización, la célula a la cual el ácido nucleico, el lípido, el péptido y/o la proteína debe administrarse es una célula eucariota. Las células humanas, las células de animales (tales como las células de roedores) o las células vegetales son particularmente apropiadas para ser utilizadas como células. También pueden utilizarse células de levadura.
En un aspecto, la invención se refiere al uso de una saponina de acuerdo con las explicaciones anteriores en la terapia o el diagnóstico. De este modo, la saponina se utiliza para una administración in vivo de un ácido nucleico, un lípido, un péptido y/o una proteína a un ser humano o animal.
En una realización, el animal es un mamífero, en particular, un roedor.
Los inventores descubrieron que una saponina de acuerdo con las fórmulas generales (I) a (VI) no solo aumenta la eficiencia de transfección cuando se utiliza individualmente, sino que es particularmente apropiada para mejorar la eficiencia de transfección de los reactivos de transfección convencionales. Por tanto, puede utilizarse como refuerzo para dichos reactivos de transfección. Los usos descritos anteriormente abarcan el uso de dicha saponina como refuerzo para los reactivos de transfección convencionales. En una realización, la saponina se utiliza in vivo o in vitro en combinación con al menos un reactivo de transfección elegido del grupo que consiste en reactivos de transfección a base de liposomas y reactivos de transfección a base de polímeros. A continuación se enumeran ejemplos de dichos reactivos de transfección.
En un aspecto, la invención se refiere a un método para administrar un ácido nucleico, un lípido, un péptido y/o una proteína a un ser humano o animal que lo necesite utilizando una saponina de acuerdo con las explicaciones anteriores.
En un aspecto, la invención se refiere a una composición de transfección que comprende una saponina de acuerdo con las explicaciones anteriores. De este modo, la saponina puede utilizarse particularmente bien como agente potenciador de la transfección.
En un aspecto, la invención se refiere a una composición de transfección que comprende un reactivo de transfección convencional y al menos una saponina de acuerdo con cualquiera de las fórmulas (I) a (VI), en donde los residuos R1 y R2 tienen los significados descritos anteriormente. Los reactivos de transfección convencionales pueden dividirse en dos subgrupos, a saber, los reactivos de transfección a base de liposomas y los reactivos de transfección a base de polímeros. Los reactivos de transfección a base de liposomas consisten principalmente en lípidos cargados catiónicos con cadenas de ácidos grasos hidrófobos unidos a grupos principales polares tales como el propano de trimetilamonio. Los reactivos de transfección a base de polímeros consisten en polímeros orgánicos que contienen un grupo principal cargado, tal como la polietilenimina (PEI).
Ejemplos de reactivos de transfección a base de liposomas convencionales disponibles en el mercado son MEtA f ECTENE; TransFast; Stemfect; y TransFectin.
Ejemplos de reactivos de transfección a base de polímeros convencionales disponibles en el mercado son GeneCellin; reactivos de transfección X-tremeGene tales como reactivo de transfección de ADN X-tremeGene 9, reactivo de transfección de ADN X-tremeGene HP, y reactivo de transfección de ARNpi X-tremeGene; reactivos de transfección TransIT, tales como el sistema de administración dinámica TransIT-X2, reactivo TransIT-LT1, reactivo TransIT-2020, reactivo TransIT-PRO, reactivo TransIT-VirusGEN, reactivo TransIT-Lenti, reactivo TransIT-Insect, reactivo TransIT-293, reactivo TransIT-BrCa, reactivo de transfección TransIT-CHO, reactivo de transfección TransIT-HeLaMONSTER, reactivo TransIT-Jurkat, reactivo de queratinocitos TransIT, reactivo de transfección de ARNm TransIT, reactivo TransIT-TKO, reactivo TransIT-siQUEST y el reactivo TransIT-Oligo; Viafect; FuGENE; Xfect; TurboFect; y GenJet.
En una realización, el reactivo de transfección es un reactivo de transfección a base de liposomas.
En una realización, el reactivo de transfección es un reactivo de transfección a base de polímeros.
En una realización, el reactivo de transfección se elige del grupo que consiste en reactivos de transfección TransIT, reactivos de transfección X-tremeGene y GeneCellin.
En una realización, el reactivo de transfección es GeneCellin.
En un aspecto, la invención se refiere a un método para una transfección in vitro de una célula. Este método comprende la etapa de incubar una célula con un ácido nucleico en presencia de una saponina de acuerdo con las explicaciones anteriores. La transfección puede ser una transfección transitoria o una transfección estable. El ADN y el ARN son ácidos nucleicos apropiados, en donde el ADN es particularmente apropiado. En una realización, el ácido nucleico a administrar es un A d N minicircular.
En una realización, la célula es una célula eucariota. Las células humanas, las células de animales (tales como las células de roedores) o las células vegetales son particularmente apropiadas para ser utilizadas como células. También pueden utilizarse células de levadura.
En una realización, el ácido nucleico forma parte de una nanopartícula. Para dar un ejemplo, se puede utilizar una nanopartícula de ADN. Las partículas de ADN minicircular peptídico o las partículas que comprenden un péptido unido al a Dn son ejemplos apropiados adicionales. Análogamente, las nanopartículas de ARN son entidades apropiadas para llevar a cabo la transfección.
En una realización, la saponina se utiliza en una concentración que se encuentra en un intervalo entre 1 pg/ml y 50
|jg/ml, en particular entre 1,5 pg/ml y 45 pg/ml, en particular entre 2 pg/ml y 40 pg/ml, en particular entre 2,5 pg/ml y
35 pg/ml, en particular entre 3 pg/ml y 30 pg/ml, en particular entre 4 pg/ml y 25 pg/ml, en particular entre 4,5 pg/ml y 24 pg/ml, en particular entre 5 pg/ml y 23 pg/ml, en particular entre 5,5 pg/ml y 20 pg/ml, en particular entre 6 pg/ml 15 pg/ml, en particular entre 7 pg/ml y 10 pg/ml, en particular entre 8 pg/ml y 9 pg/ml.
En una realización, la saponina se utiliza en combinación con al menos un reactivo de transfección elegido del grupo que consiste en reactivos de transfección a base de liposomas y reactivos de transfección a base de polímeros. Los ejemplos apropiados de reactivos de transfección se han enumerado anteriormente.
En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para aislar una saponina de acuerdo con las explicaciones anteriores a partir de Agrostemma githago L. Este método comprende las etapas que se explican a continuación. De este modo, las etapas no tienen que realizarse necesariamente en el orden indicado. Más bien, se puede aplicar cualquier otro orden sensato de las etapas del método.
En una primera etapa, se muelen semillas de Agrostemma githago L. A continuación, las semillas molidas se desgrasan con un disolvente orgánico, por ejemplo, con éter de petróleo. Posteriormente, las semillas desgrasadas molidas se liofilizan. Al hacerlo, se obtiene un polvo de semillas.
El polvo de semillas se extrae con un disolvente alcohólico para obtener un extracto de raíz. El metanol o cualquier otro alcohol orgánico de cadena corta (como el etanol o el isopropanol) es un disolvente alcohólico adecuado. Para dar un ejemplo, una concentración de disolvente del 70 al 100 % (v/v), en particular del 75 al 95 %, en particular del
80 al 90 % es una concentración elevada apropiada. El metanol al 90 % es un disolvente alcohólico particular apropiado. Si el disolvente alcohólico es miscible con agua, puede utilizarse agua como codisolvente.
Después de eso, el disolvente alcohólico se elimina del extracto de semillas para obtener un extracto seco. Esta eliminación puede realizarse, por ejemplo, por destilación al vacío.
A continuación, el extracto seco se disuelve en un disolvente orgánico de baja concentración para obtener una solución de extracto. La expresión "disolvente orgánico de baja concentración" se refiere a un disolvente orgánico que tiene una concentración inferior al 50 % (v/v). Para dar un ejemplo, una concentración del 10 % al 50 %, en particular del
15 % al 45 %, en particular del 20 % al 40 %, en particular del 25 % al 30 % es un intervalo de concentración apropiado para el disolvente orgánico de baja concentración. Una vez más, el metanol o cualquier otro alcohol orgánico de cadena corta es un disolvente orgánico adecuado. Análogamente, puede utilizarse agua como codisolvente, si el disolvente orgánico de baja concentración es miscible con agua.
La solución de extracto se somete después a al menos una etapa de separación cromatográfica. De este modo, se obtiene una solución de saponina purificada. La separación cromatográfica puede implementarse mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Normalmente, es aconsejable realizar más de una etapa de separación cromatográfica con el fin de aumentar la pureza de la solución de saponina purificada. Por tanto, es posible someter la solución de saponina purificada obtenida tras la primera etapa de separación cromatográfica a al menos una etapa de separación cromatográfica posterior. De este modo, se pueden utilizar diferentes columnas en las etapas individuales de separación cromatográfica.
Es posible realizar las etapas individuales de separación cromatográfica (si se lleva a cabo más de una etapa de
separación cromatografía) en diferentes fases estacionarias y/o móviles. Por tanto, es posible cambiar los disolventes utilizados en las etapas individuales de separación cromatografía entre estas etapas.
Para finalizar, el disolvente se elimina de la solución de saponina purificada después de la al menos una etapa de separación cromatografía. Esto puede, por ejemplo, hacerse por destilación al vacío o por liofilización. Como consecuencia se obtiene un polvo de saponina purificada.
Todas las realizaciones desveladas en el presente documento pueden combinarse de cualquier manera. Asimismo, las realizaciones explicadas con respecto a las saponinas reivindicadas pueden transferirse a los usos y métodos reivindicados, y viceversa. Análogamente, las realizaciones de los usos y métodos explicados pueden transferirse a los otros métodos y usos descritos de cualquier manera deseada. La composición de transfección descrita también puede hacer uso de cualquiera de las realizaciones descritas.
Se explicarán más detalles de los aspectos de la presente invención con respecto a una realización ilustrativa y a las Figuras anexas. En las Figuras:
La Figura 1A muestra los resultados de las pruebas de viabilidad celular con la saponina GE1741 a diferentes concentraciones de saponina;
La Figura 1B muestra los resultados de las pruebas de viabilidad celular con la saponina SO1861 a diferentes concentraciones de saponina;
La Figura 1C muestra los resultados de las pruebas de viabilidad celular con la saponina AG1856 a diferentes concentraciones de saponina;
La Figura 1D muestra los resultados de las pruebas de viabilidad celular con diferentes saponinas a una concentración de saponina de 24 pg/ml;
La Figura 2 muestra los resultados de las pruebas de viabilidad celular mediante la medición de la impedancia con la saponina AG1856 a diferentes concentraciones de saponina;
La Figura 3 muestra los resultados de las pruebas de viabilidad celular con diferentes saponinas a diferentes concentraciones de saponina;
La Figura 4 muestra la eficiencia de transfección de AG1856 para la transfección de nanoplejos que comprenden ADN unido a un péptido;
La Figura 5 muestra la eficiencia de transfección de diferentes saponinas para la transfección de nanoplejos que comprenden ADN unido a un péptido;
La Figura 6A muestra un primer gráfico de los resultados de las pruebas de viabilidad celular tras la administración de nanoplejos mediada por AG1856; y
La Figura 6B muestra un segundo gráfico de los resultados de las pruebas de viabilidad celular tras la administración de nanoplejos mediada por AG1856.
Realización ilustrativa: Aislamiento de la saponina AG1856 de Agrostemma githago L.
Para la extracción se utilizaron semillas de Agrostemma githago L. (Agrostemmae semen, AGRO 26/80, del Centro Federal de Investigación de Mejora Genética de Plantas Cultivadas (BAZ) en Gatersleben). Después de la molienda, se desgrasaron 190 g de semillas durante la noche mediante extracción Soxhlet utilizando éter de petróleo. El polvo de las semillas desgrasadas (177,1 g) se extrajo tres veces utilizando 1 l de metanol al 90 %. El metanol se evaporó por destilación al vacío y la fase acuosa se liofilizó (Christ alpha 2-4, Osterode, Alemania). El rendimiento del extracto seco fue de 11,5 g (6 %).
Cromatografía de exclusión por tamaño
El extracto seco (200 mg) se disolvió en 1 ml de DMSO y 1 ml de metanol al 50 %. Esta solución se sometió a cromatografía de exclusión por tamaño mediante cromatografía de media presión (MPLC, Azura-system, Knauer, Alemania) equipada con una columna LH-20 de Sephadex™ (10 x 2000 mm). La elución se realizó utilizando metanol/agua (1:1). El caudal fue de 1 ml/min; la detección se realizó a 210 nm. Las fracciones se recogieron y se secaron por centrifugación al vacío y liofilización.
Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)
Las fracciones seleccionadas de MPLC se sometieron a HPLC (LC-8A Shimadzu) utilizando una columna C18
(columna LC C18 Kinetex® 5 |jm 100 A, 250 x 10,0 mm). El sistema de disolvente fue (A) acetonitrilo y (B) agua (0,01 % de ácido trifluoroacético). Se aplicó un gradiente de fase móvil (45 min): del 80 al 70 % de (B) durante 10 min, luego del 70 al 60 % de (B) entre 10 y 15 min, del 60 al 50 % de (B) entre 15 y 20 min, del 50 al 30 % de (B) entre 20 y 25 min, del 30 al 10 % de (B) entre 25 y 30 min, del 10 al 80 % de (B) entre 30 y 40 min y se mantuvo al 80 % de (B) durante 5 min adicionales. El caudal se fijó en 2 ml/ min, el análisis se registró a 210 nm y 254 nm.
La estructura de esta saponina corresponde a la fórmula (IV). Si bien AG1856 comprende cuatro residuos de acetilo (uno en la posición C3 y otro en la posición C4 del residuo de quinovosa, así como uno en la posición C4 y otro unido al residuo de metilo en la posición C6), los datos preliminares sugieren que la cantidad y la posición de los residuos de acetilo pueden variarse dentro de los límites indicados sin cambiar significativamente las propiedades de la saponina respectiva.
Ensayo de las propiedades de AG1856 en comparación con otras saponinas
Se cultivaron células de neuroblastoma murino (células Neuro2a, ATTC CCL-131™) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), que contenía 1 g/l de D-glucosa, 10 % de FBS y glutamina estable, a 37 °C y CO2 al 5 %. Estas células fueron incubadas después con diferentes saponinas para analizar el efecto citotóxico de las saponinas.
Las saponinas analizadas fueron GE1741, SO1861 y AG1856. Las 3 saponinas comparten un motivo estructural común pero llevan residuos de azúcar ligeramente diferentes. Esto es más evidente en la siguiente fórmula general (VII) con la consiguiente Tabla 1.
La confluencia celular como medida de la viabilidad celular se determinó ópticamente mediante algoritmos de cálculo del número de células (Cytosmart). Los resultados se representan en las Figuras 1A a 1D.
La Figura 1A muestra los resultados de un experimento en el que se aplicaron diferentes concentraciones de GE1741 a las células Neuro2a 24 horas después de la siembra. Se observó un efecto tóxico claro a una concentración de GE1741 de 24 jg/ml. El pico inicial se debió a la expansión celular apoptótica.
La Figura 1B muestra los resultados de un experimento en el que se aplicaron diferentes concentraciones de SO1861 a las células Neuro2a 24 horas después de la siembra. Se observó un efecto tóxico claro a una concentración de SO1861 de 24 jg/ml. El pico inicial se debió a la expansión celular apoptótica.
La Figura 1C muestra los resultados de un experimento en el que se aplicaron diferentes concentraciones de AG1856 a las células Neuro2a 24 horas después de la siembra. No se observó ningún efecto tóxico claro a una concentración de AG1856 de 24 pg/ml.
La Figura 1D muestra una comparación de las diferentes saponinas GE1741, SO1861 y AG1856 aplicadas a las células Neuro2a a una concentración de 24 pg/ml. Solo AG1856 no mostró ningún efecto tóxico a una concentración de 24 pg/ml.
Se utilizó un tampón en cada caso como control negativo.
Mediciones de impedancia celular
La Figura 2 muestra los resultados de una prueba de viabilidad celular mediante la medición de la impedancia con diferentes concentraciones de AG1856. La impedancia (resistencia de corriente alterna) en el fondo del pocillo como medida de viabilidad celular en tiempo real de las células adherentes se determinó mediante el dispositivo iCELLigence®. Se sembraron 8000 células Neuro2a por pocillo en dos placas E de 8 pocillos L8 y se incubaron durante 24 h en un volumen de 800 pl. Para los estudios de toxicidad de la transfección se añadieron 50 pl de reactivo después de eliminar el volumen respectivo del medio de cultivo. Cada 10 minutos se midió la impedancia/viabilidad. Los resultados se analizaron y mostraron con el software de análisis de datos RTCA.
Las curvas indicadas en la Figura 2 representan los resultados de las siguientes mediciones:
El aumento gradual de la concentración de AG1856 no condujo a un aumento significativo de la toxicidad. En comparación, la toxicidad grave de GE1741 (a una concentración de 24 pg/ml) impidió el crecimiento celular, de forma similar al control positivo tóxico puromicina (a una concentración de 4 pg/ml).
La Figura 3 muestra los resultados de una prueba de viabilidad celular realizada mediante un ensayo de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) con diferentes concentraciones de AG1856.
La determinación de la actividad mitocondrial debida a la formación de formazán a partir del MTT sirvió como método bioquímico para medir la viabilidad celular. No se pudo observar una caída de la viabilidad mediada por la toxicidad para AG1856 (curva 9), pero sí para GE1741 (curva 10) y SO1861 (curva 11) en la misma concentración.
La Figura 4 muestra la capacidad de AG1856 en la administración de nanopartículas que comprenden ADN unido a un péptido (nanoplejos de PD). Los nanoplejos de PD comprendían ADN que codificaba la proteína verde fluorescente (GFP). Por lo tanto, la eficacia de la transfección se podía controlar muy fácilmente detectando la fluorescencia de las células que se habían incubado con las correspondientes nanopartículas de ADN. El periodo de incubación correspondiente se eligió para ser de 48 horas en el presente caso.
Formulación de los nanoplejos de PD
Se adquirieron 20 mg de péptidos de polilisina cargados positivamente sin una secuencia amínica dirigida al receptor de integrina en Genecust. Se obtuvo el vector de p-EGFP-N3, que codificaba la proteína verde fluorescente (GFP), y se propagó con células DH5a - E.Coli (1,645 mg/ml). Se utilizaron como ácidos nucleicos adicionales el ARNm eGFP de StemMACS™ (20 pg) y el ADN minicircular que codifica GFP (acceso a Gene Bank: U55761). Con el fin de llevar a cabo la transfección, se formularon nanoplejos de la siguiente manera: Los péptidos de polilisina (P) y el vector p-EGFP-N3 (D), se diluyeron en agua (cada uno 50 pl) y se mezclaron a fondo mediante un pipeteo rápido en una relación de 4:1. Se dejó que los nanoplejos se formaran en una etapa de incubación de 30 minutos. En lo sucesivo, la suspensión de nanoplejos se diluyó con OptiMEM hasta un volumen total de 1 ml. El reactivo de transfección comercial Lipofectamin®3000 se formuló como describe el fabricante.
Sapofección (transfección con saponinas triterpénicas)
Las células Neuro2a (15.000 células/pocillo) se sembraron en una placa de 24 pocilios con un volumen de pocilio de 400 |jl de medio de cultivo y se incubaron durante 24 h. Los reactivos de transfección se formularon como se ha descrito anteriormente y se mezclaron con solución de saponina, en caso de que sea necesario. El medio de cultivo se sustituyó con el medio de transfección con una cantidad final de 500 ng de ADN/ARN. Después de un periodo de incubación de 48 h, el medio de transfección se eliminó, se tripsinizaron las células y se transfirieron a un tubo de poliestireno para realizar citometría de flujo (Cytoflex). Para cada medición se adquirieron 10.000 células. La eficiencia de la transfección se determinó mediante el software de análisis Cyflogic (por comparación de los gráficos de la muestra con el control negativo en términos de fluorescencia). AG1856 ya mostró a una concentración de 2 jg/m l una muy buena eficiencia de transfección que era comparable a la del criterio de referencia Lipofectamin. A concentraciones de 4 jg/m l o superiores, la eficiencia de transfección de AG1856 fue incluso superior a la de Lipofectamin. Los datos de la Figura 4 se expresan como media ± desviación típica (DT). Lipofectamin3000 fue el control positivo (N = 4; valor p < 0,01 (**), valor p < 0,0001 (****), ns: no significativo en comparación con PD con ANOVA unidireccional).
La Figura 5 muestra la eficiencia de transfección de las transfecciones mediadas por saponina de alta concentración. Las células Neuro2a fueron transfectadas con nanoplejos portadores del plásmido GFP, como se ha explicado anteriormente, con y sin coaplicación de saponina. Las saponinas GE1741, SO1861 y AG1856 se utilizaron en sus concentraciones de trabajo o en una concentración de 24 jg/ml. La concentración de trabajo de GE1741 y SO1861 presenta la mayor concentración no tóxica. En el caso de AG1856, representa la concentración efectiva más baja, en donde un aumento no muestra un incremento significativo de la eficiencia de transfección (cf. Figura 4). Mientras que un aumento de la concentración de 24 jg/m l condujo a una severa caída de la eficiencia de las transfecciones mediadas por GE1741 y SO1861 debido a su toxicidad, se pudo observar un aumento de la eficiencia en el caso de las transfecciones mediadas por AG1856. Lipofectamin3000 sirvió de control positivo. (N = 3; valor p < 0,01 (**), valor p < 0,0001 (****), ns: no significativo en comparación con PD con ANOVA unidireccional).
Las Figuras 6A y 6B muestran las pruebas de viabilidad celular tras la administración mediada por AG1856 de nanoplejos que llevan ADN minicircular de GFP o ADN minicircular de RIP. La finalidad del experimento realizado fue revelar la capacidad de realizar una administración génica no tóxica y altamente eficiente, así como presentar la factibilidad no solo de administrar genes indicadores, sino genes terapéuticos para terapias tumorales.
La Figura 6A muestra la viabilidad tras la transfección de ADN minicircular de GFP, ADN minicircular de saporina y ADN minicircular de diantina. La saporina y la diantina son proteínas citotóxicas. Si la transfección tiene éxito, las células transfectadas morirán.
Las curvas representadas en la Figura 6A representan los resultados de las siguientes mediciones:
No se pudo observar una toxicidad clara del ADN minicircular de GFP sin y con la coaplicación de AG1856. La transfección de nanoplejos con las proteínas inactivadoras de ribosomas diantina y saporina (ADN minicircular de diantina o ADN minicircular de saporina) solo mostró una toxicidad grave cuando se coadministró AG1856. AG1856 solo no mostró toxicidad.
La Figura 6B indica que la transfección con ADN minicircular (siendo más pequeño, menos degradable y más eficiente que ADN plasmídico) que codifica ADN de GFP da como resultado una administración génica altamente eficiente, cuando se realiza con AG1856. Cuatro de cada cinco células presentaban fluorescencia, de acuerdo con lo determinado por el análisis de citometría de flujo (n > 3).
Claims (15)
1. Saponina de acuerdo con la fórmula (I):
en la que
R1 es, independiente de otros residuos R1 en la misma molécula, H o un residuo de acetilo, con la condición de que al menos dos residuos R1 sean residuos de acetilo; y
R2 es, independiente de otros residuos R2 en la misma molécula, H o un residuo de acetilo, con la condición de que al menos dos residuos R2 sean residuos de acetilo.
2. Saponina de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que lleva exactamente cuatro residuos de acetilo.
3. Saponina de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada por que en cada caso un residuo de acetilo se une a los átomos de oxígeno en las posiciones C3 y C4 del residuo de quinovosa correspondiente y a los átomos de oxígeno en las posiciones C4 y C6 del residuo de glucosa correspondiente.
4. Uso de una saponina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la administración in vitro de un ácido nucleico, un lípido, un péptido y/o una proteína a una célula.
5. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado por que la célula es una célula eucariota.
6. Saponina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en terapia o en diagnóstico mediante una administración in vivo de un ácido nucleico, un lípido, un péptido y/o una proteína a un ser humano o animal.
7. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 4 o 5, o saponina para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado por que la saponina se aplica en combinación con al menos un reactivo de transfección elegido del grupo que consiste en reactivos de transfección a base de liposomas y reactivos de transfección a base de polímeros.
8. Composición de transfección, que comprende una saponina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
9. Composición de transfección de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada por que comprende además al menos un reactivo de transfección elegido del grupo que consiste en reactivos de transfección a base de liposomas y reactivos de transfección a base de polímeros.
10. Método para una transfección in vitro, que comprende la etapa de incubar una célula con un ácido nucleico en presencia de una saponina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
11. Método de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado por que la célula es una célula eucariota.
12. Método de acuerdo con las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado por que el ácido nucleico forma parte de una nanopartícula.
13. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado por que la saponina se utiliza en una concentración que se encuentra en un intervalo de 1 pg/ml a 50 pg/ml.
14. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado por que la saponina se utiliza en combinación con al menos un reactivo de transfección elegido del grupo que consiste en reactivos de transfección a base de liposomas y reactivos de transfección a base de polímeros.
15. Método para aislar una saponina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 a partir de Agrostemma githago L., que comprende las siguientes etapas:
• moler semillas de Agrostemma githago L. y desgrasar las semillas molidas con un disolvente orgánico para obtener semillas molidas desgrasadas,
• liofilizar las semillas molidas desgrasadas para obtener un polvo de semillas,
• extraer el polvo de semillas con un disolvente alcohólico para obtener un extracto de semillas,
• eliminar el disolvente alcohólico del extracto de semillas para obtener un extracto seco,
• disolver el extracto seco en un disolvente orgánico de baja concentración para obtener una solución de extracto, • someter la solución de extracto a al menos una etapa de separación cromatográfica para obtener una solución de saponina purificada, y
• eliminar cualquier disolvente de la solución de saponina purificada para obtener un polvo de saponina purificada.
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